UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

CAROLINA RODRIGUES TEÓFILO

EXPRESSÃO DE CD31, CD34 E TRIPTASE EM LESÕES POTENCIALMENTE

MALIGNAS E NOS CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAIS

FORTALEZA

2012

CAROLINA RODRIGUES TEÓFILO

EXPRESSÃO DE CD31, CD34 E TRIPTASE EM LESÕES POTENCIALMENTE

MALIGNAS E NOS CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAIS

Dissertação submetida à Coordenação do

Programa de Pós Graduação em Odontologia da

Universidade Federal do Ceará como requisito

parcial para obtenção do título de Mestre em

Odontologia

Área de concentração: Clínica Odontológica

Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Negreiros

Nunes Alves

FORTALEZA

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

T29e Teófilo, Carolina Rodrigues.

Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e nos carcinomas de

células escamosas orais / Carolina Rodrigues Teófilo. – 2012.

69 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará; Centro de Ciências da Saúde;

Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem; Departamento de Enfermagem; Programa

de Pós-Graduação em Odontologia; Mestrado em Odontologia; Fortaleza, 2012.

Área de concentração: Clínica Odontológica.

Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves.

1. Mastócitos. 2. Lesões Pré-Cancerosas. 3. Neovascularização Patológica. I. Título.

CDD 616.99431

AGRADECIMENTOS

Inicialmente, gostaria de agradecer à minha orientadora, Prof.ª Ana Paula Negreiros

pela confiança em mim depositada e por toda a atenção e os conhecimentos

repassados ao longo desses 2 anos.

Aos Professores Mário Mota e Fabrício Bitu por todos os ensinamentos, pela

disponibilidade e atenção.

Ao Prof. Renato Maia que sempre foi grande incentivador durante a graduação,

especialização e, mais do que nunca, no mestrado, tendo sempre as palavras certas

nos momentos necessários.

Ao Prof. Vagnaldo pela colaboração fornecida no cálculo amostral e com o programa

para avaliação de angiogênese.

À Suzana pelo auxílio durante a realização da imunohistoquímica.

À amiga Malena Freitas, companheira fiel, que compartilhou todos os momentos

desta empreitada. Obrigada pela disponibilidade, incentivo e por toda a assistência

que você sempre prestou.

À Galyleia Meneses, por toda sua ajuda na elaboração da estatística deste trabalho

e por sua amizade.

Às colegas do mestrado Juliana Ximenes e Patrícia Thé, que, além de parceiras

nesta jornada, tornaram-se amigas para toda a vida.

Aos colegas da estomatologia João Paulo Perdigão, Artur Forte e Clarissa Pessoa

pelo apoio.

Às amigas Isabela Pacheco e Renata Galvão que muito estimularam o meu ingresso

no mestrado.

Às amigas do trabalho Andreia e Renata que me deram todo o estímulo e que

organizaram suas vidas em função dos meus horários para que eu pudesse estar

presente na Universidade.

Às coordenadoras Juliana Medeiros e Mônica Monteiro que sempre me apoiaram e

proporcionaram minha liberação da Prefeitura Municipal de Fortaleza. Sem a ajuda

de vocês a realização deste sonho não teria sido possível.

À minha família, Verônica, Edson, Mauro, Leonardo e Cristiana, que sempre torceu

muito pelo meu sucesso.

Ao meu Ramon, por ter compreendido os momentos de ausência e pelo apoio

irrestrito.

A todos da UFG, Prof.ª Aline, Prof. Elismauro, Prof.ª Rejane, Nancy, Nádia, Mariana,

Marília, Andréia, Alysson, Erildo, que me receberam de forma muito carinhosa e

repassaram conhecimentos valiosos durante minha estada em Goiânia.

Às Atendentes da faculdade, Soninha, Cotinha e Cassilda, e do posto de saúde,

Danila, Janaína, Mara, Lila e Betinha, pelo assessoramento frente aos pacientes.

Aos professores do programa de Pós-graduação em Clínica Odontológica da

Universidade Federal do Ceará por todos os ensinamentos repassados durante as

disciplinas.

Às secretárias do Programa de Pós-graduação em Odontologia, Lúcia e Janaíne,

pelo auxílio durante o mestrado.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”

Albert Einstein

RESUMO

Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares

pré-existentes, sendo um passo essencial no crescimento tumoral por fornecer

nutrição e oxigênio às células em proliferação. Uma célula que pode estar envolvida

nesse processo é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação de

vasos sanguíneos. Sua participação na indução da angiogênese tem sido sugerida

em vários tumores malignos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a

angiogênese e a densidade de mastócitos em displasias epiteliais e no carcinoma

espinocelular (CEC) de boca. Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e

quantitativo, realizado através da seleção de amostra proveniente dos arquivos do

Departamento de Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do

curso de Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará. Para a avaliação

dos mastócitos, a amostra foi constituída por 73 blocos parafinados, distribuídos

entre CEC (n=30), displasias epiteliais (n=23) e hiperplasias fibroepiteliais (HFE)

(n=20), como controle, e para a angiogênese a amostra foi de 65 blocos, sendo 24

de CEC, 19 de displasias epiteliais e 22 de HFE. Foi realizada imunohistoquímica

utilizando-se os anticorpos anti-triptase, para mastócitos e anti-CD31 e anti-CD34,

para vasos sanguíneos. Para quantificação, foram capturadas imagens digitais e, em

seguida, utilizados softwares para auxiliar na contagem dos mastócitos (Image J) e

para determinação do percentual de marcação do anticorpo (SAMM). Com relação

aos mastócitos, houve menor densidade destes nas lesões malignas em relação às

HFE e displasias (p=0,0092). Avaliando angiogênese, a expressão de CD31 mostrou

diferença entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre CEC e HFE, havendo um

maior percentual de vasos nos CEC (p<0,0001). Contudo, o CD34, não mostrou

diferença entre os grupos. O anticorpo CD31 mostrou-se melhor marcador de

angiogênese em mucosa oral do que CD34. O aumento da vascularização em CEC

oral sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral, aumentando à

medida que inicia o processo de malignização. Não foi encontrada correlação entre

mastócitos e angiogênese.

Palavras-chave: Angiogênese, Mastócitos, Carcinoma de Células

escamosas, Lesões Pré-Cancerosas

ABSTRACT

Angiogenesis is the development of new blood vessels from pre-existing capillaries,

being an essential step in tumor growth for supplying nutrition and oxygen to cells in

proliferation. A cell that may be involved in this process is the mast cell (MC), since

besides the defense function, acts in the blood vessels regulation. The MC

participation in the induction of angiogenesis has been suggested in various

malignant tumors. The purposes of this study was to evaluate angiogenesis and mast

cell density in oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma (SCC). This is

an observational, retrospective and quantitative study using the sample selection

from the archives of the Department of Legal Medicine and Pathology and Laboratory

of Oral Pathology, both from the Federal University of Ceará. For MC evaluation , the

sample was consisted of 73 paraffin blocks, distributed between SCC (n=30),

epithelial dysplasia (n=23) and hyperplasias fibroepithelial (HFE) (n = 20), as control,

and for angiogenesis the sample was 65 blocks, consisted of 24 SCC, 19 epithelial

dysplasias and 22 HFE. Immunohistochemistry was performed using the MC-

tryptase, CD31 and CD34 antibodies. For quantification, digital images were

captured and then counting was performed using Image J software. The antibody

staining percentage was determined using SAMM software. With regard to mast

cells, there was a lower density in malignant lesions in relation to HFE and dysplasia

(p = 0.0092). Evaluating angiogenesis, CD31 expression showed differences

between epithelial dysplasia and SCC and between SCC and HFE, with a greater

percentage of vessels in SCC (p <0.0001). However, CD34 expression did not differ

between groups. The CD31 antibody was shown to be a better angiogenesis marker

in oral mucosa than CD34. Increased vascularity in oral squamous cell carcinoma

suggests that angiogenesis is necessary for tumor growth, increasing when the

malignant transformation starts. However, no correlation was found between mast

cells and angiogenesis.

Key-words: Angiogenesis, Mast cell, Squamous Cell Carcinoma, Precancerous

condition

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................................... 9

2. PROPOSIÇÃO ............................................................................................................................... 15

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................... 15

2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................................. 15

3. CAPÍTULO ...................................................................................................................................... 16

CAPÍTULO 1 ....................................................................................................................................... 17

4. CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................................................. 44

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 45

ANEXOS .............................................................................................................................................. 51

ANEXO A - ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA HUMANA ................................. 51

ANEXO B – MANUAL DE NORMALIZAÇÃO PARA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE

MESTRADO E TESE DE DOUTORADONO FORMATO ALTERNATIVO DO PROGRAMA

DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ ...... 52

ANEXO C - NORMAS PERIÓDICO EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY ... 61

9

1. INTRODUÇÃO GERAL

As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema

de saúde pública no Brasil e no mundo. Segundo estimativas do Instituto Nacional

do Câncer, a previsão de novos casos de câncer de cavidade oral no Brasil para o

ano de 2012 é de 14.170 (BRASIL, 2011).

Muitos fatores contribuem para seu aumento crescente: dentre estes o

envelhecimento da população decorrente do desenvolvimento sócio-econômico,

urbanização, aditivos alimentares, pesticidas, poluição ambiental, tabagismo e

etilismo. Esses dois últimos fatores são responsáveis pelo aumento do risco relativo

da incidência de câncer bucal em até 140 vezes (PEREZ et al., 2007).

Na cavidade oral, o tipo histológico de tumor maligno mais comum,

presente entre 90 a 95% dos casos, é o Carcinoma Espinocelular (CEC). Esse tumor

representa uma neoplasia epitelial invasiva e agressiva, com graus variáveis de

diferenciação escamosa e exibem propensão para desenvolvimento de metástases

nodal precoce (CHRISTIAN, 2002).

Frequentemente, ocorre o surgimento de lesões e alterações teciduais

que precedem o surgimento de neoplasias malignas, sendo denominadas lesões

potencialmente malignas. Estas podem permanecer estáveis por um considerável

período de tempo antes de evoluir, ou não, para malignidade e invasão. As

principais lesões potencialmente malignas que acometem a cavidade oral são

leucoplasia com displasia epitelial, eritroplasia e queilite actínica. Leucoplasia é

definida como placa esbranquiçada que não pode ser caracterizada como qualquer

outra lesão e apresenta-se, histologicamente, como área hiperceratótica, com

acantose, podendo ou não haver displasia (PRADO et al., 2010), sendo considerada

potencialmente maligna quando esta última alteração está presente. A eritroplasia

apresenta-se como uma placa eritematosa que não pode ser caracterizada como

qualquer outra lesão e tem como características histológicas presença de atrofia

epitelial e displasia. A queilite actínica é uma alteração causada em lábios pela ação

da radiação solar que apresenta frequente transformação maligna e caracteriza-se,

histologicamente, por hiperceratose, acantose, atrofia epitelial, infiltrado inflamatório

crônico, elastose solar e displasia (CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008).

10

Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de

capilares pré-existentes, podendo ser fisiológica ou patológica. Esse processo

envolve múltiplos passos, sendo necessária a proliferação de células endoteliais

ativadas, migração destas para o interior de novos capilares e síntese de uma nova

membrana basal, seguida pela maturação e formação do lúmen (ASAHARA et al.,

1999). Para que ocorra o aumento do vascularização, estão envolvidos diversos

tipos celulares, como células tumorais, endoteliais, macrófagos e mastócitos (FOX;

GATTER; HARRIS, 1996). Outros fatores que influenciam positivamente no sinal

para angiogênese são ação de proteínas originadas a partir de oncogenes, hipóxia,

baixo pH, nutrição deficiente e atuação de formas de oxigênio reativas (BERGERS;

BENJAMIN, 2003).

Nos tumores, quando as células endoteliais são estimuladas

positivamente, começam a secretar proteases e outras enzimas que promovem a

digestão da membrana basal do vaso. A dissolução da matriz extracelular promove,

então a liberação de fatores pró-angiogênicos. A junção entre as células endoteliais

torna-se frouxa e os novos vasos brotam em direção ao estímulo. As células

hematopoiéticas progenitoras também contribuem para a formação do lúmen capilar.

Em seguida, ocorre a maturação e estabilização, resultando em microvasos

tortuosos, irregulares e com membrana basal fragmentada, o que aumenta a

permeabilidade (EICHHORN et al., 2007).

A angiogênese constitui um passo essencial no crescimento tumoral e

nas metástases, pois fornece nutrição e oxigênio às células que estão em

proliferação, promove drenagem de metabólitos, além de funcionar como via de

transporte de células tumorais (FOLKMAN, 1990; SOUZA; FREITAS; MIRANDA,

2007). Segundo Folkman (1971), as neoplasias iniciam-se como um nódulo

avascular e só são capazes de crescer além de 2 milímetros nas três dimensões

(FOLKMAN, 1971; FOLKMAN et al., 1989) quando tornam-se vascularizadas, sendo

portanto, fundamental na transição da hiperplasia até a neoplasia. A principal

diferença entre a angiogênese que ocorre em um tecido normal e a patológica é que

esta última se dá de maneira desorganizada (TERMAN; STOLETOV, 2001) e os

vasos formados são tortuosos, dilatados, formando braços e shunts (MAAHS, 2008).

A angiogênese tumoral se dá pelo desequilíbrio entre fatores de regulação positivos

11

e negativos, havendo um aumento da secreção de fatores pró-angiogênicos e/ou

diminuição de fatores anti-angiogênicos. (RIBATTI; VACCA; DAMMACCO, 1999)

Uma célula que pode estar diretamente envolvida no processo de

neoangiogênese é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação

da homeostase de vasos sanguíneos (ALKHABULI, 2007). Sua participação na

indução da angiogênese tem sido sugerida em vários tumores malignos (ACIKALIN

et al., 2005; CHAN et al., 2005; DABIRI et al., 2004; ELPEK et al., 2001; TUNA et

al., 2006).

A grande quantidade de substâncias secretadas pelos mastócitos torna

difícil determinar qual será a atuação dessa célula no ambiente, principalmente em

meio a neoplasias. A produção de agentes que promovem tanto a inibição (IL-1, IL-

4, IL-6, TNF-α) quanto a progressão tumoral (VEGF, bFGF, triptase, quimase, TGF-

β, NGF, MMP-2 e 9) faz com que esta célula possa acarretar efeitos diferentes nos

diversos tumores, dependo das condições locais do estroma (THEOHARIDES;

CONTI, 2004).

A literatura é controversa em correlacionar densidade de mastócitos e

neoplasias. Há relatos de aumento de mastócitos em lesões malignas quando

comparadas ao tecido normal em esôfago (ELPEK et al., 2001), pulmão (TOMITA;

MATSUZAKI; ONITSUKA, 2000) e linfoma (DUSE et al., 2011). Nesses casos,

acredita-se que exista uma atuação dos mastócitos na progressão tumoral através

da liberação de mediadores que favorecem a angiogênese. Entretanto, estudo

recente em útero não achou relação estatisticamente significante, em neoplasias

malignas, entre angiogênese e mastócitos, não havendo aumento do número destes

com progressão da doença (GOKSU EROL et al., 2011). Em neoplasias e lesões

potencialmente malignas de cavidade oral, os trabalhos mostram, em sua maioria,

resultados que levam a crer que esta célula participe da progressão tumoral

(IAMAROON et al., 2003; JAHANSHAHI; SABAGHIAN, 2012; MICHAILIDOU;

MARKOPOULOS; ANTONIADES, 2008; MOHTASHAM et al., 2010; SHARMA et

al., 2010). No entanto, outros apresentam resultados discordantes (KALRA et al.,

2012; OLIVEIRA-NETO et al., 2007).

12

A capacidade das células tumorais induzirem a angiogênese parece estar

relacionada com o grau de agressividade da neoplasia (MAEDA et al., 1998). Além

disso, existe uma forte associação entre o grau de vascularização e o estágio

avançado da doença, profundidade de invasão em tumores e as metástases (POON;

FAN; WONG, 2001).

Nos mais variados tumores humanos a angiogênese pode ser mensurada

por microscopia ótica, através da quantificação dos vasos sanguíneos presentes nas

áreas de maior densidade destes nos tecidos. Sua evidenciação é feita aplicando-se

a técnica de imunoistoquímica, utilizando-se anticorpos com afinidade por epítopos

específicos da célula endotelial (SOUZA et al., 2007).

Os marcadores para células endoteliais podem ser divididos em duas

categorias: marcadores de proliferação/atividade do endotélio ou marcadores pan-

endoteliais, onde estão enquadrados o anti-CD31 e o anti-CD34. Esses anticorpos

apresentam sensibilidade tanto para pequenos quanto para grandes vasos e a

intensidade de marcação é semelhante em tecidos normais e tumorais. O anti-CD31

ou PECAM-1 pode apresentar marcação cruzada com plaquetas, fibroblastos e

células inflamatórias (macrófagos e linfócitos), porém essas células podem ser

facilmente identificadas, e removidas da contagem, pela morfologia. O anti-CD34

pode marcar além de células endoteliais, vasos linfáticos e fibroblastos

(MIDDLETON et al., 2005; PARUMS et al., 1990; SCHLINGEMANN et al., 1990;

VERMEULEN et al., 1996).

Atualmente, existem vários métodos que buscam avaliar a atividade

angiogênica. O método mais comumente usado é a densidade microvascular (MVD),

que consiste na contagem de vasos nos campos com maior concentração vascular

(WEIDNER, 1995; WEIDNER et al., 1993). A técnica de Chalkley utiliza os mesmos

passos, porém durante a contagem é utilizado um gratículo contendo 25 pontos

randomizados, sendo contados os pontos que estão em sobreposição aos

vasos(FOX et al., 1994). Outra forma de mensurar a angiogênese é o Sistema de

análise multiparamétrica computadorizada (CIAS), que preconiza a contagem

semiautomatizada, além de fazer uma análise morfométrica (dimensão dos vasos,

área do lúmen, perímetro vascular e percentual da área corada pela

13

imunohistoquímica) (BARBARESCHI et al., 1995). Foi descrito também a utilização

da análise da angiogênese através da mensuração da porcentual da área marcada

pelos anticorpos através do software SAAM, específico para este fim (DORNELAS,

2009; FECHINE-JAMACARU, 2006).

Correlações entre a MVD e prognóstico tem sido encontradas em várias

neoplasias malignas, como câncer de mama (ARNES et al., 2011), próstata

(WEIDNER et al., 1993), pulmão (MACCHIARINI et al., 1992) e melanoma

(GRAHAM et al., 1994).

Não existe um consenso na literatura quanto à utilização da densidade

microvascular como fator predictor de metástases e evolução clínica em lesões orais

malignas, tendo, alguns autores, achado correlação positiva (GALLO et al., 1998;

GASPARINI et al., 1993; KLIJANIENKO et al., 1995; WILLIAMS et al., 1994) e

outros nenhuma correlação (ARTESE et al., 2001; DRAY; HARDIN; SOFFERMAN,

1995; EROVIC et al., 2005; GLEICH et al., 1997; GLEICH et al., 1996; HEGDE et

al., 1998; LEEDY et al., 1994).

Os trabalhos existentes também são controversos quanto à possibilidade

de associação entre grau de angiogênese e grau histológico (AL-HARRIS et al.,

2008; ARTESE et al., 2001; BRAHIMI-HORN; BERRA; POUYSSEGUR, 2001;

KAYASELCUK et al., 2004; SIDDIQUI et al.).

Desde 1989, Folkman sugeriu que a angiogênese inicia-se em estágios

precoces da carcinogênese, antes da formação do tumor. Porém, poucos trabalhos

dedicam-se a estudar a angiogênese em lesões potencialmente malignas. Foi

encontrado aumento gradual da densidade microvascular, comparando-se ao tecido

normal, em lesões potencialmente malignas em útero (SMITH-MCCUNE; WEIDNER,

1994), estômago (FENG et al., 2002), tireóide (DE LA TORRE et al., 2006) e nevos

displásicos (EINSPAHR et al., 2007). Em boca, alguns estudos mostram que a

progressão do tecido normal, para displasia e CEC está associada ao aumento da

vascularização (ABBAS et al., 2007; CEDENO; TONINO, 2005; MACLUSKEY et

al., 2000; PAZOUKI et al., 1997; SAUTER et al., 1999; TIPOE; JIN; WHITE, 1996).

14

O presente trabalho tem como intuito avaliar a densidade de mastócitos e

a angiogênese em displasias epiteliais e carcinoma espinocelular de boca, buscando

correlacioná-los com a progressão das lesões potencialmente malignas para a

malignidade.

15

2. PROPOSIÇÃO

2.1 Objetivo Geral

Estudar a expressão dos marcadores CD31 e CD34 e avaliar mastócitos em lesões

potencialmente malignas e câncer de boca.

2.2 Objetivos Específicos

1- Avaliar a expressão de marcadores da angiogênese (Anti-CD31 e Anti-CD34)

em lesões potencialmente malignas de boca.

2- Avaliar a expressão de marcadores da angiogênese (Anti-CD31 e Anti-CD34)

em lesões malignas de boca.

3- Avaliar a densidade de mastócitos em lesões potencialmente malignas de

boca.

4- Avaliar a densidade de mastócitos em carcinoma de células escamosas oral.

5- Correlacionar a densidade de mastócitos com o percentual de vasos

sanguíneos em lesões potencialmente malignas e carcinoma de células

escamosas de cavidade oral.

.

16

3. CAPÍTULO

Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do

Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará,

que regulamenta o formato alternativo para dissertações de Mestrado e teses de

Doutorado e permite a inserção de artigos científicos de autoria ou co-autoria do

candidato. Por se tratar de pesquisas envolvendo seres humanos, ou parte deles, o

projeto de pesquisa foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa,

tendo sido aprovado (Anexo 1).

Capítulo 1:

“Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e nos

carcinomas de células escamosas orais”

Teófilo, CR; Batista, AC; Sousa, FB; Mota, MRL; Silva, MRF; Alves, APNN.

Este artigo será submetido à publicação no periódico Experimental and Molecular

Pathology

17

CAPÍTULO 1

Título: Expressão de CD31, CD34 e triptase em lesões potencialmente malignas e

nos carcinomas de células escamosas orais

Autores:

Teófilo, CRa; Batista, ACb; Sousa, FBd; Mota, MRLc; Silva, MRFa; Alves, APNNAc

a Mestranda em Clínica Odontológica, Faculdade de Farmácia, Odontologia e

Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Brasil

b Doutora em Odontologia, Professora Adjunta da Universidade Federal de Goiás,

Brasil

c Doutor em Farmacologia, Professor Adjunto da Universidade Federal do Ceará,

Brasil

d Doutor em Odontologia, Professor Adjunto da Universidade Federal do Ceará,

Brasil

À Carolina Rodrigues Teófilo

Av. Padre Antônio Tomás, nº 2160 ap. 201 – Aldeota

CEP: 60140-160

Fortaleza-Ceará-Brasil

Fone: +55 85 88041003

e-mail: carolrt@uol.com.br

18

Resumo

Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares

pré-existentes, sendo um passo essencial no crescimento tumoral por fornecer

nutrição e oxigênio às células em proliferação. Uma célula que pode estar envolvida

nesse processo é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação de

vasos sanguíneos. Sua participação na indução da angiogênese tem sido sugerida

em vários tumores malignos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a

angiogênese e a densidade de mastócitos em displasias epiteliais e no carcinoma

espinocelular (CEC) de boca. Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e

quantitativo, realizado através da seleção de amostra proveniente dos arquivos do

Departamento de Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do

curso de Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará. Para a avaliação

dos mastócitos, a amostra foi constituída por 73 blocos parafinados, distribuídos

entre CEC (n=30), displasias epiteliais (n=23) e hiperplasias fibroepiteliais (HFE)

(n=20), como controle, e para a angiogênese a amostra foi de 65 blocos, sendo 24

de CEC, 19 de displasias epiteliais e 22 de HFE. Foi realizada imunohistoquímica

utilizando-se os anticorpos anti-triptase, para mastócitos e anti-CD31 e anti-CD34,

para vasos sanguíneos. Para quantificação, foram capturadas imagens digitais e, em

seguida, utilizados softwares para auxiliar na contagem dos mastócitos (Image J) e

para determinação do percentual de marcação do anticorpo (SAMM). Com relação

aos mastócitos, houve menor densidade destes nas lesões malignas em relação às

HFE e displasias (p=0,0092). Avaliando angiogênese, a expressão de CD31 mostrou

diferença entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre CEC e HFE, havendo um

maior percentual de vasos nos CEC (p<0,0001). Contudo, o CD34, não mostrou

diferença entre os grupos. O anticorpo CD31 mostrou-se melhor marcador de

angiogênese em mucosa oral do que CD34. O aumento da vascularização em CEC

oral sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral, aumentando à

medida que inicia o processo de malignização. Não foi encontrada correlação entre

mastócitos e angiogênese.

Palavras-chave: Angiogênese, Mastócitos, Carcinoma de Células escamosas,

Lesões Pré-Cancerosas

19

Introdução

As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema de saúde

pública no Brasil e no mundo. Muitos fatores contribuem para seu aumento

crescente: dentre estes se destacam, envelhecimento da população decorrente do

desenvolvimento sócio-econômico, aditivos alimentares, pesticidas, poluição

ambiental, tabagismo e etilismo. Esses dois últimos fatores são responsáveis pelo

aumento do risco relativo da incidência de câncer bucal em até 140 vezes (Perez et

al., 2007).

Segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer, a previsão de novos casos de

câncer de cavidade oral no Brasil para o ano de 2012 é de 14.170.

Aproximadamente 70% destes casos ocorrerão no sexo masculino (Brasil, 2011).

Na cavidade oral, o tipo histológico de tumor maligno mais comum, presente entre

90 a 95% dos casos, é o Carcinoma Espinocelular (CEC). Esse tumor representa

uma neoplasia epitelial invasiva e agressiva, com graus variáveis de diferenciação

escamosa e exibe propensão para desenvolvimento de metástases nodal precoce

(Christian, 2002). Frequentemente, ocorre o surgimento de lesões displásicas e

alterações teciduais que precedem o surgimento de neoplasias malignas. Estas

podem permanecer estáveis por um considerável período de tempo antes de evoluir

para malignidade e invasão. As principais lesões potencialmente malignas que

acometem a cavidade oral são leucoplasia com displasia, eritroplasia e queilite

actínica (Cavalcante et al., 2008; Prado et al., 2010).

Angiogênese é o surgimento de um novo vaso sanguíneo a partir de capilares pré-

existentes. Ela constitui um passo essencial no crescimento tumoral e nas

20

metástases, pois fornece nutrição e oxigênio às células que estão em proliferação,

promove drenagem de metabólitos, além de funcionar como via de transporte de

células tumorais (Folkman, 1990; Souza et al., 2007). Segundo Folkman, as

neoplasias iniciam-se como um nódulo avascular (Folkman, 1971) e só são capazes

de crescer além de 2 milímetros nas três dimensões quando se tornam

vascularizadas, sendo portanto, fundamental na transição da hiperplasia até a

neoplasia (Folkman et al., 1989). A principal diferença entre a angiogênese que

ocorre em um tecido normal e a patológica é que esta última se dá de maneira

desorganizada (Terman and Stoletov, 2001) e os vasos formados são tortuosos,

dilatados, formando braços e shunts (Maahs, 2008). A angiogênese tumoral se dá

pelo desequilíbrio entre fatores de regulação positivos e negativos, havendo um

aumento da secreção de fatores pró-angiogênicos e/ou diminuição de fatores

antiangiogênicos (Ribatti et al., 1999).

Para que ocorra o aumento da vascularização em neoplasias, há participação de

diversos tipos celulares, como células tumorais, endoteliais, macrófagos e

mastócitos (Fox et al., 1996). Outros fatores que influenciam positivamente no sinal

para angiogênese são: ação de proteínas originadas a partir de oncogenes, hipóxia,

baixo pH, nutrição deficiente e atuação de formas de oxigênio reativas (Bergers and

Benjamin, 2003).

A capacidade das células tumorais induzirem a angiogênese parece estar

relacionada com o grau de agressividade da neoplasia (Maeda et al., 1998). Além

disso, existe uma forte associação entre o grau de vascularização e o estágio

avançado da doença, profundidade de invasão em tumores e as metástases (Poon

et al., 2001).

21

Nos mais variados tumores humanos a angiogênese pode ser mensurada por

microscopia ótica, através da quantificação dos vasos sanguíneos presentes nas

áreas de maior densidade destes nos tecidos. Sua evidenciação é feita aplicando-se

a técnica de imunohistoquímica, utilizando-se anticorpos com afinidade por epítopos

específicos da célula endotelial (Souza et al., 2007).

Uma célula que pode estar diretamente envolvida no processo de evolução de

neoplasias é o mastócito, pois, além da função de defesa, atua na regulação da

homeostase de vasos sanguíneos (Alkhabuli, 2007). Sua participação nesse

microambiente tem sido sugerida em vários tumores malignos (Acikalin et al., 2005;

Chan et al., 2005; Dabiri et al., 2004; Elpek et al., 2001; Tuna et al., 2006).

Mastócitos são células imunes originadas na medula óssea e que migram para os

tecidos periféricos, onde sofrem maturação final (Chen et al., 2005; Galli, 1990). São

células de longa duração que residem principalmente no tecido conjuntivo, mais

comumente próximo ao epitélio (Gurish and Boyce, 2002). Em secções histológicas,

apresentam-se como células arredondadas ou alongadas, com diâmetro entre 8 e

20µ, apresentando grande quantidade de grânulos em seu citoplasma (Dvorak,

2005). A constituição dos grânulos dos mastócitos é variável, podendo este produzir

e secretar uma série de substâncias como quimases, fator de crescimento de

fibroblastos básico (bFGF), triptase, heparina, histamina, fator de necrose tumoral

alfa (TNF-α), várias interleucinas (IL-3, 4, 5, 6, 8, 10, 13,16), quimiocinas ,

metaloproteinases (MMP-2 e 9), fator de transformação do crescimento beta (TGF-

β), fator de crescimento neural (NGF), fator de crescimento derivado de plaquetas

(PDGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Theoharides and Conti,

2004; Theoharides et al., 2007; Walsh, 2003).

22

Os mastócitos foram inicialmente descritos em 1878 (Ehrlich, 1878) e, a partir daí,

desenvolveu-se uma série de estudos direcionados a sua função nas alergias e

resposta frente a parasitas (Drennan, 1951; Gurd, 1911; Keller, 1971). Embora a

presença de mastócitos em volta de massas tumorais já tenha sido descrita por

Ehrlich em seus estudos iniciais, somente recentemente a atenção dos

pesquisadores se voltou mais fortemente para a atuação dessa célula em processos

neoplásicos. Em cavidade oral, existem poucos trabalhos relatados na literatura e os

resultados são conflitantes (Oliveira-Neto et al., 2007; Kalra et al., 2012; Iamaroon et

al., 2003; Jahanshahi and Sabaghian, 2012; Michailidou et al., 2008; Mohtasham et

al., 2010; Sharma et al., 2010).

Desde 1989, Folkman sugeriu que a angiogênese inicia-se em estágios precoces da

carcinogênese, antes da formação do tumor. Porém, poucos trabalhos dedicam-se a

estudar a angiogênese em lesões potencialmente malignas. Foi encontrado aumento

gradual da densidade microvascular, comparando-se ao tecido normal, em lesões

potencialmente malignas originadas em útero (Smith-McCune and Weidner, 1994),

estômago (Feng et al., 2002), tireóide (de la Torre et al., 2006) e nevos displásicos

(Einspahr et al., 2007). Alguns estudos, em boca, mostram que a progressão do

tecido normal, para displasia epitelial e Carcinoma espinocelular (CEC) está

associada ao aumento da vascularização (Abbas et al., 2007; Cedeno and Tonino,

2005; Macluskey et al., 2000; Pazouki et al., 1997; Sauter et al., 1999; Tipoe et al.,

1996), entretanto, ainda há resultados conflitantes na literatura (Ashkavandi et al.,

2010; Shivamallappa et al., 2011; Tae et al., 2000).

Este trabalho tem por objetivo avaliar a angiogênese e a densidade de mastócitos

em displasias epiteliais e no carcinoma de células escamosas de cavidade oral.

23

Materiais e Métodos

Amostra

A amostra foi dimensionada para proporcionar uma confiança de 95% para detectar

diferenças relevantes entre os três grupos considerando a densidade de mastócitos.

Estabeleceu-se que nos pacientes portadores de CEC haveria um aumento de pelo

menos 10% quando comparado com os demais grupos (Gandolfo et al., 2011).

Portanto, o tamanho da amostra foi calculado em torno de 26 pacientes em cada

grupo.

Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo e quantitativo através da seleção

de 73 blocos parafinados (amostra 1), para avaliação de mastócitos e 65 para

avaliação de angiogênese (amostra 2), provenientes do arquivo do Departamento de

Patologia e Medicina Legal e do laboratório de Patologia Bucal do curso de

Odontologia, ambos da Universidade Federal do Ceará-Brasil, constituídos por

fragmentos de lesões de hiperplasia fibroepitelial, utilizadas como controle,

displasias orais e carcinoma espinocelular oral.

Dos laudos histopatológicos, foram retirados os dados relacionados à idade dos

pacientes, ao sexo e à localização da lesão, tabulados através do software excel

2007 e os resultados mostrados através de estatística descritiva.

Para seleção dos casos, deu-se preferência a biópsias realizadas mais

recentemente (até 4 anos), com blocos parafinados íntegros. Antes de serem

selecionadas para a amostra, todas as lâminas foram revisadas por um patologista

oral e excluídas as que apresentavam grande quantidade de inflamação ou que não

possuíam fragmento representativo da lesão.

24

Este trabalho foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa Humana

da Universidade Federal do Ceará, sob número de protocolo 77/09.

Imunohistoquímica (IH)

Os ensaios imunohistoquímicos foram realizados em cortes histológicos de 5m de

espessura, dispostos em lâminas histológicas previamente silanizadas, identificados,

seguindo-se a técnica de estreptavidina-biotina-peroxidase padrão, descrito por Hsu

(Hsu et al., 1981a; Hsu et al., 1981b) com modificações. Como anticorpos primários,

foram utilizados a anti-triptase (M7052, DAKO) na diluição 1:1000, para avaliação de

mastócitos e o anti-CD34(M7165, DAKO) e o anti-CD31 (M0823, DAKO) , ambos na

proporção 1:100, para avaliação de angiogênese. As lâminas silanizadas foram

incubadas em estufa a 70ºC por 3 horas e, após este período, desparafinizadas em

xilol e gradiente de álcool. Foi realizada a recuperação antigênica, em tampão pH 9

(S2367, DAKO Target Retrival), em câmara de pressão pascal (3:30 minutos, 125oC,

18-24 psi). Após bloqueio da atividade endógena da peroxidase (solução aquosa de

H202 a 10V), foram incubados os anticorpos primários, por 12 horas a 4oC em

câmara úmida. Após lavagem, foi adicionado o anticorpo secundário biotinilado (60

minutos) seguido do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (60 minutos), sendo

revelado com o cromógeno diaminobenzidina (DAB) (K3468, DAKO) por 7 a 8

minutos, tendo o peróxido de hidrogênio como substrato. Após a revelação as

lâminas foram contra-coradas com hematoxilina de Harris por 30 segundos e

montadas. Como controle negativo, foi omitido o anticorpo primário para avaliar

presença de alguma possível reação de interferência entre as células teciduais e o

complexo estreptavidina-biotina-peroxidase que pudesse comprometer os

resultados. Como controle positivo, avaliando a capacidade dos anticorpos de

25

ligarem-se às células-alvo, utilizou-se o mastocitoma e o granuloma piogênico. Após

a reação, os vasos puderam ser evidenciados pela coloração acastanhada em

contraste com um fundo discretamente azulado.

Captura de Imagens Digitais

Imagens digitais dos preparados histológicos foram capturadas de forma

padronizada, por um patologista experiente, utilizando-se, para tanto, um

microscópio de luz (Olympus CX 31, Olympus Corporation, Japão) equipado com

uma câmera digital (Sony 10.1 megapixels, Sony Corporation, Japão). O

procedimento compreendeu, inicialmente, uma varredura do tumor, utilizando o

pequeno aumento (40 vezes), com a finalidade de identificar as zonas de maior

densidade. Para cada tumor, selecionaram-se três zonas. Em seguida, utilizando

uma magnificação de 200 vezes, foram capturadas imagens digitais coloridas dos

campos escolhidos. As imagens foram armazenadas no formato Windows® Bitmap

(BMP)

Densidade de Mastócitos

Com o auxílio do software adaptado para microscopia (MBF Image J), foram

contadas as células coradas em marrom que possuíam morfologia compatível com

mastócito, determinando a densidade de mastócitos (DM) em cada campo.

Percentual de Marcação Vascular

Para quantificação vascular, foi utilizado o Sistema de Análise Morfométrica

(SAMM), um programa de computador desenvolvido especificamente para tal

finalidade (FECHINE-JAMACARU, 2006). O sistema foi previamente calibrado para

reconhecer o espectro de cores relativo às estruturas de interesse

26

(microvasculatura), de acordo com a técnica de coloração empregada. Esse

procedimento habilita o software a identificar e segmentar automaticamente os

vasos sanguíneos (separando-os dos demais componentes do preparado). Todavia,

novos parâmetros de segmentação foram realizados com relação ao ajuste da cor e

área de interesse, quando se julgou como inadequado o resultado do procedimento

automático. Concluída a segmentação, o software realizou a determinação do

percentual de superfície do campo corado. Para tanto, realizava o cálculo da

densidade de área (DA), que era definida pelo quociente entre a área ocupada pela

microvasculatura e a área total do campo analisado.

Para análise, foram consideradas duas metodologias: a média dos três campos

selecionados e a área com maior concentração de mastócitos/vasos.

Análise estatística

Para comparação de densidade de mastócitos entre os grupos, utilizou-se

os teste de Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, através do software

estatístico GraphPad Prism 5 para Windows. Foram considerados estatisticamente

significantes valores de p<0,05.

Resultados

Descrição das amostras

As amostras selecionadas foram compostas por lesões presentes em indivíduos com

idade variando entre 36 e 92 anos, com média de 64 anos para amostra 1 e 59 anos

para amostra 2. Com relação ao sexo, houve leve predominância de indivíduos do

27

sexo masculino (56%) na amostra 1, enquanto que na amostra 2 os homens

representavam (50,3%). As amostras utilizadas foram colhidas de lábio, palato,

mucosa jugal, língua, gengiva, soalho e freio labial.

Densidade de mastócitos (DM) por análise imunohistoquímica

Os mastócitos foram claramente identificados pela reação de imunohistoquímica

utilizando-se o anticorpo anti-triptase, como células com coloração marrom, ovais ou

alongadas (Figura 1). Os controles negativos mostraram ausência total de

marcação.

A contagem numérica de mastócitos no campo com maior concentração mostrou

como resultados nos grupos CEC, displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial

(HFE), respectivamente, 22,34±14,38, 32,04±16,04 e 34,00±18,53. Quando se

utilizou a média entre os 3 campos, a DM encontrada em CEC foi de 16,15±10,65,

em displasia epitelial de 24,61±12,30 e hiperplasia fibroepitelial 25,74±13,41. Após

testes estatísticos, foram encontrados resultados semelhantes nas duas

metodologias, havendo diferença estatisticamente significante entre o grupo de

lesões malignas em relação às HFE e displasias epiteliais (p=0,0092 e p=0,0038),

tendo o CEC menor concentração de mastócitos que as demais lesões (Gráfico 1).

Análise da densidade de marcação vascular (%)

Os vasos sanguíneos foram identificados pela reação de imunohistoquímica

utilizando-se os anticorpos anti-CD31 e anti-CD34, como células com coloração

marrom, solitárias (considerados brotos vasculares) ou agrupamentos celulares

28

formando ou não lumens. O controle negativo mostrou ausência total de marcação.

Observou-se marcação mais intensa quando foi utilizado o anticorpo anti-CD34,

havendo também uma maior coloração de fundo. O anti-CD31 marcou mais

fracamente, porém foi mais específico para estruturas vasculares (Figura 1).

Com relação à morfologia dos vasos encontrados, observou-se que, nas HFE, estes

se mostram mais calibrosos que nas demais lesões.

O anticorpo anti-CD31 mostrou densidade de marcação vascular de 9,6±5,4% no

grupo CEC, 4,4±3,4% nas displasias epiteliais e 3,3±1,8% em HFE. Quando foi

considerada a média entre 3 campos, os resultados de CEC, displasia epitelial e

HFE foram, respectivamente, de 7±3,9%, 3±2,2% e 2,4±,3%. Foi encontrada

diferença estatisticamente significante entre os grupos CEC e displasia epitelial e

entre CEC e hiperplasia fibroepitelial (p< 0,0001), porém não houve diferença entre

HFE e displasia epitelial (Tabela 1).

Avaliando a expressão do anticorpo anti-CD34, obteve-se como resultado da

densidade de marcação vascular em 1 e 3 campos, respectivamente, 8,7±3,7% e

6,1±2,4% em CEC; 9,9±6,8% e 6,2±4,4% em displasia epitelial; e 8,8±6,3% ;

6,1±4,2% em HFE. Não houve diferença estatisticamente significante entre os

grupos (p=0,91, avaliando 1 campo, p=0,67 considerando média de 3 campos).

Para ambos os anticorpos, encontrou-se resultados semelhantes ao analisar 1 ou 3

campos (Gráfico 2).

Discussão

29

As neoplasias malignas de cavidade oral constituem um sério problema de saúde

pública no Brasil e no mundo. De acordo com estudo Indiano, cerca de 80% das

neoplasias de cavidade oral são precedidas por lesões potencialmente malignas

(LPM) (Gupta et al., 1989). O percentual de LPM que sofrem transformação maligna

pode variar de 6,6 a 36,4% (Arduino et al., 2009; Ho et al., 2009; Lumerman et

al.,1995). Portanto, é de grande importância identificar a ocorrência de mudanças no

padrão dessas lesões que indiquem a progressão destas para malignidade,

possibilitando o desenvolvimento de agentes que visem paralisar deste processo.

Segundo os estudos de Folkman (Folkman et al., 1989), há incremento da

vascularização antes mesmo que haja invasão tumoral, durante a formação de

ilhotas hiperplásicas. Também foi demonstrado que os fatores pró-angiogênicos já

estão presentes nas lesões pré-invasivas em lesões de ânus (Mullerat et al., 2003).

Entretanto, outros autores acreditam que as lesões potencialmente malignas

permanecem adormecidas antes de tornarem-se angiogênicas e proliferar

(Moriyama et al., 1997; Shieh et al., 2004).

Inúmeros trabalhos têm se proposto a avaliar angiogênese em lesões

potencialmente malignas. Em alguns, é mostrada um aumento dos vasos, à medida

que a lesão progride para a malignidade, havendo uma menor quantidade de vasos

no epitélio normal, aumentando na displasia epitelial e tornando-se maior no CEC

(Carlile et al., 2001; Cedeno and Tonino, 2005; Gandolfo et al., 2011; Iamaroon et

al., 2003; Macluskey et al., 2000; Michailidou et al., 2008; Mohtasham et al., 2010;

Pazouki et al., 1997). Outro estudo mostra não haver diferença entre tecido normal e

displasia epitelial, somente sendo possível encontrar diferença significante entre

CEC e tecido normal (Shivamallappa et al., 2011), o que corrobora com os achados

30

do presente trabalho. Para justificar tal resultado, o autor sugere que somente há

incremento da angiogênese quando a lesão se torna maligna. Já Tae et al. e

Ashkavandi et al., não encontraram diferença estatisticamente significante entre

mucosa normal, displasia epitelial e CEC (Ashkavandi et al., 2010; Tae et al., 2000) e

afirmam que comparar os trabalhos existentes na literatura é tarefa difícil, uma vez

que as metodologias empregadas para imunohistoquímica, para contagem vascular

e o anticorpo utilizado são diferentes, além de existir a variável do examinador que

pode influenciar nos resultados. Ashkavandi et al., que utilizou como anticorpo o

anti-CD34, afirma, ainda, que este não é capaz de diferenciar vasos pré-existentes

de neovascularização (Ashkavandi et al., 2010). Neste trabalho, quando empregado

o anticorpo anti-CD34, também não foi encontrada diferença significante entre

hiperplasia fibroepitelial, displasia epitelial e carcinoma espinocelular. Observou-se

que, em alguns casos, o CD34 mostrou marcações de outras estruturas além de

vasos, principalmente fibras colágenas no tecido conjuntivo, o que pode ter

contribuído para a não obtenção de diferença entre os grupos.

Os artigos existentes são controversos ao correlacionarem densidade de mastócitos

e neoplasias. Há relatos de aumento de mastócitos em lesões malignas quando

comparadas ao tecido normal em esôfago (Elpek et al., 2001), pulmão (Tomita et al.,

2000) e linfoma (Duse et al., 2011). Nesses casos, acredita-se que exista uma

atuação dos mastócitos na progressão tumoral através da liberação de mediadores

que favorecem a angiogênese. Entretanto, estudo recente avaliando neoplasias

uterinas não achou relação estatisticamente significante, em neoplasias malignas,

entre angiogênese e mastócitos, não havendo aumento do número destes com

progressão da doença (Goksu Erol et al., 2011).

31

No presente trabalho, encontrou-se diminuição do número de mastócitos com a

evolução da lesão, havendo diferença estatisticamente significante entre os grupos

de hiperplasia fibroepitelial e displasia epitelial e o grupo de CEC. Estes dados são

concordantes com os resultados descritos por Oliveira-Neto et al. e Kalra et al.(Kalra

et al., 2012; Oliveira-Neto et al., 2007). Porém, outros autores mostraram um

aumento de mastócitos proporcionalmente ao aumento de angiogênese, ocorrendo

maior densidade de mastócitos à medida que a agressividade das lesões bucais

progredia (Iamaroon et al., 2003; Jahanshahi and Sabaghian, 2012; Michailidou et

al., 2008; Mohtasham et al., 2010; Sharma et al., 2010). Provavelmente, o

comportamento biológico variado das neoplasias bem como o microambiente

diferenciado, determinados por hábitos individuais ou do ambiente, expliquem esses

resultados divergentes. Ressalta-se que o trabalho de Oliveira-Neto, onde se

encontraram resultados semelhantes aos do presente estudo foram, igualmente,

desenvolvidos na população brasileira.

A grande quantidade de substâncias secretadas pelos mastócitos torna difícil

determinar qual será a atuação dessa célula no ambiente, principalmente em meio a

neoplasias. A produção de agentes que promovem tanto a inibição (IL-1, IL-4, IL-6,

TNF-α) quanto a progressão tumoral (VEGF, bFGF, triptase, quimase, TGF-β, NGF,

MMP-2 e 9) faz com que esta célula possa acarretar efeitos diferentes nos diversos

tumores, dependo das condições locais do estroma (Theoharides and Conti, 2004).

Sabe-se que a maioria dos indivíduos que apresenta câncer oral ou alterações

potencialmente malignas faz uso de tabaco. Estudo que buscou avaliar os efeitos do

tabaco em mucosa oral mostrou que o carcinógeno 4-nitroquinoline-N-oxide (4-

32

NQO), presente no tabaco, pode causar a diminuição dos mastócitos (Sand et al.,

2002), o que pode explicar os achados do presente trabalho.

Outro ponto a ser considerado, é o de proliferação celular maligna ocorrer

preferencialmente em locais com baixa concentração de mastócitos, uma vez que

estas células podem ter efeito anti-tumoral e inibir o desenvolvimento da neoplasia

quando presentes em alto número (Samoszuk and Corwin, 2003). Ch´ng et al.

concluíram que os mastócitos têm efeito inibitório direto sob a proliferação de CEC

de cabeça e pescoço (Ch'ng et al., 2006). Além disso, mastócitos podem recrutar

linfócitos que agem contra células aberrantes, através da liberação de IL-8 e

RANTES, dificultando ainda mais o crescimento de neoplasias malignas (Aoki et al.,

2003).

O número de mastócitos que migram em direção ao tecido também pode estar

diminuído, contribuindo para o baixo número total de mastócitos em displasias e

neoplasias malignas. Oliveira-Neto et al. observaram esse fato através do baixo

número de mastócitos c-kit+ e baixa proporção entre mastócitos residentes e

mastócitos recrutados encontrado em lesões pré-malignas e malignas de mucosa

oral. Atribuem esse fato à liberação de baixa quantidade de substâncias que atraem

mastócitos pelos queratinócitos e microambiente tumoral (Oliveira-Neto et al., 2007).

Parizi et al. realizaram estudo comparando DM em CEC de pele e cavidade bucal,

encontrando nesta uma menor DM, o que estaria relacionado à menor necessidade

de ativação de mastócitos para promover aumento da vascularização em mucosa

oral (Parizi et al., 2010).

33

Diferentes técnicas de identificação de mastócitos em espécimes histológicas são

empregadas desde reações de histoquímica, como o azul de toluidina (Parizi et al.,

2010) e o alcian blue com safranina (Tomita et al., 2000), até as reações de

imunohistoquímica através do anticorpo monoclonal anti-triptase (Mohtasham et al.,

2010). A imunohistoquímica é a técnica mais específica para detecção destas

células (Batista et al., 2005) e o presente estudo foi realizado com a técnica de

imunohistoquímica com anti-triptase, aumento de 200x e contagem em 1 e 3

campos.

Resultados semelhantes foram encontrados ao considerar 1 campo e a média de 3

campos, o que indica que ambas as metodologias podem ser usadas sem

alterações dos resultados. Nos trabalhos publicados, são utilizados, para contagem

de mastócitos, aumentos de 100x (Kalra et al., 2012), 200x (Michailidou et al., 2008)

ou 400x (Iamaroon et al., 2003). Também não há consenso quanto ao número de

campos a serem avaliados, variando entre 1 (Michailidou et al., 2008), 3 (Duse et al.,

2011),4 (Kalra et al., 2012), 5 (Jahanshahi and Sabaghian, 2012) e 10 (Souza et al.,

2010). Os diferentes métodos usados para contagem de mastócitos podem ser um

dos motivos para os resultados diferentes encontrados na literatura.

Atualmente, diversos marcadores são utilizados com o intuito de identificar as

células endoteliais. Dentre os mais comumente utilizados estão o anti-CD31 (ou

PECAM-1), anti-CD34, anti-FvW (ou fator VIII), anti-CD105 e VEGF. No presente

estudo, utilizaram-se o anti-CD31 e o anti-CD34 buscando avaliar a marcação

destes em displasias epiteliais e CEC de cavidade oral. A literatura ainda é muito

controversa em apontar o marcador ideal para avaliar angiogênese em LPM e

câncer oral. Shieh et al. relatam que CD31 e CD34 são melhores que o fator VIII em

34

casos de CEC orais e que são geralmente os marcadores de escolha quando se

trata de tecidos emblocados em parafina (Shieh et al., 2004).

Vários métodos são relatados na literatura para avaliação da vascularização

(Barbareschi et al., 1995; Fox et al., 1994; Weidner et al., 1993). Neste estudo,

utilizou-se um novo método para quantificação (Fechine-Jamacaru, 2006), em que,

após segmentação, há determinação do percentual do campo corado pelo anticorpo.

Esse método promove uma menor variação de resultados uma vez que a variável do

examinador foi eliminada durante a contagem.

Quando se avalia os estudos disponíveis na literatura, percebe-se que, em relação à

angiogênese, também existe uma grande variação com relação ao número de

campos analisados bem como ao aumento da objetiva do microscópio utilizado. Os

estudos iniciais de Weidner preconizavam que se utilizasse aumento de 200x e que

fosse contado apenas um campo com maior concentração de vasos, chamado

“hotspots” (Weidner et al., 1993). Entretanto, várias modificações à técnica foram

realizadas pelos pesquisadores, desde variações no aumento da objetiva, utilizando

400x (Ashkavandi et al., 2010; Michailidou et al., 2008; Shieh et al., 2004; Tae et al.,

2000) ou 250x (Cedeno and Tonino, 2005) em vez de 200x; contagem em múltiplos

campos, porém considerando para análise apenas o de maiores resultados

(Macluskey et al., 2000; Pazouki et al., 1997); ou contagem de múltiplos campos

analisando a média dos resultados (Ashkavandi et al., 2010; Carlile et al., 2001;

Michailidou et al., 2008; Mohtasham et al., 2010; Shivamallappa et al., 2011; Tae et

al., 2000). No presente trabalho, avaliou-se o campo com maior marcação e a média

entre três campos, com aumento de 200x, e foram obtidos resultados semelhantes

em ambas as metodologias.

35

São necessários novos estudos acerca dos mastócitos e seu comportamento nos

diversos microambientes tumorais, uma vez que se apresenta como uma célula

bastante complexa e que pode assumir diversos papéis, tanto como favorecedor do

crescimento quanto inibidor das neoplasias e lesões potencialmente malignas.

Também é importante que haja uma padronização quanto à metodologia empregada

para avaliação tanto para mastócitos quanto para angiogênese, possibilitando uma

comparação mais confiável dos resultados dos estudos.

Conclusão

O anticorpo CD-31 mostrou-se melhor marcador para avaliação de angiogênese em

mucosa oral do que o anti-CD34. O aumento da vascularização em CEC oral

quando comparado aos grupos de displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial

sugere que a angiogênese é necessária ao crescimento tumoral aumentando à

medida que se inicia o processo de malignização. Além disso, os marcadores

utilizados para angiogênese não foram eficazes na detecção de componentes pré-

malignos, provavelmente presentes nas lesões potencialmente malignas.

Há uma menor densidade de mastócitos em carcinomas epidermóides de boca

quando comparada às hiperplasias fibroepiteliais e displasias epiteliais, sugerindo

que essa célula não funciona como promotora de processos neoplásicos malignos

em cavidade oral.

Não foi possível encontrar correlação entre mastócitos e angiogênese em lesões

potencialmente malignas e câncer de boca, indicando que nos carcinomas de

células escamosas orais não há participação dessa célula no processo de

angiogênese.

36

Referências

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41

Figuras

Figura 1. Fotomicrografia de mucosa oral mostrando padrão de marcação de triptase em CEC (A), displasia epitelial (B) e HFE (C); CD31 em CEC (D), displasia epitelial (E) e HFE (F) e CD34 em CEC (G), displasia epitelial (H) e HFE (I). IHQ Estreptavidina-biotina. Aumento de 200X.

A

B

C

D

E

F

G

H

I

42

Gráficos

Grafico 1. Comparação da densidade de mastócitos em CEC, displasia epitelial e HFE considerando 1 e 3 campos, utilizando como marcador o anticorpo anti-triptase. Os dados foram expressos sob forma de média + EPM e a análise estatística foi realizada através dos testes Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, com p <0,05, sendo observada diferença estatisticamente significante entre o grupo CEC e os grupos displasia epitelial e hiperplasia fibroepitelial (*) (p= 0,0092 –1 campo; p= 0,038 – 3 campos).

Grafico 2. Correlação entre percentual de densidade de marcação vascular utilizando anticorpos CD31 e CD34 em CEC, displasia epitelial e HFE. Os dados foram apresentados sob forma de média. A análise estatística foi feita utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo Teste de Dunn, com p<0,05 sendo observada diferença estatisticamente significante entre os grupos CEC e displasia epitelial e entre os grupos CEC e hiperplasia fibroepitelial quando utilizado o marcador CD31(*).

*

*

43

Tabela

CD31 (1) Média ±DP

p CD31 (3) Média ±DP

p CD34 (1) Média ±DP

p CD34 (3) Média ±DP

p

CEC 9,61±1,11 <0,0001 7,05±0,80 <0,0001 8,32±0,76 0,92 6,02±0,50 0,05

Displasia

4,47±3,35

3,20±0,51

10,82±1,50

6,35±0,99

HFE

3,35±0,39

2,50±0,29

9,22±1,33

5,98±0,91

Tabela 1. Percentual de densidade de marcação vascular em CEC, displasia epitelial

e HFE, utilizando os anticorpos anti-CD31 e anti-CD34.

*(1) Avaliado 1 campo com maior percentual de marcação; (3) Avaliada média de 3

campos com maior percentual de marcação.

44

4. CONCLUSÕES GERAIS

Há uma menor densidade de mastócitos em carcinomas epidermóides de

boca quando comparado a hiperplasias fibroepiteliais e displasias epiteliais.

Há aumento da angiogênese quando a lesão torna-se maligna.

Entretanto, não há alteração da vascularização quando comparadas hiperplasias

fibroepiteliais e displasias epiteliais.

Não foi possível encontrar correlação entre mastócitos e angiogênese em

lesões potencialmente malignas e câncer de boca, indicando que nos carcinomas de

células escamosas orais não há participação dessa célula no processo de

angiogênese.

45

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WEIDNER, N. et al. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American journal of pathology, v. 143, n. 2, p. 401-9, Aug 1993. ISSN 0002-9440 (Print)

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51

ANEXOS

ANEXO A - ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA HUMANA

52

ANEXO B – MANUAL DE NORMALIZAÇÃO PARA DEFESA DE DISSERTAÇÃO

DE MESTRADO E TESE DE DOUTORADONO FORMATO ALTERNATIVO DO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE

FEDERAL DO CEARÁ

ESTRUTURA DO TRABALHO

As teses e dissertações apresentadas ao Programa de Pós-Graduação em

Odontologia da Universidade Federal do Ceará poderão ser produzidas em formato

alternativo ou tradicional de acordo com o artigo 46 do Regimento Interno do

Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará. O

formato alternativo estabelece: a critério do orientador e com a aprovação da

Coordenação do Programa, que os capítulos e os apêndices poderão conter cópias

de artigos de autoria ou co-autoria do candidato, publicados ou ainda não

submetidos para publicação em periódicos científicos, escritos no idioma exigido

pelo veículo de divulgação.

§1º - O orientador e o candidato deverão verificar junto às editoras a possibilidade de

inclusão dos artigos na dissertação ou tese, em atendimento à legislação que rege o

direito autoral, obtendo, se necessária, a competente autorização, devendo assinar

declaração de que não estão infringindo o direito autoral transferido à editora.

O formato padrão e alternativo das dissertações de mestrado e teses e doutorado da

UFC deverão obrigatoriamente conter:

a) capa – cobertura externa de material flexível ou rígido que oferece melhor

proteção ao trabalho. Usa-se a cor preta para dissertações e teses com os

caracteres dourados. Nela devem constar, na seguinte ordem:

- nome da instituição, seguido do centro ou faculdade, departamento e curso, todos

centralizados a partir da primeira linha do texto, em letras maiúsculas;

- nome do autor, centralizado e colocado após o cabeçalho inicial, em letras

maiúsculas;

- título em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o nome do autor;

- subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título;

53

- número de volumes (se houver) centralizado e colocado logo após o título ou o

subtítulo;

- local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras

maiúsculas, na margem inferior e centralizado na penúltima linha;

- ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha.

b) lombada (opcional) - de acordo com a NBR 12225/1992, é a parte da publicação

que reúne as margens internas ou dobras das folhas, sejam elas costuradas,

grampeadas, coladas ou mantidas juntas de outra maneira:

- último sobrenome do autor e título do trabalho escrito longitudinalmente e legível

do alto para o pé da lombada. Dessa forma, possibilita a leitura quando a publicação

estiver no sentido horizontal, com a face voltada para cima;

- ano de publicação colocado logo após o título;

- quando necessário, identifica-se com outros elementos alfanuméricos, por

exemplo: v. 2.

c) folha de rosto (obrigatório) – contém elementos essenciais que identificam o

trabalho:

O anverso da folha de rosto deve conter, na seguinte ordem:

- nome do autor, responsável intelectual do trabalho, centralizado na primeira linha

do texto, em letras maiúsculas;

- título principal do trabalho em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o

nome do autor;

- subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título;

- número de volumes (se houver mais de um, deve constar em cada folha de rosto)

centralizado e colocado logo após o título ou o subtítulo acompanhado da respectiva

especificação;

- nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome da instituição e

área de concentração, transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a

partir do centro da folha em tipo menor que o usado para o texto;

- nome do orientador e do co-orientador (se houver) iniciando e finalizando nas

mesmas margens da nota explicativa, distante desta por uma linha em branco;

- local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras

maiúsculas e centralizado na penúltima linha;

- ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha.

54

O verso da folha de rosto deve conter:

- ficha catalográfica no tamanho 7,5 cm x 12,5 cm, elaborada de acordo com o

Código de Catalogação Anglo-Americano vigente e localizada na parte inferior da

folha. A ficha deve ser feita pelo(a) bibliotecário(a) da biblioteca que serve ao curso

em questão.

d) errata (de acordo com a necessidade) – constituída pela referência do trabalho e

pelo texto da errata. Pode ser apresentada em papel avulso ou encartado acrescido

ao trabalho depois da impressão do mesmo. Deve ser inserida após a folha de rosto.

Página 6 de 21

e) folha de aprovação (obrigatório para teses e dissertações) – colocada em folha

distinta logo após a folha de rosto, contém:

- autor, centralizado na primeira linha do texto, em letras maiúsculas;

- título por extenso e subtítulo (se houver), centralizados e em letras maiúsculas,

colocados logo após o autor;

- o subtítulo deve ser separado do título por dois pontos;

- nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome e área de

concentração, transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a partir do

centro da folha em tipo menor que o usado para o texto;

- data de aprovação, colocada logo após a nota;

-nome, titulação e assinatura dos componentes da banca examinadora e instituição

a que pertencem, ocupando a metade inferior da folha. Os trabalhos defendidos em

formato alternativo têm como exigência mínima:

em revista científica com classificação Qualis A Nacional ou superior;

publicação em

revista científica com classificação Qualis C Internacional ou superior.

Obs.: A lista Qualis válida é a mais recente disponível no site da CAPES

http://qualis.capes.gov.br/webqualis/ConsultaListaCompletaPeriodicos.

Em formato alternativo:

Capa

Folha de rosto (primeira folha interna)

Ficha catalográfica (verso da folha de rosto)

55

Folha de aprovação

Dedicatória (Opcional)

Agradecimentos (Opcional)

Epígrafe (Opcional)

Resumo

Abstract

Lista de Abreviaturas e Siglas (Opcional)

Sumário

1. Introdução Geral

2. Proposição

3. Capítulos

4. Conclusão Geral

Referências

Bibliografia (Opcional)

Glossário (Opcional)

Apêndice (Opcional)

Anexo (Opcional)

RESUMO

O Resumo é a síntese dos pontos relevantes do documento, em linguagem clara,

concisa e direta. Ele transmite informações e fornece elementos para decidir sobre a

consulta do texto completo. Seis itens são essenciais para a elaboração de um

resumo: a) situar o trabalho; b) expor os objetivos; c) descrever a metodologia

utilizada; d) expor a própria experiência; e) apresentar os resultados obtidos; f)

conclusão. Usar, de preferência, a terceira pessoa do singular e empregar o verbo

na voz ativa. Localizado em folha separada, limita-se a um parágrafo. Deve ter no

mínimo 250 e no máximo 500 palavras. Logo abaixo do resumo, indicam-se as

palavras-chave. Deve obrigatoriamente estar relacionado a todos os capítulos do

trabalho sejam eles experimentais ou não.

ABSTRACT

É a tradução fiel do resumo para a língua inglesa, desta forma segue a mesma

orientação do resumo. Logo abaixo do abstract, devem ser indicadas as key-words.

56

SUMÁRIO

É a indicação do conteúdo do documento, refletindo as principais divisões e seções

na mesma ordem e grafia em que se apresentam no texto. O sumário deve oferecer

ao leitor uma visão global do estudo realizado, e deve:

• Ser localizado após todos os elementos pré-textuais, e não devem constar no

sumário.

• Ser transcrito em folha distinta, com o título centrado.

• O título do capítulo ou seção deve aparecer no sumário com o mesmo tipo de letra

utilizado no texto.

• Cada parte é seguida pelo número da página em que se inicia.

• Usa-se o termo "sumário" (e. não a palavra índice ou lista) para designar esta

parte.

1 INTRODUÇÃO GERAL

Parte inicial do texto, a introdução apresenta a formulação clara e simples do tema

investigado; deve constar a delimitação do assunto tratado, sua justificativa,

objetivos da pesquisa, rápida referência a trabalhos anteriormente realizados e

outros elementos necessários para situar o tema do trabalho. A introdução, como

primeira seção do texto, receberá o indicativo 1 (um), não sendo aconselhada a

inclusão de figuras e/ou tabelas.

2. PROPOSIÇÃO

Trata-se da descrição dos objetivos da investigação – o propósito da pesquisa

científica. Constitui a segunda parte do texto, recebendo o indicativo 2. Nesta parte

será(ão) apresentado(s) o(s) objetivo(s) da pesquisa que será(ão) concernente(s)

ao(s) capítulo(s) apresentado(s) subseqüentemente.

3. CAPÍTULOS

Deve(m) ser inserida(s) a(s) cópia(s) de artigo(s) de autoria ou co-autoria do

candidato, já publicado(s) em periódicos científicos ou ainda não publicado(s). Cada

capítulo deve conter sua indicação, seguido do número (em arábico)

correspondente. Ex.: Capítulo 1, Capítulo 2 e assim sucessivamente e deverá

57

informar o nome do periódico onde o artigo foi submetido para publicação. O idioma

e as normas de referências e de escrita devem ser as da revista na qual o artigo foi

submetido para publicação.

4. CONCLUSÃO GERAL

Podendo ser apresentada de forma dissertativa ou de tópicos, a conclusão é a parte

final do texto na qual se apresenta o fechamento das idéias correspondentes aos

objetivos, tentando responder às hipóteses formuladas. A conclusão deve ser

apresentada de maneira lógica, clara e objetiva, fundamentada nos resultados e na

discussão. Portanto, não é permitida inclusão de dados novos neste capítulo. Não

deve ser uma repetição dos resultados, deve constar o que foi resolvido,

comprovado, justificado, atingido, dificuldades encontradas, mudanças que se

fizeram necessárias, novas indagações que surgiram durante o transcorrer do

trabalho, que contribuições esse trabalho trouxe e sugestões de novas pesquisas.

Devem ser referentes a todos os capítulos apresentados.

PÓS-TEXTUAIS

São elementos complementares que têm relação com o texto, mas que, para torná-

los menos densos e não prejudicá-los, costumam vir apresentados após a parte

textual.

REFERÊNCIAS GERAIS

Consistem numa listagem de todo material bibliográfico utilizado para a produção da

parte geral do trabalho, permitindo a identificação de publicações, no todo ou em

parte. Inclui apenas referências das citações utilizadas no texto e não indicadas em

nota de rodapé. Esta lista permite ao leitor comprovar fatos ou ampliar

conhecimentos, mediante consulta as fontes referenciadas. As comunicações

pessoais não fazem parte da lista de referências, sendo colocadas apenas em nota

de rodapé. É válido ratificar que não devem ser inseridas as referências já

relacionadas nos trabalhos apresentados nos capítulos, apenas deve conter as

referências usadas na introdução geral e na discussão geral. As referências nos

trabalhos apresentados à FFOE/UFC deverão ser baseadas nas normas

58

apresentadas no Guia para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da Biblioteca

Universitária.

APRESENTAÇÃO GRÁFICA

Formato

a) papel branco, formato A4 (210 mm x 297 mm);

b) digitação em fonte tamanho 12 para o texto (Times New Roman ou Arial);

c) digitação em fonte tamanho 10 (Times New Roman ou Arial) para citações longas,

notas de rodapé, paginação, legendas de ilustrações e tabelas;

d) a digitação é feita no anverso da folha com exceção para a folha de rosto;

e) opcionalmente pode-se digitar no anverso e no verso da folha dependendo do tipo

de papel utilizado;

f) a digitação é feita na cor preta;

g) o projeto gráfico é de responsabilidade do autor do trabalho.

Margem

a) margens esquerda e superior de 3 cm;

b) direita e inferior de 2 cm;

c) parágrafo inicial de 2 cm a partir da margem esquerda;

d) a citação longa é destacada com recuo de 4 cm da margem esquerda.

Espacejamento

a) todo o texto deve ser digitado com 1,5 cm de entrelinhas;

b) as citações longas, as notas, os resumos, as referências, as legendas das

ilustrações e tabelas, a ficha catalográfica, a natureza do trabalho, o objetivo, o

nome da instituição e a área de concentração devem ser digitados em espaço

simples;

c) as referências ao final do trabalho devem ser separadas entre si por espaço

duplo;

d) os títulos das seções e subseções devem ser separados do texto que os precede

ou os sucede por um espaço duplo ou dois espaços simples;

59

e) as notas de rodapé devem ser digitadas dentro das margens, separadas do texto

por um espaço simples de entrelinhas e por filete de 3 cm, a partir da margem

esquerda;

f) na folha de rosto e na folha de aprovação, a natureza do trabalho, o objetivo, o

nome da instituição e a área de concentração devem ser alinhados do centro da

folha para a margem direita.

Indicativos de seção

a) indicativo numérico de uma seção antecede seu título, alinhado à esquerda,

separado por um espaço de caractere;

b) os títulos sem indicativo numérico, como errata, agradecimentos, resumo, listas

de ilustrações, listas de abreviaturas e siglas, lista de símbolos, sumário, glossário,

apêndices, anexos e índices devem ser centralizados conforme a NBR 6024/1989.

Paginação

a) todas as folhas do trabalho são contadas a partir da folha de rosto,

seqüencialmente;

b) a numeração é colocada, a partir da primeira folha da parte textual;

c) a numeração é em algarismos arábicos, no canto superior direito da folha a 2

cm da borda superior, ficando o último algarismo a 2 cm da borda direita da folha,

em tamanho menor que o do texto;

d) em caso de digitação no anverso e verso da folha, a numeração das páginas deve

ser em algarismos arábicos no canto superior esquerdo (para páginas pares) e no

canto superior direito (para páginas ímpares);

e) para trabalhos em mais de um volume, deve ser dada uma numeração seqüencial

das folhas do primeiro ao último volume;

f) a numeração de apêndices e anexos, quando utilizados, deve ser contínua à do

texto principal.

Numeração progressiva, de acordo com a NBR 6024/1989

a) evidencia e sistematiza o conteúdo do trabalho em seções;

60

b) as seções são partes em que se divide o texto de um documento, que contêm as

matérias consideradas afins na exposição ordenada do assunto;

c) as seções primárias são as principais divisões do texto de um documento, e

devem iniciar em folha distinta;

d) as seções primárias podem ser divididas em seções secundárias; as secundárias,

em terciárias; as terciárias, em quaternárias; e assim por diante;

e) os títulos das seções são destacados gradativamente, usando-se racionalmente

os recursos de negrito, itálico ou grifo, caixa alta ou maiúsculas etc., conforme a

NBR 6024, no sumário e de forma idêntica, no texto;

f) quando uma seção tem título, este é colocado na mesma linha do respectivo

indicativo, e a matéria da seção pode começar na linha seguinte da própria seção ou

em uma seção subseqüente;

g) o título da seção primária deve aparecer em destaque (maiúsculas e negrito); as

seções secundárias, aparecem em letras normais e em negrito; as demais seções,

terciárias, quaternárias e assim por diante aparecem em letras normais, sem

destaque, todas alinhadas à margem esquerda.

61

ANEXO C - NORMAS PERIÓDICO EXPERIMENTAL AND MOLECULAR

PATHOLOGY

Use of wordprocessing software

It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used.

The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as

possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the

article. In particular, do not use the wordprocessor's options to justify text or to

hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc.

When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each

individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces,

to align columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that

of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:

http://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables

and text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text.

See also the section on Electronic artwork.

To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and

'grammar-check' functions of your wordprocessor.

Article structure

Introduction

State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a

detailed literature survey or a summary of the results.

62

Material and methods

Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already

published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be

described.

Results

Results should be clear and concise.

Discussion

This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A

combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive

citations and discussion of published literature.

Conclusions

The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,

which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and

Discussion section.

Appendices

If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae

and equations in appendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq.

(A.2), etc.; in a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on. Similarly for tables and

figures: Table A.1; Fig. A.1, etc.

Essential title page information

• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval

63

systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.

• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a

double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses

(where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a

lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the

appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the

country name and, if available, the e-mail address of each author.

• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all

stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone

and fax numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-

mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up

to date by the corresponding author.

• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in

the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent

address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which

the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address.

Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.

Abstract

A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the

purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is

often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this

reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and

year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if

essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.

Keywords

64

Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American

spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for

example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly

established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing

purposes.

Abbreviations

Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on

the first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract

must be defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure

consistency of abbreviations throughout the article.

All abbreviations, chemical names, and journal names should follow the style of

Chemical Abstracts Service Source Index. Use generic names of chemicals wherever

possible. Proprietary names and trademarks should appear only to identify the

source of the chemical and subsequently only the generic name should be used. All

abbreviations should be unpunctuated. A useful writing guide is the "CBE Style

Manual" published by the Council of Biology Editors.

Acknowledgements

Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the

references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the

title or otherwise. List here those individuals who provided help during the research

(e.g., providing language help, writing assistance or proof reading the article, etc.).

65

Figure captions

Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached

to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a

description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum

but explain all symbols and abbreviations used.

Tables

Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place

footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript

lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that

the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the

article.

References

Citation in text

Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference

list (and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full.

Unpublished results and personal communications are not recommended in the

reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in

the reference list they should follow the standard reference style of the journal and

should include a substitution of the publication date with either 'Unpublished results'

or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item

has been accepted for publication.

Web references

66

As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was

last accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference

to a source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed

separately (e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can

be included in the reference list.

References in a special issue

Please ensure that the words 'this issue' are added to any references in the list (and

any citations in the text) to other articles in the same Special Issue.

Reference management software

This journal has standard templates available in key reference management

packages EndNote ( http://www.endnote.com/support/enstyles.asp) and Reference

Manager ( http://refman.com/support/rmstyles.asp). Using plug-ins to

wordprocessing packages, authors only need to select the appropriate journal

template when preparing their article and the list of references and citations to these

will be formatted according to the journal style which is described below.

Reference style

Text: All citations in the text should refer to:

1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity) and

the year of publication;

2. Two authors: both authors' names and the year of publication;

3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of

publication.

Citations may be made directly (or parenthetically). Groups of references should be

67

listed first alphabetically, then chronologically.

Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan and Jones, 1999).

Kramer et al. (2010) have recently shown ....'

List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted

chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s) in the

same year must be identified by the letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the year of

publication.

Examples:

Reference to a journal publication:

Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a scientific

article. J. Sci. Commun. 163, 51–59.

Reference to a book:

Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman, New

York.

Reference to a chapter in an edited book:

Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your

article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-

Publishing Inc., New York, pp. 281–304.

Journal abbreviations source

Journal names should be abbreviated according to

Index Medicus journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;

List of title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-online.php;

CAS (Chemical Abstracts Service): http://www.cas.org/sent.html.

68

Submission checklist

The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending

it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of

any item.

Ensure that the following items are present:

One author has been designated as the corresponding author with contact details:

• E-mail address

• Full postal address

• Telephone and fax numbers

All necessary files have been uploaded, and contain:

• Keywords

• All figure captions

• All tables (including title, description, footnotes)

Further considerations

• Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked'

• References are in the correct format for this journal

• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa

• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources

(including the Web)

• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the

Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web (free of

charge) and in black-and-white in print

• If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are also

supplied for printing purposes