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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
RUBEN HORN VASCONCELOS
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E PERFIL DE
RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE ENTEROBACTÉRIAS
ISOLADAS DE CANÁRIOS BELGA (Serinus canaria)
Fortaleza
2013
2
RUBEN HORN VASCONCELOS
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E PERFIL DE
RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE ENTEROBACTÉRIAS
ISOLADAS DE CANÁRIOS BELGA (Serinus canaria)
FORTALEZA-CEARÁ 2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Sanidade e reprodução de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientador: Prof. Dr. William Cardoso Maciel
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário (a) Leila Cavalcante Sátiro – CRB-3 / 544
V331i Vasconcelos, Ruben Horn.
Isolamento, caracterização bioquímica e perfil de resistência a antimicrobianos de enterobactérias isoladas de canários belga (Serinus canaria)/Ruben Horn Vasconcelos.— 2013.
CD-ROM 54f. : il. (algumas color.); 4 ¾ pol. “CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho
acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)”. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade
de Veterinária, Mestrado acadêmico em Veterinária, Fortaleza, 2013. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. William Cardoso Maciel. Co-orientação: Prof. Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira. 1. Canários. 2. Enterobactérias. 3. Multirresistência. I. Título.
CDD: 636.089
4
4
À Deus, pois sem Ele, nada é possível, e que me levou por linhas tortas a esta
maravilhosa vitória.
Ao meu príncipe Reuven Bezerra Horn que me traz tanta alegria, me faz lutar para
crescer e ser uma pessoa melhor, ele que é a razão de todo o meu esforço e o principal motivo
do meu crescimento tanto como pessoa quanto como profissional!
À minha mãe Lucile Cortez Horn, que sem ela, nem veterinário eu seria, e que me
apoiou em todos os momentos difíceis, sempre me incentivando e ajudando sem pensar em si
mesma, obrigado mãe, sem você eu jamais teria chegado tão longe!
Ao meu pai Adriano Jorge Pequeno Vasconcelos, por todos os ensinamentos e valores
aprendidos, e por todas as ajudas e apoio durante os momentos mais difíceis da minha vida!
À minha esposa Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra por aturar as minhas
chatices e mesmo assim continuar me amando em seu jeito particular, por me apoiar nos
momentos difíceis e decisões a serem tomadas, e que sem ela, não teria tido forças nem para
começar esta jornada.
À minha família que sempre me apoiou e acreditou em mim, sobretudo meu irmão
Rafael Horn Vasconcelos e minhas irmãs Rebeca Horn Vasconcelos e Raquel Horn
Vasconcelos, que, cada um de seu jeito, me apoiaram, incentivaram e acreditaram em mim.
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará, à Faculdade de Veterinária e ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela oportunidade, pelos conhecimentos
adquiridos e pela chance de concluir esta importante etapa de minha vida.
Ao Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO) pelo apoio técnico para a
realização do experimento.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo pela
bolsa de auxílio ao curso de mestrado, o que proveu as condições necessárias para eu chegar
até o fim desta jornada.
À União Cearense de Ornitologia (UNICO) por auxiliar o contato com os
canaricultores.
Ao professor Dr. William Cardoso Maciel por me aceitar como aluno e fazer o papel
além de professor, de educador também.
Ao Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira, meu co-orientador, pelo grande apoio no
decorrer do meu mestrado, auxiliando em cada pequena dificuldade ao longo de toda a
jornada, e grato sou por toda a ajuda, apoio e conselhos.
À professora Drª. Rosa Patrícia Ramos Salles pelas contribuições dadas ao projeto
desde a qualificação e auxílio na escolha da minha metodologia.
Ao professor Dr. Carlos Iberê Alves Freitas pela amizade, apesar da distância, e pelas
contribuições a este trabalho apresentadas na qualificação.
A toda equipe do Laboratório de Estudos Ornitológicos: Windleyanne Gonçalves
Amorim Bezerra, Elisângela de Sousa Lopes, Roberta Cristina da Rocha e Silva, Átilla
Holanda de Albuquerque, Sanjay Veiga Mendonça pela ajuda durante as etapas e resolução de
problemas.
Aos alunos de iniciação científica que direta ou indiretamente ajudaram na coleta de
dados: Clarice Pessoa Almeida, Isabel Cristina Lima Santos, Suzan Vitória Girão Lima,
Valdiana da Silva Gomes, Felipe Pereira Sampaio, Manuel da Silveira Netto, Ercília Maria
Coelho de Carvalho, e em especial a Débora Nishi Machado que tanto ajudou diretamente na
parte laboratorial do experimento.
Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias que contribuíram para este estudo.
Também a todos que, de alguma forma, contribuíram para essa difícil etapa, fica aqui
escrito o meu sincero agradecimento.
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RESUMO
A família Enterobacteriaceae possui bactérias com potencial zoonótico e a presença destas bactérias em canários é relatada na literatura, porém a realidade dos plantéis de criadores de canários é desconhecida. Portanto, este trabalho teve como objetivo isolar enterobactérias de canários belga (Serinus canaria) com o intuito de conhecer os gêneros mais comuns nestas aves e suas respectivas resistências a antimicrobianos. De fevereiro a junho de 2013 foram coletados 387 amostras de swabs cloacais de canários de oito propriedades da cidade de Fortaleza, Brasil, e 58 necropsias de aves do acervo próprio do Laboratório de Estudos Ornitológicos, da Universidade Estadual do Ceará. As amostras foram submetidas a isolamento microbiológico utilizando-se água peptonada como pré-enriquecimento e ágar MacConkey na etapa de plaqueamento. As colônias foram selecionadas de acordo com suas características morfológicas nas placas, submetidas à identificação bioquímica para identificação e ao teste de sensibilidade a antimicrobianos. Foram isoladas 61 cepas, sendo 42 de swabs cloacais e 19 de necropsia. A bactéria mais isolada foi Escherichia coli com vinte e cinco cepas, seguida por catorze Klebsiella spp., doze Enterobacter spp., sete Pantoea agglomerans, duas Serratia spp. e um Proteus mirabilis. As cepas apresentaram maior resistência a sulfonamidas com 55,74%, seguido por ampicilina com 54,1% e tetraciclina com 39,34%. Além disso, o total de cepas resistentes a múltiplas drogas (RMD) foi 34 (55,74%). Portanto, conclui-se que os canários albergam enterobactérias e que as cepas apresentam alto índice de resistência a antimicrobianos e que há uma alta frequência de cepas RMD. Palavras-chave: Canários. Enterobactérias. Multirresistência.
7
ABSTRACT The Enterobacteriaceae family contains bacteria potentially zoonotic and their presence in canaries is often reported, though the current status of these birds in flocks is unknown. Therefore, this study aimed to identify the most common genera of enterobacteria from canaries (Serinus canaria) and their antimicrobial resistance profiles. From February to June of 2013, a total of 387 cloacal swab samples from eight domiciliary breeding locations of Fortaleza city, Brazil, were collected and 58 necropsies were performed in canaries, which belonged to the Laboratory of Ornithological Studies. The samples were submitted to microbiological procedure using buffered peptone water and MacConkey agar. Colonies were selected according to their morphological characteristics in plates, submitted to biochemical identification and antimicrobial susceptibility test. A total of 61 isolates were obtained, of which 42 were from cloacal swabs and 19 from necropsies. The most isolated bacteria was Escherichia coli with twenty five strains, followed by fourteen Klebsiella spp., twelve Enterobacter spp., seven Pantoea agglomerans, two Serratia spp. and one Proteus mirabilis. The antimicrobial to which the strains presented most resistance was sulfonamides with 55.7%, followed by ampicillin with 54.1% and tetracycline with 39.3%. The total of multidrug-resistant bacteria (MDR) was 34 (55.7%). In conclusion, canaries harbor members of the Enterobacteriaceae family and common strains present a high antimicrobial resistance rate, with a high frequency of MDR bacteria. Key words: Canaries. Enterobacteriaceae. Multidrug-resistance.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Carcaças congeladas de canários belgas (Serinus canaria) de um criadouro a serem submetidas à necropsia para coleta de amostras.
53
FIGURA 2 - Necropsia de um canário belga (Serinus canaria) para coleta de amostra de fígado e intestinos. Imagens antes da abertura da cavidade abdominal (A) e após a coleta de amostra do fígado e do intestino (B).
53
FIGURA 3 -
(A) Procedimento de coleta de swab cloacal de canário belga (Serinus canaria). (B) Swab utilizado para coleta de amostra cloacal de pássaros pequenos.
54
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Frequências absolutas e relativas de enterobactérias de swabs cloacais e amostras de necropsia de canários de Fortaleza, Brasil.
42
TABELA 2 - Percentual de cepas de enterobactérias isoladas de canários resistentes aos antibióticos utilizados.
43
TABELA 3 - Resistência a múltiplas drogas (RMD) de enterobactérias isoladas de canários.
43
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CE Ceará
FOB Federação Ornitológica do Brasil
LABEO Laboratório de Estudos Ornitológicos
MDR Multidrug-resistant
PCR Reação em cadeia de polimerase
TSI Ágar Triple-Sugar-Iron
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 14
2.1 BREVE HISTÓRICO DA CANARICULTURA ................................................. 14
2.2 CANARICULTURA NO BRASIL ...................................................................... 15
2.3 O CANÁRIO BELGA .......................................................................................... 15
2.3.1 Taxonomia .................................................................................................... 15
2.3.2 Características gerais .................................................................................. 16
2.4 Enterobacteriaceae ................................................................................................ 16
2.4.1 Salmonella .................................................................................................... 17
2.4.2 Escherichia coli ............................................................................................ 18
2.4.3 Yersinia ......................................................................................................... 19
2.4.4 Enterobacter .................................................................................................. 20
2.4.5 Klebsiella ....................................................................................................... 21
2.4.6 Citrobacter .................................................................................................... 21
2.4.7 Serratia. ......................................................................................................... 22
2.4.8 Pantoea agglomerans ................................................................................... 22
2.4.9 Resistência de enterobactérias a antibióticos ............................................ 23
3 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 25
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ........................................................................................ 26
5 OBJETIVO ................................................................................................................ 27
5.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 27
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 27
6 CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 28
7 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 43
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 44
12
1 INTRODUÇÃO
O canário belga (Serinus canaria) pertence à ordem Passeriformes e está inserido na
família Fringilidae. As primeiras notícias sobre sua existência ocorreram após a ocupação,
pelo navegador João Bethencourt, das Ilhas Canárias em 1402 e esse arquipélago foi o habitat
original dessa ave. São as aves mais criadas em cativeiro dentre todos os pássaros domésticos,
estimado por seu canto suave e harmonioso, a beleza de suas cores, além de serem muito
dóceis, fáceis de cuidar e baixo custo de manutenção (MANTEL, 2005). Segundo COBRAP-
ASCON/IBAMA (2012), criar passarinho ajuda a conservar as espécies, mas para isso é
necessário que as aves sejam criadas de acordo com a legislação vigente. O Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) procura
estimular a criação de aves domésticas ou exóticas que não apresentem risco para a fauna
brasileira, uma vez que a criação destas aves ajuda a diminuir o interesse nas aves silvestres
que muitas vezes se encontram ameaçadas de extinção e devem ser protegidas.
A canaricultura é a atividade que reúne a maior quantidade de criadores de aves
domésticas do mundo, com mais de 520 cores de canários para concursos. No Brasil, é
regularizada pela Federação Brasileira de Ornitologia (FOB), fundada em 1979, com a
realização anual de campeonatos estaduais, regionais e o brasileiro. Anualmente também são
realizados os campeonatos do hemisfério Sul, europeu e mundial, chegando a mais de 12.000
gaiolas em um só concurso (www.fob.org.br).
Aves da ordem Passeriformes geralmente não têm um grande número de micro-
organismos no seu trato gastrointestinal, no entanto, pássaros podem ser acometidos por uma
variedade de infecções bacterianas (JOSEPH, 2003). Em um estudo sobre a flora bacteriana
normal de pássaros granívoros, Rosskopf et al. (1996) constataram, através de swab cloacal,
que as bactérias Gram negativas não pertencem à microbiota digestória normal dessas aves e a
presença desse micro-organismo em aves clinicamente saudáveis está associada ao contato
direto com o homem. De acordo com Reed et al. (2003), assim como todos os vertebrados, as
aves, além de serem susceptíveis, podem também transmitir enteropatógenos para humanos e,
surpreendentemente, há poucas pesquisas sobre a microbiota intestinal tanto das aves
silvestres quanto das domésticas.
A infecção por patógenos da família das Enterobacteriaceae é comum às aves da
ordem Passeriforme, porém são consideradas secundárias, sendo necessária a presença de
fatores predisponentes para a transmissão da bactéria. Vários gêneros desta família já foram
relatados causando diferentes doenças em fringilídeos, como: Escherichia coli, Salmonella
spp., Citrobacter sp., Yersinia pseudotuberculosis e Klebsiella spp. (MACWHIRTER, 1994;
13
DORRESTEIN, 1997). Segundo Tsiodras et al. (2008), há vários relatos em humanos de
infecções por E. coli e S. Typhimurium transmitidas indiretamente por aves migratórias
pertencentes à ordem Passeriformes, este fato levanta a hipótese da transmissão destes agentes
por estas aves também quando mantidas em cativeiro. Ainda, vários surtos de salmonelose
humana estão ligados à contaminação de alimentos por fringilídeos e outros passeriformes
(KAPPERUD et al., 1998; ALLEY et al., 2002).
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 BREVE HISTÓRICO DA CANARICULTURA
A primeira espécie de canários foi relatada nas Ilhas Canárias, na Costa Africana do
oceano Atlântico, com a ocupação deste arquipélago pelo conquistador Jean de Bettencourt
por volta de 1402. Estas ilhas receberam esse nome antes do pássaro, todavia, os romanos
chamavam-nas de "Ilhas dos Cães" por serem habitadas por um tipo de raça de cães de grande
porte, sendo que a palavra "canário" deriva de canis, que é cachorro em latim. Esse
arquipélago que pertence à Espanha desde o século XV, se localiza a pouco mais de 100
quilômetros da Costa da África e trata-se de uma região coberta por vegetação e fauna quase
inexistentes em outras partes do mundo. É considerado o habitat original dessa ave, batizada
cientificamente com o nome de Serinus canaria, atualmente chamada de canário selvagem, e
classificada pelos naturalistas como pertencente à família dos Fringilídeos, na ordem dos
Passeriformes (MANTEL, 2005).
Esta espécie possui pouco mais de 12 centímetros, é nevado, de cor verde
acinzentada e com partes córneas escuras. Em 1478 várias destas aves foram levadas para a
Europa para serem criados como animais de estimação. Ainda hoje, porém, pode-se encontrar
o canário selvagem em vida livre nas Ilhas Canárias, Açores e Cabo Verde. A primeira obra
sobre o canário foi escrita pelo naturalista suíço, Conrad Gessner, em 1550, porém uma
descrição mais apurada foi feita por Ulisses Aldobrandi, em 1559, que descreveu o canário
silvestre como um pássaro de pequeno porte, não excedendo de doze centímetros, que nidifica
em pequenos arbustos. Este seria o canário silvestre, habitante natural das Ilhas Canárias,
origem de todas as raças de canários domésticos atualmente existentes e que são agrupadas
em: canários silvestres, de cor, de canto e de porte (MANTEL, 2005).
No início do século XVI, a canaricultura foi uma importante atividade econômica
para a região europeia do Tirol, pois a população, em sua grande maioria, era empregada nos
campos e nas minas de carvão. Uma vez que eram mal pagos, a criação destas aves permitia
um aumento na renda familiar. Sendo assim, a comunidade mineira tirolesa foi um dos
primeiros centros importantes de criação e venda de canários, ponto de partida de camponeses
e mineiros que vinham da Itália, de onde adquiriam seus exemplares e posteriormente os
vendiam para o resto da Europa. Já no século XVII, mais de oito mil canários foram criados
em Nuremberg, na Alemanha, principalmente por artesãos. O comércio cresceu a tal ponto
que as autoridades se viram forçadas a ditar leis severas para punir comerciantes desonestos
que vendiam como autênticos numbergueses, canários comprados em outras regiões. Devido a
15
esta constante reprodução as mutações encontradas foram fixadas e a numerosa quantidade de
cores diferentes foi estabelecida (GISMONDI, 1995).
2.2 CANARICULTURA NO BRASIL
Não é conhecida a data precisa da primeira entrada dos canários no país, porém sabe-
se que as primeiras sociedades de canaricultores foram criadas em 1902, criando
principalmente canários de canto. Posteriormente, no Brasil, chegaram os canários de porte,
principalmente os frisados parisienses, criados desde a primeira década do século XX. Apenas
nas décadas de 1940 e 1950 é que algumas raças inglesas e os canários de cor foram
introduzidos no país. Desde então, por todo o país tem se expandido a canaricultura, sendo
organizadas as competições a nível estadual, regional e o brasileiro. Tais competições, assim
como os clubes, são atualmente organizadas pela Federação Ornitológica do Brasil - FOB
(MANTEL, 2005).
Anualmente, as 172 associações de canaricultores de todo o Brasil, filiadas à FOB,
realizam campeonatos em suas cidades nos meses de maio e junho, dos quais só podem
participar os filhotes nascidos no ano anterior, devidamente anilhados. Os campeonatos são
nos segmentos de canários de cor, canários de porte e canários de canto. Apesar de todos os
canários machos de todas as raças cantarem perfeitamente a partir de quatro meses de idade,
só os canários do segmento canto clássico "Roller" é que podem participar do concurso de
canto. Após os campeonatos regionais, a FOB realiza o Campeonato Brasileiro de Ornitologia
que acontece sempre no mês de julho (MANTEL, 2005).
2.3 O CANÁRIO BELGA
2.3.1 Taxonomia
Classe: Ave
Subclasse: Neornithes
Ordem: Passeriformes
Subordem: Passeres
Família: Fringillidae
Subfamília: Carduelinae
Gênero: Serinus
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Espécie: Serinus canaria
2.3.2 Características gerais
São aves que variam de pequeno a médio porte (50 a 120mm) e apresentam bico
curto, grosso, cônico e de cor clara, embora algumas variedades tenham a ponta do bico
escura (JACKSON et al. 2003; GISMONDI, 1995). Os machos cantam facilmente,
principalmente na época reprodutiva, enquanto que as fêmeas vocalizam menos, geralmente
se resumindo a piados ou chegam a cantar, porém com bastante esforço (COELHO, 2004).
Desta forma, os machos são mais caros no mercado pet, quando comparados às fêmeas
(ABREU, 2009).
O canário é uma ave granívora de origem, podendo ser alimentado sem prejuízos com
sementes de alpiste, aveia, cânhamo, colza, linhaça e painço. Mas também pode-se oferecer
frutas e verduras como: maçã, pêra, uva, alface e afins, couve, espinafre e pepino. A ração
farinhada não deve ser esquecida como bom aporte de proteína, vitaminas e minerais. É
imprescindível na época de reprodução, podendo ser associada ao osso de ciba, para suprir o
cálcio necessitado pelas fêmeas para postura, visando assim inibir o acontecimento de
retenção de ovos (GISMONDI, 1995).
Sua reprodução é principalmente monogâmica, porém em cativeiro, um macho pode
ser usado para até quatro fêmeas sob condições especiais. A época do ano de acasalamento
varia de acordo com a região, pois há uma relação com a temperatura. No Brasil, há uma
tendência dos canários se reproduzirem nos meses de julho e agosto (COELHO, 2004).
2.4 Enterobacteriaceae
A família Enterobacteriaceae consiste em bactérias Gram-negativas, apresentadas
em bastões medindo até 3µm de comprimento e que fermentam glicose e uma gama de outros
açúcares, porém são oxidase-negativas. Diversos membros desta família são patógenos
importantes, dentre eles se encontram em destaque os gêneros Salmonella, Escherichia e
Yersinia; enquanto que outros gêneros são comumente isolados, porém são patógenos
oportunistas, como: Citrobacter, Shigella, Enterobacter, Klebsiella e Proteus (QUINN et al.,
1994).
17
As enterobactérias estão distribuídas por todo o mundo e são encontradas no solo,
água, frutas, vegetais, grãos, flores, árvores e em animais, de vermes e insetos até o homem.
Apresenta substancial heterogeneidade na sua ecologia, gama de hospedeiros e potencial
patogênico para homens, animais, insetos e plantas. Algumas espécies causam doenças
diarreicas como a febre tifoide e disenteria bacilar, todavia muitas espécies não são
normalmente associadas a doenças e atuam como patógenos oportunistas. Ainda, os membros
da família Enterobacteriaceae são responsáveis por pelo menos 50% das infecções
nosocomiais, mais frequentemente sendo causadas por Escherichia coli, Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Providencia e Serratia marcescens (BERGEY et al., 1994).
Pássaros não possuem um grande número de micro-organismos na sua microbiota,
todavia membros da família Enterobacteriaceae como Escherichia coli, Enterobacter spp.,
Klebsiella spp. e Salmonella spp. podem causar infecções primárias ou secundárias em
pássaros. Ainda, infecções simultâneas com agentes virais, parasitas ou fúngicos podem estar
presentes e devem ser descartadas como fatores de risco precursores para estas infecções. Os
sinais clínicos variam amplamente dependendo do micro-organismo presente, mas geralmente
incluem diarreia, metrite, septicemia, conjuntivite ou rinite. Filhotes de pássaros com diarreia
estão geralmente infectados por algum micro-organismo da família Enterobacteriaceae
(JOSEPH, 2003). De acordo com Lumeij (1994), as enterobactérias não são normalmente
encontradas nas fezes de psitacídeos e pássaros, onde bactérias Gram-positivas, especialmente
Corynebacterium sp. e Bacillus sp., predominam. Este autor afirma que o isolamento de uma
grande quantidade destes micro-organismos de culturas puras em ambos os taxa de aves é
sugestivo de infecção primária ou secundária, o que é reafirmado por Joseph (2003). Em se
tratando especificamente do canário belga, segundo Cattarossi et al. (2013), a flora bacteriana
destas aves é escassa, sendo que o isolamento de qualquer membro da família
Enterobacteriaceae destas aves pode normalmente ser correlacionado com um status de
enfermidade.
2.4.1 Salmonella
O gênero Salmonella contém as bactérias causadoras das seguintes doenças nas aves:
paratifo aviário, pulorose e tifo aviário. Apenas as salmonelas do grupo paratifoides
apresentam risco zoonótico, sendo importantes não apenas na criação de aves de produção,
mas também nas aves de companhia e de vida livre. O gênero divide-se em duas espécies:
Salmonella entérica e S. bongori. Mais de 2500 sorotipos são conhecidos, sendo alguns
18
específicos de aves, como S. Gallinarum e S. Pullorum, enquanto que outros são encontrados
causando infecções em seres humanos e aves, como S. Enteritidis e S. Typhimurium. S.
Gallinarum causa o tifo aviário, enquanto que S. Pullorum causa a pulorose; os demais
gêneros, quando estão presentes causando infecções, são agentes causadores do paratifo
aviário (AGBAJE et al., 2011).
Salmonella spp. também tem sido isolada de casos de osteomielite, lesões oculares e
granulomas subcutâneos em canários, sendo que o principal sintoma é diarreia abundante e
depressão rápida da ave (GISMONDI, 1995). Salmonella Typhimurium var copenhagen pode
causar a formação de granulomas no fígado, baço, e cecos rudimentares, bem como lesões
oculares e osteomielite nos finches. Nos fringilídeos europeus, S. Typhimurium var
copenhagen é bastante isolada associada a ingluvite granulomatosa, que por sua vez pode ser
confundida com candidíase ou capilariose (PANIGRAHY & GILMORE, 1983). S.
Typhimurium é relativamente comum nas aves selvagens, não apenas nas que se alimentam
de restos de alimentos contaminados, mas também nos pássaros que estão expostos à
contaminação fecal. Esta situação ocorre de forma mais frequente nos locais onde as aves se
agrupam para se alimentar ou beber água, pois nestes locais há uma concentração maior de
aves e, por consequência, uma maior disseminação de doenças, dentre elas a salmonelose
(TIZARD, 2004). Seguindo o mesmo princípio, devido à concentração de aves, uma vez que
estejam em cativeiro, esta transmissão também pode ser exacerbada, como observado em
alguns surtos de salmonelose em canários e outros pássaros relatados ao longo dos anos na
literatura (PANIGRAHY & GILMORE, 1983; RAIDAL, 1998; SAREYYÜPOĞLU et al.,
2008; MADADGAR et al., 2009; RAHMANI et al., 2011).
A cultura microbiológica de fezes é a metodologia utilizada para identificar aves
portadoras de Salmonella sp., porém aves infectadas por este agente, podem possuí-lo em
qualquer órgão ou tecido do corpo, devido à sua característica septicêmica. A eliminação
completa do agente no indivíduo, bem como no plantel, é difícil e requer o uso de antibióticos
em longo prazo baseado no teste de sensibilidade (FUDGE, 2001).
2.4.2 Escherichia coli
A Escherichia coli coloniza o intestino dos indivíduos logo após o nascimento, sem
necessariamente causar infecção, todavia o papel dela como membro da microbiota de aves
não é completamente elucidado, podendo atuar como fonte de vitaminas e ocupando os sítios
19
na mucosa intestinal, impedindo assim a colonização do epitélio por microorganismos
patogênicos (FERREIRA & KNÖBL, 2000). A patogenicidade em amostras de E. coli
causadoras de colibacilose está relacionada aos fatores de virulência que podem ser avaliados
para diferenciar amostras patogênicas de não patogênicas (JOHNSON, 1991).
Este patógeno tem sido associado a uma variedade de doenças em diferentes pássaros,
incluindo diarreia, septicemia e infecções ascendentes do oviduto, que são geralmente raras,
porém peritonites e metrites induzidas por E. coli têm sido associadas a alta mortalidade em
alguns plantéis de canário no sudeste da Austrália (MACWHIRTER, 1994). Os sinais clínicos
da colibacilose em canários são: sonolência, inapetência, diarreia esverdeada e dispneia,
causando mortalidade de até 50% (GISMONDI, 1995). As cepas de E. coli. variam
amplamente quanto à sua patogenicidade e são frequentemente encontradas na microflora
intestinal de aves sadias, pois possuem um mecanismo de entrada especial pelo trato
respiratório. A maioria das doenças associadas a cepas de E. coli patogênicas se devem a
fatores ambientais ou fatores predisponentes do hospedeiro, sendo portanto essencialmente
secundárias. O tratamento com antimicrobianos de aves sadias e positivas para E. coli em
suas fezes ou papo geralmente apenas induz à resistência, enquanto que só deve ser realizado
quando o profissional se encontra frente a lesões associadas a este patógeno, bem como em
surtos (FUDGE, 2001).
Cepas APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) podem apresentar risco zoonótico,
uma vez que são frequentemente comparadas a cepas isoladas de casos humanos de infecções
extra intestinais (RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; EWERS et al., 2007; MORA et al., 2012;
MORA et al., 2013). Ainda, cepas de E. coli isoladas de pássaros de vida livre preencheram
os requisitos in vitro para serem consideradas APEC, mostrando que aves desta ordem podem
oferecer um risco para a saúde de aves de produção (GAUKLER et al., 2009). Outros dois
isolados de pássaros de vida livre, porém não pertenciam aos sorogrupos normalmente
relacionados a surtos de colibacilose aviária, todavia um dos dois apresentou-se positivo para
alguns genes de virulência, o que demonstra o potencial de aves desta ordem albergarem
cepas potencialmente patogênicas (GIBBS et al., 2007)
2.4.3 Yersinia
No hemisfério norte, a yersiniose (doença causada pela bactéria Yersinia
pseudotuberculosis) é vista em Passeriformes durante os meses de inverno. Acredita-se que o
organismo tenha partido da Europa, com difusão mundial ocorrendo
20
através de roedores em navios. Yersiniose é um problema generalizado em aviários
australianos onde o controle de roedores é pobre. Infecções ocorrem ocasionalmente em aves
de vida livre. Sua transmissão pode ocorrer via alimentos e água contaminados com fezes.
Este patógeno pode causar dispneia, diarreia e morte em canários e finches. Achados de
necropsia podem ser idênticos aos encontrados nas infecções por Salmonella, incluindo
formação de granulomas no fígado, baço e intestinos. Estes dois micro-organismos podem ser
diferenciados por cultivo com provas bioquímicas. Aves afetadas muitas vezes se encontram
fracas demais para responder à terapia, mas o tratamento de aves expostas sem sintomatologia
com antibióticos escolhidos de acordo com testes de sensibilidade normalmente é uma boa
técnica para controlar um surto. Desinfecção dos aviários e adaptação de suprimentos de água
e alimentos livres de roedores deve acompanhar qualquer terapia antibiótica
(MACWHIRTER, 1994).
Duas formas de yersiniose são observadas em aves: a aguda e a crônica. A forma
aguda é comum em turacos, tucanos e calopsitas, apresentando-se com septicemia, pneumonia
fibrinosa, esplenomegalia e hepatite necrótica aguda. A forma crônica se mostra com focos
puntiformes no fígado, baço, duodeno e cecos, sendo comum em finches, canários e
psitacídeos. Os achados de necropsia, contudo não são patognomônicos e devem ser
diferenciados de doenças como a micobacteriose (FUDGE, 2001).
Em oito canários (Serinus canaria) necropsiados, Yersinia pseudotuberculosis
sorotipo II foi isolado de seis aves, os quais apresentaram enterite, hepatoesplenomegalia, e,
apenas em duas aves, focos de necrose miliares. Neste mesmo estudo, outros passeriformes
analisados com isolamento de Yersinia pseudotuberculosis sorotipo II apresentaram achados
de necropsia similarmente relacionados ao sistema digestório, diferentemente de psitacídeos e
columbídeos também positivos para este patógeno, que apresentaram lesões no fígado,
pulmões e rins (CORK et al., 1999).
2.4.4 Enterobacter
O gênero Enterobacter possui 16 espécies, todavia as espécies E. aerogenes e E.
cloacae são as mais comumente isoladas de amostras biológicas. Encontram-se distribuídas
amplamente na água, esgoto, solo e vegetais. Fazem parte da microbiota entérica comensal e
acredita-se que não causam diarreia, porém estão associadas a uma variedade de infecções
oportunistas humanas que afetam as vias urinárias, o trato respiratório, as feridas cutâneas e,
em ocasiões, causam septicemia e meningite. Outra espécie que já foi isolada de casos de
21
meningite e septicemia neonatal humana foi a E. sakazakii (Koneman et al., 2001). Todavia,
para Gerlach (1994), o gênero Enterobacter, assim como Serratia, Hafnia e Proteus são
considerados de baixa patogenicidade para aves.
Segundo Cattarossi et al. (2013), as espécies E. sakazakii é considerada um importante
patógeno para criação de canários, bem como outras enterobactérias tais como: Salmonella
spp., Escherichia coli e Klebsiella spp. O motivo da preocupação destes autores é a constante
presença destes patógenos durante surtos de mortalidade em filhotes ainda no ninho.
2.4.5 Klebsiella
Um dos poucos membros da família Enterobacteriaceae que é imóvel, com células
capsuladas e alta capacidade de fermentação de diversos carboidratos. A principal espécie do
gênero é K. pneumoniae que, assim como K. oxytoca e algumas outras espécies do gênero
menos frequentes, atuam como patógenos oportunistas em humanos, sendo encontrados no
ambiente e muitas vezes causando infecções nosocomiais (BERGEY et al., 1994).
As espécies K. pneumoniae e K. oxytoca são frequentemente isoladas de aves, nas
quais podem atuar como patógenos primários, especialmente em Weaver finches, ou podem
atuar como oportunistas em pacientes estressados ou imunossuprimidos. A cápsula mucóide
apresentada por estes micro-organismos promove uma barreira contra intempéries ambientais,
desinfetantes e até mesmo a resposta imunológica celular no hospedeiro, todavia é também
altamente imunogênica, estimulando resposta humoral. A bacteremia causada pelas bactérias
deste gênero resulta em colonização e consequente falha renal, sendo em muitas aves,
incluindo diversos pássaros, a infecção detectada tardiamente apenas quando há
comprometimento respiratório (GERLACH, 1994).
2.4.6 Citrobacter
O gênero Citrobacter não é isolado frequentemente de aves de companhia, porém é
considerado como parte da microbiota intestinal de aves de rapina. Psitacídeos são raramente
afetados por este patógeno, porém pássaros podem ser mais susceptíveis a enterites e
consequente septicemia por este agente. Uma vez que Citrobacter freundii é isolado de uma
ave saudável, o tratamento medicamentoso é desaconselhável. Porém condições sanitárias do
ambiente devem ser consideradas, pois sob a constante presença do agente, fatores
predisponentes podem gerar uma infecção (FUDGE, 2001).
22
Segundo Gerlach (1994) as três espécies mais comuns do gênero Citrobacter são C.
freundii, C. amalonaticus e C. diversus, que são menos frequentemente isoladas de aves do
que outros membros da família Enterobacteriaceae. Destas, a espécie C. freundii parece ser a
mais patogênica das três, enquanto que C. diversus é raramente isolada de aves. Esse autor
afirma ainda que este gênero causa infecções secundárias graves em Weaver finches e
Estrildíneos, ocorrendo rápida bacteremia seguida por morte aguda quando o micro-
organismo penetra a mucosa intestinal. Contudo, não há casos de infecções humanas
derivadas de exposição a aves infectadas.
2.4.7 Serratia
No homem, as bactérias deste gênero são consideradas patógenos oportunistas, sendo
amplamente isolada em diversos tipos de amostras ambientais. A espécie principal é Serratia
marcescens, considerada um importante patógeno oportunista para humanos hospitalizados,
causando septicemia e infecções urinárias (BERGEY et al., 1994).
O gênero Serratia é raramente isolado causando infecções em aves e para estes
animais é, portanto, considerado uma bactéria de caráter oportunista de baixa patogenicidade,
todavia crescem os casos de Serratia marcescens isoladas de grandes psitacídeos com
doenças crônicas debilitantes (GERLACH, 1994). Ainda, no homem, Serratia marcescens já
foi considerada não-patogênica e estudos mostraram um aumento na mortalidade e morbidade
de infecções hospitalares após a dispersão deste agente para estudos em São Francisco,
Estados Unidos da América (EUA), mostrando, portanto que mesmo a característica
oportunista desta espécie, dependendo da situação pode ser um risco (FUDGE, 2001).
2.4.8 Pantoea agglomerans
Esta espécie pertence à familia Enterobacteriaceae e já foi nomeada de Erwinia
herbicola, Erwinia milletieae e Enterobacter agglomerans, sendo esta última a sinonímia
mais comumente encontrada na literatura. É uma bactéria isolada primariamente de plantas e
em segundo lugar de animais e humanos, sendo que nestes é classificada como um patógeno
oportunista (BERGEY et al., 1994). Esta bactéria é comumente associada a plantas, atuando
como patógeno ou saprófita, e tem significância incerta para animais (QUINN et al., 1994).
Segundo Gerlach (1994), o isolamento desta bactéria de fezes de aves indica o
consumo de sementes que contêm uma concentração maior que 106 bactérias por grama de
23
alimento. Este autor ainda afirma que esta bactéria é comum em vegetais em descomposição
e, devido a este fato, alimentos fornecidos a aves que possuam alta concentração da mesma
devem ser considerados tóxicos.
O levantamento de enterobactérias realizado por Gibbs et al. (2007) em Graúnas de
Cabeça Amarela (Xanthocephalus xanthocephalus), um pássaro de vida livre, demonstrou que
a bactéria P. agglomerans foi a mais isolada de amostras de fezes. Estes autores afirmaram
que esta espécie bacteriana pode ser estudada como possível organismo de exclusão
competitiva para a microbiota de aves de produção, devido à habilidade que este micro-
organismo possui em inibir a colonização por patógenos em plantas e a aparente
adaptabilidade ao sistema gastrointestinal destas aves. Ainda, afirmam que esta bactéria é um
patógeno oportunista humano, todavia, a casuística é limitada e consideravelmente menos
frequente do que patógenos como Escherichia coli.
2.4.9 Resistência de enterobactérias a antibióticos
A resistência bacteriana é uma das principais causas de insucesso da terapia
antimicrobiana e pode ser natural ou adquirida, sendo que a primeira é menos importante,
uma vez que no momento da escolha terapêutica o médico veterinário já sabe ao que o micro-
organismo em questão é resistente ou sensível. A resistência adquirida é a mais preocupante,
uma vez que prejudica os tratamentos limitando opções viáveis de antimicrobianos. Ela ocorre
por mutação ou transferência de genes, que por sua vez pode ser cromossômica ou
extracromossômica (SPINOSA, 2006). A transferência de genes por membros da família
Enterobacteriaceae já foi demonstrada in vitro por Okamoto et al. (2011), os quais
demonstraram que E. coli pode transferir genes plasmidiais de resistência de forma horizontal
para Salmonella Enteritidis, todavia os mesmos afirmam que in vivo outras condições podem
ser desfavoráveis para que este fenômeno ocorra.
Já foi relatado na literatura pesquisa de enterobactérias isoladas de pássaros e que
apresentaram resistência a antimicrobianos e as mais frequentes foram a ampicilina e
cefalotina, mas também foi detectada resistência a amoxicilina/ácido clavulânico, ceftiofur,
cloranfenicol, canamicina, ácido nalidíxico e sulfisoxazole (Gibbs et al., 2007). No estudo
realizado por Gaukler et al. (2009), também com pássaros, as resistências mais frequentes de
cepas de Escherichia coli foram a ampicilina e tetraciclina, enquanto que as cepas de
Salmonella spp. apresentaram resistência a cefoxitina, tetraciclina e amoxicilina/ácido
clavulânico. Um surto de salmonelose em dezessete plantéis de canários em Teerã, Irã,
causado por S. Typhimurium revelou que as cepas apresentavam o mesmo padrão, sendo
24
resistentes a sulfametoxazol, tilosina, cloxacilina, tiamulina e vancomicina (Madadgar et al.,
2009).
Um levantamento de Salmonella spp. de aves em pet shops e parques, também de
Teerã, Irã, revelou que 16 dos 19 isolados apresentaram algum nível de resistência, e destes,
14 eram cepas resistentes a múltiplas drogas (RMD), sendo que o máximo de antibióticos aos
quais as cepas foram resistentes foi 11. Ainda neste estudo, nenhuma das cepas foi resistente a
danofloxacina, levofloxacina, norfloxacina, amicacina, gentamicina, tobramicina, todavia os
maiores índices de resistência foram a carbenicilina, tetraciclina, estreptomicina, lincospectina
e ácido nalidíxico (Rahmani et al., 2011). Okamoto et al. (2009) demonstraram que a
resistência a múltiplas drogas por muitas vezes é mediada por integrons de classe 1 e que
pode ser transferida in vitro, porém nem sempre este mecanismo está envolvido com cepas
RMD, já que 100 cepas de Salmonella RMD foram negativas para a presença destes integrons
de classe 1.
Segundo Cattarossi et al. (2013), após levantamento microbiológico de um plantel de
canários, as espécies de bactérias mais preocupantes e/ou mais frequentes devem ser
submetidas a antibiograma, para que o curso de tratamento seja decidido baseado na
susceptibilidade dos micro-organismos.
25
3 JUSTIFICATIVA
Há relatos na literatura do isolamento de algumas enterobactérias de diferentes
espécies de pássaros, sendo uma delas o canário belga, que é uma das aves domésticas mais
criadas no mundo. A gravidade de algumas doenças causadas por estas bactérias gera grande
preocupação para a saúde pública mundial e devido à proximidade do homem com os
canários e a escassez de estudos sobre enterobactérias nestas aves, surge a necessidade de
verificar a sua presença através do isolamento e tipificação bioquímica, além de conhecer os
gêneros mais comuns.
26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os canários albergam enterobactérias e, além de serem infectados por estes micro-
organismos, se apresentam como possíveis riscos para a saúde pública devido ao seu contato
com o ser humano e a elevada quantidade de aves nas criações e competições. As
enterobactérias presentes nos canários belga apresentam resistência a antibióticos e isto
promove um risco de transmissão de resistência a patógenos humanos.
27
5 OBJETIVO
5.1 OBJETIVO GERAL
Verificar quais gêneros de enterobactérias estão presentes nos canários belga e avaliar
seus perfis de resistência a antimicrobianos (Serinus canaria)
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Verificar a existência de enterobactérias em amostras de swab cloacal de canários
belga e de necropsia em aves que vieram a óbito;
• Realizar a identificação bioquímica das enterobactérias isoladas;
• Realizar teste de sensibilidade a antimicrobianos nas cepas de enterobactérias isoladas.
28
6 CAPÍTULO 1
Identificação e resistência aos antimicrobianos de membros da família
Enterobacteriaceae isolados de canários belgas (Serinus canaria)
Identification and antimicrobial resistance of members from the family
Enterobacteriaceae isolated from canaries (Serinus canaria)
Periódico: Avian Pathology (submetido em novembro de 2013).
29
Identification and antimicrobial resistance of members from the family
Enterobacteriaceae isolated from canaries (Serinus canaria)
Ruben Horn Vasconcelos, William Cardoso Maciel, Elisângela de Souza Lopes, Régis
Siqueira de Castro Teixeira, Átilla Holanda de Albuquerque, Roberta Cristina da Rocha-e-
Silva, Débora Nishi Machado, Isabel Cristina Lima Santos, Felipe Pereira Sampaio, Suzan
Vitória Girão Lima, Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra, Sanjay Veiga Mendonça.
Abstract
The Enterobacteriaceae family contains bacteria potentially zoonotic and their presence in
canaries is often reported, though the current status of these birds in flocks is unknown.
Therefore, this study aimed to identify the most common genera of enterobacteria from
canaries (Serinus canaria) and their antimicrobial resistance profiles. From February to June
of 2013, a total of 387 cloacal swab samples from eight domiciliary breeding locations of
Fortaleza city, Brazil, were collected and 58 necropsies were performed in canaries, which
belonged to the Laboratory of Ornithological Studies. The samples were submitted to
microbiological procedure using buffered peptone water and MacConkey agar. Colonies were
selected according to their morphological characteristics in plates, submitted to biochemical
identification and antimicrobial susceptibility test. A total of 61 isolates were obtained, of
which 42 were from cloacal swabs and 19 from necropsies. The most isolated bacteria was
Escherichia coli with twenty five strains, followed by fourteen Klebsiella spp., twelve
Enterobacter spp., seven Pantoea agglomerans, two Serratia spp. and one Proteus mirabilis.
The antimicrobial to which the strains presented most resistance was sulfonamides with
55.7%, followed by ampicillin with 54.1% and tetracycline with 39.3%. The total of
multidrug-resistant bacteria (MDR) was 34 (55.7%). In conclusion, canaries harbor members
30
of the Enterobacteriaceae family and common strains present a high antimicrobial resistance
rate, with a high frequency of MDR bacteria.
Key words: Canaries. Enterobacteriaceae. Multidrug-resistance.
Introduction
Birds of the Passeriformes order usually do not harbor a large quantity of
microorganisms in their intestinal tract, however, birds are susceptible to a variety of bacterial
infections (Joseph, 2003), such as the ones caused by pathogens of the family
Enterobacteriaceae. These, however are considered secondary and the presence of
predisposal factors are necessary in order to the infection to occur. Several genera of this
family have been reported causing different diseases in passerines, such as: Escherichia coli,
Salmonella spp., Citrobacter spp., Yersinia pseudotuberculosis and Klebsiella spp.
(Macwhirter, 1994).
The Enterobacteriaceae is a large family of Gram-negative bacteria (Quinn et al.,
1994), also called enterobacteria, which do not belong in the normal digestive microbiota of
granivorous passerines, and their presence in clinically healthy birds are associated with direct
contact with men (Rosskopf et al., 1996). Similar to all other vertebrates, birds are susceptible
and can also transmit enteropathogens to humans and, surprisingly, there are few
comprehensive surveys done for wild and most domesticated birds (Reed et al., 2003). There
are reports on human infections caused by E. coli and S. Typhimurium transmitted indirectly
by migratory birds belonging in the Passeriformes order (Tsiodras et al., 2008) and this fact
generates the hypothesis of the transmission of these pathogens by birds when maintained in
captivity. Also, several outbreaks of human salmonellosis are connected to foodborne
contamination by passerines (Kapperud et al., 1998; Alley et al., 2002).
31
The canary (Serinus canaria) belongs in the Passeriformes order and is inserted in
Fringillidae family. These are small birds (50 to 120mm) with a curve, thick and conic beak,
often light collored, though some varieties present a thick beak tip (Jackson et al., 2003;
Gismondi, 1995). In all continents, though mainly in Europe, the canary is a popular bird in
the home environment as a companion bird and for competitive purposes, in which breeders
compete their birds in three categories: song, color and type (Cattarossi et al., 2013). Due to
the absence of studies of the fermentative Gram-negative microbiota of these birds and their
importance in the Brazillian home environment, this study aimed to identify the most
common Enterobacteriaceae genera and to characterize the antimicrobial resistance of the
strains isolated from canaries (Serinus canaria) of domiciliary breeding locations in Fortaleza
city, Brazil.
Material and Methods
Samples. From February to June 2013 a total of 387 cloacal swab samples from eight
domiciliary breeding location and 58 necropsy samples, performed as a pool of liver and intestines of
each canary, were collected. The cloacal swab samples were collected from each location and
submitted to the Laboratory of Ornithological Studies (LABEO) at the State University of Ceará for
the bacteriological procedure. When present, clinical signs from each sampled bird were taken note.
The dead birds analyzed belonged to the personal collection of LABEO, and the carcasses were
maintained frozen at -20ºC until sampling was performed. The necropsies were performed close to the
Bunsen burner, aseptically and using sterile equipment to prevent contamination.
Microbiological procedure. Cloacal swabs and necropsy samples were placed in tubes
containing buffered peptone water 0.1% broth and maintained in bacteriological incubator at 37ºC for
24h. After such period, a loopful was collected and streaked in MacConkey agar also submitted to the
same previous incubation conditions. Colonies were selected according to their morphological
characteristics and from each plate, at least one was selected, submitted to Triple-Sugar-Iron (TSI)
agar in order to differentiate from non-fermenter bacteria following biochemical identification (Quinn
et al., 1994).
32
Antimicrobial resistance. The antimicrobial susceptibility test was performed using the disk
diffusion method in Mueller-Hinton agar (Himedia®) with the following discs in the respective
concentrations: Ampicillin (10µg), Nalidixic acid (30µg), Ceftiofur (30µg), Enrofloxacin (5µg),
Sulfazotrim (Trimethoprim + Sulfamethoxazole) (25µg), Streptomycin (10µg), Neomycin (30µg),
Polymyxin B (300 U.I.), Sulfonamides (300µg), Gentamycin (10µg), Chloramphenicol (30µg) and
Tetracycline (30µg). Results were interpreted according to CLSI (2012) and intermediate zone
diameters were interpreted as resistant to the respected antimicrobial.
Results
Isolated bacteria. The total prevalence of enterobacteria found in cloacal swabs of
canaries analyzed was 10.85% (42/487) and in necropsies was 32.76% (19/58); the results are
presented in Table 1. From cloacal swabs, the most frequent bacteria (14/42) was Escherichia
coli, presenting a prevalence of 3.62% (11/487), followed by: Enterobacter spp. (11/42) with
2.84%, Klebsiella spp. (9/42) with 2.32%, Pantoea agglomerans (synonyms are Erwinia
herbicola or Enterobacter agglomerans) (5/42) with 1.29%, Serratia spp. (2/42) with 0.52%
and Proteus mirabilis (1/42) with 0.26%. The most frequent bacteria from necropsy samples
was also Escherichia coli (11/19) presenting a prevalence of 18.97% (11/58), followed by:
Klebsiella spp. (5/19) with 8.62%, Pantoea agglomerans (2/19) with 3.45% and Enterobacter
spp. (1/19) with 1.72%. No Bird presented more than one enterobacteria in the exam, though
ocasionally, some presented besides the enterobacteria, a non-fermenter Gram-negative
bacteria, which was identified and discarded in the TSI agar.
From the 61 birds that were positive for some enterobacteria, only 11 presented
diarrhea, of which 8 were from cloacal swabs and 3 were from necropsy. From these three,
one presented negative in the swab and after two days from sampling was found dead in the
cage. Necropsy was performed in the sequence and a strain of Escherichia coli was isolated.
Of the 384 negative birds, 26 presented diarrhea.
33
Antimicrobial resistance. The antimicrobial susceptibility test results are
demonstrated in Table 2. The antimicrobial to which strains presented the most frequent
resistance was sulfonamides with 55.7%, followed by Ampicillin with 54.1% and
Tetracycline with 39.3%. More than 50% of E. coli strains presented resistance to
Sulfonamides (64%), but a high resistance rate was also observed to Tetracycline (48%),
Sulfamethoxazole+Trimethoprim (44%), Streptomycin (40%) and Chloramphenicol (36%).
The genus Enterobacter presented a high resistance rate only to Ampicillin (66.7%), while the
genus Klebsiella presented a 100% resistance rate to Ampicillin and a high resistance rate to
Sulfonamides (57.1%). The Pantoea agglomerans strains presented high resistance rate to
Ampicillin (71.4%), to Sulfonamides (57.1%), to neomycin (42.9%), to
Sulfamethoxazole+trimethoprim (42.9%) and Tetracycline (42.9%). The genus Serratia
presented resistance only to Ampicillin (100%) and Sulfonamides (50%), while the only
Proteus mirabilis isolated was resistant to Nalidixic acid, Streptomycin, Sulfonamides,
Chloramphenicol, Tetracyline and Polymyxin B, to which the genus Proteus is naturally
resistant. The total of multidrug-resistant bacteria (MDR) was 34 (55.7%) and the maximum
antimicrobials to which a single isolate was resistant was eight, followed by three isolates that
were resistant to seven antimicrobials. Table 3 demonstrates the amount of isolates and
antimicrobials to which resistance was observed.
Discussion
Surveys of Enterobacteriaceae have been performed in several avian species, from
which different members of this bacterial family were isolated from birds in captivity
belonging to 15 orders (Jones & Nisbet, 1980). The enterobacteria are widely distributed in
the environment, in the microbiota of mammals and of some birds (Fudge, 2001), however
passerines do not possess a functional caeca, or an intestinal microbiota for the digestion of
34
nutrients, which makes the presence of members of the Enterobacteriaceae family often
related to a disease status (Dorrestein, 2003). In this study, the prevalence of enterobacteria
was higher in dead birds, than it was in the live ones, which may be explained by the
pathogenic potential that many of these micro-organisms possess, though with the
methodology applied these possible infections cannot be confirmed. Another possibility is
that, in dead birds, the bacterial isolation was higher in comparison to the swabs due to the
growth that occurs from the moment of death until the carcass was found and frozen. Also,
the technique itself may have favored the necropsy results, since large intestinal samples were
collected, when compared to swabs which sample a low amount of bacteria present in the
cloaca.
Most mammals and some bird species possess E. coli in their normal intestinal flora,
since they are colonized at birth and remain with this bacterium during the entire life (Fudge,
2001). Passerines, in spite of having a permanent microbiota, may host this bacterium with no
symptoms, which have been reported (Jones & Nisbet, 1980), however other authors have
reported this micro-organisms causing different diseases in passerines (Dorrestein, 2003;
Cattarossi et al., 2013; Macwhirter, 1994). In this study, E. coli was the most frequently
isolated bacteria from both dead and live canaries, which may implicate in a zoonotic risk,
since several other birds in this study were present in home environments and, therefore, in
direct contact with the owners. Although more studies on the virulence of these strains are
necessary in order to confirm this hypothesis, since E. coli strains with virulence factors have
been previously isolated from passerines (Gibbs et al., 2007).
The genera Enterobacter and Klebsiella may cause primary or secondary infections in
passerines, sometimes acting as opportunistic pathogens associated or not with viral, parasitic
or fungal infections (Joseph, 2003). Bacteria from the genus Klebsiella and the species
Enterobacter sakazakii have been correlated with the occurrence of high mortality outbreaks
35
in canary flocks, and these micro-organisms have been considered as important as
Salmonella, Escherichia coli, Listeria spp., Staphylococcus spp. and Pseudomonas (Cattarossi
et al., 2013). The genus Serratia also present opportunistic infections in passerines, much like
Klebsiella and Enterobacter, however it is less often isolated and the most frequent species
are S. marcescens, S. odorifera, S. rubidae and S. liquefaciens (Fudge, 2001). In this study,
only one S. odorifera and one S. liquefaciens were identified.
The most important and most frequently reported bacteria in the scientific literature
isolated from canaries is Salmonella spp. (Harrington et al., 1975; Panigrahy & Gilmore,
1983; Rosskopf & Woerpel, 1996; Raidal, 1998; Fudge, 2001; Dorrestein, 2003; Madadgar et
al., 2009; Rahmani et al., 2011). However, in this study no bacteria from this genus were
isolated, which may be explained by the excessive use of antibiotics by the owners and the
absence of outbreaks reported in the residences visited. The methodology applied may have
also hindered the isolation of these bacteria, since it has already been demonstrated that the
polymerase chain reaction (PCR) test present a higher positivity rate when compared to the
conventional culture for the survey of Salmonella from the feces of pet birds, however with
no significant difference between the two tests (Sareyyüpoğlu, 2008). Due to the reports in the
literature and the importance that this genus represents, control measures must always be
applied in order to guarantee the safety of the birds, owners and environment.
The genus Yersinia possesses species that cause zoonotic infections, being Y.
pseudotuberculosis the most frequently isolated bacterium from the intestines of wild and
captive passerines (Quinn et al., 1994). However, this pathogen is more reported during the
winter months, when the cold weather benefits the growth of this pathogen and cause
outbreaks of yersiniosis (Fudge, 2001). Another predisposing factor that favors the occurrence
of this infection is the infestation by rodents or wild birds, which may carry this bacterium
and disseminate in the environment (Guimarães, 2006). The absence of this genus in the
36
studied birds may be explained by the local weather that do not favors the spread of this
bacterium and the absence of problems with rodents or wild birds, as reported by the owners.
According to the literature, several members of the Enterobacteriaceae family are
known to cause, among other illnesses, intestinal infections and the main symptom observed
in these cases of diseased passerines is diarrhea (Macwhirter, 1994; Dorrestein, 2003;
Guimarães, 2006). In this study, however, most (26/37) of the canaries that presented diarrhea
did not present any enterobacteria, which indicates that different etiologies may be implied,
such as parasites, viral or fungal infections, or food disorders (Joseph, 2003).
Elevated antimicrobial resistance have been reported (Gaukler et al., 2009) in E. coli
strains isolated from passerines, mainly to Ampicillin and to Tetracycline, and also the
occurrence of MDR strains, which is similar to the findings in this study, however they were
free-living birds, which, theoretically do not have access to significant quantities of
antimicrobials. Other authors, in spite the low amount of tested strains, found frequent
antimicrobial resistance in strains of Klebsiella and Enterobacter to Ampicillin and Ceftiofur,
which the former agrees with this study, but the latter disagrees (Gibbs et al., 2007); the same
authors also reported a low frequency of resistance in Pantoea agglomerans strains, which
was different from this study that encountered strains of this species resistant to a maximum
of six antibiotics. However, this result may not have a major importance, since this bacterium
is more commonly isolated from plants, rarely causing infection in men (De Champs et al.,
2000) and with uncertain significance for animals (Quinn et al., 1994). Also, a high resistance
rate to antimicrobials has been reported in Salmonella strains isolated from several pet birds,
including canaries (Rahmani et al., 2011). In this study, the high resistance rate to antibiotics
and the high frequency of MDR enterobacteria isolated from canaries of home environments
suggest that the use of antibiotics is elevated and should be controlled.
37
In conclusion, canaries (Serinus canaria) host members of the Enterobacteriaceae
family and Escherichia coli is the most frequent. The enterobacteria strains from these birds
present a high resistance rate to antimicrobials and the emergence of multidrug resistant
strains is concerning, since the proximity of these birds and people represent a potential
zoonotic risk.
References
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Table 1. Absolute and relative frequencies of enterobactéria isolated from cloacal swabs and
necropsy samples of canaries (Serinus canaria) from Fortaleza, Brazil.
Enterobacteria Swabs (n=387) Necropsies (n=58) Total (n=445) n % n % n %
Escherichia coli 14 3,62 11 18,97 25 5,62 Enterobacter spp. 11 2,84 1 1,72 12 2,7 Klebsiella spp. 9 2,32 5 8,62 14 3,15
Pantoea agglomerans 5 1,29 2 3,45 7 1,57 Serratia spp. 2 0,52 0 - 2 0,45
Proteus mirabilis 1 0,26 0 - 1 0,22 Total 42 10,85 19 32,76 61 13,71
Table 2. Percentage of Enterobacteriaceae strains isolated from canaries (Serinus canaria)
resistant to antimicrobials.
E. coli Enterobacter sp. Klebsiella sp.
Pantoea
agglomerans Serratia sp.
Proteus
mirabilis Total
n % n % n % n % n % n % n % AMP 4 (25) 16 8 (12) 66,7 14 (14) 100 5 (7) 71,4 2 (2) 100 0 (1) 0 33 (61) 54,1 NAL 3 (25) 12 1 (12) 8,3 2 (14) 14,3 0 (7) 0 0 (2) 0 1 (1) 100 7 (61) 11,5 CTF 0 (25) 0 0 (12) 0 1 (14) 7,1 0 (7) 0 0 (2) 0 0 (1) 0 1 (61) 1,6 SUT 11 (25) 44 1 (12) 8,3 3 (14) 21,4 3 (7) 42,9 0 (2) 0 0 (1) 0 18 (61) 29,5 STR 10 (25) 40 4 (12) 3,3 5 (14) 35,7 1 (7) 14,3 0 (2) 0 1 (1) 100 21 (61) 34,4 NEO 4 (25) 16 1 (12) 8,3 3 (14) 21,4 3 (7) 42,9 0 (2) 0 1 (1) 100 12 (61) 19,7 SUL 16 (25) 64 4 (12) 3,3 8 (14) 57,1 4 (7) 57,1 1 (2) 50 1 (1) 100 34 (61) 55,7 GEN 1 (25) 4 0 (12) 0 1 (14) 7,1 0 (7) 0 0 (2) 0 0 (1) 0 2 (61) 3,3 CLO 9 (25) 36 0 (12) 0 0 (14) 0 0 (7) 0 0 (2) 0 1 (1) 100 10 (61) 16,4 ENO 1 (25) 4 0 (12) 0 2 (14) 14,3 1 (7) 14,3 0 (2) 0 0 (1) 0 4 (61) 6,6 TET 12 (25) 48 2 (12) 16,7 6 (14) 2,9 3 (7) 42,9 0 (2) 0 1 (1) 100 24 (61) 39,3 POL 1 (25) 4 1 (12) 8,3 0 (14) 0 0 (7) 0 0 (2) 0 1 (1)* 100* 2 (61) 3,3
AMP: ampicillin; NAL: Nalidixic acid; CTF: ceftiofur; SUT: Sulfazotrim (Sulfamethoxazole+trimethoprim); STR:
streptomycin; NEO: neomycin; SUL: sulfonamides; GEN: gentamycin; CLO: chloramphenicol; ENO: enrofloxacin; TET:
tetracycline; POL: polymyxin B. *Proteus spp. are naturally resistant to polymyxin B.
42
Table 3. Multidrug-resistant (MDR) enterobacteria isolated from canaries (Serinus canaria).
No. of antibiotics No. of resistant strains (%) At least 1 53 (83,88)
>1 34 (55,74) >2 30 (49,18) >3 23 (37,70) >4 14 (22,95) >5 9 (14,75) >6 4 (6,56) >7 1 (1,64) >8 0 (0)
43
7 CONCLUSÕES
Os canários belgas (Serinus canaria) pesquisados em Fortaleza, Ceará, albergam
membros da família Enterobacteriaceae, alguns potencialmente zoonóticos e a mais frequente
nestas aves é a Escherichia coli.
As enterobactérias isoladas de canários apresentam alto índice de resistência,
apresentando inclusive cepas resistentes a múltiplas drogas, o que denota um possível risco
para a saúde de proprietários e demais pessoas envolvidas na criação destas aves.
44
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50
APÊNDICE
51
APÊNDICE
FIGURA 1 – Carcaças congeladas de canários belgas (Serinus canaria) de um criadouro a
serem submetidas à necropsia para coleta de amostras.
FIGURA 2 – Necropsia de um canário belga (Serinus canaria) para coleta de amostra de
fígado e intestinos. Imagens antes da abertura da cavidade abdominal (A) e após a coleta de
amostra do fígado e do intestino (B).
A B
52
FIGURA 3 – (A) Procedimento de coleta de swab cloacal de canário belga (Serinus canaria).
(B) Swab utilizado para coleta de amostra cloacal de pássaros pequenos.
A
B
53
ANEXO
54
ANEXO
Comprovante de submissão do artigo ao periódico Avian Pathology.
