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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CARATINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS CONSERVAÇÃO E DINÂMICA DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE Butia eriospatha (MARTIUS EX DRUDE) BECCARI (ARECACEAE): UMA ESPÉCIE DA FLORA BRASILEIRA AMEAÇADA DE EXTINÇÃO Alison Gonçalves Nazareno Orientador: Dr. Maurício Sedrez dos Reis Florianópolis, SC 2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CARATINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS

VEGETAIS

CONSERVAÇÃO E DINÂMICA DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE Butia

eriospatha (MARTIUS EX DRUDE) BECCARI (ARECACEAE): UMA ESPÉCIE

DA FLORA BRASILEIRA AMEAÇADA DE EXTINÇÃO

Alison Gonçalves Nazareno

Orientador: Dr. Maurício Sedrez dos Reis

Florianópolis, SC

2010

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ÍNDICE GERAL

SUMÁRIO EXECUTIVO............................................................................................................... 3

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 4

2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................................... 8

3. HIPÓTESES ................................................................................................................................. 9

4. OBJETIVOS ...............................................................................................................................11

4.1 Objetivo geral.........................................................................................................................11 4.2 Objetivos específicos .............................................................................................................11

5. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................13

5.1 Áreas de estudo ......................................................................................................................13 5.2 Estudos genéticos ...................................................................................................................13

5.2.1 Extração de DNA .............................................................................................................14 5.2.2 Desenvolvimento de marcadores microssatélites ...........................................................15

5.2.2.1 Banco enriquecido em microssatélites .....................................................................15 5.2.2.2 Seqüenciamento .........................................................................................................16 5.2.2.3 Identificação dos marcadores....................................................................................16 5.2.2.4 Alinhamento...............................................................................................................16 5.2.2.5 Desenho dos iniciadores............................................................................................16

5.2.3 Marcadores cpDNA..........................................................................................................17 5.2.4 Amplificação e eletroforese do DNA nuclear ................................................................19 5.2.5 Amplificação e eletroforese de cpDNA..........................................................................19 5.2.6 Análises genéticas ............................................................................................................20

5.2.6.1 Locos SSR nuclear ....................................................................................................20 5.2.6.1.1 Análise da herança e análise de desequilíbrio de ligação ................................20 5.2.6.1.2 Análise da diversidade e estrutura genética, endogamia, parentesco, tamanho efetivo e equilíbrio de Hardy-Weinberg ...........................................................................21 5.2.6.1.3 Análise da distribuição espacial dos genótipos ................................................22 5.2.6.1.4 Sistema reprodutivo............................................................................................23 5.2.6.1.5 Fluxo gênico histórico........................................................................................24 5.2.6.1.6 Fluxo gênico contemporâneo.............................................................................24

5.2.6.2 Locos cpSSR..............................................................................................................25 5.2.6.2.1 Teste da herança do cloroplasto.........................................................................25 5.2.6.2.1 Diversidade genética e análise da distribuição espacial dos genótipos...........26 5.2.6.2.2 Estrutura genética e fluxo gênico histórico.......................................................27 5.2.6.2.4 Fluxo gênico contemporâneo.............................................................................28

5.3 Demografia .............................................................................................................................28 5.4 Fenologia reprodutiva ..........................................................................................................29

6. RESULTADOS ESPERADOS.................................................................................................30

7. PLANO DE TRABALHO.........................................................................................................31

8. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DAS ATIVIDADES ...................................................32

9. ORÇAMENTO ...........................................................................................................................33

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................34

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SUMÁRIO EXECUTIVO

Em vista das atuais taxas de destruição e perda de habitats florestais, populações

vegetais estão experimentando contrações em seus tamanhos populacionais e algumas

espécies podem ser mais susceptíveis a estocasticidade demográfica e genética que

outras. Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari (Arecaceae) é uma espécie nativa

do sul do Brasil que se encontra sob ameaça de extinção devido à exploração

insustentável, à presença do gado nas áreas de ocorrência, à degradação e redução de

seus ambientes naturais, resultando em declínio populacional. Os efeitos genéticos

associados à redução do tamanho populacional são, primordialmente, a restrição no

fluxo gênico, à deriva genética e o endocruzamento, o que geralmente resulta na

diminuição da diversidade genética. Informações quanto ao grau de organização e

dinâmica da variabilidade genética em populações, bem como o entendimento da

demografia e biologia reprodutiva das espécies são fundamentais para o delineamento

de estratégias de conservação. Neste contexto, o objetivo do trabalho é fornecer

informações que possam ser utilizadas para a conservação e manutenção da diversidade

genética de B. eriospatha. Com base em análises de DNA nuclear e cpDNA, o presente

trabalho avaliará (1) a diversidade genética, (2) a estrutura genética espacial, (3) o fluxo

gênico contemporâneo e histórico e, (4) o sistema reprodutivo de populações naturais de

B. eriospatha. Para investigar sobre a demografia e biologia reprodutiva, populações de

B. eriospatha serão monitoradas no decorrer de dois eventos reprodutivos. Os resultados

obtidos permitirão compreender o cenário evolutivo da espécie e será base para o

estabelecimento de estratégias efetivas para a conservação desta e de outras espécies

ecologicamente relacionadas.

Palavras-chave: cpDNA; demografia; diversidade genética; microssatélites; sistema

reprodutivo

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1. INTRODUÇÃO

A conservação dos recursos genéticos florestais tem se tornado prioridade,

principalmente, pelos impactos negativos na funcionalidade e composição dos

ecossistemas ocasionados pelo aumento da população humana e de suas atividades

econômicas (Laurance et al., 2006). No Brasil, cerca de 1,7 milhões de hectares de

florestas são perdidos anualmente (Wright, 2005). A degradação e a redução de habitat

resultando em remanescentes florestais menores e isolados representam uma séria

ameaça à biodiversidade (Young et al., 1996).

Em vista das atuais taxas de destruição e perda das florestas tropicais, as populações

vegetais estão experimentando contrações em seus tamanhos populacionais e algumas

espécies podem ser mais afetadas pela estocasticidade demográfica e deriva genética do

que outras (Dick et al., 2008). Padrões alterados de fluxo gênico e estrutura genética

têm implicações para o sistema reprodutivo, níveis de endogamia e para a manutenção

da diversidade genética. Hamrick (2004) argumentou que em função da extensão do

fluxo gênico, do ciclo de vida e da diversidade genética, árvores podem ser menos

vulneráveis as mudanças antrópicas do que outros organismos. No entanto, isto pode

não se aplicar as espécies da flora tropical que são, em geral, dependentes de animais

para se reproduzirem e dispersarem (Pacheco & Simonetti, 2000; Wang et al., 2007).

A importância do fluxo gênico está em contrapor os efeitos da deriva genética,

podendo ser quantificado através de medidas indiretas e diretas. Os métodos indiretos

estimam o fluxo gênico histórico e baseiam-se na distribuição da diversidade genética

entre populações (Hamrick & Nason, 2000). Segundo Reis (1996) os métodos indiretos

fundamentam-se na relação entre a taxa de migração e a divergência entre populações,

indicando uma relação inversa entre a divergência e a migração. Os métodos diretos

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estimam o fluxo gênico contemporâneo e são baseados em observações no movimento

dos vetores de pólen e sementes, na marcação do pólen e sementes, ou na identificação

de alelos ou genótipos migrantes, fazendo o uso de corantes, marcadores morfológicos e

análise de paternidade. Um dos métodos mais robustos para o estudo de fluxo gênico

contemporâneo consiste na realização de testes de paternidade usando marcadores

altamente informativos como os microssatélites (Gaiotto et al., 2003).

Os microssatélites (Seqüências Simples Repetidas - SSR) são marcadores ideais

para estudos genéticos em plantas por possuírem uma série de características desejáveis

como: distribuição ao acaso e ocorrência em grande quantidade em genomas de

eucariotos; codominância dos alelos; facilidade de detecção via PCR e alta diversidade

alélica (Chase et al., 1996; Dayanandan et al., 1997; Rossetto et al., 1999). A

determinação do fluxo gênico contemporâneo, no entanto, pode ser mais acurada pela

incorporação de dados sobre o genoma de organelas citoplasmáticas, como o DNA de

mitocôndria (mtDNA) ou de cloroplasto (cpDNA) (Cain et al., 2001). O DNA do

cloroplasto é uma molécula peculiar por apresentar herança uniparental (geralmente

materna em angiospermas e paterna em gimnospermas), ausência de recombinação e

conteúdo gênico conservado (Moritz et al., 1987). Por apresentar herança uniparental, o

cpDNA é uma ferramenta atrativa em estudos genéticos, pois, permite elucidar as

contribuições relativas do fluxo de sementes e pólen na estrutura genética de populações

naturais pela comparação de marcadores nuclear e de cloroplasto (Provan et al., 2001).

Muitos estudos têm investigado o fluxo de pólen (via indireta) por ser mais fácil de

ser detectado (Sork et al., 1999; Smouse & Sork, 2004) e pelo fato desse fluxo

apresentar, freqüentemente, uma maior escala espacial do que a dispersão de sementes

(Ennos, 1994). Alguns estudos têm demonstrado que o fluxo gênico aumenta entre

paisagens fragmentadas, como foi detectado para espécies de Ficus, que apresentam

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sistema de polinização especializado (Nason & Hamrick, 1997; Nazareno, 2006), e para

Dinizia excelsa, onde a fragmentação de habitat acarretou em mudanças na composição

e no comportamento de seus polinizadores (Dick et al., 2003). Em contraste, outros

estudos têm observado que a fragmentação pode aumentar a endogamia e, ou reduzir o

fluxo gênico entre indivíduos em remanescentes florestais (Rocha & Aguilar, 2001;

Lowe et al., 2005). Em todos estes casos, a ação antrópica tem causado mudanças nos

padrões de fluxo gênico contemporâneo que, no futuro, podem influenciar a estrutura

genética das populações.

Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari (Arecaceae) é uma espécie nativa do

sul do Brasil, sob grande pressão antrópica, que se encontra sobre ameaça de extinção

(Port.37N-IBAMA 1992, 2008) devido à exploração insustentável, à presença do gado

nas áreas de ocorrência e, à degradação e redução de seus ambientes naturais. Butia

eriospatha (Figura 1), popularmente conhecido como butiá-da-serra, é uma espécie

nativa da América do Sul que ocorre no sul do Brasil em zonas de campos no Paraná,

Santa Catarina e Rio Grande do (Reitz, 1974). De acordo com Reitz (1974) e Henderson

et al. (1995), B. eriospatha caracteriza-se por apresentar estipe ereto, com 3 a 6 metros

de altura e diâmetro de aproximadamente 50 cm. As frondes são pinadas, azul-

esverdeadas, apresentando 1 metro ou mais de comprimento, e os pecíolos munidos de

dentes ou espinhos relativamente fracos ou estreitos (Reitz, 1974). As inflorescências

são densamente ramificadas, com flores masculinas e femininas. Os frutos são globosos,

com mesocarpo carnoso e adocicado, amarelos, contendo de 1-3 sementes. Os frutos

maduros podem ser consumidos in natura ou usados na elaboração de sucos, geléias e

bebidas alcoólicas (Mentz et al., 1997). Da semente, extrai-se um tipo de azeite

comestível. Seu estipe é usado em construções rústicas e as fibras das frondes, para

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Figura 1. Indivíduo reprodutivo de Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari.

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fabricação de chapéus, cestos, cordas e enchimentos de colchões e estofados (Reitz et

al., 1978). A espécie é muito cultivada no paisagismo, inclusive no mercado

internacional de plantas ornamentais (Fischer, 2007).

Espécies vulneráveis de extinção, como B. eriospatha, necessitam de ações

mitigadoras para sua conservação. Estudos de genética molecular têm se tornado parte

integrante de diversos estudos de conservação. Informações quanto ao grau de

organização e dinâmica da variabilidade genética em populações, bem como o

entendimento da demografia e biologia reprodutiva das espécies são fundamentais para

o delineamento de estratégias de conservação. No entanto, há carência de trabalhos

científicos que investiguem a biologia de B. eriospatha. Portanto, para que um

programa efetivo de conservação seja estabelecido para B. eriospatha, o entendimento

do grau e organização genética, dos padrões espaciais de fluxo gênico, do sistema

reprodutivo e da estrutura demográfica é fundamental para a tomada de ações efetivas

que permitam a continuidade do processo evolutivo da espécie.

2. JUSTIFICATIVA

Populações naturais do Butia eriospatha estão sofrendo as conseqüências da perda

de habitats e de atividades antrópicas relacionadas ao uso da terra, especialmente em

função da monocultura e da pecuária. O pastoreio nas populações de Butia spp. vem

agravando o processo de redução da regeneração natural (Chebataroff, 1971; Cardoso,

1995; Azambuja, 2009). Devido a isso, 43% de todas as espécies do gênero Butia (B.

capitata, B. purpurascens e B. eriospatha) estão sob a ameaça de extinção (IUCN,

2009; IBAMA, 2008; Rio Grande do Sul, 2002). De acordo com os critérios da Lista

Vermelha da IUCN, B. eriospatha está vulnerável `a extinção (Noblick, 1998). Embora

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pouco se conheça sobre a ecologia da espécie, existe um consenso de que as populações

selvagens de B. eriospatha estão em declínio, e a taxa de recrutamento de indivíduos

reprodutivos das populações parece ser nula.

Como outras espécies do gênero Butia, os indivíduos de B. eriospatha apresentam

distribuição espacial agregada, às vezes densa e extensa, na forma de “populações-

ilhas” conhecidas como butiazais. A maioria dos butiazais ocorre em áreas de Campos

de Altitude (um subtipo do Domínio da Mata Atlântica), que vêem sendo

progressivamente transformadas ou degradadas por atividades relacionadas ao uso do

solo (Bilenca & Miñarro, 2004; Pillar, 2006). Em comparação com as florestas, a

conservação dos Campos de Altitude tem sido negligenciada pelas leis ambientais,

havendo poucas unidades de conservação que os contemplam (Ministério do Meio

Ambiente, 2002; Oliveira 2002). Haja vista a realidade de conservação dos Campos de

Altitude, o risco de extinção de B. eriospatha aumenta, sendo necessárias estratégias

eficazes de conservação para a espécie.

No entanto, para a definição de estratégias de conservação são imprescindíveis

estudos genéticos, demográficos e biológicos, em nível populacional, das espécies que

compõem tais ecossistemas. Dessa forma, por meio deste trabalho subsídios

consistentes poderão ser obtidos para definir estratégias de conservação de B.

eriospatha.

3. HIPÓTESES

1) Por ocorrer na forma de “populações-ilhas” - i.e., butiazais - Butia eriospatha deve

apresentar baixo nível de diversidade genética dentro das populações e alta

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diferenciação interpopulacional em função do fluxo gênico restrito decorrente do

isolamento produzido pela paisagem;

2) Devido à dispersão de sementes nas vizinhanças de árvores-matrizes, deve haver uma

estruturação genética espacial a curta distância em decorrência de arvores próximas

serem geneticamente relacionadas por ancestral comum;

3) O nível e a distribuição espacial da diversidade genética atual das populações de

Butia eriospatha deve ser em decorrência do seu processo de dispersão estar associado a

ocupação humana;

4) Para as “populações-ilhas” pequenas, o parentesco entre os indivíduos de Butia

eriospatha dentro de progênies deve ser maior que o esperado em “populações-ilhas”

maiores;

5) O sistema reprodutivo e o fluxo gênico nas populações de Butia eriospatha devem

ser alterados pelo tamanho efetivo populacional e, devem variar no tempo em

detrimento de fatores estocásticos (e.g., disponibilidade de recursos florais e

polinizadores);

6) Butia eriospatha apresenta cpDNA de herança materna e sua taxa de migração deve

ser menor que a de genes nucleares, uma vez que se dispersam apenas nas sementes;

7) Análises com marcadores cpDNA devem indicar estrutura genética populacional em

Butia eriospatha mais forte que as com marcadores nucleares em função das diferenças

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do tamanho efetivo populacional; mesmo se as taxas de fluxo de pólen e sementes

forem iguais;

8) Em decorrência de pressões antrópicas (e.g., presença do gado, extrativismo de frutos

e de indivíduos reprodutivos), as populações de Butia eriospatha devem apresentar uma

estrutura demográfica sem a presença de coortes jovens;

9) Como outras espécies do gênero, Butia eriospatha deve apresentar mecanismos (e.g.,

dicogamia) que evitam a auto-fecundação.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Estabelecer estratégias de conservação a partir de informações da organização e

distribuição da variabilidade genética, da biologia reprodutiva e da dinâmica

populacional de Butia eriospatha.

4.2 Objetivos específicos

(1) Desenvolver marcadores microssatélites (SSR nuclear) e padronizar marcadores

cpDNA para estudos populacionais de Butia eriospatha;

(2) Descrever os níveis de diversidade genética em populações naturais de Butia

eriospatha;

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(3) Caracterizar a diversidade genética interpopulacional de Butia eriospatha por

marcadores nucleares e cloroplastidiais;

(4) Investigar a existência de estruturação genética matrilinear, i.e., com base no

genoma de herança materna, em populações de Butia eriospatha;

(5) Estimar a contribuição relativa da migração de pólen e sementes na definição da

estrutura genética de Butia eriospatha por meio de análise comparativa de marcadores

nucleares e cloroplastidiais;

(6) Estimar o fluxo gênico histórico e contemporâneo em populações de Butia

eriospatha;

(7) Estimar parâmetros do sistema de reprodução como taxas de cruzamento, auto-

fecundação, endogamia biparental e cruzamentos correlacionados em populações

naturais de Butia eriospatha;

(8) Avaliar a estrutura demográfica de populações naturais de Butia eriospatha;

(9) Avaliar o padrão reprodutivo de Butia eriospatha;

(10) Propor estratégias de conservação com base em indicadores genéticos e ecológicos

de Butia eriospatha

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5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Áreas de estudo

Quinze populações naturais de Butia eriospatha, localizadas no Estado de Santa

Catarina, serão selecionadas para os estudos de genética, estrutura demográfica e padrão

reprodutivo. As populações serão escolhidas em função do tamanho e do grau de

isolamento na paisagem.

5.2 Estudos genéticos

Para caracterizar a diversidade, a estrutura genética e estimar o fluxo gênico

histórico de Butia eriospatha serão coletados um mínimo de 50 indivíduos reprodutivos

das 15 populações de B. eriospatha selecionadas. Todos os indivíduos coletados serão

marcados com placa de alumínio numerada e sua posição geográfica registrada com

auxilio de GPS (GPSmap 76 CSx). As frondes dos indivíduos de B. eriospatha serão

coletadas e armazenadas em deep freezer até o momento de extração do DNA.

Para os estudos de fluxo gênico contemporâneo via pólen e do sistema reprodutivo

de Butia eriospatha serão analisados, por dois eventos reprodutivos consecutivos, todos

os indivíduos reprodutivos oriundos de duas populações diferenciadas pelo tamanho

populacional (população A formada por mais de 500 indivíduos reprodutivos e,

população B formada por menos de 50 indivíduos reprodutivos). Todos os indivíduos

serão marcados com placa de alumínio numerada e georreferenciados utilizando o

sistema de posicionamento global (GPS). Nessas populações, as frondes de todos os

indivíduos serão coletadas para extração de DNA. Sementes de vinte indivíduos

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reprodutivos (matrizes) escolhidos aleatoriamente, nas populações A e B, serão

coletadas. As sementes serão identificadas por matriz, plantadas e, após germinação,

realizar-se-á a extração de DNA foliar de 20 plântulas por matriz. Utilizando

marcadores nucleares (SSR) será possível determinar (1) a taxa de cruzamento, (2) a

endogamia biparental, (3) a correlação de paternidade (4) a taxa de auto-fecundação, (5)

a taxa de imigração de pólen, (6) a distância física entre as efetivas árvores

polinizadoras e as árvores maternas, (7) o tamanho da vizinhança reprodutiva (número

de doadores de pólen), e a (8) área de vizinhança efetiva de polinização. Além disso,

verificar-se-á se o sistema reprodutivo e o fluxo gênico de B. eriospatha são alterados

em função do tempo e do tamanho populacional.

Para estudar o fluxo gênico contemporâneo via sementes, serão coletados tecidos

foliares de todos os indivíduos reprodutivos e cerca de 150 regenerantes das populações

A e B. A contribuição da dispersão de sementes na definição da estrutura genética de

Butia eriospatha será avaliada nas 15 populações estudadas, com um número de

indivíduos por população não excendo a 50. Com base na análise de cpDNA será

possível verificar a existência de estruturação genética matrilinear nas populações de B.

eriospatha. Além disso, com base na comparação de polimorfismos nucleares e

cloroplastidiais será possível fazer inferências sobre o passado evolutivo da espécie, e

definir se o nível e a distribuição espacial da diversidade genética observada atualmente

representam um processo recente ou se são característicos da espécie em longo prazo.

5.2.1 Extração de DNA

As condições da extração de DNA das amostras foliares serão efetuadas com base

na metodologia de Doyle e Doyle (1990) modificada por Alzate-Marin et al. (2005).

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5.2.2 Desenvolvimento de marcadores microssatélites

Para a realização desta etapa será necessário extrair o DNA das folhas de um único

indivíduo de Butia eriospatha, que será coletado na área de estudo. A seguir, serão

descritas sucintamente as etapas necessárias para construção da biblioteca enriquecida

em SSR para a espécie B. eriospatha.

5.2.2.1 Banco enriquecido em microssatélites

Inicialmente, o DNA de Butia eriospatha será extraído e quantificado (~5 µg).

Subseqüentemente, será realizada a digestão do DNA com uma enzima de restrição de

corte freqüente (RsaI, Invitrogen) de forma que sejam obtidos fragmentos entre 300 e

600 pb. Em seguida, os fragmentos obtidos serão ligados à adaptadores com seqüências

conhecidas de 21 e 25 pb (Rsa21 - 5´CTCTTGCTTACGCGTGGACTA3´ e Rsa25

5’TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA3’) e uma pré-amplificação usando como

primer o oligonucleotídeo Rsa21 será realizada. O produto de amplificação será

purificado (Quiaquick PCR Purification Kit, Quiagen) e submetido ao passo de

enriquecimento da biblioteca para fragmentos contendo microssatélites: por meio da

hibridização com os oligonucleotídeos biotinilados (GT)8 e (CT)8 . Esses fragmentos

serão recuperados pela ligação entre as moléculas de biotina e as moléculas de

streptavidina associadas com partículas magnéticas (Streptavidin MagneSphere

Paramagnetic Particles, Promega). Os fragmentos selecionados serão então amplificados

novamente usando o oligonucleotídeo Rsa21, e posteriormente, serão ligados à um vetor

de clonagem (pGEM-T Vector System, Promega). Essa construção será utilizada para

transformar células competentes de E. coli XL1-Blue de acordo com a metodologia de

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Avi Levy (1991). As colônias recombinantes serão selecionadas para resistência ao

antibiótico ampicilina e pelo sistema branco-azul, transferidas para placas ELISA e

mantidas em culturas gliceroladas com meio 2YT-HMFM à -80 °C.

5.2.2.2 Seqüenciamento

Após a construção do banco com fragmentos enriquecidos em microssatélites será

realizada a etapa de seqüenciamento dos clones. Para tanto, será isolado o DNA

plasmidial de cada um dos clones por meio da metodologia de lise alcalina. A obtenção

das seqüências será realizada com o kit DYEnamic TM ET dye terminator (GE

Healthcare) no seqüenciador automático MegaBACE TM 1000.

5.2.2.3 Identificação dos marcadores

Para identificação dos microssatélites dentro das seqüências obtidas será utilizada a

ferramenta de busca Webtroll disponível na página <http://wsmartins.net/websat/>.

5.2.2.4 Alinhamento

Após a seleção das seqüências que contêm microssatélites, o programa SeqMan -

Lasergene (DNAStar Inc.) será utilizado para avaliar o nível de redundância entre elas.

Locos de microssatélites encontrados em mais de uma seqüência serão descartados e

apenas os marcadores não ambíguos serão avaliados.

5.2.2.5 Desenho dos iniciadores

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Os iniciadores direto (foward) e reverso (reverse) de cada SSR serão desenhados com

o auxílio do programa Primer3, disponibilizado na internet, de acordo com os seguintes

critérios: não conter bases redundantes; estar a uma distância adequada dos SSRs (entre

20 a 60 pb); ser constituídos por 18 a 22 nucleotídeos sem seqüências repetitivas; conter

uma porcentagem de bases G e C entre 40 a 60%; começar em 5’ e terminar em 3’ com

duas bases G, ou C, ou G e C, se possível; e ter temperatura de anelamento entre 45 e 60

°C, com diferença máxima de 1 ºC entre as temperaturas dos iniciadores direto e reverso,

de modo que possam ser usados na mesma reação e não hibridizarem entre si, ou se auto-

hibridizarem.

5.2.3 Marcadores cpDNA

Nove iniciadores SSR universais de cpDNA (Tabela 1) sintetizados com base no

genoma de tabaco (Weising & Gardner, 1993), todos de repetições de uma base, serão

testados em reações de PCR com DNA de 10 árvores de Butia eriospatha, a fim de se

obter a temperatura de anelamento ideal para cada par de iniciadores. Em cada par de

iniciadores, o forward será marcado com fluorescência para leitura em analisador

automático de fragmento (MegaBACE ™ 1000).

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Tabela 1. Locos de microssatélites cloroplastidiais universais com as seqüências e

amplitude alélica esperada (em pares de base, pb) dos iniciadores desenvolvidos por

Weising & Gardner (1999) em Nicotiana tabacum.

Iniciadores Seqüências (5’ – 3’) pb

ccmp01 F: CAGGTAAACTTCTCAACGGA 122-143

R: CCGAAGTCAAAAGAGCGATT

ccmp02 F: GATCCCGGACGTAATCCTG 166-234

R: ATCGTACCGAGGGTTCGAAT

ccmp03 F: CAGACCAAAAGCTGACATAG 89-119

R: GTTTCATTCGGCTCCTTTAT

ccmp04 F: AATGCTGAATCGAYGACCTA 115-220

R: CCAAAATATTBGGAGGACTCT

ccmp05 F: TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT 77-145

R: AGGTTCCATCGGAACAATTAT

ccmp06 F: CATGCATATGTAGAAAGCC 93-111

R: CATTACGTGCGACTATCTCC

ccmp07 F: CAACATATACCACTGTCAAG 129-151

R: ACATCATTATTGTATACTCTTTC

ccmp09 F: GGATTTGTACATATAGGACA 96-104

R: CTCAACTCTAAGAAATACTTG

ccmp10 F: TTTTTTTTTAGTGAACGTGTCA 91-300

R: TTCGTCGDCGTAGTAAATAG

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5.2.4 Amplificação e eletroforese do DNA nuclear

Para cada reação de PCR dos locos SSR, 10 ng/µL de DNA genômico serão

utilizados em um volume total de 10 µL contendo 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH

8.9, 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada um dos desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP,

dGTP e d TTP), 0,20 µL de cada primer microssatélite 3’ e 5’ (forward e reverse) e

0,12 unidades de Taq polimerase. O protocolo de PCR consistirá de uma desnaturação

inicial a 96° C por 3 minutos, seguidos por 30 ciclos a 94° C por 30 segundos, Ta °C

(temperatura de anelamento dos iniciadores) por 1 minuto, 72° C por 1 minuto e

extensão final a 72° C por 7 minutos. Os produtos da amplificação para os SSR serão

separados por eletroforese sob condições não-desnaturante e desnaturante em géis de

poliacrilamida 10%, e os fragmentos obtidos serão detectados em coloração com nitrato

de prata (20%) segundo protocolo de Sanguineti et al. (1994). O tamanho dos alelos

será determinado utilizando como padrão de peso molecular, o marcador Ladder 10 pb

(Invitrogen™).

5.2.5 Amplificação e eletroforese de cpDNA

As reações de PCR serão padronizadas para cada par de iniciador. Os produtos

amplificados serão visualizados em gel de agarose e corados com brometo de etídio.

Devido ao tamanho pequeno e número limitado de alelos na maioria dos SSR de

cloroplasto, os tamanhos dos alelos serão obtidos por seqüenciamento. A partir dos

resultados das amplificações, as detecções de polimorfismo serão realizadas em

analisador automático de fragmentos (MegaBACE™ 1000).

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Para as reações de seqüenciamento, o produto de PCR será purificado com o uso de

exonucleaseI e SAP (0,25 U de cada enzima em 5µL de reação), por 1 hora a 37º C.

Apos esse tempo, a atividade enzimática será neutralizada expondo a reação a 80º C por

30 minutos. Para as reações de seqüenciamento, será utilizado o Kit DYEnamic TM ET

dye terminator e iniciadores descritos na Tabela 1. Para cada reação de Seqüenciamento

de 10 µL, serão utilizados 4,0 µL [(20 ng de DNA) produto da PCR], 0,6 µL (5µM) de

iniciador forward ou reverse, 4,0 µL de solução pré-mix do kit de seqüenciamento e

água ultra pura. A reação será realizada de acordo com o programa: 30 ciclos a 95º C

por 20 segundos, temperatura de anelamento específico por 15 segundos, 60 º C por 1

minuto. O protocolo de purificação de seqüenciamento será o da precipitação por

etanol/acetato de amônio 7,5 M.

5.2.6 Análises genéticas

5.2.6.1 Locos SSR nuclear

5.2.6.1.1 Análise da herança e análise de desequilíbrio de ligação

O estudo da herança dos locos SSR desenvolvidos será realizado com base no

modelo descrito por Gillet & Hattemer (1989), que compara o genótipo de árvores

maternas heterozigóticas com a segregação de suas progênies de polinização aberta. Os

genótipos observados em cada progênie, de cada árvore materna heterozigota serão

comparados com o esperado pela hipótese de segregação regular 1:1. A hipótese de

segregação regular será aceita ou descartada com base em um teste G padrão calculado

para cada progênie individualmente, soma dos testes G individuais (! 1:1_TotalG ),

agrupando as progênies de árvores maternas de mesmo genótipo para o loco sob

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consideração ( agrupadoG _1:1 ) e para a hipótese de homogeneidade de segregação entre

progênies, usando-se um teste G de heterogeneidade ( idadeHeterogeneG ), com n, n-1 e 1

grau de liberdade, respectivamente. O teste de desequilíbrio de ligação será realizado

com base na medida composta de desequilíbrio de ligação de Burrows ( ij! ) usando o

programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002). Esse método é o mais adequado para

populações onde existem indícios de desvios de cruzamentos aleatórios, como é muitas

vezes observado em espécies arbóreas. Esses testes permitirão determinar quais os locos

são adequados para as análises genéticas populacionais.

5.2.6.1.2 Análise da diversidade e estrutura genética, endogamia, parentesco,

tamanho efetivo e equilíbrio de Hardy-Weinberg

A diversidade genética e as estatísticas F serão estimadas sob modelo aleatório de

acordo com Weir (1996), em que as populações amostradas serão consideradas como

representativas da espécie e com uma história evolutiva comum. As freqüências

alélicas, o número de alelos por loco (A), a heterozigosidade observada (Ho) e esperada

(He) e as estatísticas F de Wright (FIS, FST e FIT), serão estimadas usando o programa

GDA (Lewis & Zaykin, 2002). Também se utilizará uma estatística análoga a FST ,

denominada de RST, desenvolvida especificamente para dados microssatélites (Slatkin et

al., 1995). O parâmetro RST será estimado com o auxílio do programa RSTCal

(Goodman, 1997).

O coeficiente de coancestria xy! para cada par de árvores adultas e jovens será

calculado usando o programa SPAGeDi versão 1.1b (Hardy & Vekemans, 2003) e o

tamanho )(veN segundo metodologia proposta por Sebbenn & Seoane (2005) para dados

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de marcadores genéticos. O tamanho efetivo populacional (Ne) será estimado para cada

população de acordo com Vencovsky (1987), por Ne = n/(1+ƒ), em que n é o tamanho

amostral e ƒ é o índice de fixação. Os parâmetros estimados serão: θP = divergência

genética entre populações, F = índice de fixação médio para o conjunto das populações,

ƒ = índice de fixação médio dentro de populações. Para verificar se as estimativas

médias de θP, F e ƒ serão estatisticamente diferentes de zero, se estimará o intervalo de

confiança a 95% de probabilidade pelo método de reamostragem bootstrap. As análises

de variâncias e os bootstraps serão realizados no programa GDA (Lewis & Zaykin,

2002). A estruturação da variabilidade será visualizada através de dendrogramas

construídos pela matriz de distâncias genéticas não viezadas de Nei (1978) e pelo

critério de agrupamento Como as amostras vão incluir três gerações (adultos, progênies

e jovens), serão testadas a aderência das freqüências gênicas e genotípicas ao modelo de

equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), usando o teste exato de Fisher, calculado

usando-se o programa GDA (Lewis & Zaykin, 2002).

5.2.6.1.3 Análise da distribuição espacial dos genótipos

Esta análise será realizada com base na estimativa do coeficiente de coancestria

( xy! ) entre pares de árvores dentro de classes de distância previamente determinadas,

usando o estimador de coancestria proposto por Loiselle et al. (1995). A significância

estatística do coeficiente xy! será obtida comparando os limites do intervalo de

confiança a 95% de probabilidade da estimativa média xy! para cada classe de

distância, calculado por 10.000 reamostragens bootstrap, em relação a hipótese de

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ausência de coancestria (H0: xy! = 0). O coeficiente de coancestria será estimado usando

o programa SPAGeDi versão 1.1b.

5.2.6.1.4 Sistema reprodutivo

O sistema de reprodução será caracterizado pelos modelos misto de reprodução

(Ritland & Jain, 1981) e cruzamentos correlacionados (Ritland, 1989), utilizando o

programa MLTR (Ritland, 2004). Os parâmetros estimados serão: a) taxa de

cruzamento multiloco ( mt ); b) taxa de cruzamento uniloco ( st ); c) taxa de cruzamento

entre aparentados ( sm tt ! ); d) freqüências alélicas dos óvulos e do pólen (o e p); e) taxa

de cruzamento multiloco individual por árvore materna; f) a correlação de auto-

fecundação ( Sr ); g) a correlação multiloco de paternidade ( )(mpr ) e; h) correlação

uniloco de paternidade ( )(spr ). O erro padrão dos parâmetros será estimado por 500

reamostragens bootstrap.

Com o intuito de verificar se a taxa de cruzamento é uniforme entre os eventos

reprodutivos das populações de B. eriospatha com tamanho populacional diferenciado

nos habitats de ocorrência, será realizada uma análise de variância.

A fim de conhecer a estrutura genética das progênies será estimado o coeficiente

médio de coancestria ( xy! ) entre plantas dentro de progênies, calculado de parâmetros

do sistema de reprodução, conforme derivações de Ritland (1989). A representatividade

genética dentro das progênies será medida pelo tamanho efetivo de variância ( )(veN ) de

cada progênie com base na variância amostral das freqüências alélicas (Cockerham,

1969).

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5.2.6.1.5 Fluxo gênico histórico

As estimativas de fluxo gênico entre as populações basear-se-ão na metodologia

proposta por Wright (1943), que considera a quantidade de migrantes (Nm) e a

divergência genética entre populações (FST). Utilizar-se-á a equação proposta por Crow

& Aoki (1984):

Nm = 1/4α [(1/FST) – 1]

em que:

α = (n/(n-1))2

n = número de populações

No entanto, Cockerham & Weir (1993) consideram que o emprego do θP como

estimador da divergência entre populações é mais adequado, e por isso, ele foi utilizado,

ao invés do FST. No caso do modelo de ilhas, o Nm mede o número de gametas que se

movem, enquanto que, nos modelos contínuos, como o isolamento por distância, utiliza-

se o Nb que representa o tamanho de vizinhança ou a área onde ocorre panmixia. De

acordo com Slatkin & Barton (1989), se assumirmos que a dispersão ocorre de forma

homogênea ao redor de uma árvore, a área de vizinhança pode ser dada por:

Nb = 2πNm

5.2.6.1.6 Fluxo gênico contemporâneo

As estimativas do fluxo gênico contemporâneo, via pólen, serão obtidas usando

análise de paternidade com o auxílio do programa CERVUS 3.0 (Marshall et al., 1998;

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Kalinovski et al., 2007). As análises serão conduzidas a partir dos genótipos de árvores

maternas e suas progênies e, das demais árvores adultas reprodutivas da população

(candidatos a parentais paternos). Isto permitirá determinar a taxa de imigração de pólen

e a distância física entre as efetivas árvores doadoras de pólen e as árvores maternas, o

tamanho da vizinhança reprodutiva (número de doadores de pólen) e a área de

vizinhança efetiva de polinização (área que ocorre os cruzamentos).

5.2.6.2 Locos cpSSR

As análises dos produtos de seqüenciamento serão realizados com o programa

BioEdit. As seqüências serão alinhadas e, a variação de seqüências será avaliada em

relação à deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos e, desta forma, os alelos em

cada loco serão determinados.

5.2.6.2.1 Teste da herança do cloroplasto

A probabilidade de transmissão paterna do cloroplasto será estimada com os

genótipos das progênies coletadas para os estudos do sistema reprodutivo e fluxo gênico

contemporâneo via pólen. Utilizar-se-á o procedimento descrito em Milligan (1992),

para estimar a probabilidade de transmissão paterna do cloroplasto (P), separadamente

para as progênies coletadas nas populações estudadas. A probabilidade de observar K

progênies contendo organelas derivadas do pai em conjunto de N progênies é dada pela

distribuição binomial:

Pr(K/N,P) = N! / K!(N-K)! Pk . (1-P)N – K (1)

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A equação fornece a probabilidade, dado um determinado tamanho amostral, de

reconhecer herança paterna, quando a taxa de transmissão é dada por P. O poder do

teste de hipótese (ß) deve ser grande oi suficiente para assegurar que a hipótese de

herança estritamente materna não seja falsamente aceita. Será considerado o poder do

teste com ß ≥ 0,95. Como ß = 1 – Pr(K/N,P) , sendo o valor de ß substituído na equação

(1).

Em progênies de polinização aberta, apenas um subconjunto das progênies é

informativo. Isso porque pode ocorrer auto-fecundação e, mesmo que as sementes sejam

resultantes de fecundação cruzada, o pai pode ter o mesmo haplótipo da mãe (Oddou-

Muratorio et al., 2001). O número de cruzamentos informativos (Ninf), aqueles em que

os dois parentais são esperados por carregar haplótipos diferentes, assumindo

cruzamentos aleatórios, é estimado por:

Ninf = ∑ N(1- pi)(1- s) (2)

Em que é a freqüência do haplótipo i na população, s é a taxa de auto-fecundação e N é

o número de plântulas com o haplótipo i. Substitui-se N por Ninf na eq. (1), como

sugerido por Oddou & Muratorio et al. (2001).

5.2.6.2.1 Diversidade genética e análise da distribuição espacial dos genótipos

Uma vez que os polimorfismos do genoma do cloroplasto são herdados sem

recombinação, cada combinação alélica única entre os locos microssatélites será

considerada um haplótipo. Cada haplótipo, por sua vez, será analisado como um alelo

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diferente de um único loco haplóide. Serão computados: (1) o número de haplótipos, (2)

a quantidade de haplótipos privados por população e (3) a proporção de alelos privados.

As freqüências dos haplótipos em cada população e nos indivíduos amostrados serão

utilizadas para estimar (a) a diversidade haplotípica e (b) o numero efetivo de

haplótipos.

Com o intuito de tornar comparáveis os resultados da distribuição espacial dos

genótipos por marcadores cloriplastidiais e nucleares, utilizar-se-á mesma metodologia

já descrita no item 5.2.6.1.3.

5.2.6.2.2 Estrutura genética e fluxo gênico histórico

Para genes nucleares, a estimativa de diferenciação genética, derivado do modelo de

ilhas infinitas de Wright (1931), é calculada com base no tamanho efetivo populacional

Ne e a taxa de migração m expresso por Fst (n) = 1/(4 Nem + 1). O genoma de organelas

pode ser tratado como haplóide (replicação do DNA e divisão celular pode levar a

uniformidade dentro de células e entre indivíduos) e, neste caso, considerando os

mesmos pressupostos do modelo de ilhas infinitas de Wright, e ignorando as taxas de

mutação, a estimativa de diferenciação genética com base no genoma de organela Fst (o)

para as populações de Butia eriospatha será obtida pela relação Fst (o) ≈ 2 Fst (n). Esta

relação se baseia na probabilidade de autozigose para haplótipos de organelas em

plantas hermafroditas como demonstrado por Hamilton & Miller (2002).

O fluxo gênico será calculado como proposto por McCauley (1995):

Nm = 1/2 [(θPc) – 1] em que,

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θPc é a divergência genética calculada com marcadores cloroplastidiais. Essa estimativa

e o intervalo de confiança serão obtidos por reamostragens bootstrap sobre populações,

com o uso do programa EG (Coelho, 2000).

A razão de migração de pólen e sementes será calculada de acordo com Ennos

(1994). Baseado na razão do fluxo de pólen e sementes e, nas taxas de cruzamento e de

transmissão materna, a hipótese alternativa de que há diferença nas estimativas de

divergência genética baseadas em marcadores nucleares e cloroplastidiais será testada

pelo modelo descrito por Hamilton & Miller (2002).

5.2.6.2.4 Fluxo gênico contemporâneo

Como todas as árvores adultas reprodutivas e os regenerantes amostrados nas

populações terão sua localização geográfica conhecida, será possível determinar o

padrão de dispersão de sementes, calculando a distância física entre os regenerantes e os

putativos parentais. Adicionalmente, será calculado o fluxo gênico crítico - que reflete a

probabilidade de um regenerante, com um dos parentais identificado, ser descentente de

uma árvore fora da população - com base no método proposto por Westneat & Webster

(1994).

5.3 Demografia

Propõe-se um estudo integrado da estrutura demográfica, da regeneração natural e

herbivoria para subsidiar o conhecimento da espécie nas áreas de ocorrência. A

estrutura demográfica e a distribuição espacial serão realizadas nas 15 populações em

estudo. Todos os indivíduos serão classificados por estádios de desenvolvimento e, a

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altura e a circunferência a altura do peito (CAP) serão mensuradas. A regeneração

natural e taxa de herbivoria do componente regenerante serão avaliadas em cinco das 15

populações, em parcelas circulares de raio de 2 m, num total de 30 parcelas por

população. Essas parcelas serão distribuídas equitativamente entre áreas com e sem

influencia de copa do butiá. A estrutura populacional será delineada com base na

densidade total de indivíduos registrados em cada estádio observado em cada

população. O padrão de distribuição do componente regenerante será calculado pelo

índice de Payandeh (1970), assim determinado: P=1, a distribuição da população é do

tipo aleatória; P<1, a distribuição é uniforme e P>1, é agregada. A herbivoria será

expressa pelo número de regenerantes com o eófilo predado. Os dados de herbivoria

serão analisados usando tabelas de contingência, e a significância estatística será testada

com o teste qui-quadrado de Pearson para verificar se há diferenças: (1) no número de

regenerantes predados e não predados entre parcelas com e sem influencia da copa do

butiá e, (2) na herbivoria dentro e entre populações. Para testar se a herbivoria é

dependente da densidade, a relação entre densidade e a taxa de plantas predadas será

realizada. Todas as análises estatísticas serão realizadas com o uso do programa R,

versão 2.9.0 (2009).

5.4 Fenologia reprodutiva

As avaliações fenológicas serão realizadas em todas as plantas de Butia eriospatha

das populações A e B, no decorrer de dois ciclos reprodutivos da espécie. Os registros

das variações fenológicas referentes à floração e frutificação serão realizadas

quinzenalmente. Serão determinados: (1) o potencial reprodutivo das populações

calculado com base no número de indivíduos que reproduziram nos dois ciclos

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reprodutivos estudados, (2) a capacidade reprodutiva, onde se correlacionará a

quantidade de unidades reprodutivas (inflorescência) por planta com a altura e CAP, (3)

as fenofases, (4) a duração média, em dias, das fenofases, (5) se há sobreposição de

fenofases em um mesmo indivíduo e, (6) os picos de floração e frutificação.

6. RESULTADOS ESPERADOS

Aprimorar os conhecimentos na temática dos Recursos Genéticos Vegetais. Gerar

uma tese e artigos de relevância científica. Contribuir com a conservação da espécie

Butia eriospatha. Compartilhar novas metodologias com o grupo de pesquisa. Capacitar

alunos de iniciação científica nas técnicas empregadas neste estudo. Participar de

congressos e workshops.

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7. PLANO DE TRABALHO

1. Extrair DNA foliar de um indivíduo de B. eriospatha para realizar o desenvolvimento

dos marcadores microssatélites;

2. Padronizar as condições de amplificação para todos os iniciadores SSR

desenvolvidos e realizar análises de herança mendeliana, desequilíbrio de ligação e

polimorfismo para todos os locos SSR que serão empregados nos estudos genéticos

propostos neste projeto;

3. Padronizar as condições de amplificação para os marcadores cpDNA;

4. Fazer o censo e mapear todas as árvores adultas e regenerantes de B. eriospatha

encontrados nas áreas estudadas;

5. Amostrar tecidos de folhas de todas as árvores adultas reprodutivas de B. eriospatha

e de regenerantes nas populações selecionadas;

6. Coletar sementes de árvores matrizes de B. eriospatha nas populações selecionadas.

Plantar as sementes de cada matriz e, posteriormente, amostrar tecido foliar;

7. Extrair DNA das folhas de matrizes, progênies e regenerantes da espécie B.

eriospatha e avaliar todo o material amostrado com marcadores genéticos;

8. Realizar análises de diversidade genética, fluxo gênico histórico, estrutura genética

espacial, sistema de reprodução e análise de paternidade com a estrutura de progênies.

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8. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DAS ATIVIDADES

Atividade 1◦ sem. 2◦ sem. 3◦ sem. 4◦ sem. 5◦ sem. 6◦ sem.

Créditos X X X

Desenvolvimento e caracterização dos marcadores SSR X X

Padronização dos marcadores cpDNA X

Seleção das populações X X X

Mapeamento das árvores X X X

Amostragem de tecidos foliares de árvores adultas X X X X

Amostragem de tecidos foliares dos regenerantes X X

Coleta de sementes*, plantio e amostragem de tecidos

foliares X X

Extração do DNA das amostras X X X X X

Eletroforese X X X X

Levantamento bibliográfico X X X X X X

Análises estatísticas X X X X

Defesa do projeto X

Apresentação de resultados em congressos X X X X

Qualificação X

Redação de artigos científicos X X X X X

Redação da Tese X X

*A coleta de sementes seguirá o comportamento fenológico de frutificação da espécie em

estudo.

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9. ORÇAMENTO

ITENS

Valor em R$

LABORATÓRIO

Desenvolvimento marcadores SSR nuclear 8.000,00

Caracterização genética SSR nuclear 50.000,00

Caracterização genética SSR cloroplastidiais 25.000,00

Material de consumo (plásticos/vidrarias) 8.000,00

Material permanente (cuba + fonte eletroforese) 10.000,00

CAMPO

Viagens a campo (despesas gerais) 14.000,00

Aluguel de carro 8.100,00

RECURSOS HUMANOS

Bolsa de doutorado (CNPq) 86.400,00

Taxa de bancada (CNPq) 14.256,00

OUTROS

Correção artigos científicos (inglês) 1.500,00

Pranchas científicas 1.000,00

TOTAL 226.256,00

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10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALZATE-MARIN, A. L. et al. 2005. Otimização de um método econômico e rápido de

extração de DNA para quatro espécies de árvores tropicais. In: Congresso Brasileiro

de Genética, 51. Águas de Lindóia. p. 510.

AZAMBUJA, A.C. 2009. Demografia e fenologia reprodutiva de Butia capitata (Mart.)

Becc. (Arecaceae) em Arambaré, Rio Grande do Sul. Dissertaçao de Mestrado,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 47 p.

BILENCA , D. & MIÑARRO, F. Identificación de Áreas Valiosas de Pastizal (AVPs)

en las Pampas y Campos da Argentina, Uruguay y Sur de Brasil. Buenos Aires:

Fundación Vida Silvestre, 2004. 323 p.

CAIN, M.L.; BROOK, G.M.; STRAND, A.E. 2000. Long-distance seed dispersal in

plant population. Am. J. Bot., 87(9):1217-1227.

CARDOSO, M.C.L. 1995. El palmar, la palma y el butiá. PROBIDES. Fichas

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CHASE, M.; KESSELI, R. & BAWA, K. 1996. Microssatellite markers for population

and conservation genetics of tropical trees. Am. J. Bot., 83: 51-57.

CHEBATAROFF, J. 1971. Condiciones ecológicas que influyen en la distribución de

las palmeras del Uruguay. Facultad de Humanidades y Ciencias, Montevideo,

Uruguay. 24p.

COCKERHAM, C.C. 1969. Variance of gene frequencies. Evolution, 23: 72-84.

COCKERHAM, C. C. & WEIR, B. S. 1993. Estimation of Gene Flow From F-

Statistics.Evolution, 47(3): 855-863.

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COELHO, A.S.G. 2000. Programa EG: Análise da estrutura genética de populaçoes

pelo método da análise de variancia (software). Universidade Federal de Góias, ICB,

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