UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO ......inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades de liberação das microesferas, produzindo menores velocidades de difusão k 2 de

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

TESE DE DOUTORADO

DDeesseennvvoollvviimmeennttoo ee ccaarraacctteerriizzaaççããoo ddee mmiiccrrooeessffeerraass ccoonntteennddoo

ttrraannss--ddeessiiddrrooccrroottoonniinnaa ee ccoommpplleexxoo ddee iinncclluussããoo ddee

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WALDENICE DE ALENCAR MORAIS

RECIFE/2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DDeesseennvvoollvviimmeennttoo ee ccaarraacctteerriizzaaççããoo ddee mmiiccrrooeessffeerraass ccoonntteennddoo

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Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães ORIENTADORA

Profa. Dra. Maria Aparecida M. Maciel

CO-ORIENTADORA

Waldenice de Alencar Morais DOUTORANDA

RECIFE/2010

Tese de doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Produção e Controle de Qualidade de Medicamentos.

iii

Morais, Waldenice de Alencar

Desenvolvimento e caracterização de microesferascontendo trans-desidrocrotonina e complexo deinclusão de trans-desidrocrotonina com2-hidroxipropil-β-ciclodextrina / Waldenice de AlencarMorais. – Recife : O Autor, 2010.

133 folhas; il., graf., fig., tab.

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.

Inclui bibliografia.

1. Sistemas de liberação de fármacos. 2. Microesferas. 3. Complexo de inclusão de fármaco com ciclodextrina. 4. trans-Desidrocrotonina. 5. Análise fatorial I. Título.

615.014 CDU (2.ed.) UFPE 615.58 CDD (22.ed.) CCS-05/2010

iv

iii

v

A meus pais: à minha adorável mãe, meu exemplo de

coragem e perseverança, e à memória do meu querido pai,

meu exemplo eterno de integridade e honestidade.

iv

vi

AGRADECIMENTOS

Dirijo o meu mais sincero agradecimento...

Primeiramente a Deus por toda fé, coragem e perseverança;

À minha família pelo amor, compreensão e apoio em todos os momentos felizes e difíceis e que

sempre me motivaram em meus objetivos....especialmente à memória do meu pai;

À Profª Drª Nereide Stela Santos Magalhães pela orientação, paciência e confiança que me

acolheu em seu laboratório de pesquisa, contribuindo para o meu crescimento acadêmico e

científico;

À Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel pela co-orientação, dedicação e confiança em meu

trabalho para desenvolver novos sistemas terapêuticos com o diterpeno bioativo

trans-desidrocrotonina (t-DCTN);

Aos alunos de iniciação científica Gineide Conceição dos Anjos, Luan Silveira Alves de Moura,

Cássia Carvalho de Almeida, Gilvani Gomes de Carvalho e Aline Maria Sales Solano pelo esforço

na extração e reisolamento da t-DCTN no Laboratório de Produtos Naturais da UFRN sob

orientação da Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel;

À Profª Drª. Beate Seageser Santos, à Profª Drª Noemia Pereira da Silva Santos e ao Prof. Dr.

Antônio Rodolfo de Faria pela disponibilidade e contribuição para a avaliação deste trabalho no

Exame de Qualificação de Tese;

Ao Prof. Dr. Benício de Barros Neto, ao Prof. Dr. José Luiz C. Fonseca, à Profª Drª Noemia

Pereira da Silva Santos, à Profª Drª Maria Nelly Caetano Pisciottano e à Profª Drª. Beate Seageser

Santos pela disponibilidade e contribuição para a avaliação desta tese de doutorado;

A todos os colegas e amigos do Grupo de Pesquisa de Sistemas de Liberação Controlada (SLC),

que me receberam com toda solidariedade, atenção e carinho;

v

vii

Ao Profo Drº. Benício Barros Neto pela disponibilização do software Statistic versão 6.0, à Profa

Dra Maria Fernanda Pimental e ao doutorando Pabyton Gadelha pela contribuição no estudo de

análise fatorial;

Às alunas de iniciação científica Rosana Silva Batista, Dina Melissa Amaya Silva e Rebeca

Cavalcanti Silveira pelo esforço, dedicação e compreensão pelo desenvolvimento deste trabalho;

Às doutorandas Milena Sales Ferraz, Mariane Cajubá de Brito Lira e Elisângela Afonso de Moura

Mendonça pelas discussões científicas e companheirismo;

Aos mestrandos Taciana Lima Salviano Lapenda e Hywre Cesar de Brito Pinto pela colaboração;

A todos os amigos e colegas do Laboratório de Bioquímica do LIKA-UFPE pela saudável

convivência em laboratório;

À minha grande amiga Mariana Paola Cabrera pela amizade e companheirismo;

Ao Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) e ao Centro de Tecnologias Estratégicas

do Nordeste (CETENE-PE) pelo suporte dado a este trabalho;

Ao Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) e à Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de

Pernambuco (PROPESQ-UFPE) pelo suporte financeiro durante o curso deste trabalho.

vi

viii

“....estejais seguros que Deus não nos impôs uma tarefa

acima de nossas forças, e que não vos abandonou sozinhos na Terra,

sem amigos e sem sustentação.”

São Luís, Santo Agostinho

vii

ix

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................. x

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................... xi

LISTA DE TABELAS........................................................................................................... xii

RESUMO............................................................................................................................... xiii

ABSTRACT........................................................................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 16

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 20

2.1 Nanotecnologia farmacêutica - Sistemas de liberação de fármacos.............. 20

2.2 Sistemas particulados poliméricos.................................................................... 23

2.2.1 Polímeros utilizados na preparação de sistemas particulados.............. 25

2.3 Micropartículas.................................................................................................. 27

2.3.1 Métodos de preparação de micropartículas........................................... 29

2.3.2 Métodos de caracterização de micropartículas...................................... 32

2.4 Cinética de liberação.......................................................................................... 36

2.5 Análise fatorial................................................................................................... 39

2.6 Ciclodextrinas..................................................................................................... 40

2.6.1 Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas...................... 44

2.7 trans-Desidrocrotonina (t-DCTN)..................................................................... 47

3 OBJETIVOS...................................................................................................................... 52

ARTIGO

Physicochemical and release characteristics of t-dehydrocrotonin and

t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex into PCL and PLGA

microparticles........................................................................................................................

54

4 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 98

5 PERSPECTIVAS............................................................................................................... 101

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 103

viii

x

ANEXOS

ANEXO A

ARTIGO I – Abstract

Encapsulation and release characteristics of DCTN/PLGA microspheres. Journal of

Microencapsulation. Published...............................................................................................

129

ANEXO B

ARTIGO II – Abstract

Validation of UV spectrophotometric method for the determination of

dehydrocrotonin and application in inclusion complexes with hydroxypropyl-β-

cyclodextrin.

A ser submetido.......................................................................................................................

131

ANEXO C

CONCURSO PÚBLICO

Aprovação em Concurso Público para o Cargo de Professor Adjunto no

Departamento de Farmácia na área de Farmacotécnica na Universidade Federal do

Rio Grande do Norte. DOU, seção 2, 31 de dezembro de 2009...........................................

133

iv

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

BCS – Sistema de classificação biofarmacêutica BET - Brunauer-Emmette-Teller BJH- Barret- Joyner-Halenda CD – Ciclodextrina CI50 - Concentração do fármaco que inibe 50% do crescimento celular CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência DE50 – Dose terapêutica efetiva para 50% dos animais DL50 – Dose letal para 50% dos animais DNA – Ácido desoxiribonucléico DSC – Calorimetria exploratória diferencial dv - diâmetro volumétrico médio FDA – Food and drug administration GPC- Cromatografia de permeação em gel HPβCD – 2-Hidroxipropil-β-ciclodextrina i.p. – Via intraperitoneal i.v. – Via intravenosa IR - Espectroscopia na região do infravermelho Log P – Coeficiente de partição MET – Microscopia eletrônica de transmissão MEV – Microscopia eletrônica de varredura PCL – Policaprolactona PEG – Polietilenoglicol PGA – Polímero de ácido glicólico pH – Potencial hidrogeniônico PHBHV - Poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) pKa – Logaritmo negativo da constante de ionização PLA – Polímero de ácido láctico PLA-PEG – Copolímero de PLA com PEG PLGA – Copolímero de ácido láctico e glicólico PVA – Álcool polivinílico RMN – Ressonância magnética nuclear RNA - Ácido ribonucléico s.c. – Via subcutânea SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida t1/2 – Tempo de meia-via t-DCTN – trans-Desidrocrotonina TGA – Análise termogravimétrica UV-Vis – Espectrofotometria na região do ultravioleta-visível v.o. – Via oral XRD – Difração de raios-X αCD – α-Ciclodextrina βCD – β-Ciclodextrina γCD – γ-Ciclodextrina

x

xii

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

Figura 1 - Comparação do perfil farmacocinético de formas farmacêuticas convencionais e

de sistemas de liberação controlada (adaptado de

http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/exemplar15.html).................................................................

21

Figura 2 - Representação esquemática da classificação de nanopartículas e micropartículas:

nanoesfera e microesfera (sistema matricial) (A); nanocápsula e microcápsula (sistema

reservatório) (B) (http://www.nanoparticles.org/links/Nanosphere.jpg)...................................

24

Figura 3 - Método de preparação de micropartículas por emulsificação (o/a) e evaporação

do solvente: (1) solubilização dos componentes na fase oleosa orgânica, (2) mistura da fase

orgânica com a fase contínua contendo emulsificante sob agitação (3) evaporação do

solvente (4) separação das micropartículas (adaptado de LI et al., 2008).................................

31

Figura 4 - Estrutura química de uma ciclodextrina (A) e desenho esquemático ilustrando a

cavidade hidrofóbica, a posição das hidroxilas primárias e secundárias e suas dimensões:

altura (H), diâmetro interno (DI) e diâmetro externo (DE) (adaptado de BREWSTER;

LOFTSSON, 2007)...........................................................................................................

41

Figura 5 - Estruturas moleculares das ciclodextrinas naturais (adaptado de SONG et.,

2009)..........................................................................................................................................

42

Figura 6 - Esquema da associação entre ciclodextrina hidratada (CD) e molécula hóspede

(G): (acima) complexos de inclusão 1:1 e (abaixo) complexos de inclusão 2:1

ciclodextrina:fármaco (SONG et al., 2009)...............................................................................

46

Figura 7 - Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN)......................................... 48

xi

xiii

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

Tabela 1 - Exemplos de sistemas de liberação de fármacos......................................................

22

Tabela 2 - Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas (CONNORS, 1997).................... 43

xii

xiv

RESUMO

Microesferas são sistemas poliméricos de liberação controlada capazes de aumentar a biodisponibilidade e diminuir a toxicidade de uma variedade de fármacos. Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas podem modificar as características físico-químicas e de cinética de liberação de microesferas. A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é um princípio ativo extraído do Croton cajucara Benth com várias atividades farmacológicas, tais como a hipoglicemiante. Entretanto, a sua baixa solubilidade em água e hepatotoxicidade restrigem a sua aplicação terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da presença de t-DCTN e complexo de inclusão de t-DCTN com hidroxipropil-β-ciclodetrina (t-DCTN:HPβCD) em microesferas de policaprolactona (PCL) e poliácido láctico e glicólico (PLGA) em suas propriedades físico-químicas e de cinética de liberação. Três diferentes sistemas de microesferas contendo t-DCTN, t-DCTN:HPβCD ou de t-DCTN:HPβCD e t-DCTN coencapsuladas foram preparados pelo método de emulsão múltipla (a/o/a) segido de evaporação do solvente. O polietilenoglicol (PEG) e o álcool polivinilico (PVA) foram usados como estabilizantes das emulsões simples e múltipla, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de pré-formulação com microesferas de PCL (sem fármaco) utilisando análise fatorial fracionária 24−1, variando-se as concentrações de PEG e PVA, e os volumes das fases aquosas interna e externa. Com isso, foi investigada a influência dos parâmetros no tamanho de partículas (dv) e polidispersão (span) das microesferas de PCL. A análise fatorial mostrou ser uma excelente ferramenta para a otimização de micropartículas de PCL. A variação dos volumes das fases aquosas interna e externa das emulsões afetaram consideravelmente o dv e o span dos sistemas. O dv das micropartículas de PCL variou de 6,68 to 28,41 μm e o span de 1,16 to 4,76 com a variação dos fatores. Considerando as formulações mais estáveis, microesferas de PCL e PLGA contendo t-DCTN ou t-DCTN:HPβCD foram preparadas para avaliar a influência da natureza do polímero. A t-DCTN foi encapsulada com êxito nas microesferas de PCL e PLGA com uma quantidade de fármaco encapsulada de 4% e 6% na razão de 1:10 de fármaco:polímero, respectivamente. As microesferas contendo t-DCTN:HPβCD apresentaram uma superfície lisa, e uma diminuição da quantidade de fármaco encapsulada, do tamanho de partícula e dos parâmetros de porosidade, em relação àquelas contendo somente t-DCTN. A coencapsulação de t-DCTN:HPβCD com t-DCTN na razão 1:5 de fármaco:polímero aumentou a quantidade de fármaco encapsulada para 14% em microesferas de PLGA, com tamanho de partículas (dv=9,59 µm) e polidispersão (span=1,57) satisfatórios. No que se refere a cinética de liberação in vitro, os perfis apresentaram uma boa correlação com o modelo fickiano, indicando que a difusão está envolvida no mecanismo de liberação. O complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades de liberação das microesferas, produzindo menores velocidades de difusão k2 de 0,105 (PCL) e k2 de 0,107 (PLGA), quando comparadas aos sistemas contendo t-DCTN, k2 de 0,289 (PCL) e k2 de 0,395 (PLGA), respectivamente. A coencapsulação também reduziu o efeito burst (1,5%) e a velocidade de difusão (k2=0,079). Os resultados sugerem uma menor afinidade da t-DCTN pela matriz de PCL em relação ao PLGA, devido à menor quantidade de fármaco encapsulada, maior modificação do potencial zeta, bem como, maior efeito burst e cinética de liberação mais rápida. Portanto, a microencapsulação de t-DCTN e complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em polímeros biodegradáveis pode ser uma alternativa terapêutica inovadora na avaliação da atividade hipoglicemiante da t-DCTN.

Palavras-Chave: Sistemas de liberação de fármacos, microesferas, complexo de inclusão de fármaco com ciclodextrina, trans-desidrocrotonina, análise fatorial.

xiii

xv

ABSTRACT

Microspheres are drug delivery polymeric systems able to enhance the bioavailability and to reduce the toxicity of a variety of drugs. The inclusion complexes of drugs with cyclodextrins may modify the physicochemical and release characteristics of microspheres. The trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a drug extracted of the Croton cajucara Benth that presents several pharmacological activities, such as hypoglycemic. However, its lower water solubility and hepatotoxicity limit its therapeutic application. The purpose of this study was to evaluate the influence of the presence of t-DCTN and t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex (t-DCTN:HPβCD) in polycaprolactone (PCL) and poly (lactic-co-glycolic)-acid (PLGA) microparticles on their physicochemical and release properties. Three different microparticle systems were prepared by double W/O/W emulsion-solvent evaporation method with t-DCTN, t-DCTN:HPβCD or co-encapsulation of t-DCTN:HPβCD and t-DCTN. The polyethylene glycol (PEG) and polyvinylalcohol (PVA) were used as stabilizing of the simple and double emulsion, respectively. Initially, pre-formulation studies of the preparation of unloaded PCL microparticles were performed using 24−1 fractional factorial design varying PEG and PVA concentration, and aqueous phase volume of the simple and double emulsions. Then, the influence of the formulation features on the particle size and polydispersity (span) of unloaded PCL microspheres was thus evaluated using the factorial design. Factorial design showed to be an excellent tool to optimize PCL microparticles. The variation of the inner and outer aqueous phase volumes of emulsions considerably affected the size and the span of the resultant systems. The size of unloaded PCL microparticles varied from 6.68 to 28.41 μm and the span changed from 1.16 to 4.76 with the varying of the factors. Considering the most stables unloaded microparticle formulations, t-DCTN and t-DCTN:HPβCD-loaded PCL and PLGA microparticles were prepared to evaluate the influence of polymer nature. The t-DCTN was successfully encapsulated into PCL and PLGA microparticles with loading drug of 4% and 6% (w/w) at 1:10 drug/polymer ratio, respectively. The t-DCTN:HPβCD-loaded microspheres presented a smooth surface and a decreasing of the loading, particle size and porosity parameters in relation to t-DCTN-loaded systems. The co-encapsulation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio increased the drug loading to 14% (w/w) in PLGA microspheres with satisfactory particle size (dv=9.59 µm) and polidispersity (span=1.57). The good agreement between kinetics profiles and fickian model indicated that the diffusion is involved on release mechanism. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modified the release properties with smaller diffusion rates, for PCL (k2=0.105) and PLGA (k2=0.107), in comparison with microparticles containing only t-DCTN, k2=0.289 (PCL) and k2=0.395 (PLGA), respectively. The co-encapsulation also reduced burst effect (almost 1.5%) and diffusion rate (k2=0.079). The results suggest a smaller affinity of t-DCTN by PCL matrix in relation to PLGA due its lower encapsulation, higher modification of the zeta potential, higher effect burst and faster release. Then, the microencapsulation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex into biodegradable polymers may be an inovate therapeutical alternative to evaluate the hypoglycemic effect of t-DCTN.

Keywords: Drug delivery systems, microspheres, drug inclusion complex with cyclodextrin, trans-dehydrocrotonin, factorial design.

xiv

MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo

trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. 15

INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA



1 INTRODUÇÃO

Os sistemas de liberação controlada de fármacos permitem o aumento da eficácia

terapêutica através da modificação da cinética de liberação do princípio ativo, bem como, pelo

seu direcionamento ao sítio de ação, oferecendo várias vantagens em relação às formas

farmacêuticas convencionais, tais como aumento da biodisponibilidade, liberação prolongada,

manuntenção da concentração plasmática do fármaco constante dentro da faixa terapêutica,

minimização de efeitos tóxicos e subterapêuticos, diminuição da freqüência de administração

da dose e melhoria da adesão do paciente à terapêutica (BRANNON-PEPPAS, 1995;

FREIBERG; ZHU, 2004; GARBAYO et al., 2008; MAO et al., 2008).

Dentre os sistemas de liberação controlada, as micropartículas poliméricas merecem

destaque, tendo em vista a estabilidade físico-química e biológica, sendo utilizadas para a

encapsulação de diferentes substâncias, como peptídeos, proteínas, DNA/RNA e fármacos

(GARBAYO et al., 2008; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008), destinadas principalmente

para a via oral de administração. Além disso, esses sistemas de liberação são utilizados na

preparação de produtos farmacêuticos presentes no mercado (como Lupron®, Depot®,

Zoladex®, Decapeptyl®, Eligard®, Enantone®, Trenantone®, Nutropin Depot®, e Profact®)

(HANS; LOWMAN, 2002; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008). Polímeros

biocompatíveis e biodegradáveis são comumente empregados no desenvolvimento de

micropartículas, tais como os poliésteres poli-ε-caprolactona (PCL), poliácido láctico (PLA),

poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros (PLGA) (SANTOS-MAGALHÃES et al.,

2000; LECAROZ et al., 2006; FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al., 2008).

As micropartículas biodegradáveis podem ser preparadas por diferentes técnicas, como

a técnica de emulsificação com evaporação do solvente é bastante utilizada (BILATI et al.,

2005; GARBAYO et al., 2008; ZHANG et al., 2008). Vários fatores na técnica de preparação

podem influenciar as características físico-químicas dos sistemas desenvolvidos (DILLEN et



al., 2004). A análise fatorial pode ser utilizada para a avaliação dos efeitos das variáveis de

formulação e suas interações nas propriedades estudadas com uma abordagem estatística,

sendo bastante útil como uma estratégia para a otimização de formulações farmacêuticas

(DERAKHSHANDEH et al., 2007).

A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é a substância majoritária de natureza

clerodânica isolado das cascas do caule da espécie vegetal nativa da região amazônica

brasileira Croton cajucara Benth (popularmente conhecida como sacaca) (AGNER et al.,

1999). A t-DCTN apresenta várias atividades farmacológicas comprovadas e correlacionadas

ao uso popular da sacaca, dentre elas, hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997; SILVA et al.,

2001a), hipolipidêmica (FARIAS et al., 1996; SILVA et al., 2001a; 2001b; 2001c;

BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; 2001), antiulcerogênica

(HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ et al., 2004),

antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antitumoral (GRYNBERG et

al., 1999; MELO et al., 2004), antiestrogênica (LUNA-COSTA et al., 1999) e cardiovascular

(SILVA et al., 2005). Entretanto, a baixa solubilidade aquosa (36,6 ± 3,16 µg/mL a 37ºC)

(MORAIS et al., 2008) e a hepatotoxicidade (MACIEL et al., 2002a; 2002b) da t-DCTN são

fatores limitantes da sua aplicação terapêutica (CORRÊA et al., 2005).

Em estudo prévio foi demonstrado que a encapsulação da t-DCTN em sistemas de

liberação controlada do tipo microesferas de PLGA melhorou o seu efeito hipoglicemiante em

ratos normoglicêmicos, reduzindo os níveis de glicose em 26,8%, enquanto foi obtida uma

redução de 14,3% para a t-DCTN em suspensão. As microesferas de PLGA contendo t-DCTN

foram obtidas pelo método de emulsão múltipla a/o/a com evaporação do solvente e

apresentaram uma forma esférica e superfície lisa em análise de microscopia eletrônica de

varredura. Além disso, as microesferas demonstraram uma eficiência de encapsulação de

85,5%, e duas populações de tamanho de partícula importantes (3,2 μm e 7,6 μm). No que se



refere à cinética de liberação in vitro, foi observado um efeito burst de 19,4% nas primeiras

2 h, uma etapa de liberação lenta e gradual com duração de 12 h (com uma constante de

difusibilidade k2=0,086) e, uma liberação máxima de 55,6% em 57 h (MORAIS et al., 2008).

As propriedades físicas, químicas e biológicas dos princípios ativos podem ser

modificadas pela formação de complexos de inclusão com ciclodextrinas, podendo ser

observados o aumento da solubilidade aquosa e da estabilidade, bem como a diminuição da

toxicidade dos fármacos associados (MARTIN DEL VALLE, 2004; BREWSTER;

LOFTSSON, 2007; SCHWINGEL et al., 2008). Esse mecanismo de complexação molecular é

possível porque as ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos constituídos de uma superfície

hidrofílica e uma cavidade hidrofóbica, a qual permite o alojamento de fármacos de baixa

polaridade em seu interior (DUCHÊNE et al., 1999; LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).

Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas vêm sendo incorporados em sistemas

de liberação controlada, como microesferas, a fim de melhorar a eficiência de encapsulação e

modular a cinética de liberação dos dispositivos terapêuticos (DUCHÊNE et al., 1999).

A β-ciclodextrina é uma das ciclodextrinas (CD) naturais mais utilizadas em âmbito

farmacêutico devido a sua habilidade de complexação com diferentes fármacos e seu baixo

custo (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Complexo de inclusão de t-DCTN com

β-ciclodextrina reduziu a citotoxicidade deste composto bioativo em hepatócitos de ratos e

fibrobastos V79 (CORRÊA et al., 2005). Derivados quimicamente modificados da

β-ciclodextrina, como a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD), vêm sendo bastante

utilizados devido ao aumento da solubilidade aquosa e a diminuição das restrições

toxicológicas relacionadas à β-ciclodextrina (DE ARAÚJO et al., 2008).

Nesse contexto, este estudo pretende conciliar as vantagens da nanotecnologia

farmacêutica, juntamente com os fundamentos da formação de complexos de inclusão de

fármacos com ciclodextrinas. A análise fatorial foi utilizada como estratégia para otimização



dos sistemas de liberação controlada. Essa proposta de trabalho foi desenvolvida com a

obtenção e caracterização de microesferas inovadoras dos polímeros biodegradáveis PCL e

PLGA contendo o bioativo t-DCTN e o complexo de inclusão de t-DCTN com HPβCD. Com

isso, foi avaliada a influência do complexo de inclusão nas propriedades físico-químicas e de

liberação usando diferentes matrizes poliméricas. Desta forma, o presente trabalho viabiliza a

ampliação dos estudos com o diterpeno clerodânico t-DCTN com uma abordagem

nanotecnológica, os quais podem contribuir como uma alternativa em potencial no avanço da

utilização deste princípio ativo na terapêutica.



2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Nanotecnologia Farmacêutica - Sistemas de liberação de fármacos

O termo nanotecnologia foi utilizado pela primeira vez por Norio Taniguchi em 1974

para definir a técnica de produção na ordem de 1 nanômetro (SAHOO et al., 2007). De uma

forma geral, a nanotecnologia representa a ciência e engenharia que está envolvida com o

desenvolvimento, caracterização e aplicação de materiais e dipositivos funcionalizados na

escala nanométrica (a bilionésima parte do metro) (EMERICH et al., 2003; SAHOO et al.,

2007).

As primeiras aplicações práticas da nanotecnologia contemplaram diversas áreas,

como comunicações, engenharia, física, química, biologia, robótica e medicina. O uso da

nanotecnologia nas ciências médicas oferece novas oportunidades terapêuticas contribuindo

para o avanço da saúde humana com a descoberta ou aprimoramento de tratamentos para uma

variedade de doenças e melhoria da qualidade de vida do paciente (SAHOO et al., 2007;

SINGH; LILLARD, 2009).

Nesse contexto, a nanotecnologia farmacêutica é responsável pelo delineamento de

novos dispositivos de liberação de fármacos na escala nano e micrométrica com uma

abordagem multidisciplinar. Essa tecnologia de liberação de fármacos atua obtendo sistemas

terapêuticos mais eficientes através do direcionamento do princípio ativo ao sítio de ação

(célula, tecido ou órgão) ou pelo controle de sua cinética de liberação (STAMATIALIS et al.,

2008).

Os sistemas desenvolvidos por essa sofisticada tecnologia são dispositivos que liberam

o princípio ativo de uma forma controlada, mantendo uma concentração apropriada no local

de ação por um maior período de tempo. Com isso, exerce um papel fundamental na

otimização da terapia medicamentosa, já que possibilita que os princípios ativos tornem-se



mais seletivos em termos de concentração no sítio de ação, minimizando efeitos colaterais e

aumentando a duração da atividade biológica (KUMAR et al., 2001; STAMATIALIS et al.,

2008). Essa estratégia nanotecnológica é bastante útil para reintroduzir no mercado

farmacêutico fármacos de elevada potência farmacológica que apresentam uma baixa

biodisponibilidade ou elevada toxicidade, bem como para diminuir o custo e o tempo

associados à obtenção de uma nova molécula bioativa por síntese química (FENG et al.,

2004).

As vantagens dos sistemas de liberação controlada em relação às formas

farmacêuticas convencionais estão relacionadas a inúmeros fatores (Fig. 1), tais como,

proteção do princípio ativo contra oxidação, umidade e variação de pH que podem diminuir

os níveis plasmáticos do fármaco; direcionamento a alvos específicos do organismo humano

com o uso de moléculas sinalizadoras como anticorpos, peptídeos e polissacarídeos; aumento

da biodisponibilidade; redução do número de doses e da quantidade do fármaco administrado;

liberação sustentada e prolongada; diminuição das flutuações sanguíneas da concentração do

princípio ativo; manutenção da concentração terapêutica constante; minimização de efeitos

tóxicos e subterapêuticos; maior adesão do paciente à terapia medicamentosa e redução dos

custos na saúde (BRANNON-PEPPAS, 1995; PETITTI et al., 2008).

Figura 1 - Comparação do perfil farmacocinético de formas farmacêuticas convencionais e de

sistemas de liberação controlada (adaptado de

http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/exemplar15.html).



Tabela 1 - Exemplos de sistemas de liberação de agentes terapêuticos.

Sistema Descrição Fármaco Indicação

terapêutica Micropartículas Partículas poliméricas sólidas

com tamanho de 1-1000 µm

(YANG; ALEXANDRIDIS,

2000)

Indometacina

(POLETTO et al., 2007)

Dexametasona

(BALMAYOR et al.,

2009)

Osteoartrite

Nanopartículas Partículas poliméricas coloidais

com tamanho de 10-1000 nm

(SOPPIMATH et al., 2001)

Risperidona

(MUTHU et al., 2009)

Fosfato de betametasona

(ISHIHARA et al., 2009)

Esquizofrenia

Rinite alérgica

Lipossomas Vesículas esféricas baseadas em

bicamadas lipídicas

(TORCHILIN et al., 2005)

Vacina DNA

(KHATRI et al., 2008)

Terapia gênica

Nanopartículas

lipídicas

sólidas

Partículas submicrônicas

baseadas em monocamadas

lipídicas sólidas à temperatura

ambiente ou corpórea

(FARAJI; WIPF, 2009)

Tretinoína

(SHAH et al., 2007)

Paclitaxel

(YUAN et al., 2007)

Acne

Carcinoma de

ovário Polimerssomas Vesículas esféricas baseadas em

bicamadas de polímeros

(SINGH; LILLARD, 2009)

Doxorubicina

(AHMED et al., 2006)

Leucemias

linfoblástica

aguda e

mieloblástica

Dendrímeros Macromoléculas com estrutura

simétrica baseadas em polímeros

(FARAJI; WIPF, 2009)

Doxorubicina

(LEE et al., 2006)

Câncer de

bexiga



Nesse contexto, podem ser produzidos diferentes dispositivos, tais quais as

micropartículas, nanopartículas, lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas, polimerssomas,

dendrímeros, contendo fármacos de aplicações terapêuticas diversas (Tab. 1), produzindo

diferentes perfis de liberação de acorco com o sistema e a via de administração utilizados

(PETITTI et al., 2008).

2.2 Sistemas particulados poliméricos

Os sistemas particulados são dispositivos poliméricos de liberação controlada de

fármacos com tamanho variando da escala nanométrica (nanopartículas) a micrométrica

(micropartículas) capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos (Tab. 1) desde

fármacos de baixo peso molecular a macromoléculas (BARAT et al., 2008).

Esses sistemas podem ser classificados de acordo com a sua composição e organização

estrutural em nanoesferas/microesferas e nanocápsulas/microcápsulas (Fig. 2) (BERKLAND

et al., 2001; MANDAL et al., 2001; SINGH et al., 2001; PETITTI et al., 2008). As

nanoesferas e as microesferas são sistemas matriciais ou monolíticos em que o fármaco

encontra-se disperso e/ou solubilizado na matriz polimérica, não sendo possível identificar um

núcleo diferenciado (LIMAYEM et al., 2004). Por outro lado, as nanocápsulas e

microcápsulas são sistemas reservatórios nos quais o fármaco encontra-se contido em um

núcleo central (de natureza oleosa ou aquosa) com um revestimento polimérico disposto ao

redor deste núcleo que atua como um filme protetor (SOPPIMATH et al., 2001).

Durante as últimas décadas, os sistemas particulados poliméricos vêm sendo

apontados como uma importante alternativa em várias aplicações, dentre elas, reparação

óssea, engenharia de tecidos, desenvolvimento e aplicações biomédicas, tais como liberação

de vacinas, vários tratamentos para o câncer, SIDA, tuberculose e outras doenças,

apresentando perspectivas futuras promissoras (BARAT et al., 2008). Além disso, a



encapsulação do fármaco na matriz polimérica o protege da desativação durante o processo de

liberação e garante que a concentração liberada seja suficiente para atingir o sítio de ação (NG

et al., 2009).

Figura 2. Representação esquemática da classificação de nanopartículas e micropartículas:

nanoesfera e microesfera (sistema matricial) (A); nanocápsula e microcápsula (sistema

reservatório) (B) (http://www.nanoparticles.org/links/Nanosphere.jpg).

Os sistemas particulados poliméricos merecem destaque como dispositivos de

liberação de fármacos devido à catacterísticas, tais como, boa estabilidade físico-química e

biológica, encapsulação de uma variedade de fármacos de diversas aplicações

(antiinflamatórios, antibióticos, antifúngicos, antituberculostáticos, anticancerígenos,

anestésicos, antipsicóticos) e versatilidade de vias de administração (oral, intramuscular,

subcutânea, bioadesiva, injetável, pulmonar) (HANS; LOWMAN, 2002; BARAT et al., 2008;

BALMAYOR et al., 2009; KLOSE et al., 2009; SINGH; LILLARD, 2009). Outro fator que

despertou grande interesse no desenvolvimento destes sistemas foi a sua comercialização em

importantes produtos farmacêuticos aplicados a terapêutica, muitos deles ainda presentes no

mercado (como Lupron® Depot®, Zoladex®, Decapeptyl®, Eligard®, Enantone®, Trenantone®,

Nutropin Depot®, e Profact®) (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).



2.2.1 Polímeros utilizados na preparação de sistemas particulados

Uma das principais razões do processamento de polímeros na área farmacêutica é a

preparação de carreadores de fármacos (REVERCHON et al., 2009). Nas últimas décadas, é

observada ênfase na utilização de polímeros biodegradáveis para o desenvolvimento de

sistemas de liberação controlada. Esse fato está associado à capacidade destes dispositivos

liberarem o fármaco durante certo período de tempo e, subsequentemente, serem

metabolizados pelo organismo humano sem a necessidade de remoção cirúrgica, obtendo a

duração desejada do tratamento farmacológico (BALMAYOR et al., 2009; KLOSE et al.,

2009).

Na obtenção de nanopartículas e micropartículas podem ser utilizados tanto polímeros

naturais quanto sintéticos (BRANNON-PEPPAS, 1995). Dentre os polímeros naturais mais

empregados estão albumina, colágeno, alginato, ácido hialurônico e quitosana que oferecem

numerosas vantagens quando usados como carreadores de liberação de fármacos

(BALMAYOR et al., 2009). No entanto, problemas associados à pureza, à necessidade de

modificação química ou mesmo à incompatibilidade com outros constituintes da formulação,

justificam o uso difundido de polímeros sintéticos biodegradáveis como matérias-primas

destes sistemas de liberação (HANS; LOWMAN, 2002).

Os polímeros sintéticos comumente utilizados são poliamidas, ácidos poliamino,

poliésteres, poliortoésteres, poliuretanos e poliacrilamidas (JAIN, 2000). Os poliésteres

alifáticos com ligações hidrolizáveis são polímeros atrativos para controlar o perfil de

liberação em micropartículas e nanopartículas. Os poliésteres como poli-ε-caprolactona

(PCL), poliácido láctico (PLA), poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros poli(DL-

láctico-co-glicólico ácido) (PLGA) são frequentemente usados na obtenção de sistemas de

liberação de fármacos em virtude das suas propriedades de biocompatibilidade e

biodegradação (WANG et al., 2009), além da segurança do uso em humanos, já sendo



polímeros oficialmente regulamentados para uso interno pela agência de vigilância sanitária

americana, a Food and Drug Administration (FDA) (SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000;

SOPPIMATH et al., 2001; LECAROZ et al., 2006; FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al.,

2008; GARBAYO et al., 2008).

Vários estudos utilizam o PLGA na preparação de sistemas particulados de liberação

controlada devido a fatores como a sua longa história de estudos de biocompatibilidade e

biodegradação, versatilidade de suas propriedades de liberação associada à modificação de

sua composição (razão de ácido láctico/glicólico), peso molecular e estrutura química,

podendo obter meia-vida in vivo com ampla faixa de variação (de 3 meses a 1 ano em média),

cinética de biodegradação previsível, baixas imunogenicidade e toxicidade, boas propriedades

mecânicas e ao uso de técnicas de preparação bem documentadas (BARAT et al., 2008;

MUTHU et al., 2009). O PLGA já foi usado na preparação de comprimidos orais,

nanopartículas inaláveis ou intravenosas e micropartículas para formulações subcutâneas de

depósito (GASPARINI et al, 2008). Entretanto, a formação de subprodutos ácidos da

degradação do PLGA pode ocasionar resposta inflamatória e limitar o uso deste polímero em

alguns casos como em aplicações envolvendo a engenharia de tecidos (LINHART et al.,

2001; HO et al., 2008; WANG et al., 2009).

O PCL é outro polímero sintético bastante utilizado na produção de sistemas

particulados devido a sua alta permeabilidade a muitos fármacos e biocompatibilidade em

meio fisológico, além de outras vantagens em relação a outros polímeros (como o PLA),

dentre elas, ser mais estável em condições ambientes, apresentar uma biodegradação mais

lenta e ser menos oneroso podendo ser utilizado em grandes quantidades (OH et al., 2006;

LUCIANI et al., 2008; WANG et al., 2009).



2.3 Micropartículas

A técnica de microencapsulação foi utilizada inicialmente com o objetivo de proteger

vitaminas do processo de oxidação há aproximadamente 70 anos (TAYLOR, 1938). Algumas

décadas depois o PLA e seus copolímeros (PLGA) foram avaliados como polímeros

biocompatíveis e biodegradáveis para sistemas de liberação de fármacos (KULKARNI et al.,

1971; IGNATIUS; CLEAS, 1996; ANDERSON; SHIVE, 1997; WISCHKE;

SCHWENDEMAN, 2008). A microencapsulação moderna de substâncias bioativas continua

a ser uma importante área de estudo e esforços são concentrados no sentido de aperfeiçoar

protocolos de formulação (NG et al., 2009).

A encapsulação de princípios ativos em sistemas de liberação em escala micrométrica,

como em micropartículas de PLGA, pode ser utilizada como uma estratégia para driblar ou

favorecer mecanismos celulares e fisológicos a fim de melhorar a eficiência terapêutica

(SOPPIMATH et al., 2001; FREIBERG; ZHU, 2004). Como por exemplo, micropartículas

porosas de tamanho entre 10-15 µm vêm demonstrando uma deposição pulmonar mais efetiva

e um aumento no tempo de residência no tecido pulmonar devido ao seu maior diâmetro e

diminuição da captura fagotícita alveolar em relação às partículas de menor tamanho (1-5 µm)

(ARNOLD et al., 2007). Hirota e colaboradores (2007) observaram este efeito em

micropartículas de PLGA com tamanho de 10 µm contendo rifampicina. Outro exemplo é a

faixa de tamanho de partícula adequada para o transporte através da barreira gastrointestinal,

fato este importante quando o fármaco encapsulado destina-se a via oral de administração.

Apesar de não estar totalmente elucidado, estudos demonstram que partículas com até 10 µm

não apresentam grandes dificuldades para atravessar o epitélio gastrointestinal (GAUMET et

al., 2007).

Princípios ativos das mais diversas classes terapêuticas vêm sendo incorporados em

micropartículas como antibióticos, anticancerígenos, antituberculostáticos, antifúngicos,



antiinflamatórios, analgésicos, antireumáticos, antimaláricos, antivirais; bem como, enzimas,

hormônios, esteróides, peptídeos, proteínas, anticorpos, vacinas, RNA, dentre outros

(SANTOYO et al., 2002; FREITAS et al., 2005; HIROTA et al., 2007; FERNÁNDEZ-

CARBALLIDO et al., 2008; MURATA et al., 2008; SUN et al., 2008; BARCIA et al., 2009).

Nas últimas décadas, micropartículas poliméricas são extensivamente estudadas como

sistemas de liberação de fármacos e utilizadas em preparações farmacêuticas comerciais

(DEADMAN et al., 2007), devido a inúmeras vantagens, tais como, modulação da cinética de

liberação e da eficiência de encapsulação associadas ao tamanho do dispositivo, versatilidade

das propriedades de tamanho e porosidade, possibilidade de encapsulação de substâncias

hidrofílicas e hidrofóbicas, facilidade de preparação, melhoria da estabilidade e da

biodisponibilidade oral de fármacos e proteínas, aumento da permeabilidade e/ou estabilidade

de substâncias através do trato gastrointestinal e diversidade de vias de administração (VASIR

et al., 2003; WANG et al., 2009).

Ito e colaboradores (2008) obtiveram microesferas de PLGA contendo dextrana (usada

como modelo de fármaco hidrofílico) de diferentes tamanhos (variando de 2,4-10,6 µm) e

eficiências de encapsulação (2,4–63,8%). Enquanto que, Balmayor e colaboradores (2009)

prepararam microesferas de PCL contendo o fármaco hidrofóbico dexametasona para sua

aplicação em sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Nesse contexto,

Klose e colaboradores (2009) prepararam microesferas de PLGA com fenofibrato para a

liberação controlada local em sistema nervoso central e obteve redução de problemas

associados à isquemia em ratos Wistar.

Micropartículas de PLGA contendo nanopartículas poliméricas com características de

porosidade e de diâmetro aerodiâmico adequadas para a liberação controlada via pulmonar do

antibiótico ciprofloxacino foram desenvolvidas por Arnold e colaboradores (2007). Outro

estudo desenvolvido por Hirota e colaboradores (2007) demonstrou o aumento da eficiência



da atividade antituberculostática da rifampicina em 20 vezes quando este fármaco foi

encapsulado em microesferas de PLGA em relação a sua forma em solução em estudo

desenvolvido

2.3.1 Métodos de preparação de micropartículas

As características dos sistemas de liberação dependem, dentre outros fatores, do

método de preparação (DILLEN et al., 2004). Investigações experimentais com diferentes

métodos de preparação, condições de processo e materiais são realizadas para identificar a

influência de diferentes parâmetros na encapsulação do fármaco, morfologia das

micropartículas, e consequentemente na cinética de liberação (PETITTI et al., 2008).

Vários fatores são levados em consideração no momento da escolha do método de

preparação: propriedades físico-químicas do fármaco (peso molecular, solubilidade, pKa,

coeficiente de partição octanol/água – log P, estabilidade) e do polímero (peso molecular,

composição química, hidrofobicidade); farmacocinética do fármaco; o tipo de micropartícula

desejada (microesferas ou microcápsula); rendimento do processo; eficiência de

encapsulação, dentre outros (FREITAS et al., 2005; WANG et al., 2009).

A propriedade do fármaco mais importante a ser avaliada para o estudo inicial da

microencapsulação é a sua solubilidade em água, em solventes orgânicos e em cosolventes.

Fatores que afetam a solubilidade aquosa tais como o pH e a presença de aditivos também

devem ser considerados. Estima-se que mais de 40% das moléculas microencapsuladas são

hidrofóbicas. O termo “fármacos hidrofóbicos” descreve um grupo heterogêneo de moléculas

que exibem baixa solubilidade aquosa, mas que são comumente solúveis em vários solventes

orgânicos. Os termos ligeiramente solúvel (1–10 mg/mL), fracamente solúvel (0,1–1 mg/mL),

e praticamente insolúvel (<0,1 mg/mL) são empregados para classificar estas substâncias

(WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).



Os métodos usados na preparação de micropartículas geralmente envolvem princípios

de evaporação e/ou difusão do solvente, coacervação, spray-drying, uso de fluidos sob

condições supercríticas sem resíduos de solventes tóxicos, etc (ITO et al., 2009). Os métodos

de emulsificação com evaporação do solvente costumam ser bastante utilizados e envolvem a

formação de emulsões com fases aquosas e oleosas orgânicas com a retirada do solvente

orgânico ao final do processo. O polímero e o fármaco são solubilizados nas fases apropriadas

e estas são emulsificadas em uma fase contínua (aquosa ou oleosa) contendo um emulsificante

adequado com um baixo poder de solubilização do fármaco. No caso de fases contínuas

aquosas, o álcool polivinílico (PVA) é o emulsificante mais usado. Ao final do processo, os

solventes voláteis podem ser removidos por evaporação ou por extração da fase externa

(WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).

As emulsões formadas nestes métodos podem ser do tipo simples como de óleo-em-

água (o/a) (Fig. 3), óleo-em-óleo (o/o) ou múltiplas como água-em-óleo-em-água (a/o/a). O

método o/o pode ser eficaz para moléculas que apresentam uma solubilidade aquosa razoável

(como a hidrocortisona com 280 µg/mL), minimizando as perdas para a fase contínua aquosa,

que pode ser evidenciada com o uso da técnica o/a. Modificações destes métodos como o de

sólido-em-óleo-água (s/o/a) podem ser úteis quando o fármaco não pode ser solubilizado em

um solvente ou mistura de solventes, ou ainda, quando a perda do fármaco para a fase

contínua não pode ser evitada com o uso de cosolventes. Como exemplo, podemos citar o

levonorgestrel (WANG et al., 2005) e o β-estradiol (BIRNBAUM et al., 2000; MOGI et al.,

2000) que já foram encapsulados usando a técnica s/o/a. Para outras moléculas hidrofóbicas

outras técnicas como s/o/o, o/o/o e s/a/o/a foram adequadas (HERRERO-VANELL et al.,

2000; JANORIA; MITRA, 2007; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).

As técnicas com evaporação do solvente apresentam várias vantagens, tais como:

controle da cinética de liberação e do tamanho de partícula (produzindo amostras



monodispersas), possibilidade do uso de polímeros insolúveis em água, excelentes eficiências

de encapsulação para fármacos hidrofóbicos (como exemplo: cisplatina, lidocaína, naltrexone

e progesterona) e hidrofílicos (insulina, proteínas, peptídeos e vacinas), e a possibilidade de

transposição para a escala industrial (técnica já utilizada em indústrias farmacêuticas) (LI et

al., 2008).

Micropartículas de SPCL, uma combinação polimérica “blend” de PCL com amido,

contendo dexametasona, foram preparadas usando técnica de emulsão com evaporação do

solvente, formando partículas de forma esférica com diferentes tamanhos (variando de

5 a 900 µm), morfologias de superfície e eficiências de encapsulação acima de 93%

(BALMAYOR et al., 2009). Zhang e colaboradores (2008) mostraram que o tamanho de

microesferas de PLGA contendo bupivacaína foi controlado pela velocidade de agitação e

concentração do polímero usando o método de emulsão o/a com evaporação do solvente.

Enquanto que Sun e colaboradores (2008) usando a mesma técnica obteve microesferas de

PLGA contendo contraceptivos hormonais com controle da cinética de liberação durante

1 mês demonstrada em ensaios in vitro e in vivo.

Figura 3 - Método de preparação de micropartículas por emulsificação (o/a) e evaporação do

solvente: (1) solubilização dos componentes na fase oleosa orgânica, (2) mistura da fase

orgânica com a fase contínua contendo emulsificante sob agitação (3) evaporação do solvente

(4) separação das micropartículas (adaptado de LI et al., 2008).



Outros métodos empregados na preparação de micropartículas de PLA e PLGA

incluem a formação in situ, saltint-out (separação de fases), técnicas de fusão e métodos

usando fluidos supercríticos (normalmente o CO2) (WHITAKER et al., 2005).

Comercialmente encontram-se disponíveis fármacos encapsulados em micropartículas

poliméricas biodegradáveis, com o uso destas técnicas, tais como, Vivitrol® (naltrexone via

o/a extração do solvente), Consta® (risperidona via o/a extração do solvente) e Arestin®

(cloridrato de minociclina via s/o coacervação) (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).

2.3.2 Métodos de caracterização de micropartículas

Caracterizações físico-químicas e ensaios de cinética de liberação in vitro das

micropartículas poliméricas contendo os princípios ativos são fatores imprescindíveis no

estudo de otimização de formulações farmacêuticas. Os parâmetros físico-químicos utilizados

para a caracterização de micropartículas são aspectos microscópicos, tamanho médio e

distribuição de tamanho de partícula, eficiência de encapsulação, carga de superfície,

porosidade e interações entre os componentes da formulação (MAGENHEIM; BENITA,

1991; SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000; BALMAYOR et al., 2009).

A análise microscópica de micropartículas pode ser realizada através de técnicas de

microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de

transmissão (MET) (SANTOS et al., 2006; SCHAFFAZICK et al., 2006). A aplicação destas

técnicas permite avaliar a forma geométrica, características de superfície (lisa ou porosa) e do

interior do dispositivo, distribuição de tamanho de partícula, a presença de agregados e

cristais do fármaco, distribuição do fármaco na matriz polimérica, além de diferenciar o tipo

de micropartícula obtida (microesfera ou microcápsula) (MOSQUEIRA et al., 2000; WANG

et al., 2009). Micropartículas de PLGA contendo ovoalbumina foram caracterizadas quanto as

suas propriedades de superfície e de distribuição de tamanho de partícula por MEV, e quanto



as suas propriedades internas de distribuição de proteína e a ocorrência de poros por MET

(ZHAO; RODGERS et al., 2006). A morfologia interna e externa de micropartículas porosas

de PLGA contendo oligonucleotídeo foi caracterizada usando MEV (AHMED; BODMEIER,

2009).

O tamanho médio e a distribuição de tamanho de partícula podem ser determinados

por diferentes técnicas, tais como, microscopia, métodos cromatográficos, princípio Coulter,

difração a laser, espalhamento de luz dinâmica (espectroscopia de correlação de fóton) e

tamisação (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008). A distribuição de tamanho de partícula é

um importante parâmetro que deve ser avaliado durante o desenvolvimento de formulações

farmacêuticas, visto que avalia o grau de uniformidade de uma amostra. Nesse contexto, o

índice span é um parâmetro que vêm sendo bastante utilizado na literatura para mensurar a

homogeneidade de micropartículas (RIBEIRO-COSTA et al., 2008; MUTHU et al., 2009;

ITO et al., 2009). O cálculo do span é feito com os valores de tamanho de partícula (neste

caso representado pelo diâmetro volumétrico médio, dv), correspondentes aos percentis de

90%, 10% e 50% da distribuição de tamanho de partícula da seguinte maneira:

span = (dv (90%) – dv (10%)) / dv (50%) (RIBEIRO-COSTA et al., 2008). Valores pequenos de span

sugerem amostras mais homogêneas, ou seja, apresentam gráficos de distribuição de tamanho

de partícula com aspecto unimodal (monomodal). Microesferas poliméricas com valores span

de 1,1 a 3,3 obtidas por Ribeiro-Costa e colaboradores (2008) apresentaram distribuição de

tamanho de partícula monomodal. Nesse contexto, Ito e colaboradores (2009) também

obtiveram microesferas de PLGA contendo dextrana (BLD) (usada como um fármaco

modelo) monodispersas com valores de span de 0,37 a 1,90.

A eficiência de encapsulação em micropartículas, a razão entre a quantidade de

fármaco encapsulado e a quantidade teórica inicialmente adicionada, pode ser determinada

pela dissolução do sistema polimérico em um solvente apropriado, no qual o fármaco é



quantificado por técnicas espectrofotométricas (UV-Vis) ou cromatográficas (CLAE)

(RIBEIRO-COSTA et al., 2004; MORAIS et al., 2008; COCERO et al., 2009). Solventes,

tais como diclorometano, acetonitrila, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido ou

1,4-dioxano são comumente utilizados, dissolvendo a matriz polimérica e o fármaco

hidrofóbico (SAH; LEE, 2006), ou solventes como etanol e metanol que podem extrair

seletivamente o fármaco independente da dissolução do polímero (WISCHKE;

SCHWENDEMAN, 2008).

O potencial zeta é um parâmetro que está relacionado à carga de superfície de

partículas em suspensão. O seu valor costuma ser bastante utilizado em estudos de

estabilidade de produtos e processos de adsorção de superfície. O potencial zeta corresponde

ao potencial elétrico entre o ambiente aquoso e uma região difusa de carga

predominantemente oposta à superfície da partícula. Este parâmetro é influenciado por

características das partículas em suspensão (como composição química e tamanho de

partícula) e do meio dispersante (como pH, força iônica e os tipos de íons)

(XU; CZERNUSZKA, 2008). Sua determinação é realizada através de técnicas de

eletroforese. O potencial zeta pode ser utilizado para avaliar se o fármaco encontra-se no

interior da matriz ou adsorvido à superfície do sistema polimérico (MAGENHEIM; BENITA,

1991; CALVO et al., 1997; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).

Técnicas como difração de raios-X (XRD), calorimetria exploratória diferencial

(DSC), análise termogravimétrica (TGA), ressonância magnética nuclear (RMN),

espectroscopia na região do infravermelho (IR) e cromatografia de permeação em gel (GPC)

podem evidenciar a presença e a distribuição do fármaco e aditivos na matriz polimérica, bem

como a interação entre os componentes da formulação (FAISANT et al., 2002; COCERO et

al., 2009; WANG et al., 2009). Nesse contexto, Fernández-Carballido e colaboradores (2008)

confirmaram a presença de PEG em microesferas de PLGA pela sua caracterização através



das técnicas de DSC, GPC, IR e RMN. Mundargi e colaboradores (2007) avaliaram a

estabilidade e o estado físico da doxiciclina em blend de PLGA com PCL através de DSC e

IR. Enquanto que Silva-Júnior e colaboradores (2009) usaram as técnicas de DSC, IR e

difração de raios X para estudar a estabilidade físico-química, o estado físico do fármaco na

matriz polimérica e as interações fármaco-polímero em micropartículas de PLGA contendo

triamcinolona.

A porosidade de micropartículas pode ser avaliada através de diferentes parâmetros,

tais como, densidade, tamanho de partícula, área específica, tamanho e volume de poros.

Várias técnicas foram desenvolvidas para a determinação quantitativa desses parâmetros as

quais normalmente se baseiam na determinação da quantidade adsorvida (e/ou dessorvida) de

um adsorvato (normalmente um gás) na superfície de um adsorvente em um sistema fechado à

temperatura constante. A quantidade de gás adsorvida pode ser calculada pela diminuição da

pressão por meio da aplicação das leis dos gases ou pela massa de gás adsorvida pelo sólido

(TEIXEIRA et al., 2001). A equação de Brunauer-Emmette-Teller (BET) relaciona valores

obtidos a partir das isotermas de adsorção com a área específica de um sólido (BRUNAUER

et al., 1938). A distribuição de tamanhos ou de volumes de poro em função do diâmetro de

poro pode ser calculada a partir da pressão relativa na qual os poros são preenchidos com um

líquido proveniente da condensação de um gás. O processo inverso, ou seja, a evaporação do

líquido contido no poro, também pode ser utilizado. O método de Barret, Joyner e Halenda

(BJH) é utilizado até hoje no cálculo da distribuição dos tamanhos de poro, o qual utiliza a

equação de Kelvin e assume o esvaziamento progressivo dos poros cheios de líquido com o

decréscimo da pressão (BARRET et al, 1951). Microesferas porosas com superfície rugosa

normalmente apresentem elevada área de superfície específica e velocidade de liberação

relativamente mais rápida, conforme resultados obtidos com microesferas de PLGA contrendo

o peptídeo acetato de leuprolide (RAVIVARAPU et al., 2000). A porosidade de



nanopartículas de PLA-PEG contendo propafenona foi avaliada usando os parâmetros de área

de superfície específica e distribuição de tamanho de poros (SANT et al., 2005).

Nos ensaios de cinética de liberação in vitro, diferentes métodos são empregados para

a avaliação do perfil de liberação do fármaco simulando condições fisiológicas (tampão

fosfato pH 7,4 a 37ºC). O método de dissolução costuma ser o utilizado para a cinética de

liberação em micropartículas (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008; WANG et al., 2009). O

dispositivo é submetido a condições controladas de agitação, pH e temperatura, e alíquotas do

meio são retiradas em intervalos de tempos pré-estabelecidos (com reposição do meio), sendo

filtradas ou centrifugadas para a quantificação do fármaco liberado no sobrenadante em

função do tempo. Diferentemente das formas farmacêuticas convencionais, os sistemas de

liberação controlada não apresentam métodos oficiais estabelecidos nas farmacopéias. No

entanto, fundamentos de estudos de liberação devem ser respeitados, como a manutenção das

condições sink (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).

2.4 Cinética de liberação

O perfil de liberação de micropartículas poliméricas pode ser modificado por

propriedades físico-químicas dos fármacos e polímeros utilizados (peso molecular,

cristalinidade, composição do copolímero, hidrofobicidade) (BRANNON-PEPPAS, 1995;

HANS; LOWMAN, 2002; ZOLNIK; BURGESS, 2007; GARBAYO et al., 2008), bem como

dos sistemas desenvolvidos (geometria, tamanho, porosidade, área superficial, eficiência de

encapsulação, interação fármaco-polímero, distribuição do fármaco na matriz polimérica)

(DEADMAN et al., 2007; POLETTO et al., 2007).

O controle da cinética de liberação de fármacos encapsulados em sistemas poliméricos

envolve diferentes fatores como solubilidade e difusão do fármaco no dispositivo, erosão do

polímero, dissolução do fármaco no meio circundante ou ainda uma combinação destes



processos (ZOLNIK; BURGESS, 2007; SINGH; LILLARD, 2009). A liberação do fármaco

pode ser predominantemente controlada por um desses mecanismos. Quando isto acontece o

principal processo é aquele responsável pela etapa mais rápida da cinética de liberação,

podendo variar de dispositivo para dispositivo (PETITTI et al., 2008). Por exemplo, no caso

das microesferas, nas quais o fármaco está distribuído na matriz polimérica, a liberação do

fármaco ocorre por difusão e/ou erosão. Se a difusão é mais rápida quando comparada à

erosão da matriz, o mecanismo de liberação é controlado principalmente pelo processo de

difusão (SINGH; LILLARD, 2009). Microesferas formadas por PLGA de baixo peso

molecular (em torno de 5 kDa) apresentam uma liberação frequentemente controlada apenas

pelo mecanismo de difusão, enquanto que quando o PLGA é de elevado peso molecular (em

torno de 25 kDa) a liberação é controlada pela combinação da difusão do fármaco e erosão do

polímero (ZOLNIK; BURGESS, 2007).

O processo de erosão do PLGA é iniciado com a entrada de água no dispositivo,

causando a hidrólise das ligações éster de sua estrutura química, produzindo oligômeros

ácidos (SIEPMANN et al., 2005). A concentração destes oligômeros no bulk do dispositivo

criam um microambiente acidificado, cujo pH pode variar de 1,5 a 6,4, fato este que favorece

o fenômeno de autocatálise do PLGA. A difusão dos subprodutos de degradação ácidos no

fluido bulk e das bases presentes nas proximidades do sistema de liberação ocorrem

simultaneamente com a difusão do fármaco e a degradação do polímero. Assim, o

microambiente do transporte do fármaco pode mudar significativamente durante a liberação

do fármaco. A autocatálise exerce uma importante função na liberação do fármaco, uma vez

que a degradação da matriz resulta na formação de canais através dos quais o fármaco é

liberado.

Neste contexto, a natureza do fármaco encapsulado (hidrofílico, hidrofóbico, ácido ou

básico) pode afetar a cinética de degradação do sistema e de liberação do princípio ativo. Para



fármacos solúveis em água, a penetração da água na matrix polimérica pode ser facilitada,

acelerando a degradação da matriz e criando uma estrutura relativamente mais porosa através

da qual o fármaco é mais facilmente difundido. Enquanto que para fármacos hidrofóbicos,

esse processo de difusão da água pode ser retardado, diminuindo o processo de degradação do

polímero (KLOSE et al., 2008). No caso de fármacos ácidos e básicos, a degradação do

PLGA pode ser acelerada uma vez que sua hidrólise é catalizada por ácidos e bases.

O perfil de liberação típico de fármacos hidrofóbicos consiste de uma etapa burst

inicial seguida de uma fase lag e de uma segunda etapa burst (BERKLAND et al., 2002,

2004; WANG et al., 2002; ZOLNIK et al., 2006). A primeira etapa burst resulta da liberação

rápida do fármaco associado à superfície. Por outro lado, a fase lag, do tempo requerido para

que a degradação do polímero facilite a difusão do fármaco. Enquanto que para fármacos

hidrofílicos, a fase burst inicial não é frequentemente observada uma vez que o fármaco

associado à superfície é usualmente removido durante o processo, dependendo da

hidrofilicidade e do peso molecular do fármaco (VOISINE et al., 2008).

Uma estratégia bastante utilizada para modificar o perfil de liberação de diferentes

fármacos encapsulados em micropartículas é a combinação de polímeros com diferentes

características formando blends. Micropartículas de PCL com poli (hidroxibutirato-co-

hidroxivalerato) (PHBHV) foram preparadas para avaliar a influência no perfil de liberação

do diclofenaco e indometacina, e determinar o mecanismo de liberação dos fármacos

(POLETTO et al., 2007). Micropartículas de PCL foram misturadas com uma solução de

PLGA contendo tetraglicol (10%) para prevenir a migração das partículas e reter o volume da

preparação no local de aplicação (OH et al., 2006). Microesferas de PLGA foram combinadas

com gelatina e poli(propileno fumarato) (PPF) para melhorar as propriedades mecânicas e

prolongar a liberação da proteína morfogenética óssea BMP-2 (KEMPEN et al., 2008).



Outra forma de modificar a cinética de liberação é pela adição de excipientes

hidrofóbicos ou hidrofílicos. Dentre os excipientes utilizados em micropartículas estão o

polietilenoglicol (PEG), usado normalmente para controlar a liberação inicial, todavia não

está elucidado se o mesmo permanece dentro da matriz polimérica durante muito tempo. O

mecanismo do PEG no controle da liberação do fármaco em micropartículas não está

totalmente claro, uma vez que pode diminuir ou aumentar a taxa de liberação no caso

microesferas de PLGA (FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al., 2008). Ciclodextrinas também

vêm sendo usadas como excipientes farmacêuticos em sistemas como emulsões,

microcápsulas, microesferas, nanoesferas, nanocápsulas, lipossomas e niossomas para

modificar a sua cinética de liberação (TRICHARD et al., 2006; LOFTSSON; DUCHÊNE

et al., 2007).

2.5 Análise Fatorial

As características físico-químicas e de liberação dos sistemas poliméricos dependem,

por exemplo, dos parâmetros envolvidos no seu método de preparação. Dessa forma, para

controlar estas características, é essencial estabelecer o efeito de suas variáveis de formulação

e de cada etapa do seu processamento (BUDHIAN et al., 2007). Nesse contexto, a análise

fatorial representa uma ferramenta estatística eficiente para se obter um modelo matemático

multifatorial adequado para o estudo dos efeitos de parâmetros de formulação. Dessa forma, a

análise fatorial é bastante útil no estudo de otimização de sistemas de liberação de fármacos

(DILLEN et al., 2004).

Diferentemente dos experimentos tradicionais, em que a influência de cada parâmetro

é avaliada de maneira isolada, na análise fatorial é possível alterar diferentes variáveis

simultaneamente, e ainda quantificar os efeitos causados pelas variáveis independentes e a

interação entre elas em variáveis respostas (como na eficiência de encapsulação, no tamanho



de partícula, no potencial zeta, dentre outros). Além disso, a análise fatorial permite obter uma

maior quantidade de informações com um menor número de experimentos (GOHEL; AMIN,

1998; DILLEN et al. 2004; DAVIES et al., 2009). Neste estudo, o número de variáveis

independentes e de níveis (padronizados como +1 e -1) da análise fatorial define o número de

experimentos a serem realizados. Por exemplo, uma análise fatorial 24 significa que quatro

diferentes fatores (como concentração de polímero, fármaco, tensoativo da fase aquosa e

tensoativo da fase oleosa) serão variados em dois níveis (como na concentração de polímero,

20 e 50%), e a sua influência será avaliada em um ou mais parâmetros resposta (DILLEN et

al. 2004; BOZQUIR; SAKA, 2005).

Davies e colaboradores (2009) usaram análise fatorial para avaliar a influência da

concentração de reagentes na preparação de nanopartículas de sílica. Enquanto que

Derakhshandeh e colaboradores (2007) avaliaram como quatro variáveis modificam a

encapsulação da nitrocamptotecina em nanopartículas de PLGA usando a mesma ferramenta

estatística. E, Lee e colaboradores (2009) otimizaram as condições de preparação de

micropartículas de pectinato de cálcio com lipossomas e hidroxipropilmetilcelulose contendo

catequina usando análise fatorial.

2.6 Ciclodextrinas

A fermentação enzimática de alguns carboidratos, como celulose, amido e sacarose,

produz uma mistura de monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos, resultando em

dextrinas lineares e cíclicas, estas útimas também sendo conhecidas como ciclodextrinas

(LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos com

uma estrutura rígida formados por unidades de glicopiranose unidas por ligações α (1→4).

Apresentam-se na forma de um cone truncado, onde os grupos OH secundários ligados aos

carbonos C-2 e C-3 ocupam a base de maior diâmetro do tronco, as hidroxilas primárias



ligadas ao carbono C-6 localizam-se na base menor do tronco (Fig. 4) (CHALLA et al.,

2005).

A disposição espacial dos grupamentos químicos nas ciclodextrinas favorece a

formação de uma cavidade central hidrofóbica e uma superfície externa hidrofílica,

permitindo desta forma, o processo de complexação molecular. Geralmente substâncias

químicas de baixa polaridade podem alojar-se no interior da cavidade das CDs formando

complexos de inclusão dinâmicos em solução (BREWSTER; LOFTSSON, 2007).

Figura 4 - Estrutura química de uma ciclodextrina (A) e desenho esquemático ilustrando a

cavidade hidrofóbica, a posição das hidroxilas primárias e secundárias e suas dimensões:

altura (H), diâmetro interno (DI) e diâmetro externo (DE) (adaptado de BREWSTER;

LOFTSSON, 2007).

As ciclodextrinas podem ser classificadas de acordo com o número de resíduos de

glicopiranose. As ciclodextrinas naturais αCDs, βCDs, e γCDs, respectivamente (Fig. 5)

contêm seis, sete e oito unidades glicosídicas (BREWSTER; LOFTSSON, 2007) e

apresentem diferentes propriedades de tamanho de cavidade, solubilidade, reatividade,



capacidade de complexação e efeito na estabilidade química das moléculas hóspedes (Tab. 2)

(CONNORS, 1997).

Figura 5 - Estruturas moleculares das ciclodextrinas naturais (adaptado de SONG et al.,

2009).

Dentre as ciclodextrinas naturais, a βCD é a mais utilizada por ser menos onerosa e

afinidade com muitas moléculas hidrofóbicas. No entanto, a sua menor solubilidade em água,

comparada às demais ciclodextrinas naturais, limita o seu uso (Tab. 2). Esse fato se deve a

ligação relativamente forte de suas moléculas em estado sólido (alta energia do cristal)

associada à diminuição da habilidade de formação de ligações de hidrogênio com a água (por

formar ligações de hidrogênio intramoleculares) (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Complexo

de inclusão de DCTN com β-ciclodextrina já foi desenvolvido e reduziu a sua citotoxicidade

em hepatócitos de ratos e fibrobastos V79 (CORRÊA et al., 2005).

A ciclodextrina glicosil transferase (CGTase), um exemplo de amilase, é capaz de

abrir a cadeia de um polissacarídeo e ligar as extremidades de cada fragmento formando

ciclodextrinas. O tratamento do amido com amilase do Bacillus macerans (com CGTase)

produz uma mistura de α-ciclodextrina (60%), β-ciclodextrina (20%) and γ-ciclodextrina

(20%) juntamente com pequenas quantidades de ciclodextrinas com mais de oito resíduos de

glicose. Inovações biotecnológicas com diferentes tipos de enzimas CGTase tornaram

possível a produção mais específica e com maior grau de pureza das α-, β- e



γ-ciclodextrinas, permitindo o uso destas como excipientes farmacêuticos (LOFTSSON;

DUCHÊNE, 2007).

Tabela 2 - Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas (CONNORS, 1997).

Ciclodextrina Propriedade

α β γ

n˚ de unidades de glicose 6 7 8

Fórmula empírica C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40

Peso molecular 972,85 1134,99 1297,14

Altura da cavidade (Ǻ) 8 8 8

Diâmetro da cavidade (Ǻ-aprox) ~ 5,2 ~ 6,6 ~ 8,4

Solubilidade (água, 25˚C) mol L-1 0,1211 0,0163 0,168

Vários derivados semi-sintéticos de ciclodextrinas têm sido produzidos objetivando a

otimização da solubilidade e estabilidade de ciclodextrinas ancestrais. Evidenciou-se que a

substituição de qualquer um dos grupos hidroxilas por grupamentos hidrofóbicos resulta em

um aumento significativo da solubilidade aquosa. Outros tipos de modificações estruturias

como aminação, esterificação das hidroxilas primárias e secundárias podem ainda ser

realizadas (DAVIS; BREWSTER, 2004; MARTIN DEL VALLE, 2004; CALABRÒ et al.,

2004; LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).

A 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) é um derivado obtido pelo tratamento de

uma solução de βCD com propilenoóxido, resultando em uma mistura de isômeros devido à

substituição randômica dos grupamentos hidroxílicos. Estatisticamente há aproximadamente

130.000 possibilidades de formação de derivados de HPβCD, dentre eles, inúmeros isômeros

geométricos e ópticos podem ser produzidos quando os grupamentos hidroxílicos são



inseridos em centros ópticos das moléculas. Derivados menos polares (metoxilados, aminados

ou esterificados), completamente substituídos apresentam uma menor solubilidade aquosa,

pela drástica redução de possibilidade de formação de isomerização. A habilidade dos

derivados de ciclodextrina em formar complexos solúveis em água também é dependente do

grau de substituição da ciclodextrina que pode ser otimizado objetivando-se preservar as

propriedades de solubilização. O grau de substituição da HPβCD de uso farmacêutico é de

aproximadamente 0,65 (que significa que há em média 0,65 de grupamentos hidroxipropil por

unidade de glicose) (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).

Comparativamente, comprovou-se que a HPβCD apresenta maior solubilidade aquosa,

maior potencial de complexação e menores restrições toxicológicas e biológicas em relação à

βCD (GOULD; SCOTT, 2005; BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Especificamente, a

HPβCD é bem tolerada no organismo humano, sendo metabolizada por bactérias do cólon,

onde uma parte excretada na forma intacta (aproximadamente 60%) e outra parte como

metabólitos (aproximadamente 40%) após a administração oral (DAVIS; BREWSTER,

2004). Estudos farmacocinéticos em ratos demonstraram que HPβCD apresenta t1/2 de 20 min

(i.v.), DL50 de 10 g/Kg (i.v.) e DL50 maior que 2 g/Kg (v.o.), e ainda, as doses máximas em

produtos do mercado são de 16.000 mg/dia (i.v.) e de 8.000 mg/dia (v.o.) (BREWSTER;

LOFTSSON, 2007).

2.6.1 Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas

As ciclodextrinas são alvo de interesse farmacêutico constante pela habilidade de

interagirem com fármacos hidrofóbicos melhorando a sua solubilidade aquosa. Os

mecanismos envolvidos podem estar relacionados à formação de complexos de inclusão, de

complexos de não-inclusão, de agregados e de soluções de fármacos supersaturadas estáveis

(BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Podem ser formados complexos de inclusão múltiplos e



de não-inclusão de diferentes razões molares fármaco:ciclodextrina (1:1, 1:2, 1:3, 2:1)

(LOFTSSON et al., 2005; BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Diferentes métodos são usados

na literatura para a obtenção de complexos de inclusão tais como, pasta, co-evaporação, co-

precipitação, spray-dry e freeze-dry (ZINGONE; RUBESSA, 2005; DEVARAKONDA et al.,

2005).

Na formação de um complexo de inclusão 1:1 (mol/mol) (Fig. 6), é necessário que a

molécula hóspede (G) ou parte dela, associe-se em um equilíbrio dinâmico com a cavidade da

ciclodextrina e estabeleça ligações de caráter não-covalente, como forças de van der Waals,

interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. Devido à natureza destas ligações, o

complexo de inclusão fármaco:ciclodextrina (G:CD) está continuamente sendo formado e

dissociado (MARTIN DEL VALLE, 2004; LOFTSSON et al., 2005). A habilidade de uma

ciclodextrina em formar um complexo de inclusão com uma molécula hóspede depende tanto

de fatores estéricos (relacionados ao tamanho molecular), como termodinâmicos

(relacionados a interações ciclodextrina-molécula hóspede-solvente) (MARTIN DEL VALLE

et al., 2004).

Muitas propriedades do fármaco (físico-químicas, biológicas e toxicológicas) podem

ser melhoradas com a formação de complexos com ciclodextrinas, tais como, solubilidade,

taxa de dissolução, biodisponibilidade oral de fármacos de Classe II e IV (conforme o Sistema

de Classificação Biofarmacêutico BCS), eficiência de encapsulação e perfil de liberação em

sistemas de liberação controlada, e problemas associados à toxicidade e à irritação local

(BREWSTER; LOFTSSON, 2007).

Quando as CDs são utilizadas como excipientes farmacêuticos visando melhorar as

propriedades dos fármacos associados, é importante considerar a quantidade de ciclodextrina

necessária para proposta finalidade. Nesse sentido, são desejáveis pequenas quantidades de

ciclodextrina por questões de custo e de toxicologia, o que é perfeitamente viável quando a



eficiência de complexação é satisfatória. Entretanto, existem estratégias para aumentar a

eficiência de complexação, com o aumento da solubilidade da molécula hospedeira no meio

aquoso de complexação, através de processos de ionização, formação de sal ou de complexos

metálicos ou pela adição de co-solventes orgânicos como o etanol (DUCHÊNE et al., 1999;

BREWSTER; LOFTSSON, 2007).

Figura 6 - Esquema da associação entre ciclodextrina hidratada (CD) e molécula hóspede

(G): (acima) complexos de inclusão 1:1 e (abaixo) complexos de inclusão 2:1

ciclodextrina:fármaco (SONG et al., 2009).

Apesar das vantagens atribuídas a formação dos complexos de inclusão de fármaco

com ciclodextrinas, muitas vezes, apenas o mecanismo de complexação molecular não é

suficiente para promover a liberação controlada do agente terapêutico. Com isso, a

incorporação de complexos de inclusão em sistemas de liberação controlada poderia viabilizar

a obtenção do perfil de liberação desejado (DE ROSA et al., 2005; FERNANDES et al.,

2007).



A incorporação de complexos de inclusão fármaco:ciclodextrina em sistemas

poliméricos pode aumentar a eficiência de encapsulação e a biodisponibilidade oral dos

princípios ativos associados, bem como, modular a cinética de liberação destes dispositivos

terapêuticos (DUCHÊNE et al., 1999). Isso é possível devido a natureza do complexo de

inclusão formado, produzindo de novas espécies com diferentes solubilidades e difusividades

nas matrizes poliméricas (DE ROSA et al., 2005), capazes de melhorar a hidratação da

matriz, promover sua erosão (SONG et al., 1997) e modificar o perfil de liberação do sistema

polimérico (BIBBY et al., 2000; TRAPANI et al., 2003).

2.7 trans-Desidrocrotonina (t-DCTN)

A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) (Fig. 7) é o diterpeno clerodânico majoritário

isolado das cascas do caule (de árvores com idade acima de 3 anos) do Croton cajucara Benth

(Euphorbiaceae). Os demais metabólitos secundários, na sua grande maioria diterpenos

clerodanos, também foram isolados das cascas do caule desta espécie. Em função dos teores

de isolamento muito limitados, o único que teve sua ação biológica extensivamente

investigada foi a trans-crotonina (t-CTN) que comparativamente se mostrou menos eficaz do

que a t-DCTN (MACIEL et al., 2000; 2002; 2006; COSTA et al., 2005).

Esta espécie vegetal é popularmente conhecida como sacaca e representa um recurso

medicinal de grande importância na região amazônica brasileira. No estado do Pará, as cascas

do seu caule são utilizadas na forma de chá ou cápsulas no combate a diarréia, malária, febre,

problemas estomacais, inflamações do fígado, rins e vesícula. Ainda pode ser utilizda no

controle do diabetes e de índices elevados de colesterol. As folhas são utilizadas para auxílio

da digestão (MACIEL et al., 2002).



O

O

O H

H

O

Figura 7 - Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN).

A ação medicinal do Croton cajucara está amplamente correlacionada ao clerodano

t-DCTN (MACIEL et al., 2000; 2002; 2006; 2007; COSTA et al., 2005), o qual apresenta as

seguintes atividades farmacológicas: hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997; SILVA et al.,

2001a), hipolipidêmica (FARIAS et al., 1996; SILVA et al., 2001a; 2001b; 2001c;

BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; 2001), antiulcerogênica

(HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ et al., 2004),

antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antitumoral (GRYNBERG

et al., 1999; MELO et al., 2004), antiestrogênica (LUNA-COSTA et al., 1999) e

cardiovascular (SILVA et al., 2005). A partir de modificações químicas da molécula de

t-DCTN estão sendo desenvolvidos estudos que objetivam a avaliação da relação

estrutura/atividade biológica (MACIEL et al., 2007; 2006; 2000; MELO et al., 2004; 2003;

2001; ANAZETTI et al., 2004; 2003).

Dentre as atividades farmacológicas da t-DCTN, a ação hipoglicemiante merece

destaque e já foi avaliada com este biotivo encapsulado em sistemas de liberação controlada

de fármacos. A atividade hipoglicemiante da t-DCTN foi avaliada em ratos Wistar machos

portadores de diabetes induzido por aloxano (150 mg/Kg, s.c.) e por estreptozotocina



(60 mg/Kg, i.p.). No método de indução por aloxano, o melhor resultado de hipoglicemia foi

produzido com a dose de 50 mg/Kg por via oral com uma diminuição de 53% depois de 5 h,

com eficácia comparável a da glibenclamida (2 mg/Kg, v.o.) usada como fármaco padrão.

Enquanto que no método de indução por estreptozotocina foi observada uma redução de

hiperglicemia de 61% depois de 72 h. O mecanismo de ação hipoglicemiante da t-DCTN não

está totalmente elucidado (SILVA et al., 2001). Foi observada melhoria na atividade

hipoglicemiante da t-DCTN na redução da glicemia de animais normoglicêmicos quando este

fármaco foi incorporado em microesferas poliméricas de PLGA (MORAIS et al., 2008).

Aspectos referentes à citotoxicidade e toxicidade da t-DCTN também devem ser

considerados no âmbito do desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos. A

atividade citotóxica deste bioativo foi avaliada através de parâmetros como variações da

morfologia celular, medidas da viabilidade celular e da inibição do metabolismo celular,

através de valores de CI50 (concentração do fármaco que inibe 50% do crescimento celular).

Nesse contexto, diversas linhagens de células foram estudadas: células fibroblásticas

pulmonares de hamsters chineses (V79) (SOUZA-BRITO et al., 1998; RODRÍGUEZ et al.,

1999; MELO et al., 2001; FREIRE et al., 2003), hepatócitos de ratos (RODRÍGUEZ et al.,

1999; CORRÊA et al., 2005), carcinoma de Ehrlich (GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et

al., 2002; MELO et al., 2004), e células promielocíticas leucêmicas (HL60) (GRYNBERG et

al., 1999; MACIEL et al., 2002; MELO et al., 2004).

O efeito citotóxico da t-DCTN em células fibroblásticas pulmonares de hamsters

chineses (V79) mostrou uma redução dose-dependente da viabilidade celular com uma CI50

de 240 mM, variando a concentração de 80 a 400 μM (SOUZA-BRITO et al., 1998); em

células promielocíticas leucêmicas (HL60) produziu diferenciação celular e indução de

apoptose; em células mononucleares sanguíneas humanas mostrou baixa toxicidade

(ANAZETTI et al, 2003; 2004); em células HL60 produziu inibição de fosfatase e apoptose



(CORRÊA et al., 2005); e em hepatócitos extraídos de ratos demonstrou toxicidade seletiva

após tratamento subcrônico com 8 μM (RODRÍGUEZ et al., 1999). Outro estudo observou

diminuição da citotoxicidade da t-DCTN em células de V79 e cultura de hepatócitos quando

este princípio ativo foi complexado com a β-ciclodextrina (FREIRE et al., 2003).

Quanto à toxicidade da t-DCTN, estudos de toxicidade subaguda e aguda já foram

realizados. Nos ensaios de toxicidade subaguda, a t-DCTN foi administrada diariamente por

via oral durante 35 dias (25, 50 e 100 mg/Kg). Os resultados demonstraram uma redução dos

níveis de protoplasma, fosfatase alcalina e colesterol. Além disso, foram observadas

alterações histopatológicas no fígado (tumefação turva, degeneração microvacuolar e

alterações nucleares) (RODRÍGUEZ et al., 2004), e ainda, em doses mais elevadas, um

aumento significativo no peso do fígado e nos níveis da gama-glutamil transpeptidase (ratos

fêmeas).

A toxicidade aguda da t-DCTN foi avaliada em camundongos Swiss machos após 14

dias de administração por via oral (nas doses de 125, 250, 500, 750 e 1000 mg/Kg), e por via

intraperitoneal (nas doses de 25, 31, 62,5, 125, 250 e 500 mg/Kg). Os resultados destes

ensaios demonstraram uma baixa toxicidade deste princípio ativo, com valores de DL50 de

876 mg/Kg (12 h) e 47,2 mg/Kg (14 dias) para ambas as vias de administração (SOUZA-

BRITO et al., 1998). Estudos de toxicidade aguda realizados durante 72 h com administração

da t-DCTN por via oral não revelaram nenhum sintoma tóxico em nível de sistema nervoso

central, como estereotipia, ataxia, e convulsão. A DL50 da t-DCTN foi determinada em

camundongos por via oral, sendo de 555 mg/Kg (v.o.) (CARVALHO et al., 1996). Apesar de

a t-DCTN apresentar uma baixa toxicidade, o uso indevido da sacaca (uso de folhas em

tratamentos prolongados) vem sendo associado a casos de hepatite tóxica (aguda, crônica e

fulminante) (MACIEL et al., 2006; 2002).



OOBBJJEETTIIVVOOSS



OBJETIVOS

Objetivo Geral

Obter e caracterizar sistemas de liberação controlada inovadores contendo o

terpenóide bioativo t-DCTN e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em microesferas dos

polímeros biodegradáveis PCL e PLGA.

Objetivos Específicos

• Avaliar a influência de parâmetros de formulação através de análise fatorial usando a

técnica de emulsão múltipla com evaporação do solvente para a obtenção das

microesferas;

• Otimizar formulações de microesferas através do uso de análise fatorial para a

encapsulação da t-DCTN e do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;

• Preparar microesferas de PCL e PLGA contendo t-DCTN;

• Preparar microesferas de PCL e PLGA contendo complexo de inclusão

t-DCTN:HPβCD;

• Caracterizar as microesferas físico-quimicamente com a avaliação do percentual de

encapsulação, polidispersão (índice span), carga de superfície (potencial zeta), análise

morfológica e porosidade;

• Determinar o perfil de liberação in vitro das microesferas de PCL e PLGA contendo

t-DCTN e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;

• Avaliar o perfil de liberação in vitro das microesferas através do uso de modelo teórico

de cinética de liberação;

• Avaliar a influência do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD nas propriedades

físico-químicas e de cinética de liberação das microesferas.



AARRTTIIGGOO

PPhhyyssiiccoocchheemmiiccaall aanndd rreelleeaassee cchhaarraacctteerriissttiiccss ooff

tt--ddeehhyyddrrooccrroottoonniinn aanndd tt--DDCCTTNN::

hhyyddrrooxxyypprrooppyyll--ββ--ccyyccllooddeexxttrriinn iinncclluussiioonn

ccoommpplleexx iinnttoo PPCCLL aanndd PPLLGGAA mmiiccrrooppaarrttiicclleess



Physicochemical and release characteristics of t-dehydrocrotonin and

t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex into PCL and PLGA

microparticles

Waldenice de Alencar Morais1, Rosana Silva Batista1, Maria Aparecida Medeiros Maciel2,

Nereide Stela Santos-Magalhães1*

1Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami

(LIKA), Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil, 2Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química, Natal, RN, Brazil

* Corresponding author

Dra. Nereide Stela Santos Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco

Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos

Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)

Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.

50670-901, Recife-PE, Brasil.

Phone: + 55–81- 21012501; fax: +55–81- 21012508

E-mail: [email protected]; [email protected]



Abstract

The purpose of this study was to evaluate the influence of the presence of t-DCTN and t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex (t-DCTN:HPβCD) of polycaprolactone (PCL) and poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA) microparticles on their physicochemical and release properties. Three different microparticle systems were prepared by double W/O/W emulsion-solvent evaporation method with t-DCTN, t-DCTN:HPβCD or co-encapsulated t-DCTN:HPβCD incorporated into the aqueous phase and t-DCTN in the organic phase of the simple emulsion. The polyethylene glycol (PEG) and polyvinylalcohol (PVA) were used as stabilizing agents of the simple and double emulsion, respectively. Initially, pre-formulation studies of unloaded PCL microparticles were performed using 24−1 fractional factorial design varying PEG and PVA concentration, and aqueous phase volume of the simple and double emulsions. The influence of the formulation features on the particle size and polydispersity (span) of unloaded PCL microparticles was thus evaluated using the factorial design. Factorial design showed to be an excellent tool to optimize PCL microparticles. The variation of the inner and outer aqueous phase volumes of the double emulsion considerably affected the size and the span of the resultant microparticles. The size of unloaded PCL microparticles varied from 6.68 to 28.41 μm and the span changed from 1.16 to 4.76 with the alteration of the factors. Considering the most stables unloaded microparticle formulations, t-DCTN and t-DCTN:HPβCD-loaded PCL and PLGA microparticles were prepared to evaluate the influence of the polymer type. The t-DCTN was encapsulated into PCL and PLGA microparticles with loading drug of almost 4% and 6% (w/w) at 1:10 drug/polymer ratio, respectively. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex changed physicochemical characteristics of the microspheres, producing smaller particle size, better encapsulation efficiency, loading, and porosity parameters (specific surface area and pore size distribution), as well as, a smooth surface morphology in comparison with t-DCTN-loaded systems. The co-encapsulation of DCTN:HPβCD inclusion complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio increased the drug loading to almost 14% (w/w) in PLGA microspheres with particle size of 9.59 µm and span of 1.57. The good agreement between kinetic profiles and fickian model indicated that the diffusion is involved on the release mechanism of t-DCTN. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modified the release properties with smaller diffusion rates, for PCL (k2= 0.105) and PLGA (k2= 0.107), in comparison with microparticles containing only t-DCTN, k2=0.289 (PCL) and k2=0.395 (PLGA), respectively. The t-DCTN-loaded PLGA microspheres presented higher burst effect and faster drug release associated to formation of a porous network. The co-encapsulation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD in PLGA microspheres reduced the burst effect (almost 1.5%) and diffusion rate (k2=0.079). These results suggest a smaller affinity of t-DCTN by PCL matrix in relation to PLGA due to its lower encapsulation, higher modification of the surface charge (zeta potential), higher burst effect and faster release profiles. The physicochemical and release characteristics of PCL or PLGA microspheres were modified with the presence of free drug and/or complexed drug. From these findings novel formulations of PCL and PLGA microspheres containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex were obtained to be applied in in vivo studies.

Keywords: Drug delivery systems, microparticles, trans-dehydrocrotonin, drug inclusion complex with cyclodextrin, factorial design.



1. Introduction

The diterpene 19-nor-clerodane trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a bioactive

compound isolated of the stem bark of Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), which

presents several pharmacological activities. Particularly the hypoglycemic effects of DCTN

were reported (Farias et al., 1997; Silva et al., 2001). Nevertheless, the lower water solubility

and hepatotoxicity of this compound has been associated to the limitation of its therapeutic

application (Corrêa et al., 2005; Morais et al., 2008). A promising strategy to overcome these

issues could be the encapsulation in polymeric microparticles to modulate its therapeutical

dose, bioavailability and toxic effects.

Polymeric microparticles have been commonly employed as attractive drug delivery

systems to overcome low oral bioavailability of certain drugs. Microparticles would offer

several advantages as providing a controlled drug delivery within therapeutic range, allowing

less frequent administrations and reducing toxic effects, thereby increasing patient compliance

(Freiberg and Zhu, 2004; Wischke and Schwendeman, 2008). Biocompatible and

biodegradable polymers with safety profile for human use such as poly-ε-caprolactone (PCL)

and poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA) are the most widely used materials in the

preparation of drug delivery systems (Jain, 2000; Gander et al., 2001; Lecaroz et al., 2006;

Martínez-Sancho et al., 2006; Fernández-Carballido et al., 2008).

Among the different methods described to prepare microparticles (Jiang and

Schwendeman, 2001; Zhang et al., 2008), the double emulsion-solvent evaporation technique

(w/o/w) is the widely accepted to encapsulate a variety of drugs (Garbayo et al., 2008; Li et

al., 2008). The modification of variables on the formulation and preparation method allows

the control of the microparticle characteristics such as particle size and drug release

properties. The factorial design represents a theoretical model suitable to perform a



quantitative relationship between the effects of the formulation variables individually or in

association, providing a new approach to optimize pharmaceutical formulations (Dillen et al.,

2004; Derakhshandeh et al., 2007). In the present study factorial design is proposed to as a

tool in the optimization of microparticles containing t-DCTN.

Cyclodextrins (CDs), cyclic oligosaccharides, have broad pharmaceutical applications

as solubilizing agents of lipophilic drug molecules, providing alteration of their

physicochemical and biological properties. Cyclodextrins enhance aqueous solubility of drugs

and improve thereby their stability and bioavailability profiles, through the formation of non-

covalent dynamic (host–guest) inclusion complexes (Del Valle, 2004; Brewster and Loftsson,

2007). Cyclodextrins have been used as pharmaceutical row material in drug delivery systems

such as microcapsules, microparticles, nanospheres, nanocapsules, liposomes and niosomes

(Trichard et al., 2006; Loftsson and Duchêne, 2007), modifying the loading and release

characteristics of drugs (Duchêne et al., 1999). Recently, a growing interest has been showed

in the use of βCD derivatives, such as the 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), due to

its improved ability to form inclusion complexes, greater water solubility and less toxicity

than the parent cyclodextrins (Loftsson and Duchêne, 2007).

As reported, the inclusion of t-DCTN in βCD carried out to control the drug release was

able to reduce its cytotoxicity in rat hepatocytes and V79 fibroblasts (Corrêa et al., 2005).

Furthermore, t-DCTN-loaded PLGA spherical microparticles were recently developed by our

research time with mean diameters size of 3.2 ± 0.1μm and 7.6 ± 0.7 μm, and encapsulation

efficiency of 85.5 ± 3.9%. The in vitro kinetic profile of DCTN from PLGA-microspheres

was initially fast (burst effect of 19.4% at 2 h), followed by a controlled release attaining a

maximum drug released of 55.6% within sixty hours. It was also demonstrated that the

hypoglycemic effect of t-DCTN was improved by its encapsulation into drug delivery



systems. The t-DCTN-loaded PLGA microspheres reduced the glucose levels at 26.8%

comparated with 14.3% obtained to DCTN at normal glycemic animals (Morais et al., 2008).

Taking into account all these findings, the aim of the present study was to combine the

advantages properties of the biodegradable microparticles and the concept of

drug-cyclodextrin inclusion complex to develop t-DCTN microparticles using fractional

factorial design. The main idea was to obtain novel PCL and PLGA microparticles containing

the free t-DCTN, DCTN:HPβCD inclusion complex and both free and complexed forms of

t-DCTN. The influence of the drug:inclusion complex on the physicochemical and release

characteristics of microparticles was investigated using different polymeric matrices for

further pharmacological purposes.

2. Materials and methods

2.1 Materials

The t-DCTN was extracted and purified from the stem bark of Croton cajucara Benth

(Maciel et al., 2000), and its physicochemical characterization was carried out at the

Chemistry Laboratory of the Federal University of the Rio de Janeiro (Brazil). The

poly(D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA 50/50, inherent viscosity of 0.57 dl/g) was

purchased from Birmingham Polymers (Alabama, USA) and polycaprolactone

(PCL, MW≈14,000 Da) was furnished by Sigma-Aldrich (St Louis, USA). The stabilizers

polyvinyl alcohol (PVA, MW of 13,000-17,000 Da) and polyethylene glycol (PEG, MW 4,000

Da), the cryoprotectant trehalose and the 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin

(HPβCD, MW≈1380, degree of substitution≈0.6) were obtained from Sigma-Aldrich

(St Louis, USA). Tween 80® was supplied by Labsynth (São Paulo, Brazil). Purified water

was obtained through Human UP 900 water purification system (Human Corporation, Korea)



and used in the preparation of phosphate buffer solutions (pH 7.4). Silica-alumina was

acquired from Micromeritics (Norcross, USA). All other reagents were of analytical grade.

2.2 Methodology

Three different microparticle systems were thus prepared with t-DCTN,

t-DCTN:HPβCD and co-encapsulation of t-DCTN in the organic phase of the simple

emulsion and t-DCTN:HPβCD in the aqueous phase of the double emulsion. Initially,

pre-formulation studies of the preparation of unloaded PCL microparticles were performed

using fractional factorial design.

2.2.1 Pre-formulation studies of microparticles using fractional factorial design

The unloaded PCL microparticles were prepared using a water-in-oil-in-water (w/o/w)

emulsion solvent evaporation technique. Briefly, a simple emulsion (w/o) was prepared by

dissolving the PCL (225 mg) in dichloromethane (6 mL). The organic solution was emulsified

with a pH 7.4 phosphate buffer solution (1 – 3 mL) containing PEG (50 – 200 mg) at 8,000

rpm for 1 min (ultra-turrax T25, IKA, Germany) using an ice bath. Next, the simple emulsion

was added to the outer aqueous phase (30 – 100 mL) constituted of PVA (0.5 – 2%, w/v) and

emulsified at 8,000 rpm for 30 s, resulting in a double emulsion (w/o/w). This emulsion was

then maintained under agitation at 400 rpm for 2 h allow the solvent evaporation. The

microparticles were recovered through centrifugation (Kubota KN-70 centrifuge, Japan) at

3,000 rpm (1171 g) for 10 min and washed three times with distilled water to remove the

excess of emulsifiers. Finally, microparticles were dispersed within 1% (w/v) trehalose

aqueous solution (2 mL), frozen at –80°C and lyophilized (EZ-DRY, FTS System, USA) in

equipment operating at 200 bars during 48 h. The storage of lyophilized microparticles was

performed at 25 ± 1°C in a vacuum desiccator.



The influence of the formulation parameters on the development of unloaded PCL

microparticles prepared by multiple emulsion solvent evaporation method was carried out

using a 24−1 fractional factorial design (Barros Neto et al., 1995). The effects of four

parameters of the simple (i) and multiple (ii) emulsions were evaluated as following: (i) factor

1 (PEG A1=50, 125 or 200 mg) and factor 2 (inner aqueous phase volume, VA1=1, 2 or 3 mL);

and (ii) factor 3 (PVA A2=0.5, 1.25 or 2%) and factor 4 (aqueous continuous phase volume,

VA2=30, 65 or 100 mL). The response variables of the factorial experiment were the volume

mean diameter (dv) and particle size distribution (span) of the microparticles. To provide an

estimate of the pure error, the design was enlarged with a central point run in triplicate. The

low and high levels of the factors were represented by -1 and +1 coded values, respectively,

and the central point by 0, as shown in Table 1. The design matrix was composed of eleven

batches of microparticles (from M1 to M11) prepared in a randomized manner. The

interpretation of the statistical model was performed by evaluating the main effects and their

interactions. The statistical analysis of the data was performed using the Statistica® software

(version 6).

Table 1. Factor levels and response variables used in the fractional factorial design (24−1) on

the development of unloaded PCL microparticles.

Coding Factors -1 0 +1

Simple emulsion (1) PEG (mg), (PEG A1) 50 125 200 (2) Aqueous phase volume (mL), (VA1) 1 2 3

Multiple emulsion (3) PVA (%), (PVA A2) 0.5 1.25 2 (4) Aqueous phase volume (mL), (VA2) 30 65 100

Response variables

Volume mean diameter (dv) Particle size distribution (span)

PCL= 225 mg



2.2.2 Preparation of DCTN:HPβCD inclusion complex and quantification of t-DCTN into

inclusion complex

Inclusion complex of t-DCTN:HPβCD with a 1:1 molar ratio was prepared by

freeze-drying technique. Appropriate amounts of drug and HPβCD were dissolved in an

ethanol:water solution (1:1), stirred for 48 h at 25°C, cooled by immersion in liquid-nitrogen

at -80 °C and lyophilized (EZ-DRY, FTS System, US) for 48 h.

The amount of t-DCTN in the inclusion complex was determined using a

UV spectroscopic validated method (Lapenda et al., 2010). An amount of t-DCTN:HPβCD

inclusion complex (equivalent to 1 mg of t-DCTN) was weighed and mixed with 10 mL of

methanol and acetonitrile mixture (1:10) to extract the drug. An aliquot of the sample was

diluted with acetonitrile to a drug theoretical concentration of 10 µg/mL. This procedure was

performed in triplicate. The standard curve of t-DCTN was performed at concentration

varying from 1 to 20 μg/mL in acetonitrile.

2.2.3 Preparation of t-DCTN-loaded microparticles

Based on results of the factorial design, PCL or PLGA microparticles containing

t-DCTN or t-DCTN:HPβCD inclusion complex (11.3 - 22.5 mg) were prepared using the

water-in-oil-in-water (w/o/w) emulsion/solvent evaporation technique, as previously

described in section 2.2.1. Three different microparticle systems were thus prepared

containing free t-DCTN, which was dissolved in the organic phase of the simple emulsion; the

inclusion complex t-DCTN:HPβCD dissolved in the aqueous phase of the simple emulsion;

and the co-encapsulation of t-DCTN in the organic phase of the simple emulsion and

t-DCTN:HPβCD in the aqueous phase of the simple emulsion. A typical formulation of

microparticles was constituted of PCL or PLGA (225 mg) dissolved in 6 mL of



dichloromethane, PEG (125 mg) dissolved in 2 mL of water to form the simple emulsion, and

PVA (1.25%) dissolved in 45 mL of water as the continuous phase of the multiple emulsions.

2.2.4 Characterization of microparticles

2.2.4.1 Particle size analysis

The volume mean diameter (dv) and size distribution (span) of microparticles were

determined trough laser diffraction technique using a particle size analyzer

(Microtrac® S3500, USA). Samples of lyophilized microparticles (10 mg) were dispersed in

0.04% Tween 80® (w/v), sonicated for 10 min and analysed. The dv represents the volume

mean diameter and the span was calculated by the equation: span=d(v,0.9)−d(v,0.1)/d(v,0.5), where

d(v,0.9), d(v,0.5) and d(v,0.1) are the volume mean diameters determined at 90th, 50th and 10th

percentile of particles, respectively.

2.2.4.2 Drug efficiency encapsulation and drug loading

Accurately weighed amounts of lyophilized microparticles (5 mg) were dissolved in

25 mL of dichloromethane and methanol mixture (3:2) and sonicated for 10 min. t-DCTN was

detected at 238 nm. The amount of t-DCTN in microparticles was determined using a

standard curve of t-DCTN at concentrations ranging from 3 to 20 μg/mL in methanol. The

experiments were carried out in triplicate. The drug content was thus used to calculate the

encapsulation efficiency and drug loading.

The drug encapsulation efficiency was calculated by the relation between the experimental

and theoretical t-DCTN concentrations determined in microparticles expressed as percentage.

The drug loading was calculated by the ratio between the encapsulated drug and the weight of

lyophilized microparticles expressed as percentage (w/w) (Cocero et al., 2009; Ishihara et al.,

2009).



2.2.4.3 Zeta potential measurements

The surface charge of microparticles was evaluated through electrophoretic mobility (μE )

measurements using a Zeta-Meter System 3.0+ (Zeta-Meter Inc., USA) at 25°C.

Microparticles were dispersed in 1 mM NaCl at 0.5% (w/v) and sonicated for 10 min and

analyzed. The results are reported as the average of ten runs and expressed by the zeta

potential (ζ, mV) calculated from μE by the Smoluchowski relationship: ζ=(μEη)/(ε0εr), where

ε0 is the permittivity of a vacuum, εr the relative dielectric permittivity of the medium

(dielectric constant), and η is the viscosity of the dispersing phase.

2.2.4.3 Morphological analyses

The morphology of microparticles was evaluated by scanning electron microscopy

(SEM, FEI, Quanta 200 FEG) at the Center of the Northeast Technology (CETENE, Recife,

PE, Brazil). For SEM analysis, the samples were prepared from lyophilized microparticle

redispersed in water. A sample was dropped on a piece of silicium wafer and dried in a

desiccator. After drying, the piece of silicium wafer was sealed with colloidal silver on stubs

for analysis on low vacuum at 10,00 kV and magnification of around 5,000 x.

2.2.4.4 Porosity analysis

The porosity parameters of microparticles were evaluated through the surface gas

adsorption technique. Measurements were performed using an accelerated surface area and a

porosimetry system (ASAP 2420, Micrometrics, Norcross, USA) at the CETENE. Before

analysis a sample of lyophilized microparticles (100 mg) was placed in a volumetric sample

tube and degassed under vacuum at 20°C for 48 h. The sample tube was then immersed in

liquid nitrogen and the sample exposed to inner nitrogen under precisely controlled pressures.

The pressure at which adsorption equilibrium occurred is measured and the universal gas law



applied to determine the quantity of gas adsorbed on the surface of microparticles.

Adsorption/desorption isotherms at 77 K were plotted from the volume of nitrogen (vapor)

adsorbed onto the surface of samples as a function of the relative pressure. Silica-alumina

pellets (specific surface area 215 ± 6 m2/g; mean pore diameter of 11.5 nm) were used as

standard reference. The specific surface area was calculated using the Brunauer–Emmett–

Teller (BET) method (Brunauer et al., 1938). The pore size distribution was determined by the

adsorption branch of the N2 isotherm (1.7 – 300 nm diameter range) using the Barret–Joyner–

Halenda (BJH) model (Barrett et al., 1951).

2.2.4.5 In vitro release kinetics

The release kinetics of t-DCTN from microparticles was carried out using dissolution

technique at sink conditions (Morais et al., 2008). Samples of microparticles (7 – 20 mg)

containing t-DCTN, t-DCTN:HPβCD inclusion complex or co-encapsulated free and

complexed drug were placed into 200 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) at 37 ± 1 °C

under magnetic agitation. At pre-determined time intervals, samples of the release medium

(1 mL) were withdrawn and replaced with fresh medium, filtered (0.22 μm membrane filter,

Millipore®, USA) and the t-DCTN content analyzed spectrophotometrically as previously

described. Kinetics experiments were conducted in triplicate. The in vitro release profiles of

t-DCTN from different microparticles were plotted as the percentage of t-DCTN released as a

function of time.

2.2.4.6 Mathematical modeling of drug release

The experimental release data were fitted by an exponential model using the

equation: )1(/ 21

tkt ekMM −

∞ −= , where tM and ∞M are the absolute cumulative amount of

drug released at time t and initial drug content, respectively; and the constant 2k is associated



to the drug diffusion coefficient in the polymer matrix (Siepmann and Siepmann, 2008; Klose

et al., 2008). The first hours of the kinetics were fitted with the Fickian square-root-of-time

(t1/2) model and the release rate determined by the slope of the linear regression.

3. Results

3.1 Development of unloaded PCL microparticles using factorial design

The aim of the factorial design was to obtain the adequate formulation of PCL

microparticles for further incorporation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex.

The 24−1 fractional factorial design was carried out by evaluating the effect of variables of the

emulsion/solvent evaporation technique on the size pattern of unloaded PCL microparticles.

The factors of the simple emulsion (PEGA1 and VA1) and the multiple emulsion

(PVAA2 and VA2) markedly influenced the response variables dv and span of the microparticles

as shown in Table 2. The volume mean diameter of unloaded PCL microparticles varied from

6.68 to 28.41 μm and the span from 1.56 to 4.76. Particularly, the volume mean diameter and

span of the reference formulation (M9, zero point), prepared in triplicate (M10 and M11),

varied from 19 to 23 μm (± 0.45 – 1.76 μm) and 1.35 to 1.76, respectively.

The main and interaction effects of factors of the factorial design of unloaded PCL

microparticles are summarized in Table 3. The effect value indicates the magnitude of the

impact of each factor as well as their interactions. The values showed in bold represent the

factors that present statistical significance (p<0.05). The signal effect, positive (+) or negative

(-), indicates as the response variable is modified as a function of the factor variation. A

positive effect means that the output increases with the increasing of the variable level and a

negative effect that the output increases with decreasing the variable level (Barros Neto et al.,

1995).



Table 2. Size characteristics of unloaded PCL microparticles obtained by emulsion/solvent

evaporation technique using 24−1 fractional factorial design.

Factors Response variables

Microparticles 1 (PEGA1)

2 (VA1)

3 (PVAA2)

4 (VA2)

dv ± sd (μm) span

M1 +1 -1 -1 +1 28.41 ± 0.32 2.02

M2 -1 -1 +1 +1 26.03 ± 0.49 1.29

M3 +1 +1 +1 +1 14.10 ± 1.12 1.62

M4 -1 +1 -1 +1 8.11 ± 0.12 2.51

M5 -1 +1 +1 -1 13.00 ± 0.59 4.76

M6 -1 -1 -1 -1 14.70 ± 0.87 1.79

M7 +1 -1 +1 -1 7.82 ± 0.16 3.23

M8 +1 +1 -1 -1 6.68 ± 0.43 3.61

M9

M10

M11

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

20.76 ± 1.76

18.62 ± 0.45

22.90 ± 1.47

1.56

1.35

1.76

PCL=225 mg.

Table 3. The main and interaction effects of fractional factorial design of unloaded PCL

microparticles.

Factors Effect 1

(dv)

Effect 2

(span)

Mean/Interaction 16.46636 2.31818

1 -1.20750 0.03250

2 -8.19750 0.85250

3 0.19250 0.43250

4 8.61250 -1.48750

1 by 2 1.61250 -1.24250

1 by 3 -7.91750 -0.44250

1 by 4 5.39250 -0.11250



The data clearly indicate significant effects of the factors VA1 and VA2 on dv and span of

PCL microparticles, with higher importance for VA2. The internal aqueous phase volume had a

negative effect (-8.19750) and the external aqueous phase volume had a positive effect

(8.61250) in the particle size. It means that a decrease in the dv can be achieved with an

increase of VA1 and a decrease of VA2 of the reference formulation (M9). VA1 and VA2 present

positive (0.85250) and negative (-1.48750) main effects in the span, respectively. It means

that a change in one of the significant factors of the factorial design (VA1 and VA2) carry out

opposite effects on the size and span of the microparticles. Taking into account the

formulation M8 (VA1=3 mL and VA2= 30 mL) a smaller dv (6.68 ± 0.43 µm) and an increased

span (3.61) were found.

The significant interaction effects were 1 by 3 on dv (-7.91750), and 1 by 2 on span

(-1.24250) of the PCL microparticles. The results showed that the interaction of the factors

PEGA1 and PVAA2 produced a decrease in dv (7.82 µm, M7), and that interaction of the factors

PEGA1 and VA1 produced a decrease in span of microparticles.

The fractional factorial design allowed the production of PCL microparticles with

smaller size (<19 μm) but higher span values (>1.76, except for M2 and M3) in relation to

M9, because of the opposed effects caused by the factors on the response variables.

In present study, it is desired a particle size < 10 µm and a span value < 2. That is due

to the further application of t-DCTN loaded microparticles as systems to oral route that must

have adequate particle size to pass through the intestinal barrier (Gaumet et al., 2007).

Furthermore, the span values around 2 are appropriate for drug delivery systems (Ribeiro-

Costa et al., 2008). Based on this fact, the reference formulation (M9) was modified and a

new formulation (M12) was prepared containing PCL (225 mg) and PEG (125 mg) with a VA1

of 2 mL to form the simple emulsion, and PVA (1.25%) and VA2 of 45 mL as the continuous



phase. As expected, M12 presented the smaller dv (6.45 ± 0.53 µm) and a slightly higher span

(2.09) than M9 (Figure 1).

Figure 1. Scatterplot of volume mean diameter and span of unloaded PCL microparticles

optimized using fractional factorial design 24−1.

The variation of the inner/external aqueous phase (w1/w2) ratio had a great influence

on the size properties of the PCL microparticles. The smaller value of dv (6.45 μm) was found

for w1/w2 ratio of 1/22.5 (M12). However, small dv values were also found for w1/w2 ratio

varying from 1/10 (6.68 μm, M8) and 1/30 (7.82 μm, M7).

The increase in particle size of PCL microparticles with the increase of the volume of

the external aqueous phase can be attributed to a decrease in the mixing efficiency associated

with larger volumes during the agitation process. A reduction in mixing efficiency probably

produced an increase in the size of the simple emulsion droplets, which would result in the

formation of large microparticles. The decrease of the diameter and the increase of the

polidispersity (span) of microparticles with the increase of the volume of the internal aqueous

phase were possibly caused by the increase of the volume fraction of the dispersed to



continuous phase (Li et al., 2008). Other authors have already reported this effect (Jeyanthi et

al., 1997; André-Abrant et al., 2001). When w/o/w double emulsion technique is used, the

viscosity of the polymer phase may also be influenced by the presence of the inner water

phase (Wischke and Schwendeman, 2008). A decrease of the viscosity of the dispersed phase

of microspheres carried out a larger size distribution (Yang et al., 2000).

In the present study, PEG and PVA were used to stabilize the internal phase of the

simple emulsion and the continuous phase of the multiple emulsions, respectively, during

microsphere preparation. As previously reported, the increase of surfactant concentrations

reduced the size of microspheres (Yang et al., 2001; Li et al., 2008; Luciani et al., 2008).

3.2 t-DCTN-loaded microparticles

The formulation of PCL microparticles (M12) was used to encapsulate the t-DCTN

varying the payload from 11.3 to 22.5 and the drug/polymer ratio from 1:10 to 1:20 (Table 3).

Table 3. Size properties and encapsulation efficiency of t-DCTN in PCL microparticles.

Particle size dv ± sd span (µm)

t-DCTN (mg)

Drug:polymer ratio

EE ± sd (%)

Loading ± sd (%, w/w)

22.5 1:10 49.28 ± 1.65 2.12 49.70 ± 0.21 4.06 ± 0.02

15.0 1:15 42.21 ± 3.22 1.82 34.24 ± 0.39 2.07 ± 0.02

11.3 1:20 25.81 ± 0.12 1.39 18.06 ± 0.25 0.79 ± 0.01

PCL= 225 mg.

The presence of t-DCTN influenced the particle size properties of PCL microparticles.

A remarkable increase of size and span of microparticles with the increment in the initial

amount of t-DCTN from 11.3 to 22.5 mg was found. The volume mean diameter varied from

25.81 to 49.29 μm and the span from 1.39 to 2.12. However, no significant increase of span



values in relation to unloaded PCL microparticles (span 2.09) was found. It should be noted

that the smaller size was found at 1:20 drug/polymer ratio (25.81 µm). The presence of the

drug can increase the viscosity of the dispersed phase, and, as a result, the size of the droplets

in the emulsification medium increased, which leads to an augmentation of the size of

microparticles (Li et al., 2008; Balmayor et al., 2009).

The t-DCTN was encapsulated into PCL-based microparticles with encapsulation

efficiency varying from 18.06 (11 mg t-DCTN) to 49.70% (22 mg t-DCTN) and the drug

loading increased from 0.79 to 4.06%. As expected, the t-DCTN loading in microparticles

was improved with the increase of the drug amount. In fact, it is well known that the drug

efficiency encapsulation generally increases with the drug/polymer ratio (Wan et al., 1992).

Further studies were carried out to investigate the influence of the polymer type on the

t-DCTN encapsulation. In this way, t-DCTN-loaded PLGA microparticles were prepared

under the same conditions as t-DCTN-loaded PCL microparticles (Table 4).

Table 4. Size properties and encapsulation efficiency of t-DCTN in PLGA microparticles.

Particle size dv ± sd span (µm)

t-DCTN (mg)

Drug:polymer ratio

EE ± sd (%)

Loading ± sd (%, w/w)

22.5 1:10 14.56 ± 0.19 1.00 75.73 ± 0.40 5.90 ± 0.03

15.0 1:15 16.31 ± 0.40 1.02 62.67 ± 0.13 3.34 ± 0.01

11.3 1:20 15.82 ± 0.07 0.81 58.80 ± 0.44 2.36 ± 0.02

PLGA=225 mg.

The results showed that the mean size of PLGA microparticles were smaller

(14.56 – 16.31 µm) than that of t-DCTN-loaded PCL microparticles (<25 µm). The span

values slightly varied from 0.81 to 1.00 for t-DCTN contents varying from 11.4 to 22.5 mg.

The encapsulation efficiency and drug loading increased from 58.80 to 75.73% and



2.36 to 5.90% (w/w), respectively. The increase of the drug/polymer ratio had influence on

the particle size of PLGA microparticles probably due to the higher affinity of t-DCTN to

PLGA matrix.

The t-DCTN-loaded PLGA microparticles presented different characteristics of size

and drug encapsulation. The smaller mean diameters and narrow size range were found,

whereas the encapsulation percentages were improved in relation to t-DCTN-loaded PCL

microparticles. That was probably due to the higher affinity of t-DCTN to the PLGA matrix,

and therefore, causing an increased retention of the drug in the organic phase and improving

emulsion stability during the formation of microparticles (Mao et al., 2008).

3.3 t-DCTN:HPβCD-loaded microparticles

The HPβCD was chosen to prepare inclusion complex because it was expected to

improve the aqueous solubility of t-DCTN in comparison to βCD as previously described

(Corrêa et al., 2005). The incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex

(120 mg equivalent to 22.5 mg of t-DCTN) in PLC or PLGA microparticles (1:10

drug/polymer ratio) was carried out.

Figure 2 shows the size, span, loading and zeta potential properties of PCL and PLGA

microparticles containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex. The

encapsulation of t-DCTN or t-DCTN:HPβCD in the PCL matrix caused small differences on

the volume mean diameter and span of PCL microparticles (Figure 2a,b). The t-DCTN-loaded

PCL microparticles presented dv of 49.28 ± 1.65 µm and span of 2.12, while the

t-DCTN:HPβCD-loaded PCL microparticles presented dv of 45.15 ± 1.41 µm and span of

1.95.



Figure 2. Diameter (a), span (b), loading (c) and zeta potential (d) of the PCL and PLGA

microparticles containing t-DCTN (white columns) or t-DCTN:HPβCD inclusion complex

(black columns), and unloaded microparticles (sparse gray columns). *Statistically different

(p<0.05): t-DCTN/PCL and t-DCTN:HPβCD/PCL (I); t-DCTN/PLGA and

t-DCTN:HPβCD/PLGA (II); t-DCTN/PCL and t-DCTN/PLGA (III); t-DCTN:HPβCD/PCL

and t-DCTN:HPβCD/PLGA (IV); t-DCTN/PCL, t-DCTN:HPβCD/PCL and unloaded PCL

(V); and t-DCTN/PLGA, t-DCTN:HPβCD/PLGA and unloaded PLGA (VI).

In the PLGA matrix, significant decrease in particle size and increase in span values

were found in the presence of t-DCTN:HPβCD (dv=7.11 μm and span=1.89) in comparison

with t-DCTN (dv=14.56 μm and span=1.00) (Figure 2a,b). This can be probably due to the

cryoprotectant effect of HPβCD, which has already been described in the literature at

polymeric systems as nanocapsules. Cryoprotectants are usually added to the formulation to

protect the drug delivery systems during freezing and desiccation steps in order to convert



solutions of labile materials into solids of sufficient stability for distribution and storage.

(Abdelwahed et al., 2006).

The drug loading was decreased from 4.06 to 2.70% and from 5.90 to 4.84% when

t-DCTN:HPβCD inclusion complex was incorporated in PCL and PLGA matrices,

respectively (Figure 2c). This may be explained by the fact that the droplets of the internal

aqueous phase containing the soluble inclusioncomplex t-DCTN:HPβCD can diffuse to the

external aqueous phase more easily during the formation of microparticles

(Trapani et al., 2003). It was somewhat surprising to observe that PCL microparticles with

larger size presented smaller loading compared to PLGA microparticles for both t-DCTN and

t-DCTN:HPβCD inclusion complex (Figure 2c). This shows that the encapsulation of drugs in

microparticles is affected by different factors besides particle size, including drug/polymer

interactions and emulsion stability during the preparation process of microspheres

(De Rosa et al., 2002; Trapani et al., 2003).

The zeta potential of PCL-based microparticles was changed with the incorporation of

t-DCTN (-8.36 ± 0.37 mV) or t-DCTN:HPβCD (-7.23 ± 0.36 mV) in comparison with the

unloaded microparticles (-12.68 ± 0.56 mV) (Figure 2d). The decrease on the zeta potential

in relation to unloaded microparticles can be due to a fraction of the drug adsorbed on the

particle surface that may influences the surface charge. In contrast, no changes were verified

after the incorporation of t-DCTN (-14.27 ± 0.90 mV) or t-DCTN:HPβCD

(-13.91 ± 0.85 mV) in PLGA microparticles (-14.03 ± 0.80 mV), confirming the higher

affinity of t-DCTN with the PLGA and its incorporation in the core of the polymeric matrix.

As previously demonstrated, PLGA microparticles are negatively charged and this surface

charge is associated to carboxylic groups of this polyester (Bodmer et al., 1992; Garbayo et

al., 2008; Manca et al., 2008).



Figure 3. Diameter (a), span (b) and loading (c) of PLGA microparticles containing t-DCTN

(white columns), t-DCTN:HPβCD inclusion complex (black columns) or t-DCTN with

t-DCTN:HPβCD inclusion complex co-encapsulated (sparse gray columns). *Statistically

different (p<0.05): t-DCTN and t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio (I); t-DCTN

and t-DCTN with t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (II); t-DCTN

at 1:10 and 1:5 drug:polymer ratios (III); t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio and

t-DCTN with t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (IV).

The PLGA matrix provided higher drug loading, smaller particle size and narrow size

distribution. This fact suggests a higher affinity between the dug and polymer matrix

promoting higher drug incorporation into PLGA-based microparticles.

Based on these findings, a study was performed to improve the drug loading by

changing the drug:polymer ratio from 1:10 to 1:5. Figure 3c shows that the drug loading

changed from 5.90 ± 0.03 to 10.12 ± 0.01% (w/w) for microparticles containing only



t-DCTN. However, there was an increase in the particle diameter (14.56 ± 0.19 µm) and

polidispersity (1.00) for microspheres at 1:10 drug:polymer ratio to 37.10 µm ± 0.17 and span

1.42 for microspheres at 1:5 drug:polymer ratio (Figure 3a and 3b).

The drug loading increased from 4.84 ± 0.02% (w/w), containing only

t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio, to 13.93 ± 0.05% (w/w) containing

t-DCTN:HPβCD and t-DCTN co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (Figure 3c). The

particle size and span values were changed from 7.11 ± 0.11 µm and span 1.89 for

t-DCTN:HPβCD to 9.59 ± 0.11 µm and span 1.57 for co-encapsulated t-DCTN:HPβCD and

t-DCTN.

The presence of t-DCTN in the organic phase appears to have a great influence in the

increase of viscosity of the dispersed emulsion phase, because it was observed a higher

particle size for the systems containing only t-DCTN (37.10 µm) in comparison with

t-DCTN:HPβCD and t-DCTN co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (9.59 µm). It has

been reported that the increase of the viscosity of the dispersed phase can increase the size of

microspheres (Li et al., 2008).

3.4 Morphological analysis of microparticles

The morphological characteristics of the PCL and PLGA microparticles containing

t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex are shown in SEM micrographs (Figure 4).

SEM microscopy revealed that t-DCTN-loaded microparticles prepared with PCL are

spherical shaped with smooth surface (Figure 4a), while PLGA based-microparticles showed

porous surface and inner structure (Figure 4c). These results are in disagreement with dense

and non-porous microspheres obtained in our previous study (Morais et al., 2008). This fact

can be attributed to the modification of w/o/w parameters such as the increase of the external

aqueous phase (Mao et al., 2007) and increase of PEG amount into the inner aqueous phase.



All these increased the osmotic gradient and the flux of water from w2 into the w1/polymer

phase (Wischke and Schwendeman, 2008).

Figure 4. SEM micrographs of PCL and PLGA microparticles containing t-DCTN or

t-DCTN:HPβCD inclusion complex: t-DCTN/PCL 1:10 drug:polymer ratio (5,000 x) (a);

t-DCTN:HPβCD/PCL 1:10 drug:polymer ratio (4,042 x) (b); DCTN/PLGA 1:10

drug:polymer ratio (5,000 x) (c); t-DCTN:HPβCD:PLGA 1:10 drug:polymer ratio (5,000 x)

(d) and, t-DCTN with t-DCTN:HPβCD/PLGA co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio

(5,000 x) (e).



The encapsulation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex in the microparticles did not

cause significant change in their morphology independent on the polymer type device (Figure

4b and 4d). The PLGA microparticles containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD

co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio exhibited morphological characteristics analogous

to PLGA microparticles containing only t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio (Figure

4e). This indicates that the presence of the inclusion complex in the internal aqueous phase

caused an alteration of solvent evaporation rate, reducing the porosity effect found in the

incorporation of the drug alone (Yang et al., 2000; Wischke and Schwendeman, 2008).

3.5 Porosity analysis of microparticles

The integrated area under the curve (AUC) applied to incremental pore size distribution

(PSD) of adsorption/desorption branches of isotherm was performed to characterize the

porosity of the microspheres. Results showed that the increase of the specific surface area of

microparticles (ABET) is correlated to an increase of porosity parameters (specific surface area

and pore size distribution). This indicates that a higher specific surface area is associated to a

higher porosity of the microparticles (Table 5).

Table 5. BET specific surface area and pore size distribution of the microparticles.

AUC incremental PSD (10-3) Drug:polymer ABET (m2/g) Adsorption Desorption

t-DCTN/PCL 2.874 61.539 31.239

t-DCTN/PLGA 5.166 77.694 34.799

t-DCTN:HPβCD/PCL 0.956 18.553 5.063

t-DCTN:HPβCD/PLGA 0.581 20.853 5.405

t-DCTN:HPβCD:t-DCTN/PLGA* 1.680 34.027 11.784

ABET= specific surface area; PSD= pore size distributions; *1:5 drug/polymer ratio



The PLGA microparticles containing only t-DCTN at 1:10 drug:polymer ratio presented

porosity parameter values (ABET=5.166 m2/g; AUCads=77.694 and AUCdes=34.799) greater

than PCL microparticles (ABET=2.874 m2/g; AUCads=61.539 and AUCdes=31.239) (Table 5).

However, the incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex into microparticles

produced a significant decrease of porosity parameters independent of the polymeric matrix,

PCL (ABET=0.956 m2/g; AUCads=18.553 and AUCdes=5.063) or PLGA (ABET=0.581 m2/g;

AUCads=20.853 and AUCdes=5.405).

The PLGA microspheres containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5

drug:polymer ratio presented intermediate porosity parameter values (ABET=1.680 m2/g;

AUCads=34.027 and AUCdes=11.784) compared to ones containing only t-DCTN. This fact

emphasizes the stronger character of the influence of t-DCTN:HPβCD inclusion complex in

the porosity properties as also observed in the morphological analysis using SEM microscopy.

The higher porosity for the PLGA microparticles containing only t-DCTN can be

attributed to the higher viscosity of the polymer solution and the smaller time required for

PLGA solidification as compared to PCL (Mao et al., 2007). It had already reported that more

rapid flux of solvent across the o/w interface stresses the precipitated polymer film and can

cause an increase of the porosity of PLGA microparticles (Wischke and Schwendeman,

2008). Besides, it suggests that the presence of PEG in the inner water phase might be

favorable to stablish strong interactions between PLGA/CH2Cl2 systems. Then, the higher

porosity of the particles containing only t-DCTN can be reasonably attributed to PEG osmotic

and porogen properties (Özdemir; Sahin, 1997; Courtois et al., 2006).

As already demonstrated by the literature a high osmotic pressure in the internal aqueous

phase of the double emulsion generates an influx of water toward the inner aqueous phase.

The occurrence of this process during particle hardening generally results in the formation of

a porous surface (Ungaro et al., 2006). This effect in porosity was less importance for



microspheres containing t-DCTN:HPβCD because the presence of the inclusion complex

might have disadvantaged the interaction of PEG with polymeric matrices.

Figure 5. Pore size distribution (PZD) of microspheres determined using the BHJ method

applied to N2 adsorption isotherms: i) PCL microspheres: t-DCTN-loaded MP (white squares)

and t-DCTN:HPβCD-loaded MP at 1:10 drug:polymer ratio (black squares); ii) PLGA

microspheres: t-DCTN-loaded MP (white circles) and t-DCTN:HPβCD-loaded MP at 1:10

drug:polymer ratio (black circles) and DCTN:HPβCD/DCTN-loaded MP at 1:5 drug:polymer

ratio (white/black circles).

The analysis of the N2 adsorption isotherm profiles using the BJH model showed that

the PCL and PLGA microspheres present from meso- (2 – 50 nm) and macro-pore (> 50 nm)

ranges according to the IUPAC classification (Figure 5). The BJH curves (incremental pore

volume vs. pore size) showed higher pore volume at meso-pore range and a decrease in the

population of mesopores smaller than ca. 50 nm for micropheres containing t-DCTN:HPβCD

inclusion complex in both polymeric matrices. As previously reported for the specific surface

area, the incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex into microspheres decreased



the pore volume. This decrease in pore volume of microspheres can be ascribed to the

modification of solvent removal rate and the longer time required for t-DCTN:HPβCD to

solidify as compared to t-DCTN (Mao et al., 2007).

3.6 Release kinectics of microparticles containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion

complex

In this paper, drug-loaded microparticles of different polymeric matrices were

prepared to evaluate the influence of t-DCTN:HPβCD inclusion complex on the drug kinetics.

The release profiles of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD from PCL and PLGA microparticles

during 6 days in phosphate buffer are illustrated in Figure 6. To understand which

mechanisms are decisive for the control of the drug release from these systems, an analytical

solution of Fick’s second law of diffusion was fitted to the experimental results.

The symbols represent the data experimentally measured and the curves represent the

fitting of mathematical modeling. The release during the first twelve hours with kinetics

model is shown in more detail in the insert. The calculated kinetic parameters of

loaded-microparticles are summarized in Table 6.

As it can be seen in Figure 6a and 6b a good agreement between theorethical and

experimental data was obtained. This indicates that the simple diffusion mechanism is

involved on the mass transport mechanism of the microparticulated systems. This fact is also

confirmed by the fitting of the t-DCTN release by square-root-of-time (t1/2) model (r ≥ 0.99).

The release rate (µg/mL) was calculated by the slope of the linear regression (Table 6).

All the microsphere formulations showed a biphasic drug release pattern characterized

by an initial burst effect followed by a slower release step with different 2k (exponencial

model) and release rate (linear model) values.



Figure 6. In vitro release of t-DCTN from microparticles: PCL (a) and PLGA (b).

t-DCTN-loaded microparticles (white squares); t-DCTN:HPβCD-loaded microparticles (black

squares) at 1:10 drug:polymer ratio and t-DCTN:HPβCD/DCTN-loaded microparticles at 1:5

drug:polymer ratio (white/black squares). Each point represents the mean of three different

experiments ± S.D. Lines represent the non-linear fitting of Fickian diffusion model.



Table 6. Calculated release parameters from PCL and PLGA microparticles containing

t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex using exponential and linear models.

Exponential model

)1(/ 21

tkt ekMM −

∞ −=

Linear model

(t1/2)

Drug:polymer

% Burst effect

(1 h)

k1 k2 Release rate

(µg/h)

t-DCTN/PCL 78.07 ± 3.86 0.378 ± 0.026 0.289 ± 0.061 77.62 ± 8.40

t-DCTN/PLGA 35.11 ± 3.31 0.660 ± 0.025 0.395 ± 0.074 146.69 ± 43.20

t-DCTN:HPβCD/PCL 76.10 ± 5.37 0.280 ± 0.025 0.105 ± 0.020 39.80 ± 11.66

t-DCTN:HPβCD/PLGA 17.27 ± 2.03 0.857 ± 0.012 0.107 ± 0.007 67.88 ± 10.19

t-DCTN:HPβCD:t-DCTN/

PLGA*

7.45 ± 0.53 0.978 ± 0.006 0.079 ± 0.009 52.79 ± 10.37

*1:5 drug:polymer ratio.

For PCL microparticles, an elevated initial burst effect (> 60%) of drug released was

found (Table 6). This was followed with a sustained release stage during a period of about 8 h

in the case of t-DCTN-loaded microparticles at 1:10 drug:polymer ratio ( 2k =0.289 and

release rate=77.62 µg/h), in comparison with 10 h in the case of t-DCTN:HPβCD-loaded

microspheres ( 2k =0.105 and release rate=39.80 µg/h). The drug release was fulfilled after

only 1 day for t-DCTN and after 3 days for t-DCTN:HPβCD.

The burst effect was probably due to the release of the drug poorly entrapped or

associated to the surface or pores of the particles that diffuse from matrix faster (Klose et al.,

2008; Ho et al., 2008; Wang et al., 2009). This significant burst effect is consistent with the

zeta potential for the drug-loaded PCL microparticles (Section 3.3), indicating the presence of

t-DCTN at the surface of microparticles modifying their surface charge. The tendency of

surface localized-drugs may be associated to its lower affinity by the polymeric matrix

(Wang et al., 2009). The elevated burst effects and fast release profiles also suggest the lower



affinity of t-DCTN by PCL systems, despite of a higher particle size and smaller porosity

(Table 5, Section 3.4).

In the case of PLGA matrix, the microparticles containing t-DCTN:HPβCD inclusion

complex at 1:10 drug:polymer ratio and t-DCTN with t-DCTN:HPβCD inclusion complex

co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio were evaluated on release kinetics. The PLGA

microparticles containing only t-DCTN presented important burst effect and faster drug

release due to the formation of a more porous structure in relation to the other systems as

demonstrated in SEM micrographs (Section 3.3) and porosity parameters (Table 5, Section

3.4). This fact was also confirmed by a faster release ( 2k =0.395 and release rate=146.69 µg/h)

compared to the non-porous DCTN-loaded PLGA microparticles obtained on our previous

study ( 2k =0.086 and release rate=90.56 µg/h) (Morais et al., 2008). At present study, 60% of

t-DCTN content was released from microspheres within one day, while the same drug

percentage was released within 3 days on previous work. Similarly, Yang et al. (2000)

observed that the porosity has an important effect on drug release characteristics and a large

number of pores may greatly increase the rate of drug release.

The complexation of t-DCTN with cyclodextrin HPβCD influenced the initial release,

sustained release stage and released total drug amount. The burst effect was drastically

reduced in PLGA-based microparticles comparate to PCL systems, when t-DCTN:HPβCD

inclusion complex was incorporated into microparticles (Table 6). After the burst step, a

gradual release stage was maintained during 26 h for only t-DCTN:HPβCD ( 2k =0.107 and

release rate=67.88 µg/h), and during 58 h for t-DCTN:HPβCD/t-DCTN ( 2k =0.079 and

release rate=52.79 µg/h), attaining a maximum drug release at 77.0 ± 7.4% and 72.4 ± 8.1%

within about 4 days, respectively. The higher encapsulation efficiency from PLGA

microparticles can be also contributed to reduce initial burst and slow down the release rate

(Wang et al., 2009).



The t-DCTN:HPβCD controlled more efficiently the drug release comparate to

t-DCTN in previous study that it had a sustained release during only 12 h (Morais et al.,

2008). Besides, the maximum drug release was increased slightly from almost 60% (Morais et

al., 2008) to 77% as used the inclusion complex, probably due to the increased hydrophilicity

of the polymer matrix in the presence of HPβCD (De Rosa et al., 2002; Trapani et al., 2003).

It had been reported that drug–CD mixtures or their complexes when incorporated into

polymeric matrices can improve hydration of the polymer matrix, promote its erosion

(Song et al., 1997; Trapani et al., 2003).

The diffusion is known to be a dominant mechanism in this type of controlled drug

delivery systems (Klose et al., 2008). Based on calculations of mathematical modeling, the

constants k2 (associated to apparent diffusion coefficients) of t-DCTN:HPβCD inclusion

complex had smaller values in relation to that t-DCTN within of different polymeric matrices

(Table 6). It indicates a smaller mobility of t-DCTN as associated to HPβCD within the

polymeric network. This fact can be attributed to both the characteristics of prepared

microparticles, as for instance the smaller porosity, as the inclusion complex-polymer

interactions that reduce effective diffusivity of parent drug as previously described

(Quaglia et al., 2003; Fernandes et al., 2007). It had been related that the drug solubility and

diffusivity can be modified when complexes of drugs with cyclodextrines are incorporated

into polymeric matrices, changing drug release profile from the polymeric device

(Bibby et al., 2000; Trapani et al, 2003).

The higher relative porosity associated to microparticles of higher size can justify the

fact of relative drug release rates were been almost independent of the system size. Other

factor that has been associated to this is “autocatalysis effect” was found to compensate the

“increased diffusion pathway length effect” already reported to non-porous PLGA-based

microparticles (Siepmann et al., 2005).



Several authors have reported that the release kinetic is also dependent on different

characteristics of the microparticles (e.g. type of polymer, surface morphology,

interconnected pores and channels) and the incorporation of additives (Poletto et al, 2007;

Garbayo et al., 2008). For instance, the presence of pores in PLGA-based microparticles

increased the mobility of the involved diffusing species and altered the contributions of the

involved physicochemical processes to the overall control of drug release (Klose et al., 2006).

The high internal porosity leads to much easier and deeper water penetration upon incubation

and shortens the diffusion time and path of the loaded drug, leading to higher burst release.

On the other hand, the co-encapsulation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD into

PLGA-based microparticles was crucial to reduce the release rate independent on porosity.

This indicates that in this case the formation of drug-cyclodextrin-polymer interactions was

most important. The interactions between polymer and drug will all potentially affect the

diffusion rates in the polymer matrix, and therefore, the drug release rate

(Wischke and Schwendeman, 2008). A similar behavior could take place also to

insulin:HPβCD inclusion complex inside PLGA system (Quaglia et al., 2003). For all batches

of the microparticles studied, the association of uncomplexed and complexed DCTN into the

same PLGA device provided the best release control for the tested conditions.

Drug release from a polymeric matrix is controlled by a variety of factors, such as the

solubility of the drug within the surrounding fluid, the size of the drug molecule and its

mobility within the swollen polymeric network, and the dissolution rate of the polymer and

polymer–drug interactions. As observed from the release kinetics change in release properties

was observed with the polymeric matrix nature, the drug form (drug or drug:cyclodextrin

inclusion complex), encapsulation manner (drug or drug:cyclodextrin inclusion complex

alone or co-encapsulated), and with microparticles characteristics as porosity and loading



under in vitro conditions. Then, the drug release can be modulating varying these determining

factors to obtain the desired kinetic profile.

3. Conclusions

The use of factorial design provided a new approach to study the influence of

formulation parameters on size properties of unloaded PCL microspheres and to optimize

these controlled delivery systems to encapsulate t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion

complex using the double emulsion/solvent evaporation method. Microparticle size and

polidispersity (span) can thus be controlled by adapting the factors aqueous phase of simple

emulsion and aqueous phase of multiple emulsion. Lower diameter and higher span values

were obtained with the increasing of the volume of the simple emulsion and decreasing of

volume of multiple emulsion. The t-DCTN was successfully encapsulated into PCL and

PLGA microspheres with a higher encapsulation efficiency and drug loading at 1:10

drug/polymer ratio. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex decreased encapsulation

efficiency, drug loading, particle size and porosity parameters (specific surface area and pore

size distribution) at 1:10 drug/polymer ratio in both polymeric matrices. The co-encapsulation

of t-DCTN:HPβCD inclusion complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio increased

encapsulation efficiency and drug loading in PLGA microspheres maintaining small values of

particle size (< 10 µm) and span (< 2.00). The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modified

physicochemical properties (encapsulation, size, zeta potential and porosity) and release

properties (burst step, sustained release stage and released total drug amount) from

microparticles. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modify the difusibility and release

rate (smaller values of k2 and release rate) in comparison with microparticles containing only

t-DCTN. These results suggest a smaller affinity of t-DCTN by PCL matrix in relation to

PLGA due its lower encapsulation, higher modification of the surface charge (zeta potential),



higher burst effect and faster release profiles independent on particle size and porosity

characteristics. The co-encapsulation of t-DCTN:HPβCD with t-DCTN plays a significant

role in the characteristics of PLGA microparticles such as the encapsulation and release rate.

From these findings novel oral formulations of PCL and PLGA microparticles containing

t-DCTN:HPβCD and/or t-DCTN were obtained to be applied in in vivo studies.

Acknowledgments

W.A.M. is grateful for a PhD scholarship from the Brazilian Council for Scientific and

Technological Development (CNPq) and the Pernambuco State Foundation for the

Advancement of Science (FACEPE). This research was supported by the CNPq

(Grant # 474071/2007-3).



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CONCLUSÕES



4 CONCLUSÕES

• A análise fatorial mostrou ser uma ferramenta eficiente no estudo da influência dos

parâmetros de formulação nas características de tamanho de partícula (dv e span),

sendo obtida uma formulação adequada para a encapsulação da t-DCTN e do

complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;

• As microesferas preparadas por análise fatorial obtiveram tamanho médio de partícula

(dv) e polidispersão (span) bastante distintos, sendo os volumes das fases aquosas da

emulsão simples e múltipla os fatores determinantes na modificação destas

propriedades físico-químicas;

• A t-DCTN foi encapsulada com êxito nas microesferas de PCL e PLGA em diferentes

razões fármaco:polímero, com o aumento da quantidade de fármaco encapsulada com

o aumento da massa do fármaco, com os melhores resultados obtidos na razão

fármaco:polímero 1:10 (PCL) e 1:5 (PLGA);

• O complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD 1:1 (razão molar) foi encapsulado

satisfatoriamente nas microesferas das duas matrizes poliméricas (PCL e PLGA) na

razão fármaco:polímero de 1:10;

• A incorporação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD nas matrizes poliméricas de

PCL e PLGA produziu microesferas homogêneas (span < 2,00), esféricas e de

superfície lisa, e ainda, com menores tamanho de partícula, percentual de fármaco

encapsulado, potencial zeta e parâmetros de porosidade (área de superfície específica e

distribuição de tamanho de poro);

• A modificação da razão fármaco:polímero de 1:10 para 1:5 aumentou

consideravelmente a quantidade de t-DCTN encapsulada na matriz de PLGA;



• A coencapsulação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD, na fase aquosa interna,

e t-DCTN, na fase orgânica da emulsão simples, na razão fármaco:polímero 1:5

(t-DCTN:PLGA) aumentou a quantidade de fármaco encapsulada, mantendo o

tamanho de partícula (9,59 ± 0,11 µm) e a polidispersão (span = 1,57) satisfatórios

para o transporte gastrointestinal, tornando-se viável para uma futura aplicação

farmacológica pela via de administração oral;

• O uso do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD, no que se refere à cinética de

liberação in vitro, modificou o perfil de liberação com o aumento do percentual de

fármaco liberado e um controle mais efetivo da velocidade de liberação (menores

valores de k2) associado ao maior caráter hidrofílico das microesferas;

• A coencapsulação de t-DCTN com t-DCTN:HPβCD reduziu o efeito burst (1,5%) e a

velocidade de liberação (k2= 0,079);

• Os resultados sugerem uma menor afinidade da t-DCTN pela matriz polimérica de

PCL quando comparado ao PLGA, devido à menor quantidade de fármaco

encapsulada, maior modificação no potencial zeta, um maior efeito burst e um perfil

de liberação mais rápido, independente do tamanho de partícula e porosidade;

• O complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades físico-químicas e

o perfil de liberação das microesferas de PCL e PLGA, quando comparadas aos

sistemas contendo somente t-DCTN;

• As microesferas contendo t-DCTN e/ou complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD

desenvolvidas neste estudo podem viabilizar uma formulação farmacêutica inovadora

para via oral com as matrizes poliméricas biodegradáveis de PCL e PLGA e, com isso,

podendo ser avaliada a sua atividade hipoglicemiante e contribuir para o avanço na

terapêutica do diabetes mellitus.



PERSPECTIVAS



5 PERSPECTIVAS

Avaliar a citotoxicidade em hepatócitos de ratos e o efeito hipoglicemiante em ratos

diabéticos das formulações de microesferas de PCL e PLGA contendo o complexo de

inclusão t-DCTN:HPβCD e comparar com o estudo prévio de t-DCTN/PLGA visando a

administração oral.



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Encapsulation and release characteristics of DCTN/PLGA microspheres

Waldenice A. Morais1, Marcilia P. Costa1, Ana Durce O. Paixão2, Maria Aparecida M.

Maciel3 and Nereide S. Santos-Magalhães1


(LIKA), Recife, PE, Brazil, 2Departamento de Farmacologia e Fisiologia, UFPE, Recife, PE,

Brazil, 3Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química,

Natal, RN, Brazil.

Abstract

In the present study, poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid microspheres containing trans-Dehydrocrotonin (DCTN) were prepared by the double emulsion method. The hypoglycemic activity of DCTN-loaded microspheres was monitored in normal glycemic mice after administration of a daily dose of DCTN (50 mg/kg body weight) for 7 days. Spherical microspheres with 3.2±0.1μm and 7.6±0.7 μm mean diameters size were observed. The encapsulation efficiency of DCTN was 85.5±3.9 %. The in vitro kinetic profile of DCTN from PLGA-microspheres was initially fast (burst effect of 19.4 % at 2 h), followed by a controlled release attaining a maximum drug released of 55.6 % within sixty hours. DCTN was able to reduce glucose levels (14.3%) of normal glycemic animals and this effect was improved by its encapsulation into microspheres (26.8%). DCTN-loaded microspheres are thus offered as a potential delivery system for the treatment of metabolic diseases characterized by hyperglycemia.

Keywords: trans-dehydrocrotonin, Croton cajucara, PLGA, microspheres,

hypoglycemic activity.



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Validation of UV spectrophotometric method for the determination of dehydrocrotonin

and application in inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin

Taciana Lima Salviano Lapenda1,Waldenice de Alencar Morais1, Maria Aparecida Medeiros Maciel2, Nereide Stela Santos-Magalhães1*


(LIKA), Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil, 2Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química, Natal, RN, Brazil.

Abstract

A simple and rapid spectrophotometric method was developed for determining trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) in bulk and pharmaceutical formulations. The method was validated for various parameters according to ICH guidelines. The t-DCTN in acetonitrile exhibited maximum absorption peak (�max) at 234 nm. Beer’s law correlating the absorbance (A) with t-DCTN concentration (C) was obeyed in the range of 1 – 20 µg mL-1. The regression equation for the standard curve was A = -0.00147 + 0.04214C with good correlation coefficient (n = 6) ≥ 0.99987. The detection and quantitation limits were found to be 0.16 and 0.48 µg mL-1, respectively. The precision of the method was satisfactory with values of relative standard deviation less than 2% for all sample analyzed. The accuracy, determined from recovery studies, was between 99.62 and 100.02%. The method showed to have specificity since HP-β-CD did not interfere in the analysis. The method was robust with change of solvent manufacturer and temperature. Statistical analysis by analysis of variance (ANOVA) and Student's t-test and F-test were performed. The proposed method was successfully applied to quantify the t-DCTN inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) obtained in solid state by freeze-drying. The complexed t-DCTN content was 99.78 ± 0.71%. The method was practical and can be suitably to be used in the routine analysis. Keywords: trans-Dehydrocrotonin; Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Inclusion complex; UV

Spectrophotometry; Validation.



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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO ......inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades de liberação das microesferas, produzindo menores velocidades de difusão k 2 de