UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS ... · Marcello Otake Sato, que acreditaram em mim e guiaram meus primeiros passos na vida ... ultrastructural analysis by transmission

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VETERINÁRIAS

SIMONE VIEIRA CASTRO

CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES

FORTALEZA 2011

SIMONE VIERA CASTRO


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Co-orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo

FORTALEZA 2011

Xxxxx Castro, Simone Vieira

Criopreservação De Tecido Ovariano Caprino: Eficiência De Diferentes Agentes Crioprotetores /Simone Vieira Castro – Fortaleza, 2011.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Dissertação de Mestrado (Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.

1. Folículo pré-antral. 2. Solução de congelação. 3. Agente

crioprotetor.

SIMONE VIEIRA CASTRO


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.

Aprovada em:____/____/____

BANCA EXAMINADORA

___________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues

Universidade Estadual do Ceará (Orientadora)

__________________________ Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo

Universidade Estadual do Ceará (Co-orientador Examinador)

__________________________ Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci

Universidade de Brasília (Examinadora)

Aos meus pais, Diomar Felicíssimo de Castro

e Maria Divina Vieira da Mota Castro.

Dedico

17

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-gaduação

em Ciências Veterinárias (PPGCV), que me proporcionou a realização de um curso de

pós-graduação de reconhecida qualidade.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pelo suporte financeiro por meio da concessão da bolsa.

À banca examinadora, por ter aceitado prontamente o convite, sobretudo pela

colaboração na correção deste trabalho.

À Dr. Ana Paula Ribeiro Rodrigues e Dr. José Ricardo de Figueiredo, pela

orientação na realização deste trabalho, pela oportunidade e pela confiança em mim

depositada. Obrigada por todos os ensinamentos.

Ao professor Dr. Cláudio Cabral Campello, tanto pelo precioso auxilio na

análise estatística, quanto pela dedicação e atenção sempre que solicitado.

Ao professor Dr. Kalil Skeff e seu filho Murad Skeff, por me acolherem

carinhosamente e pelo privilégio de fazer parte da família Skeff durante minha estadia

em Brasília.

Aos companheiros do instituto de ciências biológicas da UnB, Dra. Carolina

Madeira Lucci, Dra. Sônia Nair Báo, Natalia Lemos Chaves, Felipe Coutinho, Misléia

Rodrigues e Ingrid Gracielli, que demonstraram como é importante a parceria entre

instituições no mundo acadêmico.

Aos professores Dra. Tânia Vasconcelos, Dra. Helciléia Dias Santos e Dr.

Marcello Otake Sato, que acreditaram em mim e guiaram meus primeiros passos na vida

acadêmica.

A todos os membros da equipe LAMOFOPA que me deram apoio e

contribuíram de forma direta ou indireta para a execução deste trabalho. Em especial a

18

Luciana Rocha Faustino, pelo apoio e grande amizade desde minha chegada à Fortaleza.

À Adeline de Andrade Carvalho, inseparável companheira de bancada nesta árdua

caminhada, muito obrigada.

À minha “família cearense” Cleidson Manoel Gomes da Silva, Liliane Moreira

Silva e Oscar Oliveira Brasil, pelo apoio indispensável, por todas as horas

compartilhadas em nosso “lar” e pela grande amizade.

Agradeço imensamente a toda minha família que sempre me deu força e

carinho para suportar a saudade e superar a enorme distância que nos separa. Aos meus

amados pais Diomar e Divina, meus primeiros e eternos mestres, pelo amor infinito,

apoio incondicional, por me ensinarem as lições mais valiosas e importantes da vida que

me permitiram chegar até aqui. Agradecimento mais que especial aos meus queridos

irmãos Diogo e Eudes Vieira Castro, que sempre me protegeram e dos quais sinto

imenso orgulho e admiração.

Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para

esta conquista. Muito obrigada!

19

“Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo

para a vitória é o desejo de vencer.”

Mahatma Gandhi

20

RESUMO A criopreservação de tecido ovariano tem sido alvo de intensos estudos com finalidade

de auxiliar na tecnologia de reprodução assistida em animais e humanos. Para o sucesso

da criopreservação, a composição da solução de congelação, especialmente o agente

crioprotetor intracelular utilizado, é de fundamental importância. Desta forma, o

presente trabalho teve por objetivo definir uma solução de congelação lenta para o

tecido ovariano caprino. Para isso, foram realizados dois experimentos. No experimento

I, fragmentos de córtex ovariano de cabras foram submetidos à congelação lenta na

presença de 12 diferentes soluções contendo 1,0 M de etilenoglicol (EG), propanodiol

(PROH) ou dimetilsulfóxido (DMSO) como agentes crioprotetores intracelulares,

associados ou não à sacarose e/ou soro fetal bovino (SFB). No experimento II,

fragmentos previamente congelados em soluções contendo DMSO suplementado ou não

com sacarose e/ou SFB foram submetidos ao cultivo in vitro por 48 horas. Para

avaliação folicular pós-descongelação foi utilizada a histologia clássica e teste de

viabilidade por marcadores fluorescentes (etidio homodimero-1 e calceína-AM), nos

experimentos I e II, além da análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de

transmissão no experimento II. No tocante à análise estatística do efeito dos diferentes

agentes crioproterores e a interação com os suplementos foi utilizada ANOVA seguida

de teste SNK, enquanto os dados referentes à viabilidade foram comparados pelo teste

Qui-quadrado. Os valores foram considerados significativos quando p<0,05. O

experimento I demonstrou que apenas as soluções contendo DMSO foram capazes de

manter a morfologia folicular semelhante à observada no tecido fresco. Não foram

observadas diferenças entre o percentual de folículos morfologicamente normais no

tecido somente criopreservado e criopreservado seguido do cultivo in vitro. A análise da

viabilidade realizada após o cultivo in vitro de tecido ovariano revelou que apenas a

solução de congelação composta por DMSO adicionado de SFB (75,6%) foi capaz de

manter o percentual de folículos viáveis semelhante ao verificado no tecido cultivado

sem prévia congelação (89,3%). Folículos pré-antrais caprinos considerados

morfologicamente normais após a análise ultraestrutural foram encontrados somente em

tecido ovariano fresco, cultivado sem prévia congelação e congelados com

DMSO+SFB. Em conclusão, a solução de congelação composta por DMSO associado

ao SFB garantiu a manutenção da viabilidade, bem como da ultraestrutura folicular após

48 horas de cultivo in vitro.

Palavras-chave: Folículo pré-antral. Solução de congelação. Agente criprotetor.

21

ABSTRACT

The cryopreservation of ovarian tissue has been the target of intense study with the

purpose of assisting in the technology of assisted reproduction in animals and humans.

For the success of cryopreservation, the composition of the freezing solution, especially

the intracellular cryoprotectant agent used is of fundamental importance. Thus, this

study aimed to define a solution for slow freezing of ovarian tissue goat. For this, two

experiments were conducted. In experiment I, fragments of goat ovarian cortex were

subjected to slow freezing in the presence of 12 different solutions containing 1.0 M

ethylene glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO) as

intracellular cryoprotectants, associated or not sucrose and / or fetal calf serum (FCS).

In experiment II fragments previously frozen in solutions containing DMSO

supplemented or not with sucrose and / or FCS were cultured in vitro for 48 hours. To

assess follicle after thawing was used histology and viability test by fluorescent markers

(ethidium homodimer-1 and calcein-AM) in experiments I and II, in addition, to

ultrastructural analysis by transmission electron microscopy in experiment II regarding

the statistical analysis, the effect of different cryoprotectant agents and interaction with

supplements was used ANOVA followed by SNK test, while data concerning the

viability were compared by chi-square. Values were considered significant when p

<0.05. The first experiment showed that only solutions containing DMSO were able to

maintain follicular morphology similar to that observed in fresh tissue. No significant

differences were observed among the percentage of morphologically normal follicles in

ovarian tissue cryopreserved before and after in vitro culture. After in vitro culture of

ovarian tissue, the viability analysis showed that only the freezing solution composed by

DMSO and FCS (75.6%) maintained the percentage of viables follicles similar to that

observed after culture without cryopreservation (89.3%). Preantral follicles considered

morphologically normal after ultrastructural analysis were found out in the fresh

control, fragments cultured before and after cryopreservation with DMSO and FCS. In

conclusion, the freezing solution containing DMSO and FCS guarantee the maintenance

of viability as well as the follicular ultrastructure after short-term in vitro culture.

Key-words: Preantral follicle. Freezing solution. Cryoprotectant agente.

22

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído

desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina

glioxilato aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase) –

Adaptado de Corley et al. [25]........................................................................................ 70

Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído

desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase)..................... 71

Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al.

[75].................................................................................................................................. 72

Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabólicos.......................... 73

Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo

criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et

al.,[91])........................................................................................................................... 74

CAPÍTULO 2

Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green flourescence)

(A) and non-viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer-1 (red

fluorescence) (B)…………………………………………………………………..… 101

Figure 2 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles before

(fresh control) and after slow-freezing. *Differs significantly from the fresh control (P <

0.05)………………………………………………………………………………….. 101

Figure 3 Goat preantral follicles from the fresh control (A, B) and cultured control (C,

D). In A, a well-preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells

and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high

magnification, note that ooplasm is finely granular and the mitochondria are well-

23

preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in

ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC:

granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; *

vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C) 1µm (B, D)………………………………………… 102

Figure 4 Goat preantral follicles after cryopreservation with freezing solution containing

DMSO alone (A, B) and DMSO added by sucrose (C, D), fetal calf serum alone (E, F)

or fetal calf serum in combination with sucrose (G, H), followed by in vitro culture for

48 h. In A, normal granulosa cells are showed; however a vacuolated ooplasm can be

observed. In B and C, note alterations as detachment between granulosa cells and

oocyte, in D irregular mitochondria and swollen endoplasmic reticulum are showed in

the oocyte, besides the nuclear membrane thickening. (E) Note normal ooplasm finely

granulated and abundant organelles. (F) Intact nuclear membrane and normal

mitochondria and endoplasmic reticulum. (G) Normal granulosa cell and oocyte with an

irregular nucleus. (H) Oocyte with swollen mitochondria and vacuolated ooplasm. GC:


vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C, E, G) 1µm (B, D, F, H)............................................. 103

24

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1: Principais resultados com a utilização de diferentes agentes crioprotetores na

criopreservação de tecido ovariano e oócitos................................................................. 75

CAPÍTULO 2

Table 1 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in goat

ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by

short-term in vitro culture (48 h). *Differs significantly from the fresh control (P <

0.05)………………………………………………………………………………..… 105

Table 2 Percentage (mean ± SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48

h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose

and/or fetal calf serum. a,b,c Differs significantly (P < .05)………………………...... 105

25

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C – Graus Celsius

a.c. – Antes de cristo

Ac. – Acido

ACP – Agente(s) crioprotetor(es)

ADH – Álcool desidrogenase

AGAT – Alanina glioxilato aminotrasferase

ALDH – Aldeído desidrogenase

AM – Grupamento acetoximetil

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico

AO – Aldeído oxidase

ATP – Adenosina trifosfato

BSA – Albumina sérica bovina

Ca2+ - Cálcio

cm - Centímetros

CO2 – Gás carbônico

CPA – Cryoprotectant agent

DMS - Dimetilsulfuro

DMSO - Dimetilsulfóxido

DMSO2 - Dimetilsulfona

DNA – Ácido desoxirribonucléico

EG - Etilenoglicol

FSC – Fetal calf serum

g - Grama

GD- Glicolato desidrogenase

GLI - Glicerol

GLM – General linear models

GLUr – Glutationa reduzida

GO – Glicolato oxidase

h – Hora(s)

HE – Hematoxylin - eosin

HEPES – Ácido (N-[2-Hidroximetil] Piperazina-N`-[2-Etanosulfônico]4-(2-

hydroxythyl)

26

HMEM- Meio essencial mínimo tamponado com HEPES

ITS- Insulina transferrina selênio

K+ - Potássio

kg- Quilograma

kV – Quilo volts

LDH – Lactato desidrogenase

M - Molar

MAPK – Proteína quinase ativadora de mitose

MEM - Meio essencial mínimo

MET – Microscopia eletrônica de transmissão

mg – Miligrama

min – Minuto(s)

ml - Mililitro

mM - Milimolar

mm3- Milímetro cúbico

MOIFOPA – Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais

MPF – Fator promotor de mitose

MSM - Metilsulfonilmetano

Na+ - Sódio

pH – Potencial hidrogeniônico

PROH - Propanodiol

SAC - Sacarose

SAS – Statistical analysis system

SD – Standard deviation

SFB – Soro fetal bovino

SH – Soro humano

SSS – Substituto sintético do soro

TEM – Trasmission electron microscopy

v:v – Volume/volume

µl – Microlitro

µm – Micrômetro

µmol - Micromolar

27

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 16

2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 17

2.1 Ovário dos mamíferos: organização morfológica e

folicular.............................................................................................. 17

2.2 Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido

ovariano............................................................................................. 19

2.3 Agentes crioprotetores...................................................................... 20

2.3.1 Agentes crioprotetores intracelulares...................................... 20

2.3.2 Agentes crioprotetores extracelulares ..................................... 21

2.4 Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação.................. 22

2.5 CAPITULO 1. (Agentes crioprotetores intracelulares: características

e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos) ................ 25

3. JUSTIFICATIVA............................................................................................... 75

4. HIPÓTESE CIENTÍFICA................................................................................. 77

5. OBJETIVOS ....................................................................................................... 78

5.1 Geral....................................................................................................... 78

5.2 Específicos.............................................................................................. 78

6. CAPÍTULO 2. (Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf

serum maintains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after

cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue)………………………... 79

7. CONCLUSÕES……………………………………………………………… 104

8. PERSPECTIVAS……………………………………………………………… 105

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………… 106

APÊNDICE A…………………………………………………………………… 128

1 INTRODUÇÃO

A biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos ovariano pré-antrais

(MOIFOPA) compreende três diferentes processos: o isolamento, a preservação e o

cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2008). O isolamento

folicular já está bem estabelecido, enquanto que a preservação e o cultivo ainda

necessitam de ajustes para a determinação de um protocolo ideal a fim de que se possa

obter oócitos viáveis e competentes, aptos a serem fertilizados e produzirem embriões in

vitro. Especificamente, com relação à preservação, que é o tema principal desta

dissertação, essa técnica pode ser realizada por um período curto (resfriamento) ou

prolongado (criopreservação). A criopreservação é uma ferramenta de grande interesse

para a reprodução assistida, uma vez que a preservação de gametas femininos pode

assegurar a conservação de espécies animais, além de ser uma estratégia para

possibilitar a restauração da fertilidade, por meio de transplante, tanto na espécie

humana (BEDAIWY & FALCONE, 2004) como em linhagens especiais de animais de

laboratório (camundongo:LIU et al, 2008) ou de produção (ovino: BORDES et al

2005).

De um único ovário podem ser recuperados milhares de folículos pré-antrais, e

consequentemente os oócitos neles contidos. Esta prática seria uma fonte

potencialmente rica de material genético para a reprodução animal se os oócitos

pudessem ser preservados e, posteriormente, crescidos e maturados após cultivo

folicular in vitro visando a produção in vitro de embriões. Contudo, não é possível, em

um único momento, a manipulação da totalidade de folículos pré-antrais que se pode

recuperar de um único ovário (35.000/ovário caprino – LUCCI et al., 1999) sem

comprometer a viabilidade folicular. Portanto, o desenvolvimento de protocolos para a

preservação desses folículos é de fundamental importância com o intuito de permitir a

implantação de bancos de reservas genéticas, até que sejam desenvolvidos protocolos

ideais capaz de promover o completo desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro.

Neste contexto, vários protocolos de criopreservação de tecido ovariano, utilizando

a congelação lenta, têm sido empregados no intuito de assegurar a viabilidade de

folículos pré-antrais após criopreservação do tecido ovariano de animais domésticos

(ovino: PINTO et al., 2008; caprino: LUZ et al., 2009; bovino: CELESTINO et al.,

2008). Entretanto, um protocolo eficiente para tecido ovariano caprino ainda não foi

17

desenvolvido e muitas questões referentes à criopreservação de folículos pré-antrais

ainda precisam ser elucidadas, como por exemplo, o efeito da associação de

crioprotetores intracelulares aos extracelulares e a adição de macromoléculas à solução

de criopreservação.

O presente trabalho inicialmente apresenta uma descrição geral sobre o ovário

mamífero e a estrutura folicular; criopreservação de tecido ovariano; agentes

crioprotetores, bem como a avaliação de folículos ovarianos pré-antrais criopreservados.

Esse estudo também traz uma vasta revisão a cerca dos “Agentes crioprotetores

intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e

oócitos”. Além disso, a contribuição científica para o campo da criopreservação de

material genético de fêmeas, utilizando o ovário caprino como modelo experimental.

2 - REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Ovário dos mamíferos: Organização morfológica e folicular

O ovário mamífero não é apenas a gônada feminina que contém o suprimento

de células germinativas para produzir as próximas gerações (função exócrina ou

gametogênica-produção e liberação dos gametas), mas é também a glândula reprodutiva

feminina que controla alguns aspectos do desenvolvimento e fisiologia da fêmea, como

a produção de esteróides sexuais - esteroidogênese (EDSON et al., 2009). A

organização básica dessa gônada é estabelecida nas fases iniciais da organogênese,

durante a vida fetal, com exceção dos roedores, em que, especificamente a formação de

folículos ovarianos é verificada até um curto período de tempo após o nascimento

(FORTUNE, 1994).

Na maioria das espécies, histologicamente são observadas duas regiões, uma

interna (medular) e uma região externa, denominada cortical. A região medular é

constituída por tecido fribroelástico distribuído de forma irregular, algumas células

musculares lisas, feixes nervosos, vasos linfáticos e sanguíneos que adentram o córtex

ovariano e são responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ & HAFEZ,

2004). A região cortical contém inúmeros folículos ovarianos em diferentes estádios de

desenvolvimento, corpos hemorrágicos, lúteos, albicans e uma população de células

mesenquimais pouco diferenciadas, muito semelhantes às células mesenquimatosas

embrionárias, que podem sofrer grandes e complexas modificações durante a vida

18

reprodutiva. Estas últimas se diferenciam em células da teca interna e externa e são de

fundamental importância na esteroidogênese.

O folículo ovariano corresponde à unidade morfológica e funcional do ovário e

é constituído essencialmente por um oócito circundado por células foliculares

(granulosa) e demarcado por uma membrana basal (FORTUNE, 1994), que os separa do

estroma ovariano, e tem como principal função proporcionar um ambiente ideal para o

crescimento e maturação do oócito (GORDON, 1994). De acordo com características

morfológicas, os folículos ovarianos podem ser divididos em folículos pré-antrais ou

folículos antrais (GONÇALVES et al., 2002). Os folículos pré-antrais são

caracterizados pela ausência de cavidade antral e podem ser classificados em

primordiais, transição, primários e secundários de acordo com o estádio de

desenvolvimento. Os folículos primordiais, que se encontram em um estágio de

quiescência (CORTVRINDT & SMITZ, 2001), são considerados reservatórios de

gametas femininos (QU et al. 2000) e são caracterizados pela presença de uma camada

de células da granulosa em formato pavimentoso. Já os primários e secundários são

considerados folículos em estágios iniciais de crescimento e, são caracterizados pela

presença do oócitos circundado por uma ou mais camadas de células de granulosa de

formato cúbico, respectivamente (FIGUEIREDO et al.., 2008).

Por outro lado, os folículos que apresentam uma cavidade repleta de líquido

folicular, denominada antro, pertencem à categoria de folículos antrais, sendo

subdivididos em folículos terciários e pré-ovulatórios. Em ambas as classes, os folículos

possuem um oócito circundado pela zona pelúcida, células foliculares, uma cavidade

contendo líquido folicular, membrana basal e as camadas de células da teca interna e

externa. Especificamente, os folículos pré-ovulatórios apresentam uma ampla cavidade

antral e um oócito apto a retomar a meiose e completar a maturação, ou seja, passar do

estádio de prófase I para metáfase II (BARNETT et al., 2006).

Estudos têm demonstrado que cerca de 90% dos folículos ovarianos

encontram-se na fase de folículos pré-antrais, sendo a grande maioria (95%)

representada por folículos primordiais (SAUMANDE, 1991). Os folículos antrais, por

sua vez, representam apenas aproximadamente 10% de toda a população folicular do

ovário e são extremamente susceptíveis à morte folicular (FIGUEIREDO et al., 1995).

De maneira geral, em primatas e ruminantes a quantidade de folículos presentes em

19

cada ovário é estabelecida ainda durante a vida fetal sendo possível encontrar, já ao

nascimento, a presença de folículos em estádios iniciais de desenvolvimento (primário e

secundário) e pequenos folículos antrais, porém, devido à afuncionalidade do eixo

hipotálamo-hipose-gonadal não progridem para estádios mais avançados antes da

puberdade (BETTERIDGE et al., 1989). No entanto, Bukovsky et al. (2004)

demonstraram possíveis mecanismos que indicam a formação de folículos ovarianos em

mulheres adultas.

O número total de folículos por ovário varia entre espécies, sendo de

aproximadamente 1.500 na camundonga (SHAW et al., 2000); 33.000 na ovelha

(AMORIM et al., 2000); aproximadamente 2.000.000 na mulher (ERICKSON et al.,

1986) e 35.000 folículos pré-antrais na cabra (LUCCI et al., 1999). Porém a população

de folículos pode variar também em função de fatores como raça, genética (SMITH et

al., 1993), idade (ROY & TREACY,1993) e estado reprodutivo do animal (ERICKSON

et al., 1986). Desta forma, considerando a abundância de folículos pré-antrais presentes

no tecido ovariano, aliada às características intrínsecas que favorecem à criotolerância,

como baixa taxa metabólica, tamanho reduzido e ausência de zona pelúcida, a

criopreservação de oócitos nesta fase representa uma alternativa promissora para a

preservação de gametas femininos (AMORIM et. al., 2003).

2.2 Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido ovariano

A conservação do tecido ovariano, e consequentemente dos folículos pré-

antrais nele presente, tem atraído o interesse de clínicos e pesquisadores, visto que a

eficiente criopreservação do tecido ovariano possibilitaria um grande avanço para a

reprodução assistida animal e humana. O tecido ovariano previamente criopreservado

pode ser utilizado em auto e xenotransplante, possibilitando a retomada das funções

endócrina e gametogênica (LIU et. al., 2008). Além disso, pode ainda ser destinado ao

cultivo in vitro dos folículos pré-antrais isolados (GOSDEN et. al., 2002), sendo uma

alternativa de grande interesse para mulheres acometidas de câncer, evitando, portanto,

a reintrodução de células malígnas, o que é possível ocorrer após transplante (AMORIM

et al., 2009).

A criopreservação consiste na conservação de material biológico a

temperaturas ultra-baixas, com o objetivo de garantir a permanência das células em uma

20

baixa taxa metabólica durante um período de estocagem indeterminado, do qual possam

ser resgatadas e continuar o seu desenvolvimento (PEGG, 2007) e função normais após

o processo de descongelação. Para tanto, o material é armazenado geralmente em

nitrogênio líquido a –196°C. Porém, para garantir as propriedades estruturais e

funcionais normais de um material biológico que foi submetido a um protocolo de

criopreservação, é necessário considerar cuidadosamente alguns fatores como a

composição da solução de criopreservação, especialmente no que compete à escolha do

tipo e concentração do agente crioprotetor intracelular utilizado, bem como, a

associação com crioprotetores extracelulares.

Outro fator que deve ser levado em consideração no estabelecimento do

protocolo de congelação é o tipo e organização estrutural do material a ser

criopreservado. Assim, o desenvolvimento de protocolos para congelação de tipos

celulares isolados em suspensão, como espermatozóides, oócitos ou embriões, torna-se

relativamente menos complexo, quando comparado com a congelação de tecidos ou

folículos, visto que estes são formados por diferentes tipos celulares (NEWTON et al.,

1998). No entanto, a congelação de folículos isolados apresenta entraves tanto em

decorrência dos possíveis danos causados pelo próprio método de isolamento, como

pela perda de viabilidade, pelo elevado tempo de manipulação. Embora alguns estudos

visem desenvolver protocolos de criopreservação de folículos pré-antrais isolados (DE

LA PEÑA et al., 2002; AMORIM et. al., 2003), a maneira mais prática e rotineiramente

adotada, que possibilita a conservação de uma grande quantidade de folículos pré-

antrais, é a criopreservação do tecido ovariano.

2.3 Agentes crioprotetores

Os agentes crioprotetores (ACP) são solventes orgânicos, utilizados sozinhos

ou em associação, que agem protegendo a célula durante o período de estocagem em

baixas temperaturas, prevenindo-a dos danos causados pela formação de gelo

intra/extracelular ou choque osmótico (HAN et al., 2009). Esses agentes podem ser

classificados em intracelulares (penetrantes) ou extracelulares (não penetrantes).

2.3.1 Agentes crioprotetores intracelulares

Os ACP intracelulares possuem baixo peso molecular e têm a capacidade de

21

substituir a água presente no espaço intracelular. De modo geral, os ACP que têm

demonstrado melhor eficiência na manutenção da viabilidade e características

estruturais e ultraestruturais de folículos pré-antrais após criopreservação são o

etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e propanodiol (PROH). Apesar dos

benefícios obtidos com a utilização dos ACP, a eficiência dessas substâncias pode variar

com as características inerentes ao próprio ACP (tipo, concentração e tempo de

exposição) ou inerentes ao material biológico (tipo celular ou tecidual, estádio de

desenvolvimento da estrutura e espécie animal). Além disso, a toxicidade do ACP não

pode ser negligenciada e é um dos fatores limitantes para o sucesso de um protocolo de

conservação. A estrutura, metabolização e mecanismos tóxicos, bem como a utilização

dos principais agentes crioprotetores utilizados estão descritos no capitulo I desta

dissertação.

2.3.2 Agentes crioprotetores extracelulares

Visando otimizar a eficácia das soluções de congelação, frequentemente são

utilizadas substâncias que, apesar de não penetrarem na célula, auxiliam no processo de

criopreservação. Muitas macromoléculas possuem ação crioprotetora comprovada,

conferindo maior estabilidade à célula quando esta é exposta a baixas temperaturas

(EROGLU et al., 2009). Estas substâncias possuem a capacidade de preservar a

integridade estrutural e funcional da membrana celular (HUANG et al., 2008) devido à

interação com proteínas e glicoproteínas de membrana (DUNAN e FORD-LLOYD,

2004).

Dentre os crioprotetores extracelulares, a sacarose, carboidrato composto por

uma frutose e uma glicose, é utilizada com bastante freqüência nas soluções de

criopreservação, pois além de sua capacidade crioprotetora, essa substância age como

um tampão osmótico contra o estresse celular causado durante a adição e remoção do

crioprotetor intracelular (MANDELBAUM et al., 1988). A sacarose já foi utilizada com

sucesso na crioproteção de oócitos caprinos (SHARMA et al., 2006) e humanos

(COTICCHIO et. al., 2006); tecido ovariano de diferentes espécies (caprino: SANTOS

et al., 2006a; ovino:CECCONI et al., 2004; ONIONS et al 2008; bovinos: LUCCI et al.,

2004; humanos: KEROS et al., 2009). A adição de sacarose à solução de congelação

aplicada a oócitos humanos tem demonstrado ser eficiente, resultando em altas taxas de

22

sobrevivência, melhor preservação da configuração do fuso e dos cromossomos, bem

como obtenção de embriões de qualidade superior (BARRITT et al., 2007;

PARMEGIANI, et al., 2008). Do mesmo modo, Santos et al. (2006b) observaram que a

adição de sacarose ao meio de congelação contendo EG é benéfica para manutenção da

viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano caprino.

Outro componente amplamente utilizado nas soluções de congelação é o soro

fetal bovino (SFB). Sua composição não é bem definida e varia em função do sexo,

idade e raça do feto, mas é conhecido por possuir diversas substâncias como proteínas,

carboidratos, aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento e hormônios (PICTON et

al., 2008), que podem atuar positivamente na crioproteção celular durante o

resfriamento a baixas temperaturas. Comumente empregado na proporção de 10 a 20%,

o SFB tem sido utilizado em soluções de congelação de tecido ovariano (caprino: LUZ

et al., 2009; camundongas: CHOI et. al., 2008), oócito (bovino: KIM et. al., 2001),

tecido testicular (camundongo: MILAZZO et. al., 2008; macaco: JAHNUKAINEN et.

al., 2007), células precursoras neurais (camundongo: MILOSEVIC et. al., 2005), córnea

(suíno: HALBERSTADT et. al.; 2001; bovino: FAN et. al., 2009) e espermatogônias

(bovino: IZADYAR, et. al., 2002).

2.4 Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação

A eficiência do protocolo empregado na criopreservação de tecido ovariano

pode ser verificada pela: 1) manutenção da estrutura morfológica e ultra-estruturtal dos

folículos (KEROS et al., 2009) e do próprio estroma (MARSELLA et al., 2008); 2) pela

viabilidade folicular (SOLEIMANI et al., 2006); 3) pela capacidade de desenvolvimento

e produção de hormônios durante o cultivo in vitro (WALLIN et al., 2009) ou 4) in vivo

(WANG et al., 2002). Estes parâmetros podem ser avaliados, respectivamente, por

estudos morfológicos, comumente empregando histologia clássica e microscopia

eletrônica de transmissão, testes de viabilidade, por meio de corantes vitais e/ou

marcadores fluorescentes, bem como através da observação do desenvolvimento

folicular após cultivo in vitro ou in vivo (transplante).

A histologia clássica permite a observação de alterações estruturais

relacionadas à disfunção e morte celular, como picnose, retração citoplasmática do

oócito, destacamento da membrana basal, desorganização das células da granulosa. Já a

23

microscopia eletrônica de transmissão, permite uma avaliação mais detalhada da

estrutura folicular, com visualização das organelas citoplasmáticas, vacuolização,

alterações de membrana e integridade de junções celulares.

Contudo, os estudos morfológicos realizados imediatamente após a

descongelação podem não ser indicadores suficientes da eficácia do procedimento de

criopreservação, uma vez que a morfologia nem sempre está relacionada com a

competência de desenvolvimento folicular (SANTOS et al., 2007). Dentre os métodos

de análise de viabilidade, o uso de marcadores fluorescentes que indiquem a presença de

atividade enzimática no interior da célula associado a outros marcadores que revelem

danos na membrana mostra-se confiável, merecendo destaque os marcadores calceína-

AM e Etídio Homodimero-1, respectivamente. A Calceína é um marcador cuja ligação

com um grupamento acetoximetil (AM) impede a emissão de fluorescência pelo

bloqueio dos sítios de ligação com o Cálcio. Ao penetrar nas células, as enzimas

esterases, ativas apenas em células vivas, clivam esta ligação com grupamento AM.

Uma vez livre, a calceína conjuga-se com o cálcio intracelular e passa a emitir uma

fluorescência verde quando excitada pela radiação ultravioleta (NERI et al., 2001). Por

outro lado, o Etídio Homodímero 1 é um composto de alto peso molecular capaz de

penetrar apenas em células que apresentem algum dano de membrana. Dentro da célula

este composto conjuga-se com ácidos nucléicos, especialmente com DNA, e passa a

emitir fluorescência vermelha quando excitado por radiação (GATTI et al., 1998).

Logo após a criopreservação podem ocorrer alterações moleculares que se

manifestam com a retomada do metabolismo e desenvolvimento folicular (Siebzehnrübl

et al. 2000). Para evidenciar estas possíveis alterações, diversos estudos tem destacado o

cultivo in vitro como uma ferramenta valiosa para verificar a capacidade de

desenvolvimento de folículos pré-antrais previamente criopreservados (Cecconi et al

2004; Tsuribe et al, 2009; Borges et al 2009; Faustino et al, 2010). Após congelação do

tecido ovariano de camundongas seguida de cultivo foi relatado o crescimento in vitro

de folículos isolados, porém com uma taxa de desenvolvimento e sobrevivência

folicular inferior àquela obtida com o tecido fresco (NEWTON & ILLINGWORTH,

2001). Um estudo realizado com folículos pré-antrais de camundongas, isolados a partir

de tecido ovariano fresco e criopreservado, demonstrou que folículos previamente

congelados desenvolvem-se mais lentamente quando comparado aos folículos não

submetidos a este procedimento (Segino et al., 2005). Choi et al (2008) demonstraram

24

que a criopreservação suprime temporariamente a proliferação das células da granulosa

de folículos pré-antrais de camundongas, o que pode estar relacionado ao atraso no

desenvolvimento folicular. No entanto, recentemente foi mostrado que folículos

isolados derivados de tecido vitrificado apresentaram crescimento folicular e maturação

oocitária similar aos folículos não vitrificados (HAIDARI et al, 2008).

25

CAPÍTULO 1

Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos

Intracellular Cryoprotectant Agents: Characteristics and Use of Ovarian Tissue and

Oocyte Cryopreservation

Periódico: Acta Scientiae Veterinarie (Publicado –2011, 39(2): 95)

26

Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na

criopreservação de tecido ovariano e oócitos

Intracellular cryoprotective agents: characteristics and use in cryopreservation of

ovarian tissue and oocytes

Simone Vieira Castro1, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da

Silva, Luciana Rocha Faustino, José Ricardo de Figueiredo, Ana Paula Ribeiro

Rodrigues

Laboratório de manipulação de oócitos e folículos ovarianos pré-antrais –

LAMOFOPA, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza,

CE, Brasil.

Abstract

Background: The application of cryopreservation in human and animal reproductive

medicine has stimulated several studies about the effects of low temperatures and

freezing processes on cells and tissues, in order to develop efficient protocols for

gamete and embryo preservation. Moreover, cryopreservation is a fundamental tool for

the establishment of animal germplasm banks, allowing the preservation of genetic

material from several species and breeds or for further study and/or recovery of

desirable characteristics. For the success of cryopreservation, the addition of an

intracellular cryoprotectant agent in the freezing solution is indispensable. However,

issues related to intracellular cryoprotectant agents used, e.g., their metabolism and

27

potential toxicity, must be examined carefully so we can choose the cryoprotectant most

suitable for a specific structure.

Review: In this regard, this review introduces several aspects of cryopreservation, such

as basic principles and methods used (slow freezing and vitrification), describing the

fundamental steps of cryoprotectant agent’s exposure, cooling, storage, thawing or

warming and removal of the cryoprotectant agent. The addition of an intracellular

cryoprotectant to the freezing solution is essential, but does not guarantee the success of

the cryopreservation protocol, due to its toxic effect, which requires a perfect balance

between cryoprotectant concentration, temperature and exposure time to the structure

which will be cryopreserved. Some studies attribute the toxicity of these agents mainly

to the secondary metabolites formed when the cell resumes its activity and gradually

begins to metabolize the cryoprotectant agent. These secondary metabolites, such as

lactate resulting from the degradation of propanediol and the production of oxalic acid

after the catalysis of ethylene glycol, can interfere in a number ways on cellular

homeostasis, resulting from an acid-base imbalance with cellular acidosis until the

uncoupling of oxidative phosphorylation in the mitochondrial membrane, preventing the

production of adenosine triphosphate. In addition, there are characteristics of tissue’s

formation and metabolic peculiarities inherent to each species, resulting in differences

in optimal conditions required to maintain the biological properties of cells after

thawing. Therefore, in addition to the knowledge about the chemical and biological

characteristics of the most suitable cryoprotectant agent for a given species, it is also

necessary to adjust the concentration and exposure time to it, allowing a more efficient

preservation of various cell types.

Conclusion: Cryopreservation is a valuable tool for female gametes preservation,

providing support for several reproductive biotechnologies allowing safeguard the

28

genetic material and facilitating its propagation. However, the success of this procedure

depends on the proper use of a cryoprotectant agent, which application, although

essential, can cause irreversible cell damage that can result in cellular death. Although

there is no ideal cryoprotectant agent, able to protect completely the cell at low

temperatures and also to be free of toxicity, it has been demonstrated that the

cryoprotectants currently employed enabled the preservation of oocytes and ovarian

tissue allowing the in vitro production of embryos and the restoration of fertility after

transplantation.

Keywords: cryopreservation, female gamete, ethylene glycol, propanediol,

dimethylsulphoxide, glycerol.

Descritores: criopreservação, gameta feminino, etilenoglicol, propanodiol,

dimetilsulfóxido, glicerol.

I. INTRODUÇÃO

II. FUNDAMENTOS DA CRIOPRESERVAÇÃO

1. Métodos de criopreservação

III. HISTÓRICO DOS AGENTES CRIOPROTETORES

IV. AGENTES CRIOPROTETORES INTRACELULARES

1. Etilenoglicol

a. Obtenção e aplicações

b. Metabolização e mecanismo tóxico

c. Utilização do EG na criopreservação de tecido ovariano e

gametas femininos

2. Dimetilsulfóxido


29


c. Utilização do DMSO na criopreservação de tecido ovariano e

gametas femininos

3. Propanodiol



c. Utilização do PROH na criopreservação de tecido ovariano e

gametas femininos

4. Glicerol



c. Utilização do GLI na criopreservação de tecido ovariano e

gametas femininos

V. CONCLUSÃO

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

I. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, a criotecnologia tem conquistado grande destaque tanto na

medicina reprodutiva humana quanto na reprodução animal, seja através da

criopreservação de embriões [58]; células germinativas masculinas [12] ou femininas

[65] ou mesmo através da criopreservação de tecido gonadal como ovário [92].

A criopreservação tem como princípio básico a redução da temperatura como

forma de reduzir o metabolismo celular, permitindo que as células ou os tecidos sejam

conservados por períodos indeterminados, permitindo a retomada do desenvolvimento

celular normal após o armazenamento [86] em nitrogênio líquido (-196°C). No entanto,

30

o sucesso dessa técnica depende de uma delicada e complexa interação entre

importantes variáveis, que envolve tanto questões físicas, como o volume da solução de

criopreservação e as taxas de resfriamento; quanto questões químicas referentes à

composição da solução de criopreservação. Além disso, para reduzir ou evitar as

injúrias induzidas pelas baixas temperaturas é essencial a adição de substâncias que

proporcionem uma crioproteção celular e tecidual durante a redução da temperatura

[108]. Essas substâncias, conhecidas como agentes crioprotetores (ACPs) são

fundamentais para o sucesso da criopreservação.

Embora, os ACPs sejam absolutamente necessários e amplamente utilizados nos

protocolos de criopreservação, os mecanismos que conferem proteção ao material

biológico, bem como a toxicidade e a metabolização celular destes agentes não são

completamente esclarecidos e abordados na literatura. Neste contexto, a presente

revisão tem como objetivo descrever os aspectos ligados ao processo de

criopreservação, ressaltando os ACPs intracelulares, isto é, aqueles que atravessam a

membrana celular e, portanto, evitam, sobretudo, a formação de gelo no interior da

célula.

II. Fundamentos da criopreservação

A criopreservação consiste na conservação do material biológico, por tempo

indefinido, a temperaturas negativas [94], para que quando descongelado, o material

biológico possa prosseguir seu desenvolvimento normal [86]. A temperatura em que é

realizada a criopreservação é conhecida como “temperatura criogênica”, isto é,

temperatura extremamente baixa na qual os gases encontram-se liquefeitos à pressão

atmosférica [94]. Essa temperatura é obtida com o nitrogênio líquido, cuja temperatura é

de -196°C, ou em sua fase de vapor [54], na qual a temperatura varia em função da

31

distância entre a amostra e o nível de nitrogênio líquido. À temperatura criogênica,

todas as reações químicas, processos biológicos, bem como as atividades intra e

extracelulares estão suspensas, portanto, teoricamente, uma célula ou tecido podem ser

mantidos criopreservados indefinidamente [102]. Porém, para isso, é necessária a

utilização de um ACP na composição da solução de criopreservação, cuja concentração

depende do método de criopreservação empregado.

1. Métodos de criopreservação

O processo de criopreservação pode ser realizado por dois métodos, isto é, a

congelação lenta e a vitrificação. Independente do método utilizado, a criopreservação

baseia-se em cinco etapas fundamentais: 1) exposição ao ACP, com a finalidade de

permitir a difusão desses agentes nos compartimentos celulares; 2) resfriamento com

redução da temperatura de forma gradual (congelação lenta) ou súbita (vitrificação),

na qual a amostra passa da temperatura ambiente para a temperatura criogênica; 3)

armazenamento ou estocagem, permitindo a preservação do material em temperatura

ultrabaixa por períodos indefinidos; 4) descongelação ou aquecimento, etapa na qual

ocorre o resgate do material criopreservado e retomada do metabolismo celular; e 5)

diluição ou remoção do ACP, a fim de evitar, na presença de temperatura fisiológica ou

ambiente, a produção de metabólitos secundários, o que intensificaria a ação tóxica

destes aditivos.

Os métodos de criopreservação divergem entre em si, principalmente, quanto à

taxa de redução de temperatura empregada. A congelação lenta é caracterizada por uma

redução gradual da temperatura, com o objetivo de reduzir o estresse térmico na fase de

32

transição das soluções do estado líquido para o estado sólido [96]. Além disso, é

caracterizada também por uma desidratação celular gradual que evita ou reduz a

formação de cristais de gelo. Nesta situação, baixas concentrações de ACP são

suficientes a fim de que esses objetivos sejam alcançados [101].

Para o resfriamento lento, o material biológico geralmente é congelado sob o

controle de um freezer programável e, uma vez atingido uma adequada desidratação

celular, a qual ocorre quando a temperatura se encontra entre -30 a -80ºC, o material é

estocado em nitrogênio líquido [85] à temperatura de -196° C.

Por outro lado, a vitrificação consiste no método de criopreservação na qual a

redução de temperatura ocorre de forma brusca, cujo objetivo é a obtenção de um sólido

amorfo ou em estado vítreo, que difere do sólido cristalino por não haver formação de

cristais de gelo no interior dos compartimentos celulares [114]. Contudo, para a

obtenção desse estado vítreo é necessário, além de uma alta taxa de resfriamento (por

exemplo, 2500 °C/min), a utilização de uma solução de vitrificação com alta

viscosidade, a qual é obtida com o emprego de elevadas concentrações de ACPs [27,

115].

Independente do método empregado, a adição de um ACP representa um fator

chave para o sucesso da criobiologia, sendo indispensável sua presença para que as

células possam resistir às injúrias resultantes do procedimento de criopreservação [87,

77, 71]. Contudo, os metabólitos resultantes da degradação dos ACPs pela célula podem

ser tóxicos para as células, sendo este um fator limitante para o sucesso da utilização

dos mesmos [32].

III. Histórico dos agentes crioprotetores

33

A descoberta acidental da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al. [88]

durante as suas tentativas para preservar espermatozóides de aves revolucionou os

métodos de criopreservação de diversas células e tecidos. No ano seguinte, Smith

(Smith, 1950) estendeu as observações da função desse agente para a criopreservação de

eritrócitos do sangue humano. Esses dois relatos foram fundamentais para identificar

elementos chaves que desempenhariam um papel crucial na evolução do campo da

biopreservação, como por exemplo, a) a necessidade de utilização de um ACP; b) o

processo pelo qual as células poderiam ser expostas com sucesso a um ACP penetrante

ou intracelular, bem como a c) a maneira de congelar e descongelar. Na década

seguinte, exatos dez anos mais tarde, Lovelock e Bishop [63], descreveram a utilização

do dimetilsulfóxido como ACP, cujas características conferem maior permeabilidade a

vários tipos de células em relação ao Glicerol.

Somente, a partir da década de 80, estudos já consideravam o efeito tóxico dos

crioprotetores como um obstáculo para o sucesso da criobiologia [31]. Desde então,

tem-se buscado novas substâncias capazes de proteger as células dos efeitos deletérios

das baixas temperaturas e que não seja prejudicial às mesmas. Os ACPs são substâncias

de classe orgânica variada, que agem protegendo a célula durante o período de

estocagem em baixas temperaturas, prevenindo a formação de gelo intracelular e

possíveis danos causados pela desidratação [46]. Dependendo do local de ação, os

ACPs podem ser classificados como intracelulares ou extracelulares. Por razões

didáticas, na presente revisão, serão abordados somente os ACPs intracelulares.

IV. Agentes crioprotetores intracelulares

Os crioprotetores intracelulares são solventes orgânicos de baixo peso

molecular que possuem a capacidade de penetrar na célula [89]. Dentre os

34

crioprotetores intracelulares destacam-se, o etilenoglicol, o dimetilsulfóxido e o

propanodiol por apresentarem uma capacidade de penetração superior a do glicerol e

baixa toxicidade. Contudo, a eficiência destes ACPs pode variar em função da estrutura

(célula ou tecido) a ser criopreservada [90], do tipo e concentração e tempo de

exposição utilizado antes do processo de criopreservação propriamente dito. Além

disso, as diferenças estruturais entre as espécies animais é também um fator que pode

influenciar na eficácia de um ACP [37, 33].

De forma geral os ACPs intracelulares atuam substituindo parcialmente a água

no interior da célula e ligam-se ao hidrogênio das moléculas de água intracelular [52],

aumentando a viscosidade da solução de congelação, consequentemente, reduzindo o

ponto de congelação da mesma. Além disso, os ACPs também agem prevenindo a

exposição do material a altas concentrações de eletrólitos, através da ligação aos

próprios eletrólitos ou pela substituição parcial pela água. Os tópicos subseqüentes

apresentam uma descrição detalhada sobre as características dos agentes crioprotetores

intracelulares mais amplamente utilizados nos processos de criopreservação de

materiais biológicos. A tabela 1 mostra uma síntese dos principais resultados da

utilização de diferentes agentes crioprotetores para a criopreservação de estruturas como

o tecido ovariano e oócitos de diversas espécies

1. Etilenoglicol

1.a. Obtenção e aplicações

35

O etilenoglicol (EG) ou monoetilenoglicol é um álcool de fórmula molecular

C2H4(OH)2, obtido a partir da hidrólise do óxido de eteno, empregado como

anticongelante em sistemas de refrigeração de motores, fluído de freio e como matéria

prima para produção de fibra poliéster [70]. Devido às suas características de baixo peso

molecular (62,07 g/mol) e baixo ponto de fusão (-15,6°C), o EG tem sido amplamente

empregado como agente crioprotetor intracelular [78]. Todavia, a metabolização desse

crioprotetor gera subprodutos potencialmente tóxicos, como o acido glicólico e oxalato

[25].

1.b. Metabolização e mecanismo tóxico

No sistema celular, a metabolização do EG ocorre inicialmente no retículo

endoplasmático, onde é convertido em glicoaldeído pela enzima álcool desidrogenase

(ADH) e em menor quantidade pela citocromo P450 2E1 [106]. O glicoaldeído pode

originar como subproduto o ácido glicólico, que representa a via prioritária de

metabolização, e o glioxal, de menor importância in vivo devido à sua meia-vida curta

[66, 35]. O ácido glicólico é rapidamente degradado pela enzima aldeído desidrogenase

(ALDH), resultando na formação de ácido glioxílico. A partir deste metabólito, o ácido

oxálico é formado pela ação da glicolato oxidase (GD) e lactato desidrogenase (LDH).

O ácido oxálico, por sua vez pode conjugar-se com íons cálcio originando o oxalato de

cálcio, um componente tóxico que compromete principalmente a função renal [25]. As

reações de metabolização do EG são mostradas na Figura 1

Dependendo da quantidade de EG metabolizado, o ácido glicólico formado

excede a capacidade tamponante natural da célula, levando a uma redução do pH com

36

consequente acidose celular, resultando na formação de glicina e ácido oxálico [15]. Em

um estudo sobre células renais, McMartin e Wallace [72] observaram o efeito do

oxalato de cálcio monohidratado, resultante da conjugação do ácido oxálico advindo do

metabolismo do EG com íon cálcio e, sugeriram que o acúmulo intracelular deste

metabólito pode levar a uma alteração da permeabilidade mitocondrial, inibindo a

cadeia respiratória, culminando com a morte celular devido à inibição da síntese de

adenosina trifosfato (ATP). Contudo, estudos realizados in vivo, avaliando a quantidade

de subprodutos do EG secretados na urina, revelaram uma variação entre indivíduos em

decorrência do polimorfismo dos sistemas ADH e ALDH. Nesta abordagem, Gross et

al. [43] avaliando a ação de diferentes isoformas de ALDH humana, demonstraram que

a oxidação dos aldeídos (glicoaldeídos), em seus respectivos ácidos, representam a

etapa limitante para a toxicidade do EG. Um estudo realizado em ratos corrobora com

este fato, pois foi demonstrado que a diferença de sensibilidade à toxicidade do EG está

relacionada a fatores genéticos [27]. Porém, vale ressaltar que a toxicidade biológica

dos agentes crioprotetores está diretamente relacionada às suas respectivas

concentrações. Assim, nas concentrações normalmente empregadas para o processo de

congelação lenta, a toxicidade não parece ser um fator limitante para a utilização do EG

como agente crioprotetor, uma vez que, diversos estudos mostram altas taxas de

sobrevivência celular após criopreservação de folículos caprinos [3] e bovinos [18],

oócitos humanos [28] e embriões ovinos [103] com o uso de EG.

1.c. Utilização do EG na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos

37

O EG tem sido corriqueiramente empregado para a conservação de folículos

ovarianos pré-antrais isolados [94, 97] ou inclusos em tecido ovariano [9, 33], oócitos

[7] e embriões [30], obtendo-se resultados satisfatórios e promissores. Apesar disso,

alguns estudos têm demonstrado resultados contraditórios quanto à utilização deste

agente.

Um estudo realizado na espécie bovina, utilizando diferentes crioprotetores

(EG, PROH, DMSO e glicerol) para a congelação lenta de tecido ovariano mostrou que

o EG nas concentrações de 1,5 e 3,0 M, reduziu significativamente o percentual de

folículos morfologicamente normais (52,5% e 32,8%, respectivamente). Segundo os

autores [64], esse resultado foi provavelmente devido à ação tóxica desse crioprotetor.

Por outro lado, Celestino et al. [18] obtiveram um alto percentual de folículos viáveis,

semelhante ao controle fresco, tanto após a exposição quanto após a congelação-

descongelação do tecido ovariano bovino, utilizando 1,5 M de EG.

Em suínos, a utilização de 1,5 M EG mostrou ser mais eficiente no que

concerne à manutenção da morfologia e ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos

em tecido ovariano, proporcionando taxas superiores ao PROH e glicerol com duas

horas de incubação após a descongelação [9]. Amorim et al, [2] avaliaram diferentes

concentrações de EG para a congelação de folículos pré-antrais ovino isolados e

observaram que as concentrações de 1,0; 1,5 e 2,0 M foram capazes de manter a

viabilidade semelhante à verificada para folículos frescos ou não congelados (controle).

A eficiência de diferentes concentrações pode ser devido à diferença espécie-específica

e, principalmente, à forma de congelação, pois apesar do EG apresentar uma boa

permeabilidade, por razões físico-químicas, a penetração do ACP em um tecido é mais

lenta quando comparada à estruturas ou células em suspensão.

38

A alta permeabilidade do EG tem justificado sua grande utilização na

criopreservação de oócitos maturos (camundongo [22]; coelho [11]) e imaturos (ovino

[7]; bovino [19]). A exposição de oócitos humanos a 1,5 M de EG por 10 minutos

conservou a conformação da rede de filamentos corticais de actina, após a congelação

53,8% dos oócitos apresentavam fuso organizado e com os cromossomos alinhados,

7,7% apresentaram desorganização do fuso sem alterar o alinhamento dos cromossomos

e 38,5% possuíam fuso desorganizado ou ausente aliado à desorganização dos

cromossomos [28]. Porém, a exposição de oócitos de camundongas a 6,0 M de EG por

mais de 10 minutos resultou em distúrbios na organização dos filamentos do

citoesqueleto, sendo possível observar irregularidades na distribuição cortical da actina

e ausência da rica rede de filamentos que circundam os cromossomos logo após a

quebra da vesícula germinativa [49, 34].

2. Dimetilsulfóxido


O dimetilsulfóxido (DMSO) é um composto polar, cuja fórmula química é

C2H6SO [93]. É caracterizado por possuir peso molecular de 78 g/mol [16] e

temperatura de congelação de 18,5°C [10]. O DMSO é amplamente utilizado para

solubilizar pequenas moléculas orgânicas [13] e foi sintetizado pela primeira vez pelo

químico russo Alexander Saytzeff, sendo inicialmente empregado apenas como solvente

[76]. Por ser um subproduto da indústria de extração de celulose e, portanto, facilmente

39

disponível, o DMSO passou a ser utilizado industrialmente a partir da década de

quarenta do século XX [80].

A partir da década de sessenta, o DMSO foi introduzido na medicina com fins

farmacológicos e terapêuticos, sendo descritas mais de trinta propriedades, incluindo

atuação intiinflamatória, imunomoduladora, antimicrobiana, vasodilatadora,

antioxidante e crioprotetora [10]. Como crioprotetor, o DMSO foi utilizado pela

primeira vez na criopreservação de sêmen de touro e hemácias humanas e bovinas, por

Lovelock e Bishop [63]. Desde então, a ação crioprotetora desse agente vem se

destacando e tem sido largamente utilizado na criopreservação de folículos ovarianos

[55, 29], oócitos [107, 65] e embriões [58].


Por ser um álcool dipolar, o DMSO é capaz de interagir ou combinar-se com

ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos, proteínas e muitas drogas sem alterar de forma

irreversível a configuração das moléculas [105]. Essa substância é considerada

relativamente atóxica [112] e é encontrada em diversas espécies vegetais e animais,

incluindo o homem [59]. O DMSO interage com as membranas, atravessando-as

rapidamente por meio de difusão. Recentemente, estudos com injeção intraoocitária de

RNA através do canal protéico aquaporina-3, em oócitos de rã (Xenopus SP), foi

demonstrado pela primeira vez o transporte de DMSO por este canal, mesmo em

condições de baixo gradiente de concentração [113].

40

As vias metabólicas seguidas pelo DMSO, bem como seu efeito sobre diversos

sistemas biológicos ainda não são completamente elucidados. De um modo geral, o

DMSO é oxidado em dimetilsulfona (DMSO2), também conhecida com

metilsulfonilmetano (MSM), um importante metabólito utilizado como fonte de enxofre

na síntese de metionina [81]. O MSM é eliminado por via urinária [50] ou pode ser

reduzido pela DMSO-redutase em dimetilsulfuro (DMS), um produto volátil que é

eliminado pelos pulmões [74]. Estudos realizados em camundongos com a

administração de até 2 g/kg de MSM demonstraram tolerância a esse composto, sem

efeitos agudos ou crônicos, não causando nenhuma lesão patológica ou alterações de

órgãos [48].

Tanto o DMSO quanto seus metabólitos têm baixo potencial tóxico [38, 5].

Avaliando-se a genotoxicidade dos agentes crioprotetores mais utilizados na

criopreservação, foi confirmado que, dentre os agentes estudados (DMSO, EG e

PROH), o DMSO foi o único que não induziu alterações cromossômicas, mesmo em

concentrações elevadas de 150 a 200 mg/mL. Contraditoriamente, Zampolla et al. [116],

trabalhando com oócitos de Zebrafish, demonstraram que após exposição a 2,0 M de

DMSO por 30 minutos, ocorreu um aumento no DNA mitocondrial, na tentativa de

corrigir as injúrias causadas pela adição deste agente. Porém, em concentrações

superiores a 3,0 M, os oócitos foram incapazes de realizar a replicação do DNA

mitocondrial, além de ocorrer uma queda imediata dos níveis celulares de ATP.

2.c. Utilização do DMSO na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos

41

O DMSO tem sido utilizado com sucesso para criopreservação de gametas e

embriões. Quando utilizado na concentração de 1,5 M para criopreservação de

fragmentos de tecido ovariano humano (25 mm3), seguida por xenotransplante em

camundongos imunodeficientes, foi observado uma baixa recuperação de oócitos e taxa

de maturação oocitária, com oócitos apresentando grande desorganização da cromatina

[56]. Em ovinos, a análise histológica revelou que a criopreservação de tecido ovariano

com 1,5 M de DMSO, seguida por isolamento folicular e cultivo in vitro de folículos

isolados, resultou em 50% de degeneração folicular no primeiro dia de cultivo. Ao fim

de 10 dias de cultivo, uma análise da interação célula-célula revelou uma redução

significativa neste parâmetro quando comparado com tecido criopreservado com EG ou

tecido não criopreservado [17]. Contudo nestes trabalhos os folículos sofreram grande

influência do tipo de cultivo e do organismo para o qual foi xenotransplantado. Isto

supõe que os resultados não podem ser atribuídos exclusivamente à criopreservação ou

ao agente crioprotetor empregado, haja vista, que utilizando a mesma concentração de

DMSO, Demeestere et al. [29] obtiveram sucesso após tranplantes ortotópico e

heterotópico (subcutâneo) de tecido ovariano criopreservado, constatando a retomada da

ciclicidade hormonal e da fertilidade com obtenção de gestação natural.

No que diz respeito à criopreservação de oócitos, muitos trabalhos associam o

DMSO a outros agentes intracelulares, principalmente ao EG [107, 109, 23]. Mahmoud

et al. [65], comparando diferentes combinações de agentes crioprotetores na vitrificação

de oócitos imaturos de búfalas, demonstraram que a combinação de EG e DMSO é mais

efetiva, resultando em maiores taxas de maturação pós vitrificação, quando comparado

a apenas ao EG ou às combinações EG ou DMSO com glicerol. No entanto, na espécie

bovina, Campos-Chillòn et al. [14] encontraram um percentual de clivagem (87,5%) e

formação de blastocisto (23,6%) significativamente superior em zigotos criopreservados

42

com 7,0 M de EG quando comparado aqueles criopreservados com 2,5 M de DMSO

(79,4%).

3. Propanodiol


O 1,2-propanodiol (PROH) foi inicialmente descrito por Wurtz em 1859, mas

sua produção em escala industrial iniciou-se em 1930. Este composto é produzido pela

hidrólise direta do óxido de propileno, sendo formado o 1,2- propilenoglicol e o 1,3-

propilenoglicol simultaneamente, pela adição sequencial do óxido de propileno ao

propilenoglicol [75]. O PROH (C3H8O2) também pode ser obtido a partir do glicerol

(1,2,3,-propanotriol) através de uma reação de hidrogenólise, conduzida em

temperaturas que variam de 150 a 200°C, na presença de catalisadores ácidos [75].

Outra forma de obtenção deste composto é através da glicerina, que é constituída por

95% de glicerol. A glicerina pode, inclusive, ser obtida como um co-produto do

biodiesel, apresentando-se como uma alternativa viável e sustentável para a produção de

PROH [100].

A maior aplicação do PROH é na manufatura de resinas de poliéster insaturadas

sendo também aplicado na indústria farmacêutica e de alimentos [39]. Contudo, por

possuir características como baixo peso molecular, alta permeabilidade à membrana

celular [36] e biodegradabilidade, o PROH tem sido utilizado como agente

descongelante e anti-congelante em naves espaciais, automóveis e máquinas

43

refrigeradas [75], além de mostrar-se como um eficiente crioprotetor na preservação de

diversos tipos celulares e tecidos (Tecido ovariano:[92]; folículos: [4]; oócitos: [53];

sêmen: [41]; embriões: [24]).


O efeito tóxico do PROH na criopreservação ainda é pouco explorado, contudo,

por sua utilização em outras áreas, como na indústria alimentícia e cosmética, existem

trabalhos que relatam seus efeitos tóxicos em ensaios experimentais, quando

administrado em altas doses em casos acidentais [82, 6], havendo relato de casos de

sinais de intoxicação pelo PROH utilizado como veículo de medicamentos [111]. De

toda forma, os efeitos observados incluem a produção de lactato intracelular com

consequente acidificação e alterações hematológicas, podendo ocasionar desequilíbrio

ácido-básico e morte celular [111].

No organismo, o PROH é oxidado a monohidroxiacetona e convertido a ácido

pirúvico (piruvato), que é destinado ao ciclo do ácido cítrico para produção energética

através da gliconeogênese. Esse composto também pode sofrer oxidação resultando em

produção de lactoaldeído, posteriormente convertido em ácido láctico (lactato). Os

produtos formados, lactoaldeído e monohidroxiacetona, são interconversíveis, ou seja,

um produto pode ser convertido no outro [95], assim como o lactato e o piruvato

(Figura 2).

Estudos conduzidos em células de tecido vascular suíno, indicaram que a

alteração do pH ou o do estresse oxidativo não possuem papel decisivo nas lesões

44

tóxicas provocadas pela exposição ao PROH. O efeito tóxico deste composto parece ser

exercido através de um influxo de sódio para o meio intracelular. Este mecanismo ainda

é incerto, contudo acredita-se que ocorram lesões por alterações secundárias como

alteração da homeostase do cálcio intracelular, via disfunção da bomba Na+/Ca2+ e

distúrbios na permeabilidade das mitocôndrias com o decréscimo de função da Na+/K+-

ATPase [112].

3.c. Utilização do PROH na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos e

embriões

Devido às suas características estruturais, o PROH despertou grande interesse

de pesquisadores que passaram a investigar a aplicabilidade desta substância para a

preservação de gametas femininos [24, 53, 20].

Na criopreservação de tecido ovariano suíno, o PROH mostrou-se menos

eficiente quando comparado ao EG e DMSO, proporcionando uma menor taxa de

folículos morfologicamente normais, tanto imediatamente quanto após curto período (2

horas) de incubação [9]. Quando utilizado na concentração de 1,5 M com 10 minutos de

exposição, o PROH proporcionou taxas aceitáveis de manutenção da morfologia e

ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de cutia, Dasyprocta

aguti (dados não publicados). Amorim et al. [4] avaliando diferentes concentrações de

PROH (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 M) na criopreservação de folículos primordiais isolados

ovinos, obtiveram melhores resultados com 1,5 M, encontrando 10,6% de folículos

viáveis comparado com o controle. Já para tecido ovariano caprino o PROH nas

concentrações de 1,5 ou 3 M resultaram em taxas de folículos morfologicamente

normais significativamente inferiores a criopreservação com 1,5 M de DMSO [92]

45

Em oócitos de macacas rhesus (Macaca mulatta), o PROH mostrou-se mais

permeável que o DMSO e o EG [53]. Além disso, o PROH (1,5 M) foi capaz de manter

a organização do fuso meiótico de oócitos de camundongos em temperaturas

subfisiológicas, no entanto, essa organização foi perdida após o aquecimento dos

mesmos [20]. Em felinos, a mesma concentração de PROH foi eficiente na preservação

de oócitos imaturos, proporcionando taxas de maturação e desenvolvimento

embrionário (clivagem e formação de blastocisto) semelhantes às observadas para

oócitos frescos ou não congelados (controle). Porém, nas concentrações de 0,75 e 3,0 M

foi observado um grande percentual de anormalidade do fuso meiótico, 62% e 42,7%,

respectivamente [24]. Em oócitos humanos maturos e imaturos, o PROH na

concentração de 1,5 M induziu a liberação de cerca de 70% dos grânulos corticais [40],

evidenciando que seu uso pode acarretar em dificuldades para a fertilização devido ao

enrijecimento precoce da zona pelúcida. Parmegiani et al. [83] relataram o nascimento

de uma criança saudável após a fertilização in vitro de oócitos humanos maturos que

permaneceram criopreservados com 1,5 M de PROH por cinco anos. Utilizando a

mesma concentração (1,5 M) associada a 0,3 M de sacarose, Konc et al. [57] relataram

o nascimento dos primeiros bebês húngaros oriundo de oócitos congelados, que

resultaram em 127 embriões transferidos com taxa de gestação de 20%.

4. Glicerol


46

O glicerol, ou 1,2,3-propanotriol (C3H8O3) ocorre naturalmente em formas

combinadas, como com ácidos graxos nos triglicerídeos, em todos os óleos graxos

animais e vegetais, sendo isolado quando estes óleos são saponificados com hidróxido

de sódio ou potássio no processo de manufatura de sabões [75]. O primeiro relato de

isolamento do glicerol foi descrito por Scheele em 1779, pelo aquecimento de uma

mistura de óxido de chumbo com azeite de oliva, na época, chamado de “o doce

princípio das gorduras”. Apesar disso as primeiras evidências de um material parecido

com sabão é datado de 2800 a.c. encontradas em escavações na antiga Babilônia. A

denominação de “sabão” foi dada pelos romanos, tendo origem no Monte Sapo, onde

eram realizados sacrifícios de animais, cuja gordura derretida era levada pelas águas da

chuva e, misturado com cinzas e barro, acumulava ao longo das margens do rio Tibre e

era utilizado pelas mulheres romanas para limpar suas vestes [1].

Desde 1949, o glicerol também tem sido produzido comercialmente pela

síntese do propeno. A etapa inicial é a cloração a alta temperatura, envolvendo radicais

livres como intermediários, para formar o cloreto de alila. Este é então reagido com

ácido hipocloroso dando um produto de adição à dupla (haloidrina). Por fim, o

tratamento da haloidrina com excesso de base leva ao glicerol [75]. Atualmente, a

produção de biodiesel [42] tem se tornado uma forma alternativa para a obtenção de

glicerol. O óleo utilizado no processamento do biodísel, ou seja, os são triglicerídeos,

sob a ação de um catalisador básico e na presença de metanol ou etanol sofre uma

transesterificação originando três moléculas de ésteres metílicos ou etílicos (que

constituem o biodiesel em sua essência) e liberando uma molécula de glicerol [69].

O termo glicerol é utilizado apenas para o produto químico puro,

comercialmente é encontrado como glicerina, um produto purificado com pelo menos

95% de glicerol. A glicerina tem aplicação em diferentes setores de cosmético, higiene

47

pessoal, alimentos e medicamentos dentre outros [75]. A figura 3 mostra uma

distribuição percentual de aplicações usuais da glicerina.


O glicerol é encontrado normalmente em todos os tecidos animais, sendo o nível

plasmático normal de 0,1 mM em ratos, 0,05-0,1 mM em humanos [61] e 0,65 mM em

frangos [104], porém estes níveis variam em função da atividade do indivíduo podendo

elevar de 65 µmol l-1 para 150 µmol l-1 em apenas duas horas de exercícios [44]. No

organismo animal, o glicerol é metabolizado em glicerol 3-fosfato pela enzima glicerol

quinase e transformado em diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3-fosfato que é

intermediário do metabolismo dos carboidratos [84]. O destino metabólico do glicerol

pode ser dirigido, dependendo do tecido e do estado nutricional do animal, para o

fornecimento de esqueleto carbônico para a gliconeogênese, entrar na via glicolítica

para a geração de energia ou ser utilizado como precursor na síntese de novos

triglicerídeos (figura 4).

Por ser um constituinte normal presente nas membranas celulares e em todos os

óleos e gorduras animal e vegetal, todas as células são capazes de metabolizar o

glicerol, não havendo informações toxicológicas referentes ao mesmo, ou sua forma

comercial, glicerina, em bancos de dados reconhecidos internacionalmente. Contudo, já

foi relatado que o glicerol pode afetar eventos físicos no citoplasma, como a

organização citoplasmática através da alteração na polimerização da tubulina e aumento

da viscosidade; altera a permeabilidade e estabilidade da bicamada lipídica e atua

diretamente de modo prejudicial no glicocálix e nas proteínas de membrana, formando

48

ligações não covalentes com as mesmas [45]. Apesar de ser utilizado na dosagem de 6

ml/kg para induzir modelos de lesão renal aguda em camundongos, semelhante a

ocorrida na rabdomiólise [67], é uma excelente fonte de carbono e favorece o

metabolismo secundário, como demonstrado por Oliveira [79] que obteve uma maior

produção de violaceína (pigmento com atividade antibiótica, antivirótica e anti

Trypanossoma cruzi) pela bactéria Chromobacterium violaceum substituindo a glicose

pelo glicerol.

4.c. Utilização do GLI na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos

Apesar de considerado o crioprotetor padrão na criopreservação de gametas

masculinos, o glicerol não apresenta uma alternativa eficiente para preservação de

gametas femininos. Amorim et al. [4] avaliando a eficiência do glicerol na preservação

de folículos primordiais isolados ovinos, obtiveram taxas de sobrevivência de 0,44;

1,33; 3,72. 3,12 e 2,52% utilizando 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; e 2,5 M, respectivamente. Além

disso, um estudo realizado para avaliar a eficácia do glicerol, EG, PROH e DMSO, nas

concentrações de 1,5 e 3 M, na a criopreservação de folículos pré-antrais ovinos

isolados demonstraram que o glicerol é o agente menos efetivo na preservação dessas

etruturas [98].

Utilizando as mesmas concentrações (1,5 e 3 M) de glicerol acima mencionadas

para a espécie ovina, na congelação de tecido ovariano caprino, Rodrigues et al [91]

demonstraram que é possível preservar folículos pré-antrais inclusos no tecido, obtendo

41% (1,5 M) e 36% (3 M) de folículos morfologicamente normais, mantendo também a

normalidade das características ultraestruturais (Figura 5). Apesar disso já foi

49

demonstrado com a criopreservação de tecido ovariano felino, que a utilização de

glicerol não é eficiente na preservação dos folículos pré-antrais, proporcionando um

percentual de folículos morfologicamente normais semelhante ao observado no tecido

congelado sem a adição de agentes crioprotetores, sendo 39,3% e 26%, respectivamente

[60]. O mesmo foi constatado por Borges et al. [9], que avaliando os quatro agentes

crioprotetores na preservação de tecido ovariano suíno, não obtiveram nenhum folículo

morfologicamente normal com a utilização do glicerol.

Em oócitos, a presença da zona pelúcida dificulta ainda mais a penetração do

glicerol quando comparado a outros tipos celulares. A criopreservação de oócitos

bovinos maturados in vitro utilizando 10% de glicerol, resultou em apenas 3% de

clivagem após fertilização e cultivo in vitro, porém nenhuma estrutura desenvolveu-se

ao estádio de blastocisto [99]. Hunter et al. [51] avaliando a empregabilidade do glicerol

e DMSO na criopreservação de oócitos humanos, verificaram que apesar de serem

fertilizados, as estruturas não foram capazes de continuar seu desenvolvimento normal

após 48 h de cultivo. Um estudo conduzido para avaliar o coeficiente de permeabilidade

da membrana do oócito a diferentes crioprotetores, utilizando o coelho como modelo,

demonstrou que o glicerol não alterou significativamente a condutividade hidráulica

quando comparado com o EG e o DMSO, porém a permeabilidade a solutos (expresso

em cm mim-1) foi inferior (DMSO: 2,9 x 10-3; EG: 2,7 x 10-3; GLI: 0,27 x 10-3). Nesse

mesmo estudo, avaliando a capacidade de desenvolvimento de oócitos após ativação

partenogenética, apenas 19% dos oócitos expostos ao glicerol chegaram ao estádio de 2-

8 células, não sendo obtida nenhuma mórula ou blastocisto [62].

50

V. Conclusão

A criopreservação representa uma valiosa ferramenta para a preservação de

gametas femininos tanto de animais quanto de humanos, oferecendo suporte para

diversas biotecnias reprodutivas permitindo salvaguardar o material genético e,

facilitando a sua difusão. No entanto o sucesso do procedimento depende da utilização

adequada de um agente crioprotetor considerando uma delicada e complexa relação

entre fatores como tempo, temperatura de exposição, bem como a concentração e o tipo

desse agente. Apesar de indispensável para o sucesso da criopreservação, nenhum dos

agentes crioprotetores, atualmente empregados são isentos de oferecer riscos às células.

Neste sentido, inúmeros trabalhos têm sido realizados com o intuito de estabelecer as

condições ideais para a utilização de um determinado crioprotetor para a

crioconservação de um dado tipo celular ou tecido. A relevância da criopreservação

para a reprodução assistida estimula novos estudos a fim de compreender, determinar e

otimizar os protocolos para cada espécie e estrutura, incluindo também a busca por

novos agentes crioprotetores, que sejam eficientes e não prejudiciais às estruturas a

serem criopreservadas.

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 Alberici R.M. & Pontes F.F.F. 2004. Reciclagem de óleo comestível usado através

da fabricação de sabão. Engenharia Ambiental. 1(1): 73-76.

51

2 Amorim C.A., Rondina D., Lucci C.M., Gonçalves P.BD., Figueiredo J.R. &

Giorgetti A. 2006. Permeability of ovine primordial follicles to different

cryoprotectants. Fertility and Sterility. 85(1): 1077-1081.

3 Amorim C.A., Rondina D., Rodrigues A.P.R., Costa S.H.F.,Gonçalves P.B.D. &

Figueiredo J.R. 2003. Isolated ovine primordial follicles cryopreserved in different

concentrations of ethylene glycol. Theriogenology. 60: 735-742.

4 Amorim C.A., Rondina D.R., Rodrigues A.P.R., Gonçalves P.B.D., Figueiredo

J.R. & Giorgetti A. 2004. Cryopreservation of isolated ovine primordial follicles with

propylene glycol and glycerol. Fertility and Sterility. 81(1): 735-740.

5 Aye M., Giorgio C. Di., Mo M. De., Botta A., Perrin J. & Courbiere B. 2010.

Assessment of the genotoxicity of three cryoprotectans used for human oocyte

vitrification: dimethyl sulfoxide. Ethylene glycol and propylene glycol, Food and

Chemical Toxicology. 48: 1905-1912.

6 Bartsch W., Sponer G., Dietmann K. & Fuchs G. 1976. Actue toxicity of various

solvents in the mouse and rat. LD50 of ethanol, diethylacetamide, dimethylformamide,

dimethylsulphoxide, glycerine, N-methylpyrrolidone , polyethylene glycol 400, 1,2-

propanediol and Tween 20. Arzneimittel-Forschung. 26: 1581-1583.

7 Bogliolo L., Ariu F., Fois S., Rosati I., Zedda M.T., Leoni G., Succu S., Pau S. &

Ledda S. 2007. Morphological and biochemical analysis of immature ovine oocytes

vitrified with or without cumulus cells. Theriogenology. 68(8): 1138-1149.

8 Bordes A., Lonarge J., Demirci B., Franck M., Courbiere B., Guerin J.F. & Salle

B. 2005. Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified-warmed

hemi-ovaries into ewes. Human Reproduction.20(10): 2745-2748.

52

9 Borges E.N., Silva R.C., Futino D.O., Rocha-Junior C.M., Amorim C.A., Báo

S.N. & Lucci C.M. 2009. Cryopreservation of swine ovarian tissue: effect of different

cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle oocytes. Cryobiology.

59: 195-200.

10 Brayton C.F. 1986. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Veterinarian.

76: 76-90.

11 Cai X.Y., Chen G.A., Lian Y., Zheng X.Y. & Peng H.M. 2005. Cryoloop

vitrification of rabbit oocytes. Human Reproduction. 20: 1969-1974.

12 Caleghiani E.C.C., Arruda R.P., Andrade A.F.C., Nascimento J., Raphael C.F.

& Rodrigues P.H.M. 2008. Effects that bovine sperm cryopreservation using two

different extenders has no sperm membranes and chromatin. Animal Reproduction

Science. 104: 119-131.

13 Camici G.G., Steffel J., Akhmedov A., Schafer N., Baldinger J., Schulz U.,

shojaati K., Matter C.M., Yang Z., Lüscher T. F. & Tanner F.C. 2006 . Dimethyl

sulfoxide inhibits tissue factor expression, thrombus formation, and vascular smooth

muscle cell activation. Circulation. 114(14) :1512-1521.

14 Campos-Chillòn L. F., Such T. K., Barcelo-Fimbres M., Seidel Jr G.E. &

Carnevale E. M. 2009. Vitrification of early-stage bovine ande quine embryos.

Theriogenology. 71: 349-354.

15 Carney E. 1999. Ethylene glycol developmental toxicity: unraveling the roles of

glycolic acid and metabolic acidosis. Toxicological sciences. 50: 117-126.

53

16 Carpenter R.J., Angel M.F. & Morgan R.F. 1994. Dimethyl sulfoxide increases

the survival of primarily ischemic island skin flaps. Otolaryngology Head Neck

Surgery. 110: 228-231.

17 Cecconi S., Capacchietti G., Russo V., Berardinelli P., Mattioli M. & Bardoni B.

2004. In vitro growth of preantral follicles isolated from cryopreserved ovine ovarian

tissue. Biology of Reproduction. 70(1): 12-17.

18 Celestino J. J. H., Santos R.R., Lopes C.A.P., Martins F. S., Matos M. H. T.,

Melo M.A.P., Báo S.N., Rodrigues A.P.R., Silva J. R. V. & Figueiredo J. R. 2008.

Preservation of bovine preantral follicle viability and ultra-structure after cooling and

freezing of ovarian tissue. Animal Reproduction Science. 108: 309-318.

19 Y. & Bastan A. 2006. Cryopreservation of immature bovine oocytes by vitrification

in straws. Animal Reproduction Science. 92: 29-36.

20 Chang C.C., Sung L.Y., Lin C.J., Kort H.I., Yang X., Tian X. C. & Nagy Z.P.

2010. The oocyte spindle is preserved by 1,2-propanediol during slow freezing, Fertility

and Sterility. 93( 5): 1430-1439.

21 Chen S.U., Len Y.R., Chen H.F., Chang L.J., Tsai Y.Y. & Yang Y.S. 2005.

Observational clinical follow-up of oocyte cryopreservation using a slow-freezing

method with 1,2-propanediol plus sucrose followed by ICSI. Human Reproduction. 20:

1975-1980.

22 Chen S.U., Lien Y.R., Chen H.F., Chao K.H., Ho H.N. & Yang Y.S. 2000. Open

pulled straws for vitrification of mature mouse oocytes preserve patterns of meiotic

spindles and chromosomes better than conventional straws. Human Reproduction.

15(12): 2598-2603.

54

23 Cocchia N., Ciani F., Russo M., El Rass R., Rosapane I., Avallone L., Tortora

G. & Lorizio R. 2010. Immature caat oocyte vitrification in open pulled straw (POSs)

using a cryoprotectant mixture. Cryobiology. 60: 229-234.

24 Comizzoli P., Wildt D. E. & Pukazhenthi B. S. 2004. Effect of 1,2-propanediol

versus 1,2-ethanediol on subsequent oocyte maturation, spindle integrity, fertilization,

and embryo development in vitro in the domestic cat. Biology of Reproduction. 71: 598-

604.

25 Corley R.A., Bartels M.J., Carney E.W., Weitz K.K., Soelberg J.J., Gies R.A. &

Thrall K.D. 2005. Development of a physiologically based pharmacokinetic model for

ethylene glycol and its metabolite, glycolic acid, in rats aand humans. Toxicological

Science. 85: 476-490.

26 Courbiere B., Massardier J., Salle B., Mazoyer C., Guerin J. F. & Lornage J.

2005. Follicular viability and histological assessment after cryopreservation of whole

sheep ovaries with vascular pedicle by vitrification. Fertility and Sterility. 84: 1065-

1071.

27 Cruzan G., Corley R.A., Hard G.C., Mertens H.J.W.M., Mcmartin K.E.,

Snellings W.M., Gingell R. & Deyo J.A. 2004. Subchronic toxicity of ethylene glycol

in Wistar and F-344 rats related to metabolism and clearance of metabolites.

Toxicological Science. 81: 502-511.

28 De Santis L., Coticchio G., Payter S., Albertini D., Hutt K., Cino I., Iaccarino

M., Gambardella A., Flamigni C. & Borini A. 2007. Permeability of human oocytes

to ethylene glycol and their survival and spindle configurations after slow cooling

cryopreservation. Human Reproduction. 22(10): 2776-2783.

55

29 Demeestere I., Simon P., Buxant F., Robin V., Fernadez S. A., Centner J.,

Delbaere A. & Englert Y. 2006. Ovarian function and spontaneous pregnancy after

combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a

patient previously treated with bone marrow transplantation: Case Report. Human

Reproduction. 21: 2010-2014.

30 Emiliani S., Bergh M.V.den, Vannin A.S., Biramane J. & Englert Y. 2000.

Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of

slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts. Human Reproduction.

15(4): 905-910

31 Fahy G.M. 1986. The relevance of cryoprotectant "toxicity" to cryobiology.

Cryobiology. 23: 1-13.

32 Fahy G.M. 2010. Cryoprotectant toxicity neutralization. Cryobiology. 60: 45-53.

33 Faustino L.R., Santos R.R., Silva C.M.G., Pinto L.C., Celestino J.J.H.,

Campello C.C., Figueiredo J.R. & Rodrigues A.P.R. 2010. Goat and sheep ovarian

tissue cryopreservation: Effects on the morphology and development of primordial

follicles and density of stromal cell. Animal Reproduction Science. 122: 90–97.

34 Ferreira E.M., Vireque A. A., Adona P.R., Meirelles F. V., Ferriani R. A. &

Navarro P. A. A. S. 2008. Maturação citoplasmática de oócitos bovinos: aquisição de

competência para o desenvolvimento. Revista Brasileira de Reprodução Animal. 32(3):

172-181.

35 Frantz S.W., Beskitt J.L., Grosse C.M., Tallant M.J., Dietz F.K. & Ballantyne

B. 1996. Pharmacokinetics of ethylene glycol. II. Tissue distribuition, dose-dependent

elimination, and identification of urinary metabolites following single intravenous,

56

peroral or percutaneous doses in female Sprague-Dawley rat and CD-1 mice.

Xenobiotica. 26: 195-220.

36 Fuku E., Kojima T., Shioya Y., Marcus G.J. & Downey B.R. 1992. In vitro

fertilization and development of frozen-thawed bovine oocytes. Cryobiology. 29:485-

492.

37 Gandolfi F., Paffoni A., Brambilla E.P., Bonetti S., Brevini T.A.L. & Ragni G.

2006 Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the

cryopreservation of ovarian tissue: comparative analysis between human and animal

models. Fertilility and Sterility. 85: 1150-1156.

38 Gaylor Chemical Company. 2007. Dimethyl sulfoxide (DMSO) health and safety

information. Slidell. Bulletin 106. 16p.

39 Geller M., Bonalumi Filho A., Cunha K.S.G., Slaibi E.B., Abreu C.S., Barbosa

J.S.S. 2010 Avaliação imunodermatológica da resposta ao propilenoglicol e ao

butilenoglicol- revisão bibliográfica sistemática, Revista Brasileira de Medicina. 67(7):

234-239.

40 Ghetler Y., Skutelsky E., Num I.B., Dor L.B., Amihai D. & Shalgi R. 2006.

Human oocyte cryopreservation and the fate of cortical granules. Fertility and Sterility.

86: 210-216.

41 Godinho H.P., Amorim V.M.C. & Peixoto M.D.P. 2003.Criopreservação do

semen de Tilápia-Nilótica Oreochromis niloticus, var. Chitralada: crioprotetores,

soluções ativadoras ee refrigerador criogênico. Revista brasileira de Zootecnia. 32(6)

1537-1543.

57

42 Gonçalves M.F & Evangelista F.R. 2008. O descompasso do Programa nacional de

Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) no Nordeste in: XLVI Congresso da sociedade

brasileira de economia, administração e sociologia rural (Rio Branco, Brasil). pp. 1-19

43 Gross A., Ong T.R., Grant R., Hoffmann T., Gregory D.D. & Sreerama L. 2009.

Human aldehyde dehydrogenase-catalyzed oxidation of ethylene glycol ether aldehydes.

Chemico-Biological Interactions. 178: 56-63.

44 Hall G.V., Sacchetti M., Radegran G. & Saltin B.2002. Human skeletal muscle

fatty acid and glycerol metabolism during rest, exercise and recovery. Journal of

Physiology. 543(3): 10471058.

45 Hammerstedt R.H. & Graham J.K. 1992. Cryopreservation of poultry sperm: the

enigma of glycerol. Cryobiology. 29(1): 26-38

46 Han X., Mab L., Benson J., Brown A. & Critser J.K. 2009. Measurement of the

apparent diffusivity of ethylene glycol in mouse ovaries through rapid MRI and

theoretical investigation of cryoprotectant perfusion procedures. Cryobiology. 58: 298-

302.

47 Hasegawa A., Mochida N., Ogasawara T. & Koyama K. 2006. Pup birth from

mouse oocytes in preantral follicles derived from vitrified and warmed ovaries followed

by in vitro growth, in vitro maturation and in vitro fertilization. Fertility and Sterility.

86(3): 1182-1192.

48 Horváth K., Noker P.E., Somfai-Relle S., Glávits R., Financsek I. & Schauss

A.G. 2002. Toxicity of methylsulfonylmethane in rats. Food and Chemical Toxicology.

40: 1459-1462.

58

49 Hotamisligil S., Toner M. & Powers R.D. 1996. Changes in membrane integrity,

cytoskeletal structure, and developmental potential of murine oocytes after vitrification

in ethylene glycol. Biology of Reproduction. 55: 161-168.

50 Hucker H. B., Miller J. K., Hochberg A., Brobyn R.D., Riordan F.H. &

Calesnick B. 1967. Studies on the absorption, excretion and metabolism of

dimethylsulfoxide (DMSO) in man. The Jounal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics. 155(2): 309-317.

51 Hunter J.E., Bernard A., Fuller B., Amso N. & Shaw R.W. 1991. Fertilization

and development of the human oocyte following exposure to cryoprotectants, low

temperatures and cryopreservation: a comparison of two techniques. Human

Reproduction.6:1460 –1465.

52 Jain K.J. & Paulson R.J. 2006. Oocite cryopreservation. Fertility and Sterility.

86(3): 1037-1046.

53 Karlsson J.O., Younis A.I., Chan A.W., Gould K.G. & Eroglu A. 2009.

Permeability of the rhesus monkey oocyte membrane to water and common

cryoprotectants. Molecular Reproduction and Development. 76: 321–333.

54 Kartha K.K. 1985. Cryopreservation of plant cells and organs. Boca Raton:CRC

press, 276p.

55 Kim G. A., Kim H. Y., Kim J. W., Lee G., Lee E. & Lim J.M. 2010.

Utrastructural deformity of ovarian follicles induced by different cryopreservation

protocol. Fertility and Sterility. 94(4): 1548-1551.

59

56 Kim S. S., Kang H.G., Kim N.H., Lee H.C. & Lee H.H. 2005. Assessment of the

integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after

xenotransplantation. Human Reproduction. 20(9): 2502-2508.

57 Konc J., Kanyo K., Varga E., Kriston R. & Cseh S. 2008. Oocyte

cryopreservation: the birth of the first Hungarian babies form frozen oocytes. Journal of

Assisted Reproduction and Genetics. 25: 349-352

58 Kumar S., Jhamb D. & Maurya S.N. 2010. Post vitrification survival of 2-cell

stage IVP buffalo embryos: effect of concentration. Indian Journal of Animal Science.

80: 99-103.

59 Lee P. A., Mora S. J. & Levasseur M., A. 1999. review of dimethylsulfoxide in

aquatic environments. Atmosphere-ocean. 37(4): 439-456.

60 Lima A.K., Silva A.R., Santos R.R., Sales D.M., Evangelista A.F., Figueiredo

J.R. & Silva L.D. 2006. Cryopreservation of preantral ovarian follicles in situ from

domestic cats (Felis catus) using different cryoprotective agents. Theriogenology.

66:1664-1666.

61 Lin M.H., Romsos D.R. & Leveille G.A. 1976. Effect of glycerol on lippogenic

enzyme activities and on fatty acid synthesis in the rat and chicken. Journal of

Nutrition. 106: 1668-1677.

62 Liu J., Mullen S., meng Q., Critser J. & Dinnyes A. 2009. Determination of

oocyte membrane permeability coefficients and their application to cryopreservation in

a rabbit model. Cryobiology. 59: 127-134.

63 Lovelock J.E. & Bishop M.W.H. 1959. Preservation of freezing damage to living

cells by dimethyl sulfhoxide. Nature. 183: 1394-1395.

60

64 Lucci C.M., Kacinskis M.A., Lopes L.H.R., Rumpf R. & Báo S.N. 2004. Effect of

different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine

(Bos indicus) ovarian tissue. Theriogenology. 61: 1101-1114.

65 Mahmoud K.Gh.M., Sholkamy T.H., Ahmed Y.F., Seidel G.E. & Nawito M.F.

2010. Effect of different combination of cryoprotectantes on invitro maturation of

immature buffalo (Bubalus bubalis) oocytes vitrified by straw and open-pulled straw

methods. Reproduction in Domestic Animals. 45: 565-571

66 Marshall T.C. & Cheng Y.S. 1983. Deposition and fate of inhaled ethylene glycol

vapor and condensation aerosol in the rat. Toxicological Science. 3: 175-181.

67 Martin E.C.O., Pinto C.F., Watanabe M. & Vattimo M.F.F. 2007. Lesão renal

aguda por glycerol: efeito antioxidante da Vitis Vinifera L. Revista Brasileira de

Terrapia Intensiva. 19(3): 292-296.

68 Martinez-Madrid B., Camboni A., Dolmans M.M, Nottola S., Langendonckt

A.V. & Donnez J. 2007. Apoptosis and ultrastructural assessment after

cryopreservation of whole humano varies with their vascular pedicle. Fertility and

Sterility. 87(5): 1153-1165.

69 Martins D.F. 2009. Contribição ao estudo da reforma a vapor do glicerol em

catalisadores Pt/C - efeito do tamanho da partícula de Pt e do pH da solução de

alimentação. 91f. Uberlandia, MG. Dissertação (Mestrado em Química) Programa de

Pós-graduação em Química, Universidade Federal de Uberlândia.

70 Martins L. &, Cardoso D. 2005. Produção de etilenoglicóis e derivados por reações

catalíticas de óxido de eteno. Química Nova. 28: 264-273.

61

71 Matsumoto K., Raharjo S.H.T., Dhekney S., Moon P.A. & Litz R.E. 2004.

Criopreservação e embriogênese somática de calos de Dimocarpus longan. Pesquisa

Agropecuária Brasileira. 39: 1261-1263.

72 McMartin K.E. & WALLACE K.B. 2005. Calcium oxalate monohydrate, a

metabolite of ethylene glycol, is toxic for rat renal mitochondrial function.

Toxicological Science. 84: 195-200.

73 Meirow D., Levron J., Eldar-Geva T., Hardan I., Fridman E., Yemini Z. & Dor

J. 2007. Monitoring the ovaries after autotransplantation of cryopreserved ovarian

tissue: endocrine studies, in vitro fertilization cycles, and live birth. Fertility and

Sterility. 87(2): 418.e7- 418.e15.

74 Mendez A. 2003. Lupus Eritromatoso sisitêmico. Revista Bioquímica e

Ortomolecular. 12: 30-31.

75 Mota C. J. A., Silva C. X. A. & Gonçalves V. L. C. 2009. Gliceroquímica: novos

produtos e processos a partir da glicerina de procução de biodiesel. Química Nova.

32(3): 639-648.

76 Moura J.G.P. 2009. Nutrientes e terapêutica, como usá-los quando usá-lo como

avalia suas carências radicias livres na saúde. 2nd. Pelotas: Visão artes, 340p.

77 Mycock D.J., Wesley-Smith J. & Berjak P. 1995. Cryopreservation of somatic

embryos of four species with and without cryoprotectant pre-tratment. Annals of

Botany. 75: 331-336.

78 Newton H., Fisher J., Arnold J.R.P., Pegg D.E., Faddy M.J. & Gosden R.G.

1998. Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in preparation for

cryopreservation. Human Reproduction. 13: 376-380.

62

79 Oliveira C.G. 2005. Regulação gênica da biosíntese de violaceína e Quorum sensing

em Chromobacterium violaceum. 159f. Florianópolis, SC. Tese (Doutorado em

Engenharia Química) - Programa de Pós-graduação em Engenharia Química,

Universidade Federal de Santa Catarina.

80 Orlato D. 2006. Efeitos do DMSO (dimetilsulfóxido), administrado por via

intravenosa, sobre as funções renal e hepática, perfil hidrossalino e hemograma de cães

sadios. 52f. Jaboticabal, SP. Dissetação (mestrado em cirurgia veterinária) - Faculdade

de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade estadual paulista Júlio de Mesquita

Filho.

81 Otsuki S., Quina W., Ishihara A. & Kae T. 2002. Elicidation of dimethylsulfone

metabolism in rat using a 35S radioisotope tracer method. Nutrition Researche. 22: 313-

322.

82 Parker M.G., Fraser G.L., Watson D.M. & Riker R.R. 2002. Removal of

propylene glycol and correction of increased osmolar gap by hemodialysis in a patient

on high dose lorazepan infusion therapy. Journal of Intensive Care Medicine. 28:81-84.

83 Parmegiani L., Cognigni G.E., Bernardi S., Ciampaglia W., Infante F.,

Pocognoli P., Fatis C. T., Troilo E. & Filicori M. 2008. Freezing within 2 h from

oocyte retrieval increases the efficiency of human oocyte cryopreservation when using a

slow freezing/rapid thawing protocol with high sucrose concentration. Human

Reproduction. 23: 1771–1777.

84 Patsouris D., Mandard S., Voshol P.J., Escher P., Tan N.S., Havekes L.M.,

Koening W., März W., Tafuri S., Wahli W., Müller M. & Kersten S. 2004. PPARα

governs glycerol metabolism. The Journal of Clinical Investigation. 114(1): 94-103.

63

85 Paynter S.J. 2000. Current status of the cryopreservation of human unfertilized

oocytes. Human Reproduction. 5: 449-456.

86 Pegg D. E. 2007. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols Methods in:

Molecular Biology, 2.ed. Totowa:Humana Press Inc. 348p.

87 Plattner H., Fischer W.M., Schmitt W.W. & Cachmann L. 1972. Freeze etching

of cells without cryoprotectants. The Journal of Cell Biology. 53: 116-126.

88 Polge C.S., Smith A.U. & Parks A.S. 1949. Revival of spermatozoa after

vitrification and dehydration at low temperatures. Nature. 164:666

89 Rall W.F., Reid D.S. & Polge C. 1984. Analysis of slow-warming injury of mouse

embryos by cryomicroscopical and physiochemical methods. Cryobiology. 21: 106-121.

90 Fuller B, & Paynter S 2004. Fundamentals of cryobiology in reproductive

medicine. Reproductive BioMedicine Online. 9: 680-69.

91 Rodrigues A.P.R., Amorim C.A., Costa S.H.F., Matos M.H.T., Santos R.R.,

Lucci C.M., Báo S.N., Ohashi O.M. & Figueiredo J.R. 2004a. Criopreservation of

caprine ovarian tissue using glycerol and ethylene glycol. Theriogenology. 61: 1009-

1024.

92 Rodrigues A.P.R., Amorim C.A., Costa S.H.F., Matos M.H.T., Santos R.R.,

Lucci C.M., Báo S.N., Ohashi O.M. & Figueiredo J.R. 2004b. Cryopreservation of

caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol. Animal Reproduction

Science. 84: 211-227

93 Rosenbaum E.E., Herscheler R.J. & Jacob S.W. 1965. Dimethyl sulfoxide in

musculoskeletal disordens. Journal of the American Medical Association. 192(2): 309-

313.

64

94 Rubinsky B. 2003. Principles of low temperature cell preservation. Heart Failure

Reviews. 8: 277-284.

95 Ruddick J.A., 1972. Toxicology, metabolism, and biochemistry of 1,2-propanediol.

Toxicology Applied Pharmacology. 21: 102-111

96 Sanches, B. V. 2009. Uso de propanediol ou DMSO na vitrificação de embriões

bovinos produzidos in vitro, cultivados ou não na presença de Forskolin,dissertação,

Universidade federal de Goiás. 49f. Gôiania, GO. dissertação (Mestrado em ciência

veterinária). Programa de pós-graduação em ciência animal, Escola de veterinária da

Universidade Federal de Goias.

97 Santos R.R., Hurk R.V.D., Rodrigues A.P.R., Costa S.H.F., Martins F.S., Matos

M.H.T., Celestino J.J.H. & Figueiredo J.R. 2007. Effect of cryopreservation on

viability, activation and growth of in situ and isolated ovine early-stage follicles. Animal

Reproduction Science. 99: 53-64.

98 Santos R.R., Rodriuges A.P.R., Costa S. H. F., Matos M.H.T., Silva J.R.V.,

Celestino J.J.H., Martins F.S., Saraiva M.V.A., Melo M.A.P. & Figueiredo J.R.

2006. Teste de toxicidade e criopreservação de folículos pré-antrais ovinos isolados

utilizando glicerol, etilenoglicol, dimetilsulfóxido e propanodiol. Brazilian Journal of

Veterinary Research and Animal Science. 43(2): 250-255.

99 Schmidt M., Hyttel P., Avery B. & Greve T. 1995. Ultrastructure or in vitro

matured bovine oocytes aftes controlled freesing in 10% glycerol. Animal Reproduction

Science. 37: 281-290.

65

100 Schuchardt U. & Ribeiro M.L. 2001. A industria petroquímica no próximo

século: como substituir o petróleo como matéria-prima?. Química Nova. 24(2): 247-

251.

101 Shaw J.M., Cox S.L., Trounson A.O. & Jenkin G. 2000. Evaluation of the long-

term function of cryopreserved ovarian grafts in the mouse, implications for human

applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 161: 103-110.

102 Sheikhi M., Hultenby K., Niklasson B., Lundqvist M. & Hovatta O. 2011.

Clinical grade vitrification of human ovarian tissue: an ultrastructural analysis of

follicles and stroma in vitrified tissue. Human Reproduction. [In press].

103 Shirazi A., Soleimani M., Karimi M., Nazari H., Ahmadi E. & Heidari B. 2010.

Vitrification of in vitro produced ovine embyos at various developmental stages using

two methods. Cryobiology. 60: 204-210.

104 Simon A. 1996. Administration of glycerol to broilers in the drinking water.

Landbauforshung Volkenrode. 169:168-170.

105 Sojka J.E., Brisson-Kimmick S.V., Carlson G.P., Coppoc G.L. 1990. Dimethyl

sulfoxide update – New applications and dosing methods. Proceedings of the annual

convention of the American Association of Equine Practitioners. 36: 683-690.

106 Sumner S.C.J., Fennell T.R., Moore T.A., Chanas B., Gonzalez F. &

Ghanayem B.I. 1999. Role of cytochrome P450 2E1 in the metabolism of acrylamide

and acrylonitrile in mice. Chemical Research Toxicology. 12: 1110-1116.

107 Tan X., Song E., Liu X., You W. & Wan F. 2009. Factors affecting the survival,

fertilization, and embryonic development of mouse oocytes after vitifictionusing glass

capillaries, In Vito Cellular & Developmental Biology. 45:420-429.

66

108 Vajta G., Kuwayama M. & Vanderzwalmen P. 2007 Disadvantages and benefits

of vitrification. In: Vitrification in assisted reproduction A user‘s manual and

troubleshooting guide. London: Informa UK, pp. 33–44.

109 Vutyavanich T., Sreshthaputra O., Piromlertamorn W. & Nunta S. 2009.

Closed-system solid surface vitrification versus slow programmable freezing of mouse

2-cell embryos. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 26: 285-290.

110 Wallin A., Ghahremani M., Danhm-Kähler P. & Brännström M. 2009.

Viability and function of the cryopreserved whole ovary: in vitro studies in the sheep.

Human Reproduction. 24(7): 1684-16-94.

111 Wilson K.C., Reatdon C., Theodore A.C. & Farber H.W. 2005. Propylene

glycol toxicity: a severe iatrogenic illness in ICU patients receiving IV benzodiazepines.

Chest. 128(3): 1674 – 1681.

112 Wusteman M., Rauen U., Simmonds J., Hunds N. & Pegg D.E. 2008. Reduction

of cryoprotectant toxicity in cell in suspension by use of a sodium-fee vehicle solution.

Cryobiology. 56: 72-79.

113 Yamaji Y., Valdez Jr. D.M., Seki S., Yazawa K., Urakawa C., Jin B., Kasai M.,

Kleinhans F. W. & Edashige K. 2006. Cryoprotectant permeability of aquaporin-3

expressed in Xenopus oocytes. Cryobiology. 53: 258-267.

114 Yamaki S.B., Pedroso A.G. & Atvars T. D. Z. 2002. O estado vítreo dentro da

perspectiva do curso de graduação em química (físico-química). Química Nova. 25(2):

330-334.

67

115 Yeoman R. R., Wolf D. P. & Lee D. M. 2005. Coculture of monkey ovarian

tissue increases survival after vitrification and slow-rate freezing. Fertility and Sterility.

83: 1248-1254.

116 Zampolla, T., Spikings, E., Zhang, T. & Rawson, D. M. 2009. Effect of

methanol and ME2SO exposure on mithocondrial activity and distribution in stage III

ovarian follicles of zebrafish (Danio rerio). Cryobiology. 59: 188-194

FIGURAS

Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: a

desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilato

aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase)

al. [25].

Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: a


aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase) – Adaptado de Corley et

68

Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído


Adaptado de Corley et

Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool de

desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase

Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído

desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase

69

sidrogenase; ALDH: aldeído

Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].

70

Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].

Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabóFigura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabólicos

71


criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et al.,[91]).

.



72



73

Tabela 1: . Principais resultados com a utilização de diferentes agentes crioprotetores na criopreservação de tecido ovariano e oócitos.

Estrutura Espécie Agentes crioprotetores Método Principais resultados Referencia

Ovário inteiro Humano 10% DMSO + 0,4% BSA Congelação lenta

(rápida 1°C/min)

Preservação da ultra-estrutura de folículos pré-antrais e células endoteliais

Martinez-Madrid et al. [68]

Ovário inteiro Camundongo 15% DMSO +15% EG+ 20% SS + 0,5M SAC

Vitrifiicação Nascimento de dois filhotes saudáveis, após procedimentos de cultivo, maturação e fertilização in

vitro dos oócitos recuperadose transplante de embriões

Hasegawa et al., 2006[47]

Ovário inteiro Ovino 1,5M PROH + 0,1M SAC + 2% HSA

Congelação lenta Características morfológicas de folículos preservadas, com aumento dos níveis de AMPc após perfusão in

vitro

Wallin et al. [110]

Ovário inteiro e

hemi-ovário

Camundongo 1,5 M DMSO Congelação lenta Restauração da função ovariana com nascimentos após transplante ortotópico de ovários criopreservados,

porém baixa fertilidade.

Liu et al. [62]

Fragmento cortical

(10 mm3)

Bovino 1,5 ou 3M DMSO, PROH, EG e GLI (10 ou 20%)

Congelação lenta DMSO e PROH demonstram ser mais efetivos na preservação da integridade estrutural de células

somáticas e reprodutivas

Lucci et al. [64]

Fragmento cortical

(20 mm3)

Ovino 2,6 M DMSO + 2,6 Acetamida + 1,31 M PROH +

0,0075M polietileno glicol

Vitrificação Nascimento de dois cordeiros saudáveis e um com má formação de membro, que veio a óbito dois meses após

o nascimento

Bordes et al. [8]

Fragmento Humano 1,5 M DMSO + 0,1M SAC + Congelação lenta Restauração da função ovariana com gestação natural Demeestere et al. [29]

74

cortical

(50 mm3)

10% SH

Fragmento cortical

(5 mm espessura)

Caprino 1,5 ou 3M DMSO, PROH Congelação lenta Percentual de folículos morfologicamente normais após a criopreservação foi superior com 1,5M de DMSO

quando comparado a 3M DMSO e 1,5 ou 3 M de PROH

Rodrigues et al. [92]

Fragmento cortical

(3 mm espessura)

Felino 1,5 M GLI ou EG Congelação lenta GLI não preservou a morfologia dos folículos pré-antrais colocar o resultado do EG

Lima et al. [60]

Oócito Camundongo 1,5 M PROH + 0,3 M SAC Congelação lenta Manutenção da organização do fuso meiótico em temperaturas subfisiológicas seguida por perda da

organização após aquiecimento

Chang et al [20]

Oócito Humano 1,5 M PROH + 0,3M SAC Congelação lenta Restauração do fuso meiótico após 3 horas de incubação pós descongelação com boas taxas de sobrevivência,

fertilização e gestação

Chen et al. [21]

Oócito Camundogo 5,5 M EG + 1,0M SAC + 20% SFB

Vitrificação Recuperação da organização do fuso meiótico após uma hora de incubação pós-descongelação

Chen et al. [22]

Oócito Ovino 20% EG + 20% DMSO + 0,5M SAC + 20% SFB

Vitrificação Desorganização do fuso e cromatina após maturação in vitro, redução dos níveis de MPF e MAPK de oócitos

vitrificados sem células do cumulus

Bogliolo et al. [7]

DMSO: dimetilsulfóxido; PROH: propanodiol: EG: etilenoglicol; GLI: glicerol; S: sacarose; BSA: albumina sérica bovina; SH: soro humano; SSS: substituto sintético de soro

75

3. JUSTIFICATIVA

Apesar de alguns protocolos para a criopreservação de tecido ovariano caprino já

terem sido testados, trabalhos que mostrem resultados mais relevantes, como a produção

embrionária ou gestação/nascimento nesta espécie, ainda não foram relatados. Este fato

restringe, de certa forma, a aplicação prática e rotineira da criopreservação na

reprodução animal assistida, haja vista que os protocolos atualmente utilizados ainda

não estão perfeitamente estabelecidos, necessitando, portanto de vários ajustes. Dentre

os ajustes necessários destaca-se a associação de crioprotetores intracelulares com

importantes substâncias como, por exemplo, o SFB e a sacarose, os quais poderiam

incrementar as soluções de criopreservação, aumentando consequentemente as taxas de

sucesso. No entanto, apesar de diversos estudos já relatarem o emprego da sacarose em

procedimentos de criopreservação, ainda não foi demonstrado o seu efeito sobre a

congelação de tecido ovariano caprino. Com relação ao SFB, embora amplamente

utilizado em protocolos de criopreservação, os efeitos da adição deste componente não

são cientificamente comprovados, bem como, os efeitos benéficos ao processo ainda

não foram atribuídas ao mesmo.

No tocante à avaliação de folículos pré-antrais congelados no tecido ovariano,

normalmente tem sido realizada através da histologia clássica e microscopia eletrônica

de transmissão (MET). A histologia clássica permite verificar apenas as alterações

morfológicas superficiais das células da granulosa e do oócito. Já a MET tem a

capacidade de revelar as mudanças ultra-estruturais foliculares, porém nem sempre as

características morfológicas avaliadas imediatamente após a descongelação estão

correlacionadas com a capacidade funcional do folículo. Assim um período de cultivo

após a descongelação permite uma avaliação mais fidedigna da viabilidade e função

folicular. Além disso, as técnicas para verificar a viabilidade de folículos isolados do

tecido ovariano, como os marcadores fluorescentes, são amplamente utilizados e

conferem uma maior segurança à análise.

Nesse sentido, a realização desse estudo foi de grande relevância para a

criobiologia por se tratar de um trabalho pioneiro, o qual mostra a importância da adição

de SFB e sacarose ao meio de congelação de tecido ovariano caprino. Os resultados

deste trabalho permitirão auxiliar na implementação de um protocolo exequível de

76

congelação lenta, além de viabilizar a implantação de bancos de germoplasma animal.

Sem dúvidas, esse estudo beneficiará produtores de animais de genética superior, e até

mesmo permitirá a conservação de espécies e raças em via ou ameaçadas de extinção.

Além disso, a criopreservação de tecido ovariano caprino poderá também ser de grande

interesse para a elucidação de questões ainda pouco esclarecidas na criopreservação do

tecido ovariano em animais de produção.

77

4. HIPÓTESE CIENTÍFICA

1) A adição de soro fetal bovino associado a sacarose à solução de congelação, pode

maximizar a viabilidade e o percentual de folículos pré-antrais morfologicamente

normais após congelação/descongelação.

78

5. OBJETIVOS

5.1 Geral

Definir uma solução de congelação lenta para folículos pré-antrais inclusos no

tecido ovariano caprino.

5.2 Específicos

Verificar a necessidade de adição do SFB e sacarose na solução de congelação lenta

para tecido ovariano caprino;

Avaliar a morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais caprinos após congelação

lenta, comparando a eficiência de diferentes agentes crioprotetores intracelulares

(EG, PROH e DMSO);

Avaliar a morfologia, ultra-estrutura e viabilidade de folículos pré-antrais após

congelação lenta e cultivo in vitro

79

6. CPÍTULO II

Solução de congelação contendo dimetilsulfóxido e soro fetal bovino

mantem a sobrevivencia e ultraesturura de folículos pré-antrais caprinos

após criopreservação e cultivo in vitro de tecido ovariano

Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum maintains survival

and ultrastructure of goat preantral follicles after cryopreservation and in vitro culture of

ovarian tissue

Periódico: Cell and Tissue Research (submetido em: Junho de 2011)

80

Abstract

Goat ovarian cortex fragments were subjected to slow freezing in the presence of

different solutions containing intracellular cryoprotectants, including 1.0 M of ethylene

glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO), with or without

sucrose and/or fetal calf serum (FSC). Histological examination revealed that only the

DMSO-containing solutions were able to maintain a follicular ultrastructure similar to

the morphology observed in the fresh control. Therefore, fragments previously

cryopreserved in DMSO solutions (with and without sucrose and/or FCS) were cultured

in vitro for 48 h and then subjected to viability, histological and ultrastructural analysis.

No significant differences were observed among the percentages of morphologically

normal follicles in cryopreserved ovarian tissue before in vitro culture (DMSO: 62.5%;

DMSO+sucrose: 68.3%; DMSO+FCS: 60.0%; DMSO+sucrose+FCS: 60.0%) and after

culture (DMSO: 60.8%; DMSO+sucrose: 64.2%; DMSO+FCS: 70.8%;

DMSO+sucrose+FCS: 55.0%) . After in vitro culture, the viability analysis showed that

only the freezing solution containing DMSO and FCS (75.6%) maintained a percentage

of viable follicles similar to that observed after culture without cryopreservation

(89.3%). As determined by ultrastructural analysis, morphologically normal preantral

follicles were detected in the fresh control and in fragments cultured before and after

cryopreservation with DMSO and FCS. In conclusion, the freezing solution containing

DMSO and FSC, under the experimental conditions tested, guaranteed the maintenance

of viability and follicular ultrastructure after short-term in vitro culture.

Keywords: Cryopreservation. Freezing solution. Preantral follicle. Caprine.

81

1. Introduction

Ovarian tissue cryopreservation has aroused much interest especially for

application in human reproductive medicine. This technique may be an indispensable

complement to other assisted reproductive techniques that aim to preserve the endocrine

and reproductive functions of women after chemotherapy and/or radiotherapy (Broecke

et al., 2001). In animal reproduction, preservation of ovarian tissue in cryobanks

provides the means to preserve the genetic heritage of females that possesses superior

genetics but have lost their reproductive function due to death or diseases. Likewise,

this technique may be used to preserve the genetic material from endangered breed or

species (Comizzoli et al., 2000).

In caprine species, for example, it has been documented that gonadal function

recovers following auto-transplantation of cryopreserved ovarian tissue (Santos et al.,

2009). However, many adjustments are necessary to define an optimal cryopreservation

protocol for ovarian tissue in this species. In an attempt to enhance these protocols,

different compositions of freezing solutions have been investigated (Rodrigues et al.

2004ab; Luz et al. 2009; Faustino et al. 2010). For use in these solutions, intracellular

cryoprotectant agents (CPAs) have been investigated. These agents include ethylene

glycol (EG; feline: Lima et al. 2009; caprine: Faustino et al. 2010), propanediol (PROH;

bovine: Lucci et al., 2004; caprine: Luz 2010) and dimethyl sulfoxide (DMSO; ovine:

Pinto et al., 2008; caprine: Luz et al., 2009). However, no studies have compared, under

optimal conditions, the efficiency of these agents for the preservation of goat ovarian

tissue.

In addition to the intracellular CPAs, substances such as sucrose (Marsella et al.,

2008; Fabbri et al., 2010) and fetal calf serum (FCS; Jahnukainen et al., 2007; Milazzo

et al., 2008; Izadyar et al., 2002) have been routinely used to maximize the efficiency of

82

freezing solutions. These substances have the ability to interact and preserve the

structural and functional integrity of the cell membrane (Anchordoguy et al., 1988;

Crowe et al., 2003; He & Woods, 2004). In addition, they can act in the extracellular

space and indirectly prevent the formation of intracellular ice crystals (Santos et al.,

2000), which are one of the major causes of cell injury during the slow freezing process

of cryopreservation.

When added to a freezing solution, sucrose alters the osmotic gradient, promotes

cell dehydration and inhibits intracellular ice formation during cryopreservation (Santos

et al 2006b). Furthermore, studies have shown that the addition of sucrose to the

freezing solution stabilizes the phospholipids that form the lipid bilayer (Danso and

Ford-Lloyd, 2004) and increases post-thaw cell survival (Borini et al., 2006; Zhang et

al., 2009). Santos et al. (2006b) showed that a solution containing 0.5 M sucrose and 1.0

M EG was effective for goat ovarian tissue cryopreservation. Although the FCS was

considered an unnecessary component in the freezing solution for goat ovaries

(Campbell & Brockbank, 2007), this substance has been widely used for ovarian tissue

cryopreservation in other species (murine: Choi et al., 2008; caprine: Luz et al., 2009;

ovine: Onions et al., 2008: human: Isachenko et al., 2003). However, it is not known

which intracellular CPA (EG, PROH or DMSO) is most effective for preantral follicle

preservation. Furthermore, it is unknown whether the addition of sucrose at a low

concentration (0.1 M) or 10% FSC is beneficial or essential for goat ovarian tissue

cryopreservation.

The objectives of the present study included the following: i) to determine the

efficiency of EG, PROH or DMSO as intracellular CPAs, ii) to determine the best

composition (intracellular CPAs, sucrose and/or FCS) of slow freezing solution for

83

preantral follicles enclosed in goat ovarian tissue, and iii) to evaluate the ultrastructure

of caprine preantral follicles after slow freezing and short-term in vitro culture (48 h).

2. Materials and methods

2.1. Source and transport of ovaries

Ovaries from adult mixed-breed goats (Capra hircus) were obtained at a local

slaughterhouse. Ovaries were washed once in 70% alcohol and twice in HEPES-

buffered MEM (HMEM; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), supplemented

with 0.1% (v:v) penicillin/streptomycin (Sigma). Within 1 h of slaughter, the ovaries

were transported to the laboratory in thermos flasks at 20 °C.

2.2. Experiment 1: Determination of the slow freezing solution for ovarian tissue

2.2.1. Experimental design

At the laboratory, the cortex from each pair of ovaries (n = 5) was removed and

13 fragments (3x3x1 mm) were obtained. One fragment (fresh control) was immediately

fixed in Carnoy’s solution for 4 h for histological examination. The remaining

fragments (n = 12) were cryopreserved. In total, 13 treatments were included in this

work. The freezing solutions were composed of HMEM supplemented with EG, PROH

or DMSO with or without 0.1 M sucrose and/or 10% FCS. The concentration (1.0 M)

and exposure times for EG (5 min), PROH (5 min) and DMSO (10 min) were

84

previously defined by Faustino (2009), Luz et al. (2008) and Luz et al. (unpublished

data), respectively.

The slow freezing was performed according to the protocol described by

Faustino (2009), with some modifications. Briefly, ovarian fragments were exposed to

1.8 ml of freezing solution for 5 (EG or PROH) or 10 (DMSO) min in macrotubes.

After the exposure period, the macrotubes were transferred to a programmable freezer

(Freeze Control, CryoLogic Pty Ltd., Waverley, Australia), previously equilibrated at

20 ºC. The vials were cooled at 2 °C/min from 20 °C to -7 °C, and ice crystal formation

(seeding) was manually induced by touching the vials with forceps that were pre-cooled

in liquid nitrogen (-196 ºC). After 10 min, the vials were cooled at 0.3 º C/min to -40 °C

and finally at 10 °C/min to -70 °C. The samples were immersed into liquid nitrogen and

stored for up to one week.

To thaw, the vials were removed from liquid nitrogen, kept at room

temperature (~20 °C) for 1 min and then immersed in a 37 °C water bath until the

freezing solution was completely melted. In all treatments, the CPA was removed by a

three-step equilibration, which employed a 5 min treatment in each of the following: (i)

HMEM + 10% FCS + 0.5 M sucrose, (ii) HMEM + 10% FCS + 0.25 M sucrose, and

(iii) HMEM + 10% FCS. Thereafter, the ovarian tissue fragments were fixed for

histological examination.

2.2.2 Histological examination of preantral follicles

For histological examination, after fixation in Carnoy’s solution, the ovarian

fragments were dehydrated in ethanol, cleared in xylene, embedded in paraffin wax, and

serially sectioned at 5 µm. Every fifth section was mounted on a glass slide and stained

85

with hematoxylin – eosin (HE). All sections were examined using a light microscope

(Nikon, Tokyo, Japan) at a magnification of x 400. For each treatment, 30 preantral

follicles were analyzed per repetition. Only preantral follicles with visible nuclei were

counted. Preantral follicles (one or more layers of granulosa cells and no antral cavity)

were classified as morphologically normal if they presented intact oocyte and granulosa

cells. The follicles were considered degenerated if they contained a pyknotic oocyte

nucleus or shrunken ooplasm, with or without disorganized granulosa cells and/or

detachment of the basement membrane (Rodrigues et al. 2004).

2.2.3 Viability analysis of preantral follicles

The effect of cryopreservation on the viability of preantral follicles was studied.

Based on histological analysis, goat ovarian tissue were obtained from adult goats (n =

5) and cryopreserved using the CPA that better preserved the follicular morphology.

The preantral follicles were isolated from the fresh control or the frozen/thawed ovarian

fragments using the mechanical method described by Lucci et al. (1999), with some

modifications. Briefly, with a tissue chopper (the Mickle Laboratory Engineering Co.,

Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 75 µm, samples were cut into

small pieces and placed in 2 ml MEM supplemented with 3 mg/ml bovine serum

albumin (BSA). Samples were then pipetted 100 times using a large Pasteur pipette

(1600 µm) and 100 times with a smaller Pasteur pipette (600 µm) to dissociate preantral

follicles from stroma. The resulting suspension was filtered through 200 µm nylon mesh

filters.

Preantral follicles found in the suspension were then transferred to 100 µl

droplets of MEM. Thereafter, the viability of the preantral follicles (< 200 µm) was

86

assessed using a two-color fluorescent cell viability assay, which allowed for

simultaneous detection of live and dead cells by calcein-AM and ethidium homodimer-1

probes, respectively. Calcein-AM revealed intracellular esterase activity of viable cells;

ethidium homodimer-1 labeled nucleic acids of non-viable cells, which indicated

disruption of the plasma membrane. The test was performed by adding 4 µM calcein-

AM and 2 µM ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe,

Germany) to each drop of MEM that contained the isolated follicles. Samples were then

incubated at 37 °C for 15 min. After labeling, preantral follicles were classified as

viable if the cytoplasm of the oocytes and granulosa cells was stained with calcein-AM

(green) and chromatin was not stained with ethidium homodimer (red), and otherwise

they were considered non-viable (stained in red with ethidium homodimer-1) (Figure 1),

Images were obtained using an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at a

magnification of 400 x. The wavelengths used for excitation/emission were 458/515 nm

for calcein AM and 525/ 590 for ethidium homodimer-1.

2.3 Experiment 2: In vitro culture of preantral follicles enclosed in ovarian cortex

frozen/thawed

2.3.1. Experimental design

Using the results of experiment 1, we defined an experimental protocol for

experiment 2 to assess the survival, ultrastructure and viability of cryopreserved

preantral follicles after short-term in vitro culture (48 h). After dissection of the goat

ovaries (n = 10), 14 fragments (9 mm3) were obtained from each ovarian pair. One

fragment was immediately fixed for histological examination and transmission electron

87

microscopy (TEM); this fragment represents the fresh control (control 1). Another

fragment was also randomly taken for the in vitro culture (cultured control non-

cryopreserved: control 2). The remaining fragments (n = 12) were cryopreserved in

triplicate, using one of four treatments. We utilized the four CPA-containing freezing

solutions that gave the best results in experiment 1, as defined by morphological and

viability by fluorescence. After thawing, one fragment from each treatment (DMSO

with or without sucrose and/or FCS) was histologically examined, and the other two

fragments were cultured in vitro. At the end of the culture period, the fragments were

subjected to histological analysis, ultrastructural analysis and viability assessment using

fluorescent markers. From each fragment reserved for histological analysis, a small

sample was removed and fixed for TEM.

For the 48 h in vitro culture, ovarian fragments were separately transferred to a

24-well culture dish (Corning, NY, USA), which contained 1 ml of culture medium per

well. The culture medium consisted of αMEM supplemented with ITS (1.0 µg/ml

insulin, 0.55 µg/ml transferrin and 5 ng/ml selenium), 50 ng/ml follicle-stimulating

hormone (FSH), 50 µg/ml ascorbic acid, 2 mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 1.25

mg/ml BSA, 100 µg/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Ovarian tissues were

cultured at 39 °C in an atmosphere of 5% CO2 in air.

2.3.3 Ultrastructural analysis

For a more in-depth evaluation of follicular morphology after histological

analysis, ultrastructural studies were performed on fragments from fresh, cultured

control and cryopreserved/cultured groups. A portion of tissue, with a maximum

dimension of 1 mm3, was cut from each fragment of ovarian tissue. The tissue was then

88

fixed in Karnovsky solution (4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M

sodium cacodylate buffer at pH 7.2) for 4 h at room temperature. After two washes in

the sodium cacodylate buffer, specimens were post-fixed in 1% osmium tetroxide and

0.8% potassium ferricyanide in 0.1 M sodium cacodylate buffer for 1 h at room

temperature. The samples were dehydrated through a gradient of acetone solutions and

then embedded in Spurr resin. Afterward, semi-thin sections (4 µm) were cut, stained

with toluidine blue and analyzed by light microscopy at 400 x magnification. Ultra-thin

sections (70–75 nm) were obtained from preantral follicles, which were classified as

morphologically normal in semi-thin sections, according to standard histological

criteria. Subsequently, ultra-thin sections were examined under a transmission electron

microscope (Jeol JEM 1011) operating at 80 kV. The density and integrity of the

ooplasmic and granulosa cells and organelles were evaluated. We also assessed

vacuolization and membrane integrity of the samples.

2.4 Statistical analysis

Percentages of morphologically normal follicles observed in both assays were

initially subjected to Shapiro-Wilk and Bartlett’s tests to confirm normal distribution

and homogeneity of variance, respectively. Results obtained from the first assay were

then submitted to analysis of variance using the PROC GLM procedure of SAS (SAS

Inst. Inc., Cary, NC, USA); a 3×3 factorial arrangement of treatments was used, and

cryoprotectant (EG, PROH or DMSO) and supplementation (with sucrose, FCS or both)

were employed as the main effects. Ovarian fragments were considered as the

experimental units. The model was used: Yij=µ+Ci +Sj+(Ci×Sj)+eij, where Yijk =

dependent variable (percentage of morphologically normal preantral follicles), µ=

89

general mean; Ci = Cryoprotectant, Sj = Supplementation, Ci×Sj = interaction between

cryoprotectant and supplementation and eij = residual error. The second assay was

performed according to a 2×2×3 factorial arrangement of treatments, with medium (with

or without DMSO), procedure (only cryopreservation and cryopreservation followed by

culture) and supplementation (with sucrose, FCS or both supplements) used as the main

effects. The following model was used: Yijk=µ+Mi+Pj+Sk+(Mi×Pj)+(Pj×Sk)+eijk, where

Yijk = dependent variable, µ= general mean; Mi = Medium with or without DMSO, Pj =

Procedure, Sk = Supplementation, Mi×Pj = interaction between medium and procedure,

Pj×Sk = interaction between procedure and supplementation and eijk = residual error.

When any main effect or interactions was significant, the means were separated by

Student-Newman-Keuls test. For evaluation of viability using fluorescent markers,

follicles were taken as a pool and analyzed for dispersion of frequency with Chi-square

test. In all cases, differences were considered to be significant when P<0.05, and the

results were expressed as mean + standard deviation (SD).

3. Results

3.1 Experiment 1: Determination of the slow freezing solution for ovarian tissue

Using histological analysis, a total of 1950 preantral follicles, taken from 13

treatment groups, were morphologically evaluated. Figure 2 shows the percentage of

morphologically normal preantral follicles enclosed in fresh ovarian fragments and

those in fragments subjected to freezing with EG, PROH or DMSO supplemented or not

witch sucrose and/or FCS. The percentage of morphologically normal follicles in the

fresh control (non-cryopreserved tissue) was 85.5%. After cryopreservation, there was a

90

significant decrease (P < 0.05) in the percentage of morphologically normal follicles, as

compared to the control. However, this decline in the number of normal follicles was

not seen when the ovarian tissue was cryopreserved in a freezing solution containing

DMSO alone (69.3%) or associated with FCS (70.0%). However, when the

cryopreservation treatments were compared to each other, no significant difference was

observed.

The follicular viability, detected by fluorescent markers, was determined in

follicles from the fresh tissue and after cryopreservation with DMSO with or without

supplementation in the absence or presence of sucrose and/or FCS. The percentage of

viable follicles found in the fresh control (97.7%), DMSO (96.0%), DMSO plus sucrose

(100.0%), FCS (100.0%) or both (100.0%) did not significantly differ (P > 0.05).

3.2 Experiment 2: In vitro culture of preantral follicles enclosed in ovarian cortex

frozen/thawed

The percentages of morphologically normal preantral follicles observed in the

fresh control, cultured control, and after cryopreservation with DMSO (with sucrose

and/or FCS), with or without 48 h of in vitro culture (Figure 3), are shown in Table 1.

In the cultured control, we observed a reduction in the percentage of

morphologically normal follicles (64.2%), as compared to the fresh control (90.8%). The

interaction between the procedure of cryopreservation and in vitro culture no showed

significant effect, ie, the percentage of morphologically normal follicles remained similar

to the cultured control (P > 0.05). Moreover, no significant difference between the

percentage of morphologically normal follicles was observed when ovarian tissue was

only cryopreserved and after in vitro culture prior cryopreservation.

91

3.3 Ultrastructure analysis of goat preantral follicles

Only goat preantral follicles from the fresh control, cultured control, and those

cryopreserved in freezing solution containing DMSO and FBS followed by in vitro

culture were found to be morphologically normal by ultrastructural analysis. These

follicles showed intact granulosa cells, finely granulated ooplasm, intact and abundant

organelles, rare vacuoles and an absence of nuclear changes (Figures 4; 5E and F). In

contrast, follicles cultured after cryopreservation with only DMSO exhibited few

vacuoles and irregular or turgid mitochondria (Figure 5 A and B).

Regardless of the presence of FCS, the addition of sucrose to the freezing

medium resulted in ultrastructural changes such as detachment of granulosa cells,

swelling of the mitochondria and endoplasmic reticulum, and alteration in the nuclear

membrane with segregation of the lipid bilayer. These changes can be observed in

Figures 4 C, D, G and H.

The fluorescent viability analysis of the in vitro cultured preantral follicles

revealed that only the freezing solution containing DMSO supplemented with FCS

(75.6%) was able to maintain a percentage of viable follicles similar to the cultured

control (89.3%). Otherwise, follicular viability was significantly reduced when ovarian

tissue was cryopreserved in freezing solutions containing only DMSO, DMSO +

sucrose or DMSO + sucrose + FCS, as compared with ovarian tissue cultured without

cryopreservation. Furthermore, the follicular viability of tissue cryopreserved with a

freezing solution containing only DMSO was significantly inferior to the solution

containing DMSO supplemented with FCS (P < 0.05, Table 2).

92

4. Discussion

In this study, 12 freezing solutions composed of different CPAs (EG, PROH

and DMSO) and with or without sucrose and/or FBS were used to cryopreserve goat

ovarian tissue. For the first time, it was demonstrated the need for the addition of FCS,

freezing solution containing 1,0 M of DMSO, to maintain the viability and

ultrastructure of preantral follicles enclosed in goat ovarian tissue, which has been

cryopreserved and cultured in vitro for a short period (48 h).

In the first experiment, in which the efficiency of three different intracellular

CPAs was investigated, we found that only the solutions containing DMSO, with or

without FCS, retained a follicular morphology similar to that observed in non-

cryopreserved tissue. Previous studies have reported success using EG (Faustino, 2009) or

PROH (Luz et al., 2010). However, in the present study, DMSO was more effective; it was

the only CPA that maintained a follicular morphology similar to that found in the fresh

control.

The effects of ovarian tissue freezing on the preantral follicles are typically

evaluated immediately after thawing. However, following cryopreservation, molecular

changes may occur and manifest themselves with the resumption of metabolism and

follicular development (Siebzehnrübl et al., 2000). Studies have shown that short-term

culture can be used as a valuable tool to verify the developmental ability of

cryopreserved preantral follicles (Choi et al 2008, Amorim et al., 2009). Based on these

studies, we used short-term in vitro culture as an additional tool to precisely evaluate the

follicular cryopreservation procedure. After in vitro culture for 48 hours, no difference

in the percentage of morphologically normal follicles was observed between fragments

that were cultured or cryopreserved/cultured. The cryopreservation procedure may

93

promote several follicular changes, including loss of cell and membrane integrity,

decrease in mitochondrial activity (Santos et al., 2006b) and damage to the cytoskeleton

(Smith et al., 2004). These changes usually lead to degeneration, with loss of typical

configuration, which prevents the identification of these follicles after culture (Sheikh et

al., 2011). Thus, only normal or minimally damaged follicles are displayed.

In this study, the analysis of viability showed no difference between the control

and other treatments immediately after thawing. However, after 48 h of in vitro culture,

only the ovarian tissue cryopreserved with DMSO and FCS maintained a percentage of

viable follicles similar to the cultured control. These findings are consistent with other

studies that demonstrate the importance of FCS for both cryopreservation and in vitro

culture (Abedelahi et al., 2008). This may be due to the role of FCS as a survival factor

and a promoter of follicular development (Mao et al., 2002; Basso et al., 2007).

Specifically for cryopreservation, FCS has the ability to alter the physiological

membrane permeability (Marco-Jiménez et al., 2006), and provides protection to the plasma

membrane, since the amino acids of proteins contained in serum interact electrostatically with

the phosphate groups in the membrane phospholipids, (Anchordoguy et al., 1988; Picton et

al., 2008).

The ultrastructural evaluation revealed normal preantral follicles after culture

of ovarian tissue previously frozen in DMSO and FCS. On the other hand, the addition

of 0.1 M sucrose, with or without FCS, resulted in ultrastructural changes such as

swollen organelles (mitochondria and endoplasmic reticulum), cytoplasmic

vacuolization and loss of nuclear membrane integrity. These modifications may result

from an osmotic imbalance, as previously described in human ovarian tissue

cryopreserved in the presence of sucrose (Fabri et al., 2010). Santos et al. (2006b)

suggested that when ovarian tissue is cryopreserved in a solution containing sucrose, the

94

sugar facilitates proper cell rehydration during thawing and cryoprotectant removal.

However, if cryoprotectant removal occurs too slowly, the CPA can remain in the

tissues for an extended period, which results in deleterious effects on the follicle cells.

The results of our study are consistent with other studies that evaluated the effect of

sucrose in cryopreservation solutions. Using 0.2 or 0.3 M sucrose, Marsella et al. (2008)

observed poor follicular preservation associated with wide and irreversible stromal cells

degeneration, which was likely due to the osmotic shock. Structural damages were also

observed in human follicles after ovarian tissue cryopreservation in the presence of

higher (0.3 M) sucrose concentrations (Fabbri et al., 2010). We believe that the

concentration of 0.1 M used in the present study promoted excessive follicular

dehydration. These results demonstrate that, under these experimental conditions,

sucrose is unnecessary in the freezing solution. However, do not discard the possibility

of lower concentrations than 0.1 M and the adding of multi-step, can be beneficial when

added to the cryopreservation solution.

The results of this study allowed us to conclude that a freezing solution

containing DMSO and FCS was efficient for ovarian tissue preservation, under

experimental conditions tested, and ensured the maintenance of follicular viability and

ultrastructure after 48 h of in vitro culture.

95

References

Abedelahi A, Salehnia M, Allameh AA (2008) The effects of different concentration of sodium selenite on the in vitro maturation of preantral follicles in serum-free and serum supplemented media. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 25: 483-488

Amorim CA, Langendonckt AV, David A, Dolmans MM, Donnez J (2009) Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro cultures in a calcium alginate matrix. Human Reproduction. 24(1): 92-99.

Anchordoguy T, Carpenter JF, Loomis SH, Crowe JH (1988) Mechanisms of interaction of amino acids with phospolipid bilayers during freezing. Biochimica at Biophysica Acta, 946: 299-306.

Basso AC, Garcia JM, Esper CR (2007) Efeitos de diferentes sistemas de dultivo in vitro sobre o crescimento de folículos pré-antrais isolados de ovários de fetos bovinos. Brazilian Journal of veterinary Research and Animal Science 44: 134-143.

Borini A, Sciajno R, Bianchi V, Sereni E, Flamigni C, Coticchio G (2006) Clinical outcome of oocyte cryopreservation after slow cooling with a protocol utilizing a high sucrose concentration. Human Reproduction. 21(2): 512-517.

Broecke RVD, Liu J, Handyside A, Elst JCVD, Krausz T, Dhont M, Winston RM, Hovatta O (2001) Follicular growth in fresh and cryopreserved human ovarian cortical grafts transplanted to immunodeficient mice. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 97: 193-201.

Campbell LH, Brockbank KGM (2007) Serum-free solution for cryopreservation of cells. In vitro Cellular & Developmental Biology, 43: 269-275

Choi JY, Lee BE, Lee EY, Yoon BK, Bae DS, Choi DS (2008) Cryopreservation of ovarian tissue temporarily suppresses the proliferation of granulose cells in mouse preantral follicles. Cryobiology, 56: 36-42.

Comizzole P, Mermillod P, Mauget R (2000) Reproductive biotechinologies for endangered mammalian species.Reproduction Nutrition Development. 40: 493-504.

Crowe JH, Tablin F, Wolkers WF, Gousset K, Tsvetkova NM, Ricker J (2003) Stabilization of membranes in human plateles freze-dried with trehalose. Chemistry and Physics of Lipids, 122: 41-52.

Danso KE, Ford-Lloyd BV (2004) Cryopreservation of embryogenic calli of cassava using sucrose cryoprotection and air desiccation. Plant cell rep, 22: 623-631.

96

Fabbri R, Pasquinelli G, Keane D, Magnani V, Paradisi R, Venturoli S (2010) Optimization of protocols for human ovarian tissue cryopreservation with sucrose, 1,2-propanediol and human serum. Reproductive Biomedicine online, 221: 819-828.

Faustino LR (2009) dissertation: Different concentrations and time of exposure to ethylene glycol for cryopreservation of ovarian tissue goat and sheep. Programa graduate in veterinary science. State University of Ceara. Fortaleza

Faustino LR, Santos RR, Silva CMG, Pinto LC, Celestino JJH, Campello CC, Figueiredo JR, Rodrigues APR (2010) Goat and sheep ovarian tissue cryopreservation: Effects on the morphology and development of primordial follicles and density of stromal cell. Animal Reproduction Science. 122: 90–97.

He S, Woods LC (2004) Effects of dimethyl sulfoxide and glycine on cryopreservation induced damage of plasma membranes and mitochondria to striped bass (Morone saxatilis) sperm.Cryobiology, 48: 254-262.

Huang J, Li Q, Zhao R, Li W, Han Z, Chen X, Xiao B, Shuyun W, Jiang Z, Hu J, Liu L (2008) Effect of sugar on maturation rate of vitrified-thawed immature porcine oocytes. Animal Reproduction science, 106: 25-35.

Isachenko E, Isachenko V, Rahimi G, Nawroth F (2003) Cryopreservation of human ovarian tissue by direct plugning into liquid nitrogen. European journal of obstetrics & gynecology and reproductive biology, 1008(2): 186-193

Izadyar F, Matthijs-Rijsenbilt JJ, Ouden KD, Creemers LB, Woelders H, De Rooij DG (2002) Development of a Cryopreservation Protocol for Type A Spermatogonia. Journal of Andrology, 23: 537-545.

Jahnukainen K, Ehmcke J, Hergenrother SD, Schlatt S (2007) Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction, 22: 1060–1067.

Lima AK, Silva AR, Santos RR, Sales DM, Evangelista AF, Figueiredo JR, Silva LD (2006) Cryopreservation of preantral ovarian follicles in situ from domestic cats (Felis

catus) using different cryoprotective agents. Theriogenology. 66:1664-1666.

Lucci CM, Amorim CA, Báo SN, Figueiredo JR, Rodrigues APR, Silva JR, Gonçalves PBD (1999) Effect of the interval of serial sections of ovarian in the tissue chopper on the number of isolated caprine preantral follicles. Animal Reproduction Science, 56: 39-49.

Lucci CM, Kacinskis MA, Lopes LHR, Rumpf R, Báo SN (2004) Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine (Bos

indicus) ovarian tissue. Theriogenology, 61: 1101-1114.

97

Luz VB, Santos RR, Pinto LC, Soares AAX, Celestino JJH, Mafezoli J, Campello CC, Figueiredo JR, Rodrigues APR (2009) Dimethyl sulfoxide perfusion in caprine ovarian tissue and its relationship with follicular viability after cryopreservation. Fertility and Sterility, 91: 1513-1515.

Mao J, Wu G, Smith MF, McCauley TC, Cantley TC, Prather RS, Didion BA, Day BN (2002) Effects of culture medium, serum type, and various concentration of follicle-stimulating hormone on porcine preantral follicular development and anntrum formation in vitro. Biology of Reproduction, 67: 1197-1203.

Marco-Jiménez F, Garzón DL, Peñaranda DS, Pérez L, Viudes-de Castro MP, Vicente JS, Jover M, Asturiano JF (2006) Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: Effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology, 53: 51-57.

Marsella T, Sena P, Xella S, La Marca A, Giulini S, De Pol A, Volpe A, Marzona L (2008) Human ovarian tissue cryopreservation: effect of sucrose concentration on morphological features after thawing. Reproductive Biomedicine online, 16: 257-267.

Milazzo JP, Vaudreuil L, Cauliez B, Gruel E, Masse L, Mousset-Siméon N, Macé B, Rives N (2008) Comparison of conditions for cryopreservation of testicular tissue from immature mice. Human Reproduction, 23: 17–28.

Onions VJ, Mitchell MRP, Campbell BK, Webb R (2008) Ovarian tissue viability following whole ovine ovary cryopreservation: assessing the effects of sphingosine-1-phosphate inclusion. Human reproduction, 23(3): 606-618.

Picton HM, Harris SE, Muruvi W, Chambers EL (2008) The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction, 136: 703-715.

Pinto LC, Santos RR, Faustino LR, Silva CMG, Luz VB, Maia-Júnior JE, Soares AAX, Celestino JJH, Mafezoli J, Campello CC, Figueiredo JR, Rodrigues APR (2008) Quantification of Dimethyl Sulfoxide Perfusion in Sheep Ovarian Tissue: A Predictive Parameter for follicular survival to cryopreservation. Biopreservation and biobanking, 6: 269-276.

Rodrigues APR, Amorim CA, Costa SHF, Matos MHT, Santos RR, Lucci CM, Báo SN, Ohashi OM, Figueiredo JR (2004) Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol. Animal Reproduction Science. 84: 211-227

Santos IRI (2000) Criopreservação: Potencial e perspectivas para a conservação de germoplasma vegetal. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 12:70-84.

Santos RR, Knijn HM, Vos PLAM, Oei CHY, van Loon T, Colenbrander B, Gadella BM, van den Hurk R, Roelen BAJ (2009) Complere follicular development and

98

recovery of ovarian function of frozen-thawed, autotransplanted caprine ovarian cortex. Fertility and Sterility, 91: 1455-1458

Santos RR, Rodrigues AP, Costa SH, Silva JR, Matos MH, Lucci CM, Báo SN, Van den Hurk R, Figueiredo JR (2006a) Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Animal Reproduction Science, 91: 249–263.

Santos RR, Tharasanit T, Figueiredo JR, Van Haeften T, van den Hurk R (2006b) Preservation of caprine preantral follicle viability after cryopreservation in sucrose and ethylene glycol. Cell and Tissue Research 325: 523-531.

Sheikhi M, Hultenby K, Niklasson B, Lundqvist M, Hovatta O (2011) Clinical grade vitrification of human ovarian tissue: an ultrastuctural analysis of follicles and stroma in vitrifie tissue. Human Reproduction in press

Siebzehnrubl E, Kohl J, Dittrich R, Wildt L ( 2000) Freezing of human ovarian tissue – not the oocytes but the granulose in the problem. Molecular and Cellular Endocrinology, 169(1): 109-111

Smith GD, Silva E, Silva CA (2004) Developmental consequences of cryopreservation of mammalian oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online, 9(2): 171-178.

Zhang JM, Liu XL, Yang YX, Wan XP (2010) Comparisons of different protocols for vitrifying mouse ovarian tissue. Reproduction in Domestic Animals, 45: 694-698.

Figure captions

Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein

(A) and non-viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer

fluorescence) (B).

Figure 2 Percentage (mean

(fresh control) and after slow

0.05).

Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green flourescence)

viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer

Figure 2 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles before

(fresh control) and after slow-freezing. *Differs significantly from the fresh control (

99

AM (green flourescence)

viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer-1 (red

SD) of morphologically normal preantral follicles before

freezing. *Differs significantly from the fresh control (P <

Figure 3 Histological sections of preantral follicles in which morphologically normal in

(A) fresh tissue, (B) cultured tissue no

DMSO added fetal calf serum are shown. (D) Degenerating preantral follicles after in

vitro culture of tissue predicting cryopreservation in freezing solution contain DMSO

without supplementation, (E) supplemented w

serum. Arrows indicate oocyte retraction and pyknotic nucleus.


(A) fresh tissue, (B) cultured tissue no cryopreserved and (C) cryopreserved with



without supplementation, (E) supplemented with sucrose and (F) sucrose/fetal calf

serum. Arrows indicate oocyte retraction and pyknotic nucleus.

100


cryopreserved and (C) cryopreserved with



ith sucrose and (F) sucrose/fetal calf

Figure 4 Goat preantral follicles from the fresh cont

D). In A, a well-preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells


magnification, note that ooplasm is finely granular an



Goat preantral follicles from the fresh control (A, B) and cultured control (C,

preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells


magnification, note that ooplasm is finely granular and the mitochondria are well



101

rol (A, B) and cultured control (C,

preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells


d the mitochondria are well-



102


vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C) 1µm (B, D).

103

104

Figure 5 Goat preantral follicles after cryopreservation with freezing solution containing

DMSO alone (A, B) and DMSO added by sucrose (C, D), fetal calf serum alone (E, F)

or fetal calf serum in combination with sucrose (G, H), followed by in vitro culture for

48 h. In A, normal granulosa cells are showed; however a vacuolated ooplasm can be

observed. In B and C, note alterations as detachment between granulosa cells and

oocyte, in D irregular mitochondria and swollen endoplasmic reticulum are showed in

the oocyte, besides the nuclear membrane thickening. (E) Note normal ooplasm finely

granulated and abundant organelles. (F) Intact nuclear membrane and normal

mitochondria and endoplasmic reticulum. (G) Normal granulosa cell and oocyte with an

irregular nucleus. (H) Oocyte with swollen mitochondria and vacuolated ooplasm. GC:


vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C, E, G) 1µm (B, D, F, H).

Table 1 Percentage (mean


short-term in vitro culture (48 h). *Differs signific

0.05).

Table 2 Percentage (mean ±


and/or fetal calf serum. a,b,c

Table 1 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in goat


term in vitro culture (48 h). *Differs significantly from the fresh control (

± SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48


Differs significantly (P < .05).

105

SD) of morphologically normal preantral follicles in goat


antly from the fresh control (P <

SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48


106

7. CONCLUSÕES

A utilização de DMSO como agente crioprotetor intracelular demostrou ser

eficiente para a preservação do tecido ovariano caprino, mantendo a morfologia de

folículos pré-antrais semelhante à observada no tecido não criopreservado.

A adição de soro fetal bovino à solução de congelação lenta contendo 1,0 M de

DMSO proporcionou um efeito aditivo benéfico, garantindo a manutenção da

viabilidade e da ultraestrutura após 48 horas de cultivo in vitro.

107

8. PERSPECTIVAS

No presente estudo foi demonstrado que a solução de congelação contendo 1,0 M

de DMSO adicionado 10% SFB, como fonte protéica foi mais eficiente em manter a

morfologia, viabilidade e ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos em tecido

ovariano caprino, após 48 horas de cultivo in vitro. . O protocolo apresentado poderá ser

utilizado de forma rotineira para a preservação de folículos pré-antrais caprinos, visando

a implantação de bancos de germoplasma. Contudo, considerando a variabilidade no

tocante à composição do SFB, o qual varia entre partidas, recomenda-se a realização de

experimentos na tentativa de buscar uma fonte protéica, cuja composição seja

completamente conhecida. Alem disso, faz-se necessário a realização de cultivo de

longa duração, a fim de comprovar a capacidade do folículo previamente criopreservado

de crescer e se desenvolver in vitro até sua maturação.

108

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABEDELAHI, A.; SALEHNIA, M.; ALLAMEH, A.A. The effects of different

concentration of sodium selenite on the in vitro maturation of preantral follicles in

serum-free and serum supplemented media. Journal of Assisted Reproduction and

Genetics, v. 25, p. 483-488, 2008.

ALBERICI, R.M.; PONTES, F.F.F. Reciclagem de óleo comestível usado através da

fabricação de sabão. Engenharia Ambiental, v. 1, p. 73-76, 2004.

AMORIM, C. A.; LUCCI, C. M.; RODRIGUES, A.P.R.; CARVALHO, F.C.A.;

FIGUEIREDO, J. R.; RONDINA, D.; CECCHI, R.; GIORGETTI, A.; MARTINI, A.;

GONÇALVES, P.B.D. Quantitative and qualitative analysis of the effectiveness of a

mechanical method for the isolation of preantral follicles from ovine ovaries.

Theriogenology, v. 53, p. 1251-1262, 2000.

AMORIM, C.A.; GONCËALVES P.B.D.; FIGUEIREDO, J.R, Cryopreservation of

oocytes from pre-antral follicles. Human Reproduction, v. 9, p. 119-129, 2003.

AMORIM, C.A.; LANGENDONCKT, A.V.; DAVID, A.; DOLMANS, M.M.;

DONNEZ, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian

tissue, follicular isolation and in vitro cultures in a calcium alginate matrix. Human

Reproduction, v. 24(1), p. 92-99, 2009.

AMORIM, C.A.; RONDINA, D.; LUCCI, C.M.; GONÇALVES, P.BD.;

FIGUEIREDO, J.R.; GIORGETTI, A. Permeability of ovine primordial follicles to

different cryoprotectants. Fertility and Sterility, v. 85, p. 1077-108, 2006.

AMORIM, C.A.; RONDINA, D.; RODRIGUES, A.P.R.; COSTA, S.H.F.;

GONÇALVES, P.B.D.; FIGUEIREDO, J.R. Isolated ovine primordial follicles

cryopreserved in different concentrations of ethylene glycol. Theriogenology, v. 60, p.

735-742, 2003.

AMORIM, C.A.; RONDINA, D.; RODRIGUES, A.P.R.; GONÇALVES, P.B.D.;

FIGUEIREDO, J.R.; GIORGETTI, A. Cryopreservation of isolated ovine primordial

follicles with propylene glycol and glycerol. Fertility and Sterility, v. 81, p. 735-740,

2004.

109

AYE, M.; GIORGIO, C. DI.; MO, M. DE.; BOTTA, A.; PERRIN, J.; COURBIERE, B.

Assessment of the genotoxicity of three cryoprotectans used for human oocyte

vitrification: dimethyl sulfoxide Ethylene glycol and propylene glycol. Food and

Chemical Toxicology, v. 48, p. 1905-1912, 2010.

BARNETT, K.R.; SCHILLING, C.; GREENFELD, C.R.; TOMIC, D.; FLAWS, J.A.

Ovarian follicle development and transgenic mouse models. Human Reproduction

Update, v. 10, p. 1-19, 2006.

BARRITT, J.; LUNA, M.; DUKE, M.; GRUNFELD, L.; MUKHERJEE, T.;

SANDLER, B.; COPPERMAN, A.B. Report of four donor-recipient oocyte

cryopreservation cycles resulting in high pregnancy and implantation rates. Fertility and

Sterility, v. 87(1), p. 189.e13-189.e17, 2007.

BARTSCH, W.; SPONER, G.; DIETMANN, K.; FUCHS, G. Actue toxicity of various

solvents in the mouse and rat. LD50 of ethanol, diethylacetamide, dimethylformamide,

dimethylsulphoxide, glycerine, N-methylpyrrolidone , polyethylene glycol 400, 1,2-

propanediol and Tween 20. Arzneimittel-Forschung, v. 26, p. 1581-1583, 1976.

BASSO, A.C.; GARCIA, J.M.; ESPER, C.R. Efeitos de diferentes sistemas de dultivo in vitro

sobre o crescimento de folículos pré-antrais isolados de ovários de fetos bovinos.

Brazilian Journal of veterinary Research and Animal Science, v. 44, p. 134-143, 2007.

BEDAIWY, M.A.; FALCONE, T. Ovarian tissue banking for câncer patients Reduction

of post-transplantation ischemic injury: intact ovary freezing and transplantation.

Human Reproduction, v. 19(6), p. 1242 – 1244, 2004.

BETTERIDGE, K.J.; SMITH, C.; STUBBINGS, R.B.; XU, K.P.; KING, W.A.

Potential genetic improvement of cattle by fertilization of fetal oocytes in vitro. Journal

of Reproduction and Fertility Supplement, v. 38, p. 87-98, 1989.

BOGLIOLO, L.; ARIU, F.; FOIS, S.; ROSATI, I.; ZEDDA, M.T.; LEONI, G.;

SUCCU, S.; PAU, S.; LEDDA, S. Morphological and biochemical analysis of immature

ovine oocytes vitrified with or without cumulus cells. Theriogenology, v. 68, p. 1138-

1149, 2007.

110

BORDES, A.; LONARGE, J.; DEMIRCI, B.; FRANCK, M.; COURBIERE, B.;

GUERIN, J.F.; SALLE, B. Normal gestations and live births after orthotopic autograft

of vitrified-warmed hemi-ovaries into ewes. Human Reproduction, v. 20 (10), p 2745-

2748, 2005.

BORGES, E.N.; SILVA, R.C.; FUTINO, D.O.; ROCHA-JUNIOR, C.M.; AMORIM,

C.A.; BÁO, S.N.; LUCCI, C.M. Cryopreservation of swine ovarian tissue: effect of

different cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle oocytes.

Cryobiology, v. 59, p. 195-200, 2009.

BORINI, A.; SCIAJNO, R.; BIANCHI, V.; SERENI, E.; FLAMIGNI, C.;

COTICCHIO, G. Clinical outcome of oocyte cryopreservation after slow cooling with a

protocol utilizing a high sucrose concentration. Human Reproduction, v. 21(2), p. 512-

517, 2006.

BRAYTON, C.F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Veterinarian, v. 76,

p. 76-90, 1986.

BUKOVSKY, A.; CAUDLE, M.R.; SVETLIKOVA, M.; UPADHYAYA, N.B. Origin

of germ cells and formation of new primary follicles in adult human ovaries.

Reproductive Biology and Endocrinology, v. 2(20), 2004.

CAI, X.Y.; CHEN, G.A.; LIAN, Y.; ZHENG, X.Y.; PENG, H.M. Cryoloop vitrification

of rabbit oocytes. Human Reproduction, v. 20, p. 1969-1974, 2005.

CALEGHIANI, E.C.C.; ARRUDA, R.P.; ANDRADE, A.F.C.; NASCIMENTO, J.;

RAPHAEL, C.F.; RODRIGUES, P.H.M. Effects that bovine sperm cryopreservation

using two different extenders has no sperm membranes and chromatin. Animal

Reproduction Science, v. 104, p. 119-131, 2008.

CAMICI, G.G.; STEFFEL, J.; AKHMEDOV, A.; SCHAFER, N.; BALDINGER, J.;

SCHULZ, U.; SHOJAATI K.; MATTER, C.M.; YANG, Z.; LÜSCHER, T. F.;

TANNER, F.C. Dimethyl sulfoxide inhibits tissue factor expression, thrombus

formation, and vascular smooth muscle cell activation. Circulation, v. 114 (14), p.

1512-1521, 2006.

111

CAMPBELL, L.H.; BROCKBANK, K.G.M. Serum-free solution for cryopreservation

of cells. In vitro Cellular & Developmental Biology, v. 43, p. 269-275, 2007.

CAMPOS-CHILLÒN, L. F.; SUCH, T. K.; BARCELO-FIMBRES, M.; SEIDEL JR,

G.E.; CARNEVALE, E. M. Vitrification of early-stage bovine ande quine embryos.

Theriogenology,v. 71, p. 349-354, 2009.

CARNEY, E. Ethylene glycol developmental toxicity: unraveling the roles of glycolic

acid and metabolic acidosis. Toxicological sciences, v. 50, p. 117-126, 1999.

CARPENTER, R.J.; ANGEL, M.F.; MORGAN, R.F. Dimethyl sulfoxide increases the

survival of primarily ischemic island skin flaps. Otolaryngology Head Neck Surgery, v.

110, p. 228-231, 1994.

CECCONI, S.; CAPACCHIETTI, G.; RUSSO, V.; BERARDINELLI, P.; MATTIOLI,

M.; BARDONI, B. In vitro growth of preantral follicles isolated from cryopreserved

ovine ovarian tissue. Biology of Reproduction, v. 70(1), p. 12-17, 2004.

CELESTINO, J. J. H.; SANTOS, R.R.; LOPES, C.A.P.; MARTINS, F. S.; MATOS,

M.H.T.; MELO, M.A.P.; BÁO, S.N.; RODRIGUES, A.P.R.; SILVA, J. R. V;

FIGUEIREDO, J. R. Preservation of bovine preantral follicle viability and ultra-

structure after cooling and freezing of ovarian tissue. Animal Reproduction Science, v.

108, p. 309-318, 2008.

CETIN, Y.; & BASTAN, A. Cryopreservation of immature bovine oocytes by

vitrification in straws. Animal Reproduction Science, v. 92, p. 29-36.2006.

CHANG, C.C.; SUNG, L.Y.; LIN, C.J.; KORT, H.I.; YANG, X.; TIAN, X. C.; NAGY,

Z.P. The oocyte spindle is preserved by 1,2-propanediol during slow freezing. Fertility

and Sterility, v. 93(5), p. 1430-1439, 2010.

CHEN, S.U.; LEN, Y.R.; CHEN, H.F.; CHANG, L.J.; TSAI, Y.Y.; YANG, Y.S.

Observational clinical follow-up of oocyte cryopreservation using a slow-freezing

method with 1,2-propanediol plus sucrose followed by ICSI. Human Reproduction, v.

20, p. 1975-1980, 2005.

CHEN, S.U.; LIEN, Y.R.; CHEN, H.F.; CHAO, K.H.; HO, H.N.; YANG, Y.S. Open

pulled straws for vitrification of mature mouse oocytes preserve patterns of meiotic

112

spindles and chromosomes better than conventional straws. Human Reproduction, v.

15(12), p. 2598-2603, 2000.

CHOI, J.Y.; LEE, B.E.; LEE, E.Y.; YOON, B.K.; BAE, D.S.; CHOI, D.S.

Cryopreservation of ovarian tissue temporarily suppresses the proliferation of granulose

cells in mouse preantral follicles. Cryobiology, v. 56, p. 36-42, 2008.

COCCHIA, N.; CIANI, F.; RUSSO, M.; EL RASS, R.; ROSAPANE, I.; AVALLONE,

L.; TORTORA, G.; LORIZIO, R. Immature caat oocyte vitrification in open pulled

straw (POSs) using a cryoprotectant mixture. Cryobiology, v. 60, p. 229-234, 2010.

COMIZZOLI, P.; WILDT, D. E.; PUKAZHENTHI, B. S. Effect of 1,2-propanediol

versus 1,2-ethanediol on subsequent oocyte maturation, spindle integrity, fertilization,

and embryo development in vitro in the domestic cat. Biology of Reproduction, v. 71, p.

598-604, 2004.

CORLEY, R.A.; BARTELS, M.J.; CARNEY, E.W.; WEITZ, K.K.; SOELBERG, J.J.;

GIES, R.A.; THRALL, K.D. Development of a physiologically based pharmacokinetic

model for ethylene glycol and its metabolite, glycolic acid, in rats aand humans.

Toxicological Science, v. 85, p. 476-490, 2005.

CORTVRINDT, R.; SMITZ, J.E.J. In vitro follicle growth: achievements in

mammalians species. Reproduction in Domestic Animals, v. 36, p. 03-09, 2001.

COTICCHIO, G.; SANTIS, L.DE.; ROSSI, G.;BORINI, A.; ALBERTINI, D.;

SCARAVELLI, G.; ALECCI, C.; BIANCHI, V.; NOTTOLA, S.; CECCONI, S.

Sucrose concentration influences the rate of human oocytes with normal spindle and

chromosome configurations after slow-cooling cryopreservation. Human Reproduction,

v. 21, p. 1771 -1776, 2006.

COURBIERE, B.; MASSARDIER, J.; SALLE, B.; MAZOYER, C.; GUERIN, J. F.;

LORNAGE, J. Follicular viability and histological assessment after cryopreservation of

whole sheep ovaries with vascular pedicle by vitrification. Fertility and Sterility, v. 84,

p. 1065- 1071, 2005.

CRUZAN, G.; CORLEY, R.A.; HARD, G.C.; MERTENS, H.J.W.M.; MCMARTIN,

K.E.; SNELLINGS, W.M.; GINGELL, R.; DEYO, J.A. Subchronic toxicity of ethylene

113

glycol in Wistar and F-344 rats related to metabolism and clearance of metabolites.

Toxicological Science, v. 81, p. 502-511, 2004.

EDSON, M.A.; NAGARAJA, A.K.; MATZUK, M.M. The mammalian ovary from

genesis to revelation. Endocrinology reviews,v. 30, p.624-712 , 2009.

DANSO, K.E.; FORD-LLOYD, B.V. Cryopreservation of embryogenic calli of cassava

using sucrose cryoprotection and air desiccation. Plant cell rep, v. 22, p. 623-631, 2004.

DE LA PEÑA, E.C.; TAKAHASHI, Y.; KATAGIRI, S.; ATABAY, E.C.; NAGANO,

M. Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral

follicles. Reproduction, v.123, p.593-600. 2002.

DE SANTIS, L.; COTICCHIO, G.; PAYTER, S.; ALBERTINI, D.; HUTT, K.; CINO,

I.; IACCARINO, M.; GAMBARDELLA, A.; FLAMIGNI, C.; BORINI, A.

Permeability of human oocytes to ethylene glycol and their survival and spindle

configurations after slow cooling cryopreservation. Human Reproduction, v. 22(10), p.

2776-2783, 2007.

DEMEESTERE, I.; SIMON, P.; BUXANT, F.; ROBIN, V.; FERNADEZ, S. A.;

CENTNER, J.; DELBAERE, A.; ENGLERT, Y. Ovarian function and spontaneous

pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue

transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case

Report. Human Reproduction, v. 21, p. 2010-2014, 2006.

EMILIANI, S.; BERGH, M.V.DEN; VANNIN, A.S.; BIRAMANE, J.; ENGLERT, Y.

Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of

slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts. Human Reproduction, v.

15(4), p. 905-910, 2000.

ERICKSON, B. H.; REYNOLDS, R.A.; MURPHREE, R. L. Ovarian characteristics

and reproductive performance of the aged cow. Biology of reproduction, v. 15, p. 555-

560, 1986.

EROGLU, A.; BAILEY, S.E.; TONER, M.; TOTH, T.L. Successful cryopreservation of

maouse oocytes by using low concentrations of trehalose and dimethylsulfoxide.

Biology of Reproduction, v. 80, p. 70-78, 2009.

114

FABBRI, R.; PASQUINELLI, G.; KEANE, D.; MAGNANI, V.; PARADISI, R.;

VENTUROLI, S. Optimization of protocols for human ovarian tissue cryopreservation

with sucrose, 1,2-propanediol and human serum. Reproductive Biomedicine online, v.

221, p. 819-828, 2010.

FAHY, G.M. Cryoprotectant toxicity neutralization. Cryobiology, v. 60, p. 45-53, 2010.

FAHY, G.M. The relevance of cryoprotectant "toxicity" to cryobiology. Cryobiology, v.

23, p. 1-13, 1986.

FAN, W.X.; MAA, X.H.; GE, D.; LIU, T.Q. CUI, Z.F. Cryoprotectants for the

vitrification of corneal endothelial cells. Cryobiology, v. 58, p. 28-36, 2009.

FAUSTINO, L.R. Diferentes concentrações e tempos de exposição ao etilenoglicol para

a criopreservação de tecido ovarian caprino e ovino. 78f. Fortaleza, CE. Dissertação

(Mestrado em Ciências Veterinárias) - Programa de Pós-graduação em Ciências

Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, 2009.

FAUSTINO, L.R.; SANTOS, R.R.; SILVA, C.M.G.; PINTO, L.C.; CELESTINO,

J.J.H.; CAMPELLO, C.C.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R. Goat and sheep

ovarian tissue cryopreservation: Effects on the morphology and development of

primordial follicles and density of stromal cell. Animal Reproduction Science, v. 122, p.

90–97, 2010.

FERREIRA, E.M.; VIREQUE, A.A.; ADONA, P.R.; MEIRELLES, F.V.; FERRIANI,

R.A.; NAVARRO, P.A.A.S. Maturação citoplasmática de oócitos bovinos: aquisição de

competência para o desenvolvimento. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.

32(3), p. 172-181, 2008.

FIGUEIREDO, J.R.; HULSHOF, S.C.J.; BECKERS, J.F. Nova Biotecnologia:

Isolamento, Caracterização e Cultura de Folículos Ovarianos Pré-Antrais Em Bovinos.

Ciência Animal, v. 5, p. 22-33, 1995.

FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R.; AMORIM, C.A.; SILVA, J.R.V.

Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais - MOIFOPA. In:

P.B.D. Gonçalves, J. R. Figueiredo, V. J. F Freitas. Biotécnicas aplicadas à reprodução

animal. 2. ed. São Paulo: Roca, p. 303-327, 2008.

115

FORTUNE, J. Ovarian follicular growth and development in mammals. Biology of

Reproduction, v. 50, p. 225-232, 1994.

FRANTZ, S.W.; BESKITT, J.L.; GROSSE, C.M.; TALLANT, M.J.; DIETZ, F.K.;

BALLANTYNE, B. Pharmacokinetics of ethylene glycol. II. Tissue distribuition, dose-

dependent elimination, and identification of urinary metabolites following single

intravenous, peroral or percutaneous doses in female Sprague-Dawley rat and CD-1

mice. Xenobiotica, v. 26, p. 195-220, 1996.

FUKU, E.; KOJIMA, T.; SHIOYA, Y.; MARCUS, G.J.; DOWNEY, B.R. In vitro

fertilization and development of frozen-thawed bovine oocytes. Cryobiology, v. 29, p.

485-492, 1992.

FULLER, B.; PAYNTER, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine.

Reproductive BioMedicine Online, v. 9, p. 680-690, 2004.

GANDOLFI, F.; PAFFONI, A.; BRAMBILLA, E.P.; BONETTI, S.; BREVINI, T.A.L.;

RAGNI, G. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the

cryopreservation of ovarian tissue: comparative analysis between human and animal

models. Fertilility and Sterility, v. 85, p. 1150-1156, 2006.

GATTI, R.; BELLETTI, S.; ORLANDINI, G.; BUSSOLATI, O.; DALL'ASTA, V.;

GAZZOLA, G. C. Comparison of annexin V and calceina-AM as early vital markers of

apoptosis in adherent cells by confocal laser microscopy. Journal of Histochemistry &

Cytochemistry, v.46, p.895-900, 1998.

GAYLOR CHEMICAL COMPANY. Dimethyl sulfoxide (DMSO) health and safety

information. Slidell. Bulletin 106, 16p, 2007.

GELLER, M.; BONALUMI-FILHO, A.; CUNHA, K.S.G.; SLAIBI, E.B.; ABREU,

C.S.; BARBOSA, J.S.S. Avaliação imunodermatológica da resposta ao propilenoglicol

e ao butilenoglicol- revisão bibliográfica sistemática. Revista Brasileira de Medicina, v.

67(7), p. 234-239, 2010.

GHETLER, Y.; SKUTELSKY, E.; NUM, I.B.; DOR, L.B.; AMIHAI, D.; SHALGI, R.

Human oocyte cryopreservation and the fate of cortical granules. Fertility and Sterility,

v. 86, p. 210-216, 2006.

116

GODINHO, H.P.; AMORIM, V.M.C.; PEIXOTO, M.D.P. Criopreservação do semen

de Tilápia-Nilótica Oreochromis niloticus, var. Chitralada: crioprotetores, soluções

ativadoras e refrigerador criogênico. Revista brasileira de Zootecnia, v. 32(6), p. 1537-

1543, 2003.

GONÇALVES, M.F; EVANGELISTA, F.R. O descompasso do Programa nacional de

Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) no Nordeste in: XLVI Congresso da sociedade

brasileira de economia, administração e sociologia rural (Rio Branco, Brasil), p. 1-19,

2008

GONÇALVES, P.B.D.; FIGUEIREDO, J.R.; FREITAS, V.J.F. Biotécnicas aplicadas à

reprodução animal, 339p, Varela, São Paulo, 2002.

GORDON, I. Storage and cryopreservation of oocytes and embryos. In: I. Gordon,

Laboratory production of cattle embryos. Cambridge: CAB International, Raven Press,

p. 293-328, 1994.

GOSDEN, R.G.; MULLAN, J.; PICTON, H.M.; YIN, H.; TAN, S.L. Current

perspective on primordial follicle cryopreservation and culture for reproductive

medicine, Human Reproduction, v. 8, p. 105-110, 2002.

GROSS, A.; ONG, T.R.; GRANT, R.; HOFFMANN, T.; GREGORY, D.D.;

SREERAMA, L. Human aldehyde dehydrogenase-catalyzed oxidation of ethylene

glycol ether aldehydes. Chemico-Biological Interactions, v. 178, p. 56-63, 2009.

HAFEZ, B.; HAFEZ, E.S.E. Reprodução Animal. 7.ed. Barueri: Manole, 2004. 513p

HAIDARI, K.; SALEHNIA, M.; VALOJERDI, M.R.. The effect of leukemia inhibitory

factor and coculture on the in vitro maturation and ultrastructure of vitrified and

nonvitrified isolated mouse preantral follicles. Fertility and Sterility, v. 90, p.2389-

2397, 2008.

HALBERSTADT, M.; ATHMANN, S.; HAGENAH, M. Corneal Cryopreservation

with Dextran. Cryobiology, v. 43, p. 71–80, 2001.

HALL, G.V.; SACCHETTI, M.; RADEGRAN, G.; SALTIN, B. Human skeletal muscle

fatty acid and glycerol metabolism during rest, exercise and recovery. Journal of

Physiology, v. 543(3), p. 1047-1058, 2002.

117

HAMMERSTEDT, R.H.; GRAHAM, J.K. Cryopreservation of poultry sperm: the

enigma of glycerol. Cryobiology, v. 29(1), p. 26-38, 1992.

HAN, X.; MAB, L.; BENSON, J.; BROWN, A.; CRITSER, J.K. Measurement of the

apparent diffusivity of ethylene glycol in mouse ovaries through rapid MRI and

theoretical investigation of cryoprotectant perfusion procedures. Cryobiology, v. 58, p.

298-302, 2009.

HASEGAWA, A.; MOCHIDA, N.; OGASAWARA, T.; KOYAMA, K. Pup birth from

mouse oocytes in preantral follicles derived from vitrified and warmed ovaries followed

by in vitro growth, in vitro maturation and in vitro fertilization. Fertility and Sterility, v.

86(3), p. 1182-1192, 2006.

HORVÁTH, K.; NOKER, P.E.; SOMFAI-RELLE, S.; GLÁVITS, R.; FINANCSEK, I.;

SCHAUSS A.G. Toxicity of methylsulfonylmethane in rats. Food and Chemical

Toxicology, v. 40, p. 1459-1462, 2002.

HOTAMISLIGIL, S.; TONER, M.; POWERS, R.D. Changes in membrane integrity,

cytoskeletal structure, and developmental potential of murine oocytes after vitrification

in ethylene glycol. Biology of Reproduction, v. 55, p. 161-168, 1996.

HUANG, J.; LI, Q.; ZHAO, R.; LI, W.; HAN, Z.; CHEN, X.; XIAO, B.; SHUYUN,

W.; JIANG, Z.; HU, J.; LIU, L. Effect of sugar on maturation rate of vitrified-thawed

immature porcine oocytes. Animal Reproduction science, v. 106, p. 25-35, 2008.

HUCKER, H. B.; MILLER, J. K.; HOCHBERG, A.; BROBYN, R.D.; RIORDAN,

F.H.; CALESNICK, B. Studies on the absorption, excretion and metabolism of

dimethylsulfoxide (DMSO) in man. The Jounal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, v. 155(2), p. 309-317, 1967.

HUNTER, J.E.; BERNARD, A.; FULLER, B.; AMSO, N.; SHAW, R.W. Fertilization

and development of the human oocyte following exposure to cryoprotectants, low

temperatures and cryopreservation: a comparison of two techniques. Human

Reproduction, v. 6, p. 1460 –1465, 1991.

118

ISACHENKO, E.; ISACHENKO, V.; RAHIMI, G.; NAWROTH, F. Cryopreservation

of human ovarian tissue by direct plugning into liquid nitrogen. European journal of

obstetrics & gynecology and reproductive biology, v. 1008(2), p. 186-193, 2003.

IZADYAR, F.; MATTHIJS-RIJSENBILT, J.J.; OUDEN, K.D.; CREEMERS, L.B.;

WOELDERS, H.; DE ROOIJ, D.G. Development of a Cryopreservation Protocol for

Type A Spermatogonia. Journal of Andrology, v. 23, p. 537-545, 2002.

JAHNUKAINEN, K.; EHMCKE, J.; HERGENROTHER, S.D.; SCHLATT, S. Effect

of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue

on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction, v. 22, p.

1060–1067, 2007.

JAIN, K.J.; PAULSON, R.J. Oocite cryopreservation. Fertility and Sterility, v. 86(3), p.

1037-1046, 2006.

KARLSSON, J.O.; YOUNIS, A.I.; CHAN, A.W.; GOULD K.G.; EROGLU A.

Permeability of the rhesus monkey oocyte membrane to water and common

cryoprotectants. Molecular Reproduction and Development, v. 76, p. 321–333, 2009.

KARTHA, K.K. Cryopreservation of plant cells and organs. Boca Raton:CRC press,

276p, 1985

KEROS, V.; XELLA, S.; HULTENBY, K.; PETTERSSON, K.; SHEIKHI, M.;

VOLPE, A.; HREINSSON, J.; HOVATTA, O. Vitrification versus controlled-rate

freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Human Reproduction, v. 24, p.

1670-1683, 2009.

KIM, G. A.; KIM, H. Y.; KIM, J. W.; LEE, G.; LEE, E.; LIM, J.M. Utrastructural

deformity of ovarian follicles induced by different cryopreservation protocol. Fertility

and Sterility, v. 94(4), p. 1548-1551, 2010.

KIM, J.Y.; KINOSHITA, M.; OHNISHI, M.; FUKUI, Y. Lipid and fatty acid analysis

of fresh and frozen–thawed immature and in vitro matured bovine oocytes.

Reproduction, v. 122, p. 131-138, 2001.

119

KIM, S. S.; KANG, H.G.; KIM, N.H.; LEE, H.C.; LEE, H.H. Assessment of the

integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after

xenotransplantation. Human Reproduction, v. 20(9), p. 2502-2508, 2005.

KONC, J.; KANYO, K.; VARGA, E.; KRISTON, R.; CSEH, S. Oocyte

cryopreservation: the birth of the first Hungarian babies form frozen oocytes. Journal of

Assisted Reproduction and Genetics, v. 25, p. 349-352, 2008.

KUMAR, S.; JHAMB, D.; MAURYA, S.N. Post vitrification survival of 2-cell stage

IVP buffalo embryos: effect of concentration. Indian Journal of Animal Science, v. 80,

p. 99-103, 2010.

LEE, P. A.; MORA, S. J.; LEVASSEUR, M.A. Review of dimethylsulfoxide in aquatic

environments. Atmosphere-ocean, v. 37(4), p. 439-456, 1999.

LIMA, A.K.; SILVA, A.R.; SANTOS, R.R.; SALES D.M.; EVANGELISTA, A.F.;

FIGUEIREDO, J.R.; SILVA, L.D. Cryopreservation of preantral ovarian follicles in situ

from domestic cats (Felis catus) using different cryoprotective agents. Theriogenology,

v. 66, p. 1664-1666, 2006.

LIN, M.H.; ROMSOS, D.R.; LEVEILLE, G.A. Effect of glycerol on lippogenic enzyme

activities and on fatty acid synthesis in the rat and chicken. Journal of Nutrition, v. 106,

p. 1668-1677, 1976.

LIU, J.; MULLEN, S.; MENG, Q.; CRITSER, J.; DINNYES, A. Determination of

oocyte membrane permeability coefficients and their application to cryopreservation in

a rabbit model. Cryobiology, v. 59, p. 127-134, 2009.

LIU, L.; WOOD, G.A.; MORIKAWA, L.; AYEARST, R.; FLEMING, C.;

MCKERLERLIE, C. Restoration of fertility by orthotopic transplantation of frozen

adult mouse ovaries. Human Reproduction, v. 23, p. 122-128, 2008.

LOVELOCK, J.E.; BISHOP, M.W.H. Preservation of freezing damage to living cells

by dimethyl sulfhoxide. Nature, v. 183, p. 1394-1395, 1959.

LUCCI, C.M.; AMORIM, C.A.; BÁO, S.N.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES,

A.P.R.; SILVA, J.R.; GONÇALVES, P.B.D. Effect of the interval of serial sections of

120

ovarian in the tissue chopper on the number of isolated caprine preantral follicles.

Animal Reproduction Science, v. 56, p. 39-49, 1999.

LUCCI, C.M.; KACINSKIS, M.A.; LOPES, L.H.R.; RUMPF, R.; BÁO, S.N. Effect of

different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine

(Bos indicus) ovarian tissue. Theriogenology, v. 61, p. 1101-1114, 2004.

LUZ, V.B.; SANTOS, R.R.; PINTO, L.C.; SOARES, A.A.X.; CELESTINO, J.J.H.;

MAFEZOLI, J.; CAMPELLO, C.C.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R.

Dimethyl sulfoxide perfusion in caprine ovarian tissue and its relationship with

follicular viability after cryopreservation. Fertility and Sterility, v. 91, p. 1513-1515,

MAHMOUD, K.G.M.; SHOLKAMY, T.H.; AHMED, Y.F.; SEIDEL, G.E.; NAWITO,

M.F. Effect of different combination of cryoprotectantes on invitro maturation of

immature buffalo (Bubalus bubalis) oocytes vitrified by straw and open-pulled straw

methods. Reproduction in Domestic Animals, v. 45, p. 565-571, 2010.

MANDELBAUM, J.; JUNCA, A. M.; PLACHOT, M.; ALNOT, M. O.; ALVAREZ, S.;

DEBACHE, C.; SALAT-BAROUX, J.; COHEN, J. Human embryo cryopreservation,

extrinsic and intrinsic parameters of success. Human Reproduction, v. 2, p. 709-715,

1988.

MARCO-JIMÉNEZ, F.; GARZÓN, D.L.; PEÑARANDA, D.S.; PÉREZ, L.; VIUDES-

DE-CASTRO, M.P.; VICENTE, J.S.; JOVER, M.; ASTURIANO, J.F.

Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: Effect of dilution

ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology, v. 53, p.

51-57, 2006.

MARSELLA, T.; SENA, P.; XELLA, S.; LA MARCA, A.; GIULINI, S.; DE POL, A.;

VOLPE, A.; MARZONA, L. Human ovarian tissue cryopreservation: effect of sucrose

concentration on morphological features after thawing. Reproductive Biomedicine

online, v. 16, p. 257-267, 2008.

MARSHALL, T.C.; CHENG, Y.S. Deposition and fate of inhaled ethylene glycol vapor

and condensation aerosol in the rat. Toxicological Science, v. 3, p. 175-181, 1983.

121

MARTIN, E.C.O.; PINTO, C.F.; WATANABE, M.; VATTIMO, M.F.F. Lesão renal

aguda por glycerol: efeito antioxidante da Vitis Vinifera L. Revista Brasileira de

Terrapia Intensiva, v. 19(3), p. 292-296, 2007.

MARTINEZ-MADRID, B.; CAMBONI, A.; DOLMANS, M.M.; NOTTOLA, S.;

LANGENDONCKT, A.V.; DONNEZ, J. Apoptosis and ultrastructural assessment after

cryopreservation of whole humano varies with their vascular pedicle. Fertility and

Sterility, v. 87(5), p. 1153-1165, 2007.

MARTINS, D.F. Contribição ao estudo da reforma a vapor do glicerol em catalisadores

Pt/C - efeito do tamanho da partícula de Pt e do pH da solução de alimentação. 91f.

Uberlandia, MG. Dissertação (Mestrado em Química) Programa de Pós-graduação em

Química, Universidade Federal de Uberlândia, 2009.

MARTINS, L.; CARDOSO, D. Produção de etilenoglicóis e derivados por reações

catalíticas de óxido de eteno. Química Nova, v. 28, p. 264-273, 2005.

MATSUMOTO, K.; RAHARJO, S.H.T.; DHEKNEY, S.; MOON, P.A.; LITZ, R.E.

Criopreservação e embriogênese somática de calos de Dimocarpus longan. Pesquisa

Agropecuária Brasileira, v. 39, p. 1261-1263, 2004.

MCMARTIN, K.E.; WALLACE, K.B. Calcium oxalate monohydrate, a metabolite of

ethylene glycol, is toxic for rat renal mitochondrial function. Toxicological Science, v.

84, p. 195-200, 2005.

MEIROW, D.; LEVRON, J.; ELDAR-GEVA, T.; HARDAN, I.; FRIDMAN, E.;

YEMINI, Z.; DOR, J. Monitoring the ovaries after autotransplantation of cryopreserved

ovarian tissue: endocrine studies, in vitro fertilization cycles, and live birth. Fertility

and Sterility, v. 87(2), p. 418.e7- 418.e15, 2007.

MENDEZ, A. Lupus Eritromatoso sisitêmico. Revista Bioquímica e Ortomolecular, v.

12, p. 30-31, 2003.

MILAZZO, J.P.; VAUDREUIL, L.; CAULIEZ, B.; GRUEL, E.; MASSE, L.;

MOUSSET-SIMÉON, N.; MACÉ, B.; RIVES, N. Comparison of conditions for

cryopreservation of testicular tissue from immature mice. Human Reproduction, v. 23,

p. 17–28, 2008.

122

MILOSEVIC, J.; STORCH, A.; SCHWARZA J. Cryopreservation Does Not Affect

Proliferation and Multipotency of Murine Neural Precursor Cells. Stem Cells, v. 23, p.

681-688, 2005.

MOTA, C. J. A.; SILVA, C. X. A.; GONÇALVES, V. L. C. Gliceroquímica: novos

produtos e processos a partir da glicerina de produção de biodiesel. Química Nova, v.

32(3), p. 639-648, 2009.

MOURA, J.G.P. Nutrientes e terapêutica, como usá-los quando usá-lo como avalia

suas carências radicias livres na saúde. 2nd. Pelotas: Visão artes, 340p, 2009.

MYCOCK, D.J.; WESLEY-SMITH, J.; BERJAK, P. Cryopreservation of somatic

embryos of four species with and without cryoprotectant pre-tratment. Annals of

Botany, v. 75, p. 331-336, 1995.

NERI, S,; MARIANI., E.; MENEGHETTI, A.; CATTINI, L. FACCHINI, A. Calcein-

acetoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional

analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic

Laboratory Immunology, v.8(6), p.1131-1135, 2001.

NEWTON, H.; FISHER, J.; ARNOLD, J. R. P.; PEGG, D. E.; FADDY, M. J.;

GOSDEN, R. G. Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in

preparation for cryopreservation. Human Reproduction, v. 13, p. 376-380, 1998.

NEWTON, H.; ILLINGWORTH, P. In vitro growth of murine pre-antral follicles after

isolation from cryopreserved ovarian tissue. Human Reproduction, v.16, p.423-429,

2001.

OLIVEIRA, C.G. Regulação gênica da biosíntese de violaceína e Quorum sensing em

Chromobacterium violaceum. 159f. Florianópolis, SC. Tese (Doutorado em Engenharia

Química) - Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, Universidade Federal

de Santa Catarina, 2005.

ONIONS, V.J.; MITCHELL, M.R.P.; CAMPBELL, B.K.; WEBB, R. Ovarian tissue

viability following whole ovine ovary cryopreservation: assessing the effects of

sphingosine-1-phosphate inclusion. Human reproduction, v. 23(3), p. 606-618, 2008.

123

ORLATO, D. Efeitos do DMSO (dimetilsulfóxido), administrado por via intravenosa,

sobre as funções renal e hepática, perfil hidrossalino e hemograma de cães sadios. 52f.

Jaboticabal, SP. Dissetação (mestrado em cirurgia veterinária) - Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias, Universidade estadual paulista Júlio de Mesquita Filho, 2006.

OTSUKI, S.; QUINA, W.; ISHIHARA, A.; KAE, T. Elicidation of dimethylsulfone

metabolism in rat using a 35S radioisotope tracer method. Nutrition Researche, v. 22, p.

313-322, 2002.

PARKER, M.G.; FRASER, G.L.; WATSON, D.M.; RIKER, R.R. Removal of

propylene glycol and correction of increased osmolar gap by hemodialysis in a patient

on high dose lorazepan infusion therapy. Journal of Intensive Care Medicine, v. 28, p.

81-84, 2002.

PARMEGIANI, L.; COGNIGNI, G.E.; BERNARDI, S.; CIAMPAGLIA, W.;

INFANTE, F.; POCOGNOLI, P.; FATIS, C. T.; TROILO, E.; FILICORI, M. Freezing

within 2 h from oocyte retrieval increases the efficiency of human oocyte

cryopreservation when using a slow freezing/rapid thawing protocol with high sucrose

concentration. Human Reproduction, v. 23, p. 1771–1777, 2008.

PATSOURIS, D.; MANDARD, S.; VOSHOL, P.J.; ESCHER, P.; TAN, N.S.;

HAVEKES, L.M.; KOENING, W.; MÄRZ, W.; TAFURI, S.; WAHLI, W.; MÜLLER,

M.; KERSTEN, S. PPARα governs glycerol metabolism. The Journal of Clinical

Investigation, v. 114(1), p. 94-103, 2004.

PAYNTER, S.J. Current status of the cryopreservation of human unfertilized oocytes.

Human Reproduction, v. 5, p. 449-456, 2000.

PEGG, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols Methods in: Molecular

Biology, 2.ed. Totowa: Humana Press Inc, 348p, 2007.

PICTON, H. M.; HARRIS, S. E.; MURUVI, W.; CHAMBERS, E. L., The in vitro

growth and maturation of follicles. Reproduction, v. 136, p. 703-715, 2008.

PINTO, L.C.; SANTOS, R.R.; FAUSTINO, L.R.; SILVA, C.M.G.; LUZ, V.B.; MAIA-

JÚNIOR, J.E.; SOARES, A.A.X.; CELESTINO, J.J.H.; MAFEZOLI, J.; CAMPELLO,

C.C.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R. Quantification of Dimethyl Sulfoxide

124

Perfusion in Sheep Ovarian Tissue: A Predictive Parameter for follicular survival to

cryopreservation. Biopreservation and biobanking, v. 6, p. 269-276, 2008.

PLATTNER, H.; FISCHER, W.M.; SCHMITT, W.W.; CACHMANN, L. Freeze

etching of cells without cryoprotectants. The Journal of Cell Biology, v. 53, p. 116-126,

1972.

POLGE, C.S.; SMITH, A.U.; PARKS, A.S. Revival of spermatozoa after vitrification

and dehydration at low temperatures. Nature, p. 164:666, 1949.

QU, J.; GODIN, P.A.; NISOLLE, M.; DONNEZ, J. Distribution and epidermal growth

factor receptor expression of primordial follicles in human ovarian tissue before and

after cryopreservation. Human Reproduction, v. 15, p. 302–310, 2000.

RALL, W.F.; REID, D.S.; POLGE, C. Analysis of slow-warming injury of mouse

embryos by cryomicroscopical and physiochemical methods. Cryobiology, v. 21, p.

106-121, 1984.

RODRIGUES, A.P.R.; AMORIM, C.A.; COSTA, S.H.F.; MATOS, M.H.T.; SANTOS,

R.R.; LUCCI, C.M.; BÁO, S.N.; OHASHI, O.M.; FIGUEIREDO, J.R. Criopreservation

of caprine ovarian tissue using glycerol and ethylene glycol. Theriogenology, v. 61, p.

1009-1024, 2004a.


R.R.; LUCCI, C.M.; BÁO, S.N.; OHASHI, O.M.; FIGUEIREDO, J.R.

Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol.

Animal Reproduction Science, v. 84, p. 211-227, 2004b.


R.R.; LUCCI, C.M.; BÁO, S.N.; OHASHI, O.M.; FIGUEIREDO, J.R.

Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol.

Animal Reproduction Science, v. 84, p. 211-227, 2004.

ROSENBAUM, E.E.; HERSCHELER, R.J.; JACOB, S.W. Dimethyl sulfoxide in

musculoskeletal disordens. Journal of the American Medical Association, v. 192(2), p.

309-313, 1965.

125

ROY, S.K., TREACY, B.J. Isolation and long-term culture of human preantral follicles,

Fertility and Sterility, v. 59, p. 783-791, 1993.

RUBINSKY, B. Principles of low temperature cell preservation. Heart Failure Reviews,

v. 8, p. 277-284, 2003.

RUDDICK, J.A. Toxicology, metabolism, and biochemistry of 1,2-propanediol.

Toxicology Applied Pharmacology, v. 21, p. 102-111, 1972.

SANCHES, B. V. Uso de propanediol ou DMSO na vitrificação de embriões bovinos

produzidos in vitro, cultivados ou não na presença de Forskolin, dissertação,

Universidade federal de Goiás. 49f. Goiânia, GO. dissertação (Mestrado em ciência

veterinária). Programa de pós-graduação em ciência animal, Escola de veterinária da

Universidade Federal de Goiás, 2009.

SANTOS, I.R.I. Criopreservação: Potencial e perspectivas para a conservação de

germoplasma vegetal. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v. 12, p. 70-84, 2000.

SANTOS, R.R.; HURK, R.V.D.; RODRIGUES, A.P.R.; COSTA, S.H.F.; MARTINS,

F.S.; MATOS, M.H.T.; CELESTINO, J.J.H.; FIGUEIREDO, J.R. Effect of

cryopreservation on viability, activation and growth of in situ and isolated ovine early-

stage follicles. Animal Reproduction Science, v. 99, p. 53-64, 2007.

SANTOS, R.R.; KNIJN, H.M.; VOS, P.L.A.M.; OEI, C.H.Y.; VAN LOON, T.;

COLENBRANDER, B.; GADELLA, B.M.; VAN DEN HURK, R.; ROELEN, B.A.J.

Complere follicular development and recovery of ovarian function of frozen-thawed,

autotransplanted caprine ovarian cortex. Fertility and Sterility, v. 91, p. 1455-1458,

2009.

SANTOS, R.R.; RODRIGUES, A.P.; COSTA, S.H.; SILVA, J.R.; MATOS, M.H.;

LUCCI, C.M.; BÁO, S.N.; VAN DEN HURK, R.; FIGUEIREDO, J.R. Histological and

ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Animal Reproduction

Science, v. 91, p. 249–263, 2006a.

SANTOS, R.R.; RODRIUGES, A.P.R.; COSTA, S.H.F.; MATOS, M.H.T.; SILVA,

J.R.V.; CELESTINO, J.J.H.; MARTINS, F.S.; SARAIVA, M.V.A.; MELO, M.A.P.;

FIGUEIREDO, J.R. Teste de toxicidade e criopreservação de folículos pré-antrais

ovinos isolados utilizando glicerol, etilenoglicol, dimetilsulfóxido e propanodiol.

126

Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 43(2), p. 250-255,

2006.

SANTOS, R.R.; THARASANIT, T.; FIGUEIREDO, J.R.; VAN HAEFTEN, T.; VAN

DEN HURK, R. Preservation of caprine preantral follicle viability after

cryopreservation in sucrose and ethylene glycol. Cell and Tissue Research, v. 325, p.

523-531, 2006b.

SANTOS, R.R.; THARASANIT, T.; VAN HAEFTEN, T.; FIGUEIREDO, J.R.;

SILVA, J.R.; VAN DEN HURK, R. Vitrification of goat preantral follicles enclosed in

ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods. Cell and

Tissue Research, v. 327, p. 167-176, 2007.

SAUMANDE, J. Ovogenèse et folliculogenèse. Recueil de Médecine Vétérinaire,

v.157, p.29-38, 1991.

SCHMIDT, M.; HYTTEL, P.; AVERY, B.; GREVE, T. Ultrastructure or in vitro

matured bovine oocytes aftes controlled freesing in 10% glycerol. Animal Reproduction

Science, v. 37, p. 281-290, 1995.

SCHUCHARDT, U.; RIBEIRO, M.L. A industria petroquímica no próximo século:

como substituir o petróleo como matéria-prima?. Química Nova, v. 24(2), p. 247-251,

2001.

SEGINO, M.; IKEDA, M.; HIRAHARA, F.; SATO, K.;. In viro development of

cryopreserved mouse ovarian tissue. Reproduction, v.130, p.187-192, 2005

SHARMA, G.T.; KHARCHE, S.D.; MAJUMDAR, A.C. Vitrification of in vitro

matured goat oocytes and the effect on in vitro fertilization. Small Ruminant Research,

v. 64, p. 82-86, 2006.

SHAW, J.M.; COX, S.L.; TROUNSON, A.O.; JENKIN, G. Evaluation of the long-term

function of cryopreserved ovarian grafts in the mouse, implications for human

applications. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 161, p. 103-110, 2000.

SHEIKHI, M.; HULTENBY, K.; NIKLASSON, B.; LUNDQVIST, M.; HOVATTA, O.

Clinical grade vitrification of human ovarian tissue: an ultrastructural analysis of

follicles and stroma in vitrified tissue. Human Reproduction, [In press], 2011.

127

SHIRAZI, A.; SOLEIMANI, M.; KARIMI, M.; NAZARI, H.; AHMADI, E.;

HEIDARI, B. Vitrification of in vitro produced ovine embyos at various developmental

stages using two methods. Cryobiology, v. 60, p., 204-210, 2010.

SIEBZEHNRUBL, E.; KOHL, J.; DITTRICH, R.; WILDT, L. Freezing of human

ovarian tissue – not the oocytes but the granulose in the problem. Molecular and

Cellular Endocrinology, v. 169(1), p. 109-111, 2000.

SIMON, A. Administration of glycerol to broilers in the drinking water.

Landbauforshung Volkenrode, v. 169, p. 168-170, 1996.

SMITH, G.D.; SILVA, E.; SILVA, C.A. Developmental consequences of

cryopreservation of mammalian oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine

Online, v. 9(2), p. 171-178, 2004.

SMITH, P.; HUDSON, O.N.L.; SHAW, L.; HEATH, D.A.; CONDELL, L.; PHILLIPS

D.J.; MCNATTY, K.P. Effects of the Booroola gene (FecB) on body weight, ovarian

development and hormone concentrations during fetal life. Journal of reproduction and

fertility, v. 98, p. 41-54, 1993.

SOJKA, J.E.; BRISSON-KIMMICK, S.V.; CARLSON, G.P.; COPPOC, G.L. Dimethyl

sulfoxide update – New applications and dosing methods. Proceedings of the annual

convention of the American Association of Equine Practitioners, v. 36, p. 683-690,

1990.

SOLEIMANI, R.; De VOS, W.; OOSTVELDT, P. V.; LIERMAN, S.; BROOECKE, R.

V.D.; SUTTER, P. de; DHONT, M.; ELST, J.V.D. Two novel techniques to detect

follicles in human ovarian cortical tissue. Human Reproduction, v. 21, p. 1720-1724,

2006.

SUMNER, S.C.J.; FENNELL, T.R.; MOORE, T.A.; CHANAS, B.; GONZALEZ, F.;

GHANAYEM, B.I. Role of cytochrome P450 2E1 in the metabolism of acrylamide and

acrylonitrile in mice. Chemical Research Toxicology, v. 12, p. 1110-1116, 1999.

TAN, X.; SONG, E.; LIU, X.; YOU, W.; WAN F. Factors affecting the survival,

fertilization, and embryonic development of mouse oocytes after vitifictionusing glass

capillaries, In Vito Cellular & Developmental Biology, v. 45, p. 420-429, 2009.

128

TSURIBE, P.M.; GOBBO, C.A.M.; LANDIM-ALVARENGA, F.C. Viability of

primordial follicles derived from cryopreserved ovine ovarian cortex tissue. Fertility

and Sterility, v. 91, p.1976-1983, 2009.

VAJTA, G.; KUWAYAMA, M.; VANDERZWALMEN, P. Disadvantages and benefits

of vitrification. In: Vitrification in assisted reproduction A user‘s manual and

troubleshooting guide. London: Informa UK, pp. 33–44, 2007.

VUTYAVANICH, T.; SRESHTHAPUTRA, O.; PIROMLERTAMORN, W.; NUNTA,

S. Closed-system solid surface vitrification versus slow programmable freezing of

mouse 2-cell embryos. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, v. 26, p. 285-

290, 2009.

WALLIN, A.; GHAHREMANI, M.; DANHM-KÄHLER, P.; BRÄNNSTRÖM, M.

Viability and function of the cryopreserved whole ovary: in vitro studies in the sheep.

Human Reproduction, v. 24(7), p. 1684-16-94, 2009.

WANG, X.; CHEN, H.; YIN, H.; KIM, S. S.; TAN, S. L.; GOSDEN, R. G.

Cryopreservation: fertility after intact ovary transplantation. Nature, v. 415, p. 385,

2002.

WILSON, K.C.; REATDON, C.; THEODORE, A.C.; FARBER, H.W. Propylene

glycol toxicity: a severe iatrogenic illness in ICU patients receiving IV benzodiazepines.

Chest, v. 128(3), p. 1674 – 1681, 2005.

WUSTEMAN, M.; RAUEN, U.; SIMMONDS, J.; HUNDS, N.; PEGG, D.E. Reduction

of cryoprotectant toxicity in cell in suspension by use of a sodium-fee vehicle solution.

Cryobiology, v. 56, p. 72-79, 2008.

YAMAJI, Y.; VALDEZ JR., D.M.; SEKI, S.; YAZAWA, K.; URAKAWA, C.; JIN, B.;

KASAI, M.; KLEINHANS, F. W.; EDASHIGE, K. Cryoprotectant permeability of

aquaporin-3 expressed in Xenopus oocytes. Cryobiology, v. 53, p. 258-267, 2006.

YAMAKI, S.B.; PEDROSO, A.G.; ATVARS, T. D. Z. O estado vítreo dentro da

perspectiva do curso de graduação em química (físico-química). Química Nova, v.

25(2), p. 330-334, 2002.

129

YEOMAN, R. R.; WOLF, D. P.; LEE, D. M. Coculture of monkey ovarian tissue

increases survival after vitrification and slow-rate freezing. Fertility and Sterility, v. 83,

p. 1248-1254, 2005.

ZAMPOLLA, T.; SPIKINGS, E.; ZHANG, T.; RAWSON, D. M. Effect of methanol

and ME2SO exposure on mithocondrial activity and distribution in stage III ovarian

follicles of zebrafish (Danio rerio). Cryobiology, v. 59, p. 188-194, 2009.

ZHANG, J.M.; LIU, X.L.; YANG, Y.X.; WAN, X.P. Comparisons of different

protocols for vitrifying mouse ovarian tissue. Reproduction in Domestic Animals, v. 45,

p. 694-698, 2010.

Documents

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS ... · Marcello Otake Sato, que acreditaram em mim e guiaram meus primeiros passos na vida ... ultrastructural analysis by transmission