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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ANA KAROLINE FREIRE DA COSTA
LEVEDURAS ASSOCIADAS À CLOACA E A EXCREMENTOS DE POMBOS
(Columba livia): UM ENFOQUE ESPECIAL PARA OS ASPECTOS
MICOLÓGICOS DE CRYPTOCOCCUS SPP.
FORTALEZA – CE
2007
ANA KAROLINE FREIRE DA COSTA
LEVEDURAS ASSOCIADAS À CLOACA E A EXCREMENTOS DE POMBOS
(Columba livia): UM ENFOQUE ESPECIAL PARA OS ASPECTOS
MICOLÓGICOS DE CRYPTOCOCCUS SPP.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Carnívoros, Onívoros e Aves.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha
Rocha.
FORTALEZA – CE
2007
C837l Costa, Ana Karoline Freire da.
Leveduras associadas à cloaca e a excrementos de pombos (Columba livia): um enfoque especial para os aspectos micológicos de Cryptococcus spp./ Ana Karoline Freire da Costa. _ Fortaleza, 2007.
111p.il. Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 1. Pombos. 2. Leveduras. 3. Cryptococcus neoformans var.
neoformans. 4. Resistência antifúngica. 5. Lectinas. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. II.
CDD: 636
Título do Trabalho: Leveduras Associadas à Cloaca e a Excrementos de Pombos
(Columba Livia): Um Enfoque Especial Para os Aspectos Micológicos de
Cryptococcus spp.
Autora: Ana Karoline Freire da Costa
Defesa em 13 / 12 / 2007
Banca Examinadora:
_______________________________________
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Orientador
Prof. Dra. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos Prof. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro
Examinadora-UECE Co-orientadora/Examinadora-UECE
Prof. Dr. William Cardoso Maciel Prof. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Examinador - UECE Suplente - UFC
Com carinho aos meus pais queridos...
“Muitas coisas não ousamos empreender por parecerem difíceis; entretanto, são difíceis
porque não ousamos empreendê-las”
Séneca
AGRADECIMENTOS
A Deus...
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pela oportunidade, apoio e
paciência, mas principalmente pelos ensinamentos transmitidos.
A minha co-orientadora, Profa. Dra. Rossana de Aguiar Cordeiro, por todo incentivo,
sugestões e capacitação dada à minha vida profissional.
A Prof. Dra. Sâmia Nogueira Brilhante, por ter-me acolhido no Centro Especializado
em Micologia Médica (CEMM) desde a minha graduação, como também orientado
minhas pesquisas.
Ao Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim, por proporcionar todas as ferramentas necessárias
para o desenvolvimento de nossas pesquisas.
A Ms. Érika Helena Salles de Brito, por contribuir com o desenvolvimento dos meus
experimentos e por ser uma pessoa sempre disposta colaborar.
A Francisco Atualpa Soares Júnior e Gladson Miranda Rodrigues, por se
disponibilizarem para a realização das coletas juntamente comigo.
A todos que fazem parte da equipe do CEMM e que, de alguma forma, contribuíram
para realização da minha pesquisa.
A Prof. Dra. Cristina Souza Chaves, por me orientar nos experimentos desenvolvidos
com as lectinas.
Ao Prof. Dr. Benildo Souza Cavada, por ceder as lectinas utilizadas nos experimentos.
A Mércia Sindeaux Frutuoso, por todo auxílio, em especial, por sua amizade sincera.
A Ms. Renata Félix de Lima, pelo apoio em todos os momentos, mas, principalmente,
por sua amizade e sábados de alegria.
A minha família, que nunca mediu esforços para minha realização profissional, pelo
apoio, amor e compreensão constantes.
A Paulo André de Castro e Silva Ribeiro, Elisabeth Rocha de Castro e Silva e Hélio
Marques Ribeiro, por toda ajuda, carinho e paciência.
A todos os meus amigos, que de alguma forma, contribuíram para a realização deste
projeto.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
suporte financeiro.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do
Ceará.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACM Ácido Caféico Modificado
AMB Amphotericin B
ASN Agar Semente de Niger
ATCC American Type Culture Collection
BSA Bovine Seric Albumin
Ca++ Cálcio
CAS Caspofungin
CEMM Centro Especializado em Micologia Médica
CFL Cratilya floribunda
CFU Colony-forming unit
CGB Canavanine-Glycine-Bromothymol Blue
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
ConA Concanavalin A
ConBr Canavalia brasiliensis
DGL Dioclea grandiflora
DGL Dioclea grandiflora
DVL Dioclea violacea
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
FD Fluorescência Direta
FLC Fluconazole
GMX Glucuronaxilomamana
ITR Itraconazole
ITS Internal Transcription Sites
KTC Ketoconazole
LCR Líquido Cefalorraquidiano
MIC Minimal Inhibitory Concentration
NCCLS National Committee for Clinical laboratory Standards
PAS Coloração Ácido Periódico Schiff
PBS Phosphate Buffered Saline
i
PCR Polimerase Chain Reaction
pH Potencial Hidrogeniônico
SGA Sabouraud Glucose Agar
SNC Sistema Nervoso Central
TE Tris-EDTA
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
Var Variedade
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Colônia de cor creme e textura mucóide, característica do gênero Cryptococcus.................5
Figura 2.
Esquema representativo do ciclo de vida de Cryptococcus sp. A - Fusão de duas células
MAT complementares e formação da hifa dicariótica. B – Cariogamia. C – Meiose e
Esporulação.............................................................................................................................7
Figura 3.
Pesquisa direta de Cryptococcus sp. no líquor. Tinta da China 40X......................................9
Figura 4.
Cultura de C. neoformans em Ágar Sabouraud 2%. A – Aspecto mucóide.........................10
Figura 5.
Crescimento de diferentes espécies fúngicas em meio Ágar Niger. A – Colônias de C.
neoformans............................................................................................................................10
Figura 6.
Prova da urease em Meio Uréia Rápida em Caldo. A - Teste negativo. B – Teste
positivo...................................................................................................................................11
Figura 7.
Teste negativo para assimilação de nitrato por C. neoformans. A – Sem crescimento para
nitrato. B – Halo de crescimento na presença de peptona (controle positivo).......................11
Figura 8.
Assimilação de carboidratos realizada para C. neoformans. A – Halo de crescimento
fúngico na presença de sacarose............................................................................................12
Figura 9. API 20C AUX. A - Galeria contendo microcúpulas com açúcares desidratados utilizados no
teste e inóculo fúngico. B – Turvação do meio.....................................................................12
Figura 10.
Meio CGB. A – resultado positivo para C. neoformans variedade neoformans, B – resultado
positivo para C. gattii.............................................................................................................13
Figura 11.
Felino com criptococose. A - Grande massa granulomatosa na região dorsal do nariz com
tecido de mesma característica protuindo da narina esquerda...............................................21
iii
Fugura 12
Criptococose em paciente HIV positivo. A - Lesão cutânea secundária...............................23
Figura 13.
Desenho esquemático da síntese da melanina.......................................................................27
Figura 14.
Acúmulo de fezes de pombos em ambientes urbanos...........................................................30
Figura 15.
Cativeiro de pombos-correio. A - Acúmulo de excretas favoráveis ao desenvolvimento de
Cryptococcus spp...................................................................................................................30
Figura 16. Microdiluição em palcas de 96 poços para C. neoformans...................................................35
iv
RESUMO
Aves industriais, domésticas e silvestres têm sido implicadas como possíveis carreadores de fungos patogênicos, tais como Cryptococcus spp. e Candida spp. Em especial, diversos estudos têm detectado a presença de Cryptococcus spp. em fezes de psitaciformes, passeriformes, columbiformes e falconiformes. Para investigar a ocorrência de Cryptococcus spp., assim como de outras leveduras na cloaca e fezes de pombos, 47 amostras de excrementos e 322 amostras provenientes da cloaca foram coletadas na cidade de Fortaleza-Ceará, Brasil. As amostras de fezes suspensas em solução fisiológica estéril (0,9%) e as da cloaca foram semeadas em meio ágar semente de niger (ASN) e ácido caféico modificado (ACM). As colônias leveduriformes eram subcultivadas em ágar Sabouraud 2% para a identificação fúngica por meio de testes micológicos específicos. Para a identificação de Cryptococcus spp. foram realizados os seguintes procedimentos: crescimento em meio L-canavanina azul de bromotimol (CGB), auxonograma em API 20C e PCR. A partir das fezes dos pombos, foi possível isolar: C. neoformans var. neoformans. (n=10), C. laurentii (n=3), C. albicans (n=9), C. tropicalis (n=3), C. krusei (n=1), C. parapsilosis (n=1), Rhodotorula sp. (n=6), Trichosporon sp. (n=3); enquanto da cloaca isoloram-se: C. albicans (n=3), C. tropicalis (n=1), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2). Outro objetivo deste estudo foi investigar a sensibilidade, in vitro, de cepas ambientais e humanas de Cryptococcus spp., através da técnica da microdiluição em caldo preconizada pelo CLSI, (M27-A2). Assim, foram testadas as 10 cepas de C. neoformans var. neoformans e as três cepas de C. laurentii isoladas neste estudo, bem como foram incluídas no teste seis cepas de C. neoformans var. neoformans, obtidas de amostras clínicas humanas e estocadas em nossa micoteca. Entre os isolados ambientais, a resistência só foi detectada em uma única cepa de C. neoformans var. neoformans para o itraconazol (CIM=1�g/mL). Dentre as seis cepas de C. neoformans var. neoformans humanas foi observado o seguinte padrão de resistência: itraconazol (n=1), fluconazol (n=3), anfotericina B (n=4). Ademais, foi detectada a presença de multiresistência entre as cepas humanas para fluconazol e anfotericina B (n=2) e para itraconazol e anfotericina B (n=1). Todos os isolados humanos e ambientais foram resistentes a caspofungina. O último objetivo deste estudo foi investigar a capacidade das lectinas como marcadores biológicos de C. neoformans var. neoformans. Para tanto, foi realizado um ensaio de fluorescência direta utilizando lectinas marcadas. Neste protocolo foram testadas cinco cepas de C. neoformans var. neoformans e cinco lectinas (Dioclea violácea - DVL, Cratilya floribunda - CFL, Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr e Dioclea virgata – DVG). O padrão de marcação das lectinas foi classificado como: +++ (intenso), ++ (moderado), + (discreto) e – (ausente). A lectina DVL foi a que apresentou a melhor capacidade de ligação nas cepas de C. neoformans var. neoformans, seguida por CFL, ConBr, DGL e DVG. Em suma, o presente estudo mostrou a importância dos pombos na disseminação de Cryptococcus spp., Candida spp., Rhodotorula sp e Trichosporon sp., bem como detectou resistência antifúngica em cepas de C. neoformans var. neoformans. Por fim, demonstrou a capacidade de lectinas, particularmente a DVL, para a marcação de C. neoformans var. neoformans. Palavras-chave: Pombos; leveduras; C. neoformans var. neoformans; resistência antifúngica; lectinas
v
ABSTRACT
Industrials, domestic and wild birds are known to act as possible carriers of pathogenic fungi such as: Cryptococcus spp. e Candida spp. In particular, several studies have been detected the occurrence of Cryptococcus spp. from bird excrements in psittaciformes, passeriformes, columbiformes and falconiformes. In order to investigate the occurrence of Cryptococcus spp. as well as others yeasts in the cloacae and feces of pigeons, 47 samples of pigeon droppings and 322 samples from pigeon cloacae were collected in the city of Fortaleza-Ceará, Brazil. Feces samples suspended in sterile saline and cloacae swabs were smeared on niger seed agar medium (NSA) and on minimal synthetic caffeic acid medium (MSCAM). Yeast-like colonies were subcultured in Sabouraud glucose agar 2% for fungal identification by specific mycologic tests. For identification of Cryptococcus spp., growth in L-canavanine-glicyne-bromothymol blue (CGB), identification by auxanogram on API 20C and PCR were performed. C. neoformans var. neoformans. (n=10), C. laurentii (n=3), C. albicans (n=9), C. tropicalis (n=3), C. krusei (n=1), C. parapsilosis (n=1), Rhodotorula sp. (n=6), Trichosporon sp. (n=3) were isolated from the pigeon droppings. C. albicans (n=3), C. tropicalis (n=1), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2). were recovered from the cloacae. Furthermore, the in vitro antifungal susceptibility of the environmental and human strains of Cryptococcus spp. was investigated by the microdiluition method as recommended by CLSI (M27-A2). Thus, the 10 isolates of C. neoformans var. neoformans and the three isolates of C. laurentii here isolated, as well as six strains of C. neoformans var. neoformans from human, stored in our fungal culture collection, were tested in this study. Among the environmental Cryptococcus, resistance was detected in only one strain of C. neoformans var. neoformans, which was resistant to itraconazole (MIC=1�g/ml). However, from the six human strains the following resistances were observed: itraconazole (n=1), fluconazole (n=3) e amphotericin B (n=4), In addition, multiresistance was detected in human strains to fluconazole and amphotericin B (n=2) and to itraconazole and amphotericin B (n=1). All environmental and clinical isolates were resistant to caspofungin. Finally, it was investigate the lectins ability to binding C. neoformans cells by direct fluorescence using labeled lectins. For that, five C. neoformans var. neoformans strains and five lectins (Dioclea violacea - DVL, Cratilya floribunda - CFL, Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr e Dioclea virgata – DVG) were tested. The binding pattern was classified as follows: +++ (intense), ++ (moderate), + (discreet) e – (absent). The DVL was the lectin that showed better ability to binding to C. neoformans var. neoformans cells, fllowed by CFL, ConBr, DGL e DVG. Summary, the present study showed the importance of pigeons in disseminating Cryptococcus spp., Candida spp., Trichosporon sp. and Rhodotorula sp., and additionally, it evidenced some antifungal resistance in C. neoformans var. neoformans. Finally, it was observed that lectins, especially DVL, are able to binding to C. neoformans cells. Key words: Pigeons; yeasts; C. neoformans var. neoformans; antifungal resistance; lectins
vi
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. .............................................i
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................................iii
RESUMO ...........................................................................................................................................................v
ABSTRACT ......................................................................................................................................................vi
INTRODUÇÃO .................................................................................................................................................1
REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................................................3
1. Aspectos Históricos..........................................................................................................................3
2. Caracterização Microbiológica.......................................................................................................5
3. Ciclo de Vida ...................................................................................................................................7
4. Métodos Diagnósticos. ....................................................................................................................9
5. Utilização de lectinas como marcadores
moleculares.....................................................................................................................................17
6. Aspectos Epidemiológicos ............................................................................................................19
7. Patogenia ........................................................................................................................................23
8. Fatores de Virulência ....................................................................................................................25
9. Ecologia...........................................................................................................................................29
10. Teste de sensibilidade aos Antifúngicos.......................................................................................34
11. Cryptococcus spp. e Outras Leveduras Isoladas de Aves e/ou suas Excretas...........................37
JUSTIFICATIVA ...........................................................................................................................................39
OBJETIVOS ....................................................................................................................................................40
1. Objetivo Geral ......................................................................................................................................40
2. Objetivos Específicos ...........................................................................................................................40
CAPÍTULO I: População de leveduras associadas à cloaca e a excrementos de pombos (Columbia livia): um
enfoque especial para Cryptococcus spp...........................................................................................................41
CAPÍTULO II: Lectinas como marcadores de Cryptococcus neoformans variedade neoformans: um
destaque para a lectina Dioclea violacea...........................................................................................................70
CONCLUSÕES GERAIS ...............................................................................................................................83
PERSPECTIVAS ............................................................................................................................................84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................................................85
vii
ANEXOS ........................................................................................................................................................103
Anexo I: Corantes, Meios de Cultura e Soluções Usadas para Isolamanto e Testes Micológicos para Cryptococcus spp. ..........................................................................................................................................103
viii
INTRODUÇÃO
O Cryptococcus é uma levedura capsulada de grande importância na micologia
médica, por ser agente etiológico da criptococose, uma infecção fúngica capaz de causar
doença no homem e em animais. Observe-se que em indivíduos imunocompetentes é
possível ocorrer a infecção primária, muito embora surja com maior freqüência em
pacientes imunodeprimidos. Nesse caso, apresenta-se como uma doença grave e
potencialmente fatal. O sítio inicial de infecção geralmente é o pulmão, podendo haver
apenas colonização traqueobrônquica e evoluir, por via hematogênica, atingindo outros
órgãos, com predileção pelo sistema nervoso central.
Na natureza, o agente etiológico da criptococose é um saprófita, com
distribuição mundial, sendo comumente encontrado em fezes de pombos. Aves
industriais, domésticas e silvestres são conhecidas por atuarem como possíveis
carreadores de fungos patogênicos ao homem e outros animais. Diversos estudos têm
detectado a presença de C. neoformans em fezes de psitaciformes (papagaios, araras,
cacatua), passeriformes (curió, azulão), columbiformes (pombos, rolinhas) e
falconiformes (falcões, águias, gaviões).
Com relação as outras leveduras presentes, tanto na cloaca como nas excretas de
aves, pode-se observar que os gêneros Candida, Trichosporon e Rhodotorula são os
mais relatados, especialmente a C. albicans, que tem sido comumente detectada no trato
digestivo de aves migratórias, bem como na microbiota da cloaca, orofaringe e fezes de
aves domésticas. Candida, Trichosporon e Rhodotorula são leveduras de importância
médica, especialmente por acometerem indivíduos imunocomprometidos. Com relação
à microbiota da cloaca e das fezes de pombos, especificamente, o relato de outras
leveduras, que não Cryptococcus, são escassos.
Baseando-se em antígenos específicos da cápsula mucopolissacarídea, C.
neoformans foi dividido em três variedades e cinco sorotipos, sendo o sorotipo A,
pertencente à variedade grubii, o sorotipo D à variedade neoformans e os sorotipos B e
C pertencentes à variedade gattii. Sob essa classificação, a designação correta para o
sorotipo AD ainda não foi definida, entretanto, alguns autores o consideram híbrido. As
variedades apresentam diferenças fenotípicas, genotípicas, bioquímicas,
epidemiológicas e clínicas.
Recentemente, com base em dados de subtipagem, seqüenciamento de
nucleotídeos e análise filogenética, foi sugerida a reclassificação de C. neoformans var.
1
gattii como uma nova espécie, C. gattii. No presente texto será considerado esta última
classificação, ou seja, C. neoformans var. grubii (sorotipo A), C. neoformans var.
neoformans (sorotipo D) e C. gattii (sorotipos B e C).
Desde a descrição do gênero, por Sanfelice, em 1895, mais de cem anos se
passaram, e muito já se sabe sobre esta levedura, porém, ainda há vários aspectos da
relação parasita-hospedeiro que não estão completamente esclarecidos. No que diz
respeito à epidemiologia do agente, ocorre heterogeneidade de distribuição dos
sorotipos e das variedades em diferentes países e regiões de um mesmo país.
Em animais, a doença já foi descrita em mamíferos, com casos esporádicos em
gatos, cães, caprinos, cavalos, ovelhas e aves. Já nos humanos, é responsável por 4,5%
das infecções fúngicas que acometem pacientes portadores da síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA).
Até o momento, poucos estudos sobre a criptococose têm sido feitos na região
Nordeste, em particular no Estado do Ceará, o que explica o pouco conhecimento a
respeito da epidemiologia, rota de infecção e diagnóstico da criptococose animal e
humana no nosso meio. No que diz respeito às variedades de C. neoformans aqui
existentes e seus perfis de sensibilidades aos antifúngicos, os dados são praticamente
inexistentes, especialmente sobre a classificação sorológica. Além disso, deve ser
levada em consideração a importância da busca de metodologias alternativas no estudo
da doença, como, por exemplo, o uso de marcadores biológicos, não imunes, na
diferenciação dos sorogrupos ao invés dos tradicionais kits importados.
Baseado no exposto, o objetivo principal deste estudo foi fazer uma busca ativa
de Cryptococcus spp. em cloaca e fezes de pombos; assim como investigar a presença
de outras leveduras presentes neste sítio anatômico e nas excretas destas aves.
2
REVISÃO DE LITERATURA
1. Aspectos Históricos
Em 1894, Fancesco Sanfelice estudando blastomicetos do suco de algumas
frutas, isolou, pela primeira vez, o C. neoformans, denominando-o de Saccharomyces
neoformans, em 1895. Este trabalho, que marcou o início do estudo do Cryptococcus,
foi publicado na Revista do Instituto de Higiene da Universidade do Cagliari, Itália.
Neste mesmo ano, Busse, na Alemanha, descrevia o primeiro caso de criptococose sob
forma de lesão óssea, simulando sarcoma. Busse isolou, de um caso de periosteíte
crônica da tíbia, uma levedura que denominou de Saccharomyces sp., sendo estudada no
ano seguinte por Buschke (LACAZ et al., 2002).
Em 1901, Constantin considerou essa espécie como S. hominis, agente da
chamada blastomicose européia. Em 1895, Curtis dava a denominação de S.
subcutaneus tumefasciens, a uma levedura isolada de tumor subcutâneo da base do
triângulo de Scarpa e de abscesso da região lombar. Todos esses fungos foram depois
identificados como semelhantes à levedura previamente descrita por Sanfelice
(LAZÉRA et al., 2004).
Ainda no ano de 1901, Vuillemin mostrou que o termo Saccharomyces era
inadequado, pois não havia formação de ascósporos nem fermentação nesses isolados,
transferindo-as para o gênero Cryptococcus. Em 1916, nos Estados Unidos, Stoddard &
Cutler observaram alguns casos de blastomicose com lesões cutâneas ou nervosas, de
onde isolaram uma levedura por eles denominada de Torula histolytica (LACAZ et al.,
2002).
Como pode ser visto várias denominações foram propostas para designar o
agente dessa micose tão grave e polimorfa em seus aspectos clínicos. Benham, em
1935, revisou os isolados classificados como Saccharomyces, Torula e Cryptococcus,
através de sua morfologia, patogenicidade e reatividade frente a fatores séricos,
concluindo que todos pertenciam a um só gênero e espécie. Posteriormente, essa mesma
autora propôs a designação Cryptococcus neoformans, a qual se tornou definitiva
(LAZÉRA et al., 2004).
Os anos 50 foram importantes para o estabelecimento do nome da doença como
criptococose, bem como para a renomeação da levedura, reduzindo a confusão causada
pelas terminologias anteriores. Nesta década, também se evidenciou o nicho de C.
3
neoformans no solo, ninhos e excretas de pombos (KWON-CHUNG & BENNETT,
1992). A partir dos estudos de Emmons, através dos quais foi possível demonstrar a
relação saprobiótica de C. neoformans com matéria orgânica rica em excreta de aves,
particularmente fezes secas de pombos, ninhos e solos contaminados, tornou-se
evidente a distribuição cosmopolita e urbana do fungo e da micose (LAZÉRA et al.,
2000).
Em animais, este agente fúngico foi isolado, pela primeira vez, em 1895, por
Sanfelice, em linfonodos de um bovino. Em 1901, Vuillemin e Klein isolaram o agente
de uma lesão pulmonar em suíno. O primeiro caso descrito em eqüinos deu-se no ano
seguinte, com a observação da levedura em uma massa mixomatosa pulmonar
(JUNGERMAN & SCHWARTZMAN, 1972). Os casos de criptococose em animais
foram relatados esporadicamente até os anos 50 e, somente em 1952, foi descrito o
primeiro caso em gatos e, no ano seguinte, o primeiro em cães (JUNGERMAN &
SCHWARTZMAN, 1972).
Anteriormente à era da SIDA, a criptococose humana era considerada uma
doença esporádica, relacionada, geralmente, com uma deficiência na imunidade celular,
ocorrendo em um pequeno percentual da população (KWON-CHUNG & BENNETT,
1992). A partir dos anos 80, com o advento da pandemia da SIDA e da utilização de
fármacos imunossupressores, houve um incremento na incidência da criptococose,
sendo essa, atualmente, uma das principais infecções fúngicas que acomete pacientes
sidéticos (ROZENBAUM & GONÇALVES, 1994; FRANZOT et al., 1997; CALVO et
al., 2001; PAPPALARDO & MELHEM, 2003).
No Brasil, os primeiros relatos da doença ocorreram nos anos de 1941 e 1944,
descritos por Carlos da Silva Lacaz e Floriano de Almeida (PAPPALARDO &
MELHEM, 2003). A partir de então, vários estudos epidemiológicos foram e estão
sendo realizados no país (LACAZ & RODRIGUES, 1983; ROZEMBAUM et al., 1992;
ROZEMBAUM & GONÇALVES, 1994; AOKI et al., 1999; LAZÉRA et al., 2000;
CALVO et al., 2001; HORTA et al., 2002; OHKUSU et al., 2002; FERNANDES et al.,
2003; NISHIKAWA et al., 2003; IGREJA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2004;
DELGADO et al., 2005).
4
2. Caracterização Microbiológica
O gênero Cryptococcus, composto por aproximadamente 19 espécies (LACAZ
et al., 2002), pertence à classe Basidiomicetes, família Filobasidiaceae, podendo
apresentar reprodução sexuada e assexuada no seu ciclo de vida (TAKEO et al., 1993;
BARRETO DE OLIVEIRA, 2001).
A fase teleomórfica, ainda não encontrada na natureza, pode ser induzida em
laboratório, sendo classificada como Filobasidiella neoformans correspondente ao
anamorfo C. neoformans e F. bacillispora correspondente ao C. gatti (KWON-CHUNG
& BENNET, 1992). O sistema de reprodução sexuado é do tipo mating-type, de um
locus e dois alelos, a e α, cujas células são denominadas de α-mating type e a-mating
type (LITVINTSEVA et al., 2005). No entanto, esta fase é obtida somente através do
cultivo, in vitro, em meios apropriados, como ágar extrato de malte, ágar suco V-8,
infusão de fenoágar, a temperaturas de 25 a 37 °C.
Na fase anamórfica, por sua vez, o fungo apresenta-se como uma levedura
haplóide, geralmente capsulada, com formato arredondado ou ovalado de
aproximadamente 5 a 10�m, sem hifas ou pseudo-hifas. A reprodução ocorre por
brotamento único ou múltiplo, a partir de qualquer ponto da parede celular e os
blastoconídeos resultantes podem permanecer unidos à célula-mãe por um colo estreito.
No cultivo em meios como ágar Sabouraud, entre outros meios utilizados para o cultivo
de leveduras, apresenta colônia de cor creme, brilhante, de textura mucóide, margem
lisa, sem pseudo-hifas ou micélio (figura 1) (LAZÉRA et al., 2004).
Figura 1. Colônia de cor creme e textura mucóide, característica do gênero Cryptococcus.
(Fonte: CEMM, 2007)
5
A partir de características morfológicas, bioquímicas, antigênicas e
epidemiológicas, a espécie C. neoformans é classificada em duas variedades:
neoformans e grubii. De acordo com as propriedades sorológicas, essas variedades e a
espécie C. gattii podem ser subdivididas em cinco diferentes sorotipos: A (var. grubii),
B e C (C. gattii) e D (var. neoformans) (BARRETO DE OLIVEIRA et al, 2004; LIN&
HEITMAN, 2006). Alguns isolados possuem características de ambos os sorotipos A e
D, e têm sido classificados, portanto, como sorotipos híbridos AD (NAKAMURA et al.,
2000).
C. neoformans e C. gattii são classificados, sorologicamente, através das
diferenças antigênicas do principal polissacarídeo capsular, uma glucuronaxilomanona
(GMX). A diferença, na estrutura das glucuronoxilomananas de sua parede celular,
permitiu a identificação dos cinco sorotipos conhecidos atualmente (MITCHELL &
PERFECT, 1995). A cápsula é composta geralmente por três componentes:
manoproteínas, GMX e galactoxilomanona. A GMX consiste de uma molécula com
ligações lineares de 1-3-D-manapironona com �-D-xilopiranosil, �-D-
glucuranopiranosil e 6-O-acetil. O sorotipo específico do GMX é dependente da
quantidade de orto-acetilações da ligação entre a manose e a xilose, da localização e do
tipo de substituição de resíduos de xilose (KWON-CHUNG, 1998; PERFECT et al,
1998; NISHIKAWA et al. 2003).
6
3. Ciclo de Vida
Assim como em outras infecções fúngicas profundas, tais como aspergilose,
histoplasmose e coccidioidomicose, a criptococose é iniciada através das células
fúngicas depositadas nos alvéolos pulmonares. A infecção é fundamentalmente
oportunista e, a partir do pulmão, se dissemina via hematogênica para outras partes do
corpo. Sendo o inóculo aerossolizado uma potencial fonte infecciosa da criptococose, a
compreensão do ciclo de vida pode fornecer uma visão de como as partículas
infecciosas são produzidas, além de um melhor entendimento da ecologia do fungo
(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005; LIN & HEITMAN, 2006).
C. neoformans e C. gattii são mais frequentemente isolados na forma anamórfica
haplóide, tanto a partir de isolados clínicos como de amostras ambientais. Entretanto,
por ser um basidiomiceto heterotálico, pode passar por uma fase dimórfica e se
transformar na forma filamentosa, através de dois caminhos distintos: conjugação de
células haplóides � e a mating type para produzir filamentos dicarióticos, como também
de frutificação monocariótica, que produz filamentos e basidiósporos sob condições
laboratoriais (figura 2) (LIN & HEITMAN, 2006).
(Fonte: Adaptado de Lin & Heitman, 2006)
Figura 2. Esquema representativo do ciclo de vida de Cryptococcus sp. A - Fusão de duas células MAT complementares e formação da hifa dicariótica. B – Cariogamia. C – Meiose e Esporulação.
7
Vários estudos sobre a reprodução sexual de C. neoformans e C. gattii mostram
que mais de 95% dos isolados clínicos e ambientais corresponde ao �-mating type,
sendo as cepas do tipo � de C. neoformans var. neoformans, por sua vez, relatadas como
as mais virulentas (PAPPALARDO & MELHEM, 2003; TRILLES et al., 2003;
LITVINTSEVA et al., 2005; TAY et al., 2005; ABEGG et al., 2006).
8
4. Métodos Diagnósticos
A condução de metodologias que levem ao diagnóstico laboratorial é dependente
da suspeita clínica, além de outros aspectos, como: características clínico-
epidemiológicas, inclusive regionais, que devem ser levadas em conta pelo profissional,
como, por exemplo, a procedência de pacientes de áreas do Norte, Nordeste e também
Centro-Oeste do Brasil, onde C. gattii tem sido mais frequentemente isolado (LAZÉRA
et al., 2004).
Atualmente, o diagnóstico laboratorial mais barato e prático ainda é a pesquisa
direta do fungo no sedimento do líquido cefalorraquidiano (LCR) em suspensão com
tinta da China (figura 3), o qual possui sensibilidade de 96,3% em pacientes com SIDA,
podendo a nigrosina também ser utilizada como método alternativo. (MITCHELL &
PERFECT, 1995; CASALI et al., 2001; PAPPALARDO & MELHEM, 2003).
Além do exame direto, também é realizado o isolamento do fungo em meio de
cultura para sua confirmação (LAZÉRA et al., 2004). O cultivo de C. neoformans e C.
gattii em laboratório, pode ser realizado através da utilização de meios de cultivo
clássicos na micologia, tais como meio Ágar Sabouraud, sem cicloeximida, já que são
sensíveis à mesma na concentração de 0,2 a 0,5%. Neste caso, o fungo cresce formando
colônias lisas ou mucóides de cor creme (figura 4) (LACAZ et al., 2002; LAZÉRA et
al., 2004).
Figura 3. Pesquisa direta de Cryptococcus sp. no
líquor. Tinta da China 40X.
(Fonte: CEMM, 2007)
9
Ágar Sabouraud, com ou sem cloranfenicol ou meios presuntivos, tais como:
Ágar Niger (figura 5), Ágar L-dopa ou dopamina, podem ser usados, dependendo das
condições do laboratório. No meio Ágar Caféico, por exemplo, a enzima fenoloxidase
produzida pelo C. neoformans, oxida o ácido caféico presente no ágar presuntivo,
resultando na produção de melanina (WILLIAMSON, 1997) e, desta forma, o fungo é
facilmente diferenciado por apresentar colônias marrons bem escuras. Tais meios
presuntivos são especialmente úteis para culturas mista e/ou ambientais.
Figura 4. Cultura de C. neoformans em Ágar Sabouraud
2%. A – Aspecto mucóide.
A
(Fonte: CEMM, 2007)
A
(Fonte: CEMM, 2007)
Figura 5. Crescimento de diferentes espécies fúngicas
em meio Ágar Niger. A – Colônias de C. neoformans.
10
Outras epécies de Cryptococcus, como C. albidus, C. laurentii e C.
uniguttulatus, podem apresentar produção de melanina nos meios acima citados,
contudo, menos pronunciada que C. neoformans e C. gattii (IKEDA et al., 2002).
Pedroso et al. (2007) puderam observar esse fenômeno através da utilização dos meios
ágar alpiste, o mesmo ágar níger, e ágar L-dopa na produção de melanina por cepas C.
albidus, C. laurentii e C. neoformans. Entretanto, a pigmentação marrom nos meios foi
mais intensa e em menor tempo de incubação que as outras espécies.
A identificação de Cryptococcus spp. é feita através de um conjunto de
características fisiológicas e bioquímicas. Hidrolisa uréia (figura 6), por meio de uma
metaloenzima, resultando em amônia e carbamato (REOLON et al., 2004). Não assimila
nitrato como única fonte de nitrogênio inorgânico e não sofre redução a nitrito (figura
7) (LAZÉRA et al., 2004). Não fermenta carboidratos, mas assimila, por metabolismo
oxidativo, glicose, maltose, sacarose e galactose (DE HOOG et al., 2000) (figura 8).
Figura 6. Prova da urease em Meio Uréia Rápida em Caldo. A - Teste negativo, B – Teste positivo.
B
Figura 7. Teste negativo para assimilação de nitrato por C. neoformans. A – Sem crescimento para nitrato. B – Halo de crescimento na presença de peptona (controle positivo).
A
(Fonte: CEMM, 2007) (Fonte: CEMM, 2007)
B
A
11
A assimilação de carboidratos também pode ser realizada através métodos
manuais e automatizados (MILAN & ZAROR, 2004). Dentre os sistemas disponíveis, o
API 20C (BioMérieux) e o ID 32C (BioMérieux) são os mais utilizados para
identificação de Cryptococcus spp. Estes testes consistem em galerias plásticas
contendo microcúpulas com açúcares desidratados (figura 9). Dentro de cada
microcúpula coloca-se uma suspensão da levedura e incuba-se sob temperatura e tempo
determinados. Os resultados baseiam-se na turvação ou mudança de cor das
microcúpulas, comparando-se com os dados presentes em um banco de dados fornecido
pelo fabricante. Entretanto, a galeria ID 32C inclui provas que envolvem leitura
automatizada.
Figura 8. Assimilação de carboidratos realizada para C. neoformans. A – Halo de crescimento fúngico na presença de sacarose.
(Fonte: CEMM, 2007)
A
A
B
Figura 9. API 20C AUX. A - Galeria contendo microcúpulas com açúcares desidratados utilizados no teste e inoculo fúngico. B – Turvação do meio indicando crescimento do fungo através da assimilação do açúcar.
(Fonte: CEMM, 2007)
12
Para diferenciar C. neoformans var. neoformans de C. gattii é geralmente
utilizado o meio ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (Teste de CGB)
(LUGARINI, 2007). No período de um a cinco dias, somente isolados de C. gattii
mudam o meio para a cor azul (figura 10). Isso ocorre porque esta variedade é
naturalmente resistente à L-canavanina, podendo assim metabolizá-la em produtos não
tóxicos e crescer no meio de CGB, onde a glicina é utilizada como única fonte de
carbono e nitrogênio, produzindo amônia, elevando o pH e alterando a cor do indicador,
de azul de bromotimol para azul-colbato. Originalmente o pH do meio é 5,8, e sua cor,
amarelo esverdeado.
A grande maioria das cepas de C. neoformans var. neoformans são inibidas pela
L-canavanina e não crescem nem utilizam a glicina contida no meio, não alterando,
portanto, o pH, mantendo a cor original do meio (LAZÉRA et al, 2004; MILAN &
ZAROR, 2004). O meio D-prolina também pode ser empregado para diferenciar C.
neoformans de C. gattii, sendo que, apenas este último, utiliza a prolina como única
fonte de nitrogênio (FERREIRA & ÁVILA, 2001). Com relação às outras espécies de
Cryptococcus, o meio de CGB geralmente não é utilizado, entretanto, estudos
conduzidos por Bauters et al., (2001) mostram que cepas clínicas de C. laurentii foram
capazes de crescer na presença de L-canavnina e glicina.
Nos tecidos, a coloração com mucicarmim de Meyer é um método útil para
diferenciar C. neoformans de outros fungos com tamanho e aparências similares
Figura 10. Meio CGB. A – Resultado positivo para C. neoformans variedade neoformans. B – Resultado positivo para C. gattii.
A B
(Fonte: CEMM, 2007)
13
(LACAZ et al., 2002). Esta coloração evidencia a cápsula em vermelho, facilitando o
seu reconhecimento. A impregnação com prata pelo método de Gomori-Grocott e o
método de PAS (coloração ácido periódico Schiff) são as mais utilizadas para a
detecção do fungo no tecido. A coloração Fontana Masson pode ser utilizada para
evidenciar o depósito de melanina na parede do C. neoformans, auxiliando na sua
identificação em tecidos (LAZÉRA et al., 2004).
No diagnóstico da criptococose é recomendada a pesquisa de antígeno solúvel
polissacarídico (glucuranaxilomanana), presente na cápsula da levedura (LACAZ et al.,
2002). O teste é comercialmente disponível sob a forma de um kit, baseia-se na reação
de aglutinação e é de fácil execução. Partículas de látex revestidas com globulinas anti-
C. neoformans são aglutinadas frente a mínimas concentrações de antígenos solúveis
presentes no LCR ou no soro. Tais sistemas comercializados podem conter partículas
revestidas com anticorpos policlonais ou monoclonais e, apesar de existir variabilidade
de resultados, a sensibilidade do teste é de cerca de 95 a 99%.
Reações falsas positivas podem ocorrer relacionadas ao fator reumatóide,
doenças causadas por Trichosporon spp. e bacilos Gram negativos, devendo, então, ser
correlacionadas com o quadro clínico e laboratorial do caso sob investigação
(FERREIRA & ÁVILA, 2001).
Uma opção para diagnóstico da doença, com alta sensibilidade e rápidos
resultados, é a detecção do antígeno polissacarídico através da aglutinação de partículas
de látex em fluidos corporais (LCR, soro e urina). A sorotipagem é realizada apenas em
centros de pesquisa especializados, uma vez que apresenta custo elevado devido à
importação de reagentes comercializados por uma única empresa estrangeira, sendo,
portanto, a cultura considerada o padrão ouro de diagnóstico (MOREIRA et al., 2006).
Atualmente, dispõe-se de técnicas moleculares para detecção de seqüências
gênicas específicas para C. neoformans e C. gattii em espécimes clínicos e
monitoramento das infecções fúngicas, seja por técnicas da reação em cadeia da
polimerase (PCR), hibridação ou metodologias combinadas. Dentre as várias técnicas
de manipulação e obtenção de informações, a partir do ácido desoxirribonucléico
(DNA), a PCR, que surgiu no final dos anos 80, possibilitou a obtenção de uma grande
quantidade de DNA de uma região específica a partir de pequenas quantidades de pares
de bases de um DNA - molde (RODRIGUES et al., 2006).
Essa particularidade tornou a PCR uma técnica revolucionária na área de
diagnóstico molecular, porque permite a detecção direta de um agente infeccioso,
14
através dos seus genes, mesmo que ele esteja presente em quantidades bem pequenas no
organismo do hospedeiro (PASCHOAL et al., 2004). Não diferentemente para
Cryptococcus spp., esta técnica vem sendo utilizada como a principal ferramenta na
identificação, por meio de DNA, deste agente fúngico, bem como de outras leveduras.
As metodologias variantes da PCR mais amplamente utilizadas para
identificação de C. neoformans e C. gattii são: nested PCR, PCR multiplex e PCR em
tempo real, sendo a PCR fingerprinting, técnica baseada na avaliação de bandas
polimórficas, formadas pela amplificação de DNA, a partir de oligonucleotídeos
iniciadores aleatórios, uma das mais empregadas na tipificação molecular (KIDD et al.,
2004; ENANCHE-ANGOULVANT et al., 2007).
A PCR fingerprinting permitiu que C. neoformans e C. gattii pudessem ser
identificados em nível de sorotipos com sensibilidade suficiente para detectar diferenças
inter e intravariedades, bem como possibilitou a classificação de isolados clínicos e
ambientais em oito tipos moleculares (definidos pela presença de bandas específicas e
reproduzíveis): VNI (variedade grubii, sorotipo A1), VNII (variedade grubii, sorotipo
A2), VNIII (sorotipo AD), VNIV (variedade neoformans, sorotipo D), VGI, VGII,
VGIII e VGIV (C. gattii, sorotipo B e C) (LIN & HEITMAN, 2006).
Algumas pesquisas vêm sendo conduzidas no intuito de que a PCR possa ser
uma técnica mais aplicável no diagnóstico laboratorial da criptococose por meio da
análise de fluidos biológicos, tais como: sangue, líquor, secreções e urina. Estudos
feitos por Paschoal et al. (2004), demonstram que a detecção de C. neoformans pode ser
otimizada pela técnica de PCR. A amplificação foi realizada nas áreas ITS e 5,8S do
RNA ribossomal. Foram estudadas 72 amostras de líquor obtidas de pacientes com e
sem SIDA. Os pacientes eram portadores de meningite criptocócica (n = 56) e
meningite ocasionada por outros agentes (n = 16). Os resultados demonstraram que a
técnica tem alta sensibilidade (92,9%), superior a cultura (85,7%) e ao teste da tinta da
China (76,8%). A análise comparativa dos métodos tinta da China, cultura e PCR
demonstrou que o último é muito mais sensível e específico, podendo ser aplicável
como importante recurso laboratorial no diagnóstico da neurocriptococose.
Embora os métodos moleculares ofereçam vantagens de rapidez, sensibilidade e
especificidade, e já sejam exeqüíveis em alguns laboratórios particulares, a cultura e o
exame direto ainda são considerados os mais amplamente utilizados no diagnóstico da
criptococose, especialmente na rotina laboratorial da rede pública do Brasil (MENEZES
15
et al., 2002). Desta forma, o desenvolvimento de métodos alternativos, exeqüíveis em
laboratórios de rotina, se faz necessário, como, por exemplo, o uso de lectinas.
16
5. Utilização de Lectinas como Marcadores Moleculares
Há mais de três décadas, pesquisas vêm apontando o uso de lectinas como
reagentes úteis no estudo da superfície da célula fúngica, com amplas perspectivas de
desempenhar também papel de valor na classificação desses microrganismos (POTTS et
al., 2001). No estudo do agente da criptococose, o interesse está voltado,
principalmente, no que diz respeito aos novos métodos de sorotipagem, que devem
reconhecer as propriedades bioquímicas e antigênicas da cápsula polissacarídica do
microrganismo, permitindo a correta identificação de cada sorogrupo. Assim sendo,
marcadores biológicos não imunológicos podem ser utilizados para a identificação de
sorotipos de C. neoformans e C. gattii. Dentre as várias classes de moléculas com essas
propriedades, as lectinas se destacam por possuírem a capacidade de reconhecimento e
ligação específica, porém reversível, a resíduos de açúcares (AMBROSI et al., 2005;
KOMATH et al., 2006).
As lectinas correspondem a um grupo heterogêneo de proteínas ou
glicoproteínas ubíquas, encontradas em diversas espécies de vegetais, animais, algas e
microrganismos (KOMATH et al., 2006). Dependendo da origem, podem mostrar
diferenças nos padrões de ligação a carboidratos. Em geral, lectinas de algas apresentam
massa molecular menor que a maioria das lectinas de plantas e não apresentam
afinidade por açúcares simples, ligando-se mais especificamente a oligossacarídeos,
frequentemente glicoproteínas. Tanto as lectinas de origem animal quanto aquelas
provenientes de vegetais têm sido extensivamente utilizadas como ferramentas
bioquímicas em pesquisas biotecnológicas e biomédicas (LIS & SHARON, 1998;
TEIXEIRA et al., 2007).
Tais moléculas apresentam diversas atividades biológicas e são amplamente
utilizadas como marcadores celulares específicos, reconhecendo inclusive mudanças
nos padrões de expressão de glicoproteínas relacionadas à maturação celular e processos
patológicos (AMBROSI et al., 2005). Estudos, in vivo, realizados por Barbosa et al.
(2001), mostraram a capacidade estimulatória da produção de células T e indução de
apoptose mediada por três lectinas extraídas de leguminosas: Canavalia brasiliensis
(ConBr), Dioclea grandiflora (DGL) e D. violacea (DVioL).
Diversos estudos têm mostrado a utilização de lectinas vegetais na identificação
e tipagem de vários microrganismos, incluindo leveduras patogênicas do gênero
Candida (NENOFF et al., 2000), bactérias (AABENHUS et al., 2002) e espécies de
17
Leishmania (ANDRADE & SARAIVA, 1999). Em um estudo de identificação rápida
feito com 18 espécies de Mycobacterium, por exemplo, foi possível observar um único
modelo de aglutinação para cada espécie. Ademais, foi determinada a concentração de
lectina mínima (MLC) para a ocorrência da aglutinação, sendo visto que a concentração
de 125µg/ml em somente duas lectinas, já era suficiente para diferenciar as espécies
umas das outras (ATHAMNA et al., 2005).
No que diz respeito a leveduras, com intuito de avaliar o uso de lectinas na
tipagem de cepas de Candida, Muñoz et al. (2001), estudaram um modelo de
aglutinação de 93 isolados clínicos de Candida spp. frente a 14 lectinas comerciais de
variadas especificidades. Foi visto que todos os isolados foram aglutinados pelas
lectinas Canavalia ensiformis (ConA), Lens culinaris (LCA) e Pisum sativum (PSA),
sendo estas �-D-manose específicas. Estudos anteriores realmente mostraram que tais
moléculas de carboidratos podem estar presentes de maneira abundante na superfície
celular de leveduras do gênero Candida e Cryptococcus (NETH et al, 2000; JACK &
TURNET, 2003).
Desta maneira, mais investigações devem ser feitas para melhor estabelecer o
papel das lectinas na tipagem de leveduras, em especial de C. neoformans, já que,
praticamente, nada se sabe a respeito da sua interação com tais moléculas. Estudos desta
natureza auxiliariam pesquisas taxonômicas e epidemiológicas nos laboratórios clínicos,
além de servirem como métodos alternativos àqueles mais laboriosos e de custos
elevados.
18
6. Aspectos Epidemiológicos
A criptococose é uma doença que ocorre no mundo inteiro e, atualmente, é
considerada a quarta causa mais freqüente de infecção oportunista em pacientes
sidéticos (HORTA et al., 2002; PAPPALARDO & MALHEM, 2003). Dentre as
infecções fúngicas, a criptococose é a principal responsável pela morbidade e
mortalidade destes pacientes (IDNURM et al., 2005). No Brasil, de acordo com dados
do Ministério da Saúde, no período entre 1980 e 2002, 6% das infecções oportunísticas
associadas à SIDA foram causadas por C. neoformans e C. gattii (MINISTÉRIO DA
SAÚDE DO BRASIL, 2002). Desde então, a criptococose deixou de ser uma doença
rara e passou a ocupar o quarto lugar entre as doenças infecciosas que acometem
pacientes sidéticos (HORTA et al., 2002).
Estudos mostram que, em Vancouver, Canadá, entre os anos de 1999 e 2003, a
incidência da doença por C. gattii foi de 37 casos por milhão de residentes por ano
(KIDD et al., 2004). Esta taxa foi significativamente maior do que tipicamente é
observado na Austrália (0,94 por milhão de residentes por ano), onde C. gattii é
endêmico (SORRELL et al., 2001). Os casos de criptococose no Brasil por esta espécie,
segundo o que se observa na literatura, são menos freqüentes que os casos por C.
neoformans, entretanto, uma taxa específica da incidência da doença não é observada
(PAPPALARDO & MELHEM, 2003; DORA et al., 2006).
No mundo todo, o sorotipo A é o mais comumente isolado, sendo observado em
até 90% dos casos, seguido pelos sorotipos B e AD, nesta seqüência (BOEKHOUT et
al., 2001; LITVINTSEVA et al., 2005). Os sorotipos D e C são menos relatados, exceto
em alguns países europeus, algumas áreas dos Estados Unidos (Califórnia e Nova
Iorque) e Ásia, sendo considerados menos patogênicos (LIN & HEITMAN, 2006).
No Brasil, estudos pioneiros de Lacaz & Rodrigues, em 1983, mostraram que a
maioria (64%) de 25 amostras biológicas analisadas pertencia à variedade neoformans
com prevalência do sorotipo A, seguido pelo sorotipo B e D. Mais recentemente, de
acordo com Nishikawa et al. (2003), o sorotipo A tem-se mostrado prevalente nas
regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil, tanto em isolados clínicos quanto
ambientais, enquanto nas regiões Norte e Nordeste, o sorotipo B predomina em todos os
isolados (PAPPALARDO & MELHEM, 2003).
No Ceará, estudos sobre a epidemiologia da criptococose são escassos e os casos
descritos são apenas em nível de espécie, portanto, dados sobre os sorotipos são
19
inexistentes ou não reportados. Dentre os únicos estudos realizados sobre o tema,
destaca-se o de Menezes et al. (2002) no Hospital São José, centro de referência de
doenças infecciosas no Estado do Ceará, 54 amostras de líquor oriundas de indivíduos
sidéticos com sinais e sintomas de meningite foram analisadas por meio de exame direto
com tinta da China, cultura em Ágar Sabouraud 2%, prova da urease e assimilação de
inositol. Entre as amostras estudadas, 5 (9,25%) foram consideradas positivas e
classificadas como C. neoformans.
Enquanto C. neoformans possui ampla distribuição, o C. gattii possui
distribuição mais restrita, estando geralmente associado a áreas tropicais e subtropicais
(BOEKHOUT et al., 2001; SORREL et al., 2001). No Brasil, a prevalência de C. gattii
é considerada uma das mais altas na América do Sul (MONTENEGRO & PAULA,
2000), parecendo esta espécie ser endêmica na região Nordeste, representando 62,7 a
91,2% dos casos (NISHIKAWA et al., 2003).
Quanto à predisposição etária e sexual, a doença é mais comum em homens
adultos (LOPES et al., 1997; DARZÉ et al., 2000; FERNANDES et al., 2003; MEYER
et al., 2003; LITVINTSEVA et al., 2005). Curiosamente, a incidência da doença em
crianças é baixa (FERNANDES et al., 2000; CÔRREA et al., 2002), entretanto, no
Brasil, houve um incremento nos relatos da criptococose nessa faixa etária (CÔRREA et
al., 1999), parecendo esse fator estar ligado à desnutrição ou ao aumento do número de
crianças imunocomprometidas (ROZENBAUM & GONÇALVES, 1994; CÔRREA et
al., 1999). Estudos realizados por Rozenbaum & Gonçalves (1994) mostraram que pode
ocorrer reativação da infecção latente em indivíduos adultos que foram expostos ao
agente quando ainda jovens.
Os relatos na literatura sobre a incidência da criptococose em animais são mais
escassos do que em humanos, especialmente com relação aos sorotipos encontrados. A
criptococose afeta diversas espécies de animais (domésticos e selvagens), porém, cães e
gatos parecem ser mais suscetíveis à doença, com apresentação de sinais clínicos
característicos (LIN & HEITMAN, 2006).
Dentre as espécies domésticas, o gato (Felis domesticus) é o mais comumente
afetado (figura 11) (DUNCAN et al., 2006; JULIANO et al., 2006). A doença pode se
desenvolver em animais de qualquer idade e parece independer do sexo e da raça
(BEATTY et al., 2000; KERL et al., 2003). No Brasil, a doença em felinos tem sido
mais freqüentemente relatada em animais adultos, machos e da raça Siamesa (PEREIRA
& COUTINHO, 2003). Em cães, a criptococose tem sido mais relatada em animais de
20
um a sete anos de idade. Não há nenhuma predisposição relacionada com o sexo, mas
algumas raças parecem ser mais suscetíveis, como: Doberman, Dog Alemão, Cocker
Spaniel e Pinscher (KERL et al., 2003).
A doença também tem sido documentada em outras espécies domésticas, tais
como os eqüinos. Recentemente, foi detectado um caso de criptococose pulmonar
granulomatosa em um eqüino com laminite crônica, que fazia uso de glicocorticóides,
sendo C. neoformans a espécie envolvida (KOMMERS et al., 2005). Nas aves, poucos
casos da doença têm sido relatados, entre os quais, podem ser citados: presença de
massa tumoral na região infra-orbitária de um pombo causada por C. neoformans,
acometimento do trato respiratório superior de uma cacatua devido a C. gattii
(MENDONZA et al., 1984; RAIDAL et al., 2001; MALIK et al., 2003; RASO et al.
2004).
Em animais silvestres, tanto C. gattii como C. neoformans têm sido reportado
em Coalas (Phascolarctos cinereus), entretanto, C. gattii é a espécie mais comumente
encontrada nestes animais nativos da Austrália. Isso deve estar relacionado ao hábito
destes animais se alimentarem e viverem sobre árvores do gênero Eucalyptus, e já que
C. gattii tem uma forte associação com estas plantas, estes animais são, portanto, mais
predisponentes a adquirirem o microrganismo (KROCKENBERGER et al., 2002).
Mais uma vez, em nossa região podemos verificar que informações a respeito da
criptococose em animais são inexistentes. A criptococose na clínica de pequenos
Figura 11. Felino com criptococose. A - Grande massa granulomatosa na região dorsal do nariz com tecido de mesma característica protuindo da narina esquerda.
(Fonte: Simões-Mattos, 2007)
A
21
animais não tem sido diagnosticada, possivelmente, por não haver um diagnóstico
diferenciado. Entretanto, vale destacar que, recentemente, nosso grupo de pesquisa
diagnosticou um caso de criptococose em um gato macho, sem raça definida, de
aproximadamente oito anos, nativo do município de Baturité, Ceará, com suspeita
clínica de Leishmaniose Tegumentar Americana. O animal apresentava uma lesão
nodular ulcerada na região dorsal do nariz, de coloração róseo-avermelhada, protuindo
da narina esquerda levando à obstrução completa (DADOS NÃO PUBLICADOS).
22
7. Patogenia
A criptococose é uma importante micose sistêmica, ubiquitária, cujo agente
etiológico possui tropismo pelo sistema nervoso central e apresenta extraordinária
capacidade de infectar e causar doença em uma larga variedade de hospedeiros,
incluindo mamíferos, insetos e pássaros (CASADEVALL & PERFECT, 1998; LIN &
HEITMAN, 2006).
A doença em humanos começa como uma infecção pulmonar e se dissemina via
hemato-linfática, produzindo lesões principalmente no sistema nervoso central (SNC),
em particular nas meninges (CHANG et al, 2004; MOREIRA et al., 2006), podendo
envolver também pele (figura 12), rins e outros órgãos (QUAZZAFI et al., 2007). O
comprometimento da resposta imune é o principal fator predisponente para a ocorrência
da doença, sendo os pacientes com doenças imunodepressoras, como a SIDA,
neoplasias linfoproliferativas ou sarcomas, sob tratamento imunossupressor ou
transplantados, mais suscetíveis à doença (PAPPALARDO & MELHEM, 2003).
Além de causar doença em hospedeiros humanos, Cryptococcus spp. podem
infectar uma larga variedade de animais industriais, domésticos e silvestres,
apresentando-se com sinais clínicos diferentes daqueles em humanos (LACAZ et al.,
2002; JULIANO et al., 2006). Os fatores predisponentes para a doença têm sido
associados com estados de debilidade e desnutrição, uso prolongado de glicocorticóides
A
Figura 12. Criptococose em paciente HIV positivo. A - Lesão cutânea secundária.
Fonte: Silva, 2007.
23
e infecções virais, como por exemplo, pelos vírus da imunodeficiência e da leucemia
felina (DUNCAN et al., 2006).
Nos animais, a via de infecção direta para o sistema nervoso central,
possivelmente através da tábua óssea e terminações do nervo olfativo, tem sido descrita
associada a lesões de face, principalmente de mucosa nasal (LAZÉRA et al., 2004).
Infecção subclínica e colonização nasal são comuns em cães e gatos. Em gatos,
sintomas pulmonares, anormalidades oculares e sinais neurológicos associados com
meningite criptococócica são raros. Ao invés disso, a criptococose apresenta-se mais
comumente como uma infecção do trato respiratório superior. Em cães, por sua vez, a
criptococose é menos comum, tendendo a ser disseminada e, no lugar de infecções
nasais, apresenta maior envolvimento ocular e do SNC (DUNCAN et al., 2006).
A doença tem sido detectada em bovinos, caprinos e ovinos, associada com
quadros de mastites e pneumonias, podendo outros animais do rebanho estar infectados
(LEMOS et al., 2007). Na espécie bovina, a mastite criptocócica é a forma mais comum
da doença e os sinais clínicos são extremamente variáveis, incluindo edema moderado e
transitório em um ou mais quartos do teto, até edema severo e distensão da glândula
afetada (LIN & HEITMAN, 2006). Em eqüinos, a infecção por C. neoformans tem sido
associada, principalmente, a quadros de pneumonia (KOMMERS et al., 2005) A
criptococose também tem sido descrita acometendo animais selvagens, tais como os
coalas, sendo mais comumente descritos casos de colonização nasal assintomática e
lesões de pele (KROCKENBERGER et al., 2002).
24
8. Fatores de virulência
Fatores de virulência são características que permitem ao microrganismo
transpor as defesas do hospedeiro e que são expressas somente quando estes são
susceptíveis. Os três principais fatores de virulência de C. neoformans e C. gattii
descritos são: termotolerância a 37°C, síntese de melanina através de uma lacase e
presença de cápsula (LAZÉRA et al., 2004).
O crescimento do fungo nos tecidos do hospedeiro é condicionado a
transposição das condições fisiológicas existentes no sítio de infecção. Ele deve crescer
a 37°C, numa concentração de gás carbônico aproximadamente 5% e pH entre 7,3 e 7,4.
Para o crescimento a 37°C, o fungo deve expressar a subunidade catalítica A da proteína
calcineurina, fosfatase específica para as serinas e treoninas, sendo ativada por Ca++
calmodulina e necessária para o crescimento do microrganismo no hospedeiro
(BUCHANAN & MURPHY, 1998).
Estudos genéticos complementares têm mostrado que a cápsula polissacarídica é
um fator crítico na virulência do C. neoformans. Pelo menos, quatro genes capsulares já
foram identificados e caracterizados: CAP64, CAP60, CAP59, CAP10 (KWON-
CHUNG, 1998). Há vários atributos da cápsula que conferem ao C. neoformans uma
melhor adaptação durante a infecção, tais como: antigenicidade e resistência à
fagocitose mediada por monócitos, macrófagos e neutrófilos. Isso acarreta considerável
redução da apresentação de antígenos nas células T, promovendo, assim, uma baixa na
resposta imunológica (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
O C. neoformans libera os polissacarídeos capsulares em vesículas ao redor do
fagossomo dos macrófagos. Essas vesículas se acumulam no citoplasma do macrófago e
promovem disfunções, resultando na morte do mesmo. A cápsula funciona como um
agressor intracelular, enquanto os polissacarídeos, como componentes citotóxicos aos
macrófagos (TUCKER & CASADEVALL, 2002).
Limitações de ferro podem levar a uma intensa elaboração da estrutura capsular
por parte do fungo (ALSPAUGH et al., 1998). Tal mecanismo é substanciado pelo fato
de o ferro ser um elemento central na regulação do mecanismo imune. Desde que este
elemento pode servir como nutriente para o desenvolvimento de microrganismos,
acredita-se que o mesmo seja limitado durante o processo infeccioso, deixando o
microrganismo mais susceptível ao ataque do sistema imunológico (GONZALES et al.,
25
2007). Desta forma, a formação da cápsula poderá conferir ao fungo proteção contra o
sistema imune.
Diferenças significativas de crescimento, disseminação e resposta celular do
hospedeiro foram notadas na progressão da infecção pulmonar, quando cepas
capsuladas e mutantes acapsuladas foram inoculadas em modelos animais (WILDER et
al., 2002). A cápsula também interfere na presença de componentes do complemento
(soro e proteínas de superfície celular), impossibilitando a ligação aos receptores CR3
dos leucócitos e prejudicando a resposta leucocitária (STEENBERGEN &
CASADEVALL, 2003). Existe uma correlação direta entre a quantidade de
polissacarídeos no soro com a severidade e a disseminação da doença, numa associação
que promove evidência circunstancial para a relação entre o polissacarídeo liberado, o
dano ao hospedeiro e a doença (VECCHIARELLI, 2000).
Outro fator de virulência relacionado ao fungo é a produção do pigmento
melanínico, que tem ação antioxidante e antifagocítica (LAZÉRA et al., 2004).
Melaninas são macromoléculas sintetizadas por polimerização oxidativa de compostos
fenólicos, são hidrofóbicas e negativamente carregadas, que resultam em pigmentos
marrons ou pretos (LANGFELDER et al., 2003). A melanina possui um radical livre
estável que é insolúvel nos solventes fisiológicos e resistente à degradação por ácidos.
Desta maneira, protege o fungo dos radicais livres tóxicos que são produzidos pelo
sistema de defesa do hospedeiro (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
A produção de melanina é realizada por uma lacase, enzima que efetiva a
oxidação de dihidroxifenóis em quinonas e catalisam sua polimerização em melanina, e
que pode usar como precurssores a L-DOPA exógena, dopamina, noroepinefrina e
epinefrina (figura 13) (CHANG et al., 2004). O pigmento melanínico fica localizado na
parede celular do fungo, conferindo à célula efeito protetor contra reações oxidativas,
atuando na defesa contra radiação UV e ao ataque das células de defesa (HAMILTON
& HOLDON, 1999). A melanina confere ainda à célula fúngica proteção contra as
defesas do hospedeiro em função da sua capacidade de reter enzimas, impedindo que as
mesmas sejam degradadas, deixando os produtos da ação dessas enzimas para o
microrganismo (JACOBSON, 2000). Vários estudos têm associado a síntese de
melanina com a virulência da cepa. Mutantes amelaninogênicos obtidos em laboratório
mostraram-se avirulentos para animais inoculados (WILLIAMSON, 1997).
26
O forte neurotropismo do C. neoformans, que pode ocorrer em formas
localizadas ou associado à doença disseminada, pode ser explicado, em parte, pela
habilidade do fungo de usar neurotransmissores, tais como, a epinefrina e a dopamina
como substratos para a produção de melanina (CHANG et al., 2004). Pesquisas
utilizando peptídeos melanina-específicos e anticorpos monoclonais demonstraram, em
tecidos humanos e de roedores, células marcadas com C. neoformans, indicando que o
fungo produzia melanina, in vivo (NOSANCHUK et al., 1999). Essas observações
sugerem que a melanina potencializa a virulência através da redução da suscetibilidade
do fungo aos mecanismos imunoefetores do hospedeiro. Contudo, ainda há muita
especulação acerca de como a melanização potencializa a virulência deste agente
fúngico.
Outros potenciais fatores de virulência vêm sendo estudados, como a produção,
tanto em de cultura e durante a infecção, do poliol D-manitol. Acredita-se que a
quantidade deste poliol secretada está relacionada com a quantidade de microrganismos
presentes no sítio da infecção, apresentando-se como osmólito ou antioxidante durante o
processo da infecção. A produção de manitol pelas células do C. neoformans no local da
infecção é responsável pelo aumento da resistência ao estresse provocando diferenças
osmóticas, dano por formas reativas de oxigênio e ataque mediado por
polimorfonucleares, com conseqüente aumento da patogenicidade (PERFECT et al.,
1998).
Figura 13. Desenho esquemático da síntese da melanina.
(Fonte: Adaptado de Lehninger et al., 2006)
ENZIMA TIROSINASE ENZIMA TIROSINASE
TIROSINA
ENZIMA TIROSINASE
Oxidação
DOPA
ENZIMA TIROSINASE
DOPAQUINONA
REAÇÕES INTERMEDIÁRIAS
Dehidrogenação
ENZIMA TIROSINASEENZIMA TIROSINASE ENZIMA TIROSINASEENZIMA TIROSINASE
TIROSINA
ENZIMA TIROSINASE
Oxidação
DOPA
ENZIMA TIROSINASE
DOPAQUINONA
REAÇÕES INTERMEDIÁRIAS
Dehidrogenação
TIROSINATIROSINA
ENZIMA TIROSINASEENZIMA TIROSINASE
Oxidação
DOPADOPA
ENZIMA TIROSINASEENZIMA TIROSINASE
DOPAQUINONADOPAQUINONA
REAÇÕES INTERMEDIÁRIASREAÇÕES INTERMEDIÁRIAS
Dehidrogenação
27
A enzima urease também tem sido sugerida como um provável fator de
virulência de C. neoformans. Estudos realizados por Cox et al. (2000) mostraram que
camundongos infectados com cepas mutantes de C. neoformans var. grubii, deficientes
na produção de urease, apresentaram maior tempo de sobrevivência em relação aos
infectados com o tipo selvagem.
As fosfolipases têm constituído outro potencial fator de virulência, pois são
capazes de hidrolisar cadeias de ésteres atuando na degradação e desestabilização da
membrana celular do hospedeiro ocasionando a lise da célula (COX et al., 2001). A
atividade da fosfolipase de várias cepas de C. neoformans foi observada através da
formação de um halo de precipitação ao redor das colônias em meio ágar gema de ovo
(GHANNOUM, 2000). Através desta técnica, a atividade da enzima foi comparada
entre isolados clínicos e ambientais e foi demonstrado que os isolados clínicos
produziram significativamente mais fosfolipase. Um fato interessante é a capacidade da
fosfolipase de clivar a fosfatidilcolina dipalmitol, um dos principais componentes do
surfactante pulmonar, possibilitando a dispersão do fungo. (STEENBERGEN &
CASADEVALL, 2003).
As proteinases, por sua vez, têm demonstrado importância na virulência de
fungos e bactérias patogênicas. Essas enzimas atuam no colágeno, elastina,
fibrinogênio, imunoglobulina e fatores do complemento, ocasionando danos teciduais,
fornecendo nutrientes para o patógeno e proteção contra o sistema imune do hospedeiro
(CASADEVALL & PERFECT, 1998; COLLOPY-JUNIOR et al., 2006).
28
9. Ecologia
C. neoformans é cosmopolita e pode ser encontrado em uma variedade de nichos
ecológicos, dentre estes estão substratos orgânicos e habitats relacionados (construções
antigas, torres de igreja, estábulos, porões, barracões e cavernas), além de excretas de
aves, já tendo sido isolado também, a partir de fezes de morcegos e baratas, ninhos de
vespa, suco de frutas, microbiota intestinal de cavalo, leite, cavidade nasal e pele de
cães e gatos, recintos de coelhos, buracos de tatus, solo, vegetais em decomposição e
ocos de várias espécies de árvores (LAZÉRA et al., 1998, 2000; CASADEVALL &
PERFECT, 1998; TRILLES et al., 2003; GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005).
Como podemos verificar, este agente fúngico tem sido isolado de várias fontes
na natureza, sendo mais comumente associado a fezes de pombos (figuras 14 e 15) e
menos frequentemente tem sido isolado em excretas de outras aves, tais como
psitacídeos e passeriformes (FILIÚ et al., 2002; LUGARINI, 2007). Trabalhos
pioneiros de Emmons, no início da década de 50, já faziam referência à relação
saprofítica de C. neoformans com matéria orgânica rica em excretas de aves,
particularmente fezes secas de pombos, bem como, solos contaminados com estes
excrementos em ambientes urbanos (EMMONS, 1951).
Recentemente, Cichon (2006) fez uma busca ativa do fungo a partir de 88
amostras provindas de ambientes públicos que continham acúmulo de excretas de
pombos em Curitiba, e obteve 11 isolados de C. neoformans com uma taxa de 12,5% de
positividade. No ano seguinte, na mesma cidade, foi realizado um estudo por Lugarini
(2007), que tinha como objetivo investigar a presença de C. neoformans e C. gattii nas
fezes, inglúvio e cloaca de passeriformes e psittaciformes localizados em cativeiros. Das
141 amostras fecais colhidas, 25,53% foram positivas para C. neoformans var. grubii,
enquanto todas as amostras oriundas de amostras cloacais (n=119) e do inglúvio (n=24)
foram negativas para C. neoformans e C. gattii.
29
Lazéra et al. (2000), verificaram a presença de C. neoformans var. neoformans
na madeira em decomposição e em ocos de árvores vivas, sugerindo um novo habitat
natural e um possível nicho ecológico primário para o fungo. No Brasil, C. neoformans
e C. gattii já foram isolados de ocos de várias espécies de árvores nativas ou exóticas,
em ambientes urbano, florestal e rural, demonstrando que não há relação entre uma
árvore específica e o fungo (LAZÉRA et al., 1998, 2000; FORTES, 2001; TRILLES et
al., 2003).
C. gattii, que possui distribuição mais restrita geograficamente (SORREL &
ELLIS, 1997), foi isolado, primeiramente, na natureza, por Ellis & Pfeiffer (1990), no
sul da Austrália em associação ao eucalipto (Eucalyptus camaldulensis).
Posteriormente, outras espécies de eucaliptos, tais como: E. tereticornis, E. rudis e E.
gomphocephala, também foram sugeridas como possíveis nichos ecológicos do fungo.
C. gattii também já foi isolado a partir de excretas de aves, especificamente de
psittaciformes (ABEGG et al., 2006).
No Brasil, Lazéra et al. (1998) relatam a presença de C. gattii em ocos de
árvores em decomposição, protegidos dos efeitos dessecadores dos raios solares. Em
estudos realizados por Ellis & Pfeiffer (1990) foi proposto que a formação de
basidiósporos e a dispersão dos propágulos infecciosos de C. gattii ocorrem
intensificadamente durante a estação de florescimento do eucalipto. Entretanto, Lazéra
Figura 14. Acúmulo de fezes de pombos em ambientes urbanos.
(Fonte: CEMM, 2007)
Figura 15. Cativeiro de pombos-correio. A - Acúmulo de excretas favoráveis ao desenvolvimento de Cryptococcus spp.
(Fonte: CEMM, 2007)
30
et al. (1998, 2000) e Granados & Castañeda (2005), na América do Sul, não
encontraram associação entre a floração das árvores e a presença do fungo.
A variedade grubii, reconhecida no ano de 1998, tem sido isolada
principalmente em pacientes sidéticos nos Estados Unidos. Entretanto, no mundo
inteiro, é recuperada com maior freqüência em amostras ambientais, tais como fezes de
pombos, ocos e troncos de árvores (SOARES et al., 2005; GRANADOS &
CATAÑEDA et al., 2005). No que diz respeito à distribuição regional, ambos isolados
ambientais e clínicos de C. neoformans var. grubii possuem distribuição similar
(FRANZOT et al., 1997; NISHIKAWA et al., 2003).
O isolamento de C. neoformans em excretas de aves está ligado à presença de
um ambiente favorável ao crescimento do fungo, através da sua adaptação bioquímica,
que lhe confere a habilidade de assimilação de creatinina, uma amina nitrogenada,
composta de dois aminoácidos (glicina e arginina), importante por ser fonte de energia
química, pois facilita a transferência de energia dentro das células (NARDELLI et al,
2005). Além disso, o fungo também pode utilizar o ácido úrico e as purinas como fonte
de nitrogênio, compostos esses, em abundância nesse nicho ecológico. Apesar de
também ser capaz de assimilar a creatinina, C. gattii, geralmente, não está associado às
excretas de aves, devido, possivelmente, à regulação diferenciada de enzimas
responsáveis por esse metabolismo (CASALI et al., 2001).
No Brasil, isolamentos do fungo em excretas de passeriformes e psittaciformes
já foram relatados por Filiú et al. (2002) e Abegg et al. (2006). Filiú et al. (2002)
obtiveram isolamento de C. neoformans var. neoformans a partir de excretas de aves de
cativeiro e de vida livre na cidade de Campo Grande/MS, com elevadas concentrações
do fungo. O isolamento foi feito a partir de 18 amostras de fezes envelhecidas e secas
dos poleiros e grades de recintos contendo aves agrupadas, das seguintes aves: canário-
belga (Serinus canarius), canário-do-reino (Corduelis coculatos), canário-da-terra-
verdadeiro (Sicalis flaveola), periquito-australiano (Melopsittacus undulatus), calopsita
(Nymphicus hollandicus), agapornis (Agapornis sp.), mandarim (Taeniopigya guttata),
pombo-rabo-de-leque (Columba sp.), pombo-africano (Columba sp.) e papagaio
(Amazona sp.). Enquanto Abegg et al. (2006), a partir de amostras de excretas de aves
provenientes do Parque Zoológico do Rio Grande do Sul, registraram 18,2% de
positividade para C. neoformans e C. gattii. As aves selecionadas neste estudo
pertenciam à família dos psittaciformes, sendo as amostras colhidas a partir de fezes de
papagaio-moleiro (A. farinosa), papa-cacau (A. festiva), chauá (A. rhodocorytha),
31
periquito-rei (Aratinga aurea), jandaia (A. solstitialis), periquito-maracanã (A.
leucophthalmus), periquito-australiano (M. undulatus), calopsita (N. hollandicus),
maitaca-de-maximiliano (Pionus maximiliani), e periquito-alexandrino (Psittacula
eupatria).
Os fatores climáticos de cada região, tais como: temperatura, umidade e
exposição à luz, podem influenciar na recuperação de cepas de C. neoformans e C.
gattii oriundas de amostras ambientais (MONTENEGRO & PAULA, 2000;
GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005; QUINTERO et al., 2005). Portanto, o sucesso
no isolamento de espécies de Cryptococcus não é tarefa simples, pois está relacionado
aos fatores acima citados, além de características, tais como, condições de isolamento e
cultura em laboratório.
Apesar do isolamento de C. neoformans ser abundante em excretas, o fungo
dificilmente é isolado do aparelho digestório de aves (ROSARIO et al., 2005;
CAFARCHIA et al., 2006a, 2006b). O mecanismo pelo qual as excretas tornam-se
infectadas ainda é incerto (FILIÚ et al., 2002). O desenvolvimento de C. neoformans
em excretas de aves se deve possivelmente à grande quantidade de células fúngicas no
ambiente, as quais encontram compostos ricos em nitrogênio nas excretas, o que facilita
a sua multiplicação (CASADEVALL & PERFECT, 1998; CHEE & LEE, 2005).
Reolon et al. (2004) relataram que excretas secas oferecem um substrato mais favorável
por possuírem menor quantidade de bactérias e, desta maneira, menor competição pelo
crescimento, e isto também pode ajudar a explicar a elevada densidade populacional de
células de C. neoformans neste substrato.
Em estudo recente, Rosario et al. (2005) conseguiram isolar 1,81% de cepas de
C. neoformans, a partir de 331 amostras cloacais de pombos em cativeiro, na Ilha de
Gran Canaria, Espanha, enquanto Cafarchia et al. (2006b) obtiveram uma taxa de
isolamento de 2,2%, a partir de amostras cloacais de aves de rapina no Sul da Itália.
Já Cafarchia et al. (2006a) não obtiveram resultado positivo para C. neoformans
ou C. gattii a partir de swabs cloacais de 421 aves migratórias. Essa ausência de
isolamento se deve às más condições para o crescimento do fungo, possivelmente pela
elevada temperatura corporal (41,5 ºC) das aves e pela alta concentração de amônia
presente nas fezes frescas, que alcaliniza o meio (SORREL & ELLIS, 1997; LIN &
HEITMAN, 2006).
Segundo Swinne-Desigain (1975), C. neoformans é capaz de colonizar a mucosa
do papo de pombos sem causar doença, sendo considerado, portanto, endosaprobiótico
32
natural dessas aves. Essa autora obteve quase 50% de isolamento da levedura
proveniente do inglúvio de pombos, mas nenhum isolado a partir do intestino delgado e
grosso dessas aves. Segundo a mesma, o fungo conseguiria ficar no inglúvio das aves
por longo período e quando existissem condições favoráveis à sua multiplicação
atingiria o tubo digestório distal, sendo eliminado pelas fezes. A partir de então, o fungo
já multiplicado, estando num ambiente com falta de limpeza, acúmulo de excretas e
aumento de temperatura, por meio do ar, seria capaz de contaminar as excretas
adjacentes.
Já Rosario et al. (2005) sugerem que a maioria das leveduras contidas no papo
das aves não sobrevive à passagem pelo aparelho digestório, com exceção às cepas
termorresistentes, as quais podem se multiplicar na alta temperatura das aves.
Entretanto, estudos mostrando a administração experimental, por via oral, de C.
neoformans para pombos e canários revelaram que o fungo sobreviveu à passagem no
aparelho digestório (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Cafarchia et al. (2006b) não
obtiveram recuperação de C. neoformans ou C. gattii de nenhuma amostra do aparelho
gastrintestinal de aves de rapina (águia-de-asa-redonda e lagarteiro-peneireiro), apesar
de obterem 2,2% de cepas de C. neoformans var. grubii a partir de swabs cloacais,
indicando que essas aves podem ser carreadoras do fungo.
Muitos trabalhos relatam a criptococose em seres humanos após a exposição às
excretas de aves (LAGROU et al., 2005). Nosanchuk et al. (2000) descreveram a
ocorrência da criptococose em uma paciente que sofrera transplante renal e estabelecia
contato com uma cacatua. Shrestha et al. (2004) relataram a possível transmissão
zoonótica de criptococose pulmonar, a partir de uma calopsita, a um paciente recebendo
terapia com infliximab (antagonista de fator de necrose tumoral alfa).
LAGROU et al. (2005) descreveram recentemente a transmissão de criptococose
por ave de estimação e observaram que ambos os isolados clínicos e da excreta da ave
apresentavam similaridade bioquímica, cariotípica e genética. Nosanchuk et al. (2000) e
Lagrou et al. (2005) ilustraram, ainda, que não é necessário o contato direto com aves de
estimação para propiciar uma exposição ao agente e, mesmo em contatos limitados,
pode-se evidenciar a aquisição da doença, até mesmo em pessoas imunocompetentes.
Além disso, a evidência da participação das aves como fonte de infecção em seres
humanos já foi demonstrada pela identificação das mesmas linhagens em excretas de
aves e isolados clínicos (FRANZOT et al., 1997; NOSANCHUNK et al., 2000;
LAGROU et al., 2005).
33
10. Teste de Sensibilidade aos Antifúngicos
Com o aumento da população imunocomprometida, principalmente após o
surgimento da SIDA, e do uso abusivo de agentes imussupressores, tais como
glicocorticóides utilizados em pacientes transplantados, a incidência de infecções
sistêmicas por fungos também tem aumentado (SOUZA et al., 2005; NUCCI &
COLOMBO, 2007). Somando-se a este fato, verifica-se que os avanços obtidos com a
terapia antibacteriana têm permitido que as infecções fúngicas oportunistas se instalem.
Portanto, o desenvolvimento dos testes de susceptibilidade aos antifúngicos tem sua
história vinculada à antibioticoterapia (COLOMBO & ALVES, 2004).
Nas últimas décadas, várias mudanças ocorreram na epidemiologia das micoses
humanas e animais (DUNCAN et al., 2006; QUAZZAFI et al., 2007). As infecções
fúngicas oportunistas têm sido caracterizadas pelo seu aumento em freqüência, bem
como pela diversidade de fungos isolados e pelo aumento da gravidade das infecções,
muitas vezes em razões de fatores predisponentes (MOREIRA et al., 2006).
Diante desses fatos, cresceu o interesse em métodos laboratoriais que buscavam
credibilidade nos resultados para a obtenção de um teste padrão ouro para sensibilidade
aos antifúngicos, cuja acurácia e reprodutibilidade fossem inquestionáveis. Com a
obtenção de um método coerente, poder-se-ia então avaliar variações na metodologia
que tornassem o método exeqüível em laboratórios de rotina, assim como avaliar sua
relevância clínica nos dados obtidos, in vitro, para orientar a seleção da terapia
antifúngica.
Desta maneira, em 1982, o Comitê da Área de Microbiologia do Clinical
Laboratory Standards Institute (CLSI), entidade responsável pela padronização de
testes laboratoriais nos Estados Unidos, estabeleceu um subcomitê para testes de
sensibilidade a agentes antifúngicos que, em 1985, publicou seu primeiro relatório.
Sendo assim, vários estudos multicêntricos foram realizados para definir as condições
ideais de realização dos ensaios.
Os testes de sensibilidade, in vitro, às drogas antifúngicas têm sido realizados
com o intuito de avaliar seu potencial terapêutico, comprovar a sensibilidade do fungo
frente aos antifúngicos e ter controle da terapia antifúngica (COLOMBO & ALVES,
2004). O princípio destes testes é, basicamente, expor um inóculo definido do
microrganismo em estudo a concentrações conhecidas das drogas a serem testadas e
observar se o crescimento do mesmo é minimizado ou não. A leitura final do teste
34
permite identificar a concentração inibitória mínima da droga (CIM) que inibe o
crescimento fúngico (CLSI, 2002).
Para facilitar a análise mais apurada das diversas condições de teste, ficou
definido que o método de referência deveria ser o teste de macrodiluição em caldo.
Entretanto, dados adicionais eram necessários para resolver questões que incluíam:
preparo e tamanho do inóculo, escolha entre os vários meios sintéticos, temperatura e
período de incubação, bem como definição do ponto de corte. Essas questões foram
então objeto de uma série de pesquisas colaborativas (PFALLER et al., 1990;
FROMTLING et al., 1993). Assim, após vários estudos, em 1992, ficou estabelecida a
padronização dos testes de sensibilidade para leveduras através da publicação do
documento M-27P, a fim de padronizar testes de sensibilidade às drogas antifúngicas
com base no método da macrodiluição em caldo.
Apesar da macrodiluição em tubo ser um método de credibilidade e boa
reprodutibilidade, padronizado pelo CLSI, é uma técnica muito laboriosa e dispendiosa.
Sendo assim, foram propostos métodos alternativos mais adequados à rotina dos
laboratórios clínicos, entre os quais estão o método da microdiluição em caldo e o Etest
(BARCHIESI et al., 1994; COLOMBO et al., 1995).
O primeiro, realizado em placas de microdiluição de 96 poços (figura 23),
permite a análise de um maior número de amostras, além de apresentar maior facilidade
de execução e economia de material. O Etest, por sua vez, é o principal método
comercial (figura 26), que apresenta aceitável equivalência com os métodos de diluição
em caldo do CLSI. Ademais, possui a vantagem da simplicidade de uma técnica
baseada em uma fita plástica, que contém a droga em diferentes concentrações
expressas no reverso de uma fita, colocada sobre a superfície de um meio solidificado
(COLOMBO & ALVES, 2004).
(Fonte: CEMM, 2007)
Figura 16. Microdiluição em palcas de 96 poços para C. neoformans.
35
A microdiluição em caldo é uma técnica para leveduras que causam infecções
invasivas e que inclui espécies de Candida (incluindo Candida glabrata) e C.
neoformans. É uma técnica realizada segundo parâmetros do CLSI, documento M-
27A2, e está sendo desenvolvida por meio de processos consensuais para facilitar a
concordância entre laboratórios na determinação da sensibilidade de leveduras a agentes
antifúngicos. Entretanto, não tem sido usada em estudos com fungos dimórficos em fase
leveduriforme, como Blastomyces dermatitidis ou Histoplasma capsulatum variedade
capsulatum (CLSI, M27A2, 2002).
Uma vez superada a etapa da padronização de um método que permitisse a
otimização das condições de realização, assim como sua reprodutibilidade, seria
possível, então, passar à etapa da avaliação de sua correlação clínico-laboratorial
(COLOMBO & ALVES, 2004). Apesar de alguns estudos, tais como análise da
evolução clínica de pacientes com quadros de candidíase, não mostrarem resultados
satisfatórios, o CLSI, baseado na análise dos resultados obtidos na terapêutica com
fluconazol e itraconazol de candidíase oral, em pacientes sidéticos, sugeriu “valores de
corte” para a interpretação do perfil de sensibilidade de leveduras a essas drogas. Ainda
que esses “valores de corte” se apresentem como referência geral para essas drogas, não
se tem certeza que essas definições sejam válidas para infecções causadas por outras
espécies de leveduras, como para Cryptococcus spp.
É importante lembrar que os valores da concentração inibitória mínima de
antimicrobianos não definem isoladamente o resultado da terapêutica antiinfecciosa
com a droga em questão. Mesmo além da atividade inibitória ou fungicida do
antifúngico utilizado, fatores tais como: a capacidade de resposta imunológica do
hospedeiro, presença de próteses ou cateteres e diagnóstico tardio da doença podem
influenciar na falha do tratamento, independentemente da eficácia microbiológica da
droga utilizada. Ademais, vale ressaltar que as definições aqui apresentadas ainda
podem ser revistas, dada a recente padronização desses testes.
36
11. Cryptococcus spp. e Outras Leveduras Isoladas de Aves e/ou suas Excretas
Assim como C. neoformans pode ser encontrado nas fezes e na cloaca de aves
(FILIÚ et al., 2002; REOLON et al., 2004; CARFACHIA et al., 2006a), outras espécies
de leveduras têm sido relatadas principalmente neste último sítio, entre as quais se
destacam os gêneros: Candida, Rhodotorula e Trichosporon (CARFACHIA et al.,
2006b; MANCIANTI et al., 2004). Estudos conduzidos por Carfachia et al., (2006a),
através da análise da microbiota fúngica da cloaca de 421 aves migratórias, mostraram
que R. rubra foi a levedura mais isolada, seguida de Candida spp. e T. cutaneum.
A C. albicans está presente na microbiota de vários mamíferos domésticos
(bovinos, eqüinos, cães) e roedores. E tem sido detectada na mucosa do trato digestivo e
orofaringe de avestruzes (MELLEVILE et al., 2004; ALMEIDA et al., 2005). Apesar de
estar presente na microbiota de homem e animais saudáveis, sem causar nenhum dano, a
C. albicans, também pode atuar como patógeno destas espécies, causando quadros
diversos de candidíases, especialmente em indivíduos imunocomprometidos (NUCCI &
COLOMBO, 2007). Algumas espécies de Rhodotorula, assim como Trichosporon
também são relatadas como causadores de micoses oportunistas, como o acometimento
de pacientes com câncer, SIDA (LACAZ et al., 2002; THAKUR et al., 2007).
Carfachia et al. (2006a) relatam ainda um percentual elevado de C. albidus e C.
laurentii. Apesar destas espécies de Cryptococcus já terem sido anteriormente
detectadas em fezes de pombos (GALLO et al., 1989), os relatos mais freqüentes são a
partir da cloaca de aves. Não obstante ter sido pouco relatado o acometimento em
homem e animais, C. laurentii já foi implicado como causador de quadros de infecções
pulmonares, ceratites, fungemias e infecções cutâneas indivíduos imunocomprometidos
como também em imunocompetentes (JOHNSON et al., 1998).
Embora estando presente em grande número no ambiente das aves,
Cryptococcus spp., na maioria das vezes não é isolado, fato que provavelmente se deve
à elevada temperatura corporal destes animais, a qual inibe o crescimento da levedura
(LIN & HEITMAN, 2006). Provavelmente, ocorre erradicação da levedura no
organismo pela imunidade inata, havendo apenas infecção subclínica. Desta forma, as
aves podem funcionar como reservatório transitório e portadores assintomáticos da
doença.
Relatos de criptococose em aves já foram descritos em psittaciformes,
columbiformes e anseriformes (GRINER & WALCH, 1978; ROSSKOPF &
37
WOERPEL, 1984; RAIDAL et al., 2001; MALIK et al., 2003; RASO et al., 2004). O
diagnóstico da doença nestes animais é difícil de ser realizado, pois os sinais são
geralmente inespecíficos, incluindo fraqueza, depressão, dispnéia, anorexia, emaciação,
diarréia, tumores orais, cegueira, incoordenação, paralisia progressiva, dificuldade em
voar e, eventualmente, morte súbita (RASO et al., 2004).
Raso et al. (2004) relataram uma epizootia de criptococose generalizada em
psittaciformes no estado de São Paulo, causada por C. gattii, sorotipo B. A lesão post
morten mais comum foi a presença de material mixomatoso no trato respiratório,
cavidade celomática, seios nasais e cérebro. Os autores acreditam que os poleiros
confeccionados com eucalipto tenham sido a fonte de infecção, já que essas aves têm
comportamento de bicar pedaços de madeira. Acredita-se que a infecção ocorra por
meio do trato respiratório ou da inoculação tegumentar. Segundo Abegg et al. (2006), a
termotolerância de cepas de C. gattii, explique a prevalência dessa espécie na
criptococose aviária. Logo, como podemos verificar, aves domésticas e selvagens
podem representar importantes fontes carreadoras de leveduras patogênicas ao homem e
animais.
38
JUSTIFICATIVA
A carência de dados sobre a epidemiologia e as vias de infecção da criptococose
em nossa região justificou o interesse pelo estudo das fontes naturais de infecção.
Ademais, foi de grande importância a realização do presente projeto de pesquisa, que
visou colaborar para o melhor entendimento da criptococose humana e animal, com
ênfase nos aspectos do perfil de sensibilidade a drogas antifúngicas e marcação com
lectinas.
39
OBJETIVOS
1. Objetivo Geral
Com este estudo pretendeu-se fazer uma busca ativa de Cryptococcus spp. na
cloaca de pombos e suas excretas, bem como caracterizar fenotipicamente as cepas
isoladas.
2. Objetivos específicos
2.1. Investigar a presença de Cryptococcus spp. e outras espécies de leveduras em
amostras da cloaca e fezes de pombos;
2.2. Avaliar a sensibilidade antifúngica das cepas de Cryptococcus spp. isoladas, in
vitro, comparando-se com o perfil de sensibilidade de cepas humanas estocadas
na micoteca do CEMM;
2.3. Avaliar a utilização de lectinas na marcação de cepas de C. neoformans;
40
Capítulo I
Yeast populations associated with excrement and cloacae of pigeons: a special
approach to Cryptococcus spp.
A.K.F. Costa a,*, R.A. Cordeiro b, c, R.S.N. Brilhante b, S.B. Praciano b, J.J.C. Sidrim b,
A.J. Monteiro d, M.F.G. Rocha a, b
a Faculty of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of
Ceará, Av. Paranjana, 1700. CEP: 60.740-903, Fortaleza-CE, Brazil.
b Specialized Medical Mycology Center, Federal University of Ceará, Rua Coronel
Nunes de Melo, s/n, Rodolfo Teófilo. Cep: 60430270, Fortaleza-CE, Brazil.
c Department of Biology, State University of Ceará, Av. Paranjana, 1700. CEP: 60.740-
903, Fortaleza-CE, Brazil.
d Department of Statics, Federal University of Ceará, Campus do Pici, s/ n, CEP: 60455-
760, Fortaleza – CE, Brazil.
Veterinary Microbiology
(Estados Unidos)
(Submetido)
* Corresponding author: A. K. F. Costa. Rua Major Gerardo Mendes, 646;
Aerolândia. CEP: 60.851-440. Fortaleza, CE, Brazil. Phone: 55 (85) 3257-1921. Fax:
55 (85) 3246-1536. E-mail: [email protected]
41
Capítulo I
População de leveduras associadas à cloaca e a excrementos de pombos (Columba
livia): um enfoque especial para Cryptococcus spp.
Resumo - Aves industriais, domésticas e silvestres são conhecidas por atuarem como
possíveis carreadoras de fungos patogênico ao homem e animais, tais como
Cryptococcus spp. e Candida spp. Para investigar a ocorrência de Cryptococcus spp.,
assim como outras leveduras na cloaca e fezes de pombos, 47 amostras de excrementos
de pombos e 322 amostras de swabs cloacais de pombos foram coletadas na cidade de
Fortaleza, Brasil. Para a identificação de Cryptococcus spp., foi realizado crescimento
em meio L-canavanina azul de bromotimol (CGB), auxonograma em API 20C e PCR.
As outras leveduras foram identficadas através de testes micológicos específicos,
descritos adiante. Ademais, foi investigada a sensibilidade, in vitro, de cepas ambientais
e humanas de Cryptococcus spp. estocadas em nossa micoteca através do método da
microdiluição. A partir das fezes dos pombos foi possível isolar: C. neoformans var.
neoformans (n=10), C. laurentii (n=3), Candida spp. (n=14), Rhodotorula sp. (n=6) e
Trichosporon sp. (n=3), enquanto da cloaca isolou-se: Candida spp. (n=4), Rhodotorula
sp. (n=2) e Trichosporon sp. (n=3). Os resultados dos testes de sensibilidade aos
antifúngicos mostraram que, entre os isolados ambientais, a resistência só foi detectada
em uma única cepa para o itraconazol (CIM=1�g/ml). Entretanto, dentre as seis cepas
de C. neoformans var. neoformans humanas foi observado o seguinte padrão de
resistência: itraconazol (n=1), fluconazol (n=3), amfotericina B (n=4). Além disso, foi
detectado o fenômeno da multiresistência entre as cepas humanas para fluconazol e
amfotericina B (n=2) e itraconazol e amfotericina B (n=1). Todos os isolados
ambientais e humanos foram resistentes à caspofungina. Em suma, o presente estudo
mostrou a importância dos pombos na disseminação de Cryptococcus spp., Candida
spp., Trichosporon sp. e Rhodotorula sp., que apresentam potencial patogênico ao
homem e animais. Adicionalmente foi observada resistência antifúngica em cepas de
Cryptococcus spp.
42
Abstract – Industrials, domestic and wild birds are known to be possible carriers of
human and other animal pathogenic fungi, such as Cryptococcus spp. and Candida spp.
In order to investigate the occurrence of Cryptococcus spp. as well as others yeasts in
pigeons, 47 samples of pigeon droppings and 322 samples from pigeon cloacae were
collected in the city of Fortaleza, Brazil. For identification of Cryptococcus spp., growth
in CGB, auxanogram tests on API 20C and PCR were performed. Other yeasts species
were identified by specific mycologic tests described elsewhere. Furthermore, the in
vitro antifungal susceptibility of environmental and human strains of Cryptococcus spp.
from our collection culture was investigated by microdilution method. As results, C.
neoformans variety neoformans (n=10), C. laurentii (n=3), Candida spp. (n=14),
Rhodotorula sp. (n=6), Trichosporon sp. (n=3) were isolated from the pigeon droppings.
Candida spp. (n=4), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2) were recovered
from the cloacae. Resistance was detected in only one environmental strain of
Cryptococcus, which was resistant to itraconazole (MIC=1�g/ml). However,
Cryptococcus human strains were resistant to amphotericin B (n=4), fluconazole (n=3)
and itraconazole (n=1). In addition, multiresistance was detected in human strains to
fluconazole and amphotericin B (n=2) and to itraconazole and amphotericin B (n=1).
All environmental and clinical isolates were resistant to caspofungin. The present study
showed the importance of pigeons in disseminating Cryptococcus spp., Candida spp.,
Trichosporon sp. and Rhodotorula sp., which have pathogenic potential to humans and
animals. Additionally, some antifungal resistance was observed in Cryptococcus spp.
strains.
Key words: Pigeons; yeasts; C. neoformans var. neoformans; antifungal resistance
43
1. Introduction
C. neoformans is a basidiomycetous capsulate yeast known as an opportunistic
human pathogen that causes cryptococcosis, a life-threatening illness that usually
manifests itself as meningoencephalitis, mainly in immunocompromised patients
(Matsumoto et al., 2007). In addition, Cryptococcus spp. can infect both wild and
domestic animals (Krockenberger et al., 2002) . Cryptococcosis occurs in domestic
animals such as cats, dogs, horses and sheeps (Duncan et al., 2005; Kommers et al.,
2005; Lemos et al., 2007). This microorganism has also been observed in wild animals
such as various bird species, koalas, ferrets, mice, and foxes (Staib et al., 1985;
Casadevall and Perfect, 1998; Carfachia et al., 2006a).
Currently, on the basis of capsular agglutination reactions, phenotypic
differences and molecular studies, C. neoformans have been classified as follows: C.
neoformans var. neoformans (serotype D), C. neoformans var. grubii (serotype A), and
C. gattii (serotypes B, C) (Kwon-Chung et al., 2002).
Cryptococcosis etiological agents have already been isolated in various places in
the world (Australia, India, Colombia, Brazil) from environmental source (Lazéra et al.,
2000; Granados and Castañeda, 2005). Domestic and wild birds are known to act as
possible carriers of pathogenic fungi to humans and others animals (Gründer et al.,
2005; Cafarchia et al., 2006a). In particular, several studies have been carried out on the
occurrence of C. neoformans from bird droppings in psittaciformes (Bauwens et al.,
1986; Nosanchuk et al., 2000), passeriformes (Bauwens et al., 1986), columbiformes
(Bauwens et al., 1986) and falconiformes (Caicedo et al., 1999).
In addition to C. neoformans and C. gattii, other Cryptococcus species have been
found in avian cloacae and droppings, especially C. albidus, C. laurentii and C.
44
uniguttulatus (Rosario et al., 2005; Cafarchia et al., 2006b). As well as Cryptococcus
spp., others pathogenic yeasts, such as Candida spp. and Trichosporon spp., have also
been commonly carried by domestic and wild birds (Grunder et al., 2005; Cafarchia et
al., 2006a).
Over a hundred years have passed since the first description of the Cryptococcus
genus, by Sanfelice in 1895, and much is known about this capsulated yeast, but there
are still many aspects to be investigated, like the interaction of the agent with the host
(Lin & Heitman, 2006). Based on this, our main aim was to investigate the occurrence
of Cryptococcus spp. and other yeast in the cloacae and feces of pigeons. Additionally,
the in vitro antifungal susceptibility profiles of Cryptococcus environmental and human
strains isolated from the same geographic area were compared.
2. Materials and methods
2.1. Sampling collection procedure
Forty seven samples of pigeon droppings were collected (Columbia livia) from
August 2006 to March 2007 in open-air public spaces in the city of Fortaleza, Brazil
(3º30' and 4º30'S and 38º39' WGR), distributed as follows: 11 from two buildings of
Federal University of Ceará, four from a public school and four in the harbor district.
Twenty three feces samples from six pigeon lofts and five samples from two pet shops
were collected. The environmental samples were collected according to the method
described by Filiú et al. (2002). In brief, dried feces were collected in sterile flasks using
spatulas and brushes. The samples were kept under refrigeration (8-12°C) for until 24
hours and transported to the Specialized Medical Mycology Center (CEMM, Federal
University of Ceará, Brazil). The samples were homogenized in a class II biological
45
safety cabinet and approximately 1g was suspend in 50 mL of sterile saline solution
(NaCl 0.9%), added to 0.4g/l of chloramphenicol. After three minutes of mixing in a
vortex and rest for 30 minutes at 25°C, the supernatant was aspirated and 0.1mL was
distributed in Petri dishes containing niger seed agar medium (NSA), supplemented
with 0.2g/L of chloramphenicol, and in minimal synthetic caffeic acid medium
(MSCAM) (Vidotto et al., 2004). The samples were smeared in duplicate, incubated at
28°C and inspected daily until yeast-like colonies (whether or not brown pigmented)
were observed.
The collection of cloacae clinical specimens samples took place between August
2006 and January 2007. The material used for this study consisted of cloacae swabs
from 322 homing pigeons. The birds were randomly sampled from six pigeon lofts and
two pet shops. The cloacal clinical specimen samples of 322 pigeons were collected
using sterile cotton swabs and transported in a sterile saline solution. The swab was
introduced and rotated in the cloacae of each pigeon. The samples were kept at 8°C,
until processing in the laboratory. Then, again in a class II biological safety cabinet,
they were inoculated in Petri dishes containing NSA, supplemented with 0.2g/L of
chloramphenicol, to avoid bacterial contamination, and in Petri dishes with MSCA
(Vidotto et al., 2004). The dishes were incubated at 25°C and inspected daily for ten
days.
In addition, six C. neoformans var. neoformans human clinical strains, isolated
in the city of Fortaleza, Brazil, stored at – 20 °C in the CEMM Culture Collection, were
subcultivated into Sabouraud glucose agar 2% (SGA) and evaluated by auxanogram on
API 20C AUX (BioMérieux, France). After confirmatory results, all strains were tested
by antifungal susceptibility assays.
46
2.2. Mycological culture and identification procedures of Cryptococcus spp.
The dark-brown or black yeast-like colonies grown in NSA and MSCAM,
respectively, were subcultured in Petri dishes containing NSA for purification, and then
they were cultured in SGA and incubated at 25°C for identification by
morphophysiological tests. Fragments of the colonies were examined by microscope
(40X) for morphological analysis, after staining with a solution of cotton lactophenol
The observation of round, regular size, uni or multibrotant yeasts without hyphae or
pseudo-hyphae prompted physiological tests and all the isolates identified as
Cryptococcus spp. were submitted to urease production on Christensen’s Urea Agar
(Milan and Zaror, 2004), observed after 24-48 hours and the color change of the
medium from yellow to pink was deemed to indicate a positive reaction. C. neoformans
biotyping was carried out by canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB) agar growth
test, as described elsewhere (Kwon-Chung et al., 1982). Additionally, Cryptococcus
identification was achieved by API 20C AUX (BioMérieux, France) according to
manufacturer’s instructions.
2.3. Molecular identification of C. neoformans
DNA extraction was performed according to Brilhante et al. (2005), with
modifications. The cells were cultured in SGA for 48 hours at 25 °C. After this period,
sterile normal saline was added to the agar slant and the cultures were gently scraped
with cotton swabs, being harvested by centrifugation at 1000g for 1 min. Afterwards,
the supernatant was discarded and 1mL of lysis buffer (2% CTAB - cetyltrimethyl
ammonium bromide; 100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 0.7M NaCl, 0.2 % ß-
47
mercaptoethanol) was added. The microtubes were incubated at 65°C overnight and
after that, cell debris were submitted to a chloroform/isoamyl alcohol extraction (24:1,
v/v) and centrifugation at 5000 rpm for 20 minutes. The supernatant was mixed with
0.54 vol. of isopropanol and left on ice for 2 hours, followed by centrifugation as
described above. After that, the pellet was washed with 2 mL of 3M NaCl, precipitated
in 3 mL of 70% ethanol and centrifuged at 5000 rpm, for 20 minutes. The DNA pellet
was dried, resuspended in TE buffer (10 mM Tris-Cl; 1 mM EDTA) pH 8.0 and stored
at –20°C.
Molecular typing of Cryptococcus neoformans strains was carried out according
to Enache-Angoulvant et al. (2007). PCR reaction was carried out with a 25�L reaction
volume containing 1X PCR buffer, 2 pmol (each) primers CN-5 (3’GAA GGG CAT
GCC TGT TTG AGA G 5’) and CN-4 (5’ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T 3’)
(Invitrogen, Brazil), 0.5 mM (each) deoxynucleoside triphosphates (equimolar
concentrations of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), and 1 U of Taq polymerase (New
England BioLabs, USA). A touchdown amplification program was performed as
follows: seven minutes at 94°C; three cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 60°C, and 30 s at
72°C; three cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 58°C, and 30 s at 72°C; three cycles of 30 s at
94°C, 30 s at 55°C, and 30 s at 72°C; 28 cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 52°C and 30 s at
72°C; and a final 15-min extension at 72°C. The PCR products were analysed by
electrophoresis in agarose gel (1% in Tris-borate-EDTA buffer) stained with ethidium
bromide (0.5 �L/ml) at 90V for 3 hours.
48
2.4. Mycological culture of other yeasts species
Candida spp. isolates from NSA were subcultured in Petri dishes with Sabouraud
dextrose agar 2% and incubated at 28°C for seven days. The identification was
according to morphological characteristics, biochemical profile and growth in
CHROMagarTM Candida (BD Diagnositics, USA). To determine the yeast
micromorphology, cornmeal-Tween 80 agar plates were streaked and stabbed with a 48-
h-old yeast colony, incubated at room temperature (25°C) for three to five days, to
promote the production of chlamydospores, hyphae and pseudohyphae (Milan and
Zaror, 2004).
Biochemical tests were performed by assimilation method on yeast nitrogen base
(DIFCO, Detroit) containing 2% agar, using disks impregnated with various
carbohydrate sources. Noticeable growth around the disks, after 48 hours of incubation
at 37 °C, indicated assimilation of the respective carbohydrate sources. Fermentation of
sugars was performed by inoculating 0.1 mL quantities of 48h culture suspensions of
test isolates into tubes of fermentation broth containing 2% solutions of each sugar. A
positive result was indicated by the production of acid and gas after 14 days (Milan and
Zaror, 2004).
Identification of Trichosporon sp. was based on to macromorphology
characteristics in SGA, slides cultures on malt extract agar and assimilation of
carbohydrates (De Hoog et al., 2000). Rhodotorula sp. identification of was based on
macromorphology characteristics, assimilation of carbohydrates and urease production,
as described by De Hoog et al. (2000).
49
2.5. Antifungal susceptibility tests
The antifungal susceptibility profile of 13 Cryptococcus spp. environmental
strains from this study, as well as the six C. neoformans var. neoformans human strains,
were evaluated in a broth microdilution method, according to the recommendations of
the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; M27-A2, 2002, formally
NCCLS). C. parapsilosis ATCC 22019 and C. krusei ATCC 6528 were included as
quality controls in both tests with environmental and human clinical strains. A
standardized inoculum (2.5 - 5 x 103 CFU/ml) was prepared by turbidimetry. Stock
inocula were prepared from 2-day cultures grown on potato dextrose agar at 28º C. 2 ml
of sterile saline solution (0.9%) was added to the agar slant, and the cultures were gently
swabbed to dislodge the blastoconidia. The blastoconidia suspension was transferred to
a sterile tube, and the volume adjusted to 4 mL with sterile normal saline. The resulting
suspension was allowed to settle for five minutes at 28º C, and its density was read at
530 nm and adjusted to 95% transmittance. The suspensions were diluted to 1:100, and
then for 1:20 with RPMI 1640 medium with L-glutamine, without sodium bicarbonate
(Sigma Chemical Co., St. Louis), buffered at pH 7.0 with 0.165M
morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma Chemical Co., St. Louis), to obtain
the inoculum size of approximately 2.5 – 5 x 103 CFU/ml.
Stock solutions of caspofungin (CAS; Merck Sharp & Dohme, Brazil),
voriconazole and fluconazole (VRZ; FLC; Pfizer Pharmaceuticals, USA), ketoconazole
and itraconazole (KTC; ITR; Janssen Pharmaceutica, Belgium) and amphotericin B
(AMB; Sigma Chemical Corporation, USA) were prepared in dimethyl sulfoxide; were
prepared in distilled water. All solutions were stored at -80° C until use. So, the drugs
were diluted in RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis), and final concentrations
50
ranged as follows: 0.01 and 16 µg/mL for CAS, VRZ, KTC, ITR, and AMB. For FLC,
the range was 0.06 to 64 µg/mL (CLSI - M27A2, 2002).
The microdilution assay was performed in 96-well microdilution plates. Growth
and sterile control wells were included for each isolate tested. The microplates were
incubated at 37º C and were read visually after two days. All isolates were run in
duplicate and repeated at least twice. For azoles and CAS, the Minimal Inhibitory
Concentration (MIC) was determined as the lowest drug concentration showing 80%
inhibition of fungal growth. For AMB, the MIC was considered to be the lowest
concentration of the drug at which there was no fungal growth, as recommended by
CLSI-M27A2 (2002).
Resistance was defined as MIC ≥ 2 µg/ml against AMB and KTC; MIC > 8 µg/ml
for CAS; MIC ≥ 1 µg/ml for ITR and VRZ; and MIC ≥ 64 µg/ml for FLC (Espinel-
Ingroff, 2003; Souza et al., 2005). The strains resistant to more than one drug were
considered multiresistant (Melo et al., 2003).
2.6. Statistical analysis
Statistical analyses were performed by Wilcoxon Signed Ranks Test and p <
0.05 was considered statistically significant.
3. Results
From the 47 samples of pigeon droppings, 13 (27.6%; p < 0.05) were positive
for Cryptococcus spp. (Table 1), corresponding to four positive origins among 12
studied places (Table 1). Regarding the cloacal clinical specimens, from 322 samples
51
collected, no Cryptococcus spp. was isolated. The species of Cryptococcus more
isolated from pigeon droppings was C. neoformans var. neoformans (n=10; 76.9%),
followed by C. laurentii (n=3; 23.1%).
The other yeasts isolated (n=9) from the cloacae samples were identified as C.
albicans (n=3), C. tropicalis (n=1), Trichosporon sp. (n=3) and Rhodotorula sp. (n=2)
C. albicans (n=9; p < 0.05), C. tropicalis (n=3), C. krusei (n=1), C. parapsilosis (n=1),
Rhodotorula sp. (n=6) and Trichosporon sp. (n=3) were isolated from pigeon droppings
(Table 2).
Regarding to the in vitro antifungal susceptibility, the MIC values for the
Cryptococcus spp. environmental strains, C. parapsilosis (ATCC 22019) and C. krusei
(ATCC 6528), are summarized in Table 3. All 13 Cryptococcus strains studied had a
MIC > 16 µg/mL for CAS. The MIC range for the other drugs tested were as follows:
VRZ, 0.5-0.125 µg/mL; KTC, 1-0.125 µg/mL; ITR, 1-0.25 µg/mL; FLU, 8-32 µg/mL;
AMB, 1-0.125 µg/mL.
The results for the in vitro susceptibility of the six tested drugs against C.
neoformans from human clinical strains, as well as C. papapsilosis (ATCC 22019) and
C. krusei (ATCC 6258) are summarized in Table 4. For CAS, three strains showed MIC
>16 µg/mL and three showed MIC=16 µg/mL. The MIC ranges for the other drugs were
as follows: VRZ, 0.5-0.25 µg/mL; KTC, 1-0.25 µg/mL; ITR, 1-0.25 µg/mL; FLU, 64-
16 µg/mL. For AMB, two strains showed MIC of 0.125 µg/mL and four strains
displayed MIC of 2 µg/mL.
A varied antifungal resistance profile was observed in the studied strains.
Among the environmental strains, resistance was detected in only one of 13 evaluated
samples, which was resistant to ITR (MIC=1�g/mL). However, five of six clinical
samples analyzed were resistant to these antifungal agents as follows: ITR (n=1), FLC
52
(n=3), AMB (n=4). Only among the clinical strains was multiresistance verified, namely
to FLC and AMB (n=2) and ITR and AMB (n=1). As has been observed by others
authors, all environmental and clinical Cryptococcus spp. strains were resistant to CAS.
4. Discussion
C. neoformans has been isolated from various sources in nature. It is commonly
associated with pigeon droppings and less frequently with the droppings of other birds,
such as psittacidae and passeriformes (Caceido et al., 1999; Filiú, 2002). The pioneering
works of Emmons in the early 1950s already referred to the saprophytic relationship of
C. neoformans with organic material rich in bird excreta, particularly dried pigeon
droppings and soil contaminated by them in urban settings (Emmons, 1955).
Despite these findings, some aspects of this association have yet to be clarified,
such as the origin of the fungus in these substrates, since it has not been isolated from
the intestinal tract of these birds, where it probably has difficulty surviving due to
competition from other microbes. Besides this, the fact that birds have a high body
temperature (40 – 42ºC), maintained by the rapid circulation of their blood and cover of
insulating feathers, can help make these animals resistant to the invasion of fungi (Lin
and Heitman, 2006).
Nevertheless, some authors have isolated species of Cryptococcus in the cloacae
of captive pigeons and from the gastrointestinal tracts of birds of prey (Carfachia et al.,
2006b). Seeking to clarify the role of pigeons in disseminating C. neoformans and other
pathogenic yeasts, in this work we performed an active search for these fungi in the
cloacae and feces of pigeons.
53
According to our results, 27.6% of the pigeon feces samples contained
Cryptococcus spp. Studies of this type have been carried out in other places in Brazil,
such as those by Soares et al. (2005). However, they only performed an active search for
C. neoformans in the droppings of urban pigeons, located in public squares in the city of
Santos, São Paulo State, where they proved the presence of C. neoformans. Unlike in
our study, the variety they found was C. neoformans var. grubii. Regarding to C.
laurentii isolated by us from pigeon droppings, this specie is more frequently related
from cloaca samples (Rosario et al., 2005).
Although our main objective was to undertake an active search for Cryptococcus
spp. in the cloacae and feces of pigeons, we identified other pathogenic yeasts from
these sources as well. In both types of samples, Candida was the genus most often
isolated, followed by Trichosporon sp. and Rhodotorula sp. Within the Candida genus,
four species of medical importance were isolated in this study, mainly C. albicans, the
most common of them in animals (Carfachia et al., 2006a).
Candida species isolated here are considered emerging pathogens, especially in
immunocompromised individuals (Nucci and Colombo et al., 2007). Some species of
Trichosporon, as well as Rhodotorula, are reported as causes of opportunistic mycoses
in patients with cancer (Sidrim and Rocha, 2004). Reports of yeasts other than
Cryptococcus in pigeon droppings are scarce. Therefore, this study makes a contribution
to the knowledge of which other yeasts are associated with the excreta of these animals.
From the analysis of the clinical specimens from the cloacae, through which it
was possible to observe the presence of Cryptococcus spp., we can suggest that pigeons
are not direct carriers of these fungi. Nevertheless, they play an important role in
dissemination of these fungi and of other yeasts, through environmental contamination
54
by their feces. Moreover, this study provides a better understanding of the fungal
microbiota present in the feces of these birds.
In this study, Cryptococcus identification was carried out by API 20C AUX test
and PCR amplification of a characteristic gene fragment. However, PCR amplification
was achieved in only four (40%) strains from environmental sources, which suggests
that identification of Cryptococcus should be performed by physiological and molecular
tests simultaneously.
There is known to be an association between pigeon droppings and strains of C.
neoformans (Lin and Heitman, 2006), but the Cryptococcus presence in the cloacae of
these birds is not be clear. Only in studies such as that of Rosario et al. (2005) has their
presence been detected in the bodies of these birds. The most common observation is
the presence of other species of Cryptococcus, such as C. albidus and C. laurentii,
isolated from the cloacae of birds (Cafarchia et al., 2006a). These species are commonly
isolated from the cloacae of birds such as birds of prey (Cafarchia et al., 2006b) and can
be implicated in cases of pulmonary infections, keratitis, fungemias and cutaneous
infections in immunocompromised individuals, and also in immunocompetent people
(Johnson et al., 1998).
The aged feces of these birds present higher positive rates for the presence of C.
neoformans than do fresh droppings, suggesting that the fungus comes from the soil and
dust in the air and propagates in the excreta by environmental contamination (Filion et
al., 2005). Lin and Heitman (2006) state that dried droppings offer a more favorable
substrate because they have fewer bacteria and thus less competition for growth, and
that this can help explain the higher population density of C. neoformans cells in this
substrate. Our studies once again corroborate this idea, because in a previous study at
the start of this research project, we collected fresh feces samples from pigeons and
55
found a high bacterial contamination without growth of C. neoformans. This finding
caused us to thereafter concentrate on samples of dried feces.
An interesting characteristic associated with the excreta of pigeons is the
presence of high concentrations of creatine. Creatine is a nitrogen amine, composed of
two amino acids (glycine and arginine), important as a source of chemical energy,
because it facilitates the transfer of energy within cells (Nardelli et al., 2005). In this
study, two culture media were used for primary isolation of C. neoformans from the
pigeon dropping samples, niger seed agar medium (NSA) and minimal synthetic caffeic
acid medium (MSCAM), but its growth was only observed in the first.
This may have occurred due to the fact that NSA, besides containing diphenol
substrates, permitting the fungus to synthesize melanin pigment and produce brown-
colored colonies, also contains glucose and creatine. Thus, since creatine is a substance
directly related to energy metabolism, it can offer better conditions for the fungus to
grow. On the other hand, although MSCA contains iron citrate and caffeic acid in its
formulation, which also permit the fungus to synthesize melanin and produce dark
colonies, is not efficient in primary isolation, where the fungus needs better nutrient
conditions to develop, because other microorganisms could be present as well.
In this study we observed that besides closed environments, places with busy
circulation of people were also positive for C. neoformans, including one very near a
hospital. The captive animals used were homing pigeons, which were released every
day for training, and the positive sample isolated in feces collected from a pet shop was
from pigeons caught in the street and kept in cages. This once again indicates the role of
these birds in the dissemination of C. neoformans. The contamination that is occurring
really might be environmental, and these animals in some way are contributing by
56
carrying the fungus on their body surfaces, such as the beak and feathers as also
observed to others birds (Gründer et al., 2005).
Regarding the in vitro susceptibility tests, we observed a differentiated
antifungal resistance profile between the human and environmental strains. Among the
environmental isolates, we detected resistance in one of 13 samples studied, which was
resistant to itraconazole (MIC=1�g/ml). Similar studies in the city of Ribeirão Preto,
São Paulo State, showed resistance of C. neoformans var. neoformans to ITR (Pedroso
et al., 2006). Besides ITR, other studies show resistance of environmental strains to
other antifungal drugs tested, such as in the study by Soares et al. (2005), in which out
of eleven isolates of C. neoformans var. grubii, one strain was resistant to FLU.
Researches of Pedroso et al. (2006) also reported antifungal resistance for Cryptococcus
spp. strains of environmental origin.
Resistance was mainly found among the human samples (n=5). Generally the
human strains of C. neoformans and C. gattii are sensitive, in vitro, to AMB
(Pappalardo and Melhem, 2003). However, in this study we found a high number, four
isolates, of clinical strains resistant to AMB. AMB is a drug widely used to treat
cryptococcosis, especially in serious cases, in patients where the infection afflicts the
central nervous and in advanced cases of the disease. The resistance pattern detected in
this study is reason for concern, with possible repercussions in the therapeutic treatment
of patients with cryptococcosis. The resistance to FLC encountered in our clinical
isolates is in line with some findings in the literature. Studies by Fernandes et al. (2003),
analyzing the sensitivity profile in vitro of 60 human strains of C. neoformans against
FLC, ITR and AMB, demonstrated the resistance of four strains to FLU. Reports of the
resistance of strains of C. neoformans and C. gattii to ITR, in turn, are not as frequent as
those to FLU. However, this phenomenon was recently observed in 2.1% of the 48
57
clinical samples of C. neoformans var. grubii and C. gattii evaluated (Tay et al., 2006).
Although these events are infrequent or under-reported, our results reinforce the
question of selection of resistant strains induced by antifungal therapy. Regarding KTC,
although it is not indicated for treatment of neurocryptococosis due to its high toxicity
and the availability of better tolerated therapeutic options, however, we tested it to
evaluate the possibility of cross-resistance with other azolic agents.
Besides this, we detected multiresistance of the human strains to FLC and AMB
(n=2) and ITR and AMB (n=1). This phenomenon regarding strains of C. neoformans
and C. gattii has not been reported in the literature. Information of this nature is very
important, because AMB and FLC are the most widely used drugs to treat
cryptococcosis. These findings could contribute to a better understanding of clinical
cases with slow improvement or unfavorable outcomes, sometimes observed during
treatment of cryptococcosis with these drugs.
In various articles, the majority of the isolates of C. neoformans and C. gattii
have been sensitive to the antifungals tested in this study (Pappalardo and Melhem,
2003). Souza et al., (2005) researched resistance in clinical and environmental strains of
C. neoformans and C. gattii in Brazil, and they could observe that both clinical and
environmental isolates showed the same sensitive profile and did not demonstrate
resistance. However, according to our results and those found by Alves et al., (2001),
human strains of C. neoformans var. neoformans are less sensitive to antifungal agents
than the environmental strains.
In summary, we observed the saprophytic occurrence C. neoformans variety
neoformans, C. laurentii, Candida spp., Trichosporon and Rhodotorula sp., which are
potential pathogens to humans and animals. Moreover, we detected antifungal resistance
both in Cryptococcus from environmental and human sources. Therefore, more research
58
is needed to monitor the antifungal resistance of strains of C. neoformans, in order to
alert the medical-scientific community regarding resistance selection of clinical strains
induced by antifungal therapy.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Specialized Medical Micology Center (CEMM-
Federal University of Ceará, Brazil) for material conditions to carried out this study and
for excellent guidance given. This work was supported by CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Process: 475724/2006-2)
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65
Table 1. Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. laurentii isolated from pigeon
excrement in pigeon lofts.
Location Collected samples (n) Positive samples (n)
Pet shop 1 1 1
Public building 7 6
Pigeon loft 4 4 3
Pigeon loft 6 4 3
Others 31 0
Total 47 13
66
Table 2. Yeasts isolated from pigeon cloacae and droppings.
Yeast species Origin Positive samples (n)
Cloacae Feces
C. neoformans var. neoformans
0 10 10
C. laurentii 0 3 3
C. albicans 3 9 12
C. tropicalis 1 3 4
C. krusei 0 1 1
C. parapsilosis 0 1 1
Trichosporon sp. 3 3 6
Rhodotorula sp. 2 6 8
Total 9 36 45
67
Table 3. Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of azoles, amphotericin B and
caspofungin against Cryptococcus spp. environmental strains.
Isolate MIC (�g/ mL)
CAS VRZ KTC ITC FLC AMB
*CEMM 3-2-074 >16 0.125 0.25 0.5 32 0.25
*CEMM 3-2-066 >16 0.125 0.5 0.25 8 0.25
**CEMM 3-2-065 >16 0.125 0.5 0.5 8 1
*CEMM 3-2-078 >16 0.125 0.25 0.5 8 0.125
*CEMM 3-2-064 >16 0.125 0.25 0.5 8 1
*CEMM 3-2-075 >16 0.125 1 0.25 8 1
**CEMM 3-2-079 >16 0.5 0.5 0.25 32 0.25
*CEMM 3-2-063 >16 0.125 0.125 0.5 16 0.125
*CEMM 3-2-080 >16 0.125 0.5 0.5 8 0.125
*CEMM 3-2-067 >16 0.125 1 0.5 8 0.5
*CEMM 3-2-076 >16 0.125 1 0.5 8 1
*CEMM 3-2-060 >16 0.25 1 1 32 0.25
**CEMM 3-2-058 >16 0.125 0.5 0.25 8 0.25
Candida krusei ATCC 6528 0.25 0.125 0.25 0.5 64 1
Candida parapsilosis ATCC22019 0.5 0.03 0.125 0.5 1 1
*Cryptococcus neoformans;
**Cryptococcus laurentii
68
Table 4. Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of azoles, amphotericin B and
caspofungin against C. neoformans var. neoformans clinical strains.
Isolate MIC (�g/ mL)
CAS VRZ KTC ITC FLC AMB
CEMM 32057 16 0.25 0.5 0.5 32 2
CEMM 32062 16 0.5 0.25 0.5 64 0.125
CEMM 32073 16 0.5 0.5 0.25 64 2
CEMM 32072 >16 0.25 0.5 0.25 16 0.125
CEMM 32068 >16 0.25 0.5 0.5 64 2
CEMM 32069 >16 0.5 1 1 16 2
Candida krusei ATCC 6528 0.25 0.125 0.25 0.5 64 1
Candida parapsilosis ATCC 22019 0.5 0.03 0.125 0.5 1 1
69
Capítulo II
Lectinas como marcadores de Cryptococcus neoformans variedade neoformans: um
destaque para a lectina Dioclea violacea
Ana Karoline Freire COSTA a, Mércia Sindeaux FRUTUOSOd, Cristina Souza
CHAVESd Rossana Aguiar CORDEIRO b, c, Raimunda S. N. BRILHANTE b, Silviane
Bandeira PRACIANO b, Benildo Souza CAVADAe, José J. C. SIDRIM b, Marcos F. G.
ROCHA a, b
A. K. F. COSTA a, *, R. A. CORDEIRO b, c, M. S. FRUTUOSOe, C.C. SOUZAe, R. S.
N. BRILHANTE b, S. B. PRACIANO b, J. J. C. SIDRIM b, B. S. CAVADAd, M. F. G.
ROCHA a, b a Faculty of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Science, State University of
Ceará, Fortaleza – CE, Brazil. b Specialized Medical Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE,
Brazil. c Department of Biology, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. d Departamento of Biochemistry e Molecular Biology, Federal University of Ceará,
Fortaleza-CE, Brazil. e Department of Pathology and Legal Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza-
CE, Brazil.
* Corresponding author: A. K. F. Costa. Rua Major Gerardo Mendes, 646;
Aerolândia. CEP: 60.851-440. Fortaleza, CE, Brazil. Phone: 55 (85) 3257-1921. Fax:
55 (85) 3246-1536. E-mail: [email protected]
Journal of Applied Microbiology
(Reino Unido)
(Em elaboração)
70
Capítulo II
Lectinas como marcadores de Cryptococcus neoformans variedade neoformans: um
destaque para a lectina Dioclea violacea
Resumo - Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada de grande importância
na micologia médica por ser agente etiológico da criptococose, uma infecção fúngica
que acomete homem e animais. O diagnóstico da doença, com alta sensibilidade e
rápidos resultados, pode ser feito por meio da detecção de diferenças no principal
antígeno polissacarídico da cápsula, uma glucuronaxilomanona (GMX). Entretanto, por
serem testes de custos elevados, não são realizados sistematicamente na maioria dos
laboratórios. Este estudo investigou o uso de lectinas como marcadores biológicos de C.
neoformans var. neoformans, através de ensaio de fluorescência direta, utilizando
lectinas marcadas. Para tanto, foram testadas cinco cepas de C. neoformans var.
neoformans e cinco lectinas (Dioclea violacea - DVL, Cratilya floribunda - CFL,
Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr e Dioclea virgata – DVG).
O padrão de marcação das lectinas foi classificado como: +++ (intenso), ++
(moderado), + (discreto) e – (ausente). A lectina DVL foi a que apresentou a melhor
capacidade de ligação nas cepas de C. neoformans var. neoformans, seguida por CFL,
ConBr, DGL e DVG. Desta maneira, conclui-se que as lectinas analisadas,
particularmente a DVL, podem ser utilizadas como marcadores biológicos de células de
C. neoformans var. neoformans. Entretanto, necessitam de mais estudos para definição
do seu papel na sorotipagem de células de C. neoformans e C. gattii.
Palavras-chaves: Cryptococcus neoformans var. neoformans; lectinas; Dioclea violacea;
fluorescência direta.
71
Abstract - Cryptococcus neoformans is a capsulate yeast very important in medical
mycology because it is the etiologic agent of cryptococcosis, a fungal infection that
attacks human and animal. The cryptococcosis diagnostic has high sensitivity, quick
results and can be performed by the detection of some differences on the main capsule
polysaccharide antigen, GMX. However, the disadvantage of this technique is the high
cost, achieved only in specialized centers. This study investigates the lectins ability to
binding C. neoformans cells by direct fluorescence using labeled lectins. For that, five
C. neoformans var. neoformans strains and five lectins (Dioclea violacea - DVL,
Cratilya floribunda - CFL, Dioclea grandiflora - DGL, Canavalia braziliensis - ConBr
e Dioclea virgata – DVG) were tested. The binding pattern was classified as follows:
+++ (intense), ++ (moderate), + (discreet) e – (absent). The DVL was the lectin that
showed better ability to binding to C. neoformans var. neoformans cells, fllowed by
CFL, ConBr, DGL e DVG. Thus, the analyzed lectins can be used as C. neoformans
var. neoformans molecular markers. However, more studies are needed to better
understand the role of those lectins in the typing of C. neoformans and C. gattii.
Key words: Cryptococcus neoformans var. neoformans; lectins; Dioclea violacea; direct
fluorescence
72
1. Introdução Cryptococcus neoformans e C. gattii são leveduras capsuladas de grande importância na
micologia médica por serem capazes de causar a criptococose, uma infecção fúngica
que acomete homem e animais (DUNCAN et al., 2006; QUAZZAFI et al., 2007). O
sítio inicial de infecção geralmente é o pulmão, podendo haver apenas colonização
traqueobrônquica e evoluir por via hematogênica atingindo outros órgãos, com
predileção pelo sistema nervoso central (CRISSEY et al., 1997; LAZÉRA et al., 2004).
A infecção primária em indivíduos imunocompetentes é possível, contudo, ocorre com
maior freqüência em pacientes imunodeprimidos, quando se apresenta como uma
doença grave e potencialmente fatal.
Baseando-se em antígenos específicos da cápsula mucopolissacarídea, C.
neoformans é dividido em duas variedades com seus respectivos sorotipos: C.
neoformans var. neoformans (sorotipo D) e C. neoformans var. grubii (sorotipo A),
enquanto à espécie C. gattii correspondem os sorotipos B e C. Sob essa classificação, a
designação correta para o sorotipo AD ainda não foi definida, entretanto, alguns autores
o consideram híbrido (LIN & HEITMAN, 2006).
Atualmente, o diagnóstico laboratorial da criptococose mais barato e prático,
ainda é a pesquisa direta do fungo no sedimento do líquido cefalorraquidiano (LCR) em
suspensão com tinta da China, o qual pode apresentar sensibilidade de 96,3% em
pacientes com a sídrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) (MOREIRA et al.,
2006). Além do exame direto, também é realizado o isolamento do fungo em meio de
cultivo para a confirmação no espécime clínico, (LAZÉRA et al., 2004).
Opções para o diagnóstico da doença que apresentem alta sensibilidade e rápidos
resultados, além da determinação de sorotipos, baseiam-se na detecção do antígeno
polissacarídico, através da aglutinação de partículas de látex em fluidos corporais (LCR,
soro e urina) ou por meio PCR. (PASCHOAL et al., 2004; MOREIRA et al., 2006). No
entanto, a sorotipagem é realizada apenas em centros de pesquisa especializados, uma
vez que apresenta custo elevado.
Os novos métodos de sorotipagem de C. neoformans devem reconhecer as
propriedades bioquímicas e antigênicas da cápsula polissacarídica do microrganismo,
permitindo a correta identificação de cada sorogrupo. Assim sendo, marcadores
biológicos, não imunológicos, podem ser utilizados para a identificação de sorotipos do
microrganismo. Dentre as várias classes de moléculas com essas propriedades, as
73
lectinas vegetais se destacam por possuírem a capacidade de reconhecimento e ligação
específica, porém reversível a resíduos de açúcares (AMBROSI et al., 2005; KOMATH
et al., 2006). Desta maneira, nosso objetivo foi investigar o uso das lectinas Dioclea
violacea, Cratilya floribunda, Dioclea grandiflora, Canavalia braziliensis e Dioclea
virgata na marcação de células de C. neoformans var. neoformans
2. Material e Métodos
2.1. Cepas
Foram utilizadas cepas de C. neoformans var. neoformans de origem humana,
veterinária e ambiental, isoladas na cidade de Fortaleza, Ceará. As cepas humana (n=1)
e veterinária (n=2) encontravam-se estocadas a – 20 °C em meio Agar Batata na
micoteca do Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM). Enquanto as cepas
ambientais (n=3) analisadas foram isoladas nos estudos feitos por Costa et al., (2007).
2.2. Lectinas
Foram utilizadas as lectinas de Dioclea violacea (DVL), Cratilya floribunda
(CFL), Dioclea grandiflora (DGL), Canavalia braziliensis (ConBr) e Dioclea virgata
(DVG), todas com especificidade para �-D-manose e � -D - glicose, provenientes do
Laboratório BioMol (Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Ceará),
onde foram extraídas, purificadas e conjugadas a marcadores como fluorocromos ou
enzimas segundo metodologia preconizada por Teixeira et al. (2007). As lectinas foram
então armazenadas a 4 °C na concentração de 1mg/ml até o momento do uso.
2.3. Fluorescência direta (FD)
Para o ensaio de fluorescência direta, foi utilizada metodologia preconizada por
Pinheiro (2005) com algumas modificações, cujos passos foram: fixação do fungo,
inibição com açúcar e marcação com lectinas, conforme descrito a seguir.
74
2.3.1. Fixação do fungo
A partir da colônia do fungo com 48 horas de crescimento em Agar Batata, foi
realizada uma suspensão fúngica com 1,5 ml de PBS (tampão fosfato salina) em um
microtubo de 2 ml. Este microtubo foi centrifugado a 1000 rpm por 5 minutos, sendo
este procedimeto realizado três vezes para lavagem das células fúngicas. Em seguida,
aproximadamente 7�l da suspensão de células em PBS foram transferidos para cada
poço das lâminas de fluorescência. As lâminas foram então levadas para estufa à 37 °C
por meia hora para fixação do fungo.
2.3.2. Inibição com açúcar
Com o intuito de comprovar que as lectinas utilizadas estavam realmente
marcando as células, foi incluído no experimento o teste da inibição com açúcar (�-D-
manose). Foram utilizados açúcares específicos para as lectinas estudadas (Biomol-
UFC), que, após serem diluídos em água destilada para a concentração de 1M, foram
estocados a 4 °C. A partir desta solução estoque de açúcar foram preparados 45 µl de
soluções 0,5M e 0,25M com PBS-BSA 0,5% (albumina sérica bovina). Em seguida, a
cada uma destas soluções adicionou-se 5 µl da lectina e então, estas soluções eram
incubadas a 37 °C por aproximadamente 30minutos. Este procedimento foi realizado
para cada lectina.
2.3.3. Marcação com as lectinas
Primeiramente, era feito o bloqueio de ligações não específicas através da
imersão da lâmina, já com o fungo previamente fixado, em solução de PBS-BSA 2% à
37 °C por meia hora. Em seguida, cada lectina era cuidadosamente diluída em PBS nas
proporções de 1:2 e 1:5 a partir da concentração de estoque (1mg/ml). Após o período
de bloqueio das ligações não-específicas, eram adicionados aos respectivos poços da
lâmina: 5 �l de cada lectina já diluída, 5 �l de cada solução destinada à inibição com
açúcar e 5 �l de PBS (controle negativo). As lâminas eram então incubadas em câmara
úmida à 37 °C por 30 minutos. Por fim, decorrido o tempo de incubação, as lâminas
eram lavadas três vezes com PBS por cinco minutos e, uma vez, com água destilada por
1 minuto. Depois de secas, as lâminas eram montadas com glicerina tamponada e
75
lamínulas (24 x 50 mm). A leitura era realizada em microscópio de fluorescência em
câmara escura. O padrão de ligação de cada lectina recebeu os seguintes escores: +++
(intenso), ++ (moderado), + (discreto) e – (ausente). Vale ressaltar que foi incluída no
estudo uma cepa de Candida albicans e o teste foi realizado em duplicata para cada
cepa.
3. Resultados
O padrão de ligação, as células de C. neoformans var. neoformans, das cinco
lectinas testadas, encontra-se sumarizados na Tabela 2. Para a cepa CEMM 32076, na
diluição 1:5, a DVL e DGL foram as únicas lectinas que conseguiram marcar as células
fúngicas, recebendo escores ++ e +, respectivamente, enquanto na diluição 1:2 ,
somente a DVL conseguiu marcar, recebendo escore +.
Já para o isolado CEMM 32078, tanto na diluição 1:5 e 1:2, apenas a DVL
marcou, recebendo escore ++ em ambas as diluições.
Para o isolado CEMM 32061, observou-se que, na diluição 1:5, a DVL recebeu
escore +++ (Figura 1), a CFL, escore ++, a ConBr e DVG, escore + e a DGL, escore -;
na diluição 1:2, a DVL recebeu escore +++, a CFL, escore ++, a DGL e ConBr, escore
+ e a DVG, escore -.
Quanto à cepa CEMM 32074, o seguinte padrão de ligação foi observado: na
diluição 1:5, todas as lectinas conseguiram marcar as células fúngicas, recebendo a
DVL, CFL, e DVG escore ++, enquanto a DGL e ConBr receberam escore +; já na
diluição 1:2, a DVL recebeu escore +++, a DGL e ConBr, escore ++ e a CFL+ e DVG,
escore +.
Por fim, para a cepa CEMM 32069, na diluição 1:5, a DVL apresentou escore
+++, a CFL e ConBr, escore ++, a DGL, escore + e a DVG, escore -, enquanto, na
diluição 1:2, a DVL recebeu escore +++, a CFL, escore ++, a DGL e ConBr, escore + e
DVG, escore -;
Com relação a cepa de C. albicans incluída no estudo, a marcação foi a seguinte:
na diluição 1:5, a DVL, CFL e DGL apresentaram escore + e a ConBr e DVG, escore -;
já na diluição 1:2, a DVL recebeu escore ++, a DGL e ConBr, escore + e a CFL e DVG,
escore -.
No que diz respeito à inibição com açúcar, pôde-se observar que houve inibição
da ligação das lectinas ás células fúngicas, pois se verificou menor intensidade de
76
marcação das células de C. neoformans var. neoformans. Ademais, através do controle
negativo, não foram visualizadas células marcadas.
4. Discussões
A criptococose vem assumindo papel relevante por ser considerada uma das
micoses mais comuns em pacientes imunodeprimidos, particularmente nos portadores
de SIDA (MOREIRA et al., 2006). O diagnóstico do seu agente etiológico é facilmente
realizado através de testes micológicos específicos. Contudo, a determinação dos
sorotipos de C. neoformans e C. gattii não tem sido adotada como uma prática de rotina
laboratorial, fato este, que se deve, especialmente, aos elevados custos dos reagentes
utilizados.
Testes diagnósticos rápidos e específicos para a criptococose são extremamente
importantes para melhor eficácia e rapidez no tratamento, principalmente devido ao fato
do paciente, na maior parte dos casos, já se apresentar imunologicamente deprimido.
Numerosos estudos têm mostrado que a demora na terapia apropriada da criptococose
está associada ao aumento da morbidade e mortalidade (IDNURM et al., 2005).
Além disso, a busca de metodologias que sejam acessíveis e adequadas às
condições de rotina de cada laboratório é de grande interesse para a comunidade
médico-científica, destacando-se como outro ponto importante nas pesquisas. Portanto,
através de nosso trabalho, que se propôs a avaliar o uso de lectinas na marcação de
cepas de C. neoformans var. neoformans pudemos verificar a possibilidade de uma
metodologia alternativa, de custos menos elevados, no estudo da criptococose.
Como se sabe, a sorotipagem de C. neoformans e C. gattii é realizada por meio
de técnicas bem específicas, tais como a detecção do antígeno capsular (NISHIKAWA
et al., 2003), realizada somente nos grandes centros. A reação em cadeia da polimerase
(PCR) também pode ser empregada para este fim, podendo ocasionar falsos resultados.
Estudos conduzidos por nosso grupo de pesquisa mostraram que, através da PCR, não
foi possível realizar a identificação de todos os isolados de C. neoformans avaliados,
sendo necessários testes adicionais para correta identificação.
A reação de aglutinação do látex é considerada uma técnica muito sensível e
específica na detecção desse agente fúngico no líquor, podendo ser utilizada na
detecção, no controle do tratamento da doença e na detecção de recidivas após o
aparente sucesso terapêutico (MOREIRA et al., 2006). Porém, como já foi ressaltado,
77
por ser uma técnica de custo elevado, não se constitui ainda uma prova de rotina
laboratorial. Sendo assim, métodos alternativos vêm sendo estudados, tais como o uso
de lectinas na tipagem de leveduras, conforme os dados obtidos com a nossa pesquisa
com as lectinas D. violacea, C. floribunda, D. grandiflora, C. braziliensis e D. virgata.
Estudos feitos por Muñoz et al. (2001), com intuito de avaliar o uso de lectinas
na tipagem de cepas de Candida, mostraram um modelo de aglutinação de 93 isolados
clínicos de Candida spp. frente a 14 lectinas comerciais de variadas especificidades. Foi
visto que todos os isolados foram aglutinados pelas lectinas Canavalia ensiformis
(ConA), Lens culinaris (LCA) e Pisum sativum (PSA), sendo estas �-D-manose
específicas. Estudos anteriores realmente mostram que tais moléculas de carboidratos
podem estar presentes de maneira abundante na superfície celular de leveduras do
gênero Candida e Cryptococcus (NETH et al, 2000; JACK & TURNET, 2003).
Diferentemente de outros instrumentos, como anticorpos monoclonais, os quais
requerem obtenção laboriosa, as lectinas podem ser obtidas e utilizadas de forma menos
laboriosa, uma vez que, além de apresentarem excelente estabilidade ao calor, não
necessitam de pré-tratamento antigênico e inoculações em animais para obtenção de
antissoro. Nesta perspectiva, nossos dados abrem novos horizontes para
desenvolvimento de metodologias alternativas no estudo na criptococose. Ademais, a
técnica aqui desenvolvida, mostrou simplicidade, além de combinar rapidez e custos
menos elevados do que a imunofluorescência indireta, por exemplo.
As lectinas utilizadas em nosso estudo mostraram diferenças nos padrões de
ligação às cepas de C. neoformans var. neoformans analisadas. De fato, o padrão de
ligação de uma determinada lectina com a superfície da célula fúngica expressa o perfil
bioquímico da parede do fungo estudado (PINHEIRO, 2005). Sendo assim, as
diferenças observadas no padrão de marcação das células fúngicas em nossos achados,
podem ser: devido à distribuição dos açúcares na parede da célula fúngica; à
conformação dos sítios de ligação de cada lectina, bem como da pureza destas.
Em suma, observou-se que a maioria das lectinas aqui estudadas conseguiu
marcar as células de C. neoformans var. neoformans. Contudo, apresentaram diferenças
nos padrões de ligação, sendo a DVL a única lectina que marcou todas as cepas
estudadas. Por fim, destacamos que mais estudos devem ser conduzidos para a definição
do papel destas moléculas na tipagem de células de C. neoformans e C. gattii.
78
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80
Tabela 1. Resultados das lectinas utilizadas na marcação de células de C.
neoformans.
CEPA DVL CFL DGL ConBr DVG
1:5 1:2 1:5 1:2 1:5 1:2 1:5 1:2 1:5 1:2
CEMM
32076
++ + - - + - - - - -
CEMM
32078
++ ++ - - - - - - - -
CEMM
32061
+++ +++ ++ ++ - + + + + -
CEMM
32074
++ +++ ++ + + ++ + ++ ++ +
CEMM
32069
+++ +++ ++ ++ + + ++ + - -
C. albicans + ++ + - + + - + - -
+++ intenso; ++ moderado; + fraco; - ausente
81
Figura 1. Células de C. neoformans var. neoformans (CEMM 32061) marcadas
com DVL.
82
CONCLUSÕES GERAIS
- A partir de excretas de pombos localizados em ambientes urbanos e de cativeiros,
pôde-se observar a ocorrência saprofítica de C. neoformans var. neoformans e C.
laurentii, evidenciando que a manutenção destes animais em cativeiro e o acúmulo de
suas excretas podem contribuir para a dispersão fúngica no ambiente. Ademais, estas
aves podem ser também fontes de outras leveduras potencialmente patogênicas, como,
por exemplo: Candida spp., Rhodotorula sp e Trichosporon sp.;
- O Cryptococcus não é um fungo caracteristicamente endosaprobiótico de pombos,
considerando-se a taxa nula de recuperação do mesmo, a partir de amostras cloacais.
Portanto, esta levedura está presente no meio ambiente e apenas encontra condições
favoráveis para sua sobrevivência nas excretas destas aves;
- Resistência antifúngica está presente em cepas de C. neoformans var. neoformans de
origem ambiental, mas principalmente naquelas de origem humana, sendo necessárias,
assim, mais investigações no sentido de monitorar a resistência antifúngica desta
levedura;
- As lectinas extraídas de Cratilya floribunda, Dioclea grandiflora, Canavalia
braziliensis, Dioclea virgata e, em especial de Dioclea violacea, são capazes de marcar
cepas de C. neoformans var. neoformans.
83
PERSPECTIVAS - O presente trabalho de pesquisa forneceu dados importantes sobre a biologia,
micologia e sensibilidade antifúngica de C. neoformans var. neoformans e C. laurentii,
possibilitando, assim, a formação de uma linha de pesquisa no Centro Especializado em
Micologia Médica, na área de epidemiologia, diagnóstico, sensibilidade antifúngica e
biologia molecular deste gênero.
84
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WILLIAMSON, P.R. Laccase and melanin in the pathogenesis of Cryptococcus neoformans. Frontiers in Bioscience, v.2, p.99-107, 1997.
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ANEXO I
CORANTES
LACTOFENOL AZUL-ALGODÃO OBJETIVO
Fluido de montagem entre lâmina – lamínula para examinar a micromorfologia das colônias fúngicas. COMPOSIÇÃO Ácido lático 20 g Fenol 20 g Glicerina 20 g Azul-algodão 0,05 g Água destilada 20 ml Obs. O azul-algodão pode ser substituído por qualquer azul de metileno. Fundir os cristais de fenol e juntar com as demais substâncias. Esperar 24 horas e filtrar com papel – filtro. Acondicionar em um frasco conta – gotas de cor âmbar. Esse corante pode ser adquirido já preparado sob as denominações Lactophenol cotton blue (BBL) e corante azul-algodão (Newprov). TÉCNICA Colocam-se 2 gotas do lactofenol sobre uma lâmina de microscopia limpa. Retira-se um pequeno fragmento da colônia fúngica a ser estudada, imerginto-o no líquido. Cobrir co uma lamínula e observar ao microscópio óptico na objetiva de 40X. NIGROSINA (TINTA DA CHINA) OBJETIVO É um contracorante usado para visualização microscópica (direto do material clínico ou de culturas) das cápsulas de Cryptococcus neoformans. COMPOSIÇÃO Nigrosina 10 g Solução de formaldeído 10% 100 ml Dissolver a nigrosina na formalina em banho-maria, aquecendo por 30 minutos. Restituir o volume evaporado. Filtrar 2 vezes em papel de filtro e acondicionar num frasco de cor âmbar. TÉCNICA Colocar sobre uma lâmina de microscopia estéril 2 gotas de nigrosina e , sobre estas, 0,1-0,2 ml do material clínico (líquor centrifugado, escarro, dentre outros). Homegeneizar e colocar uma lamínula. Observar ao microscópio óptico.
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SOLUÇÕES SOLUÇÃO SALINA PARA ISOLAMENTO DE CRYPTOCOCCUS SPP. OBJETIVO Isolamento de Cryptococcus spp. a partir de amostras ambientais contaminadas. COMPOSIÇÃO Cloreto de sódio 0,9 g Água destilada 100 ml Cloranfenicol 0,04g PREPARO
Misturar a água destilada e o cloreto de sódio. Autoclavar e distribuir, alíquotas de 10 ml, em tubos de vidro com tampa de roscar. MEIOS DE CULTURA AGAR BATATA OBJETIVO
Usado para realização de microcultivo de fungos filamentosos e estoque de cepas fúngicas. COMPOSIÇÃO Infusão de batatas 500 ml Dextrose 10 g Agar bacteriológico 15 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO
Cozinhar 250 g de batata inglesa (Solanum tuberosum) descascadas em 500 ml de água, por 1 hora. Filtrar a infusão de batatas através de gaze. Restituir o volume inicial de água (500 ml) e acrescentar 500 ml de água destilada. Adicionar o ágar e a dextrose, dissolvendo-os completamente. Autoclavar o meio, por 15 minutos, a 121°C e distribuir, alíquotas de 4 ml, em tubos de vidro. Deixar solidificar, na posição inclinada, de modo a obter uma superfície de aproximadamente 6 cm. Obs.: Esse meio pode ser adquirido comercialmente, na forma desidratada, sob as denominações: Agar batata (DIFCO), Potato dextrose Agar (OXOID) e Agar Pomme-de Terre (Sanofi-Institut Pasteur).
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AGAR ÁCIDO CAFÉICO OBJETIVO
Usado para identificação presuntiva de Cryptococcus neoformans, baseando-se na capacidade dessa espécie em produzir a enzima fenoloxidade a partir do ácido cféico e citrto férrico.
COMPOSIÇÃO Glicose 5g Sulfato de Amônio 5g Extrato de Levedura 2g Fosfato de Potássio 0,8g Sulfato de Magnésio 0,7g Solução de Citrato férrico (2mM) 4ml Ácido Caféico 0,18g Agar bacteriológico 20g Água Destilada q.s.p. 1000ml PREPARO
Dissolver os ingredientes em um béquer, fundir e completar o volume para 1000ml. Autocalvar o meio, por 15 minutos, a 121 °C. Estocar em refrigerador. AGAR ÁCIDO CAFÉICO MODIFICADO OBJETIVO
Usado para identificação presuntiva de Cryptococcus neoformans, baseando-se na capacidade dessa espécie em produzir a enzima fenoloxidade a partir do ácido cféico e citrto férrico, contudo, com menos nutrientes disponíveis que o meio tradicional. COMPOSIÇÃO Solução de Citrato férrico (2mM) 4ml Ácido Caféico 0,18g Agar bacteriológico 20g Água Destilada q.s.p. 1000ml PREPARO
Dissolver os ingredientes em um béquer, fundir e completar o volume para 1000ml. Autocalvar o meio, por 15 minutos, a 121 °C. Estocar em refrigerador. AGAR C.G.B. (CANAVANINA, GLICINA, AZUL DE BROMOTIMOL) OBJETIVO Quimiotipar (Cryptococcus neoformans, diferindo a var. neoformans, que não consegue crescer nesse meio, da var. gattii, que se desenvolve bem na presença da glicina e modifica a cor do meio para azul-cobalto em 48 h-5 dias.
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COMPOSIÇÃO Água destilada 880 ml Solução B 20 ml Solução A 100 ml Agar bacteriológico 20 g PREPARO Preparo da Solução A Glicina 10 g Fosfato de potássio monobásico 1 g Sulfato de magnésio 1 g Sulfato de L-canavanina 30 mg Água destilada q.s.p. 1000 ml Dissolver os ingredientes em um béquer e ajustar o pH para 5,6. Filtrar a solução com um filtro 0,22 µm. Distribuir alíquotas de 100 ml. Estocar em refrigerador. Preparo da Solução B Azul de bromotimol 0,4 g Hidróxido de sódio 0,01 N 64 ml Água destilada 36 ml Preparo da Solução de NaOH 0,01 N NaOH 0,04g Água destilada 100 ml Dissolver o azul de bromotimol em NaOH e adicionar água. Acondicionar em frasco de cor âmbar e manter sob refrigeração. Dissolver completamente o agar em água destilada. Adicionar a solução B. Autocalvar o meio, por 15 minutos, a 121 °C e resfriar até 48°C. Acrescentar 100 ml da solução A, homogeneizar o meio e distribuir, alíquotas de 4 ml, em tubos de ensaio. Deixar solidificar, na posição inclinada, de modo a obter uma superfície de aproximadamente 6 cm. AGAR MALTE A 2% OBJETIVO Utilizado para realizar microcultivo de leveduras do gênero Trichosporon sp. COMPOSIÇÃO Extrato de malte 20 g Peptona 3 g Agar bacteriológico 15 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO Dissolver o extrato de malte, a peptona e o ágar em água destilada sob aquecimento. Homogeneizar e autoclavar, por 15 minutos, a 121°C. Distribuir em placas de Petri e acondicioná-las, sob refrigeração, até o momento do uso.
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O agar malte vendido comercialmente por alguns fabricantes, como a Merck, apresenta, em sua formulação, 3% de malte, sendo essa concentração inadequada para a realização de microcultivo de leveduras do gênero Trichosporon. AGAR NÍGER OBJETIVO Usado para identificação presuntiva de Cryptococcus neoformans, baseando-se na capacidade dessa espécie em produzir a enzima fenoloxidade quando em presença de tirosina e ácido clorogênico contido em algumas sementes, tais como a Guizottia abyssinica, fornecendo ao meio uma pigmentação castanha característica. COMPOSIÇÃO Dextrose 10 g Creatinina 780 mg Clorafenicol 50 mg Difenil 100 mg Extrato de semente de niger 200 ml Agar bacteriológico 20 g Água destilada 800 ml PREPARO Preparo do Extrato de Sementes de Níger (Guizottia abyssinica) Pesar 70 g de sementes de níger pulverizadas em almofariz com pistilo. Suspender em 350 ml de água destilada. Autoclavar, durante 10 minutos, a 121°C. Filtrar através de gaze e acondicionar em frasco estéril. Dissolver o ágar em 800 ml de água destilada, aquecendo-o em banho-maria. Adicionar as demais substâncias, agitando para homogeneizar o meio. Autolcalvar e distribuir em placas de Petri médias ou em tubos de ensaio. Acondicionar, sob refrigeração até o momento do uso. AGAR SABOURAUD 2% OBJETIVO É o principal meio de cultura usando nem micologia. Utiliza-se para o cultivo primário geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns dimórficos), em especial para os dermatófitos, uma vez que as principais características macro e microscópicas desse grupamento fúngico são classicamente descritas a partir do seu crescimento nesse meio. A composição do ágar Sabouraud foi, inicialmente, proposta por Raymond Sabouraud, em 1904, e vem apresentando inúmeras modificações com passar dos anos, com alterações na quantidade de alguns componentes, tais como a dextrose e a adição de substâncias inibidoras, como clorafenicol e a cicloeximida.
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COMPOSIÇÃO CLÁSSICA Peptona 10 g Dextrose 40 g Agar bacteriólico 20 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO Dissolver ágar, peptona e dextrose em água destilada, aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a 121°C. Distribuir, alíquotas de 4 ml, em tubos de ensaio. Deixar solidificar, na posição inclinada, de modo a obter um superfície de 6 cm. AGAR URÉIA DE CHRISTENSEN’S (SÓLIDA) OBJETIVO Utilizado para diferenciar algumas espécies do gênero Trichophyton, como o T. mentagrophytes (que hidrolisa a uréia) e o T. rubrum (que não hidrolisa a uréia). É usado, ainda, para diferenciar as leveduras pertencentes aos filos Ascomycotina (p.ex., Candida sp., que não hidrolisa a uréia) e Basidiomycotina (p. ex., Rhodotorula sp. e Malassezia sp., que hidrolisam a uréia). Esse teste baseia-se na capacidade de determinadas espécies fúngicas de produzir enzima urease, a qual hidrolisa a uréia, liberando amônia e alcalinizando o meio, fazendo com que a coloração do meio passe do amarelo para o rosa-escuro. COMPOSIÇÃO Solução A: Agar base uréia (Christensem’s) 29 g Água destilada q.s.p. 100 ml Suspender o ágar base uréia e, em água destilada, misturar até dissolver completamente. Esterilizar por filtração. Distribuir, alíquotas de 10 ml, e manter, sob refrigeração, até o momento do uso. Solução B: Agar bacteriológico 15 g Água destilada 900 ml Dissolver o ágar em água destilada. Distribuir, alíquotas de 90 ml, em balões de vidro e esterilizar em autocalve, a 121°C , por 15 minutos. PREPARO Para preparar 100 ml de meio, é necessário fundir 90 ml da solução B, esperar esfriar até que a mesma atinja aproximadamente 50°C e adicionar 10 ml da solução A. Homogeneizar bem a mistura e distribuir, alíquotas de 1m l, em tubos de ensaio estéreis. Deixar solidificar na posição inclinada. INTERPRETAÇÃO A leitura desse teste deve ser feita até 96 horas após semado, uma vez que, em longo prazo, com o esgotamento do substrato do meio, os fungos morrem e, conseqüentemente, liberam metabólitos alcalinos que promoverão a viragem da coloração do meio, inutilizando a leitura.
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MEIO DE ASSIMILIAÇÃO DE CARBOIDRATOS (MEIO C) OBJETIVO Analisar a capacidade das leveduras de assimilar diferentes carboidratos. COMPOSIÇÃO Meio basal Ágar bacteriológico 20 g Água destilada q.s.p. 1000 ml Solução estoque de Yest Nitrogen Base Yeast Nitrogen Base (DIFCO) 6,7 g Água destilada q.s.p. 100 ml PREPARO Meio basal Dissolver o aguar em água destilada, aquecendo-o em banho Maria. Autoclavar, por 15 minutos, a 121°C. Distribuir alífquotas de 40 ml. Solução estoque de Yest Nitrogen Base Dissolver o Yeast Nitrogen Base em 100 ml de água destilada e deionizada; esterilizar por filtração. Distribuir, alíquotas de 10 ml, e estocar em frasco de cor âmbar na geladeira. Preparo final do meio Para cada alíquota de 40 ml do meio basal, acrescentar 0,4 ml da solulção-estoque de Yeast Nitrogem Base. Atenção: só acrescentar a solução de Yeast Nitrogem Base quando o meio basal estiver com a temperatura aproximada de 48°C. MEIO PARA ASSIMILAÇÃO DE NITRATO (MEIO N) OBJETIVO Testar a capacidade das leveduras de assimilar fontes inorgânicas de nitrogênio. COMPOSIÇÃO Yest Carbon Base (DIFCO) 12 g Ágar bacteriológico 20 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO Dissolver, por aquecimento, o aguar e o Yeast Carbom Base em água destilada. Distribuir em frascos, alíquotas de 20 ml. Autoclavar, por 15 minutos, a 121°C. Conservar a 4°C.
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MEIO RPMI – MOPS OBJETIVO Meio de cultura padronizado pelo NCCLS, para execução de testes de susceptibilidade a antifúngicos, através da técnica da microdiluição em caldo (documento M-27A, aprovado em 1997). COMPOSIÇÃO RPMI 1640 (com glutamina e sem bicarbonato de sódio) 10,5 g MOPS (ácido 2-[N-morfolino}-propanossulfônico) 34,5 g Clorafenicol 0,5 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO Dissolver os componentes em água destilada. Ajustar o pH final para 7,0 ( com solução de hidróxido de sódio 10 N). Homogeneizar e esterilizar o meio pro filtração. Manter, sob refrigeração, até o momento do uso. O meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) é uma mistura de sais enriquecidos com aminoácidos e vitaminas, sedo quimicamente definido e livre de macromoléculas. Esse meio é fornecido comercialmente, na forma desidratada, em pó ou líquido. Na forma de pó extremamente higroscópico, dev ser vem protegido do meio ambiente, especialmente de lugares úmidos. Não são recomendadas preparações com concentrações maiores do que as preconizadas pelo fabricante, devido à grande possibilidade de formação de precipitados. URÉIA RÁPIDA EM CALDO OBJETIVO É usada para diferenciar, rapidamente, as leveduras pertencentes aos filos Ascomycotina (p. ex., Rhodoturula sp. e Malassizia sp., que hidrolisam a uréia). COMPOSIÇÃO Extrato de levedura 0,1 g Fosfato de potássio monobásico 0,091 g Fosfato dissódico 0,095 g Uréia 20 g Vermelho fenol 0,01 g Água destilada q.s.p. 1000 ml PREPARO Reidratar o extrato de levedura em 5 ml de água destilada. Repetir o mesmo procedimento com o fosfato de potássio monobásico e o vermelho fenol. Dissolver a uréia emáuga destilada. Misturar todas as soluções e completar o volume final de água para 1000 ml. Aferir o pH final, que deve se 6,9±0,2. Esterilizar por filtração. Distribuir, alíquotas de 0,5 ml, em tubos de ensaio estéreis. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO Após semear o fungo a ser estudado, incubar os tubos, por 4 horas, em estufa a 37°C, realizando leituras com 10, 30, 60 minutos e 4 horas. Se a cor do meio
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permanecer laranja, o resultado é interpretado como negativo e, se houver uma viragem para rosa-escuro, o resultado é positivo.
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