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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Dissertação
Identificação de sequências homólogas de aquaporinas
no genoma de aveia cultivar Barbarasul
Carla Ferreira Silveira
Pelotas, 2011
1
Carla Ferreira Silveira
Identificação de sequências homólogas de aquaporinas no
genoma de aveia cultivar Barbarasul
Orientador: Antonio Costa de Oliveira, PhD.
Co-orientadora: Ana Lúcia Soares Chaves, PhD.
Pelotas, 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Biotecnologia vegetal).
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Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
S587i Silveira, Carla Ferreira
Identificação de sequências homólogas de aquaporinas no
genoma de aveia cultivar Barbarasul / Carla Ferreira Silveira ; orientador Antonio Costa de Oliveira; co-orientador Ana Lúcia Soares Chaves. - Pelotas,2011.-52f. : il..- Dissertação (Mestrado) –Área de conhecimento em Biotecnologia Vegetal. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Instituto de Biologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2011.
1.Avena sativa 2.Água 3.Pós-genômica 4.Genômica
comparativa I.Oliveira, Antonio Costa de (orientador) II .Título. CDD 633.11
3
Banca Examinadora:
Antonio Costa de Oliveira, PhD. – FAEM/UFPel (presidente)
Ana Lúcia Soares Chaves, PhD. – CCQFAL/UFPel
Beatriz Helena Gomes Rocha, Dra. – IB/UFPel
Fabiana Roos Nora, PhD. – CDTec/UFPel
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Aos meus pais João Carlos Silveira e Mara Regina Ferreira Silveira.
Ao meu irmão Rodrigo Ferreira Silveira.
A minha avó Palmira Lopes Ferreira (in memorium).
DedicoDedicoDedicoDedico
5
Agradecimentos
A Deus, pela vida, saúde e proteção.
Ao professor Antonio Costa de Oliveira pela orientação, oportunidade e
confiança.
A professora Ana Lúcia Soares Chaves pela co-orientação, pelas conversas,
conselhos, experiência e conhecimentos transmitidos, pela confiança depositada e
principalmente pela amizade.
A Dra. Fabiana Roos Nora e ao professor Luciano Carlos da Maia pela
disponibilidade e auxílio durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas e amigos do LGF, Adriana Bresolin, Camila Pegoraro, Claudete
Mistura, Daniel Farias, Felipe Victoria, Gabriela de Magalhães da Fonseca, Glacy
Jaqueline da Silva, Juliana Castelo Branco, Lara Isys Dias, Maraisa Crestani,
Naciele Marini, Renata Ahlert, Sydney Kavalco, Taciane Finatto, Tatiane Souza,
Thaís Hagemann e Viviane Kopp da Luz, pelos agradáveis momentos de
convivência e troca de experiências.
Aos bolsistas de iniciação científica e estagiários do LGF.
Ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia/CDTec-UFPel, pela
oportunidade de realização do curso.
A CAPES, pela viabilização financeira deste projeto e concessão da bolsa de
estudos.
A minha família pelo apoio recebido desde a graduação e durante o curso de
pós-graduação.
Por fim, agradeço a todos aqueles que de alguma maneira contribuíram para
a realização deste trabalho.
MUITO OBRIGADA!
6
Resumo
SILVEIRA, CARLA FERREIRA. Identificação de sequências homólogas de aquaporinas no genoma de aveia cultivar Barbarasul. 2011. 52f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A aveia (Avena sativa L.) é um cereal de inverno utilizado tanto para a alimentação
humana quanto animal, apresentando uma grande importância no cenário mundial.
Na era pós-genômica novos genomas sequenciados podem ser utilizados para
inferir funções de organismos a partir do conhecimento de outros sistemas. Neste
trabalho foi aplicada essa abordagem à análise de genes da familia das aquaporinas
em aveia. As aquaporinas são proteínas intrínsecas de membrana (MIP) que têm
sido caracterizadas como facilitadoras do fluxo de água. São também conhecidas
como canais de água, glicerol facilitadores e aquagliceroporinas. Dados recentes
sugerem que elas facilitam a circulação de outros metabólitos de baixo peso
molecular. A presença dos genes que codificam essas proteínas é de suma
importância para o desenvolvimento e adaptação das plantas, contudo, até hoje não
existiam estudos relatando a identificação de genes de aquaporinas no genoma da
aveia. O sequenciamento e caracterização in silico das sequências obtidas neste
trabalho propõem a presença de genes que codificam prováveis aquaporinas. Foram
identificadas duas sequências como prováveis aquaporinas presentes no genoma da
aveia. Considerando o número de genes de aquaporinas presentes no genoma do
arroz, Arabidopsis, milho e trigo e a complexidade de seu genoma poliplóide, estima-
se que a aveia possua mais cópias desses genes. Tendo em vista os crescentes
problemas de alagamento e/ou seca, a necessidade de cultivo em áreas afetadas
pela salinidade, e o comprovado papel das MIPs na resposta das plantas a
estresses relacionados com a disponibilidade de água, as investigações desses
genes em aveia são essenciais. Contudo um número maior desses genes poderão
ser identificados e caracterizados, esse estudo representa uma etapa importante
para sua caracterização.
Palavras-chave: avena sativa. água. pós-genômica. genômica comparativa.
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Abstract
SILVEIRA, CARLA FERREIRA. Identification of homologous sequences of aquaporins in oat genome cv. Barbarasul. 2011. 52f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Oats (Avena sativa L.) are a winter cereal used for both humans and livestock, giving
a great importance on the world stage. In the post-genomic era new sequenced
genomes can be used to derive functions of organisms from the knowledge of these
systems. In this work were apply this approach to the analysis of gene family of
aquaporins in oats. The aquaporins are major intrinsic proteins (MIP) that have been
characterized as facilitating the water flow. They are also known as water channels,
glycerol facilitators and aquaglyceroporins, recent data suggest that they facilitate the
movement of other molecular low weight metabolites. The presence of these genes is
importance for the development and adaptation of plants, however, until now there
are not studies reporting the identification of aquaporins in the oat genome. In this
report we identified two sequences identified as potential aquaporins present in the
genome of oat. Considering the number of aquaporin genes present in genome of
rice, Arabidopsis, maize and wheat and the complexity of its polyploid genome, it is
estimated that oats may have around 20 or more copies of these genes in each
genome. Given the growing problems of flooding and drought, the need for cultivation
in areas affected by salinity and the proven role of MIPs on plant response to
stresses related to water availability, the investigations of these genes are essential
in oats too. However a greater number of these genes can be identified in the future,
this study was an important step in its characterization.
Key words: avena sativa. water. post-genomic. comparative genomic.
8
Lista de Figuras
Figura 1 - Figura 1 - Aquaporina: modelo ampulheta. O modelo mostra os
seis domínios alfa-hélice transmembrana (1-6) e os loops B (hemiporo-1) e E
(hemiporo-2) contendo os motivos NPA (Asn - Pro - Ala) altamente
conservados que formam uma via única aquosa das AQPs através das
membranas. (a) Topologia geral. (b) Topologia do poro formado. Adaptado de
Jung et al. (1994) e Agre et al. (2002)......................................................................
17
Figura 2 - Figura 2- Modelo topológico da ZmPIP1;2 de milho (Zea mays). O
modelo mostra os seis domínios alfa-hélices transmembrana (TM1-TM6) e os
loops B e E (HB e HE). Resíduos aminoacídicos em amarelo circulados em
vermelho são altamente conservados em ZmAQPs. Adaptado de Chaumont
et al. (2005).................................................................................................................
20
Figura 3 - Figura 3 – Fotografia do gel dos fragmentos homólogos de
aquaporinas amplificados por PCR a partir do genoma de aveia cv.
Barbarasul. Marcador - 1 Kb Plus DNA Ladder. 01 - AsF1/AsR1; 02 -
AsF2/AsR3.................................................................................................................
38
Figura 4 - Figura 4 - Árvore filogenética das sequências parciais de
aquaporinas de arroz, milho, Arabidopsis, trigo e contigs de aveia, obtida a
partir de sequencias de DNA, através do método de neighbor-joining. At
(Arabidopsis thaliana), Os (Oryza sativa), Ta (Triticum aestivum), Zm (Zea
mays), PIP (plasma membrane intrinsic proteins), TIP (tonoplast intrinsic
proteins), NIP (Nodulin-26-like intrinsic proteins), e SIP (small basic intrinsic
proteins).....................................................................................................................
39
Figura 5 - Árvore filogenética das sequências parciais de aquaporinas da
subfamília PIP de arroz, milho, Arabidopsis, trigo e contigs de aveia, obtida a
partir de sequencias de DNA, através de inferência bayesiana. At
(Arabidopsis thaliana), Os (Oryza sativa), Ta (Triticum aestivum), Zm (Zea
mays), PIP (plasma membrane intrinsic proteins), TIP (tonoplast intrinsic
proteins), NIP (Nodulin-26-like intrinsic proteins), e SIP (small basic intrinsic
proteins).....................................................................................................................
41
Figura 6 - Figura 6. Alinhamento entre os genes de aquaporinas de trigo e
9
fragmentos amplificados a partir do gDNA de aveia (contigs - potenciais
aquaporinas), indicando a presença/aunsência dos motivos NPA circuladas
em vermelho. (a) Alinhamento entre TaPIP2-5 e cgf contigAs3. (b)
Alinhamento entre TaPIP1-8 e cgf contigAs2.........................................................
43
10
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Primers utilizados para a amplificação das sequencias
homólogas de aquaprinas a partir do gDNA de aveia por PCR.....................
36
Tabela 2 - ORF, posição, tamanho e Blastp dos potenciais genes de
aquaporinas em aveia........................................................................................
38
Tabela 3 - Analíse in silico das potenciais aquaporinas presentes no
genoma de aveia, identificadas neste estudo.................................................
44
11
Lista de Abreviaturas e Siglas ABA Ácido abscísico
AQP Aquaporina
cDNA complementary Deoxyribonucleic acid – ácido Desoxirribonucléico
complementar
CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio
DNA Deoxyribonucleic acid – ácido Desoxirribonucleico
EST Expressed Sequence Tag – Etiquetas de Sequencias Expressas
gDNA genomic Deoxyribonucleic acid – ácido Desoxirribonucléico genômico
CGF Centro de Genômica e Fitomelhoramento
MIP Major Intrinsic Protein – Proteínas Intrínsecas de Membrana
NCBI National Center for Biotechnology Information
NIP Nodulin-26-like Intrinsic Proteins
NPA Aspargina-Prolina-Alanina
ORF Open Reading Frame – Fase Aberta de Leitura
PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da Polimerase
pI Ponto isoelétrico
PIP Plasma Membrane Intrinsic Proteins
RNA Ribonucleic acid – ácido Ribonucleico
SIP Small Basic Intrinsic Proteins
TIGR The Institute for Genomic Research Rice Genome Annotation project
TIP Tonoplast Intrinsic Proteins
TMH Transmembrane Helix – Hélice Transmenbrana
12
Sumário
Agradecimentos.................................................................................................. 5
Resumo................................................................................................................ 6
Abstract............................................................................................................... 7
Lista de Figuras.................................................................................................. 8
Lista de Tabelas.................................................................................................. 10
Lista de Abreviaturas e Siglas........................................................................... 11
1. Introdução geral.............................................................................................. 13
2. Capítulo I. Revisão bibliográfica................................................................... 15
2.1 Avena sativa L. ............................................................................................. 15
2.2 Transporte de água em plantas................................................................... 16
2.3 Aquaporinas.................................................................................................. 17
2.3.1 A sub família PIP ....................................................................................... 19
2.3.2 A sub família TIP........................................................................................ 21
2.3.3 A sub família NIP........................................................................................ 22
2.3.4 A sub família SIP........................................................................................ 22
2.4 Regulação da atividade das aquaporinas.................................................. 23
2.5 Referências ................................................................................................... 24
3. Capítulo II. Identificação de sequências homólogas de aquaporinas no
genoma da Avena sativa cultivar Barbarasul..................................................
32
3.1 Introdução..................................................................................................... 32
3.2 Material e métodos....................................................................................... 34
3.3 Resultados e discussão............................................................................... 37
3.4 Conclusões.................................................................................................... 44
3.5 Referências.................................................................................................... 45
4. Considerações Finais..................................................................................... 49
5. Referências...................................................................................................... 50
Apêndice 1........................................................................................................... 51
13
1. INTRODUÇÃO GERAL
A água é uma das substâncias essenciais à vida, constitui o meio onde
moléculas movimentam-se dentro das células e entre elas, influenciando
grandemente a estrutura de proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e outros
constituintes celulares. A água forma o ambiente onde ocorre a maioria das reações
bioquímicas celulares e participa diretamente em muitas reações químicas
essenciais (TAIZ; ZEIGER, 2006).
As plantas absorvem e perdem água continuamente, além disso ela é o
solvente que permite que gases, minerais e outras substâncias possam penetrar nas
células e fluir entre as mesmas e entre os vários órgãos do vegetal. De todos os
recursos de que a planta necessita para crescer e funcionar, a água é o mais
abundante e o mais limitante para a produtividade agrícola. Assim, a compreensão a
respeito de absorção e perda de água pelas plantas é muito importante. Com a
descoberta da existência das aquaporinas explicaram-se as taxas de movimento de
água observadas através das membranas, uma vez que a água difunde-se mais
rapidamente através desses canais do que pela dupla camada lipídica (MAUREL,
1997; AGRE; KOZONO, 2003).
Aquaporinas, um dos reguladores de estresses abióticos em plantas, fazem
parte de uma superfamília de proteínas integrais de membrana, denominada MIP
(major intrinsic proteins), que está subdividida em quatro subfamílias com base na
similaridade das suas sequências: TIPs (tonoplast intrinsic proteins), abundantes na
membrana vacuolar; PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), abundantes em
membranas plasmáticas; NIPs (Nodulin-26-like intrinsic proteins), presentes em
membranas de nódulos de fixação simbiótica de nitrogênio e SIPs (small basic
intrinsic proteins), presentes na membrana do retículo endoplasmático (LUU;
MAUREL, 2005; KALDENHOFF; FISHER, 2006).
A principal função das aquaporinas é facilitar o transporte de água, mas esses
canais também são utilizados para o transporte de glicerol, gás carbônico e uréia
(KALDENHOFF; FISHER, 2006). A regulação dos genes que codificam aquaporinas
pode ocorrer em nível transcricional, por hormônios (ABA e giberelina) e estresses
abióticos (frio, seca, salinidade e luz) ou pós-traducional, por fosforilação,
glicosilação e proteólise (JOHANSSON et al., 2000).
14
Contudo, essas proteínas que são de vital importância para organismos vivos
ainda não foram estudadas em aveia, um cereal que tem importante papel no
sistema de produção e integração lavoura/pecuária do sul do Brasil. Esta é cultivada
em estação fria para produção de grãos, forragem e cobertura de solo, e teve
aumento significativo em sua demanda tanto para consumo humano como para
ração animal (GUTKOSKI, 2000). Destaca-se a cultivar Barbarasul utilizada nesse
estudo. A cultivar de aveia branca Barbarasul, a qual foi desenvolvida pela
Universidade Federal de Pelotas, possui adaptação para cultivo na região sul do
Brasil, com excelente potencial de rendimento de grão e estatura reduzida, o que lhe
confere ótima tolerância ao acamamento (CARVALHO et al., 2009).
O conhecimento do genoma completo do arroz e a sintenia com genomas de
outras gramíneas como arroz, trigo, milho, cevada e sorgo (DEVOS; GALE, 2000),
permite que os genes correspondentes ou colineares sejam obtidos mais facilmente
na aveia, estudos comparativos já demonstraram que a colinearidade dos genes
geralmente é bem preservada entre os diferentes genomas das gramíneas
(KULEUNG et al., 2004).
A sintenia e a colinearidade encontrada nos cereais possibilita novas
oportunidades para uma transferência de informações genéticas das espécies
modelos para aquelas espécies com poucos investimentos em pesquisa genômica
ou com importância regional (VARSHNEY et al., 2005). Tal estratégia que aborda a
transferência de conhecimento será de grande importância nesse estudo, não só
para a compreensão da história evolutiva dos genes, mas também para auxiliar na
identificação de genes de aquaporinas em estudos de sintenia entre arroz (espécie
modelo para monocotiledôneas) e aveia.
Neste sentido, o presente estudo objetiva identificar em aveia genes
homólogos de aquaporinas já estudados em outras espécies, através de técnicas de
biologia molecular e bioinformática.
15
2. CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Avena sativa L.
A aveia (Avena sativa L.) é um cereal de inverno utilizado tanto para a
alimentação humana quanto animal, apresentando uma grande importância no
cenário mundial, sendo o sétimo cereal mais produzido no mundo, ficando atrás do
milho, arroz, trigo, cevada, sorgo e do milheto (FAOSTAT, 2008).
Devido às importantes propriedades nutricionais, a aveia tem evidenciado
grande destaque na alimentação humana, por apresentar em relação aos demais
cereais um teor de proteína nos grãos mais elevado, variando de 16 a 21%. Além
disso, a aveia apresenta vitaminas essenciais, minerais, ácidos graxos, antioxidantes
e fibras que a qualificam como cereal de grande importância na alimentação humana
e animal, como por exemplo, as β-glucanas, responsáveis pela redução no teor de
colesterol no sangue (LORENCETTI, 2004; BUTT et al., 2008).
No Brasil a aveia é apontada como uma das alternativas para o cultivo de
inverno, em rotação de cultivo com o trigo, na formação de pastagens de inverno,
em cultivo isolado ou consociado, para a elaboração de feno e silagem e como
adubo verde, apresentando um reconhecido efeito de recuperação e conservação do
solo (CARVALHO et al., 1987).
A aveia, pelas suas várias formas de utilização, representa uma alternativa
economicamente viável para cultivo no período de estação fria na Região Sul do
Brasil, o que pode possibilitar além de todas as vantagens já citadas, o
desenvolvimento efetivo do sistema de plantio direto na metade sul do Rio Grande
do Sul e uma nova alternativa econômica aos produtores rurais, principalmente
visando à produção de grãos para comercialização.
Apesar da importância dessa espécie, poucos investimentos no setor de
biotecnologia beneficiam estudos em aveia. Varshney et al. (2005) classificam essas
espécies como plantas órfãs e afirmam que, a transferência de conhecimentos
acumulados na genômica funcional e estrutural de espécies denominadas como
16
modelo, representa uma estratégia que a partir de investimentos menores podem
beneficiar o conhecimento genético dessas espécies e beneficiar diretamente
programas de melhoramento genético. A integração dessas informações, não é
somente útil para análise funcional de genes, numa abordagem de genômica
comparativa, pode ser uma ferramenta chave e essencial que poderá prover
melhorias na resposta aos estresses abióticos em plantas cultivadas.
2.2 Transporte de água em plantas
Os organismos vivos são compostos principalmente de água, sendo os
tecidos vegetais constituídos por cerca de 75 a 85%. A água como solvente
universal promove nas plantas a absorção de minerais dissolvidos no solo, permite o
movimento de moléculas no interior da célula e entre as células, influencia a
estrutura das moléculas e participa em reações bioquímicas (TAIZ; ZEIGER, 2006).
O fluxo celular é um processo essencial na adaptação dos organismos ao seu
ambiente. As plantas por serem organismos estáticos, para se adaptarem ao seu
ambiente e a vários fatores de estresse, como déficit hídrico, desenvolveram
mecanismos de captura de água e de sais minerais a partir das raízes (TAIZ;
ZEIGER, 2006).
A água é transportada, juntamente com os sais minerais, para toda a planta, o
fluxo da água e dos sais minerais desde o solo ao ápice da planta pode ocorrer por
difusão molecular, por fluxo de massa, ou por uma combinação destes mecanismos.
A água difunde-se porque moléculas estão em constante agitação térmica, o que
tende a eliminar as diferenças de concentração. Move-se por transporte em massa
em resposta a uma diferença de pressão, sempre que há uma rota apropriada para
movimento em massa da água. A osmose, o movimento de água através das
membranas, depende de um gradiente de energia livre da água pela membrana; na
osmose os dois tipos de gradiente, difusão e fluxo de massa, influenciam o
transporte (TAIZ; ZEIGER, 2006).
A hipótese de que o fluxo de água através de células vivas ocorreria através
de poros nas membranas, levou vários cientistas a buscarem esclarecimentos para
tal fenômeno, levando a descoberta de um número elevado de isoformas de
aquaporinas que facilita o transporte de água nas plantas (NOZAKI et al., 2008).
17
2.3 Aquaporinas
A existência de aquaporinas foi uma surpresa, pois se acreditava que a
bicamada lipídica seria suficientemente permeável a água, no entanto são comuns
em membranas de animais e relativamente abundantes em membranas vegetais.
Com a descoberta de sua existência (AGRE; KOZONO, 2003), diversos estudos em
oócitos do sapo Xenopus laevis comprovaram a presença destas proteínas na
membrana vacuolar (tonoplasto) e na membrana plasmática e sua caracterização
como canais de água em Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (MAUREL et al., 1993,
DANIELS et al., 1994). Desde então, genes que codificam aquaporinas têm sido
identificados em outras espécies vegetais, como o milho (Zea mays L.), o arroz
(Oryza sativa L.) e o trigo (Triticum aestivum L.). O aumento da permeabilidade da
Figura 1 - Aquaporina: modelo ampulheta. O modelo mostra os seis domínios
alfa-hélice transmembrana (1-6) e os loops B (hemiporo-1) e E (hemiporo-2)
contendo os motivos NPA (Asn - Pro - Ala) altamente conservados que formam uma
via única aquosa das AQPs através das membranas. (a) Topologia geral. (b)
Topologia do poro formado. Adaptado de Jung et al. (1994) e Agre et al. (2002).
Intracelular
Intracelular
Extracelular
Extracelular
Bicamada lipídica
Bicamada lipídica
Hemiporo-1 Hemiporo-2 (a)
(b)
Ampulheta
18
membrana à água após expressão heteróloga em oócitos, demonstra que
aquaporinas representam uma importante via seletiva para o fluxo da água através
das membranas (fig. 1) (CHAUMONT et al., 2001; SAKURAI et al. 2005; FORREST;
BHAVE, 2008).
Nas plantas, o transporte de água através das aquaporinas mostra-se
fundamental para os processos fisiológicos como elongação, germinação e
osmorregulação (MAUREL, 2007). As plantas diferem dos outros organismos por
expressarem um número elevado de isoformas de aquaporinas. No genoma da
Arabidopsis foram identificados 38 genes que potencialmente codificam estas
proteínas (QUIGLEY et al, 2001).
Em arroz e em milho foram identificados 33 e 36 genes, respectivamente,
enquanto que números menores foram identificados no genoma humano (13), na
bactéria E. coli (2), em nemátoides (9) e na levedura S.cerevisiae (9). A elevada
quantidade de isoformas de aquaporinas encontrada nos vegetais deve-se ao fato
destes organismos precisarem de uma absorção contínua de água durante o seu
desenvolvimento; permite também um transporte rápido e reversível de água,
exercendo assim, uma função vital quando a planta enfrenta condições adversas
como o estresse hídrico (CHAUMONT et al., 2001; JOHANSON et al., 2001;
QUIGLEY et al., 2002; CHAUMONT et al., 2005; MAUREL, 1997; SAKURAI et al.
2005). No entanto, devido à presença de um elevado número de genes codificando
diferentes isoformas de aquaporinas nos tecidos vegetais acredita-se na
possibilidade destas proteínas não serem específicas para o transporte de água
(SANTONI et al., 2000; HACHEZ et al., 2006).
As aquaporinas de plantas estão agrupadas em quatro subfamílias, de acordo
com sua localização sub-celular: PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), TIPs
(tonoplast intrinsic proteins), NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) e SIPs (small
basic intrinsic proteins). As PIPs e as TIPs são proteínas da membrana plasmática e
do tonoplasto, respectivamente, já as NIPs e as SIPs encontram-se associadas às
membranas intracelulares (CHAUMONT et al., 2001; MAUREL et al., 2002).
Estudos experimentais revelaram que elementos pertencentes às quatro
subfamílias transportam água (MAUREL et al., 1993; DANIELS et al., 1994; WEIG et
al., 1997; ISHIKAWA et al., 2005). Porém, algumas aquaporinas não são específicas
para a água, podendo realizar o transporte de moléculas pequenas e neutras, como
a formamida, o glicerol, a uréia e o CO2 (RIVERS et al., 1997; BIELA et al., 1999).
19
Outros estudos demonstraram que algumas aquaporinas vegetais podem ser
permeáveis à amônia (JAHN et al., 2004), ao boro (DORDAS et al., 2000), ao
peróxido de hidrogênio e a alcoóis de baixo peso molecular. Entretanto, outros
trabalhos sugerem que algumas aquaporinas de mamíferos, embora específicas
para a água, podem transportar íons quando expressas em oócitos de Xenopus
(TYERMAN et al., 2002; CHAUMONT et al., 2005).
2.3.1 A subfamília PIP
Aquaporinas da subfamília PIP são expressas na membrana plasmática.
Membros desta subfamília possuem peso molecular de aproximadamente 30 kDa,
ponto isoelétrico (pI) 9.0 e dividem-se em duas subclasses PIP1 e PIP2. A subclasse
PIP1 é composta por cinco isoformas (PIP1;1 a PIP1;5), e a PIP2 por oito (PIP2;1 a
PIP2;8) (JOHANSON et al., 2001; MAUREL, 2007). As aquaporinas PIP1 possuem a
porção N-terminal mais longa do que as aquaporinas PIP2 e a porção C-terminal
mais curta. Com a exceção de PIP1 de Arabidopsis, não há conhecimento de
nenhuma proteína PIP1 que seja específica para a água (CHAUMONT et al., 2000;
JOHANSSON et al., 2000; BOTS et al., 2005).
A aquaporina SoPIP1 do espinafre (Spinacia oleracea) mostrou uma baixa
atividade de transporte de água quando expressa em oócitos de Xenopus, ao
contrário do seu homólogo SoPIP2 (JOHANSSON et al., 1996; JOHANSSON et al.,
1998; TÖRNROTH-HORSEFIELD et al., 2006).
Por outro lado, estudos recentes em milho mostraram que a co-expressão das
isoformas ZmPIP1;2 (não funcional) e ZmPIP2 (funcional) resultou num aumento da
permeabilidade dos oócitos, tendo já sido demonstrada a interação física e
heteromerização entre estas proteínas (FETTER et al., 2004). Estes efeitos parecem
ser muito específicos visto que não foi observado um aumento da permeabilidade à
água quando a isoforma ZmPIP1;1, que partilha 96% de homologia com a
ZmPIP1;2, foi co-expressa com qualquer isoforma ZmPIP2. No entanto, a co-
expressão de ambas as isoformas de PIP1(ZmPIP1;2 e ZmPIP1;1) resultou num
aumento significativo da permeabilidade à água da membrana dos oócitos, o que
sugere que a aquaporina PIP1 atua de modo a induzir canais de água funcionais
(fig. 2).
20
Figura 2- Modelo topológico da ZmPIP1;2 de milho (Zea mays). O modelo
mostra os seis domínios alfa-hélices transmembrana (TM1-TM6) e os loops B e E
(HB e HE). Resíduos aminoacídicos em amarelo circulados em vermelho são
altamente conservados em ZmAQPs. Adaptado de Chaumont et al. (2005).
A interação entre as aquaporinas PIP1 (NtPIP1;1) e PIP2 (NtPIP2;1) do
tabaco (Nicotiana tabacum) resultou também num aumento da atividade de
transporte de água nos oócitos de Xenopus (MAHDIEH et al., 2008). Estes estudos
têm revelado um novo mecanismo de regulação de aquaporinas em plantas
(FETTER et al., 2004).
As aquaporinas PIPs são ubíquas e abundantes nos tecidos das plantas, mas
não existe um perfil de expressão padrão dos elementos desta subfamília de
aquaporinas. Como foi descrito, a aquaporina ZmPIP2;2 é majoritariamente
expressa em tecidos do aparelho reprodutivo enquanto a aquaporina ZmPIP2;4 é
sobretudo expressa nas raízes. ZmPIP1;3 e ZmPIP1;4 codificam proteínas idênticas
e os seus transcritos mostram uma distribuição semelhante nos tecidos (ZELAZNY
et al., 2007).
aa conservados nas ZmPIPs
aa importantes para a seletividade e formação do poro
aa diferentes presentes em ZmPIP1;1
citoplasma
21
2.3.2 A subfamília TIP
As aquaporinas TIP (tonoplast intrinsic proteins), como o nome sugere, são
expressas no tonoplasto, contudo, ainda se especula que possam ser expressas em
outros locais. Os membros da subfamília TIP possuem um peso molecular entre 25 e
28 kDa e ponto isoelétrico 6.0 (DELROT et al., 2001). No milho, em Arabidopsis e no
arroz, os membros desta subfamília encontram-se agrupados em cinco subclasses,
TIP1 a TIP5. A isoforma AtTIP1;1 (γ-TIP) é altamente específica para o transporte de
água, no entanto outras isoformas facilitam o transporte de glicerol, uréia ou CO2,
além de água (RIVERS et al., 1997; DEAN et al., 1999; GERBEAU et al., 1999;
GUENTHER; ROBERTS, 2000; WEIG; JAKOB, 2000; LIU et al., 2003; UEHLEIN et
al., 2003). Em milho, a aquaporina ZmTIP1;1 é a mais expressa, em níveis
equivalentes à AtTIP1;1 de Arabidopsis (BARRIEU et al., 1998; CHAUMONT et al.,
1998).
Os membros da subclasse TIP4 também transportam solutos, como
demonstrado no tabaco onde a aquaporina NtTIPa é capaz de transportar uréia e
glicerol (GERBEAU et al.,1999). A subclasse TIP5 inclui uma proteína de
Arabidopsis ainda não caracterizada e duas proteínas de milho e cevada (Hordeum
vulgare) (CHAUMONT et al., 2001). De acordo com os trabalhos de Kammerloher et
al. (1994) e de outros publicados posteriormente (CHAUMONT et al., 2000;
JOHANSSON et al., 2000; CHAUMONT et al., 2001; JOHANSON et al., 2001), a
subfamília PIP difere da subfamília TIP por possuir na porção N-terminal
aminoácidos adicionais. Contudo, existe um elevado número de posições de
aminoácidos (142, aproximadamente 50%) que são conservados em todas as
aquaporinas PIP (CHAUMONT et al., 2001).
A inexistência de um perfil de expressão padrão também é evidente nesta
subfamília, podendo, por exemplo, a aquaporina AtTIP2 ser expressa no sistema
vascular da parte aérea e em raízes (DANIELS et al., 1996), a AtTIP3 nas sementes
e nos cotilédones (JOHANSON et al., 2001) e a γ-TIP em raízes e nas folhas
(MAUREL, 1997).
22
2.3.3 A subfamília NIP
A denominação NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) advém da similaridade
destas aquaporinas com a nodulina 26 da soja (Glycine max L.). Os membros desta
subfamília são encontrados em plantas leguminosas e não leguminosas e são
estrutural e funcionalmente diferentes das outras aquaporinas, por serem
permeáveis a uma vasta variedade de pequenos solutos, como o glicerol e a uréia.
Devido à sua reduzida especificidade, as aquaporinas NIP são consideradas
aquagliceroporinas de plantas (WALLACE et al., 2006; MAUREL, 2007). A sua
expressão é mais baixa do que a das PIPs e das TIPs e está usualmente associada
a células e órgãos especializados, como por exemplo, os nódulos radiculares das
leguminosas onde ocorre a fixação de nitrogênio.
As NIPs têm sido encontradas na membrana plasmática e em membranas
intracelulares (ALEXANDERSSON et al., 2005; WALLACE et al., 2006; MAUREL,
2007). As aquaporinas NIP podem ser divididas em dois grupos segundo a estrutura
dos seus canais seletivos Ar/R (WALLACE; ROBERTS, 2004), NIP1, com seis
membros em Arabidopsis, são permeáveis à água e ao glicerol e NIP2, que
possuem um poro de maior diâmetro do que as NIP1 e são permeáveis a solutos
maiores, como a uréia. Tem sido mostrado que a aquaporina de Arabidopsis
AtNIP5;1 transporta boro em raízes e, mais recentemente, foi mostrado que é capaz
de transportar silício como um mecanismo de defesa em resposta a diversos fatores
de estresse biótico e abiótico (MA et al., 2006; TAKANO et al.,2006).
A subfamília NIP é representada por quatro membros no milho. Uma delas é a
ZmNIP1;1, capaz de transportar glicerol (RIVERS et al., 1997; DEAN et al., 1999;
WEIG; JAKOB, 2000). As aquaporinas NIP e PIP são as proteínas mais longas,
contudo as NIPs diferem das PIPs principalmente por possuírem uma porção C-
terminal mais longa (CHAUMONT et al., 2001).
2.3.4 A subfamília SIP
As SIPs constituem uma nova e pequena subfamília descoberta por Johanson
e Gustavsson (2002), com base em estudos filogenéticos. Os membros desta
subfamília, subdividida em dois grupos, SIP1 e SIP2, possuem pI muito elevado e
23
sequências aminoacídicas altamente divergentes, mostrando apenas 16% a 20% de
semelhança com as outras três subfamílias. As principais diferenças dizem respeito
ao primeiro motivo NPA da hélice curta do loop B (HB), encontrado em todas as
PIPs, TIPs e na maioria das NIPs, que é substituído pelos motivos NPT e NPC no
grupo SIP1 e pelo motivo NPL no grupo SIP2 (CHAUMONT et al., 2001) e ao canal
seletivo Ar/R (BANSAL; SANKARARAMAKRISHNAN, 2007).
Diversos experimetos têm demonstrado que os motivos conservados NPA,
bem como o canal seletivo Ar/R, funcionam como locais seletivos para o movimento
da água e de pequenos solutos (CHAKRABARTI et al., 2004). Ishikawa et al. (2005)
demonstraram que as três SIPs de Arabidopsis estão localizadas no retículo
endoplasmático e que AtSIP1;1 e AtSIP1;2, ao contrário de AtSIP2;1, funcionam
como canais de água.
2.4 Regulação da atividade das aquaporinas
A regulação da permeabilidade da membrana biológica à água é um processo
muito complexo. De modo geral, pode ocorrer por mecanismos de controle rápido
que afetam diretamente a atividade das aquaporinas, ou ainda por respostas
adaptativas mais lentas em nível da expressão gênica. Situações como anoxia,
estresse salino e osmótico e modificação da disponibilidade da água podem
determinar a abertura e o fechamento das aquaporinas e representar uma via de
resposta rápida (JOHANSON et al., 2001; BOURSIAC et al., 2005; CHAUMONT et
al., 2005).
A atividade das aquaporinas pode ainda ser modificada por metais pesados,
disponibilidade de nutrientes, temperatura e espécies reativas de oxigênio
(PRESTON et al., 1993; DANIELS et al., 1996; ZHANG; TYERMAN, 1999;
NIEMIETZ; TYERMAN, 2002). A abertura das aquaporinas pode também ser
controlada por forças de tensão/coesão exercidas na presença de elevadas
concentrações de solutos osmoticamente ativos (YE et al., 2004). Em geral, as
aquaporinas são inibidas por compostos de mercúrio, que atuam sobre o aminoácido
cisteína (DANIELS et al., 1996), porém, em algumas proteínas o mercúrio funciona
como ativador (CHRISPEELS; MAUREL, 1994).
Recentemente foi estabelecida a estrutura detalhada da aquaporina SoPIP do
espinafre e elucidados os mecanismos de abertura e fechamento do canal
24
(TÖRNROTH-HORSEFIELD et al., 2006). Esses autores comprovaram que o
mecanismo do fechamento da aquaporina é controlado por desfosforilação da
proteína e pela formação de associações hidrofóbicas entre aminoácidos. A
desfosforilação ocorre em dois resíduos de Ser em locais de fosforilação consenso,
na Ser 115 localizada do loop B e na Ser 274 do loop D (região C-terminal), onde se
encontra também localizado o resíduo chave para este mecanismo, a Leu 197. Este
resíduo insere-se junto da entrada do canal e, em combinação com os resíduos His
99, Val 104 e Leu 108, cria uma barreira hidrofóbica que bloqueia o poro.
Ao contrário do mecanismo de fechamento, o mecanismo de abertura da
aquaporina no espinafre é controlado pela fosforilação da proteína e dissociação das
interações hidrofóbicas entre aminoácidos. A fosforilação ocorre nos resíduos de
fosforilação consenso citados anteriormente, Ser 115 e Ser 274. A abertura parcial
da aquaporina, devido ao deslocamento do loop D após a fosforilação dos resíduos
de Ser, conduz à dissociação da interação hidrofóbica entre os resíduos Leu 197,
His 99, Val 104 e Leu 108, permitindo o movimento da água (TÖRNROTH-
HORSEFIELD et al., 2006).
Estudos de expressão gênica por microarranjos em Arabidopsis, arroz e
cevada mostraram que a transcrição dos genes de aquaporinas pode ser modificada
por estímulos hormonais (giberelina e ABA), temperaturas baixas, déficit de água,
estresse salino, anoxia, carência mineral e pela luz (MAUREL et al., 2002). Um dos
aspectos interessantes da regulação das aquaporinas de plantas consiste no efeito
da luz. Em protoplastos de Samanea saman foi observada uma mudança da
permeabilidade à água durante o dia, correlacionada com a expressão de gene PIP2
(MOSHELION et al., 2002). Adicionalmente, a expressão da maioria dos genes que
codificam as aquaporinas é sub-regulada pela carência do íon cálcio ou pela
exposição à elevada salinidade (MAUREL et al., 2002; LUU; MAUREL, 2005). No
entanto, não existe um padrão geral de regulação das aquaporinas por expressão
gênica.
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32
3. CAPÍTULO II
IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS DE AQUAPORINAS NO
GENOMA DE AVENA SATIVA L. CULTIVAR BARBARASUL
3.1 INTRODUÇÃO
A aveia (Avena sativa L.) é um cereal de inverno utilizado tanto para a
alimentação humana quanto animal, apresentando uma grande importância no
cenário mundial, uma vez que é o sétimo cereal mais produzido no mundo perdendo
em produção somente para o milho, o arroz, o trigo, a cevada, o sorgo e o milheto
(FAOSTAT, 2008). No Brasil a aveia é apontada como uma das alternativas para o
cultivo de inverno, em rotação de cultivo com o trigo, na formação de pastagens de
inverno, em cultivo isolado ou consorciado, para a elaboração de feno e silagem e
como adubo verde, apresentando um reconhecido efeito de recuperação e
conservação do solo (CARVALHO et al., 1987)
A cultivar de aveia branca Barbarasul, alvo do presente estudo, foi
desenvolvida pela Universidade Federal de Pelotas, possui adaptação para cultivo
na região sul do Brasil, com excelente potencial de rendimento de grão e estatura
reduzida, o que lhe confere ótima tolerância ao acamamento (CARVALHO et al.
2009). Apesar da importância dessa espécie, poucos investimentos no setor de
biotecnologia beneficiam estudos em aveia. Varshney et al. (2005) classificam essas
espécies como plantas órfãs e afirmam que a transferência de conhecimentos
acumulados na genômica funcional e estrutural de espécies denominadas como
modelo, representa uma estratégia que a partir de investimentos menores podem
beneficiar o conhecimento genético dessas espécies e beneficiar diretamente
programas de melhoramento genético. A integração dessas informações, não é
somente útil para análise funcional de genes, mais numa abordagem de genômica
comparativa, pode ser uma ferramenta chave e essencial que poderá prover
melhorias na resposta aos estresses abióticos em plantas cultivadas.
Aquaporinas são proteínas transmembrana que funcionam como canais, para
facilitar e regular a permeabilidade de moléculas de água através das membranas
33
biológicas (MAUREL et al., 2008). MIPs (Major Intrinsic Proteins) consitem
tipicamente de seis hélices transmembrana (TMHs; H1 - H6), ligadas por cinco loops
(loops A - E) e dois motivos NPA (Asn - Pro - Ala) altamente conservados
(FORREST; BHAVE, 2007). Estas proteínas, que possuem importância vital para
organismos vivos, até o presente trabalho não foram estudadas em aveia. Elas estão
agrupadas em quatro subfamílias de acordo com sua localização sub-celular: PIPs
(plasma membrane intrinsic proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs
(nodulin26-like intrinsic proteins) e SIPs (small basic intrinsic proteins). As PIPs e as
TIPs são proteínas da membrana plasmática e do tonoplasto, respectivamente, já as
NIPs e as SIPs encontram-se associadas às membranas intracelulares
(CHAUMONT et al., 2001; MAUREL et al., 2002).
Com a descoberta da existência das aquaporinas (AGRE; KOZONO, 2003),
diversos estudos comprovam a presença destas proteínas na membrana vacuolar
(tonoplasto), na membrana plasmática e sua caracterização como canais de água
em Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (MAUREL et al., 1993, DANIELS et al., 1994).
Desde então, genes que codificam aquaporinas têm sido identificados em outras
espécies vegetais, como o milho (Zea mays L.), o arroz (Oryza sativa L.) e o trigo
(Triticum aestivum L.). Nas plantas, o transporte de água através das aquaporinas
mostra-se fundamental para os processos fisiológicos como elongação, germinação
e osmorregulação (MAUREL, 2007).
As plantas diferem dos outros organismos por expressarem um número
elevado de isoformas de aquaporinas. No genoma de Arabidopsis foram
identificados 38 genes que potencialmente codificam estas proteínas (QUIGLEY et
al, 2001). Em arroz e milho foram identificados 33 e 36 genes, respectivamente,
enquanto que números menores foram identificados no genoma humano (13), na
bactéria E. coli (2), em nematóides (9) e na levedura S.cerevisiae (9). A elevada
quantidade de isoformas de aquaporinas encontrada nos vegetais deve-se ao fato
destes organismos precisarem de uma absorção contínua de água durante o seu
desenvolvimento, permitindo também um transporte rápido e reversível de água,
exercendo assim função vital quando a planta enfrenta condições adversas como o
estresse hídrico (CHAUMONT et al., 2001; JOHANSON et al., 2001; QUIGLEY et al.,
2002; CHAUMONT et al., 2005; MAUREL, 1997).
A análise das sequências dos genes e o estudo das relações filogenéticas
contribuem significativamente na escolha de estratégias de transferibilidade entre o
34
arroz (espécie modelo) e demais espécies em que os genes de interesse já foram
estudados e a aveia (espécie órfã). Tendo em vista os crescentes problemas de
alagamento e/ou seca, a necessidade de cultivo em áreas afetadas pela salinidade,
e o comprovado papel das MIPs na resposta das plantas a estresses relacionados
com a disponibilidade de água, investigações desses genes na aveia são essenciais.
Este trabalho objetiva identificar em aveia genes homólogos de aquaporinas já
estudados em outras espécies, através de técnicas de biologia molecular e
bioinformática, constituindo o primeiro relato sobre a caracterização de genes MIP
em aveia.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Centro de Genômica e Fitomelhoramento (CGF)
do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia "Eliseu Maciel", da
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas (RS).
Material vegetal e extração de DNA
Sementes de aveia branca (Avena sativa L. cv. Barbarasul), provenientes do
banco de germoplasma do CGF, germinaram em câmara climatizada do tipo BOD à
temperatura de 20°C e fotoperíodo de 12h, por um período de 15 dias, até obtenção
das plântulas (BRASIL, 2009).
O DNA genômico (gDNA) foi extraído a partir de tecido vegetal jovem e
fresco, utilizando o tampão CTAB, conforme técnica descrita por Saghai-Maroof
(1984) com algumas modificações. O precipitado foi ressuspendido em tampão Tris-
EDTA, pH 8,0 e tratado com RNAse à concentração final de 10 mg/mL para remoção
de contaminação com RNA, quantificado em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídeo. Através da intensidade da banda foi estimada a quantidade de
DNA em ng/mL, por comparação com o marcador de peso molecular Low DNA Mass
Ladder (InvitroGen Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA).
35
Amplificação e clonagem dos genes de aquaporinas da aveia
Como não existe informação a respeito de genes de aquaporinas em aveia
até então, os primers foward e reverse (tab. 1) foram desenhados com base em
ESTs de aveia homólogas a genes de aquaporinas de arroz (Oryza sativa L.) e
primers degenerados baseados em regiões conservadas de genes de aquaporinas
de trigo (TMHs e Loop E).
Diferentes seções do gene foram amplificadas do gDNA da aveia branca
cultivar Barbarasul por PCR utilizando 100ng de gDNA molde, 10 mM de cada
primer (tab. 1) e 25 µL de GoTaq® Green Master Mix 2x (Promega, contendo dNTPs,
MgCl2, e Taq DNA polimerase) em 50 µL de reação. As PCRs foram realizadas em
termociclador PTC-100 TM (MJ research), utilizando desnaturação inicial (94°C,
5min.), 30 ciclos de desnaturação (94°C, 1min.), anelamento com temperatura
específica para cada primer (55 – 63°C, 1min.) e extensão (72°C, 1min. 30seg.), e
então extensão final (72°C, 5min.).
Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 1%, e as múltiplas
bandas foram selecionadas de acordo com o tamanho esperado para cada par de
primers (baseado em ESTs) para purificação com illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification Kit (GE Healthcare).
DNAs purificados foram ligados no vetor TOPO® TA Cloning Kit (Invitrogen),
em seguida células competentes de E. coli (linhagem TOP10) transformadas por
eletroporação com os vetores contendo os fragmentos cresceram por 16h em meio
LB/Agar com espectinomicina (50 µg/mL). As análises dos clones positivos foram
feitas através de digestão com enzima de restrição (EcoRI). Para o
sequenciamento, foram selecionados os clones que apresentaram o tamanho de
fragmento esperado. A extração do DNA plasmidial dos clones selecionados foi
realizada utilizando o QIAprep Miniprep Kit.
Sequenciamento do DNA dos clones amplificados do DNA genômico
O sequenciamento das amostras foi realizado no Laboratório ACTGene
(Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS) utilizando o sequenciador
automático ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer armado com capilares de 50 cm e
polímero POP6 (Applied Biosystems). Os DNAs-molde (100 a 250 ng) foram
36
marcados utilizando-se 3,2 pmol do respectivo primer (tab. 1) e 2 µL do reagente
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems) em um
volume final de 10 µL. As reações de marcação foram realizadas em termociclador
GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação
inicial a 96ºC por 3 min seguida de 25 ciclos de 96ºC por 10 seg, 55ºC por 5 seg e
60ºC por 4 min. Após marcadas, as amostras foram purificadas pela precipitação
com isopropanol e lavagem com etanol 60%. Os produtos precipitados foram
diluídos em 10µL de formamida, desnaturados a 95ºC por 5 min, resfriados em gelo
por 5 min e eletroinjetados no sequenciador automático. Os dados de
sequenciamento foram coletados utilizando-se o programa Data Collection v1.0.1
(Applied Biosystems) com os parâmetros Dye Set “Z”; Mobility File
“DT3100POP6{BDv3}v1.mob”; BioLIMS Project “3100_Project1”; Run Module 1
“StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100”; e Analysis Module 1 “BC-
3100SR_Seq_FASTA.saz”.
Tabela 1 - Primers utilizados para a amplificação das sequencias homólogas de aquaprinas a partir do gDNA de aveia por PCR.
Primera Sequencia TM (°C)
AsF1 ATGGCAAAGGACGAGGTGGTGG 70 AsF2 GCCACBYTSCTCTTCSTCTAC 57 AsR1 CGGTCGGAGCGGCTGATGACT 71 AsR2 GGTCATCCCAGGTCTTGTC 58 AsR3 GVCCVACCCAGAAGATCC 58
aPrimers com o nome terminado em F: primers foward; primers com o nome
terminado em R: primers reverse. Degeneração: R=A+G, Y=C+T, S=C+G,
B=T+C+G, V=A+C+G.
Análise das sequências amplificadas do genoma da aveia
As sequências de DNA dos fragmentos clonados foram submetidas à
tradução nas seis fases de leitura com o auxílio da ferramenta ORFinder para
determinar se estes são potenciais MIPs, também foi realizada uma busca no blastp
usando bancos de dados do NCBI (ALTSCHUL et al., 1990) e aquelas identificadas
como sendo MIPs foram analisadas posteriormente. O cDNA das sequencias
clonadas foi predito e traduzido em potenciais proteínas.
37
As proteínas preditas a partir das sequências de DNA de aveia foram
submetidas ao servidor TMHMM v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) e
TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) para a predição da
TMHs, a localização subcelular foi predita através dos programas WoLF PSORT
(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp), TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP), e
SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP).
Análises filogenéticas
A homologia das sequências selecionadas foi definida pelo do escore máximo
do alinhamento associado à maior cobertura da query e o menor valor de E-value
(quando o valor do e-value foi menor que 1e-10). As sequências selecionadas deste
alinhamento foram submetidas ao alinhamento global com o auxílio do software
ClustalW (LARKIN et al., 2007). Uma árvore inicial foi construída com base no
método de Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987), com um boostrap de 1000
réplicas com o auxílio do programa MEGA 4 (TAMURA et al., 2007), a fim de avaliar
o sinal filogenético. Os agrupamentos considerados monofiléticos foram submetidos
ao teste de escolha do modelo de substituição nucleotídica ideal, com auxílio do
software Jmodeltest (POSADA, 2008). O modelo apropriado foi selecionado para
análise bayesiana no programa BEAST (DRUMMOND; RAMBAUT, 2007), sendo as
árvores resultantes desta análise utilizadas para gerar uma árvore consenso. As
análises das árvores filogenéticas foram realizadas com o auxílio do software EPOS
for MacOSX 10.5.1.
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Identificação de potenciais genes de aquaporinas no genoma da aveia
A partir dos primers utilizados obtiveram-se produtos de PCR de 760pb,
771pb e 1072pb a partir do gDNA da Avena sativa L. cv. Barbarasul. O DNA
amplificado com os diferentes pares de primers, AsF1/AsR1 (760pb) e AsF2/AsR3
(771 e 1072pb), foi purificado dessas bandas selecionadas (fig. 3). Os fragmentos
foram clonados e os plasmídeos recombinantes tiveram seus fragmentos
sequenciados, os alinhamentos realizados através do blastp foram conduzidos após
38
identificação da melhor ORF de acordo com a melhor identidade obtida (tab. 2)
(Apêndice 1). As sequencias não relacionadas à MIPs não foram consideradas nos
estudos posteriores. Somente nos produtos de PCR obtidos a partir da combinação
de primers AsF2/AsR3 foram detectados relação com genes da família das
aquaporinas.
Figura 3 – Fotografia do gel dos fragmentos homólogos de aquaporinas amplificados por PCR a partir do genoma de aveia cv. Barbarasul. Marcador - 1 Kb Plus DNA Ladder. 01 - AsF1/AsR1; 02 - AsF2/AsR3.
Tabela 2 - ORF, posição, tamanho e Blastp dos potenciais genes de
aquaporinas em aveia.
Sequência Primer ORF Posição Tamanho Blastp e-value
(identidade)
cgfcontigAs2 AsF1/R1 +3 18-488 471 (156) aquaporina (Triticum aestivum) 6e-74 (89%)
cgfcontigAs3 AsF2/R3 -2 184-738 552 (183) aquaporina PIP2
(Triticum aestivum) 4e-73 (84%)
Análise das sequências
O método adotado inicialmente para estimar as filogenias foi o neighbor-
joining que é preferível a outros métodos comumente usados quando as taxas
evolutivas variam entre os ramos da árvore filogenética (HUGHES, 2001) o que é
verdadeiro no caso de famílias multigênicas cujos membros têm se adaptado a
diferentes funções. Genes de AQP estão sendo identificados em várias espécies de
vegetais (JOHANSSON et al., 2000).
760pb
1072bpb 771pb
39
Figura 4 - Árvore filogenética das sequências parciais de aquaporinas de arroz,
milho, Arabidopsis, trigo e contigs de aveia, obtida a partir de sequencias de DNA,
através do método de neighbor-joining. At (Arabidopsis thaliana), Os (Oryza sativa),
Ta (Triticum aestivum), Zm (Zea mays), PIP (plasma membrane intrinsic proteins),
TIP (tonoplast intrinsic proteins), NIP (Nodulin-26-like intrinsic proteins), e SIP (small
basic intrinsic proteins).
Foram conduzidas análises filogenéticas incluindo AQPs de outras espécies
vegetais para determinar como APQs de aveia se relacionam a sequências de
40
outras proteínas já estudadas. Na primeira etapa foram analisadas as sequências de
aquaporinas de arroz, milho, Arabdopsis, trigo e as potenciais aquaporinas de aveia.
Pode-se notar que as subfamilias de aquaporinas se separam de maneira marcante,
os contigs cgfcontigAs2 e cgfcontigAs3 apresentam-se no grupo da subfamília PIP.
Os resultados demonstram que os contigs cgfcontigAs2 e cgfcontigAs3
obtiveram homologia com PIPs de trigo (fig. 4). As proteínas PIP apresentam relação
mais próxima entre si do que as outras, cerca de 64% a 100% de identidade. No
entanto sua relação com os outros grupos é bem menor, cerca de 16% a 35% dos
aminoácidos são conservados (CHAUMONT et al. 2001).
Para a segunda etapa foram analisadas as sequênicas de aquaporinas
pertencentes à subffamilia PIP de arroz, milho, Arabidopsis, trigo e os dois contigs,
colaborando com os resultados obtidos na primeira etapa. Os contigs permaneceram
agrupados com PIPs de trigo o que indica alta similaridade desses genes entre as
espécies de trigo e aveia (fig. 5).
A conservação na ordem e no conteúdo de genes e/ou grupos gênicos entre
essas espécies relacionadas é altamente informativa para estudos comparativos de
função, ação e regulação entre os diferentes genomas. Considerando que as
espécies pertencentes à família Poaceae tenham divergido de um ancestral comum
há cerca de 60 milhões de anos (WILSON et al.,1999), é provável que as gramíneas
de interesse agronômico tenham sofrido as mesmas modificações também nos
genes envolvidos com o transporte de água.
Estes resultados aliados a estudos de genômica comparativa podem reforçar
esta hipótese, demonstrando que a colinearidade dos genes geralmente é bem
conservada entre os genomas das gramíneas (BENNETZEN; FREELING, 1997).
Contudo, a maior proximidade entre as sequências dos genes PIPs de trigo e os
contigs de aveia pode ser justificada por estas espécies pertencerem à mesma tribo
(Pooideae), o que torna seus genomas mais colineares.
41
Figura 5 - Árvore filogenética das sequências parciais de aquaporinas da subfamília
PIP de arroz, milho, Arabidopsis, trigo e contigs de aveia, obtida a partir de
sequencias de DNA, através de inferência bayesiana. At (Arabidopsis thaliana), Os
(Oryza sativa), Ta (Triticum aestivum), Zm (Zea mays), PIP (plasma membrane
intrinsic proteins), TIP (tonoplast intrinsic proteins), NIP (Nodulin-26-like intrinsic
proteins), e SIP (small basic intrinsic proteins).
42
Algumas características das proteínas preditas ou descritos como
interferentes na estrutura e/ou função das MIPs foram identificados nas potenciais
aquaporinas pertencentes à subfamília PIP de aveia, elas foram testadas quanto a
presença dos seis domínios alfa-hélices transmembrana (TMHs). Loop B e E
mostraram-se conservados em ambas sequências, porém somente uma das
sequências de aveia apresenta os dois motivos NPA conforme mostra o alinhamento
entre os contigs e as PIPs as quais estão mais relacionados (fig. 6), já o contigAs2
apesar de apresentar alta similaridade com PIPs de trigo apresentou um motivo tipo
NPA podendo ser um pseudogene ou ainda por esta poder ser uma sequência
parcial. Porém sua alta identidade com MIPs correspondentes em outras gramíneas,
em especial o trigo sugerem que as proteínas de aveia têm maior probabilidade de
possuir a estrutura ampulheta mais parecida com as proteínas do trigo.
Várias características das AQPs foram encontradas nas potenciais
aquaporinas de aveia através das ferramentas de predição in silico como os motivos
NPA e regiões transmembrana que afetam diretamente a seletividade do canal para
água e outras moléculas e sua estrutura.
A provável localização subcelular foi determinada com os algoritmos WoLF
PSORT e TargetP. É importante ressaltar que o programa TargetP detecta apenas
sequências N-terminais, com uma fidelidade de cerca de 85%, os resultados obtidos
através deste programa apresentaram baixa confiabilidade de acordo com seus
parâmetros, indicando que a localização dessas sequencias não podem ser preditas
com precisão.
A sobreposição de predição da localização sub-celular por dois ou mais
programas foi adotada na tentativa de aumentar a confiabilidade dos resultados em
sua relação. Utilizando os mesmos programas a maioria das PIPs de trigo tiveram
sua topologia predita similar à encontrada neste trabalho, em média uma TMH a
mais (FORREST; BHAVE, 2008).
Apesar da predição de TMH e localização sub-celular sugerirem que as
AsPIPs seriam proteínas de membrana, peptídeo sinal foi predito somente em uma
das sequências, isto explica-se já que algumas proteínas transmembrana não
possuem peptídeo sinal na porção N-terminal clivável, como a PIP2 do espinafre que
possui a porção N-terminal sem os três primeiros aminoácidos (FOTIADIS et al.,
2001) e a Met inicial em PIP2s de Arabidopsis pode ser clivada mas em suas PIP1s
43
Figura 6. Alinhamento entre os genes de aquaporinas de trigo e fragmentos
amplificados a partir do gDNA de aveia (contigs - potenciais aquaporinas), indicando
a presença/aunsência dos motivos NPA circuladas em vermelho. (a) Alinhamento
entre TaPIP2-5 e cgf contigAs3. (b) Alinhamento entre TaPIP1-8 e cgf contigAs2.
não (SANTONI et al., 2006). Além disso, TMHs podem funcionar como sinalização
para endereçamento, como é o endereçamento da AQP1 em mamíferos e AQP4 em
retículo endoplasmático para sintese e posterior envio para a membrana celular
(FOSTER et al., 2000).
A orientação de proteínas para membrana também pode ser afetada pelo
tamanho e hidrofobicidade dos domínios transmembrana (WAHLBERG; SPIESS,
1997). Ainda se conhece pouco a respeito dos mecanismos de endereçamento das
(a)
(b)
44
PIPs, no entanto AQPs de mamíferos utilizam diferente rota de dobramento; A AQP4
obtem seis TMHs via translocação co-transducional (SHI et al., 1995), já que AQP4 é
sintetizada com quatro TMHs e depois reorientada para seis TMHs (SKACH et al.,
1994; LU et al., 2000).
Tabela 3 - Analíse in silico das potenciais aquaporinas presentes no genoma
de aveia, identificadas neste estudo.
Proteína TMHMM TMpred PSORT TargetP SignalP
cgfcontigAs2 3 4 6% CLO
27% MT
4% SP
72% OT
Sim
cgfcontigAs3 4 4 7% CLO
38% MT
8% SP
63% OT
Não
CLO – cloroplasto; MT – mitocondrial; SP – via secretora; OT – outra
localização; ER – retículo endoplasmático.
SignalP identificou probabilidade da presença de um de peptídeo sinal com
possível sítio de clivagem na posição entre os resíduos 40 e 41 em cgfcontigAs2,
este resultado foi considerado incomum visto que indicaria a retirada de parte da
proteína, não estando de acordo com a possível topologia predita. Os resultados
obtidos com relação ao endereçamento proteico e topologia para cgfAscontig2
discordam entre si, indicando que este seja um possível pseudogene, contudo ainda
não está descartada a hipótese de que este seja uma aquaporina, já que sua
sequência poderia também estar incompleta.
3.4 CONCLUSÕES
A caracterização in silico das amplificações obtidas nas reações de
amplificação realizadas sugerem a presença de genes que codificam aquaporinas,
pertencentes a subfamília PIP, no genoma da aveia, o que vem ratificar dados
encontrados na literatura, no entanto é importante ressaltar que a identificação
experimental desses genes é necessária para real confimação de sua presença.
45
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49
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foram identificadas duas sequências de potenciais genes que
expressam aquaporinas em aveia amplificadas a partir do gDNA de aveia cultivar
Barbarasul.
A identificação desses genes é de suma importância, pois estão envolvidos
no desenvolvimento e adaptação das plantas, entretanto, ainda não existiam relatos
sobre a identificação de genes de aquaporinas em aveia.
As ferramentas de bioinformática foram de grande impotância para auxiliar no
desenvolvimento dos primers e para identificação dos genes de aquaporinas, no
entanto, é impotante ressaltar que a identificação experimental desses genes é
necessária para real confimação de sua presença.
50
5. REFERÊNCIAS
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51
Apêndice 1 >cgf contigAs2
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