Universidade Federal do Ceará Instituto de Ciências do Mar

Universidade Federal do Ceará

Instituto de Ciências do Mar

Pós-graduação em Ciências Marinhas Tropicais

SANDRA PIEDAD VELASQUEZ MEDINA

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE PIRAPITINGA

Piaractus brachypomus (PISCES, CHARACIDAE)

Fortaleza, Ceará

2008

ii

Universidade Federal do Ceará

Instituto de Ciências do Mar

Sandra Piedad Velásquez Medina

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE PIRAPITINGA

Piaractus brachypomus (PISCES, CHARACIDAE)

Dissertação apresentada à Coordenação do Curso de Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Marinhas.

Área de concentração: Utilização e Manejo de Ecossistemas Marinhos e Estuarinos

Orientador: Prof. Dr. Luiz Drude de Lacerda.

Co-orientadora: Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro.

Fortaleza, Ceará

2008

iii

Velásquez-Medina, Sandra P.

Criopreservação do sêmen de pirapitinga, Piaratus

brachypomus (Pisces, Characidae)/ Sandra Velásquez

Medina – Fortaleza, 2008.

96 f.

Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas

Tropicais) - Universidade Federal do Ceará, Instituto de

Ciências do Mar.

1. Sêmen. 2. Criopreservação. 3. Pirapitinga.

iv

Dedico este trabajo a mi papá Luis

Francisco, a mi hermana Vicky y a

Gustavo que son para mi las

personas mas importantes en mi

vida.

v

“En el fondo, los científicos somos gente con suerte:

podemos jugar a lo que queramos durante toda la vida”.

Lee Smolin

“Si no conozco una cosa, la investigaré”.

Louis Pasteur

http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=932

http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=737

vi

AGRADECIMENTOS

Meus agradecimentos a continuação são de todo coração, já que estas pessoas colocaram seu grãozinho de areia tanto de forma emocional, educativa ou laboral para a realização desta dissertação:

Ao professor Luiz Drude agradeço imensamente por ter-me apoiado neste projeto no ultimo momento e ter-me brindado sua orientação sabendo do pouco tempo que ele dispõe.

A minha família por estar sempre me ajudando e me animando em tudo o que eu preciso.

A Cristiane Mello por seu tempo e sugestões em cada uma das páginas deste trabalho.

Ao meu querido Gustavo, namorado, noivo, amigo, cúmplice, confidente e demais, que está todos os dias lutando do meu lado para conseguir as coisas “tavo, sin ti no se a donde mi mente hubiera vagado”.

À Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade concedida.

À CAPES pela ajuda financeira para me manter no Brasil nestes anos.

Ao pessoal do Laboratório de Tecnologia de Sêmen Caprino e Ovino da UECE, em especial ao Marcelo e à Audália, sendo pessoas maravilhosas, ensinando-me os primeiros passos da criopreservação e ajudando-me nas minhas coletas.

Ao pessoal do DNOCS por permitir-me realizar minhas coletas nas suas instalações e em especial ao Pedro e ao Alexandre pela grande disposição em colaborar.

A meus amigos brasileiros Fredy, Luciano, Eduardo e Fabiano, que sempre me escutaram e me alegraram.

Ao pessoal dos Laboratórios de Ecologia Marina e Ecotoxicologia do LABOMAR, pessoas tão amáveis que sempre me abriram as portas para compartir com eles.

Ao professores e funcionários do LABOMAR nos momentos de gentileza para comigo, em especial à Maria Gomes por ser um tipo de pessoa de quem mais precisa o mundo, com seu bom dia e sorriso a cada dia.

Ao Frank pelas conversas e ajuda nas minhas dúvidas na língua inglesa.

Ao Ricardo e Lula, por tentar ajudar-me no meu anterior projeto com os ariacós L. synagris.

vii

RESUMO

A pirapitinga (Piaractus brachypomus) é uma espécie de peixe exótico introduzido

no nordeste brasileiro, o qual tem grande importância comercial devido a seu hábito

alimentar, excelente crescimento, resistência ao manejo em cativeiro e às

enfermidades. A criopreservação de seu sêmen pode contribuir nos aspectos

econômico, genético e meio ambiental da região e da espécie. O objetivo deste

trabalho foi desenvolver um protocolo adequado de congelação seminal para poder

obter motilidades próximas ao sêmen a fresco. Trabalhou-se com o sêmen de 19

machos maduros de dezembro de 2007 a março de 2008, determinando as

características seminais; a toxicidade dos crioprotetores DMSO 10% e metilglicol

10%, diluídos em glicose 5%, ACP-104 e solução Ringer nas diluições de 1:3, 1:5 e

1:7, durante 15 minutos a 4°C; a criopreservação a -196°C com as mesmas

criodiluições usando palhetas de 0,25 e 0,5 mL, congeladas em vapores de

nitrogênio líquido em caixas de isopor ou em “dry shipper”, sendo depois transferidas

para botijões criogênicos durante 15 dias. Foram avaliadas as motilidades e

velocidades através da análise seminal auxiliado por computador (CASA) pós-

descongelação; e a morfologia seminal a fresco e pós-descongelação. Os

parâmetros seminais a fresco observados foram: motilidade objetiva média de 94%,

concentração de 44 x 109 spzt/mL, volume de 7 mL, osmolaridade de 317 mOsm/Kg

e pH de 8,4. Nos testes de toxicidade não foram encontradas diferenças

significativas entre o T3 (Ringer+Metilglicol 10%) na diluição 1:3 comparado com o

grupo controle (P=0.06), apresentando motilidade de 80% e VCL de 95 µm/s. O

melhor método de congelamento foi o “dry shipper” utilizando palhetas de 0,5 mL,

registrando motilidade de 62% para o T6 (Glicose+DMSO 10%) na diluição 1:7,

entretanto, apresentaram baixas velocidades para todos os tratamentos, com

melhores resultados de VCL, VSL e VAP para o T6. No sêmen fresco, a

morfoanomalia mais encontrada foi a cauda dobrada (20%) e no sêmen pós-

descongelação, a cauda enrolada (23%). Comparando-se os resultados de

morfoanomalias antes e pós-descongelamento foram observadas diferenças

significativas entre as amostras (P<0,05). Conclui-se que o sêmen de pirapitinga

pode ser preservado em Ringer+Metilglicol 10% em 1:3, sem apresentar altas

toxicidades, e criopreservado em Glicose+DMSO 10% utilizando o “dry shipper”.

Palavras-chave: sêmen, criopreservação, pirapitinga.

viii

ABSTRACT

The pirapitinga (Piaractus brachypomus) is a species of exotic fish introduced in the

Brazilian north-eastern, with great commercial importance for its alimentary habit,

excellent growth, handling resistance in captivity and against diseases. The

cryopreservation of its semen can contribute in the economic, genetic and

environment aspects of the region and the species. The objective of this work was to

develop an adequate protocol of seminal frozen to be able to obtain motility closer to

the fresh semen. It was worked with the semen of 19 mature males between

December of 2007 and March of 2008, determining its seminal characteristics; the

cryoprotectants toxicity DMSO 10% and methylglicol 10%, diluted in glucose 5%,

ACP-104 and Ringer solution at 1:3, 1:5 and 1:7 dilutions, during 15 minutes at 4°C;

the cryopreservation at -196°C with the same cryoextenders using 0,25 and 0,5 mL

straws, frozen in nitrogen vapor inside styrofoam boxes or in dry shipper, being later

transferred to cryogenic containers for 15 days. It was evaluated the motilities and

speeds through the computer-assisted sperm analysis (CASA) post-thawed; and the

morphology in fresh and post-thawed semen. The seminal parameters observed in

fresh semen were: objective mean motility of 94%, concentration of 44 x 109 spzt/mL,

semen volume of 7 mL, osmolarity of 317 mOsm/kg and pH of 8,4. In the toxicity

tests weren’t find significant differences between T3 (Ringer+Methylglicol 10%) at 1:3

dilution compared with the control group (P=0.06), showing motility of 80% and VCL

of 95 µm/s. The best frozen method was in dry shipper using 0.5 mL straws,

registering motility of 62% for T6 (Glucose+DMSO 10%) at 1:7 dilution, however,

showing low speeds for all treatments, with better results of VCL, VSL and VAP to

T6. In fresh semen, the morpho anomalies most found was the tail doubled (20%)

and in the post-thawed semen, the tail coiled (23%). Comparing the morpho

anomalies results before and after frozen it was observed significant differences

between samples (P<0.05). It was concluded that the pirapitinga semen can be

preserved in Ringer+Methylglicol 10% in 1:3, without presenting high toxicities, and

cryopreservated in Glucose+DMSO 10% using dry shipper.

Key words: semen, cryopreservation, pirapitinga.

ix

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO................................................................................................................ vii

ABSTRACT............................................................................................................. viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS............................................................ xi

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... xii

LISTA DE TABELAS E QUADROS ....................................................................... xvi

1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 01

2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 03

2.1. Descrição da espécie................................................................................. 03

2.2. Características gerais do espermatozóide de teleósteos........................... 05

2.2.1. Motilidade......................................................................................... 06

2.2.2. Morfoanomalias................................................................................ 08

2.3. Processo de Congelamento...................................................................... 10

2.3.1. Agentes crioprotetores.................................................................... 12

2.3.2. Meios diluentes................................................................................ 13

2.4. Avaliação da cinética espermática através de análise seminal auxiliada

por computador (CASA)........................................................................... 14

3. JUSTIFICATIVA................................................................................................. 16

4. OBJETIVOS....................................................................................................... 18

4.1. Objetivo Geral............................................................................................ 18

4.2. Objetivos Específicos................................................................................ 18

5. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 19

5.1. Local do experimento e animais experimentais......................................... 19

5.2. Hipofisação dos reprodutores.................................................................... 20

5.3. Coleta de sêmen........................................................................................ 20

5.4. Teste de contaminação do sêmen............................................................. 21

5.5. Avaliação da motilidade............................................................................. 21

5.6. Características seminais............................................................................ 22

5.7. Estudo da toxicidade do crioprotetor......................................................... 23

5.8. Congelamento e descongelamento seminal.............................................. 24

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL............ 24

x

Experimento 2: Congelamento em rampa em palheta de 0,5 mL.............. 27

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL.. 27

5.9. Análise morfológica do sêmen................................................................... 28

5.10. Análises estatísticas................................................................................. 29

6. RESULTADOS.................................................................................................. 30

6.1. Características do sêmen........................................................................... 30

6.2. Estudo da toxicidade dos crioprotetores.................................................... 31

6.2.1. Motilidade......................................................................................... 31

6.2.2. Velocidades...................................................................................... 32

6.3. Congelamento e descongelamento seminal.............................................. 37

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL............ 37

Experimento 2: Congelamento em rampa em palheta de 0,5 mL.............. 40

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL.. 43


7. DISCUSSÃO...................................................................................................... 53

7.1. Características do sêmen.......................................................................... 53

7.2. Estudo da toxicidade de crioprotetores...................................................... 54

7.3. Testes de Criopreservação........................................................................ 57


8. CONCLUSÕES.................................................................................................. 64

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 65

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Porcentagem

ACP-104 Meio diluente à base de água de coco em pó para sêmen de peixes

ATP Adenosina trifosfato

AMPc Adenosina monofosfato ciclico

°C Graus Celsius

CASA Computer Assisted Semen Analysis

DMSO Dimetil sulfóxido

EP Erro padrão

LTSCO Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino

M Mol

mL Mililitro

mOsm Miliosmoles

N2L Nitrogênio líquido

pH Potencial hidrogeniônico

s Segundo

SCA Sperm Class Analyzer

T1 Tratamento 1 (Ringer + DMSO 10%)

T2 Tratamento 2 (ACP-104 + DMSO 10%)

T3 Tratamento 3 (Ringer + Metilglicol 10%)

T4 Tratamento 4 (ACP-104 + Metilglicol 10%)

T5 Tratamento 5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%)

T6 Tratamento 6 (Glicose 5% + DMSO 10%)

µL Microlitros

µm Micrômetro

VAP Velocidade média

VCL Velocidade curvilinear da trajetória

VSL Velocidade linear

xii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Adulto de pirapitinga (Piaractus brachypomus).............................. 05

Figura 2. Espermatozóides de Piaractus brachypomus a 400X, corados

com azul de bromofenol................................................................ 06

Figura 3. Dinâmica dos mecanismos de inibição e ativação espermática

em peixes de água doce (Adaptado de Tabares et al., 2005)...... 08

Figura 4. Equipamentos para congelamento de sêmen: (A) geladeira de

poliestireno com rampa metálica, (B) “dry shipper”...................... 12

Figura 5. Representação esquemática das diferentes velocidades medidas

pelo sistema de análise seminal (CASA). VCL= velocidade

curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade

média.............................................................................................. 15

Figura 6. Leitura da marcação eletrônica com chip das pirapitingas............. 19

Figura 7. Coleta do sêmen de pirapitinga em Epperdorf................................ 20

Figura 8. Teste de toxicidade, criodiluições resfriadas a 4°C........................ 23

Figura 9. Preenchimento de palhetas com as criodiluções............................ 25

Figura 10. Raques com globetes para o armazenamento das palhetas........ 25

Figura 11. Descongelamento das palhetas em banho-maria......................... 26

Figura 12. Página principal do resultado da avaliação de motilidade com o

sistema CASA............................................................................... 26

Figura 13. Representação dos movimentos dos espermatozóides de

pirapitinga avaliados com o método CASA.................................. 27

Figura 14. Congelamento em “dry shipper” a -170°C.................................... 28

Figura 15. Média ± erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos nas criodiluições

avaliadas no teste da toxicidade. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 =

ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-

104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 =

Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são

significativamente diferentes (P<0.05)......................................... 34

xiii

Figura 16. Média ± erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s,

nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da toxicidade.

VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade linear; VAP =

velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-

104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-


Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são

significativamente diferentes (P<0.05)......................................... 34

Figura 17. Médias e intervalo de confiança da motilidade de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos nas

criodiluições avaliadas no teste de toxicidade. T1 =

Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 =

Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 =

Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%........ 35

Figura 18. Médias e intervalo de confiança das velocidades espermáticas,

em µm/s, nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da

toxicidade. VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade

linear; VAP = velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 =

ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-


Glicose 5%+DMSO 10% 36

Figura 19. Curva de congelamento dos experimentos 1 e 2 utilizando o

equipamento de geladeira de isopor com rampa durante 5

minutos......................................................................................... 37

Figura 20. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides

progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento

utilizando palheta de 0,25 mL e rampa de congelamento. T1 =



Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%....... 38

xiv

Figura 21. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s,

pós-descongelamento, em palheta de 0,25 mL e rampa de

congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO

10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol

10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose

5%+DMSO 10%............................................................................ 40



utilizando palheta de 0,50 mL e rampa de congelamento. T1 =



Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%........ 41

Figura 23. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s,

pós-descongelamento, em palheta de 0,50 mL e rampa de

congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO

10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol

10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose

5%+DMSO 10%........................................................................... 43



utilizando palheta de 0,50 mL e “dry shipper”. T1 =


Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 =

Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%....... 46

Figura 25. Média e erro padrão das velocidades espermáticas (curvilinear,

linear e média) pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50

mL e “dry shipper”. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-

104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-

104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 =

Glicose 5%+DMSO 10%............................................................... 46

Figura 26. Análise geral das criosoluções e criodiluições em palhetas de

0,25 e 0,5 mL e pelos métodos de congelamento em rampa

dentro de geladeira de isopor e “dry shipper” (média ± ep).......... 48/49

xv

Figura 27. Porcentagem média das características morfológicas do sêmen

de Piaractus brachypomus a fresco............................................. 51

Figura 28. Porcentagem média das características morfológicas do sêmen

de Piaractus brachypomus pós-descongelamento nos meios

diluentes Ringer, ACP-104 e Glicose e nos crioprotetores

DMSO e Metilglicol........................................................................ 51

xvi

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1. Diluentes e crioprotetores utilizados no teste de toxicidade e na

criopreservação de sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus) 24

Tabela 2. Morfoanomalias em espermatozóides de pirapitinga (Piaractus

brachypomus)................................................................................... 29

Tabela 3. Características seminais das pirapitingas, avaliadas durante o

período de dezembro de 2007 a março de 2008.............................. 30

Tabela 4. Características dos “pools” de sêmen de pirapitinga......................... 31

Tabela 5. Valores médios das porcentagens de motilidade total (MT),

espermatozóides rápidos, médios e lentos, e velocidades

curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP) (µm/s) nos testes de

toxicidade.......................................................................................... 33

Tabela 6. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de

espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e

velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em

µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em

palheta de 0,25 mL........................................................................... 39




µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em

palheta de 0,50 mL........................................................................... 42




µm/s, no teste de congelamento no “dry shipper”, em palheta de

0.50 mL............................................................................................. 45

Quadro 1. Análise subjetiva da motilidade (adaptado de Strussman et

al.,1994)............................................................................................ 21

Quadro 2. Parâmetros estabelecidos para a análise pelo sistema CASA do

sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus).............................. 22

xvii

Quadro 3. Alterações morfologicas do sêmen de Piaractus brachypomus,

lâminas coradas com azul de bromofenol: (A) normal; (B) cabeça

deformada; (C) peça intermediária degenerada; (D, F, G, H) cauda

enrolada; (E) cauda dobrada na ponta; (I) cauda dobrada; (J) gota

citoplasmática proximal; (K) gota citoplasmática distal; (L) cauda

quebrada........................................................................................... 52

1

Sandra Velásquez Medina Criopreservação de sêmen de pirapitinga

1. INTRODUÇÃO

As populações naturais de peixes têm diminuído nas ultimas décadas devido à

degradação ambiental e à pesca excessiva, fatores que aceleram a

descaracterização e o desaparecimento do habitat aquático natural e dos

organismos que nele vivem (Miliorini, 2006). Com o passar dos anos a demanda de

pescado vem aumentando impulsionada principalmente pelo crescimento da

população e a tendência mundial da procura de alimentos saudáveis indicados para

a saúde humana, como o pescado, sendo este uma alternativa alimentar de alto

valor nutritivo, baixo teor de gordura e alta digestabilidade (Andrade e Yusi, 2003).

Visando suprir este desequilíbrio ecológico e aumentar os benefícios

econômicos, a piscicultura que produz 43 milhões de toneladas por ano (FAO, 2007)

gera constantemente inúmeros trabalhos no âmbito de técnicas de cultivo, controle

de doenças, avaliação dos gametas produzidos em cativeiro e técnicas para

congelamento seminal, entre outras (Yao et al., 2000; Williot et al., 2000; Tvedt et al.,

2001; Taddei et al., 2001; Tanaka et al., 2002).

O conhecimento e desenvolvimento de novos protocolos para o

armazenamento de sêmen de peixes vêm avançando desde a última década,

mostrando sempre a sua importância como ferramenta em programas de

melhoramento genético de espécies de interesse econômico, em iniciativas de re-

estabelecimento das populações de ambientes em recuperação, na criação de

importantes bancos de sêmen de peixes nativos e no aumento das produções em

cativeiro (Carneiro, 2007).

A técnica de criopreservação fundamenta-se no congelamento de gametas

em nitrogênio líquido, podendo ser preservadas por um período de vários anos

(Suquet et al., 2000). O primeiro trabalho de congelamento foi realizado por Blaxter,

em 1953 (citado por Suquet et al., 2000), que viabilizou o cruzamento de duas

espécies de arenque que desovam em épocas diferentes do ano. Desde então, tem-

se gerado um grande número de protocolos tanto para espécies de água doce

(salmão e carpa) como marinhas (linguados e tainhas), entre outras (Suquet et al.,

2000). Na atualidade existem no mundo bancos genéticos de peixes na Rússia,

Ucrânia, Finlândia, Noruega, Reino Unido, Filipinas, Estados Unidos, Canadá, índia,

Brasil e Colômbia (Harvey et al., 1998).

2


No Brasil, mais especificamente no Sudeste, várias espécies de peixes

encontradas nos Estados de Santa Catarina, São Paulo e Minas Gerais, têm sido

objetos de diversos estudos relacionados à criopreservação, destacando-se

trabalhos com as espécies Pseudoplatystoma corruscans (pintado), os characideos

curimba (Prochilodus lineatus), pacu (Piaractus mesopotamicus), piapara (Leporinus

elongatus), dourado (Salminus maxillosus) (Carolsfeld et al., 2003), a falsa

pirapitinga (Brycon nattereri) (Oliveira et al., 2006) e a piracanjuba (Brycon

orbignyanus) (Bedore, 1999; Murgas et al., 2001, 2004, 2007; Carolsfeld et al., 2003;

Maria et al., 2006). Nestes trabalhos vários tipos de crioprotetores e diluentes foram

testados, dos quais o dimetilsulfóxido a 10%, combinado com a glicose a 5% e a

gema de ovo mostraram motilidades espermáticas acima de 50%.

No Nordeste do Brasil, este tipo de pesquisa tem sido pouco abordada. No

caso do Estado do Ceará só foram realizados dois trabalhos, um deles com a

espécie Colossoma macropomum (tambaqui), realizado por Farias (1998) que

utilizou a água de coco como ativador e como diluente do sêmen, em várias

osmolaridades, conseguindo resultados promissórios. O outro trabalho realizado por

Carvalho (1999), mostrou motilidades baixas dos espermatozóides ao criopreservar

sêmen da espécie Ciprinus carpio (carpa) em água de coco acrescida de glicerol ou

etileno-glicol como crioprotetores.

Embora seja endêmica do Amazonas, a espécie Piaractus brachypomus

(pirapintiga ou pacu branco), pertencente aos characideos, é uma espécie altamente

comercial na região Nordeste brasileira pela qualidade de sua carne. Recentemente,

a diminuição na diversidade genética observada nos plantéis de reprodutores das

fazendas dedicadas à produção de alevinos e os freqüentes fenômenos cíclicos de

secas, os quais exercem acentuada ação sobre seus processos reprodutivos, obriga

a regularizar ou desenvolver tecnologias que permitam o intercâmbio de material

seminal entre os produtores, aproveitar as gametas que possam obter-se de

indivíduos silvestres e conservar amostras seminais nos períodos menos favoráveis

(Farias, 1998; Fresneda et al., 2004).

3


2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Descrição da espécie

A pirapitinga (Piaractus brachypomus) é uma espécie nativa dos rios

Amazonas, Orinoco e seus afluentes. Foi introduzida no Ceará em 1972 pelo

Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS). Os primeiros

exemplares trazidos de Iquitos (Peru) foram com o objetivo de povoamento dos

açudes e estocagem em viveiros para seu cultivo intensivo (Sobrinho et al., 1984).

Hoje em dia o Centro de Pesquisas em Aqüicultura do DNOCS produz grandes

quantidades de alevinos provenientes do cruzamento dos estoques originais.

A espécie apresenta de 33 a 37 rastros no primeiro arco branquial, 88 a 98

escamas na linha lateral e 1 a 3 dentes no maxilar. Atinge 79 cm de comprimento

total e 11 kg de peso corporal. Sua cor é branco prateada, com nadadeiras peitorais

de cor amarela, abdominais e anal vermelhas. A coloração vermelha vivo no peito

aparece na época de desova e é muito acentuada (Fig. 1). A espécie é conhecida no

mundo como cachama, cachama blanca, freshwater pompano, pacu, red pacu,

redbellied pacu, morocoto, paco e caranha.

Classificação taxonômica (FISHBASE, 2008):

Reino Animália

Filo Chordata

Classe Teleostei

Ordem Cypriniforme

Família Characidae

Gênero Piaractus (Holmberg, 1887)

Espécie Piaractus brachypomus (Cuvier, 1818)

Sinônimos ambíguos (FISHBASE, 2008):

Colossoma mitrei (non Berg, 1895)

Myletes edulis (non Castelnau, 1855)

Myletes mitrei (non Berg, 1895)

../../../../topic/pacu-2

../../../../topic/paco-drug

4


Piaractus mitrei (non Berg, 1895)

Sinônimos Unambíguos (FISHBASE, 2008):

Colossoma bidens (Spix e Agassiz, 1829)

Colossoma brachypomum (Cuvier, 1818)

Colossoma branchypomus (Cuvier, 1818)

Colossoma paco (Humboldt, 1821)

Myletes bidens (Spix e Agassiz, 1829)

Myletes brachypomus (Cuvier, 1818)

Piaractus mesopotamicus (Cuvier, 1818)

Piaractus brachipomus (Cuvier, 1818)

Piaractus briachypumus (Cuvier, 1818)

Os indivíduos em cativeiro não conseguem desovar naturalmente porque

nessas condições não encontram estímulos físico-químicos para completar seu ciclo

de reprodução, sendo necessária a indução hormonal com hipófise de carpa e a

fertilização artificial. Nas condições naturais, estes peixes migram rio acima no

período entre junho/julho até outubro, quando os ovários das fêmeas ainda não

estão desenvolvidos, por isso são chamadas de espécie de piracema. A desova

ocorre no período de novembro a fevereiro quando as condições ambientais se

tornam ideais, com temperatura media da água de 27°C após as primeiras chuvas.

As fêmeas de pirapitinga alcançam sua maturidade sexual ao cabo de três

anos, enquanto que a dos machos ocorre ao final de dois anos. São espécies de

fecundação externa as quais liberam seus gametas no meio ambiente (Almeida,

1997).

Segundo Mesa e Botero (2007) as pirapitingas são espécies de grande

importância comercial devido a seu hábito alimentar (frutas, restos de cultivos

agrícolas, farelo de trigo, cuim, etc.), excelente crescimento, resistência ao manejo

em cativeiro, apresenta alta docilidade, resistente às enfermidades, é de fácil

adaptação às condições limnológicas desfavoráveis por períodos não prolongados e

porque podem ser criadas com outras espécies, tais como as tilápias e as carpas.

5


Figura 1. Adulto de pirapitinga (Piaractus brachypomus)

2.2. Características gerais do espermatozóide de teleósteos

O espermatozóide dos peixes com fecundação externa tem uma estrutura do

tipo simples (Fig. 2), apresenta uma cabeça que mede entre 2-4 micrometros, sendo

quase esférica e conformada por um núcleo no qual se encontra o DNA, um colar

que forma a peça intermediária onde se encontram os centríolos e de 2 a 9

mitocôndrias, um flagelo que pode medir entre 20 e 100 mm constituído por um

axonema com nove pares de microtubulos periféricos e um par central. A membrana

que recobre o espermatozóide está composta de fosfolipídios, lipídios neutros e

glicolipídios, sua função é fundamental para a regulação de diferentes atividades

celulares e vias de sinalização que podem conduzir à motilidade espermática.

Os espermatozóides da maioria dos peixes não possui acrossoma,

característica que os diferença do sêmen de mamíferos, não precisam desta

estrutura porque as gametas, ao serem liberados no meio, entram diretamente na

micrópila dos ovócitos, finalizando a fecundação. Esta cavidade permanece pouco

tempo aberta, se fechando em poucos minutos ao hidratar-se o ovócito no momento

de ser liberado na água (Morales, 1986).

6


Figura 2. Espermatozóides de Piaractus brachypomus a 400X, corados com azul de

bromofenol.

2.2.1. Motilidade

O sêmen de peixes se encontra inativo dentro dos testículos, ao entrar em

contato com a água, contam com um breve período de ativação, que se expressa no

movimento e velocidade para lograr a fertilização. Esta motilidade se deve a

mudanças na pressão osmótica, balanço iônico e pH (Fig. 3).

Todo o processo começa quando os espermatozóides passam pelo conduto

espermático, onde são banhados pelo fluido testicular ou plasma seminal, o qual tem

pH básico e é rico em bicarbonato (HCO3), fazendo com que permaneçam imóveis e

com metabolismo reduzido, onde as mitocôndrias se encontram com baixo potencial

de membrana a fim de preservar as poucas reservas energéticas e diminuir a

formação de compostos de oxidação.

Quando ocorre a espermiação no meio aquoso, os fatores que suprimem a

motilidade são neutralizados no momento pelas condições do meio ambiente e a

motilidade espermática é parcialmente controlada pela pressão osmótica. Em peixes

continentais, a água tem uma baixa osmolaridade em comparação com o plasma

seminal, ocorrendo assim um choque hiposmótico que gera o sinal inicial para os

eventos que conduzem à ativação e que, na maioria dos peixes de água doce, tem

uma duração de 30 a 40 segundos. Com uma solução ativadora de qualquer

composição iônica, entre a faixa de 100 a 200 miliosmoles (mOsm/kg), já é possível

desencadear a ativação por abertura de canais iônicos ao provocar um estiramento

das células por hiperpolarizando a membrana.

O principal efeito do choque hiposmótico na cascada da iniciação da ativação

da motilidade do espermatozóide é induzir uma imediata hiperpolarização da

7


membrana, o qual leva a um desenvolvimento progressivo da ativação da

motilidade flagelar e também a um incremento do pH intracelular, alterado pelo

incremento ou diminuição da concentração iônica interna (Tabares et al., 2005).

Na carpa, os espermatozóides imóveis têm um potencial de membrana baixo,

devido ao fato de que a carga é maior no plasma seminal (82.4 mM de K+) que em

nível intracelular (60.5 mM de K+). Na iniciação da motilidade induzida por

osmolaridade, diminui a pressão osmótica extracelular e a concentração de K+,

resultando em uma hiperpolarização transitória da membrana (Krasznai et al., 1995).

O balanço iônico também tem papel na aquisição da capacidade para a

ativação da motilidade e está relacionado com as mudanças nas concentrações

extracelulares de K+, Na+, HCO3 e íons hidrogênio. A tensão de membrana modifica

a conformação de algumas proteínas membranais, permitindo o intercâmbio de íons

com o meio extracelular, o Ca2+ ingressa no espermatozóide, e participa na

regulação do início da ativação; desencadeando a transdução de sinais e atuando

como enzima efetora através da adenilato ciclase, a qual regula o metabolismo do

AMPc. Os íons K+ inibem a ativação dos espermatozóides a baixas concentrações.

Devido a isso, se há reportado que a inibição da ação do K+ é regulada

principalmente pelos íons Ca2+, possivelmente devido ao fluxo simultâneo de Ca2+ e

K+. A saída de K+ favorece a abertura de canais de Ca2+ e o ingresso do mesmo até

o interior. O Ca2+ que ingressa, favorece a liberação de Ca2+ intracelular

armazenado e modifica o pHi (pH intracelular) produzindo-se o primeiro sinal Ca2+

dependente e AMPc independente para o início da motilidade. No caso da truta, os

íons Na+ e Mg2+ também participam no processo de ativação, reduzindo a ação

inibitória dos íons K+ (Cosson et al., 1999).

O pH extracelular é outro dos fatores que controla os parâmetros da motilidade,

e seus valores ótimos são necessários mas não suficientes para as condições de

ativação espermática, alterações do pH interno (um possível segundo mensageiro

celular) interferem com a motilidade em diferentes espécies. Portanto, a modificação

do pH intracelular por ação do Ca2+ e outros componentes parecem ser necessárias

no processo de ativação. A motilidade flagelar depende do pH intracelular numa

faixa de 6.5 - 8.5, acima ou abaixo desses valores, se reduz significativamente

(Tabares et al., 2005).

8


Figura 3. Dinâmica dos mecanismos de inibição e ativação espermática em peixes

de água doce (Adaptado de Tabares et al., 2005).

2.2.2. Morfoanomalias:

A avaliação morfológica dos espermatozóides é importante, já que poderá

definir o estado das células e a taxa de fecundidade. Suas características foram

classificadas em dois grupos:

9


a) Anormalidades secundárias ou menores: espermatozóides que podem

apresentar cabeça isolada, flagelo dobrado ou gotas citoplasmáticas no flagelo

próximas à cabeça. Estas morfoanomalias não afetam significativamente a

fertilidade.

b) Anormalidades primárias ou maiores: são todas as anormalidades de cabeça

(macrocefalia, microcefalia, degenerada), gotas livres ou distais no flagelo, flagelos

curvados, dobrados ou quebrados. Estas morfoanomalias podem afetar

significativamente a fertilidade (Sierra, 2005).

Cada uma destas alterações se define da seguinte forma:

Anormalidades maiores:

a) Macrocefalia: se observa naqueles espermatozóides que apresentam cabeça

gigante, com contorno e forma anormais, sem aparente degeneração cromatínica ou

vacuolar.

b) Microcefalia: espermatozóides com cabeça de tamanho reduzido, com

contorno e forma anormais, sem degeneração cromatínica ou vacuolar aparentes.

c) Cabeça degenerada: espermatozóides com cabeça de tamanho e forma

normais, mas que apresentam contorno irregular e ou degenerações cromatínica ou

vacuolar aparentes.

d) Peça intermediária degenerada (PID): alterações na espessura (terço médio

da peça intermediária), densidade, difração e comprimento da peça intermediária,

envolvendo seu contorno e sua inserção à cabeça (colo).

e) Cauda fraturada: células espermáticas com fratura e retenção da cauda.

f) Cauda fortemente enrolada: consisti da dobradura e enovelamento da cauda

sobre si mesma ou sobre a cabeça.

g) Cauda degenerada: espermatozóides que apresentam descontinuidade da

cauda a partir da peça intermediária.

Anormalidades menores:

a) Cabeça isolada normal: cabeças observadas sem cauda, porém sem

qualquer alteração de cabeça.

10


b) Cauda dobrada: dobradura da cauda, em diversos graus, sem envolver a si

mesma ou a cabeça.

c) Gotas citoplasmáticas: gotas posicionadas ao longo do flagelo.

Quando os espermatozóides apresentam morfoanomalias maiores e menores

simultaneamente, são consideradas as alterações maiores e, quando dois tipos de

anormalidade da mesma categoria ocorreram simultaneamente, aquela de maior

implicação sobre a fertilização é considerada.

2.3. Processo de congelamento

A técnica de congelamento celular basicamente resulta na transferência de

temperatura e no transporte de água. Pode ser dividida em três etapas: (1) As

células são submetidas a uma solução crioprotetora (metanol, etileno-glicol, glicerol,

etc.), a qual penetra na célula e substitui a maior quantidade de água intracelular; (2)

Posteriormente, a célula deve regular a osmolaridade, ficando isotônica com o meio

extracelular, o que pode causar efeitos tóxicos e impactos osmóticos nas mesmas;

(3) Na última etapa, se faz diminuir a temperatura passando pelo ponto de

congelamento da água e da solução crioprotetora onde, segundo a curva de

congelamento empregada, se realizará de maneira diferente a formação de cristais,

os quais podem chegar a danificar a célula (Lezcano, 2001).

Se a taxa de resfriamento é baixa, há suficiente tempo para que as células

percam a água necessária para permanecer em equilíbrio osmótico com a solução

extracelular concentrada; embora uma exposição prolongada à solução concentrada

seja geralmente letal. Por outra parte, se a taxa de resfriamento é alta, não há tempo

suficiente para que a água se difunda fora das células formando cristal de gelo. As

células se equilibrarão por congelamento intracelular iniciado por nucleação

homogênea ou heterogênea, sendo o congelamento intracelular fatal.

Uma situação balanceada que permita a sobrevivência pode dar-se quando a

taxa de resfriamento seja o suficientemente alta para minimizar o tempo de

exposição à solução concentrada e, ao mesmo tempo, suficientemente baixa para

minimizar a quantidade de gelo intracelular por abaixo do nível crítico ao criodano

(Sierra, 2005).

11


Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen,

sendo os mais utilizados as geladeiras de isopor, “dry shippers”, freezers reguláveis

e botijões criogênicos, dentro dos quais são introduzidas palhetas francesas

plásticas, cujo volume pode ser de 0,25 , 0,5 e 5 mL (Maisse et al., 1998).

A geladeira de isopor consiste em uma caixa de polietileno de 50x30x30 cm,

dentro da qual é adaptada uma rampa metálica separada do fundo 10 cm, onde a

temperatura desejada se consegue colocando o nitrogênio líquido a certa altura e as

amostras são congeladas só com o vapor do nitrogênio (Fig. 4 A).

O “dry shipper” é um contêiner para transportar com segurança amostras em

temperaturas criogênicas. Trata-se de um botijão em alumínio de 50 cm de altura x

30 cm de diâmetro, cujo interior está recoberto por um material de absorção e no

meio possui um cilindro onde se suspende uma caneca onde são colocadas as

amostras, as quais também são congeladas com os vapores do nitrogênio (Fig. 4 B)

(www.taylorwharton.com).

Vários destes equipamentos foram testados em várias ocasiões, Riley et al.

(2004) congelaram em câmaras frias a -140°C, com uma curva de -16°C/min,

começando de -60°C, já que ao colocar as amostras a temperatura aumentou.

Cruz et al. (2004), usaram o vapor de nitrogênio líquido dentro de uma

geladeira de isopor, colando uma rampa a 3 cm do fundo, estabilizando a

temperatura a -76°C durante 15 minutos e Degraaf et al. (2004), colocando as

amostras em palhetas de 0,5 mL congelou em um freezer programável a -10°C/min

até -150°C, finalmente como a maioria de estudos depois de um tempo determinado

as palhetas foram transferidas ao nitrogênio liquido a -196°C.

No Brasil, Maria (2005), congelou sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus)

dentro de um “dry shipper” a -170°C, a uma taxa de congelamento de -35.6°C/min

durante 24 horas.

12


Figura 4. Equipamentos para congelamento de sêmen: (A) geladeira de poliestireno com rampa metálica, (B) “dry shipper” (www.taylorwharton.com).

2.3.1. Agentes crioprotetores

Os crioprotetores são empregados no congelamento para diminuir os danos

celulares produzidos pelo processo de congelamento-descongelamento. Estas

substâncias devem possuir como propriedades uma baixa toxicidade para as células

e alta solubilidade em água (Miliorini, 2006). Podem ser classificadas como

intracelulares ou permeáveis e extracelulares ou impermeáveis. O crioprotetor

intracelular é uma substância química que retira a água da célula e diminui a

temperatura em seu interior, interferindo na formação de cristais de gelo. Entre os

crioprotetores intracelulares mais utilizados podem ser citados dimetilsulfóxido

(DMSO), glicerol, metanol e etilenoglicol usados geralmente a uma concentração de

10% (Maria, 2005). Recentemente foi descrita a excelente ação do metilglicol como

crioprotetor de sêmen de piracanjuba (Maria, 2005).

O DMSO tem mostrado bons resultados tanto para espécies de água doce

como a truta arco-íris (Oncorrhynchus mykiss) e a piracanjuba (Brycon siebenthale)

com taxas de motilidade de 60 a 80 % (Medina et al., 2005), como para espécies

marinhas como o linguado e o pargo (Dreanno et al., 1997; Riley et al., 2004).

Carolsfeld et al. (2003), trabalhando com criopreservação de sêmen de peixes

migratórios brasileiros, utilizaram o crioprotetor DMSO com sucesso no

congelamento do sêmen das seguintes espécies: curimbatá (Prochilodus lineatus),

pacu (Piaractus mesopotamicus), piapara (Leporinus elongatos), piracanjuba

(Brycon orbignyanus) e dourado (Salminus maxillosus).

13


No caso do glicerol este funciona para algumas espécies nas quais seu fluido

seminal é naturalmente rico em glicerol como no peixe Coregonus muksun. E o

metanol, que é altamente inflamável, em peixes tropicais como as tilápias

(Oreochromis sp.) e o Zebrafish (Brachydanio rerio) apresentando altas taxas de

motilidade (Maisse et al., 1998).

Os crioprotetores extracelulares funcionam de forma diferente; ao invés de

entrarem na célula, eles recobrem a superfície celular e estabilizam a membrana,

ajudando, portanto, a minimizar e reparar os possíveis danos celulares causados

pelo processo de congelamento. Incluem açúcares (sacarose, glicose) sendo estes

também considerados como diluentes, polímeros (dextrano, PVP) e proteínas (gema

de ovo e leite em pó) (Sierra, 2005), a combinação de um crioprotetor intra e

extracelular é muito empregada para os processos de criopreservação. Navarro et

al. (2004) criopreservaram sêmen de cachama blanca (Piaractus brachypomus) em

criosoluções contendo glicose, gema de ovo e leite em pó.

2.3.2. Meios diluentes

O sêmen puro é praticamente impossível de ser congelado, necessitando tanto

da adição de crioprotetores como de meios diluentes. Sendo estes últimos soluções

de sais ou de carboidratos, que adicionados ao sêmen, mantém a viabilidade das

células espermáticas durante a redução da temperatura. As condições mínimas

requeridas para um diluente adequado são: isotonicidade, para que não haja

ativação prévia da motilidade espermática; estabilidade, pois suas características

físico-químicas não devem ser alteradas durante o contato com o sêmen;

condutividade térmica elevada, permitindo a rápida transferência de temperatura do

meio externo para os espermatozóides; esterilidade, ou seja, não devem vincular

microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e, finalmente,

servir de carreador de crioprotetores. É importante que a motilidade dos

espermatozóides não seja ativada antes do congelamento e nem durante o

descongelamento, pois a mesma pode exaurir a reserva energética necessária à

fertilização (Legendre e Billard, 1980).

Na maioria dos trabalhos, a combinação desses dois agentes (crioprotetores e

diluentes) é diferente sendo muito difícil saber qual é o fator ideal para cada espécie,

já que eles atuam de forma distinta (Maisse et al., 1998).

14


2.4. Avaliação da cinética espermática através do sistema de análise

seminal auxiliada por computador (CASA)

O sistema de análise seminal auxiliado por computador é formado por um

microscópio ótico binocular com contraste de fase acoplado a uma câmera de vídeo

e placa aquecedora, conectados a um computador que utiliza o software SCA. Este

programa provê os meios para uma classificação objetiva e rápida, de uma

determinada população de espermatozóides. Usando imagens digitais da trajetória

de cada célula espermática, o CASA pode analisar, processando algoritmos, as

propriedades de movimento dos espermatozóides (Verstegen et al., 2002).

O sistema é simples, envolve uma câmara filmadora que grava o movimento

através do videomicroscópio e depois recomeça a seqüência quadro a quadro

enquanto marca a posição de cada espermatozóide em um tempo determinado para

assim poder calcular as velocidades e a motilidade. Este programa é muito utilizado

para avaliação de sêmen humano em clínicas de fertilidade, também sendo muito

utilizado para mamíferos, mas que para peixes teve que ser adaptado pelo tempo de

movimento, que é de menos de 2 minutos, comparado às varias horas do sêmen de

mamíferos (Kime et al., 2001).

Os parâmetros do CASA que são geralmente informados incluem:

MOT (%): percentual de espermatozóides móveis ou progressivos, determinando os

que têm movimento rápido, movimento médio e os localmente móveis ou lentos.

VCL (µm/seg): velocidade curvilinear, que é a velocidade do movimento ao longo da

trajetória (Fig. 5).

VSL (µm/seg): velocidade em linha reta, velocidade do movimento a partir do ponto

inicial até o ponto final ao longo de uma linha reta teórica unindo os dois pontos.

VAP (µm/seg): é a velocidade média do caminho.

LIN (%): linearidade, que é a proporção entre a VSL e a VCL (VSL/VCL) e indica que

o maior valor da reta é o caminho mais linear dos espermatozóides.

STR (%) (straightness): índice de espermatozóides na reta.

ALH (µm/seg): deslocamento lateral da cabeça.

BCF (Hz): freqüência de batimentos cruzados.

15


Figura 5. Representação esquemática das diferentes velocidades medidas pelo sistema de análise seminal (CASA). VCL= velocidade curvilinear; VSL= velocidade em linha reta; VAP = velocidade média.

Alguns estudos foram realizados em peixes utilizando o sistema CASA para

registrar o movimento dos espermatozóides depois do processo de criopreservação,

um destes é o de Liu et al. (2007), onde avaliaram a motilidade e a velocidade do

sêmen fresco e descongelado do Pagrus major 10 segundos pós-ativação. Os

autores encontraram 87% de motilidade no sêmen fresco e 82% no sêmen

congelado com DMSO a 10%, não existindo diferença significativa entre a

velocidade do sêmen descongelado e o sêmen fresco.

Dreando et al. (1997), analisaram no CASA a motilidade do sêmen pré e pós-

descongelamento do peixe plano Scophthalmus maximus, onde os melhores

resultados (60 e 80% de motilidade) foram obtidos quando se diluiu Mounib

modificado (KHCO3, sacarose e glutationa) em BSA ou DMSO a 10%, enquanto a

velocidade permaneceu estável entre o sêmen puro e o descongelado.

Outros estudos se apóiam no programa para observar características do sêmen

“in natura” ou para testar outros fatores que influenciam a velocidade e o movimento

do sêmen. Dietrich et al. (2005), investigaram os efeitos seqüenciais do sêmen

coletado post mortem e depois da anestesia da truta arco íris (Oncorhynchus

mykiss), percebendo uma diminuição nos parâmetros de motilidade, velocidade e

trajetória. Wilson e Ingerman (2007) obtiveram no peixe zebra (Danio rerio)

motilidades de 83%, VCL de 104 µm/s, VAP de 77 µm/s, VSL de 77 µm/s e LIN de

84 µm/s ativado com água da torneira.

16


3. JUSTIFICATIVA

Cada processo de congelamento é espécie-específico, por isso é preciso ter

informações sobre as particularidades do sêmen da espécie objetivo e de diversas

espécies de peixes (volume coletado, motilidade, concentração de espermatozóides,

pH e osmolaridade), o que permite padronizar as técnicas, definir os componentes

crioprotetores e os meios diluentes a testar, bem como os procedimentos adequados

para o congelamento e posterior descongelamento dos espermatozóides (Carneiro,

2007). Também é importante conhecer as morfoanomalias do sêmen antes e depois

de ser congelado, já que estas representam o estado dos gametas no momento do

congelamento e os criodanos causados por este processo.

Ainda existem muitas questões básicas a serem respondidas no tocante às

técnicas de conservação de sêmen de muitas espécies tropicais de interesse

econômico e ambiental. Alguns dos objetivos essenciais da criopreservação são

alcançar taxas de fertilização próximas às obtidas com sêmen fresco, avaliar

criodiluentes que diminuam os efeitos tóxicos, estresse osmótico e criodanos sobre

a célula espermática (alterações na membrana do espermatozóide e em seu DNA) e

conseguir curvas de congelamento e descongelamento benéficas para os

espermatozóides (Deandro et al., 1997; Suquet et al., 2000; Medina et al., 2005).

Portanto, é importante a continua e progressiva pesquisa com crioprotetores, já que

eles são adicionados ao meio para proteger os gametas durante o processo de

criopreservação e descongelamento, sendo fundamentais para evitar a formação de

cristais de gelo intracelular que causariam o rompimento da célula (Medeiros et al.,

2002). Entretanto, altas concentrações de crioprotetores são deletérias aos

espermatozóides devido a sua toxicidade, o qual pode resultar na redução da

motilidade. Igualmente os meios diluentes devem ser adicionados aos crioprotetores,

já que os mesmos prolongam a vida dos espermatozóides in vitro, reduzindo a

atividade metabólica, seja por inibidores químicos ou por redução de temperatura

(Cloud, 2000).

A geração de um protocolo de criopreservação do sêmen da espécie Piaractus

brachypomus (pirapitinga), contribuirá não só para suprir a demanda da espécie

como também trará vantagens ao aqüicultor e ao meio ambiente, devido a seguintes

17


itens: i) redução ou eliminação de reprodutores (machos) mantidos na Estação

experimental, com conseqüente redução de custos; ii) eliminação da assincronia da

atividade reprodutiva entre reprodutores, quando estes não estão preparados

simultaneamente para a reprodução; iii) utilização de um volume total de sêmen,

quando são indivíduos que produzem pouco em cativeiro; iv) disponibilidade de

sêmen fora da temporada de desova; e v) diminuição da pressão sobre as

populações silvestres (Godinho, 2000).

18


4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral

Desenvolver um protocolo adequado de criopreservação para o sêmen da

pirapitinga, Piaractus brachypomus, testando diferentes crioprotetores e

diluentes na qualidade “in vitro” dos espermatozóides.

4.2. Objetivos Específicos

Determinar as características seminais da pirapitinga como: volume, pH,

concentração espermática e osmolaridade;

Avaliar a toxicidade dos crioprotetores DMSO e metilglicol a 10%, através

do comportamento cinético espermático após 15 minutos resfriados a 4°C;

Avaliar a cinética espermática em sêmen fresco e diluído em Ringer, ACP-

104 e glicose pós-descongelamento;

Observar as principais alterações morfologicas do sêmen fresco e pós-

descongelamento.

19


5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Local do experimento e animais experimentais

O estudo foi conduzido entre os meses de dezembro de 2007 e março de 2008.

Foram utilizados 19 machos maduros de pirapitinga, os quais apresentaram a papila

urogenital hiperêmica e liberaram sêmen sobre delicada pressão no abdômen. Estes

peixes foram pesados e medidos usando uma balança analítica e fita métrica. Logo

colocados em viveiros de terra de 350 m2, alimentados com rações balanceadas

com 30% de proteína, fornecida diariamente a uma taxa de 3% do peso total dos

indivíduos. Os 19 animais foram marcados com chip, sendo colocado na base da

nadadeira dorsal para sua posterior identificação (Fig. 6).

Figura 6. Leitura da marcação eletrônica com chip das pirapitingas.

Os animais faziam parte do plantel do Centro de Pesquisas Ictiológicas

"Rodolpho von Ihering" do DNOCS, Pentecoste-Ceará, localizado entre os

03°45’00”S e 39°21’00”W, a 90 Km de Fortaleza.

20


5.2. Hipofisação dos reprodutores

Os peixes foram divididos em dois grupos, um com 09 e outro com 10 animais.

A indução hormonal se realizou a cada 20 dias, trocando sempre o grupo para que

não fossem induzidos os mesmos peixes, ou seja, cada grupo foi induzido a cada 40

dias durante o período de amostragem. Para tanto, se estimou a média do peso de

cada grupo de reprodutores e procedeu-se a tratamento hormonal com extrato bruto

de hipófise de carpa (EBHC), em uma dosagem para indução à espermiação de 2

mg/kg de peso corporal médio, aplicada próxima à nadadeira dorsal. A coleta de

sêmen foi realizada 12 horas após a injeção.

5.3. Coleta de sêmen

Antes de ser coletado o sêmen, foi realizada uma breve pressão celômica

sobre os rins para eliminar a maior quantidade de urina possível. Seguidamente, a

papila urogenital foi seca com papel toalha para reduzir o risco de possível

contaminação com água, fezes ou resquícios de urina. Em seguida, foram realizadas

massagens manuais leves sobre a parede celômica na área onde se localizam os

testículos, no sentido ântero-posterior. O sêmen foi coletado em tubos Eppendorf de

2 mL e mantido em geladeira de isopor a 4°C (Fig. 7).

Figura 7. Coleta do sêmen de pirapitinga em Epperdorf.

21


5.4. Teste de contaminação do sêmen

Imediatamente após a coleta, uma alíquota de 2 µL de sêmen fresco de cada

peixe foi colocada em uma lâmina histológica, coberta com lamínula e observada ao

microscópio ótico, sob aumento de 400x, onde foram avaliados três campos,

calculando o porcentual médio de espermatozóides móveis, conforme Strussman et

al. (1994) (Quadro 1). Tendo em vista que os espermatozóides no sêmen fresco,

sem contaminação são imóveis, se considerou adequado para os experimentos o

sêmen que exibiu taxas de motilidade espermática não superior a 5%. Amostras que

apresentaram motilidade foram descartadas dos testes de toxicidade e

criopreservação.

Quadro 1. Análise subjetiva da motilidade (adaptado de Strussman et al.,1994).

Porcentagem de

espermatozóides

móveis

Qualidade dos espermatozóides

0 - 20 Espermatozóides parados ou vibrando.

20 - 40 Espermatozóides vibrando e alguns com movimentos circulares no próprio

local.

40 - 60 Espermatozóides com movimentos circulares no próprio local e alguns com

movimento retilíneo de baixa freqüência.

60 - 80 A maior parte dos espermatozóides apresenta movimento retilíneo linear de

alta freqüência, uns poucos com velocidade retilínea de baixa freqüência e

uma pequena parte com movimento circular.

80 - 100 Espermatozóides móveis com movimento retilíneo de alta freqüência

(movimentos flechantes).

5.5. Avaliação da motilidade

A motilidade foi mensurada subjetivamente segundo o Quadro 1, para cada

peixe durante a coleta (visando formar os “pools” de sêmen) e objetivamente para

cada “pool” no programa SCA (SCA®2005, Microptics S.L., Espanha) usando o

sistema de analise CASA, no Laboratório de Tecnologia de Sêmen Caprino e Ovino

(LTSCO) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). Os parâmetros para a análise

pelo sistema CASA se encontram descritos no Quadro 2.

22


Foi colocado 1 µL de sêmen em uma lâmina e depois foram adicionados 50 µL

de solução ativadora (NaCl 50 mM; Maria et al., 2006) misturando com a ponteira da

micropipeta durante 2 segundos. Finalmente a amostra foi observada em

microscópio ótico a 400x, sendo analisados três campos. A duração da motilidade

espermática foi estimada desde a homogeneização até que somente restassem 10%

de espermatozóides móveis.

Quadro 2. Parâmetros estabelecidos para a análise pelo sistema CASA do sêmen

de pirapitinga (Piaractus brachypomus).

Espécie Peixe

Número de quadros consecutivos a analisar 25

Estáticos <10 µm/seg

Motilidade Lenta 10 µm/seg

Motilidade Média 20 µm/seg

Motilidade Rápida >40 µm/seg

5.6. Características seminais

Amostras de sêmen de cada peixe por coleta foram avaliadas para determinar

suas características: aspecto (denso, semi-denso, ralo); cor (branco leitoso, branco

amarelado, amarelo, transparente); volume (mL; graduação nos Eppendorfs);

osmolaridade (mOsm/Kg; osmômetro), pH (0-14; papel medidor de pH); e

concentração espermática (x109 sptz/mL; câmara Neubauer).

Para mensuração da concentração espermática, uma alíquota de 1 µL foi

diluída em 4 mL de solução formol-salina a 1%; desta amostra, foram colocados 20

µL na câmara de Neubauer, contando os 5 quadrados da diagonal em microscópio

óptico a 400x, realizando 3 leituras por amostra.

23


5.7. Estudo da toxicidade do crioprotetor

Amostras de sêmen com motilidades maiores a 85% pós-ativação no teste da

motilidade foram selecionadas para os estudos de toxicidade, formando “pools” com

aproximadamente 2 mL de cada amostra e mantidas a 4°C.

Foram avaliados como crioprotetores:

Dimetil sulfóxido (DMSO) a 10%;

Metilglicol a 10%.

E como meios diluentes:

Glicose a 5%;

ACP-104 (meio diluente à base de água de coco em pó para peixes);

Solução Ringer (NaCl, KCl, NaHCO3 e CaCl2).

Nas diluições 1:3, 1:5 e 1:7 (sêmen:criodiluente), conforme Tabela 1.

Cada tratamento foi deixado em repouso por 15 minutos, à temperatura de 4°C

(Fig. 8) e depois analisado usando o método CASA, onde foram capturados e

registrados os dados de cinética espermática pós-ativação com solução de NaCl a

50 mM, segundo Quadro 2.

Figura 8. Teste de toxicidade, criodiluições resfriadas a 4°C.

24


Os resultados foram comparados com a motilidade calculada objetivamente dos

“pools” de sêmen fresco no teste da motilidade. Os tratamentos 5 e 6 só foram

avaliados a uma diluição de 1:7 por ser um criodiluente comumente usado em

peixes da mesma família.

Tabela 1. Diluentes e crioprotetores utilizados no teste de toxicidade e na criopreservação de sêmen de pirapitinga (Piaractus brachypomus).

Tratamento Diluente + Crioprotetores Diluições1:31:5T1 Ringer + DMSO 10%1:71:31:5T2 ACP-104 + DMSO 10%1:71:31:5T3 Ringer + Metilglicol 10%1:71:31:5T4 ACP-104 + Metilglicol 10%1:7

T5 Glicose 5% + Metilglicol 10% 1:7T6 Glicose 5% + DMSO 10% 1:7

5.8. Congelamento e descongelamento seminal

Experimento 1: Congelamento em rampa em palheta de 0,25 mL

Utilizou-se 3 “pools” de sêmen das amostras com motilidades pós-ativação

acima de 85%, para os tratamentos mencionados na Tabela 1.

As diluições dos criodiluentes foram realizadas em tubos de ensaio pequenos,

os quais permaneceram resfriados a 4°C durante 30 minutos antes de colocar as

amostras de sêmen correspondentes.

Após diluição, segundo cada tratamento, o sêmen+criodiluente foi envasado

em palhetas francesas de 0,25 mL (três palhetas por tratamento) (Fig. 9), vedadas

com álcool polivinílico e limpas com papel absorvente para evitar aderência de uma

palheta à outra.

25


Figura 9. Preenchimento de palhetas com as criodiluções.

Em seguida, foram dispostas em raques (suporte de alumínio) (Fig. 10)

marcadas e colocadas sobre rampa de congelamento a 5 cm do nitrogênio líquido

para obter a temperatura de -150ºC, recebendo somente os vapores. O controle da

temperatura foi realizado através de um termômetro digital com sonda. Após 5

minutos, as raques foram transferidas para canecas identificadas dentro de botijão

criogênico a -196ºC, onde permaneceram submersas de 12 a 15 dias.

Figura 10. Raques com globetes para o armazenamento das palhetas.

26


Após esse período, cada palheta foi descongelada em banho-maria a 60°C

(Fig. 11), durante 8 segundos, retiradas com pinças, enxutas com papel toalha e

cortadas com tesoura uma das extremidades. O sêmen descongelado foi alocado

em Eppendorfs de 2 mL a temperatura ambiente de 26ºC. Uma alíquota de 1 µL de

sêmen descongelado homogeneizada com 50 µL de solução ativadora de NaCl foi

colocada em câmara de Makler, sendo avaliada usando o CASA. Foram realizadas

três leituras de campos diferentes para cada palheta (Fig. 12 e 13). Vale ressaltar

que todo o procedimento de leitura foi realizado em menos 1 minuto.

Figura 11. Descongelamento das palhetas em banho-maria.

Figura 12. Página principal do resultado da avaliação de motilidade com o sistema CASA.

27


Figura 13. Representação dos movimentos dos espermatozóides de pirapitinga

avaliados com o método CASA.


Este experimento foi realizado com 3 “pools” com a mesma metodologia

descrita no experimento 1, sendo que com palhetas francesa de 0,5 mL.

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL

Neste caso foram realizadas 4 réplicas, ou seja, se formaram 4 “pools” de

sêmen. Utilizaram-se palhetas de 0,5 mL e o congelamento foi realizado em um

contêiner de vapor de nitrogênio (Taylor-Wharton, CX100 “dry shipper”) a -170ºC

(Fig. 14), permanecendo as raques durante 5 horas e logo transferidas ao nitrogênio

liquido. Os demais procedimentos foram realizados como no experimento 1.

28


Figura 14. Congelamento em “dry shipper” a -170°C.

5.9. Análise morfológica do sêmen

Com o sêmen de cada um dos 19 animais foram realizados esfregaços corados

para calcular as morfoanomalias do sêmen fresco e pós-descongelação.

Uma alíquota de 1 μL de sêmen fresco ou descongelado foi diluída em 4 mL de

solução formol-salina. A seguir, uma fração de 100 μL da amostra foi adicionada

com 2 μL do corante azul de bromofenol (1g azul de bromofenol; 4g citrato de sódio;

100 mL água destilada; pH 8.0) em um Eppendorf. Uma gota desta solução foi

depositada em lâmina histológica, realizado um esfregaço e deixado secar a

temperatura ambiente. As leituras foram realizadas no programa SCA em

microscópio de contraste de fases e campo claro a 400x.

O exame consistiu da observação das morfoanomalias (Tab. 2) de 100

espermatozóides focalizados em diversos campos ao longo de toda a lâmina.

29


Tabela 2. Morfoanomalias em espermatozóides de pirapitinga (Piaractus brachypomus).

Parte do espermatozóide Morfoanomalias

Macrocefalia

MicrocefaliaCabeça

Degenerada

Peça intermediária Degenerada

Proximal

Gota citoplasmática Distal

Dobrada

Cauda Enrolada (levemente e fortemente)

5.10. Análises estatísticas

Para as características seminais foi utilizada a média dos dados do mesmo

peixe nas diferentes coletas, devido ao fato de que cada um deles foi induzido várias

vezes. As amostras com sêmen contaminado que apresentaram alto movimento no

teste de contaminação não foram usadas para as análises estatísticas de motilidade.

Finalmente foi calculada a média e erro padrão para todos os peixes do

experimento.

No caso da análise dos testes de toxicidade e descongelamento, os dados das

taxas de motilidades espermática e velocidades de cada experimento foram testados

para distribuição normal. Os valores que não apresentaram essa distribuição foram

transformados em Log x+1 para sua normalização. Então, os dados foram

submetidos à análise de variância fatorial e as médias comparadas pelo teste de

Duncan, com um nível de significância de 0.05% utilizando-se o pacote

computacional Statistica 7, versão 2006.

Para a análise das morfoanomalias, se comparou as porcentagens de

alterações morfologicas encontradas do sêmen fresco e as morfoanomalias das

amostras pós-descongelamento, também entre os mesmos tratamentos. As

variáveis foram observadas quanto à homogeneidade da variância e à normalidade

dos resíduos, para depois serem transformadas e comparadas através do teste t.

30


6. RESULTADOS

Os machos da espécie Piaractus brachypomus mantidos em cativeiro

apresentaram fácil liberação de sêmen quando massageados ventralmente, após o

processo de indução hormonal e, em poucas ocasiões, o sêmen coletado foi

contaminado com urina, fezes, sangue ou água, segundo o teste de contaminação.

6.1. Características do sêmen

As amostras de sêmen dos 19 exemplares de pirapitinga apresentaram

coloração branca leitosa e aspecto semidenso. A maior quantidade de volume

coletado nos indivíduos foi de 12,3 mL e a menor foi de 1,5 mL. O pH apresentou

valores de 8,0 mínimo e 8,6 maximo. A osmolaridade registrou valores entre 272 e

400 miliosmoles (mOsm/kg) e a concentração espermática entre 11 a 70 x 109

espermatozóides/mL. Os espermatozóides não ficaram mais do que 60 segundos

móveis. A média dos dados de cada peixe, a média geral e o erro padrão podem ser

observados na Tabela 3.

Tabela 3. Características seminais das pirapitingas, avaliadas durante o período de dezembro de 2007 a março de 2008

PEIXEN°

CHIPVOL(mL)

pHOSMOL

(mOsm/kg)CONC PESO (g) CT (cm) MOT-S (%)

1 2020 9,8 8,0 319,3 67,5 3616,7 59,3 91,72 3492 5,3 8,2 298,7 28,8 3380,0 57,7 86,73 8474 6,4 8,4 382,7 30,1 3126,7 56,0 90,04 3354 6,8 8,2 349,3 34,2 3400,0 59,0 93,35 6876 8,3 8,3 294,7 57,6 3540,0 59,0 80,06 3568 8,1 8,3 297,0 41,2 3453,3 58,0 92,57 9326 6,7 8,2 272,0 14,3 2466,7 53,3 85,08 4063 12,3 8,5 290,5 26,4 3110,0 58,5 80,09 0196 6,4 9,0 317,5 11,2 2900,0 56,5 90,010 6975 7,9 8,3 300,5 70,3 3570,0 60,5 87,511 8103 7,0 8,5 272,5 49,2 3160,0 62,5 87,512 0290 8,8 8,3 350,5 55,4 3690,0 59,5 85,013 7232 9,4 8,5 294,0 35,1 3340,0 58,0 70,014 2117 6,7 8,6 325,5 46,2 3550,0 59,5 85,015 0373 5,5 8,3 311,0 67,5 4290,0 60,5 82,516 5808 6,7 8,5 313,5 69,3 3510,0 58,5 80,017 5000 1,5 8,5 284,0 17,8 4100,0 63,0 95,018 4389 8,3 8,5 350,5 55,0 3410,0 60,0 92,519 2671 4,1 8,5 400,5 54,2 3320,0 58,5 90,0

Média ± EP 7,1±1,6 8,4 ±0,2 317 ± 27 43,7 ± 16,3 3417 ± 270 59±1,5 86,5±4,7VOL = volume; OSMOL = osmolaridade; CONC = concentração espermática (x109/mL); CT = comprimento total; MOT-S = motilidade subjetiva.

31


As características dos “pools” formados com o sêmen dos 19 peixes são

apresentados na Tabela 4. As motilidades subjetiva e objetiva não foram

significativamente diferentes (P>0.05), embora seja mais precisa a objetiva por ser

medida com maior acurácia.

Tabela 4. Características dos “pools” de sêmen de pirapitinga

“POOL” VOL (mL) pHOSMOL

(mOsm/kg)CONC MOT-S (%) MOT-O (%)

1 5,7 8,5 276 19,4 90 942 6,7 8,5 288 25,0 90 973 6,0 8,5 309 10,0 90 934 6,5 8,5 307 13,6 85 915 12,5 8,5 328 53,4 85 966 13,0 8,5 320 58,2 85 937 6,0 8,5 317 52,8 90 998 5,0 8,5 429 57,7 85 929 5,3 8,5 411 39,0 85 9410 9,0 8,5 253 47,0 85 93

P>0.05; VOL = volume; OSMOL = osmolaridade; CONC = concentração espermática (x109/mL); MOT-S = motilidade subjetiva; MOT-O = motilidade objetiva.

6.2. Estudo da toxicidade dos crioprotetores

6.2.1. Motilidade

Os valores médios das motilidades e velocidades das amostras de sêmen

submetidas aos testes de toxicidade durante 15 minutos são apresentados na

Tabela 5. As análises estatísticas não mostraram diferença significativa entre a

maioria dos tratamentos, nem entre as diluições de cada um destes, no caso dos

valores de motilidade total ou progressiva, deslocamento médio e lento (P>0.05).

Entretanto, os espermatozóides do T5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%) foram menos

progressivos que os avaliados no T3 (Ringer + Metilglicol 10%) (P=0.03) (Fig. 15).

Observou-se nas amostras que as porcentagens de espermatozóides mais rápidos

encontravam-se nas duas primeiras diluições do T1 (Ringer + DMSO 10%) e T3

(Ringer + Metilglicol 10%), estando muito próximas aos valores do grupo controle

(P>0.05) (Fig. 17), embora entre todos eles não exista uma variabilidade

representativa.

32


No T3 (Ringer + Metilglicol 10%), na diluição 1:3, após o tempo de espera, se

registrou a maior motilidade do estudo (80%), com uma das maiores porcentagens

de espermatozóides rápidos do experimento, sendo este resultado semelhante aos

valores do grupo controle (P=0.06) (Fig. 17).

Por outro lado, ao comparar as criosoluções e suas respectivas diluições contra

o grupo controle (“pools” a fresco) se verificou uma diminuição na motilidade de

todas as criosoluções na diluição 1:7 (P<0.05), excetuando as do T3 (Ringer +

Metilglicol 10%) (P= 0.07) e T6 (Glicose 5% + DMSO 10%) (P>0.05) (Fig. 17).

6.2.2. Velocidades

Foi observada uma interação significativa da velocidade curvilinear (VCL) de T2

(ACP-104 + DMSO 10%) e T6 (Glicose 5% + DMSO 10%) com T3 (Ringer +

Metilglicol 10%) (P= 0.03), sendo este último quem apresenta os mais altos valores

de VCL do estudo, estando muito próximos aos valores do grupo controle, porém

não evidenciando diferenças estatísticas (P=0.12) (Fig. 16). O teste de Duncan

revelou que todas as diluições do T2 (ACP-104 + DMSO 10%) e T6 (Glicose 5% +

DMSO 10%) são diferentes ao controle, mas que só as diluições 1:5 e 1:7 do T3

(Ringer + Metilglicol 10%) diferem com a diluição 1:7 do T2 (ACP-104 + DMSO 10%)

(P=0.04) (Fig. 18).

A velocidade linear (VSL) permaneceu sem variações consideráveis em todos

os testes, apresentando uma rapidez similar ao sêmen fresco (P=0.37), embora

pareça ser um pouco mais alta no T4 (ACP-104 + Metilglicol 10%) na diluição 1:7

com 55,7 µm/s (Fig. 18).

No caso da velocidade média (VAP), o tratamento que teve maior influência na

sua redução foi o T2 (ACP-104 + DMSO 10%) na diluição 1:7 (42 µm/s) comparado

com o grupo controle (71 µm/s) (P=0.04) e com o T3 (Ringer + Metilglicol 10%)

(P=0.03). Não foram observadas diferenças significativas nas outras criodiluições

avaliadas no teste de toxicidade (P>0.05) (Fig. 18).

33


Tabela 5. Valores médios das porcentagens de motilidade total (MT), espermatozóides rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear(VCL), linear (VSL) e média (VAP) (µm/s) nos testes de toxicidade

Tratamento Diluição MT (%)Rápidos

(%)

Médios

(%)

Lentos

(%)

VCL

(µm/s)

VSL

(µm/s)

VAP

(µm/s)

T1 1:3 75,5 45,8 9,6 20,1 85,7 49,0 72,7

T1 1:5 77,3 43,5 11,8 22,1 80,7 42,2 68,4

T1 1:7 58,5 34,7 10,1 13,7 76,1 43,2 67,4

T2 1:3 61,5 31,8 13,4 16,3 59,3 41,6 53,9

T2 1:5 65,0 26,9 15,6 22,5 50,8 34,3 44,9

T2 1:7 53,3 22,9 13,8 16,7 47,6 32,6 41,9

T3 1:3 80,1* 50,3 13,9 16,1 94,9* 48,4 75,3

T3 1:5 78,9 51,1* 12,0 15,9 93,2 49,3 78,0*

T3 1:7 70,0 42,4 10,7 16,8 87,7 48,2 73,7

T4 1:3 79,7 35,4 22,0* 22,3 82,1 42,4 62,5

T4 1:5 63,6 25,5 13,7 24,3* 71,6 43,4 60,8

T4 1:7 56,0 29,7 9,1 17,2 83,5 55,7* 75,1

T5 1:7 51,5 32,8 7,2 11,5 82,2 50,7 74,0

T6 1:7 61,8 27,5 14,3 20,0 56,5 34,4 50,0

Controle - 94,2 71,1 14,6 8,8 113,7 43,3 71,2

*Maiores valores obtidos entre tratamentos. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3= Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 =Glicose 5%+DMSO 10%.

34


Figura 15. Média ± erro padrão da motilidade de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos nas criodiluições avaliadas no teste da toxicidade. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são significativamente diferentes (P<0.05).

Figura 16. Média ± erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s, nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da toxicidade. VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade linear;VAP = velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%. Letras diferentes são significativamente diferentes (P<0.05).

35


Figura 17. Médias e intervalo de confiança da motilidade de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos nas criodiluições avaliadas no teste de toxicidade. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

36


Figura 18. Médias e intervalo de confiança das velocidades espermáticas, em µm/s, nas diferentes criodiluições avaliadas no teste da toxicidade. VCL = velocidade curvilinear; VSL = velocidade linear; VAP = velocidade média. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

37


6.3. Congelamento e descongelamento seminal


Durante os congelamentos em vapores de nitrogênio líquido utilizando a

geladeira de isopor, a temperatura variou constantemente. Na curva de

congelamento apresentada na Figura 19, pode-se observar que nos 2 primeiros

minutos a temperatura aumentou entre 30 e 90°C, estabilizando entre o minuto 3 e 4

e começando a diminuir no quarto, levando aproximadamente 5 a 10 minutos para

retornar a temperatura inicial de -150°C, embora as amostras tenham sido retiradas

aos 5 minutos, para conservar um padrão.

-150-140

-130-120

-110-100

-90-80

-70-60

0 1 2 3 4 5

Tempo (min)

Te

mp

era

tura

(°C

)

Pool 1

Pool 2

Pool 3

Pool 4

Pool 5

Pool 6

Figura 19. Curva de congelamento dos experimentos 1 e 2 utilizando o equipamento de geladeira de isopor com rampa durante 5 minutos.

De maneira geral, todos os tratamentos congelados em palhetas de 0,25 mL

utilizando a técnica de congelamento sobre rampa na geladeira, apresentaram

valores de motilidade total baixos (aproximadamente de 12%) quando comparados

com o grupo controle (94%), apresentando diferença estatística altamente

significante (P<0.01).

Com 40% de motilidade, a criosolução T5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%) foi a

única criosolução que se sobressaiu das outras (P<0.05). Foi ainda observado que

26% dos espermatozóides eram rápidos pós-descongelamento. Mesmo assim, estes

valores continuam sendo baixos quando comparados com o sêmen fresco (P<0.05).

38


A criosolução T6 (Glicose 5% + DMSO 10%) apresentou valores de motilidade

espermática muito semelhante à criosolução anterior (P= 0.1) com maior número de

espermatozóides médios e lentos (Fig. 20).

Progressivos Rápidos Médios LentosT1 T2 T3 T4 T5 T6 Controle

Tratamentos

0

20

40

60

80

100

Mo

tilid

ad

e (

%)

Figura 20. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento utilizando palheta de 0,25 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

Com relação à progressividade entre diluições, todas apresentaram diferença

dentro do mesmo tratamento (criosolução), exceto o T2 (ACP-104 + DMSO 10%)

cujas diluições não variam (P>0.05). Sendo as melhores diluições em relação a cada

criosolução as de 1:5 no T1 e T3, e 1:3 no T4 (Tab. 6), contendo estas também o

maior número de espermatozóides rápidos com relação às outras (P<0.05).

39


A velocidade curvilinear (VCL) entre as diferentes diluições variou de 30 a 85

µm/s, sendo de 60 µm/s no T3 (Ringer + Metilglicol 10%) na diluição de 1:3, e de 85

µm/s no T5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%) na diluição de 1:7, sendo as únicas

criodiluições cujas velocidades se aproximaram às velocidades do sêmen no meio

natural, mas mesmo assim diferentes tanto para o controle como para as outras

diluições (P<0.05) (Tab. 6). Ao contrário, estes tratamentos apresentaram VSL e

VAP semelhantes as do grupo controle (P>0.05) (Fig. 21).

Tabela 6. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em palheta de 0,25 mL

Tratamento Diluição Progressivos Rápidos Médios Lentos VCL VSL VAP

T1 1:3 7±2ec 0,6±0,3d 1±0,5cd 5±1cd 33±3e 16±2c 24±3c

T1 1:5 15±4d 2±1cd 4±1cd 9±2a 34±1e 19±2c 26±2c

T1 1:7 5±2ec 0,7±0,3d 1±0,3cd 4±1c 32±4e 17±3c 23±4c

T2 1:3 10±2cd 1±0,2d 2±0,7cd 7±1ad 30±3e 20±3c 25±4c

T2 1:5 6±1ec 1±0,4d 1±0,3cd 3±0,7c 33±5e 23±6cb 27±6cb

T2 1:7 8±2ec 1±0,2d 2±0,4cd 5±1cd 33±4e 23±4cb 27±4cb

T3 1:3 6±2ec 2±1cd 1±0,3cd 3±0,7c 39±9ce 24±9cb 29±9cb

T3 1:5 14±3d 7±2c 2±0,5cd 5±1cd 60±8d 38±7a 52±9a

T3 1:7 3±0,5e 0,2±0,1d 1±0,2cd 2±0,3c 31±3e 13±3c 19±3c

T4 1:3 10±2cd 2±0,5cd 1±0,3cd 7±1ad 39±5ce 23±4cb 30±5cb

T4 1:5 3±1e 0,3±0,1d 0,4±0,2d 2±0,6c 30±3e 11±3c 17±3c

T4 1:7 6±2ec 2±1cd 1±0,5cd 3±0,7c 52±9cd 36±9b 43±9b

T5 1:7 40±4b* 26±4b* 5±0,4c 9±0,5a 85±5b* 56±4a* 78±5a*

T6 1:7 35±0,4b 7±0c 11±0,4b* 17±1b* 27±0,3e 17±0,2c 22±0,1c

Controle - 94±1a 71±5a 15±3a 9±2a 114±7a 43±4a 71±6a

*Maiores valores obtidos entre tratamentos. Letras diferentes entre linhas mostram médias significativamente diferentes (P<0.05). T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

40


VCLVSLVAP

T1 T2 T3 T4 T5 T6 Controle

Tratamentos

0

20

40

60

80

100

120

140V

elo

cid

ad

e (

µm

/s)

Figura 21. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s, pós-descongelamento, em palheta de 0,25 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.


As amostras de sêmen do T6 (Glicose 5% + DMSO 10%) apresentaram as

taxas mais altas de motilidade de espermatozóides progressivos, médios e lentos

pós-descongelamento dentre os outros tratamentos, mas não chegando a igualar ou

se aproximar da motilidade dos espermatozóides progressivos à fresco (P<0.05)

(Fig. 22). Entretanto, esta criosolução (T6) não apresenta diferença significativa com

as diluições 1:5 de T1 e de T2, e de 1:3 de T4 (Tab. 7).

A porcentagem mais alta de espermatozóides rápidos (13%) foi registrada no

T4 (ACP-104 + Metilglicol 10%), sendo observada uma redução geral da motilidade

em todos os casos, cujos movimentos menos progressivos se notaram na diluição

1:7 do T1 e T3 (2,4%) (P=0.02).

41


Progressivos Rápidos Médios Lentos


Tratamentos

0

20

40

60

80

100

Mot

ilida

de (

%)

Figura 22. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

42


Tabela 7. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento na geladeira de isopor, em palheta de 0,50 mL


T1 1:3 24±2ce 3±1c 7±1bc 13±1a 25±1b 11±1bd 17±1b

T1 1:5 39±3b 5±1bc 12±1a 21±2b* 27±1b 14±1cd 21±1b

T1 1:7 17±4de 2±1c 4±1bc 9±2ac 29±3b 12±1bd 18±1b

T2 1:3 22±4ce 3±1c 6±1bc 12±1a 24±2b 14±1cd 19±2b

T2 1:5 33±7cb 4±1cb 10±2ac 18±3b 23±1b 13±1bd 17±1b

T2 1:7 24±5ce 4±1cb 6±1bc 13±2a 30±2b 20±2cd 25±2b

T3 1:3 23±4ce 7±2cb 4±1bc 12±1a 41±8b 24±6cd 34±8b

T3 1:5 19±4cde 8±3cb 4±1bc 7±1ac 43±8b* 23±4cd 35±7b*

T3 1:7 8±1d 2±1c 2±1b 4±1c 41±6b 19±4cd 30±6b

T4 1:3 33±8cb 12±5b* 6±1bc 14±2a 41±10b 25±7c 34±10b

T4 1:5 30±4cb 9±3cb 7±1bc 13±1a 38±7b 25±5c 32±7b

T4 1:7 16±3de 3±1c 4±1bc 8±2ac 40±7b 27±5c* 34±6b

T5 1:7 21±1c 3±1c 6±1bc 12±1a 26±1b 14±1cd 20±1b

T6 1:7 44±6b* 8±1cb 15±2a* 20±3b 29±1b 17±1cd 24±1b

Controle - 94±1a 71±5a 14±3a 9±1a 113±6a 43±3a 71±5a


Das criosoluções testadas, o único parâmetro que não se viu afetado em

comparação ao controle foi a motilidade média dos espermatozóides, onde o T1

(Ringer + DMSO 10%) e o T2 (ACP-104 + DMSO 10%) na diluição de 1:5 ou o T6

(Glicose 5% + DMSO 10%) na diluição de 1:7 apresentaram resultados similares

(P>0.05). Estas mesmas criosoluções proporcionaram altas porcentagens de

espermatozóides lentos, característica que no meio natural deveria ser baixa, como

nas amostras recém colhidas (Tab. 7).

Nesse experimento, a velocidade curvilinear (VCL) não ultrapassou os 43 µm/s

e a velocidade média (VAP) os 34 µm/s. O teste de Duncan não revelou alterações

entre as diferentes criosoluções e diluições testadas, mas entre as velocidades

espermáticas, que foram significativamente mais baixas que as observadas antes do

congelamento. Entretanto, constatou-se que o T4 (ACP-104 + Metilglicol 10%) e o

T3 (Ringer + Metilglicol 10%) apresentaram resultados melhores que os outros

tratamentos (Tab. 7; Fig. 23).

43


A velocidade linear também foi alterada significativamente ao longo dos

tratamentos, mas neste caso, todas as diluições do T4 (ACP-104 + Metilglicol 10%)

apresentaram velocidades superiores que as do T1 (Ringer + DMSO 10%) (P<0.05).

VCL VSL VAPT1 T2 T3 T4 T5 T6 Controle

Tratamento

0

20

40

60

80

100

120

Vel

ocid

ades

(µ

m/s

)

Figura 23. Média e erro padrão das velocidades espermáticas, em µm/s, pós-descongelamento, em palheta de 0.50 mL e rampa de congelamento. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10%; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10%; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

Experimento 3: Congelamento em “dry shipper” em palhetas de 0,5 mL

As palhetas acondicionadas no “dry shipper” em meio ao vapor de nitrogênio

líquido alcançaram temperaturas de -170 °C depois de 300 segundos, congelando-

se a uma taxa de -14°C/min entre -100 e -170 °C.

Nesse experimento foi possível observar que as porcentagens de motilidades

aumentaram em aproximadamente 20% comparadas com as motilidades dos outros

dois experimentos precedentes, embora as velocidades continuassem sendo muito

44


baixas com relação às dos “pools” de sêmen à fresco. Neste caso, o melhor

tratamento continuou sendo o T6 (Glicose 5% + DMSO 10%) com 62% de

espermatozóides progressivos, dos quais os rápidos e médios apresentaram

resultados superiores com relação às outras criodiluições dos demais tratamentos.

Igualmente, as velocidades (VCL, VSL, VAP) apresentaram valores um pouco

melhores que as dos outros testes neste experimento (Fig. 24 e 25).

Entretanto, através das análises estatísticas, se confirmou que o T6 (Glicose

5% + DMSO 10%) apresentou resultados significativamente diferentes aos do grupo

controle e das demais criosoluções, exceto na diluição 1:7 de T1 (Ringer+ DMSO

10%) e 1:3 de T2 (ACP-104 + DMSO 10%) (P>0.05), sendo o T6 o que apresenta

maior porcentagens de espermatozóides rápidos (20%) e médios (22%) e os outros

dois tratamentos com movimentos médios e lentos maiores.

Em contrapartida, o T4 (ACP-104 + Metilglicol 10%; 1:7) e o T3 (Ringer +

Metilglicol 10%; 1:5 e 1:7) apresentaram resultados semelhantes de

espermatozóides lentos em relação ao sêmen fresco (9%) (P>0.05), mas com

valores de progressividade muito baixa.

Embora o T6 seja o que melhor respondeu às criodiluições e ao congelamento,

é possível observar que apresenta semelhanças nas velocidades com respeito aos

demais tratamentos; no caso da VCL, é comparável com o T1 (Ringer + DMSO 10%)

e T2 (ACP-104 + DMSO 10%), na VSL com T1 (Ringer + DMSO 10%) e as duas

últimas diluições de T2 (ACP-104 + DMSO 10%), e na VAP com as duas últimas

diluições de T1 (Ringer + DMSO 10%) e T2 (ACP-104 + DMSO 10%) (P>0.05) (Tab.

8).

45


Tabela 8. Média e erro padrão da motilidade, em porcentagem, de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos, e velocidades curvilinear (VCL), linear (VSL) e média (VAP), em µm/s, no teste de congelamento no “dry shipper”, em palheta de 0,50 mL


T1 1:3 46±4a 10±2acd 16±2a 21±1a 29±2acd 14±1ad 21±1be

T1 1:5 45±3a 12±2acd 14±1a 18±1a 32±2ad 17±1d 25±2abe

T1 1:7 50±4ab 15±4ab 17±2ab 18±2a 34±3d 16±2ad 25±3abe

T2 1:3 57±5ab 12±2ad 20±2b 25±1a* 29±1acd 15±1a 22±1abce

T2 1:5 47±4a 10±1ad 14±2a 23±2a 32±2ad 19±1d 26±2ae

T2 1:7 41±3a 9±1cd 12±1ac 21±2a 30±1adc 18±1d 24±1abe

T3 1:3 26±3c 4±0.5c 7±1c 15±1b 26±1ac 13±1a 19±1bc

T3 1:5 22±2c 3±0.3c 7±0.6c 13±2bc 24±1c 12±1a 17±1c

T3 1:7 18±3c 4±2c 5±0.7c 9±1bc 29±3acd 13±2a 20±3ce

T4 1:3 36±4a 6±1c 12±2a 19±2a 25±1ac 14±1a 19±1ce

T4 1:5 36±3a 6±1c 11±1a 20±2a 28±1ac 17±1a 22±1ae

T4 1:7 16±1c 3±0.4c 4±0.3c 9±0.6bc 26±1a 17±1a 20±2ce

T5 1:7 41±7a 8±2cd 13±3a 20±2a 27±2a 14±1a 21±2e

T6 1:7 62±7b* 20±3b* 22±3b* 19±1a 35±2d* 19±1d* 28±2a*

Controle - 94.2±1e 71±5e 15±3b 9±2c 114±8b 43±4e 71±6d


46


Progressivos Rápidos Médios LentosT1 T2 T3 T4 T5 T6 Controle

Tratamento

0

20

40

60

80

100

Mo

tilid

ad

e (

%)

Figura 24. Média e erro padrão da motilidade de espermatozóides progressivos, rápidos, médios e lentos pós-descongelamento utilizando palheta de 0,50 mL e “dry shipper”. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

VCL VSL VAP


Tratamento

0

20

40

60

80

100

120

140

Ve

loci

da

de

(µ

m/s

)

Figura 25. Média e erro padrão das velocidades espermáticas (curvilinear, linear e média) pós-descongelamento utilizando palheta de 0.50 mL e “dry shipper”. T1 = Ringer+DMSO 10%; T2 = ACP-104+DMSO 10%, T3 = Ringer+Metilglicol 10% ; T4 = ACP-104+Metilglicol 10%; T5 = Glicose 5%+Metilglicol 10% ; T6 = Glicose 5%+DMSO 10%.

47


Os resultados dos três experimentos juntos são apresentados na Figura 26,

onde é possível observar que o melhor tratamento foi o T6 (Glicose 5% + DMSO

10%), com motilidade progressiva média de 50%, e com espermatozóides rápidos,

médios e lentos apresentando porcentagens mais altas em relação aos demais

tratamentos (Fig. 26 A).

As velocidades (VCL, VSL e VAP), em geral, mostraram um aumento no T5

(Glicose 5% + Metilglicol 10%), entretanto, estas velocidades foram afetadas após o

processo de congelamento, chegando só a 45 µm/s, 20 µm/s e 30 µm/s para VCL,

VSL e VAP, respectivamente (Fig. 26 B).

As melhores motilidades e velocidades entre diluições variaram muito de

tratamento para tratamento, o T5 (Glicose 5% + Metilglicol 10%) e o T6 (Glicose 5%

+ Metilglicol 10%) por terem somente uma taxa de diluição (1:7) foram comparado

somente com os outros tratamentos em geral. Com relação à motilidade espermática

(progressivos, rápidos, médios e lentos), a diluição 1:5 foi a que apresentou

melhores resultados para T1 (Ringer + DMSO 10%); 1:3 para T2 (ACP-104 + DMSO

10%) e T4 (ACP-104 + DMSO 10%); e T3 com as duas primeiras diluições (1:3 e

1:5), as quais não apresentaram grande diferença entre elas (Fig. 26 C). As

velocidades entre diluições por tratamento não variaram consideravelmente para T1

(Ringer + DMSO 10%) e T2 (ACP-104 + DMSO 10%), ao passo que T3 (Ringer +

Metilglicol 10%) se destaca com 1:5, e T4 (ACP-104 + DMSO 10%) com 1:7 (Fig. 26

D).

Foi possível confirmar que a porcentagem de espermatozóides móveis, em

geral, foi maior com o uso de palhetas de 0,5 mL e ao congelar no “dry shipper” a -

150°C. Entretanto, a velocidade espermática, em geral, apresentou resultados um

pouco melhores em palhetas de 0,25 mL e congeladas sobre a rampa dentro da

geladeira de isopor (Fig. 26 E e 26 F).

48


Progressivos Rapidos Medios LentosT1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamento

0

10

20

30

40

50

60

70M

otilid

ade

(%)

VCL VSL VAP

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamento

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ve

loci

da

de

(µ

m/s

)

Progressiv os Rapidos Medios Lentos

T1

1--3

1--5

1--7

0

10

20

30

40

50

60

Mot

ilida

de (

%)

T2

1--3

1--5

1--7

T3

1--3

1--5

1--7

T4

1--3

1--5

1--7

T5

1--3

1--5

1--7

T6

1--3

1--5

1--7

VCL VSL VAP

T1

1--3

1--5

1--7

0

10

20

30

40

50

60

Vel

ocid

ade

(µm

/s)

T21-

-3

1--5

1--7

T3

1--3

1--5

1--7

T4

1--3

1--5

1--7

T5

1--3

1--5

1--7

T6

1--3

1--5

1--7

Figura 26. Análise geral das criosoluções e criodiluições em palhetas de 0,25 e 0,5 mL e pelos métodos de congelamento em rampa dentro de geladeira de isopor e “dry shipper” (média ± ep).

A B

C

D


49

Progressivos Rapidos Medios Lentos

1 2

Palheta

0

10

20

30

40

50

60M

otilid

ade

(%)

VCL VSL VAP

1 2

Palheta

0

10

20

30

40

50

60

70

Vel

ocid

ade

(µm

/s)

Progressivos Rapidos Medios Lentos

a b

Metodo de Congelamento

0

10

20

30

40

50

60

Mo

tilid

ad

e (

%)

VCL VSL VAPa b

Metodo de Congelamento

0

10

20

30

40

50

60

Vel

ocid

ade

(µm

/s)

Figura 26. Análise geral das criosoluções e criodiluições em palhetas de 0,25 e 0,5 mL e pelos métodos de congelamento em rampa dentro de geladeira de isopor e “dry shipper” (média ± ep).

EF

G H


50


Os esfregaços de sêmen fresco das pirapitingas mostraram uma porcentagem

média de alterações morfologicas totais de 31%, onde a principal morfoanomalia

observada foi de cauda (Fig. 27). Dos 100 espermatozóides analisados por peixe,

20% apresentaram o flagelo dobrado e 5,3% cauda enrolada, sendo este primeiro

valor uma alteração menor. As outras anomalias representam somente 5,5 % das

amostras.

O Quadro 3 ressalta as diferentes alterações morfológicas apresentadas pelos

espermatozóides em suas diferentes regiões (cabeça, peça intermediaria e flagelo).

No caso da cauda ou flagelo, podem ser observadas diversas formas para uma

mesma alteração.

Das diferentes alterações não foi possível determinar as morfoanomalias de

cabeça isolada e cauda degenerada, devido ao grande número de partículas

adjacentes presentes nas lâminas. Também não se encontrou, amostra alguma

problemas relacionados a microcefalia e, no caso de macrocefalia, foram poucas as

ocasiões onde foram observadas esta alteração.

O sêmen de pirapitinga diluído com as criosoluções pós-descongelamento

apresentou um aumento nas porcentagens das morfoanomalias (44%) (Fig. 28). As

alterações maiores, cauda enrolada e cauda quebrada (as quais não tinha aparecido

no sêmen à fresco) evidenciaram diferenças estatísticas com as amostras à fresco

(P<0.05), representando 23% e 1% do total, respectivamente (Fig. 28). Outra

anomalia secundária que aumentou em 3% foram os problemas na peça

intermediária, que se apresentou com encurvamento da cauda na altura da peça.

Não foi possível observar outra morfoanomalia na peça, devido a seu tamanho

reduzido e de difícil diferenciação.

A análise estatística não evidenciou diferenças significativas entre as

criosoluções e as diluições (P>0.05).


51

Morfoanomalias

1%20%

69%1%1%

1% 3%

5%

Normal

Cabeça deformada

Peça inter. degenerada

Gota distal

Gota proximal

Cauda enrolada

Cauda dobrada

Macrocefalia

Figura 27. Porcentagem média das características morfológicas do sêmen de Piaractus brachypomus à fresco

Morfoanomalias apos descongelamento

56%

1%

4%4%

2%

23%

1%

8% 1% Normal

Cabeça deformada

Peça inter. degenerada

Gota distal

Gota proximal

Cauda enrolada

Cauda dobrada

Macrocefalia

Cauda quebrada

Figura 28. Porcentagem média das características morfológicas do sêmen de Piaractus brachypomus pós-descongelamento nos meios diluentes Ringer, ACP-104 e Glicose e nos crioprotetores DMSO e Metilglicol.


52

Quadro 3. Alterações morfológicas do sêmen de Piaractus brachypomus, lâminas coradas com azul de bromofenol: (A) normal; (B) cabeça deformada; (C) peça intermediária degenerada; (D, F, G, H) cauda enrolada; (E) cauda dobrada na ponta; (I) cauda dobrada; (J) gota citoplasmática proximal;(K) gota citoplasmática distal; (L) cauda quebrada.


53

7. DISCUSSÃO

7.1. Características do sêmen

As características seminais das pirapitingas induzidas com hipófises de carpa

neste estudo apresentaram valores similares aos relatados por Fresneda et al.

(2004) cujo sêmen tinha cor branca leitosa, pH de 8.8, motilidade de 91% e tempo

de ativação de 72 segundos. Embora a concentração espermática de 30 x 109

sptz/mL e o volumem do sêmen de 0.83 mL tenham apresentado valores inferiores

aos aqui obtidos (43,7 x 109 sptz/mL e 7 mL, em média, respectivamente). Já

Navarro et al. (2004) coletaram uma boa quantidade de sêmen (13,4 mL) de

indivíduos da mesma espécie na Colômbia, mas ainda assim com baixas

concentrações (17,7 x 10 9 sptz/mL).

Shimoda (1999) afirmou que o volume seminal pode ser muito variável entre e

intra-espécies, dado que diversos fatores devem influenciá-los, como por exemplo, o

estado nutricional, o peso, o grau de maturidade, a metodologia de coleta, dentre

outros. A grande quantidade de sêmen produzido por esta espécie depois da

indução hormonal torna desnecessário o sacrifício do animal para coleta seminal.

Tal característica facilita a aplicação de técnicas de criopreservação, permitindo a

utilização de diferentes meios diluentes para um mesmo ejaculado.

Em outras espécies brasileiras de água doce foram obtidas concentrações

espermáticas de 24,8 (x109sptz/mL) para Brycon insignis (Andrade-Talmelli et al.,

2001); 9,6 para Brycon cephalus (Ninhaus-Silveira et al., 2006); 64,6 para

Steindachneridion scripta (Luz et al., 2001); 5,31 para Brycon orbignyanus (Maria,

2005); 5,73 para Salminus maxillosus e 30.0 para Brycon nattereri (Oliveira, 2006) e

37,4 e 42,4 para Piaractus mesopotamicus (Shimoda, 1999; Bedore,1999,

respectivamente), sendo estes dos últimos valores os mais próximos aos obtidos no

presente estudo, cuja espécie pertence ao mesmo gênero.

Şahinöz et al. (2008) afirmaram que as altas concentrações espermáticas

podem estar relacionadas à época reprodutiva e à idade. No momento das

amostragens, as pirapitingas se encontravam na época reprodutiva que vai desde

novembro a fevereiro (Almeida, 1997), influenciando possivelmente à obtenção de

grandes concentrações espermáticas.


54

A mensuração da osmolalidade ou pressão osmótica do meio diluente é de

suma importância pela sua marcada influência sobre a motilidade espermática,

sendo a ativação dos espermatozóides parcial ou totalmente dependente da iso ou

hipotonicidade da mesma em relação ao plasma seminal. A pressão osmótica média

no plasma seminal das pirapintingas foi de 317±27 mOsm/kg. No mundo, a

osmolaridade (mOsm/kg) do plasma seminal de alguns peixes de água doce foi

avaliada: Salmo salar (245±11; Aas et al., 1991); Oncorhynchus mykiss (297±15;

Morisawa, 1985), (322±21; Glogowski et al., 2002); Salvelinus fontinalis (300±11;

Marshall, 1986); Cyprinus carpio (302±5; Morisawa et al., 1983) e Perca flavescens

(317±13; Koenig et al., 1978), sendo muitos próximos aos relatados para o sêmen de

Piaractus brachypomus.

7.2. Estudo da toxicidade de crioprotetores

Efeitos tóxicos de crioprotetores no sêmen de peixes têm sido observados

especialmente quando utilizados em altas concentrações. Por esta razão, o teste de

toxicidade deste trabalho envolveu a concentração de 10%, sendo a mais

comumente utilizada na criopreservação (Maisse et al., 1998). A criosolução de

Ringer + Metilglicol 10% na diluição de 1:3 foi a que mais se aproximou ao grupo

controle (80% de motilidade total), embora os tratamentos que utilizaram o DMSO

tenham apresentado valores muito próximos, estes apresentaram maior número de

espermatozóides com movimentos médios e lentos. Godinho et al. (2003),

trabalhando com o sêmen de tilápia-nilótica, na diluição de 1:10, em meios com

DMSO ou etilenoglicol (10%), registraram 92 e 88% de motilidade no primeiro minuto

de ativação, respectivamente. Da mesma forma, Melo e Godinho (2000) utilizando

os mesmos meios diluentes, na mesma proporção, a temperatura ambiente,

obtiveram motilidades de 87 e 82%, respectivamente, em Brycon orthotaenia,

indicando que os crioprotetores utilizados no presente trabalho podiam ser bons

candidatos para experimentos de criopreservação. Apesar de não haver informações

disponíveis sobre o uso do metilglicol no resfriamento ou toxicidade de sêmen de

Piaractus sp, esta substância tem sido utilizada em experimentos de criopreservação

com outras espécies brasileiras (Maria et al., 2006). O efeito dos crioprotetores na

viabilidade dos espermatozóides deve ser avaliado quando se tem a intenção de


55

utilizá-los em espécies onde não foram anteriormente testados (Melo e Godinho,

2006).

No caso dos meios diluentes, Murgas et al. (2007) e Milioniri (2006) utilizaram o

BTS a 5%, acrescido de metanol ou DMSO a 10%, na diluição de 1:4. O diluente

BTS possui alguns componentes semelhantes ao diluente Ringer, como o

bicarbonato de sódio e o cloreto de potássio, não havendo diferença significativa

entre seus tratamentos, apresentando motilidades médias de 86% ao ser ativado

com bicarbonato de sódio 60 mM, o que supera bem pouco a motilidade obtida

neste estudo, ativada com cloreto de sódio 50 mM. Ao contrário, Cruz (2001)

observou valores de motilidade de 62% para o sêmen de curimbatá (Prochilodus

lineatus) em diluente contendo DMSO a 10%, embora a duração média da

motilidade fosse superior àqueles acrescidos de etilenoglicol. O sêmen de

piracanjuba, ao ser resfriado a 4°C com BTS por 0, 72 e 144 horas, alcançou

motilidades médias de 76% (Murgas et al., 2004).

Os meios diluentes como Ringer, Glicose ou Solução Fisiológica e água de

coco industrializada (KeroCoco) já foram testados por Muchlisin et al. (2004) e Maria

et al. (2006). No primeiro estudo, após 24 horas, o sêmen resfriado a 4°C na diluição

de 1:20 registrou 65% de movimento para a Glicose e 71% para o Ringer. Por outro

lado, estes autores, ao manter outras amostras a 23°C nos primeiros 15 minutos,

obtiveram motilidades de 80% em ambas as soluções. No segundo estudo, nota-se

que depois de uma hora, observa-se 83% de espermatozóides móveis na água de

coco industrializada (KeroCoco) e 63% no Ringer Ginsburg na diluição de 1:5. De

forma similar, Carvalho et al. (2002) diluiu o sêmen de carpa em meio diluente à

base de água de coco in natura e registrou 71% de espermatozóides móveis após

30 minutos.

A composição do Ringer basicamente consiste em NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3,

contendo assim alguns íons, como K+ e Ca2+, que estão ausentes nos outros

diluentes testados, o que poderia explicar as diferenças observadas quanto à

porcentagem de espermatozóides móveis. O fluido seminal em peixes geralmente

tem altas concentrações de íons K+, Na+ e Cl-, mas baixas concentrações de Ca2+ e

Mg2+, embora estes íons tenham papéis variados em inibir ou ativar os

espermatozóides de peixes em cada espécie. Portanto, muitas características dos

espermatozóides de peixes são espécie-especificas (Muchlisin et al., 2004).


56

Várias pesquisas relacionadas às diluições para preservar a motilidade do

sêmen de peixes têm sido realizadas e, como se percebeu nos trabalhos

anteriormente mencionados, estas aparentam ser muito variadas entre as espécies

de peixes, apresentando melhores resultados no resfriamento de pirapitinga, na

diluição de 1:3 nas criosoluções com metilglicol e na diluição de 1:5 com DMSO. No

caso dos tratamentos com Glicose só foi testada a diluição de 1:7, verificando que

esta, em proporções maiores no resfriamento, não está sendo tão eficaz como em

outros ensaios com vários peixes brasileiros, obtendo resultados promissores nas

diluições de 1:3 e 1:4 (Carolsfeld et al., 2003).

Em Piaractus brachypomus a ativação da motilidade é breve (ao redor de 1

minuto), sendo necessário o uso de métodos rápidos e precisos para avaliar a

qualidade do sêmen através da cinética espermática (porcentagem de

espermatozóides móveis, qualidade do movimento, velocidades, etc.). A velocidade

inicial de deslocamento dos espermatozóides de pirapitinga a fresco (113 µm/s)

esteve em uma faixa similar às observadas em teleósteos de água doce como

Chalcalburnus chalcoides (84.6±17.4 µm/s; Lahnsteiner et al., 1999); Perca fluviatilis

(122±22 µm/s; Lahnsteiner et al., 1995); Onchorhynchus mykiss (105±18.8 µm/s;

Lahnsteiner et al., 1999); Silurus glanis (125±10 µm/s; Billard et al., 1997). Os outros

parâmetros de velocidade avaliados por Ravinder et al. (1997) para o sêmen de

carpa in natura, variaram de 31 a 148 µm/s para a VSL, e de 138 a 145 µm/s para a

VCL.

No teste da toxicidade, o T3 (Ringer + Metilglicol 10%) foi o que mais se

acercou ao grupo controle quanto à velocidade curvilinear (VCL) enquanto as outras

duas velocidades (VSL e VAP) não variaram consideravelmente, exceto no caso do

T2 (ACP-104 + DMSO 10%) na VAP. Poucos estudos foram realizados com o

objetivo de avaliar a toxicidade através do CASA nas diferentes velocidades, sendo

difícil comparar dados, já que sempre se avaliam diferentes crioprotetores, meios

diluentes, diluições e tempo de resfriamento. Por outro lado, Rurangwa et al. (2001)

reportam, como no presente estudo, pouca diminuição das velocidades ao cabo de

30 minutos de resfriamento a 4°C, caindo a VCL de 55 a 45 µm/s, a VSL de 49 a 35

µm/s e a VAP de 50 a 40 µm/s, entre as amostras a fresco e diluídas em Mounibs +

DMSO 8%. É provável que neste último caso as diferenças entre os tratamentos se

devam à velocidade em que o crioprotetor penetra na célula, e que o metilglicol entre

e saia da célula mais rápido do que o DMSO, ambos a 4°C.


57

Neste estudo foi demonstrada que a maiores diluições existe uma tendência a

decrescer a velocidade, embora não sejam observadas diferenças estatísticas. Nos

experimentos com bagre africano, Mansour et al. (2004) não encontraram

diminuição significativa da velocidade em diferentes diluições a 4°C, permanecendo

entre 108 e 100 µm/s e só diminuindo um pouco com a maior diluição. É possível

que, ao aumentar as diluições, os componentes do plasma seminal percam sua

influência protetora, como acontece com as atividades líticas enzimáticas no plasma

seminal dos peixes, as quais decrescem sob essas condições (Lahnsteiner et al.,

1997).

Como os procedimentos que antecedem o congelamento do sêmen de peixes

geralmente devem ser conduzidos em pouco tempo, o período de estabilização

entre o crioprotetor e o sêmen (15 minutos) empregado no presente estudo

certamente favoreceu a manutenção da qualidade seminal de pirapitinga, permitindo

o congelamento de amostras com viabilidade assegurada. Em futuros experimentos

de resfriamento de sêmen ou toxicidade dos crioprotetores em tempos mais

prolongados, seria necessário subministrar oxigênio para evitar seu rápido

deterioramento, assim como antibióticos e antifúngicos, avaliando a viabilidade das

criosoluções através da cinética espermática.

7.3. Testes de Criopreservação

A técnica de congelamento seminal mais difundida em peixes utiliza vapores de

nitrogênio líquido, sendo a velocidade de congelamento um dos fatores mais críticos

e menos padronizado do processo. No presente estudo não foi possível padronizar

uma curva de congelamento em graus por minuto usando a geladeira de isopor

porque todas as curvas foram diferentes entre si. Lahnsteiner e Patzner (1996)

afirmaram que isto acontece pela rápida evaporação do nitrogênio líquido quando do

uso de sistemas abertos, como as caixas de congelamento. Apesar disso, Cruz et al.

(2004) congelando neste método a 3 cm (-76°C) do nitrogênio líquido e Deandro et

al. (1997) a 2 cm (-148°C), 6.5 cm (-99°C) e 13 cm (-46°C), encontraram motilidades

acima de 55%.

Taxas adequadas de congelamento não podem ser generalizadas, pois

diferentes diluentes, tamanhos de palhetas e temperaturas têm sido utilizadas com

sucesso (Lahnsteiner, 2000). Taxas de congelamento ótimas foram obtidas entre 5 e


58

50°C/min (Rana e McAndrew, 1989) e entre 10 a 80°C/min (Godinho et al., 2003)

para o sêmen de tilápia. O “dry shipper” utilizado neste estudo foi igualmente

satisfatório para a criopreservação de sêmen de vários peixes neotropicais a uma

taxa de congelamento de 30°C/min (Carolsfeld et al., 2003). No congelamento do

sêmen de pirapitinga se obteve uma taxa boa de congelamento de -14°C/min

comparável com a de Riley et al. (2004) a -16°C/min, chegando até -140°C, onde os

espermatozóides alcançaram motilidades de 80%. Tais fatos demonstram que os

espermatozóides da espécie em questão são pouco tolerantes às mudanças de

temperatura durante o congelamento (caixa de isopor), talvez devido à

desestabilização das membranas, danos físicos no citoplasma e nas membranas

nucleares resultantes da formação de cristais de gelo intracelular (Kang et al., 2004).

O uso das palhetas francesas simplificou e acelerou a manipulação durante o

envase, congelamento e descongelamento do sêmen criodiluído, apesar do tamanho

da palheta aparentemente influenciar a motilidade do sêmen descongelado da

pirapitinga. Verificou-se que a porcentagem de espermatozóides móveis

praticamente dobrou entre as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, sendo esta última a melhor.

Carolsfeld et al. (2003) e Maria et al. (2006) verificaram que a palheta de 0,5 mL é a

mais prática para a maioria de espécies, apresenta os melhores resultados e é a

mais apropriada para bancos genéticos (Lahnsteiner, 2000). Ninhaus-Silveira et al.

(2006) por sua parte, ao congelar sêmen de Matrinhã em palhetas de 4 ml e 0,5 mL,

não encontrou diferenças significativas no momento de descongelar, mesmo que os

valores de fertilidade tenham sido um pouco melhores na palheta de 0,5 mL.

Enquanto Medina et al. (2007) observou, em palhetas de 0,5 mL, motilidades

espermáticas e porcentagens de fertilidade significativamente inferiores às

observadas em volumes de 1,8 , 2,5 e 4 mL.

Supõem-se que o sêmen que foi acondicionado em palheta de 0.25 mL tenha

passado por um longo platô do ponto de congelamento (ponto de calor residual

liberado, onde os cristais de gelo são formados por uma subida na temperatura

dentro da palheta) ou por uma faixa de congelamento lenta pelo volume da palheta,

similarmente ao ocorrido nos trabalhos de Richardson et al. (1999) e Velasco-

Santamaria et al. (2006). Devido à temperatura na caixa de congelamento variar

constantemente e existir uma associação direta entre a duração do platô do ponto

de congelamento e o diâmetro da palheta na viabilidade do congelamento-

descongelamento dos espermatozóides, uma redução na duração deste platô


59

melhoraria provavelmente a motilidade espermática (Velasco-Santamaria et al.,

2006). As mudanças na estrutura e viabilidade dos espermatozóides durante o

processo de congelamento são principalmente influenciados pela longitude do pico

de calor latente, ocasionado pela liberação do calor de fusão que, ao ser liberado

retorna a sua temperatura original, que tarda um pouco mais em palhetas de maior

volume (Richardson et al., 1999) sendo mais homogêneo nas de 0,5 mL.

A utilização de palhetas de maior tamanho auxilia nos processos de fertilização

artificial em escala comercial devido principalmente aos grandes volumes de

ovócitos desovados pelas espécies tropicais cultivadas. Mas, devido à importância

da diversidade genética dos peixes produzidos em cativeiro, não se recomenda o

uso de palhetas grandes, já que o mais importante é conservar a variabilidade

genética em detrimento à quantidade de sêmen criopreservada (Carolsfeld et al.,

2003).

Foi observado que as amostras diluídas em meio contendo DMSO pós-

descongelamento, de maneira geral, apresentaram as maiores porcentagens de

espermatozóides móveis, aproximando-se àquelas observadas no sêmen não

diluído. Esta substância tem sido um crioprotetor efetivo para outros

espermatozóides de teleósteos (Piironen, 1993; Bart et al., 1998; Suquet et al., 2000;

Melo e Godinho, 2006). Mas em algumas outras espécies, como no caso da tilápia-

nilótica (Oreochromis niloticus) não foi tão efetivo como o metanol (Godinho et al.,

2003). Em outras pesquisas realizadas com a mesma espécie do presente estudo,

os resultados apresentaram motilidades superiores às observadas por Navarro et al.

(2004) e inferiores às de Fresneda et al. (2004) (40% e 80%, respectivamente),

ambos os trabalhos utilizando DMSO, glicose e gema de ovo. Isto indica que, neste

caso, o crioprotetor foi suficiente para induzir a saída de água da célula, impedindo a

formação de gelo intracelular, sem produzir retração pela desidratação da célula.

O metilglicol, ao contrário, apresentou as taxas de motilidade mais baixas pós-

descongelamento, contradizendo aos resultados de Maria (2005), que testou o

metilglicol pela primeira vez como agente crioprotetor em sêmen de piracanjuba e

dentre os crioprotetores testados, mostrou ser o mais indicado para a

criopreservação do sêmen dessa espécie.

Nenhum dos meios diluentes testados neste experimento (Ringer, ACP-104 e

Glicose) proporcionou valores superiores a 62% de motilidade progressiva, sendo os

resultados com glicose um pouco melhores. Murgas et al. (2001) destacaram o uso


60

da glicose e da água de coco industrializada como meios diluentes no congelamento

do sêmen de piracanjuba, apresentando 60% de motilidade pós-descongelamento

no diluente água de coco industrializada. Resultados similares foram relatados por

Carvalho (1999) e Farias et al. (2000) com sêmen de tambaqui e carpa diluídos em

meio diluente à base de água de coco in natura (acima de 50%). É provável que na

criopreservação do sêmen de pirapitinga o meio diluente à base de água de coco em

pó (ACP-104) não tenha oferecido um ambiente iônico favorável, embora tenha

apresentado motilidades representativas, com maior quantidade de espermatozóides

móveis.

A glicose é um meio diluente que tem sido satisfatoriamente utilizado para a

criopreservação do sêmen de várias espécies de peixes como o bagre africano

Clarias gariepinus (Urbányi et al., 1999), várias espécies de esturjão (Tsvetkova et

al., 1996; Glogowski et al., 2002) e a bijupira Rachycentron canadum (Caylor et al.,

1994), dentre outras. O sucesso deste meio diluente pode ser explicado pelo seu

papel como crioprotetor externo estabilizador de membrana (Maisse, 1994) e como

substrato para a síntese de ATP (Murgas et al., 2007). Segundo Cosson et al.

(1999), a fosforilação oxidativa mitocondrial é altamente requerida para a produção

de energia durante o batimento flagelar dos espermatozóides, de modo que a

insuficiência de ATP constitui uma das principais causas da redução da motilidade.

Igualmente este meio diluente é utilizado como um componente semelhante ao

plasma seminal, que possui em sua composição açúcares como a frutose, a

sacarose, etc. (Maisse et al., 1998). Em um estudo comparativo com a truta arco-íris

foi relatado que os efeitos da sacarose, da frutose, da galactose e da glicose

incorporadas a 125 mM como meio diluente são semelhantes quanto à motilidade

seminal (Maisse, 1994). É possível que, neste estudo, os espermatozóides de

pirapitinga metabolizem prioritariamente a glicose como fonte de energia e sua

concentração tenha sido adequada para suprir as necessidades metabólicas das

células espermáticas.

Pôde ser observado que as velocidades espermáticas (VCL, VSL e VAP)

diminuíram consideravelmente nos experimentos 2 e 3 o que pode estar relacionado

com o momento da ativação pós-descongelamento e com os parâmetros

preestabelecidos no sistema CASA no momento da leitura.

No primeiro caso, os recursos energéticos dos espermatozóides de peixes são

limitados; um incremento na velocidade causado por aumento de temperatura leva a


61

uma diminuição da duração da motilidade e, ao contrário, a diminuição da

temperatura no momento da ativação resulta no prolongamento da duração da

motilidade e na redução da velocidade espermática. Em truta arco-íris a freqüência

de batimento flagelar é menor a 5°C, permanecendo constante a 10°C, aumentando

rapidamente em torno de 14°C e se estabilizando a temperaturas maiores que 21°C

(Hadi e Cosson, 2005). É possível que a temperatura da solução ativadora não

tenha permanecido estável devido às variações na temperatura ambiente do

laboratório, onde algumas vezes aumentava ou diminuía dependendo da hora e do

dia das avaliações. Uma vez que estas sustâncias permanecem conservadas sob

refrigeração, é possível que não se tenha aguardado o tempo necessário requerido

para sua estabilização antes de sua utilização, podendo então ter influenciado a

cinética espermática.

No segundo caso, os parâmetros do CASA devem ser estabelecidos

dependendo ao tipo do movimento (linear, circular ou aleatório) que apresentem os

espermatozóides ao serem descongelados porque, aparentemente, existe uma

influência do padrão de movimento sobre o número de quadros avaliados quanto

aos parâmetros cinéticos. Ravinder et al. (1997) monitoraram os parâmetros em 25 e

60 Hz, variando a VCL de 126 a 152 µm/s, a VSL de 31 a 148 µm/s e a VAP de 106

a 142 µm/s entre os padrões e as taxas. Também Toth et al. (1995) afirmaram que

os parâmetros de velocidade quando são monitorados em uma maior taxa de

quadros leva a um incremento na VCL e na VSL. Seria necessário realizar futuros

experimentos testando essas duas taxas para se avaliar a possível influência sobre

a velocidade dos espermatozóides descongelados de pirapitinga.


O colorante azul de bromofenol é um tipo de corante vital que já foi efetivo na

avaliação de espermatozóides ovinos e bovinos (Amaral, 2004) e cuja função é

propiciar a visualização de espermatozóides vivos e mortos, além de diferenciar

suas estruturas. À medida que os espermatozóides sofrem danos, a membrana

espermática torna-se permeável e ficam coradas de azul, com maior intensidade nos

espermatozóides que apresentam maiores danos estruturais (Sierra, 2005). No caso

dos espermatozóides de pirapitinga não foram avaliadas as porcentagens de

espermatozóides vivos e mortos, pela dificuldade de visualização dos tonos de


62

coloração dos mesmos, mas esse corante foi efetivo na observação das estruturas

espermáticas.

Referente às características estruturais dos espermatozóides de pirapitinga,

Piaractus brachypomus, foi observado que este apresenta o padrão ancestral,

característico das espécies com fecundação externa, sendo muito semelhante aos

espermatozóides descritos nas demais espécies da ordem Characiformes. Eles são

constituídos por cabeça arredondada, sem acrossoma, peça intermediária curta

(poucas mitocôndrias) e flagelo longo, semelhante ao descrito para outros peixes

teleósteos (Romagosa et al., 1999; Vicentini, 2002; Pompiani, 2003).

No presente estudo, a leitura realizada dos esfregaços de sêmen a fresco com

azul de bromofenol mostrou 31% de espermatozóides com morfoanomalias na

cabeça, peça intermediária e cauda, quando considerados os defeitos maiores e

menores em conjunto. Segundo Kavamoto et al. (1999), em curimbatá (Prochilodus

scrofa) a porcentagem de morfoanomalias espermáticas foi de 9,5%. Já Prieto

(2004) reportou 2,5% para piracanjuba, 3,4% para jundiá e 4% para piraputanga.

Contrariamente, Moraes et al. (2004) obtiveram resultados similares aos do presente

estudo, com 38% de morfoanomalias na carpa, 49% no piavuçu e 40% na

curimbatá, sendo as mais freqüentes cabeça solta, cauda solta, cauda enrolada e

cauda degenerada ou dobrada. O sêmen fresco de pirapitinga pode refletir estas

morfoloanomalias nos espermatozóides tanto por variações ambientais e genéticas

(Miliorini, 2006) como por falhas durante a espermatogênese, no caso das

anormalidades primárias (cauda enrolada) ou durante a passagem do sêmen pelo

epidídimo, no caso das secundárias (cauda dobrada) (Moraes et al., 2004).

No caso do sêmen pós-descongelamento não foram observadas diferenças

estatísticas entre tratamentos e/ou diluições, apesar de que existiu um aumento de

13% nas morfoanomalias em relação ao sêmen a fresco. Tal aumento não foi

considerado alto em relação ao apresentado no sêmen de pacu (P. mesopotamicus)

descongelado com DMSO+glicose+gema de ovo (87%), com 50% de alterações

primárias e 37% de alterações secundárias (Streit Jr. et al., 2006). Enquanto em

curimba (Prochilodus lineatus) tanto com metanol como com DMSO 10% foram

observadas alterações morfológicas primárias de 24,4% e secundárias de 1,4%.

Em mamíferos, de acordo com Hafez e Hafez (2000), de um modo geral, as

morfoanomalias secundárias, como cauda quebrada e solta, além de cabeça solta,

podem estar relacionadas à preparação dos esfregaços, e as anormalidades


63

primárias estão relacionadas às falhas durante a espermatogênese. Outros autores

acham que as alterações primárias podem ter uma resposta negativa a uma

exposição hiposmótica, como no caso do sêmen de carpa que, depois de diluído em

água doce, apresenta o flagelo enrolado na ponta (Tsvetkova et al., 1996) ou no

esturjão siberiano que apresentou pressão osmótica do plasma seminal de 38

mOsm/kg induzindo a uma alteração discreta que só se veria no momento do

descongelamento. As alterações de flagelo são menos prejudiciais que as de cabeça

porque a maioria poderia ainda mover-se e chegar a fecundar um ovócito (Billard et

al., 2000). Enquanto que as alterações de peça intermediária são conseqüência da

desestabilização das membranas lipoprotéicas dos espermatozóides, sobretudo das

mitocôndrias, por influência do congelamento (Miliorini, 2006), causando alterações

progressivas na motilidade, aumentando o número de espermatozóides com

movimentos circulares ou oscilatórios e, conseqüentemente, diminuindo a taxa de

fertilização (Kavamoto et al., 1999). Esta morfoanomalia foi encontrada em baixa

proporção, da mesma forma que a presença de gotas citoplasmáticas. Uma

distribuição anormal das mitocôndrias na peça intermediária poderia impedir a

liberação da gota citoplasmática durante o processo de maturação celular (Amaral,

2004). Para melhor aquilatar a capacidade de fecundação dos espermatozóides

descongelados, seria necessário a avaliação do estado da membrana espermática

através de metodologias mais específicas como sondas fluorescentes, citometria e

fluxo e microscopia eletrônica.


64

8. CONCLUSÕES

Os machos de pirapitinga se apresentaram como peixes que apresenta fácil

liberação de sêmen após o processo de indução hormonal, com

concentrações espermáticas satisfatórias para utilização em protocolos de

criopreservação e fertilização;

As observações direta subjetiva ou a objetiva, através de métodos de

análise seminal auxiliado por computador (CASA), foram satisfatórias para a

estimativa da motilidade espermática das pirapitingas;

O sêmen de pirapitinga pode ter um tempo de latência resfriado a 4ºC por

15 minutos, quando diluído em Ringer acrescido de metilglicol a 10% na

diluição de 1:3, apresentando baixos níveis de toxicidade refletidos nos

parâmetros cinéticos espermáticos;

O sêmen de pirapitinga pode ser satisfatoriamente congelado na criosolução

Glicose 5% + DMSO 10% utilizando a técnica de congelamento em “dry

shipper” em palhetas de 0,5 mL;

As melhores diluições dos tratamentos com maiores motilidades foram 1:7

para a Glicose 5% + DMSO 10%, seguido da diluição 1:3 do tratamento ACP-

104 + DMSO 10%;

As principais morfoanomalias apresentadas no sêmen a fresco de

pirapitinga são do tipo secundárias, como cauda dobrada, as quais não

afetariam substancialmente as taxas de fecundação; já no sêmen

descongelado foram detectadas algumas morfoanomalias primárias como

cauda enrolada e alterações na peça intermediária;


65

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AAS, G.; REFSTIE, T.; GJERDE, B. Evaluation of milt quality of Atlantic salmon.

Aquaculture, v.95, p.125-132, 1991.

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bidens (Spix, 1829) com vista a melhorar a taxa de sobrevivencia de pos-larvas

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Universidade Federal do Ceará. 1997.

AMARAL, A. Utilização do azul de bromofenol como método de coloração vital

para a avaliação da morfologia do espermatozóide ovino. 2004. 30f. Dissertação

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