UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · iluminando e dando forças para continuar batalha de ... Aos amigos do Laboratório de Microbiologia do Solo José ... Andrade

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA

QUALIDADE DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE

CARNEIROS ALIMENTADOS COM ÁCIDOS GRAXOS POLI-

INSATURADOS COMPLEXADOS COM SAIS DE CÁLCIO

TARSIZIO DA SILVA SANTOS

SÃO CRISTÓVÃO / SE 2013

i


QUALIDADE DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE CARNEIROS

ALIMENTADOS COM ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS

COMPLEXADOS COM SAIS DE CÁLCIO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da Universidade

Federal de Sergipe como requisito à obtenção do

título de Mestre em Biotecnologia na área de

concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.

Orientador: Dr. Hymerson Costa Azevedo

Co-orientador: Dr. Alexandre Nizio Maria

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE – BRASIL

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

Santos, Tarsizio da Silva

S237q Qualidade de sêmen criopreservado de carneiros alimentados com ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio / Tarsizio da Silva Santos ; orientador : Hymerson Costa Azevedo. – São Cristóvão, 2014. 86 f. : il. Dissertação (mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)

– Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2014.

O 1. Biotecnologia. 2. Ovino. 3. Criopreservação - Sêmen. 4.

Ácidos graxos poli-insaturados. I. Azevedo, Hymerson Costa, orient. II. Título.

CDU: 606:636.32/.38

iii


QUALIDADE DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE CARNEIROS

ALIMENTADOS COM ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS

COMPLEXADOS COM SAIS DE CÁLCIO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da Universidade

Federal de Sergipe como requisito à obtenção do

título de Mestre em Biotecnologia na área de

concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE – BRASIL

2013

iv

DEDICO

Aos minhas tias Gilzete e Janete e minha mãe Crismélia

Mesmo com dificuldades vocês estiveram me incentivando. Ofereço a vocês

essa minha conquista com a mais profunda sinceridade e carinho. Vocês lutaram para

que os meus sonhos se tornassem realidade. Com vocês aprendi a ter fé, com as

minhas melhores lembranças, a ter amor em tudo o que o que faço. Que Deus continue

iluminando e dando forças para continuar batalha de vocês. E que eu possa sempre

sentir e ter esse amor por vocês em todos os momentos de minha vida.

v

Ao meu eterno amor, Érika Ferreira

É incondicional o amor que eu tenho por você, pois nos momentos em que estive

ausente pensava em ti. E nos momentos que estávamos juntos, vivenciávamos com

muita felicidade a concretização de diversos sonhos de maneira inesquecível.

Certamente alguém já tentou descrever o amor, encontrar palavras que

expressasse com precisão a sensação gostosa que num passe de mágica é capaz de

modificar uma vida inteira. Fizeram poemas, músicas e tentaram representar este

sentimento de mil maneiras numa busca que não para, numa tentativa quase que

desesperada de tentar em palavras o que temos no coração, sei que não serei o único a

tentar falar sobre o amor, mas quero que você perceba nisso um gesto que é a

verdadeira intenção de expressar tudo o que estou sentindo.

E principalmente que perceba que é a responsável por tanta alegria.

Desejo que o tempo esteja sempre ao meu favor, e que a cada dia eu possa

demonstrar o quanto tudo que estamos vivendo juntos tem sido importante e o quanto

desejei encontrar alguém com você.

Quero sempre tê-la ao meu lado e sentir a felicidade de perto me faz ver que

tenho a maior bênção que Deus me deu.

Te amo!

vi

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A Deus acima de tudo

Antes de Jesus se tornar humano houve uma reunião no céu. Para essa reunião

os anjos não foram convidados, apenas o Pai, o Filho e o Espírito Santo. Então o Pai

perguntou ao Filho:

- Você poderia salvar a humanidade?

O filho logo respondeu:

- Claro que sim meu Pai.

O Filho na glória era chamado de Verbo Vivo.

Então o Filho diz ao Espírito Santo:

- Eu precisarei de ti, para que eu possa me despir da minha forma divina e me

torne humano.

A Palavra de Deus afirma que Ele se despiu dEle mesmo. Deus se despiu da

forma divina e se tornou humano.

Então agradeço pela minha salvação que sempre foi à vontade do Pai e antes do

meu nascimento, pois Cristo disse:

- Pai que seja feita a sua vontade.

Pela capacidade do Espírito Santo de transformar o Filho de Deus em Filho do

homem e de me transformar espiritualmente em filho de Deus.

O Pai esteve sempre nos céus, o Filho veio, morreu, ressuscitou e voltou

sozinho para viver à destra do Pai. O Espírito Santo veio, mas quando ele voltar, não

retornará sozinho.

(mensagem do Pr. David Andrade)

vii

AGRADECIMENTOS

À Embrapa Tabuleiros Costeiros pela liberação de funções, pelo suporte durante o

curso e pelo incentivo para o desenvolvimento de trabalhos de pesquisa futuros.

Ao Programa de Pós-graduação de Biotecnologia em Recursos Naturais da

Universidade Federal de Sergipe (UFS) pela oportunidade de aprimoramento técnico-

científico, experiência acadêmica e pelo inestimável apoio financeiro fornecido para

execução dos experimentos.

Ao meu orientador, Hymerson Costa Azevedo, antes de tudo, por ter me aceitado como

orientando sem nenhum conhecimento prévio; em seguida, por ter confiado e acreditado

na minha capacidade para desenvolver os trabalhos que nos propomos e finalmente,

por fornecer os subsídios necessários para a execução do projeto, ajudar a esclarecer

as dúvidas com imensa experiência e contribuição intelectual.

Aos pesquisadores Alexandre Nizio, Paulo Falanghe, Marcelo Fernandes pelo

indispensável auxílio e experiência no trabalho.

Aos companheiros de trabalho Jadson Pinheiro, Allan Charles e Ana pela boa

convivência e preciosa colaboração, especialmente José Eduardo Matos, pela sua

cooperação e amizade nas mais diversas situações.

Às pessoas que fizeram parte e compõe a seção do Programa de Pós-graduação de

Biotecnologia em Recursos Naturais (UFS), Jackeline Rittes, Adriano sempre

prestativos e gentis ao atendimento das nossas solicitações.

Ao todos os funcionários do Campo experimental Pedro Arle, Unidade do EMBRAPA

Tabuleiros Costeiros e nos ajudarão de forma grandiosa com os devidos cuidados com

os animais.

A todos os colegas do curso, por estarmos juntos nos momentos mais difíceis dos

estudos, um ajudando o outro.

A amiga de todas as horas Rebeca da Silva Santos, pela sua cooperação e amizade

nas mais diversas situações.

Aos amigos do Laboratório de Microbiologia do Solo José Guedes Sena, Isis e Carlos

Rodolfo Sampaio pelo apoio e colaboração e pelos momentos de descontração e

companheirismo.

Aos professores do Programa de Pós-gradução de Biotecnologia em Recursos Naturais

da UFS, em especial à Roberta Fernandes, Marcelo Fernandes, Paulo, Leandro Bacci e

Charles Santos Estevam pelo apoio e orientação.

Aos amigos que durante esse período fizeram parte trabalhos do Laboratório de

Reprodução Animal – EMBRAPA Tabuleiros Costeiros – Claydson, Mayana, Pábola,

viii

Flávia, Gisele, Joffson, Diva, André, Allan Resende, Coutinho, Vinícius, Alisson, Evelyn

pela colaboração e saudável convivência.

Aos meus amigos, irmãos, em especial Eduardo Cavalcante, Adeí Cavalcante, David

Andrade e Jair pela contribuição espiritual.

A todos que colaboraram direta ou indiretamente com meu mestrado.

ix

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................ xi

LISTA DE SÍMBOLOS ................................................................................................... xiii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................ xiv

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... xv

RESUMO ...................................................................................................................... xvii

ABSTRACT .................................................................................................................. xviii

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13

2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 15

2.1. Formação do Espermatozoide ...................................................................... 15

2.2. Aspectos Estruturais e Funcionais do Espermatozoide ............................ 15

2.2.1. Estrutura e Dinâmica das Membranas Espermáticas ............................. 17

2.3. Avaliação da Integridade e Funcionalidade Espermática .......................... 18

2.3.1. Avaliação Computadorizada da Cinética Espermática ........................... 18

2.3.2. Avaliação das Injúrias Espermáticas ...................................................... 20

a) Integridade das Membranas dos Espermatozoides ............................. 20

b) Avaliações Simultâneas das Membranas Espermáticas ...................... 22

2.3.3. Avaliação da Capacitação e Reação Acrossomal .................................. 23

2.4. Espermatozoides e os Ácidos Graxos Poli-insaturados............................. 25

2.4.1. PUFAs da Série n-3................................................................................. 25

a) Ácido - Linolênico.............................................................................. 25

b) Ácido Docosahexaenoico.................................................................... 27

2.4.2. PUFAs da Série n-6................................................................................. 27

a) Ácido Linoleico e -Linolênico............................................................. 28

b) Ácido Araquidônico............................................................................. 28

2.5. Influência dos Ácidos graxos na Criopreservação ..................................... 29

2.6. Extração e Separação dos Ácidos Graxos................................................... 30

3. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 32

ARTIGO CIENTÍFICO: Viabilidade e Funcionalidade de Espermatozoides

Criopreservados de Carneiros Alimentados com Ácidos Graxos Poli-insaturados

Complexados com Sais de Cálcio................................................................................... 42

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 42

2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 44

2.1. Local e Animais do Experimento......................................................................... 44

2.2. Dietas e Delineamento Experimental.................................................................. 44

x

2.3. Colheita e Análise do Sêmen in natura............................................................... 44

2.4. Experimento 1: Perfil cromatográfico dos ácidos graxos dos espermatozoides. 46

2.5. Experimento 2: Congelação, descongelação e análise do sêmen

criopreservado..................................................................................................... 47

2.6. Qualidade dos espermatozoides criopreservados de carneiros alimentados

com Ácidos Graxos Poli-Insaturados Complexados com Sais de Cálcio............ 48

2.6.1. Avaliação Computadorizada da Cinética................................................... 48

2.6.2. Viabilidade Espermática............................................................................ 49

2.6.3. Capacitação e Reação Acrossomal.......................................................... 50

2.7. Análise Estatística............................................................................................... 51

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 53

4. CONCLUSÃO............................................................................................................ 65

5. REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 66

ANEXOS - Tabelas ........................................................................................................ 74

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

g micrograma;

L microlitro;

M micromolar;

m micrômetro;

ALH (amplitude of lateral head) - amplitude lateral da cabeça;

AR padrão de reação acrossomal do espermatozoide – teste da CTC;

B padrão de capacitação espermática – teste da CTC;

BCF (Beat/Cross Frequency) - frequência do batimento flagelar;

C14:0 ácido mirístico

C18:0 ácido esteárico

C16:1n7 ácido palmitoleico

C18:1n9 ácido oleico

C18:2n6 ácido linoleico

C18:3n3 (ALA) - ácido -linolênico

C18:3n6 (GLA) - ácido -linolênico

C20:1n9 ácido eicosenoico

C20:4n6 ácido araquidônico

C22:4n6 ácido docosatetraenoico

C22:6n3 (DHA) - ácido docosahexaenoico

CTC clortetraciclina;

DABCO 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octano;

DHA ácido docosahexaenoico;

DMSO dimetilsulfóxido;

DNA ácido desoxirribonucleico

DPA ácido docosapentaenoico

EthD homodímero de etídio;

EthD+ padrão de célula viável ou viva;

EthD- padrão de célula não-viável ou morta;

F padrão de ausência de capacitação e reação acrossomal do

espermatozoide – teste da CTC;

FITC-PSA aglutinina de Pisum sativum conjugada a isotiocianato de fluoresceína;

g força gravitacional;

G0 grupo experimental – dieta controle: sem adição de ácidos graxos poli-

insaturados complexados com sais de cálcio;

G3 grupo experimental – dieta com 3% de ácidos graxos poli-insaturados

complexados com sais de cálcio;





Hz hertz;

IA inseminação artificial;

IMA integridade da membrana acrossomal;

xii

IMP integridade da membrana plasmática;

JC-1 iodeto de 5,5’,6,6’tetracloro-1,1,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina;

LIN (Linearity) - linearidade;

M molar;

Mcal megacalorias;

mg miligrama;

mL mililitro;

mOsm miliosmol;

mM milimolar;

P0 período zero ou início da administração das dietas;

P30 período 30 ou 30 dias após o início da administração das dietas;



MP (progressive motile) - motilidade progressiva;

n número de unidades experimentais;

N2 nitrogênio;

NS não significativo;

N2L nitrogênio líquido;

p nível de significância;

PBS solução tamponada de Dulbecco;

pH concentração de íons hidrogênio;

PI (propidium iodide) - iodeto de propídio;

PMM potencial da membrana mitocondrial;

PSA aglutinina de Pisum sativum;

PUFAs (polyunsaturated fatty acids) - ácidos graxos poli-insaturados;

PUFA-Ca ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio;

PUFAs somatório de ácidos graxos poli-insaturados;

r coeficiente de correlação;

RAP percentual de espermatozoides rápidos;

R123 rodamina 123;

ROS espécies reativas do oxigênio;

s segundos

SFA (saturated fatty acids) - ácidos graxos saturados;

SFA somatório de ácidos graxos saturados;

sptz (spermatozoa) - espermatozoide;

STR (Straightness) - retilinearidade;

VAP (Average Path Velocity) - velocidade média do percurso;

VCL (Curvilinear Velocity) - velocidade curvilinear;

VSL (Straight-line Velocity) - velocidade em linha reta;

m/s micrômetros por segundo.

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS

= igual;

+ mais / positivo;

- menos / negativo;

% porcentagem;

mais ou menos

grau;

C graus Celsius;

> maior;

< menor;

maior ou igual;

menor ou igual;

marca registrada;

x vezes;

: para (ex.: 1:100 – uma parte para cem partes).

somatório.

xiv

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Esquema experimental simplificado destacando a análise, diluição e

envase do sêmen in natura de cada período............................................. 47

Esquema simplificado do processamento para criopreservação e análises do sêmen descongelado de cada período................................................. 48

Ordenação em duas dimensões do perfil dos ácidos graxos e os parâmetros dos espermatozoides criopreservados de carneiros alimentados com dieta controle (G0) e 9% PUFAs-Ca (G9) aos 90 dias após o início da administração das dietas................................................. 55 Correlações entre a qualidade dos espermatozoides (SQ), expressa por amostras do grupo controle e a dieta 9% ao longo do eixo NMS 1, e a variável que descreve a velocidade curvilinear (VCL). Dieta controle ( ); dieta 9% ( ). As barras horizontais e verticais indicam desvio padrão ± 1 para os escores NMS e variáveis da qualidade dos espermatozoides, respectivamente......................................................................................... 62 Correlações entre a qualidade dos espermatozoides (SQ), expressa por amostras do grupo controle e a dieta 9% ao longo do eixo NMS 1, e a variável que descreve a amplitude lateral da cabeça (ALH). Dieta controle ( ); dieta 9% ( ). As barras horizontais e verticais indicam desvio padrão ± 1 para os escores NMS e variáveis da qualidade dos espermatozoides, respectivamente......................................................................................... 62

.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Procedimento de permutação multi-resposta (MRPP) comparando o grupo

controle e os demais tratamentos tanto em relação ao perfil de AG dos

espermatozoides de cada grupo (médias nos eixos 1 e 2 do NMS,

simultaneamente) e as médias em cada eixo da escala multidimensional

não-métrica (NMS) separadamente, dentro de cada período...................... 53

Tabela 2. Coeficientes de correlação dos ácidos graxos (AG) entre o perfil de AG dos

grupos G0 e G9 representado pelas médias das amostras ao longo dos

eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica

(NMS)........................................................................................................... 54

Tabela 3. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico no

grupo controle e na dieta de 9% de poli-insaturados complexados com sais

de cálcio dos espermatozoides criopreservados de carneiros durante os 90

dias............................................................................................................... 54

Tabela 4. Coeficientes de correlação dos parâmetros dos espermatozoides

criopreservados de carneiros dos grupos G0 e G9 representados pelas

médias das amostras ao longo eixos 1 e 2 através da Escala

Multidimensional Não-Métrica (NMS)........................................................... 56

Médias desvio-padrão dos parâmetros de cinética e viabilidade

espermática, e padrão de capacitação e reação acrossomal no grupo

controle e na dieta de 9% de poli-insaturados complexados com sais de

cálcio dos espermatozoides criopreservados de carneiros.......................... 56

Tabela 6. Composição e análises das dietas (MATOS et al., 2012)............................ 73

Tabela 7. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico dos

ácidos graxos dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos

diferentes grupos experimentais dentro de cada período............................ 74

Tabela 8. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico dos

ácidos graxos dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos


Tabela 9. Médias desvio-padrão dos parâmetros cinéticos dos espermatozoides

criopreservados de carneiros nos diferentes grupos experimentais dentro de

cada período................................................................................................ 76

Médias desvio-padrão dos parâmetros cinéticos, viabilidade, capacitação e

reação acrossomal dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos


Tabela 5.

Tabela 10.

xvi

Tabela 11. Coeficientes de correlação dos ácidos graxos (AG) entre o perfil de AG dos

grupos experimentais representados pelas médias das amostras ao longo

dos eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS)

dentro de cada período experimental........................................................... 78

Coeficientes de correlação dos parâmetros dos espermatozoides

criopreservados de carneiros representados pelas médias das amostras ao

longo eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS)

dentro de cada período experimental........................................................... 79

Tabela 12.

xvii

RESUMO SANTOS, Tarsizio da Silva. Qualidade do Sêmen Criopreservado de Carneiros Alimentados com PUFA-Ca. Sergipe: UFS, 2012. 79p. (Dissertação – Mestrado em Biotecnologia em Recursos Naturais)

Fontes de lipídios a base de ácidos graxos poli-insaturados têm sido usadas para melhoria dos aspectos quantitativos e qualitativos do sêmen criopreservado. A suplementação de óleos insaturados em dietas para ruminantes requer a adição de um protetor que facilite a sua absorção. O objetivo do estudo foi avaliar a influência de diferentes níveis de ácidos graxos poli-insaturados na dieta ao perfil de ácidos graxos e na qualidade dos espermatozoides criopreservados de carneiros. Vinte e quatro carneiros da raça Santa Inês foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos alimentados durante 90 dias com dietas isoprotéicas: G0 - sem ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio (PUFA-Ca) e G3, G6 e G9 com PUFA-Ca em teores de 3, 6, 9%, respectivamente. O sêmen foi coletado e congelado em palhetas nos períodos: 0 (P0), 30 (P30), 60 (P60) e 90 (P90) dias do início da administração das dietas. As amostras de sêmen in natura foram analisadas quanto à motilidade subjetiva, e ao perfil de ácidos graxos, enquanto que aquelas descongeladas foram analisadas quanto à cinética espermática em sistema computadorizado, integridade das membranas espermáticas e capacitação e reação acrossomal. Os dados obtidos foram submetidos à análise multivariada com o teste de comparação de médias entre os tratamentos, quanto ao perfil de ácidos graxos dentro do P90, com o coeficiente de correlação para os eixos 1 e 2 NMS e com coeficiente de correlação dos parâmetros dos espermatozoides para os eixos 1 e 2 NMS com teste de Monte Carlo, ao nível de significância mínimo de 5%. No experimento 1 foram identificadas menores proporções

dos ácidos esteárico, oleico, -linolênico, araquidônico nos espermatozoides dos carneiros do grupo tratado com 9% de PUFAs-Ca (G9), quando comparado ao grupo controle (G0) aos 90 dias da administração da dieta. No experimento 2 foram observadas menores médias nos parâmetros cinéticos ALH e VCL dos espermatozoides dos carneiros alimentados pela dieta 9%. Conclui-se que a suplementação da dieta de carneiros com 9% de ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio por um período de 90 dias produz uma mudança no perfil de ácidos graxos dos espermatozoides ovinos associada significativamente à diminuição das proporções dos

ácidos esteárico, oleico, -linolênico, araquidônico, do somatório de ácidos graxos poli-insaturados e da razão entre os somatório dos ácidos graxos poli-insaturados e saturados, além de reduzir a qualidade do sêmen criopreservado associada ao deslocamento lateral da cabeça e a velocidade curvilinear. Palavras-chave: ovinos; espermatozoides; criopreservação; ácidos graxos poli-insaturados. Comitê de Orientação: Hymerson Costa Azevedo – UFS (Orientador), Alexandre Nizio Maria (Co-orientador), Paulo César Falanghe Carneiro – UFS.

xviii

ABSTRACT SANTOS, Tarsizio da Silva. Semen Cryopreservation Quality of Rams Fed with PUFA-Ca. Sergipe: UFS, 2012. 79p. (Dissertation - MSc in Biotechnology in Natural Resources) Sources of lipids based on polyunsaturated fatty acids have been used for qualitative improvement of cryopreserved semen. Supplementation of diets with unsaturated oils for ruminants is recommended with the addition of a protector to facilitate their absorption. The objective of this study was to evaluate the influence of different levels of polyunsaturated fatty acids in the diet on the fatty acid view and quality of the semen cryopreservation of rams. Twenty-four Santa Inês raced rams were randomly distributed into four groups fed with isoproteic diets: G0 - without polyunsaturated fatty acids complexed with calcium salts (Ca-PUFA) and G3, G6 and G9 with Ca-PUFA levels in 3, 6, 9%, respectively. The semen was collected and frozen in French straws in the following periods: 0 (P0), 30 (P30), 60 (P60) and 90 (P90) days beginning the administration of diets. The fresh semen samples were analyzed for motility subjective, and the fatty acid profile, while samples of frozen-thawed semen were analyzed for sperm kinetics in a computerized system, evaluation of sperm membranes integrity, sperm capacitation and acrossome reaction. The results were subjected to a multivariate analysis including comparison tests of average between treatments on fatty acid profile in the P90, with the correlation of coefficient for axis 1 and 2 NMS and correlation of coefficient of the parameters of sperm for axis 1 and 2 NMS with a Monte Carlo test, at the significance level of 5%. It was identified in experiment 1 were identified lower

proportions of stearic acid, oleic, -linolenic, arachidonic sperms in groups of rams treated with 9% Ca-PUFAs (G9) when compared to the control group (G0) after 90 days of administration diet. It was observed in experiment 2 a lower average kinetic parameters ALH and VCL of semen from rams fed with 9% diet. It was concluded that supplementing the diet with 9% Ca-PUFA after 90 days, produces no changes in the kinetic parameters such as curvilinear velocity and amplitude of lateral head of semen

cryopreservation produced by rams, even containing lower proportions of oleic, - linolenic and arachidonic. Keywords: rams, sperm, cryopreservation, polyunsaturated fatty acids.

13

1. INTRODUÇÃO

A criopreservação é um processo biotecnológico que viabiliza o uso do sêmen

pós-congelação. A melhoria na qualidade desse germoplasma em ovinos pode facilitar

a conservação e distribuição de material genético de relevância, do ponto de vista

comercial, e de preservação da biodiversidade da espécie (AZEVEDO, 2006).

Uma técnica reprodutiva associada ao sêmen congelado é a inseminação

artificial (IA) cuja aplicação potencializa o melhoramento genético, disseminando os

genes dos animais, aumentando a eficiência dos rebanhos e contribuindo para

melhoria dos produtos (SELAIVE–VILARROEL, 1991).

O incremento na qualidade do sêmen congelado pode ser obtido pela

incorporação de biomoléculas integrantes da estrutura celular gamética masculina.

Entre as várias biomoléculas que exercem efeito sobre a fisiologia dos gametas

masculinos estão os lipídios (KELSO et al., 1997). Os lipídios têm sido incorporados à

dieta com o objetivo de proporcionar melhorias na qualidade do sêmen de várias

espécies como suínos (ROOKE et al., 2001; MITRE et al., 2004), equinos (BRINSKO

et al., 2005), bovinos (POULOS et al., 1986; SULLIVAN et al., 2004), aves (SURAI et

al., 1998; ZANIBONI et al., 2006) e ovinos (SAMADIAN et al., 2010; FARAJI et al.,

2012). Ácidos graxos como oleico e linoleico foram avaliados após adição ao sêmen

apresentando resultados benéficos no potencial energético, na cinética, na

manutenção da viabilidade, na função e no status de capacitação dos

espermatozoides criopreservados (PERÉZ-PÉ et al., 2001).

Mesmo com a existência de muitas iniciativas para melhorar a fertilidade com

uso de sêmen congelado, envolvendo a adição de substâncias aos espermatozoides

em alguma fase da criopreservação, a ideia de modificar a composição das

membranas espermáticas antes da ejaculação, pela ingestão alimentar, representa

uma alternativa atraente para o sucesso da congelação.

A suplementação alimentar dos ruminantes com fontes de lipídios pode elevar

o teor de energia da dieta, tornando mais eficiente o desempenho produtivo dos

animais (GRUNERT et al., 2005). Os lipídios são utilizados na alimentação para

aumentar o conteúdo intramuscular de ácidos graxos poli-insaturados na carne,

especificamente aqueles de cadeias longas (PONNAMPALAM et al., 2002; GARCIA et

al., 2010) e do leite (ROTUNNO et al., 1998; SANZ SAMPELAYO et al., 2002).

A incorporação de óleos insaturados em dietas para ruminantes necessita da

adição de um protetor contra biohidrogenação e lipólise (DE GRAAF et al., 2007). Os

ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio (PUFA-Ca) são

14

caracterizados como nutrientes associados ao componente mineral, que possui o

objetivo de proteger a biomolécula lipídica da biohidrogenação ou lipólise (COSTA,

2007), por enzimas bacterianas secretadas no interior do rúmen, possibilitando a

transferência de ácidos graxos poli-insaturados para células intestinais, aumentando a

disponibilidade de energia e fornecendo as substâncias essenciais para formação dos

componentes de membrana e precursores de moléculas regulatórias (JENKINS, 1993;

MATTOS et al., 2000; SANTOS et al., 2008; VASCONCELOS & MAXIMO, 2010;

CERVONI, 2011).

O uso de ácidos graxos poli-insaturados complexados com objetivos

reprodutivos em ruminantes tem sido mais relacionado à fertilidade em fêmeas

(FUNSTON, 2004). A dieta de ruminantes com PUFA-Ca foi desenvolvida para

atender as necessidades energéticas de vacas de alta produção leiteira (PALMQUIST,

1984). Entretanto, pode ser aplicada aos espermatozoides de carneiros para aumentar

a resistência à congelação e descongelação (WATSON et al., 1991; HOLT et al., 1992;

GILLAN et al., 2004; PERIS et al., 2004).

É limitada a quantidade de trabalhos sobre o efeito de dietas à base de ácidos

graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio sobre os parâmetros dos

espermatozoides de ruminantes. Algumas pesquisas mostram melhorias na qualidade

seminal obtidas pela inclusão de ácidos graxos poli-insaturados a dieta de galos

(BLESBOIS et al., 1997; RODENAS et al., 2005), perus (BLESBOIS et al., 2004) e

suínos (MITRE et al., 2004; CASTELLANO et al., 2010). Contudo, o sistema digestivo

do ruminante apresenta peculiaridades que impossibilitam fazer uma relação com

estas espécies monogástricas (MATOS, 2012).

15

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. Formação do espermatozoide

Os espermatozoides são formados no interior dos testículos em um processo

denominado espermatogênese, que é dividido em três fases: a espermatocitogênese,

a meiose e a espermiogênese. Durante a espermatocitogênese, as células

germinativas dos testículos, conhecidas como espermatogônias dividem-se por mitose

para produzir outras células que se proliferam no parênquima testicular durante toda

vida adulta do macho. As espermatogônias diferenciam-se para produzir

espermatócitos primários que sofrem meiose, permitindo mudanças no material

genético por meio da produção de espermátides haploides. Na espermiogênese, as

espermátides diferenciam-se a partir de células com núcleo esférico em células

germinativas maduras na forma de espermatozoides. Nesta última fase, o flagelo é

desenvolvido formando uma cauda e, a cabeça do espermatozoide é composta de um

núcleo condensado, fonte do genoma do macho, e o acrossomo, com enzimas

necessárias para penetrar na zona pelúcida do óvulo (JOHNSON et al., 2000).

Quando os espermatozoides são liberados do epitélio seminífero eles são

conduzidos para um único duto altamente enrolado chamado de epidídimo. Na cabeça

e no corpo do epidídimo ocorre uma série de eventos relacionados com a maturação

das células espermáticas como a síntese e secreção de glicoproteínas, reabsorção do

fluido tubular seminífero, transporte ativo de íons e de proteínas através do epitélio,

drenagem do excesso de citoplasma residual do espermatozoide e mudanças na

estrutura das membranas plasmática e acrossômica, incluindo mudanças na peça

intermediária e expressão de diferentes antígenos de superfície. Esses eventos

alteram a morfologia e o metabolismo das células espermáticas e estão associados

com a capacidade de fundir e fertilizar o oócito (EDDY, 2001; HASCHEK et al., 2010).

Em mamíferos como carneiros o tempo de espermatogênese somado ao trânsito do

espermatozoide no epidídimo é de aproximadamente 60 a 70 dias (CUNNINGHAM &

KLEIN, 2008).

2.2. Aspectos Estruturais e Funcionais do Espermatozoide

Uma característica pertencente aos espermatozoides é a subdivisão da

membrana plasmática em domínios regionais que diferem em sua composição e

função. Detecção da distribuição de carga de superfície, ligações com lectinas,

16

padrões de crio-fraturas, uso de agentes de intercalação, e ligações com anticorpos

compreendem fatores que demonstram a natureza heterogênea da superfície

espermática. As características estruturais especializadas fornecem ao

espermatozoide a capacidade única de realizar sua atividade funcional. O acrossomo

contém enzimas essenciais que exercem ligações em sítios catalíticos localizados no

revestimento do oócito durante a fertilização. O flagelo consome energia necessária

para proporcionar motilidade. Essas funções são essenciais para assegurar a

transferência do material genético contido no núcleo espermático para o citoplasma do

oócito, onde ocorre a fusão entre os pró-núcleos haploides masculino e feminino para

produzir o zigoto (EDDY, 2001).

A composição bioquímica da membrana plasmática dos espermatozoides é

constituída em maior parte de fosfolipídios (EDDY, 2001). Esses componentes contêm

em sua estrutura molecular moléculas precursoras denominadas de ácidos graxos.

(LEHNINGER & COX, 2011). Um dos ácidos graxos mais abundantes é o

docosahexaenoico (DHA), que constitui 61% dos fosfolipídios das células

espermáticas de touros e carneiros (NEILL & MASTERS, 1973; SPEAKE et al., 2003).

Esse lipídio está relacionado a diversas funções biológicas reprodutivas em mamíferos

(PARKS & HAMMERSTEDT, 1985; ROOKE et al 2001; OLIVEIRA et al, 2006).

Relatos apontam que a quebra de ligações químicas entre fosfolipídios e a

membrana dos espermatozoides na cauda epididimária, não resulta na elevação da

sua concentração no plasma seminal, designando que eles são deslocados do lúmen

dos túbulos ou catabolizados in situ (QUINN & WHITE, 1967). Os espermatozoides de

carneiros são capazes de romper ligações existentes de fosfolipídios (LARDY &

PHILLIPS, 1941; HARTREE & MANN, 1961) e tem sido proposto que as substâncias

remanescentes de ácidos graxos de fosfolipídios intracelulares atuam como uma fonte

de energia para os espermatozoides no epidídimo (SCOTT et al., 1967).

A composição heterogênea, diferença na disposição desses lipídios, pela

presença de barreiras intramembranosas que impedem a permuta livre entre os

domínios influencia significativamente na difusão da bicamada lipídica entre os

domínios de superfície da membrana plasmática dos espermatozoides. Os lipídios de

membrana exercem influência na regulação da migração polarizada dos antígenos de

superfície do espermatozoide durante o processo de capacitação. Em células

espermáticas vivas de ovinos e de outras espécies, o coeficiente de difusão de lipídios

de membrana demonstrou ser significativa maior no acrossomo e região pós-

acrossomal quando comparado com a peça intermediária e a peça principal da cauda.

Estes aspectos destacam a regionalização da membrana plasmática do

espermatozoide e sugerem que as diferenças na composição e/ou na organização dos

17

lipídeos entre os domínios possam estar alicerçados em fenômenos como a migração

de antígenos e a fusogenicidade da membrana durante o desenvolvimento

espermático (WOLFE et al., 1998).

2.2.1. Estrutura e Dinâmica das Membranas Espermáticas

Um processo multivariado que tem sido correlacionado com modificações na

distribuição e composição dos fosfolipídios, no pH intracelular, metabolismo e na

concentração intracelular de monofosfato cíclico de adenosina e fluidez da membrana

plasmática é a capacitação espermática (ROLDAN & GOMENDIO, 1992; GORDON,

1994; PÉREZ et al., 1996a; GILLAN et al., 1997; VISCONTI et al., 1998; OLIVEIRA,

2002). In vivo, esse fenômeno é caracterizado quando os espermatozoides são

ativados e adquirem potencial de fertilização no trato genital feminino, principalmente

no istmo do oviduto. (YANAGIMACHI, 1994; PÉREZ et al., 1996a; ASSUMPÇÃO,

1999; PEREIRA et al., 2000).

Para concluir o processo de capacitação, há demanda de íons cálcio (Ca2+)

pelos espermatozoides humanos, assim como os de camundongos. A elevação da

concentração de Ca2+no meio extracelular proporciona aumento na quantidade de

espermatozoides humanos que sofrem a transição do estado de não capacitação para

o estado de capacitação (DasGUPTA et al., 1993).

Quanto ao tempo suficiente para a capacitação in vitro, há uma considerável

diferença entre as espécies. Essas variações acontecem em decorrência das

diferenças inatas nas características físico-químicas da membrana plasmática. O

tempo requisitado para a capacitação, sendo in vivo ou in vitro, também não é

notoriamente preciso. O intervalo de tempo possui variações conforme o estágio

fisiológico do animal e a composição físico-química do meio. Condições que propiciam

a estabilidade das membranas espermáticas prolongam o tempo de capacitação; por

outro lado, existe uma diminuição à medida que as condições desestabilizam as

membranas. Não se espera que ocorra uma capacitação simultânea entre todos os

espermatozoides de um mesmo ejaculado. Alguns podem exibir tempo menor que

outros mesmo em condições idênticas. Além disso, existe uma variação individual na

mesma espécie, comparando células espermáticas quanto ao tempo de capacitação

(YANAGIMACHI, 1994).

Em princípio, capacitação completa do espermatozoide ocorre a reação

acrossomal. As células espermáticas são induzidas a receber um estímulo adequado

que possibilita a ocorrência da reação acrossomal (YANAGIMACHI, 1994), sendo esta

considerada como pré-requisito (JAISWAL et al., 1998). Capacitando-as a atravessar a

18

zona pelúcida e a se fundir com a membrana plasmática do ovócito (YANAGIMACHI,

1994).

O fenômeno da reação acrossomal constitui no aumento intra-espermático de

mediadores iônicos por endocitose, incluindo o Ca2+. Estudos têm demonstrado que

existe influência do cálcio extracelular na capacitação em várias espécies de

mamíferos (VISCONTI et al. 1995; LUCONI et al. 1996; TARDIF et al. 2001). Grasa et

al. (2006) avaliaram os efeitos da capacitação espermática em ovinos em reposta a

vários componentes inclusive o Ca2+ e identificaram que a adição de uma alta

concentração extracelular de Ca2+ para um meio contendo bicarbonato não aumenta a

subpopulação capacitados e eleva a de acrossomos reagidos.

Panneerdoss, et al., (2012) obtiveram a diminuição de Ca2+ intracelular de

espermatozoides de camundongos com a adição de 5-metoxi-indole-2-carboxílico que

inibiu a ação da enzima Dihidrolipoamida Deidrogenase. A inibição enzimática

estabeleceu a redução significativa de células capacitadas e que sofreram reação

acrossômica.

2.3. Avaliação da Integridade e Funcionalidade Espermática

A qualidade seminal em conjunção com a fertilidade é de suma importância

na produção animal. Análises são desenvolvidas para estabelecer a qualidade seminal

para sua validação e aplicação em inseminações artificiais, o que torna de

fundamental relevância uma avaliação precisa (PERIS et al., 2004). Análises por

sondas fluorescentes das membranas, plasmática, acrossomal e mitocondrial e o uso

de sistemas computadorizados para avaliação da motilidade espermática, são ensaios

que elucidam de forma objetiva a qualidade seminal (CELEGHINI et al., 2007).

2.3.1. Avaliação Computadorizada da Cinética Espermática

A maturação da célula espermática é caracterizada por mudanças; uma delas

é a capacidade de adquirir habilidade para se deslocar quando esta inicia o contato

com o plasma seminal e outros meios fisiológicos. O espermatozoide deve locomover-

se por meio do muco cervical, percorrendo o útero, até o oviduto chegando a porção

da ampola onde é realizada a fertilização. Cada padrão de motilidade espermática

está relacionado a um desses sítios, sendo que as células espermáticas sofrem

alterações durante o trajeto no trato reprodutivo da fêmea como é o caso da

capacitação. Os padrões de motilidade espermática são diferenciados essencialmente

19

por causa das variações na formação físico-química dos microambientes a que são

inseridos (MORTIMER, 1997).

Acredita-se que a motilidade seja um dos parâmetros mais importantes

relacionados à capacidade de fertilização do espermatozoide. Esse atributo da cinética

é imprescindível para a condução do espermatozoide por meio do trato reprodutivo da

fêmea e para a fertilização e é considerado uma manifestação da integridade e

viabilidade estrutural da célula espermática (VERSTEGEN et al., 2002).

Uma das avaliações mais adequadas de análise da cinética de um grande

número de células espermáticas é a de movimento espermático assistida por

computador. Essa análise parte do princípio que é feita uma reconstituição de cada

percurso realizado pela cabeça do espermatozoide (MORTIMER & MAXWELL, 2004).

Os sistemas computadorizados de análise de sêmen, a exemplo do Sperm Class

Analyzer (SCA 5.0) oferecem recursos que consiste em acessar diversos atributos em

uma única unidade amostral de células espermáticas com alta repetibilidade. As

diferenças na motilidade espermática avaliadas pelo método computadorizado são de

maior visibilidade se comparados com métodos subjetivos (FARREL et al., 1998).

Entre outras variáveis como motilidade total (MT) e progressiva (MP) três

valores para velocidade são frequentemente mensurados pela análise informatizada e

utilizados para a descrição da movimentação dos espermatozoides, a velocidade

curvilinear (VCL), a velocidade em linha reta (VSL) e velocidade média da trajetória

(VAP). Cada uma dessas velocidades descreve uma dimensão diferenciada do

percurso da célula espermática. O percurso curvilinear é um delineamento

bidimensional da real trajetória tridimensional (MORTIMER, 1997). De acordo com

Verstegen et al. (2002), a VCL é sempre a maior das três velocidades e serve como

elemento de cálculo para a linearidade. A VSL consiste na velocidade média em

função da linha reta estabelecida entre o primeiro e o último ponto da trajetória do

espermatozóide. É sempre a mais baixa das três velocidades. O valor de VAP

proporciona uma representação do comprimento da trajetória média do

espermatozoide e é obtido através do comprimento do caminho médio em relação ao

intervalo de tempo estabelecido para essa ação (MORTIMER, 1997; VERSTEGEN et

al., 2002 ). Em casos onde a trajetória da cabeça espermática é muito regular e linear

com pouco movimento lateral da cabeça, a VAP é quase a mesma que a VSL, porém

com trajetórias irregulares, não lineares ou onde existe um alto grau de movimento

lateral, a VAP será maior que a VSL. A VCL e a VAP também têm sido usadas para

proporcionar valores preditivos referentes a fertilização em razão de que ambos os

parâmetros possuem valores mais elevados no período pós-capacitação

(VERSTEGEN et al., 2002).

20

Além das velocidades, existem outros parâmetros como amplitude do

deslocamento lateral da cabeça (ALH), freqüência de batimento flagelar cruzado

(BCF), retilinearidade (STR), linearidade (LIN). O ALH, por exemplo, consiste da

amplitude do deslocamento médio da cabeça do espermatozóide em sua trajetória

real. A mensuração desse parâmetro esta relacionada com a capacidade de

penetração na zona pelúcida do óvulo, assim, o ALH é um dos parâmetros que tem

efeito sobre a fertilização. O BCF corresponde ao número de vezes que a cabeça do

espermatozoide cruza a direção do movimento. Se existem mais batimentos/segundos

que imagens/segundos, então, a BCF irá ser subestimada. Os valores de STR são

obtidos a partir do percentual entre VSL e VAP estimando a proximidade do percurso

da célula a uma linha reta (VERSTEGEN et al., 2002). A LIN compreende a relação

percentual entre VSL e VCL, ou seja, é a porcentagem de célula que tem índice linear

> 0.7, ângulo absoluto < 25° e ângulo algébrico < 3°. O afastamento do

espermatozoide em relação à velocidade em linha reta é inversamente proporcional a

sua linearidade (MORTIMER, 2000). Os valores de velocidade são determinados

como percurso relevante percorrido em um período de tempo e são representados em

μm/s, enquanto os valores de LIN, e STR são determinados como raio dos valores de

velocidade (AMANN & KATZ, 2004).

2.3.2. Avaliação das Injúrias Espermáticas

a) Integridade das Membranas dos Espermatozoides

Considera-se que a avaliação dos espermatozoides deve ser através de

técnicas que demonstram maior objetividade e replicabilidade. Entre os métodos de

avaliação dos espermatozoides, tem sido atribuído grande destaque ao uso de

fluorocromos, por seus atributos como biomarcadores específicos e capacidade de

detectar integridade estrutural ou funcional de forma esclarecedora (MEDINA, 1995,

CELEGHINI, 2005). As diferenças em afinidade dos fluorocromos por específicas

localidades do arcabouço celular espermático aparentemente é o produto de

interações destas com biomoléculas como lipídios e proteínas distribuídas

heterogeneamente no plasmalema (EDDY, 2001).

A avaliação da viabilidade dos espermatozoides é de extrema importância na

pesquisa e tecnologia de sêmen haja vista que trata-se de uma demanda

indispensável para a funcionalidade da célula espermática, baseando-se na

integridade da membrana plasmática (HARRISON & VICKERS, 1990; MEDINA, 1995;

21

PINTADO et al., 2000). Para diferenciar células viáveis e não viáveis diversos ensaios

têm sido usados como os flourocromos do tipo diacetato de carboxifluoresceína

(CFDA), iodeto de propídio (propidium iodide - PI) e o Hoechst 33342 (H342) para

demarcar a área da cabeça do espermatozoide (YÁNIZ et al., 2012). Fluorocromos

como o H342, PI e o homodímero de etídio (EthD-1), os quais possuem afinidade com

a carioteca, reagindo com o DNA somente quando o plasmalema está lesionado e/ou

permeabilizado, têm sido utilizados de forma extensa e específica na avaliação da

integridade espermática particularmente do sêmen ovino. Também como indicadores

de danos acrossomais, os fluorocromos proporcionam mais sensibilidade que as

análises clássicas, que baseiam-se no uso da microscopia de contraste de fase

(HARRISON & VICKERS, 1990; MEDINA, 1995; SUKARDI et al., 1997, GRASA, et al.,

2006; YÁNIZ et al., 2012).

Se algumas substâncias ou fluorocromos com permeabilidade à membrana

dispõem de uma afinidade específica pela membrana acrossomal ou aos

componentes acrossomais, eles podem ser úteis para estabelecer o status nessa

estrutura em células espermáticas usando um microscópio óptico de luz visível como

um de ultravioleta (YANAGIMACHI, 1994). As lectinas são unidades protéicas que se

unem a glicídios e têm sido marcadas por meio de fluorescência para avaliar o perfil

da estrutura da superfície das células espermáticas de mamíferos (CARDULLO &

FLORMAN, 1993). A análise que diferencia células com acrossomo reagido daquelas

com acrossomo intacto é baseada na marcação de lectinas que têm sido usadas para

distinguir especificamente as aglutininas derivadas do Pisum sativum (PSA), Arachis

hypogea (PNA) e Triticum vulgaris (WGA) (VALCÁRCEL et al., 1997). Existem

inúmeros benefícios no uso das lectinas como a disponibilidade comercial,

considerável baixo custo e reduzido tempo de marcação das células (CARDULLO &

FLORMAN, 1993). Proveniente de ervilhas comestíveis, a PSA tem sido associada

com a fluoresceína isotiocianato (FITC) sendo útil como corante da avaliação seletiva

de membrana acrossomal de espermatozoides em ovinos (SUKARDI et al., 1997;

VALCÁRCEL et al., 1997;).

Os métodos usados para determinar o dano acrossomal não podem distinguir

de forma instantânea entre modificações fisiológicas e degenerativas. Há uma

necessidade de mensuração do número de células envolvidas com estímulos

fisiológicos ou outros fenômenos como a reação acrossomal somente em populações

viáveis (PINTADO et al., 2000).

A função mitocondrial nos espermatozoides pode ser avaliada utilizando a

Rodamina 123 (R-123). Muitos indicadores que investigam o potencial de membrana

de mitocôndrias têm sido úteis no uso dos fluorocromos em conjunção com a

22

fluorometria, proporcionando uma estimativa inicial da qualidade seminal. Entre as

sondas com sensitividade ao potencial de membrana mitocondrial mais comuns

existem as rodaminas e as carbocianinas. A obtenção do sucesso na utilização dessas

substâncias em células vivas baseia-se no fato de não serem destrutivas nem

produzirem toxicidade. Também proporcionam uma avaliação rápida e precisa de

milhares de células espermáticas em cada unidade amostral, existindo reciprocidade

significativa com a motilidade. Portanto, a união da avaliação da motilidade com a do

potencial de membrana mitocondrial pode ser de grande utilidade para estimar a

proporção de células viáveis (CONNELL et al., 2002; MESEGUER et al., 2004;

CELEGHINI, 2005).

Aplicando a R-123, a função mitocondrial pode ser analisada de duas

maneiras. Espermatozoides que exibem a tonalidade intensa indicam aquelas células

que se incluem na população com mitocôndria funcional. Também se pode quantificar

individualmente a atividade no interior da mitocôndria, mensurando-se a intensidade

da fluorescência nessas células espermáticas (CONNELL et al., 2002). Avaliando a

função mitocondrial em espermatozoides ovinos, Souza (2007) obteve bons resultados

com Rodamina 123 que marcou de forma bem diferenciada a presença e ausência de

potencial de membrana.

b) Avaliações Simultâneas das Membranas Espermáticas

Nos últimos anos, as avalições simultâneas das membranas dos

espermatozoides têm sido aplicadas em pesquisas com a combinação de

fluorocromos, que são marcadores moleculares (CELEGHINI, 2005), utilizados em

análises simultânea de amostras num espaço de tempo, relativamente reduzido

(FARIA, 2011). Um dos primeiros experimentos com o uso simultâneo de fluorocromos

em espermatozoide ovino foi descrito por Harrison & Vickers (1990). Esses autores

misturaram dois fluorocromos para analisar viabilidade espermática de ovinos, o iodeto

de propídio (PI) e o diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e propuseram a

avaliação de categorias celulares diferenciadas a partir de comparações por

tonalidades exibidas por estruturas pertencentes à célula (AZEVEDO, 2006).

As técnicas que permitem a análise simultânea da integridade de membrana

plasmática e status acrossomal, por exemplo, possibilitam diferenciar o

espermatozoide que sofreu verdadeiramente a reação acrossomal daquele que

apresentou uma falsa reação acrossomal. A partir desse pressuposto, a combinação

dupla de fluorocromos foi inicialmente desempenhada para fazer a distinção

simultânea de células espermáticas viáveis de não viáveis e o status acrossomal em

23

ovinos (MEDINA, 1995; VALCÁRCEL et al., 1997; SUKARDI et al., 1997; GRASA, et.

al., 2006).

Experimentando a combinação de fluorocromos no sêmen de bovino,

Celeghini (2005) testou variedades de associações para análise simultânea da

integridade das membranas acrossomal e plasmática e da função mitocondrial: FITC-

PSA com PI e Rodamina 123 e ; FITC-PSA com PI e Mito Tracker Green FM (MITO);

FITC-PSA com PI e a Mito Tracker Red (CMXRos) e; FITC-PSA com PI e iodeto de

5,5’,6,6’tetracloro-1,1,3,3’- tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1).

Entre os protocolos avaliados quanto à combinação das sondas fluorescentes

PI, FITC-PSA e Rodamina 123 foi descrita devido a sua simplicidade, alta

repetibilidade e acurácia e por produzir um número considerável de observações

(dados não publicados de experimentos do Laboratório de Biotecnologia da

Reprodução Animal - EMBRAPA).

2.3.3. Avaliação da Capacitação e Reação Acrossomal

As alterações que surgem durante a capacitação, antecedendo a reação

acrossomal são muito mais complexas de serem acessadas (PÉREZ et al., 1996b).

Uma diversidade de ensaios indiretos tem sido determinada para analisar mudanças

no plasmalema espermático, porém muitos deles são indicativos de capacitação,

representados por fenômenos habitualmente avaliados tais como reação acrossomal e

capacidade fertilizante, representam eventos estes que não elucidam a transição para

a capacitação (GILLAN et al., 1997; AZEVEDO, 2006).

O aprimoramento de métodos para diagnosticar a capacitação espermática

tem relevância significativa para a avaliação da função espermática e para confrontar

a eficácia de técnicas de reprodução (PÉREZ et al., 1996b). A avaliação com uso de

fluorescência pela clortetraciclina (CTC) tem sido empregada em células espermáticas

de ovinos com o proveito de possibilitar não apenas a distinção entre células com

acrossomo intacto e reagido, mas também diferenciar as células com acrossomo

intacto em duas categorias funcionais, não capacitadas e capacitadas (DasGUPTA et

al., 1993; GILLAN et al., 1997; LAUSMANN et al., 2004).

Introduzido também como antibiótico, também denominado de aureomicina, o

CTC é um fluorocromo, classificado como quelante de cálcio utilizado para analisar o

transporte dessa última substância através das membranas mitocondriais.

Historicamente, ele também foi utilizada para avaliar a morfologia acrossomal em

células espermáticas de camundongo, primeiramente como corante vital (SALING &

24

STOREY, 1979) e em seguida com amostras fixadas (WARD & STOREY, 1984). A

clortetraciclina se une ao íon cálcio (Ca2+) disposto na membrana e pode ser

prontamente observada por microscopia de fluorescência (CARDULLO & FLORMAN,

1993; PÉREZ et al., 1996b).

A forma pela qual a emissão de fluorescência da CTC é espalhada varia no

decorrer da capacitação, sendo assim, existe uma atividade sinérgica entre o padrão

de distribuição do brilho fluorescente e o estágio de capacitação (CARDULLO &

FLORMAN, 1993; PÉREZ et al., 1996b). De acordo com a funcionalidade, células

espermáticas maduras de camundongo exibiram padrões de CTC diferenciados que

baseia-se na emissão intensa de fluorescência a partir da região anterior da cabeça e

da peça intermediária. Havendo uma perda de fluorescência da porção anterior da

cabeça concomitante ao processo de exocitose (CARDULLO & FLORMAN, 1993).

Experimentos pioneiros com CTC em camundongos, foram convencionados

e, têm sido utilizados nas mais diversas espécies, três padrões de fluorescência:

padrão F do termo em inglês full procedente do aspecto apresentado pelo

espermatozoide com a cabeça “completa” de fluorescência, padrão B do termo em

inglês banded procedente da aparência em forma de “faixa” da fluorescência

visualizada somente na região pós-equatorial e, padrão AR do termo acrosome

reaction que indica brilho fluorescente ausente na cabeça que exprime a reação

acrossomal como em ovinos (GILLAN et al., 1997 e 1999; MAXWELL et al., 1999;

PERIS et al., 2004), bovinos (FRASER et al., 1995; THUNDATHIL et al., 1999;

CORMIER et al., 1997), equinos (SCHEMBRI et al., 2002), suínos (HE et al., 2001;

HUO et al., 2002), camundongos (WARD & STOREY, 1984; CARDULLO &

FLORMAN, 1993) e humanos (DasGUPTA et al., 1993).

Gillan et al. (1997) convencionaram para ovinos uma nomenclatura idêntica e

originalmente descrita por Saling & Storey (1979) e Ward & Storey (1984) que

definiram uma proposta de classificação dos espermatozoides nas respectivas

categorias: padrão F - não capacitados e com acrossomos intactos, padrão B -

capacitados e com acrossomos intactos e, padrão AR – acrossomos reagidos. Os

autores mencionados organizaram as categorias I e II descritas por Pérez et al.

(1996b) como padrão F, sendo que as respectivas categorias foram visualizadas em

espermatozoides com acrossomo intacto que apresentavam um padrão de tonalidade

de cor distintas das células capacitadas. Ainda assim, um padrão visualizado com

frequência relativamente baixa, no qual espermatozoides que exibiram fluorescência

brilhosa na região pós-acrossomal e não ocorrência de brilho na região do acrossomo

foi classificada como padrão AR.

25

2.4. Espermatozoides e os Ácidos Graxos Poli-insaturados (PUFAs)

Os lipídios são considerados componentes celulares insolúveis em água,

também classificados como substâncias orgânicas oleosas ou gordurosas de

estruturas diversas, extraídas das células e tecidos por solventes não polares, como

clorofórmio, metanol ou éter (BLIGH & DYER, 1959; LEHNINGER & COX, 2011).

As unidades básicas de constituição de um lipídio são os ácidos graxos (AG),

sendo classificados em dois grandes grupos: saturados e insaturados. Os saturados

são os que não possuem duplas ligações na cadeia hidrocarbonada e os insaturados

exibem uma ou mais duplas ligações, podendo estar ligados a diferentes classes

lipídicas (PARKS & LYNCH, 1992; LEHNINGER & COX, 2011).

2.4.1. PUFAs da Série n-3

Essa família de PUFAs contém uma ligação dupla entre o terceiro e o quarto

carbono a partir da extremidade da cadeia com o grupo metil e é de importância na

nutrição dos vertebrados. Como o papel fisiológico dos PUFAs está mais relacionado à

posição da primeira ligação dupla próxima à extremidade da cadeia com o grupo metil

em vez da extremidade com a carboxil, uma nomenclatura alternativa algumas vezes é

utilizada para estas biomoléculas menos complexas. O carbono do grupo metil – isto é

o carbono mais distante do grupo carboxil – por convenção da União Internacional de

Química Pura e Aplicada (IUPAC, 1996) é chamado de e recebe o número 1 e,

portanto, com uma ligação dupla entre terceiro e o quarto carbono são classificados

como ácidos graxos ômega-3 (-3), como o -linolênico (ALA) e o docohexaenoico

(DHA) (LEHNINGER & COX, 2011).

a) Ácido -linolênico (C18:3n3)

Os vertebrados necessitam do ALA devido à incapacidade enzimática para

sintetizá-lo nos vertebrados, precisando assim obtê-lo a partir da dieta (BLESBOIS et

al., 1997; DROKIN, et al., 1999). O ALA é utilizado pelas células para sintetizar o DHA

por intermédio de uma sequência de reações que inclui dessaturações e

alongamentos da cadeia carbônica. As células neurais e da retina são consideradas

um dos principais compartimentos de locais de síntese de DHA (SCOTT & BAZAN,

1989).

26

Inicialmente a enzima Δ6-dessaturase atua na dessaturação do ALA,

inserindo uma dupla ligação na posição 6 e transformando-o em 18:4n-3 (cis-

6,9,12,15-18:4). Posteriormente, a elongase alonga a cadeia carbônica deste ácido

graxo até a estrutura de 20:4n-3 (cis-8,11,14,17-20:4), sendo subsequentemente

convertido a 20:5n-3 (cis-5,8,11,14,17-20:5, ácido eicosapentaenoico) pela Δ5-

dessaturase e alongado a 22:5n-3 (cis-5,8,11,14,17-22:5) no retículo endoplasmático.

Ainda nesta organela, são adicionados dois cardonos ao 22:5n-3 produzindo 24:5 (cis-

9,12,15,18,21-24:5), e pela ação da Δ6-dessaturase é convertido a 24:6 (cis-

6,9,12,15,18,21-24:6). Este é transferido para os peroxissomos que por β-oxidação

consiste no rompimento da ligação covalente por oxidação do ácido graxo sempre em

seu carbono , convertendo-o na nova carbonila de um ácido graxo agora com dois

carbonos. Devido à remoção dos carbonos da cadeia, produz o DHA. O DHA formado

é transferido de volta ao retículo endoplasmático e rapidamente incorporado aos

fosfolipídios de membrana desta organela por nova esterificação (SPRECHER, et al.,

1995; UAUY & CASTILLO, 2003; KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et al., 2011).

A -oxidação peroxissomal ocorre preliminarmente nos ácidos graxos de

cadeia muito longa, com 20 carbonos ou mais. A desidrogenação inicial nos

peroxissomos é catalisada pela acil-CoA-oxidase que contém um cofator denominado

dinucleotídio de flavina-adenina (FAD), e que por fosforilação oxidativa é reduzido à

FAD di hidrogênio (FADH2). O FADH2 é reoxidado a FAD, liberando o hidrogênio

molecular (H2) que exerce ligação com o oxigênio (O2) resultando no peróxido de

hidrogênio (H2O2). Devido à sua toxicidade para a célula, o H2O2 é reduzido a H2O

pela catalase (LEHNINGER & COX, 2011).

Os AG que não são utilizados nos peroxissomos podem atuar nas

mitocôndrias para posterior oxidação e produção de energia. Para cadeia de AG de 12

ou mais carbonos, a -oxidação mitocondrial consiste num conjunto de reações

catalisadas por um complexo enzimático associado a membrana interna da

mitocôndria. As reações de oxidação dos AG possibilitam a formação de FADH2 a

partir do FAD e a síntese de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH2) através do

NAD. Cada cofator derivado doa de um par de elétrons para NADH-desidrogenase

mitocondrial (enzima transportadora de elétrons para coenzima), resultando na

formação de moléculas de ATP (LEHNINGER & COX, 2011).

Devido à necessidade de adquirir PUFAs essenciais através de dietas para a

biossíntese de ácidos graxos como DHA e para a produção de energia, é de se

esperar que -oxidação nas mitocôndrias obtenha uma quantidade limitada de

produção de energia comparada com o consumo de saturados, porque os poli-

27

insaturados são utilizados nas diversas atividades metabólicas e, portanto, uma menor

variedade de equivalentes podem ser produzidos a partir das suas estruturas

(LEHNINGER & COX, 2011).

A adenosina difosfato (ADP) é convertida por reações de fosforilação em

adenosina monofosfato (AMP), nucleotídeo responsável por ativar a enzima adenosina

monofosfato cinase (AMPK), a qual ativa a proteína-cinase, previamente estimulada

pela leptina, considerado hormônio peptídico produzido pelos adipócitos que está

envolvida no controle da massa corporal, reprodução e outras funcionalidades. A

AMPK possui a função de ativar a acetil-CoA-carboxilase que produz o malonil-CoA,

atuante na biossíntese de ácidos graxos. Entretanto, o malonil-CoA age

simultaneamente como potente inibidor da enzima carnitina-aciltransferase I, que inicia

o processo de -oxidação pelo transporte dos AG para a mitocôndria com o objetivo

de produzir adenosina trifosfato (ATP), onde parte do consumo deste nucleotídeo é

para o movimento celular. Por fosforilar e inativar a acetil-CoA-carboxilase, a AMPK

inibe a síntese de AG, ao mesmo tempo em que alivia a inibição (pela malonil-CoA) da

-oxidação (LEHNINGER & COX, 2011).

b) Ácido docosahexaenoico (C22:6n3).

A composição variada dos lipídios que se encontra na membrana plasmática

do espermatozoide tem sido considerada um fator importante para a qualidade do

ejaculado submetido aos processos de criopreservação (PARKS & LYNCH, 1992),

existindo uma quantidade considerável de PUFAs na membrana plasmática, como por

exemplo, o ácido docosahexanóico (OLLERO et al., 2000).

Caracterizado pela presença de 22 átomos de carbono, com seis ligações

duplas e classificado como da série n-3, o C22:6n3 também encontra-se nos

fosfolipídios atuando na fisiologia dos gametas masculinos (MARTIN RILLO et al.,

1996). O DHA permite a fluidez necessária para que os fenômenos relacionados à

fertilização ocorram (PARKS & HAMMERSTEDT, 1985). Em humanos, a diminuição

do DHA está diretamente associada com o declínio da concentração, motilidade

(ROOKE et al., 2001), e capacidade fertilizante dos espermatozoides (OLIVEIRA et al.,

2006).

2.4.2. PUFAs da Série n-6

Essa família de PUFAs contém uma ligação dupla entre o sexto e sétimo

carbono a partir da extremidade da cadeia com o grupo metil (IUPAC). São

28

classificados como PUFAs ômega-6 (-6) e estão inseridos nesta classificação o

linoleico, -linolênico e o araquidônico (LEHNINGER & COX, 2011).

a) Ácido Linoleico (C18:2n6) e -Linolênico (GLA)

O C18:2n6 e o GLA são considerados essenciais, em decorrência da

incapacidade enzimática para sintetizá-lo nos vertebrados, precisando assim obtê-los

a partir da dieta (BLESBOIS et al., 1997; DROKIN, et al., 1999). Encontrados em óleos

vegetais e de sementes, os ácidos graxos de cadeia longa n-6 são utilizados como

precursores do ácido araquidônico e este participa da formação do docosapentaenoico

(DPA), que consiste numa biomolécula constituinte das membranas de organelas

(CAMPBELL & FARRELL, 2007).

A biossíntese ocorre a partir do ácido linoleico (18:2n-6) utilizando uma via

análoga e o mesmo sistema enzimático do ALA. A enzima Δ6-dessaturase atua na

dessaturação do linoleico, inserindo uma dupla ligação na posição 6 e transformando-

o em GLA (cis-6,9,12-18:3). Posteriormente, a elongase alonga a cadeia carbônica

deste ácido graxo até a estrutura de 20:3n-6 (cis-8,11,14-20:3), sendo

subsequentemente convertido em araquidônico (cis-5,8,11,14,-20:4) pela Δ5-

dessaturase e alongado a 22:4n-6 (cis-5,8,11,14-22:4) no retículo endoplasmático.

Ainda nesta organela, são adicionados dois carbonos produzindo 24:4n6 (cis-

9,12,15,18-24:4), e pela ação da Δ6-dessaturase é convertido a 24:5n6 (cis-

6,9,12,15,18-24:5). Este é transferido para os peroxissomos, aonde por β-oxidação

são removidos dois carbonos da cadeia e então produz-se o ácido docosapentaenoico

(DPA). De forma similar aos DHA, o DPA formado é transferido de volta ao retículo

endoplasmático e rapidamente incorporado aos fosfolipídios de membrana desta

organela por nova esterificação (SPRECHER, et al., 1995; UAUY & CASTILLO, 2003;

KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et al., 2011).

b) Ácido Araquidônico (C20:4n6)

Contém 20 átomos de carbono e quatro ligações duplas e é um derivado do

ácido linoleico. Classificado como da série n-6, o C20:4n6 encontra-se nos

fosfolipídios ou lipídios da membrana celular, caracterizados por moléculas complexas

constituída pelo glicerol que interliga um grupo fosfato (polar) e dois ácidos graxos

(apolares), portanto considerado um dos constituintes dos fosfolipídios (CAMPBELL &

FARRELL, 2007).

29

Quando ocorre a necessidade da síntese de moléculas complexas, a partir do

controle hormonal da espermatogênese, há uma modulação de vias de sinalização

intracelular, que consiste na liberação de cálcio (Ca2+) do retículo endoplasmático e na

fosforilação da fosfolipase A2 (PLA2). Dependendo das concentrações de Ca2+

intracelular, a PLA2 atua clivando ligações entre o fosfolipídio e o C20:4n6,

desagregando-o da membrana plasmática e disponibilizando-o para que lipoxigenases

possam incorporar o oxigênio molecular produzindo prostaglandinas (PG). As PG são

mediadores lipídicos que estão também nas vesículas seminais e a concentração é

influenciada pela quantidade dos hormônios como folículo estimulante (FSH), cuja

função é de estimular os espermatócitos primários a se dividirem, dando origem aos

espermatócitos secundários. O FSH tem sua atividade controlada pelo eixo

hipotálamo-hipofisário (SURAI et al., 2000; GLEW, 2010).

2.5. Influência dos Ácidos Graxos na Criopreservação

De acordo com Strzezek et al. (2004) a relação entre os ácidos graxos da

série ω-3 e ω-6 pode ser a principal responsável pela qualidade do sêmen in natura, e

por consequência o criopreservado; uma vez que a fluidez da membrana dos

espermatozoides é intimamente associada à sua composição lipídica. Vários autores

demonstram que dietas ricas em ω-3 em não ruminantes têm resultado em avaliações

satisfatórias quanto à criopreservação do sêmen destas espécies (LABBE et al., 1995;

ROOKE et al., 2001; BLESBOIS et al., 2004; STRZEZEK et al., 2004; BRINSKO et al.,

2005; CASTELLINI et al., 2005).

De Graaf et al. (2007) sugerem que os resultados negativos na

criopreservação de sêmen ovino são obtidos em decorrência da saturação dos ácidos

linoleico e oleico, provocada pela biohidrogenação ruminal. Segundo os referidos

autores, a biohidrogenação ruminal poderia ser responsável pela elevação da

concentração de ácidos graxos saturados e não alteração na composição dos PUFAs

na membrana espermática.

A dieta dos ruminantes não deve apresentar elevadas concentrações de

ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) porque existe a possibilidade de ocorrer

distúrbios na digestão dos carboidratos, como também pelo efeito tóxico sobre os

microrganismos do rúmen (GRUNERT et al., 2005). As bactérias ruminais não contêm

triglicerídeos e são incapazes de sintetizar PUFAs, com ligações duplas ou triplas

entre os átomos de carbonos, incorporando em sua composição lipídica somente

ácidos graxos saturados, que contém ligações simples (MARQUES, 2003).

30

Algumas enzimas produzidas por bactérias são responsáveis por reações que

possuem a finalidade de reduzir um possível efeito deletério da gordura consumida por

bovinos (SULLIVAN et al., 2004) e em ovinos (De GRAFF et al., 2007). Esse

fenômeno é denominado biohidrogenação ou lipólise (DETMANN et al., 2002).

Os ácidos graxos insaturados que prejudicam a funcionalidade dos

microrganismos ruminais, são largamente hidrogenados total ou parcialmente pelas

bactérias e protozoários, como forma de proteção celular, passando para a condição

de saturados. Isso é feito pela ação das enzimas redutases, que adicionam hidrogênio

às ligações duplas dos AG insaturados, produzindo o saturado correspondente

(CAMPBELL & FARRELL, 2007).

Segundo Jenkins (1993), os PUFAs complexados com cálcio são fonte

lipídica que têm apresentado melhores resultados e por isso têm sido bastante

recomendados. Experimentos que envolvam a suplementação de óleos insaturados

em dietas para ruminantes são beneficiados pela adição de um protetor que reduza a

saturação dos ácidos graxos no rúmen, resultando em maior absorção no intestino.

As séries n-3 e n-6 de PUFAs de cadeia longa podem ser fornecidos através

da dieta, quer sob a forma de precursores de carbono-18 de vegetais (ácido linolênico

ou linoleico) ou de cadeia longa, derivados encontrados em tecidos animais (20 a 22

átomos de carbono, com 4, 5 ou 6 ligações duplas) (COOK,1996). Isso indica que a

suplementação da dieta à base de biomoléculas como LC-PUFA n-3 é requerido em

ruminantes.

A inclusão do óleo de fígado de tubarão a dieta de suínos aumentou as

proporções de PUFAs n-3 e n-6 em lipídios de espermatozoides, em particular DHA,

em comparação com o controle (MITRE et al., 2004). Alimentação à base de PUFAs

têm melhorado os aspectos quanti e qualitativos do sêmen em várias espécies com

aves (ZANIBONI et al, 2006), suínos (MITRE et al., 2004), ovinos (ESMAELLI, et al., e

SELVARAJU et. al., 2012). Óleo de peixe como uma fonte de ácidos graxos n-3

melhorou a qualidade do sêmen de caprinos (DOLATPANAH et al., 2008), suínos

(ROOKE et al., 2001) e perus (ZANIBONI et al., 2006).

2.6. Extração e Separação dos Ácidos Graxos

Os fosfolipídios existentes na membrana plasmática de diferentes células são

extraídos por solventes orgânicos mais polares, como o etanol ou metanol, que

reduzem as interações hidrofóbicas entre as moléculas lipídicas enquanto

enfraquecem as pontes de hidrogênio e as interações eletrostáticas que ligam os

lipídios de membrana as proteínas de membrana. Um extrator bastante utilizado é a

31

solução metanol, água e hexano que inicialmente são miscíveis, produzindo uma única

fase. Depois que a amostra é homogeneizada nesses solventes para extrair todos os

lipídios, a mistura separa-se em duas fases, hexano (fase de cima) e metanol (fase de

baixo). Os AG permanecem na camada com hexano, e as moléculas mais polares,

como as proteínas e os carboidratos, repartem-se na camada de metanol/água


Para separar os componentes dessa mistura entre os lipídios e o hexano

utiliza-se o processo da cromatografia gasosa-líquida, que atua de acordo com as

suas tendências relativas a dissolverem-se no material inerte contido na coluna

cromatográfica ou a volatilizarem-se e migrarem através da coluna, carregados por

uma corrente de um gás inerte como o hélio. Alguns lipídios são naturalmente voláteis,

mas a maioria inicialmente necessita ser derivatizada para aumentar sua volatilidade,

ou seja, diminuir seu ponto de ebulição. Para uma análise de AG em uma amostra de

fosfolipídios, a princípio os lipídios são transesterificados, que significa aquecer em

uma mistura de metanol e hidróxido de sódio ou metanol e hidróxido de potássio para

converter os AG esterificados em seus ésteres metílicos. Esses ésteres são então

colocados na coluna cromatográfica aquecida para volatilizar os compostos. Os

ésteres que são mais solúveis dissolvem-se no material da coluna; os lipídios menos

solúveis são carregados pela corrente de gás inerte e emergem mais rapidamente da

coluna. A ordem de eluição depende da natureza da adsorção na coluna e do ponto de

ebulição dos componentes da mistura lipídica. Utilizando-se essas técnicas, as

misturas de ácidos graxos de vários comprimentos de cadeia e vários graus de

instauração são completamente separados (LEHNINGER & COX, 2011).

Com o objetivo de determinar o perfil lipídico de ácidos graxos do sêmen

ovino, Cardoso et al. (2011) realizaram dois métodos de extração por meio da

cromatografia líquida de alta eficiência, e identificaram que a composição de AG do

espermatozoide e do plasma seminal são semelhantes, utilizando os seguintes

padrões de PUFAs: ácido linoleico (C18:2n6), ácido linolênico (C18:3n3), ácido

araquidônico (C20:4n6), ácido docosahexaenoico (C22:6n3).

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3. REFERÊNCIAS

AMANN R.; KATZ D.F. Reflections on CASA after 25 years. Journal Andrology, v.25, p.317-325, 2004. APPOLINÁRIO P. P.; DEROGIS P. B. M. C.; YAMAGUTI T. H.; MIYAMOTO, S. Metabolismo, Oxidação e Implicações Biológicas do Ácido Docosahexaenoico em Doenças Neurodegenerativas. Química Nova, n. 8, p.1409-1416, 2011 ASSUMPÇÃO, M. E. O. D. Capacitação espermática in vitro com heparina e cálcio ionóforo e sua correlação com a fertilidade em touros. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 63p. 1999. AZEVEDO, H.C. Integridade e funcionalidade dos espermatozoides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoleico e α- lactoalbumina. Botucatu. Tese – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP. 195p, 2006. BLESBOIS, E.; LESSIRE, M.; GRASSEAU, I.; HALLOUIS, J.M.; HERMIER, D. Effect of dietary fat on the fat acid composition and fertilizing ability of fowl semen. Biology of reproduction, v.56, p.1216-1220, 1997. BLESBOIS, E., DOUARD, V., GERMAIN, M., BONIFACE, P., PELLET, F. Effects of n-3 polyunsaturated dietary supplementation on the reproductive capacity of male turkeys. Theriogenology, v.61, p.537–549, 2004. BLIGH, E.G.; DYER, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian. Journal of Biochemistry and Physiology, v. 37, n. 8, p. 911-917, 1959. BRINSKO, S.P.; VARNER, D.D.; LOVE, C.C.; BLANCHARD, T.L.; DAY, B.C.; WILSON, M.E. Effect of feeding a DHA-enriched nutriceutical on the quality of fresh, cooled and frozen stallion semen. Theriogenology, v.63, p.1519–1527, 2005. CAMPBELL, M.K.; FARRELL, S.O. Bioquímica: bioquímica básica. 5ed., v.1, Thomson Learning, 2007. CARDOSO, P. B. S.; NICHI, M.; ZOGNO, M. A.; FUJIWARA, H.; BARNABE, V. H.; BARNABE, R. C. Comparação da eficácia de dois métodos de extração para determinação do perfil lipídico de ácidos graxos do sêmen ovino por meio da cromatografia líquida de alta eficiência. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.48, n.6, p.486-494, 2011. CARDULLO, R.; FLORMAN, H .M. Strategies and methods for evaluating acrosome reaction. In: WASSARMAN, P. M.; DePAMPHILIS, M. L. (Eds.).Methods in enzymology: guide to techniques in mouse development. SanDiego: Academic Press, v.225, p.148-153,1993. CASTELLANO, C.A.; AUDET, I.; BAILEY, J.L.; CHOUINARD, P.Y.; LAFOREST, J.P.; MATTE, J.J. Effect of dietary n-3 fatty acids (fish oils) on boar reproduction and semen quality. Journal Animal Science, v.88, p.2346-2355, 2010.

33

CASTELLINI, C.; CARDINALI, R.; LATTAIOLI, P.; DAL BOSCO, A. Comparison of different dietary sources of PUFA n-3 on semen characteristics of rabbit bucks. Reproduction in Domestic Animals, (Abstr. 386), p.180, 2005. CELEGHINI, E. C. C. Efeitos da criopreservação do sêmen bovino sobre as membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozoides utilizando sondas fluorescentes. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. p.186, 2005. CELEGHINI, E.; DE ARRUDA, R.; DE ANDRADE, A.; NASCIMENTO, J. and RAPHAEL, C. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reproduction in Domestic Animals, n. 42, p. 479–488, 2007. CERVONI, J.E. Gordura protegida na alimentação de ruminantes. 2011. Disponivel em: <http;//www.limousin.com.br>. Acesso em: 02 jan 2013. CONNELL, M. O.; McCLURE, N.; LEWIS, S. E. M. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Human Reproduction. v. 17, p. 704-709, 2002. COOK H.W. Fatty acid desaturation and chain elongation in eukaryotes. In Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes (ed. DE Vance and JE Vance), Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp. 129–152, 1996. CORMIER, N.; SIRARD, M. A.; BAILEY, J. L. Premature capacitation of bovine spermatozoa is initiated by cryopreservation. Journal of Andrology, v. 18, n. 4, p. 461-468, 1997. COSTA, R. L. D. Efeito da Suplementação com gordura protegida no retorno ao estro em ovelhas da raça Santa Inês. Tese (Doutorado em Produção Animal) - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF, Rio de Janeiro, 101p, 2007. CUNNINGHAM, J.G.; KLEIN, B.G. Tratado de fisiologia veterinária. In: Fisiologia reprodutiva do macho. 4.ed. Rio de Janeiro: Editora Elsevier, p.523, 2008. DasGUPTA, S.; MILLS, C. L.; FRASER, L. R. Ca2+-related changes in the capacitation state of human spermatozoa assessed by a chlortetracycline fluorescence assay. Journal of Reproduction and Fertility, v.99, p.135-143, 1993. DE GRAAF, S. P.; PEAKE, K.; MAXWELL, W. M. C.; O'BRIEN, J. K. AND EVANS, G. Influence of supplementing diet with oleic and linoleic acid on the freezing success and sex-sorting parameters of ram semen. Livestock Science, v.110, p.166-173, 2007. DETMANN, E.; MORAIS, M.G.; ANDREOTTI, M.O. Introdução ao estudo da digestão e absorção em nutrição animal. Campo Grande: UFMS, 48p, 2002. DOLATPANAH, M. B.; TOWHIDI, A.; FARSHAD, A.; RASHIDI, A.; REZAYAZDI, A. Effects of dietary fish oil on semen quality of goats. Asian Australasian Journal of Animal Sciences. v.21, n.1, p.29-34, 2008. DROKIN S.I.; VAISBERG, T.N.; KOPEIKA, E.F.; MITEVA, K.D.; PIRONECHEVA, G.L. Effect of cryopreservation on lipids and some physiological features of spermatozoa from rams pastured in highlands and in valleys. Cytobios. n.393, p.27-36, 1999

34

EDDY, E. M. The spermatozoon. In: KNOBIL, E.; NEILL J. D. The Physiology of Reproduction.3.ed. New York: Raven Press, p. 29-77, 2001. ESMAEILI V.; SHAHVERDI, A.; ALIZADEH, AR.; ALIPOUR, H.; TOWHIDI, A.; ZARRABI, M. Fatty acid profiles of ram's sperm after removing some fatty acid sources from the diets and persistency of fatty acids in sperm. International Journal of Fertility and Sterility, v. 5(4), p. 211-216, 2012. FARAJI, Z.; ZAMIRI, M.J.; ROWGHANI, E.; AKHLAGHI, A.; JAFARZADEH, M.R.; BAYAT, A.R.; GHOLAMI, M. Effect of feeding olive-pulp silage on the seminal characteristics and fatty acid profile of the sperm plasma membrane in Iranian fat-tailed sheep. Small Ruminant Research, v.105, p. 216-221, 2012. FARIA, N. I. G. Fertilização In vitro Heteróloga utilizando ovócitos de bovino e sémen de garanhão. Dissertação de Mestrado em Engenharia Zootécnica. 98f. Departamento de Ciências Agrárias. Universidade dos Açores. Angra do Heroísmo, 2011. Disponível [on line]: <https://repositorio.uac.pt/handle/10400.3/1344>. Acesso em: 25 jan 2012. FARREL, P. B.; PRESICCE, G. A.; BROCKETT, C. C.; FOOTE, R. H. Quantification of bull sperm characteristics measured by computer-assisted sperm analysis (CASA) and the relationship to fertility. Theriogenology, v. 49, p. 871-879, 1998. FRASER, L. R.; ABEYDEERA, L. R.; NIWA, K. Ca2+-Regulating mechanisms that modulate bull sperm capacitation and acrosomal exocytosis as determined by chlortetracycline analysis. Molecular Reproduction and Development, v. 40, p. 233-241, 1995. FUNSTON, R.N. Fat suplementation and reproduction in beef females. Journal Animal Science, v.82, p.154-161, 2004. GARCIA, I.F.F.; ALMEIDA, A.K.; COSTA, T.I.R.; RIBEIRO, J.S.; SOUZA, F.A. Carcass characteristics and cuts of Santa Inês lambs fed different roughage proportions and fat source. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, p.1322-1327, 2010. GILLAN, L.; EVANS, G.; MAXWELL, M.C. Capacitation status and fertility of fresh and frozen-thawed ram spermatozoa. Reproduction Fertility and Development, v.9, p.481-487, 1997. GILLAN, L.; MAXWELL, W. M. C.; EVANS, G. Preservation and evaluation of semen for artificial insemination. Reproduction Fertility and Development, v. 16, p. 447-454, 2004. GILLAN, L.; SKOVGOLD, K.; WATSON, P. F.; EVANS, G.; MAXWELL, W. M. C. Fate and functional integrity of fresh and frozen–thawed ram spermatozoa following intrauterine insemination. Reproduction Fertility and Development, v.11, p.309-315, 1999. GLEW, R. H. Lipid Metabolism II: Pathways of Metabolism of Special Lipids. In: DEVLIN, T. M. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 7.ed. Wiley-Liss, p. 732, 2010. GORDON, I. Laboratory Production of Cattle Embryos. Cambridge: UK University Press, 640p. 1994.

35

GRASA, P.; CEBRIÁN-PÉREZ, J.A.; MUIÑO-BLANCO, T. Signal transduction mechanisms involved in in vitro ram sperm capacitation. Reproduction, n. 132, p. 721–732, 2006. GRUNERT, E.; BIRGEL, E.H.; VALE, W.G.; BIRGEL JÚNIOR, E.H. Patologia e Clínica da Reprodução dos Animais Mamíferos Domésticos – Ginecologia. São Paulo: Varela, 2005. HARRISON, R.A.P.; VICKERS, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v.88, p.343-352, 1990. HARTREE, E. F.; MANN, T. Phospholipids in ram semen: metabolism of plasmalogen and fatty acids. The Biochemical Journal, v. 80, p. 464, 1961. HASCHEK, W.M.; ROUSSEAUX, C.; WALLIG, M.A. Male Reproductive System, capítulo 18, Fundamentals of Toxicologic Pathology (Second Edition), Editora Elsevier, p.553–597, 2010. HE, L. BAILEY, J.L., BUHR, M.M. Incorporating lipids into boar sperm decreases chilling sensitivity but not capacitation potencial. Biology of Reproduction, v.64, p.69-79, 2001. HOLT, W. V.; HEAD, M. F.; NORTH, R. D. Freeze–induced membrane damage in ram spermatozoa is manifested after thawing: observations with experimental cryomicroscopy. Biology of Reproduction, v. 46, p. 1089-1094, 1992. HUO, L. J.; MA, X. H.; YANG, Z. M. Assessment of sperm viability, mitochondrial activity, capacitation and acrosome intactness in extended boar semen during long-term storage. Theriogenology, v.58, p.1349-1360, 2002. IUPAC – International Union Pure and Applied Chemistry. Basic terminology of stereochemistry, IUPAC Recommendations, 1996. Disponível em http://goldbook.iupac.org/C01093.html. Acesso em 09/02/13. JAISWAL, B. S.; COHEN-DAYAG, A.; TUR-KASPA, I.; EISENBACH, M. Sperm capacitation is, after all, a prerequisite for both partial and complete acrosome reaction. FEBS Letters, v. 427, p. 309-313, 1998. JENKINS, T.C. Lipid metabolism en the rumen. Symposium: Advances in ruminant lipid metabolism. Journal of Dairy Science, v.79, p.3851-3863, 1993. JOHNSON, L.; VARNER, D.D.; ROBERTS, M.E.; SMITH, T.L.; KEILOR, G.E.; SCRUTCHFIELD, W.L. Efficiency of spermatogenesis: a comparative approach. Animal Reproduction Science, v. 60 – 61, p. 471 – 480, 2000. KELSO, K. A.; CEROLINI S.; SPEAKE B. K.; CAVALCHINI L. G.; NOBLE R. C. Effect of dietary supplementation with α-Linolenic acid on the phospholipids fatty acid composition and quality of spermatozoa in cockerel from 24 to 72 week of age. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v. 110, p. 53-59, 1997. KIM, H. Y. Novel Metabolism of Docosahexaenoic Acid in Neural Cells. The Journal of Biological Chemistry, n. 282, p.18661, 2007.

http://goldbook.iupac.org/C01093.html

36

LABBE, C.; MAISSE, G.; MULLER, K.; ZACHOWSKI, A.; KAUSHIK, S.; LOIR, M. Thermal acclimation and dietary lipids alter the composition, but not fluidity, of trout sperm plasma membrane. Lipids, v.30, p.23–33, 1995. LARDY, H. A.; PHILLIPS, P. H. Phospholipids as a source of energy for spermatozoa. American Journal of Physiology, v. 134, p. 542, 1941. LAUSMANN, C. V.; NEVES, J. P.; GONÇALVES, P. B. D.; OLIVEIRA, J. F. C.; BRAGANÇA, J. F. M.; OLIVEIRA, A. K.; MEYER, A. A. Plasma seminal na capacitação espermática em ovinos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 28, n. 3, p. 150-157, 2004. LEHNINGER, D. N.; COX, M.M. Lipídios. In: LEHNINGER D. N. Princípios de Bioquímica. São Paulo: Sarvier, 5ª. edição, Artmed, p.343-366, 2011. LUCONI, M.; KRAUSZ, C.; FORTI, G.; BALDI, E. Extracellular calcium negatively modulates tyrosine phosphorylation and tyrosine kinase activity during capacitation of human spermatozoa. Biology of Reproduction, n. 55 p. 207–216, 1996. MARQUES, D. C. Criação de Bovinos. 7a Ed. Belo Horizonte: CVP – Consultoria Veterinária e Publicações, 586 p, 2003. MARTIN RILLO, S. MARTINEZ, E.; GARCIA ARTIGA, C.; DE ALBA, C. Boar semen evaluation in practice. Reproduction Domestics Animal, v. 31, n.3, p.519-526, 1996. MATOS, J. E. Qualidade seminal de carneiros alimentados com diferentes níveis de energia. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) 48 f., – Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão, 2012. MATTOS, R.; STAPLES, C.R.; THATCHER, W.W. Effects of dietary fatty acids on reproduction in ruminants. Reviews of Reproduction, v.5, p.38-45, 2000. MAXWELL, W. M. C.; EVANS, G.; MORTIMER, S. T.; GILLAN, L.; GELLATLY, E. S.; McPHIE, C. A. Normal fertility in ewes after cervical insemination with frozen–thawed spermatozoa supplemented with seminal plasma. Reproduction Fertility and Development, v. 11, p. 123–126, 1999. MEDINA, V. H. Uso de sondas fluorescente na avaliação da integridade da membrana plasmática de espermatozoides ovinos recém-colhidos e submetidos à congelação. Jaboticabal. Dissertação (Mestrado) -Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal,Universidade Estadual Paulista. 89p.,1995. MESEGUER, M.; GARRIDO, N.; MARTÍNEZ-CONEJERO, J. A.; SIMÓN, C.; PELLICER, A.; REMOHÍ, J. Relationship between standard semen parameters, calcium, cholesterol contents, and mitochondrial activity in ejaculated spermatozoa from fertile and infertile males. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, v. 21, p. 445-551, 2004. MITRE, R.; CHEMINADE, C.; ALLAUME, P.; LEGRAND, P.; LEGRAND, A.B. Oral intake of shark liver oil modifies lipid composition and improves motility and velocity of boar sperm. Theriogenology, v.62, p.1557–1566, 2004. MORTIMER, S. T. A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Human Reproduction. Update, v. 3, n. 5, p. 403-439, 1997.

37

MORTIMER, S. T. A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Human Reproduction. Update, v. 3, n. 5, p. 403-439, 1997. MORTIMER, S.T. Casa - Practical aspects. Journal Andrology, p.515-524, 2000. MORTIMER, S. T.; MAXWELL, W. M. C. Effect of medium on the kinematics of frozen–thawed ram spermatozoa. Reproduction, v. 127, p. 285–291, 2004. NEILL, A. R.; MASTERS, C. J. Metabolism of fatty acids by ovine spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 34, p. 279–287, 1973. OLIVEIRA, V. P. Estudo in vitro da capacitação espermática edesenvolvimento de embriões em suínos. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. 60p, 2002. OLIVEIRA, S. L.; FIALHO, E. T.; MURGAS, L. D. S.; FREITAS, J. A.; FREITAS, R. T. F.; ZANGERONIMO, M. G. Efeito da inclusão de diferentes tipos de óleo na dieta de varrões sobre a qualidade do sêmen in natura. Ciência e Agrotecnologia, vol. 30, n.6, p. 1205-1210, 2006. OLLERO, M.; POWERS, R. D.; ALVAREZ, J. G. Variation of decosahexaenoic acid content in subset of human spermatozoa at different stages of maturation: implications for sperm lipoperoxidative damage. Molecular Reproduction and Development, v.55, n.1, p.325-334, 2000. PALMQUIST, D.L. Use of fats in diets for lactating dairy cows. In: J. Wiseman (Ed.) Fats in Animal Nutrition. Butterworth. London, p. 357-381, 1984. PANNEERDOSS, S.; SIVA, A. B.; KAMESHWARI, D. B.; RANGARAJ, N.; SHIVAJI, S. Association of Lactate, Intracellular pH, and Intracellular Calcium During Capacitation and Acrosome Reaction: Contribution of Hamster Sperm Dihydrolipoamide Dehydrogenase, the E3 Subunit of Pyruvate Dehydrogenase Complex. Journal of Andrology. n.33, p. 699-710, 2012. PARKS, E. J.; HAMMERSTEDT, H. R. Developmental changes occurring in the lipids of ram epididymal spermatozoa plasma membrane. Biology of Reproduction, v. 32, p.653-668, 1985. PARKS, J.E.; LYNCH, D. V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar, bull, stallion and rooster sperm membranes. Cryobiology, v.29, n.1, p.255-266, 1992. PEREIRA, R. J. T. A.; TULI, R. K.; WALLENHORST, S.; HOLTZ, W. The effect of heparin, caffeine and calcium ionophore A 23187 on in vitro induction of the acrosome reaction in frozen-thawed bovine and caprine spermatozoa. Theriogenology, v. 54, p. 185-92, 2000. PÉREZ, L. J.; VALCÁRCEL, A.; DE LAS HERAS, M. A.; MOSES, D.; BALDASSARRE, H. Evidence that frozen/thawed ram spermatozoa show accelerated capacitation in vitro as assessed by chlortetracycline assay. Theriogenology, v.46, p.131-140, 1996a.

38

PÉREZ, L. J.; VALCÁRCEL, A.; DE LAS HERAS, M. A.; MOSES, D.; BALDASSARRE, H. In vitro capacitation and induction of acrosomal exocytosis in ram spermatozoa as assessed by the chlortetracycline assay. Theriogenology, v. 45, p. 1037-1046, 1996b. PERÉZ–PÉ, R.; CEBRIÁN PERÉZ, J. A.; MUIÑO-BLANCO, T. Semen plasma proteins prevent cold-shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology, v. 56, p. 425-434, 2001. PERIS, S. I.; MORRIER, A.; DUFOUR, M.; BAILEY, J. L. Cryopreservation of ram semen facilitates sperm DNA damage: relationship between sperm andrological parameters and the sperm chromatin structure assay. Journal of Andrology, v. 25, n. 2, 2004. PINTADO, B.; de la FUENTE, J.; ROLDAN, E. R. S. Permeability of boar and bull spermatozoa to the nucleic acid stains propidium iodide or Hoechst 33258, or to eosin: accuracy in the assessment of cell viability. Journal of Reproduction and Fertility, v.118, p.145–152, 2000. PONNAMPALAM, E. N.; SINCLAIR, A. J.; HOSKING, B. J.; EGAN, A. R. Effects of dietary lipid type on muscle fatty acid composition, carcass leanness, and meat toughness lambs. Journal Animal Science, v.80, p.628-636, 2002. POULOS A.; SHARP P.; JOHNSON D.; WHITE I.; FELLENBERG A. The occurrence of polyenoic fatty acids with greater than 22 carbon atoms in mammalian spermatozoa. Biochemical Journal, v. 240, 891–895, 1986. QUINN, P. J.; WHITE, I. G. Phospholipid and cholesterol content of epididymal and ejaculated ram spermatozoa and seminal plasma in relation to cold shock. Australian Journal of Biological Sciences, v. 20, p. 1205-1215, 1967. RODENAS, C.E.O.; MURGAS, L.D.S.; MACIEL, M.P. Características seminais de galos alimentados com rações suplementadas com diferentes óleos e níveis de vitamina E. Ciência e Agrotecnologia, v.29, n.1, p.160-167, 2005. ROLDAN, E. R. S.; GOMENDIO, M. Morphological, functional and biochemical changes underlying the preparation and selection of fertilizing spermatozoa in vitro. Animal Reproduction Science, v. 28, p. 69-78, 1992. ROOKE, J.A.; SHAO, C.C.; SPEAKE, B.K. Effects of feeding tuna oil on the lipid composition of pig spermatozoa and in vitro characteristics of semen. Reproduction v.121, p.315–322, 2001. ROTUNNO, T.; SEVI, A.; DI CATERINA, R.; MUSCIO, A. Effects of graded levels of dietary rumen protected fat on milk characteristics of Comisana ewe. Small Ruminants Research, v.30, p. 137-145, 1998. SALING, P. M.; STOREY, B. T. Mouse gamete interactions during fertilization in vitro. Chlortetracycline as a fluorescent probe for the mouse sperm acrosome reaction. Journal of Cell Biology, v. 83, p. 544-555, 1979.

SAMADIAN, F.; TOWHIDI, A.; REZAYAZDI, K.; BAHREINI, M. Effects of dietary n-3 fatty acids on characteristics and lipid composition of ovine sperm. The Animal Consortium, v.4, n. 12, pp 2017–2022, 2010.

39

SANTOS, J.E.P.; BILBY, T.R.; THATCHER, W.W. Long chain fatty acids as factors influencing reproduction cattle. Reproduction in Domestic animals, v.43 (suppl.2), p.23-30, 2008.

SANZ SAMPELAYO, M.R.; PÉRAZ, L.; MARTÍN ALONSO, J.J.; AMIGO, L.; BOZA, J. Effects of concentrates with diferent concents of protected fat rich in PUFAs on the performance lactin Granadina goats Part. II Milk production and composition. Small Ruminant Research, v.43, p. 141-148, 2002.

SCHEMBRI, M. A.; MAJOR, D. A.; SUTTIE, J. J.; MAXWELL, W. M. C.; EVANS, G. Capacitation-like changes in equine spermatozoa throughout the cryopreservation process. Reproduction, Fertility and Development, v. 14, p. 225-233, 2002.

SCOTT, T. W.; VOGLMAYR, J. K.; SETCHELL, B. P. Lipid composition and metabolism in testicular and ejaculated ram spermatozoa. Biochemical Journal, v. 102, p. 456, 1967.

SCOTT, B. L.; BAZAN, N. G. Membrane docosahexaenoate is supplied to the developing brain and retina by the liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. n. 86, p.2903, U.S.A., 1989.

SELAIVE-VILARROEL, A. B. Perdas reprodutivas dos ovinos no Brasil. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.3, p.252-256, 1991.

SELVARAJU, S.; SIVASUBRAMANI, T.; RAGHAVENDRA, B.S.; RAJU, P.; RAO, S.B.N.; DINESHKUMAR, D.; RAVINDRA, J.P. Effect of dietary energy on seminal plasma insulin-like growth factor-I (IGF-I), serum IGF-I and testosterone levels, semen quality and fertility in adult rams. Theriogenology, v.78, p.646-655, 2012.

SOUSA, Daniel Bartoli de. Variabilidade das sub-populações de espermatozoides avaliadas pela cinética em sistema computadorizado e combinação de sondas fluorescentes como parâmetro qualitativo do sêmen congelado de ovinos. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007.

SPEAKE, B.K.; SURAI, P.F.; ROOK, J.A.; DE VRIESE, S.R.; CHRISTOPHE, A.B. Regulation of avian and mammalian sperm production by dietary fatty acids. In: De Vriese SR, Christophe AB (Ed.) Male Fertility ans lipid Metabolism. AOCS Press, Champaign, IL, p. 96-117, 2003.

SPRECHER, H.; LUTHRIA, D. L.; MOHAMMED, B. S.; BAYKOUSHEVA, S. P. Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids. The Journal of Lipid Research, n.36, p.2471, 1995.

STRZEZEK, J.; FRASER, L.; KUKLINSKA, M.; DZIEKONSKA, A.; LECEWICZ, M. Effects of dietary supplementation with polyunsaturated fatty acids and antioxidants on biochemical characteristics of boar semen. Reproductive Biology, [S.l.], v. 4, n. 3, p. 271-287, 2004.

SUKARDI, S., CURRY, M. R.; WATSON, P. F. Simultaneous detection of the acrosomal status and viability of incubated ram spermatozoa using fluorescent markers. Animal Reproduction Science, v.46, p.89-96, 1997.

40

SULLIVAN, H.M.; BERNARD, J.K.; AMOS, H.E.; JENKINS, T.C. Performance of lactating dairy cows fed whole cottonseed with elevated concentrations of free fatty acids in the oil. Journal of Dairy Science, v.87, p.665-671, 2004.

SURAI P. F.; BLESBOIS E.; GRASSEAU I.; CHALAH T.; BRILLARD J. P.; WISHART G. J.; CEROLINI S.; SPARKS N. H. Fatty acid composition, glutathione peroxidase and superoxide dismutase activity and total antioxidant activity of avian semen. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology 120, 527–533, 1998. SURAI P. F.; NOBLE R. C.; SPARKS N. H.; SPEAKE B. K. Effect of long-term supplementation with arachidonic or docosahexaenoic acids on sperm production in the broiler chicken. Journal of Reproduction and Fertility 120, 257–264, 2000. TARDIF, S.; DUBE, C.; CHEVALIER, S.; BAILEY, J. L. Capacitation is associated with tyrosine phosphorylation and tyrosine kinase-like activity of pig sperm proteins. Biology of Reproduction, n. 65, p. 784–792, 2001. THUNDATHIL, J.; GIL, J.; JANUSKAUSKAS, A.; LARSSON, B.; SODERQUIST, L.; MAPLETOFT, R.; RODRIGUEZ-MARTINEZ, H. Relationship between the proportion of capacitated spermatozoa present in frozen-thawed bull semen and fertility with artificial insemination. International Journal of Andrology, v. 22, p. 366-373, 1999. UAUY, R.; CASTILLO, C. Lipid requirements of infants: implications for nutrient composition of fortified complementary foods. Journal of Nutrition, n.133, p.2962, 2003. VALCÁRCEL, A.; de las HERAS, M. A.; PÉREZ, L.; MOSES, D. F.; BALDASSARRE, H. Assessment of acrosomal status of membrane-intact ram spermatozoa after freezing and thawing, by simultaneous lectin/Hoechst 33258 staining. Animal Reproduction Science, v. 45, p. 299-309, 1997. VASCONCELOS, J. L. M.; MAXIMO, M.; Gordura protegida. XX Reunião Anual da SBTE. Disponivel [on line]: <http://www.beefpoint.com.br>. Acesso em: 23 set 2010. VERSTEGEN J, IGUER-OUADA M, ONCLIN K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, v.57, p.149-179, 2002. VISCONTI, P.E.; BAILEY, J.L.; MOORE, G.D.; PAN, D.; OLDS-CLARKE, P.; KOPF, G.S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development 121 1129–1137, 1995. VISCONTI, P. E.; GALANTINO-HOMER, H; MOORE, G. D.; BALEY, J. L.; NING, X.; FORNES, M.; KOPF, G. S. The molecular basis of sperm capacitation. Journal of Andrology, v. 19, p. 242-248, 1998. WARD, C. R.; STOREY, B. T. Determination of the time course of capacitation in mouse spermatozoa using a chlortetracycline fluorescence assay. Developmental Biology, v. 104, p. 287-296, 1984. WATSON, P. F.; JONES, P. S.; PLUMMER, J. M. A quantitative comparison of the spontaneous and ionophore-induced acrosome reaction in ejaculated ram spermatozoa: the effects of temperature, time and individual. Animal Reproduction Science, v.24, p.93-108, 1991.

41

WOLFE, C. A.; JAMES, P. S.; MACKIE, A. R.; LADHA, S.; JONES, R. Regionalized lipid diffusion in the plasma membrane of mammalian spermatozoa. Biology of Reproduction, v. 59, p. 1506-1514, 1998.

YANAGIMACHI, R. Mammalian fertilization. In: KNOBIL, E.; NEILL J. D. The Physiology of Reproduction. 2.ed. New York: Raven Press, p. 189-317, 1994. YÁNIZ, J.L.; VICENTE-FIEL, S.; CAPISTRÓS,S.; PALACÍN,I.; SANTOLARIA, P. Automatic evaluation of ram sperm morphometry. Theriogenology 77, p. 1343–1350, 2012. ZANIBONI, L.,RIZZI, R., CEROLINI, S. Combined effect of DHA anda-tocopherol enrichment on sperm quality and fertility in the turkey. Theriogenology, v.65, p.1813–1827, 2006.

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Artigo Científico

VIABILIDADE E FUNCIONALIDADE DE ESPERMATOZOIDES

CRIOPRESERVADOS DE CARNEIROS ALIMENTADOS COM ÁCIDOS

GRAXOS POLI-INSATURADOS COMPLEXADOS COM SAIS DE CÁLCIO

1. INTRODUÇÃO

A criopreservação é um processo biotecnológico que viabiliza o uso do sêmen

pós-congelação. A melhoria na qualidade desse germoplasma em ovinos pode facilitar

a conservação e distribuição de material genético de relevância, do ponto de vista

comercial, e de preservação da biodiversidade da espécie (AZEVEDO, 2006).

Uma técnica reprodutiva associada ao sêmen congelado é a inseminação

artificial (IA) cuja aplicação potencializa o melhoramento genético, disseminando os

genes dos animais, aumentando a eficiência dos rebanhos e contribuindo para

melhoria dos produtos (SELAIVE–VILARROEL, 1991).

O incremento na qualidade do sêmen congelado pode ser obtido pela

incorporação de biomoléculas integrantes da estrutura celular gamética masculina.

Entre as várias biomoléculas que exercem efeito sobre a fisiologia dos gametas

masculinos estão os lipídios (KELSO et al., 1997). Os lipídios têm sido incorporados à

dieta com o objetivo de proporcionar melhorias na qualidade do sêmen de várias

espécies como suínos (ROOKE et al., 2001; MITRE et al., 2004), equinos (BRINSKO

et al., 2005), bovinos (POULOS et al., 1986; SULLIVAN et al., 2004), aves (SURAI et

al., 1998; ZANIBONI et al., 2006) e ovinos (SAMADIAN et al., 2010; FARAJI et al.,

2012). Ácidos graxos como oleico e linoleico foram avaliados após adição ao sêmen

apresentando resultados benéficos no potencial energético, na cinética, na

manutenção da viabilidade, na função e no status de capacitação dos

espermatozoides criopreservados (PERÉZ-PÉ et al., 2001).

Mesmo com a existência de muitas iniciativas para melhorar a fertilidade com

uso de sêmen congelado, envolvendo a adição de substâncias aos espermatozoides

em alguma fase da criopreservação, a ideia de modificar a composição das

membranas espermáticas antes da ejaculação, pela ingestão alimentar, representa

uma alternativa atraente para o sucesso da congelação.

A suplementação alimentar dos ruminantes com fontes de lipídios pode elevar

o teor de energia da dieta, tornando mais eficiente o desempenho produtivo dos

43

animais (GRUNERT et al., 2005). Os lipídios são utilizados na alimentação para

aumentar o conteúdo intramuscular de ácidos graxos poli-insaturados na carne,

especificamente aqueles de cadeias longas (PONNAMPALAM et al., 2002; GARCIA et

al., 2010) e do leite (ROTUNNO et al., 1998; SANZ SAMPELAYO et al., 2002).

A incorporação de óleos insaturados em dietas para ruminantes necessita da

adição de um protetor contra biohidrogenação e lipólise (DE GRAAF et al., 2007). Os

ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio (PUFA-Ca) são

caracterizados como nutrientes associados ao componente mineral, que possui o

objetivo de proteger a biomolécula lipídica da biohidrogenação ou lipólise (COSTA,

2007), por enzimas bacterianas secretadas no interior do rúmen, possibilitando a

transferência de ácidos graxos poli-insaturados para células intestinais, aumentando a

disponibilidade de energia e fornecendo as substâncias essenciais para formação dos

componentes de membrana e precursores de moléculas regulatórias (JENKINS, 1993;

MATTOS et al., 2000; SANTOS et al., 2008; VASCONCELOS & MAXIMO, 2010;

CERVONI, 2011).

O uso de ácidos graxos poli-insaturados complexados com objetivos

reprodutivos em ruminantes tem sido mais relacionado à fertilidade em fêmeas

(FUNSTON, 2004). A dieta de ruminantes com PUFA-Ca foi desenvolvida para

atender as necessidades energéticas de vacas de alta produção leiteira (PALMQUIST,

1984). Entretanto, pode ser aplicada aos espermatozoides de carneiros para aumentar

a resistência à congelação e descongelação (WATSON et al., 1991; HOLT et al., 1992;

GILLAN et al., 2004; PERIS et al., 2004).

É limitada a quantidade de trabalhos sobre o efeito de dietas à base de ácidos

graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio sobre os parâmetros dos

espermatozoides de ruminantes. Algumas pesquisas mostram melhorias na qualidade

seminal obtidas pela inclusão de ácidos graxos poli-insaturados a dieta de galos

(BLESBOIS et al., 1997; RODENAS et al., 2005), perus (BLESBOIS et al., 2004) e

suínos (MITRE et al., 2004; CASTELLANO et al., 2010). Contudo, o sistema digestivo

do ruminante apresenta peculiaridades que impossibilitam fazer uma relação com

estas espécies monogástricas (MATOS, 2012).

44

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Local e animais do experimento

O experimento foi conduzido no Campo Experimental Pedro Arle (10° 57’

077’’ Sul, 37° 03’ 171’’ Oeste) da Embrapa Tabuleiros Costeiros, no estado de

Sergipe, Brasil, no período de novembro de 2011 a fevereiro de 2012, durante a

estação da seca.

Vinte e quatro carneiros da raça Santa Inês nunca utilizados em estações

reprodutivas e criados em regime semi-intensivo e com idade média de 25,49 ± 0,28

meses e peso vivo médio de 53,40 ± 5,91 kg, foram alojados em baias (0,715m²),

alimentados individualmente e mantidos sob condições de manejo uniforme durante

todo o experimento.

2.2. Dietas e delineamento experimental

Os carneiros passaram por um período de sete dias de adaptação a uma

dieta base composta por feno de capim tifton-85 (Cynodon dactylon) moído (8mm),

milho triturado, farelo de soja, cloreto de sódio e fosfato bicálcico e, formulada de

acordo com o NRC (2006) para atender as exigências de ganho mínimo de 100g/dia

(Tabela 6, anexo 1).

Após o período de adaptação, os animais foram distribuídos aleatória e

equitativamente em quatro grupos: G0, G3, G6 e G9 (Figura 1). Os grupos

experimentais diferiram-se na quantidade consumida diariamente de ácidos graxos

poli-insaturados complexados com sais de cálcio (PUFA-Ca) a partir da ingestão da

dieta base formulada sem e com adição de diferentes níveis de Megalac-E® (Church &

Dwight Co., Nova Jersey, EUA): G0 – grupo controle, sem adição de PUFA-Ca e, G3,

G6 e G9 com a adição de 3%, 6% e 9% de PUFA-Ca, respectivamente. A composição

e análise nutricional das dietas estão expostas na tabela 6 (ANEXOS) (MATOS, et al.,

2012). Durante todo o período experimental os alimentos foram fornecidos na forma de

dieta total, com consumo ad libitum de água e das dietas.

2.3. Colheita e Análise do Sêmen in natura

O esquema utilizado para coleta e análise do sêmen in natura está

representado graficamente na Figura 1. As coletas de sêmen foram feitas por meio de

45

vagina artificial a aproximadamente 43°C estimulando-se previamente cada reprodutor

por dois minutos por aproximação a ovelhas em estro natural. O sêmen coletado

permaneceu aquecido a 32°C para as análises espermáticas e início do

processamento.

Figura 1. Esquema simplificado do delineamento experimental e análise, diluição e envase do sêmen in natura de cada período.

O volume ejaculado foi mensurado observando-se o nível do sêmen nos

tubos de coleta graduados enquanto que a concentração espermática foi mensurada

adicionando-se alíquotas de sêmen à água destilada (1:400) e realizando-se a

contagem dos espermatozoides em câmara de Neubauer sob microscopia óptica em

aumento de 400 vezes. Em seguida foi determinado o número total de

espermatozoides ejaculados pela multiplicação do volume do sêmen e a concentração

espermática para efeitos de cálculo do rendimento mínimo de doses necessárias ao

experimento.

ENVASE (0,25mL)

400 x 106

sptz/mL

G0 G3 G6 G9

Grupos de dietas experimentais G0: Controle (sem PUFA-Ca) G3: 3% de PUFA-Ca G6: 6% de PUFA-Ca G9: 9% de PUFA-Ca

(n=6) (n=6) (n=6) (n=6)

8 ejaculados /

DILUIÇÃO

Exame clínico–andrológico

para seleção dos animais. Avaliação do sêmen in natura Perfil cromatográfico dos AG

dos SPTZ

G0 G3 G6 G9

46

Após a remoção das amostras para realização das análises iniciais, o sêmen

foi transferido para um tubo de ensaio mantido a 37oC que continha previamente o

meio diluidor. O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,25 mL com 100 x 106

espermatozoides o que correspondia a uma concentração espermática final de 400 x

106 espermatozoides/mL.

Após a cuidadosa e completa homogeneização do conteúdo de cada tubo

experimental, as amostras foram envasadas em palhetas francesas (IMV - São Paulo)

de 0,25mL em temperatura ambiente, e posteriormente seladas com álcool polivinílico.

Foram congeladas oito palhetas de sêmen por animal, totalizando 192 palhetas

processadas em cada um dos quatro períodos que representaram, em número de

dias, o período no qual os carneiros ficaram ingerindo as dietas experimentais como

segue: 0; 30, 60 e 90 dias, obtendo-se ao final de todas as coletas um total de 768

amostras congeladas.

2.4. Experimento 1: Perfil cromatográfico dos ácidos graxos dos espermatozoides

Após a remoção da quantidade necessária de amostras para análises

seminais, diluição, envase e congelação, a parte restante do ejaculado de cada animal

foi utilizada para análise do perfil de ácidos graxos dos espermatozoides contidos no

sêmen in natura separadamente de cada dieta experimental e de cada período. As

amostras de sêmen foram centrifugadas à 4500 rpm durante 20 minutos para a

retirada do sobrenadante e congelação dos espermatozoides (precipitado) à -20C.

Após aproximadamente seis dias de congelação, os pellets foram

descongelados à temperatura ambiente sendo removidas alíquotas para

processamento e análise cromatográfica. Para tanto, uma alíquota de 0,3 mg de pellet

foram adicionadas a 10,0 mL de solução KOH + metanol com posterior

homogeneização em vórtex durante 10 minutos. Após a homogeneização, a mistura

permaneceu em banho-maria (40C) por uma hora, para que fossem adicionados 2,0

mL de solução de ácido acético glacial em água destilada (1:17). A mistura foi

homogeneizada em vórtex durante dois minutos para que fosse adicionado 6,6 mL de

hexano. Em seguida, cada amostra foi centrifugada a 3600 g durante 10 minutos, para

a retirada cuidadosa do sobrenadante. O precipitado foi colocado em tubos de ensaio

para secagem em nitrogênio gasoso. As amostras aderidas ao tubo foram lavadas em

hexano para que fossem analisadas conforme metodologia descrita por Surai et al.

(2000). Os ésteres metílicos resultantes de ácidos graxos foram analisados por

cromatografia gasosa com detector de ionização de chamas HP 6890 e amostrador

automático HP 7683, (Hewlett Packard, Wilmington, Delaware, EUA) utilizando uma

47

coluna capilar Carbowax com dimensões de 30m de comprimento x 0,25mm de

diâmetro e 0,25µm de espessura (Alltech Ltd, Carnforth, Lancashire, Reino Unido). A

integração dos picos e a manipulação subsequente de dados foram realizados

usando-se o HP Chemstation software (Hewlett Packard, Wilmington, Delaware, EUA),

permitindo a determinação da composição e área dos ácidos graxos. As identidades

dos picos foram verificadas por comparação com os tempos de retenção dos padrões

de ésteres metílicos dos ácidos graxos. Foram utilizados os seguintes padrões de

ácidos graxos: ácido mirístico (C14:0), ácido esteárico (C18:0), ácido palmitoleico

(C16:1n7), ácido oleico (C18:1n9), ácido linoleico (C18:2n6), ácido -linolênico

(C18:3n3), ácido -linolênico (C18:3n6), ácido eicosenoico (C20:1n9), ácido

araquidônico (C20:4n6), ácido docosatetraenoico (C22:4n6) e, ácido

docosahexaenoico (C22:6n3).

2.5. Experimento 2: Congelação, descongelação e análise do sêmen

criopreservado

O esquema utilizado para congelação, descongelação e análise do sêmen

criopreservado está representado graficamente na Figura 2. As palhetas contendo o

sêmen foram submetidas à congelação automatizada utilizando-se a máquina TK

4000 (TK Tecnologia em Congelação Ltda, Uberaba-MG). As palhetas foram

transferidas para a máquina programada para executar uma curva de refrigeração a

uma velocidade de 0,25°C/minuto até 5°C, sendo as palhetas mantidas nessa

temperatura até completar 120 minutos do início do processo A etapa de congelação

era processada acionando-se o início da curva automatizada correspondente a

velocidade de -20°C/minuto até atingir –140°C. Ao final do processo as palhetas foram

imersas no nitrogênio líquido (N2L), colocadas em raques previamente identificadas e

armazenadas em botijão criogênico até a sua descongelação conforme descrito por

Bandeira et al. (2012).

48

Solução para análise = sêmen + solução avaliadora

Figura 2. Esquema simplificado do processamento para criopreservação e análises do sêmen descongelado de cada período.

Três palhetas de cada um dos 24 carneiros, em cada período experimental

foram descongeladas separadamente, perfazendo um total de 288 amostras

avaliadas. As palhetas foram submetidas à descongelação em banho-maria a 40C

por 20 segundos, sendo o sêmen transferido para microtubos de 1,5 mL previamente

aquecidos e mantidos a 37C e dos quais se removiam amostras para as avaliações in

vitro do sêmen congelado, quanto à avaliação computadorizada da cinética,

viabilidade espermática, capacitação e reação acrossomal como descrito no item 2.6.

2.6. Qualidade dos espermatozoides criopreservados de carneiros alimentados

com Ácidos Graxos Poli-Insaturados

2.6.1. Avaliação Computadorizada da Cinética

Amostras de sêmen contendo 15 x 107 espermatozoides foram transferidas

para microtubos previamente aquecidos com 250 L de solução avaliadora (330mg de

glucose anidra, 62mg de citrato de sódio bi-hidratado, 11mg de bicarbonato de sódio,

37mg de EDTA sal dissódico, 11mg de cloreto de potássio, 1718mg de sulfato de

gentamicina, 50mL de água mili Q). Após homogeneização e incubação a 37oC por

G0 G3 G6 G9

Avaliações Pós Descongelações Avaliação Computadorizada da Cinética Viabilidade Espermática Capacitação e Reação Acrossomal

REFRIGERAÇÃO: 0,25C/min 120’

CONGELAÇÃO: - 20C/min -140C

DESCONGELAÇÃO: 40C – 20 seg.

49

cinco minutos, eram removidas alíquotas de 2μL da mistura para câmara de Makler®

(Sefi-Medical Instruments, Haifa, Israel) pré-aquecida à 37°C para captura de imagem

por meio de uma câmera de vídeo (Basler Vision Technologies® 602FC, Ahrensburg,

Alemanha) conectada a um microscópio com contraste de fase (Nikon® 50i, Japão),

sob aumento de 1000 x. A captura de imagens foi feita de forma manual automatizada

a velocidade 100 imagens/segundo, sendo que pelo menos quatro campos foram

selecionados manualmente a partir de um mesmo ponto central, capturando-se no

mínimo 500 células por amostra. As imagens capturadas foram analisadas pelo Sperm

Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L. Versão 5.0, Barcelona, Espanha) tendo-se

como padrão o set-up de fábrica para a espécie ovina modificado por Bandeira et al.

(2012).

Foram analisados os seguintes parâmetros de cinética e suas respectivas

unidades e critérios relacionados ao movimento dos espermatozoides (SPTZ): MP -

motilidade progressiva (% SPTZ >60% de STR - retilinearidade), RAP - (% SPTZ

rápidos), VCL - velocidade curvilinear (μm/s), VSL - velocidade em linha reta (μm/s),

VAP - velocidade média do percurso (μm/s), ALH - deslocamento lateral da cabeça

(μm), BCF - frequência de batimento flagelar cruzado (Hz), LIN - linearidade (%) e STR

- retilinearidade (%).

2.6.2. Viabilidade Espermática

Para análise de viabilidade espermática, o sêmen foi submetido à técnica de

avaliação simultânea das integridades da membrana plasmática e do acrossomo e do

potencial de membrana mitocondrial dos espermatozoides (CELEGHINI, 2005),

adaptada por Souza (2007). Amostras de sêmen contendo 15 x 107 espermatozoides

foram transferidas para microtubos previamente aquecidos à 37C e contendo 250L

de solução avaliadora. Após cinco minutos de incubação a 37C, eram removidas

alíquotas de 8L a concentração aproximada de 4 x 106 espermatozoides/mL da

mistura para serem adicionadas em microtubos contendo solução de trabalho dos

fluorocromos, como segue: iodeto de propídio (PI) à 7,3µM; rodamina 123 (Rh 123) à

0,53mM e aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína de isotiocianato

(FITC-PSA) à 256,81µM. A mistura foi homogeneizada, mantida protegida da luz e

submetida à incubação à 37oC por 30 minutos. Após esse período, uma amostra de

aproximadamente 12μL foi removida e colocada entre lâmina e lamínula pré-aquecidas

à 37oC para realização da leitura e contagem de 200 células sob imersão e aumento

de 1000 vezes em microscópio com iluminação epifluorescente (Nikon® 50i, Japão),

usando-se o filtro com comprimento de onda de excitação de 450-490 e de emissão de

50

515 nanômetros. A contagem foi realizada percorrendo-se os campos rapidamente e

registrando-se a leitura sendo que os espermatozoides contados foram visualizados e

classificados baseados na descrição de Celeghini (2005). A ausência ou presença de

fluorescência verde fosca (FITC-PSA) e consequentemente a presença ou ausência

de fluorescência vermelha na cabeça (PI) indicaram respectivamente a lesão ou não

da membrana plasmática. A presença ou ausência de fluorescência verde intenso na

região acrossomal (FITC-PSA) indicaram respectivamente a lesão ou não do

acrossomo. Peças intermediárias com coloração verde com elevada e baixa

intensidade indicaram respectivamente, com e sem potencial de membrana

mitocondrial (Rh 123). Para avaliação da qualidade seminal foram considerados como

espermatozoides viáveis somente aqueles que possuíam membrana plasmática e

acrossomal íntegras e com potencial de membrana mitocondrial.

2.6.3. Capacitação e Reação Acrossomal

A avaliação de capacitação e reação acrossomal foi feita utilizando-se a

clortetraciclina (CTC) como descrito por Gillan et al. (1997) e adaptado por Azevedo

(2006) em conjugação com o homodímero de etídio (EthD-1) segundo técnica descrita

por Grasa et al. (2006). Amostras de sêmen contendo 24 x 106 espermatozoides foram

diluídas em 1000L de solução tamponada de Dulbecco (PBS) pré-aquecida à 37oC e

submetidas a uma leve centrifugação a 900 por quatro minutos para remoção do

plasma seminal e do meio diluidor. Após remoção cuidadosa do sobrenadante, o pellet

de sêmen foi re-suspendido com 150L de PBS, separando-se 5µL da amostra em um

microtubo. Foi adicionado Homodímero de Etídio à 23,3µM, mantendo-se a amostra

do pellet diluído sob incubação durante 10 minutos. Após esse período, foi adicionada

a solução de 1mM de CTC recém preparada (≤ 12 horas). A mistura foi

homogeneizada vagarosamente por 20 segundos e, com o objetivo de interromper a

reação foi adicionado solução de glutaraldeído a 1%.

Uma amostra dessa suspensão foi colocada numa lâmina aquecida a 37oC,

sendo coberta com lamínula, comprimida firmemente com papel absorvente para

remover o excesso de fluido, selada com esmalte incolor e mantida a 4oC protegida da

luz para ser realizada a leitura até uma hora depois. A contagem das células foi

realizada sob óleo de imersão e aumento de 1000 vezes em microscópio com

iluminação epifluorescente (Nikon® 50i, Japão) usando o filtro com comprimento de

onda de excitação de 450-490 e de emissão de 515 nanômetros. Um total de 200

células por cada lâmina foi contado sendo os espermatozoides classificados em quatro

categorias ou padrões baseados na distribuição da fluorescência verde (CTC) e

51

vermelha (EthD-1), conforme descrito por Gillan et al. (1997) e Grasa et al. (2006): F –

uniforme distribuição da fluorescência verde por toda a cabeça com presença ou não

de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial e ausência de fluorescência

vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra, não

capacitados e com acrossomo intacto; B – fluorescência verde na região anterior da

cabeça, ausência de fluorescência na região pós-acrossomal e ausência de

fluorescência vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática

íntegra, capacitados e com acrossomo intacto; AR – região anterior da cabeça com

pouca ou nenhuma fluorescência verde e ausência de fluorescência vermelha na

cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra e acrossomo reagido e;

NV (não-viáveis) – fluorescência vermelha distribuída total ou parcialmente pela

cabeça - espermatozoides com membrana plasmática lesada. Para avaliação da

qualidade seminal foram considerados somente os espermatozoides classificados

como padrão F.

2.7. Análise Estatística

Para o experimento 1, verificou-se a mudança no perfil de ácidos graxos (AG)

dos espermatozoides entre as dietas. Os percentuais das 14 variáveis de AG de cada

amostra foram analisados utilizando ordenação multivariada de escala

multidimensional não-métrica (SOKAL, 1979), com distâncias Sorensen. Os valores de

p < 0,05 foram considerados como estatisticamente significativo pelo teste de Monte

Carlo.

Para o experimento 2, foram verificadas as mudanças no parâmetros dos

espermatozoides de cada dieta. A matriz contendo a média das três palhetas de cada

animal das 11 variáveis foi analisada utilizando ordenação multivariada de escala

multidimensional não-métrica (NMS), com distâncias Sorensen. A ordenação foi

realizada no modo piloto automático, opção lenta e completa no programa PCORD v.

6.04 (MCCUNE & MEFFORD, 2006).

Consideraram-se os critérios de estabilidade e de estresse das soluções

gráficas para que fosse estabelecido o número de dimensões que foi interpretado e

selecionado. Variações no perfil de AG foram caracterizadas pela correlação de

Pearson entre as médias das amostras sobre os eixos 1 e 2 do NMS e as médias das

11 variáveis referentes aos parâmetros dos espermatozoides neste estudo.

Para testar a hipótese de nenhuma alteração no perfil de AG entre o grupo

controle e as dietas 3%, 6% e 9% utilizou-se o procedimento de permutação multi-

resposta (MRPP, MIELKE & BERRY, 2000). Foram realizadas comparações entre os

52

tratamentos dentro de cada período pelo MRPP tanto em relação aos AG (médias dos

eixos 1 e 2 do NMS, simultaneamente) e as médias de cada eixo NMS

separadamente. Em todos estes casos, foram utilizadas medidas de distância

Sorensen. Todos os testes multivariados foram realizados do programa estatístico PC-

ORD versão 6.0 (MCCUNE E MEFFORD, 2006).

53

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Quanto ao perfil cromatográfico dos ácidos graxos dos espermatozoides, a

análise multivariada indicou diferença significativa entre as dietas 0 e 9% aos 90 dias

da administração das dietas (Tabela 1 e 2).

Tabela 1. Procedimento de permutação multi-resposta (MRPP) comparando o grupo controle e os demais tratamentos tanto em relação ao perfil de AG dos espermatozoides de cada grupo (médias nos eixos 1 e 2 do NMS, simultaneamente) e as médias em cada eixo NMS separadamente, dentro de cada período.

Comparação Períodos

1

P0 P30 P60 P90

G0 vs. G3 NS NS NS NS

G0 vs. G6 NS NS NS NS

G0 vs. G9 NS NS NS 0.00247175

1 P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 da administração da dieta, respectivamente. ¹ G0 = sem adição de PUFA-

Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. NS: não significativo (p<0,05).

Os espermatozoides dos carneiros do grupo tratado com 9% de PUFAs-Ca

(G9) apresentaram menores proporções dos ácidos esteárico, oleico, -linolênico

(GLA), araquidônico, do somatório de ácidos graxos poli-insaturados (ƩPUFAs) e da

razão entre os somatórios dos ácidos graxos poli-insaturados e saturados

(ƩPUFAs/ƩSFA), quando comparado ao grupo controle (G0) aos 90 dias da

administração da dieta. Apesar de ter sido verificada diminuição (p<0,001) da

proporção dos ácidos mirístico, docosatetraenoico e do somatório de ácidos graxos

saturados (ƩSFA), esta redução foi mais expressiva no grupo controle. (Tabela 2,

figura 3). Os AG monoinsaturados palmitoleico e eicosenoico, e os poli-insaturados

linoleico, -linolênico (ALA), e o docosahexaenoico (DHA) obtiveram valores não

significativos (Tabela 2).

54

Tabela 2. Coeficientes de correlação dos ácidos graxos (AG) entre o perfil de AG dos grupos G0 e G9 representado pelas médias das amostras ao longo dos eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS).

a C14:0 - ácido mirístico, C18:0 - ácido esteárico, C16:1n7 - ácido palmitoleico, C18:1n9 - ácido oleico, C18:2n6 - ácido

linoleico, C18:3n3 - ácido -linolênico, C18:3n6 - ácido -linolênico, C20:1n9 - ácido eicosenoico, C20:4n6 - ácido araquidônico,

C22:4n6 - ácido docosatetraenoico , C22:6n3 - ácido docosahexaenoico, SFA: somatório de ácidos graxos saturados, PUFA:

somatório dos ácidos graxos poli-insaturados, PUFA/SFA: relação entre os somatórios de poli-insaturados e saturados. NS: não significativo (p>0,05). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Tabela 3. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico no grupo controle e na dieta de 9% de poli-insaturados complexados com sais de cálcio dos espermatozoides criopreservados de carneiros após 90 dias.

Ácidos Graxos

Grupos1

G0 G9

C14:0 30,53 5,64*** 32,87 1,29***

C18:0 29,69 4,00** 27,53 0,71**

C16:1(n-7) 1,45 0,69 0,64 0,29

C18:1(n-9) 11,06 2,83** 9,11 1,19**

C18:2(n-6) 8,78 1,47 10,20 0,46

C18:3(n-3) 0,38 0,04 0,26 0,03

C18:3(n-6) 0,68 0,26** 0,58 0,11**

C20:1(n-9) 0,80 0,17 2,35 0,55

C20:4(n-6) 12,96 6,51*** 15,58 0,99***

C22:4(n-6) 3,33 7,74*** 0,17 0,07***

C22:6(n-3) 0,36 0,18 0,71 0,16

SFA 60,21 7,73*** 60,40 1,03***

PUFA 45,94 19,48*** 45,56 2,58***

PUFA/SFA 26,48 8,76*** 27,50 1,15***

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. C14:0 - ácido mirístico, C18:0 - ácido esteárico, C16:1n7 -

ácido palmitoleico, C18:1n9 - ácido oleico, C18:2n6 - ácido linoleico, C18:3n3 - ácido -linolênico, C18:3n6 - ácido -linolênico, C20:1n9 - ácido eicosenoico, C20:4n6 - ácido araquidônico, C22:4n6 - ácido docosatetraenoico , C22:6n3 -

ácido docosahexaenoico, SFA: somatório de ácidos graxos saturados, PUFA: somatório dos ácidos graxos poli-

insaturados, PUFA/SFA: relação entre os somatórios de poli-insaturados e saturados. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Coeficientes de correlação

Variáveisa NMS Eixo 1 NMS Eixo 2

C14:0 0,260 NS

-0,860***

C18:0 -0,540** -0,164 NS

C16:1(n-7) -0,227 NS

0,168 NS

C18:1(n-9) -0,588** -0,011 NS

C18:2(n-6) -0,370 NS

0,076 NS

C18:3(n-3) 0,162 NS

0,069 NS

C18:3(n-6) -0,550** -0,107 NS

C20:1(n-9) -0,059 NS

-0,071 NS

C20:4(n-6) -0,369 NS

0,788***

C22:4(n-6) 0,889*** 0,325 NS

C22:6(n-3) 0,021 NS

0,097 NS

SFA -0,031 NS

-0,950***

PUFA 0,334 NS

0,913***

PUFA/SFA 0,342 NS

0,909***

55

Em relação à qualidade dos espermatozoides criopreservados de carneiros

alimentados com PUFAs, o G9 apresentou menores médias para os parâmetros ALH

e VCL (p<0,05), que aquelas do grupo controle (G0) aos 90 dias da administração da

dieta (Tabela 4, figura 3). Os parâmetros cinéticos MP, RAP, VSL, VAP, BCF, LIN,

STR, além da viabilidade e do padrão F de capacitação e reação acrossomal

obtiveram valores não significativos (Tabela 4).

Eix

o 2

(0

,38)

VCL(m/s)

C18:0 C18:3n6

C18:1n9

ALH(m)

PUFAs PUFAs/SFA

C20:4n6

C22:4n6

SFA

C14:0

Eixo 1 (0,55)

Figura 3: Ordenação em duas dimensões do perfil dos ácidos graxos e os parâmetros dos espermatozoides criopreservados de carneiros alimentados com dieta controle (G0) e 9% PUFAs-Ca (G9) aos 90 dias após o início da administração das dietas. Grupos: G0: Controle (s/ PUFA-Ca); G9: 9% PUFA-Ca.

56

Tabela 4. Coeficientes de correlação dos parâmetros dos espermatozoides criopreservados de carneiros dos grupos G0 e G9 representados pelas médias das amostras ao longo eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS).

1 MP - motilidade progressiva, RAP – espermatozoides rápidos, VCL - velocidade curvilinear, VSL - velocidade em linha

reta, VAP - velocidade média do percurso, ALH - deslocamento lateral da cabeça, BCF - frequência de batimento flagelar cruzado, LIN – linearidade, STR – retilinearidade, VIAB – espermatozoides com membrana plasmática e acrossomal íntegras e com potencial de membrana mitocondrial, F – uniforme distribuição da fluorescência verde por toda a cabeça com presença ou não de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial e ausência de fluorescência vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra, não capacitados e com acrossomo intacto. * p<0,05.

Tabela 5. Médias desvio-padrão dos parâmetros dos espermatozoides criopreservados de carneiros no grupo controle e na dieta de 9% de ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio.

Parâmetros2

Grupos1

G0 G9

MP(%) 40,51 6,07 44,07 6,08

RAP(%) 41,99 6,63 47,83 10,23

VCL(µm/s) 187,16 16,31* 186,99 18,28*

VSL(µm/s) 91,40 9,97 94,98 9,92

VAP(µm/s) 115,30 9,46 118,80 12,58

ALH(µm) 2,97 0,23* 2,89 0,08*

BCF(Hz) 49,95 1,95 50,65 1,71

LIN(%) 48,84 3,07 50,78 1,19

STR(%) 79,12 2,58 79,93 0,98

Viab.(%) 4,92 2,43 5,63 1,73

F(%) 1,58 0,83 2,33 1,43

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. 2 MP - motilidade progressiva (%), RAP – espermatozoides

rápidos (%), VCL - velocidade curvilinear (μm/s), VSL - velocidade em linha reta (μm/s), VAP - velocidade média do percurso (μm/s), ALH - deslocamento lateral da cabeça (μm), BCF - frequência de batimento flagelar cruzado (Hz), LIN - linearidade (%), STR - retilinearidade (%), BCF - frequência de batimento flagelar cruzado, LIN – linearidade, STR – retilinearidade, VIAB – espermatozoides com membrana plasmática e acrossomal íntegras e com potencial de membrana mitocondrial, F – uniforme distribuição da fluorescência verde por toda a cabeça com presença ou não de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial e ausência de fluorescência vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra, não capacitados e com acrossomo intacto. * p<0,05.

Parâmetros1

Coeficientes de correlação

NMS Eixo 1 NMS Eixo 2

MP -0,209 NS

0,148 NS

RAP -0,282 NS

0,200 NS

VCL -0,410* 0,134 NS

VSL -0,323 NS

0,040 NS

VAP -0,331 NS

0,076 NS

ALH -0,468* 0,193 NS

BCF -0,172 NS

0,161 NS

LIN 0,087 NS

-0,176 NS

STR -0,078 NS

-0,139 NS

VIAB -0,054 NS

0,273 NS

F -0,259 NS

-0,051 NS

57

Os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) foram significativamente alterados

por tratamento dietético no sêmen de várias espécies animais, incluindo mamíferos

como bovinos e suínos (POULOS et al., 1986), ovinos (SAMADIAN et al., 2010;

SELVARAJU et al.,2012). Neste estudo observaram-se mudanças no perfil de ácidos

graxos dos espermatozoides de carneiros que se alimentaram com 9% de PUFA-Ca,

comparado ao grupo controle após 90 dias do início da dieta.

Mudanças aos 90 dias podem ser totalmente associadas ao tempo de

espermatogênese somado ao trânsito do espermatozoide no epidídimo em ovinos,

uma vez que nesta espécie este período é de aproximadamente 70 dias

(CUNNINGHAM & KLEIN, 2008). Mesmo considerando o fato de que os

espermatozoides foram avaliados 20 dias após o intervalo estabelecido pode ser

detectável que uma subpopulação de espermatozoides estarem localizados nos

epidídimo, que possui a função de armazenar temporariamente as células

espermáticas após o término da espermatogênese.

A ausência de valores significativos para as modificações esperadas pelas

dietas 3% e 6% podem ser atribuidas a ocorrência da biohidrogenação ruminal.

Redutases, sintetizadas por bactérias e protozoários ruminais, são responsáveis pela

clivagem de ligações duplas, transformando-as em simples, podendo ter

descaracterizado a estrutura molecular dos PUFAs quanto ao número de insaturações,

convertendo-os em ácidos graxos saturados. Esse fenômeno tem como objetivo

reduzir um possível efeito deletério da gordura, caracterizado pelas saturações nos

PUFAs ingeridos por ruminantes como bovinos (SULLIVAN et al., 2004) e ovinos (De

GRAFF et al., 2007).

O maior percentual de PUFAs-Ca (9%) contribuiu para que a estrutura

molecular dos ácidos esteárico, oleico, GLA, araquidônico permanecessem intactas,

possibilitando a absorção destes pelas células intestinais e consequentemente,

mudança no perfil destas biomoléculas nos espermatozoides, mesmo com valores

menos expressivos que a dieta controle.

De Graaf et al. (2007) sugeriram que os resultados negativos na

criopreservação de sêmen ovino são obtidos em decorrência da saturação dos

PUFAs, provocada pela biohidrogenação. Segundo os referidos autores, esse

fenômeno poderia ser responsável pela elevação da concentração de ácidos graxos

saturados e não alteração na composição dos PUFAs na membrana espermática.

O ácido palmitoleico e eicosenoico (C20:1n9) obtiveram coeficientes não

significativos de correlação. Pode estar associado a formação de fosfolipídeos. Sabe-

se que o C16:1n9 (palmitoil) exerce ligação covalente com o aminoácido serina,

previamente ligada a coenzima A (CoA), afim de se condensar formando a

58

cetoesfinganina. Seguida da redução de NADPH, contribui para formar a esfinganina,

utilizada na biossíntese de esfingolipídeos, que são tipos de lipídios de membrana

contendo em sua estrutura molecular um monossacarídio (HUWILLER, et al., 2000;

DEGROOTE, et al., 2004).

Considerado que o ácido saturado mais predominante no espermatozoide

ovino é o mirístico (C14:0), pode ser que a redução foi em decorrência do consumo

em atividades metabólicas. Sabe-se que espermatozoides são capazes de oxidar AG

como o 14:0 e o 18:0, constituintes precursores de plasmalogênios, tipos de

fosfolipídios nos quais reagem de forma catalítica pela ação de fosfolipases para

romper ligações éter saturadas. A remoção do C14:0 e C18:0 é importante na

atividade da respiração intracelular para a produção de energia (HARTREE & MANN,

1961; MANN, 1964; SCOTT, 1973; GLEW, 2010; CARDOSO, et al., 2011;

LEHNINGER & COX, 2011), contribuindo também para menores valores na SFA.

Foram observadas proporções de ácido oleico (C18:1n9) menores na dieta

9%. Pode ser que tenha ocorrido oxidação produzida por enzimas. O C18:1n9 pode ter

se ligado covalentemente com a coenzima A (CoA), formando o composto oleolil-CoA

podendo ter entrado na matriz mitocondrial pelo circuito da carnitina, que por -

oxidação produz moléculas de acetil-CoA, a qual possui diversos grupos funcionais

com características químicas de reação distintas, entre elas, biossíntese de AG e

produção de ATP. Portanto, pode ter refletido nos parâmetros cinéticos significativos


As médias menos expressivas do ácido -linolênico (GLA) no G9 podem estar

associadas à utilização deste AG como precursor na biossíntese do docosatetraenoico

(C22:4n6). A elongase alonga a cadeia carbônica do GLA até a estrutura de 20:3n-6,

sendo subsequentemente convertido em araquidônico pela Δ5-dessaturase e

alongado a 22:4n-6 no retículo endoplasmático. Ainda nesta organela, são adicionados

dois carbonos produzindo 24:4n6, e pela ação da Δ6-dessaturase é convertido a

24:5n6. Este é transferido para os peroxissomos que por β-oxidação remove dois

carbonos da cadeia e então produz o docosapentaenoico (DPA). De forma similar aos

DHA, o DPA formado é transferido de volta ao retículo endoplasmático e rapidamente

incorporado aos fosfolipídios de membrana desta organela por nova esterificação

(SPRECHER, et al., 1995; UAUY & CASTILLO, 2003; KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et

al., 2011).

A fonte de PUFA-Ca utilizada neste trabalho (Megalac-E®) apresenta uma

composição mínima de extrato etéreo de 85%, sendo destes 45% de ácido linoleico

(C18:2n6) 6% de ácido -linolênico (C18:3n3) (ARM & HAMMER, 2006). Como esses

59

ácidos graxos não podem ser sintetizados pelos vertebrados, eles precisam ser

ingeridos (BLESBOIS et al., 1997), e assim serem incorporados nas células

espermáticas. Como foi atribuído ao G9 um maior percentual de PUFAs-Ca, era

esperado que esse grupo obtivesse maiores proporções dos ácidos linoleico e -

linolênico (ALA), e consequentemente, PUFAs e PUFAs/SFA em relação ao G0.

Uma possível explicação para esse fato é que o linoleico (C18:2n-6) é uma

molécula essencial e precursora do -linolênico (GLA) e do araquidônico (C20:4n6). A

biossíntese ocorre a partir do C18:2n-6 e utiliza uma via análoga e sistema enzimático

semelhante ao exercido pelo ALA. A enzima Δ6-dessaturase atua na dessaturação do

linoleico, inserindo uma dupla ligação na posição 6 e transformando-o em GLA,

processo mencionado anteriormente. (SPRECHER, et al., 1995; UAUY & CASTILLO,

2003; KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et al., 2011). Portanto, os valores não significativos

para o C18:2n-6 e GLA, menores proporções de C20:4n6 da dieta 9% em relação a

grupo controle e redução do ácido docosatetraenoico (C22:4n6) podem estar

associados à biossíntese do ácido docosapentaenoico (DPA).

Foram observados valores de correlação menos expressivos de C20:4n6 no

G9. Pode ser que tenha ocorrido elevação da concentração de prostaglandinas (PG).

Quando ocorre a necessidade da síntese de moléculas complexas, a partir do controle

hormonal da espermatogênese, há uma modulação de vias de sinalização intracelular,

que consiste na liberação de cálcio (Ca2+) do retículo endoplasmático e na fosforilação

da fosfolipase A2 (PLA2). Dependendo das concentrações de Ca2+ intracelular, a PLA2

atua clivando ligações entre o fosfolipídio e o ácido araquidônico (C20:4n6),

desagregando-o da membrana plasmática e disponibilizando-o para que lipoxigenases

possam incorporar o oxigênio molecular produzindo PG. As PG são mediadores

lipídicos que estão também nas vesículas seminais e a concentração é influenciada

pela quantidade dos hormônios como folículo estimulante (FSH) (SURAI et al., 2000;

GLEW, 2010), cuja função é de estimular os espermatócitos primários a se dividirem,

dando origem aos espermatócitos secundários. O FSH tem sua atividade controlada

pelo eixo hipotálamo-hipofisário (SURAI et al., 2000; GLEW, 2010).

O ácido araquidônico é uma molécula precursora que participa da via

metabólica para a síntese de prostaglandinas (SAMADIAN, 2010; LEHNINGER &

COX, 2011). Pode ser que após uma ingestão dietética significativa de ácidos graxos

(n-6), os resultados deste estudo tenham sido mediados pela alteração do tipo de

eicosanoides produzidos. Infelizmente, os eicosanoides não foram caracterizados.

Uma consideração importante é o potencial de interação do PUFA com derivados

eicosanoides, como as prostaglandinas, controladas pelo eixo hipotálamo-hipofisário e

o hormônio folículo estimulante (FSH) na espermatogênese. A utilização do

60

araquidônico e do -linolênico nos processos metabólicos pode ter contribuído para os

valores menos expressivos de PUFAs e, consequentemente PUFAs/SFA. Assim,

os efeitos da suplementação de PUFAs podem agir sobre a secreção do hormônio

FSH, podendo ser digno de investigação (SURAI et al., 2000).

Em relação ao -linolênico(ALA), este utiliza uma via análoga e o mesmo

sistema enzimático do linoleico, porém contribui para a síntese do ácido

docosahexaenoico (DHA) por intermédio de uma sequência de reações que inclui

dessaturações e alongamentos da cadeia carbônica. As células neurais e da retina

são consideradas um dos principais compartimentos de locais de síntese de DHA

(SCOTT & BAZAN, 1989).

Inicialmente a enzima Δ6-dessaturase atua na dessaturação do ALA,

inserindo uma dupla ligação na posição 6 e transformando-o em 18:4n-3.

Posteriormente, a elongase alonga a cadeia carbônica deste ácido graxo até a

estrutura de 20:4n-3, sendo subsequentemente convertido a 20:5n-3 (ácido

eicosapentaenoico) pela Δ5-dessaturase e alongado a 22:5n-3 no retículo

endoplasmático. Ainda nesta organela, são adicionados dois cardonos ao 22:5n-3

produzindo 24:5, e pela ação da Δ6-dessaturase é convertido a 24:6. Este é

transferido para os peroxissomos que por β-oxidação remove dois carbonos da cadeia

e então produz o DHA. O DHA formado é transferido de volta ao retículo

endoplasmático e rapidamente incorporado aos fosfolipídios de membrana desta

organela por nova esterificação (SPRECHER, et al., 1995; UAUY & CASTILLO, 2003;

KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et al., 2011). Provavelmente esse fato pode explicar a

correlação não significativa para o ALA.

E quanto ao DHA, devido a sua participação na formação dos lipídios das

membranas de organelas, pode ter contribuído para que houvesse esses valores não

significativos dos parâmetros de cinética, viabilidade espermática e o padrão F de

capacitação. O DHA não foi alterado em ambas as dietas e é considerado um dos

ácidos graxos mais abundantes, constituindo 61% dos fosfolipídios das células

espermáticas de touros e carneiros (NEILL & MASTERS, 1973; SPEAKE et al., 2003).

Entretanto, no meio intracelular existem organelas com membranas, as quais possuem

estrutura molecular similar à membrana celular.

A utilização do DHA para a constituição dos lipídios de membrana das

organelas pode ter influenciado na viabilidade e no padrão F de capacitação

espermática. Um processo multivariado que tem sido correlacionado com

modificações na distribuição e composição dos fosfolipídios da membrana celular, no

pH intracelular, metabolismo e concentração intracelular de monofosfato cíclico de

adenosina e fluidez da membrana plasmática é a capacitação espermática (ROLDAN

61

& GOMENDIO, 1992; GORDON, 1994; PÉREZ et al., 1996; GILLAN et al., 1997;

VISCONTI et al., 1998; OLIVEIRA, 2002).

Em humanos, a diminuição do ácido docosahexanoico (DHA) está

diretamente associada com o declínio da motilidade (ROOKE et al., 2001). Entre as

análises que foram propostas neste estudo, a avaliação do potencial de membrana

mitocondrial (como parte integrante da viabilidade espermática) e análise dos

parâmetros de cinética espermática (MP, RAP, VSL, VAP, BCF, LIN e STR), podem

ter sido influenciadas pela produção de adenosina trifosfato (ATP). Quando os ácidos

graxos são utilizados para diversas funções como produção de hormônios, controle da

massa corporal e outras atividades, o nucleotídeo adenosina difosfato (ADP) é

convertido por reações de fosforilação em adenosina monofosfato (AMP), sendo

responsável por ativar a enzima adenosina monofosfato cinase (AMPK), a qual ativa a

proteína-cinase, previamente estimulada pela leptina, considerado hormônio peptídico

produzido pelos adipócitos. A AMPK possui a função de ativar a acetil-CoA-

carboxilase que produz o malonil-CoA, atuante na biossíntese de ácidos graxos.

Entretanto, o malonil-CoA age simultaneamente como potente inibidor da enzima

carnitina-aciltransferase I, que inicia o processo de -oxidação pelo transporte dos AG

para a mitocôndria com o objetivo de produzir adenosina trifosfato (ATP), onde parte

do consumo deste nucleotídeo é para a cinética espermática (SPRECHER, et al.,

1995; UAUY & CASTILLO, 2003; KIM, 2007; APPOLINÁRIO, et al., 2011).

Devido à necessidade de adquirir PUFAs essenciais de dietas para a

biossíntese de ácidos graxos como DHA para a composição lipídica da membrana

plasmática e para a produção de energia, é de se esperar que a -oxidação nas

mitocôndrias obtenha uma quantidade limitada de energia dos AG saturados,

justificando a utilização dos poli-insaturados nas diversas atividades metabólicas e,

portanto, menor variedade de biomoléculas podem ser produzidas a partir das suas

estruturas.

Uma hipótese pela qual pode justificar menores proporções de AG da dieta

9% em relação ao controle está na regulação da expressão gênica. Além dos vários

mecanismos reguladores que modulam a atividade de enzimas como acetil-CoA-

carboxilase, malonil-CoA, AMPK, proteína-cinase, carnitina-aciltransferase I, a

transdução pode mudar a concentração destas enzimas, impedindo a inibição ou

estímulo.

Santoro et al., (2012) avaliaram a ação de receptores ativados por

proliferadores em diferentes eventos que caracterizam a biologia da célula

espermática como a motilidade, a viabilidade e a capacitação e reação acrossomal e

os resultados demonstraram melhorias nas funcionalidades, sobrevivência e

62

metabolismo nos espermatozoides de suínos pelos efeitos sobre os lipídios e que

induz o gasto energético. Portanto, os receptores ativados por proliferadores de

peroxissomos são fatores de transdução que em resposta a uma grande variedade de

ligantes semelhantes à AG pelo maior percentual de PUFAs, podem ter possibilitando

um aumento na concentração das enzimas responsáveis por regular as vias de

oxidação, produção de ATP, síntese de prostaglandinas, entre outros mecanismos.

(WATHES et al., 2007; LEHNINGER & COX, 2011).

Quanto aos parâmetros seminais, houve diminuição dos valores do VCL e

ALH do G9 em relação a G0 (p<0,05) (tabela 5, figuras 4 e 5), pode ser devido aos

danos sub-letais sofridos pelos espermatozoides de carneiros submetidos à dieta de

9% durante processo de criopreservação, perda da atividade mitocondrial ou a efeitos

decorrentes da liberação de metabólitos livres pela atividade metabólica das células

espermáticas ativas (BAG et al., 2004), sendo que o grupo controle exibiu melhor

proteção aos espermatozoides.

FIG. 4. Correlações entre a qualidade dos espermatozoides (SQ), expressa por amostras do grupo controle e a dieta 9% ao longo do eixo NMS 1, e a variável que descreve a velocidade curvilinear (VCL). Dieta controle ( ); dieta 9% ( ). As barras horizontais e verticais indicam desvio padrão ± 1 para os escores NMS e variáveis da qualidade dos espermatozoides, respectivamente. * Significativo a 5% de probabilidade.

FIG. 5. Correlações entre a qualidade dos espermatozoides (SQ), expressa por amostras do grupo controle e a dieta 9% ao longo do eixo NMS 1, e a variável que descreve a amplitude lateral da cabeça (ALH). Dieta controle ( ); dieta 9% ( ). As barras horizontais e verticais indicam desvio padrão ± 1 para os escores NMS e variáveis da qualidade dos espermatozoides, respectivamente. *** Significativo a 5% de probabilidade.

63

Valores inferiores de ALH estão relacionados com maior deslocamento linear

e retilíneo o que é desejável nas amostras de sêmen (MORTIMER, 1997). O ALH

também está relacionado com a capacidade de penetração da zona pelúcida pelo

espermatozoide, sendo um parâmetro que tem um efeito direto sobre a fertilização

(FENEUX et al., 1985; MORTIMER et al., 1986), por isso ele não deve ser muito

elevado.

O grupo G9 indicou valores de correlação não significativos para a maioria

dos parâmetros dos espermatozoides. O fato da suplementação não ter provocado

efeitos sobre os parâmetros dos espermatozoides, com exceção do VCL e ALH, pode

ter sido reflexo da não alteração do DHA. Neste estudo, não é verificada correlação

significativa de DHA na composição lipídica dos espermatozoides. Uma possível

justificativa para o DHA é que a dieta de 9% pode ter ocorrido reações com

metabólitos do oxigênio molecular, comparado ao controle.

A disponibilidade de PUFAs, como o DHA (OLLERO et al., 2000) podem

tornar as membranas mais sensíveis à deterioração (DI MASCIO et al., 1991), em

decorrência de que podem ter proporcionado aos espermatozoides vulnerabilidade ao

estresse oxidativo causado por metabólitos reativos do oxigênio (ROS) (PARKS &

HAMMERSTEDT, 1985; LI et al., 2004; HATAMOTO et al., 2006), que são capazes de

alterar quimicamente praticamente todas as principais classes de biomoléculas,

lipídios, por exemplo, com modificações concomitantes na estrutura e função

(MCCALL & FREIZ, 1999).

A segunda hipótese é que pode estar associada às reações nas quais os

PUFAs da dieta 9% terem sido submetidos aos complexos enzimáticos, em um nível

suficiente para provocar alterações no perfil lipídico das membranas plasmática, e

acrossomal. Uma explicação alternativa para a diminuição dos PUFAs no presente

estudo é a peroxidação lipídica. Isto pressupõe que a quantidade de PUFAs, durante

os 90 dias, pode ter sido neutralizada pela suscetibilidade da membrana plasmática à

peroxidação (JONES et al., 1979). A peroxidação lipídica é conhecida por ter impacto

negativo sobre a motilidade espermática e integridade da membrana acrossomal

(AITKEN et al., 1993; SHARMA & AGARWAL, 1996) Os PUFAs são excelentes alvos

para o ataque de metabólitos reativos do oxigênio (ROS) (FERREIRA & MATSUBARA,

1997; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Os ROS são comumente encontrados em

condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, em que o oxigênio molecular

(O2) sofre redução, produzindo moléculas de água. Durante esse processo, são

sintetizados intermediários reativos como: os radicais superóxido (O2-), hidroperoxila

(HO2-) e hidroxila (OH-) e, o não radical, peróxido de hidrogênio (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997; NORDBERG & ARNÉR, 2001), sendo o sistema mitocondrial a

64

principal fonte de ROS intracelular (TURRENS, 2003; GUERRA, et al., 2004), com a

cadeia respiratória, atuando em um processo de auto-oxidação (TURRENS, 2003).

A geração de elevadas concentrações de ROS nos espermatozoides está

associada ao declínio no metabolismo energético, na motilidade e na viabilidade

espermática em equinos (BAUMBER et al., 2002), bovinos (KRZYZOSIAK et al., 2000;

BILODEAU et al., 2002) e humanos (ARMSTRONG et al., 1999; DURU et al., 2000).

Uma alternativa para inibir a formação de ROS é o uso de antioxidantes, que

são substâncias capazes de retardar ou previnir significativamente a oxidação dos

PUFAs, quando presente em concentrações adequadas comparadas aos níveis

produzidos pela célula (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Os danos provocados

pela peroxidação lipídica foram corrigidos pela inclusão na dieta de altos níveis de

anti-oxidantes, tais como a vitamina C e E, em espermatozoides de coelhos

(CASTELLINI et al., 2003). Silva et al. (2012) testaram Trolox, derivado da vitamina E,

em meio diluidor e verificaram que em concentrações de 60 e 120 µM, proporciona

maior integridade de membrana plasmática e alto potencial de membrana mitocondrial

bem como melhores valores para os parâmetros cinéticos de espermatozoides

criopreservados de carneiros. Portanto uma aplicação de sistema anti-oxidante

associado a produção de ROS é sugerida para verificar a identificação dos proporções

de PUFAs e dos parâmetros dos espermatozoides significativos na dieta 9%.

65

4. CONCLUSÃO

Conclui-se que a suplementação da dieta de carneiros com 9% de ácidos

graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio por um período de 90 dias

produz uma mudança no perfil de ácidos graxos dos espermatozoides ovinos

associada significativamente à diminuição das proporções dos ácidos esteárico, oleico,

-linolênico, araquidônico, do somatório de ácidos graxos poli-insaturados e da razão

entre os somatório dos ácidos graxos poli-insaturados e saturados, além de reduzir a

qualidade do sêmen criopreservado associada ao deslocamento lateral da cabeça e a

velocidade curvilinear.

66

5. REFERÊNCIAS

APPOLINÁRIO P. P.; DEROGIS P. B. M. C.; YAMAGUTI T. H.; MIYAMOTO, S. Metabolismo, Oxidação e Implicações Biológicas do Ácido Docosahexaenoico em Doenças Neurodegenerativas. Química Nova, n. 8, p.1409-1416, 2011 ARM & HAMMER. Megalac E. Gordura protegida Ruminal. 2006. CD Rom. ARMSTRONG, J.S.; RAJASEKARAN, M.; CHAMULITRAT, W.; GATTI, P.; HELLSTROM, W.J.; SIKKA, S.C. Characterization of reactive oxygen species induced effects on human spermatozoa movement and energy metabolism. Free Radical Biology & Medicine, v.26, n.7/8, p. 869-880, 1999. AITKEN, R.J.; HARKISS, D. D. Buckingham. Relationship between iron-catalysed lipid peroxidation potential and human sperm function. Journal of Reproduction & Fertility, n.98, p. 257–265, 1993. AZEVEDO, H.C. Integridade e funcionalidade dos espermatozoides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoleico e α- lactoalbumina. Botucatu. Tese – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP. 195p, 2006. BAG, S.; JOSHI, A.; NAQVI, S.M.K.; MITTAL, J.P. Effect of post-thaw incubation on sperm kinematics and acrosomal integrity of ram spermatozoa cryoperserved in medium-sized French straws. Theriogenology, n.62, p. 415-424, 2004. BANDEIRA, A. M. P.; CHAVES, M.S.; MATOS, J.E.; ANDRADE, A.T.; MARIA, A.N.; CARNEIRO, P.C.F.; AZEVEDO, H.C. Gelatin in the cooling medium of ram semen. Reproduction in Domestic Animals, v. 47, p. 429-430, 2012. BAUMBER, J.; VO, A.; SABEUR, K; BALL, B.A. Generation of reactive oxygen species by equine neutrophils and their effect on motility of equine spermatozoa. Theriogenology, v. 57, p.1025-1033, 2002. BILODEAU, J.F.; BLANCHETTE, S.; CORMIER, N.; SIRAD, M-A. Reactive oxygen species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by pyruvate, metal chelators and bovine liver or oviductal fluid catalase. Theriogenology, v.57, p.1105-1122, 2002. BLESBOIS, E.; LESSIRE, M.; GRASSEAU, I.; HALLOUIS, J.M.; HERMIER, D. Effect of dietary fat on the fat acid composition and fertilizing ability of fowl semen. Biology of reproduction, v.56, p.1216-1220, 1997. BLESBOIS, E., DOUARD, V., GERMAIN, M., BONIFACE, P., PELLET, F. Effects of n-3 polyunsaturated dietary supplementation on the reproductive capacity of male turkeys. Theriogenology, v.61, p.537–549, 2004. BRINSKO, S.P.; VARNER, D.D.; LOVE, C.C.; BLANCHARD, T.L.; DAY, B.C.; WILSON, M.E. Effect of feeding a DHA-enriched nutriceutical on the quality of fresh, cooled and frozen stallion semen. Theriogenology, v.63, p.1519–1527, 2005. CARDOSO, P. B. S.; NICHI, M.; ZOGNO, M. A.; FUJIWARA, H.; BARNABE, V. H.; BARNABE, R. C. Comparação da eficácia de dois métodos de extração para

67

determinação do perfil lipídico de ácidos graxos do sêmen ovino por meio da cromatografia líquida de alta eficiência. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.48, n.6, p.486-494, 2011. CASTELLANO, C.A.; AUDET, I.; BAILEY, J.L.; CHOUINARD, P.Y.; LAFOREST, J.P.; MATTE, J.J. Effect of dietary n-3 fatty acids (fish oils) on boar reproduction and semen quality. Journal Animal Science, v.88, p.2346-2355, 2010. CASTELLINI C.; LATTAIOLI P.; DAL BOSCO A.; MINELLI A.; MUGNAI C. Oxidative status and semen characteristics of rabbit buck as affected by dietary vitamin E, C and n-3 fatty acids. Reproduction Nutrition Development, v. 43, p.91–103, 2003. CELEGHINI, E. C. C. Efeitos da criopreservação do sêmen bovino sobre as membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozoides utilizando sondas fluorescentes. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. Pirassununga, p.186, 2005. CERVONI, J.E. Gordura protegida na alimentação de ruminantes. Disponivel em: <http;//www.limousin.com.br>. Acesso em: 02 jan 2013. COSTA, R. L. D. Efeito da Suplementação com gordura protegida no retorno ao estro em ovelhas da raça Santa Inês. Tese (Doutorado em Produção Animal) - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF, Rio de Janeiro, 101p, 2007. CUNNINGHAM, J.G.; KLEIN, B.G. Tratado de fisiologia veterinária. In: Fisiologia reprodutiva do macho. 4.ed. Rio de Janeiro: Editora Elsevier, p.523, 2008. DE GRAAF, S. P.; PEAKE, K.; MAXWELL, W. M. C.; O'BRIEN, J. K. AND EVANS, G. Influence of supplementing diet with oleic and linoleic acid on the freezing success and sex-sorting parameters of ram semen. Livestock Science, v.110, p.166-173, 2007. DEGROOTE, S.; WOLTHOORN, J.; MEER, G. The cell biology of glycosphigolipids. Seminars in Cell & Developmental Biology, n.15, p.375-387, 2004. DI MASCIO, P.; MURPHY, M.E.; SIES, H. Antioxidant defense systems: the role of carotenoids, tocopherols and thiols. The American Journal of Clinical Nutrition, n.53, p.194–200, 1991. DURU, N.K.; MORSHEDI, M.; OEHNINGER, S. Effects of hydrogen peroxide on DNA and plasma membrane integrity of human spermatozoa. Fertility and Sterility, v.74, n.6, p.1200-1207, 2000. FARAJI, Z.; ZAMIRI, M.J.; ROWGHANI, E.; AKHLAGHI, A.; JAFARZADEH, M.R.; BAYAT, A.R.; GHOLAMI, M. Effect of feeding olive-pulp silage on the seminal characteristics and fatty acid profile of the sperm plasma membrane in Iranian fat-tailed sheep. Small Ruminant Research, v.105, p. 216-221, 2012. FENEUX, D.; SERRES, C.; JOUANNET, P. Sliding spermatozoa: a dyskinesia responsible for human infertility? Fertility and Sterility, v. 44, p. 508–511, 1985. FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, v.43, n.1, p.1-16, 1997.

68

FUNSTON, R. N. Fat suplementation and reproduction in beef females. Journal Animal Science, v.82, p.154-161, 2004. GARCIA, I. F. F.; ALMEIDA, A. K.; COSTA, T. I. R.; RIBEIRO, J.S.; SOUZA, F.A. Carcass characteristics and cuts of Santa Inês lambs fed different roughage proportions and fat source. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, p.1322-1327, 2010. GILLAN, L.; EVANS, G.; MAXWELL, M. C. Capacitation status and fertility of fresh and frozen-thawed ram spermatozoa. Reproduction Fertility and Development, v.9, p.481-487, 1997. GILLAN, L.; MAXWELL, W. M. C.; EVANS, G. Preservation and evaluation of semen for artificial insemination. Reproduction Fertility and Development, v. 16, p. 447-454, 2004. GHOLAMI, H.; CHAMANI, M.; TOWHIDI, A.; FAZELI, M.H. Effect of feeding a docosahexaenoic acid-enriched nutriceutical on the quality of fresh and frozen-thawed semen in Holstein bulls. Theriogenology, v.74, p.1548–1558, 2010. GLEW, R. H. Lipid Metabolism II: Pathways of Metabolism of Special Lipids. In: DEVLIN, T. M. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 7.ed. Wiley-Liss, p. 732, 2010. GORDON, I. Laboratory Production of Cattle Embryos. Cambridge: UK University Press, 640p. 1994. GRASA, P.; CEBRIÁN-PÉREZ, J.A.; MUIÑO-BLANCO, T. Signal transduction mechanisms involved in in vitro ram sperm capacitation. Reproduction, n. 132, p. 721–732, 2006. GRUNERT, E.; BIRGEL, E.H.; VALE, W.G.; BIRGEL JÚNIOR, E.H. Patologia e Clínica da Reprodução dos Animais Mamíferos Domésticos – Ginecologia. São Paulo: Varela, 2005. GUERRA, M.M.P; EVANS, G.; MAXWELL, W.M.C. Papel de oxidantes e anti-oxidantes na andrologia [role of oxidants and antioxidants in andrology]. Revista Brasileira de Reprodução Animal, n.28, p.187-95, 2004. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. 3ed., Oxford University Press: New York, p.936, 1999 HATAMOTO, L. K.; SOBRINHO, C. A. B.; NICHI, M.; BARNABE, V. H.; BARNABE, R. C.; CORTADA, C. N. M. Effects of dexamethasone treatment (to mimic stress) and Vitamin E oral supplementation on the spermiogram and seminal plasma spontaneous lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in dogs. Theriogenology, v. 66, n. 6-7, p. 1610-1614, 2006. HARTREE, E. F.; MANN, T. Phospholipids in ram semen: metabolism of plasmalogen and fatty acids. The Biochemical Journal, v. 80, p. 464, 1961. HOLT, W. V.; HEAD, M. F.; NORTH, R. D. Freeze–induced membrane damage in ram spermatozoa is manifested after thawing: observations with experimental cryomicroscopy. Biology of Reproduction, v. 46, p. 1089-1094, 1992.

69

HUWILLER A.; KOLTER T.; PFEILSCHIFER, J.; SANDHOFF, K. Phisiology and pathophysiology of sphingolipid metabolism and signaling. Biochimica et Biophisica Acta, n. 1485, p. 63-99, 2000. JENKINS, T.C. Lipid metabolism en the rumen. Symposium: Advances in ruminant lipid metabolism. Journal of Dairy Science, v.79, p.3851-3863, 1993. JONES, R.; MANN, T.; SHERINS, R.J. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal, properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertility and Sterility, n.31, p. 78–85, 1979. KELSO, K. A.; CEROLINI S.; SPEAKE B. K.; CAVALCHINI L. G.; NOBLE R. C. Effect of dietary supplementation with α-Linolenic acid on the phospholipids fatty acid composition and quality of spermatozoa in cockerel from 24 to 72 week of age. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v. 110, p. 53-59, 1997. KIM, H. Y. Novel Metabolism of Docosahexaenoic Acid in Neural Cells. The Journal of Biological Chemistry, n. 282, p.18661, 2007. KRZYZOSIAK, J. EVENSON, D.; PITT,C.; JOST, L.; MOLAN, P.; VISHWANATH, R. Changes in susceptibility of bovine sperm to in situ DNA denaturation, during prolonged incubation at ambient temperature under conditions of exposure to reactive oxygen species and nuclease inhibitor. Reproduction, Fertility and Development, v.12, p. 251-261, 2000. LEHNINGER, D. N.; COX, M.M. Lipídios. In: LEHNINGER D. N. Princípios de Bioquímica. São Paulo: Sarvier, 5ª. edição, Artmed, p.343-366, 647-665, 805-819, 2011. LI, K.; SHANG, X.; CHEN, Y. High-performance liquid chromatographic detection of lipid peroxidation in human seminal plasma and its aplication to male fertility. Clinica Chimica Acta, v. 346, n. 2, p. 199-203, 2004. MANN, T. Metabolism of semen: fructolysis, respiration, and sperm energetics. In: The Biochemistry of Semen and of the Male Reproductive Tract. John Wiley and Sons Inc., New York, USA, pp. 265–307, 1964. MATOS, J. E. Qualidade seminal de carneiros alimentados com diferentes níveis de energia. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) 48 f., – Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão, 2012. MATTOS, R.; STAPLES, C.R.; THATCHER, W.W. Effects of dietary fatty acids on reproduction in ruminants. Reviews of Reproduction, v.5, p.38-45, 2000. MCCALL, M.R.; FREIZ, B. Can antioxidant vitamins materially reduce oxidative damage in humans? Free Radical Biology & Medicine, n.26, p.1034–1053, 1999. MCCUNE, B.; MEFFORD, M.J. PC-ORD. Multivariate Analysis of Ecological Data. Version 6.04. MjM Software, Gleneden Beach, Oregon, USA, 2011. MIELKE, P.W.; BERRY, K.J. Permutation Methods: a Distance Function Approach. Springer-Verlag, New York, 2000.

70

MITRE, R.; CHEMINADE, C.; ALLAUME, P.; LEGRAND, P.; LEGRAND, A.B. Oral intake of shark liver oil modifies lipid composition and improves motility and velocity of boar sperm. Theriogenology, v.62, p.1557–1566, 2004. MORTIMER, D.; PANDYA, I. J.; SAWERS, R. S. Relationship between human sperm motility characteristics and sperm penetration into human cervical mucus in vitro. Journal of Reproduction and Fertility, v. 78, p. 93–102, 1986. MORTIMER, S. T. A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Human Reproduction. Update, v. 3, n. 5, p. 403-439, 1997. NATIONAL RESEARCH COUNCIL – NRC. Nutrient requeriments of small ruminants, p.362, 2006. NEILL, A. R.; MASTERS, C. J. Metabolism of fatty acids by ovine spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 34, p. 279–287, 1973. NORDBERG, J. & ARNÉR, E.S.J. Reactive oxygen species, antioxidants and the mammalian thioredoxin system. Free Radical Biology & Medicine, v.31, n.11, p.1287-1312, 2001. OLIVEIRA, V. P. Estudo in vitro da capacitação espermática edesenvolvimento de embriões em suínos. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. 60p, 2002. OLLERO, M.; POWERS, R. D.; ALVAREZ, J. G. Variation of decosahexaenoic acid content in subset of human spermatozoa at different stages of maturation: implications for sperm lipoperoxidative damage. Molecular Reproduction and Development, v.55, n.1, p.325-334, 2000. PALMQUIST, D.L. Use of fats in diets for lactating dairy cows. In: J. Wiseman (Ed.) Fats in Animal Nutrition. Butterworth. London, p. 357-381, 1984. PARKS, E. J.; HAMMERSTEDT, H. R. Developmental changes occurring in the lipids of ram epididymal spermatozoa plasma membrane. Biology of Reproduction, v. 32, p.653-668, 1985. PÉREZ, L. J.; VALCÁRCEL, A.; DE LAS HERAS, M. A.; MOSES, D.; BALDASSARRE, H. Evidence that frozen/thawed ram spermatozoa show accelerated capacitation in vitro as assessed by chlortetracycline assay. Theriogenology, v.46, p.131-140, 1996. PERÉZ–PÉ, R.; CEBRIÁN PERÉZ, J. A.; MUIÑO-BLANCO, T. Semen plasma proteins prevent cold-shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology, v. 56, p. 425-434, 2001. PERIS, S. I.; MORRIER, A.; DUFOUR, M.; BAILEY, J. L. Cryopreservation of ram semen facilitates sperm DNA damage: relationship between sperm andrological parameters and the sperm chromatin structure assay. Journal of Andrology, v. 25, n. 2, 2004. PONNAMPALAM, E. N.; SINCLAIR, A. J.; HOSKING, B. J.; EGAN, A. R. Effects of dietary lipid type on muscle fatty acid composition, carcass leanness, and meat toughness lambs. Journal Animal Science, v.80, p.628-636, 2002.

71

POULOS A.; SHARP P.; JOHNSON D.; WHITE I.; FELLENBERG A. The occurrence of polyenoic fatty acids with greater than 22 carbon atoms in mammalian spermatozoa. Biochemical Journal, v. 240, 891–895, 1986. RODENAS, C.E.O.; MURGAS, L.D.S.; MACIEL, M.P. Características seminais de galos alimentados com rações suplementadas com diferentes óleos e níveis de vitamina E. Ciência e Agrotecnologia, v.29, n.1, p.160-167, 2005. ROLDAN, E. R. S.; GOMENDIO, M. Morphological, functional and biochemical changes underlying the preparation and selection of fertilizing spermatozoa in vitro. Animal Reproduction Science, v. 28, p. 69-78, 1992. ROOKE, J.A.; SHAO, C.C.; SPEAKE, B.K. Effects of feeding tuna oil on the lipid composition of pig spermatozoa and in vitro characteristics of semen. Reproduction v.121, p.315–322, 2001. ROTUNNO, T.; SEVI, A.; DI CATERINA, R.; MUSCIO, A. Effects of graded levels of dietary rumen protected fat on milk characteristics of Comisana ewe. Small Ruminants Research, v.30, p. 137-145, 1998. SAMADIAN, F.; TOWHIDI, A.; REZAYAZDI, K.; BAHREINI, M. Effects of dietary n-3 fatty acids on characteristics and lipid composition of ovine sperm. The Animal Consortium, v.4, n. 12, pp 2017–2022, 2010. SANTORO, M.; GUIDO, C.; De AMICIS, F.; SISCI, D.; VIZZA, D.; GERVASI, S.; CARPINO, A.; AQUILA, S. Sperm metabolism in pig: a role for peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ. The Journal of Experimental Biology. n.10, p. 1242, 2012. SANTOS, J.E.P.; BILBY, T.R.; THATCHER, W.W. Long chain fatty acids as factors influencing reproduction cattle. Reproduction in Domestic animals, v.43 (suppl.2), p.23-30, 2008. SANZ SAMPELAYO, M.R.; PÉRAZ, L.; MARTÍN ALONSO, J.J.; AMIGO, L.; BOZA, J. Effects of concentrates with diferent concents of protected fat rich in PUFAs on the performance lactin Granadina goats Part. II Milk production and composition. Small Ruminant Research, v.43, p. 141-148, 2002.

SCOTT, B. L.; BAZAN, N. G. Membrane docosahexaenoate is supplied to the developing brain and retina by the liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. n. 86, p.2903, U.S.A., 1989.

SCOTT, T.W. Lipid metabolism of spermatozoa. Journal Reproduction Fertility. n.18, p.65–76, 1973.

SELAIVE-VILARROEL, A. B. Perdas reprodutivas dos ovinos no Brasil. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.3, p.252-256, 1991.

SELVARAJU, S.; SIVASUBRAMANI, T.; RAGHAVENDRA, B.S.; RAJU, P.; RAO, S.B.N.; DINESHKUMAR, D.; RAVINDRA, J.P. Effect of dietary energy on seminal plasma insulin-like growth factor-I (IGF-I), serum IGF-I and testosterone levels, semen quality and fertility in adult rams. Theriogenology, v.78, p.646-655, 2012.

SHARMA, R. H.; AGARWAL, A. Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology, n.48, p. 835–850, 1996.

72

SILVA, S. V.; SOARES, A. T.; A. M. B; ALMEIDA, F. C.; NUNES, J. F.; PEIXOTO, C. A.; GUERRA, M. M. P. Vitamin E (Trolox) addition to Tris-egg yolk extender preserves ram spermatozoon structure and kinematics after cryopreservation. Animal Reproduction Science, p.1-8, 2012. SOKAL, R.R. Testing statistical significance of geographic variation patterns. Systematic Zoology, n.28, p.627–632, 1979. SOUSA, Daniel Bartoli de. Variabilidade das sub-populações de espermatozoides avaliadas pela cinética em sistema computadorizado e combinação de sondas fluorescentes como parâmetro qualitativo do sêmen congelado de ovinos. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2007. SPEAKE, B.K.; SURAI, P.F.; ROOK, J.A.; DE VRIESE, S.R.; CHRISTOPHE, A.B. Regulation of avian and mammalian sperm production by dietary fatty acids. In: De Vriese SR, Christophe AB (Ed.) Male Fertility ans lipid Metabolism. AOCS Press, Champaign, IL, p. 96-117, 2003. SPRECHER, H.; LUTHRIA, D. L.; MOHAMMED, B. S.; BAYKOUSHEVA, S. P. Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids. The Journal of Lipid Research, n.36, p.2471, 1995.

SULLIVAN, H.M.; BERNARD, J.K.; AMOS, H.E.; JENKINS, T.C. Performance of lactating dairy cows fed whole cottonseed with elevated concentrations of free fatty acids in the oil. Journal of Dairy Science, v.87, p.665-671, 2004.

SURAI P. F.; BLESBOIS E.; GRASSEAU I.; CHALAH T.; BRILLARD J. P.; WISHART G. J.; CEROLINI S.; SPARKS N. H. Fatty acid composition, glutathione peroxidase and superoxide dismutase activity and total antioxidant activity of avian semen. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology 120, 527–533, 1998.

SURAI P. F.; NOBLE R. C.; SPARKS N. H.; SPEAKE B. K. Effect of long-term supplementation with arachidonic or docosahexaenoic acids on sperm production in the broiler chicken. Journal of Reproduction and Fertility 120, 257–264, 2000.

TURRENS, J.F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. The Journal of Physiology, n.552, p.335-44, 2003.

UAUY, R.; CASTILLO, C. Lipid requirements of infants: implications for nutrient composition of fortified complementary foods. Journal of Nutrition, n.133, p.2962, 2003.

VASCONCELOS, J. L. M.; MAXIMO, M.; Gordura protegida. XX Reunião Anual da SBTE. Disponivel [on line]: <http://www.beefpoint.com.br>. Acesso em: 23 set 2010.

VISCONTI, P. E.; GALANTINO-HOMER, H; MOORE, G. D.; BALEY, J. L.; NING, X.; FORNES, M.; KOPF, G. S. The molecular basis of sperm capacitation. Journal of Andrology, v. 19, p. 242-248, 1998.

WATHES, D. C.; ABAYASEKARA D. R. E.; AITKEN R. J. Polyunsaturated fatty acids in male and female reproduction. Biology of Reproduction, v.77, p.190–201, 2007.

WATSON, P. F.; JONES, P. S.; PLUMMER, J. M. A quantitative comparison of the spontaneous and ionophore-induced acrosome reaction in ejaculated ram

73

spermatozoa: the effects of temperature, time and individual. Animal Reproduction Science, v.24, p.93-108, 1991. ZANIBONI, L.,RIZZI, R., CEROLINI, S. Combined effect of DHA anda-tocopherol enrichment on sperm quality and fertility in the turkey. Theriogenology, v.65, p.1813–1827, 2006.

74

ANEXOS

Tabela 6. Composição e análises das dietas (MATOS et al., 2012).

Grupos¹

Composição (%) G0 G3 G6 G9

Feno de tifton 50 50 50 50

Milho triturado 39 35,3 31,7 28,1

Farelo de soja 10,4 11 11,7 12,2

PUFA-Ca² - 2,9 5,9 8,9

Fosfato bicálcico 0,5 0,6 0,6 0,6

Cloreto de sódio 0,1 0,2 0,2 0,2

Análise

MS3 (%) 90,27 91,41 91,41 91,51

Proteína bruta (PB) (%) 13,82 13,20 12,59 12,49

Extrato etéreo (EE) (%) 3,3 6,3 8,7 11,8

Energia Metabolizável (Mcal/Kg)4 2,47 2,63 2,77 2,94

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. ² Ácidos graxos poli-insaturados complexados com sais de cálcio. ³ Matéria seca. 4Mcal: megacalorias

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Tabela 7. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico dos ácidos graxos dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos diferentes grupos experimentais dentro de cada período.

Ácidos graxos Grupo¹

Períodos²

P0 P30 P60 P90 Média

C14:0

G0 30,35 5,62 31,11 3,31 28,99 5,48 30,53 5,64*** 30,25 0,90

G3 28,61 7,26 25,95 5,52 28,41 4,52 29,86 4,88 28,21 1,64

G6 26,32 9,00 31,76 2,26 29,11 3,59 31,33 5,06 29,63 2,50

G9 29,41 4,68 33,96 2,12 30,52 1,48 32,87 1,29*** 31,69 2,09

Média 28,67 1,72 30,70 3,39 29,26 0,89 31,14 1,30

C18:0

G0 29,79 2,68 0,22 0,25 29,49 5,43 29,69 4,00** 22,30 14,72

G3 30,22 2,60 0,19 0,14 28,49 1,37 29,09 1,94 22,00 14,55

G6 30,75 1,76 0,16 0,14 27,93 2,06 28,45 1,57 21,82 14,49

G9 29,24 2,88 0,18 0,14 26,67 1,85 27,53 0,71** 20,91 13,86

Média 30,00 0,64 0,19 0,02 28,15 1,18 28,69 0,92

C16:1(n-7)

G0 1,23 0,31 28,84 1,97 3,21 5,02 1,45 0,69 8,68 13,47

G3 1,12 0,50 31,07 2,45 3,43 5,62 1,33 0,43 9,24 14,59

G6 1,86 0,83 28,14 1,92 1,43 1,10 1,01 0,73 8,11 13,36

G9 1,19 0,27 28,19 0,77 3,37 4,29 0,64 0,29 8,35 13,28

Média 1,35 0,34 29,06 1,38 2,86 0,96 1,11 0,36

C18:1(n-9)

G0 12,64 1,83 13,36 0,93 10,73 5,20 11,06 2,83** 11,95 1,26

G3 12,48 1,80 14,25 1,09 11,71 1,16 9,88 1,65 12,08 1,81

G6 13,43 2,03 12,51 1,46 11,14 1,16 8,98 2,30 11,52 1,94

G9 12,54 2,17 12,40 0,87 9,92 1,00 9,11 1,19** 10,99 1,74

Média 12,77 0,44 13,13 0,86 10,88 0,75 9,76 0,96

C18:2(n-6)

G0 7,12 1,03 7,38 1,46 8,14 1,49 8,78 1,47 7,86 0,75

G3 7,09 1,36 8,29 1,72 9,74 1,03 10,42 1,74 8,89 1,49

G6 7,83 1,62 7,47 1,10 10,60 1,29 10,63 1,38 9,13 1,72

G9 7,02 1,00 6,81 0,72 9,80 0,56 10,20 0,46 8,46 1,79

Média 7,26 0,38 7,49 0,61 9,57 1,03 10,01 0,84

C18:3(n-3)

G0 0,64 0,29 0,41 0,12 0,03 0,07 0,38 0,04 0,36 0,25

G3 0,74 0,23 0,30 0,10 0,03 0,07 0,26 0,04 0,33 0,30

G6 1,02 0,59 0,34 0,10 0,04 0,07 0,26 0,04 0,41 0,42

G9 0,82 0,28 0,27 0,04 0,02 0,03 0,26 0,03 0,34 0,34

Média 0,80 0,16 0,33 0,06 0,03 0,01 0,29 0,06

C18:3(n-6)

G0 0,32 0,23 0,44 0,17 0,33 0,23 0,68 0,26** 0,44 0,17

G3 0,49 0,33 0,44 0,17 0,22 0,02 0,68 0,15 0,46 0,19

G6 0,44 0,28 0,37 0,13 0,39 0,24 0,60 0,12 0,45 0,10

G9 0,51 0,12 0,50 0,19 0,35 0,25 0,58 0,11** 0,49 0,10

Média 0,44 0,09 0,44 0,05 0,32 0,07 0,63 0,05

C20:1(n-9)

G0 0,68 0,19 0,14 0,33 0,57 0,18 0,80 0,17 0,55 0,28

G3 0,58 0,19 0,17 0,40 1,14 0,13 1,44 0,12 0,83 0,57

G6 0,53 0,18 0,01 0,00 1,37 0,36 2,02 0,35 0,98 0,89

G9 0,49 0,09 0,21 0,48 1,92 0,42 2,35 0,55 1,24 1,05

Média 0,57 0,08 0,13 0,09 1,25 0,56 1,65 0,68

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. ² P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. C14:0 - ácido mirístico, C18:0 - ácido esteárico, C16:1n7 - ácido palmitoleico,

C18:1n9 - ácido oleico, C18:2n6 - ácido linoleico, C18:3n3 - ácido -linolênico, C18:3n6 - ácido -linolênico, C20:1n9 - ácido eicosenóico. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

76

Tabela 8. Médias desvio-padrão dos ácidos graxos que compõem o perfil lipídico dos ácidos graxos dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos diferentes grupos experimentais dentro de cada período.

Ácidos graxos Grupo¹

Períodos²


C20:4(n-6)

G0 13,85 1,35 14,58 2,50 16,47 2,44 12,96 6,51*** 14,46 1,49

G3 15,79 3,10 15,84 1,03 15,50 1,18 16,54 1,35 15,92 0,44

G6 14,26 1,29 14,46 2,60 15,36 1,49 15,92 1,24 15,00 0,78

G9 14,14 1,99 14,40 1,75 14,91 0,75 15,58 0,99*** 14,76 0,63

Média 14,51 0,87 14,82 0,68 15,56 0,66 15,25 1,58

C22:4(n-6)

G0 3,25 7,12 3,49 3,71 2,03 1,43 3,33 7,74*** 3,03 0,67

G3 1,57 2,82 3,50 4,31 1,32 1,25 0,16 0,08 1,64 1,38

G6 2,29 4,83 4,77 4,33 2,62 1,49 0,12 0,09 2,45 1,90

G9 3,15 6,61 3,06 3,58 2,52 1,19 0,17 0,07*** 2,22 1,40

Média 2,57 0,79 3,70 0,74 2,12 0,60 0,95 1,59

C22:6(n-3)

G0 0,14 0,05 0,01 0,01 0,00 0,00 0,36 0,18 0,13 0,17

G3 1,31 2,68 0,01 0,00 0,00 0,00 0,33 0,33 0,41 0,62

G6 1,27 2,45 0,01 0,00 0,00 0,00 0,70 0,17 0,49 0,61

G9 1,48 2,91 0,01 0,01 0,00 0,00 0,71 0,16 0,55 0,70

Média 1,05 0,61 0,01 0,00 0,00 0,00 0,52 0,20

SFA

G0 60,14 6,69 59,96 1,81 58,48 5,92 60,21 7,73*** 59,70 0,82 G3 58,83 7,15 57,02 3,99 56,90 5,14 58,94 3,26 57,92 1,11 G6 57,07 7,91 59,90 1,52 57,04 2,65 59,77 3,87 58,45 1,61 G9 58,64 5,32 62,16 1,76 57,19 2,84 60,40 1,03*** 59,60 2,15 Média 58,67 1,26 59,76 2,11 57,40 0,73 59,83 0,65

PUFA

G0 25,31 6,18 26,32 2,20 27,01 3,66 45,94 19,48*** 119,48***

31,15 9,89

G3 27,00 6,25 28,37 3,48 26,81 1,10 48,52 7,83 32,68 10,59

G6 27,11 6,25 27,41 1,91 29,01 1,88 47,56 6,61 32,77 9,89

G9 27,13 5,48 25,05 1,76 27,60 1,76 45,56 2,58*** 31,33 9,55

Média 26,64 0,89 26,79 1,43 27,61 0,99 46,90 1,39

PUFA/SFA

G0 43,62 17,16 44,02 5,06 46,53 8,05 26,48 8,76*** 40,16 9,21

G3 47,51 16,92 50,27 9,25 47,47 4,86 28,40 3,01 43,41 10,10

G6 49,58 18,35 45,83 4,04 51,05 5,25 28,23 2,17 43,67 10,53

G9 47,24 13,75 40,39 3,84 48,37 4,10 27,50 1,15*** 40,87 9,59

Média 46,99 2,47 45,13 4,11 48,35 1,95 27,65 0,87

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. ² P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. C20:4n6 - ácido araquidônico, C22:4n6 - ácido docosatetraenoico ,

C22:6n3 - ácido docosahexaenoico, SFA: somatório de ácidos graxos saturados, PUFA: somatório dos ácidos graxos poli-

insaturados, PUFA/SFA: relação entre os somatórios de poli-insaturados e saturados. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

77

Tabela 9. Médias desvio-padrão dos parâmetros cinéticos dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos diferentes grupos experimentais dentro de cada período.

Parâmetros Grupo¹ Períodos²


MP(%)

G0 32,89 7,85 28,25 12,88 27,39 10,16 40,51 6,07 32,26 6,01

G3 42,23 10,40 35,04 7,23 33,99 14,18 40,46 9,00 37,93 4,03

G6 32,03 5,62 36,98 6,08 30,22 14,78 43,18 5,67 35,60 5,80

G9 37,30 10,25 34,61 8,53 39,55 9,43 44,07 6,08 38,88 4,01

Média 36,11 4,68 33,72 3,79 32,79 5,26 42,06 1,85

RAP(%)

G0 35,90 9,11 29,28 15,04 29,86 13,38 41,99 6,63 34,26 5,96

G3 43,67 9,48 38,36 8,30 35,42 16,30 42,07 11,99 39,88 3,71

G6 32,97 5,83 39,89 8,56 31,00 16,88 46,83 6,91 37,67 7,19

G9 36,25 12,23 34,83 8,13 41,11 8,40 47,83 10,23 40,01 5,87

Média 37,20 4,56 35,59 4,71 34,35 5,11 44,68 3,08

VCL(µm/s)

G0 175,05 14,43 158,09 31,03 159,13 33,54 187,16 16,31* 169,86 13,90

G3 185,68 17,26 173,88 17,08 169,57 35,14 178,64 21,96 176,94 6,90

G6 168,93 8,93 178,90 8,40 153,51 35,49 187,57 11,36 172,23 14,62

G9 172,55 22,54 167,21 15,99 177,10 17,53 186,99 18,28* 175,96 8,39

Média 175,55 7,21 169,52 9,00 164,83 10,55 185,09 4,31

VSL(µm/s)

G0 83,40 10,10 73,95 16,92 72,95 14,19 91,40 9,97 80,43 8,70

G3 94,73 16,71 83,50 11,01 84,80 21,42 91,36 12,21 88,59 5,34

G6 80,86 4,70 88,87 5,91 74,37 19,65 94,89 5,53 84,75 8,99

G9 88,97 12,36 84,82 11,26 89,84 14,16 94,98 9,92 89,65 4,17

Média 86,99 6,17 82,78 6,31 80,49 8,17 93,16 2,05

VAP(µm/s)

G0 106,98 9,17 95,45 19,44 94,93 18,45 115,30 9,46 103,17 9,82

G3 118,18 17,78 106,54 12,31 106,31 23,72 113,20 14,30 111,06 5,72

G6 102,83 5,67 111,20 7,47 94,13 24,39 117,52 7,57 106,42 10,16

G9 110,36 14,60 106,19 11,01 112,01 13,78 118,80 12,58 111,84 5,25

Média 109,59 6,50 104,85 6,67 101,85 8,77 116,20 2,47

ALH(µm)

G0 2,87 0,32 2,95 0,21 2,94 0,36 2,97 0,23* 2,94 0,04

G3 2,86 0,21 2,93 0,18 2,87 0,20 2,84 0,22 2,88 0,04

G6 2,92 0,12 2,96 0,09 2,90 0,14 2,95 0,10 2,93 0,03

G9 2,80 0,19 2,84 0,12 2,92 0,14 2,89 0,08* 2,86 0,05

Média 2,86 0,05 2,92 0,05 2,91 0,03 2,92 0,06

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. ² P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. MP - motilidade progressiva, RAP – espermatozoides rápidos, VCL - velocidade curvilinear, VSL - velocidade em linha reta, VAP - velocidade média do percurso, ALH - deslocamento lateral da cabeça. * p<0,05.

78

Tabela 10. Médias desvio-padrão dos parâmetros cinéticos, viabilidade, capacitação e reação acrossomal dos espermatozoides criopreservados de carneiros nos diferentes grupos experimentais dentro de cada período.

Parâmetros Grupo¹ Períodos²


BCF(Hz)

G0 48,06 2,66 48,23 1,63 47,27 2,57 49,95 1,95 48,38 1,13

G3 50,47 1,08 48,81 1,96 49,01 3,91 50,61 1,21 49,72 0,95

G6 49,44 1,23 50,57 1,78 48,16 0,74 51,54 1,67 49,93 1,46

G9 50,90 1,76 49,40 3,18 49,92 2,64 50,65 1,71 50,21 0,69

Média 49,72 1,27 49,25 1,00 48,59 1,13 50,69 0,65

LIN(%)

G0 47,35 4,37 46,44 2,90 46,00 2,41 48,84 3,07 47,16 1,25

G3 50,71 4,42 47,95 4,32 49,53 4,11 51,12 2,98 49,83 1,42

G6 47,90 1,44 49,61 1,39 47,95 2,78 50,63 0,97 49,02 1,33

G9 51,56 2,32 50,58 3,54 50,48 3,28 50,78 1,19 50,85 0,49

Média 49,38 2,07 48,65 1,83 48,49 1,96 50,34 1,02

STR(%)

G0 77,63 5,30 77,06 3,11 76,82 1,77 79,12 2,58 77,66 1,03

G3 79,85 2,03 78,19 2,76 79,20 3,84 80,62 2,26 79,47 1,03

G6 78,61 0,94 79,91 1,66 78,79 1,06 80,77 1,01 79,52 1,01

G9 80,58 1,47 79,68 4,46 79,90 3,16 79,93 0,98 80,02 0,39

Média 79,17 1,31 78,71 1,34 78,68 1,32 80,11 0,76

Viab.(%)

G0 2,69 1,67 1,67 2,04 3,27 2,55 4,92 2,43 3,14 1,36

G3 2,73 2,13 4,64 3,08 4,92 2,86 6,56 4,73 4,71 1,57

G6 2,89 1,89 2,87 1,21 3,81 3,05 6,94 3,29 4,13 1,93

G9 2,64 1,43 2,89 0,85 3,92 1,81 5,63 1,73 3,77 1,36

Média 2,74 0,11 3,02 1,22 3,98 0,69 6,01 0,91

F(%)

G0 2,53 2,05 1,25 1,29 0,50 0,69 1,58 0,83 1,47 0,84

G3 2,53 1,94 1,83 2,34 1,67 1,26 2,25 1,56 2,07 0,39

G6 3,28 1,90 2,30 1,10 1,39 0,39 3,08 2,68 2,51 0,86

G9 2,42 1,60 1,50 1,18 1,22 0,59 2,33 1,43 1,87 0,60

Média 2,69 0,40 1,72 0,45 1,19 0,50 2,31 0,61

¹ G0 = sem adição de PUFA-Ca; G3 = 3% de PUFA-Ca; G6 = 6% de PUFA-Ca; G9 = 9% de PUFA-Ca. ² P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. BCF - frequência de batimento flagelar cruzado, LIN – linearidade, STR – retilinearidade, VIAB – espermatozoides com membrana plasmática e acrossomal íntegras e com potencial de membrana mitocondrial, F – uniforme distribuição da fluorescência verde por toda a cabeça com presença ou não de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial e ausência de fluorescência vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra, não capacitados e com acrossomo intacto.

79

Tabela 11. Coeficientes de correlação dos ácidos graxos (AG) entre o perfil de AG dos grupos experimentais representados pelas médias das amostras ao longo dos eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS) dentro de cada período experimental.

1 P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. C14:0 - ácido mirístico,

C18:0 - ácido esteárico, C16:1n7 - ácido palmitoleico, C18:1n9 - ácido oleico, C18:2n6 - ácido linoleico, C18:3n3 - ácido

-linolênico, C18:3n6 - ácido -linolênico, C20:1n9 - ácido eicosenoico, C20:4n6 - ácido araquidônico, C22:4n6 - ácido

docosatetraenoico , C22:6n3 - ácido docosahexaenoico, SFA: somatório de ácidos graxos saturados, PUFA:

somatório dos ácidos graxos poli-insaturados, PUFA/SFA: relação entre os somatórios de poli-insaturados e saturados. NS: não significativo (p>0,05). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Ácidos graxos

Coeficientes de correlação dos períodos1

P0 P30 P60 P90

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

C14:0 0,461* 0,875*** 0,831*** -0,532** -0,057 NS

0,981*** 0,260 NS

-0,860***

C18:0 -0,869*** 0,201 NS

-0,105 NS

-0,386 NS

0,866*** -0,226 NS

-0,540** -0,164 NS

C16:1(n-7) -0,496* -0,359 NS

-0,934*** 0,127 NS

-0,776*** -0,308 NS

-0,227 NS

0,168 NS

C18:1(n-9) -0,688*** -0,376 NS

-0,797*** 0,009 NS

-0,101 NS

-0,382 NS

-0,588** -0,011 NS

C18:2(n-6) -0,728*** -0,338 NS

-0,798*** 0,058 NS

0,073 NS

-0,439* -0,370 NS

0,076 NS

C18:3(n-3) -0,110 NS

-0,175 NS

0,008 NS

-0,004 NS

-0,334 NS

0,328 NS

0,162 NS

0,069 NS

C18:3(n-6) -0,241 NS

-0,426* -0,325 NS

-0,604** 0,047 NS

0,154 NS

-0,550** -0,107 NS

C20:1(n-9) 0,053 NS

0,091 NS

-0,102 NS

0,410 NS

-0,315 NS

0,186 NS

-0,059 NS

-0,071 NS

C20:4(n-6) -0,326 NS

-0,109 NS

-0,702*** -0,571** 0,775*** -0,405 NS

-0,369 NS

0,788***

C22:4(n-6) 0,697*** -0,679*** 0,478* 0,859*** 0,022 NS

0,189 NS

0,889*** 0,325 NS

C22:6(n-3) -0,649*** -0,389 NS

0,114 NS

0,000 NS

-0,238 NS

-0,359 NS

0,021 NS

0,097 NS

SFA 0,143 NS

0,963 NS

0,591** -0,713*** 0,577** 0,754*** -0,031 NS

-0,950***

PUFA 0,114 NS

-0,935*** -0,276 NS

0,788*** 0,584** -0,408 NS

0,334 NS

0,913***

PUFA/SFA 0,024 NS

-0,950*** -0,409 NS

0,778*** 0,074 NS

-0,792*** 0,342 NS

0,909***

80

Tabela 12. Coeficientes de correlação dos parâmetros dos espermatozoides criopreservados de carneiros representados pelas médias das amostras ao longo eixos 1 e 2 através da Escala Multidimensional Não-Métrica (NMS) dentro de cada período experimental.

1 P0, P30, P60 e P90 = dia zero, 30, 60 e 90 dias da administração da dieta, respectivamente. MP - motilidade

progressiva, RAP – espermatozoides rápidos, VCL - velocidade curvilinear, VSL - velocidade em linha reta, VAP - velocidade média do percurso, ALH - deslocamento lateral da cabeça, BCF - frequência de batimento flagelar cruzado, LIN – linearidade, STR – retilinearidade, VIAB – espermatozoides com membrana plasmática e acrossomal íntegras e com potencial de membrana mitocondrial, F – uniforme distribuição da fluorescência verde por toda a cabeça com presença ou não de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial e ausência de fluorescência vermelha na cabeça - espermatozoides com membrana plasmática íntegra, não capacitados e com acrossomo intacto. * p<0,05.

Parâmetros

Coeficientes de correlação dos períodos1

P0 P30 P60 P90

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

NMS Eixo 1

NMS Eixo 2

MP 0,308 NS

0,119 NS

-0,064 NS

0,032 NS

-0,041 NS

-0,016 NS

-0,209 NS

0,148 NS

RAP 0,534** 0,032 NS

-0,174 NS

-0,049 NS

0,136 NS

-0,013 NS

-0,282 NS

0,200 NS

VCL 0,512* -0,044 NS

-0,194 NS

-0,044 NS

0,155 NS

-0,015 NS

-0,410* 0,134 NS

VSL 0,368 NS

-0,031 NS

-0,134 NS

0,000 NS

0,010 NS

-0,056 NS

-0,323 NS

0,040 NS

VAP 0,413* -0,056 NS

-0,184 NS

-0,057 NS

0,074 NS

-0,026 NS

-0,331 NS

0,076 NS

ALH 0,209 NS

-0,273 NS

-0,188 NS

-0,112 NS

0,472* -0,148 NS

-0,468* 0,193 NS

BCF 0,318 NS

-0,458* 0,002 NS

0,169 NS

-0,108 NS

-0,226 NS

-0,172 NS

0,161 NS

LIN 0,046 NS

-0,030 NS

0,017 NS

0,072 NS

-0,337 NS

-0,135 NS

0,087 NS

-0,176 NS

STR 0,079 NS

0,028 NS

0,081 NS

0,184 NS

-0,329 NS

-0,235 NS

-0,078 NS

-0,139 NS

VIAB 0,385 NS

-0,151 NS

-0,256 NS

-0,136 NS

0,289 NS

-0,199 NS

-0,054 NS

0,273 NS

F 0,667*** -0,365 NS

-0,059 NS

-0,034 NS

0,253 NS

0,105 NS

-0,259 NS

-0,051 NS

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