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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARLOS HENRIQUE TABOSA PEREIRA DA SILVA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, ANTIOXIDANTE E
CITOTÓXICA DE Sapium glandulosum (L.) Morong E Caesalpinia pyramidalis Tul. VISANDO
O DESENVOLVIMENTO DE UM GEL ODONTOLÓGICO
RECIFE, 2012
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARLOS HENRIQUE TABOSA PEREIRA DA SILVA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, ANTIOXIDANTE E
CITOTÓXICA DE Sapium glandulosum (L.) Morong E Caesalpinia pyramidalis Tul. VISANDO
O DESENVOLVIMENTO DE UM GEL ODONTOLÓGICO
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Profa. Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim (Orientadora)
RECIFE, 2012
. .
Catalogação na Publicação (CIP)
Bibliotecária: Gláucia Cândida da Silva, CRB4-1662
S586e Silva, Carlos Henrique Tabosa Pereira da. Estudo fitoquímico e avaliação da atividade antimicrobiana, antioxidante e citotóxica de Sapium glandulosum (L.) morong e Caesalpinia pyramidalis Tul. visando o desenvolvimento de um gel odontológico / Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva. – Recife: O autor, 2012.
99 folhas : il. ; 30 cm. Orientador: Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco, CCS.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2012. Inclui bibliografia e anexos. 1. Fitoterapia. 2. Estomatite sob Prótese. 3. Plantas da Caatinga. 4.
Sapium. I. Amorim, Elba Lúcia Cavalcanti de (Orientadora). II. Título. 615.3 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2012-225)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Vice-Reitor
Sílvio Romero de Barros Marques
Pró-Reitor para assuntos de Pesquisas e Pós-Graduação
Francisco de Sousa Ramos
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Nicodemos Teles de Pontes Filho
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Vânia Pinheiro Ramos
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Dalci José Brondani
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Antônio Rodolfo de Faria
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Nereide Stela Santos Magalhães
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Ana Cristina Lima Leite
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Dedico esta tese aos meus pais Carlos e
Fátima, que me viram nascer, crescer e
realizar minhas conquistas. Às Minhas
irmãs Andresa e Amanda, que escreveram
comigo minha história. Aos meus avós
paternos Maria de Jesus e Graciliano (In
Memorian) pelo convívio no período em que
tudo começou. À minha noiva Wanessa que
compartilha meus pensamentos e idéias.
Obrigado por todo o carinho, incentivo e
paciência durante estes quatro anos.
Muito obrigado!
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser o princípio de tudo o que temos.
À Universidade Federal de Pernambuco, e em especial ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, por ter concedido a realização deste curso.
À minha amiga e orientadora Profª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim, pois sempre
soube dosar seus ensinamentos, tendo paciência quando precisei e disponibilidade nos
meus momentos de inspirações, contribuindo integralmente na conquistadeste título de
Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Aos professores Gardênia Carmen Gadelha Militão, Maria Nelly Caetano
Pisciottano,Teresinha Gonçalves da Silva e ao aluno de doutorado Marcos Saraiva por toda a
contribuição realizada no transcorrer desta tese.
Aos professores, Janete Magali de Araújo, Karina Perrelli Randau,Thiago Antônio de
Sousa Araújo, Teresinha Gonçalves da Silva, Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho eIvone
Antônia de Souzapor terem aceitado o convite e contribuírem com este trabalho.
Aos meus amigos do Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT) Allan, Clarissa,
Daniel, Daniela Cabral, Daniela Sena, Danielle Lima, Elvis, Jenifer, Jorge, Luma, Tássia, Valéria
e em especial a Tadeu “bola de ouro”, Joabe, Thiago e Valérium, por acreditar no caminhar
deste trabalho e por tentarmos sempre ser campeões, através da nossa “Seleção de Futsal”
nas várias edições do Interfarma, das quais participamos.
A todos os professores e alunos do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, que contribuíram direta e indiretamente para a conclusão deste estudo.
A todos vocês, meu muito obrigado!
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“A memória é algo cheio de truques, pode
tornar um segundo interminável, assim como
ajudar a reviver várias vezes momentos
inesquecíveis ao lado das pessoas que
amamos. O homem deve cultivar a memória
como um de seus maiores bens para o futuro”.
Henrique Tabosa
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1.Indivíduo de Sapium glandulosum (LORENZI, 1998) 16
Figura 2. Folhas, ramos e frutos de Sapium glandulosum (Foto do autor) 16
Figura 3. Exsicata do exemplar de S. glandulosum, catalogada no Herbário (HFP), sobre o nº 60.196 (Foto do autor)
17
Figura 4.Indivíduo de Caesalpinia pyramidalis(SARAIVA, 2007) 18
Figura 5. Folhas, flores e frutos de Caesalpinia pyramidalis(SARAIVA, 2007) 18
Figura 6. Exsicata do exemplar de C. pyramidalis, catalogada no Herbário (HFP), sobre o nº 60.195 (Foto do autor)
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11
2. REVISÃO DA LITERATURA 15
2.1 Sapium glandulosum (L.) Morong: aspectos botânicos, farmacognósticos, etnofarmacológicos e farmacológicos
16
2.2 Caesalpinia pyramidalis Tul.: aspectos botânicos, farmacognósticos, etnofarmacológicos e farmacológicos
18
2.3 Atividade antioxidante 22
2.4 Estudo de toxicidade seletiva frente Artemia salina Leach 23
2.5 Atividade antimicrobiana 24
2.6 Atividade citotóxica 25
2.7 Desenvolvimento farmacotécnico de formulações 26
2.8 Avaliação da estabilidade de formulações 26
3. OBJETIVOS 31
3.1 Objetivo Geral 32
3.2 Objetivos específicos 32
4. ARTIGO 1: Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Caesalpinia pyramidalis Tul. and Sapium glandulosum (L.) Morong from Northeastern Brazil
33
5. ARTIGO 2: Phytochemical profile and antibacterial activity of bark and leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. and Sapium glandulosum (L.) Morong.
47
6. ARTIGO 3: Cytotoxic activity and brine shrimp lethality assay of the extracts of barks and leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. and Sapium glandulosum (L.) Morong.
55
7. ARTIGO 4: Desenvolvimento farmacotécnico e avaliação da estabilidade de gel bucal com extrato de Caesalpinia pyramidalis Tul.
68
8. CONCLUSÃO 87
REFERÊNCIAS 89
ANEXOS 97
9
RESUMO
No Brasil, os recursos terapêuticos encontrados são bastante abundantes, porém ainda pouco explorados, em especial, em regiões como o Nordeste, para biomas como a Caatinga. Os objetivos deste trabalho foram determinar o perfil fitoquímico e avaliar a atividade biológica e antioxidante de Sapium glandulosum (L.) Morong e Caesalpinia pyramidalis, desenvolver farmacotecnicamente géis bucais, a partir do material mais promissor e avaliar a estabilidade destes produtos. As coletas das duas espécies foram realizadas no município de Caruaru/PE. Os conteúdos de fenóis totais e taninos foram determinados pelo método Folin-Ciocalteu e o conteúdo de flavonóides pelo método de complexação com cloreto de alumínio. A atividade antioxidante foi analisada pelo ensaio do DPPH e ensaio quelante do íon ferroso (FIC). A caracterização fitoquímica foi realizada por cromatografia em camada delgada. O método de difusão em ágar foi utilizado para determinar a atividade antimicrobiana dos extratos e em seguida determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM). A toxicidade seletiva foi avaliada frente às larvas de Artemia salina Leach e a atividade citotóxica frente às linhagens Hep-2 e NCI-H292 pelo método do MTT. O desenvolvimento farmacotécnico foi realizado através de um estudo quali-quantitativo na produção de géis bucais com diferentes polímeros, seguido de avaliações da estabilidade. Os níveis de fenóis totais variaram de 135,55 ± 9,85 mg equivalentes de ácido tânico (EAT)/g nas cascas de S. glandulosum a 459,79 ± 11,65 mg EAT/g nas folhas de C. pyramidalis e o conteúdo de flavonóides foi elevado nas folhas das duas espécies. O extrato etanólico das cascas de C. pyramidalis apresentou melhor CI50 (16,98 ± 1,34 µg/mL), valor menor que o obtido com a rutina, utilizada como padrão. Os ensaios fitoquímicos apresentaram derivados antracênicos, flavonóides e monoterpenos em todas as amostras. Nos estudos microbiológicos, o extrato das cascas de C. pyramidalis foi ativo contra Enterococus faecalis, Staphylococus aureus e S. coagulase-negativa, sendo os extratos das folhas e cascas de S. glandulosum ativos contra os dois últimos. Os resultados da toxicidade seletiva frente às larvas de A. salina variaram de 1618,44 ± 271,02 µg/mL para o extrato das folhas de C. pyramidalis a 2655,50 ± 15,40 µg/mL para o extrato das folhas de S. glandulosum, todos considerados atóxicos. As espécies estudadas não apresentaram atividade citotóxica nas linhagens testadas, confluindo com os achados atóxicos com A. salina. No desenvolvimento farmacotécnico utilizou-se o extrato das folhas de C. pyramidalis, o que resultou seis lotes de produtos com características quali-quantitativas diferentes, dos quais apenas o gel oriundo do polímero carbopol 940 mostrou-se resistente às agressões sofridas pelas avaliações da estabilidade. O presente trabalho fornece informações sobre espécies com potencial antioxidante, antimicrobiano e que foram considerados atóxicos, nos ensaios realizados, permitindo o desenvolvimento futuro de produtos que possam contribuir com a saúde da população. Palavras chaves: Fitoterapia, Estomatite sob Prótese, Plantas da Caatinga, Sapium.
10
ABSTRACT
In Brazil, therapeutic resources found are still fairly abundant, but largely unexplored, especially in regions such as the Northeast, for as Caatinga biomes. The objectives of this study were to determine the phytochemical profile and evaluate the biological activity and antioxidant Sapium glandulosum (L.) and Caesalpinia pyramidalis Morong, pharmacotechnical develop oral gels, from the most promising material and assess the stability of these products. The collections of the two species were carried out in the Caruaru city, Pernambuco. The content of total phenols and tannins were determined by the Folin-Ciocalteu and flavonoid contents by the method of complexation with aluminum chloride. The antioxidant activity was evaluated by DPPH assay and testing of ferrous ion chelating (FIC). The phytochemical characterization was performed by thin layer chromatography. The agar diffusion method was used to determine the antimicrobial activity of the extracts and then determined the minimum inhibitory concentration (MIC). The selective toxicity was evaluated against the larvae of Artemia salina Leach and cytotoxic activity against strains to Hep-2 and NCI-H292 by the method of MTT. The pharmacotechnical development was performed using a qualitative and quantitative study in the production of polymers with different buccal gels, followed by stability assessments. Levels of total phenols ranged from 135.55 ± 9.85 mg tannic acid equivalents (TAE)/g in the bark of S. glandulosum to 459.79 ± 11.65 mg TAE/g in the leaves of C. pyramidalis and the content of flavonoids was high in leaves of the two species. The ethanol extract of the bark of C. pyramidalis showed better IC50 (16.98 ± 1.34 mg/mL) value lower than that obtained with rutin, used as standard. The tests showed phytochemicals antracênicos derivatives, flavonoids and monoterpenes in all samples. In microbiological studies, the extract from the bark of C. pyramidalis was active against Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus and S. coagulase-negative, being extracts from the leaves and bark of S. glandulosum active against the latter two. The results of selective toxicity against the larvae of A. saline ranged from 1618.44 ± 271.02 mg/mL for the extract of the leaves of C. pyramidalis to 2655.50 ± 15.40 mg/mL for the extract of the leaves of S. glandulosum, all considered nontoxic. Species studied showed no cytotoxic activity in the tested lines, converging with findings nontoxic to brine shrimp. In developing pharmacotechnical used the extract of C. pyramidalis, resulting six batches of products with different qualitative and quantitative characteristics of which only the gel polymer derived carbopol 940 was resistant to attacks suffered by stability assessments. This paper provides information on species with potential antioxidant, antimicrobial and were considered non-toxic in the tests, allowing the future development of products that contribute to the health of the population. Keywords: Phytotherapy, under Denture stomatitis, Caatinga Plants, Sapium.
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1. Introdução
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1. INTRODUÇÃO
Não existem registros oficiais sobre quando, exatamente, foi iniciado o uso de
plantas com intuitos medicinais pelos homens, aponta-se sempre, de forma genérica,
para as antigas civilizações (PANIS et al., 2010; PLETZ; SPANIOL; PETROVICK, 2010).
Atrelado a este uso pela medicina popular, ergueram-se grupos temáticos que se
consolidaram e formaram os alicerces de novas ciências, tais como a etnofarmacologia
e a etnobotânica, o que gerou os estudos etnodirigidos (ALBUQUERQUE; HANAZAKI,
2006; OLIVEIRA; KFFURI; CASALI, 2010). Tais estudos visam o conhecimento sobre os
recursos naturais utilizados na medicina tradicional de um povo. Dentre os vários fins
para estas pesquisas, encontramos um que por si mesmo justifica tamanho esforço,
embora considerações éticas mais aprofundadas sejam necessárias, é ele: o
encurtamento do tempo para a descoberta de novos fármacos, potencialmente
melhores, do ponto de vista farmacológico e toxicológico, para o tratamento de
doenças que já apresentam alternativas terapêuticas ou para aquelas ainda sem
fármacos elucidados (COSTA et al., 2010).
O Brasil, como bem relatado (MARINELLI et al., 2008; BISPO; KUPLICH, 2010;
CAMARGO et al., 2012), possui uma das maiores biodiversidades do planeta, todavia,
não apresenta instrumentos suficientes para explorá-la. Assim, endossa o dilema já
bastante debatido sobre a dicotomia “Tecnologia x Biodiversidade”, no qual países
desenvolvidos possuem alta tecnologia, porém baixos recursos da biodiversidade, por
já terem sido consumidos ou por nunca terem existido (KLEIN et al., 2009; MARINELLI
et al., 2008). Já países ditos em desenvolvimento apresentam, em sua maioria, grande
biodiversidade, mas poucos recursos tecnológicos. Certo há que a biodiversidade tem
um valor estratégico ainda inestimável, entretanto, neste momento discussões acerca
dos mecanismos de defesa contra a exploração dos nossos Biomas por outras nações
estão sendo realizadas (ALBAGLI, 2010; BANERJEE; ALAVALAPATI, 2010; KISHI, 2010).
No Brasil encontramos vários Biomas, sendo os de mais destaques: pantanal,
cerrado, mata atlântica, caatinga e a floresta amazônica. Destes, os de mais renomes
dentro e fora do país é a floresta amazônica e a mata atlântica, ambas já bastante
13
dizimadas pelo desmatamento desenfreado, causado pelos homens (GRELLE et al.,
2009).
O Bioma da caatinga foi por muito tempo deixado de lado, semelhante à região
Nordeste, quanto ao interesse de grupos de pesquisas em avaliar, em vários campos, a
biodiversidade presente (CARVALHO; FREITA, 2005; BISPO; VALERIANO; KUPLICH,
2010). Acreditava-se que pouco havia a ser descoberto, porém estas crendices iniciais
já foram superadas e muitos grupos de pesquisa se empenham no sentido de explorar
e descobrir potenciais novos fármacos ou agentes medicamentosos, como já vem sido
relatado em artigos nos últimos anos (USTULIN et al., 2009; JESUS et al., 2009).
Entre os principais focos de pesquisa no cenário mundial, no momento, estão
aquelas relacionadas à descoberta de novos agentes antioxidantes, antimicrobianos e
anticancerígenos (MUNTANA; PRASONG, 2010; COSTA-LOTUFO et al., 2010). A
atividade antioxidante tem sido pesquisada e proposta por diferentes metodologias
(COUTO; CANNIATTI-BRAZACA, 2010; DIAS; SOUZA; ROGEZ, 2010), as atividades
antimicrobianas através de testes com micro-organismos ditos normais e com aqueles
que apresentam certo grau de resistência aos antibióticos comuns (SILVA; RANGEL,
2010) e os anticancerígenos através de vários modelos de estudo, dentre os quais os
relacionados ao efeito citotóxico, in vitro, frente a várias linhagens de células tumorais
(OLIVEIRA et al., 2010). Sempre relacionado a estas avaliações deve existir
quantificações de possíveis substâncias responsáveis por tais efeitos, incluindo neste
presente estudo fenóis totais, taninos e flavonóides (ROSA et al., 2010; ALCÂNTARA;
YAMAGUCHI; VEIGA JUNIOR, 2010; CHAVES et al., 2010).
O Sistema Único de Saúde (SUS) acenou claramente sobre o seu interesse de
inserir as plantas medicinais como recursos terapêuticos para a população, para isso
criou recentemente a RENISUS (Relação Nacional de Plantas de Interesse ao SUS –
BRASIL, 2009). Nesta relação, há 71 espécies com divulgação mais ampla sobre sua
ação farmacológica, porém o Ministério da Saúde ressaltou que tem interesse em
inserir várias outras espécies, desde que apresentem estudos científicos que as
certifiquem, sendo, desta forma, uma ótima oportunidade para se pesquisar sobre
espécies contidas na caatinga (BRASIL, 2006; BRASIL, 2007a; BRASIL, 2007b; BRASIL,
2010).
14
C. pyramidalis e S. glandulosum são espécies facilmente encontradas na
caatinga, porém seu uso com intuito medicinal ainda se encontra muito restrito às suas
regiões. Estas espécies são comumente utilizadas para outros fins, como para
formação de carvão e madeira para estacas e marcenaria (RAMOS et al., 2008).
A veiculação de princípios ativos ou de complexos ativos (mais apropriado
quando se trabalha com plantas medicinais) necessita de uma adequada forma
farmacêutica (AULTON, 2005; ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007; FERREIRA, 2008)
para que haja o melhor efeito terapêutico. A escolha desta forma farmacêutica para
algum produto fitoterápico deve considerar a eficácia e a segurança do componente
ativo, o local de aplicação e assegurar sua qualidade; facilidade de aplicação do
medicamento, tudo isso para evitar o abandono ao tratamento (LORCA; FONSECA;
SANTOS, 2009). Entre as diversas formas farmacêuticas disponíveis, temos a gel,
baseado principalmente na presença de um polímero. Esses polímeros agem como
agentes gelificantes e suspensores que retardam a sedimentação e a aglomeração das
partículas ao atuarem como uma barreia energética que entre si, aumentam, assim, a
viscosidade e melhora a estabilidade dos produtos suspensos (LACHMAN et al., 2001).
Com o crescente uso clínico de extratos vegetais e a necessidade de
desenvolvimento farmacotécnico de formulações adequadas à veiculação destes
extratos, um novo problema começa a surgir que é a falta de estabilidade de muitos
destes produtos. A partir desta demanda, o desenvolvimento farmacotécnico e
principalmente a avaliação da estabilidade das formulações tornam-se atores
fundamentais para a obtenção de produtos estáveis e que garantam a eficácia e
segurança, critérios primordiais de acordo com a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (KLEIN et al., 2009; SILVA et al., 2009).
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2. Revisão da Literatura
16
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1Sapium glandulosum (L.) Morong.: aspectos botânicos, farmacognósticos,
etnofarmacológicos e farmacológicos
Sapium glandulosum (L.) Morong pertence a família das Euphorbiaceae,
conhecida como mofumbo-do-rio ou burra-leiteira (MOREIRA et al., 2006) apresenta
distribuição desde o México até a América do Sul. Apresenta também o nome de
murupita (CORRÊA, 1984) ou ainda laço-benedita (FLORENTINO; ARAÚJO;
ALBUQUERQUE, 2007). Possui como sinonímias, de acordo com o sítio eletrônico do
catalogue of life 2012, 144 sinonímias (CATALOGUE OF LIFE, 2012).
Botânica
Árvore pequena, folhas com pecíolo biglanduloso e limbo de 5-12 cm de
comprimento, 15-30 mm de largura, estreitamente oblongo-lanceolado, agudo e
brevemente cuspidado-acuminado, obscuramente denteado, membranoso, costa
saliente e nervuras secundárias pouco distintas; espigas androginais, brácteas
biglandulosas, na base, as masculinas 6-9 floras; flores masculinas pequenas, com
cálice bilobado e 2 estames; flores femininas com cálice tubuloso tridentado; ovário
com 3 lojas (CORRÊA, 1984). De acordo com Genini e cols (2009) esta espécie
apresentaria flores no mês de dezembro, na cidade de Ubatuba-SP, Brasil. As figuras 1,
2 e 3 mostram a árvore, as folhas e ramos do vegetal e a exsicata depositada no
herbário UFP Geraldo Mariz sob o no 60.196, respectivamente.
Uso popular
Fornece madeira amarelada, leve, para obras de marcenaria e carpintaria. Apresenta
citação pela população, pois a presença do látex a destaca dentro do Bioma Caatinga,
todavia não são relatados usos medicinais atribuídos a espécie (RAMOS et al., 2008;
ZUCHIWSCHI et al., 2010).
17
Figura 1:Sapium glandulosum (LORENZI, 1998).
Figura 2: Folhas, ramos e frutos de Sapium glandulosum(Foto do autor).
18
Figura 3: Exibe a exsicata de S. glandulosum, catalogada no Herbário (HFP), sobre o nº
60.196. Foto do autor.
2.2Caesalpinia pyramidalis Tul.: aspectos botânicos, farmacognósticos,
etnofarmacológicos e farmacológicos
Caesalpinia pyramidalis é uma leguminosa (Caesalpiniaceae), subfamília
Caesalpinioideae e gênero Caesalpinia L. distribuídas nas regiões tropicais e
subtropicais (BARROSO, 1991; MELO-PINA et al., 1999), árvore endêmica do sertão
nordestino que habita em lugares pedregosos (SILVA; MATOS, 1998), conhecida
popularmente como: “catingueira”, “pau-de-porco”, “caatinga de porco” (BRAGA,
1960), “pau-de-rato”, “mussitaiba” e “catingueira-das-folhas-largas” (CNIP, 2012).
Dentre as espécies do gênero Caesalpinia, a espécie mais conhecida é Caesalpinia
echinata “pau-brasil”, cuja madeira teve grande importância no início da colonização
do nosso país (BAHIA, 2002).
Botânica
A catingueira é uma árvore que atinge até 4 metros de altura (Figura 4) com
folhas bipinadas, 5-11 folíolos, sésseis, alternos, obtusos e oblongos. As flores são
amarelas, dispostas em racemos pouco maiores ou tão longos quanto às folhas e sua
vagem é achatada de cor escura (BRAGA, 1960) (Fig. 5 e 6). Estimativas de valores para
19
aquisição de suas sementes foram propostas por Santo e cols (2010). A catingueira é
uma das plantas sertanejas cujos gomos brotam às primeiras manifestações de
umidade, pelo qual é dita como anunciadora de períodos chuvosos (SILVA; MATOS,
1998).
Figura 4: Caesalpinia pyramidalis Tul. (SARAIVA, 2007)
Figura 5: Folhas, flores e frutos de Caesalpinia pyramidalis Tul. (SARAIVA, 2007)
20
Figura 6: Exibe exsicata de C. pyramidalis, catalogada no Herbário (HFP), sobre o nº
60.195(Foto do autor).
Uso popular
Referentes ao uso, a madeira é recomendada para lenha, carvão e estaca
(SILVA; MATOS, 1998), enquanto que as folhas fenadas constituem boa forragem
(BRAGA, 1960), sendo considerado como excelente alimento animal, por conter alto
teor protéico e menor conteúdo de fibras (ZANINE et al., 2005).
Na medicina popular as flores, folhas e cascas são usadas no tratamento das
infecções catarrais, nas diarréias e disenterias (BRAGA, 1960; AGRA et al., 2008), ainda
apresenta ação antipirética e diurética (MENDES et al., 2000). Suas flores e folhas, na
forma de xarope, são indicadas para gripe (ROQUE; ROCHA; LOIOLA, 2010).
Santos e cols (2011) e Santana e cols (2012) avaliaram como satisfatória a ação
anti-inflamatória de C. pyramidalis utilizando roedores.
Estudos fitoquímicos
No levantamento bibliográfico da espécie foi assinalado o isolamento de vários
metabólitos secundários, destacando-se polifenóis e terpenóides (MENDES et al.,
2000; BAHIA, 2002; BAHIA, 2005).Os ensaios fitoquímicos de Silva e cols (2012)
21
apresentaram derivados antracênicos, flavonóides e monoterpenos nas cascas e folhas
de C. pyramidalis.
Atividade antimicrobiana
Estudos realizados com extratos em acetato de etila, das folhas e caule de C.
pyramidalis frente a cepas de Staphylococcus aureuse Escherichia coli foram realizados
por Novais e cols (2003), obtendo halos da ordem de 10 mm, pelo método da difusão
em disco, apenas para a cepa de S. aureus. Nos estudos microbiológicos de Silva e cols
(2012), o extrato das cascas de C. pyramidalis foi ativo contra Enterococus faecalis,
Staphylococus aureus e S. coagulase-negativa.
O Instituto de Antibiótico – UFPE num “screening” de plantas superiores, C.
pyramidalis foi estudada frente às sete cepas seguintes: S. aureus, Bacillus subtilis,
Mycobacteriumsmegmatis, E. coli, Escherichia faecalis, Candida albicans e Neurospora
crassa, verificando-se atividade somente sobre as três primeiras (CHIAPPETA; MELLO,
1984/5).
Alviano e cols (2008) avaliaram a atividade das folhas de C. pyramidalis contra
bactérias que afloram a cavidade bucal: Prevotella intermedia, Porphyromonas
gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans e Lactobacillus casei,
encontrando CIM (Concentração Inibitória Mínima) de 1,0 ± 0 mg/mL, para as três
primeiras e 8,0 ± 0 mg/mL para as duas últimas, os testes foram realizados em
triplicata e calculados as médias aritmétricas.
Baseados em um trabalho sobre espécies utilizadas para o tratamento de
micoses, pela população, Cruz e cols (2007) avaliaram quatro espécies, dentre as quais
C. pyramidalis, contra Candida albicans, Candida guilliermondii e cepas clínicas de
Trichophyton rubrum, Candida guilliermondii, Fonsecaea pedrosoi e Cryptococcus
neoformans.
22
2.3. Atividade antioxidante
Os antioxidantes têm sido o objetivo de constantes pesquisas nacionais e
internacionais por apresentar diversas atividades biológicas. Contudo, há certa
dificuldade em padronizar uma metodologia que avalie a capacidade antioxidante
devido, principalmente, a diversidade química (PRATT; BIRAC, 1979). Algumas
metodologias utilizam à capacidade de sequestrar os radiais livres induzidos nas
reações, outras avaliam através da inibição da peroxidação lipídica por quantificar os
produtos da reação, bem como dos produtos de decomposição da peroxidação lipídica
ou mensurando a inibição da oxidação do lipídio do sistema pelo antioxidante a ser
testado (MELOet al., 2006; SILVA et al., 2011).
As metodologias mais comuns para se determinar a atividade antioxidante de
modo prático, rápido e sensível são as que envolvem um radical cromóforo, simulando
as espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo o radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazil) um dos mais utilizados (CANO, ACOSTA e ARNAO, 2000). À medida que o
DPPH sofre redução pelos componentes presentes na solução teste, observa-se
mudança da coloração da solução original de violeta intensa para amarela, e o grau
deste descoramento indica a habilidade do antioxidante em sequestrar o radical livre
(BLOIS, 1958). Outras metodologias, como o ensaio quelante do íon ferroso (FIC),
avaliam o processo de quelação de metais de transição que geram radicais hidroxilas
através das reações de Haber-Weiss e Fenton (CHEWet al., 2009).
Os compostos fenólicos, representados principalmente por taninos e
flavonóides, se destacam como os principais grupos de antioxidantes naturais, pois
atuam como eficientes captadores de radicais livres e interrompem as reações em
cadeia, e isto se deve ao seu potencial de agir como doadores de hidrogênio (DELAZAR
et al., 2006; GAZZANIet al., 2008).
23
2.4. Estudo de toxicidade seletiva frente Artemia salina Leach.
Artemia salina ou também, em outras regiões do Brasil, conhecida como
camarão de salmoura, é um micro-crustáceo, braquiópoda, pertencente ao filo
Arthropoda e a ordem Anostraca. Os cistos ou ovos da artemia possuem um diâmetro
médio de 0,2 a 0,3 mm com peso entre 2,8 a 4 mg. As larvas apresentam-se como
excelente dieta alimentar para peixes e crustáceos no ambiente natural, devido a isso
preferem habitar locais com difícil sobrevivência para outras espécies, como salinas
que atingem temperaturas de até 40 oC e salinidade de até 300 partes por mil, pois
nestes ambientes conseguem escapar dos predadores (STORER; USINGER, 1984).
Os laboratórios de produtos naturais vêm realizando constantemente ensaios
biológicos complementares à investigação fitoquímica, buscando orientar a descoberta
de novas drogas com potencial terapêutico. O estudo de letalidade dos extratos frente
às larvas do microcrustáceo Artemia salina Leach é um exemplo prático destes
bioensaios, que apresentam facilidade e rapidez de execução associado ao baixo custo,
favorecendo estudos rotineiros nos laboratórios. Este estudo também fornece boa
correlação entre citotoxicidade e atividade antitumoral (MEYER et al., 1982;
MCLAUGHLIN, 1991) e antitripanossomíase (ZANI et al., 1995), sendo por estas razões
uma excelente ferramenta para analisar preliminarmente a toxicidade geral (LUNA et
al., 2005).
A metodologia mais utilizada baseia-se na eclosão dos cistos em tubos de
ensaio, contendo água salina, após incubação sob luz artificial durante 48h. Utiliza-se
como controle positivo o Dicromato de potássio (K2Cr2O7) e como controle negativo
(DMSO). Os extratos a serem testados são adicionados em concentrações crescentes
(50 a 1000 µg/mL) e após 24h de exposição são quantificadas as larvas que morreram
e realizada regressão linear para determinar a Concentração letal de 50% das larvas
(CL50) (Meyer et al., 1982).
Meyer e colaboradores (1982) estabeleceram escalas para determinar o grau
de toxicidade dos extratos avaliados e apontou o seguinte: CL50 menores que 500
µg/mL indicam toxicidade; valores de CL50 entre 500 até 1000 µg/mL teriam moderada
toxicidade; e valores de CL50 acima de 1000 µg/mL seriam atóxicas.
24
2.5. Atividade antimicrobiana
Uma das atividades desenvolvidas por muitos grupos de pesquisa é a busca
ativa por novos agentes antimicrobianos. Esta busca ocorre devido à resistência de
muitos micro-organismos patogênicos aos antibióticos tradicionais. Esta resistência
microbiana acontece por diferentes fatores, sendo alvo de equipes multidisciplinares
que atuam principalmente junto a comissões hospitalares, por exemplo, na busca por
estratégias que minimizem as chances de resistência por parte dos micro-organismos.
Espera-se novas substâncias atuem por mecanismos diferentes dos atuais agentes
antibióticos e antifúngicos, impondo a necessidade permanente de pesquisa e
desenvolvimento de novas drogas (SILVER; BOSTIAN, 1993).
Doenças bacterianas e fungicas causam profundos impactos econômicos na
saúde pública, especialmente em regiões tropicais e em pacientes imunodeficientes ou
imunossuprimidos (SARAIVA, 2007).
No mundo inteiro, estudos etnofarmacológicos orientam as pesquisas para
descoberta de potentes antibióticos a partir de espécies usadas frequentemente pelas
comunidades tradicionais, como no Brasil, que mantêm programas de triagem de
produtos naturais para esta atividade (SARTORATTO et al., 2004). Uma vez que as
plantas medicinais produzem uma variedade de substâncias com propriedades
antimicrobianas, é esperado que estudos voltados à triagem possamrevelar compostos
candidatos para o desenvolvimento de novos antibióticos (AHMAD; BEG, 2001).
Os métodos mais comuns para realizar avaliações antimicrobiológicas são o
método de difusão em Agar (CLSI, 2009a) e a determinação da Concentração Mínima
Inibitória (CMI) (CLSI, 2009b). Os parâmetros utilizados para determinar atividade
antimicrobiana foram: A- método de difusão em Agar: halos menores 9 mm, inativo;
entre 9 a 12 mm, pouca atividade; entre 13 a 18 mm, ativo; e halos maiores que 18
mm, muito ativo (ALVES et al., 2000); B- Concentração Mínima Inibitória (CMI): boa
atividade quando CMI menor ou igual a 100 µg/mL; atividade moderada quando CMI
entre 100-500 µg/mL; baixa atividade quando CMI entre 500-1000 µg/mL; e inativo
quando CMI maior que 1000 µg/mL (Tanaka et al., 2005).
25
2.6. Atividade citotóxica
O câncer continua representando uma das maiores causas de mortalidade
mundiais com mais de seis milhões de mortes todos os anos (ABDULLAEV et al., 2000).
A busca por agentes anticâncer de fonte vegetal iniciou-se por volta dos anos de 1950
com a descoberta dos alcalóides da vinca, vincristina e vimblastina (CRAGG; NEWMAN,
2005). O Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI) teve a iniciativa de um
extensivo programa de coleção de plantas em 1960, focado principalmente nas plantas
da região temperada, o que levou a descoberta de muitos compostos naturais com
vasta atividade citotóxica (CASSADY; DOUROS, 1980), incluindo o taxol e a
camptotecina (CRAGG; NEWMAN, 2005).
Baseado no conhecimento que as células tumorais possuem defeitos
estruturais que impossibilitam reparar a molécula de DNA, substâncias com potencial
citotóxico seletivo que atuam sobre células deficientes, tornam-se potenciais agentes
anticancerígenos (DANTAS et al., 2005). Deste modo, tais substâncias atuam
protegendo o DNA nos danos frequentes, evitando a multiplicação desordenada das
células que resulta na formação dos tumores (REZENDE et al., 2004).
Os diferentes tipos de câncer ocorrem em função da variada natureza das
células do corpo. Por exemplo, existem diversos tipos de câncer de pele porque esta é
formada por mais de um tipo de célula. Então se o câncer tem início em tecidos
epiteliais, como pele ou mucosas, ele é denominado carcinoma. Se começa em tecidos
conjuntivos como osso, músculo ou cartilagem é chamado de sarcoma (INCA, 2012).
Além de não haver fármacos disponíveis para os diversos tipos de câncer, um
dos maiores problemas para a cura de muitos pacientes é a resistência intrínseca ou
adquirida de diversos cânceres aos agentes quimioterápicos (HUANG et al., 2003).
Neste sentido, há um crescente interesse em avaliar a ação biológica de várias plantas
usadas medicinalmente como antitumorais pela população. Estes recursos utilizados
secularmente por diferentes povos merecem atenção dos pesquisadores na busca e
desenvolvimento de novas drogas (BALANCHANDRAN; GOVINDARAJA, 2005).
26
2.7 Desenvolvimento farmacotécnico de formulações
O desenvolvimento e a formulação apropriada da forma farmacêutica
requerem a consideração das características físicas, químicas, físico-químicas e
biológicas de todos os princípios ativos ou complexos ativos (no caso de fitoterápicos)
e de todas as matérias-primas usados na elaboração dos produtos, assim como ser
considerada a anatomia e fisiologia do local de administração e absorção do produto.
O fármaco e os excipientes devem ser compatíveis entre si para gerar um produto
estável, eficaz, atraente, fácil de administrar e seguro, devem ser compatíveis também
com a via de administração. O produto deve ser manufaturado de acordo com
medidas apropriadas de controle de qualidade, e acondicionadas em recipientes que
contribuam para a estabilidade (AULTON, 2005).
Os excipientes farmacêuticos podem solubilizar, suspender, espessar, diluir,
emulsificar, estabilizar, conservar, colorir, flavorizar, entre outros, eles possibilitam a
obtenção de formas farmacêuticas estáveis, eficazes e atraentes. A maioria dos
fármacos usados atualmente não é palatável nem atraentes no estado natural, mas as
preparações farmacêuticas modernas devem chegar ao paciente em formas
farmacêuticas agradáveis para visão, olfato e paladar e ainda possuir estabilidade
contra as adversidades encontradas no meio e ainda contra processos hidrolíticos e
oxidativos (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007).
2.8 Avaliação da estabilidade de formulações
Produtos mal elaborados acarretam em insatisfação dos
consumidores/pacientes e consecutiva diminuição do uso de todos os produtos
elaborados pela empresa. Além disso, medicamentos mal elaborados, do ponto de
vista da estabilidade, podem acarretar danos a saúde, pela presença, principalmente
nos produtos finais, de dosagens subterapêuticas. Desta forma, é cada vez maior a
procura por estudos de estabilidade de formulações (MISHRA; MISHRA;
CHATTOPADHYAY, 2012).
O estudo de estabilidade fornece indicações sobre o comportamento do
produto, em determinado intervalo de tempo, frente a condições ambientais a que
27
possa ser submetido, desde a fabricação até o término da validade (D’ LEON, 2001;
BRASIL, 2004).
2.8.1 Fatores que influenciam a estabilidade
Cada componente, ativo ou não, pode afetar a estabilidade de um produto.
Variáveis relacionadas à formulação, ao processo de fabricação, ao material de
acondicionamento e às condições ambientais e de transporte podem influenciar na
estabilidade do produto (AULTON, 2005; ZANIN et al., 2001).
Conforme a origem, as alterações podem ser classificadas como extrínsecas,
quando determinadas por fatores externos; ou intrínsecas, quando determinadas por
fatores inerentes à formulação (BRASIL, 2004).
2.8.1.1 Fatores extrínsecos
Referem-se a fatores externos aos quais os produtos estão expostos, tais como:
A- Tempo: O envelhecimento do produto pode levar a alterações nas características
organolépticas, físico-químicas, microbiológicas e toxicológicas.
B- Temperatura: Temperaturas elevadas aceleram reações físico-químicas e químicas,
ocasionando alterações em: atividade de componentes, viscosidade, aspecto, cor e
odor do produto. Baixas temperaturas aceleram possíveis alterações físicas como
turvações, precipitação, cristalização.
C- Luz e Oxigênio: A luz ultravioleta, juntamente ao oxigênio, origina a formação de
radicais livres e desencadeia reações de óxido-redução. Os produtos fotossensíveis
devem ser acondicionados ao abrigo da luz, em frascos opacos ou escuros e devem ser
adicionadas substâncias antioxidantes na formulação, a fim de retardar o processo
oxidativo.
D- Umidade: Afeta principalmente as formas sólidas como talco, sabonete em barra,
sombra, sais de banho, entre outras. Podem ocorrer alterações no aspecto físico do
produto, tornando-o amolecido, pegajoso, ou modificando peso ou volume
E- Material de acondicionamento: Os materiais utilizados para o acondicionamento
dos produtos, como vidro, papel, metal e plástico podem influenciar na estabilidade,
algumas vezes sendo permeáveis a gases, outras reagindo ou adsorvendo
componentes da formulação (BRASIL, 2004).
28
F- Micro-organismos: Os produtos mais suscetíveis à contaminação são os que
apresentam água em sua formulação como emulsões, géis, suspensões ou soluções
(PINTO et al., 2000; BRASIL, 2004).
G- Vibração: Vibração, durante o transporte, pode afetar a estabilidade das
formulações, acarretando separação de fases de emulsões, compactação de
suspensões, alterações da viscosidade dentre outros (BRASIL, 2004).
2.8.1.2 Fatores intrísecos
São fatores relacionados à própria natureza das formulações e, sobretudo à
interação de seus ingredientes entre si e/ou com o material de acondicionamento.
Resultam em incompatibilidades de natureza física ou química que podem, ou não, ser
visualizadas pelo consumidor.
A - Incompatibilidade física: Ocorrem alterações, no aspecto físico da formulação
observado por: precipitação, separação de fases, cristalização, entre outras.
B - Incompatibilidade química: Devem ser observados os parâmetros ligados a: pH;
reações de óxido-redução; reações de hidrólise; interações entre ingredientes da
formulação e interações entre ingredientes da formulação e o material de
acondicionamento (BRASIL, 2004).
2.8.2 Tipos de avaliação de estabilidade
Há várias análises que necessitam ser realizadas para a avaliação e o estudo da
estabilidade. Entre elas temos, estudo preliminar de centrífugas e estabilidade
preliminar por ciclos gelo-degelo (BRASIL, 2004), estabilidade acelerada, estabilidade
de longa duração (prateleira), fotoestabilidade (BRASIL, 2005) teste de estabilidade
entre formulação e material de acondicionamento e teste de transporte e distribuição
(MACEDO; GARCIA, 2007).
2.8.2.1 Estudo preliminar de centrífuga
Este teste tem por finalidade aumentar abruptamente a força de gravidade,
aumentando a movimentação das partículas, e gerar condição favorável para se
observar uma possível instabilidade (BRASIL, 2004). Esta parte inicial observa se há
mudança na coloração, no aspecto, se a viscosidade ou espalhabilidade se alteraram,
29
se há a presença de precipitado, ou seja, este estudo indica se a formulação apresenta
qualquer sinal de instabilidade física.Produtos reprovados aqui não segue as fases
seguintes.
2.8.2.2 Estudo preliminar de ciclos gelo-degelo
O estudo de estabilidade preliminar consiste na realização do teste na fase
inicial do desenvolvimento do produto, utilizando-se diferentes formulações de
laboratório e com duração reduzida. Emprega condições extremas de temperatura
com o objetivo de acelerar possíveis reações entre seus componentes e o surgimento
de sinais que devem ser observados e analisados conforme as características
específicas de cada tipo de produto. Devido às condições em que é conduzido, este
estudo também não tem a finalidade de estimar a vida útil do produto, mas sim de
auxiliar na triagem das formulações. Recomenda-se que as amostras para avaliação da
estabilidade sejam acondicionadas em frascos de vidro neutro, transparente, com
tampa que garanta uma boa vedação evitando perda de gases ou vapor para o meio. A
quantidade de produto deve ser suficiente para as avaliações necessárias. É
importante não completar o volume total da embalagem permitindo um espaço vazio
(headspace) de aproximadamente um terço da capacidade do frasco para possíveis
trocas gasosas.
A duração do estudo é geralmente de doze dias e auxilia na triagem das
formulações. As formulações em teste são submetidas a condições de estresse visando
acelerar o surgimento de possíveis sinais de instabilidade. Geralmente as amostras são
submetidas a aquecimento em estufas (45 ± 2 ºC), resfriamento em refrigeradores (-5
± 2 ºC) em ciclos alternados de resfriamento e aquecimento (BRASIL, 2004).
2.8.2.3 Estabilidade acelerada em câmera climática.
Estudo projetado para acelerar a degradação química e/ou mudanças físicas de
um produto farmacêutico, em condições forçadas de armazenamento (temperatura 40
± 2 oC e umidade 75 ± 5%). Os dados assim obtidos, juntamente com aqueles derivados
dos estudos de longa duração, podem ser usados para avaliar efeitos químicos e físicos
prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o impacto de curtas
30
exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto, que podem
ocorrer durante o transporte (BRASIL, 2004).
2.8.2.4 Estabilidade de prateleira (Longa duração)
Estudo projetado para verificação das características físicas, químicas,
biológicas e microbiológicas de um produto farmacêutico durante e, opcionalmente,
depois do prazo de validade esperado. Os resultados são usados para estabelecer ou
confirmar o prazo de validade e recomendar as condições de armazenamento (BRASIL,
2004).
2.8.2.5 Estabilidade luminosa
A radiação luminosa pode alterar significativamente a cor e o odor do produto
e levar à degradação de componentes da formulação. Para a realização deste estudo a
fonte de iluminação pode ser a luz solar, captada através de vitrines especiais para
este fim, ou lâmpadas que apresentem espectro de emissão semelhante à do sol,
como as lâmpadas de xenônio. Também são utilizadas fontes de luz ultravioleta. Os
produtos devem ser armazenados em mais de uma condição de temperatura, para que
se possa avaliar seu comportamento nos diversos ambientes a que possa ser
submetido.
2.8.2.6 Teste de compatibilidade entre formulação e material de acondicionamento
A estabilidade do produto e sua compatibilidade com o material de
acondicionamento são conceitos distintos, separados e complementares, que devem
ser aplicados ao produto antes de ser comercializado.Neste teste, são avaliadas
diversas alternativas de materiais de acondicionamento para determinar a mais
adequada para o produto (BRASIL, 2004; BRASIL, 2005).
31
3. Objetivos
32
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Determinar as atividadesantimicrobiana, antioxidante, citotóxica e teores de
taninos e flavonóides de Sapium gladulosum e Caesalpinia pyramidalis, buscando
observar influências laboratoriais e visando a obtenção de um gel odontológico.
3.2. Objetivos específicos
Caracterizar por cromatografia em camada delgada os principais grupos de
metabólitos secundários presentes nas espécies estudadas;
Quantificar espectrofotometricamente o teor de fenóis totais, taninos e flavonóides
das espécies estudadas;
Analisar a capacidade antioxidante primária dos extratos pelo método do 2,2-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH);
Analisar a atividade antioxidante secundária dos extratos pelo ensaio quelante do
íon ferroso (FIC);
Investigar a atividade antibacteriana das espécies frente a cepas padrões e isolados
clínico multirresistentes;
Avaliar a toxicidade seletiva dos extratos frente às larvas de Artemia salina Leach;
Determinar a atividade citotóxica dos extratos das espécies estudadas frente às
linhagens tumorais Hep-2 (carcinoma de laringe humano) e NCI-H292 (câncer de
pulmão humano);
Desenvolver tecnicamente gel para veiculação de extrato seco, para uso bucal;
Avaliar a estabilidade das formulações desenvolvidas (estudo reológico, estudo
preliminar de centrífuga, estabilidade preliminar ciclo gelo-degelo, estabilidade
acelerada e de prateleira).
33
4. Artigo 1 Antioxidant Capacity and Phenolic Content of
Caesalpinia pyramidalis Tul.andSapium glandulosum (L.) Morong from Northeastern
Brazil
34
4. ARTIGO 1
ARTIGO PUBLICADO NA:
Revista: Molecules (ISSN online 1420-3049) – Qualis B1 (2012)
Autores: Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva, Tadeu José da Silva Peixoto
Sobrinho, Valérium Thijan Nobre de Almeida e Castro, Danielle da Cunha Amaral Lima
e Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim.
Título: Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Caesalpiniapyramidalis Tul.
andSapium glandulosum (L.) Morong fromNortheastern Brazil.
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5. Artigo 2 Phytochemical profile and antibacterial
activity of barkand leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul.andSapium glandulosum (L.)
Morong.
48
5. ARTIGO 2
ARTIGO PUBLICADO NA:
Revista:Journal of Medicinal Plants Research (ISSN 1996-0875) – Qualis B2 (2012)
DOI:10.5897/JMPR12.830
Autores:Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva, Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho,
AntônioMarcos Saraiva, Maria Nelly Caetano Pisciottano e Elba Lúcia Cavalcanti de
Amorim.
Título:Phytochemical profile and antibacterial activity of bark and leaves of Caesalpinia
pyramidalis Tul. andSapium glandulosum (L.) Morong.
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6. Artigo 3 Antiproliferative activity and Brine Shrimp
lethality assay of the extracts of barks and
leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul.
andSapium glandulosum (L.) Morong.
56
6. ARTIGO 3
ARTIGO SUBMETIDO A:
Revista: Tropical journal of pharmaceutical research (ISSN 1596-9827 online) – Qualis
B2 (2012)
Autores: Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva, Tadeu José da Silva Peixoto
Sobrinho, Gardênia Carmen Gadelha Militão, Teresinha Gonçalves da Silva, Elba Lúcia
Cavalcanti de Amorim.
Título: Antiproliferative activity and Brine Shrimp lethality assay of the extracts of
barks and leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. andSapium glandulosum (L.) Morong.
57
Antiproliferative activity and Brine Shrimp lethality assay of the extracts of barks and
leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. andSapium glandulosum (L.) Morong.
Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva1*, Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho1,
Gardênia Carmen Gadelha Militão2,Teresinha Gonçalves da Silva2, Elba Lúcia Cavalcanti
de Amorim1.
1Natural Products Laboratory, Federal University of Pernambuco, Av. Prof Arthur de
Sá, s/n 50740-521, Cidade Universitária-Recife, PE. Brazil.
2Laboratory of Pharmacology and Experimental Oncology, Federal University of
Pernambuco, Recife-PE, Brazil.
*Corresponding author: Email: [email protected], Tel: +55 81 2126
8511.
58
Antiproliferative activity and Brine Shrimp lethality assay of the extracts of barks
and leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. andSapium glandulosum (L.) Morong.
ABSTRACT
Purpose: The objectives of this study were to characterize and assess the acute toxicity
against the larvae of Artemia salina Leach. and verify the in vitro cytotoxicity against
two cancer cell lines from bark and leaves of Caesalpinia pyramidalis Tul. andSapium
glandulosum (L.) Morong.
Methods:The bioassay with A. saline was based on the method described by Meyer et
al. [1]. Cytotoxicity front of the lines Hep-2 and NCI-H292 was assessed by the MTT
method.
Results:The results of the selective toxicity against the larvae of A. salinaranged from
1618.44 ± 271.02 µg/mL for the extract of the leaves of C. pyramidalis to 2655.50 ±
15.40 µg/mL for the extract of the leaves of S. glandulosum, however, all considered
nontoxic. Species studied showed no cytotoxic activity in the tested lines, converging
with findings nontoxic to brine shrimp.
Conclusion:The results showed no antiproliferative activity, not showing promising
species as candidates for new drugs against the tested strains, although further studies
need to be performed.
Key words: Artemia salina, Burra-leiteira, Catingueira, Caatinga, cancer cell lines.
59
INTRODUCTION
The bioprospecting mainly from plants with medicinal indications, by the
people, is a worldwide trend in which researchers conduct trials to determine various
biological activities and/or toxicological for a later time to identify active substances
[2]. An example of these bioassays is the lethality assay with larvae of Artemia salina
Leach, because of its ease of use, reliability, low cost and have demonstrated a good
correlation with various biological activities such as antitumor [3] and anti-
Trypanosoma cruzi [4], being for these reasons a great tool for analyzing the
preliminary general toxicity.
Another trial important, the in vitro analysis of cytotoxicity by MTT method has
been used in the screening program of the National Cancer Institute of the United
States [5]. This is a method that provides speed, sensitivity and low cost, having the
ability to analyze the viability and metabolic state of the cell. The MTT method allows
defining the cytotoxicity, but not the mechanism of action [6].
Many ethnopharmacological studies in Brazil have shown that a large number
of plant species are used by the local population, among these, C. pyramidalis appears
in these studies with a good index quotes and indications popular [7-8] and S.
glandulosum has a wide geographic distribution. S. glandulosum appears frequently in
the work of floristic survey, presents frequent citation in ethnodirected studies, but
few indications in folk medicine [8]. Some studies phytochemicals, antioxidants and
microbiological are found for the two species [9-10], though complementary studies
are required. Santana et al.[11] evaluated as satisfactory the anti-inflammatory action
of C. pyramidalis using rodents.
60
Based on growing interest in evaluating the biological action of medicinal plants
used as seen by the population and the need for additional studies on the toxicity of
plants present in the Caatinga, the objectives of this study were to evaluate the acute
toxicity of C. pyramidalis and S. glandulosum against the larvae of the brine shrimp
Artemia salina and antiproliferative activity against tumor cell models.
EXPERIMENTAL
Study area and plant material
Samples of the bark and leaves of C. pyramidalis and S. glandulosum were
collected on May of 2009 from aremnant of Caatinga of the InstitutoAgronômico de
Pernambuco-IPA (08°14′18.2" S and 35°54′57.1"W). The region has a Bsh climate (hot
semi-arid), lies at an altitudeof 537 m above sea level and has an average precipitation
below700 mm/year [12]. In the same period,the voucher specimens were identified by
Doctor Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho, Federal University of Pernambuco,
andincorporated in the Herbarium UFP Geraldo Mariz with the number60.195 (C.
pyramidalis) and 60.196 (S. glandulosum).
Preparation of extracts
The samples were dried in an oven (Nova Técnica NT-503) forthree days at 45 ±
5°C, powdered in a Willy vertical mill grinder(Adamo 340) and standardized on sieves,
resulting in a 20-meshparticle size (1.2 mm). The samples were extracted by
61
macerationfor 72 h with 70% ethanol (500 mg/ml) and then filtered through 9mm
filter paper. The extracts were subjected to slow evaporation(Fisatom 801) under
reduced pressure at a temperature of 40 ±5°C.
Toxicity assay
The toxicity assay employs the larvae of A. salina Leach and is based on the
method described by Meyer et al. [1]. Saline water was prepared with sea salt (30 g/L
of salt in distilled water; pH between 7 and 8). The cysts of A. salina (20 mg) were
incubated in a non-toxic vat containing saline water and subjected to artificial light for
48 hours. Ten larvae of A. salina were transferred to test tubes containing 5 mL of
different concentrations of the extracts of barks and leaves of C. pyramidalis and S.
glandulosum dissolved in saline water (50 to 1000 µg/mL) or a negative control (saline
water only). The larvae were considered dead who had no movement during the
observation after 24 h and Probit analysis was used to calculate the value of lethal
concentration (LC50) defined as the sample concentration that causes the death of 50%
of the larvae.
In vitro cytotoxicity assay
The cytotoxicity of extracts was tested against Hep-2 (human larynx epidermoid
carcinoma) and NCI-H292 (human pulmonary mucoepidermoid carcinoma), cells all
obtained from the Adolfo Lutz Institute, SãoPaulo, Brazil. The cells were grown in
DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, supplemented with 10% fetal bovine
62
serum, 2 mM glutamine, 100 µg/mL streptomycin and 100 U/mL penicillin at 37 °C
with a 5% CO2 atmosphere.
The tumor cell growth was quantified by the ability of living cells to reduce the
yellow MTT to a purple formazan product from mitochondrial enzyme present only in
metabolically active cells [6]. A cellular suspension (105 cells/mL) was prepared and
distributed in 96-well (225 μL/well) and incubated during 24 h at 37 °C. After that, 25
μl of the extracts (50 µg/mL)was added to the wells. At the end of incubation (72 h),
the plate was centrifuged and the medium was then replaced by fresh medium (200
μL) containing 25 μL of MTT. Three hours later, the MTT formazan was dissolved in 100
μL dimethylsulfoxide and the absorbance was measured using a multiplate reader [13].
The optical density ofthe wells was measured at 540 nm and compared to the control
(cellswith medium only).The data represent the mean of experiments in duplicate. The
IC50 value was defined as the concentration at which 50% survival of cells was
observed and determined from non-linear regression. Etoposide in DMSO 0,1% was
used as a positive control.
Statistical analysis
Data were expressed as mean ± standard deviation. The data were analyzed by
Kolmogorov-Smirnov and ANOVA: one way followed by multiple comparisons by the
Tukey test. To obtain the lethal concentrations (LC50), Probit analysis was used,
calculated from regression obtained with concentrations versus percentages of larvae
of A. salina alive. The Pearson correlation test was used to compare the results of
63
lethality assay and in vitro cytotoxicity. The GraphPad Prism 5 was used to perform the
statistical analysis and p<0.05 was considered as indicative of significance.
RESULTS
The results for C. pyramidalis and S. glandulosum against larvae of A. salina
(LC50, in µg/mL) and proliferative activity against Hep-2 and NCl-H292 are present in
Table 1.
Table 1. Yield samples, values of lethal concentration against larvae of Artemia salina
Leach (LC50, in µg/mL) and antiproliferative activity (percentage of inhibition) in the
single dose of 50 µg/mL of the extracts against Hep-2 (human larynx epidermoid
carcinoma) and NCI-H292 (human pulmonary mucoepidermoid carcinoma).
Species
Voucher number Part used
Yield (%) LC50
Hep-2
PI (%)
NCI-H292
PI (%)
C. pyramidalis
60.195
Leaves 26.78 2367.17 ± 471,96 -7.39 ±1,71 -73.82 ±7,90
Barks 11.54 2655.50 ± 15,40 -20.35 ±0,86 -67.65 ±6,84
S. glandulosum
60.196
Leaves 24.28 2023.56 ± 401,52 -22.68 ±1,38 -118.62 ±15,05
Barks 16.30 1618.44 ± 271,02 -22.05 ±2,64 -85.71 ±4,04
DISCUSSION
Meyer et al. [1] established the lethal concentration (LC50) based on the toxicity
of extracts against the larvae of A. salina. According to the scale, LC50 values of < 500
µg/mL indicate toxicity, LC50 values of 500 to 1000 µg/mL denote moderate toxicity
while LC50 values of > 1000 µg/mL suggest without toxicity. It was observed a wide
variation in LC50, with values between 1618.44 ± 271.02 a 2655.50 ± 15.40 µg/mL
64
(Table 1). However, the extracts tested showed no toxicity and no deaths were
observed on larvae of A. saline at higher concentrations after 24 hours of exposure to
the extracts. Alviano et al. [14] conducted acute toxicity tests in mice using C.
pyramidalis, the results indicated this species as nontoxic, corroborating our findings,
since there was no effect lethal to animals at doses 1-5 g/kg (orally administered).
These animals were observed and weighed at 15 days, but no weight loss was
observed.
The scale of the National Cancer Institute of United States (NCI-US) was used to
assess the cytotoxic potential of the samples tested. The extracts was considered
inactive (inhibition of cell growth ranging from 1 to 20%), low active (inhibition of 20 to
50%), moderate activity (inhibition of 50 to 70%) and very active (inhibition of 70 to
100%).
All extracts evaluated presented proliferative activity against strains to Hep-2
and NCI-H292 strain with proliferative percentage of 7.39 ± 3.54 to 22.68 ± 1.38 and
67.65 ± 6.84 to 118.62 ± 15.05, respectively. In general, direct relationship between
cytotoxicity of extracts against A. salina and cytotoxic potential is often found [15], but
it was not statistically confirmed in our study (LC50 × Hep-2, r = -0.3993 and p> 0.05;
LC50 × NCI-H292, r = -0.5222 and p> 0.05)
CONCLUSIONS
The results of this study help to provide more security in the use of
preparations of C. pyramidalis and S. glandulosum because these species were
nontoxic front of brine shrimp larvae and showed no toxic activity against cell lines
65
evaluated (models of tumor cell lines Hep-2 and NCI-H292), in pre-established
conditions.
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68
7. Artigo 4 Desenvolvimento Farmacotécnico e Avaliação
da Estabilidade de gel bucal com extrato de
Caesalpinia pyramidalis Tul.
69
7. ARTIGO 4
ARTIGO SUBMETIDO A:
Revista: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas
(ISSN 0717-7917) – Qualis B3 (2012)
Autores: Carlos Henrique Tabosa Pereira da SILVA, Elba Lúcia Cavalcanti de AMORIM.
Título: Desenvolvimento Farmacotécnico e Avaliação da Estabilidade de gel bucal com
extrato de Caesalpinia pyramidalis Tul.
70
Desenvolvimento Farmacotécnico e Avaliação da Estabilidade de gel bucal com
extrato de Caesalpinia pyramidalis Tul.
[Pharmacotechnical Development and Evaluation of Stability of oral gel with extract of Caesalpinia
pyramidalis Tul.]
Carlos Henrique Tabosa Pereira da SILVA1,2
, Elba Lúcia Cavalcanti de AMORIM1*
1Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco, Brasil.
2Faculdade ASCES, Caruaru-PE, Brasil
Contatos/Contacts: Carlos Henrique Tabosa Pereira da SILVA – E-mail address:
Abstract
Brazil presents alarming data on the substantial portion of toothless. There are several factors
that lead to loss of teeth, such as caries, endodontic infections and periodontitis. This group of
patients in need of total denture suffers still prosthetic stomatitis, which are enhanced by the
presence of microorganisms often opportunistic in the oral cavity. In the present study, we
evaluated the stability of gels produced by polymer carbopol 940, Hydroxypropyl
methylcellulose (HPMC) and carboxymethylcellulose (CMC), with the active 70% ethanol
extract of the leaves of Caesalpinia pyramidalis, which has filed against several strains that
inhabit the oral flora. Six groups were formed, of which those who had most satisfactory results
were those produced carbopol base 940, as resisted the aggression suffered by the assessments
of centrifugation, freeze-thaw cycle and accelerated stability.
Keywords: Catingueira, oral gel, denture stomatitis.
Resumo
O Brasil apresenta dados alarmantes quanto à expressiva parcela da população desdentada.
Vários são os fatores que levam a perda dos elementos dentários, tais como cáries, infecções
71
endodônticas e periodontites. Este grupo de pacientes que necessitam de prótese dentária total
sofre ainda com estomatites protéticas, que são potencializadas pela presença de micro-
organismos, muitas vezes oportunistas, presentes na cavidade oral. No presente trabalho foi
avaliada a estabilidade de géis produzidos pelos polímeros carbopol 940,
Hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e Carboximetilcelulose (CMC), tendo como ativo o extrato
etanólico 70% das folhas de Caesalpinia pyramidalis, que possui ação contra várias cepas que
habitam a flora bucal. Foram formados seis grupos, dos quais os que tiveram resultados mais
satisfatórios foram aqueles produzidos a base de carbopol 940, pois resistiram as agressões
sofridas pelas avaliações de centrifugação, ciclo gelo-degelo e estabilidade acelerada.
Palavras chave: Catingueira, gel bucal, estomatite protética.
INTRODUÇÃO
No Brasil, o programa Brasil Sorridente, vinculado ao Ministério da Saúde, constatou,
em 2004, que 30 milhões de brasileiros são desdentados. Desses, oito milhões precisam de
prótese dentária completa (Silva e Sousa, 2006). Paralelos ao uso das próteses, encontram-se
problemas relacionados a diversos fatores, tendo como principal o da estomatite protética
(Martins Netoet al., 2005; Scalercio et al., 2007).
A estomatite protética é caracterizada por um eritema generalizado que afeta tecidos
moles recobertos pela prótese, sendo observado tanto nas próteses sob bases metal ou resina
acrílica podendo ser normalmente encontrada na maxila (Rodneyet al., 2007;Turano e Turano,
2010). Nos pacientes portadores de próteses totais, é comum o surgimento de estomatite
protética, quase sempre associada à presença da candidiase eritematosa (Scarlercio et al., 2007).
A etiologia da candidiase associada ao uso de próteses totais mostram-se extremamente
variáveis, portanto sendo considerada uma doença multifatorial, na qual a placa bacteriana, o
uso contínuo da dentadura, xerostomia, traumatismo e infecção pelo agente fúngico Candida sp.
entre outros, constituem fatores predominantes na patologia desta alteração (Oliveira et
al.,2000).
72
Os tratamentos usuais para a estomatite protética associada à candidíase consistem na
combinação de antifúngicos tópicos, orientação ao paciente quanto a higienização da prótese e
verificação da necessidade da troca da mesma (Santos, 2002). O miconazol a 2% tem
apresentado sucesso em sua aplicação, em detrimento a outros antifúngicos por apresentar-se na
formulação de gel e esta apresentação favorece o encaixe na prótese, aumentando o tempo de
contato da medicação com a lesão. Também é encontrado como terapia medicamentosa o uso da
Nistatina, Anfotericina B, Cetoconazol e Fluconazol (Scalercio et al., 2007).
Nos dias atuais, vários fatores contribuem para o ingresso do uso terapêutico de plantas
medicinais no sistema de saúde público, entre os quais temos o alto custo dos medicamentos
industrializados, o difícil acesso da população à assistência médica, bem como a tendência, nos
dias atuais, ao uso de produtos de origem natural (Brasileiro et al., 2008; Camargo et al., 2012).
O Governo Federal Brasileiro, inclusive, aprovou o uso no Sistema Único de Saúde – SUS
(Sistema de Saúde Oficial do Brasil) de 71 espécies vegetais, já de uso consagrado pela
população no país, com achados farmacológicos satisfatórios para várias patologias, mas que
precisam ser estudadas do ponto de vista farmacotécnico, para gerarem produtos que possam ser
utilizados com segurança pela população (Isaac et al., 2008; Brasil, 2009). Várias outras
espécies vegetais são candidatas a entrar nesta lista oficial, de acordo com o Ministério da
Saúde, por possuírem uso na medicina tradicional e por terem achados científicos para algumas
finalidades terapêuticas, dentre as quais encontramos Caesalpinia pyramidalis, conhecida
popularmente como catingueira (Palombo, 2011).
Alviano et al. (2008) avaliaram a atividade de C. pyramidalis contra bactérias que
afloram na cavidade bucal: Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium
nucleatum, Streptococcus mutans e Lactobacillus casei, encontrando CIM (Concentração
Inibitória Mínima) de 1,0 ± 0 mg/mL, para as três primeiras e 8,0 ± 0 mg/mL para as duas
últimas (todas em triplicata). Cruz et al. (2007) avaliaram quatro espécies vegetais, dentre as
quais C. pyramidalis, que foi ativa contra Candida albicans, Candida guilliermondii e cepas
clínicas de Trichophyton rubrum, Candida guilliermondii, Fonsecaea pedrosoi e Cryptococcus
neoformans.
73
Silva et al. (2012), levando em consideração que Enterococcus faecalis tem importância
clínica em diversas doenças da cavidade bucal, tais como cárie, infecções endodônticas
recorrentes e periodontites apicais (Paradellaet al., 2007), encontrou ação satisfatória contra E.
faecalis para extratos secos hidralcoólicos das folhas e cascas da catingueira.
Com o crescente uso clínico de extratos vegetais e a necessidade de desenvolvimento
farmacotécnico de formulações adequadas à veiculação destes extratos, para que haja o melhor
efeito terapêutico, um novo problema começa a surgir que é a falta de estabilidade de muitos
destes produtos. A partir desta demanda, o desenvolvimento farmacotécnico e principalmente a
avaliação da estabilidade das formulações tornam-se atores fundamentais para a obtenção de
produtos estáveis e que garantam a eficácia e segurança, critérios primordiais de acordo com a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
A escolha da forma farmacêutica mais apropriada para um produto fitoterápico deve
considerar a eficácia e a segurança do componente ativo e assegurar sua qualidade; facilitar a
aplicação do medicamento, por meio da via de administração mais apropriada (Miguel, 2003).
Entre as diversas formas farmacêuticas disponíveis, temos o gel, baseado principalmente na
presença de um polímero. Esses polímeros agem como agentes suspensores que retardam a
sedimentação e a aglomeração das partículas ao atuarem como uma barreia energética que entre
si, aumentam, assim, a viscosidade e melhora a estabilidade das suspensões (Lachmanet al.,
2001).
O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento farmacotécnico de um gel bucal
a partir do extrato seco etanólico 70% de folhas de Caesalpinia pyramidalis e a avaliação de
estabilidade de diferentes formulações.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
74
As amostras de folhas de C. pyramidalis foram coletadas em maio de 2009, num
remanescente de Caatinga, dentro da Estação Climatológica de Caruaru, do Instituto
Agronômico de Pernambuco - IPA, situado no Agreste pernambucano (08º14’18,2”S e
35º54’57,1”W). A região possui clima Bsh (semi-árido quente), altitude de 537 m acima do
nível do mar e precipitação média abaixo de 700 mm/ano (Alcoforado-Filho et al., 2003). No
mesmo período, o material-testemunho foi preparado e encontra-se incorporado no Herbário
UFP Geraldo Mariz do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Pernambuco, sob
o nº. 60195 (C. pyramidalis).
Preparação do extrato bruto etanólico (EBE)
A amostra vegetal foi estabilizada em estufa (Nova Técnica NT-503) durante três dias a
45±5°C, pulverizada em moinho vertical de facas tipo Willye (Adamo 340) e padronizada em
tamises, obtendo-se granulometria de 20 Mesh (1,2 mm). A amostra foi extraída por maceração
durante 72 horas com etanol 70% (500 mg/mL) e em seguida filtrado em papel de filtro de 9
mm. O extrato foi submetido à evaporação lenta (Fisatom 801) sob pressão reduzida, à
temperatura de 40±5 °C, até total secura.
Desenvolvimento das formulações
Foi realizado um estudo quali-quantitativo relacionando diversos constituintes na
formulação, conforme Tabela I, a seguir. As formulações tiveram variações entre três tipos de
polímeros hidrofílicos: carbopol 940; carboximetilcelulose (CMC) e hidroxipropilmetilcelulose
(HPMC). Este estudo quali-quantitativo formou 6 grupos, caracterizados entre G1 a G6. Para
cada grupo, foram produzidos 1000 g de produto. Foi formulado um sistema conservante para
ser inserido nas formulações, sendo descrito na Tabela II.
75
Tabela I: Planejamento quali-quantitativo do desenvolvimento farmacotécnico de gel
bucal com extrato seco de C. pyramidalis.
Componentes G1 G2 G3 G4 G5 G6
CMC 4% 6% - - - -
HPMC - - 2,5% 3,5% - -
Carbopol 940 - - - - 1% 1,3%
Extrato seco 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
Sacarina 0,05% 0,05% 0,05% 0,05% 0,05% 0,05%
Sistema conservante 3,3% 3,3% 3,3% 3,3% 3,3% 3,3%
Glicerina 6% 6% 6% 6% 6% 6%
Lauril Sulfato de sódio 1% 1% 1% 1% 1% 1%
Trietanolamina - - - - 1% 1%
Tabela II: Componentes e concentrações dos constituintes integrantes do sistema
conservante das formulações.
Componentes Concentração (%)
Metilparabeno 6
Propilparabeno 3
Propilenoglicol qsp 100
Determinação das especificações do produto acabado
Aspectos
Foi realizada a análise de parâmetros que permitam avaliar o estado da amostra em
estudo. Entre estes, foi verificada a presença de alterações como: separação de fases,
precipitação e turvação. As amostras foram descritas como normal, sem alteração; levemente
separada, precipitada ou turva; separada, precipitada ou turva.
76
Cor
Foi comparada visualmente entre os produtos a cor de cada um deles, com a cor do
padrão, que foi uma amostra que não sofreu os processos de avaliação da estabilidade. As
amostras foram classificadas, em relação a cor, como: normal, sem alteração; levemente
modificada; modificada; intensamente modificada.
Odor
Foi comparado o odor de cada um dos produtos amostrados com o odor do padrão
estabelecido, que foi uma amostra que não sofreu os processos de avaliação da estabilidade. As
amostras foram classificadas, em relação ao odor, em: normal, sem alteração; levemente
modificado; modificado; intensamente modificado.
Densidade
Foi tarado uma proveta de 50 mL na balança analítica (Marte AL500) e acrescido o
produto até completar o volume de 50 mL da proveta. Em seguida, foi determinada a massa de
cada um dos produtos e dividido por 50 mL para ser encontrado a densidade do produto em
g/mL.
pH
Foi determinado o pH (pHmetro de bancada Tecnopon) a partir de uma dispersão aquosa
a 10% (p/p) da amostra analisada (2 g do gel) e em seguida comparados com valores
compatíveis com o pH da região aplicada (entre 5,5 e 6,5) (Isaac et al., 2008).
Estudo reológico das formulações
Em um béquer de 50 mL, foi colocado 50 mL do produto e realizado estudo reológico
(viscosímetro marca Shannon Ireland, modelo RI:2:M). Foi utilizado o pino nº7.
77
O estudo reológico foi realizado analisando a viscosidade para as seguintes rotações de
pêndulo: 10; 20; 30; 40; 50; 80 rpm, respectivamente de forma crescente. Foi utilizado o
intervalo de dois minutos entre as velocidades de rotação do pêndulo.
As amostras, durante as avaliações em seguida, foram realizadas no viscosímetro a 20
rpm.
Avaliação da estabilidade
A avaliação da estabilidade foi obtida observando o estudo preliminar de centrífuga
(Baby-I centrifugi Ma. 206, Fanem, SP-Brasil), o estudo de estabilidade preliminar em ciclo
gelo-degelo (12 dias) e o estudo de estabilidade acelerado (tempo 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias).
Estudo preliminar de centrífuga
Os produtos desenvolvidos foram colocados aos pares, com mesmo peso (cerca de 8 g
de cada produto), incluídos tubos de centrífuga, material desenvolvido, tampas e suportes, para
que ficassem com o mesmo peso. Em seguida, foram colocados na centrífuga, em lados opostos,
e ligados a 3000 rpm durante 30 minutos.
Estudo de estabilidade ciclo gelo-degelo
Os produtos desenvolvidos foram colocados em ciclos de gelo-degelo (congelador
Esmaltec 350 L e estufa Quimis aparelho científico 250W) durante um período de 12 dias,
alterando entre 24h a temperatura de 45 ± 2 ºC e 24h a temperatura de -5 ± 2 ºC. Até o término
dos 12 dias. Após cada ciclo de 24h, antes de ser colocado em um outro ciclo, o material
repousava até temperatura ambiente.
Estudo de estabilidade acelerada
Os produtos desenvolvidos foram colocados em estufa a 45 ± 2 ºC e avaliados nos
tempos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias, sob os aspectos pré-determinados.
78
RESULTADOS E DISCUSSÕES
O desenvolvimento e, principalmente, a avaliação da estabilidade de produtos para uso
bucal se faz necessário, para que os produtos colocados no mercado tenham eficácia e segurança
pelo prazo de validade estabelecido pelo fabricante. No Brasil, de acordo com o Ministério da
Saúde, em 2004 (Silva e Sousa, 2006), 75% dos idosos são desdentados totais, portanto,
formulações voltadas para cuidados a pacientes que usam próteses dentárias devem ser
incentivadas, uma vez que seu uso encontra-se relacionado a diversos danos secundários como a
estomatite protética entre outros (Martins Netoet al., 2005; Scalercio et. al.,2007).
Entre várias substâncias utilizadas contra candidiase, um dos principais fatores para o
desenvolvimento da estomatite protética, temos: Nistatina, Anfotericina B, Cetoconazol e
Fluconazol. Porém, cada uma destas substâncias apresenta incompatibilidades, como na
Nistatina o problema de se apresentar somente como suspensão, dificultando a ação
medicamentosa; a Anfotericina B é nefrotóxica mesmo em doses terapêuticas e o Cetoconazol e
o Fluconazol são hepatotóxicos (Batistaet al, 1999; Scalercio et al., 2007).
O rendimento extrativo utilizando maceração, durante 72 horas, com etanol 70% (500
mg/mL), foi de 26,78% para as folhas da catingueira.
As especificações dos produtos obtidos estão apresentadas na Tabela III:
79
Tabela III: Características iniciais dos seis grupos dos géis desenvolvidos com extrato de
C. pyramidalis, antes do início das avaliações da estabilidade.
Parâmetros
Grupos
G1 G2 G3 G4 G5 G6
Aspecto a a a b a a
Cor c c d d e e
Odor f f f f f f
Densidade
(g/mL) 1,11 1,09 1,05 1,12 1,04 1,05
pH 6,1 5,9 6,2 6,0 5,8 6,1
Viscosidade
(Pa) 39,0 41,1 16,1 16,4 25,0 25,8
a = brilhoso e homogêneo; b= fosco e homogêneo; c= amarelo escuro; d= amarelo médio; e=
amarelo claro; f= característico.
Os produtos obtidos (grupo de G1 a G6) apresentaram comportamento reológico
esperado, compatível com aqueles pseudo-plásticos.
Os trabalhos de Singhet al. (2008) e o de Chorilli et al. (2006) mostram pontos
importantes relacionados à estabilidade de formulações, entre os quais, encontramos: teste de
estabilidade preliminar de centrífuga, teste de estabilidade preliminar de ciclos gelo-degelo e
teste de estabilidade acelerada. É válido frizar que várias outras avaliações de estabilidade
também são importantes, como: avaliação da fotoestabilidade (Chorilli et al., 2006), avaliação
da estabilidade frente a diferentes valores de pH (Montagner e Corrêa, 2004), avaliação da
termoestabilidade (Fariaet al., 2002), avaliação da estabilidade do produto junto ao material de
embalagem (Brasil, 2004; Brasil, 2005), avaliação da estabilidade frente a trepidação
ocasionada pelo transporte rodoviário, predominante no nosso país (Macedo e Garcia, 2007).
A concentração estabelecida para a formulação no trabalho baseou-se na Concentração
Inibitória Mínima (CIM), encontrado por Alviano et al. (2008), de 1 mg/mL quanto ao efeito
80
antimicrobiano de C. pyramidalis contra três cepas de micro-organismos relacionados a doenças
da cavidade oral: Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum.
Silva et al. (2012) encontraram contra E. faecalis uma CIM de 0,5 mg/mL e Cruz et al. (2007)
acharam CIM de 6,25 µg/mL frente as cepas de Candida guilliermondii (ATCC6260) e
Trichophyton rubrum (Isolado clínico 311RC); e de 12,5 µg/mL frente as cepas de Candida
albicans (ATCC18804) e Cryptococcus neoformans (Isolado clínico T1-444) . Palombo (2011)
cita o uso de C. pyramidalis contra bactérias orais. Foi utilizada, neste trabalho, a concentração
de 2 mg/mL. Além dos efeitos contra os micro-organismos anteriormente citados, Santos et al.
(2011) e Santana et al. (2012) avaliaram como satisfatória a ação anti-inflamatória de C.
pyramidalis utilizando roedores, isso muito possivelmente potencializaria melhoras contra
quadros de estomatite protética, uma vez que haveria combate contra os micro-organismos e
contra os processos inflamatórios presentes.
Cada um dos géis desenvolvidos (G1 a G6) foram produzidos em um único lote, para
não haver possibilidade de interferência da produção na avaliação da estabilidade dos produtos.
Dentre as formulações estudadas, os grupos G1, G2 (a base de CMC) e G3, G4 (com
HPMC) apresentaram turbidez e sedimentos nos tubos de ensaio analisados. Sendo, desta forma,
descontinuados os estudos de estabilidade, embora tenham sido avaliados os demais
paramentos. Os grupos G5 (leve turbidez) e G6 apresentaram-se satisfatórios para a limpidez e
transparência, sendo desta forma indicados para continuação das avaliações de estabilidade.
Durante a avaliação da estabilidade no ciclo gelo-degelo, os dados obtidos para as
amostras G5 e G6 foram os seguintes (Tabela IV):
81
Tabela IV: Avaliação da estabilidade no ciclo gelo-degelo, para as amostras G5 e G6 (carbopol 940 a 1 e 1,3%, respectivamente).
Parâmetros
Dia 01 Dia 02 Dia 03 Dia 04 Dia 05 Dia 06 Dia 07 Dia 08 Dia 09 Dia 10 Dia 11 Dia 12
G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6 G5 G6
Aspecto a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a
Cor a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a
Odor a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a
Densidade
(g/mL) 1,04 1,05 1,06 1,04 1,04 1,00 0,99 0,99 1,00 0,98 0,99 1,00 1,01 0,99 1,00 0,98 0,97 1,00 0,95 0,96 0,91 0,90 0,88 0,89
pH 5,8 6,1 5,9 5,7 5,7 5,5 5,9 5,6 6,0 5,8 5,7 5,5 5,7 5,5 5,7 5,5 5,8 5,6 5,9 5,6 5,8 5,6 5,9 5,7
Viscosidade
(Pa) 25,0 25,8 25,1 26,2 26,4 29,1 25,9 29,7 27,0 28,2 26,5 27,9 29,5 31,0 30,0 32,1 29,2 31,3 29,8 32,1 30,1 31,0 29,9 31,9
a= Normal, sem alterações.
82
A centrifugação promove estresse na amostra, acelerando a mobilidade de partículas e
antecipando possíveis sinais de instabilidade, como: precipitação, separação de fases, formação
de sedimento compacto e coalescência (Brasil, 2007). Quaisquer destas alterações sinalizam
problemas comprometedores muitas vezes já em médio prazo, no tempo de vida útil da
formulação (Allen Jr et al., 2007; Ferreira, 2008).
O aspecto dos géis, em relação à coloração e homogeneidade, é importante do ponto de
vista comercial, pois produtos que apresentam turvação, heterogeneidade e coloração
desuniforme são pouco atraentes aos usuários, diminuindo a adesão ao tratamento.
Na avaliação do ciclo gelo-degelo, os grupos G1 a G4 apresentaram mudança na
coloração, escurecendo a tonalidade, provavelmente devido a processos oxidativos do extrato.
Os grupos G5 e G6 permaneceram com a mesma tonalidade da coloração inicial (amarelo
claro).
As variações de pH foram compatíveis para os pré-estabelecidos e a viscosidade não
apresentou variações que extrapolassem os valores padronizados. Apenas os grupos G1 e G2
(base CMC) tiveram grande aumento da viscosidade, após ciclo gelo-degelo, incompatíveis com
a funcionalidade do viscosímetro.
Na avaliação da estabilidade acelerada (nos tempos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias), os grupos
G5 e G6 demonstraram valores compatíveis com os pré-estabelecidos, dentro da normalidade e
sem alterações consideradas significativas, para os parâmetros analisados (aspecto, cor, odor,
densidade, pH e viscosidade).
Os produtos finais que apresentaram melhor estabilidade, frente aos testes realizados,
foram os elaborados com o polímero carbopol, consoante com outros trabalhos, como Singh et
al. (2008) e Vasconcelos et al. (2003).
CONCLUSÃO
A avaliação da estabilidade de formulações, contendo extrato seco de C. pyramidalis,
contribuiu para o conhecimento do comportamento de produtos, na forma de géis, oriundos de
83 diferentes polímeros, quanto a estimativa de prazo de validade, estabilidade de características
organolépticas e físico-químicas, levando a uma maior confiabilidade e segurança dos produtos.
Foram utilizados três polímeros (carbopol, carboximetilcelulose e
hidropropilmetilcelulose), em concentrações diferentes, para avaliação da estabilidade, dos
quais teve apenas aqueles oriundos do carbopol como melhor pretendente a produto a ser
lançado ao mercado. Pois apresentou todos os parâmetros pré-estabelecidos (aspectos, cor, odor,
densidade, pH e viscosidade) dentro das faixas aceitáveis.
Os produtos oriundos dos polímeros CMC e HPMC apresentaram turbidez (após teste
preliminar de centrífuga) e mudança de coloração (esta mudança possivelmente por reações de
oxidação). Além disso, nos grupos com CMC houve aumento na viscosidade do produto,
inviabilizando seu uso bucal.
É importante ressaltar, que outras avaliações de estabilidade necessitam ser feitas e
estudos mais aprofundados são necessários para avaliar a eficácia terapêutica (estudos clínicos)
dessas formulações em pacientes que apresentem quadro de estomatite.
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87
8. Conclusão
88
8. CONCLUSÃO
Os resultados encontrados neste trabalho mostraram perfis, em alguns
momentos, diferentes para as espécies C. pyramidalis e S. glandulosum, ambas
presentes em abundância no Bioma Caatinga. Foram obtidos, com sucesso, os
objetivos propostos para avaliações dos teores de fenóis totais, taninos e flavonóides,
atividades antioxidantes primária e secundária, bioprospecção fitoquímica, atividades
contra micro-organismos, toxicidade seletiva e citotoxicidade e ainda desenvolvimento
farmacotécnico de gel odontológico e avaliações de estabilidade. Tanto C. pyramidalis,
quanto S. glandulosum apresentaram baixa toxicidade, nos ensaios realizados, o que
encoraja a continuação de estudos no âmbito clínico, embora outros estudos possam
e/ou devam ser realizados para ampliar o grau de segurança no uso destas espécies.
S. glandulosum é uma espécie que apresenta ampla distribuição geográfica,
mas foi observado que são escassas as informações relacionadas a mesma. Com isso,
este trabalho pode elucidar suas concentrações elevadas de compostos fenólicos (CFT
(mg ATE/g) para folhas de 280,68 ± 6,36 e para cascas de 135,55 ± 9,85; CTT (mg
ATE/g) para folhas de 125,97 ± 9,30 e para cascas não detectado; CFT (mg ER/g) para
folhas de 312,56 ± 7,34 e para cascas de 107,34 ± 3,05). Ação antimicrobiana contra S.
aureus e S. coagulase-negativa.
C. pyramidalis apresentou maiores teores de fenóis totais (459,79 ± 11,65 e
160,82 ± 8,11 mg ATE/g, para folhas e cascas, respectivamente), taninos (284,22 ± 4,85
e 61,36 ± 2,85 mg ATE/g, para folhas e cascas, respectivamente) e flavonóides (370,40
± 12,80 e 114,55 ± 3,34 mg ER/g, para folhas e cascas respectivamente), quando
comparado com S. glandulosum. Teve ainda maior espectro de ação contra micro-
organismos apontados como patogênicos, sendo ativo contra S. aureus, E. faecalis, P.
aeruginosa, S. coagulase-negativa. Todos estes trabalhos realizados incentivaram o
desenvolvimento de géis para uso odontológico, tendo aqueles produzidos a base de
carbopol os melhores resultados de estabilidade.
Todos os resultados foram bastante promissores, para que estudos futuros
sejam realizados, sejam eles para o isolamento de moléculas líderes a serem mais bem
exploradas, quanto a sua eficácia e segurança, isoladamente, ou quanto ao emprego
dos fitocomplexos em formulações que ajudem a tratar ou amenizar patologias que
aflijam a saúde da população.
89
Referências
90
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