UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE … · que apenas 10% do total de fêmeas bovinas em reprodução são inseminadas anualmente no Brasil (ASBIA,2012). A Instrução

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

MARIANE PACHECO DOS SANTOS LOURENCETTI

DETECÇÃO MOLECULAR DE DNA DE Brucella abortus EM SÊMEN BOVINO in

natura.

UBERLÂNDIA – MINAS GERAIS - BRASIL

2014

MARIANE PACHECO DOS SANTOS LOURENCETTI

DETECÇÃO MOLECULAR DE DNA DE Brucella abortus EM SÊMEN BOVINO in

natura.

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Ciências

Veterinárias da Universidade Federal

de Uberlândia, como requisito parcial

para obtenção do título de mestre em

Ciências Veterinárias.

Área de Concentração: Saúde Animal.

Orientadora: Professora Dra. Anna

Monteiro Correia Lima.

UBERLÂNDIA – MINAS GERAIS - BRASIL

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.

L892d 2014

Lourencetti, Mariane Pacheco dos Santos, 1984- Detecção molecular de DNA de Brucella abortus em sêmen bovino in natura / Mariane Pacheco dos Santos Lourencetti. – 2014. 66 f. : il. Orientador: Anna Monteiro Correia Lima. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Inclui bibliografia. 1. Veterinária - Teses. 2. Brucella os Aspectos moleculares - Teses. 3. Sêmen - Teses. 4. Brucelose - Teses. I. Lima, Anna Monteiro Correia. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. III. Título.

1. CDU: 619

Aos meus pais e irmãs, sempre

presentes nos melhores momentos e

nos momentos mais difíceis.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais que sempre me guiaram no caminho do estudo, da pesquisa e da

vida.

Às minhas irmãs Jandra e Candice, únicas e especiais. Não consigo imaginar minha

vida sem elas.

Aos meus cunhados Álvaro e Matt que sempre me incentivaram e aplaudiram.

À minha sobrinha Sofia, raio de sol que em certas ocasiões me fez interromper os

estudos e soltar uma sonora gargalhada.

Ao meu esposo Fábio, cujo carinho, compreensão e estímulo foram os verdadeiros

combustíveis nessa jornada.

Aos animais, aqui representados pela cadela Vida, razão primeira de minha escolha

profissional.

À minha competente orientadora, Dra. Anna Lima, pela confiança, orientação,

ensinamento constantes e, sobretudo, pela amizade.

Ao meu primo Lucas, pela grande ajuda nas ilustrações desta dissertação.

À Érica, Janise e Patrícia Brettas, grandes amigas da época da graduação e, ainda

hoje, tão queridas e presentes em minha vida.

Às amigas Dayane, Gabriela, Muriell, Pollyanna, Tatiane, cuja efetiva ajuda durante

o experimento tornou a caminhada menos árdua.

À querida amiga Mariana Assunção, cuja ajuda durante o processo de pesquisa fez

com que eu superasse inseguranças e seguisse sempre em frente.

Aos amigos do laboratório Andréia, Sílvia, João Helder, Beletim, Nádia e Danilo

pelas boas horas de convívio e pela ajuda na pesquisa.

Aos técnicos do laboratório de doenças Infectocontagiosas da FAMEV-UFU, pela

colaboração. Em especial à Marília, pela amizade.

À médica veterinária do Instituto Biológico Simone Miyashiro, pelo auxilio na técnica

de PCR.

À CAPES, CNPq (nº 64/2008) e FAPEMIG, pela concessão do apoio financeiro.

Aos familiares, amigos, professores e técnicos da Universidade Federal de

Uberlândia que contribuíram para a realização deste trabalho.

A todos, OBRIGADA.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi identificar a presença de DNA de Brucella abortus em

amostras de sêmen bovino provenientes de centrais de coleta e processamento de

sêmen (CCPS), e de fazendas. O sêmen bovino foi analisado pela Reação em

Cadeia pela Polimerase (PCR) e foram realizados os testes sorológicos Antígeno

Acidificado Tamponado (AAT) e o Sêmen Plasma Aglutinação (SPA) no soro

sanguíneo e plasma seminal, respectivamente. Foi realizada a diferenciação entre

linhagem de campo e cepa vacinal B19, com a utilização da técnica de PCR. Foram

utilizados amostras de sêmen in natura, soro sanguíneo e plasma seminal de 100

touros. Das 100 amostras analisadas com a PCR para a presença de DNA de

Brucella abortus 68 (68%) estavam positivas. Em todas as 68 amostras de sêmen

positivas quando foi realizada a diferenciação com a técnica de PCR entre linhagem

de campo e cepa vacinal B19, foram positivas para Brucella abortus cepa vacinal

B19. Todos os animais apresentaram resultado negativo no AAT e 11 (11%)

apresentaram aglutinação na SPA. Nenhum touro foi positivo nos três testes

simultaneamente. Conclui-se que mesmo touros soronegativos para brucelose

podem eliminar a bactéria no sêmen.

Palavras-chave: PCR, Sêmen, Brucelose, Touros.

ABSTRACT

The objective of this study was to identify the presence of Brucella abortus in bovine

semen specimens from central collection and processing sites and farms. The bovine

semen was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), serum blood samples and

seminal plasma were analyzed and by serological tests Rose Bengal test (RBT) and

semen plasma agglutination (SPA), respectively. In Brucella abortus positive bulls,

the use of PCR differentiated between field and vaccine strain B19. Semen samples

in nature, blood serum and seminal plasma of 100 bulls were used. Of the 100

samples analyzed by PCR for the presence of Brucella abortus DNA, 68% were

positive. Of the 68% positive, all were shown to be from the B19 vaccine. In

serological testing of the bovines, all were negative by RBT testing, and 11% showed

positive agglutination in SPA. The testing showed that none of the bovine specimens

were positive for all three tests used. Therefore, we conclude that even bulls testing

seronegative for Brucella abortus can eliminate the bacteria in the semen.

Key words: PCR, Semen, Brucellosis, Bulls.

LISTA DE ABREVIATURAS

µg = micrograma

µg/mL = micrograma por mililitro

µL = microlitro

cm = centímetros

dATP = desoxi-adenosina trifosfato

dCTP = desoxi-citosina trifosfato

dGTP = desoxi-guanosina trifosfato

DNA = ácido desoxirribonucleico

dNTPs = desoxirribonucleotídeos

dTTP = desoxi-timidina trifosfato

EDTA = ácido etileno-diamino-tetracético

et al. = e colaboradores

g = gramas

HCl = ácido clorídrico

KDa = kilodalton

L = litro

LPS = lipopolissacarídeos

M = molar

mg = miligrama

MgCl2 = cloreto de magnésio

mL = mililitro

mM = milimolar

NaCl = cloreto de sódio

Nº = número

ºC = Celsius

p/v = peso/volume

pb = pares de base

PCR = reação em cadeia pela polimerase

pH = potencial hidrogeniônico

PK = proteinase K

pmol = picomoles

RNA = ácido ribonucléico

rpm = rotações por minuto

SDS = dodecil sulfato de sódio

Taq = Thermus aquaticus

TBE = Tris-Borato-EDTA

TE = tampão TRIS-EDTA

TRIS = Tris (hidroximetil) aminometano

UI = unidade internacional

V = volts

x g = múltiplos da gravidade terrestre (9,81 m/s2)

X = vezes

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura - 1 Representação da hibridização dos “primers” específicos para

Brucella abortus biovares 1, 2 e 4 e tamanho do fragmento

amplificado..................................................................................

34

Figura - 2 Representação da hibridização dos “primers” eri e eri 2 no

genoma de Brucella spp., destacando-se a deleção genética

existente na B19, e o tamanho dos produtos

amplificados................................................................................

37

Figura - 3 Representação da hibridização dos “primers” utilizados na

hemi-nested PCR nas cepas de Brucella spp., exceto cepa

vacinal B19, e tamanho do produto amplificado..................

37

Figura - 4 Representação da hibridização do “primers” eri 1 na hemi-

nested PCR em cepa vacinal B19, e o tamanho do produto

amplificado...................................................................................

38

Figura - 5 Comprovação da especificidade dos “primers” BAB/IS711,

Uberlândia, 2014.........................................................................

40

Figura - 6 Detecção de DNA de Brucella abortus em amostras de sêmen

bovino, com os “primers” BAB e IS711, Uberlândia,

2014..............................................................................................

41

Figura – 7

Técnica de PCR com os “primers” eri 1 e eri 2,Uberlândia, 2014 ......................................................................................................

42

Figura - 8 Detecção de DNA de B. abortus cepa vacinal B19 em sêmen

bovino, Uberlândia, 2014.............................................................

43

Figura - 9 Possíveis mecanismos de transmissão de B. abortus cepa

vacinal B19 para touros e manutenção no ambiente..................

50

LISTA DE TABELAS

Tabela - 1 Situação epidemiológica da brucelose bovina em 14 estados

brasileiros...................................................................................................

18

Tabela - 2 Sequência dos “primers” utilizados na PCR para identificação de B.

abortus......................................................................................................

34

Tabela - 3 Ciclo de temperaturas para amplificação do fragmento de DNA de B.

abortus, para 40 ciclos...............................................................................

35

Tabela - 4 Sequência dos “primers” utilizados para diferenciação da cepa de B.

abortus em campo ou vacinal (B19).........................................................

35


abortus, na diferenciação de cepa de campo e cepa vacinal (B19),

“primers” eri 1/eri 2, para 35 ciclos...........................................................

36


abortus, na diferenciação de cepa de campo e cepa vacinal (B-19),

“primers” eri 1/eri 3 hemi-nested PCR, para 30 ciclos.............................

36

Tabela - 7 Resultados do AAT, SPA, técnica de PCR para determinação da

espécie B. abortus e hemi-nested PCR (eri 1 e eri 3) para diferenciação

da origem da cepa em campo ou vacinal (B19) de touros positivos na

PCR, Uberlândia, 2014............................................................................

44

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 16

2.1 CARACTERÍSTICAS DO AGENTE..................................................... 16

2.2 PREVALÊNCIA.................................................................................... 17

2.3 EPIDEMIOLOGIA E PATOGENIA....................................................... 19

2.4 BRUCELOSE EM TOUROS................................................................ 20

2.5 COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO (Código

Sanitário dos Animais Terrestres, OIE 2013)......................................

22

2.6 DIAGNÓSTICO………………………………………………................... 23

2.6.1 Diagnóstico direto……………………………………………………….. 23

2.6.2 Diagnóstico indireto.......................................................................... 25

2.7 PREVENÇÃO E CONTROLE.............................................................. 26

2.8 VACINA B19........................................................................................ 28

3 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………………... 30

3.1 COMITÊ DE ÉTICA DA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL...................... 30

3.2 AMOSTRAS DE SÊMEN E SORO SANGUÍNEO............................... 30

3.3 TESTES DE DIAGNÓSTICO……………………………………………. 31

3.3.1 Diagnóstico sorológico………………………………………………… 31

3.3.1.1 Teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT).............................. 31

3.3.1.2 Sêmen Plasma Aglutinação (SPA)..................................................... 31

3.3.2 Diagnóstico Molecular..................................................................... 32

3.3.2.1 Extração do DNA................................................................................ 32

3.3.2.2 Quantificação do DNA........................................................................ 33

3.3.2.3 Amostra do DNA de Brucella abortus................................................ 33

3.3.2.4 Amostra da cepa vacinal B19 e RB51................................................ 33

3.3.2.5 Amostras de DNA de Ochrobactrum intermedium e Ochrobactrum

anthropi...............................................................................................

34

3.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)........................... 34

3.4.1 Primers utilizados para detecção de DNA de Brucella abortus.... 34

3.4.2 Primers utilizados para diferenciação da cepa de Brucella

abortus em campo ou vacinal (B19)...............................................

35

3.5 ANÁLISE DO PRODUTO AMPLIFICADO.......................................... 38

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................... 39

4 RESULTADOS…………………………………………………………… 40

5 DISCUSSÃO...................................................................................... 46

6 CONCLUSÃO..................................................................................... 54

REFERÊNCIAS.................................................................................. 55

ANEXO............................................................................................... 66

13

1 INTRODUÇÃO

Segundo o Relatório Estatístico de Produção, Importação e Comercialização

de Sêmen da Associação Brasileira de Inseminação Artificial (ASBIA), em 2012 o

Brasil comercializou aproximadamente 12,3 milhões de doses de sêmen. Desse

total, cerca de 53,29% são de origem nacional, e o estado de Minas Gerais teve a

participação das vendas em 26,51% (gado de leite) e 7,89% (gado de corte). Mesmo

com todo esse volume de material genético comercializado, estimativas mostram

que apenas 10% do total de fêmeas bovinas em reprodução são inseminadas

anualmente no Brasil (ASBIA,2012).

A Instrução Normativa SDA Nº 8, de 10 de março de 2006, estabelece que

somente poderá ser distribuído no Brasil o sêmen bovino e bubalino coletado em

Centros de Coleta e Processamento de Sêmen – CCPS, registrados no Ministério da

Agricultura Pecuária e Abastecimento – MAPA, que cumprem os requisitos sanitários

mínimos para a produção e comercialização de sêmen bovino e bubalino no país.

Essa resolução estabelece exigências para o touro doador quanto à pré-quarentena

e a quarentena para ingresso no CCPS, controle do rebanho residente e a adição de

antibióticos ao processamento de sêmen (MAPA, 2006).

Brucelose, Tuberculose, Campilobacteriose Genital Bovina, Tricomonose e

Diarreia Viral Bovina (BVD) são doenças para as quais os animais devem ter

resultados dos exames considerados oficiais negativos, sendo que para as quatro

primeiras os exames são repetidos anualmente de acordo com recomendação da

Normativa 08/2006 (MAPA, 2006), visando garantir a produção e comercialização de

sêmen livre de patógenos.

Em busca de maior competitividade, técnicas como inseminação artificial (IA),

inseminação artificial em tempo fixo (IATF), transferência de embrião (TE) e

fertilização in vitro (FIV) são utilizadas com maior frequência para propiciar aumento

da produtividade e, consequentemente, garantir maior retorno econômico ao

produtor rural.

Com a utilização da inseminação artificial o intercâmbio de material genético

tornou-se possível, promovendo a melhor produção de leite e carne pelo uso de

sêmen de melhor qualidade. Assim, a possibilidade de que o sêmen contaminado

dissemine patógenos na monta natural ou por biotécnicas da reprodução, representa

uma das principais preocupações para criadores e autoridades sanitárias dos países

14

que empregam essa tecnologia (AFSHAR; EAGLESOME, 1990; BARCELOS et al.,

2009).

A Organização Internacional de Saúde Animal (OIE) classifica a brucelose

como uma importante doença nos bovinos, com impacto sócio-econômico para a

saúde pública e com consequências significativas no comércio internacional de

animais e seus produtos (OIE, 2011).

A contaminação bacteriana maciça do sêmen congelado pode afetar

sobremaneira a fertilidade, pois quando micro-organismos patogênicos são

veiculados pela inseminação artificial, não necessitam atravessar a mucosa vaginal

ou cervical, que agem como barreiras para bactérias, visto que são introduzidos

diretamente no útero (FLATSCHE; HOLZMANN, 1981).

O diagnóstico da brucelose baseia-se em exames laboratoriais, com a utilização

de métodos indiretos através da detecção de anticorpos ou por métodos diretos,

pela identificação do agente. No Brasil, de acordo com o Plano Nacional de Controle

e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT), em bovinos e búfalos,

os testes de triagem são o Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Anel em Leite

(TAL) e os testes confirmatórios 2- Mercaptoetanol (2-ME) juntamente com soro

aglutinação em tubos (SAT), Fixação de Complemento (FC) e Polarização

Fluorescente (PF) (BRASIL, 2006).

Em busca de exames mais práticos, rápidos e específicos, a Reação em Cadeia

pela Polimerase (PCR) vem sendo amplamente empregada em estudos

moleculares, em razão da facilidade com que é possível ampliar, in vitro, regiões

específicas do genoma de qualquer organismo. A PCR possibilita a amplificação de

sequências de DNA (ácido desoxirribonucleico) que estejam presentes em misturas

complexas e permite estudos de naturezas variadas (OLIVEIRA et al., 2007).

A brucelose é uma doença de caráter zoonótico, com impacto importante na

produção de carne e leite, o que torna a prevenção e profilaxia fundamentais para tal

setor agropecuário. A utilização de técnicas moleculares como a PCR é de grande

valia para o diagnóstico de patógenos presentes no sêmen bovino e, pode também,

ser eficiente para o controle sanitário de centrais de coleta e processamento de

sêmen, e de fazendas. Assim, o diagnóstico desse patógeno no sêmen bovino, por

meio da PCR, é uma prática desejável, pois os exames sorológicos de rotina podem

apresentar um resultado falso-negativo e os machos podem ficar assintomáticos e

levar à contaminação de todo um rebanho.

15

Dessa maneira, o presente trabalho apresenta como objetivos:

Geral:

-Detectar a presença de DNA de B. abortus no sêmen “in natura” de touros do

estado de Minas Gerais.

Específicos:

- Avaliar a prova de AAT no soro sanguíneo de touros.

- Avaliar a prova de SPA no plasma seminal de touros.

- Detectar DNA de B. abortus na técnica de PCR no sêmen de touros.

- Diferenciar as amostras positivas para B. abortus em linhagem de campo e

cepa vacinal (B19), pela técnica de PCR.

16

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO GÊNERO BRUCELLA

As bactérias quem compõem o gênero Brucella são cocobacilos Gram-negativos

e imóveis, não flagelados, desprovidos de cápsula e não formadores de esporos.

São bactérias aeróbias ou microaerófilas. O seu metabolismo é oxidativo e a energia

é produzida pela utilização de vários substratos de aminoácidos e carboidratos

(METCALF et al., 1994).

O gênero Brucella é composto de dez espécies independentes, cada uma

apresenta um hospedeiro preferencial mesmo não sendo espécie-específica: B.

abortus (bovinos); B. melitensis (caprinos); B. ovis (ovinos), B. suis (suínos); B. canis

(cães); B. neotomae (ratos do deserto); B. ceti (golfinhos e baleias); B. pinnipedialis

(focas e leões marinhos), B. microti (roedor Microtus arvalis) e B. inopinata em

humanos (FOSTER et al., 2007; SCHOLZ et al., 2008a; SCHOLZ et al., 2010).

As brucelas podem ser divididas em dois grupos antigenicamente distintos: as

lisas (B. abortus, B. melitensis e B. suis) e as rugosas (B. ovis e B. canis) (METCALF

et al., 1994).

A morfologia da colônia está relacionada com a composição do

lipopolissacarídeo (LPS) na membrana celular externa. As colônias lisas possuem o

lipídeo A (LA), núcleo oligossacarídeo e cadeia O (CO), enquanto as rugosas

possuem apenas lipídeo A e parte do núcleo oligossacarídeo (PAULIN, 2003;

BRASIL, 2006). A cadeia O é o sítio imunodominante da bactéria e a responsável

pelo desencadeamento da maior parte da resposta imune humoral, tanto na infecção

natural, quanto na desenvolvida após a vacinação com a B19 (SCHURIG, 2002).

A capacidade de sobrevivência da brucela é grande quando comparada a

outras bactérias patogênicas não esporuladas, sobretudo em ambiente úmido

contendo matéria orgânica, ao abrigo da luz solar direta e pH neutro (OMS, 1986).

No solo, com luz solar direta, o tempo de sobrevivência da bactéria é de cerca de

quatro horas, porém à sombra este tempo pode ser de até sete meses. Nas

secreções uterinas pode sobreviver até 200 dias, ou mais, e no feto abortado até

oito meses, dependendo das condições ambientais. Na urina de bovinos sobrevive

até quatro dias. No leite pasteurizado ou fervido ocorre a inativação da bactéria. Já

no leite in natura, se mantido a 15 ºC, a bactéria sobrevive até 38 dias (PAULIN;

17

FERREIRA-NETO 2003). São escassos os relatos de tempo de sobrevivência

dessa bactéria no sêmen de animais infectados.

2.2 PREVALÊNCIA

Em 2001, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)

instituiu o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose

(PNCEBT), em bovinos e búfalos, com o objetivo de diminuir o impacto negativo

dessas zoonoses na saúde humana e animal, além de promover a competitividade

da pecuária nacional. Assim, a vacinação obrigatória de fêmeas bovinas e bufalinas

entre 3 e 8 meses de idade contra a brucelose bovina e bufalina em todo o território

nacional foi introduzida pelo PNCEBT, que definiu, ainda, uma estratégia de

certificação de propriedades livres ou monitoradas (BRASIL, 2006).

A brucelose é uma doença mundial e endêmica em várias regiões, e está

presente na maioria dos países. Mesmo nas regiões livres da doença, o risco da

reintrodução de animais infectados e/ou a existência de hospedeiros silvestres da B.

abortus, significam custos consideráveis nos programas de controle (MCGIVEN,

2013). B. abortus ocorre principalmente nos países em desenvolvimento como a

África, América do Sul, Oriente Médio e Ásia (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003).

No Brasil, a doença é endêmica, e a sua ocorrência registrada em todo o

território brasileiro (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003). Em 1975, foi feito um

levantamento da situação da brucelose bovina no Brasil, tendo sido estimada a

porcentagem de animais soropositivos em 4% na Região Sul, 7,5% na Região

Sudeste, 6,8% na Região Centro-Oeste, 2,5% na Região Nordeste e 4,1% na

Região Norte (BRASIL, 1977). Recentemente, o MAPA encomendou novo estudo

da situação da doença, cuja prevalência em 14 estados brasileiros estão

apresentadas na Tabela 1.

18

Tabela 1 - Situação epidemiológica da brucelose bovina em 14 estados brasileiros.

Estado Prevalência

%

Número de

amostrados

animais

Referência

Bahia 0,66 10.816 (ALVES et al., 2009)

Distrito Federal 0,16 2.019 (GONÇALVES et al.,

2009a)

Espírito Santo 3,5 5.351 (AZEVEDO et al.,

2009)

Goiás 1,4 10.744 (ROCHA et al., 2009)

Minas Gerais 1,1 20.643 (GONÇALVESb et al.,

2009b)

Mato Grosso do Sul 7,6 9.466 (CHATE et al., 2009)

Mato Grosso 10,2 13.684 (NEGREIROS et al.,

2009)

Paraná 1,7 14.857 (DIAS et al., 2009)

Rio de Janeiro 4,1 8.239 (KLEIN-GUNNEWIEK

et al., 2009)

Rondônia 6,2 9.717 (VILLAR et al., 2009)

Rio Grande do Sul 1,0 16.072 (MARVULO et al.,

2009)

Santa Catarina 0,06 7.801 (SIKUSAWA et al.,

2009)

Sergipe 3,4 4.757 (SILVA et al., 2009)

São Paulo 3,8 8.761 (DIAS et al., 2009)

Tocantins 4,4 20.908 (OGATA et al., 2009)

No Estado de Minas Gerais, Gonçalves et al. (2009b) constataram que a

prevalência de animais soropositivos para brucelose foi de 1,1%, e as regiões com

maior ocorrência foram o Triângulo Mineiro com 1,7% e a região Central com 1,5%.

Para a brucelose bovina, as estratégias de combate são bastante conhecidas e

podem ser resumidas em vacinação, certificação de propriedades livres por rotinas

de testes indiretos, controle da movimentação de animais e sistema de vigilância

específico. Os resultados alcançados pelos países variam muito, segundo os

programas de controle, pois há registros de sucessos e fracassos citados na

literatura especializada. Os programas bem sucedidos atingem bons índices de

controle, com redução significativa da prevalência, depois de aproximadamente 20

anos de trabalho (POESTER et al., 2009).

19

2.3 EPIDEMIOLOGIA E PATOGENIA

A principal via de infecção de B. abortus no bovino é a oral, e ocasionalmente

por via aerógena. Grande quantidade de B. abortus é eliminada durante o

abortamento e parto de animais infectados. Estes animais continuam eliminando a

bactéria nas secreções uterinas por aproximadamente 30 dias (CRAWFORD et al.,

1990). A difusão da doença é favorecida pelo hábito dos bovinos de cheirar e lamber

animais recém-nascidos, ou mesmo fetos abortados (NICOLETTI, 1980; SILVA et

al., 2005).

Entre os ruminantes, a principal fonte de transmissão é o alimento e a água

contaminados, mas ocorre também pelo contato direto com o animal infectado ou

sêmen contaminado (ACHA; SZYFRES, 2003). A infecção por B. abortus se dá pelo

contato do agente com qualquer mucosa do animal susceptível, principalmente a

mucosa oral (THOEN et al., 1993). Após a invasão do organismo, há um curto

período de bacteremia, e as bactérias vão se alojar em diversos órgãos,

principalmente do sistema linfóide (EAGLESOME; GARCIA, 1992; THOEN et al.,

1993).

A capacidade de sobreviver dentro de macrófagos facilita a disseminação e a

permanência de B. abortus no organismo. Desta forma, B. abortus multiplica-se

dentro da célula sem alterar suas funções básicas com a capacidade de persistir por

período prolongado, muitas vezes de forma silenciosa, sem desencadear resposta

imune inata ou adquirida efetora no hospedeiro (GORVEL; MORENO, 2002)

A transmissão de Brucella spp. pela inseminação artificial possui papel mais

importante na disseminação da doença, de machos infectados para fêmeas

suscetíveis, do que a monta natural. Brucella está presente no fluido seminal e é

transmitida à fêmea pela inseminação intrauterina. A infecção pela monta natural

raramente ocorre, mesmo que haja no sêmen do touro infectado carga bacteriana

inicialmente suficiente para desencadear a infecção, pois esta é reduzida por

atividade bactericida dos fluidos vaginais antes de atingir o útero (CAMPERO et al.,

1990; AMIN et al., 2001).

Os bovinos e bubalinos são os hospedeiros preferências de B. abortus, e a

manifestação clínica nestas espécies é caracterizada por abortamento de fetos

prematuros, ocorrendo geralmente no sétimo mês de gestação. O abortamento

20

quase sempre acontece na primeira gestação após a infecção e, em decorrência do

desenvolvimento da imunidade celular, torna-se menos frequente na segunda

gestação e muito raro nas subsequentes. Após o primeiro abortamento, são mais

frequentes a presença de natimortos, o nascimento de bezerros fracos e retenção de

placenta (BRASIL, 2006).

Na brucelose, o período de incubação pode ser de poucas semanas e até

mesmo de meses ou anos. Considerando-se o momento em que ocorre a infecção,

o período de incubação é inversamente proporcional ao tempo de gestação, ou seja,

quanto mais adiantada a gestação, menor será o período de incubação (BRASIL,

2006).

2.4 BRUCELOSE EM TOUROS

O papel do touro na epidemiologia da brucelose é pouco descrito, visto que a

maioria das pesquisas está concentrada em fêmeas bovinas. Todavia, os touros

possuem importância na transmissão da doença, pois eliminam a bactéria pelo

sêmen (OMS, 1986). Na monta natural, com touros infectados, a contaminação

venérea é em torno de 2%. Em contraste, na inseminação artificial, a transmissão

ocorre com maior frequência se o doador estiver infectado (LANGENEGGER, 1992;

POESTER, 1997).

Na monta natural, o sêmen é depositado na vagina, onde existem defesas

inespecíficas (muco vaginal, pH vaginal, células fagocíticas, epitélio) que podem

eliminar o agente, dificultando o processo de infecção. Entretanto, na inseminação

artificial, o sêmen é depositado diretamente no útero, permitindo infecção da fêmea

com pequena quantidade do agente, representando importante via de transmissão e

eficiente forma de difusão da doença nos plantéis (LANGENEGGER, 1993; BRASIL,

2006).

Países como Nova Zelândia, Austrália e Irlanda permitem a distribuição de

sêmen na forma líquida, utilizando sêmen a fresco na inseminação artificial. Tal

prática tem como vantagem a utilização de um baixo número de espermatozoides

por inseminação, alta utilização de um único touro e baixo custo, mas apresenta a

desvantagem de ter uma vida útil do ejaculado menor em relação ao sêmen

congelado (AL NAIB et al., 2011). Outra técnica bastante utilizada é a mistura de

sêmen de diferentes touros, chamado de sêmen heterospérmico (AZMAL et al.,

21

2004). Esta mistura do sêmen de diferentes machos tem sido demonstrada como

muito vantajosa em diferentes espécies (STEWARD et al., 1974). Essas técnicas,

porém, quando utilizadas em fazendas que não realizam o controle sanitário

adequado do rebanho, favorecem a disseminação de patógenos transmitidos pelo

sêmen, notadamente no caso da brucelose.

Nos touros, o genêro Brucella pode localizar-se nos testículos e nas glândulas

genitais anexas e, quando a enfermidade se manifesta clinicamente, os testículos

podem aumentar de volume, com diminuição da libido e infertilidade (ACHA e

SZYFRES, 2003). Observa-se artrite no tarso e metatarso ou poliartrite, bursites,

abscessos cutâneos, e manifestações nos órgãos reprodutivos como orquite e

epididimite, com aumento uni ou bilateral dos testículos (GRASSO; CARDOSO

1998; CAMPANÃ et al., 2003).

Brucella spp. se instala principalmente nos órgãos acessórios do sistema

reprodutivo, particularmente na vesícula seminal e próstata, podendo ser eliminada

pelo sêmen (SUTHERLAND, 1980). No aparelho reprodutivo masculino, a bactéria

pode levar à reação inflamatória, do tipo necrosante, nas vesículas seminais,

testículos e epidídimos, provocando subfertilidade ou infertilidade. Como sequela

pode determinar atrofia do testículo e órgãos acessórios (OMS, 1986).

Touros com brucelose podem apresentar intensa reação inflamatória nos

testículos, levando à degeneração dos túbulos seminíferos, epididimite com

infiltração de linfócitos, neutrófilos e células gigantes com espermatozóides mortos,

vesiculite com inflamação unilateral ou bilateral das vesículas seminais e glândulas

aumentadas e fibrosadas (HAFEZ; HAFEZ 2004; RADOSTITS; GAY; BLOOD;

HINCHCLIFF, 2007).

A infecção por bactérias do gênero Brucella em machos induz resposta imune

do tipo celular e humoral. A resposta humoral frente à infecção natural pelo micro-

organismo se notabiliza pela elevação quase simultânea dos níveis de

imunoglobulinas (Ig) das classes IgM e IgG. Nestes animais, as Ig da classe IgM

tendem ao desaparecimento algumas semanas após a infecção. Ao contrário, a

classe IgG, se estabelece e persiste nos animais cronicamente infectados

(SUTHERLAND, 1980).

A localização preferencial da bactéria nas glândulas acessórias e testículos

pode induzir a presença de baixos títulos ou mesmo a ausência de títulos séricos de

imunoglobulinas em touros infectados. Isso pode dificultar o diagnóstico da

22

brucelose nos machos bovinos, com base em métodos sorológicos convencionais

(AGUIAR et al., 2001; RADOSTITS et al., 2007).

Campos et al. (2003) estudaram a prevalência de reprodutores bovinos soro-

reagentes para B. abortus na microrregião de Goiânia. Dos 139 reprodutores

avaliados, dois foram suspeitos na prova de soroaglutinação rápida em placa.

Nessas duas amostras foi realizada a prova de AAT e ambos foram negativos. Um

dos touros suspeitos era oriundo de uma propriedade com histórico de abortamento.

2.5 COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO (Código Sanitário dos

Animais Terrestres, OIE 2013a)

A Instrução Normativa SDA Nº 8, de 10 de março de 2006, estabelece que o

sêmen precisa ser coletado e processado de acordo com o estabelecido no Código

Sanitário dos Animais Terrestres da Word Organisation Animal Health (OIE, 2013a).

Os objetivos desse código sanitário para a produção de sêmen são: manter a

saúde dos animais de centros de inseminação artificial em nível que permita a

distribuição internacional de sêmen com menor risco de infecção de outros animais,

ou humanos, com patógenos transmitidos por essa fonte; garantir que esse sêmen

seja higienicamente coletado, processado e armazenado.

Os touros devem estar em estado satisfatório de limpeza, devem ser

mantidos em condições de higiene, seja no pasto ou no estábulo. Quando da coleta

de sêmen, as instalações devem ser de fácil limpeza e desinfecção. O animal

manequim deve ter exames negativos das mesmas doenças exigidas para os touros

e deve ser cuidadosamente limpo antes de cada sessão de coleta. A vagina artificial

deve ser completamente limpa após cada coleta. Os tubos coletores devem ser

estéreis ou descartáveis, e devem ser mantidos lacrados para prevenir a exposição

ao ambiente, enquanto não estiverem sendo utilizados.

Após a coleta de sêmen, o tubo deve ser mantido anexado ao cone e dentro

da capa protetora, até ser removido da sala de coleta para transferência para o

laboratório.

Para manipulação e preparo das amostras de sêmen em laboratório são

necessários recipientes esterilizados e os diluentes devem ser preparados com água

estéril. Em cada mL de sêmen congelado deve ser incluída uma mistura de

antibióticos com atividade bactericida no mínimo equivalente às seguintes misturas:

23

gentamicina (250 µg), tilosina (50 µg), lincomicina-espectinomicina (150/300 µg) ou

penincilina (500 UI), estreptomicina (500 µg).

Sempre que se utilizar leite, gema de ovo ou qualquer proteína de origem

animal na preparação de diluente para sêmen, o produto deve estar livre de

patógenos ou deve ser esterilizado. Recomenda-se o uso de ovos originários de

plantéis SPF, quando possível. O exame dos ejaculados, a diluição e congelamento

do sêmen devem ser realizados em laboratórios com padrões higiênicos

determinados pelos médicos veterinários.

2.6 DIAGNÓSTICO

2.6.1 Diagnóstico direto

O teste de referência “gold standard” para o diagnóstico da brucelose é o

isolamento bacteriano por meio da cultura bacteriana. No entanto, o isolamento das

bactérias do gênero Brucella requer laboratório com nível 3 de biossegurança,

recursos, tempo e técnicos altamente qualificados para a manipulação de isolados

viáveis de brucela visando a identificação e biotipagem. O manuseio dessas

bactérias vivas envolve riscos de contaminação, infecção e rigorosas regras de

biossegurança. Métodos baseados na reação em cadeia pela polimerase (PCR)

estão se tornando úteis com resultados recentes promissores, com elevada

sensibilidade e especificidade, relativa facilidade de execução e redução de custos,

se ternando uma opção para o diagnóstico direto (YU; NIELSEN, 2010).

A utilização do diagnóstico direto muitas vezes ocorre nos animais triados

pelo diagnóstico indireto e encaminhados para o sacrifício e, também, nos casos de

abortamento, tendo papel importante na confirmação bacteriológica de foco da

doença e caracterização da estirpe (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003).

A detecção do DNA bacteriano pela PCR apresenta rapidez, significativa

sensibilidade e especificidade e pode ser realizada em amostras clínicas

contaminadas. Tem também a vantagem de detectar pequenas quantidades de DNA

dos micro-organismos em diversos substratos, sem a necessidade de estarem

viáveis, ao contrário da cultura bacteriológica (ERLICH et al., 1991;FEKETE et al.,

1992). As amostras de DNA para a PCR podem ser extraídas de tecidos de

24

neonatos ou fetos abortados, do leite, do sangue total, do soro sanguíneo, do sêmen

e de alimentos como o queijo (ROMERO; LOPEZ- GONI, 1999).

Na PCR são utilizados genes alvos, como os oligonucleotídeos iniciadores

(primers) desenhados a partir de uma sequência codificante de uma proteína de 31

KDa (B4/B5) de B. abortus (BAILY et al., 1992). Bricker e Halling (1994)

descreveram uma técnica de PCR chamada de AMOS PCR, que identifica e

diferencia a maioria das espécies de Brucella e biotipos encontrados nos Estados

Unidos. Essa técnica é baseada nas observações de que o elemento genético

repetitivo IS 711 é único no gênero Brucella e, para a maioria das espécies, pelo

menos uma cópia deste elemento ocorre num “lócus” cromossomal espécie ou

biótipo-específico único. Ewalt e Bricker (2000) validaram a AMOS PCR para a

diferenciação de B. abortus em estirpe de campo ou vacinal.

Os “primers” B4 e B5 (BAILY et al., 1992) apesar de sua ampla utilização e

elevada sensibilidade diagnóstica, foram capazes de amplificar DNA provenientes da

bactéria Ochrobactrum spp., o que pode gerar resultados falso-positivos (CASANAS

et al., 2001). Os gêneros Ochrobactrum e Brucella apresentam elevada similaridade

de sequências gênicas (VELASCO et al., 1998). Na literatura consultada foi

encontrada referência de Ochrobactrum sp. provocando infecções oportunistas em

humanos. Scholz et al. (2008b) desenvolveram um PCR multiplex capaz de

diferenciar estirpes de Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum intermedium e Brucella

spp. provenientes de cultura pura.

A utilização de métodos moleculares revelou a existência de potenciais novas

espécies de Brucella. Estes micro-organismos foram isolados de humanos e de

animais variados, incluindo novos hospedeiros (SCHOLZ; VERGNAUD, 2013). A

PCR tem se mostrado como boa opção para o diagnóstico da brucelose. Entretanto,

poucos estudos têm sido realizados com isolados de campo para empregar a reação

como uma ferramenta de diagnóstico (LEYLA et al., 2003).

Estudos com a utilização da PCR com amostras de sêmen bovino e ovino

para o diagnóstico da brucelose. Tem revelado bons resultados na utilização da

técnica (AMIN et al., 2001; MANTEROLA et al., 2003; VINODH et al., 2008;

JUNQUEIRA JUNIOR et al., 2013). O diagnóstico da brucelose em amostras de

sêmen ovino e bovino já foi descrito, apresentando maior sensibilidade em relação

ao cultivo microbiológico (AMIN et al., 2001).

25

Amin et al. (2001) trabalharam com 65 touros positivos na sorologia para

brucelose (B. melitensis) e Junqueira Júnior et al. (2013) trabalharam com 88 touros

negativos na sorologia para brucelose (B. abortus). Esses pesquisadores

conseguiram isolar DNA de Brucella spp., usando a técnica de PCR em amostras de

sêmen de alguns desses animais.

2.6.2 Diagnóstico indireto

Os métodos indiretos ou sorológicos para diagnóstico da brucelose visam

demonstrar a presença de anticorpos específicos contra Brucella spp., no soro

sanguíneo e nos fluídos corporais. Esses métodos são os mais utilizados quando se

trabalha com rebanhos, pois são rápidos, de fácil execução e baixo custo. Além

disso, apresentam boa sensibilidade e especificidade e são a base na busca do

controle e erradicação da brucelose, por permitirem tanto o monitoramento de

propriedades como de regiões inteiras (BRASIL, 2006).

Existem vários testes sorológicos para o diagnóstico da brucelose bovina.

Assim, cada país deve escolher os que melhor se adaptem à estratégia de combate

à doença. Os principais testes são: Soroaglutinação Lenta em Tubos (SLT),

Soroaglutinação Rápida em Placa (SRP), Teste do Antígeno Acidificado Tamponado

ou Teste Rosa Bengala (AAT ou TRB), Reação de Fixação de Complemento (FC),

Teste do 2-Mercaptoetanol (2-ME), Testes Imunoenzimáticos (ELISA), Teste da

Polarização da Fluorescência, Teste do Anel em Leite (TAL) e Sêmen Plasma

Aglutinação (SPA) (BRASIL, 2006; RADOSTITIS et al., 2007; MATHIAS et al., 2010;

OIE, 2013b). São aceitos pela OIE a reação de FC para confirmação diagnóstica e o

AAT como teste de triagem, como referência para o comércio internacional de

animais (OIE, 2013a).

Os testes oficiais do Programa Nacional de Controle e Erradicação da

Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) do Brasil são o AAT, TAL, 2-ME e FC, sendo os

dois primeiros de triagem e os dois últimos confirmatórios. Os exames devem ser

realizados em fêmeas de idade igual ou superior a 24 meses, desde que vacinadas

entre 3 e 8 meses com a B19; nos machos e fêmeas não vacinadas a partir dos 8

meses de idade. Excluem-se desses, os animais castrados (BRASIL, 2006). Embora

a legislação não exija exame sorológico de animais castrados, esses animais, se

estiverem infectados, apesar de não disseminarem a doença através da reprodução,

26

poderão se tornar uma fonte de infecção ao eliminarem a bactéria pela urina,

contaminando assim o ambiente.

Os testes sorológicos não apresentam sensibilidade e especificidade

absoluta, havendo a necessidade de associação entre técnicas em busca de

melhores resultados na detecção de animais soropositivos, sobretudo na fase inicial

da infecção e em infecções crônicas (COSTA, 2001; OLIVEIRA, 2003). Nesses

testes podem ocorrer reações inespecíficas decorrentes do compartilhamento de

epítopos com outros gêneros bacterianos ou até mesmo envolvendo

imunoglobulinas da classe IgM, provenientes da vacinação contra brucelose,

gerando resultados falso-positivos (COSTA, 2001; MINHARRO, 2009).

Há várias evidências de reações imunológicas cruzadas entre as cepas lisas

de brucela com outros micro-organismos. Já foi descrito que as bactérias Yersinia

enterocolitica O:9, Escherichia coli O157:H7, Salmonela spp., Francisella tularensis

e Vibrio cholerae podem reagir nos testes sorológicos na detecção da brucelose

bovina (NIELSEN et al., 2004). Naves et al. (2012) demonstraram que bovinos

recém vacinados para leptospirose podem reagir positivamente nos testes

sorológicos oficiais de brucelose, por um período de até 96 dias pós-vacinação.

2.7 PREVENÇÃO E CONTROLE

A brucelose, por causar prejuízos à pecuária e ser transmitida dos animais

aos humanos, vem sendo, desde o início do século XX, alvo de medidas de controle

e erradicação na população animal, em vários países (POESTER et al., 2009). De

acordo com as necessidades do controle da doença, a implementação de programas

bem sucedidos de erradicação tem sido necessária. Porém esses programas muitas

vezes são de alto custo, de difícil execução e de médio a longo prazo. A maior

dificuldade é em relação à política de gestão nas propriedades com criação

extensiva, deslocamento dos animais e existência de várias espécies de animais

(GODFROID et al., 2011).

As estratégias de controle da brucelose têm como base a redução constante

do número de focos da doença, além do controle do trânsito de animais de

reprodução e a certificação de propriedades livres da enfermidade com base no

diagnóstico, sacrifício dos animais positivos e a adoção de medidas ambientais

(PAULIN; FERREIRA NETO, 2003).

27

As vacinas atenuadas são utilizadas nos programas de controle da brucelose,

com o propósito de reduzir a prevalência da doença a baixos custos. Duas delas,

recomendadas pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) são empregadas

em programas de controle da brucelose em vários países, inclusive no Brasil: a

amostra B19 e a vacina não indutora de anticorpos aglutinantes amostra RB51

(BRASIL, 2006; OIE, 2013b).

A vacina B19 é uma amostra lisa de B. abortus e é utilizada somente em

bezerras de 3 a 8 meses de idade em dose única via subcutânea (BRASIL, 2006). A

vacinação de fêmeas com B. abortus cepa 19 tem sido utilizada no mundo inteiro

para prevenir a doença em bovinos, apresentando níveis variáveis de proteção,

dependendo da prevalência da doença (NICOLETTI, 1990).

Diante da necessidade de obter uma vacina que não provocasse a indução de

anticorpos vacinais, que interferissem nos exames sorológicos, foi desenvolvida na

década de 90, a vacina não indutora de anticorpos aglutinantes, a RB51. Esta

amostra, praticamente isenta de cadeia O, foi obtida por passagens sucessivas da

cepa 2308 de B. abortus em meios de cultura contendo rifampicina, originando uma

mutante permanentemente rugosa, reduzindo assim, a virulência (POESTER et al.,

2005; AMAKU et al., 2009).

A cepa vacinal RB51 possui características de proteção semelhantes à B19.

Porém, por ser rugosa, não induz a formação de anticorpos reagentes nos testes

sorológicos de rotina, não interferindo, portanto, no diagnóstico sorológico da

brucelose por testes convencionais (POESTER, 2006; LAGE et al., 2008). Em

alguns países, como México, Chile e Estados Unidos, esta vacina é empregada

oficialmente nos programas de controle de brucelose. Porém, no Brasil, a utilização

da RB51 está praticamente restrita à vacinação estratégica de fêmeas adultas, que

não foram vacinadas quando bezerras (3 a 8 meses de idade), com a vacina B19

(BRASIL, 2006).

Com a redução da prevalência da brucelose, a vacinação em massa se torna

desnecessária e as estratégias de controle são alteradas para medidas de

erradicação, cujo objetivo consiste na eliminação de todos os focos. A identificação

destes focos tem como base: (1) a detecção de anticorpos no leite, (2) a aplicação

de testes sorológicos em animais de reprodução sob trânsito e animais de

reprodução descartados em abatedouros, (3) busca por produtores informais, (4) a

investigação de propriedades que apresentam relação epidemiológica com focos, (5)

28

a investigação de abortamentos em bovinos e, principalmente, em casos de

brucelose humana (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003; LAGE et al., 2008).

2.8 VACINA B19

Na década de 1930, Dr. John Buck pesquisando sobre a imunidade gerada

com vacinação de fêmeas contra B. abortus, conhecida na época como Bacterium

abortus, isolou um micro-organismo a partir do leite de uma vaca de raça jérsei

infectada. Ao deixar a cultura em temperatura ambiente por aproximadamente um

ano e meio, descobriu que a cultura tinha se tornado atenuada e estável, capaz de

conferir imunidade duradoura e não provocava mais doença nos bovinos. Essa

amostra foi chamada de 19, pois era a 19 cultura utilizada na pesquisa (BUCK,

1930).

A vacina B19 é produzida segundo rígidas normas internacionais com estirpe

viva (que possui maior capacidade em ativar macrófagos) de B. abortus cepa B19

(PAULIN, 2003). Fêmeas vacinadas com a vacina B19 na idade correta estarão

protegidas por cerca de sete anos após a vacinação (BATHKE, 1988).

A cepa B19 é uma vacina atenuada, que apresenta morfologia colonial lisa e

incapacidade de alterar a virulência por passagens sucessivas em animais e não é

isolada na presença de eritritol (ALTON et al., 1988). O metabolismo do eritritol é a

diferença mais conhecida e mais importante entre a cepa B19 e as demais cepas

virulentas de B. abortus (SANGARI et al., 2000).

O eritritol é um poli-álcool composto de quatro carbonos que serve como fonte

de energia para B. abortus (SPERRY; ROBERTSON, 1975). E está presente nos

tecidos osteoarticulares, mamários e órgãos reprodutores de fêmeas e machos,

atingindo grandes concentrações no útero gravídico, principalmente nos líquidos

fetais, nos placentomas e no tecido córion-alantoideano (CARTER; CHENGAPPA,

1991).

O uso preferencial do eritritol é característica do gênero Brucella. Foi

reportada a ausência, na B19, de D-eritrose-1-fosfato de desidrogenase, uma

enzima crítica no mecanismo catabólico do eritritol, causando o acúmulo do produto

tóxico intermediário a D-eritrose 1-fosfato e uma depleção dos níveis de ATP,

inibindo a multiplicação bacteriana (SANGARI et al., 2000).

29

Na cepa vacinal, o gene ery, de 702 pares de base (pb), apresenta-se

deletado e esta seria a explicação para a sensibilidade ao eritritol (CORBEL, 1997).

Porém, algumas estirpes de B19 são tolerantes ao eritritol e acredita-se que esta

seja uma das causas do desenvolvimento de infecções persistentes pela mesma, e,

subsequente abortamento (SANGARI et al., 1998).

A vacina B19 é indicada para fêmeas bovinas até 8 meses idade e pode ser

prejudicial para machos e outras espécies animais incluindo humanos, devido à

virulência residual. Os machos vacinados permanecem com títulos de anticorpos

vacinais por toda vida, além de haver a possibilidade de desenvolverem vesiculite,

prostatite e, ocasionalmente, orquite. Portanto, não é recomendado à vacinação de

machos (OMS, 1986; MAPA, 2006).

30

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 COMITÊ DE ÉTICA DA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais

- CEUA da Universidade Federal de Uberlândia sob o protocolo nº 088/12 (Anexo 1).

3.2 AMOSTRAS DE SÊMEN E SORO SANGUÍNEO

Para a determinação do tamanho da amostra (n), admitiu-se uma prevalência

esperada de 1% (GONÇALVES et al., 2009b), nível de confiança de 95% e variação

de 2%. A fórmula utilizada, segundo Thrusfield (2004), foi:

n = 1,962 Pesp (1 - Pesp)

d2

Nesta fórmula:

n = tamanho da amostra baseado em uma população infinita

Pesp = prevalência esperada

d = precisão absoluta desejada

Substituindo os valores nas fórmulas:

n = 1,962 0,01 (1 – 0,01)

0,022

n = 95 amostras

Foram analisadas 100 amostras de sêmen in natura e soro sanguíneo de

touros (Bos taurus e Bos indicus) provenientes de centrais de coleta de sêmen (64

amostras) e fazendas produtoras de touros para comercialização (36 amostras) do

estado de Minas Gerias. Dados quanto à situação epidemiológica dos doadores de

sêmen envolvidos neste estudo não foram coletados, já que os estabelecimentos

obedecem rigorosamente os requisitos sanitários impostos pelo Ministério da

Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2006).

31

A análise do sêmen e soro sanguíneo foi realizada independente de raça,

aptidão reprodutiva e idade do animal, embora todos os animais estivessem com

mais de 20 meses de idade.

As amostras de sêmen in natura (1-2 mL) e soro sanguíneo (1 mL) foram

fornecidas pelos estabelecimentos doadores devidamente identificadas. Essas

amostras foram coletas por colaboradores das fazendas e centrais de coleta e

processamento de sêmen de acordo com suas práticas rotineiras e seguindo as

normas preconizadas no Manual para Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen

Animal / Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 1998).

Tanto as amostras de sêmen como as de soro sanguíneo foram transportadas

em refrigeração (4 – 8 ºC), em recipientes térmicos até o Laboratório de Doenças

Infectocontagiosas da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal

de Uberlândia (LADOC-FAMEV-UFU), Minas Gerias, aonde foram registradas e

devidamente acondicionadas (-20ºC) para posterior análise sorológica e molecular.

Cada amostra foi identificada de acordo com o reprodutor e dados como

identificação da central produtora, ou fazenda e número de registro dos touros foram

mantidos em sigilo, pois este trabalho não apresenta conflito de interesse.

3.3 TESTES DE DIAGNÓSTICO

3.3.1 Diagnóstico sorológico

3.3.1.1 Teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT)

Teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) foi procedido e interpretados

respeitando a metodologia contida no PNCEBT (BRASIL, 2006).

3.3.1.2 Sêmen Plasma Aglutinação (SPA)

Após descongelamento o sêmen total foi centrifugado e daí retirado o

plasma seminal, que foi submetido à prova de AAT (PAULIN, 2003), sem o

tratamento com azida sódica 1%.

32

3.3.2 Diagnóstico Molecular

3.3.2.1 Extração do DNA

Para a extração do DNA de B. abortus foi utilizado o protocolo por lise

enzimática com Proteinase K e purificação com fenol clorofórmio (adaptado de

BIASE et al., 2002).

Inicialmente foram transferidos 400 µL de cada amostra de sêmen total para

novos microtubos de plásticos (2,0 mL) e foram acrescentados a este material 800µL

de tampão de extração [Tris-HCl 20mM pH 8.0, EDTA 100mM pH 8.0, NaCl 100mM;

SDS 1% (p/v)]. As amostras foram agitadas em agitador de tubos do tipo vórtex e

mantidas em banho-seco a 65ºC por 60 minutos, sendo invertidas gentilmente a

cada 10 minutos. Posteriormente, foram acrescentados 15 µL de Proteinase k

(10mg/mL) em cada amostra e deixadas por 60 minutos a 37°C em banho-maria.

Após, adicionou-se 400µL de acetato de potássio 5M à solução. Nesta etapa,

as amostras foram mantidas no gelo por 30 minutos, invertendo-se os tubos a cada

10 minutos. Em seguida, os microtubos foram centrifugados a 13.400 x g por 10

minutos a 4ºC, e o sobrenadante foi transferido para microtubos novos, sendo

acrescentado a estes 700 µL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1). As

amostras foram misturadas por inversão durante três minutos, e posteriormente

centrifugadas a 13.400 x g por 10 minutos.

O sobrenadante foi transferido para novos microtubos e em seguida foram

acrescentados 700 uL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Em seguida, as

soluções foram misturadas por inversão durante três minutos e centrifugadas a

13.400 x g por 10 minutos a 4ºC. A fase superior foi transferida para microtubos

novos, tomando-se cuidado para não tocar na interface orgânica. Acrescentou-se

1000µL de etanol absoluto gelado, que após ser misturada gentilmente foi mantida

em freezer -20ºC “overnight”.

Após a precipitação do DNA em etanol, os microtubos foram centrifugados a

13.400 x g por 15 minutos a 4ºC. A fase líquida foi descartada e o “pellet” foi lavado

com 1000µL de etanol 70% (v/v). Após a centrifugação sob as mesmas condições

anteriores, a fase líquida foi novamente descartada e o “pellet” foi colocado para

secar em temperatura ambiente ±25ºC por 60 minutos. Em seguida, o pellet foi

ressuspendido em 30µL de tampão TE 10:1 (Tris-HCl 10mM pH 8,0; EDTA 1mM pH

33

8,0) por 24 horas a 4ºC. Após esse período as amostras foram estocas a – 20 ºC até

a sua utilização. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose

1% (p/v), contendo Sybr safe gel stain 10x (Invitrogen) e padrão de concentração

100 pb DNA Ladder (Invitrogen) para verificação da qualidade e quantidade do DNA.

O gel foi visualizado sob luz UV em fotodocumentador Alpha Digi Doc (Alpha

Innotech).

3.3.2.2 Quantificação do DNA

Alíquotas do DNA obtido da extração do sêmen total foram diluídas 1:1000

em água ultrapura obtida em aparelho Milli-Q-Millipore. Em seguida, foram

submetidas à leitura espectrofotométrica nos comprimentos de onda 260nm e

280nm, em espectrofotômetro BIOMATE 3S (Thermo Scientific). A quantificação foi

realizada para avaliar a qualidade e a concentração de DNA (AZEVEDO et al.,

2003).

3.3.2.3 DNA de Brucella abortus

O DNA puro da cepa padrão 2308 de Brucella abortus utilizado como controle

positivo foi doado pelo Prof. Dr. Luis Antônio Mathias do Departamento de Medicina

Veterinária Preventiva e Reprodução Animal (Preventiva), da Universidade Estadual

Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Campus Jaboticabal, São Paulo.

3.3.2.4 Cepas vacinais B19 e RB51

As amostras de DNA de B. abortus cepa vacinal B19 (Brucelina-B19,

laboratório Vallé) e RB51 (laboratório Schering-Plough) foram obtidas pela extração

com o Wizard® Genomic DNA Purification Kit da Promega, de acordo com

recomendações do fabricante. Essas amostras foram utilizadas para controle

positivo das respectivas cepas vacinais.

34

3.3.2.5 DNA de Ochrobactrum intermedium e Ochrobactrum anthropi

O DNA das bactérias O. intermedium e O. anthropi, foram cedidos pelo Dr.

Renato de Lima Santos do Laboratório de Patologia Molecular da Escola de

Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Essas amostras

foram utilizadas para demonstrar a especificidade dos “primers".

3.4 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR)

Com o DNA extraído das amostras foram realizadas as reações de PCR.

3.4.1 “Primers” utilizados para detecção de DNA de B. abortus

Para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus foram utilizados os

“primers” BAB e IS 711 (Tabela 2), descritos por Bricker e Halling (1994), que

amplificam fragmentos de 498 pares de base (pb). Na Figura 1 está representado a

hibridização dos “primers” BAB e IS711 no genoma da B. abortus biovares 1,2 e 4.

Todos os “primers” utilizados no experimento foram sintetizados pelo laboratório

Invitrogen™.

Tabela 2 - Sequência dos “primers” utilizados na PCR para identificação de B. abortus.

“Primers” Sequência

BAB 5’ GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC 3’ IS 711 5’ TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT 3’

FONTE: BRICKER; HALLING (1994). Figura 1 – Representação da hibridização dos “primers” específicos para B. abortus

biovares 1, 2 e 4 e tamanho do fragmento amplificado.

FONTE: MIYASHIRO (2004).

35

O procedimento de amplificação foi realizado em um volume final de 20 µL.

Cada reação contendo 2 µL de tampão de reação 10X (1X); 0,8 µL de MgCl2 (1.5

mM); 0,4 µL de dNTPs (10mM); 1 µL dos primers BAB/IS711 (5 pmol/uL); 0,2 µL de

Taq DNA-polimerase (5 U/µL); 6 µL (50ng/ µL) do DNA total a ser testado; 9,6 µL de

água MilliQ. Foi utilizado como controle negativo da reação um mix sem DNA.

O ciclo de temperaturas utilizado no aparelho termociclador Select Cycler

(BioProducts) para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus foi realizado

conforme descrição de Miyashiro et al. (2007) (Tabela 3).

Tabela 3 – Ciclo de temperaturas para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus, para 40 ciclos.

Etapas da PCR Tempo Temperatura °C Desnaturação inicial 5 minutos 94°C

Desnaturação do DNA 60 segundos 94°C

Hibridação 60 segundos 55°C

Extensão da cadeia de DNA 45 segundos 72°C

Extensão final 10 minutos 72°C

FONTE: MIYASHIRO et al. (2007).

3.4.2 “Primers” utilizados para diferenciação da cepa de B. abortus em campo

ou vacinal (B19)

Para diferenciação da origem da cepa foi realizada a técnica de PCR a partir

do DNA extraído das amostras positivas na PCR para B. abortus, utilizando-se os

“primers” eri 1 e eri 2 descritos por Sangari, García-Lobo e Aguero (1994). Foi

empregado também o “primer” eri 3 , descrito por Bricker e Halling (1995) - junto

com o eri 1 em uma reação de hemi-nested PCR para aumentar a sensibilidade da

reação, caso a primeira não permitisse a visualização de banda para diferenciar

entre cepa de campo e cepa vacinal B-19. Os “primers” estão descritos na Tabela 4.

Tabela 4 - Sequência dos primers utilizados para diferenciação da cepa de B. abortus de campo ou vacinal (B19).

“Primers” Sequência

eri 1 5’TTG GCG GCA AGT CCG TCG GT 3’ eri 2 5’CCC AGA AGC GAG ACG AAA CG 3’ eri 3 5’CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA 3’

FONTE: SANGARI, GARCÍA-LOBO; AGUERO (1994); BRICKER; HALLING (1995).

36

O procedimento de amplificação foi realizado em um volume final de 20 µL.

Cada reação contendo 2 µL de tampão de reação 10X (1X); 0,8 µL de MgCl2 (1.5

mM); 0,4 µL de dNTPs (10mM); 1 µL dos “primers” eri 1/eri 2 (5 pmol/uL); 0,2 µL de

Taq DNA-polimerase (5 U/µL); 6 µL do DNA total a ser testado (50 µg/µL); 9,6 µL de

água MilliQ.

Na hemi-nested PCR foi utilizado o mesmo protocolo de amplificação com a

substituição dos “primers” por eri 1/eri 3 a 10pmol, e o DNA molde era o da

amplificação anterior. O volume final da solução para a amplificação foi de 20 μL,

sendo 6 μL de amostra e 14 μL de mix, nas duas reações.

O ciclo de temperatura utilizado no aparelho termociclador Select Cycler

(BioProducts) para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus, na

diferenciação da cepa de campo e cepa vacinal B19 foi realizado conforme

descrição de Miyashiro et al. (2007), (Tabelas 5 e 6).

Tabela 5 - Ciclo de temperaturas para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus, na diferenciação de cepa de campo e cepa vacinal (B19), utilizando “primers” eri 1/eri 2, para 35 ciclos.

Etapas da PCR Tempo Temperatura °C

Desnaturação inicial 10 minutos 94°C Desnaturação do DNA 60 segundos 94°C Hibridação 120 segundos 57°C Extensão da cadeia de DNA

120 segundos 72°C

Extensão final 10 minutos 72°C FONTE: MIYASHIRO et al. (2007).

Tabela 6 - Ciclo de temperaturas para amplificação do fragmento de DNA de B. abortus, na diferenciação de cepa de campo e cepa vacinal (B19), utilizando “primers” eri 1/eri 3 hemi-nested PCR, para 30 ciclos.

Etapas da PCR Tempo Temperatura °C

Desnaturação inicial 10 minutos 94°C Desnaturação do DNA 60 segundos 94°C Hibridação 60 segundos 59°C Extensão da cadeia de DNA

45 segundos 72°C

Extensão final 10 minutos 72°C FONTE: MIYASHIRO et al. (2007).

37

Está representando na Figura 2 a hibridização dos “primers” eri 1 e eri 2 com

o genoma de cepa do gênero Brucella, destacando-se a deleção genética de 702

pares de base (pb) existentes na cepa vacinal B19, e o tamanho dos produtos

amplificados.

Figura 2 – Representação da hibridização dos “primers” eri 1 e eri 2 no genoma do gênero

Brucella, destacando-se a deleção genética existente na B19, e o tamanho dos produtos

amplificados.


Nas amostras que não revelaram banda na reação com eri 1 e eri 2, foi

realizada a reação de hemi-nested PCR. Para as amostras de Brucella spp. exceto a

cepa vacinal B19, na hemi-nested PCR, a fita de DNA alvo é o fragmento de 1063

pb amplificado na primeira PCR, cujo sinal não foi possível de ser visualizado. Na

Figura 3 está representado a hibridização dos “primers” da hemi-nested PCR para

cepas de Brucella spp., exceto a B19 (MIYASHIRO, 2004).

Figura 3 – Representação da hibridização dos “primers” utilizados na hemi-nested PCR nas

cepas de Brucella spp., exceto cepa vacinal B19, e tamanho do produto amplificado.


38

Para as amostras vacinais B19, na hemi-nested PCR, a fita de DNA alvo é o

fragmento de 361 pb amplificado na primeira PCR. Devido à deleção genética da

B19, o “primer” eri 3 não se hibridiza em nenhum lócus da fita alvo. Porém, como

esta fita tem uma pequena extensão, e o “primer” eri 1 se hibridiza à fita, a Taq DNA

polimerase consegue estender todo o fragmento, podendo revelar o fragmento não

visualizado na primeira reação, como demonstrado na Figura 4 (MIYASHIRO, 2004).

Figura – 4 Representação da hibridização do “primer” eri 1 na hemi-nested PCR em cepa

vacinal B19, e o tamanho do produto amplificado.

a + b = 361 pb


3.5 ANÁLISE DO PRODUTO AMPLIFICADO

A visualização do produto amplificado (8µL) + 2 µL de tampão de amostra

(TBE 10X 50%, Glicerol 50% e Azul de Bromofenol 0,1%) foi realizada pela técnica

de eletroforese em cuba horizontal com tampão de corrida TBE 0,5X (0,04 M Tris-

borato e 1 mM EDTA, pH 8,0), em gel de agarose 1,0 % (p/v). Foi adicionado o

corante Sybr® Safe Gel Stain 10.000X – Invitrogen, 0,5uL/10mL. O gel foi submetido

à voltagem constante de 6-7 V/cm e a visualização das bandas realizada em

transluminador ultravioleta (SAMBROOK et al., 1989).

As bandas que apareceram foram comparadas com padrão de peso

molecular (Invitrogen™), com fragmentos múltiplos de 100 pares de bases dispostos

39

no gel juntamente com as amostras analisadas. Os géis foram analisados sob luz

UV em fotodocumentor Alpha Digi Doc (Alpha Innotech).

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Foi realizada análise descritiva dos resultados, com cálculo de percentual

simples (SIEGEL; CASTELLAN JUNIOR, 2006).

40

4 RESULTADOS

Das 100 amostras de soro sanguíneo, nenhuma foi reagente na

soroaglutinação para o AAT. Das 100 amostras de plasma seminal, 11 (11%) foram

reagentes.

Das 68 amostras de sêmen positivas na PCR oito amostras de plasma

seminal também estavam positivas na SPA. Das 68 amostras positivas para B.

abortus, 100% das amostras estavam positivas para a cepa de vacinal B19 (Tabela

7).

Das 32 amostras negativas tanto no AAT como na PCR, somente três foram

positivas para o SPA.

Nenhuma das amostras foi positiva nos três testes.

Na Figura 5 estão os resultados da comprovação da espécie especificidade

dos “primers” descritos por Bricker e Halling (1994), com a amplificação de 498 pb

de B. abortus cepa 2308. Nessa figura também aparecem bandas inespecíficas

quando se utiliza DNA das bactérias Ochrobactrum intermedium e Ochrobactrum

anthropi. Demonstrando também cinco touros positivos e um negativo.

Figura 5 – Comprovação da especificidade dos “primers” BAB/IS711, Uberlândia, 2014.

(a): marcador de tamanho de fragmento de DNA (100 pb); (b): B. abortus cepa 2308; (c,d): controle negativo com água; (e): DNA de Ochrobactrum intermedium; (f): DNA de Ochrobactrum anthropi; (g,h,i,k,l): produto de PCR originado de sêmen total; (j): touro negativo. FONTE: LOURENCETTI (2014).

41

Na Figura 6 estão os resultados da comprovação da espécie especificidade

dos “primers” descritos por Bricker e Halling (1994), com a amplificação de 498 pb

em todas as espécies do gênero Brucella testadas como controle positivo (B.

abortus cepa 2308, B. abortus cepa B19 e B. abortus cepa RB51). Demonstrando

também a presença de três touros positivos.

Das 100 amostras de DNA extraídos de sêmen total quando testadas para a

detecção de DNA de B. abortus, 68 amostras (68%) foram positivas.

Das 68 (100%) amostras positivas, 46 (67,6%) eram de CCPS e 22 (32,5%) eram

de fazendas.

Figura 6 - Detecção de DNA de B. abortus em amostras de sêmen bovino, com os “primers”

BAB e IS711, Uberlândia, 2014.

(a): marcador de tamanho de fragmento de DNA (100 pb); (b): B. abortus cepa 2308; (c): controle negativo; (d): B. abortus cepa vacinal B19; (e): B. abortus cepa vacinal RB51; (f,g,h): produto da PCR originado de sêmen total.

FONTE: LOURENCETTI, 2014.

A Figura 7 foi utilizado DNA de (B. abortus cepa 2308, B. abortus cepa B19 e

B. abortus cepa RB51) para demonstrar a especificidade dos “primers” descritos por

Sangari, García-Lobo e Aguero (1994) visando a diferenciação de cepas de campo e

vacinal B19, que amplificaram 1063 pb quando DNA era de B. abortus cepa 2308 e

B. abortus cepa RB51 e 361 pb para o DNA de B. abortus cepa B19.

42

Figura 7 - Comprovação da especificidade dos “primers” eri 1 e eri 2 , Uberlândia, 2014.

(a): marcador de tamanho de fragmento de DNA (100 pb); (b): controle negativo; (c): B. abortus cepa vacinal B19; (d): B. abortus cepa 2308; (e): B. abortus cepa vacinal RB51. FONTE: LOURENCETTI (2014).

Na Figura 8 estão apresentados os resultados da técnica de hemi-nested

PCR com os “primers” eri 1 descritos por Sangari, García-Lobo e Aguero (1994) e

eri 3 descrito por Bricker e Halling (1995), que amplificam 240 pb em isolados de B.

abortus cepa de campo e 361 pb na cepa vacinal B19, utilizado na diferenciação de

isolados de campo e vacinal. Todas as 68 amostras (100%) positivas para B.

abortus, foram determinadas como sendo de origem vacinal (B19). Na Tabela 7

estão apresentadas as amostras positivas para B. abortus, e os resultados da

reação de PCR com “primers” para diferenciação da origem da cepa.

43

Figura 8 – Detecção de DNA de B. abortus cepa vacinal B19 em sêmen bovino, Uberlândia,

2014.

(a): marcador de tamanho de fragmento de DNA (100 pb); (b): B. abortus cepa 2308; (c): B.

abortus cepa vacinal B19; (d): controle negativo; (e,f,g,h,i,j,k,l,m): produto da PCR originado de

sêmen total (B. abortus cepa vacinal B19).

FONTE: LOURENCETTI (2014).

44

Tabela 7 - Resultados do AAT, SPA, técnica de PCR para determinação da espécie B. abortus e hemi-nested PCR (eri 1 e eri 3) para diferenciação da origem da cepa em campo ou vacinal (B19) de touros positivos na PCR, Uberlândia, 2014.

PCR

Amostra AAT SPA B.abortus eri 1 e 2 eri 1 e 3 Origem

1 negativo negativo positivo --------- 361 pb B19

3 negativo Positivo positivo 361 pb --------- B19





8 negativo Positivo positivo --------- 361 pb B19



12 negativo negativo positivo 361 pb --------- B19



16 negativo Positivo positivo --------- 361 pb B19























45

Tabela 7 - Resultados do AAT, SPA, técnica de PCR para determinação da espécie B. abortus e hemi-nested PCR (eri 1 e eri 3) para diferenciação da origem da cepa em campo ou vacinal (B19) de touros positivos na PCR, Uberlândia, 2014. (continuação)

PCR

Amostra AAT SPA B.abortus eri 1 e 2 eri 1 e 3 Origem

























83 negativo positivo positivo 361 pb --------- B19










46

5 DISCUSSÃO

No monitoramento sorológico dos touros não foi encontrado nenhum reagente

ao teste do AAT e somente 11 touros (11%) foram positivos no SPA. Aguiar et al.

(2001) avaliando a ocorrência de aglutininas anti-Brucella abortus em touros

encontraram resultados diferentes no exame de SPA: dos 191 bovinos avaliados,

nenhum reagiu nas provas de AAT, 2-ME e SPA. Em contraste, Campos et al.

(2003) pesquisando a prevalência da brucelose em touros na microrregião de

Goiânia encontraram resultado sorológico semelhante ao da presente pesquisa,

visto que nenhum dos 139 animais foram reagentes ao teste do AAT, embora um

dos touros negativos era oriundo de uma propriedade com histórico de abortamento.

A ausência de animais positivos no AAT desta pesquisa pode ser justificada

pela localização preferencial do agente no testículo e glândulas acessórias nos

machos bovinos, podendo induzir a formação de baixos títulos séricos de

imunoglobulinas, dificultando o diagnóstico por métodos sorológicos de triagem

(RADOSTITIS et al., 2007).

A ocorrência de oito touros positivos no SPA, negativos no AAT e positivos na

PCR pode ser justificada pelo fato da técnica de SPA ser fundamentada na detecção

de IgG e IgA no sêmen, decorrentes da reação inflamatória testicular frente ao

agente (GRASSO; CARDOSO, 1998; RADOSTITIS et al., 2007). Desta forma, esses

oito touros poderiam estar apresentando forte resposta imunológica local. Os três

touros reagentes no SPA, negativos no AAT e na PCR poderiam estar com a

bactéria presente órgão reprodutivo, mas devido à eliminação intermitente da B.

abortus no sêmen não foi possível detectar a presença do DNA bacteriano pela PCR

nessas amostras.

Em razão das dificuldades encontradas em relação ao diagnóstico sorológico

da brucelose nos touros, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem se

mostrado uma boa ferramenta para auxilio no diagnóstico dessa doença, ajudando

na certificação de material genético livre de patógenos. São poucos os trabalhos

encontrados utilizando sêmen bovino comercial, visto que a maioria das pesquisas

trabalha com amostras experimentalmente contaminadas.

A PCR vem sendo utilizada com vantagens na detecção de vários agentes

nas diferentes espécimes clínicas de origem animal, por ser uma técnica sensível,

específica e rápida. Está particularmente indicada na detecção de agentes de difícil

47

cultivo, permitindo o diagnóstico em amostras deterioradas ou contaminadas e

principalmente no monitoramento da eliminação de agentes infecciosos (PACHECO,

2007).

A extração de DNA bacteriano do sêmen total utilizando o protocolo por lise

enzimática com Proteinase k e purificação com fenol clorofórmio (adaptado de

BIASE et al., 2002), mostrou-se eficiente, pois das 100 amostras foi detectado DNA

de B. abortus em 68% . Amin et al. (2001), avaliando a detecção de DNA de B.

melitensis em sêmen bovino e ovino, obtiveram detecção de DNA apenas em

amostras de fluido seminal livres de células. Nas amostras de sêmen total ou

contendo apenas células espermáticas houve inibição da reação de polimerização,

diferente do que ocorreu no presente estudo.

Manterola et al. (2003) pesquisando B. ovis em ovinos naturalmente e

experimentalmente infectados, detectaram maior número de positivos no cultivo

microbiológico de sêmen do que na PCR. As amostras de sêmen foram colhidas

diretamente do prepúcio após eletro-ejaculação, utilizando swab estéril.

Vinodh et al. (2008) testaram quatro protocolos de extração de DNA em

amostras de sêmen contaminadas com B. abortus cepa vacinal B19 e Leptospira

spp. separadamente. Dos quatro métodos testados, fervura, fenol clorofórmio,

DNAzol e “Kit’ AuPrep (Invitrogen, USA) o último método foi o que mais removeu os

inibidores de PCR presentes no sêmen. Ao analisarem 40 amostras de palhetas de

sêmen congeladas não foi encontrada nenhuma positiva para Leptospira spp. e

somente 3 positivas para B. abortus. No mesmo estudo foi utilizado o par de

primers” específico para B. abortus descritos por Bricker e Halling (1994), que

amplificam um fragmento de 498 pb. No presente estudo, foi utilizado o mesmo par

de “primer”, mas a detecção de amostras de sêmen positivas para B. abortus foi

diferente: 68/100 positivos. A diferença de resultados pode ser explicada devido ao

uso de amostras de sêmen total que não passam pelo mesmo processo das

palhetas utilizadas para inseminação artificial.

Nas Figuras 6, 7 e 8 estão demonstrados que os “primers” utilizados BAB e

IS711 amplificaram fragmento de 498 pb nas espécies de B. abortus cepa 2308 e

nas cepas vacinais B19 e RB51 (BRICKER; HALLING, 1994), enquanto eri 1 e eri 2

amplificaram fragmento de 1063 pb na cepa de campo e vacinal RB51 e fragmento

de 361 pb na B19 (SANGARI et al., 1994); eri 3 amplificaram fragmento de 240 pb

na hemi-nested PCR na cepa de campo, e de 361 pb na cepa vacinal B19.

48

Devido à similaridade genética entre as bactérias dos gêneros Ochrobactrum

e Brucella (VELASCO et al., 1998),optou por aplicar o mesmo protocolo adotado

para amplificação de DNA de B. abortus, com os “primers” BAB e IS711 em

bactérias do gênero Ochrobactrum. Não foi observada a presença de bandas

especificas relacionadas a este gênero, confirmando-se desta forma, que o “primers”

foi específico para detecção dos 498 pb da B. abortus.

Em consequência do elevado número de amostras de sêmen (68%) com DNA

de B. abortus, e por esses touros serem sorologicamente negativos nos testes

oficiais recomendados pelo PNCEBT, foi aplicado a PCR para diferenciação entre

cepa de campo e a cepa vacinal (B19), mesmo sabendo-se da proibição da

vacinação dos machos. Várias pesquisas com diversos produtos de origem animal

foram desenvolvidas para diferenciação, com a PCR, entre cepa de campo de B.

abortus e cepa vacinal B19. Todos esses estudos demonstraram a diferenciação da

cepa vacinal B19 e cepa de campo.

Louzan (2012) trabalhou com 257 amostras de sangue e soro para o

diagnóstico de brucelose em bovinos não vacinados na idade adulta e 66 (25,6%)

foram positivos ao exame sorológico. Nas extrações de DNA do sangue total foram

encontrados 22 (8,5%) positivos para Brucella spp. “primer” bcps31. Quando se

utilizou o “primer” BruAb_0168 foram encontradas 235 (91,4%) amostras positivas

para B. abortus; quando foi utilizado o par de “primers” descritos por Sangari et al.

(2000) para diferenciação entre cepa de campo e cepa vacinal B19, foram

encontradas 145 (56,4%) amostras positivas para cepa vacinal B19, 3 (1,1%)

amostras positivas para cepa de campo e 109 (42,4%) negativas.

Pacheco (2007) extraiu DNA da urina e do leite de 14 vacas de diferentes

faixas etárias (3 a 9 anos) vacinadas na idade correta contra brucelose com a vacina

B19, durante um ciclo reprodutivo completo (sincronização do cio e fecundação, até

30 dias após o parto). Das 420 amostras analisadas de leite e urina, 86 (20%) foram

positivas para Brucella spp.. Das 210 amostras de leite (5,7%) foram positivas para

cepa vacinal B19 e das 210 amostras de urina (35,2%) foram positivas para cepa

vacinal B19. A excreção intermitente da B19 pela urina e pelo leite durante um ciclo

reprodutivo completo, com persistência em vacas de nove anos de idade, confirmou

a multiplicação das brucelas no organismo de fêmeas bovinas que haviam sido

vacinadas entre três a oito meses de idade, sugere que pode ser continuada por

toda a vida do animal.

49

Miyashiro et al. (2007) trabalharam com detecção de DNA de B. abortus e

diferenciação entre cepa de campo e cepa vacinal em amostras de queijos

clandestinos de diferentes regiões do estado de São Paulo e Minas Gerais. Das 192

amostras analisadas foi encontrado DNA de Brucella spp. em 37 (19,2%). Deste

total positivo, 100% foram diagnosticadas como Brucella abortus. Destas, 30 foram

diferenciadas como cepa vacinal (B19) e sete como cepa de campo, o que

demonstra ocorrência de cepa vacinal B19 sendo excretada pelo leite.

Nesta pesquisa, das 68 amostras positivas para DNA de B. abortus todas

(100%) estavam positivas para cepa vacinal B19, como demonstrado na Figura 9.

No presente estudo foi detectado DNA da bactéria por PCR em amostras de sêmen

de touros sorologicamente negativos. Sugere-se que a estirpe B19 manteve-se

viável e capaz de se multiplicar, provavelmente localizada no baço, linfonodos e,

principalmente, nos testículos. Mesmo mantendo-se viável a bactéria não seria

capaz de induzir títulos de anticorpos detectáveis nos exames sorológicos de

triagem AAT, mas induzir a produção de imunoglobulinas locais capazes de reagir

na prova de sêmen plasma aglutinação, como ocorreu com 11 touros desta

pesquisa.

Nos 60 touros negativos no AAT, negativos no SPA e positivos na PCR com a

cepa vacinal B19, pode-se aventar a possibilidade desses animais estarem

infectados com a cepa vacinal, desenvolvendo resposta imunológica protetora contra

a brucelose e não desenvolvendo a doença. Não foi encontrado relatos da

imunização com a cepa B19 em machos bovinos. No entanto, em cervídeos Cook et

al. (2000) demonstraram que seis machos adultos de cervo norte-americano (Cervus

elaphus nelsoni) quando receberam dose da vacina RB51 por via oral não

desenvolveram doença, e nem ocorreu a presença da cepa vacinal RB51 na cultura

de sêmen. Já 10 cervos mais jovens que foram inoculados com a vacina RB51

injetável desenvolveram bacteremia e as glândulas sexuais permaneceram

infectadas por um período prolongado. Essa bacteremia desapareceu de três

cervos, que foi constatada após a cultura bacteriana de tecidos.

A ingestão oral da cepa B19 eliminada por fêmeas vacinadas poderia estar

contaminando o ambiente e infectando os touros do presente estudo. Outra

alternativa seria a vacinação inadvertida de machos junto com fêmeas bovinas entre

3 e 8 meses de idade, que resultaria em infecção persistente na vesícula seminal e

próstata, com eliminação da bactéria pelo sêmen (Figura 9).

50

Figura 9 - Possíveis mecanismos de transmissão da B. abortus cepa vacinal B19 para touros e

manutenção no ambiente.

Possíveis mecanismos de transmissão e manutenção da cepa vacinal B19 em touros. A: Vacinação

equivocada dos machos bovinos; B: Eliminação da cepa B19 na urina de fêmeas bovinas infectando

os touros; C: Cepa B19 contaminando ambiente e ingerida junto com o alimento; D: Machos

infectados eliminando B19 na urina e contaminando o ambiente; E: Sêmen bovino contaminado com

a cepa B19 com possibilidade de transmissão para as fêmeas durante a inseminação artificial; F:

Touro adquire imunidade ao entrar em contato com a cepa B19 via oral; G: Touro infectado com a

cepa B19 apresentando sinais clínicos.


51

Embora o mecanismo de infecção por B. abortus cepa vacinal B19 seja

semelhante ao da cepa de campo, não está totalmente esclarecido quais

substancias favorecem a multiplicação no organismo hospedeiro (PACHECO, 2007).

Algumas cepas de B19 podem ser tolerantes ao eritritol e essa seja uma das causas

do desenvolvimento de infecção persistente (SANGARI et al., 1998).

Os touros de centrais também entram em contato com fêmeas adultas no

momento da coleta do sêmen. Essas fêmeas servem como manequins e na maioria

das vezes urinam quando estão juntas com os machos. Foi demonstrado no trabalho

de Pacheco (2007) que fêmeas adultas vacinadas na idade correta podem eliminar a

cepa vacinal B19 na urina. Dessa forma, esses animais possam ser uma possível

fonte de infecção.

Dos 68 (100%) touros com DNA de B. abortus cepa vacinal B19 detectado no

sêmen, 46 (67,6%) são touros de centrais de coleta e processamento de sêmen. A

presença do DNA da cepa vacinal (B19) sendo eliminado no sêmen desses animais

é preocupante no que diz respeito à saúde pública. Pois esses animais estão em

contato frequente com funcionários das centrais para coleta de sêmen e exames da

rotina das centrais, podendo significar risco de infecção, já que a vacina B19 é

patogênica para humanos.

Diante dos resultados desta pesquisa aumenta-se a preocupação com uma

prática de mistura do ejaculado de vários touros em uma mesma dose inseminante.

Atualmente essa prática é fiscalizada pelo MAPA que aprovou a regulação para a

produção e comercialização de sêmen heterospérmico de ruminantes, de acordo

com a Instrução Normativa (IN), nº. 32, de 23 de agosto de 2007. Esta IN autoriza a

mistura de ejaculados de diferentes animais para a produção de doses de sêmen,

com finalidade comercial. Até o momento, todo sêmen comercializado no Brasil

provém de central de inseminação artificial estrangeira, sendo uma tecnologia

patenteada (PECPLAN, 2009).

Tanto a utilização de sêmen a fresco (AL NAIB et al., 2011) quanto a

utilização de sêmen heterospérmico (AZMAL et al., 2004). São técnicas usadas

visando melhorar a fertilidade na inseminação artificial. A primeira é de uso mais

restrito devido à viabilidade reduzida dos espermatozóides por um curto tempo, mas

não isenta de risco de transmissão da brucelose. Já a utilização de sêmen

heterospérmico, se ocorrer em um ambiente sem o controle sanitário adequado

52

representa risco, pois será a mistura de vários ejaculados de bovinos que podem ser

possíveis veiculadores de doenças, como por exemplo, B. abortus cepa de campo.

Por isso, se faz necessário o uso de técnicas que viabilizam o diagnóstico mais

correto de bactérias veiculadas pelo sêmen.

Fuverki (2010), trabalhando com 96 amostras de palhetas de sêmen bovino,

provenientes de centrais de coleta e processamento de sêmen dos estados de

Minas Gerais, Santa Catarina, São Paulo e Paraná, utilizou “kit” comercial para

extração de DNA de Brucella spp. e Leptospira spp., e todas as 96 amostras foram

negativas para qualquer DNA bacteriano.

Já Junqueira Junior et al. (2013) aplicaram a técnica de PCR para a detecção

de DNA de Brucella spp. em 88 amostras de plasma seminal de touros de centrais

de coleta e processamento de sêmen, e de fazendas de produção de bovinos com

sorologia negativa para brucelose do estado de Minas Gerias. Das 88 amostras

analisadas, 27 (30,6%) foram consideradas positivas para DNA de Brucella spp.

Neste estudo não foi realizada a diferenciação entre cepa vacinal B19 e cepa de

campo.

Amin et al. (2001) aplicaram a técnica de PCR no sêmen de 65 touros com

sorologia positiva para brucelose, no Egito. Das amostras analisadas, sete foram

consideradas positivas para DNA de B. melitensis. Uma das possíveis explicações

para tal resultado, segundo os autores, deve-se ao fato de que as amostras foram

coletadas de animais em estágios crônicos da infecção. Nesses casos, alguns

animais param a eliminação da bactéria. Outra possibilidade a ser considerada, é

que alguns desses animais possam ter apresentado resultado falso-positivo no

exame sorológico. Isto poderia ter ocorrido devido à infecção cruzada com outros

micro-organismos Gram-negativos, como, Yersinia enterocolitica.

Estudos recentes em javalis na costa atlântica da Carolina do Sul, EUA,

demonstraram a presença de B. abortus, cepa de campo e as cepas vacinais B19 e

RB51 em uma propriedade onde a criação de gado não existe desde 1970. Esse é

um dos primeiros relatos de caso de um reservatório da vida selvagem nos EUA fora

do parque de Yellowstone, onde cervos e bisões são reservatórios de B. abortus

(STOFFREGEN et al., 2007; GODFROID et al., 2013), levantando a possibilidade da

cepa vacinal B19 infectar reservatórios silvestres.

Com os dados encontrados no presente estudo, recomenda-se aliar técnicas

moleculares aos exames realizados na rotina de estabelecimentos que

53

comercializam tal material genético, mesmo de touros negativos nos testes

sorológicos considerados oficiais. A presença do DNA da cepa vacinal B19

encontrada no sêmen dos touros deve ser investigada, para determinar qual a

importância epidemiológica dessa cepa nesses animais, e as prováveis causas de

infecção, apesar da ausência de estado de doença nestes animais.

Desta forma acredita-se que essa cepa vacinal B19 pode ter sido adquirida

pelos touros via indireta pelo convívio com fêmeas vacinadas, seria capaz de induzir

resposta imune protetora nesses animais contra B. abortus, e não provocando o

desenvolvimento de doença. Vale a salientar que a vacinação em machos de

qualquer idade, com B19 ou RB51, está proibida no Brasil, e não deve ser realizada

em nenhuma hipótese, pois ainda não se tem comprovação científica necessária

que assegure imunidade nos machos sem efeitos adversos.

54

6 CONCLUSÃO

A presença de 11 touros positivos na SPA, negativos no AAT, indica

infecção das glândulas acessórias dos animais, em detrimento de baixo

estímulo imune sérico;

A ocorrência de três touros positivos na SPA e negativos no AAT e

PCR poderia ser justificada pela eliminação intermitente de B. abortus

pelo sêmen em animais infectados;

A detecção de 68 touros eliminando cepa vacinal B19 de B. abortus

detectada pela PCR, alerta para a possibilidade de vacinação

equivocada de machos com a B19 ou mesmo a infecção dos touros

pelo contato direto com a cepa vacinal eliminada por fêmeas, sugerindo

maior rigor no uso da B19, e a adoção de técnicas moleculares

juntamente com os métodos sorológicos convencionais no diagnóstico

da brucelose em touros.

55

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ANEXO 1

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Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE … · que apenas 10% do total de fêmeas bovinas em reprodução são inseminadas anualmente no Brasil (ASBIA,2012). A Instrução