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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
RAYANNE CRISTINA LIMA DA SILVA
INFLUÊNCIA DA COBERTURA DE QUITOSANA NA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA EM QUEIJO COALHO COMERCIALIZADO NA CIDADE
DE VITÓRIA DE SANTO ANTÃO - PE
Vitória de Santo Antão
2017
RAYANNE CRISTINA LIMA DA SILVA
INFLUÊNCIA DA COBERTURA DE QUITOSANA NA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA EM QUEIJO COALHO COMERCIALIZADO NA CIDADE DE
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO - PE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Colegiado do Curso de Graduação em Nutrição do Centro Acadêmico de Vitória da Universidade Federal de Pernambuco em cumprimento a requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Nutrição, sob orientação da Professora Dra Roberta Bento; e coorientação de Diogo da Fonte.
Vitória de Santo Antão
2017
Catalogação na fonte Sistema de Bibliotecas da UFPE – Biblioteca Setorial do CAV
Bibliotecária Ana Ligia F. dos Santos – CRB-4/2005
S586i Silva, Rayanne Cristina Lima da.
Influência da cobertura de quitosana na qualidade microbiológica em
queijo coalho comercializado na cidade de Vitória de Santo Antão - PE./
Rayanne Cristina Lima da Silva. - Vitória de Santo Antão, 2017.
34 folhas: il.
Orientadora: Roberta Bento.
Coorientador: Diogo da Fonte.
TCC (Graduação)– Universidade Federal de Pernambuco, CAV, Bacharelado
em Nutrição, 2017.
Inclui referências.
1.Quitosana. 2. Conservação de Alimentos. 3. Qualidade dos Alimentos. I.
Bento, Roberta (Orientadora). II. Fonte, Diogo da (Coorientador). III. Título.
664.028 CDD (23.ed.) BIBCAV/UFPE-083/2017
RAYANNE CRISTINA LIMA DA SILVA
INFLUÊNCIA DA COBERTURA DE QUITOSANA NA QUALIDADE
MICROBIOLÓGICA EM QUEIJO COALHO COMERCIALIZADO NA CIDADE DE VITÓRIA DE SANTO ANTÃO – PE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Colegiado do Curso de Graduação em Nutrição do
Centro Acadêmico de Vitória da Universidade Federal
de Pernambuco em cumprimento a requisito parcial
para obtenção do grau de Bacharel em Nutrição
Aprovado em: 13/01/2017.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Dra. Cybelle Rolin de Lima
Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Mª Dayane de Melo Barros
Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Dra. Roberta Albuquerque Bento da Fonte
Universidade Federal de Pernambuco
Dedico este trabalho a todos os meus
familiares, principalmente aos mais
próximos, visto que é fonte de orgulho para
meus avós, que não são alfabetizados e tem
a segunda neta concluindo a graduação.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me iluminar desde a escolha do curso até o término, pois “até
aqui nos ajudou o Senhor” (I Samuel 7:12) . Pelo qual sou completamente
dependente.
Aos meus pais que me fizeram amar os estudos desde pequena, me ajudaram nos
momentos mais difíceis.
Aos meus avós pelas palavras de conforto e as orações fiéis.
A minha irmã mais velha que se fez presente quando mais precisei.
A meus líderes espirituais que estiveram sempre me dando incentivos a continuar.
A meus irmãos em Cristo que sempre me deram apoio.
A minhas amigas de universidade, principalmente Patrícia Arcanjo, Cathleen Rocha,
Jardilene Andrade, Wêdja Luana.
A minhas amigas Jéssica Priscila, Raylla Sandely, Ingreth Kamila, Sandra Helena e
Jamille Sheila.
A Dayane Melo por sua paciência no laboratório e por sua amizade.
A Silvio por seu apoio no laboratório.
A minha orientadora pela paciência e apoio.
Ao meu co-orientador Diogo pelo apoio.
Ora, àquele que é poderoso para fazer infinitamente mais do que tudo quanto pedimos ou pensamos, conforme o seu poder que opera em nós, a ele seja a glória,
na igreja e em Cristo Jesus, por todas as gerações, para todo o sempre. Amém! (Efésios 3: 20 e 21).
RESUMO
A produção de queijo coalho compõe uma importante atividade econômica tanto para a indústria de laticínios, como para a agricultura familiar, entretanto, a produção, manipulação e armazenamento inadequado, podem provocar à presença de microrganismos indesejáveis que são um risco à saúde do consumidor. Neste contexto surge a quitosana, conservante comestível natural que pode ser aplicado na forma de cobertura nos alimentos prontos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicação da quitosana como cobertura comestível na qualidade microbiológica do queijo de coalho comercializado na cidade de Vitória de Santo Antão –PE. As análises foram realizadas na Universidade Federal de Pernambuco – Centro Acadêmico de Vitória, no Laboratório de Microbiologia dos Alimentos. Os queijos para análise foram adquiridos em supermercados da cidade de Vitória de Santo Antão - PE, tendo como critério de inclusão apenas aqueles que foram realizadas a pasteurização do leite e a embalagem a vácuo. Os queijos foram categorizados em A, B e C. Os géis de quitosana a 1,5 e 2% foram preparados por dissolução do pó de quitosana em ácido acético. Cubos de queijo coalho, com 25g foram individualmente mergulhados nos géis de quitosana, sendo posteriormente armazenados em condições de refrigeração a 12º C. Foram realizadas análises de coliformes a 45°C, Staphyloccocus coagulase positiva/g, Salmonella p/25g e Listeria monocytogenes p/25g. Tratando-se da presença de coliformes, apenas o queijo C (amostra controle) encontrou-se fora da legislação vigente, entretanto, a aplicação da quitosana foi eficaz para reduzir o microrganismo ao nível tolerável pela legislação. Todas as amostras controle apresentaram contagens elevadas de Staphylococcus, acima do permitido, sendo na concentração de 1,5% apenas a amostra B, e a 2% todas as amostras dentro da legislação. Foram ausentes os resultados de Staphylococcus coagulase positiva/g, Salmonella p/25g e Listeria monocytogenes p/25g para todas as amostras. Com isso, pode-se concluir que os queijos comercializados em Vitória de Santo Antão – PE encontram-se sem qualidade e fora da legislação vigente, entretanto, o uso do gel de quitosana foi bastante eficaz no controle e inibição dos microrganismos patogênicos, servindo como uma alternativa natural para inclusão no produto pronto, diminuindo assim os riscos de contaminação ao consumidor. Palavras - chave: controle de qualidade de alimentos. Análises. Microrganismos. Contaminação de alimentos.
ABSTRACT
The production of cheese curds composes an important economic activity for both the dairy industry and for family agriculture, however, the production, handling and inadequate storage, can lead to the presence of undesirable microorganisms that are a risk to consumer health. In this context arises the chitosan, edible natural preservative that can be applied in the form of coverage in ready-to-eat foods. Thus, the objective of this work was to evaluate the application of chitosan as edible in microbiological quality coverage of rennet cheese sold in the city of Vitória de Santo Antão - PE. The analyses were carried out at the Federal University of Pernambuco – Academic Center for Victory, in the laboratory of Food Microbiology. The cheeses for analysis were purchased in supermarkets in the city of Vitória de Santo Antão, PE, with inclusion criteria, only those which were held milk pasteurization and vacuum packing. The cheeses were categorized into A, B and c. The chitosan gels at 1.5 and 2% were prepared by dissolution of chitosan in acetic acid powder. Rennet cheese cubes, with 25 g have been individually dipped in chitosan gels, later being stored in cooling conditions 12 C. Coliform analyses were carried out to 45° C, coagulase positive/g Staphyloccocus, Salmonella and Listeria monocytogenes/25 g p p/25 g. In the case of the presence of coliforms, just the cheese C (control sample) found outside of the current legislation, however, the application of chitosan was effective to reduce the micro-organism at the level tolerable by the legislation. All control samples showed high counts of Staphylococcus, above the permitted, being at a concentration of 1.5% only the sample B, and 2% all the samples within the legislation. Missing were the results of coagulase positive Staphylococcus/g, Salmonella and Listeria monocytogenes/25 g p p/25 g for all samples. With this, we can conclude that the cheeses marketed in Vitória de Santo Antão -PE are without quality and out of existing legislation, however, the use of chitosan gel was quite effective in the control and inhibition of pathogenic microorganisms, serving as a natural alternative to the ready product, thereby reducing the risk of contamination to the consumer.
Keywords: Food quality control. Analyses. Micro-organisms. Food contamination.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 –Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em Vitória de
Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana- Queijo A. 24
Quadro 2- Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em Vitória de
Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana - Queijo B. 25
Quadro 3- Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em Vitória de
Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana - Queijo C. 26
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 13
3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 14
4 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 15
5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 19
5.1 Seleção da amostra de queijo coalho e adição de quitosana ....................... 19
5.2 Elaboração do gel de quitosana e imersão dos cubos de queijo coalho ..... 19
5.3 Análises microbiológicas ................................................................................. 20
5.3.1 Coliformes termotolerantes 45ºC...................................................................... 20
5.3.2 Salmonella 35ºC ............................................................................................... 21
5.3.3 Staphylococcus coagulase positiva/g ............................................................... 22
5.3.4 Listeriamonocytogenes ..................................................................................... 23
6 RESULTADOS ....................................................................................................... 24
7 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 27
8 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 30
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 31
11
1 INTRODUÇÃO
O queijo é uma das preparações mais antigas de que se tem registro,
acredita-se que tenha emergido por volta de 11.000 a.C. (SEBRAE, 2008). É um
alimento elaborado e consumido em todo Brasil, tendo muitas vezes a sua
identidade intimamente relacionada às regiões do nosso país (MENEZES, 2011).
A composição do queijo é modificada de acordo com o tempo de
maturação e constituição do leite utilizado, além de poder revelar diversos sabores e
texturas, encontrando-se assim uma grande multiplicidade de tipos (SILVINO et. al.,
2010). Apresentam uma composição nutricional rica em proteínas de alto valor
biológico, cálcio, fósforo, zinco, iodo, selênio, vitaminas e oligoelementos (FREITAS
et al., 2009).
O queijo de coalho é adquirido por coagulação do leite através do coalho ou
enzimas coagulantes específicas, bactérias láticas podem ser adicionadas e este
deve ser comercializado normalmente com até dez dias de produção. É um queijo
classificado entre média e alta umidade, de massa semi-cozida ou cozida e
apresenta uma proporção de gordura nos sólidos totais variável entre 35% e 60%
(BRASIL, 2001). Este deve ser acondicionado numa embalagem
bromatologicamente apta, com ou sem vácuo. Suas condições de conservação e
comercialização segundo a legislação vigente deverão manter-se a uma temperatura
que não seja superior a 12ºC (IIIV Anexo da Instrução Normativa nº 30, de 26 de
junho de 2001), sendo normalmente comercializado com até dez dias de fabricação
(BRASIL, 2001), tendo uma vida de prateleira muito curta, precisando do emprego
de recursos tecnológicos que preservem a qualidade do produto e possam estender
o seu prazo de validade (PAGANI et al., 2012).
A produção de queijo coalho compõe uma importante atividade econômica
para indústria de laticínios, além de ter uma destacada participação como fonte de
renda para a agricultura familiar (LIMA, 2010). Dependendo da qualidade higiênica
sanitária do processo de fermentação empregado para obtenção do queijo coalho, a
microbiota do produto final será adequada e desejável. A presença de
microrganismos desejáveis otimiza as características organolépticas do queijo
coalho. No entanto a presença de microrganismos indesejáveis interfere na
12
qualidade do produto e indicam erros em seu processamento (FREITAS et al.,
2009).
A fim de evitar o aparecimento de microrganismos indesejáveis em queijos de
coalho é importante que sejam aplicadas técnicas de conservação microbiológica.
Revestimentos comestíveis tem sido uma alternativa utilizada pelas indústrias para
incluir conservantes nos alimentos. Esse tipo de tecnologia se trata de uma emulsão
que deve sobrepor na superfície do alimento, onde após a secagem, constitui uma
fina película sobre o produto, o qual não causa riscos a saúde do consumidor, pois
não são metabolizados pelo mesmo, passando de maneira inofensiva pelo trato
gastrointestinal (PAGANI et al., 2012).Neste contexto surge a quitosana, um
polímero atóxico e antibactericida, com possibilidade de uso em gel como
revestimento comestível,e coadjuvante no controle higiênico sanitário (ALMEIDA et
al., 2015).
A quitosana é adquirida por meio da desacetilação da quitina que é o maior
componente de exoesqueletos dos crustáceos e de outros animais marinhos. Quitina
e quitosana têm suas propriedades pesquisadas em aplicações industriais e
tecnológicas há mais de setenta anos (ALMEIDA et al., 2015). Seu emprego como
cobertura comestível e protetora em frutas inteiras ou minimamente processadas, é
um bom exemplo de sua aplicação (ASSIS e BRITTO, 2014); assim como
revestimento de filés de salmão congelado e alho minimamente processado
(SOARES et al.,2009); para conservação de sucos (BARBOSA, 2011); como
envoltório de filés de pargo armazenados sob congelamento (NUNES,
2014);adicionada a patês de carne (BENTO et al., 2011);hambúrgueres adicionados
de quitosana (GALINDO, et al., 2011); e quitosana em queijo coalho (MACHADO,
2016; OLIVEIRA, 2015).
A utilização da quitosana é importante para a indústria e para a preservação
ambiental, visto que pode ser gerada a partir dos resíduos da indústria pesqueira
(ALMEIDA et al., 2015). Porém outras formas de obter a quitosana foram
anteriormente pesquisadas e se mostram bastantes promissoras em questão de
rendimentos e preservação do meio ambiente, como a desacetilação de quitina
através de fungos (BENTO, 2011). Dessa forma, a quitosana mostra-se muito eficaz
no controle e/ou inibição de microrganismos patogênicos e deterioradores, o que
pode a definir como uma tecnologia inovadora (BENTO, 2009), aqui utilizada como
cobertura em queijos coalhos já produzidos.
13
2 OBJETIVOS
Geral:
Avaliar a qualidade microbiológica do queijo de coalho, comercializado na cidade de
Vitória de Santo Antão – PE, adicionado de quitosana em cobertura
Específicos:
Avaliar a qualidade microbiológica dos queijos comercializados;
Analisar a ação da quitosana em inibir e/ou eliminar Listeriamonocytogenes,
Staphylococcus aureus; Salmonella entérica e coliformes termotolerantes.
Coletar amostras de queijo coalho comercializados em Vitória de Santo Antão
- PE;
Avaliar a efetividade de diferentes concentrações de cobertura de quitosana
em queijos coalhos em inibir as cepas dos microrganismos.
14
3 JUSTIFICATIVA
É de suma importância garantir ao consumidor um alimento seguro
microbiologicamente e proporcionar a indústria e ao consumidor um produto com um
tempo maior de vida de prateleira, com boa qualidade, sem perder suas
características nutritivas. Diante disso, a quitosana como cobertura vai garantir a
segurança microbiológica do queijo coalho e sua maior vida de prateleira, sem que
perca suas características nutritivas e sua qualidade. Tendo em vista o aumento do
consumo de queijo na atualidade, é importante/relevante a avaliação da efetividade
da quitosana neste alimento na inibição do crescimento microbiano.
15
4 REVISÃO DA LITERATURA
O queijo é uma forma de preservar o leite, pois suas propriedades nutritivas
não se perdem, além de ser recomendado em dietas alimentares por ter alta
digestibilidade. Este derivado lácteo é significativo nos costumes da população
brasileira, tornando-se intrínseco a cultura nacional. (APOLINÁRIO et al., 2014).
Segundo a FIESP (Federação das Indústrias do Estado de São Paulo), os
cidadãos do Brasil desejam alimentos que possam refletir qualidade de vida. E os
queijos fazem parte desses alimentos (24%) (SOUZA et al., 2014).
Porém, as condições de fabricação, conservação e comercialização podem
interferir em suas características sensoriais, assim como impossibilitá-lo de ser
consumido devido à presença de microrganismos patogênicos (COSTA et al.,
2012). O conhecimento do leite simboliza o direcionamento correto referente ao
aprimoramento da qualidade e a expansão do produto no mercado (FREITAS et al.,
2013).
A elaboração do queijo de coalho, significativa econômica e socialmente, é
geralmente realizada por pequenos produtores, que frequentemente utilizam leite
cru, sem os princípios básicos de higiene ou indústrias que não exercem as Boas
Práticas de Fabricação (BPF) (COSTA et al., 2012).
As propriedades da matéria prima associadas ao método de produção do
queijo coalho, que geralmente não utilizam as BPF, transformam o alimento
favorável ao crescimento de microrganismos patogênicos, expondo o indivíduo às
doenças veiculadas por alimentos. Esse fato pode mudar se a tecnologia for
propagada não apenas na escala industrial, mas também ao nível dos pequenos
produtores (DANTAS, 2012).
Para evitar contaminações durante a produção do queijo, deve-se ter
precaução desde a ordenha, pasteurização do leite, além de utilizar as BPF e
conservação adequada até o consumidor final. São indispensáveis à elaboração de
produtos de qualidade, as BPF, além de procedimentos de sanitização. A
pasteurização é um método empregado ao leite cru antes da produção do queijo,
que minimiza aos microrganismos presentes no leite, mas as toxinas, como a
enterotoxina estafilocócica, não são controladas por esse processo o que podem ser
causa de intoxicações alimentares (APOLINÁRIO et al., 2014).
16
O queijo é uma importante fonte de nutrientes ao ser humano, porém, suas
características nutritivas também o tornam suscetível ao desenvolvimento de
microrganismos, patogênicos, indicadores e deterioradores, como por exemplo:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes
bactérias mesófilas aeróbicas, bolores e leveduras(OLIVEIRA et al., 2010;FREITAS,
2015).
A propagação de microrganismos em derivados lácteos deve ser ressaltada
em relação a duas bactérias patogênicas, que são Salmonella e Staphylococcus,
onde a primeira aparece viva nos alimentos e a segunda a presença da bactéria no
alimento indica a produção de sua toxina (FREITAS, 2015). Outro patógeno que
pode ser encontrado em queijos é a Listeria spp., esta pode ocasionar desde febre,
náusea, vômitos, dores, diarréia até comprometimento do sistema nervoso central,
como meningite e encefalite (APOLINÁRIO et al., 2014).
Segundo DANTAS (2012), os coliformes termotolerantes são denominados
microrganismos indicadores, pois a sua presença assinala contaminações de origem
fecal. Este grupo de microrganismos também está relacionado à deterioração de
queijos, causador das denominadas olhaduras, pequenos orifícios, e que pode
ocasionar o intumescimento do produto.
O aparecimento de coliformes nos queijos está associado à qualidade do
leite, visto que a presença de microrganismos causa modificação nesta matéria-
prima, desde a degradação de gorduras até torná-lo impróprio ao consumo, sendo
provável a contaminação em qualquer etapa do processamento do queijo (FREITAS,
2015).
A contaminação em queijo coalho pode ser evidenciada em diversas
pesquisas com bactérias do grupo coliformes e Staphylococcus aureus. Essa
contaminação pode estar relacionada às condições de higiene dos manipuladores,
dos utensílios e locais de elaboração do produto (FREITAS et al., 2013).
Algumas pesquisas também têm relatado o aparecimento da Salmonella em
queijo coalho. Porém é um microrganismo que se mantém viável no produto por um
longo período, o que evidencia a importância do controle de qualidade
microbiológica do produto (FEITOSA et al., 2003).
Segundo SILVA et al., 2010, a Resolução RDC 12/20014 a tolerância
máxima de 500NMP/g de coliformes termotolerantes, 500UFC/g de S. coagulase
positiva, ausência de Listeria monocytogenes e Salmonella spp.
17
Apesar da grande popularidade do queijo de coalho na região Nordeste e sua
relevância econômica, o processamento do queijo não conta com a tecnologia
necessária para o aperfeiçoamento de sua qualidade (OLIVEIRA et al., 2010).
Os revestimentos comestíveis têm a finalidade de estender o tempo de
conservação, além de permitir uma melhor versatilidade de manuseio e
comercialização do produto. Não podem ser tóxicos, visto que serão ingeridos com o
produto protegido e podem ser removidos com água. Estes revestimentos são
compostos por materiais que se caracterizam por sua diversidade estrutural e
funcional, sendo classificados como: polissacarídeos, lipídios e proteínas. Os
polissacarídeos têm boa resistência às trocas gasosas, danos mecânicos,
preservação da integridade da parede celular, retenção de vitamina C, barreira à
incorporação de solutos, além de características fungicidas e fungiestáticas, são
exemplos desses materiais, a quitosana e a fécula de mandioca. Os lipídios
participam na redução da perda de massa e no prolongamento do tempo de
armazenamento. E as proteínas proporcionam a manutenção sensorial, as
propriedades físico-químicas e a diminuição do escurecimento enzimático, como por
exemplo, a gelatina. (XAVIER et al., 2014).
Portanto, as coberturas a base de polissacarídeos são enfatizadas, pois
apresentam uma boa barreira contra o oxigênio e outros gases, o que possibilita a
formação de uma atmosfera modificada dentro da embalagem, prolongamento da
vida de prateleira do alimento, impedindo a oxidação de lipídeos e o
desenvolvimento do sabor de ranço (SERNA, 2015).
O polissacarídeo mais distribuído na natureza é a quitosana, esta pode ser
encontrada em animais invertebrados e na parede celular de fungos.Sua produção e
aplicação industrial tiveram início em 1970. A quitosana é utilizada pela indústria
alimentícia por ser uma fibra natural solúvel em meio ácido, além das enzimas que
fazem parte do processo de hidrólise desta estarem presentes em organismos
biológicos (BENTO et al., 2009).
Atualmente, o maior isolamento industrial da quitosana tem sido a partir do
exoesqueleto de crustáceos, como o camarão (ALMEIDA et al., 2015). Todavia uma
alternativa de desacetilação tem sido utilizada, tendo como fonte os fungos da
Ordem Mucorales, incluindo Rhizopusoligosporus, R. arrhizus,
Cunninghamellaelegans e Mucorroxxi e que geraram grandes rendimentos para a
produção de quitosana (BENTO et al., 2009).
18
Assim as embalagens, os filmes e as coberturas biodegradáveis devem
proteger o produto contra danos mecânicos e físicos; preservar de contaminação
microbiana, mudanças químicas e bioquímicas durante sua vida útil; formar uma
barreira contra os gases, lipídeos ou vapor de água para preservar o produto em sua
vida de prateleira; servir como meio de comunicação, criando um impacto visual no
consumidor (SERNA, 2015).
19
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Seleção da amostra de queijo coalho e adição de quitosana
Esta pesquisa é determinada como experimental, laboratorial, discriminativa e
quantitativa. Para a realização da mesma foi feita a aquisição de queijo de coalho
comercializado com até dez dias da data de fabricação como preconiza a legislação
nº 30 de 26 de maio de 2001 (BRASIL, 2001). Foi realizada a aquisição de três tipos
de queijos de coalho de supermercados diferentes do município de Vitória de Santo
Antão (queijo A, B e C), tendo como critério de inclusão para a compra do queijo a
pasteurização do leite e a embalagem a vácuo do produto final. Todos os queijos
adquiridos foram levados ao laboratório de Microbiologia dos Alimentos da
Universidade Federal de Pernambuco, Centro Acadêmico de Vitória, onde houve
todas as análises.
5.2 Elaboração do gel de quitosana e imersão dos cubos de queijo coalho
A quitosana é obtida através da desacetilação da quitina, maior constituinte
do exoesqueleto de crustáceos, como o camarão (ALMEIDA et al., 2015). Para
efetuação da pesquisa foi adquirida quitosana através da empresa Aldrich® (Alto de
Pinheiros, São Paulo, SP, Brasil), de massa molar (MW) = 340.000g/mol, GD=
>75%.
Os géis de quitosana a 1,5 e 2% foram preparados por dissolução do pó de
quitosana em ácido acético a 1%, mantidos sob agitação moderada em agitador
magnético (TECNAL) durante 24 a 48 horas em temperatura ambiente, até a total
dissolução do pó e obtenção do gel homogêneo. Posteriormente a quitosana foi
transportada para recipientes de vidro estéreis com tampa e mantida em
refrigeração a 4º C.
A embalagem dos queijos foram higienizadas com detergente neutro e álcool
a 70%, para evitar uma possível contaminação cruzada (DIAS, et al., 2015). Cubos
de queijo coalho, com 25g foram individualmente mergulhados nos géis de
quitosana com ajuda de um suporte metálico, sendo após escoamento do excesso
20
de gel as amostras assepticamente transferidas para recipientes de vidros estéreis
com tampa plástica, e armazenadas em condições de refrigeração a 4º C.
5.3 Análises microbiológicas
Para indicação da análise microbiologia foi realizada de acordo com a
resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001, a qual preconiza a determinação de
coliformes a 45°C, Staphyloccocus coagulase positiva/g, Salmonella p/25g e Listeria
monocytogenes p/25g para o queijo de coalho. De cada amostra de queijo (controle,
quitosana como cobertura em duas concentrações diferentes, uma de 1,5% e outra
de 2%) retirou-se 25g para cada análise com microrganismo diferente.
5.3.1 Coliformes termotolerantes 45ºC
Para a análise de coliformes termotolerantes foi necessário o preparo de três
meios de cultura: Caldo lactosado, Verde Brilhante e Caldo EC. Todos foram
devidamente pesados em balança analítica, homogeneizados em água destilada e
inoculados 10mL em cada tubo. Para cada meio, foram separados 27 tubos de
ensaio e adicionados tubos de Durhan, dentro, estes posicionados para baixo.
Também foram necessários dois tubos com 10 mL de água destilada. Em seguida
todos os tubos foram tamponados e levados a autoclave para esterilização. Além
disso, foram esterilizados três erlenmeyers com água destilada para a pesquisa de
Staphylococcus e coliformes termotolerantes, visto que a mesma amostra é utilizada
para analisar os dois microrganismos, pois em sua primeira etapa seus meios são
inespecíficos, ambos usam água destilada, portanto do mesmo erlenmeyer pode ser
retiradas amostras para microrganismos diferentes (BRASIL, 2003).
Amostra e diluente foram homogeneizados, adquirindo assim a primeira
diluição, seguida de três diluições, com 1mL para cada tubo com meio caldo
lactosado, com incubação à 35 ± 1ºC por 24/48h, este é chamado teste presuntivo
(FREITAS et al., 2009).
Após o período de incubação, todos os tubos foram vistoriados e os que
apresentarem turbidez e formação de gás passaram para a próxima etapa, que foi
realizado o teste confirmativo para coliformes totais. Esta etapa cada 1mL de cada
21
tubo com gás foi transferido para um tubo com o meio Verde Brilhante a 2%, o qual
foi incubado a 35 ± 1ºC por 24h. Em seguida, passadas as vinte e quatro horas, os
tubos que formaram gás no meio verde brilhante foram visualizados os resultados e
devidamente anotados, então 1mL do meio caldo lactosado dos tubos
correspondentes passaram para os tubos com o meio EC para confirmação de
coliformes termotolerantes. Sempre atentando para que não fosse passado o 1mL
do meio verde brilhante para o meio EC (DIAS, et al., 2015). Havia na totalidade dos
tubos, tubos de Durhan para analisar a produção de gás. Foi utilizada a técnica de
Número Mais Provável (NMP) para os tubos que fossem considerados positivos na
produção de gás, então eram registrados como coliformes fecais (FREITAS et al.,
2009).
5.3.2 Salmonella 35ºC
Para a procura de Salmonella sp. a amostra de 25g foi diluída em 225ml de
água peptonada a 1%, homogeneizada por 60 segundos aproximadamente. Após
uma hora em temperatura ambiente e em seguida incubada a 36ºC por 24horas.
Todo esse procedimento é considerado o pré-enriquecimento da amostra (BRASIL,
2003).
Após esse período foi inoculada 1 mL da amostra pré-enriquecida em tubos
de ensaio contendo 10mL dos meios Caldo Tetrationato e Caldo Selenito Cistina e
incubados a temperatura de 42ºC, em banho Maria, preferencialmente com agitação
ou circulação contínua de água, por 24hrs (DANTAS, 2012).
A partir dos caldos seletivos de enriquecimento, repicou-se sobre a superfície
previamente seca de placas de Petri contendo 25mL dos meios Ágar Bismuto
Sulfito, Ágar Hektoen e Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD), estriando de forma a
obter colônias isoladas. Foram incubadas todas as placas de Petri, invertidas, a
36ºC por 18 a 24hrs (BRASIL, 2003).
Após esse período as placas foram examinadas e observou-se a formação de
colônias típicas e atípicas que podiam ser Salmonella e marcá-las no fundo da
placa. As características das colônias típicas ou suspeitas desse microrganismo nos
diferentes meios sólidos são: colônias rosadas com centro negro no Ágar XLD;
colônias azuis ou verdes azuladas com ou sem o centro negro no Ágar Hektoen; e
22
colônias marrons com brilho metálico no Ágar Bismuto Sulfito. Se essas colônias
forem detectadas, 3 a 10 destas devem ser selecionadas por amostra e repicadas
em meio não seletivo como TSA, e incubar a 36ºC por 18 a 24hrs, a fim de verificar
sua pureza. Em seguida provas bioquímicas devem ser feitas a fim de confirmar a
presença de Salmonella na amostra: TSI, Uréia, Citrato, Motilidade e Lisina
(BRASIL, 2003).
Depois deve-se emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as
culturas selecionadas apresentarem relações típicas nas provas bioquímicas. O
resultado foi expresso em pesquisa de Salmonella sp.: ausência/25g ou
presença/25g.
5.3.3 Staphylococcus coagulase positiva/g
Antes de dar início ao experimento os meios de cultura foram preparados, no
caso do Staphylococcus aureus, o Ágar Baird Parker foi adicionado a água destilada
e então levado a autoclave para esterilizar. Após esse período de esterilização, foi
adicionado ao meio de cultura gema de ovo e telurito de potássio antes do
plaqueamento. Em seguida foram preparados dois tubos de ensaio com água
destilada para a diluição da amostra advinda dos erlenmeyers que foram utilizados
para a análise de coliformes termotolerantes, visto que utilizaram o mesmo diluente
(BRASIL, 2003).
A amostra de queijo foi homogeneizada com água destilada esta é a primeira
diluição seguida de duas diluições, com 1mL para cada tubo com água destilada.
Em seguida transferiu-se 100 µL para a placa contendo ágar Baird Parker
(Himedia®) o qual continha solução de gema de ovo com telúrio (Himedia®), as
quais foram incubadas a 35ºC por 48h. Logo após realizou-se a contagem
presuntiva do número de colônias. A presença ou ausência foi confirmada pela
prova de coagulase positiva (SANTANA et al., 2008).
Para a realização da prova de coagulase positiva foi necessário o preparo do
meio BHI (Brain Heart Infusion), adicionou-se a água destilada e inoculado em
eppendorfs e foi conduzido a esterilização em autoclave. No mesmo dia foi
adicionada uma colônia de Staphylococcus, com o auxílio da alça de platina, em um
eppendorf de cada amostra e diluição, em seguida foi incubado a 35ºC por 24hrs.
23
Passado esse período foi inoculado 3mL de solução salina ao plasma de coelho e
esta solução final deve ser inoculada 300 µL por eppendorf e incubou-se a 35ºC por
24h. Com a finalidade de observar o coágulo na presença do microrganismo, pois
haveria a transformação de fibrinogênio em fibrina (SILVA, 2008).
5.3.4 Listeriamonocytogenes
Para a pesquisa de Listeriamonocytogenes foi iníciada com o preparo do
caldo Fraser adicionando-o a água destilada e citrato férrico a 5%, em seguida o
meio foi esterilizado em três erlenmeyers um para cada amostra. Também foi
preparado caldo Fraser sem citrato férrico para a segunda etapa da pesquisa deste
microrganismo e incubado em três tubos de ensaio ao menos para cada amostra de
acordo com as diluições desejadas; este caldo Fraser foi esterilizado em autoclave
similarmente ao antecedente. Além desses meios, se fez necessário o preparo do
meio Oxford onde as colônias poderão ser visualizadas e contadas se presentes;
para sua realização foi preciso água destilada, o meio Ágar Oxford e suplemento
seletivo de Listeria, que também foram autoclavados, antes do plaqueamento
(BRASIL, 2003).
Para o início do experimento foi realizada a adição da amostra de queijo em
caldo frazer, que em seguida foi incubada a 30ºC por 24h. Após esse período, foi
transferido 1mL para cada tubo com 10mL de caldo fraser, foram incubados os tubos
a 30ºC por 24 a 48h. Em seguida utilizando alça de platina, o caldo Fraser dos tubos
foi repicado para as placas contendo Ágar Oxford suplementado, as quais foram
incubadas a 30ºC por 24h. Logo após realizou-se a contagem presuntiva do número
de colônias, quando presentes (APOLINÁRIO et al., 2014).
24
6 RESULTADOS
No quadro 1 é possível verificar que o queijo A, teve como resultados de
coliformes termotolerantes 1,5 x 10¹de acordo com o NMP (Número Mais Provável)
ou 42UFC/g ou mL para a amostra controle; 1,1 x 10-¹ NMP ou 38 UFC/g ou mL
para a amostra com 1,5% de quitosana como cobertura; e a cobertura de quitosana
2% não obteve resultado significativo de coliformes, por ter um NMP <3, que
confirma a ausência de coliformes termotolerantes em todos os tubos (BRASIL,
2003). Todas as amostras apresentaram coliformes termotolerantes de acordo com
a legislação vigente.
Os resultados para Staphylococcus foram na 104, na triplicata do queijo
controle. Na amostra com 1,5% de cobertura de quitosana, os resultados também se
concentraram na 104 nas triplicatas, demonstrando que não houve alteração
significativa na mudança da concentração, ficando as amostras (Controle e 1,5%)
fora da legislação vigente. Entretanto, na amostra com cobertura a 2% de quitosana,
o resultado foi satisfatório, pois não apresentou crescimento significativo do
microrganismo.
Ao realizar o teste de Staphylococcus coagulase positivo, com as colônias
encontradas, este foi negativo, confirmando que os Staphylococcus encontrados não
são do tipo aureus. As amostras controle e cobertura de quitosana a 1,5% e 2%
todas obtiveram como resultados ausentes de Salmonella e Listeria.
Quadro 1 - Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em
Vitória de Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana.
Queijo A
Amostras Controle Cobertura 1,5%
Cobertura 2%
RDC 12
Coliformes termotolerantes
NMP 1,5 x 10-¹ ou 42 UF C/g ou mL
NMP 1,1x10-¹ ou 38 UFC/g ou mL
<3 ou 9,5 UFC/g ou mL
5x10²UFC/g
Staphylococcus UFC/g
1,42 x104
6,16x104 4 x104
- 5x10²UFC/g
Staphylococcus coagulase positivo
Negativo Negativo - Negativo
Listeria Ausência Ausência Ausência Ausência
25
monocitogenes
Salmonella Ausência Ausência Ausência Ausência Fonte: SILVA, RAYANNE C. L. DA, 2017.
No quadro 2 pode-se observar que queijo B analisado apresentou valores
abaixo de 3 de NMP para todas as amostras de coliformes termotolerantes, sem
variações, estando dentro da legislação vigente.Os resultados para Staphylococcus
foram 104 diluição para as triplicatas da amostra controle, e as amostras com 1,5% e
2% de cobertura de quitosana não apresentaram crescimento do microrganismo.
Dessa forma, apenas a amostra controle encontrou-se divergente da legislação,
demonstrando a eficácia da quitosana. Quando feito o teste de Staphylococcus
coagulase positivo este foi obtido o resultado negativo, confirmando que os
Staphylococcus encontrados não são aureus.
Quadro 2. Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em Vitória
de Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana.
Queijo B
Amostras Controle Cobertura 1,5%
Cobertura 2%
RDC 12
Coliformes termotolerantes
NMP <3 ou 9,5 UFC/g ou mL
NMP <3 ou 9,5 UFC/g ou mL
NMP <3 ou 9,5 UFC/g ou mL
5x10²UFC/g
Staphylococcus UFC/g
1,96x104 2,63 x104 - - 5x10²UFC/g
Staphylococcus coagulase positivo
Negativo - - Negativo
Listeria Monocytogenes
Ausência Ausência Ausência Ausência
Salmonella Ausência Ausência Ausência Ausência Fonte: SILVA, RAYANNE C. L. DA ,2017
No quadro 3 é possível verificar que o queijo C, teve como resultados de
coliformes termotolerantes 1,1x 10³ de acordo com o NMP (Número Mais Provável)
para a amostra controle; 2,9 x 10² para a amostra com 1,5% de quitosana como
cobertura; e a 2% de cobertura de quitosana 2,1 x 10² (BRASIL, 2003). Portanto,
apenas a amostra controle encontrava-se fora da legislação, confirmando a eficácia
da quitosana nas concentrações de 1,5 e 2%.
Os resultados para Staphylococcus não obtiveram nenhuma alteração, sendo
Negativos para todas as amostras, estando dentro da legislação vigente. Ao realizar
o teste de Staphylococcus coagulase positivo, com as colônias encontradas, este foi
26
negativo, confirmando que os Staphylococcus encontrados não são do tipo aureus.
As amostras controle e cobertura de quitosana a 1,5% e 2% todas obtiveram como
resultados de Salmonella e Listeria ausentes.
Quadro 3. Avaliação Microbiológica de queijo coalho comercializado em Vitória
de Santo Antão/PE e com adição de cobertura de quitosana.
Queijo C
Amostras Controle Cobertura 1,5% Cobertura 2%
RDC 12
Coliformes termotolerantes
NMP>1,1x10³ ou -.- NMP 2,9x10² ou 1000 UFC/mL
NMP 2,1x10² ou 430 UFC/mL
5x10² UFC/g
Staphylococcus UFC/g
1,75x104 6,93x104 3,3x102 2,56x103 4,4x102 5x10² UFC/g
Staphylococcus coagulase positivo
Negativo Negativo Negativo Negativo
Listeria monocytogenes
Ausência Ausência Ausência Ausência
Salmonella Ausência Ausência Ausência Ausência Fonte: SILVA, RAYANNE C. L. DA ,2017.
27
7 DISCUSSÃO
De acordo com a Resolução RDC 12/20014 a tolerância máxima de
microrganismos em queijos deve ser 500 UFC/g de coliformes termotolerantes,
500UFC/g de S. coagulase positiva, ausência de Listeria monocytogenes e
Salmonella spp (SILVA et al., 2010).
Apenas na concentração de 2%, todos os queijos coalhos (A, B e C) estavam
conforme a legislação no que se refere aos coliformes termotolerantes. Nas demais
amostras, apresentaram ausência total de coliformes termotolerantes (NMP<3 ou 9,5
UFC/g ou mL) apenas o Queijo A (2% de quitosana) e o Queijo B (em todas as
amostras). No queijo A, apesar da presença do microorganismo nas amostras
controle e 1,5% de quitosana, este estavam dentro da legislação; o que diferiu do
queijo C, cuja amostra controle e cobertura a 1,5% estavam fora da legislação.
Resultado semelhante ao queijo A e B, foram também encontrados por
Fonseca et al. (2016), com valores de coliformes termotolerantes dentro dos
parâmetros exigidos pela legislação vigente (BRASIL, 2003). Esses resultados
positivos no que se refere aos coliformes termotolerantes comprovam nestes
queijos, a impossibilidade de contaminação via fecal, não podendo atribuir a
aplicação de Boas Práticas de Fabricação visto que depende dos resultados das
demais análises para tal afirmação.
Os resultados acima do permitido pela legislação para coliformes
termotolerantes na amostra controle do queijo C, são semelhantes aos de Maia
(2013), visto que no seu estudo também foram encontrados coliformes
termotolerantes em números acima dos limites da legislação, tornando-o impróprio
para o consumo. Entretanto, ressalta-se a eficácia da quitosana no queijo C, uma
vez que em ambas as concentrações (1,5 e 2%), observaram-se uma redução na
presença desse microrganismo ao nível de tolerável pela legislação vigente. Outro
fato de redução também ocorreu no queijo A, uma vez que os valores passaram de
dentro do nível tolerável nas amostras controle e 1,5%, para ausência de coliformes
na amostra a 2%, reafirmando a atividade inibitória da quitosana sob esse
microorganismo.
No que se trata do Staphylococcus, todas as amostras dos queijos controle
apresentaram resultados insatisfatório estando fora da legislação, demonstrando
uma ausência de higiene durante a fabricação dos queijos. Resultados dentro da
28
legislação foram encontrados na concentração a 1,5% apenas no queijo B, e a 2%
em todos os queijos (A, B, C).
No caso do queijo C, apesar da amostra controle e 1,5% estarem foram dos
níveis toleráveis, observou-se uma redução gradual conforme aumentava-se a
concentração de quitosana, atingindo a eliminação máxima a 2%, percentual este
que o produto foi considerado em conformidade com a legislação. Dessa forma
reforça-se a hipótese que o aumento gradual da concentração de quitosana, é capaz
de reduzir e até mesmo eliminar (conforme ocorreu a 2% no queijo A e B) a
presença de Staphylococcus.
Diante de todos os resultados obtidos pode-se observar que o gel de
quitosana como cobertura é eficaz na inibição e retardo de crescimento de
Staphylococcus, conforme estudo de Santos et al.(2014) feito com queijo minas
frescal; e Maia, (2013) feito com queijo coalho. De acordo com um estudo de Maia
(2013), a cobertura de quitosana a 2% apresentou um efeito significativo em queijo
coalho por não apresentar nenhuma colônia de Staphylococcus. Porém no estudo
de Freitas et al. (2013) colônias desse microrganismo foram encontradas em todas
suas amostras de seus três produtores de queijo analisados, porém apenas as
amostras de um dos produtores de queijo estavam dentro dos padrões atribuídos
pela resolução.
A contaminação do queijo encontrada nas amostras controle por
Staphylococcus e coliformes termotolerantes se deve a precária higiene dos
manipuladores, utensílios e queijarias, ou seja, a falta de BPF, medidas implantadas,
que garantem uma melhor segurança ao alimento, minimizando as possíveis
contaminações (FREITAS et al., 2013; FREITAS et al., 2009).
Os resultados para as três amostras de queijo em todos os tratamentos
(controle e cobertura de quitosana 1,5% e 2%), foram negativos para
Listeriamonocytogenes, equivalentes aos estudos de Fonseca et al., (2016), e Maia
(2013) que também utilizou quitosana em queijo coalho.
A análise microbiológica para Salmonella spp.encontrou-se dentro do padrão
exigido pela resolução, tendo ausência em todos os queijos (A, B e C) e tratamentos
de acordo com o achado de Oliveira et al., (2010) e Fonseca et al. (2016) para as
amostras controle; e Maia (2013) para as amostras com revestimento de quitosana.
A inexistência de L. monocytogenes e Salmonella spp. nas amostras controle
pesquisadas pode estar relacionada a microbiota autóctone presente no queijo,
29
como as bactérias láticas, que podem restringir o crescimento doa microrganismos
patogênicos por competição ou produção de moléculas antagônicas. Entretanto, o
antimicrobiano produzido por essas bactérias láticas pode não ser satisfatório para o
controle do Staphylococcus que pode encontrar em alguma contagem até o exigido
pela legislação ou acima. (SILVA et al., 2010). A adoção de parâmetros
microbiológicos com exigência de inexistência de L. monocytogenes em alimentos
pretende assegurar um produto seguro ao consumidor, porque mesmo que uma
única colônia não seja capaz de causar listeriose, a sua presença pode ser
suficiente para uma provável multiplicação no período de armazenamento do
produto, mesmo sob refrigeração.
Assim, o queijo coalho, por ser um produto tradicionalmente brasileiro, que
participa do hábito alimentar, fonte de renda e trabalho para uma parcela de
pequenos e médios produtores que necessitam de infra-estrutura, precisa ser melhor
avaliado, com estudo de técnicas de manipulação e conservação natural. É
necessário, investir em sua assistência técnica, fornecer informações e orientações
para melhoria das boas práticas de fabricação e higienização; além de padronização
de metodologias que garantam um produto final dentro da legislação, e do ponto de
vista seguro para consumo da população (FREITAS et al., 2013).
30
8 CONCLUSÕES
A qualidade dos queijos comercializados na cidade de Vitória de Santo Antão
– PE encontram-se fora do padrão microbiológico, estando impróprios para consumo
segundo legislação vigente, uma vez que todas as amostras controle apresentaram
Staphylococcus, e uma delas também coliformes termotolerantes acima do limite
permitido por lei.
No que se trata da adição do gel de quitosana, observou-se redução dos
níveis de microorganismos com o aumento da concentração, entretanto, resultados
dentro da legislação vigente para todos os queijos, somente foram alcançados com
quitosana a 2%. Com isso, o uso do gel de quitosana foi bastante eficaz no controle
e inibição dos microrganismos patogênicos, servindo como uma alternativa natural
de conservação para diminuição dos riscos de contaminação ao consumidor de
queijo coalho.
31
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