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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE AGUDA DO EXTRATO BRUTO DAS RAÍZES DE Euclea natalensis A.DC (Mulala)
Carla de Souza Neves
RECIFE 2010
2
Carla de Souza Neves
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E TOXICIDADE AGUDA DO EXTRATO BRUTO DE Euclea natalensis A.DC (Mulala).
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Profa. Dra. Miracy Muniz de Albuquerque Co- Orientador: Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley
RECIFE 2010
3
Neves, Carla de Souza
Avaliação da atividade antimicrobiana e toxicidade aguda do extrato bruto das raízes de Euclea natalensis A.DC (mulala) / Carla de Souza Neves. – Recife: O Autor, 2010.
64 folhas: il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia.
1. Euclea natalensis A.DC. 2. Atividade antimicrobiana. 3. Toxicidade. I. Título.
616-078 CDU (2.ed.) UFPE 616.01 CDD (20.ed.) CCS2010-101
4
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Dalci José Brondani
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Beate Saegesser Santos
5
Dedico este trabalho
primeiramente à Deus, meu
esposo Leonardo e à minha mãe
Lisete. Obrigada por todo o
apoio!
6
AGRADECIMENTOS
A Deus por me dá a força e perseverança para enfrentar as dificuldades.
À minha mãe Lisete Gomes de Souza por todo o apoio e confiança.
Ao meu irmão Homero de Souza Neves pelo carinho e torcida.
À minha amiga dentista, Marcela Figueiredo pela amizade, incentivo e pela
idéia do estudo dessa planta em Moçambique.
A amiga, dentista, Suely Coutinho Pires pelo incentivo, por ter colaborado em
uma das estapas da pesquisa.
A amiga Andreza Santos pela amizade e apoio na pesquisa.
Ao amigo Saulo de Tarso pela ajuda na correção do trabalho.
Ao Reitor do Instituto Superior de Ciências e Tecnologia de Moçambique,
Professor, Dr. João Leopoldo da Costa, por ter permitido e apoiado essa
pesquisa.
Ao Instituto Superior de Ciências e Tecnologia de Moçambique por ter
permitido essa pesquisa em suas dependências e por todo o apoio oferecido.
A professora Dra. Elsa Gomes pela orientação incondicional e boa vontade e
conhecimentos transmitidos.
A professora Dra. Olga Duarte pelo apoio na realização da pesquisa.
A amiga Luciana Santos de Oliveira pelo apoio fundamental.
A professora Márcia da Silva Nascimento pelo grande apoio e conhecimentos
transmitidos.
A professora Eulália Ximenes pela orientação e apoio na realização de uma
das etapas importantes do trabalho.
Ao meu co-orientador Professor Dr. Almir Gonçalves Wanderley pelo apoio e
orientação.
A minha orientadora Miracy Muniz de Albuquerque pelos conhecimentos
transmitidos, confiança e colaboração.
Ao meu amor Leonardo Albuquerque Andrade pelo amor, incentivo e
compreensão durante todo o tempo.
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... 8
LISTA DE TABELA ........................................................................................... 9
RESUMO.......................................................................................................... 10
ABSTRACT ...................................................................................................... 11
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 12
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 17
3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 19
3.1. ESTUDOS SOBRE EUCLEA NATALENSIS A.DC. ......................... 19
3.1.1. Botânico .......................................................................................... 19
3.1.2. Usos populares ............................................................................. 21
3.1.3. Estudo Fitoquímico da Euclea natalensis A.D.C........................... 23
3.1.4. Farmacológico .............................................................................. 26
3.1.5. Toxicológico .................................................................................. 27
3.2. MICRORGANISMOS ....................................................................... 28
3.2.1. Bactérias ..................................................................................... 28
3.2.2. Bactérias Gram positivas ........................................................... 28
3.2.3. Bactérias Gram-negativas ......................................................... 31
3.2.4. Leveduras .................................................................................... 32
3.2.4.1. Candida albicans ....................................................................... 32
3.2.5. Fármaco utilizado - Clorexidina ................................................. 32
3.2.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima ................... 33
4. PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................... 37
4.1. MATERIAL BOTÂNICO ................................................................... 37
4.2. OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO DE EUCLEA NATALENSIS ... 37
4.3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 37
4.3.1. Substâncias e Meios de Cultura ................................................ 37
4.3.4. Metodologia................................................................................. 38
4.3.4.1. Preparo da suspensão de microrganismos para verificação da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato de Euclea natalensis ..... 38
4.3.4.2. Determinação da Atividade Antimicrobiana e da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do Extrato de Euclea natalensis. .......................... 39
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 40
5.1.1. Ensaio Toxicológico ......................................................................... 47
5.1.1.1. Introdução ..................................................................................... 47
5.1.2. Materiais e Métodos ..................................................................... 48
5.1.2.2. Material Botânico ....................................................................... 48
5.1.2.3. Toxicidade aguda ...................................................................... 48
5.1.3. Resultados .................................................................................... 49
5.1.3.1. Toxicidade aguda ...................................................................... 49
6. CONCLUSÕES GERAIS .......................................................................... 52
7. PERSPECTIVAS ...................................................................................... 53
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 55
8
LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Fotografia das flores e folhas de Euclea natalensis
FIGURA 2. Mapa da distribuição geográfica da Euclea natalensis na África
FIGURA 3.
FIGURA 4. FIGURA 5. FIGURA 6. FIGURA 7. FIGURA 8.
Fotografia das raízes de Euclea natalensis Fotografia indicando o tamanho da árvore Euclea natalensis comparando ao tamanho de um adulto Estruturas químicas da octahidroeuclein e shinanolona Estruturas químicas da Diospirina, 7-metiljuglona, Isodiospirina, Mamegakiona e Neodiospirina Esquema da técnica da CIM Fotografia da placa da determinação da concentração inibitória. mínima (CIM) do extrato etanólico de Euclea natalensis frente a bactérias
FIGURA 9. Fotografia da placa da determinação da concentração mínima inibitória (CIM) da clorexidina frente bactérias
FIGURA 10. Fotografia da placa da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato etanólico de Euclea natalensis frente a cepas de Candida albicans
FIGURA11. Fotografia da placa da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) da clorexidina frente as cepas de Candida albicans
FIGURA 12.
FIGURA 13. FIGURA 14.
Figura representativa de ganho de massa corporal
Figura representativa do consumo de água pelos ratos Wistar Figura representativa do consumo de ração pelos ratos Wistar
9
LISTA DE TABELA TABELA 1 Resultados da Concentração inibitória mínima (CIM)
do extrato etanólico de Euclea natalensis e clorexidina frente bactérias Gram positivas e Gram negativa.
TABELA 2 Resultados da Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato etanólico de Euclea natalensis e clorexidina frente a leveduras Candida albicans
10
RESUMO
Euclea natalensis A. DC. pertence a família Ebenaceae e é encontrada na
África Austral desde o Quênia e República Democrática do Congo até a África
do Sul. Esta planta destaca-se popularmente pela pronunciada ação
antibacteriana ao impedir a formação da placa bacteriana e antiinflamatória de
seus metabólitos secundários, principalmente as naftoquinonas. Em revisão de
literatura, constatou-se a carência de informações detalhadas para a área
odontológica. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a
atividade antimicrobiana frente a microrganismos patogênicos para a cavidade
oral e determinar a toxicidade aguda do extrato bruto etanólico da raiz de
Euclea natalensis. Diante deste relato foi utilizado método de microdiluição em
caldo Mueller Hinton para a determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) frente aos seguintes microrganismos Streptococcus agalactiae,
Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus,
Porphyromonas gingivalis e algumas cepas de Candida albicans obtidas do
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) e Depto. de
Antibióticos da UFPE e teste de toxicidade aguda. Na análise microbiológica,
os resultados foram satisfatórios comparando com a clorexidina frente aos
microrganismos ensaiados. Desta forma, foi observado que o extrato bruto das
raízes de Euclea natalensis A.DC. possui atividade antimicrobiana
possivelmente correlacionada a presença de naftoquinonas. Para o ensaio de
toxicidade aguda por via oral em Ratos Wistar, realizado pelo método de
Trevan (1927), foi administrada uma dose de 4mL de 6/6 horas, numa
concentração de 5g/Kg, aos animais durante 24 horas e posteriormente foram
observados em relação ao comportamento, consumo de água e alimento. Foi
observado que os animais não apresentaram sinais clínicos de toxicidade, nem
alteração no consumo de água e ração. Dessa forma conclui-se que o extrato
bruto de Euclea natalensis A.DC. apresentou atividade antimicrobiana frente
aos microorganismos testados e não possui toxicidade aguda.
Palavras-Chave: Euclea natalensis A.DC. toxicidade, antimicrobiana
11
ABSTRACT Euclea natalensis A. DC. Belongs to the family Ebenaceae and is found in
Southern Africa from Kenya and the Democratic Republic of Congo to South
Africa. This plant stands by popularly pronounced antibacterial action to prevent
the formation of plaque and its anti-inflammatory secondary metabolites
especially naphthoquinones. In the literature review, we noted a lack of detailed
information to the field of dentistry. Thus, this study aimed to evaluate the
antimicrobial activity against pathogenic microorganisms to the oral cavity and
determine the acute toxicity of crude ethanol extract of the roots of Euclea
natalensis. Before this report was used microdilution method in Mueller Hinton
broth for the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) against
the following microorganisms Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans,
Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis
and some strains of Candida albicans obtained from the National Institute
Quality Control in Health (INCQS) and Depto. Antibiotics, UFPE and acute
toxicity test. In the microbiological analysis, the results were satisfactory
compared with chlorhexidine against microorganisms tested. Thus, it was
observed that the crude extract of the roots of Euclea natalensis A.DC. possibly
have antimicrobial activity correlated with the presence of naphthoquinones.
When tested for acute oral toxicity in Wistar rats, conducted by the method of
Trevan (1927), was administered a dose of 4mL of 6 / 6 hours, at a
concentration of 5 g / kg, animals for 24 hours and were later observed toward
the behavior, consumption of food and water. It was observed that the animals
showed no clinical signs of toxicity or changes in the consumption of food and
water. Thus it is concluded that the crude extract of Euclea natalensis A.DC.
showed antimicrobial activity against the tested microorganisms and has no
acute toxicity.
Keywords: Euclea natalensis A.DC. , toxicity, antimicrobial
12
1. INTRODUÇÃO
12
1. INTRODUÇÃO
As plantas medicinais constituem importantes recursos terapêuticos para o
tratamento da saúde humana, principalmente dos países sub desenvolvidos, servindo
ao conhecido “uso popular”, que faz parte da cultura desses países, como matéria-
prima para elaboração de produtos fitoterápicos ou, extração de compostos químicos,
farmacologicamente ativos (FREITAS, 1999). A fitoterapia existe principalmente no
mercado informal, o que representa grande perigo à saúde da população, em
decorrência da comercialização de drogas vegetais sem nenhum controle quer seja
fitosanitário, quer seja de identidade e/ou pureza. Há necessidade de maior e melhor
controle nesse ramo farmacêutico, pois os fitoterápicos representam uma altenativa
economicamente viável à população (BENDAZZOLLI, 2000).
A abrangência da utilização de fitoterápicos e de plantas medicinais é vasta e
engloba fins variáveis, sobretudo em relação à saúde bucal (MONTEIRO et al., 2002).
Alguns produtos de origem vegetal também são utilizados na higiene oral com
a vantagem de não apresentarem efeitos colaterais, sendo relatados pequena
ardência com possibilidade de erosão na mucosa, quando comparados a produtos
sintéticos (MORAN; et al., 1992).
A higienização dos dentes com raízes de plantas vem sendo avaliada em
alguns estudos (KORN, 1965; EMSLIE, 1966; ENWONWU, 1974; MANLEY,
LIMONGELLI e WILLIAMS, 1975; ATTAR, 1979; LODHIA, 1986). Tem sido proposto
que esse costume é benéfico para a saúde bucal porque nessas raízes possuem
compostos com propriedades antibacterianas (KORN, 1965; MANLEY e
LIMONGELLI, 1975; WOLINSKY e SOTE, 1983).
Na África, usar raízes e caules de plantas é uma forma muito comum de
manter a higiene oral. Alguns extratos de algumas raízes usadas para mascar tem
atividade antimicrobiana contra vários microorganismos, incluindo aqueles
comumente implicados em infecções orofaciais. Alguns destes compostos
antimicrobianos que foram identificados pertencem aos grupo dos flavonoides e
alcalóides (NDUKWE; et al.,2004).
13
Uma prática similar vem sendo utilizadas para higiene oral, por povos da África
do Sul e principalmente em Moçambique, onde encontra-se a raiz de uma planta
chamada Euclea natalensis A. DC, que é a principal planta utilizada para higiene oral
(FILIPE; et al., 2008).
Em Moçambique o acesso ao dentista é raro. Apesar de escova e creme dental
serem o método preferido dos cuidados da higiene bucal, é um luxo que é, na maior
parte apreciado somente por pessoas que têm um elevado nível de educação formal.
Para o resto da população que não tem condições financeiras para pagar esse luxo,
mascar raízes ou caules de determinados vegetais com propriedades anti-bacterianas
são uma medida de atenção primária à saúde comuns e importantes. Há muitas
espécies diferentes de plantas que são usadas para fins medicinais. Por exemplo, em
Moçambique Euclea divinorum e Euclea e natalensis são as espécies de plantas mais
vendidas que são usados dessa forma. Ao longo do continente africano há muito mais
espécies de plantas que são usadas para esta mesma finalidade na. Sociedade
(.Ethnomedicine/Disease Prevention Practices
http://en.wikibooks.org/wiki/Ethnomedicine/Disease_Prevention_Practices, consulta
em 05/05/2010 as 17:00hs)
Considerando a cárie dentária e as periodontopatias como uma das principais
preocupações na odontologia, foi observado que há insuficiência de estudos da
Euclea natalensis A.DC.voltados para área odontológica. fazendo despertar o
interesse em aprofundar os estudos nessa área (SOUSA; GIL, 1998).
Além da cárie a placa bacteriana também é uma ameaça à saúde oral e é
definida como uma massa densa, não calcificada, constituída por microrganismos
envolvidos numa matriz rica em polissacarídeos extracelulares bacterianos e
glicoproteínas salivares, firmemente aderida aos dentes e outras superfíces da
cavidade bucal. (LASCALA, 1997).
A remoção da placa faz-se por meios mecânicos e ou químicos, os quais
previnem a sua reincidência a redução de seu potencial patogênico. Os inibidores
químicos da placa incorporados em colutórios e dentifrícios, atuam como agentes
auxiliares das técnicas mecânicas e devem ser prescritos de acordo com a
necessidade do paciente. (CARRANZA JÚNIOR, 1992).
14
Além das raízes, o caule de Euclea natalensis A.DC. também é utilizado para
escovar os dentes (20) além de ser usado na forma cozida para esquistossomose
urinária ou intestinal, doenças muito comuns que acometem a população em
Moçambique (consulta em 27/04/2010 17:23hshttp://www.verdade.co.mz/vida-e-
lazer/saude/bilharziose-infeccao-de-parasitas.html). Depois de ferver, o filtrado é
administrado três vezes ao dia durante três dias, seguido de um clister de 30Ml
(MOSHI et al, 2006).
Para tratamento de malária e febre amarela usa-se o caule cozido na dose de
uma colher de sopa três vezes ao dia.
São utilizadas também as cinzas das cascas pulverizadas, misturadas com
vaselina e aplicadas topicamente em nódulos e sifilomas (HUTCHINGS et al, 1996).
As folhas dessa espécie também são utilizadas para dores de dente e cefaléias
(Mc GRAW et al , 1997).
Em Moçambique o banho morno com as folhas pela manhã e à noite é usado
para tratar algumas alergias (MARTINS,N. 2006).
Diversas substâncias químicas tais como anti-sépticos de amplo espectro,
antibióticos específicos, têm sido utilizadas para prevenir ou limitar o acúmulo da
placa bacteriana e doenças relacionadas. Pode- se citar como exemplos: fluoretos,
sais de metais e agentes. oxidantes (KORNMAN, 1986; ADDY, 1986; NAKAE;et al.
1986; MANDEL; 1994; MARSH; 1992; GIORGI e DE MICHEL, 1992).
O digluconato de clorexidina é um detergente catiônico colocado a disposição
da prática clínica odontológica e se mostra efetivo na inibição da formação da placa
seja em solução ou gel, no entanto, a clorexidina quando usada por longo período,
apresenta efeitos colaterais indesejáveis, o que torna o seu uso restrito (STEFANI, e
LIMA, 1996)
Assim, este trabalho visa dar continuidade aos estudos desenvolvidos com
Euclea natalensis D.C., que foi dividido nas seguintes abordagens: obtenção do
extrato bruto das raízes de Euclea natalensis A.DC, estudo antimicrobiano do extrato
etanólico das raízes e ensaio de toxicidade aguda. Esta planta foi escolhida com o
objetivo de correlacionar o seu uso popular como escova de dentes à atividade
antimicrobiana em relação à saúde bucal.
Os microrganismos escolhidos são causadores de infecções na cavidade oral
como por exemplo: faringite, amigdalite, cárie, doença periodontal, abcessos,
15
O estudo de toxicidade aguda é um dos parâmetros observados antes da
elaboração de qualquer forma farmacêutica utilizando extratos vegetais. O controle
de qualidade dos extratos vegetais é uma etapa importante para segurança no
desenvolvimento de uma forma farmacêutica, nesse sentido esse também se
enquadra nos objetivos desse estudo.
16
2.OBJETIVOS
17
2. OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana e a toxicidade aguda de Euclea
natalensis A.DC.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtenção do extrato etanólico das raízes de Euclea natalensis A.DC.
Avaliar a ação antimicrobiana do extrato de Euclea natalensis frente
aos microrganismos: Streptococcus agalactiae IC 02, Streptococcus
mutans ATCC 00446, Streptococcus pyogenes -hemolítico IC 01,
Staphylococcus aureus IC 17, Porphyromonas gingivalis ATCC 49417
e Candida albicans IC 01, 02 e 04.
Determinar a dose letal mediana (DL50) do extrato etanólico.
18
3.REVISÃO DE LITERATURA
19
3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. ESTUDOS SOBRE EUCLEA NATALENSIS A.DC.
3.1.1. Botânico
Euclea natalensis A.DC. espécie vegetal pertence à família Ebenaceae e ao
gênero Euclea Murray. Apresenta- se como pequenas árvores em Moçambique com
folhagem verde escuro, onduladas e longas (FILIPE, et al, 2008).
Essa espécie está presente desde o Quênia e República Democrática do
Congo até a África do Sul, vegeta, em regiões desde o nível do mar e até 1525m de
altitude (WHITE, 1983).
FIGURA 1. Fotografia ilustrativa das flores e folhas de Euclea natalensis A.DC.
Fonte: Dra. Elsa Gomes Novembro de 2008.
20
FIGURA 2. Mapa da distribuição geográfica da Euclea natalensis A.DC na
África
Dentre a vasta sinonímia popular, Euclea natalensis é conhecida como mulala,
kitana, mcriparica, uchangula (Moçambique), hairy guari (África do Sul). Tem como
sinônimos científicos Euclea multiflora Hiern., Euclea fructosa e Royena macrophylla
E. Mey. Ex A.DC. (DA SILVA et al., 2004).
Num estudo macroscópico as raízes de Euclea revelaram que são retas e
longas, de superfície externa crenada e com alguns pêlos epidérmicos.
A superfície externa é castanha escura a preta e a medula castanha clara a
alaranjada. Tem uma textura fibrosa, odor, sabor amargo e adstringente.Neste
mesmo trabalho após análise microscópica da raiz apresentou, nas secções
transversais, a presença de medula com células do parênquima medular de parede
espessada, raios medulares visíveis, vasos de xilema, parênquima cortical com
escleritos, grãos de amido e cristais prismáticos de oxalato de cálcio, espessa
camada de súber composto por células de parede muito espessa (FILIPE et al.,
2008).
Em análise histoquímica da planta encontraram-se amido na medula, nos
raios medulares e em algumas células corticais, quinonas nos raios medulares,
ausência de lipídios, ausência de mucilagens, polifenóis nos raios medulares e em
algumas células corticais, ausência de terpenóides (FILIPE. et al., 2008 ).
21
FIGURA 3 - Fotografia ilustrativa das raízes
de Euclea natalensis A.DC
3.1.2. Usos populares e estudo etinobotânico
A prática de higienizar os dentes com a raiz de Euclea natalensis A.DC.
consiste em retirar a casca e mastigar o interior até ficar desfeito, esfregando em
seguida nos dentes e gengiva. Este processo deixa a boca e os dentes com uma
coloração laranja que é temporária, desaparecendo em algumas horas. (STANDER,
1991). Também pode-se usar a raiz com a casca (KHAN, 2000). Nas dores de
dentes também podem ser utilizadas as cascas das raízes (KHAN, 1991) ou então
as raízes queimadas e pulverizadas (LONG, 2005b).
A conservação das raízes de Euclea natalensis é bastante simples e fácil,
pode-se guardar as raízes frescas em água ou em refrigeração
Tradicionalmente as raízes de Euclea natalensis A.DC. também são utilizadas
no tratamento de outras doenças da cavidade oral e no tratamento de cefaléias,
parasitoses, malária, febre amarela, distúrbios gastrintestinais, nas lesões cutâneas
da hanseníase, nos distúrbios ginecológicos, como estimulante sexual e em algumas
doenças sexualmente transmissíveis como por exemplo gonorréia (HUTCHINGS,
1996; KHAN, 1991; LONG, 2005b; STEENKAMP, 2003; WATT, 1962; WHITE,
1983).
22
Para o tratamento de malária utiliza-se a Euclea natalensis, juntamente com
outro vegetal, Tabernaemontana elegans Stapf., misturadas e cozidas e
posteriormente usadas no banho pela manhã e a tarde (JANSEN, P. 1984).
Nos casos de pleurite cozinha-se a Euclea natalensis com espinho de
Phoenix reclinata Jacq.,Maytennus heterophylla (Exkl e Zeyh) N. Robson e Capparis
tomentosa Lam. Outros cozimentos dessa espécie junto com as cascas de
Ekebergia capensis são utilizados como anti – eméticos para azia e distúrbios
respiratórios(LALL e MEYER, 2000).
Na África do Sul alguns habitantes locais também usam como purgativo e
como remédio para, bronquite, pleurite, asma crônica, infecções do trato urinário e
odontogênicas (LALL e MEYER, 2000; WATT e BREYER – BRANDWIJK, 1962).
Uma tinta escura é obtida a partir de das raízes esmagadas e fervidas e são
usadas para tingir tapetes e cestos na África Oriental (WHITE, 1983; PALMER e
PITMAN, 1973;PALGRAVE, 1977;LONG 2005).
FIGURA 4. Fotografia da Euclea natalensis A.DC. comparada ao tamanho de
uma pessoa
23
3.1.3. Estudo Fitoquímico da Euclea natalensis A.D.C Os primeiros trabalhos com isolamento dos constituintes da Euclea natalensis
A.DC. foram desenvolvidos por Lall e Meyer (2001) onde foi isolada a binaftoquinona
diospirina.
Alguns grupamentos químicos foram identificados em várias partes dessa
espécie como compostos terpênicos nas folhas (α-amirina, lupeol, ácido betulínico,
ácido ursólico e respectiva lactona e uvaol) 30, 31. Na raíz lupeol, betulina, 20 (29) –
lupene - 3β-isoflerrulato e β-sitosterol (WEIGNAD et al , 2004; LALL, 2006).
As naftoquinonas encontradas na raíz foram : simples 4,8-di-hidroxi-6-metil-1-
tetralona, 7-metiljuglona e shinanolona (34,24,32), diméricas, natalenona, 8-
hidroxidiospirina, euclanona, diospirina, octa-hidroeucleína, isodiospirina, ,
mamegakinona e nodiospirina e triméricas como galpinona. (KING et al, 1976;
FERREIRA et al, 1977;KOOY et al, 2006).
Figura 5. Octahidroeuclein e shinanolona
Mais tarde em 2006 seis naftoquinonas: diospirina, isodiospirina, mamegakinona,
7-metiljuglona, neodiospirina e shinanolona foram isoladas de extratos de raiz desta
planta através da cromatografia em coluna de sílica gel (KOOY, et al., 2006).
24
Figura 6. Diospirina, 7-metiljuglona, Isodiospirina, mamegakiona e neodiospirina
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos
secundários de distribuição natural. Nos últimos anos intensificou-se o interesse
nestas substâncias, não só devido à sua importância nos processos bioquímicos
25
vitais como também ao destaque cada vez maior que apresentam em variados
estudos farmacológicos (SILVA, et al., 2003).
Um estudo comparativo das naftoquinonas presentes em diversas espécies de
Euclea foi realizado para selecionar a espécie com maior concentração de
naftoquinonas para futuros estudos pré-clínicos (JOUBERT, et al., 2006).
A quantificação foi realizada através da cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC) e determinou a concentração de cada naftoquinona nas amostras. As
naftoquinonas encontradas foram: 7-metiljuglona, isodiospirina, neodiospirina e
diospirina. Euclea natalensis apresentou apenas duas naftoquinonas 7-metiljuglona
e diospirina (JOUBERT, et al., 2006).
A presença dessas naftoquinonas pode explicar a sua utilização como remédio
natural em algumas doenças infecciosas por exemplo as infecções cutâneas (KHAN
et al., 1978).
Em 2008 Filipe et al., realizaram um estudo do perfil em cromatografia em
camada fina (TLC) foram identificadas as naftoquinonas presentes na raiz (FILIPE,
et al., 2008).
O estabelecimento e a manutenção da qualidade de produtos farmacêuticos de
origem vegetal apresentam grandes problemas ligados à insuficiência de dados
fitoquímicos sobre muitas matérias-primas vegetais, bem como o desconhecimento
das substâncias responsáveis pelas atividades terapêuticas relatadas. Por outro
lado, existem determinadas limitações nas metodologias e nos equipamentos, que
dificultam o controle de qualidade de produtos constituídos por extratos vegetais.
Para garantir a qualidade no desenvolvimento de um produto é necessário o
monitoramento da constituição química para que se possa garantir a ação
farmacológica, durante todo o processamento.
Dentre as técnicas de controle do processo extrativo encontram-se as técnicas
cromatográficas, com as quais torna-se possível realizar avaliações tanto qualitativa
quanto quantitativas. A análise da composição da droga vegetal e de preparações
extrativas derivadas pode ser direta, através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) ou cromatografia gasosa, com o emprego de cromatografia em
camada delgada ou cromatografia em papel, seguidas de extração do componente e
determinação por análise química quantitativa ou físico-química tais como térmicas,
26
volumetria, espectrofotometria, fotocolorimetria ou densitometria (MELO, 1989;
ARAGÃO,1999, 2001, 2000a, 2002a, 2002b).
3.1.4. Farmacológico
Euclea natalensis A.DC. é conhecida como fonte de naftoquinonas. Dentre
essas naftoquinonas a 7-metiljuglona e diospirina apresenta atividade antibacteriana
contra vários microrganismos: Staphylococcus aureus, Neisseria gonorréia p.,
Shigella disenteriae, e Shigella flexneri (KHAN, et al., 1978).
Extratos etanólicos de 26 plantas, utilizadas por curandeiros de povos Zulu, da
África do Sul, foram avaliados, para tratamento da dor e inflamação, entre estes os
de Euclea natalensis, revelaram atividade antiinflamatória , por inibição da atividade
da cicloxigenase, enzima responsável pela síntese das prostaglandinas que estão
presentes durante o processo inflamatório (McGRAW, et al., 1997).
Os extratos aquoso e acetônico inibiram o crescimento de Bacillus cereus,
Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Micrococcus kristinae e Staphylococcus aureus
numa concentração que variou de 0,1 e 6,0 mg/mL. O extrato aquoso não inibiu
crescimento das bactérias Gram negativas enquanto que o acetônico mostrou
inibição numa concentração de 5,0 mg/mL contra todas as Gram negativas
investigadas por exemplo Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,
Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Serratia
marcerscens (LALL e MEYER 2000).
Extratos aquoso e acetônico dessa espécie também foram avaliados em estudo
comparativo com outras plantas, demonstrando atividade contra Mycobacterium
tuberculosis, sendo a concentração inibitória mínima de 0,5 mg/ml, tanto para o
extrato aquoso quanto o acetônico (LALL e MEYER, 2000).
Em uma avaliação do potencial esquistossomicida, o extrato aquoso de Euclea
natalensis, apresentou letalidade in vitro para os esquistossômulos da espécie
Schistosoma haematobium, que causa a esquistossomose urinária. Este extrato foi
usado numa concentração de 200 mg/mL (PARG; et al, 2000).
27
Avaliando as naftoquinonas isoladamente a binaftoquinona diospirina, isolada
de extrato de raízes de Euclea natalensis, também foi testada para determinar a
concentração inibitória mínima contra cepas de Mycobacterium tuberculosis
resistente a fármacos e também cepa sensível. A concentração inibitória mínima
(CIM) da diospirina foi de 100g/mL (LALL e MEYER, 2001).
A naftoquinona 7-metiljuglona também isolada do extrato de raízes de Euclea
natalensis inibiu também o crescimento de Mycobacterium tuberculosis tanto
ensaida isoladamente numa concentração inibitória mínima (CIM) de 0,5g/mL ou
em associação com rifampicina e isoniazida cuja concentração inibitória mínima foi
da ordem de 1,25g/mL e 0,62g/mL respectivamente sugerindo um efeito sinérgico
(BAPELA, et al.,2006).
A atividade antifúngica dessa espécie também foi investigada em um estudo
onde isolaram 2 naftoquinonas a partir do seu extrato etanólico as quais foram
denominadas shinanolone e octahidroleucina. Essas naftoquinonas foram testadas
contra os microorganismos: Aspergillus flavus, Aspergillus níger, Cladosporium
cladosporioides e Phytophthora spp. A. niger foram significativamente inibidos pela
shinanolone numa concentração de 0,01 mg/mL (LALL et al., 2006).
3.1.5. Toxicológico
Existe uma idéia geral de que medicamentos a base de plantas são mais
seguros e menos tóxicos comparando com os medicamentos sinéticos por exemplo.
Apesar da incidência de efeitos colaterais serem menores entre os fitoterápicos a
verdade é que alguns constituintes das plantas apresentam elevada toxicidade como
digitálicos e alcalóides (DIMECH, 2003; DREW e MYERS, 1977).
Existe uma preocupação das autoridades regulatórias com a normatização
dos medicamentos fitoterápicos propiciando avaliações de aspectos importantes ,
como eficácia e segurança do uso destes medicamentos. O uso tradicional de
diversas plantas medicinais baseado em conhecimentos populares, aliado à crença
de que, por ser natural não causa reações adversas , fez com que poucas plantas
fossem avaliadas através de estudos pré-clínicos e clínicos, a fim de comprovar sua
eficácia e segurança (TURROLLA E NASCIMENTO, 2006).
28
Sendo assim no presente estudo iremos abordar sobre a toxicidade aguda do
extrato bruto de Euclea natalensis como um dos objetivos.
3.2. Microrganismos
3.2.1. Bactérias Bactérias são microrganismos procarióticos que em relação a sua forma
tipicamente são descritos como bastonetes, esferas, espirais, apresentando uma
parede celular rígida o que vai determinar a forma do organismo.
De acordo com a estrutura dessa parede celular, as bactérias se dividem em
dois grandes grupos frente à coloração de Gram: bactérias Gram-positivas e
bactérias Gram-negativas.
Na coloração de Gram, quando tratadas com cristal violeta as bactérias
Gram-positivas apresentam-se coradas em violeta, pois devido à estrutura de sua
parede celular apresentar-se mais “densa” impossibilita a saída do corante quando
essas bactérias são submetidas à lavagem com álcool.
Já as Gram-negativas, que possuem uma parede celular mais “frouxa”
apresentam-se incolores, pois permitem a saída do corante após a lavagem com
álcool. A adição do contra corante safranina ou fucsina cora as bactérias Gram-
negativas em rosa ou vermelhas (STROHL et al., 2004)
3.2.2 Bactérias Gram-positivas
3.2.2.1 Streptococcus agalactiae
Esse microrganismo faz parte da microbiota de membranas mucosas de
seres humanos e animais, colonizando principalmente os tratos intestinal e
geniturinário. A grande relevância desta bactéria está na contaminação de
neonatos, ocasionando quadros graves de septicemia, pneumonia e meningite
(BORGER; et al., 2005).
29
3.2.2.2 Streptococcus mutans
Streptococcus mutans é um microrganismo intimamente associado à cárie
dentária, apresentando a capacidade de sinteizar polissacarídeos extracelulares
aderentes, a partir da sacarose, e polissacarídeos intracelulares a partir de
carbohidratos fermentáveis. Esta espécie geralmente coloniza a superfície dental,
sendo que a área de maior frequência de localização é a região mais apical dos
pontos de contato entre os dentes (HOFLING; et al., 1999).
Streptococcus mutans tem sido considerado a principal espécie bacteriana
envolvida na formação da placa bacteriana. Esses microrganismos não são
encontrados na cavidade bucal antes da erupção dos dentes. Os glucanos,
polissacarídeos formados por monômeros de glicose com ligações glicosídicas do
tipo α-(1-6) e α-(1-3), produzidos por essas bactérias facilitam a aderência e o
acúmulo de microrganismos, estabelecendo uma matriz extracelular resistente às
forças mecânicas normais de remoção presentes no hospedeiro, e proporcionando
alguma proteção contra o sistema imune e defesas não imunes (CANETTIERI; et
al.,2006).
3.2.2.3 Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes ou estreptcoco beta-hemolítico é uma epécie
bacteriana mais frequentemente associada à etiologia de infecções primárias da
faringe e amígdalas. O paciente pode apresentar febre alta e dor à deglutição,
com mal estar geral, anorexia e astenia, sintomas que principalmente em crianças
podem ser acompanhados por náuseas, vômitos e dor abdominal (SCALABRIN;
et al.,2003). Esse microrganismo é resposável por causar a febre reumática que é
uma complicação da infecção pelo estreptococo beta-hemolítico do grupo A. É a
principal causa da doença cardíaca adquirida em crianças e adultos jovens em
todo o mundo, mas é também a cardiopatia de mais fácil prevenção.
30
Existem 3 principais mecanismos responsáveis pela patogenia da febre
reumática. O primeiro deve-se a infecção direta pelos estreptococos do grupo A, o
segundo a um efeito tóxico dos produtos extracelulares do estreptococo sobre os
tecidos do hospedeiro e por último uma resposta imune anormal a um ou mais
antígenos extracelulares não identificados produzidos por todos ou, talvez, por
alguns, estreptococos do grupo A.
Verifica-se que as cepas reumatogênicas demonstram grande aderência
às células da mucosa da faringe dos pacientes reumáticos, em contraste com as
cepas não reumatogênicas, propriedade que habitualmente está associada a
maior quantidade de proteína M no estreptococo. O fator reponsável pela
aderência é o ácido lipotecóico, presente nas fímbrias da proteína M, que se une
à fibronectina das células da mucosa da orofaringe. Aceita-se que o fator
essencial na patogenia da febre reumática é a exposição de um indivíduo com
uma anormalidade imunológica geneticamente determinada, a um estreptococo
do grupo A que apresenta potencial reumatogênico, possivelmente relacionado a
antígenos de reação cruzada com o tecido do hospedeiro (Liga de Reumatologia
de Porto Alegre, www. Ufrgs.br/ligadereumatologia, agosto 2009).
3.2.2.4 Staphylococcus aureus
São cocos Gram-positivos aeróbios ou anaeróbios facultativos, coagulase-
positiva que se apresentam tipicamente em agrupamentos nos esfregaços
corados. É o patógeno humano mais importante entre o gênero Staphylococus,
sendo amplamente distribuído na natureza podendo ser isolados de ambiente,
mucosa e outros sítios corpóreos dos seres humanos. Embora faça parte da
microbiota normal podem produzir infecções oportunistas estando na maioria dos
casos associados à inflamação purulenta, produzindo abscessos, além se
também serem responsáveis por impetigo, furúnculo, osteomielite, artrite
infecciosa e intoxicação alimentar (KONEMAN, 2001).
31
3.2.3 Bactérias Gram-negativas
3.2.3.1 Porphyromonas gingivalis
Porphyromonas gingivalis é uma bactéria anaeróbia, Gram-negativa presente
em diversas formas de doença periodontal. Essa bactéria apresenta relevância
etiológica na iniciação e progresso da peridontite e demonstraram associação
com doenças periodontais destrutivas. As bactérias do gênero Porphyromonas
possuem fímbrias que atuam na fixação dos microrganismos nas células do
hospedeiro. Elas geralemente podem tolerar uma exposição ao oxigênio. Em
muitas cepas patogênicas, observa-se a presença de catalase e de superóxido-
desmutase, que inativam o peróxido de hidrogênio e os radicais livres (O2-),
respectivamente.
A colonização por este organismo resulta em lesão tecidular, através da
produção de uma variedade de fatores de virulência e através da desregulação
dos sistema imune e inflamatório do hospedeiro (CARVALHO e CABRAL, 2007).
As proteases são encontradas nas bactérias do gênero Porphyromonas
proteases, que degradam as imunoglobulinas IgA, IgG e IgM proetases, e
também causam destruição tecidual devido à liberação de enzimas como
protease, colagenases, fibrino-lisinas, neuraminidases, heparinases,
glicuronidases e hemolisinas (MURRAY et al., 2000).
A expressão de muitos determinantes da virulência pelas bactérias
patogênicas é altamente regulada. Essas bactérias se adaptam a alterações do
ambiente através da ativação ou inativação de uma gama de genes associados ao
metabolismo e à virulência. A análise da expressão dos genes da virulência
constitui um dos aspectos em maiorr expansão no estudo da patogênese
microbiana, pois permite uma melhor compreensão da adaptação das bactérias à
muitas alterações na medida em que iniciam as infecções e se disseminam em
diferentes hospedeiros (MIMS, 1999)
32
3.2.4 Leveduras
3.2.4.1 Candida albicans
As leveduras do gênero Candida são microrganismos integrantes da
microbiota bucal do homem desde o nascimento. Esta condição microbiológica
propicia comumente uma relação de equilíbrio entre parasita-hospedeiro, diante
da manutenção da integridade das barreiras teciduais, relação harmônica da
microbiota autóctone e funcionamento adequado dos sitema imunológico humano,
havendo em contrapartida por parte do fungo leveduriforme, permanência
equilibrada da capacidade de aderência e da produção de enzimas e toxinas.
Alterações físicas, químicas, iatrogênicas e mecânicas, que se processsem na
cavidade bucal, como mastigação, possam entre diversos fatores descritos.
Favorecer a ruptura do esquilíbrio estabelecido entre o fungo e o hospedeiro
fazendo com que as infecções por Candida sejam de origem geralmente
endógena (DANIEL; et al., 2005).
3.2.5 Fármaco utilizado – Clorexidina
A clorexidina foi desenvolvida nos anos 40 pela Indústria Química Imperial
na Inglaterra e introduzida no mercado em 1954 como um anti - séptico para
ferimentos na pele. Esta substância foi utilizada inicialmente na Odontologia para
desinfecção pré-cirúrgica e na Endodontia (ADDY e MORAN 1997). A clorexidina
pode ser adquirida em farmácias de manipulação sob a forma de uma solução
aquosa de digluconato de clorexidina nas concentrações de 0,2 a 2,0%,
(ZEHNDER, 2006 ;LOPES et al., 2004) Esta substância vem sendo utilizada na
endodontia como solução irrigadora e medicação intracanal devido à sua
atividade anti bacteriana de amplo espectro, baixa citotoxicidade e por apresentar
substantividade, isto é, ela se liga à hidroxiapatita do esmalte ou dentina e a
grupos aniônicos ácidos de glicoproteínas, sendo lentamente liberada à medida
que a sua concentração no meio decresce, permitindo desse modo um tempo de
atuação prolongado (LOPES; et al., 2004).
33
É um antibacteriano de largo espectro, do grupo das biguanidas, com
propriedade catiônica, alto poder desinfetante, que controla a placa bacteriana em
humanos. É uma molécula simétrica e estável, tendo afinidade com as bactérias,
agindo através da interação eletrostática de sua carga positiva com a negativa da
parede celular bacteriana, o que aumenta a permeabilidade desta parede,
ocorrendo a ruptura e precipitação do citoplasma, causando a morte do
microorganismo. O mecanismo de ação antibacteriano da clorexidina começa
com a ligação na parede celular da bactéria, quando a adsorção das cargas
positivas da molécula da substância às cargas negativas das superfícies
bacterianas aumenta a permeabilidade da parede celular do microorganismo e
permite que o agente penetre no citoplasma, ocorrendo o rompimento da
membrana celular e fuga dos componentes intracelulares (RECHE, 2005).
O uso diário da solução com a clorexidina apresenta efeitos colaterais
indesejáveis como manchas nos dentes e na língua, perda do paladar e sensação
de queimação na mucosa oral.
O uso de produtos fitoterápicos naturais pode contribuir no controle do
crescimento desordenado da microbiota oral contornando transtornos
ocasionados por cepas resistentes devido ao uso indiscriminado dos
antimicrobianos convencionais (SILVA; et al., 2006; SALGADO; et al.,2006).
3.2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento do microrganismo-teste; esse valor é conhecido como Concentração
Mínima Inibitória (CMI). Um aspecto bastante relevante na determinação da CMI
de extratos vegetais é a preocupação em relação aos aspectos toxicológicos,
microbiológicos e legais pertinentes dos compostos naturais ou suas
combinações (PINTO; et al., 2003).
34
A pesquisa de novos agentes antimicrobianos se faz necessária devido ao
surgimento de microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais,
associadas a AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), quimioterapia
antineoplásica e transplantes (PENNA; et al., 2001). O estudo de agentes
antimicrobianos tem grande abrangência, sendo ponto crucial em vários setores
do campo farmacêutico e cosmético. Outro ponto a ser ressaltado é a descoberta
da atividade farmacológica de novos agentes, sendo de extrema importância,
principalmente em um país como o Brasil que oferece uma imensa
biodiversidade. Desta forma, tais pesquisas podem contribuir significativamente
no desenvolvimento do campo da saúde em nível mundial, encontrando
substâncias mais eficazes e menos tóxicas na corrida contra a resistência e o
surgimento de microrganismos patogênicos (MENG; et al., 2000; HO; et al., 2001;
MICHELIN; et al., 2005; LEITÃO; et al., 2006; LIMA; et al., 2006b; BARBOSA-
FILHO; et al., 2007; SAÚDE-GUIMARÃES; e FARIA, 2007).
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana
e antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem método de
difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição. Para determinar a CMI
ou a Concentração Mínima Bactericida (CMB) de extratos ativos de plantas, tem-
se utilizado um método sensível de microdiluição desenvolvido por Eloff em 1998.
As variações referentes à determinação da CIM (Concentração Mínima
Inibitória) de extratos de plantas podem ser atribuídas a vários fatores. Dentre
eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e a cepa utilizada no
teste, à origem da planta, a época da coleta, se os extratos foram preparados a
partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada. Assim, não
existe método padronizado para expressar os resultados de testes
antimicrobianos de produtos naturais (FENNEL; et al., 2004)
35
Dados sobre a atividade antimicrobiana de extratos vegetais e fitofármacos,
avaliada frente a microrganismos sensíveis e resistentes a antibióticos, bem como
o possível efeito sinérgico da associação entre antibióticos e extratos, são
relevantes, permitindo concluir que estudos mais detalhados sobre o uso
terapêutico das plantas devem ser intensificados (NASCIMENTO et al., 2000).
36
4.PARTE EXPERIMENTAL
37
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. MATERIAL BOTÂNICO
Raízes de Euclea natalensis foram coletadas na região da Manhiça, zona
Maluane de coordenadas de GPS (Global position satelite) S25 32 33.0 e E 032 39
41.5 . A planta foi identificada pelo Engenheiro Agrônomo, Ernesto Macamo Amamo,
do jardim botânico e uma exsicata desta planta foi depositada no Herbarium do
Jardim Botânico da Universidade Eduardo Mondlane, cidade de Maputo.(Carla
Neves Número 01)
4.2. OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO DE EUCLEA NATALENSIS
As raízes da planta fresca foi submetida à secagem à temperatura ambiente
por 120 horas.100 g de raízes da planta secas foram moídas no moinho IKA® Works,
Yellow line A10, foram extraídos por maceração a frio com agitação num agitador de
marca Labcon, com etanol absoluto (Fisher Scientific), até esgotamento, filtrado por
funil de placa porosa 4.0. O etanol foi utilizado devido a sua polaridade ter afinidade
por um maior número de compostos químicos.O extrato obtido foi concentrado em
evaporador rotativo de marca Buchi Waterbath B-480, Buchi Vacuum Controler V-
800, Buchi Vac® V-500, depois seco em estufa a 35C.
4.3. MATERIAIS E MÉTODOS
4.3.1. Substâncias e Meios de Cultura
Meio de cultura: Caldo nutritivo BHI (Brain Heart Infusion Merck) e Ágar
Mueller Hinton (Merck), meio RMPI 1640 (Merck), Tioglicolato de sódio,
Digluconato de clorexidina 0,12% (Farmácia de Manipulação), Etanol absoluto
(Fisher), TTC (Cloreto de Trifenil Tetrazólio), Extrato bruto etanólico de Euclea
natalensis.
38
4.3.2. Microrganismos
Para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) da clorexidina e
do extrato etanólico de Euclea natalensis foram utilizados os seguintes
microrganismos: Streptococcus mutans ATCC 00446, Streptococcus pyogenes
isolado clínico (IC) 01, Streptococcus agalactae (IC) 02, Staphylococcus aureus
(IC) 17, Porphyromonas gingivalis ATCC 49417, Candida albicans (IC) 01, 02 e
04.
4.3.3. Equipamentos e materiais
Estufa de marca FANEM, Capela de fluxo laminar (TECNAL),Placas de Petri,
Pipetas automáticas de volumes ajustáveis de 5 a 100µL e 20 a 1000µL.
Microplacas estéreis de 96 cavidades e fundo em “U” (TRP-92096).
4.3.4. Metodologia
4.3.4.1. Preparo da suspensão de microrganismos para verificação da
concentração inibitória mínima (CIM) do extrato de Euclea
natalensis A.DC.
Com auxílio de alça de platina,calibrada (10µL), foram transferidas para
5mL de meio de cultura Mueller Hinton e incubado por 18h a 37°C. A suspensão
do inóculo foi preparada utilizando água destilada esterilizada sendo a
concentração ajustada para 108UFC/mL conforme comparação com a opacidade
com o tubo 0,5 da escala de Mc Farland.
Para padronização das leveduras foi utilizada metodologia similar, usando
o meio Sabouraund dextrose e incubados a 22°C 2°C.
39
4.3.4.2. Determinação da Atividade Antimicrobiana e da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do Extrato de Euclea natalensis.
Para isto foi preparada uma solução de digluconato de clorexidina na
concentração de 1,2mg/mL. Esterilizada no sistema milipore 0,45m.
Uma suspensão do extrato foi preparada usando o sistema composto de água
aquecida/Tween 80/Etanol (8,5:3:0,5) na concentração de 2000µg/mL.
Esterilizadas em sistema milipore com membrana de 0,45m.
A concentração inibitória mínima foi realizada segundo a metodologia de diluição
em meio líquido proposto pelo Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI.
Foram utilizadas microplacas estéreis (TRP-92096) de 96 orifícios. Para o teste
foram usadas placas distintas para clorexidina e para o extrato da planta.
Um volume de 200µL de cada solução padronizada foram depositadas em cada
orifício às colunas 1 a 8 da linha A.
As demais cavidades foram preenchidas com 100µL de caldo Mueller-Hinton
(Merck) para os ensaios com as bactérias e RMPI 1640 Merck, meio de cultura
desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial, feito com tecido animal
desidratado e usado para as leveduras. Em seguida, uma alíquota de 100 µL do
conteúdo de cada orifício da linha A foi trasnferido para os orifícios da linha B, e
após homogeneização, o mesmo volume foi transferido para linha C, sendo este
procedimento repetido até a linha H. Assim obteve-se concentrações
decrescentes dos produtos que variavam de 200mg/mL a 0,015µg/mL para o
extrato de Euclea natalensis e de 1,2 a 0,009mg/mL para a clorexidina.
Os inóculos microbianos na concentração de 108 UFC/mL (0,5 de McFarland)
foram diluídos em água estéril 1/10 e desta diluição um volume de 5 µL
(104UFC/mL) foi transferido para os orifícios das linhas A-H, sendo que cada
coluna 1 a 8 foi inoculado com microrganismo pré-escolhido. As placas foram
incubadas a 37°C por 24 horas para bactérias e 30°C por 48 horas para as
leveduras. Posteriormente a incubação e viabilidade microbiana foi realizada com
depósito em cada poço 20µL da solução 0,5% de 2,35 – Trifenil tetrazólio e as
placas reincubadas, sendo que as bactérias Porphyromonas gingivalis e
Streptococcus mutans foram incubadas em anerobiose com sachet.
40
200µL do extrato + 5µL do inoculo
(104 UFC/mL) Caldo
Mueller
Hinton
100µl
FIGURA 7. Esquema da técnica da CIM
O tratamento estatístico que foi utilizado nesse experimento foi o programa Soft
Graphpad Prism 5.0, análise pelo T de Student dados pareados.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo os valores da concentração inibitória mínima (CIM) do
gluconato de clorexidina são discretamente inferiores aqueles obtidos para o extrato
de Euclea natalensis frente aos microganismos ensaiados, mas quando esses
valores foram comparados entre si foi observado que não houve diferença
estatisticamente significativa entre estes resultados (p<0,05), estão apresentados na
tabela 1, página 35. O extrato inibiu o crescimento de Streptococcus pyogenes numa
concentração de <0,15 mg/mL, sendo essa a menor concentração do extrato usada
nesse estudo. Os microrganismos mais resistentes são Streptococcus mutans e
Porphyromonas gingivalis onde tiveram seu crescimento suprimido numa
concentração inibitória mínima de 1,0 mg/mL.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
41
Também corroborando os estudos realizados por Stander e Van Wyk (1991)
onde avaliou-se usuários e não usuários das raízes de Euclea natalensis,observou-
se que o crescimento da bactéria Streptococcus mutans foi suprimido pelo extrato
etanólico (STANDER e WYK, 1991).
Comparando os resultados da determinação da concentração inibitória
mínima (CIM) em extratos acetônicos e aquosos obtidos por Lall e Meyer (2000),
respectivamente 0,5g/mL e 6,0g/mL, em relação ao microrganismo
Staphylococcus aureus, sugerem que o extrato etanólico apresentou uma
concentração inibitória mínima menor de 0,125 mg/mL, corroborando assim os
estudos daqueles pesquisadores.
As bactérias Gram positivas parecem ser mais susceptíveis ao esfeito
inibitório do extrato do que a bactéria Gram negativa, Porphyromonas gingivalis por
exemplo. Similarmente às observações feitas por Lall e Meyer (2000) quando
testaram extratos acetônico e aquoso da Euclea natalensis A. DC. Das bactérias
testadas as Gram positivas demonstraram ser mais susceptíveis à inibição pelos
extratos comparando com as Gram- negativas.
Para as leveduras testadas, três cepas de Candida albicans, o resultado
apresenta-se na tabela 2 sendo que a mais sensível ao extrato apresentou
concentração de 0,15 mg/mL e a mais resistente inibiu o crescimento numa
concentração de 0,25 mg/mL também não havendo diferença estatisticamente
significante (p<0,05).
42
Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato de Euclea natalensis e
clorexidina
___________________________________________________________________
Microrganismos Gram+/- Extrato Clorexidina
(mg/mL) (mg/mL)
Streptococcus agalactie IC 02 + 0,25 0,15
Streptococcus mutans ATCC 00446 + 1,00 0,03
Streptococcus pyogenes IC 01 + <0,015 0,009
Staphylococcus aureus IC 17 + 0,125 0,009
Porphyromonas gingivalis ATCC
49417
- 1,00 0,009
Poços vazios
FIGURA. 8 – Fotografia representativa da determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) do extrato etanólico de Euclea
natalensis frente a Streptococcus agalactiae IC 02 (poços 1 e 2),
Streptococcus mutans ATCC 00446 (poços 3 e 4), Streptococcus pyogenes
IC 01 (pocós 5 e 6), Staphylococcus aureus IC17 (poços 7 e 8) e
Porphyromonas gingivalis ATCC 49417(poços 11 e 12).
43
Poços vazios
FIGURA 9 – Fotografia representativa da determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) do gluconato de clorexidina frente a
Streptococcus agalactae (1 e 2), Streptococcus mutans (3 e 4), Streptococcus
pyogenes (5 e 6), Staphylococcus aureus (7 e 8) e Porphyromonas gingivalis
(11 e 12).
Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) da Euclea natalensis e clorexidina
__________________________________________________________________
Microrganismos extrato (mg/mL) clorexidina (mg/mL)
__________________________________________________________________
Candida albicans IC 01 0,25 <0,009
Candida albicans IC 02 <0,015 <0,009
Candida albicans IC 04 <0,015 <0,009
44
Cepa IC01 IC 02 IC 04
FIGURA 10 – Fotografia representativa da determinação da
concentração mínima inibitória (CIM) do extrato etanólico de Euclea
natalensis frente a 3 cepas de Candida albicans. Isolado clínicos 01 (poços 1
e 2), IC02 (poços 3 e 4) e IC 04 (poços 5 e 6).
45
Cepas 01 02 04
FIGURA 11 – Fotografia representativa da determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) do gluconato de clorexidina frente a 3
cepas de Candida albicans. Isolado clínicos 01 (poços 1 e 2), IC 02 (poços 3
e 4) e IC 04 (poços 5 e 6).
Em ensaio preliminar também sobre atividade antimicrobiana foi observado
que os extratos de Euclea natalensis obtidos com éter de petróleo e clorofórmio a
partir de suas raízes foram capazes de inibir o crescimento de Staphylococcus
aureus numa concentração de 0,3 mg/ml (KHAN; et al.,1978). No presente estudo
obtivemos uma concentração inibitória mínima de 0,125mg/mL apresentando dessa
forma uma melhor atividade quando comparado com o extrato de éter de petróleo e
clorofórmio com os outros solventes acima citados.
.
46
5.ESTUDO TOXICOLÓGICO
47
5.1.1. Ensaio Toxicológico
5.1.1.1. Introdução
Estudos de toxicidade aguda constituem o primeiro teste toxicológico
realizado com um novo produto. A toxicidade aguda avalia os efeitos tóxicos
detectados após administração de um agente em doses única ou múltiplas em 24h,
tendo como propósito determinar a sintomatologia a curto prazo após a
administração de um composto, bem como o binômio dose-efeito letal, que é
estimada por um parâmetro denominado dose letal 50%, mais conhecida como DL50
(LITCHFIELD e WILCOXON, 1949).
A determinação da DL50 no estudo de novos medicamentos é um importante
parâmetro, pois é a partir dela que podemos determinar as doses que podem
serem utilizadas na forma farmacêutica acabada. Uma vez que é um dos requisitos
a ser atendido para avaliação tóxica de novos medicamentos.
A DL50 foi desenvolvida por Trevan (1927) com o objetivo de padronizar
biologicamente a potência dos extratos de digitális e outras drogas. Este parâmetro
é estatístico e representa a probabilidade de uma dose causar efeito letal em
metade da população dos animais em estudo (FOWLER e RUTTY, 1983;
PAUMGARTEN; et al., 1989).
Os ensaios de toxicidade aguda são comumente realizados em camundongos
e ratos, embora em certos casos também se utilizam animais maiores, como
coelhos e cães. Recomenda-se a mesma via de administração utilizada no homem,
sendo a via oral a mais comum (KLAASSEN; et al.,1996).
O presente estudo objetiva a determinação de DL50 e toxicidade aguda da raiz
de Euclea natalensis em ratos Wistar.
48
5.1.2. Materiais e Métodos
5.1.2.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus) provenientes do Biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de
Pernambuco. Os animais receberam água e ração (Labina®) ad libitum e foram
mantidos em condições controle de iluminação (ciclo 12h claro/escuro) e
temperatura (22 ± 2ºC) O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pernambuco,
processo n 23076.027573/2009-49.
5.1.2.2. Material Botânico
O material botânico utilizado foi constituído pelas raízes secas de Euclea
natalensis A.DC. sob a forma de extrato etanólico (EE), (50g do material vegetal
para 100mL de álcool absoluto, produzido e fornecido pelo Laboratório de
Farmacologia e Toxicologia Pré-Clínica de Produtos Bioativos da Universidade
Federal de Pernambuco. O extrato etanólico (EE) foi concentrado na temperatura de
35°C para eliminação do solvente orgânico, em rotaevaporador, em seguida o
material foi ressuspenso em água destilada.
5.1.2.3. Toxicidade aguda
Dois grupos (controle e EE) de ratos machos (n=4/grupo) foram privados de
ração por 12 horas e em seguida receberam por via oral EE (5g/kg de massa
corporal). Após a administração, os animais foram observados individualmente
durante os primeiros 30 minutos e a cada hora, durante as primeiras 6 horas e
diariamente por um período de até 14 dias. Os animais foram observados
diariamente quanto ao consumo de ração e água, alterações gerais de
comportamento e sinais clínicos de toxicidade (MALONE, 1977).
49
5.1.3. Resultados e discussão
5.1.3.1. Toxicidade aguda
O Extrato etanólico na dose de até 5,0g/kg administrado por via oral em ratos
Wistar não produziu morte em nenhum grupo por um período de 14 dias de
observação. Os animais não mostraram sinais clínicos de toxicidade ou alteração
comportamental. Não houve alteração do ganho de massa corporal em ambos os
grupos durante os 14 dias de observação (figura 12). Da mesma forma o consumo
de água e ração não foram modificados (Figura 13 e 14).
0
100
200
300
400Controle (água)
EEEn (5g/kg)
14o1o 7o dia
Massa c
orp
ora
l (g
)
FIGURA 12: Efeito do extrato etanólico de Euclea natalensis (EEEn) sobre o ganho
de massa corporal de ratos Wistar durante 14 dias de observação (n=4/grupo).
50
0 2 4 6 8 10 12 140
20
40
60Controle (água)
EEEn (5g/kg)
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de á
gu
a (
mL
/dia
/rato
)
FIGURA 13: Efeito do extrato etanólico de Euclea natalensis (EEEn) sobre o
consumo de água de ratos Wistar durante 14 dias de observação (n=4/grupo).
0 2 4 6 8 10 12 140
20
40
60Controle (água)
EEEn (5g/kg)
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de r
ação
(g
/dia
/rato
)
FIGURA 14: Efeito do extrato etanólico de Euclea natalensis (EEEn) sobre o
consumo de ração de ratos Wistar durante 14 dias de observação (n=4/grupo).
51
Dessa forma de acordo com os parâmetros avaliados de consumo de água e
ração, indicam que o extrato etanólico da raízes de Euclea natalensis não
apresentou efeitos tóxicos gerais pois estes parâmetros são indicativos de toxicidade
sistêmica (MELLO et al., 2006).
52
6. CONCLUSÕES GERAIS
No presente estudo pode-se concluir que obteve-se o extrato bruto das raízes de
Euclea natalensis o qual mesmo apresentou atividade antimicrobiana relevante
sobre os microrganismos testados, para as doenças que afetam a cavidade oral
dentre elas cárie, doença periodontal, amigdalite, faringite, febre reumática
candidíase, entre outras.
Os principais microrganismos que tiveram mais sensibilidade ao extrato etanólico
das raízes de Euclea natalensis foram Streptococcus pyogenes, Staphylococcus
aureus,Streptoccoccus agalactiae e Candida albicans.
O extrato das raízes de Euclea natalensis não apresentou toxicidade aguda no
ensaio de determinação da DL50 nos animais testados. Os parâmetros de consumo
de água e ração não foram alterados indicando que o extrato não é tóxico.
53
7. PERSPECTIVAS
- Padronização do extrato etanólico.
-Doseamento das naftoquinonas, triterpenos e polifenóis no extrato etanólico
em HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência)
-Avaliação da toxicidade sub-crônica e crônica;
-Produção de uma forma farmacêutica para área odontológica;
54
8.REFERÊNCIAS
55
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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