0

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA

SAÚDE

THARCIANO LUIZ TEIXEIRA BRAGA DA SILVA

EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DA L-ARGININA, DO EXERCÍCIO RESISTIDO E DA L-ARGININA ASSOCIADA

AO EXERCÍCIO RESISTIDO SOBRE A REATIVIDADE VASCULAR DA ARTÉRIA MESENTÉRICA DE RATOS

DIABÉTICOS

ARACAJU

2011

1

THARCIANO LUIZ TEIXEIRA BRAGA DA SILVA

EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DA L-ARGININA, DO EXERCÍCIO RESISTIDO E DA L-ARGININA

ASSOCIADA AO EXERCÍCIO RESISTIDO SOBRE A REATIVIDADE VASCULAR DA ARTÉRIA MESENTÉRICA DE RATOS DIABÉTICOS

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto V. Santos

ARACAJU

2011

2

THARCIANO LUIZ TEIXEIRA BRAGA DA SILVA

EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DA L-ARGININA, DO EXERCÍCIO RESISTIDO E DA L-ARGININA

ASSOCIADA AO EXERCÍCIO RESISTIDO SOBRE A REATIVIDADE VASCULAR DA ARTÉRIA MESENTÉRICA DE RATOS DIABÉTICOS

Aprovada em ____/___/____

__________________________________________________________

Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos Universidade Federal de Sergipe – Orientador

__________________________________________________________

1º Examinador: Profª. Dr. Anderson Carlos Marçal Universidade Federal de Sergipe – DMO/UFS

__________________________________________________________

2º Examinador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior Universidade Federal de Sergipe – DFS/UFS

PARECER

____________________________________________________________________

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____________________________________________________________________

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

3

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S586e

Silva, Tharciano Luiz Teixeira Braga da Efeitos da administração da L-arginina, do exercício resistido e

da L-arginina associada ao exercício resistido sobre a reatividade vascular da artéria mesentérica de ratos diabéticos / Tharciano Luiz Teixeira Braga da Silva. – Aracaju, 2011.

85 f.

Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina.

Orientador(a): Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos.

1. Diabetes mellitus 2. L-arginina 3. Exercícios físicos 4.

Reatividade vascular I. Título.

CDU 613.72:616.379-008.64

4

Dedico este trabalho a todas as pessoas que valorizam o

próximo pelo seu potencial como ser humano e que

acreditam no amor e na perseverança como ferramentas

de trabalho e riqueza.

5

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo incrível dom da vida, a imensa vontade de amar e pela minha

alma feliz e inconquistável;

Às minhas mães Lorena, Walquíria (vovó) e Laís (vovó) e aos meus pais

João Luiz, Raimundinho (vovô) e Geraldo (vovô, in memorian). Obrigado

pelo amor incondicional, por todo suporte emocional, espiritual, financeiro

e, por fim, todo esforço para que eu me tornasse um PhD da vida;

Aos meus tios Pami, Beto e Jader e as minhas tias Ló, Mônica, Roseana,

Rosângela e Laissandra sem palavras para caracterizar o quanto vocês são

importantes para a minha vida. Aos primos Viví, Diego, Daví e jefinho

vocês não sabem o quanto contribuíram para realização deste sonho;

Aos meus irmãos Thales, Thaian, Maria Laís e, principalmente, ao meu

irmão Tharcísio (o verdadeiro Tatá), por ser companheiro, fiel, feliz,

compreensivo, amoroso, um grande exemplo de determinação e de

espiritualidade;

À minha amada namorada Renatinha (Tita), que sempre demonstrou ser

uma grande mulher em todos os momentos de confusão, sendo minha

bússola na incrível jornada do conhecimento. Você faz parte de mais uma

conquista!;

Aos meus sogros Durval e Dona Emília por sempre acreditarem em mim e

terem me dado mais uma família linda... Rodrigo, Tati, Lelinha, Lina,

Doug, Mí, Tia Lena...;

Aos meus irmãos da vida, Anderson (Laurinha), Arthur, Celsinho, Digão,

Luiz (Zéla), Rodolfo e Juquinha. De forma especial, ao meu amigo-irmão

Marcelinho, por sempre ser meu exemplo de seriedade, sobriedade,

imparcialidade, orientador e por ter me dado a minha afilhada Moana, meu

sobrinho Mauê, minha amiga “mais” linda (Dani), Dona Zú e Seu Rusinho;

6

Aos amigos, Arari, James, Luizota, Danilão, Beto, Nogueira, Raul

Meneleu, Marcelo Cobra, Paulinho, Hélio, Nay, Larissa, Luciano, Alan,

Sebá, Miriam Rosângela, Luís, Dudu, Alex, Isa, Câmara, Aida... Sintam-se

todos abraçados;

Aos amigos do laboratório que contribuíram com o desenvolvimento dessa

pesquisa, Paulinha Sans (PIBIC), Daniel, Barbosa, Luana, Paty (força

pequena!), Flavinha, Kátia, Polly, André, Vitinho, Brício, Carol, Ayslan e

Gabriela. Em especial, à Milene (Mí) pelo empenho, dedicação,

preocupação e por ter me ensinado muito enquanto fui seu “PIBIC”;

Aos amigos que fiz no mestrado, Cliomar (Dani), Diego, Alípio, Mirabor,

Aída, Luana, Polly, Paulo Márcio (Paulinho). Fica a certeza de um vínculo

científico, profissional e de amizade ao longo de nossas vidas;

Aos professores (pesquisadores) que despertaram o meu olhar científico,

Eduardo Seixas, Cameron, Coriolano, Francisco Igor, Chrystiane

Vasconcelos, Daniel Badauê, Léo (obrigado pela oportunidade!), Lucindo,

Walter, Anderson (valeu!), Cabral, Augusto Barreto, Enilton, Rodrigo Dias

(professor amigo!);

Ao meu professor e orientador Márcio Roberto Viana Santos, exemplo de

ética, professor, cientista, simplicidade, humildade, pai, marido, funcionário

público e cidadão. Sua história acadêmica é inspiradora, me motiva a

continuar e saber que posso ser muito feliz na carreira que escolhi.

Obrigado pela confiança e ensinamentos!;

Aos meus alunos... Gilson, Genival, Fernanda, Henrique, Carla e Carlão.

Gostaria de agradecer em especial a minha aluna mais dedicada e que

nunca deixou de acreditar na minha capacidade. Valeu Kaká!!;

Por fim, agradeço a pessoa que apesar de todas as adversidades nunca

desistiu, foi sempre perseverante, não perdeu a fé em Deus e sempre fez

com muito amor as suas obrigações. Obrigado ao meu corpo, a minha alma

e a minha mente pelo esforço de me manter firme nos meus objetivos!

7

SILVA T.L.T.B. EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO DA L-ARGININA, DO EXERCÍCIO RESISTIDO E DA L-ARGININA ASSOCIADA AO EXERCÍCIO RESISTIDO SOBRE A REATIVIDADE VASCULAR DA ARTÉRIA MESENTÉRICA DE RATOS DIABÉTICOS. 2011. 85p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju.

RESUMO

O diabetes mellitus (DM) pode ser definido como um grupo heterogêneo de

distúrbios metabólicos caracterizados pela hiperglicemia, resultando em disfunção, e

última instância, insuficiência de vários órgãos, especialmente dos olhos, rins, nervos

e sistema vascular. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da L-

arginina (L-Arg), do exercício resistido (ER) e da associação entre L-Arg e o ER

sobre as alterações dos fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs) em anéis

isolados da artéria mesentérica superior de ratos diabéticos induzidos por aloxano.

Ratos Wistar (250-300g) foram divididos em 7 grupos: Controle (CON, n = 4),

Estimulado Eletricamente (EE, n = 4), Controle Treinado (CT, n = 4), Diabético

Sedentário (DS, n = 5), Diabético L-arginina (DL-Arg, n = 5), Diabético Treinado

(DT, n = 5) e grupo Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg, n = 5). Os

animais dos grupos diabéticos receberam aloxano 2 semanas antes do início dos

protocolos de tratamento. O protocolo de ER consistiu em 3 séries de 10

agachamentos (no aparelho de Tamaki) com uma intensidade de 50% de uma

repetição máxima (1RM). Os animais tratados com L-Arg receberam 1,25 mg/ml

diariamente na água de beber. No final de 8 semanas, o vasorrelaxamento

dependente de endotélio foi obtido em anéis pré-contraídos com L-fenilefrina (FEN,

10 µM) pela adição à cuba de concentrações crescentes e cumulativas de acetilcolina

(ACh, 10-9 – 10-4 M). Após isto, curvas concentração-respostas foram construídas na

condição controle ou na presença dos inibidores da síntese do óxido nítrico (L-

NAME), da ciclo-oxigenase (INDO) e dos canais para potássio (TEA). Os

vasorrelaxamentos induzidos por ACh apresentaram uma redução significativa (p <

0,05) na resposta máxima (Rmax) do DS comparado com o CON. Além disso, foi

observado uma redução significativa (p < 0,001) da sensibilidade (pD2) (de 6,8 ±

0,12 para 6,2 ± 0,11) do DL-Arg quando comparado com o DS. Na presença do L-

NAME o DL-Arg apresentou uma redução (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos

8

quando comparado com o DS. Após adição de L-NAME + INDO, o DT + L-Arg

apresentou uma redução significativa (p < 0,001) nos vasorrelaxamentos quando

comparado com o DS. Já na presença de L-NAME + INDO + TEA, o DT e DT + L-

Arg apresentaram uma redução significativa (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos

quando comparados com o DS. Os resultados demonstram que apesar de não haver

melhora nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh, foi observado uma modificação

na participação dos EDRFs em todos os grupos.

Palavras-Chave: Diabetes mellitus; L-arginina; exercício resistido; reatividade

vascular.

9

SILVA T.L.T.B. EFFECTS OF ADMINISTRATION OF L-ARGININE, RESISTANCE EXERCISE AND L-ARGININE COMBINED WITH RESISTANCE EXERCISE ON THE VASCULAR REACTIVITY OF MESENTERIC ARTERY OF DIABETIC RATS. 2011. 85p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju.

ABSTRACT

Diabetes mellitus (DM) can be defined as a heterogeneous group of metabolic

disorders characterized by hyperglycemia, resulting in dysfunction, ultimately,

failure of various organs, especially the eyes, kidneys, nerves and vascular system.

This study aimed to evaluate the effects of L-arginine (L-Arg), resistance exercise

(RE) and the association between them on changes of endothelium-derived relaxing

factor (EDRF) in isolated rings of superior mesenteric artery of diabetic rats induced

by alloxan. Wistar rats (250-300g) were divided into 7 groups: Control (CON, n = 4),

Electrically Stimulated (ES, n = 4), Trained Control (TC, n = 4), Sedentary Diabetic

(SD, n = 5), L-arginine Diabetic (L-Arg + D, n = 5), Trained Diabetic (TD, n = 5)

and L-arginine + Trained Diabetic (L-Arg + TD, n = 5). The animals diabetic groups

received alloxan 2 weeks before the start of treatment protocols. The RE protocol

consisted of 3 sets of 10 squats (Tamaki apparatus) with an intensity of 50% of one

repetition maximum (1RM). Animals treated with L-Arg received 1.25 mg/ml daily

in drinking water. At the end of 8 weeks, vessel relaxation endothelium-dependent

was obtained in rings pre-contracted with L-phenylephrine (Phe, 10 mM) by addition

of increasing concentrations and cumulative acetylcholine (ACh, 10-9 – 10-4 M).

After this, concentration-response curves were constructed in control conditions or in

the presence of inhibitors of nitric oxide sintetase (L-NAME), cyclo-oxygenase

(INDO) and potassium channels blockers (TEA). The vessel relaxation induced by

10

ACh showed a significant reduction (p < 0.05) in the maximum response (Rmax) of

SD compared with CON. Furthermore, we observed a significant reduction (p <

0.001) in sensitivity (pD2) (6.8 ± 0.12 to 6.2 ± 0.11) of L-Arg + D compared with the

SD. In the presence of L-NAME the L-Arg + D showed a reduction (p < 0.001) of

vessel relaxation compared to the SD. After addition of L-NAME + INDO, the L-

Arg + TD showed a significant reduction (p < 0.001) in vessel relaxation compared

with the SD. The presence of L-NAME + INDO + TEA, the TD and L-Arg + TD

showed a significant reduction (p <0.001) of vessel relaxation compared with the SD.

The results show that although there was no improvement in vessel relaxation

induced by ACh, we observed a change in the participation of EDRF in all groups.

Keywords: Diabetes mellitus; L-arginine; resistance training; vascular reactivity.

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Principais vias endoteliais envolvidas na vasodilatação............................24

Figura 2: Estrutura química da L-Arg.......................................................................30

Figura 3: Produtos formados a partir do metabolismo da L-Arg..............................31

Figura 4: Produção do NO via L-Arg........................................................................32

Figura 5: Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em

anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-

contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e

Controle Treinado (CT)..............................................................................................55

Figura 6: Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em

anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-

contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e

Diabético Sedentário (DS)..........................................................................................55

Figura 7: Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em

anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-

contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Diabético

Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e

Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg).........................................................56

Figura 8: Efeitos do L-NAME sobre as curvas concentração-resposta para

acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior

com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético

Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e

Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg).........................................................57

12

Figura 9: Efeitos do L-NAME + INDO sobre as curvas concentração-resposta para

acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior

com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético

Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e

Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg).........................................................58

Figura 10: Efeitos do L-NAME + INDO + TEA sobre as curvas concentração-

resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados da artéria

mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM)

dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético

Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg)..............................59

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Variação do peso corporal, glicemia e do teste de 1 RM dos ratos no início

e ao final de 8 semanas de protocolo experimental....................................................54

Tabela 2: Valores de pD2 and Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para

acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior de

ratos com endotélio intacto pré-contraídas com FEN (10 µM) antes e após o pré-

tratamento com L-NAME...........................................................................................57

Tabela 3: Valores Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina

(ACh: 10-9 – 10-4 M) construídas na condição controle ou na presença dos seguintes

inibidores: L-NAME, L-NAME + INDO e L-NAME + INDO +

TEA.............................................................................................................................59

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AC- Adenilil ciclase

ACh- Acetilcolina

ADP- Adenosina disfosfato

ALX- Aloxano

ANG II- Angiotensina II

AT1- Receptor da angiotensina II

BH4- Tetrahidrobiopterina

BK- Bradicinina

BKCa- Canais para potássio sensíveis ao cálcio de grande condutância

[Ca2+] i- Concentração de cálcio intracelular

CGs- Ciclase da guanilil solúvel

DAG- Diacilglicerol

DE- Disfunção endotelial

DM- Diabetes mellitus

DM1- Diabetes mellitus tipo 1

DM2- Diabetes mellitus tipo 2

EA- Exercício aeróbio

EDCF- Fator contrátil derivado do endotélio

EDHF- Fator hiperpolarizante derivado do endotélio

EDRF- Fator relaxante derivado do endotélio

EF- Exercício físico

eNOS- Óxido nítrico sintase endotelial

ER- Exercício resistido

ET-1- Endotelina-1

FAD- Flavina adenina dinucleotídeo

FMN- Flavina mononucleotídeo

GMPc- Guanosina monofosfato cíclica

GTP- Guanosina trisfosfato

HIS- Histamina

15

IP3- Trisfosfato de inositol

K ir- Canais para K+ ativados pela despolarização da membrana

L-Arg- L-arginina

MLCK- Quinase da cadeia leve da miosina

Na+/K+-ATPase- Bomba de Na+/K+

NADPH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (Forma reduzida)

NO- Óxido nítrico

NOS- Óxido nítrico sintase

PGI2- Prostaciclina

PGH2- Prostaglandina H2

PKA- Proteína quinase dependente de AMPc

PKC- Proteína quinase C

PKG- Proteína quinase G

PLC- Fosfolipase C

SERCA- Bomba de Ca2+

STZ- estreptozotocina

16

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 18

2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................... 21

2.1 Diabetes Mellitus (DM)................................................................................................ 21

2.2 Função do EndotélioVascular....................................................................................... 22

2.2.1 Fatores envolvidos na regulação do tônus vascular............................................. 23

2.2.1.1 Fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs)................................ 23

2.2.1.2 Fatores contráteis derivados do endotélio (EDCFs)................................. 27

2.3 Disfunção Endotelial (DE)........................................................................................... 28

2.3.1 Disfunção endotelial no Diabetes Mellitus........................................................... 29

2.4 L-arginina (L-Arg)........................................................................................................ 29

2.4.1 L-arginina e Função Vascular............................................................................. 33

2.4.1.1 Estudos Experimentais………………………………………………… 33

2.4.1.2 Estudos Clínicos...................................................................................... 35

2.5 Exercício Físico (EF).................................................................................................... 38

2.5.1 Exercício Físico e Função Vascular.................................................................... 39

2.5.1.1 Estudos Experimentais............................................................................ 39

2.5.1.2 Estudos Clínicos...................................................................................... 42

2.6 L-arginina, Exercício Físico e Função Vascular.......................................................... 44

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 47

3.1 Objetivo geral............................................................................................................... 47

3.2 Objetivos específicos.................................................................................................... 47

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 48

4.1 Animais......................................................................................................................... 48

4.2 Drogas........................................................................................................................... 48

4.3 Delineamento experimental.......................................................................................... 48

4.4 Indução do diabetes...................................................................................................... 49

4.5 Tratamento com L-arginina.......................................................................................... 50

4.6 Tratamento com exercício resistido.............................................................................. 50

17

4.7 Avaliação do vasorrelaxamento dependente de endotélio............................................ 51

4.8 Análises estatísticas...................................................................................................... 51

5 RESULTADOS................................................................................................................. 53

5.1 Peso corporal................................................................................................................ 53

5.2 Glicemia........................................................................................................................ 53

5.3 Teste de uma repetição máxima................................................................................... 53

5.4 Vasorrelaxamento dependente de endotélio................................................................. 54

5.5 Efeito do L-NAME, INDO e TEA sobre o vasorrelaxamento induzido por ACh....... 56

6 DISCUSSÃO..................................................................................................................... 60

7 CONCLUSÕES................................................................................................................. 64

8 PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 65

REFERÊNCIAS................................................................................................................... 66

ANEXO A - Aprovação do comitê de ética........................................................................... 84

ANEXO B- Comprovante de submissão do artigo............................................................... 85

18

1 INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus (DM) pode ser definido como um grupo heterogêneo de

distúrbios metabólicos caracterizados pela hiperglicemia, causado por uma disfunção

na secreção da insulina ou na ação desta, ou por ambas as coisas, resultando em

disfunção, e última instância, insuficiência de vários órgãos, especialmente dos

olhos, rins, nervos e sistema vascular (ADA, 2008; GRAVES; FRANKLIN, 2006;

SBD, 2007). O número de pessoas com DM é crescente em todo o mundo e isto se

deve a vários fatores como o aumento da população, da faixa etária, da urbanização e

da prevalência de obesidade e inatividade física (WILD et al., 2004).

Existem dois tipos principais de DM, comumente denominados como DM

tipo 1 (DM1) e DM tipo 2 (DM2) (SBD, 2007). O DM1 é uma doença auto-imune

caracterizada pela destruição das células beta produtoras de insulina. O DM1 surge

quando o organismo deixa de produzir a insulina ou produz apenas uma quantidade

muito pequena. Já a etiologia específica do DM2 ainda não está claramente

estabelecida como no DM1. Ao contrário do DM1, a maioria dos pacientes apresenta

obesidade e existe uma contínua produção de insulina pelo pâncreas. O problema

está na incapacidade de absorção da glicose plasmática pelas células musculares e

adiposas caracterizando o quadro de resistência insulínica (ADA, 2008).

O DM está associado a complicações agudas em situações de extrema

deficiência da insulina ou na ação desta e a complicações crônicas, principalmente

envolvendo o sistema cardiovascular. As doenças macro e microvasculares são

frequentemente a principal causa de morbidade e mortalidade em pacientes com

DM1 e DM2 (NEGRÃO; BARRETTO, 2010). Em condições fisiológicas o

endotélio vascular sintetiza e libera substâncias que modulam o tônus vascular,

regulam a coagulação, a trombólise e a resposta inflamatória (BEHRENDT; GANZ,

2002). Essas substâncias vasoativas que modulam o tônus vascular são denominadas

de fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs) e fatores contráteis derivados

do endotélio (EDCFs) (LUZ et al., 2005; TANG; VANHOUTTE, 2010).

O desequilíbrio entre os EDRFs e os EDCFs é um fenômeno sistêmico que

caracteriza a disfunção endotelial (DE) (LUZ et al., 2005). A relação entre DM1 e

doença cardiovascular é bem conhecida e tem sido atribuída à associação entre a

hiperglicemia crônica, inflamação crônica e a DE (SCHRAM et al., 2003). Entre os

19

mediadores responsáveis pela DE, foram constatados o aumento da expressão e/ou

atividade de agentes contracturantes como a angiotensina II (ANG II) e a Endotelina-

1 (ET1) associado a uma reduzida produção de óxido nítrico (NO) em leitos

vasculares, o principal fator vasorrelaxante derivado do endotélio (LUZ et al., 2005;

TANG; VANHOUTTE, 2010).

Terapias convencionais e novas abordagens terapêuticas são sugeridas para

melhorar a função vascular no estado diabético (POTENZA et al., 2009). Por este

motivo, muitos pesquisadores vêm investigando os papéis do exercício físico (EF) e

do aminoácido L-arginina (L-Arg) no tratamento da DE para minimizar os danos

cardiovasculares causados por este fenômeno sistêmico (HAMBRECHT et al., 2000;

MAIORANA et al., 2001; MAXWELL et al., 2001; WU; MEININGER, 2000).

O EF aeróbio promove efeitos benéficos à saúde, dentre eles a prevenção e a

melhora da DE, que está associado a uma maior biodisponibilidade de NO

(CHAKRAPHAN et al., 2005; HIGASHI et al.,1999; MYERS et al., 2002). O

estresse de cisalhamento promovido pelo exercício aeróbio, chamado de shear stress,

é um importante estimulador da produção de NO pelo endotélio, promovendo assim

a vasodilatação (DELP, 1995; DELP et al., 1993; FISHER et al., 2002). Esta

vasodilatação adaptativa do leito vascular é benéfica, uma vez que se contrapõem aos

fatores vasoconstritores usualmente presentes na DE (HIGASHI et al., 1999). No

entanto, não são bem compreendidos os efeitos na reatividade vascular promovida

pelo exercício resistido (ER) (CUNHA et al., 2005; FAHS et al., 2009; FIGARD et

al., 2006; MOTA, 2010).

Além dos efeitos do ER sobre a reatividade vascular, alguns estudos apontam

uma ação benéfica do tratamento com a L-Arg na reversão da DE no diabético e em

vários outros casos patológicos (KOHLI et al., 2004; ÖZÇELIKAY et al., 1999;

ÖZÇELIKAY et al., 2000; WU; MEININGER, 2000). A admininstração oral da L-

Arg demonstra ser eficaz em reverter o deficit do relaxamento dependente do

endotélio em ratos diabéticos (ÖZÇELIKAY et al., 1999; PIEPER et al., 1997).

Entretanto, alguns autores afirmam que são necessários mais estudos, pois o sucesso

deste tratamento depende das padronizações das variáveis metodológicas como, as

concentrações de L-Arg utilizada, o tempo de duração do tratamento, o local de

administração e o tempo da manifestação da patologia (BLUM et al., 2000;

20

CAMPBELL et al., 2006; MAXWELL et al., 2001; MAYHAN, 1997; WU;

MEININGER, 2000; WU et al., 2007).

Apesar dos benefícios que o EF e a L-Arg podem oferecer, as pesquisas

existentes acerca dos efeitos da L-Arg e do ER sobre a DE ainda não são

conclusivas. Similarmente, estudos comparando as alterações na reatividade vascular

em animais diabéticos submetidos a esses dois tipos de tratamentos, de forma isolada

e combinada, ainda são inconsistentes. Desta forma, se faz necessário o

desenvolvimento de estudos experimentais a fim de investigar as alterações na

reatividade vascular de ratos diabéticos submetidos ao tratamento com L-Arg e com

o ER de forma isolada e combinada.

21

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Diabetes Mellitus (DM)

O DM pode ser definido como um grupo heterogêneo de distúrbios

metabólicos caracterizados pela hiperglicemia, causado por uma disfunção na

secreção da insulina ou na ação desta, ou por ambas as coisas, resultando em

disfunção, e última instância, insuficiência de vários órgãos, especialmente dos

olhos, rins, nervos e sistema vascular (ADA, 2008; GRAVES; FRANKLIN, 2006;

SBD, 2007).

O DM é uma epidemia crescente. Em 1985, estimava-se que existissem 30

milhões de adultos com DM no mundo. Esse número cresceu para 135 milhões em

1995 e atingindo 173 milhões em 2002, com projeção de chegar a 300 milhões no

ano de 2030. Os custos diretos com DM variam entre 2,5% e 15% do orçamento

anual da saúde, dependendo de sua prevalência e do grau de sofisticação do

tratamento disponível (SBD, 2007). Estimativas do custo direto para o Brasil estão

em torno de 3,9 bilhões de dólares americanos, em comparação com 0,8 bilhão para a

Argentina e 2 bilhões para o México (BARCELÓ et al., 2003).

Existem dois tipos principais de DM, comumente denominados como DM1 e

DM2. O DM1, forma presente em 5% a 10% dos casos, é o resultado de uma

destruição das células beta pancreáticas com consequente deficiência na síntese e

secreção de insulina, usualmente por processo auto-imune ou menos comumente de

causa desconhecida (ADA, 2008; GROSS, 2002). O pico de incidência do DM1

ocorre dos 10 aos 14 anos de idade, havendo a seguir uma diminuição progressiva

deste acometimento até os 35 anos, de tal maneira que casos de DM1 diagnosticados

após esta idade é pouco frequente. Em geral, os pacientes apresentam índice de

massa corporal normal, mas a presença de obesidade não exclui o diagnóstico

(ATKINSON; MACLAREN, 1994; GROSS, 2002).

Já o DM2, mais comum do que o DM1, se faz presente em 90% a 95% dos

casos e caracteriza-se por disfunção na ação e na secreção da insulina. Em geral,

ambas as disfunções estão presentes quando a hiperglicemia se manifesta, porém

pode haver predomínio de uma delas (ADA, 2008; WHO, 1999). A etiologia

22

específica do DM2 ainda não está claramente estabelecida como no DM1. Ao

contrário do DM1, a maioria dos pacientes apresenta obesidade. A idade de início do

DM2 é variável, embora seja mais frequente após os 40 anos de idade, com pico de

incidência ao redor dos 60 anos (GROSS, 2002).

O DM1 está associado a complicações agudas em situações de extrema

deficiência da ação insulínica, como a cetoacidose diabética, e a complicações

crônicas, principalmente envolvendo o sistema cardiovascular (NEGRÃO;

BARRETTO, 2010). Dentre as complicações cardiovasculares mais comuns

podemos citar aumento do risco de infartos, acidentes vasculares cerebrais e doença

vascular periférica (GRAVES; FRANKLIN, 2006). As doenças macro e

microvasculares são frequentemente a principal causa de morbidade e mortalidade

em pacientes com DM1 e DM2 (COCCHERI, 2007; NEGRÃO; BARRETTO,

2010).

2.2 Função do Endotélio Vascular

O endotélio recobre internamente todos os vasos do organismo, possui uma

monocamada de epitélio pavimentoso localizado entre o sangue circulante e a

camada média do músculo liso vascular. Pode ser considerado um órgão endócrino

ativo que, em respostas a estímulos humorais, neurais e mecânicos, sintetiza

substâncias vasoativas que desempenham um papel fundamental na regulação da

circulação sanguínea (LUZ et al., 2005).

Em situações fisiológicas o endotélio sintetiza e libera vários fatores

envolvidos em numerosos processos fisiológicos, dentre os quais sintetiza e libera

substâncias que modulam o tônus vascular, regulam a coagulação, a trombólise e a

resposta inflamatória (BEHRENDT; GANZ, 2002). Estes fatores são secretados

principalmente quando o endotélio é ativado por agonistas que interagem com os

receptores específicos acoplados a proteínas G. Dentre os quais, podemos citar a

acetilcolina (ACh), a substância P (SP), a bradicinina (BK), a histamina (HIS), a

adenosina disfosfato (ADP) e a insulina (LUZ et al., 2005). Além dos estímulos

químicos, existe ainda um importante estímulo físico, o shear stress, ou estresse de

23

cisalhamento, o qual corresponde à força que o fluxo sanguíneo exerce nas células

endoteliais e que gera a síntese e liberação de mediadores vasorrelaxantes

(MATLUNG et al., 2009).

2.2.1 Fatores envolvidos na regulação do tônus vascular

O endotélio controla o tônus do músculo liso vascular pela produção de

mediadores que podem evocar vasodilatação ou vasoconstrição. O NO e os Fatores

Hiperpolarizantes Derivados do Endotélio (EDHFs), por exemplo, produzem

relaxamento vascular, enquanto que a endotelina-1 (ET-1) e a angiotensina II (ANG

II) são potentes vasoconstritores (LUZ et al., 2005). Essas substâncias vasoativas que

modulam o tônus vascular são denominadas de fatores relaxantes derivados do

endotélio (EDRFs) e fatores contráteis derivados do endotélio (EDCFs) (LUZ et al.,

2005; TANG; VANHOUTTE, 2010).

2.2.1.1 Fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs)

Os EDRFs possuem três principais vias geradoras de vasodilatação. A via de

produção do NO, a via da prostaciclina (PGI2) e a via dos EDHFs. Agonistas tipo

ACh, SP, BK e ADP, estimulam o aumento da concentração intracelular do Ca2+

ativando as três vias. O relaxamento do músculo liso vascular ocorre através dos

segundos mensageiros AMPc, GMPc ou ainda, através da hiperpolarização da

membrana celular proveniente do aumento da condutância dos canais para potássio

(K+) (Figura 1).

24

Figura 1: Principais vias endoteliais envolvidas na vasodilatação. Figura adaptada de RATTMANN, 2009.

O NO é uma molécula sintetizada nas células endoteliais a partir do

aminoácido L-Arg por uma família de enzimas denominadas NO sintase (NOS). Três

isoformas de NO sintases foram identificadas em humanos e em outros organismos.

Duas destas isoformas são expressas constitutivamente: a neural (nNOS), também

conhecida como NOS-1, porque foi a primeira isoforma descoberta e a endotelial

(eNOS; NOS-3). Ambas as enzimas são reguladas pelo complexo cálcio-

calmodulina. A terceira isoforma é a induzível (iNOS; NOS-2), que é regulada por

estimulação de citocinas e produz grandes quantidades de NO, excedendo em muito

as quantidades produzidas pelas outras duas isoformas (FURCHGOTT;

ZAWADZKI,1980; LUZ et al., 2005; MONCADA et al., 1991).

A atividade celular da eNOS está localizada nas cavéolas, que são

invaginações microscópicas do endotélio (GOLIGORSKY et al., 2002; LUZ et al.,

2005). Os principais transportadores de íons cálcio (Ca2+) estão localizados na

cavéola e são canais ativados por agonistas químicos como a ACh ou por estímulos

físicos, como o shear stress (FISSLTHALER et al., 2000; NILIUS; DROOGMANS,

2001). Após a ligação do agonista ao seu receptor acoplado a proteína Gq/11, ocorre

ativação da fosfolipase C (PLC) para produzir diacilglicerol (DAG) e trifosfato de

25

inositol (IP3). O IP3 aumenta a concentração intracelular de íons (Ca2+), favorecendo

a interação Ca2+ -calmodulina e resultando na ativação da eNOS e produção de NO

(LUZ et al., 2005).

O NO difunde-se facilmente através das células da musculatura lisa adjacente,

estimula a ciclase da guanilil solúvel (CGs), que metaboliza a guanosina trifosfato

(GTP) e transforma em guanosina monofosfato cíclica (GMPc) (COHEN;

VANHOUTTE, 1995). O GMPc, por sua vez, ativa a proteína quinase G (PKG),

resultando em estimulação da bomba de Ca2+ no retículo sarcoplasmático (SERCA),

acelerando a recaptação de Ca2+ para os estoques intracelulares. Ocorre também a

abertura dos canais para K+, fechamento dos canais para Ca2+ sensíveis a voltagem e

a fosforilação da quinase da cadeia leve da miosina (MLCK), inativando-a

(CORNWELL, et al., 1991). Todos estes eventos levam a uma redução de [Ca2+] i e o

vasorelaxamento (FURCHGOTT, 1983; SCHINI-KERTH; VANHOUTTE, 1995).

Além desta via dependente de GMPc, alguns trabalhos têm demonstrado que o NO

também pode produzir seus efeitos por uma via independente de GMPc através da

ativação direta de canais para K+ sensíveis ao Ca2+ de grande condutância (BKCa)

(BOLOTINA et al., 1994; MISTRY; GARLAND, 1998).

O NO também medeia ativamente muitas das funções protetoras exercidas

pelo endotélio intacto, e em conjunto com a PGI2 exerce potente efeito

antiaterogênico e tromborresistencia, prevenindo adesão e agregação plaquetária

(LUZ et al., 2005). A PGI2 pode ser considerada um dos EDRFs porque possui

atividade vasodilatadora e a sua origem é primariamente endotelial. Apesar disso, a

importância fisiológica da PGI2 para a vasodilatação é usualmente pequena e a

inibição de sua síntese não altera níveis pressóricos (CARVALHO et al., 2001; LUZ

et al., 2005). Sua ação depende da presença de receptores específicos no músculo liso

vascular. A estimulação dos receptores da PGI2 leva a uma estimulação da adenilil

ciclase (AC) produzindo um aumento de AMP cíclico e estimulação da proteína

quinase dependente de AMP cíclico (PKA). A PKA tem um efeito semelhante à

PKG, podendo ativar canais para K+ sensíveis ao ATP induzindo assim, a

hiperpolarização e estimulação da saída de Ca2+ do citosol inibindo a maquinaria

contrátil (CARVALHO et al., 2001).

Além do NO e da PGI2, o endotélio vascular produz um terceiro fator

relaxante que gera hiperpolarização no músculo liso vascular. Embora o NO seja

26

reconhecido como o fator primário em nível das artérias de condutância, nos últimos

anos, aumentaram as evidências para o papel de outros vasodilatadores derivados do

endotélio conhecidos como EDHFs (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009; LUKSHA et

al., 2009). É relatado na literatura ainda que a importância dos EDHFs nos

vasorrelaxamentos aumenta na medida em que o diâmetro do vaso diminui

(SHIMOKAWA et al., 1996). Este relato confirma a predominância do NO como o

principal fator relaxante derivado do endotélio em artérias de condutância, tal como

aorta torácica, enquanto que em artérias de resistência, como a mesentérica e

femoral, os EDHFs tem maior participação no controle da circulação local (SHI et

al., 2006).

Apesar do importante papel fisiológico que desempenha no controle do tônus

vascular, a identidade química do EDHF até hoje é desconhecida e ocorre a

possibilidade da existência de vários EDHFs (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009).

Dentre os candidatos podemos citar os metabólitos do ácido araquidônico (Ciclo-

oxigenase e lipoxigenase), derivados do citocromo P450, peróxido de hidrogênio,

monóxido de carbono, sulfeto de hidrogênio, as espécies reativas de oxigênio,

peptídeos, K+, as vias mono-oxigenase, Na+/K+-ATPase ou comunicações via gap

junctions entre células endoteliais e musculares lisas (CAMPBELL, 1996;

FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009; LUKSHA et al., 2009).

Esses fatores ativam diferentes famílias de canais para K+ e hiperpolarização

de células musculares lisas vasculares contribuem para os mecanismos que

conduzem para o seu relaxamento. Em geral, a hiperpolarização do músculo liso

vascular produz relaxamento por reduzir tanto a probabilidade de abertura de canais

para Ca2+ dependentes de voltagem, quanto à taxa de renovação de fosfatidilinositol

intracelular, diminuindo assim a [Ca2+] i (LUZ et al., 2005).

As respostas mediadas pelos EDHFs são iniciadas por um aumento na

concentração de [Ca2+] i endotelial, ocorrendo uma consequente ativação de canais

para K+ ativados por Ca2+ de baixa condutância (SKCa) e canais para K+ ativados por

Ca2+ de condutância intermediária (IKCa), os quais induzem a hiperpolarização da

célula endotelial (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009). A hiperpolarização pode se

difundir para as células do músculo liso vascular através das gap junctions

mioendoteliais ou pelo efluxo de K+ (Canais SKCa e IKCa) que induz a

hiperpolarização de miócitos por ativar canais Kir e/ou Na+/K+-ATPase (LUZ et al.,

27

2005). A proporção relativa de cada mecanismo dependerá de numerosos

parâmetros, incluindo o estado de ativação do músculo liso vascular, densidade de

gap junctions mioendoteliais, nível de expressão do citocromo P450 e isoformas

apropriadas de canais Kir e/ou Na+/K+-ATPase (BUSSE et al., 2002).

Apesar de alguns mecanismos sobre os EDHFs já terem sido identificados,

ainda faltam ferramentas farmacológicas e eletrofisiológicas específicas para elucidar

a importância, os efeitos e os benefícios dos EDHFs sobre a maquinaria contrátil.

Além disso, também devem ser cuidadosamente estudados os mecanismos

subjacentes aos EDHFs (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009).

2.2.1.2 Fatores contráteis derivados do endotélio (EDCFs)

Além da produção dos EDRFs, o endotélio é capaz de sintetizar substâncias

vasoconstritoras chamados de EDCFs (THORIN; WEBB, 2010). Os principais

EDCFs envolvidos nas contrações do músculo liso vascular são a ET-1, ANG II e em

menor proporção, o tromboxano A2 e a prostaglandina H2 (PGH2) (VANHOUTTE,

TANG, 2008).

As endotelinas são peptídeos de 21 aminoácidos produzidos por vários

tecidos e possuem três diferentes isoformas (ET-1, ET-2 e ET-3) (KEDZIERSKI;

YANAGISAWA, 2001). A ET-1 é secretada principalmente na direção abluminal e

atua de maneira autócrina e parácrina em células próximas, como células musculares

lisas, células do miocárdio e células do tecido conectivo (CARVALHO et al., 2001).

A ET-1 é o mais potente vasoconstritor descrito, tanto em vasos de maior calibre

quanto na microcirculação (FORTES, et al., 1989; YANAGISAWA et al., 1988).

As endotelinas possuem receptores que se ligam a proteínas G. Sua ativação

promove despolarização da membrana plasmática, aumento do [Ca2+] i, contração

vascular, liberação de fatores endoteliais, síntese de DNA e crescimento celular

(RUBANYI, G.M.; POLOKOFF, 1994). Alguns dados sugerem que a ET-1 se liga

de maneira quase irreversível aos seus receptores nas células do músculo liso

vascular, com consequente duração de suas ações vasoconstritoras e pressoras

(BOULANGER; LÜSCHER, 1990). Além disso, nas doenças cardiovasculares, é

28

descrita uma importante interação entre a ET-1 e a angiotensina II (ANG II), outro

importante vasoconstritor (D'ORLÉANS-JUSTE et al., 2008).

A ANG II é o peptídeo responsável pelas principais ações do sistema renina-

angiotensina, modulando a pressão arterial, a homeostase de sal e água, e o sistema

nervoso autônomo, entre outros (PEACH, 1977). Três subtipos de receptores para

ANG II são conhecidos: AT1A, AT1B e AT2. A maioria dos efeitos fisiológicos da

ANG II é mediada pela ativação de receptores do subtipo AT1, enquanto poucos

efeitos, geralmente opostos àqueles desencadeados pela ativação de AT1, têm sido

atribuídos à ativação de receptores AT2. Os receptores para ANG II também

pertencem à família de receptores acoplados a proteínas G e, no caso dos receptores

AT1, o acoplamento ocorre via proteínas Gq. Consequentemente, a estimulação de

receptores AT1 ativa a PLC, aumenta os níveis de DAG e IP3, eleva a [Ca2+] i e

promove ativação de várias quinases modulando as funções celulares levando a

ativação da maquinaria contrátil (CARVALHO et al., 2001).

É importante salientar que o tônus vascular basal fisiológico resulta da

interação de todos os fatores, vasoconstritores e vasodilatadores. Qualquer

desequilíbrio na liberação destes fatores resulta numa situação de disfunção

endotelial que está relacionada a fatores de risco predisponentes a aterosclerose,

como: hipercolesterolemia, obesidade, hipertensão, tabagismo e DM (BRITTEN et

al., 1999; NACCI et al., 2009).

2.3 Disfunção Endotelial (DE)

A DE é um fenômeno sistêmico e pode ser definida como o desequilíbrio

entre os EDCFs e EDRFs (LUZ et al., 2005). Este desequilíbrio inclui mudanças na

função do endotélio, aumento da agregação plaquetária, expressão de moléculas de

adesão, resposta vasodilatadora reduzida, ativação inflamatória exacerbada,

crescimento do músculo liso vascular e angiogênese (BAKKER et al., 2009;

FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2006; VANHOUTTE et al., 2009).

Assim, um ciclo é estabelecido, consequentemente contribuindo para a

trombose, remodelamento vascular e aterosclerose (TANG; VANHOUTTE, 2010).

29

No paciente diabético a DE tem sido sugerida como um evento precoce na

patogênese das complicações vasculares (CALLES-ESCANDON; CIPOLLA, 2001).

2.3.1 Disfunção endotelial no Diabetes Mellitus

As doenças micro e macrovasculares são as principais causas de

morbimortalidade em pacientes com DM (CALLES-ESCANDON; CIPOLLA,

2001). Sabe-se, que a hiperglicemia crônica é um importante preditor das

complicações micro e macrovasculares no paciente com DM1 (BAKKER et al.,

2009; NATHAN et al., 2005). A esta patologia tem sido atribuída à associação entre

a hiperglicemia crônica, inflamação crônica e DE (SCHRAM et al., 2003).

O comprometimento funcional do endotélio precede o desenvolvimento das

alterações morfológicas durante a progressão do diabetes. A redução da

biodisponibilidade NO ocorre principalmente devido a uma acelerada degradação

promovida pelas espécies reativas de oxigênio (CAI; HARRISON, 2000). Os

mecanismos propostos para explicar as alterações vasculares no diabetes incluem a

acelerada formação de produtos finais da glicação avançada, aumento da atividade da

proteína quinase C (PKC), sinalização inflamatória, ativação da via dos polióis e

estresse oxidativo (POTENZA et al., 2009).

As terapias convencionais para reduzir a hiperglicemia, dislipidemia e a

resistência à insulina podem efetivamente melhorar a função endotelial e retardar o

aparecimento de complicações vasculares. Novas abordagens terapêuticas destinadas

a inibir a formação de produtos finais da glicação avançada, reduzir a ativação da

PKC, diminuir os sinais inflamatórios e restaurar o balanço oxidativo do endotélio

podem ser indicadas para melhorar a função vascular no estado diabético

(POTENZA et al., 2009).

2.4 L-arginina (L-Arg)

A L-Arg (Figura 2) é um aminoácido catiônico nutricionalmente classificado

como semi-essencial, que foi descoberto em 1886 e participa de diversos processos

30

do metabolismo humano (APPLETON, 2002; CYLWIK et al., 2005). É considerado

um aminoácido semi-essencial porque pode ser proveniente da dieta ou produzido

endogenamente no organismo adulto saudável (APPLETON, 2002). Por outro lado,

quando sua síntese está diminuída, ou seu catabolismo aumentado, torna-se um

aminoácido nutricionalmente essencial (BRUNINI et al., 2005).

Figura 2: Estrutura química da L-Arg. Figura adaptada de Cynober et al., 1995.

Dentre as várias fontes alimentares onde a L-Arg é encontrada destacam-se os

frutos do mar, o suco de melancia, nozes, sementes, algas, carnes e isolados protéicos

de soja (HOU et al., 2008; KING et al., 2008; WU et al., 2009). Interessantemente,

no leite dos mamíferos é relativamente baixo o conteúdo da L-Arg (DAVIS et al.,

1994; WU; KNABE, 1994).

A síntese da L-Arg nos mamíferos ocorre a partir de processos complexos do

metabolismo protéico no intestino, fígado e rins. O aminoácido L-citrulina produzido

principalmente no intestino delgado a partir de aminoácidos como a prolina,

glutamina e glutamato é absorvido e transportado para os rins (DHANAKOTI,

1990). Nos túbulos renais proximais a L-citrulina é sintetizada em L-Arg pelas

enzimas argininosuccinato sintetase e argininosuccinato liase. O fígado também é

capaz de sintetizar consideráveis quantidades de L-Arg, porém, é completamente

31

reaproveitada no ciclo da uréia para que o fígado contribua pouco com o fluxo da L-

Arg no plasma (WATFORD, 1991).

O transporte de membrana celular da L-Arg ocorre por difusão facilitada, os

processos são mediados por proteínas e existem quatro sistemas de transportes: y+,

y+L, B0,+ e b0,+. O sistema y+ é específico para aminoácidos catiônicos e possui fraca

interação com aminoácidos neutros. Já os sistemas y+L, B0,+ e b0,+ são sistemas de

transportes da L-Arg que possuem alta afinidade e baixa capacidade no seu

transporte devido a uma grande interação com diversos substratos, incluindo

aminoácidos catiônicos e neutros (DEVÉS; BOYD, 1998).

A L-Arg é considerada um aminoácido muito versátil porque participa de

importantes processos biológicos (Figura 3) tanto nos humanos, quanto em animais

(MORRIS, 2006; WU et al., 2009).

Sabe-se também que a L-Arg possui efeitos significativos sobre a função

endócrina, em especial na glândula adrenal e pituitária. A administração de L-Arg

demonstrou que é capaz de estimular a liberação de catecolaminas, insulina,

glucagon, prolactina e hormônio do crescimento (DE CASTRO BARBOSA et al.,

2009; IMMS, 1969; PALMER et al., 1975). Apesar destes efeitos já terem sido

evidenciados, pouco se sabe sobre o mecanismo exato através do qual a L-Arg

exerce seus efeitos sobre o sistema endócrino.

Dentre os vários processos biológicos que envolvem a L-Arg, a síntese do

NO pelas células endoteliais desempenha um importânte papel no controle da

regulação do tônus e da homeostasia vascular (GREEN et al., 2004). Para a produção

de NO pela eNOS, são necessários os seguintes co-fatores: NADPH (nicotinamida

Figura 3: Produtos formados a partir do metabolismo da L-Arg. Figura adaptada de Morris, 2006.

Proteína

L-arginina

Uréia

NO

Prolina Glutamato

Creatina

Agmatina

Poliaminas

32

adenina dinucleotídeo fosfato, forma reduzida), O2, BH4 (tetrahidrobiopterina), FAD

(flavina adenina dinucleotídeo), FMN (flavina mononucleotídeo) e Ca+2 (essencial

para a atividade das formas constitutivas) (BREDT et al., 1991; STEVENS-TRUSS

et al., 1997). A eNOS possui em cada lado de sua estrutura molécular duas porções

funcionais. Na porção carboxiterminal, existe um domínio que recebe elétrons do

NADPH (Redutase) e na porção aminoterminal, existe o domínio que abstrai um

elétron da L-Arg (Oxigenase). Este último domínio possui sítios de ligação com o

grupo ferro heme, a BH4 e a L-Arg. As duas porções são unidas por um sítio de

ligação cálcio/calmodulina (Ca2+/CaM), essencial para o acoplamento funcional da

transferência de elétrons dos grupos flavina para o ferro heme (LUZ et al., 2005;

STUEHR et al., 2001).

Podemos então caracterizar que a produção do NO via L-Arg (Figura 4)

acontece após cinco passos (NAPH - FAD - FMN - Ca2+/CaM - Heme/O2 - L-

Arg/NO) que envolvem a transferência de elétrons. A transferência de elétrons para o

grupo ferro heme induz a sua ativação, com consequente ligação ao O2, e este

complexo catalisa a oxidação do nitrogênio guanidinotermial da L-Arg, resultando na

síntese de NO e o subproduto L-citrulina (LUZ et al., 2005).

Figura 4: Produção do NO via L-Arg. Figura adaptada de RATTMANN, 2009.

33

2.4.1 L-arginina e Função Vascular

2.4.1.1 Estudos Experimentais

Sabe-se que a redução da biodisponibilidade de NO contribui para o

surgimento da DE e que este fato ocorre em diversos estados patológicos (WU;

MEININGER, 2000). Devido a isto, o modelo animal de doença tem sido

amplamente utilizado em estudos que objetivam avaliar os efeitos do tratamento com

a L-Arg sobre a função vascular. Os estudos experimentais que avaliam a função

vascular em sua maioria são feitos in vitro e in vivo (CYLWIK et al., 2005). Para a

administração do tratamento com a L-Arg, os pesquisadores se utilizam do método

de gavagem, infusão venosa e a mais comum, a administração na água de beber

(ÖZÇELIKAY et al., 2000; WITTE et al., 2002; WU et al., 2007).

No decorrer da década de 1980, foi descoberto que a L-Arg era o precursor do

óxido nítrico (NO) (PALMER et al., 1988a; SCHMIDT et al., 1988). Em 1991

Schini e Vanhoutte, estudaram o vasorrelaxamento de anéis isolados de artéria aorta

de ratos saudáveis e demonstraram existir um aumento no vasorrelaxamento das

artérias quando pré-incubadas com L-Arg. O experimento foi realizado tanto na

presença, como na ausência do endotélio. Os resultados sugeriram a existência de

uma via metabólica L-Arg/NO também no músculo liso vascular.

Com isto, a L-Arg na década de 1990 passou a despertar um maior interesse

da comunidade científica para o seu potencial clínico como uma nova estratégia

nutricional para prevenir e tratar as desordens vasculares (CHEN; SANDERS, 1991;

CHEN et al., 1993; PIEPER, 1998). Um fato importante é que na mesma década a

administração oral de L-Arg in vivo e in vitro demonstrou restaurar as respostas aos

relaxamentos induzidos por ACh em artéria aorta de diferentes modelos animais de

hipertensão, hipercolesterolemia e diabetes (COOKE et al.,1992; CHEN;

SANDERS, 1991; CHEN et al., 1993; PIEPER; PELTIER, 1995; PIEPER et al.,

1996; PIEPER et al., 1997).

Em um estudo feito por Özçelikay e colaboradores (1999), foi avaliado o

efeito protetor do tratamento crônico com a L-Arg sobre a reatividade vascular da

artéria aorta de ratos com DM1 durante 12 semanas após a indução do diabetes. O

estudo mostrou que o tratamento crônico com a L-Arg (1 mg/mL na água de beber)

em ratos diabéticos previne a redução na reatividade vascular observada nos animais

34

diabéticos não tratados. Foi observado também, que o efeito da L-Arg sobre a

reatividade vascular pode ser resultado de uma diminuição do estresse oxidativo.

Apesar destes efeitos, o tratamento crônico com a L-Arg não foi capaz de causar

mudança significativa na insulina plasmática, glicose, colesterol e triglicerídeos dos

ratos diabéticos.

Em outro estudo do mesmo grupo, os autores demonstraram que o tratamento

com L-Arg (1,25 mg/mL na água de beber) durante 4 semanas em ratos com DM1 e

hipertensão crônica, foi capaz de reverter o efeito da resposta vascular reduzida a

ACh em artéria aorta e o estado hipertensivo dos animais. Estes resultados sugerem

que o tratamento com L-Arg aumentou a síntese de NO endotelial, aumentando a

vasodilatação associada a uma redução da pressão arterial (ÖZÇELIKAY et al.,

2000).

É relatado na literatura ainda que a importância do EDHFs no

vasorrelaxamento aumenta na medida em que o diâmetro do vaso diminui

(SHIMOKAWA et al., 1996). Este relato confirma a predominância do NO como o

principal fator relaxante derivado do endotélio em artérias de condutância, tal como

aorta torácica, enquanto que em artérias de resistência, como a mesentérica e

femoral, os EDHFs possuem uma maior participação no controle da circulação local

(SHI et al., 2006).

Diante disto, sabe-se que a artéria mesentérica superior de ratos o NO têm

uma menor participação nos vasorrelaxamentos quando comparada com a artéria

aorta (WALDRON; GARLAND, 1994). Apesar deste fato, evidências demonstram

que o NO é de fundamental importância para o vasorrelaxamento da artéria

mesentérica superior já que, ele é capaz de modular o aumento do potencial de

membrana e a liberação dos EDHFs (SIMONSEN et al., 1999; STANKEVICIUS et

al., 2006; WALDRON; GARLAND, 1994).

Sabendo da importância do NO para os vasorrelaxamentos da artéria

mesentérica, Ward e colaboradores (2000) avaliaram o tratamento agudo com L-Arg

(4 mg/kg/min, i.v.) em ratos saudáveis que sofreram isquemia do leito mesentérico

por 30 minutos e logo em seguida reperfusão por 4h. Eles observaram com este

método um aumento na produção de NO que resultou em redução na DE sistêmica

nos ratos que receberam o tratamento. Da mesma forma, Taha e colaboradores

(2010) trataram coelhos com L-Arg (100 mg/kg/min, i.v.) e constataram também que

35

o leito mesentérico que sofreu isquemia teve uma atenuação na resposta a DE

sistêmica.

Kohli e colaboradores (2004) observaram em células endoteliais da carótida

de ratos com DM1, que o tratamento com a L-Arg (1,51% na água de beber) por 14

dias foi capaz de reduzir a perda de peso corporal, diminuir a glicose plasmática e

aumentar a disponibilidade do BH4 reforçando a síntese endotelial de NO. A redução

da glicose plasmática encontrada neste estudo pode ser explicada através do achado

de Vasilijevic e colaboradores (2007) que sugere uma neogênese das células β do

pâncreas, retomando os valores normais de insulina e glicose no plasma ocasionado

pelo tratamento com a L-Arg (2,25% na água de beber) por 12 dias em ratos com

DM1. Apesar do estudo de Özçelikay e colaboradores (1999) não demonstrar

melhora nas variáveis metabólicas dos animais diabéticos, estes resultados citados

fornecem uma base bioquímica para o efeito benéfico do tratamento com a L-Arg na

prevenção da DE em indivíduos diabéticos.

Por fim, têm sido demonstrados que o tratamento em longo prazo com a L-

Arg é seguro e sem aparecimento de efeitos adversos por todo o período de

tratamento em suínos, ovelhas e ratos (WU et al., 2007). Com estas evidências

benéficas nos modelos animais de doenças o tratamento com L-Arg pode ser uma

nova estratégia para a terapêutica das patologias que desencadeiam a DE (obesidade,

hipertensão, síndrome metabólica e diabetes) (WU; MEININGER, 2000; WU et al.,

2009). O tratamento com L-Arg é seguro para animais e abre perspectivas para os

estudos que buscam a prevenção e o tratamento da DE em humanos (WU et al.,

2009).

2.4.1.2 Estudos Clínicos

Apesar das evidências de segurança e prevenção do tratamento com a L-Arg

sobre a função vascular em modelos animais, ainda não está totalmente elucidado

qual o verdadeiro papel da L-Arg frente às desordens vasculares tanto em animais

quanto em humanos. Muitos estudos avaliam os efeitos em curto prazo através de

infusão venosa e arterial da L-Arg em pacientes com hipercolesterolemia, doença

arterial coronariana, hipertensão e diabetes (CREAGER et al., 1992; LAUER et al.,

36

2008; NITENBERG et al., 1998; PANZA et al., 1993; TOUSOULIS et al., 1997). Da

mesma forma, o estudo em longo prazo com a L-Arg pode caracterizar a real

efetividade do tratamento, mas existe um enorme desafio em produzir estudos

prospectivos (com longos seguimentos), randomizados (Crossover), placebo

controlado e duplo-cego (BAI et al., 2009; PRELI et al., 2002).

Em uma recente meta-análise elaborada por Bai e colaboradores (2009),

foram selecionados 13 estudos randomizados e placebos controlados, que avaliaram

a função endotelial em diversos estados patológicos e leitos vasculares. Chegaram à

conclusão que indivíduos com DE são susceptíveis a ter um benefício sobre a função

vascular em curto prazo com a ingestão oral de L-Arg, este efeito não parece ser

dose-dependente quando a dose de L-Arg variou de 3 a 24 g/dia. Porém, pensando no

melhor método em longo prazo para a prevenção e tratamento das desordens

cardiovasculares que acometem o endotélio, ao invés de administração por infusão

venosa e arterial, a via oral parece ser a mais viável.

Apesar das dificuldades encontradas para desenvolver os estudos com

humanos, os cientistas vêm demonstrando que o vasorrelaxamento dependente do

endotélio da artéria braquial reduzido em hipercolesterolêmicos pode ser melhorado

através da administração oral de L-Arg (7 g 3x/dia) durante 4 semanas

(CLARKSON et al., 1996). Interessantemente, um estudo com barra nutritiva

contendo grandes quantidades de L-Arg (6-21 g/dia) consumida por pacientes com

hipercolesterolemia durante 7 dias (2 barras/dia), foi capaz de melhorar o

vasorrelaxamento dependente do endotélio da artéria braquial destes pacientes

(MAXWELL et al., 2000). Outro efeito importante demonstrado é que o tratamento

com L-Arg oral (8,4 g/dia) por 2 semanas reduz a adesão plaquetária encontrada em

pacientes hipercolesterolêmicos (WOLF et al., 1997).

Nos pacientes com a doença arterial coronariana estabelecida também é

observado uma redução da adesão plaquetária e melhora do vasorrelaxamento

dependente do endotélio da artéria braquial com a administração oral de L-Arg (7 g

3x/dia) durante 10 dias (ADAMS et al., 1997). Em outro estudo elaborado por Blum

e colaboradores (2000) em pacientes com doença arterial coronariana que

mantiveram o tratamento médico convencional, não observaram mudanças

significativas nas moléculas de adesão plaquetária e no vasorrelaxamento dependente

do endotélio da artéria braquial quando administrado oralmente a L-Arg (9 g/dia)

37

durante 4 semanas. Apesar destes resultados conflitantes, Yin e colaboradores (2005)

demonstraram que o tratamento oral com L-Arg (10 g/dia) durante 4 semanas em

pacientes com doença arterial coronariana foi capaz de melhorar o vasorrelaxamento

dependente do endotélio da artéria braquial e reduzir os marcadores do estresse

oxidativo. No entanto, não foi capaz de reduzir as concentrações séricas dos

marcadores inflamatórios. Estes resultados conflitantes demonstram que ainda existe

um longo caminho para compreender os efeitos da L-Arg sobre a doença arterial

coronariana.

Os efeitos da L-Arg sobre a hipertensão têm demonstrado que 6 g/dia de L-

Arg é capaz de promover um aumento do vasorrelaxamento da artéria braquial em

pacientes com hipertensão essencial (LEKAKIS et al., 2002). Recentemente tem sido

demonstrado que a administração oral (12 g/dia) reduz significativamente a pressão

arterial (sistólica e diastólica) com um forte efeito hipotensor observado após 4

semanas de tratamento (AST et al., 2010). Em pacientes hipertensos e com DM tipo

II o tratamento com N-acetilcisteína (600 mg/dia) associado a L-Arg (1,200 mg/dia)

durante 6 meses foi capaz de demonstrar um potencial para a terapia anti-

aterogênica. Neste estudo, foi demonstrado que o tratamento com a L-Arg melhorou

o vasorrelaxamento dependente do endotélio da artéria braquial e aumentou a

produção de NO via redução do estresse oxidativo (MARTINA et al., 2008).

Já em pacientes portadores somente do DM2 o tratamento oral com a L-Arg

(3 g 3x/dia) durante 4 semanas foi capaz de melhorar significativamente a via

NO/GMPc, entretanto, não melhorou a sensibilidade à insulina (PIATTI et al., 2001).

Lucotti e colaboradores (2006) demonstraram que quando associado uma dieta

hipocalórica, exercício físico e o tratamento oral com L-Arg (8,3 g/dia) por 21 dias,

os pacientes portadores do DM2 quando comparado com o grupo controle,

apresentaram uma redução significativa do peso corporal, da pressão arterial, do

estresse oxidativo e uma melhora significativa da sensibilidade à insulina e da função

endotelial.

O mesmo efeito sobre a função endotelial não pode ser observado em

pacientes portadores do DM1. Mullen e colaboradores (2000), acompanharam por 6

semanas pacientes portadores do DM1 que foram tratados com L-Arg (7 g 2x/dia) e

diferente dos resultados benéficos sobre aumento do vasorrelaxamento da artéria

braquial encontrados em pacientes com hipercolesterolemia, doença arterial

38

coronariana, hipertensão e DM2, o tratamento com a L-Arg não foi capaz de

melhorar a função endotelial da artéria braquial dos pacientes portadores do DM1.

Finalmente, estudos através da infusão venosa e arterial da L-Arg em seres

humanos têm mostrado que a função endotelial é melhorada em sujeitos com

hipercolesterolemia, doença arterial coronariana, hipertensão e diabetes. Entretanto

sua eficácia ainda não foi comprovada no tratamento em longo prazo em diferentes

estados patológicos e até o momento parece que os pacientes com

hipercolesterolemia respondem melhor ao tratamento. O tratamento em longo prazo

com a L-Arg parece ser seguro, já que não foram observados efeitos adversos com 30

g de L-Arg na infusão venosa e na dose oral de 9 g/dia em adultos saudáveis (SHAO;

HATHCOCK, 2008). No entanto, doses orais mais elevadas são associadas

ocasionalmente com náusea, desconforto gastrointestinal e diarréia (GRIMBLE,

2007). Em contraste com os estudos em animais, os resultados em humanos são

variados, possivelmente devido aos pequenos tamanhos de amostra e o curto período

de tratamento. Desta forma, ainda existe a lacuna sobre os benefícios que o

tratamento com a L-Arg pode trazer para a saúde vascular nos diversos estados

patológicos em humanos.

2.5 Exercício Físico (EF)

Cada vez mais ocorre uma maior interação multidisciplinar entre o médico

especialista e os vários profissionais da área da saúde (educadores físicos,

nutricionistas e psicólogos). Profissionais estes que auxiliam o diabético facilitando a

adesão ao tratamento e, consequentemente, atenuando a progressão do diabetes e as

suas complicações (SBD, 2007).

Entre estas abordagens multidisciplinares o exercício físico regular (EF)

confere benefícios diretos e/ou indiretos que auxiliam na redução do risco

cardiovascular global dos pacientes diabéticos (LI et al., 2003; SBD, 2007). O EF

prioritariamente aeróbio (EA) é caracterizado pela realização de movimentos cíclicos

que demonstra provocar alterações benéficas no estado glicêmico, perfil lipídico, na

resistência a insulina, na função renal, na hemoglobina glicada, na função

autonômica e na função endotelial do paciente diabético (FUCHSJÄGER-MAYRL

39

et al., 2002; HORDERN et al., 2008; HOWLEY, 2001; HOWORKA et al., 1997;

JESSEN, N.; GOODYEAR, 2005; MOSHER et al., 1998; O'DONOVAN et al.,

2005).

Desta forma, para o tratamento não-medicamentoso do diabético é sugerido

EA regular. Recentemente, o exercício resistido (ER) popularmente chamado de

musculação, foi sugerido em diretrizes nacionais como uma alternativa para o

tratamento do DM (SBD, 2007). O ER proporciona o metabolismo energético

prioritariamente anaeróbio e caracteriza-se pela execução de movimentos

intermitentes em que os músculos de um segmento específico do corpo estão

contraídos contra uma força que se opõe ao movimento (HOWLEY, 2001).

Na literatura o ER demonstra ser benéfico na melhora da ação insulínica, no

ganho de massa muscular, na redução da massa gorda, no controle glicêmico e na

redução da pressão arterial em indivíduos com DM2 (CASTANEDA et al., 2002;

DUNSTAN et al., 2002; SIGAL et al., 2007). Entretanto, são pouco consistentes os

dados na literatura com relação aos benefícios do ER em pacientes com DM1 (DE

ANGELIS et al., 2006).

2.5.1 Exercício Físico e Função Vascular

2.5.1.1 Estudos Experimentais

Até a década de 90 não eram conhecidos quais os fatores que estariam

envolvidos nos efeitos benéficos do EF sobre o endotélio. Após a descoberta da

molécula de NO, diversos trabalhos foram realizados avaliando os efeitos do EF

sobre as células endoteliais. Foi observado que o aumento do fluxo sanguíneo na

parede das células endoteliais é o estímulo fisiológico ideal para a produção dos

EDRFs (DELP et al., 1993; HIGASHI et al., 1999; ROBERTS et al., 1999; SESSA

et al., 1994).

O endotélio está localizado em uma posição estratégica, entre o sangue e o

músculo liso vascular, e este responde às mudanças no estresse de cisalhamento

ocorrendo uma série de sinais químicos que produz EDRFs e os mesmos atuam

regulando o tônus do músculo liso vascular (JASPERSE; LAUGHLIN, 2006; PAN,

2009). O EF promove o aumento do shear stress melhorando a biodisponibilidade do

40

NO e estudos mostram que o shear stress induzido pelo EA é um poderoso estímulo

para a produção dos EDRFs (KINGWELL, 2000; KURU et al., 2002; WHYTE;

LAUGHLIN, 2010; ZAGO; ZANESCO, 2006).

Xiang e colaboradores (2005) observaram os efeitos do EA na função

microvascular de ratos Zucker obesos, um modelo experimental do DM2. Os ratos

treinaram o EA com uma rotina de 4-5x/semana, na velocidade de 24 m/min,

caracterizando um protocolo de curta duração. No grupo obeso EA quando

comparado com o grupo obeso sedentário apresentou redução plasmática da glicose

sanguínea, insulina, interleucina 6 e melhora nos vasorrelaxamentos da

microcirculação do músculo trapézio. Estes resultados sugerem que o EA de curta

duração pode melhorar a função vascular da microcirculação.

Um protocolo de EA com uma duração de 7 semanas, demonstrou que uma

intensidade moderada, 60 min, foi capaz de reduzir o estresse oxidativo, reduzir a

hiperglicemia e aumentar a biodisponibilidade de NO em artéria aorta de ratos com

DM2. Quando compararam os ratos DM2 treinados com os DM2 sedentários,

concluíram que o EA reverteu à DE promovida pelo diabetes e este efeito pode ter

sido provocado por uma maior biodisponibilidade de NO e redução do stress

oxidativo (MOIEN-AFSHARI, 2008). Em outro modelo de DM2 experimental, os

ratos Goto-Kakizaki foram submetidos ao EA durante 9 semanas, 5x/semana, por 60

min e com uma intensidade de 50% do consumo máximo de oxigênio (VO2Máx).

Verificaram que 9 semanas de EA foi capaz de elevar a expressão da eNOS e reduzir

o estresse oxidativo nas células endoteliais estudadas, corroborando com o estudo

citado anteriormente (GRIJALVA et al, 2008).

Estudos com protocolos de treinamento em longo prazo, 16 e 24 semanas,

corroboraram com os achados de outros estudos com protocolos de curta duração.

Sakamoto e colaboradores (1998) verificaram que o DM2 (Otsuka Long-Evans

Tokushima Fatty rat) reduziu os vasorrelaxamentos da aorta em ratos e que o EA de

16 semanas melhorou a função vascular dos ratos diabéticos. O treinamento também

aumentou a sensibilidade insulínica e reduziu os níveis plasmáticos de glicose. Outro

grupo constatou que a aorta torácica e a artéria mesentérica de ratos com DM2

(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rat) tinham reduzido a resposta à ACh e

também tinham a produção endotelial de NO e EDHF reduzidas. O EA de 24

41

semanas aumentou o relaxamento para a ACh devido a uma maior produção de NO e

EDHF (MINAMI et al., 2002).

Até o momento o EA em curto e longo prazo parece modificar de forma

benéfica os parâmetros cardiovasculares e bioquímicos em ratos com DM2.

Entretanto, a falta de estudos sobre os efeitos do ER em modelos animais com DM2

deixa uma lacuna no conhecimento sobre o potencial terapêutico do ER frente às

complicações geradas pelo DM2. A administração de estreptozotocina (STZ) ou

aloxano (ALX) é frequentemente utilizado para a indução do DM1 (DE ANGELIS et

al., 2002b; LENZEN, 2008; SZKUDELSKI, 2001). Esses animais apresentam muitas

alterações semelhantes às observadas em humanos com DM1, tais como

hiperglicemia, deficiência na secreção de insulina, glicosúria, poliúria, perda de peso,

neuropatia, nefropatia e cardiopatia (LENZEN, 2008; VERSPOHL, 2002).

Em estudos com ratos induzidos ao DM1 com estreptozotocina (STZ) foi

verificado uma melhora nos vasorrelaxamentos da artéria basilar (reatividade

cerebrovascular) com 4 semanas de EA (MAYHAN et al., 2004). Em outro estudo,

também com ratos STZ, foi observado que o EA com intensidade moderada e 10

semanas de treinamento, melhorou os vasorrelaxamentos da microcirculação cutânea

dos ratos diabéticos treinados (HEIDARIANPOUR et al., 2007). Para reforçar estes

dados, alguns estudos utilizando o modelo de DM1 induzido por STZ demonstravam

que o EA por 10 semanas promoveu uma melhora nas alterações da freqüência

cardíaca intrínseca, no tônus vagal e no controle reflexo cardiovascular (barorreflexo

e quimiorreflexo) (DE ANGELIS et al., 2000; DE ANGELIS et al., 2002a; DE

ANGELIS et al., 2002b).

É visto também em protocolos de longa duração (24 semanas) com ratos STZ

que o EA de baixa intensidade, 5x/semana, por um período de 30 min/dia, reduz

significativamente os níveis de glicemia, pressão arterial, hipertrofia do ventrículo

esquerdo, adesão leucocitária nas células endoteliais e os índices de DE, por meio de

um aumento no fluxo sanguíneo e maior atividade antioxidante. Este estudo sugere

também, que o EA de baixa intensidade pode ser uma terapia preventiva frente às

complicações cardiovasculares do diabetes (CHAKRAPHAN, 2005).

Apesar de poucos estudos publicados, o ER parece promover benefícios para

os animais induzidos ao DM1. Farrell e colaboradores (1999) demonstraram que 8

semanas de ER em ratos com DM1 induzidos por STZ reduziu a glicemia associada

42

ao ganho de massa muscular nos animais tratados. Em estudos recentes do nosso

laboratório, pôde ser observado que ER de intensidade moderada, durante 8 semanas

e 3x/semana foi capaz de prevenir a hipertensão secundária, reduzir glicemia, pressão

sistólica, aumentar a sensibilidade barorreflexo e restaurar os vasorrelaxamentos

induzido por ACh em anéis isolados de artéria mesentérica superior em ratos com

DM1 induzidos por ALX (BARRETO, 2010; MOTA, 2010). Apesar destes achados,

são necessários mais estudos para compreender os mecanismos e os benefícios do

ER sobre a prevenção e o tratamento do animal induzido ao DM1.

2.5.1.2 Estudos Clínicos

Estudos em pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, doença arterial

coronária e diabetes, sugerem que a melhora da função endotelial pode ser um alvo

terapêutico para reduzir o desenvolvimento de sintomas da doença ou eventos

clínicos (IFRIM; VASILESCU, 2004; JIN et al., 2008; JOHN; SCHMIEDER, 2000;

POREDOS et al., 2006; SCHACHINGER et al., 2000). As mudanças no estilo de

vida tais como o EF, podem influenciar na função endotelial e por sua vez, reduzir o

risco cardiovascular. Tem sido demonstrado que o EF pode melhorar a função

endotelial em pacientes com insuficiência cardíaca crônica, hipercolesterolemia,

síndrome plurimetabólica, hipertensão e diabetes (FUCHSJÄGER-MAYRL et al.,

2002; HAMBRECHT et al., 1998; HIGASHI, et al., 1999; LAVRENCIC et al.,

2000; LEWIS et al., 1999).

A DE tem sido implicada na gênese da aterosclerose e no DM possivelmente

ocorre devido à consequências metabólicas provocadas pela doença e em particular

pela hiperglicemia crônica (BAKKER, 2009; BERTOLUCI et al., 2008;

WAJCHENBERG, 2002). Em pacientes com DM2, Hordern e colaboradores (2008)

demonstraram que o EA de intensidade moderada, feito 3x/semana e com duração de

4 semanas foi capaz de melhorar a aptidão cardiorrespiratória, o índice de massa

corporal e os triglicerídeos. Foi observada também uma redução significativa na

glicose plasmática e na hemoglobina glicada.

Em um recente estudo, elaborado por Sixt e colaboradores (2010), avaliou os

efeitos de uma intervenção multidisciplinar em curto e longo prazo com o foco no

43

EA em pacientes com DM2 e que possuíam doença arterial coronariana avançada.

Este estudo demonstrou que o EA feito em bicicleta ergométrica, 6x15 min/dia,

5x/semana, com uma intensidade leve, durante 4 semanas (curto prazo) não foi capaz

de alterar a função endotelial da artéria coronária, no entanto, foi encontrada uma

redução nos valores da glicose em jejum, hemoglobina glicada, proteína C reativa,

colesterol total e LDL. Já a intervenção feita com o período de 6 meses (longo

prazo), 30 min de esteira ergométrica/dia, 5x/semana, com uma intensidade leve e

mais 60 min de ginástica em grupo/semana melhorou significativamente a função

endotelial coronariana e todos os parâmetros metabólicos avaliados no protocolo de 4

semanas. Estes resultados sugerem que o EA é capaz de melhorar os parâmetros

metabólicos do paciente com DM2 em curto prazo e somente em longo prazo pode

alterar a função endotelial da artéria coronária de forma significativa.

É também documentado na literatura que quando associado o EA ao ER pelo

período de 8 semanas existe uma melhora na função endotelial da artéria braquial de

pacientes com DM2 (MAIORANA et al., 2001). O ER sozinho parece ser capaz de

melhorar também a ação da insulina, contribuir no ganho de massa muscular, reduzir

a massa gorda, controlar glicemia e reduzir a pressão arterial em indivíduos com

DM2 (CASTANEDA et al., 2002; DUNSTAN et al., 2002; IRVINE; TAYLOR,

2009; SIGAL et al., 2007).

Como o DM2 caracteriza-se predominantemente por resistência à insulina,

nesses pacientes observa-se mais facilmente o efeito benéfico dos exercícios sobre o

controle glicêmico (DE ANGELIS et al., 2006). Já nos pacientes com DM1 os

estudos são divergentes e na sua maioria demonstram que o EA não reduz de forma

efetiva a glicose plasmática e a hemoglobina glicada, apesar destas evidências,

constata-se melhora na resistência a insulina (DEFRONZO et al., 1982; RAMALHO

et al., 2006; WASSERMAN; ZINMAN, 1994; YKI-JÄRVINEN et al., 1984;

ZINMAN et al., 1984).

Em contraste, resultados benéficos sobre a hemoglobina glicada são

observados em adolescentes com DM1 após 12 semanas de atividades recreativas

vigorosas, por 30 min e 3x/semana (CAMPAIGNE et al., 1984). Resultados similares

foram demonstrados por Valério e colaboradores (2007), onde verificaram que o EF

por meio da participação em atividades esportivas está associado à melhora do

controle metabólico, avaliado pela hemoglobina glicada. Um estudo publicado por

44

Mosher e colaboradores (1998) demonstrou os efeitos benéficos sobre a hemoglobina

glicada, a resistência cardiorrespiratória, força muscular, perfil lipídico e a regulação

da glicose plasmática de 10 pacientes com DM1 após 12 semanas de EA em circuito

calistênico com ritmo vigoroso e frequência de 3x/semana.

Parece também que o EA no paciente com DM1 pode trazer benefícios

vasculares independente do nível de glicose no sangue e, aparentemente, não se

limita aos leitos vasculares próximos dos músculos exercitados. Fuchsjäger-Mayrl e

colaboradores (2002) estudaram 26 pacientes com DM1 durante 4 meses que

participaram de um programa de EA 3x/semana, com 60 a 70% da freqüência

cardíaca máxima e duração de 40 min/dia. Eles observaram que o EA após 4 meses

melhorou a função endotelial da artéria braquial e a rede vascular dos olhos,

entretanto não foi observada mudança significativa na hemoglobina glicada.

Deve-se ressaltar que não foi encontrado na literatura os benefícios

metabólicos e vasculares do ER na promoção da saúde em pacientes com DM1.

Entretanto, apesar do ER demonstrar um importante potencial terapêutico em

algumas doenças, o ER agudo e crônico em pessoas saudáveis induz aumento da

rigidez arterial (DEVAN et al., 2005; HEFFEMAN et al., 2007; MIYACHI et al.,

2004). No entanto, estes achados não têm sido consistentes.

Rakobowchuk e colaboradores (2005) não observaram aumento de rigidez

arterial da artéria carótida após 12 semanas de ER intenso com jovens do sexo

masculino. Os resultados sobre a rigidez arterial são controversos e necessitam de

mais investigações já que o ER tem demonstrado diversos benefícios em condições

saudáveis e em diferentes estados de doença, além do que, atualmente é sugerido

como um tratamento não-medicamentoso por diretrizes nacionais (DBH V, 2006;

DBH VI 2010; SBD, 2007).

2.6 L-arginina, Exercício Físico e Função Vascular

A L-Arg têm tido destaque no meio científico em relação ao seu efeito

promissor no aumento da biodisponibilidade de NO em diversos tecidos, de forma

mais substancial nos vasos sanguíneos. Existem evidências de que a L-Arg aumenta

a captação de glicose durante o EF prolongado, reduz lipólise e que o tratamento oral

45

de L-Arg pode interagir com o EF para aumentar os seus efeitos benéficos

(MCCONELL et al., 2007).

A eficiência do tratamento com a L-Arg em resposta ao EF vem sendo

demonstrada em diversos estados de doença. Sugere-se que o tratamento oral com L-

Arg melhora a capacidade aeróbia em pacientes com doenças cardiovasculares

coronariana, angina estável, hipertensão arterial pulmonar e insuficiência cardíaca

congestiva (CEREMUZYNSKI et al., 1997; CHENG; BALDWIN, 2001; NAGAYA

et al., 2001; RECTOR et al., 1996).

Doutreleau e colaboradores (2006) trataram com L-Arg por 6 semanas

pacientes com insuficiência cardíaca crônica e observaram um aumento na tolerância

ao EA prolongado, redução da frequência cardíaca e do lactato circulante. Os autores

sugerem que o tratamento com a L-Arg pode ser um complemento terapêutico, a fim

de melhorar a aptidão física do paciente. Em um estudo experimental, o tratamento

em longo prazo com L-Arg (6% na água de beber) aumentou a capacidade aeróbia

durante o exercício de esteira em camundongos hipercolesterolêmicos e esta melhora

possivelmente esteja ligada ao aumento de NO endotelial encontrado no estudo

(MAXWELL et al., 2001).

Foi demonstrado que 21 dias de tratamento oral com L-Arg (8,3 g/dia)

aumentou os efeitos benéficos da dieta hipocalórica e do programa de EA no

metabolismo da glicose, sensibilidade à insulina e nos marcadores de estresse

oxidativo em pacientes com DM2 (LUCOTTI et al., 2006). A redução do estresse

oxidativo vista neste estudo é benéfica já que quando as células endoteliais são

expostas a níveis excessivos de espécies reativas de oxigênio ocorre uma redução da

biodisponibilidade de NO endotelial, diminuindo o efeito de vasorrelaxante e

aumentado o efeito vasoconstritor (COSENTINO et al., 1994; MCINTYRE et al.,

1999).

É importante destacar que até o momento não foram encontrados na literatura

estudos que apontem os benefícios metabólicos e vasculares da associação do

tratamento oral com L-Arg e ER na promoção da saúde em pacientes com DM1 e

DM2. Entretanto, um estudo recente avaliou efeito do tratamento com L-Arg (7 g)

associado a uma única sessão de ER sobre a função vascular e as respostas

hemodinâmicas. Os resultados demonstraram que a L-Arg associada ao ER não teria

nenhum efeito sobre a resposta hemodinâmica e vascular de pessoas saudáveis. Os

46

autores sugerem que outras vias envolvidas na vasodilatação possam mascarar os

efeitos da L-Arg e possivelmente a via da L-Arg/NO contribua pouco para a

vasodilatação pós-exercício (FAHS et al., 2009). Poucas pesquisas foram realizadas

para examinar o efeito do tratamento com L-Arg sobre o metabolismo do EF. Mais

estudos são necessários para elucidar o potencial ergogênico e terapêutico da L-Arg

associado ao ER.

47

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar os efeitos da L-arginina (L-Arg), do exercício resistido (ER), e da L-

Arg associada ao ER, sobre a reatividade vascular em artéria mesentérica de ratos

diabéticos.

3.2 Objetivos específicos

Caracterizar as respostas vasculares relacionadas aos fatores relaxantes

derivados do endotélio (EDRFs) em anéis isolados da artéria mesentérica de ratos:

- Diabéticos induzidos por aloxano;

- Diabéticos tratados com a L-Arg e o ER, separadamente;

- Diabéticos tratados com a L-Arg associada ao ER.

48

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados 32 ratos Wistar machos (Rattus norvegicus), com idade de 3

meses, pesando entre 250g e 300g, provenientes do Biotério Central da UFS. Os

animais foram acomodados em número de 4 animais por caixa retangular grande,

mantidos sob condições ambientais de temperatura (22 ± 1ºC) e ciclo claro-escuro

de 12 horas, tendo livre acesso à alimentação e água. Os animais receberam água de

torneira e foram alimentados com ração específica para roedores, Labina (Purina®).

Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo Comitê

de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Sergipe, Brasil (protocolo

45/08).

4.2 Drogas

As drogas utilizadas foram: L-fenilefrina (FEN, agonista α1 adrenérgico),

cloreto de acetilcolina (ACh, agonista muscarínico não-seletivo), NG-nitro L-

arginina metil éster (L-NAME, inibidor da sintase do óxido nítrico endotelial),

indometacina (INDO, inibidor não-seletivo da ciclo-oxigenase), tetraetilamônio

(TEA, bloqueador de canais para K+ ativados por Ca2+ de alta condutância), aloxano

(ALX, agente diabetogênico) e L-arginina ≥ 98,5% (L-Arg, aminoácido precursor

do óxido nítrico) (Todos da Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA).

4.3 Delineamento experimental

Os animais foram divididos em 7 grupos:

1) Controle (CON, n = 4) – composto por animais saudáveis e sedentários

tratados somente com água da torneira;

49

2) Estimulado Eletricamente (EE, n = 4) – composto por animais saudáveis e

sedentários tratados somente com água da torneira e que foram estimulados

eletricamente sem executar o exercício;

3) Controle Treinado (CT, n = 4) - composto por animais saudáveis tratados

somente com água da torneira e que foram treinados com exercício resistido através

de estimulos elétricos;

4) Diabético Sedentário (DS, n = 5) - composto por animais diabéticos e

sedentários tratados somente com água da torneira;

5) Diabético L-arginina (DL-Arg, n = 5) - composto por animais diabéticos e

tratados com L-arginina;

6) Diabético Treinado (DT, n = 5) composto por animais diabéticos tratados

somente com água da torneira e que foram treinados com exercício resistido através

de estimulos elétricos;

7) Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg, n = 5) - composto por

animais diabéticos tratados com L-arginina e que foram treinados com exercício

resistido através de estimulos elétricos;

Os animais do CON, EE, DS e DL-Arg foram mantidos em suas caixas sem

exposição ao treinamento, enquanto que os animais do CT, DT e DT + L-Arg foram

submetidos a 8 semanas de exercício resistido.

4.4 Indução do diabetes

Para a indução do diabetes experimental, os ratos, depois de permanecerem

12 horas em jejum, foram anestesiados. Após constatar que o animal estava

anestesiado, foi administrado aloxano (ALX, 40 mg/kg de peso), dissolvida em

tampão citrato com 0,01 M e um pH de 4,5, injetada na veia dorsal do pênis. Os ratos

foram recolocados nas gaiolas com alimento e solução glicosada a 15% no primeiro

dia após o aloxano (CAVALLI et al., 2007; LUCIANO; LIMA, 1997; LUCIANO;

ROSTOM DE MELLO, 1998).

A comprovação do diabetes foi realizada uma semana após da administração

do ALX, através da determinação da glicemia. Foram selecionados como diabéticos,

ratos que apresentarem glicemia ≥ 200 mg/dL. Estes parâmetros foram medidos

50

utilizando a técnica de fitas reagentes (URIQUEST. CAT 100, LABTEST e ACCU-

CHEK Advantage II, Roche, respectivamente) (LUCIANO; ROSTOM DE MELLO,

1998).

4.5 Tratamento com L-arginina

Os grupos DL-Arg e DT + L-Arg receberam a L-Arg através da água de

beber na concentração de 1,25 mg/ ml durante as 8 semanas de tratamento

(ÖZÇELIKAY et al., 1999; ÖZÇELIKAY et al., 2000). Esta concentração é

considerada segura, pois a tolerância da administração oral para ratos é de 2,14 g/ kg

de peso corporal/ dia (WU et al., 2007). Os animais foram mantidos em caixas

coletivas com 4 animais, uma vez que não existem diferenças na ingesta da ração e

água entre caixas individuais ou coletivas de ratos tratados com L-Arg (CASTRO-

BARBOSA et al., 2006; KOHLI et al., 2004).

4.6 Tratamento com exercício resistido

O treinamento resistido foi realizado em aparelho de agachamento segundo

modelo de Tamaki et al., 1992. Os animais dos grupos CT, DT e DT + L-Arg, após 1

semana de habituação, foram treinados através de 3 séries de 10 repetições, com

intervalos de repouso de 60 s, e intensidade de 50% da carga estabelecida através do

teste de uma repetição máxima (1RM), 3 vezes por semana (SBD, 2007). A carga de

treinamento e a intensidade foram reajustadas a cada 2 semanas através de um novo

teste de 1RM. O grupo EE recebeu a mesma intensidade do estímulo e o mesmo

número de séries e repetições que os grupos treinados, mas sem carga de treinamento

e movimento do exercício. Os grupos CON, DS e DL-Arg foram manipulados e

fixados ao aparelho 3 vezes por semana, durante 5 min sem a aplicação de estímulo

elétrico.

Os parâmetros de estimulação elétrica foram realizados conforme descrito em

Barauna et al., 2005. Os animais foram estimulados a executar as séries através da

aplicação de estímulos elétricos (20 V, 0.3 s de duração, 3 s de intervalo) por

eletrodos (ValuTrode, Modelo CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, EUA) fixados na

51

cauda e conectados a um eletroestimulador (BIOSET, Physiotonus Four, Modelo

3050, Rio Claro, SP, Brasil).

4.7 Avaliação do vasorrelaxamento dependente de endotélio

O vasorrelaxamento dependente de endotélio foi avaliado utilizando anéis de

artéria mesentérica superior de rato preparado conforme descrito em Menezes et al.,

2007. Após o sacrifício dos animais, anéis do primeiro segmento da artéria

mesentérica superior (1 - 2 mm) foram obtidos livres de tecido conjuntivo e adiposo,

e foram mantidos em cubas contendo 10 mL de solução de Tyrode (concentração em

mM: NaCl 158.3, KCl 4.0, CaCl2 2.0, NaHCO3 10.0, C6H12O6 5.6, MgCl2 1.05 and

NaH2PO4 0.42), a 37º C e gaseificada com uma mistura carbogênica (95% de O2 e

5% de CO2). Os anéis foram suspensos por linhas de algodão fixadas a um transdutor

de força (Letíca, Modelo TRI210, Espanha). As tensões isométricas foram

registradas através de um sistema de aquisição (BD-01, AVS, SP, Brasil). Cada anel

foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de no mínimo 60

minutos (período de estabilização). A funcionalidade do endotélio foi verificada pela

habilidade medida em percentagem (%), de 10 µM de ACh em relaxar mais do que

75% os anéis pré-contraídos com 10 µM de FEN. A ausência ou valores menores do

que 75% do relaxamento à ACh foi considerado como prova de que os anéis eram

sem endotélio funcional (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980).

O vasorrelaxamento dependente de endotélio foi obtido em anéis pré-

contraídos com FEN (10 µM) pela adição à cuba de concentrações crescentes e

cumulativas de ACh (10-9 - 10-4 M). Após isto, curvas concentração-respostas foram

construídas na condição controle ou na presença dos seguintes inibidores: L-NAME

(100 µM), L-NAME + INDO (10 µM) e L-NAME + INDO + TEA (1 µM).

4.8 Analíses estatísticas

Os valores foram expressos como a média ± erro padrão da média (E.P.M.).

Os valores de pD2 dos experimentos in vitro foram calculados pelo logarítmo

negativo da EC50 obtida através de regressão não-linear das curvas concentração-

52

resposta. Para avaliar a significância das diferenças entre as médias foram utilizados

os testes t de Student (pareado e não-pareado) e a análise de variância (ANOVA) de

uma via ou duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni. Os valores foram

considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05. Para todos estes

procedimentos foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism versão 3.02

(GraphPad Software, San Diego,CA, E.U.A.).

53

5 RESULTADOS

5.1 Peso corporal

O peso corporal dos animais no início do estudo foi similar em todos os

grupos (Tabela 1). Após as 8 semanas de estudo, apenas os animais do DS reduziram

significativamente (p < 0,001) seu peso corporal quando comparado ao CON. Uma

análise comparativa dos valores iniciais e finais entre todos os grupos demonstrou

que os animais do CON, EE e CT apresentaram um aumento significativo (p < 0,001

e p < 0,05; respectivamente) do peso corporal. Já os animais do grupo DS e DT

apresentaram uma redução significativa (p < 0,01 e p < 0,001) deste parâmetro. Além

disso, os animais tratados com L-Arg mantiveram seu peso corporal (Tabela 1).

5.2 Glicemia

As variações de glicemia antes e após as 8 semanas do experimento estão

mostradas na Tabela 1. No início do estudo, o DS apresentou um aumento

significativo (p < 0,001) da glicemia quando comparado com o CON. Após as 8

semanas de tratamento, não foram observadas variações nas glicemias dos animais

CON, EE, CT e DL-Arg (Tabela 1). Os animais DS e DT apresentaram um aumento

significativo (p < 0,01 e p < 0,05; respectivamente) em seus níveis glicêmicos. Além

disso, os animais DT + L-Arg apresentaram uma redução significativa (p < 0,01)

deste parâmetro.

5.3 Teste de uma repetição máxima

Como demonstrado na Tabela 1, no início dos experimentos foi observado

uma redução significativa (p < 0,05) nos níveis de força (carga de 1RM) do DS

quando comparado com o CON. Após as 8 semanas de estudo, apenas os animais do

grupo CT, DL-Arg e DT + L-Arg obtiveram um aumento significativo (p < 0,05; p <

0,05 e p < 0,01; respectivamente) nos níveis de força (Tabela 1).

54

Tabela 1- Variação do peso corporal, glicemia e do teste de 1 RM dos ratos no início e ao final de 8 semanas de protocolo experimental.

Rodapé: Grupo Controle (CON), Estimulado Eletricamente (EE), Controle Treinando (CT), Diabético Sedentário (DS), Diabético + L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). O número de animais utilizados está representado entre parênteses. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de student pareado (intra-grupo) ou pela ANOVA de uma-via seguido do pós-teste de Bonferroni (inter-grupo). *p < 0,05 e ***p < 0,001 vs CON; a p < 0,05; b p < 0,01 e c p < 0,001 valores iniciais vs valores finais. 1 RM: Teste de uma repetição máxima.

5.4 Vasorrelaxamento dependente de endotélio

A ACh foi capaz de induzir vasorrelaxamento dependente da concentração

em anéis isolados de artéria mesentérica superior com endotélio intacto de todos os

grupos (Fig. 5, 6 e 7). Não foram observadas diferenças entre as pD2 (CON: 6,9 ±

0,11; CT: 6,7 ± 0,09), entretanto, existiu uma redução significativa (p < 0,05) na

Rmax do CT quando comparado ao CON (Fig. 5).

Grupos Semanas Peso corporal (g) Glicemia (mg/dL) 1 RM (g)

CON (4) 0 264 ± 20,4 82 ± 1,7 1525 ± 47,8

8 316 ± 21,2c 75 ± 5,3 1675 ± 103,0

EE (4) 0 262 ± 6,8 83 ± 2,3 1500 ± 105,4

8 306 ± 16,8a 77 ± 4,1 1625 ± 151,0

CT (4) 0 277 ± 8,3 72 ± 5,0 1550 ± 119,0

8 308 ± 14,5a 75 ± 3,1 2175 ± 47,8a

DS (5) 0 253 ± 7,4 411 ± 24,2*** 1037 ± 98,1*

8 219 ± 2,2***, b 478 ± 14,9b 1050 ± 56,7

DL-Arg (5) 0 256 ± 6,8 435 ± 30,7 967 ± 95,4

8 252 ± 3,9 477 ± 18,7 1166 ± 98,9a

DT (5) 0 252 ± 3,2 364 ± 22,1 1040 ± 18,3

8 211 ± 3,3 c 479 ± 24,7 a 1100 ± 52,7

DT+L-Arg (5) 0 250 ± 5,7 421 ± 45,5 1050 ± 84,6

8 246 ± 11,9 338 ± 37,9b 1250 ± 111,8b

55

Figura 5 – Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e Controle Treinado (CT). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste t de student não pareado.

Da mesma forma, foi observada uma redução significativa (p < 0,05) na

Rmax do DS quando comparado com o CON (Fig. 6). Não foram observadas

diferenças entre as pD2 (CON: 6,9 ± 0,11; DS: 6,8 ± 0,12) (Fig. 6).

Figura 6 – Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e Diabético Sedentário (DS). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste t de student não pareado.

456789

0

25

50

75

100

125

CON (Rmax= 114,2 ± 4.0%)

CT (Rmax= 98,39 ± 2,8%)

*

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

456789

0

25

50

75

100

125

CON (Rmax= 114,2 ± 4.0%)

DS (Rmax= 101,5 ± 3,2%)

*

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

56

Por outro lado, não foram observadas diferenças entre as pD2 (CON: 6,9 ±

0,11; DS: 6,8 ± 0,12) (Fig. 7). Além disso, foi observado uma redução significativa

(p < 0,001) da pD2 (de 6,8 ± 0,12 para 6,2 ± 0,11) do DL-Arg quando comparado

com o DS. Já os demais grupos diabéticos não apresentaram diferenças na pD2 (DT:

6,9 ± 0,09; DT + L-Arg: 6,7 ± 0,09) e nem na Rmax (Fig. 7).

Figura 7 – Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM). Anéis obtidos de ratos dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

5.5 Efeito do L-NAME, INDO e TEA sobre o vasorrelaxamento induzido por

ACh

Como observado na tabela 2, o L-NAME (100 µM) foi capaz de reduzir

significativamente o vasorrelaxamento induzido por ACh em todos os grupos.

Porém, o grupo diabético tratado somente com L-Arg (DL-Arg), esta redução (p <

0,001) foi muito mais pronunciada quando comparado com o DS (Fig. 8).

456789

0

25

50

75

100

125

DS (Rmax= 101,5 ± 3,2%)

DL-Arg (Rmax= 100,9 ± 4,0%)

DT (Rmax= 101,7 ± 3,0%)

DT+L-Arg (Rmax= 108,9 ± 3,0%)

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

57

Tabela 2- Valores de pD2 e Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior de ratos com endotélio intacto pré-contraídas com FEN (10 µM) antes e após o pré-tratamento com L-NAME.

Os anéis isolados foram obtidos de ratos dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético + L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Experimentos foram realizados na ausência de L-NAME (ACh) e na presença de 100 µM de L-NAME (L-NAME). Os dados representam as médias ± E.P.M. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de student pareado. *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001 para valores ACh vs L-NAME. ---: os pontos não convergiram sobre a curva.

Figura 8- Efeitos do L-NAME sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Grupos Condição n pD2 Rmax (%)

DS ACh 7 6,8 ± 0,12 101,5 ± 3,2

L-NAME 7 6,0 ± 0,14*** 85,7 ± 4,9*

DL-Arg ACh 7 6,2 ± 0,11 100,9 ± 4,0

L-NAME 7 --- -2,9 ± 4,1***

DT

ACh 7 6,9 ± 0,09 101,7 ± 3,0

L-NAME 7 5,8 ± 0,20*** 75,3 ± 6,2**

DT + L-Arg

ACh 7 6,7 ± 0,09 108,9 ± 3,0

L-NAME 7 5,4 ± 0,14*** 69,2 ± 4,3***

456789

-25

0

25

50

75

100

DS (Rmax= 85,75 ± 4,9%)

DL-Arg (Rmax= -2,9 ± 4,1%)

DT (Rmax= 75,28 ± 6,2%)

DT+L-Arg (Rmax= 69,20 ± 4,3%)

*** ******

**

**

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

58

Após a adição de L-NAME + INDO (10 µM) o grupo DL-Arg apresentou não

somente um bloqueio, mas sim, uma reversão significativa (p < 0,01 e p < 0,001)

dos vasorrelaxamentos induzidos por ACh quando comparado com o grupo DS (Fig.

9). Além disso, o grupo DT + L-Arg apresentou uma redução significativa (p <

0,001) apenas na última concentração quando comparado com o DS (Fig. 9).

Figura 9- Efeitos do L-NAME + INDO sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Já a presença de L-NAME + INDO + TEA (1 µM) (Fig. 10), o grupo DL-Arg

apresentou na sua curva uma reversão significativa (p < 0,001) dos

vasorrelaxamentos induzidos por ACh quando comparado com o grupo DS. Os

grupos DT e DT + L-Arg apresentaram uma redução significativa (p < 0,001)

somente nas duas últimas concentrações quando comparados com o grupo DS (Fig.

10). O EE não apresentou modificações em seu vasorrelaxamento quando comparado

com o CON (Tabela 3).

456789

-25

0

25

50

75

100

DS (Rmax= 58,49 ± 11,68%)

DT (Rmax= 52,13 ± 12,40%)

DT+L-Arg (Rmax= 6,0 ± 3,0%)

***

DL-Arg (Rmax= -21,4 ± 7,1%)

*****

*

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

59

Figura 10- Efeitos do L-NAME + INDO + TEA sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Tabela 3- Valores Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) construídas na condição controle ou na presença dos seguintes inibidores: L-NAME, L-NAME + INDO e L-NAME + INDO + TEA.

Os anéis isolados foram obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e Estimulado Eletricamente (EE). Experimentos foram realizados na presença de L-NAME (100 µM); na presença de L-NAME + INDO (10 µM) e na presença de L-NAME + INDO + TEA (1 µM). Os dados representam as médias ± E.P.M. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de student não pareado.

Condição CON

(n = 7) EE

(n = 7) ACh 114,2 ± 4,0 108,5 ± 4,3

L-NAME 16,7 ± 5,4 16,2 ± 5,1

L-NAME + INDO 0,5 ± 2,3 2,9 ± 4,2

L-NAME + INDO + TEA -1,5 ± 2,2 4,3 ± 3,0

456789

-25

0

25

50

75

100

DS (Rmax= 80,32 ± 6,9%)

DT (Rmax= 0,5 ± 3,4%)

******

DL-Arg (Rmax= -17,86 ± 1,3%)

DT+L-Arg (Rmax= -0,4 ± 2,3%)

*** ***

- Log [ACh] M

% d

e re

laxa

men

to

60

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, os animais do grupo CT apresentaram uma melhora no

condicionamento físico, demonstrando a eficiência do ER na condição saudável.

Estes resultados estão de acordo com aqueles encontrados por Barauna e

colaboradores (2005). De maneira semelhante, os nossos animais diabéticos tratados

com L-Arg por 8 semanas também apresentaram uma melhora em seus níveis de

força máxima. Estudos também demonstram que a administração da L-Arg pode

influenciar no desempenho do teste de 1RM de indivíduos saudáveis (CAMPBELL

et al., 2006).

Nossos resultados demonstram que 8 semanas de ER não foram capazes de

prevenir a perda de peso corporal nos animais diabéticos. A falta de condicionamento

físico nestes animais pode ter sido um dos fatores que contribuíram para a redução

encontrada no peso corporal. Achados divergentes encontrados por Harthmann e

colaboradores (2007) demonstraram que o exercício aeróbio (EA) foi capaz de

aumentar o peso corporal dos animais diabéticos e este achado foi atribuído a uma

melhora metabólica induzido pelo treinamento.

Interessantemente, os grupos tratados com L-Arg não apresentaram variações

do peso corporal entre o início e o fim do estudo. A manutenção do peso corporal

apresentada por estes animais pode ser atribuída a uma possível redução do estresse

oxidativo ocasionada por este tratamento. Estudos clínicos e experimentais sugerem

que o tratamento com L-Arg reduz a lipoperoxidação no DM (LUBEC et al., 1997a;

LUBEC et al., 1997b)

Além da lipoperoxidação, o DM apresenta um quadro de degradação protéica

(FAGAN et al., 1987; GARLICK et al., 1981). Desta forma, a L-Arg também pode

ter contribuído para a manutenção do peso corporal devido a uma manutenção da

síntese protéica. Uma vez que, evidências apontam que a L-Arg possui um

importante papel na síntese protéica e na biosíntese de outros aminoácidos

(MORRIS, 2006; WU et al., 2009). Apesar destes efeitos, o tratamento crônico por

12 semanas com a L-Arg não foi capaz de causar mudança significativa na insulina

plasmática, colesterol, triglicerídeos e glicemia nos ratos diabéticos (ÖZÇELIKAY et

al., 1999).

61

É importante ressaltar que os dados na literatura em relação aos benefícios

metabólicos ER sobre a prevenção e o tratamento do DM1, ainda não são

consistentes. Farrell colaboradores (1999) demonstram que o tratamento com ER ao

final de 8 semanas reduz a glicemia de animais com DM1. Em nosso estudo, o ER

não foi capaz de reduzir os níveis plasmáticos da glicemia, possivelmente porque os

animais diabéticos treinados não conseguiram se condicionar com o protocolo de

treinamento adotado. Interessantemente, quando o ER foi associado ao tratamento

com L-Arg foi observado uma redução na glicemia acompanhada de uma melhora no

condicionamento físico dos animais.

Pela primeira vez, foi demonstrado que o modelo de treinamento adotado no

presente estudo pode ser usado para investigar os efeitos do ER sobre a reatividade

vascular, uma vez que o grupo EE não apresentou alterações nos vasorrelaxamentos

induzidos por ACh quando comparado com o grupo CON. Este resultado sugere que

a eletroestimulação não foi capaz de proporcionar alterações na reatividade vascular

em anéis isolados de artéria mesentérica superior de ratos. Os parâmetros de

eletroestimulação utilizados no presente estudo foram adotados porque, segundo

Barauna e colaboradores (2005), não foram observadas mudanças nos níveis

plasmáticos das catecolaminas, da atividade simpática e da hipertrofia adrenal.

Apesar disto, o grupo CT apresentou uma redução nos vasorrelaxamentos

induzido por ACh quando comparado com o grupo CON, mesmo sendo um dos

grupos que apresentou uma melhora no condicionamento físico. Algumas evidências

sugerem que o ER em pessoas saudáveis tem demonstrado induzir um aumento da

rigidez arterial (HEFFEMAN et al., 2007; MIYACHI et al., 2004). No entanto, estes

achados não têm sido consistentes. Rakobowchuk e colaboradores (2005) não

observaram um aumento da rigidez na artéria carótida após 12 semanas de ER em

indivíduos saudáveis.

Alguns estudos têm demonstrado que o DM promove alterações na

vasodilatação dependente do endotélio induzidas por ACh em diferentes leitos

vasculares (COSENTINO; LUSCHER, 1998; LASH; BOHLEN, 1991). Estas

alterações parecem ser causadas tanto pela hiperglicemia, quanto pela duração do

DM (SINGH et al., 2003). Nossos animais diabéticos sedentários apresentaram

redução nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh após 8 semanas de hiperglicemia

62

severa. Isto pode ser explicado porque, de acordo com a literatura a hiperglicemia

inibe a eNOS, enzima catalisadora da síntese de NO (CAI; HARRISON, 2000).

Nossos resultados também demonstraram uma redução na sensibilidade

arterial a ACh somente no grupo diabético tratado com L-Arg. Esta redução pode ter

sido devido a uma menor participação na atividade dos receptores muscarínicos em

detrimento de outros receptores responsáveis também em ativar o NO, como por

exemplo, o NK1 e o B2, ativados pelos agonistas substância P e bradicinina

respectivamente (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009; FURCHGOTT, 1983).

Entretanto, outros experimentos são necessários para entender o efeito da redução na

sensibilidade a ACh em artéria mesentérica de ratos diabéticos.

Sabe-se que os vasorrelaxamentos induzidos por ACh ativa as cascatas

enzimáticas dos EDRFs, que são o NO, a prostaciclina (PGI2) e os fatores

hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHFs) (BUSSE et al., 2002;

MAIORANA et al., 2003; YANG et al., 2003). A participação do NO em nosso

estudo foi avaliada através das curvas concentração-resposta para ACh realizadas na

presença de L-NAME. Nesta condição experimental, foi observado que o L-NAME

foi capaz de inibir significativamente os vasorrelaxamentos induzidos por ACh de

todos os grupos, porém somente nos grupo diabéticos tratados por 8 semanas com L-

Arg (DL-Arg e DT + L-Arg) é que esta redução foi mais pronunciada. Isto demonstra

que o tratamento com L-Arg foi capaz de aumentar a participação do NO nos

vasorrelaxamentos dependentes de endotélio.

Em preparações pré-incubadas com L-NAME + INDO, os vasorrelaxamentos

induzidos por ACh no grupo diabético tratado com L-Arg, foi totalmente inibido.

Isto pode ser explicado pelo fato de que quando a eNOS e a ciclo-oxigenase se

encontram inibidas, os efeitos dos fatores contráteis derivados do endotélio são

acentuados (Shi et al., 2006). A associação do ER com a L-Arg foi capaz de

aumentar a participação da via da prostaciclina dos animais diabéticos submetidos a

esta combinação de tratamento, uma vez que em animais diabéticos a participação

desta via nos relaxamentos induzidos por ACh são reduzidos (HARRISON et al.,

1978).

Na presença dos inibidores (L-NAME + INDO + TEA), o DL-Arg apresentou

uma resposta similar a encontrada na ausência de TEA, que na concentração de 1 µM

torna-se um bloqueador seletivo de canais para K+ ativados por Ca2+ de alta

63

condutância (BKCa) (TRIGGLE et al., 2003). Além disso, foi observado que o grupo

DT demonstrou um aumento na participação dos canais BKCa. Da mesma forma,

Chen e colaboradores (2001) demonstraram que 8 semanas de EA em animais

saudáveis aumentou a participação dos canais BKCa no vasorrelaxamento em anéis

isolados de aorta e mesentérica superior. Sugerindo que tanto o EA quanto o ER são

capazes de aumentar a participação dos BKCa em artéria mesentérica.

Interessantemente, a presença dos três inibidores não foi capaz de bloquear o

vasorrelaxamento no grupo DS. Este fato ocorreu porque a concentração de TEA

adotada neste estudo é capaz de inibir somente os canais BKCa, podendo assim,

atribuir esta resposta a participação de outros tipos de canais para K+ existentes no

músculo liso vascular, como por exemplo, os canais para K+ sensíveis ao ATP

(KATP). Existem evidências demonstrando uma maior ativação destes canais como

característica das mudanças metabólicas promovidas pelo DM (CAMERON;

COTTER, 1992).

64

7 CONCLUSÕES

O presente estudo foi o primeiro a avaliar os efeitos da L-arginina (L-Arg),

do exercício resistido (ER), e da L-Arg associada ao ER, sobre a participação dos

fatores relaxantes derivados do endotélio em artéria mesentérica de ratos diabéticos.

Os resultados demonstram que:

1- Os tratamentos associados foram capazes de melhorar os níveis glicêmicos;

2- O tratamento com L-Arg foi capaz de evitar a perda de peso corporal

característico do DM1 e melhorar o condicionamento físico;

3- O ER demonstrou ser eficiente em melhorar o condicionamento dos animais

saudáveis;

4- Os resultados de reatividade vascular demonstraram que o protocolo de

exercício adotado reduziu os relaxamentos induzidos por ACh dos animais

saudáveis, possivelmente por um aumento do tônus vascular;

5- Apesar de não haver melhora nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh, o

tratamento apenas com L-Arg apresentou uma maior participação do NO no

vasorrelaxamento e quando associado ao ER foi observado uma maior

participação da PGI2;

6- O tratamento somente com ER apresentou uma maior participação do

EDHFs;

No entanto, mais estudos são necessários para melhor compreender esses

efeitos.

65

8 PERSPECTIVAS

- Caracterizar as alterações na reatividade vascular para agentes contracturantes;

- Avaliar a redução da sensibilidade a ACh encontrada no DL-Arg;

- Estudar os envolvimentos de outros canais para K+ que possam estar contribuindo

para os vasorrelaxamentos do DS.

66

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ANEXO A

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ANEXO B