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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
FACULDADE DE FARMÁCIA
ANNA CAROLINA SODRÉ EVANGELISTA
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk: UM NOVO POTENCIAL TERAPÊUTICO?
Juiz de Fora
2017
ANNA CAROLINA SODRÉ EVANGELISTA
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk: UM NOVO POTENCIAL TERAPÊUTICO?
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Farmácia - Universidade
Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial
para obtenção do título de Farmacêutica.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Luiz Fabri
Juiz de Fora
2017
Ficha catalográfica elaborada através do programa de geração automática da
Biblioteca Universitária da UFJF, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Evangelista, Anna Carolina Sodré.
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk: UM NOVO POTENCIAL
TERAPÊUTICO? / Anna Carolina Sodré Evangelista. -- 2017.
75 f.
Orientador: Rodrigo Luiz Fabri
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) - Universidade Federal
de Juiz de Fora, Faculdade de Farmácia e Bioquímica, 2017.
1. Pouteria caimito. 2. Antioxidante. 3. Anti-inflamatório. 4.
Antimicrobiano. 5. Fotoproteção. I. Fabri, Rodrigo Luiz, orient. II.
Título.
ANNA CAROLINA SODRÉ EVANGELISTA
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk: UM NOVO POTENCIAL TERAPÊUTICO?
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Farmácia - Universidade
Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial
para obtenção do título de Farmacêutica.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Luiz Fabri
Aprovada em _______ de _________________ de 2017
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Rodrigo Luiz Fabri - Orientador
Universidade Federal de Juiz de Fora
____________________________________ Jucélia Barbosa da Silva- Mestre
Universidade Federal de Juiz de Fora
____________________________________ Ari Sérgio Lemos - Farmacêutico
Universidade Federal de Juiz de Fora
Juiz de Fora
2017
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelas bênçãos sem fins e pelas alegrias que Ele
proporciona à minha vida!
À minha mãe Elizângela por ser sempre meu porto seguro, por me incentivar a
estudar e correr atrás dos meus sonhos!
Aos meus irmãos (os mais “maneiros” que alguém poderia ter) e à toda minha
família, amo vocês! E, claro, às minhas amigas-irmãs Vívian, Jéssica e BG!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Luiz Fabri pelos seus ensinamentos e
paciência (extrema) comigo. Obrigada por ser um exemplo de profissional pra mim!
Aos colegas do laboratório e aos colegas do grupo de pesquisa: Paula, Maria Clara,
Lívia, Lara, Laura, Isabela e Ari por tornarem o trabalho em equipe mais divertido!
Aos professores e funcionários do curso de Farmácia, em especial professores
Guilherme, Fernanda, Rozângela e Marcelo e ao Edimar, todos vocês me inspiram e
me fazem ter a certeza da carreira que eu escolhi!
Aos meus amigos da Metalurgia 2009-2011(∞), conhecida como a turma mais
gostosa de todas, obrigada por sempre estarem comigo! Em especial agradeço à
Letícia, Ágata, Tamires, Gabi, GBDalton e Luan, vocês são sensacionais!
Aos “Ecoamigos” e amigos que conquistei no Movimento Empresa Jr. por me
fazerem acreditar que a mudança do nosso país é possível e só depende de nós!
Em especial, gostaria de agradecer às Ecocobras Natasha, Célio, Igor e Ju, e ao
Higor, Nina, Luiza, Micaele, Natalia, Fernanda, Philipe, Augusto, Túlio, Iza e
Jackson, por serem grandes amigos e ótimos profissionais!
À Associação Atlética da Faculdade de Farmácia e aos snakes Lucas, Suélen,
Paula, Duda e Nath por terem realizado o sonho de fundar a nossa associação!
Aos Ligantes da LAFF por acreditarem em uma formação mais humana e que o
Farmacêutico, como profissional de saúde, deve sempre prezar pelo bem-estar dos
pacientes!
Ao DAFF e ao DCE onde consolidei meus valores e princípios éticos!
Ao Grupo Cimed, onde realizei meu estágio e me descobri ainda mais apaixonada
por essa profissão! Em especial, gostaria de agradecer aos colaboradores do setor
de Desenvolvimento Farmacotécnico e à Leticia, Bianca, Cris, Dênis e todos os
estagiários que compartilharam essa experiência comigo.
E, por fim, à Turma Prof. Lúcio Guedes Barra e à Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), meu eterno obrigada!
“A vida é um constante recomeço.
Não se dê por derrotado e siga adiante.
As pedras que hoje atrapalham a sua caminhada
Amanhã enfeitarão a sua estrada” (Autor desconhecido)
RESUMO
A Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk., conhecida como abiu, é uma árvore
frutífera da família Sapotaceae e seus frutos são utilizados na medicina popular para
aliviar tosses, bronquites e outras doenças pulmonares. Nesse contexto, o objetivo
deste estudo foi determinar o conteúdo de polifenois e flavonoides no extrato
etanólico das folhas de P. caimito, bem como avaliar a viabilidade celular, o
doseamento de óxido nítrico (NO), o potencial antioxidante, antimicrobiano e
fotoprotetor in vitro do extrato. A atividade antioxidante foi avaliada pelos métodos de
sequestro de radicais 2,2-difenil- 1-picrilidrazila (DPPH), poder de redução, redução
do complexo de fosfomolibdênio e determinação da peroxidação lipídica pela
quantificação de malonaldeído (teste de TBA). O conteúdo de polifenois foi
determinado pelo método de Folin-Denis e o conteúdo de flavonoides pelo ensaio
reativo com cloreto de alumínio. As atividades citotóxica e anti-inflamatória foram
avaliadas pelos ensaios de viabilidade celular e dosagem dos níveis de NO,
respectivamente. A atividade fotoprotetora in vitro foi avaliada pelo método de
Mansur e a atividade antimicrobiana determinada pela Concentração Inibitória
Mínima (CIM), pelo método de microdiluições. A quantidade de flavonoides foi igual
a 1,66 μg/mL equivalente à rutina e o conteúdo de fenóis totais igual a 100,45 μg/mL
equivalente ao ácido tânico. O CI50 determinado pelo método de DPPH foi de
10,0741 µg/mL para o extrato e o CE50, determinado pelo método de poder de
redução, foi de 28,462 µg/mL. A atividade antioxidante relativa da amostra pelo
método de redução do complexo fosfomolibdênio foi de 24,453 ± 0,475% para o
ácido ascórbico e 79,780 ± 1,551% para a quercetina, ou seja, a amostra apresentou
atividade antioxidante relativa significativa quando comparada à quercetina. No teste
de TBA a concentração de 0,3 mg/mL da amostra também apresentou resultado
satisfatório quando comparada à mesma concentração de ácido ascórbico. No
estudo de viabilidade celular o extrato não apresentou toxidez significativa nas
concentrações testadas. Com relação ao doseamento de NO, o extrato apresentou
redução significativa na produção de NO. No estudo fotoprotetor a amostra
apresentou fator de proteção solar inferior quando comparada aos filtros solares
empregados e isso ocorreu pois os filtros se encontram na forma pura e, como
avaliado na varredura, a amostra do extrato apresentou absorção máxima no
comprimento de onda de 230 nm. No que tange à avaliação da atividade
antimicrobiana o extrato apresentou atividade significativa para inibir o crescimento
de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan (ATCC® 4352™)
e Staphylococcus epidermidis (Winslow and Winslow) Evans (ATCC® 14990™).
Pode-se concluir então que a P. caimito apresentou atividades antioxidante, anti-
inflamatória, fotoprotetora e antimicrobiana significativas e que mais estudos acerca
dessas atividades devem ser realizados.
Palavras-chave: Pouteria caimito. Antioxidante. Anti-inflamatório. Antimicrobiano.
Fotoproteção.
ABSTRACT
The Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. is a fruit tree of the Sapotaceae
family and its fruits are sent in folk medicine to relieve coughs, bronchitis and other
lung diseases. In this context, the objective of this study was to determine the content
of polyphenols and flavonoids in the ethanolic leaves of P. caimito, as well as to
evaluate cell viability, nitric oxide dosage, antioxidant, antimicrobial and
photoprotective potential in vitro. The antioxidant activity was evaluated by the
methods of radical scavenging DPPH, reduction power, reduction of the
phosphomolybdenum complex and determination of lipid peroxidation by the
quantification of malonaldehyde (TBA test). The polyphenylene content was
determined by the Folin-Denis method and the flavonoid content by the aluminum
chloride reactive assay. Cytotoxic and anti-inflammatory activities were evaluated by
cellular viability assays and cellular nitric oxide (NO) levels, respectively. In vitro
photoprotective activity was assessed by the activity method and an antimicrobial
activity determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC). A quantity of
flavonoids was equal to 1.66 μg/mL equivalent to rutin and the total phenol content
equal to 100.45 μg/mL equivalent to tannic acid. The IC50 determined by the DPPH
method was 10.0741 μg/mL for the extract. The values found in the evaluation of the
reduction power lower than the EC50 found for the extract 28.462 μg/mL. The
antioxidant activity relative to the sample of the phosphomolybdenum complex
reduction method was 24.453 ± 0.475% for ascorbic acid and 79.780 ± 1.551% for a
quercetin, that is, a sample of a relative antioxidant activity when compared to
quercetin. In the TBA test a concentration of 0.3 mg/mL of the sample also showed a
good result when compared to the same concentration of ascorbic acid. In the cell
viability assay the extract has showed no significant toxicity at the concentrations
tested. In the nitric oxide study, although the extract reduced the production of this
radical, the reduction can be considered significant. In the photoprotector study the
sample did not present significant SPF when compared to the solar filters used and
this occurs because the filters are in the pure form and as evaluated in the scan, the
extract sample presents maximum absorption in wavelength of 230 nm. Nine
antimicrobial activity testing, extract had inhibition for Klebsiella pneumoniae subsp.
pneumoniae (Schroeter) Trevisan (ATCC® 4352™) and Staphylococcus epidermidis
(Winslow and Winslow) Evans (ATCC® 14990™). It can be concluded that P. caimito
presented significant antioxidant, antiinflamatory, photoprotector and antimicrobial
activities and that more studies on these activities should be performed.
Keywords: Pouteria caimito. Antioxidant. Anti-inflammatory. Antimicrobial.
Photoprotection.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Substâncias naturais produzidas pelo metabolismo primário e
secundário................................................................................................................. 22
Figura 2 - A espécie Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. .................................... 24
Figura 3 - Folhas e frutos da Pouteria caimito (Ruiz & Pav.)
Radlk......................................................................................................................... 24
Figura 4 - Algumas substâncias antioxidantes.......................................................... 28
Figura 5 - Estabilização do radical DPPH• pelo deslocamento do elétron
desemparelhado........................................................................................................ 29
Figura 6 - Mecanismos de reação entre o radical DPPH• e um antioxidante através
da transferência de um átomo de hidrogênio............................................................ 30
Figura 7 - Visão geral do processo inflamatório, com as principais células e
mediadores envolvidos.............................................................................................. 31
Figura 8 - Resposta e ativação celulares do sistema imune
adaptativo.................................................................................................................. 34
Figura 9 - Componentes ultravioleta (UV) no espectro eletromagnético................... 36
Figura 10- Esquema do método de DPPH................................................................ 41
Figura 11- Esquema do processo de ativação e indução do crescimento
bacteriano.................................................................................................................. 49
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Principais Espécies Reativas de Oxigênio e suas características.......... 26
Quadro 2 - Principais mediadores derivados das células e suas funções................ 32
Quadro 3 - Características dos processos inflamatórios agudo e crônico................ 35
Quadro 4 - Características e doenças relacionadas às espécies de bactérias
utilizadas no estudo................................................................................................... 38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Preparo das amostras em diferentes concentrações, adicionando solução
estoque das amostras, água destilada, tampão fosfato e ferrocianeto de potássio
1%............................................................................................................................. 42
Tabela 2 - Relação entre a concentração e a porcentagem de inibição das amostras
avaliadas................................................................................................................... 50
Tabela 3 - Atividade antioxidante dos extratos brutos de folhas de Pouteria spp..... 53
Tabela 4 - Resultado das atividades antioxidantes dos frutos avaliadas pelo método
de poder de redução................................................................................................. 56
Tabela 5 - Concentração de MDA referentes às concentrações avaliadas nos dias 0,
2 e 4........................................................................................................................... 58
Tabela 6 - Relação entre a concentração e o FPS das amostras analisadas.......... 62
Tabela 7 - Concentração Inibitória Mínima................................................................ 64
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Determinação do CI50 para o extrato das folhas de Pouteria caimito
................................................................................................................................... 51
Gráfico 2 - Determinação do CI50 para o ácido ascórbico........................................ 52
Gráfico 3 - Determinação do CI50 para a quercetina................................................ 52
Gráfico 4 - Determinação do CE50 para o extrato das folhas de Pouteria caimito
.................................................................................................................................. 54
Gráfico 5 - Determinação do CE50 para a quercetina ............................................. 55
Gráfico 6 - Determinação do CE50 para o ácido ascórbico ..................................... 55
Gráfico 7 - Curva padrão de Ácido Ascórbico .......................................................... 56
Gráfico 8 - Curva padrão de Quercetina .................................................................. 57
Gráfico 9 - Estudo comparativo correlacionando concentração das amostras versus
concentração de malonaldeído formado, nos dias 0, 2 e 4....................................... 59
Gráfico 10 - Viabilidade celular versus concentração do extrato.............................. 61
Gráfico 11 - Dosagem de óxido nítrico versus concentração do extrato................... 62
Gráfico 12 - Correlação entre o FPS e a concentração da amostra do extrato
etanólico das folhas de P. caimito ............................................................................ 63
Gráfico 13- Correlação entre o FPS e a concentração dos filtros ............................ 63
Gráfico 14 - Avaliação da absorção da radiação nos comprimentos de onda de 200 a
400nm do extrato etanólico de P. caimito na concentração de 0,2 mg/mL
.................................................................................................................................. 64
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Absorbância do Controle
Am Absorbância da Amostra
ADPPH Absorbância do DPPH em metanol
Aamostra Absorbância da amostra em metanol
AAR% Atividade Antioxidante Relativa
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
BHT 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol
CI50 CI50 Concentração Inibitória Média
CE50 Concentração da amostra para atingir 50% de efetividade
CO2 Dióxido de carbono
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DPPH• Radical 2,2-difenil- 1-picrilidrazila
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
ERNs Espécies Reativas de Nitrogênio
FeCl3 Cloreto Férrico
FPS Fator de Proteção Solar
IL Interleucina
K3Fe(CN)6 Ferrocianeto de Potássio
KOH Hidróxido de Potássio
LPS Lipopolissacarídeo derivado de E. coli
MDA Malonaldeído
MEC Matriz extracelular
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium
NADH Dinucleótido de nicotinamida e adenina
NAD+ Dinucleótido de nicotinamida e adenina na sua forma reduzida
NaNO2 Nitrito de sódio
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NO2- Nitrito
Nm Nanômetro
PAMPs Padrões moleculares associados aos patógenos
PBS Tampão fosfato-salino
TBA Ácido 2-tiobarbitúrico
TNF-α Fator α de necrose tumoral
UV Ultravioleta
UVA Raios ultravioleta A
UVB Raios ultravioleta B
UVC Raios ultravioleta C
%I Porcentagem de Inibição
O2-. Radical superóxido
HO2. Radical hidroperoxila
OH. Radical hidroxila
H2O2 Peróxido de hidrogênio
1O2 Oxigênio singlet
H+ Próton
H2Od Água destilada
qsp Quantidade suficiente para
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
2 REVISÃO 20
2.1 PRODUTOS NATURAIS 20
2.1.1 Metabólitos secundários 21
2.1.2 Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk 23
2.2 RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO 25
2.2.1 Mecanismos de defesa antioxidante 27
2.2.2 Métodos de Avaliação da Atividade Antioxidante 28
2.3 A INFLAMAÇÃO 31
2.3.1 A relação entre o processo inflamatório e o câncer 35
2.4 RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA E CARCINOMA DE PELE 36
2.4.1 Proteção solar e métodos de determinação do Fator de Proteção
Solar
37
2.5 RESISTÊNCIA BACTERIANA E O USO DE ANTIMICROBIANOS 37
3 OBJETIVOS 35
3.1 OBJETIVO GERAL 39
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 39
4 MATERIAL E MÉTODOS 39
4.1 COLETA DA AMOSTRA VEGETAL E PREPARO DOS EXTRATOS 39
4.2 MÉTODOS ANTIOXIDANTES 40
4.2.1 Método do sequestro do radical DPPH 40
4.2.2 Método do poder de redução 42
4.2.3 Redução do complexo fosfomolibdênio 43
4.2.4 Determinação da peroxidação lipídica pela quantificação de
malonaldeído
44
4.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE POLIFENÓIS E FLAVONOIDES 45
4.3.1 Determinação do teor de polifenóis pelo método de Folin-Denis 45
4.3.2 Determinação do teor de flavonóides 46
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA 46
4.4.1 Linhagem celular 46
4.4.2 Viabilidade celular 47
4.4.3 Dosagem de óxido nítrico 47
4.5 DETERMINAÇÃO DO FPS IN VITRO PELO MÉTODO DE MANSUR
(1986)
48
4.6 MÉTODO ANTIMICROBIANO 49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 50
5.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 50
5.1.1 Método de sequestro de radical livre: redução do radical 2,2-
difenil-1-picrilidrazila (DPPH•)
50
5.1.2 Método do poder de redução 54
5.1.3 Redução do complexo fosfomolibdênio 56
5.1.4 Determinação da peroxidação lipídica pela quantificação de
malonaldeído
58
5.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE POLIFENÓIS E FLAVONOIDES 60
5.3 ESTUDO DA VIABILIDADE CELULAR E DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA
60
5.3.1 Viabilidade celular 60
5.3.2 Atividade anti-inflamatória pelo método de dosagem de óxido
nítrico
61
5.4 DETERMINAÇÃO DO FPS IN VITRO PELO MÉTODO DE MANSUR
(1986)
62
5.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA 64
6 CONCLUSÃO 65
REFERÊNCIAS 66
18
1 INTRODUÇÃO
O uso popular de plantas medicinais como forma de tratamento para algumas
doenças é tão antigo quanto à procura de outras ferramentas para o homem, o que
remonta, de certa forma, à própria origem das grandes civilizações (HIGBY, 2014;
BADKE et al., 2011; DANTAS; GUIMARÃES, 2006). Essa cultura apresenta um
grande impacto socioeconômico, pois além de implicar significativamente na
melhora da qualidade de vida das comunidades de baixa renda, em geral essas
plantas apresentam alta disponibilidade, riscos mínimos de efeitos adversos e baixo
custo, quando comparadas aos medicamentos alopáticos (RODRIGUES;
CARVALHO, 2001).
Um exemplo de aplicação das plantas medicinais é na prevenção de
processos degenerativos causados pelo estresse oxidativo. As reações de oxidação
e redução nos organismos constituem etapas essenciais ao metabolismo e
deficiências ou alterações neste ciclo de produção resultam em substâncias
altamente reativas que poderão provocar processos fisiopatológicos como
envelhecimento, câncer, aterosclerose, inflamação, entre outras (MATSUBARA;
FERREIRA, 1997). Alguns estudos demonstram que dietas ricas em substâncias
antioxidantes podem produzir ação protetora contra os processos oxidativos e
plantas como a Copaifera reticulata Ducke., Ginkgo biloba L., Morus indica L., Vitis
vinifera L. e Camellia sinensis(L.) O. Kuntze já são conhecidas por apresentaram
atividade antioxidantes confirmadas cientificamente (BRENNA; PAGLIARINI, 2001;
DAMASCENO; DALLAQUA, 2011).
Intimamente associadas ao estresse oxidativo, encontram-se as doenças
inflamatórias e o câncer. O processo inflamatório é uma resposta de defesa do
organismo contra injúrias decorrentes de infecções ou traumas e, em geral, a
resposta inflamatória tem como resultado o reestabelecimento da integridade
orgânica (TRACEY, 2002). Alguns estudos mostram que a inflamação é um
componente crítico na progressão de tumores e que diversos tipos de câncer podem
se originar a partir de irritações crônicas, sítios de infecção ou inflamação, logo a
participação das células inflamatórias se faz presente no processo neoplásico
(COUSSENS; WERB, 2002). Com o aumento da população mundial e o
envelhecimento populacional, a incidência dessas doenças se torna cada vez maior
19
e a necessidade de tratamentos alternativos se faz mais presente, sendo
indispensáveis estudos que comprovem a eficácia e segurança dos tratamentos a
partir das plantas medicinais (LOPES, 2008).
Os carcinomas de pele, por exemplo, tem se tornado mais frequentes e dados
da Organização Mundial de saúde apontam que, para cada três novos casos de
câncer, um é localizado na pele (WHO, 2009). Essa incidência crescente se
relaciona principalmente com a ação da luz ultravioleta solar, agravada
principalmente pela redução dos níveis do ozônio atmosférico, pelo envelhecimento
populacional, mudanças no estilo de vida e aos fatores fenotípicos e, em
consequência, cresce cada vez mais a necessidade do uso de protetores solares
(SGARBI; CARMO; ROSA, 2007; POLONINI; RAPOSO; BRANDÃO, 2011).
Outro grave problema de saúde pública é a resistência bacteriana frente aos
antibióticos atuais empregados no tratamento de infecções e o uso inadequado
destes medicamentos nas últimas décadas fez com que as bactérias
desenvolvessem defesas relativas aos agentes antibacterianos. Por outro lado,
assim como a resistência bacteriana já é reconhecida, surgem novos desafios para o
seu tratamento e o uso das plantas medicinais como forma de tratamento alternativo
faz-se necessário (SILVEIRA et al., 2006). Os vegetais, através do metabolismo
secundário, produzem substâncias com ação antibiótica, utilizadas como mecanismo
de defesa contra microrganismos, insetos e herbívoros (GOTLIEB, 1981), porém a
maioria das plantas empregadas no uso popular para esse fim ainda não tiveram
suas atividades terapêuticas comprovadas (GONÇALVES; ALVES FILHO;
MENEZES, 2005).
A Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk, também conhecida como abiu, é uma
árvore frutífera da família Sapotaceae, nativa da Amazônia Central e da Mata
Atlântica costeira do Brasil. Seus frutos são de grande aceitação popular e a polpa
mucilaginosa utilizada para aliviar tosses, bronquites e outras doenças pulmonares
(CALZAVARA, 1970; DONADIO; MARTINS; VALENTE, 1992), porém existem
poucos estudos sobre essa espécie. Frente às patologias aqui apresentadas, este
trabalho buscou avaliar o extrato das folhas de Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk,
com a finalidade de buscarmos novas possibilidades terapêuticas no tratamento de
20
processos degenerativos causados pelo estresse oxidativo, na inflamação,
fotoproteção e no tratamento de infecções.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 PRODUTOS NATURAIS
Iniciou-se como uma arte, atualmente é tratada como ciência, a prática da
farmácia, cuja sua essência é a fabricação de um dos bens mais importantes para o
homem, o medicamento, é tão antiga quanto à procura da humanidade por outras
ferramentas, como a fabricação de facas e machados. Uma mistura de mito e
ciência, de cultura popular e de experimentações validadas, da antiguidade à era
contemporânea as drogas tem participação direta no comércio, na exploração, nas
descobertas científicas e, principalmente, influenciam diretamente na vida de
milhões de pessoas (HIGBY, 2014).
Relatos de escavações de colonizações mais antigas, como Shanidar (30.000
a.C.), mostram que os povos pré-históricos colhiam plantas com fins medicinais. No
Ocidente o primeiro grande estudo sobre plantas e remédios preparados a partir
destas foi realizado por Teofrasto (cerca de 370-285 a.C.) e, anos depois,
Dioscórides (cerca de 65 d.C.) reuniu todos estes conceitos e publicou um resumo
conhecido como Matéria Médica, tornando-se referência nos anos seguintes. Já em
1546 foi lançada a obra Dispensatorium, escrita por Valerius Cordus, que se
apresentava como um livro de fórmulas de drogas oriundas de plantas (HIGBY,
2014).
De modo geral, a utilização das plantas com objetivos medicinais é retratada
em todas as eras da humanidade e, atualmente, representam um recurso mais
acessível em relação aos medicamentos alopáticos, onde cerca de 80% da
população faz uso de alguma erva medicinal (CARNEIRO et al., 2014; OMS, 1979).
Além dos benefícios para a ciência e a saúde dos pacientes, os
medicamentos fitoterápicos, medicamentos obtidos exclusivamente de matérias-
primas vegetais, possuem grande impacto na economia. Globalmente, o setor
movimenta US$ 21,7 bilhões por ano e, só no Brasil, estima-se que o mercado
21
movimente cerca de US$ 160 milhões por ano (CARVALHO et al., 2008). Apesar de
causar um impacto significativo, este fica muito aquém do real potencial do país,
onde contamos com cerca de 55 mil espécies catalogadas, de um total estimado
entre 350 e 500 mil espécies de plantas com propriedades medicinais (FONSECA,
2012).
Um estudo realizado por Carneiro e colaboradores (2014) mostrou que entre
os anos de 1995 e 2011, 265 artigos brasileiros foram publicados com estudos que
envolviam plantas medicinais, sendo pesquisado principalmente tratamentos
terapêuticos e preventivos para o câncer, doenças do sistema nervoso central
(Alzheimer e Parkinson), doenças infecciosas e/ou inflamatórias ou ainda com
propriedades antibacterianas, antivirais, antiasmáticos, antipsoríase,
antihipertensivos e antidiábeticas, além de ter ressaltado que a maioria das plantas
utilizadas hoje não possuem dados de segurança, podendo ter ação genotóxica e
embriotóxica.
Desta forma, nota-se a importância de buscarmos não apenas comprovar
possíveis atividades farmacológicas das plantas, como também assegurar o seu
uso, reduzindo os riscos que estas podem trazer aos pacientes (CARNEIRO et al.,
2014).
2.1.1 Metabólitos secundários
O metabolismo é definido como o conjunto de transformações das moléculas
orgânicas que ocorrem nas células, sejam elas reações de síntese (anabolismo) e
reações de degradação (catabolismo). Esses processos são vitais para os
organismos vivos, pois envolvem a nutrição (inclusão de elementos essenciais),
respiração (oxidação desses elementos para produção de energia) e síntese de
moléculas estruturais, utilizando a energia produzida. Estas reações ocorrem de
forma direcionada, pois cada organismo possui enzimas específicas, definindo assim
as rotas metabólicas (MARZZOCO; TORRES, 2007; CHAMPE et al., 2008).
Nos vegetais, além do metabolismo primário, responsável pela produção de
celulose, proteínas, lipídeos, carboidratos e outras substâncias relacionadas às
funções vitais, temos o metabolismo secundário, específico para cada organismo,
que contribui com os aromas, as cores e a resistência aos patógenos e predadores
22
(BRAZ FILHO, 2009; PEREIRA e CARDOSO, 2012). O metaboloma é composto
pela substâncias formadas pelos metabolismos primário e secundário. A Figura 1
exemplifica quais substâncias são formadas e as principais biorreações envolvidas.
Figura 1: Substâncias naturais produzidas pelo metabolismo primário e secundário.
Fonte: BRAZ FILHO, 2009, com modificações.
Os metabólitos secundários, em geral, são estruturas complexas, de baixo
peso molecular, apresentam-se em baixas concentrações e possuem atividades
biológicas marcantes, fato este que desperta o grande interesse pela atividade
farmacológica que possuem (BERG; LUBERT, 2008). Além de específicos para
cada espécie, a produção dos metabólicos secundários depende da idade e do
estágio de desenvolvimento da planta e é influenciada também por fatores
ambientais, como a sazonalidade, o ritmo circadiano, temperatura, disponibilidade
hídrica e de nutrientes, radiação ultravioleta, altitude, poluição atmosférica e indução
por estímulos mecânicos ou patógenos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
23
Os compostos fenólicos são substâncias que possuem anel aromático com
um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais. São
encontrados principalmente em frutas cítricas, como limão, laranja e tangerina, mas
outras frutas e vegetais também são ricos desses metabólitos, como mamão,
ameixa, pimenta verde, cebola e tomate. Muitos estudos comprovam a atividade
antioxidante dos compostos fenólicos e estes se incluem na categoria de inibidores
dos radicais livres, sendo eficientes na prevenção da oxidação. Devido à diversidade
estrutural dos compostos fenólicos, estes podem ser divididos nas seguintes
classes: fenólicos simples, benzoquinonas, ácidos hidroxibenzóicos, acetofenol,
ácidos fenilacéticos ácidos hidroxicinâmicos, fenilpropanóides, nafitoquinonas,
xantonas, estilbenos, anttraquinonas, flavonóides, lignanas, neolignanas, ligninas e
taninos condensados (HARBORNE; BAXTER; MOSS, 1999; SHAHIDI; JANITHA;
WANASUNDARA, 1992; PIMENTEL; FRANCKI; GOLLÜCKE, 2005; LEE et al.,
2005).
Os flavonoides podem ser subdivididos em antocianinas, flavonóis, flavonas,
isoflavonas, flavanonas, chalconas, flavananol e flavan-3-ol. São compostos
aromáticos contendo 15 átomos de carbono, sendo dois anéis aromáticos e um
heterociclo oxigenado, formando um sistema C6-C3-C6. Mais de 8.000 substâncias
pertencentes a esse grupo já foram identificadas e muitas estão associadas com
atividades antioxidantes, antiinflamatória e antitumoral (ARAÚJO, 2008; FILHO;
SILVA; BOVERIS, 2001).
2.1.2 Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk
A Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk, representada nas Figuras 2 e 3,
também conhecida como abieiro, abiu, abiurana, abiurana-acariquara, caimito
amarelo, abiorama, abio ou guapeva ou cabo-de-machado é uma árvore frutífera da
família Sapotaceae, nativa da Amazônia Central e da Mata Atlântica costeira do
Brasil. É uma árvore de 5 a 6 m de altura, com folhas pecioladas, glabras e os frutos
possuem forma ovóide ou esférica com casca amarela e lisa, às vezes amarela com
estrias verdes, com massa entre 300 e 1.000 g, polpa translúcida, branca ou
amarela, mucilaginosa, doce ou insípida, contendo de 1 a 5 sementes grandes e
lisas de cor preta e com grande aceitação popular, utilizado em sua maioria na forma
in natura (CALZAVARA, 1970; DONADIO, 1992).
24
Figura 2: A espécie Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk.
Fonte: SILVA e SOUZA, 1996.
Figura 3: Folhas e frutos da Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk.
Fonte: CARVALHO; NASCIMENTO; MÜLLER, 2010.
25
A casca do fruto exsuda um látex viscoso, que coagula em contato com o ar,
e esse mesmo látex, presente também nas folhas, galhos e tronco, pode ser
utilizado para produção de chicletes e remédios caseiros. Na medicina popular a
polpa mucilaginosa dos frutos é ingerida para aliviar tosses, bronquites e outras
doenças pulmonares, além de ser utilizada na produção de geleias e refrescos. A
arvore também é muito cultivada em projetos de reflorestamento, visando fornecer
alimento para a fauna (MARTINS et al., 2002).
Existem estudos que mostram a utilização da P. caimito como antimicrobiano,
antimalárico (PÉREZ, 2002), antioxidante (CONDESSA, 2011), com relativa
atividade fotoprotetora contra raios UVA e UVB (SILVA; SIMEONI; SILVEIRA, 2009).
Também foi relatada possível atividade alelopática do extrato hexânico das folhas
sobre a germinação e crescimento de Lactuca sativa l. e Lycopersicum esculentum
Mill (CONDESSA et al., 2013).
Um estudo de Souza e colaboradores (2011) com extratos aquoso, hexânico
e etanólico das folhas de P. caimito demonstrou que o extrato aquoso apresentou
forte atividade inibidora de α-amilase e α-glucosidase, sugerindo também uma
ferramenta potencial para o desenvolvimento de novas estratégias no tratamento de
diabetes.
O estudo fitoquímico do extrato benzênico dos frutos mostrou a presença de
α-amirina, lupeol, eritrodiol e dammarenediol, já o extrato das cascas apresentou
taraxerol e seu acetato, taraxenona e esteróide (PELLICCIARI et al., 1972). A
análise do óleo obtido á partir dos frutos da planta demonstrou presença de ácido
palmítico, acetato de hexadecilo e α-copaína (MAIA; ANDRADE; ZOGHBI, 2003).
2.2 RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO
Acredita-se atualmente que o envelhecimento celular está intimamente
relacionado à exposição dos organismos vivos frente a diferentes fontes oxidativas e
inúmeras são as pesquisas relacionadas ao estudo dos radicais livres e seu papel
no envelhecimento e em outros processos fisiopatológicos, como o câncer, a
inflamação, aterosclerose, entre outros (MATTOS, 2011; MATSUBARA; FERREIRA,
1997).
26
As reações de oxidação e redução nos organismos constituem etapas
essenciais ao metabolismo e consequentemente à vida. Elas consistem em
transferências de elétrons de um átomo a outro. Deficiências ou alterações neste
ciclo de produção resultam em substâncias altamente reativas, denominadas de
radicais livres (MATSUBARA; FERREIRA, 1997). A produção dos radicais livres
pode ser de origem endógena ou exógena, com a influência de fatores ambientais.
O oxigênio é a principal fonte para a formação desses radicais no organismo
(Quadro 1), denominados espécies reativas de oxigênio (EROs), porém ele também
participa de processos fundamentais, como a geração de energia (SASTRE et al.,
2003).
Quadro 1: Principais Espécies Reativas de Oxigênio e suas características.
ESPÉCIES
REATIVAS DE
OXIGÊNIO
CARACTERÍSITCAS
Radical superóxido
(O2-.)
Formado após a primeira redução do gás oxigênio, durante a ativação
máxima de neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos. É considerado
pouco reativo, porém alguns estudos demonstraram lesões secundárias
associadas a sistemas geradores de superóxido.
Radical hidroperoxila
(HO2.)
Forma protonada do radical superóxido, porém é considerado mais reativo,
facilidade em iniciar a destruição de membranas biológicas.
Radical hidroxila (OH.) Considerada a ERO mais reativa. Combina rapidamente com metais e
outros radicais. Pode levar a inativação ou mutação do DNA, inativação de
proteínas e lipoperoxidação.
Peróxido de
hidrogênio (H2O2)
Não é um radical livre, porém participa da reação que produz o radical
hidroxila. É capaz de atravessar camadas lipídicas, pode reagir com a
membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao Fe++.
Oxigênio singlet (1O2) O estado excitado singlete do oxigênio não é um radical, visto não ter os
elétrons desemparelhados, mas reage com uma grande variedade de
compostos biológicos, como lipídeos de membrana.
Fonte: GUTTERIDGE, HALLIWELL, 1999; SCOTT et al., 1991.
Além das espécies reativas de oxigênios, temos durante o metabolismo a
produção das Espécies Reativas de Nitrogênio (ERNs). Dentre elas, podemos citar o
27
óxido nítrico, sintetizado pela óxido nítrico sintase (NOS), que converte o aminoácido
L-arginina a NO• + L-citrulina, e que atua em vários processos biológicos, como
relaxamento muscular, resposta imune, neurotransmissão e regulação da pressão
arterial (SASTRE et al., 2003).
Em situações fisiológicas, ocorre um equilíbrio entre os agentes óxido-
redutores e o sistema de defesa antioxidante. Este sistema é composto por
substâncias detoxificadoras do agente, evitando que este cause a lesão, como a
glutationa redutase, superóxido-dismutase, catalase, vitamina E e glutationa-
peroxidase. Falhas nestes sistemas de defesa, excesso de produção de radicais
livres ou exposição da célula a agentes xenobióticos provocam um desequilíbrio
fisiológico e podem ocasionar lipoperoxidação e estresse oxidativo, resultando em
patologias, como o câncer, doenças pulmonares, cardiovasculares,
neurodegenerativas, entre outras (MATSUBARA e FERREIRA, 1997).
2.2.1 Mecanismos de defesa antioxidante
Antioxidantes são substâncias que retardam as reações de degradação
oxidativa, ou seja, reduzem a velocidade da oxidação por um ou mais mecanismos,
como inibição de radicais livres e complexação de metais. As substâncias
antioxidantes podem apresentar diferentes propriedades e agir em diversas etapas
do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos. Como exemplos,
podemos citar as vitaminas C, E e o β-caroteno, encontradas em frutas e verduras,
consideradas excelentes antioxidantes que são capazes de sequestrar os radicais
livres (BIANCHI; ANTUNES, 1999). Os flavonóides presentes nos vegetais também
apresentam propriedade antioxidante e a quercetina, a rutina, a miricetina e a
naringenina são amplamente investigados quanto a essa propriedade farmacológica
(HARTMAN; SHANKEL, 1990).
O sistema de defesa antioxidante pode ser dividido em sistema enzimático e
não-enzimático. O sistema enzimático é composto principalmente pelas enzimas
superóxido-dismutase, a catalase e a glutationa peroxidade. Entre os captadores
não-enzimáticos, podemos citar a vitamina C hidrossolúvel (ácido ascórbico), a
vitamina E lipossolúvel (α-tocoferol), ubiquinol-10 (coenzima Q10) e outras
28
substâncias como cisteína, ácido úrico e glutationa, apresentados na Figura 4
(BIANCHI; ANTUNES, 1999).
O primeiro mecanismo de defesa dos antioxidantes é impedir a formação dos
radicais livres, isso ocorre principalmente pela inibição das reações em cadeia com o
ferro e o cobre. Outra forma de atuação é a interceptação ou reação com esses
radicais, o que evita as lesões e perda da integridade celular. Outra forma de ação é
a reparação das lesões e esse processo está relacionado com a remoção dos danos
causados nas moléculas e reconstituição das membranas celulares. Caso as
respostas anteriores não sejam efetivas, ocorre ainda uma adaptação do
organismos a geração dos radicais livres com aumento da síntese de enzimas
antioxidantes (BIANCHI; ANTUNES, 1999).
Figura 4: Algumas substâncias antioxidantes.
Fonte: HIDRATA et al., 2004, com modificações.
2.2.2 Métodos de avaliação da atividade antioxidante
O conhecimento do potencial antioxidante dos vegetais é de grande
importância, visto a eficácia que eles possuem no combate às doenças relacionadas
ao estresse oxidativo. Neste contexto, técnicas in vitro permitem uma rápida seleção
29
destas plantas com potencial atividade. Porém, os métodos analíticos são
numerosos e sujeitos a interferências, sendo preconizado a utilização de duas ou
mais técnicas, pois nenhum ensaio conseguirá refletir a capacidade antioxidante
total de uma matriz complexa (GANDRA, 2012).
O método de sequestro de radicais livres pelo DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazila) baseia-se na transferência de elétrons de um composto ao outro (de
um antioxidante para um oxidante), ocorrendo o descoramento de uma solução
composta por estes radicais. O DPPH é um radical livre que possui carga negativa, o
que o torna muito reativo. Por ação de um antioxidante, ocorre a sua redução
formando o composto 2,2-difenilpicril-hidrazina (DPPH-H) isto é, ele recebe o H+ de
algum composto presente no extrato, mudando a coloração desta de roxo para
amarelo, mostrando que o extrato possui atividade antioxidante (GANDRA, 2012;
BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
O método de sequestro do radical DPPH• é considerado um método simples,
fácil, preciso e reprodutível, além de servir com triagem no estudo das atividades
antioxidantes. Este radical livre é instável, devido à deslocalização do elétron
desemparelhado por toda a molécula (Figura 5), porém ao receber átomos de
hidrogênio esta substância, que antes apresentação coloração violeta, se torna
amarela (OLIVEIRA, 2015). A Figura 6 mostra a molécula de DPPH e a reação
envolvida.
Figura 5: Estabilização do radical DPPH• pelo deslocamento do elétron desemparelhado.
Fonte: OLIVEIRA, 2015.
30
Figura 6: Mecanismos de reação entre o radical DPPH• e um antioxidante através da
transferência de um átomo de hidrogênio.
Fonte: OLIVEIRA, 2015, com modificações.
Outro método utilizado é o poder redutor, descrito por Yildrim et al., 2001. O
método consiste em avaliar a capacidade de extratos vegetais em reduzir o íon
ferricianeto a ferricianato, através da doação de um íon hidrogênio, que na presença
do íon férrico forma o azul da Prússia. Quanto maior for a absorbância, maior será a
capacidade antioxidante. Através deste método é possível avaliar a capacidade do
extrato em neutralizar radicais livres e torná-los produtos mais estáveis e em reduzir
intermediários oxidativos dos processos de peroxidação lipídica (GANDRA, 2012;
YILDIRIM et al, 2001; SANTOS; BATISTA, 2007).
O método baseado na redução do complexo de fosfomolibdênio, por Prieto e
colaboradores (1999), fundamenta-se na redução do molibdênio (VI) a molibdênio
(V) na presença de substâncias antioxidantes e resulta na formação do complexo de
fosfomolibdênio (verde/azul) (BALESTRIN, 2006; BORA et al., 2005).
O teste de TBA (ácido 2-tiobarbitúrico), também muito utilizado, consiste na
quantificação do malonaldeído (MDA), um dos principais produtos da decomposição
dos hidroperóxidos de ácidos graxos poli-insaturados, formados durante o processo
oxidativo. Uma molécula de MDA reage com duas moléculas de TBA, formando um
complexo de cor avermelhada (SILVA, BORGES, FERREIRA, 1997).
31
2.3 A INFLAMAÇÃO
O processo inflamatório está envolvido em inúmeras patologias, como
tendinites, infecções e doenças autoimunes, e apresenta-se como um mecanismo
natural de defesa do organismo, cujo objetivo é eliminar ou minimizar a causa inicial
da lesão, sendo esta provocada por patógenos ou agentes físicos (COSTA et al.,
2009; TRACEY, 2002). A Figura 7 apresenta uma visão geral sobre o processo
inflamatório.
Figura 7: Visão geral do processo inflamatório, com as principais células e
mediadores envolvidos.
Fonte: FORTES, 2013.
A reação inflamatarória consiste em dois componentes: a resposta inata e a
resposta adquirida. Na resposta imunológica inata, um importante evento inicial que
ocorre é a atuação dos macrófagos, onde estas células reconhecem padrões
moleculares associados aos patógenos (PAMPs), como por exemplo o
peptideoglicano, componente da parede celular de praticamente todas as bactérias,
e o lipopolissacarídeo (LPS), constituinte da membrana externa das bactérias gram-
negativas. Como resultado dessa interação, temos a produção de citocinas pró-
32
inflamatórias: o fator α de necrose tumoral (TNF-α) e a interleucina-1 (RANG et al,
2003).
As citocinas pró-inflamatórias atuam estimulando a síntese de óxido nítrico
(NO) nas células endoteliais dos vasos sanguíneos. A molécula de NO é formada
através da oxidação do átomo de nitrogênio com o aminoácido L-arginina, pela ação
enzima óxido nítrico sintase (NOS) presente nessas células e, logo em seguida, se
transforma em nitrito (NO2-). A principal função dessa molécula é provocar o
relaxamento do músculo liso subjacente das arteríolas e, consequentemente,
provocar vasodilatação, levando a distribuição de plasma e células sanguíneas para
a área de inflamação (RANG et al, 2003). Além do NO, estas células são capazes
de sintetizar a prostaglandina-2, o ativador de plasminogênio, a endotelina e outras
citocinas, e estão envolvidas na angiogênese, que ocorre em processos de reparo,
na inflamação crônica e no câncer (RANG et al, 2003).
No plasma estão presente outros mediadores que também atuam no
processo inflamatarório, como os componentes das cascatas enzimáticas que dão
origem aos mediadores da inflamação: a bradicinina do sistema das cininas, o C5a e
o C3a do sistema complemento,que estimulam a liberação de histamina pelos
mastócitos, e outros componentes deste sistema que provocam lise das bactérias
(RANG et al, 2003).
O TNF-α também está relacionado aos processos imunomodulatórios e
inflamatórios, atuando na inflamação aguda e crônica, na resposta antitumoral e nas
infecções. Além disso, essa citocina é capaz de induzir a enzima óxido nítrico
sintase, estimular linfócitos T e B, suprimir a lipase lipoproteica e induzir a expressão
de outras citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina-1 (EIGLER et al., 1997;
PALLADINO et al., 2003). No Quadro 2 encontra-se um resumo dos principais
mediadores desse processo.
Quadro 2: Principais mediadores derivados das células e suas funções.
Mediadores
celulares
Tipo Fonte Função
Histamina Amina vasoativa Mastócitos,
basófilos e
Presente em grânulos pré-formados. Causa
dilatação de arteríolas e aumento da
33
plaquetas permeabilidade vascular.
Óxido Nítrico Gás solúvel Macrófagos e
células
endoteliais
Potente vasodilatador, relaxa musculatura
lisa, reduz agragação plaquetária, tem ação
antimicrobiana em altas concentrações.
Leucotrieno
B4
Eicosanóide
derivado do ácido
araquidônico por
ação de
lipoxigensase
Leucócitos Promove ativação e adesão de leucócitos ao
endotélio e sua migração. Induz a formação
de EROs nos neutrófilos.
Prostaglandi
nas
Eicosanóides
derivados de ácido
araquidônico por
ação de
cicloxigenases
Mastócitos Causam vasodilatação, febre e dor.
TNF-α e IL-1 Citocinas Macrófagos Ativam fibroblastos, promovem adesão de
leucócitos e quimiotaxia. Causam efeitos
sistêmicos como febre, perda de apertite e
aumento de batimentos cardíacos.
IFN-g Citocina Células T e
NK
Ação antiviral, imunorregulatória e antitumoral.
Também denominado fator ativados de
macrófagos, é importante na inflamação
crônica.
IL-8 Quimiocina Macrófagos Ativação e quimiotaxia para neutrófilos.
Fonte: CRUVINEL et al., 2010, com modificações.
Quando o estímulo nocivo persiste, como ocorre na inflamação crônica, o
processo inflamatório se mantém e sofre alterações qualitativas, onde ocorre maior
envolvimento da imunidade adquirida, aumentando acentuadamente a eficácia da
resposta inata. Como células-chave desse processo temos os línfócitos B, linfócitos
T, divididos em células T auxiliares (CD4+) e citotóxicas (CD8+), e células natural
killer e o mesmo se apresenta em duas fases: a fase de indução e a fase efetora.
Na fase de indução as células T virgens são expostas ao antígeno apresentado e
irão se diferenciar em: células T citotóxicas, que podem destruir céluas infectadas
por vírus; células T auxiliares, que por sua vez, podem ser dividias em células Th1,
34
que proliferam e transformam-se em células que liberam citocinas de ativação dos
macrófagos, ou células Th2, que interagem com células B; ou se transformam em
células de memória. Já a fase efetora envolve as respostas mediadas por anticorpos
e células. Já a fase efetora envolve as respostas mediadas por anticorpos e células.
As reações mediadas por células envolvem: células T citotóxicas que interagem com
células infectadas por vírus, matando-as; liberação de citocinas pelas células T
auxiliares; e ação das células de memória. Por outro lado, temos também a
produção de anticorpos pelos linfócitos B, onde esses produzem ativação mais
seletiva da cascata do sistema completmento, neutralizam alguns vírus e algumas
toxinas bacterianas, auxiliam na ingestão mais eficaz do microorganismo ou
promovem a maior fixação a parasitas muticelulares, facilitando a sua destruição
(RANG et al, 2003). A Figura 8 ilustra resumidamente esse processo.
Figura 8: Resposta e ativação celulares do sistema imune adaptativo.
Fonte: GRECO; PARREIRA; RESENDE; 2015.
Os principais sinais do processo inflamattório a nível macroscópico,
conhecidos como os cinco sinais cardinais, são a dor, o edema, a vermelhidão e o
calor, além de poder ocorrer perda da função da região afetada. Como resultado
desse processo, temos a cura ou a inflamação crônica, caso a resposta não seja
efetiva ou o patógeno ou substância nociva persistirem (COSTA et al, 2009;
35
TRACEY, 2002). No Quadro 3 temos as principais características dos processos
inflamatórios agudo e crônico.
Quadro 3: Características dos processos inflamatórios agudo e crônico.
Inflamação
Aguda Crônica
Agente
causal
Patógenos orgânicos, radiação
ionizante, agentes químicos, trauma
mecânico
Persistência do estímulo inicial, auto-
imune
Células
envolvidas
Neutrófilos, monócitos, macrófagos,
mastócitos
Macrófagos, linfócitos, fibroblastos
Mediadores
primários
Aminas vasoativas, eicosanóides,
quimiocinas, EROs
IFN-g, citocinas, fatores de crescimento,
enzimas hidrolíticas
Início Imediato Tardio
Duração Poucos dias Meses ou anos
Evolução Cicatrização com restituição ad
integrum, formação de abcesso ou
cronificação
Destruição tecidual e fibrose
Fonte: CRUVINEL et al., 2010, com modificações
2.3.1 A relação entre o processo inflamatório e o câncer
Alguns estudos mostram que a inflamação é um componente crítico na
progressão de tumores e que diversos tipos de câncer podem se originar a partir de
irritações crônicas, sítios de infecção ou inflamação, logo a participação das células
inflamatórias se faz indispensável no processo neoplásico. O processo inflamatório
ocorre na tentativa de reparar um dano tecidual e esse processo, em geral, é
autolimitado. Entretanto, a falta de regulação de um dos fatores envolvidos pode
levar a anormalidades, como ocorre na progressão neoplásica (COUSSENS; WERB,
2002).
36
2.4 RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA E CARCINOMA DE PELE
A radiação eletromagnética emitida pelo sol apresenta um largo espectro de
comprimentos de onda e pode ser dividida em radiação ionizante, subdividida em
raios-x e raios gama, e não-ionizante, subdivida em luz visível, raios ultravioleta e
radiação infravermelho (KIRCHHOFF, 1995). A radiação ionizante, altamente
prejudicial ao homem, não penetra na atmosfera terrestre, porém os raios
ultravioleta (subdivididos em raios UVA, UVB e UVC) podem trazer danos à saúde,
implicando em queimadura solar, envelhecimento precoce e câncer de pele
(RIBEIRO, 2004). A Figura 9 ilustra essa divisão.
Figura 9: Componentes ultravioleta (UV) no espectro eletromagnético.
Fonte: RONDON et al, 2004.
Os carcinomas de pele, por exemplo, tem se tornado cada vez mais
frequentes e dados da Organização Mundial de saúde apontam que, para cada três
novos casos de câncer, um é localizado na pele (OMS, 2009). Esse aumento se
deve principalmente a ação da luz ultravioleta solar, agravada principalmente pela
redução dos níveis do ozônio atmosférico, pelo envelhecimento populacional,
mudanças no estilo de vida e aos fatores fenotípicos (SGARBI SGARBI; CARMO;
ROSA, 2007; POLONINI; RAPOSO; BRANDÃO, 2011).
A exposição excessiva da pele aos raios ultravioleta pode gerar severo
estresse oxidativo nas células da epiderme e, em consequência, os queratinócitos
podem demonstrar maior resistência a apoptose e sobreviver por tempo maior,
dessa forma teremos um acúmulo de danos nas cadeias de DNA e alterações em
proteínas, favorecendo o processo neoplásico (MA et al., 2001). A radiação UVB é o
37
principal componente associado ao processo da carcinogênese por provocar danos
diretos ao DNA e por induzir a formação de radicais livres. Isso culmina em
processos inflamatórios que, inicialmente protegem a epiderme contra a propagação
de células cancerígenas, porém após altas doses de radiação, levam a ulceração da
epiderme, com consequente perda da barreira de proteção (HILDESHEIM et al.,
2004).
2.4.1 Proteção solar e métodos de determinação do Fator de Proteção Solar
Como forma de prevenção, além da realização de campanhas de
conscientização, o uso de filtros solares é altamente recomendado. Estas
substâncias são capazes de absorver a energia eletromagnética e emiti-la sob outra
forma, evitando a penetração da radiação na pele (RIBEIRO, 2004).
Com o aumento da incidência dos raios solares e dos carcinomas de pele, se
faz cada vez mais necessária a busca por novos filtros solares, para prevenção
desta patologia. Atualmente, a metodologia aceita para a determinação do fator de
proteção solar (FPS) segundo a ANVISA é a metodologia in vivo indicada pelo FDA,
de maio de 1993, ou a norma COLIPA, de outubro de 1994 (RIBEIRO, 2004).
Entretanto, existem metodologias in vitro que podem ser utilizadas como
forma de investigação para uma possível atividade fotoprotetora. Dentre elas
podemos citar o Método de Mansur et al (1986). Este método é eficaz e rápido, além
de apresentar uma boa correlação com os resultados in vivo. Uma solução da
formulação é submetida a diferentes comprimentos de onda, dentro de uma faixa pré
estabelecida. Com o valor da absorbância e a relação do efeito eritematogênico e a
intensidade da radiação, é possível calcular o FPS.
2.5 RESISTÊNCIA BACTERIANA E O USO DE ANTIMICROBIANOS
As doenças infecciosas sempre representaram um grave problema de saúde
pública mundial e inclusive relacionam-se aos grandes acontecimentos que
marcaram a humanidade, como as grandes guerras, onde ocorria a disseminação de
epidemias, como a peste e o tifo (WALDMAN, 2001). Porém, no decorrer dos anos o
desenvolvimento de fármacos antimicrobianos revolucionou o tratamento dessas
38
enfermidades, reduzindo drasticamente a mortalidade por doenças microbianas
(SILVEIRA et al., 2006).
Infelizmente, devido ao uso inadequado destes medicamentos, a resistência
bacteriana frente aos antibióticos atuais empregados no tratamento de infecções
também cresceu e fez com que as bactérias desenvolvessem defesas relativas aos
agentes antibacterianos (SILVEIRA et al., 2006).
A resistência bacteriana é um fenômeno evidenciado quando ocorre o
crescimento do micro-organismo em um meio contendo o antimicrobiano na mesma
concentração que este deve atingir no sangue e pode ocorrer num período curto de
tempo. Esse fenômeno ocorre devido a quatro fatores: prescrição arbitrária de
antibióticos, uso abusivo ou inadequado pelos pacientes, globalização, (facilitando a
transmissão dos patógenos) e a falta de um sistema global de vigilância
epidemiológica (GURGEL e CARVALHO, 2008).
No Quadro 4 encontra-se uma lista de alguns microorganismos patogênicos e
suas principais doenças relacionadas.
Quadro 4: Características e doenças relacionadas às espécies de bactérias
utilizadas no estudo.
Nome científico Principais doenças relacionadas
Escherichia coli Comumente envolvida na sepse por micro-organismos, gram negativos e no
choque induzido por endotoxina. As infecções do trato urinário e de feridas,
pneumonia em pacientes hospitalizados imunossuprimidos e meningite em
recém-nascidos constituem outras infecções comuns causada por essa espécie,
além de gastroenterite.
Klebsiella
pneumoniae
Pneumonia e infecção do trato urinário.
Salmonella
entérica
typhimurium
Salmonelose.
Staphylococcus
aureus
Pode causar uma variedade de processos infecciosos, que incluem desde
infecções cutâneas relativamente benignas (foliculite, furúnculo, carbúnculos,
mastite, etc.) até doenças sistêmicas potencialmente fatais (broncopneumonia
39
estafilocócica, pericardite, osteomielite, etc.).
Staphylococcus
epidermidis
Podem causar infecções do trato urinário, infecções de feridas cirúrgicas,
osteomielite, endorcadite de próteses valvares, infecções de cateteres
intravenosos. (a maioria das infecções são adquiridas no hospital).
Fonte: MURRAY, et al, 2010; TRABULSI e ALTERTHUM, 2004.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial antioxidante, antiinflamatório,
citotóxica, antimicrobiano e fotoprotetor do extrato etanólico de Pouteria caimito.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Quantificar o teor de polfenóis e flavonoides do extrato etanólico de P.
caimito.
• Avaliar a atividade antioxidante do extrato etanólico de P. caimito;
• Avaliar a atividade citotóxica e anti-inflamatória in vitro do extrato etanólico de
P. caimito em macrófagos e dosar óxido nítrico.
• Determinar a atividade fotoprotetora do extrato etanólico de P. caimito.
• Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico de P. caimito
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 COLETA DA AMOSTRA VEGETAL E PREPARO DOS EXTRATOS
As folhas de Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk foram coletadas no sítio
Pindorama localizado no município de Governador Valadares, Minas Gerais, Brasil,
40
em maio de 2014. A exsicata foi depositada no Herbário Leopoldo Krieger da
Universidade Federal de Juiz de Fora e está em processo de análise.
As amostras foram secas em estufa com circulação forçada de ar a 40°C e
pulverizadas para obtenção do material vegetal seco (100 g). Em seguida, foi
realizada extração pelo método de maceração estática com etanol, à temperatura
ambiente, até a exaustão. O extrato, então, foi concentrado à pressão reduzida
utilizando evaporador rotatório (Heidolph – Laborota 4000), pesado e mantido sobre
refrigeração até o momento da realização dos ensaios fitoquímicos e biológicos.
4.2 MÉTODOS ANTIOXIDANTES
A determinação da atividade antioxidante foi realizada por meio dos ensaios:
método de sequestro do radical DPPH, método do poder de redução, redução do
complexo fosfomolibdênio, determinação da peroxidação lipídica pela quantificação
de malonaldeído e bioautografia.
4.2.1 Método do sequestro do radical DPPH
O primeiro ensaio antioxidante avaliado foi o Método de Sequestro de
Radicais Livres- DPPH e baseou-se no método descrito por Brand-Williams (1995),
com modificações. Foram preparadas soluções do extrato e dos padrões na
concentração de 1 mg/mL em metanol. Neste ensaio, foram utilizados como padrões
o ácido ascórbico, quercetina e rutina.
Em uma microplaca de 96 poços foram adicionados 100 µL da solução
preparada do extrato em 4 poços coluna 2 e 50 µL de metanol nos poços laterais a
estes até a coluna 12. Alíquotas de 50 µL foram retiradas da 1ª fileira, com pipeta
multicanal e transferidas para fileira subsequente (2ª fileira), homogeneizando três
vezes e prossegui-se com diluição seriada até o poço 12, descartando a última
alíquota. Após esta etapa, foi adicionada em cada poço 150 µL de solução de DPPH
0,02 mg/mL, com exceção da linha D, onde foi adicionado 150 µL de metanol, que
representava o branco da amostra (Figura 10). Além disso, preparou-se 3 poços
com 50 µL de metanol e 150 µL de solução DPPH, que representaram oxidação
total. Feita adição, a placa foi mantida em local escuro, protegido da luz, à
temperatura ambiente por 30 minutos e em seguida foi medida a absorbância em
41
517nm, em leitor microplaca (Thermo Scientific Skanlt® Multiskan GO, software 3,2).
Foi realizado o mesmo procedimento para cada padrão.
Figura 10: Esquema do método de DPPH.
Fonte: Elaborada pela autora.
As concentrações variaram entre 250 e 0,488 µg/mL. Os resultados foram
expressos em CI50, concentração necessária para que a amostra possa reduzir em
50% a concentração do radical livre DPPH, que foi determinado no programa Grafit
5. A porcentagem de inibição da oxidação foi determinada através da seguinte
fórmula:
%I = ADPPH – Aamostra x 100
ADPPH
Onde:
%I = porcentagem de inibição do radical DPPH
ADPPH = absorbância do DPPH em metanol
Aamostra = absorbância da amostra em metanol
42
4.2.2 Método do Poder de Redução
A avaliação do poder redutor foi realizada de acordo com Yildrim et al. (2001).
Foram preparas soluções estoques na concentração de 1mg/mL do extrato e dos
padrões ácido ascórbico e quercetina. Foram pesadas 3,5 mg de cada amostra e
estas transferidas para tubo falcon, com posterior adição de 3,5mL de água
destilada. Para a realização do ensaio, foi necessário preparar também uma solução
de tampão fosfato (pH 6,6), solução de cloreto férrico 0,1%, solução de ácido
tricloroacético 10% e solução de ferrocianeto de potássio 1% [K3Fe(CN)6].
Foram preparadas sete concentrações de cada amostra, de acordo com a
Tabela 1.
Tabela 1: Preparo das amostras em diferentes concentrações, adicionando solução
estoque das amostras, água destilada, tampão fosfato e ferrocianeto de potássio
1%.
Concentração
Preparada (μg/mL)
Solução Estoque
(μL) H2Od (mL)
Tampão Fosfato 200
μM (mL)
[K3Fe(CN)6]
1% (mL)
1 53,64 500 --- 1,5 1,5
2 26,82 250 250 1,5 1,5
3 13,41 125 375 1,5 1,5
4 6,7 62,5 437,5 1,5 1,5
5 3,35 31,25 468,35 1,5 1,5
6 1,675 15,625 484,375 1,5 1,5
7 0,8375 7,8125 492,1875 1,5 1,5
Fonte: Elaborada pela autora, 2017.
O teste foi feito em triplicata, ou seja, foram preparados três tubos para cada
concentração. Além disso, foi preparado também o branco, tubo contendo todos os
reagentes, com exceção da solução estoque, sendo esta substituída por água
destilada. Os tubos foram posteriormente incubados a 50ºC em banho-maria por 20
minutos. Após esta etapa, foi adicionado 1,25 mL de ácido tricloroacético 10% em
todos os tubos e os mesmos foram centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos.
Retirou-se 1,25 mL da parte superior da solução (sobrenadante) e transferiu-se para
outro tubo (previamente identificado). Em seguida, adicionou-se 1,25 mL de água
destilada no tubo contendo o sobrenadante e 0,250 mL de cloreto férrico 0,1%. A
absorbância foi medida em 700 nm, em leitor microplaca (Thermo Scientific Skanlt®
43
Multiskan GO, software 3,2). Os resultados foram expressões em CE50,
concentração do extrato com efetividade de 50%. Foi utilizado o programa Excel,
com os dados de concentração do extrato versus absorbância.
4.2.3 Redução do Complexo Fosfomolibdênio
O ensaio foi realizado de acordo com o método proposto por Prieto et al.
(1999). Foi preparada amostra do extrato na concentração de 0,2 mg/mL, diluída em
água:etanol, na proporção 1:1, onde 1 mg da amostra foi pesada em tubo falcon e
solubilizada em 1 mL de álcool e 1 mL de água, obtendo-se a concentração de 0,5
mg/mL. Dilui-se aliquotando 400 µL dessa em 300 µL de álcool e 300 µL de água,
chegando a concentração de 0,2 mg/mL. Neste ensaio, também foi necessário
preparar o reagente teste, onde adicionou-se ao balão volumétrico de 100 mL. 28
mL da solução de fosfato de sódio (0,1 mol/L), 12 mL da solução de molibdato de
amônio (0,03 mol/L), 20 mL de solução de ácido sulfúrico (3 mol/L) e o volume foi
completado com água destilada. Nos tubos de ensaio, em triplicata, foram
adicionados 300 µL da amostra e 2 mL do reagente teste. Foram feitos também o
branco do experimento, onde adicionou-se 150 µL de água destilada, 150 µL de
etanol e 2 mL do reagente teste e o branco da amostra, contendo 300 µL da amostra
e 2 mL do reagente teste. Posteriormente, os tubos foram vedados com papel
alumínio e colocados em banho-maria por 90 minutos. Após esta etapa, retirou-se os
tubos do banho e foi feita a leitura a 695 nm leitor microplaca (Thermo Scientific
Skanlt® Multiskan GO, software 3,2) quando as amostras atingiram a temperatura
de 25ºC.
Os padrões utilizados foram o ácido ascórbico e a quercetina. Porém, foram
feitas 5 concentrações para que fossem obtidas as curvas padrões. À partir das
equações das retas, substitui-se a absorbância encontrada pela amostra nas curvas-
padrão e foi determinada a massa equivalente de ambos os padrões em relação a
0,2 mg da amostra.
Os resultados também foram expressos em porcentagem de Atividade
Antioxidante Relativa (AAR %), sendo a capacidade antioxidante do extrato
expressa em relação ao ácido ascórbico e a quercetina (NEGRI et al., 2009) de
acordo com a seguinte fórmula:
44
AAR% (padrão) = Abs (amostra) – Abs (branco) x 100% Abs (padrão) – Abs (branco)
Onde:
AAR% (padrão) = Atividade Antioxidante Relativa (AAR %)
Abs (amostra) = Média das absorbâncias da amostra
Abs (padrão) = Média das absorbâncias do padrão
4.2.4 Determinação da Peroxidação Lipídica pela Quantificação de
Malonaldeído
O Teste de determinação da peroxidação lipídica pela quantificação de
malonaldeído (MDA) foi baseado no método descrito por Kohn e Liversedge (1944),
com modificações (OSAWA; FELÍCI.; GONÇALVES, 2005). Para este ensaio, foi
necessário o preparo de uma solução de hidróxido de sódio 0,05M, solução de ácido
tiobarbitúrico (TBA) em hidróxido de sódio 0,05M, solução de ácido fosfórico 1% e
solução etanólica de 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) 4%.
A primeira etapa baseou-se na construção da curva padrão de malonaldeído
(MDA) e, a partir desta curva, seria determinada a quantidade de MDA formada pelo
extrato, nas concentrações que foram avaliadas: 0,075, 0,15 e 0,3 mg/mL. Para esta
etapa, foram necessários 11 tubos de ensaio. Nos tubos enumerados de 1 a 5,
adicionou-se 9 mL de água destilada e, nos tubos de 6 a 11, 5 mL de água destilada.
Ao tubo 1, foi adicionado 164 µL de tetrametoxipropano e 836 µL de etanol. Foi
realizada homogeneização e transferência de 1 mL para o tubo seguinte e assim por
diante. À partir do tubo 5, foram retiradas 5 mL para as próximas diluições. As
concentrações variaram de 0,1M a 0,1562 μM. Às concentrações de 5 μM a 0,1562
μM, foram adicionados 2,5 mL de ácido tricloroacético 10 % e 1,25 mL de TBA.
Estas soluções foram submetidas a banho de água fervente por 15 minutos e
posteriormente resfriadas em banho de gelo por 10 minutos. Foram retiradas
alíquotas de 200 µL de cada solução, em triplicata, e feita leitura em 532 nm em
leitor microplaca (Thermo Scientific Skanlt® Multiskan GO, software 3,2). Com estes
valores, construi-se a curva padrão utilizando o programa Excel.
45
A etapa seguinte baseou-se no preparo do homogeinato contendo o extrato.
Em um béquer, foi pesado 25 g de carne moída e adicionado 17 mL de água
destilada e 200 µL do extrato vegetal diluído em metanol. O homogeinato foi levado
a aquecimento até o aparecimento de coloração “amarronzada”. O volume foi
completado para 100 mL com água destilada e homogeneizado. Foram preparados
3 homogeinatos nas concentrações 0,075; 0,15 e 0,3 mg/mL do extrato, estes foram
transferidos para frascos âmbar e mantidos sob refrigeração durante os dias do
ensaio.
Para quantificação de MDA, foram realizadas leituras em triplicada. Em cada
tubo de ensaio foi adicionado 0,5 g de homogeinato, 50 µL de BHT, 2,5 mL de ácido
fosfórico 1 % e 1,25 mL de TBA. As soluções foram aquecidas por 15 minutos em
banho maria e em seguida submetidas a banho de gelo por 10 minutos. Após o
resfriamento, foram adicionados 3 mL de butanol em cada tubo. Estes foram levados
a centrifugação a 3000 rpm por 8 minutos. Foi então retirada uma alíquota de 200 µL
do sobrenadante e a absorbância lida em leitor de microplaca a 532 nm (Thermo
Scientific Skanlt® Multiskan GO, software 3,2). As substâncias de referência
(controles positivos) utilizados no teste foram o ácido ascórbico, a quercetina e o
BHT, testados nas mesmas concentrações dos extratos. Como controle negativo, foi
utilizado o homogeinato sem a adição de extrato, apenas com adição de metanol e
no branco do experimento foi utilizada água destilada. Os resultados foram
analisados no programa Ghaphpad prism 6 (One way Anova; Bonferroni 0,05 – 95%
IC). As leituras foram realizadas no primeiro, terceiro e quinto dias, após a
preparação do homogeinato.
4.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE POLIFENÓIS E FLAVONOIDES
4.3.1 Determinação do teor de Polifenóis pelo método de Folin-Denis
Este método foi baseado no ensaio preconizado pela Farmacopeia Brasileira,
3ª edição. Para o ensaio, foi necessário determinar a curva padrão, onde se utilizou
ácido tânico como composto fenólico equivalente. Transferiu-se para tubos de
ensaio alíquotas de 0,07; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mL da solução padrão de ácido
tânico 1% (1 g dissolvido em etanol 70%). Os volumes de cada tubo de ensaio foram
completados com etanol 70% qsp 1 mL. A cada tubo de ensaio foi adicionado 8 mL
46
de solução tampão de carbonato de sódio 2% e 1 mL do reagente de Folin-Denis e
os tubos foram agitados. Após repouso por 60 minutos em banho-maria a 30 °C os
tubos foram centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos. A leitura das absorbâncias foi
realizada em espectrofotômetro em 730 nm (Thermo Scientific Skanlt® Multiskan
GO, software 3,2). As concentrações finais foram de 7, 10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL.
Cada concentração foi feita em triplicata e a partir das médias foi elaborada a curva
padrão utilizando o programa Microsoft @Excel. O extrato foi avaliado na
concentração de 500 μg/mL e o procedimento adotado foi o mesmo para o ácido
tânico. Também foi feito controle negativo, contendo, no lugar da amostra, somente
etanol 70%. A absorbância lida para a triplicata da amostra contendo o extrato foi
substituída na equação da reta da curva padrão e o resultado foi expresso em μg de
ácido tânico/mL de extrato.
4.3.2 Determinação do teor de Flavonoides
Este ensaio baseou-se no método realizado por Miliauskas (2004). Para o
ensaio também foi necessário determinar a curva padrão, onde se utilizou rutina
(Sigma- Teor de 95%) como flavonoide equivalente. Transferiu-se para balões
volumétricos de 25 mL alíquotas de 0,10; 0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 mL da solução padrão
de rutina 0,5 mg/mL em etanol PA, feitas em triplicata. Adicionou-se a cada balão
1,0 mL de solução de AlCl3 2% e 1 gota de ácido acético. Os volumes foram
completados com etanol PA. As soluções ficaram em repouso por 40 minutos, ao
abrigo da luz. Após esse intervalo, foi feita a leitura das absorbâncias em
espectrofotômetro a 415 nm (Thermo Scientific Skanlt® Multiskan GO, software 3,2).
À partir das médias foi elaborada a curva padrão utilizando o programa Microsoft
Excel. O extrato foi avaliado na concentração de 500 μg/mL e o procedimento
adotado foi o mesmo para a rutina. Também foi feito controle negativo, contendo, no
lugar da amostra, somente etanol PA. A absorbância lida para a triplicata da amostra
contendo o extrato foi substituída na equação da reta da curva padrão e o resultado
foi expresso em μg de rutina/mL de extrato.
4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
4.4.1 Linhagem celular
47
A linhagem celular de macrófagos murino RAW 264.7 foram obtidas a partir
do banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ-RJ, Brasil). As células foram mantidas
em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino 10% (SFB) e antibióticos (100
unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) a 37°C em incubadora
humidificada contendo 5% de CO2.
4.4.2 Avaliação da citotoxicidade
A viabilidade das células na presença do extrato etanólico das folhas de P.
caimito foi determinada utilizando o ensaio de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide – Sigma-Aldrich) (Mosmann, 1983). Resumidamente,
células RAW 264.7 (1x104 células/poço) foram cultivadas em microplacas de 96
poços e incubadas durante 24 h antes do tratamento com o extrato. As células foram
tratadas com concentrações de 25, 50, 75 e 100 µg/mL de extrato a 37 ° C durante
44 h. Logo após, a solução de MTT (5 mg/mL em meio isento de soro, 20 μL/poço)
foi adicionado em cada poço seguido por incubação durante 4 h. Finalmente, a
solução de MTT foi removida e os cristais de formazan formados por redução de
MTT foram dissolvidos em 200 μL de DMSO. A absorvância foi medida a 540 nm
utilizando um leitor de microplacas (Thermo Scientific® - Multiskan GO, MA, EUA).
Valores foram calculados em comparação com as células do controle.
4.4.3 Dosagem de óxido nítrico
Atividade anti-inflamatória foi investigada pela inibição da produção de óxido
nítrico (NO). A produção de NO foi determinada indiretamente por reação de Griess
para medir a concentração de nitrito no meio de cultura. As células, RAW 264.7
foram semeadas em microplacas de 96 poços a uma densidade de 8 x 104
células/poço e incubadas durante 24 h. Em seguida, foram expostas a 100 ng/ml de
LPS (Escherichia coli 055:B5, Sigma-Aldrich), com as concentrações 25, 50, 75 e
100 µg/mL de extrato durante 48 h. O sobrenadante de cultura (100μL) foi misturado
com o reagente de Griess (100μL, 1% de sulfanilamida; 0,1% de N- [1-naftil] -
etilenodiamine em ácido fosfórico a 5% - Sigma-Aldrich) e incubou-se à temperatura
ambiente durante 10 min. A absorvância foi medida a 540 nm (Thermo Scientific -
Multiskan GO, Waltham, MA, EUA). A concentração de NO foi assim determinada,
utilizando-se uma curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2), realizada por meio da
48
leitura das absorbâncias de onze concentrações, no intervalo de 500 a 8,7 ng de
NO2. A partir das absorbâncias e das concentrações construiu-se a regressão na
ferramenta Excel e realizou-se análise estatística no programa GraphPad Prism,
versão 5 (2007). Todo experimento foi realizado em triplicata e calculado a média ±
desvio padrão.
4.5 DETERMINAÇÃO DO FPS IN VITRO PELO MÉTODO DE MANSUR (1986)
Este ensaio baseou-se no método de Mansur et al. (1986), com modificações
propostas por Ribeiro et al (2004). Foram preparadas soluções diluídas em etanol
95% do extrato livre e do filtro solar ácido-2-fenilbenzimidazol-5-sulfônico e ácido-2-
hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfônico (filtro solar hidrossolúvel UVA/UVB da All
Chemistry do Brasil Ltda, /lote 037/02). As concentrações foram 200, 100, 50, 20, 2
e 0,2 µg/mL. Para todas as concentrações, foi feita varredura de 290 a 320 nm,
realizando leituras a cada 5 nm, para se determinar o FPS, conforme a equação
abaixo:
Equação 1 - Cálculo do FPS in vitro por espectrofotometria por absorbância no UV
pelo método de Mansur.
FPS = FC . EE (λ) . I (λ) . Abs (λ)
Fonte: MANSUR et al., 1986.
Legenda: FC = fator de correção (igual a 10); EE (λ) = efeito eritematogênico da
radiação de comprimento de onda ;Ι (λ) = intensidade da luz solar no comprimento
de onda λ; Abs (λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância da solução da
preparação no comprimento de onda (λ).
Além disso, foi feita varredura de 200 a 400 nm, com intervalos de 2 nm, de
todas as soluções para se avaliar o pico de maior absorção da radiação. Foi utilizado
leitor microplaca (Thermo Scientific Skanlt® Multiskan GO, software 3,2). Os
resultados dessas concentrações foram comparados.
49
4.6 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
O método utilizado neste trabalho foi a determinação da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) por microdiluições seriadas. Este ensaio foi baseado no
método proposto por Eloff (1998). As linhagens de bactérias utilizadas foram
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™), Klebsiella
pneumoniae subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan (ATCC® 4352™),
Staphylococcus epidermidis (Winslow and Winslow) Evans (ATCC® 14990™),
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 10536™) e Salmonella
enterica subsp. enterica (ex Kauffmann and Edwards) Le Minor and Popoff serovar
Typhimurium (ATCC® 13311-MINI-PACK™), cedidas Instituto Nacional de Controle
de Qualidade em Saúde - Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.
As cepas, que antes se encontravam congeladas a -5ºC, foram ativadas em 2
mL de caldo brain heart infusion (BHI). Após 24 horas, em estufa, 100 µL do caldo
foram transferidos para placas contendo agar BHI e foram plaqueadas com auxílio
de alça de Drigalski. Observado o crescimento, após 24 horas, foi feito o repique das
cepas e estas foram mantidas em estufa, por mais 24 horas. A Figura 11 ilustra esse
processo.
Figura 11: Esquema do processo de ativação e indução do crescimento bacteriano.
Fonte: elaborado pela autora.
No dia do ensaio, o inóculo foi preparado em solução salina, dentro da escala
McFarland entre 0,5 e 1. O extrato foi preparado na concentração de 2 mg/mL,
50
diluído em 80% de PBS e 20% de DMSO (na concentração final na microplaca a
solução continha 5% de DMSO). O teste foi realizado em microplacas de poliestireno
de 96 poços. Na primeira fileira, foi adicionado 180 µL de extrato e 180 µL de caldo
Muller Hinton (MH), feita homogeneização e, posteriormente, microdiluições até a
fileira 8, onde já havia sido adicionado 180 µL de caldo em cada. Em seguida,
adicionou-se 20 µL de inoculo, em duplicata. Desta forma, foram avaliadas 8
concentrações da amostra, que variaram de 900 a 7 µg/mL. Também foram
reservados poços para o controle negativo, contendo apenas caldo MH, o branco da
amostra, contendo caldo com extrato (um para cada concentração), e para o
controle de crescimento, contendo caldo e inóculo. As microplacas foram mantidas
em estufa a 37ºC por 24 horas. No dia seguinte, foi feita leitura por avaliação da
turbidez e determinado o CIM.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
5.1.1 Método de sequestro de radical livre: redução do radical 2,2-difenil-1-
picrilidrazila (DPPH•)
O primeiro teste que foi realizado foi o teste do DPPH. Na Tabela 2 encontra-
se a relação entre a porcentagem de inibição do radical com as concentrações
avaliadas e, à partir destes valores, foi determinado o CI50, concentração necessária
para que a amostra possa reduzir em 50% a concentração do radical livre DPPH,
que foi determinado no programa Grafit 5. Os gráficos obtidos para cada amostra
encontram-se a seguir.
Tabela 2: Relação entre a concentração e a porcentagem de inibição das amostras
avaliadas.
Concentração (µg/mL)
Extrato das folhas de Pouteria caimito
Ácido ascórbico Quercetina
Inibição % Inibição % Inibição %
250 91,26712 91,92661 91,92661
125 93,83562 89,17431 89,17431
62,5 96,91781 86,42202 86,42202
31,5 92,29452 86,23853 86,23853
51
15,625 70,89041 86,23853 86,23853
7,8125 37,67123 80,91743 80,91743
3,90625 19,00685 84,0367 84,0367
1,953125 7,020548 81,10092 81,10092
0,976563 -4,28082 72,11009 72,11009 0,4882815 -6,16438 5,366667 5,366667
Fonte: Elaborada pela autora, 2017.
Gráfico 1: Determinação do CI50 para o extrato etanólico das folhas de Pouteria
caimito.
[Inhibitor]
Re
sp
onse
Parameter Value Std. Error
Y Range 87,4565 4,9286
IC 50 10,0741 0,7987
Slope factor -2,3785 0,3851
Background 7,5479 4,0071
Fonte: Elaborada pela autora.
52
Gráfico 2: Determinação do CI50 para o ácido ascórbico.
[Inhibitor]
Re
sp
onse
Parameter Value Std. Error
Y Range 54,8189 1,1892
IC 50 0,4803 0,0127
Slope factor -10,9180 14,7893
Background 40,3278 1,1865
Fonte: Elaborada pela autora.
Gráfico 3: Determinação do CI50 para a quercetina.
[Inhibitor]
Re
sp
onse
Parameter Value Std. Error
Y Range 108,4578 158,6050
IC 50 0,9829 1,0205
Slope factor -3,2911 1,7933
Background -23,0532 157,8171
Fonte: Elaborada pela autora.
53
Como podemos observar o CI50 foi de 10,0741 µg/mL para o extrato, 0,4803
µg/mL para o ácido ascórbico e 0,9829 µg/mL para a quercetina. Quanto menor for o
valor do CI50 menor será a concentração necessária para reduzir o radical DPPH.
Desta forma os padrões apresentaram valores inferiores, porém não podemos
desconsiderar o fato de que são substâncias puras, enquanto no extrato estão
presentes inúmeras substâncias que podem estar atuando ou não de forma
sinérgica nesta ação. A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos por Castro et al.
(2001) da atividade antioxidante dos extratos brutos de folhas de Pouteria caimito,
Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni, Pouteria ramiflora (Mart.) Radlk e Pouteria
torta (Mart.) Radlk e do BHT, utilizado como padrão, pelo método de DPPH.
Tabela 3: Atividade antioxidante dos extratos brutos de folhas de Pouteria spp.
Espécie Solvente CI50 (µg/mL)
Pouteria caimito Hexano 1570,0 Etanol 20,2 Água 72,9
Pouteria gardnerii Hexano 181,0 Etanol 46,5 Água 15,625
Pouteria ramiflora Hexano 291,0 Etanol 6,3 Água 37,5
Pouteria torta Hexano 2000,0 Etanol 10,1 Água 5,9
BHT - 15,0
Fonte: SILVEIRA et al., 2001.
Em outro estudo, França e colaboradores (2016) avaliaram a atividade pelo
mesmo método, para extrato etanólico das folhas de P. caimito e encontrou os
seguintes resultados: para o extrato hexânico CI50 igual a 597.7 ± 9.3 µg/mL, para o
extrato etanólico 223.1 ± 2.8 µg/mL e para o extrato aquoso 36.1 ± 0.8 µg/mL.
Em ambos os estudos, o CI50 dos extratos etanólicos foram maiores do que o
valor encontrado neste trabalho, porém isso pode ter ocorrido pela diferença na
obtenção dos extratos, visto que neste trabalho utilizamos o extrato concentrado das
folhas. É importante salientar também que nestes estudos foi adotado o método de
Blois, com modificações (YILDIRIM et al., 2001), onde o DPPH está na concentração
inicial de 0,5 mg/mL.
54
O Gráfico 1 nos mostra também que a atividade do extrato aumentou à
medida que a concentração aumentou, o que indica que sua atividade foi dose-
dependente.
5.1.2 Método do Poder de Redução
O método consiste em avaliar a capacidade de extratos vegetais em reduzir o
íon ferricianeto a ferricianato, através da doação de um íon hidrogênio, que na
presença do íon férrico forma o azul da Prússia.
De forma semelhante ao teste do DPPH, na avaliação do poder Redutor, o
CE50, concentração do extrato com efetividade de 50%, foi determinado pelo
programa Excel e os gráficos e equações das retas obtidas encontram-se abaixo
(Gráficos 4, 5 e 6).
Gráfico 4: Determinação do CE50 para o extrato das folhas de Pouteria caimito.
Fonte: Elaborada pela autora.
55
Gráfico 5: Determinação do CE50 para a Quercetina.
Fonte: Elaborada pela autora.
Gráfico 6: Determinação do CE50 para o Ácido Ascórbico.
Fonte: Elaborada pela autora.
Os valores encontrados para os padrões, 3,99 µg/mL para a quercetina e 3,53
µg/mL para o ácido ascórbico, foram inferiores ao CE50 encontrado para o extrato
(28,462 µg/mL). Os padrões apresentaram valores muito inferiores, porém não
podemos desconsiderar o fato de que são substâncias puras, enquanto no extrato
temos inúmeras substâncias que podem estar atuando ou não de forma sinérgica
nesta ação.
56
Um estudo realizado por Guimarães (2016) utilizou a mesma metodologia
proposta, porém os resultados foram expressos em equivalentes de BHT. Neste
estudo, a autora avaliou extratos obtidos dos frutos de Araçá-boi, Bacaba, Curriola,
Gabiroba, Mangaba, Marmelada-bola, Marmelada-espinho, Marolo, Murici, Peki,
Y.puça, B.puça e Saborosa e os resultados se encontram na Tabela 4.
Tabela 4: Resultado das atividades antioxidantes dos frutos avaliadas pelo método
de poder de redução.
Fruto CE50 (mg de BHT/g do extrato)
Eugenia stipitata McVaugh (Araçá-boi) 8,09 Oenocarpus bacaba Mart (Bacaba) 8,15
P. ramiflora (Curriola) 4,24 Campomanesia pubescens (DC.) O. Berg
(Gabiroba) 56,96
Harconia speciosa Gomes (Mangaba) 37,56 Alibertia edulis (Rich.) A.Rich. (Marmelada bola) 5,41
Alibertia verrucosa S. Moore(Marmelada-espinho)
4,47
Annona crassiflora Mart (Marolo) 39,04 Byrsonima crassifloria L. Rich (Murici) 11,10
Caryocar brasiliense Camb. (Pequi) 4,70 Mouriri eliptica Gardner (Puçá- amarelo) 11,04
Mouriri pusa Gardner (Puçá-preto) 8,44 Selenicereus setaceus Rizz (Saborosa) 3,40
Fonte: GUIMARÃES, 2016.
5.1.3 Redução do Complexo Fosfomolibdênio
Para avaliação da redução do complexo fosfomolibdênio, foi necessária a
construção das curvas e equações das retas dos padrões ácido ascórbico e
quercetina, apresentadas nos Gráficos 7 e 8.
Gráfico 7: Curva padrão de Ácido Ascórbico.
Fonte: Elaborada pela autora.
57
Gráfico 8: Curva padrão de Quercetina.
Fonte: Elaborada pela autora.
O teste foi realizado utilizando concentração final de 0,2 mg/mL de amostra e,
substituindo a média das absorbâncias desta concentração nas curvas padrões
temos que: 0,176 ±0,003 mg de quercetina correspondem a 0,2 mg de amostra e
0,057 ± 0,001 mg de ácido ascórbico correspondem a 0,2 mg de amostra. Ou seja,
para redução do molibdênio IV a molibdênio V e formação do complexo
fosfomolibdênio é necessário uma quantidade cerca de 1,14 vezes maior de extrato
em comparação com a quercetina e 3,51 vezes maior que o ácido ascórbico para
produzir o mesmo efeito. Neste caso, o extrato apresentou então uma atividade
relevante em relação à quercetina.
Outra forma de avaliação deste método foi empregando a equação utilizada
por Negri et al. (2009) onde determinou-se a porcentagem de Atividade Antioxidante
Relativa (AAR %). Aplicando esta fórmula, observamos que a AAR % da amostra foi
de 24,453 ± 0,475% para o ácido ascórbico e 79,780 ± 1,551% para a quercetina.
Observamos então que estes resultados estão de acordo com o que foi avaliado
anteriormente, onde a amostra apresentou uma atividade antioxidante relativa
quando comparada à quercetina.
Um estudo realizado por Balestrin et al. (2008) com extrato etanólico bruto
obtido de amostras da planta Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) demonstrou
que a atividade antioxidante, avaliada pelo método de redução do complexo
fosfomolibdênio, apresentou AAR de 21,21% em relação ao ácido ascórbico e
65,30% em relação à rutina. Já Negri et al (2009) obtiveram resultado de AAR% de
58
30% em relação ao ácido ascórbico, para extrato bruto das folhas de espinheira-
santa - Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. Paula e colaboradores (2014) também
demonstrou potencial atividade para folhas e cascas do caule de Dasyphyllum
tomentosum (Spreng.) Cabrera, onde o extrato etanólico bruto das folhas apresentou
AAR de 18,08 ± 1,69% e o extrato bruto do caule 23,67 ± 1,96%, em relação ao
ácido ascórbico. Em comparação com estes estudos, podemos constatar que a P.
caimito também apresentou atividade antioxidante significativa.
5.1.4 Determinação da Peroxidação Lipídica pela Quantificação de
Malonaldeído
Para o teste de TBA, também foi obtida curva padrão de MDA e a partir desta
curva, foi possível quantificar o malonaldeído, formado pela decomposição dos
hidroperóxidos de ácidos graxos poliinsaturados. As concentrações de MDA
encontradas estão apresentadas na Tabela 5.
Tabela 5: Concentração de MDA referentes às concentrações avaliadas nos dias 0,
2 e 4.
Amostra Concentração
da Amostra (mg/mL)
Concentração de MDA
Dia 0 Dia 2 Dia 4
Extrato de Pouteria caimito
0,075 0,1899 2,5119 3,0616 0,15 0,1504 1,1266 2,0853 0,3 0,4274 0,6781 0,8804
Ácido Ascórbico 0,075 0,2383 1,5488 2,1381 0,15 0,2296 0,9024 1,1706 0,3 0,3614 0,7836 0,6254
Quercetina 0,075 0,4406 0,3614 0,2383 0,15 0,2383 0,2471 0,1679 0,3 0,3263 0,2647 0,1504
Controle Negativo ----- 0,4143 1,5048 3,3166
Fonte: Elaborada pela autora.
A avaliação de peroxidação lipídica é realizada pela detecção de seus
derivados liporeróxidos, por meio de substâncias que reagem com o ácido
tiobarbitúrico, como o malonaldeído, produzindo uma base de Shiff de coloração
rosa (FERREIRA et al., 1997). Para uma melhor visualização do resultado, foi
construído o Gráfico 9 onde comparamos as concentrações de MDA encontradas
para o extrato e para os padrões utilizados. Como podemos observar, durante os
dias ocorre aumento da concentração de MDA devido à oxidação e isso ocorre para
todas as concentrações e amostras. Além disso, quando comparamos ao controle
negativo, que representa oxidação total, conseguimos notar que o extrato teve ação
59
antioxidante, pois as concentrações de MDA foram inferiores. A concentração de 0,3
mg/mL da amostra também apresentou resultado significativo, quando comparada à
mesma concentração de ácido ascórbico.
Gráfico 10: Estudo comparativo correlacionando concentração das amostras versus
concentração de Malonaldeído formado, nos dias 0, 2 e 4.
Fonte: Elaborada pela autora.
60
5.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE POLIFENÓIS E FLAVONOIDES
A determinação do conteúdo de polifenois e flavonoides é essencial, visto que
essas substâncias relacionam-se diretamente com as atividades avaliadas. O
método utilizado para determinação do conteúdo de flavonoides é simples e rápido.
Nesta reação, o íon alumínio complexa-se com as moléculas de flavonoides,
formando um complexo estável de coloração “amarelada”. Quanto maior for a
concentração de flavonoides presentes, maior será a intensidade da cor (MABRY et
al., 1970). A quantidade de flavonoides foi igual a 3,32 mg/g equivalente à rutina e o
conteúdo de fenóis totais igual a 200,9 mg/g equivalente ao ácido tânico.
5.3 ESTUDO DA VIABILIDADE CELULAR E DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
5.3.1 Viabilidade celular
A viabilidade celular foi realizada para analisar como a cultura de células da
linhagem de macrófagos murino RAW 264.7 se comporta na presença do extrato
etanólico de Pouteria caimito em diferentes concentrações, nas quais conseguimos
avaliar a citotoxidade in vitro da amostra. Esta linhagem representa um modelo de
macrófagos murinos altamente responsivos a estímulos inflamatórios, o que a torna
excelente para investigar drogas anti-inflamatórias e avaliar inibidores de vias de
sinalização.
No Gráfico 10, estão apresentados os resultados da viabilidade celular versus
concentração do extrato. As células tratadas com DMSO 0,5% foram utilizadas como
controle de viabilidade celular. A partir disso, observou-se que o extrato em todas as
concentrações estimulou a proliferação celular. Desta forma, o extrato não
apresentou toxidez significativa nas concentrações testadas.
61
Gráfico 10: Viabilidade celular versus concentração do extrato.
Fonte: Elaborada pela autora.
5.3.2 Atividade anti-inflamatória pelo método de dosagem de óxido nítrico
Para determinar o teor de óxido nítrico (NO) resultante do processo
inflamatório, inicialmente foi construída uma curva padrão de nitrito de sódio com
objetivo de estimar a concentração de NO das amostras. A análise de covariância
(ANOVA) foi realizada e não apresentou diferença significativa para o intervalo de
confiança de 95% (p<0,05).
No Gráfico 11 são apresentadas as dosagens de NO do grupo de células
controle (Basal), do grupo de células que foram estimuladas com LPS derivado de E.
coli (LPS) e dos grupos de células estimuladas com LPS e tratadas com solução do
extrato etanólico de P. caimito nas concentrações de 25, 50, 75 e 100 µg/mL. A
quantidade calculada de NO na célula basal foi de 2,65 ± 1,03 µM. O grupo de
células estimulado com LPS apresentou 20,39 ± 0,34 µM de NO. Em todas as
concentrações testadas, houve redução de NO, sendo que a menor concentração,
100 µg/mL, apresentou maior diminuição do NO celular (14,09 ± 0,7 µM). Com este
estudo conseguimos verificar que o extrato influenciou na redução da liberação de
óxido nítrico, minimizando a inflamação.
62
Gráfico 11: Dosagem de óxido nítrico versus concentração do extrato.
Basal
25µg
/mL
50µg
/mL
75µg
/mL
100µg
/mL
LP
S
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5N
O (
µM
)
2 5 µ g /m L
5 0 µ g /m L
7 5 µ g /m L
1 0 0 µ g /m L
B a sa l
L P S
Fonte: Elaborada pela autora.
5.4 DETERMINAÇÃO DO FPS IN VITRO PELO MÉTODO DE MANSUR (1986)
Na avaliação da fotoproteção, através do Método de Mansur, foram
calculados os FPSs das concentrações do extrato e do padrão utilizado,
apresentados na Tabela 6 e, à partir destes valores, foram criados gráficos que
correlacionam o FPS com as concentrações das amostras (GRÁFICOS 12 e 13).
Além disso, para a concentração de 200 µg/mL, que apresentou maior FPS, foi feita
uma varredura na faixa de 200 a 400 nm, com intervalos de 2 nm, para avaliar em
qual absorbância o extrato apresentou maior absorção da radiação, conforme o
Gráfico 14.
Como podemos notar a amostra não apresentou FPS significativo, quando
comparada aos filtros solares empregados. Isso ocorre pois os filtros se encontram
na forma pura e, como avaliado na varredura, a amostra do extrato apresenta
absorção máxima no comprimento de onda de 230 nm, fora da faixa avaliada pelo
método.
Tabela 6: Relação entre a concentração e o FPS das amostras analisadas.
Concentrações (µg/mL) FPS do extrato de Pouteria caimito Filtros
0,2 0,0275 ± 0,005 0,067 ± 0,010
2 0,144 ± 0,031 0,558 ± 0,007
63
20 0,625 ± 0,009 4,394 ± 0,199
50 1,427 ± 0,046 10,465 ± 0,121
100 2,817 ± 0,131 20,825 ± 0,922
200 5,550 ± 0,139 27,696 ± 0,136
Fonte: Elaborada pela autora.
Gráfico 12: Correlação entre o FPS e a concentração da amostra do extrato
etanólico das folhas de P. caimito.
Fonte: Elaborada pela autora.
Gráfico 13: Correlação entre o FPS e a concentração dos filtros.
Fonte: Elaborada pela autora.
64
Gráfico 14: Avaliação da absorção da radiação nos comprimentos de onda de 200 a
400nm do extrato etanólico de P. caimito na concentração de 0,2 mg/mL.
Fonte: Elaborada pela autora.
5.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
No que tange à determinação da Concentração Inibitória Mínima, a Tabela 7
apresenta os valores de MIC encontrados. De acordo com Fabry e colaboradores
(1998), para que um extrato seja considerado como potencialmente útil na
terapêutica o valor do CIM deve ser inferior a 8 mg/mL. Segundo esta classificação,
podemos considerar então que o extrato foi um forte inibidor para Klebsiella
pneumoniaea e Staphilococcus epidermidis. Para as demais bactérias, não podemos
considerar o extrato como inibidor do crescimento, visto que não avaliamos o
crescimento destes microorganismos em concentrações maiores de extrato.
Tabela 7: Concentração Inibitória Mínima.
Staphylococcus aureus
Staphilococcus epidermidis
Salmonella tiphymuriun
Escherichia coli
Klebsiela pneumoniaea
MIC > 900 µg/mL 7,03 µg/mL > 900 µg/mL > 900 µg/mL > 450 µg/mL
Fonte: Elaborada pela autora.
Um estudo realizado por Nogueira (2012) com P. torta e P. ramiflora,
identificou que o extrato de P. torta inibiu o crescimento das cepas de S. aureus, B.
subtilis e E. coli, enquanto as cepas de S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa,
S. setubal e C. albicans foram mais sensíveis frente ao extrato de P. ramiflora. Neste
estudo notamos que plantas do gênero possuem atividade.
65
6 CONCLUSÃO
À partir dos testes realizados, podemos concluir que a Pouteria caimito (Ruiz
& Pav.) Radlk apresentou atividade antioxidante em todos os métodos, porém nos
métodos de redução do complexo fosfomolibdênio e determinação da peroxidação
lipídica pela quantificação de malonaldeído os resultados foram mais relevantes.
Isso ressalta ainda mais a importância da realização de diferentes metodologias
para avaliação da atividade antioxidante, visto que os antioxidantes podem atuar de
diferentes formas.
No que tange a avaliação da atividade antimicrobiana, o extrato se mostrou
promissor na inibição do crescimento de Klebsiela pneumoniae e Staphylococcus
epidermidis.
De acordo com os resultados da atividade citotóxica, podemos notar que o
extrato da planta não apresentou atividade citotóxica, o que torna o seu uso mais
seguro. Já na avaliação da atividade anti-inflamatória, o extrato se mostrou
promissor na redução da produção de óxido nítrico.
Com relação à atividade fotoprotetora, o extrato apresentou FPS significativo
na concentração de 0,2 mg/mL e estudos avaliando o FPS do extrato em presença
de outros filtros para avaliação de uma possível atividade sinérgica são
recomendados.
Ressaltamos também que todas essas atividades podem estar relacionadas
com a alta concentração de compostos fenólicos da amostra, que representaram
cerca de 20% do total de compostos presentes no extrato.
Por fim, é importante salientar que os extratos são misturas complexas
compostas por várias substâncias que podem ou não agir sinergicamente nas
atividades farmacológicas avaliadas. Sugerimos, então, estudos multidisciplinares
mais aprofundados sobre estas atividades, bem como uma possível separação das
substâncias do extrato para avaliação de seriam responsáveis pelos efeitos
apresentados.
66
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