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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
MARCO ANTONIO BASILIO LINARD
PERFIL MINERAL E PROTÉICO DO PLASMA SEMINAL DE COELHOS
FORTALEZA
2013
MARCO ANTONIO BASILIO LINARD
PERFIL MINERAL E PROTÉICO DO PLASMA SEMINAL DE COELHOS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Zootecnia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Zootecnia.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Cláudia Nascimento
Campos
FORTALEZA
2013
À Deus.
Aos melhores pais do mundo, Marcos Farias Linard e Olga Basilio Gonçalves Linard.
A minha namorada e companheira Mariana dos Santos Candido.
Aos meus irmãos, primos amigos e todos que acreditaram em mim.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pela minha vida.
Aos meus pais, Marcos e Olga, pelo amor, apoio e incentivo durante toda minha
vida e meus irmãos Marlon e Mairon pela amizade e o apoio.
Aos meus avós, tios, primos e demais familiares que sempre estiveram ao meu
lado nessa caminhada. Em especial aos meus tios Ary e Lilia e meu primo Basilio que
são minha segunda família.
A minha namorada Mariana, pelo apoio, amor, ajuda e companhia.
À minha orientadora Profª. Ana Claudia Nascimento Campos que por muitas
vezes fez o papel de mãe, me passando conhecimentos e conselhos valiosos.
À Profª. Carla Renata Gadelha, pela co-orientação, apoio e por toda a ajuda.
À minha banca, em especial a Profª Ana Carolina Landim Pacheco e o Profº
Raimundo Bezerra da Costa, por aceitarem o convite.
A todos os meus amigos e companheiros. Em especial aos companheiros de
caminhada Gabriel e Assis Rubens, e suas namoradas Iana e Anne Maiane.
Aos todos integrantes e amigos do LERA que me ajudaram sempre que
necessário.
A todos os membros do NUGEN, pela a ajuda e amizade, em especial ao grande
amigo Ricardo e novamente o Profº Raimundo Bezerra da Costa.
À Universidade Federal do Ceará, em especial ao departamento de zootecnia e
todos os professores.
À CAPES/PROPAG, pela concessão da bolsa.
À FUNCAP, por financiar parte da pesquisa realizada.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Médias e desvio-padrão mensais das concentrações seminais
cloretos, sódio e ácido cítrico no plasma seminal de
coelhos............................................................................................ 41
Tabela 2
Médias e desvio-padrão das concentrações seminais de cloretos,
sódio e ácido cítrico no plasma seminal de coelhos, segundo a
cor e aspecto do ejaculado.............................................................. 42
Tabela 3
Correlações simples de Pearson para os parâmetros bioquímicos
e seminais do sêmen de coelhos da raça Nova Zelândia Branca
do nordeste do Brasil...................................................................... 42
Tabela 4 Distribuição de frequência das características qualitativas do
sêmen de coelhos............................................................................ 43
Tabela 5 Curva de focalização adotada......................................................... 62
Tabela 6 Composição da solução de gel-malha 15%.................................... 62
Tabela 7 Protocolo adotado na separação eletroforética das
proteínas.......................................................................................... 63
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição de frequência mensal dos spots em função do ponto
isoelétrico....................................................................................... 66
Figura 2 Distribuição de frequência mensal dos spots em função do peso
molecular....................................................................................... 67
Figura 3 Mapaeletroforético (2D – SDS PAGE) do plasma seminal de
coelhos…………………………………………………………... 68
RESUMO
O plasma seminal representa a porção fluida do sêmen e sua presença afeta
positivamente a sobrevivência e os parâmetros de motilidade espermática em coelhos.
Este trabalho teve como objetivos (i) verificar as concentrações seminais de sódio,
cloretos e ácido cítrico em função do mês de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado, e
encontrar a frequência de ejaculados com presença de fração gel, cor e aspecto do
sêmen de coelhos criados em clima tropical; (ii) conhecer os spots proteicos mensais e
suas possíveis correlações com parâmetros seminais e bioquímicos de coelhos. Foram
utilizados 20 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, criados em sistema flat-deck,
alimentados com ração comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por
semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e
concentração espermática. Após as avaliações os ejaculados foram centrifugados para
obtenção do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Um
pool mensal de PS de cada animal foi feito para avaliação das concentrações de sódio,
cloretos, ácido cítrico e proteínas totais. Foram constatadas variações mensais
significativas (p<0,05) nas concentrações de sódio, cloretos e ácido cítrico no plasma
seminal de coelhos. Todos os constituintes minerais analisados sofreram influencia
significativa (p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentrações mais elevadas foram
constatadas nos ejaculados de cor branco-amarelada. O estudo de correlações encontrou
associação alta e significativa entre as concentrações de sódio e vigor (r=0,80; p<0,001),
bem como entre a concentração espermática e o ácido cítrico (r=-0,64; p<0,02). A maior
parte dos ejaculados de coelhos não apresentaram a fração gel. Os resultados também
mostraram que o ejaculado de cor branca e de aspecto leitoso são os mais comuns nessa
espécie. Também foi verificado uma concentração média de 2,73 ±0,31 µg/dl de
proteínas totais nas amostras de plasma seminal. A partir da quantificação das proteínas
totais foram confeccionados dois géis de eletroforese bidimensional SDS-PAGE
corados com nitrato de prata, com gradiente de pH entre 3 – 10, malha de 15% e uma
concentração de 100 µg de proteínas por amostra, para cada mês. Os géis foram
analisados no software Image Master 2D Platinum 6.0. ®
. O gel que continha o maior
número de spots (555 spots) foi o do mês de maio, e o gel com menor número spots (71
spots) foi verificado em janeiro, mas não houve efeito do mês sobre a quantidade de
spots detectados. A maioria dos spots presentes no plasma seminal de coelhos tem pI
abaixo de 8 e, destes spots, cerca de 40% tem pI ácido, a distribuição dos spots em
função do pI foi homogênea ao longo do ano. A distribuição dos spots em função do
peso molecular variou amplamente entre os meses. Com exceção de alguns os meses, a
maioria das proteínas apresentaram peso molecular acima de 100 kDa. O número de
spot proteicos correlacionaram-se moderada e positivamente com as proteínas totais
(r=0,57; p<0,05) e com o ácido cítrico (r=0,59; p<0,05). A análise in silico dos spots
encontrou 1.411 proteínas compatíveis com os bancos de dados Swiss-Prote e TrEMBL
(UniProtKB). Concluiu-se que a composição do plasma seminal de coelhos apresentou
ampla variação mensal e que ejaculados com alta concentração de ácido cítrico são
indesejáveis. Além disso, o perfil proteico de coelhos apresenta grande parte das
proteínas com afinidade a meio ácido e com alto peso molecular, não houve influencia
de meses do ano sobre a quantidade de spots proteicos detectados, e devido à ausência
de dados sobre coelhos, a ferramenta de análise bioinformática não ofereceu resultados
coerentes, mas permite uma estimativa das prováveis proteínas que podem ser
encontradas.
Palavras chave: plasma seminal, minerais, coelhos, ácido cítrico, proteínas, nitrato de
prata, proteoma 2D, análise in silico.
ABSTRACT
Seminal plasma is the fluid portion of semen and its presence positively affects
the survival and parameters of sperm motility in rabbits. This study aimed (i) to verify
the seminal concentrations of sodium, chloride and citric acid as a function of collection
month, the color and aspect of the ejaculate, and to find the frequency of ejaculations
with the presence of gel fraction, color and aspect of the semen of rabbits on tropical
climate, (ii) to meet monthly protein spots and their possible correlation with seminal
and biochemical parameters in rabbits. 20 rabbits of New Zealand White, raised in the
flat-deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a week,
and then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm concentration.
After the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal plasma, which
was stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly seminal plasma pool of each
animal was made to evaluate the concentrations of sodium, chloride, citric acid and
proteins. Significant monthly variations were found (p <0.05) in the concentrations of
sodium, chloride and citric acid in the seminal plasma of rabbits. All mineral
constituents analyzed suffered significant influence (p <0.05) by the color of the
ejaculate, and the highest concentrations were found in the white-yellowish ejaculates.
Correlation studies found a high and significant association between concentrations of
sodium and vigor (r = 0.80, p <0.001), and between sperm concentration and citric acid
(r = -0.64, p <0.02). Most of the ejaculates of rabbits showed no gel fraction. The results
also showed that the white and milky ejaculate are the most common for the species. It
was also observed an average concentration of 2.73 ± 0.31 mg / dl total protein in
samples of seminal plasma. From the quantification of total protein were prepared two-
dimensional electrophoresis gels stained SDS-PAGE with silver nitrate, with a pH
gradient between 3 – 10, mesh 15% and a concentration of 100 mg of protein per
sample for each month. Gels were analyzed with the Image Master 2D Platinum 6.0. ®
software. The gel containing the most spots (555 spots) was the gel of the month of
May, and the gel with fewer spots (71 spots) was observed in January, but no effect of
month on the amount of spots was detected. The majority of spots present in seminal
plasma of rabbits have pI below 8, and these spots, about 40% have pI acid, the
distribution of the spots as a function of pI was homogeneous throughout the year. The
distribution of spots depending on the molecular weight widely varied between the
months. Except of a few months, most of the protein had a molecular weight above 100
kDa. The number of protein spot positively and moderately correlated with total protein
(r = 0.57, p <0.05) and citric acid (r = 0.59, p <0.05). In silico analysis of 1411 protein
spots found compatible proteins with the Swiss-Prote database and TrEMBL
(UniProtKB). It is concluded that the composition of the seminal plasma of rabbits
showed a broad monthly variation and ejaculated with high concentrations of citric acid
are undesirable. In addition, the protein profile of rabbits has great affinity of the
proteins to acidic and high molecular weight, no influence of the months of the year on
the amount of protein spots identified were found and bioinformatics analysis tool does
not provide consistent results with those obtained gel electrophoresis, but it allows an
estimate of the probable proteins that can be found.
Key-word: seminal plasma, minerals, rabbits, citric acid, proteins, silver nitrate, two-
dimensional electrophoresis, bioinformatics.
SUMÁRIO
CAPITULO I – REFERENCIAL TEÓRICO...................................................... 14
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 15
2. OBJETIVOS.................................................................................................... 17
2.1. OBJETIVO GERAL..................................................................................... 17
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................... 17
3. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 18
3.1. Cunicultura................................................................................................... 18
3.2. Reprodução de coelhos................................................................................. 19
3.3. Características do sêmen de coelhos............................................................ 20
3.4. Fração gel...................................................................................................... 21
3.5. Plasma seminal............................................................................................. 21
3.6. Motilidade..................................................................................................... 22
3.7. Volume e concentração espermática............................................................ 23
3.8. Cor e Aspecto............................................................................................... 23
3.9. Proteínas do plasma seminal......................................................................... 24
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 26
CAPITULO II - CARACTERÍSTICAS QUALITATIVAS E BIOQUÍMICAS
DO SÊMEN DE COELHOS............................................................................... 35
RESUMO............................................................................................................. 36
ABSTRACT........................................................................................................ 37
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 38
2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 39
2.1. Local do experimento................................................................................... 39
2.2. Manejo dos animais experimentais e coleto de sêmen.............................. 39
2.3. Análises Bioquímica do Plasma Seminal..................................................... 40
2.4. Análise Estatística......................................................................................... 40
3. RESULTADOS............................................................................................... 41
4. DISCUSSÃO................................................................................................... 44
5. CONCLUSÃO................................................................................................. 48
REFERÊNCIAS................................................................................................. 49
CAPITULO III - MAPAS ELETROFORETICOS DO PLASMA SEMINAL
DE COELHOS..................................................................................................... 54
RESUMO............................................................................................................. 55
ABSTRACT........................................................................................................ 57
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 58
2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 60
2.1. Local do experimento................................................................................... 60
2.2. Manejo dos animais experimentais e coleto de sêmen................................. 60
2.3. Quantificação das proteínas totais................................................................ 61
2.4. Eletroforese 2D............................................................................................. 61
2.4.1. Reidratação das strips................................................................................ 61
2.4.2. Focalização Isoelétrica............................................................................... 61
2.4.3. Confecção do gel....................................................................................... 62
2.4.4. Equilíbrio das strips................................................................................... 63
2.4.5. Separação eletroforética das proteínas....................................................... 63
2.4.6. Coloração e revelação do gel..................................................................... 64
2.4.7. Digitalização e leitura do gel..................................................................... 64
2.5. Análise estatística......................................................................................... 64
3. RESULTADOS............................................................................................... 66
4. DISCUSSÃO................................................................................................... 69
5. CONCLUSÃO................................................................................................. 73
6. PERSPECTIVAS FUTURAS......................................................................... 74
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 75
14
CAPITULO I – REFERENCIAL TEÓRICO
15
1. INTRODUÇÃO
Os coelhos domésticos (Oryctolagus cuniculus) são descendentes do coelho
selvagem europeu, da ordem Lagomorpha, família Leporinae caracterizados por
possuírem um par de dentes incisivos superiores (BROWN, 2004; HARCOURT-
BROWN, 2002; ACBC, 2004). São animais monogástricos, herbívoros e bastante
prolíferos, cujo período de gestação é de apenas 30 dias (VIEIRA, 1981).
Segundo Hernández et al., (2000), quando comparada a carnes tradicionalmente
mais consumidas no Brasil, como às carne bovina, ovina, suína e frango, a carne de
coelho é considerada mais magra e saudável. Além disso, é altamente digerível,
saborosa, baixa em calorias, gorduras e colesterol, sendo frequentemente recomendada
pelos nutricionistas em regiões de maior produção dessa carne em detrimento das de
ruminantes.
A cunicultura é uma atividade estratégica, segundo Silva (2006), além da carne
de qualidade (branca, macia e saborosa), a rentabilidade da cunicultura comercial é
resultado da comercialização da pele (indústria de confecções, artesanato e cola), couro
(indústria de artefatos de couro), pêlo (feltros e artesanato), patas dianteiras e cauda
(confecção de chaveiros), cérebro (produção de tromboplastina e medicamentos),
orelhas (fabricação de gelatina), vísceras (farinha de carne em rações de animais),
urina e fezes (adubos orgânicos para outros animais), urina (veículo de perfumes) e
sangue (soro).
Segundo Carabaño et al. (2003), os coelhos não apresentam exigência de
grandes áreas para a sua criação, outro ponto positivo da criação de coelhos é a
possibilidade de inclusão de alimentos fibrosos como pastos de menor custo na sua
dieta. Scapinello et al. (2006), sitam como vantagens da criação de coelhos no Brasil o
clima favorável e a grande variedade de vegetais produzidos no pais que podem ser
utilizados na alimentação dos mesmos. Entretanto existem poucos estudos relacionados
à reprodução de coelhos, fato que torna a literatura desta área carente e necessitada de
mais pesquisas e aprofundamentos científicos, que vão aprimorar as praticas e o manejo
adotado na criação de coelhos.
16
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Caracterizar o perfil mineral e protéico e verificar alterações durante o ano
no plasma seminal de coelhos Nova Zelândia Branco criados em clima
tropical.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as concentrações mensais e individuais de sódio, cloretos e ácido
cítrico;
Verificar associações entre as concentrações de sódio, cloretos e ácido cítrico
com os parâmetros seminais;
Avaliar a expressão protéica do plasma seminal de coelhos criados em clima
tropical e suas possíveis correlações com parâmetros seminais e bioquímicos
durante um ano;
17
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Cunicultura
A cunicultura é a área da zootecnia destinada ao estudo e a produção de coelhos
domésticos. Dentre os produtos da cunicultura podemos citar a carne, pele, couro, pêlo,
patas dianteiras e cauda, cérebro, orelhas, vísceras, urina, fezes e sangue (SILVA,
2006). Entre os fatores da produção de coelhos que mais atraem os produtores podemos
citar a produção de proteína de origem animal, em um curto período de tempo e a custos
mínimos (ACBC, 2004).
A carne é o principal produto explorado comercialmente, é considerada de ótima
qualidade, apresentando na carcaça níveis de 20% de proteína bruta, e de 8% de
gordura, além de apresentar baixos teores de colesterol (55 mg/100g), o que representa
uma excelente opção de consumo de proteína animal (COMBES e DALLE ZOTTE,
2005).
O maior produtor mundial de coelhos é a China, com uma produção acumulada
de 500.000 toneladas no ano de 2005, que representa cerca de 40% da produção total
mundial, em seguida por vêm a Itália (225.000 ton.) e a Espanha (108.000 Ton.)
(XICCATO e TORCINO, 2007).
Segundo o IBGE-SIDRA (2011), existem no país 233.707 cabeças, a região com
o maior efetivo de coelhos é a região Sul com 175.045 cabeças, na região Nordeste se
encontram apenas 6.067 cabeças, sendo que 1.625 destes pertencem ao estado do Ceará.
O Brasil é um país de pouca tradição nesta atividade, contudo, principalmente
em regiões do sul e sudeste do país, já se percebem o surgimento de associações,
núcleos e cooperativas de criadores, além de preocupações com a formação técnica que
permita a utilização de tecnologias modernas de produção de coelhos (MACHADO et
al. 2011).
O fato de a cunicultura ser pouco desenvolvida no Brasil esta relacionada ao fato
de não haver tradição do consumo de carne de coelho, havendo dificuldades de inserir
esse produto no cardápio dos brasileiros. A criação de coelhos é uma atividade cujo
retorno do investimento é rápido, pois é possível produzir grande quantidade de carne
em um curto espaço de tempo devido ao seu rápido crescimento, sua prolificidade e seu
18
curto período de gestação. Além disso, outras partes do animal podem ser
comercializadas (SOUZA, 2011). No Brasil a cunicultura pode ser uma alternativa
rentável para pequenas propriedades (SCAPINELLO et al., 2002). Segundo Starck
(2011), a utilização de forragem na alimentação de coelhos é economicamente viável.
A temperatura ambiente é um fator que influencia consideravelmente a
produtividade dos coelhos (CAMPS, 2002). Para que o coelho possa manter sua
homeostase térmica e se desenvolver com máxima eficiência, é necessário que ele seja
criado em temperatura termoneutra, compreendida entre 15 a 20ºC (MULLER, 1982;
CERVERA e CARMONA, 1998). A primeira reação do coelho a sua exposição a uma
situação de estresse térmico é a redução do consumo alimentar (BANI et al., 2005).
Além da redução do consumo de alimento, a exposição ao calor promove efeito direto
sobre o metabolismo do coelho, provoca aumento na freqüência respiratória,
inapetência, estresse fisiológico, diminuição da função imune e diminuição da
capacidade reprodutiva (BANI et al., 2005; FRANCI et al.,1996; SIMPLICIO et al.,
1991).
3.2. Reprodução de coelhos
A inseminação artificial é empregada em coelhos desde 1950 (MURPHREE et
al., 1951). A partir do inicio da técnica da inseminação começaram as pesquisas
voltadas principalmente para o armazenamento do sêmen, que vem sofrendo grande
evolução desde os anos 1960, quando começou a ser empregado (O’SHEA e WALES
1969). Além das técnicas de armazenamento para se obter sucesso nos programas de
inseminação artificial em coelhos é importante também o conhecimento dos
constituintes do sêmen e quais as funções exercidas pelos mesmos. Roca et al. (2000),
cita que o fator limitante da inseminação artificial na cunicultura se encontra na
conservação do sêmen.
A maturidade sexual é descrita como o momento em que a produção diária de
sêmen é estabilizada (LEBAS et al., 1996). Para que haja reprodução entre os coelhos, é
necessário que eles alcancem a maturidade sexual, que ocorre quando o animal atinge
80% do peso adulto (RIOS et al., 2011). Contudo, pode-se utilizar coelhos jovens para a
reprodução a partir da idade de 20 semanas, com bons resultados. As primeiras
19
manifestações de comportamento sexual ocorrem entre 60 e 70 dias de idade (DELLA
PORTA et al., 1992).
Os principais fatores que afetam a fertilidade inerente a coelha são temperatura,
luminosidade e alimentação. Estes são os três principais causadores do efeito sazonal.
Porém há fatores relacionados ao macho que influenciam a fertilidade da fêmea e o
sucesso do programa de reprodução, sendo o principal é a qualidade do sêmen.
Há poucos relatos na literatura que afirmem que existe diferença na qualidade
seminal de coelhos conforme a mudança de estações do ano, embora, Theau-Clement et
al. (1991) afirmem que os ejaculados coletados na entrada da primavera sejam
superiores aos coletados no fim do outono.
O sucesso da criação de coelhos esta baseado na aplicação de boas práticas
reprodutivas, deve-se atentar para a utilização de bons reprodutores pertencentes a raças
melhoradas e capazes de transmitir suas boas qualidades a seus descendentes. Segundo
Rios et al. (2011) para escolha correta, os reprodutores devem possuir as seguintes
características: serem puros, pertencerem a uma raça aperfeiçoada para uma
determinada produção; ser sadios, com pelos brilhantes, em bom estado de nutrição e
musculosos; ser bem conformados; possuir órgãos sexuais externos perfeitos e que
funcionem normalmente; ser provenientes de ninhadas numerosas com número de
láparos maior que sete.
3.3. Características do sêmen de coelhos
As características físicas e químicas do sêmen são fatores fundamentais na
avaliação da puberdade e da maturidade sexual. Todavia, no coelho, a determinação da
maturidade sexual baseada nas características do sêmen é um pouco controverso
(MACARI e MACHADO, 1978), visto que, diferentes fatores, tais como a frequência
de coleta, programa de luz, idade do macho e estado de saúde, bem como, as estratégias
alimentares, podem influenciar quantitativa e qualitativamente a produção espermática
(IRRG, 2005). Por outro lado, a avaliação do sêmen deve fornecer informações sobre a
capacidade fertilizante dos espermatozoides (IRRG, 2005; CASTELLINI, 2008).
Na Europa, a Inseminação Artificial em coelhos é amplamente empregada por
razões comerciais e operacionais (IRRG, 2005). Ao mesmo tempo, esta tecnologia tem
20
contribuído para melhorar o conhecimento da fisiologia da fêmea e do macho, bem
como do metabolismo espermático (CASTELLINI et al., 2006a). Deve-se, portanto,
enfatizar que o sêmen é uma mistura de espermatozoides produzidos pelos testículos e
de plasma seminal secretado pelos epidídimos e por diferentes glândulas acessórias, que
se combinam no momento da ejaculação (EL-AZIM e EL-KAMASH, 2011). Todavia,
no coelho, o sêmen possui ainda duas partes principais, uma porção fluida e outra
gelatinosa, no plasma seminal (MUKHERJEE et al., 1951).
3.4. Fração gel
O gel é originado nas glândulas vesiculares (HOLTZ e FOOTE, 1978a; DEL
JESUS NIÑO et al., 1997) e o padrão de secreção do gel é androgênico dependente
(PARSON, 1950; BELL e MITCHEL, 1984). É composto de uma quantidade
significativa de substâncias estrogênicas (MUKHERJEE et al., 1951), além de alguns
constituintes seminais como o ácido cítrico e a frutose (pouca quantidade) (PARSON,
1950). Estudos posteriores demonstraram que a consistência do fluido contido nas
glândulas vesiculares varia de levemente viscoso a gelificado (HOLTZ e FOOTE,
1978a). Apesar de ser comum no sêmen de coelhos, nenhuma função foi encontrada
para o gel, além de prevenir a perda retrógrada de espermatozoides como nos roedores
(QUESENBERRY et al., 2004). Essa função também foi sugerida por Mukherjee et al.
(1951), pois especularam que logo após a ejaculação, o gel preencheria o lúmen vaginal
como um tampão de coagulação. Diante disso, o IRRG (2005) recomenda a remoção
imediata do gel logo após a coleta e antes que se realizem as avaliações do sêmen de
coelho.
3.5. Plasma seminal
Representa a porção fluida do sêmen e sua presença no meio diluidor afeta
positivamente a sobrevivência e os parâmetros de motilidade dos espermatozoides de
coelhos (CASTELLINI et al., 2000; HAGEN et al., 2002).
O plasma seminal contém constituintes tais como, carboidratos, lipídios,
proteínas e minerais (HOLTZ e FOOTE, 1978b; MÜLLER e KIRCHNER, 1978;
CASTELLINI et al., 2006b; ZANIBONI et al., 2004), que são importantes para o
21
metabolismo espermático. Um importante constituinte seminal é a frutose que
representa um substrato para o metabolismo dos espermatozoides (MANN, 1946).
Outros constituintes importantes são as proteínas. Sendo geralmente aceita que a
ligação das proteínas do plasma seminal ao espermatozoide estabiliza os componentes
do plasmalema, mascara antígenos expostos na superfície das células e previne e reação
acrossômica prematura. No plasma seminal de coelhos pode ser encontrado Na, K, Ca,
Mg, Se e Zn (HOLTZ e FOOTE, 1978b; CASTELLINI et al., 2007), além de traços de
alguns elementos, tais como, Cu, Fe, Mn, Cd, Pb e Ni (LUKÁČ et al., 2009). Este fluido
também contém várias gotas e vesículas (grânulos secretórios prostáticos) de diferentes
tamanhos e origens, que desempenham papéis diferentes e parcialmente desconhecidos
(Castellini et al., 2006a). Mourvaki et al. (2010) sugeriram que os grânulos secretórios
prostáticos podem representar uma fonte de proteção para os espermatozoides contra o
estresse oxidativo in vitro por suprir o espermatozoide com endógenos alfa –tocoferóis.
3.6. Motilidade
Representa a percentagem de espermatozoides que se movem progressivamente
em linha reta (CHRENEK et al., 2007). Para espécies com fecundação interna, a
motilidade é importante para o transporte dos espermatozoides dentro do aparelho
reprodutivo feminino e para a penetração do ovócito (HOLT e VAN LOOK, 2004). A
estimação subjetiva da motilidade e a avaliação da morfologia espermática são os dois
testes laboratoriais mais amplamente usados para a avaliação do sêmen de coelhos nas
estações de inseminação (LAVARA et al., 2008). Imediatamente, após a coleta, a
motilidade espermática pode ser avaliada visualmente pelo operador, mas tal avaliação é
subjetiva (IRRG, 2005). A análise computadorizada de espermatozoides (CASA) foi
desenvolvida para uma avaliação objetiva da motilidade espermática. Este sistema
inclui um microscópio de contraste de fase equipado com placa aquecedora, conectado a
uma vídeo-câmera de alta resolução e um computador (IRRG, 2005). Entretanto este
sistema requer grande investimento.
Roca et al. (2000) classificaram a motilidade progressiva em espermatozoides de
coelhos usando uma escala arbitrária de 0 – 5 (0, 1, 2, 3, 4 ou 5, D 0–10, 10–25, 25–50,
22
50–70, 70–90 ou 90–100%, respectivamente, dos espermatozoides mostrando
motilidade progressiva).
3.7. Volume e concentração espermática
O volume do ejaculado em coelhos pode variar de 0,3 a 0,6 mL e a concentração
espermática de 150 a 500 x 106 espermatozoides/mL, mas estes são susceptíveis de
variação (ADAMS e SINGH, 1981; LEBAS et al., 1997). Além do efeito de raça
(AMANN, 1966), outros fatores que podem fazer variar estes parâmetros são: dieta
alimentar (KAMEL e ATTIA, 2011), frequência de coleta (AMANN, 1966;
CASTELLINI et al., 2006c), idade (THEAU-CLEMENT et al., 2009), sequencia de
ejaculado e temperatura ambiental (FINZI et al., 1994) entre outros. O volume de sêmen
parece ser fortemente afetado pela temperatura (GARCIA-THOMAS et al., 2008;
ROCA et al., 2005), já a concentração pode aumentar devido à estimulação sexual sem
cópula, 1 a 2 minutos antes desta (LEBAS et al., 1997).
3.8. Cor e Aspecto
Alguns estudos afirmaram que o sêmen de coelho tem cor branca, cuja
intensidade depende da concentração espermática (ALVARIÑO, 1993; ALVAREZ et
al., 2006; BILBAO, 1996). Sêmen amarelado frequentemente é aquele contaminado
com urina, normalmente obtido quando a temperatura da vagina artificial está alta
(CHANG, 1959).
Vários trabalhos têm associado à cor e o aspecto como um único parâmetro
(MATAVELLI, 2011; EL-AZIM e EL-KAMASH, 2011). Um sêmen normal tem uma
aparência (aspecto) branca opalescente homogênea (IRRG, 2005). De acordo com
MATAVELLI (2011), os ejaculados são principalmente branco-leitoso, mas a melhor
qualidade (concentração espermática) é encontrada no sêmen branco-cremoso. Já
Arrebola e Fernandez (2011) afirmaram que o sêmen branco perolado é bom, e as outras
cores são classificadas como ruins. Assim também, um aspecto uniforme é o mais
procurado.
23
3.9. Proteínas do plasma seminal
A composição protéica do plasma seminal (PS) de mamíferos varia entre as
diferentes espécies, e tem importantes efeitos sobre a função espermática
(VILLEMURE et al., 2003). Algumas proteínas do PS têm influência sobre a motilidade
espermática (HENRICKS et al., 1998), viabilidade e fertilização (BRANDON et al.,
1999). Várias proteínas do PS tem sido descritas como fatores de infertilidade em
eqüinos (BRANDON et al., 1999) e suínos (JONÁKOVÁ et al., 2007).
Desse modo, desempenham um importante papel na capacitação dos
espermatozoides, traduzido por um complexo processo que habilita a célula espermática
a penetrar, através da zona pelúcida, por meio da reação acrossômica (CALVETE et al.,
1994; JONAKOVA et al., 2000). Alguns autores descreveram que a habilidade
fertilizante do espermatozoide seria, em grande parte, determinada pelas proteínas
espermáticas localizadas no acrossoma e peça intermediária, conhecidas como fonte de
enzimas metabólicas especialmente ativas, cujas liberações em grandes quantidades
podem indicar danos na membrana plasmática do espermatozoide (BITTMAR e
KOSINIAK, 1992).
As proteínas do plasma seminal são compostas principalmente por albuminas e
globulinas e pequenas quantidades de peptídeos e aminoácidos não protéicos
(KULKARNI et al., 1998). Segundo Dhami et al. (1994), esses compostos são
responsáveis pela propriedades anfóteras das proteínas do plasma seminal e, portanto,
baixas concentrações de proteína no plasma seminal reduz a capacidade de
tamponamento e, consequentemente, a qualidade do sêmen. Strezek et al. (1985) ao
estudarem veados, relataram que a globulina é a principal proteína em atividade durante
o período reprodutivo e que o seu nível decresce gradativamente durante o período de
quiescência reprodutiva.
Okab (2007), estudando coelhos da raça Nova Zelândia Branca criados em clima
temperado, constatou que as concentrações de proteínas totais, albumina e globulina no
plasma seminal foram influenciadas de maneira significativa pela estação do ano. As
maiores concentrações desses metabólitos foram encontradas no verão, enquanto que na
primavera foram observadas as menores concentrações, sugerindo portanto, que a
qualidade do sêmen é melhor no verão devido ao aumento da concentração dessas
proteínas na sua composição (OKAB, 2007; STREZEK et al., 1995).
24
As proteínas do PS parecem ser importantes para manutenção da motilidade em
touros e carneiros, pela melhoria da viabilidade espermática, e por protegerem a
membrana espermática dos espermatozoides de suínos e ovinos dos danos causados
pelas baixas temperaturas de preservação (BARRIOS et al., 2000; PÉREZ-PÉ et al.,
2001). Em eqüinos, o aumento da concentração de proteínas no sêmen pouco
concentrado diminuiu a congelabilidade do mesmo (BITTMAR e KOSINIAK, 1992).
Estudos também têm demonstrado que as algumas proteínas do plasma, tipo BSP, são
responsáveis por promoverem o efluxo de colesterol e fosfolipídios da membrana
espermática (MOREAU e MANJUNATH, 2000), mesmo quando adicionada a
espermatozoides do epidídimo (THÈRIEN et al., 1999). Por tudo isso, algumas
proteínas presentes no plasma seminal tem sido estudadas para serem utilizadas como
marcadores moleculares de fertilidade, uma vez que o sucesso do manejo reprodutivo
depende da escolha de bons reprodutores, ou como aditivos no processo de conservação
e industrialização do sêmen. Poucas proteínas foram identificadas no sêmen de bovinos
e não há relatos de estudos nessa área em coelhos. Um conhecimento mais detalhado
dessas proteínas poderia ajudar a compreender melhor os fenômenos fisiológicos
referentes à função espermática e a fertilidade nesta espécie.
25
REFERÊNCIAS
ACBA, 2004. Associação Científica Brasileira de Cunicultura. Disponível em:
<http://www.acbc.uem.br>. Acessado em: 15/07/2013.
ADAMS. C. E.; SINGH, M. M. Semen characteristics and fertility of rabbits subjected
to exhaustive use. Laboratory Animals, v. 15, p. 157-161, 1981.
ALVAREZ, C. A.; MORAES, G. V.; SCAPINELLO, C. et al. Efeito da suplementação
de selenometionina e vitamina C sobre as características quantitativas e qualitativas do
sêmen de coelho. Acta Scientiarum, 28: 177-185. 2006.
ALVARIÑO, M. R. Control de la reproducción en el conejo. Ediciones Mundi –
Presa. Madrid, 1993.
AMANN, R. P. Effect of ejaculation frequency and breed on semen characteristics and
sperm output of rabbits. Journal Reproduction Fertility, v. 11, p. 291-293, 1966.
ARREBOLA, D. F. A.; FERNÁNDEZ, L. A. R. Analysis of seminal quality, a tool in
fertility experimental toxicology study. Revista de Toxicología en Línea, p. 39-50,
2011.
BANI, P.; PICCIOLI, F.; CAPPELLI, A. Variations of some blood parameters in rabbit
reared under different environmental conditions. Italian Journal of Animal Science,
v4, p535-537, 2005. (supplement 2).
BARRIOS, B.; PÉREZ-PÉ, R.; GALLEGO, M. et al. Seminal Plasma Proteins Revert
the Cold-Shock Damage on Ram Sperm Membrane. Biology of Reproduction, v.63, p.
1531-1537, 2000.
BELL, D. J.; MITCHELL, S. Effects of female urine on growth and sexual maturation
in male rabbits. Journal Reproduction Fertility, v. 71, p. 155 – 160, 1984.
BILBAO, M. M. Manejo en inseminación artificial: factores que afectan a la calidad
seminal y al indice de fertilidad. Boletin de Cunicultura. p.45-56, 1996.
BITTMAR, A.; KOSINIAK, K. The role of selected biochemical components of equine
seminal plasma in determining suitability for deep-freezing. Archivum Veterinarium
Polonicum, v. 32, p. 17-28, 1992.
26
BRANDON, C. I.; HEUSNER, G. L.; CAUDLE, A. B. et al. Two-dimensional
polyacrylamide gel electrophoresis of equine seminal plasma proteins and their
correlation with fertility. Theriogenology, v. 52, p.863-873, 1999.
BROWN, S. A. 2004. Basic Anatomy, Physiology, and Husbandry. In: Quesenberry
KE, Carpenter JW, eds. Ferrets, Rabbits and Rodents: Clinical Medicine and Surgery.
2nd ed., p.136 – 146, Philadelphia, PA: Elsevier; 2004.
CALVETE, J. J.; NESSAU, S.; MANN, K. et al. Isolation and biochemical
characterization of stallion seminal plasma proteins. Reproduction Domestic Animal,
v. 29, p. 411-426, 1994.
CAMPS J. Mínimos de conforto para cunicultura industrial. In: SIMPOSIUM DE
CUNICULTURA, Réus, p27, 2002. Asociacion espanõla de cunicultura, p57-64,
2002.
CARABAÑO, J. A.; PIQUER, J. The digestive system of the rabbit. In: Nutrition of
the Rabbit, edited by Carlos de Blas and Julian Wiseman 2nd Edition, p. 1-18, 2003.
333p.
CASTELLINI, C. Semen production and management of rabbit bucks. In: World Rabbit
Congress, 9, 2008, Anais… Verona: Itália, p. 265 – 277.
CASTELLINI, C.; BESENFELDER, U.; PIZZI, F. et al. Developments in the
investigation of rabbit semen and buck management. In: Recents Advances in Rabbit
Sciences, MAERTENS, L., COUDERT, P. Institute for Agricultural and Fisheries
Research. p. 53-68. 2006a.
CASTELLINI, C.; CARDINALI, R.; DAL BOSCO, A. Lipid composition of the main
fractions of rabbit semen. Theriogenology, v. 65, p. 703-712, 2006b.
CASTELLINI, C.; LATTAIOLI, P.; CARDINALI, R. et al. Effect of collection rhythm
on spermatozoa and droplet Concentration of rabbit semen. World Rabbit Science, v.
14, p. 101 – 106, 2006c.
CASTELLINI, C.; LATTAIOLI, P.; MORONI, M. et al. Effect of seminal plasma on
the characteristics and fertility of rabbit spermatozoa. Animal Reproduction Science,
v. 63, p. 275 – 282, 2000.
27
CASTELLINI, C.; MOURVAKI, E.; DAL BOSCO, A. et al. Vitamin E biochemistry
and function: a case study in male rabbit. Reproduction Domestic Animal, v. 42, p.
248–256, 2007.
CERVERA, C.; CARMONA, F. J. Climatic environment. In: The Nutrition of the
Rabbit. DE BLAS, J.C.; WISEMAN, J. (Ed.). CABI Publish: Wallingford, p273-295,
1998.
CHANG, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa. In: Recent Progress in the
Endocrinology of Reproduction, 1959, p. 131. Ed. C. W. Lloyd, Academic Press, New
York. 1959.
CHRENEK, P,; TRANDZIK, J.; MASSANYI, P. et al. Effect of transgenesis on
reproductive traits of rabbit males. Animal Reproduction Science, v. 99, p. 127–134,
2007.
COMBES, S.; DALLE ZOTTE, A. 2005. Le viande de lapin: valeur nutritionnelle et
particularites technologiques. In Proc.: 11émes. Journées de la Recherche Cunicole,
29-30 November, 2005. Paris, France, 167-180.
DEL NIÑO JESUS, A.; MUÑOZ LOPEZ, I.; JOSA, A. et al. Modifications of some
parameters of the rabbit ejaculate after ablation of the vesicular gland. World Rabbit
Science, v. 5, p. 3 – 5, 1997.
DELLA PORTA, P.; DELLA PORTA, P.; MACCARIO, P. et al. Inseminazione
Artificiale nei conigli. Edizione Grupo Azeta. Aprile, 1992.
DHAMI, A.S.; KLASAHNI, G.M.; TRIPATHI, R.P. Comparative evaluation of
initially static and motile semen ejaculates from Friesian and Murah buffalo bulls for
physico-morphlogical, biochemical, enzymatic and mineral constituents of seminal
plasma. Indian Journal of Animal Sciences, v. 64, p. 926-932, 1994.
EL-AZIM, A. A.; EL-KAMASH, E. M. Evaluation of semen quality and its relation to
mating system for some breeds of rabbits under environmental conditions in the middle
of egypt. Egyptian Poultry Science Journal, v. 31, p. 467-480, 2011.
FINZI, A.; MORERA, P.; MACCHIONI, P. Modifications of some rabbit spermatic
parameters in relationship to high ambient temperatures. Cahiers Options
Méditerranéennes, v. 8, p. 333 -336, 1994.
28
FRANCI, O.; AMICI, A.; MARGARIT, R. Influence of thermal and dietary stress on
immune response of rabbits. Journal of Animal Science, v74, n7, p1523-1529, 1996.
GARCIA-THOMAS M.; TUSELL, L. I.; LOPEZ-BEJAR, M. et al. Influence of
environmental temperature and relative humidity on quantitative and qualitative semen
traits of rabbits. In: World Rabbit Congress, 9, 2008, Anais… Verona: Itália, p. 359 –
363.
HAGEN, D. R.; GILKEY, A. L.; FOOTE, R. H. Spermatozoal velocity and motility and
relationship to fertility in the rabbit inseminated with low sperm numbers. World
Rabbit Science, v. 10, p. 135–140, 2002.
HARCOURT-BROWN, F. Biological characteristics of the domestic rabbit
(Oryctolagus cuniculus). In: Textbook of Rabbit Medicine. 410p. 2002.
HENRICKS, D. M.; KOUBA, A. J.; LACKEY, B. R. et al. Identification of insulin-like
growth factor-I in bovine plasma and its receptor on spermatozoa: influence on sperm
motility. Biology of Reproduction, v. 59, p. 330-337, 1998.
HERNÁNDEZ, P.; PLA, M.; OLIVER, M. A. et al. Relationships between meat quality
measurements in rabbits fed with three diets of different fat type and content. Meat
Science, Barking, v.55, n.4, p.379-384, 2000.
HOLT, W. V.; VAN LOOK, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection
and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality.
Reproduction, v. 127, p. 527–535, 2004.
HOLTZ W, FOOTE H. The anatomy of the reproduction system in male dutch rabbits
(Oryctolagus cuniculus) with special emphasis on the accessory sex glands. Journal of
Morphology, v. 158, p. 1 – 20, 1978a.
HOLTZ, W,; FOOTE, H. Composition of Rabbit Semen and the Origin of Several
Constituents. Biology of Reproduction, v.18, n. 2, p.286 -292, 1978b.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – SISTEMA IBGE
DE RECUPERAÇÃO AUTOMÁTICA – SIDRA/IBGE. 2011. Disponível em: <
http://www.sidra.ibge.gov.br>. Acessado em: 16/07/2013.
IRRG – International Rabbit Reproduction Group. Guidelines for the handling of rabbit
bucks and semen. World Rabbit Science, v. 13, p. 71 – 91, 2005.
29
JONAKOVA, V.; MANASKOVA P.; TICHA, M. Separation, characterization and
identification of boar seminal plasma proteins. Journal of Chromatography B,
Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, v. 849, p. 307-314, 2007.
JONAKOVA, V.; SKOVA, M. P.; KRAUS, M. et al. Sperm Surface Proteins in
Mammalian Fertilization. Molecular Reproduction and Development, v. 56, p. 275–
277, 2000.
KAMEL, K. I.; ATTIA, Y. A. Effect of dietary lecithin supplementation on
improvement semen quality, reproductive performance plasma biochemical traits and
antioxidant changes in rabbit bucks. Egyptian Poultry Science, v. 31, p. 667-680,
2011.
KULKARNI, B.A.; RUPAL, P.Q; HEDGE, U.C. Comparative SDS polyacrylamide gel
electrophoresis of seminal plasma protein and blood plasma proteins of the Indian
buffalo and cattle bulls. Indian Journal of Animal Sciences, v. 68, n, 1 p, 66 a 67,
1998.
LAVARA, R.; GARCÍA, M. L.; TORRES, C. et al. Genetic parameters for semen traits
of rabbit males: II. Motility. In: World Rabbit Congress, 9, 2008, Anais… Verona:
Itália, p. 159- 162.
LEBAS, F.; COUDERT, P.; ROCHAMBEAU, H. et al. Reproduccion. In: LEBAS, F.
(Ed.) El conejo: cría y patologia. Roma: Organização das Nações Unidas para a
Agricultura e Alimentação (FAO), 1996. 227p.
LEBAS, F.; COUDERT, P.; ROCHAMBEAU, H. et al. Reproduction. In: Rabbit
husbandry, health and production. Animal Production and Health Series nº 21, FAO,
Rome. 1997. 250pp.
LUKÁČ, N.; MASSÁNYI, P.; KROČKOVA, J. et al. Relationship between trace
element concentrations and spermatozoa quality in rabbit semen. Slovak Journal
Animal Science, v. 42, p. 46-50, 2009.
MACARI, M.; MACHADO, C. R. Sexual maturity in rabbits defined by the physical
and chemical characteristics of the semen. Laboratory Animals, v. 12, p. 37-39, 1978.
MACHADO, L. C.; FERREIRA, W. M.; SCAPINELLO, C. et al. Manual de
formulação de ração e suplementos para coelhos. Bambuí : Ed. do Autor, 2011. 24 f.
30
MANN, T. Studies on the metabolism of semen: 3. fructose as a normal constituent of
seminal plasma site of formation and function of fructose in semen. Biochemical
Journal, v. 40, p. 481 – 491, 1946.
MATAVELLI, M. Níveis de selênio na dieta de coelhos e a influência na qualidade e
nos métodos de conservação do sêmen. 2011, 52p. Dissertação (Mestrado em
Zootecnia). Curso de Pós-Graduação em Zootecnia, Universidade Estadual de Maringá.
MOREAU, R.; MANJUNATH, P. Characteristics of the cholesterol eflux induced by
novel seminal phospholipid-binding proteins. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1487,
p. 24-32, 2000.
MOURVAKI, E.; CARDINALI, R.; DAL BOSCO, A. et al. In vitro antioxidant activity
of the prostatic secretory granules in rabbit semen after exposure to organic peroxides.
Reproduction Biology Endocrinology, v. 8, p. 1-7, 2010.
MUKHERJEE, D. P.; JOHARI, M. P.; BHATTACHARYA. P. The gelatinous mass in
rabbit semen. Nature, v. 168, p. 422 – 423, 1951.
MULLER P. B. Bioclimatologia aplicada aos animais domésticos. 2ª edição. Porto
Alegre, RS, Sulina, p.158, 1982.
MÜLLER, B.; KIRCHNER, C. Influence of seminal plasma proteins on motility of
rabbit spermatozoa. Journal Reproduction Fertility, v. 45, p. 167-172, 1978.
MURPHREE, R.;, BLACK, W. G.; OTTO, G. et al. Effect of site of insemination upon
the fertility of gonadotrophin-treated rabbits of different reproductive stages.
Endocrinology 1951;49:474-480.
O’SHEA, T.; WALES, R. G. Further studies of the deep freezing of rabbit spermatozoa
in reconstituted skim milk powder. Australian Journal of Biological Sciences 1969;
22:709-719.
OKAB, A. B. Semen characteristics and plasma testosterone of New-Zealand male
rabbits as affected by environmental temperatures. Slovak Jounal Animal Science, v.
40, n. 4, p. 161 – 167, 2007.
PARSON, U. Fructose in rabbit semen: a study of normal fluctuations, and changes
evoked by testosterone and stilboestrol. Journal of Endocrinology, v. 6, p. 412 – 422,
1950.
31
PÉREZ-PÉ, R.; CÉBRIAN-PÉREZ, J.A.; MUIÑO-BLANCO, T. Semen plasma
proteins prevent cold-shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology,
v.56, p.425-434, 2001.
QUESENBERRY, K. E.; DONNELLY, T. M.; HILLYER, E. V. Biology, Husbandry,
and Clinical Techniques of Guinea Pigs and Chinchillas. In: Quesenberry KE, Carpenter
JW. Ferrets, Rabbits and Rodents: Clinical Medicine and Surgery. 2nd ed., p.232 – 244,
Philadelphia, PA: Elsevier; 2004.
RIOS, D. M.; BARBOSA, L. E.; NEVES, M. V. B. et al. Manual de cunicultura. 2011.
46 f. Trabalho acadêmico (Graduação em Engenharia Agronômica) – Universidade do
Estado da Bahia, Barreiras, 2011. Disponível em:
<http://pt.scribd.com/doc/49387002/cunicultura>. Acesso em: 19 jul. 2011.
ROCA, J.; MARTÍNEZ, S.; ORENGO, J. et al. Influence of constant long days on
ejaculate parameters of rabbits reared under natural environment conditions of
Mediterranean area. Livestock Production Science, v. 94, p. 169-177, 2005.
ROCA, J.; MARTINEZ, S.; VAZQUEZ, J. M. et al. Viability and fertility of rabbit
spermatozoa diluted in Tris-buffer extenders and stored at 15 degrees C.
Animal Reproduction Science, 2000 ; 64(1-2): 103-112.
SCAPINELLO, C.; MICHELAN, A. C.; FURLAN, A. C. et al. Utilização da farinha de
varredura de mandioca na alimentação de coelhos. Acta Scientiarum, Maringá, v.28,
n.1, p.39-45, 2006.
SCAPINELLO, C.; MICHELAN, A. C.; FURLAN, A. C. et al. Valor nutritivo e
utilização de feno do terço superior da rama de mandioca para coelhos em crescimento.
In: 39a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2002, Recife. Anais da
39a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia. Recife: Sociedade Brasileira
de Zootecnia, 2002. v. 1. p. 1-1.
SILVA, R. A. Cunicultura. In: 3° Congresso de Cunicultura das Américas, 2006,
Maringá, PR. Maringá, 2006.
SIMPLICIO, J. B.; FERNÁNDEZ C. J.; CERVERA, C. Efecto del pienso sobre la
producción de la coneja a una temperatura ambiente alta. Investigación Agraria,
Producción y Sanidad Animales, v6, p67-74, 1991.
32
SOUZA, G. C. C. F. Cunicultura. Dossiê Técnico. Serviço Brasileiro de Respostas
Técnicas (SBRT). Instituto de Tecnologia do Paraná – TECPAR. 2011. Disponível em:
http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NTY5NA==. Acessado
em: 22 Ago. 2013
STARCK, A. S. Desempenho e avaliação de carcaça de coelhos submetidos a
diferentes manejos alimentares. Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curso
de Bacharelado em Zootecnia. Trabalho de conclusão de curso. 2011.
STREZEK, J.; KRZYWINSKI, A.; SWIDOWICS, K. Seasonal changes in the chemical
composition of red deer (Cerous elaphus) semen. Animal Reproduction Science, v. 9,
p. 195-204, 1985.
THEAU-CLEMENT, M.; SANCHEZ, A.; DUZERT, R. et al. Etude de facteurs de
variation de la production spermatique chez le lapin. In: Jourmées de la Recherche
Cunicole, 13, 2009, Anais ... Le Mans: France, p. 1-4.
THEAU-CLÉMENT, M.; THÉBAULT, R. G.; BOLET, G. et al.. La reproduction du
Lapin Angora de souche française: ovulation chez la femelle, production de semence
chez le mâle. Reproduction Nutrition Development, (1991) Dev., 31: 667-673.
THERIEN, I.; MOREAU, R.; MANJUNATH, P. Bovine Seminal Plasma Phospholipid-
Binding Proteins Stimulate Phospholipid Efflux from Epididymal Sperm. Biology of
Reproduction, v. 61, p. 590-598, 1999.
VIEIRA, M. I. Produção de coelhos: caseira, comercial, industrial. 9° Ed. Ver. E ampl.
São Paulo, 1981. 716p.
VILLEMURE, M.; LAZURE, C.; MANJUNATH, P. Isolation and characterization of
gelatin-binding proteins from goat seminal plasma. Reproductive Biology and
Endocrinology, v. 1, p. 39-48, 2003.
XICCATO, G.; TROCINO, A. (2007). Italy, a system of integrated rabbit production.
Livro de Comunicações do II Congresso Ibérico de Cunicultura, 175-184.
ZANIBONI, L.; GLIOZZI, T.; MALDJIAN, A. et al. Fatty acid and tocopherol
composition of semen components in the rabbit. In: World Rabbit Congress, 8, 2004,
Anais … Puebla: Mexico, p. 365-370.
33
CAPITULO II - CARACTERÍSTICAS QUALITATIVAS E BIOQUÍMICAS DO
SÊMEN DE COELHOS
34
RESUMO
Este estudo teve como objetivos verificar as concentrações seminais de sódio,
cloretos e ácido cítrico em função do mês de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado, e
verificar a frequência destes parâmetros nos ejaculados com presença de fração gel, em
coelhos criados em clima tropical. Foram utilizados 20 coelhos da raça Nova Zelândia
Branca, criados em sistema flat-deck, alimentados com ração comercial. Os ejaculados
foram coletados duas vezes por semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor,
aspecto, vigor, motilidade e concentração espermática. Após as avaliações os ejaculados
foram centrifugados para obtenção do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos
eppendorfs a -18 oC. Um pool mensal de PS de cada animal foi obtido para avaliação
das concentrações de sódio, cloretos e ácido cítrico. Foram constatadas variações
mensais significativas (p<0,05) nas concentrações de sódio, cloretos e ácido cítrico no
plasma seminal de coelhos. Todos os constituintes minerais analisados sofreram
influencia significativa (p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentrações mais elevadas
foram constatadas nos ejaculados de cor branco-amarelada. O estudo de correlações
encontrou associação alta e significativa entre as concentrações de sódio e vigor
(r=0,80; p<0,001), bem como entre a concentração espermática e o ácido cítrico (r=-
0,64; p<0,02). A maior parte dos ejaculados de coelhos não apresentaram a fração gel.
Os resultados também mostraram que o ejaculado de cor branca e de aspecto leitoso são
os mais comuns nessa espécie. Concluiu-se que a composição do plasma seminal de
coelhos apresentou ampla variação mensal e que ejaculados com alta concentração de
ácido cítrico são indesejáveis.
Palavras chave: minerais, plasma seminal, coelhos, ácido cítrico
35
ABSTRACT
This study aimed to verify the seminal concentrations of sodium, chloride and
citric acid as a function of collection month, the color and aspect of the ejaculate, and to
check the frequency of ejaculations with the presence of gel fraction, color and aspect of
rabbit semen on tropical climate. 20 rabbits of New Zealand White, raised in the flat-
deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a week, and
then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm concentration. After
the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal plasma, which was
stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly PS pool of each animal was made to
evaluate the concentrations of sodium, chloride and citric acid. Significant monthly
variations were found (p <0.05) in the concentrations of sodium, chloride and citric acid
in the seminal plasma of rabbits. All mineral constituents analyzed suffered significant
influence (p <0.05) by the color of the ejaculate, and the highest concentrations were
found in the white-yellowish ejaculates. Correlation studies found a high and significant
association between concentrations of sodium and vigor (r = 0.80, p <0.001), as
between sperm concentration and citric acid (r = -0.64, p <0.02 .) Most of the ejaculates
of rabbits showed no gel fraction. The results also showed that the white and milky
ejaculates are the most common for the species. It is concluded that the composition of
the seminal plasma of rabbits showed a broad monthly variation and ejaculate with high
concentrations of citric acid are undesirable.
Key-words: minerals, seminal plasma, rabbits, citric acid.
36
1. INTRODUÇÃO
O plasma seminal representa a porção fluida do sêmen e sua presença afeta
positivamente a sobrevivência e os parâmetros de motilidade espermática em coelhos
(CASTELLINI et al., 2000, HAGEN et al., 2002). Contém constituintes tais como,
carboidratos, lipídios, proteínas e minerais (HOLTZ e FOOTE, 1978b; MÜLLER e
KIRCHNER, 1978; CASTELLINI et al., 2006; ZANIBONI et al., 2004), que são
importantes para o metabolismo espermático. A frutose e a glicose são constituintes
seminais importantes para o metabolismo dos espermatozoides (MANN, 1946). Estudos
anteriores observaram que a concentração inicial de frutose no plasma seminal está
relacionada com a de testosterona (MANN e PARSON, 1947; OKAB, 2007). Todavia,
a concentração desse açúcar no sêmen de coelhos está bem abaixo do encontrado em
ruminantes (ANAND, 1973; MENDONZA et al., 1989; ROCA et al., 1993).
Outros constituintes importantes são as proteínas, cujos efeitos biológicos sobre
a função espermática são complexos e não completamente compreendida (STRZEŻEK
et al., 2005). Bem como, os minerais, tais como, o Na, K, Ca, Mg, Se e Zn (HOLTZ e
FOOTE, 1978b; CASTELLINI et al., 2007), além de alguns elementos traços tais como,
Cu, Fe, Mn, Cd, Pb e Ni (LUKÁČ et al., 2009). Holtz e Foote (1978b) relataram que as
concentrações seminais de sódio e o potássio foram encontrados em concentrações
similares (1:1), apesar disso, as concentrações dos minerais citados estão muito abaixo
do encontrado nas outras espécies (BLACKSHAW e SALISBURY, 1957). Sendo
assim, afirmou-se que os constituintes minerais contribuem pouco para manter a pressão
osmótica do sêmen, sugerindo-se que os componentes orgânicos são os principais
responsáveis por essa manutenção (HOLTZ e FOOTE, 1978b). O sódio seminal reduz
significativamente caso a glândula vesicular seja removida (DEL NIÑO JESUS et al.,
1997). Estudo anterior sobre o efeito de diferentes concentrações de cálcio, potássio e
cloreto no diluidor de sêmen lavado e não lavado demonstrou que esses não afetaram
significativamente a motilidade do espermatozoide de coelhos (BLACKSHAW, 1953).
Este estudo teve como objetivos verificar as concentrações seminais de sódio,
cloretos e ácido cítrico em função do mês de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado,
bem como, verificar a frequência de ejaculados com presença de tampão gel, cor e
aspecto do sêmen de coelhos criados em clima tropical.
37
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Local do experimento
O experimento foi conduzido nas instalações do Setor de Cunicultura do
Departamento de Zootecnia/UFC (Fortaleza, Ceará) e as análises foram realizadas no
Laboratório de Estudos em Reprodução Animal. O clima, segundo a classificação de
Koeppen, é do tipo AW, quente e úmido, suas médias térmicas são de 26 a 27 °C, com
máximas de 30 °C e mínimas de 19 °C, a umidade relativa do ar é de 82 % no litoral do
estado do Ceará/Brasil.
2.2. Manejo dos animais experimentais e coleto de sêmen
Vinte coelhos da raça Nova Zelândia Branco foram treinados para coleta de
sêmen usando uma vagina artificial de vidro italiana (DAL BOSCO et al., 1996) e uma
fêmea em estro foi usada como manequim. Os ejaculados foram obtidos duas vezes por
semana de cada macho durante um ano, totalizando 104 amostras de sêmen por animal.
A fração gel, quando presente, foi removida conforme recomenda o IRRG (2005).
Amostras de sêmen contendo urina foram desprezadas. Logo após a coleta, cada
ejaculado foi avaliado quanto ao volume, cor (branco, branco amarelado, branco-
perolado ou marfim) e aspecto (aquoso, cremoso ou cremo - leitoso). A concentração
espermática (x109sptz/mL) foi determinada por meio de câmara de Neubauer com
sêmen diluído (1:100) em solução tampão formol salina (IRRG, 2005). As amostras de
sêmen foram diluídas em solução fisiológica para avaliação subjetiva (microscopia
óptica; Olympus CX40) do vigor (escala de 0 a 5) e motilidade progressiva espermática
(0-100%). Em seguida, as amostras de sêmen de cada animal foram imediatamente
centrifugadas a 2.500g/20 min/+4°C. O sobrenadante (plasma seminal) foi congelado a -
18°C para posterior análise bioquímica. Devido ao pequeno volume de plasma seminal
obtido por coleta, ao final do período experimental, um “pool” foi feito a cada oito ou
nove ejaculados mensais por animal, de modo que resultou em uma amostra mensal por
animal, totalizando em 240 amostras para análise.
38
2.3. Análises Bioquímica do Plasma Seminal
O plasma seminal foi analisado quanto às concentrações de cloretos (método
colorimétrico; SCHALES e SCHALES, 1941), sódio (método enzimático; BERRY et
al., 1988) e ácido cítrico (colorimétrico; SAFFRAN e DENSTEDT,1948).
As análises foram realizadas em espectrofotômetro seguinda a recomendação
dos kits industriais.
2.4. Análise Estatística
O experimento foi conduzido entre setembro de 2009 a agosto de 2010, foram
utilizados 20 coelhos. Para análise dos dados utilizou-se o programa estatístico SAS
versão 9.1 (2003). Procedeu-se ao estudo da análise de variância utilizando-se o
procedimento GLM do SAS para testar os efeitos de animal, mês de coleta do sêmen,
presença ou ausência de gel no ejaculado, da cor e do aspecto sobre os parâmetros
bioquímicos de coelhos.
Algumas variáveis que não atenderam o pressuposto para serem submetidas a
análise de variância sofreram as transformações necessárias, o ácido cítrico sofreu
transformação logarítmica, o cloreto transformação quadrática e o sódio foi elevado a
0,3. As médias mensais foram comparadas pelo teste Duncan com 5% de probabilidade
de erro. Procedeu-se ainda ao estudo das correlações simples de Pearson utilizando a
média mensal, para observação do grau de associação, entre aos parâmetros seminais e
bioquímicos de coelhos. Para verificar a distribuição de frequência entre mês de coleta
do sêmen, presença ou ausência de gel, da cor e do aspecto foi utilizado tabelas de
contingência. Para verificar a distribuição de freqüência entre mês de coleta do sêmen,
presença ou ausência de gel, da cor e do aspecto foi utilizado tabelas de contingência.
39
3. RESULTADOS
As concentrações mensais médias de cloreto, sódio e ácido cítrico estão
expressas na tabela 1.
Tabela 1 – Médias e desvio-padrão mensais das concentrações seminais cloretos, sódio
e ácido cítrico no plasma seminal de coelhos.
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si para P<0,05.
Foram constatadas variações mensais significativas (p<0,05) nas concentrações
de sódio, cloretos e ácido cítrico no plasma seminal de coelhos.
Todos os constituintes minerais analisados sofreram influencia significativa
(p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentrações mais elevadas foram constatadas nos
ejaculados de cor branco-amarelada (tabela 2).
Mês Sódio
(mg/dL)
Cloreto
(mEq/L)
Acido cítrico
(mg/dL)
Janeiro 106,85±10,84c 73,59±21,63
h 137,81±74,11
d
Fevereiro 77,24±27,46e 101,57±23,09
g 74,59±33,14
f
Março 98,42±17,45d 107,60±20,72
fg 152,73±52,08
cd
Abril 100,94±12,81cd
181,19±31,17a 155,78±41,26
c
Maio 95,16±23,96d 112,03±13,05
ef 411,77±180,60
b
Junho 62,22±25,58f 117,20±17,09
de 413,13±147,01
a
Julho 43,75±15,05g 122,89±27,85
d 152,61±67,81
c
Agosto 47,27±18,14g 141,88±27,54
b 131,41±53,64
d
Setembro 72,30±20,46e 134,08±26,31
c 150,35±66,26
cd
Outubro 57,28±15,43f 105,66±31,63
g 100,26±31,99
e
Novembro 156,69±20,72b 115,53±23,32
de 105,36±30,31
e
Dezembro 252,51±32,25 a 107,83±17,79
fg 100,68±37,72
e
Media Geral 95,44 ± 61,42 118,61± 35,03 171,42 ± 134,95
40
Tabela 2 –– Médias e desvio-padrão das concentrações seminais de cloretos, sódio e
ácido cítrico no plasma seminal de coelhos, segundo a cor e aspecto do ejaculado.
Característica Cloreto
(mEq/L)
Sódio
(mg/dL)
Acido cítrico
(mg/dL)
Cor Branca 119,05±34,82b 97,84±64,21
ab 171,69±134,72
b
Bca-Amarela 130,91± 35,20a 96,42±29,25
a 246,65±184,19
a
Bca- perolada 107,98±42,37c 83,03±27,61
b 190,80±136,13
b
Marfim 115,16±32,50b 71,77±33,21
c 137,42±111,11
c
Aspecto Aquoso 112,13±37,85 90,53±48,24 160,29±122,90
Leitoso 120,46±33,99 96,84±64,64 174,59±138,09
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si para P<0,05
Os resultados deste experimento demonstraram que a presença da fração gel não
influenciou significativamente na concentração destes constituintes seminais analisados.
Tabela 3 – Correlações simples de Pearson para os parâmetros bioquímicos e seminais
do sêmen de coelhos da raça Nova Zelândia Branca do nordeste do Brasil.
CE Sódio Cloreto Ácido cítrico
Vigor 0,57567 0,80995* -0,38896 -0,06687
CE 0,48647 -0,55374 -0.64459*
Sódio 0,17576 0,21644
Cloreto 0,03673
CE: concentração espermática
O estudo de correlações encontrou associação alta e significativa entre o sódio e
vigor (r=0,80; p<0,001), bem como entre a concentração espermática e o ácido cítrico
(r=-0,64; p<0,02). Entretanto, não foi observada correlação entre os íons estudados e
nem com o volume de sêmen, volume de plasma e motilidade espermática.
41
Tabela 4 – Distribuição de frequência das características qualitativas do sêmen de
coelhos.
Mês Fração Gel (%) Cor (%) Aspecto (%)
Ausente Presente B M BA BP L AQ
Janeiro 66,67
(68)
33,33
(34)
77,45
(79)
6,86
(7)
0,0
(0)
15,69
(16)
47,06
(48)
52,94
(54)
Fevereiro 70,89
(56)
29,11
(23)
57,52
(42)
38,56
(33)
1,96
(1)
1,96
(3)
46,84
(37)
53,16
(42)
Março 53,57
(30)
46,43
(26)
96,43
(54)
1,79
(1)
1,79
(1)
0,0
(0)
62,50
(35)
37,50
(21)
Abril 68,18
(60)
31,82
(28)
87,50
(77)
3,41
(3)
5,68
(5)
3,41
(3)
79,55
(70)
20,45
(18)
Maio 67,37
(64)
32,63
(31)
89,47
(85)
1,05
(1)
9,47
(9)
0,0
(0)
76,19
(64)
23,81
(20)
Junho 63,10
(53)
36,90
(31)
83,33
(70)
7,14
(6)
0,0
(0)
9,52
(8)
76,19
(64)
23,81
(20)
Julho 68,81
(75)
31,19
(34)
93,58
(102)
6,42
(7)
0,0
(0)
0,0
(0)
84,40
(92)
15,60
(17)
Agosto 68,75
(88)
31,25
(40)
84,38
(108)
10,16
(13)
1,56
(2)
3,91
(5)
82,81
(106)
17,19
(22)
Setembro 77,50
(62)
22,50
(18)
86,25
(69)
6,25
(5)
1,25
(1)
6,25
(5)
83,75
(67)
16,25
(13)
Outubro 59,17
(71)
40,83
(49)
98,33
(118)
0,83
(1)
0,83
(1)
0,0
(0)
88,33
(106)
11,23
(14)
Novembro 56,58
(43)
43,42
(33)
94,74
(72)
2,63
(2)
2,63
(2)
0,0
(0)
98,68
(75)
1,32
(1)
Dezembro 65,69
(67)
34,31
(35)
100
(102)
0,0
(0)
0,0
(0)
0,0
(0)
86,27
(88)
13,73
(14)
Total 65,86
(737)
34,14
(382)
87,40
(978)
7,06
(79)
1,97
(22)
3,57
(40)
77,84
(871)
22,16
(248)
B: branco; BP: branco-perolado; M: marfim; BA: branco-amarelado; L: leitoso e AQ:
aquoso.
A maior parte dos ejaculados de coelhos não apresentaram a fração gel (tabela
4), todavia, no mês de março a proporção entre ejaculados com e sem gel foi similar
(p>0,05). Os resultados também mostraram que o ejaculado de cor branca é o mais
comum nessa espécie, apenas em fevereiro é que foi observado um aumento na
frequência de ejaculados de cor marfim. No tocante ao aspecto do sêmen, ejaculados
leitosos foram mais frequentes, exceto nos meses de janeiro e fevereiro. Ejaculados de
aspecto cremo-leitosos foram raros (12 amostras) e por isso foram excluídos do
delineamento experimental.
42
4. DISCUSSÃO
As concentrações seminais de ácido cítrico foram similares as encontradas por
Desjardins et al. (1968), Macari e Machado (1978) e Mann (1946), exceto nos meses de
maio e junho que foram comparáveis ao encontrado em ruminantes (CATUNDA et al.,
2011; HUMPHREY e MANN, 1949). Apesar disso, este metabólito sofreu ampla
variação mensal (Tabela 1), conforme também foi constatado por Macari e Machado
(1978). Nessa espécie, ácido cítrico é secretado principalmente pelas glândulas
vesiculares (HUMPHREY e MANN, 1949) e está associado com a maturidade sexual
(STRATTON et al., 1973) e maior acidez do sêmen (KAVANAGH, 1985). Segundo
Holtz e Foote, (1978a), as glândulas vesiculares produzem um fluido que varia de
levemente viscoso à consistência de gel e contribui com 45,6% do volume do ejaculado
do coelho (DEL NIÑO JESUS et al., 1997). Também é aceito que o ácido cítrico pode
estar envolvido com o fenômeno de gelificação, coagulação e subsequente liquefação
que normalmente ocorre no sêmen de certas espécies (HUGGINS e NEAL, 1942;
HUMPHREY e MANN, 1949; MANN, 1964).
Estudos anteriores enfatizaram que, no plasma seminal de coelhos, a maior parte
do ácido cítrico está concentrada na fração gel (HOLTZ e FOOTE, 1978a). Nesse
experimento, a fração gel não foi analisada quanto à concentração de ácido cítrico, mas
a presença de gel no sêmen analisado não indicou diferença entre os ejaculados.
Entretanto, o ácido cítrico também foi encontrado em maior concentração no sêmen
branco-amarelado (tabela 2), porém, sêmen com esta característica só representou
1,97% do total de ejaculados obtidos, além disso, em alguns meses do ano nenhum
ejaculado branco-amarelado foi observado (tabela 4). Outro achado importante foi que o
ácido cítrico correlacionou-se negativamente com a concentração espermática (r= -0,64,
p<0,05; tabela 3). Este resultado diferiu do encontrado por Holtz e Foote (1978b), em
que o ácido cítrico correlacionou-se com a aglutinação espermática e com o magnésio.
Diante do exposto é possível afirmar que ejaculados de cor branco-amarelado além de
apresentarem alta concentração de ácido cítrico podem ser indicativos de baixa
concentração espermática, sendo portanto indesejáveis.
No que se refere à concentração dos constituintes minerais do plasma seminal,
poucos relatos na literatura foram encontrados sobre o assunto. As concentrações de
43
cloreto foram mais altas que os encontrados por Quinn et al. (1965) e à semelhança de
Ejellstrom e Kihlstrom (1975), também não foi encontrada correlação entre o sódio e o
cloreto. Além da variação mensal, o cloreto sofreu influencia da cor do ejaculado
(p<0,05), sendo significativamente mais elevado nos ejaculados de cor branco-
amarelado.
As concentrações seminais de sódio no plasma seminal também apresentaram
ampla variação mensal, e os valores ficaram bem abaixo do relatado por diversos
autores (DEL NIÑO JESUS et al., 1997; HOLTZ e FOOTE, 1978b; MACARI e
MACHADO, 1978; QUINN et al., 1965). No coelho, este íon parece ser secretado pelas
glândulas vesiculares, pois a remoção cirúrgica delas promoveu redução significativa do
sódio no plasma seminal (DEL NIÑO JESUS et al., 1997). Outro achado importante
observado pelos autores é que a vesiculoectomia também eliminou a incidência da
fração gel no sêmen. Este achado pode servir de base para justificar a baixa
concentração de sódio seminal verificada nesse experimento, pois foram encontrados
uma maior frequência de ejaculados sem a fração gel (tabela 4). Então, deve ser
lembrado que apesar das coletas de sêmen terem sido obtidas duas vezes por semana, as
amostras foram homogeneizadas para constituírem uma única amostra mensal por
animal; desse modo, acredita-se que as características bioquímicas do sêmen sem a
fração gel foram prestigiadas. No entanto, o sódio correlacionou-se positivamente com
o vigor (r=0,80995; p<0,05; tabela 3), semelhante ao constatado por Gusani et al. (1988)
no sêmen humano e diferente do encontrado por Kaya et al. (2002) no sêmen de
carneiro. Apesar da semelhança desse achado com o sêmen humano, deve ser ressaltado
que no homem o sódio é secretado pela próstata (KAVANAGH, 1985), diferente do
coelho que é pela vesícula seminal (DEL NIÑO JESUS et al., 1997). Nesse experimento
também foi verificado uma maior concentração de sódio no sêmen de cor branco-
amarelada.
No presente estudo, a maior proporção dos ejaculados foi da cor branca,
representando 87,40% do total de ejaculados. Todavia, no mês de fevereiro, a proporção
de sêmen de cor marfim aumentou em detrimento dos ejaculados de cor branca. Alguns
estudos afirmaram que o sêmen de coelho tem cor branca, cuja intensidade depende da
concentração espermática (ALVARIÑO, 1993; ALVAREZ et al., 2006).
44
Já o aspecto predominante foi o leitoso representando 77,84% do total, seguido
pelo aspecto aquoso que foi 22,16%. Entretanto, a frequência de ejaculados leitosos e
aquosos foi similar nos meses de janeiro e fevereiro (tabela 4). Vários trabalhos tem
associado a cor e o aspecto como um único parâmetro (SCAPINELLO et al., 1997; EL-
AZIM e EL-KAMASH, 2011). Segundo o IRRG (2005), um sêmen normal tem uma
aparência (aspecto) branca opalescente homogênea. Alvarez et al. (2006) relataram que
o sêmen branco-leitoso é o melhor e predominante no coelho e representa um sêmen
normal com boa qualidade. Esta afirmativa foi confirmada no presente experimento. O
sêmen amarelado frequentemente é aquele contaminado com urina, normalmente obtido
quando a temperatura da vagina artificial está alta (CHANG, 1959). No estudo atual,
amostras de sêmen com urina foram descartadas, todavia, mais estudos necessitam ser
conduzidos para identificar a origem da pigmentação amarelada de alguns ejaculados de
coelhos. Algumas espécies podem apresentar sêmen de cor amarelada, tais como os
caprinos (CATUNDA et al., 2011; MENDONZA et al., 1989), porém a cor amarela esta
intimamente associada a presença de riboflavina e ácido cítrico no plasma seminal
(MENDONZA et al., 1989). Nos resultados desse estudo o ácido cítrico estava elevado
no sêmen branco-amarelado (tabela 2), o que pode justificar a menor qualidade dos
ejaculados encontrados.
Somente 34,14% dos ejaculados de coelhos apresentarem a fração gel.
Resultados foram semelhantes foram observados por Del Niño Jesus et al. (1997). A
fração gel produzida pelas glândulas vesiculares é androgênica dependente (PARSON,
1950; BELL e MITCHELL, 1984). Consiste de quantidades significativas de
substâncias estrogênicas e ácido cítrico (PARSON, 1950; MUKHERJEE et al., 1951;
HOLTZ e FOOTE, 1978b). A fração gel costuma reduzir significativamente no segundo
ejaculado do dia (AMANN, 1966; AMANN e LAMBÍASE Jr, 1967; HOLTZ e
FOOTE, 1978b). Embora seja comum no ejaculado de coelhos, nenhuma função foi
encontrada para este gel, exceto de prevenir a perda retrógrada de sêmen em roedores
(QUESENBERRY et al., 2004). Esta função também tem sido sugerida para coelhos
por Mukherjee et al. (1951), que especularam que após a ejaculação o gel preenche o
lúmen vaginal, como tampão de coagulação. No entanto, o IRRG (2005) recomenda a
remoção do gel imediatamente após a coleta e antes da avaliação do sêmen de coelhos.
45
5. CONCLUSÃO
Concluiu-se que a composição do plasma seminal de coelhos pode variar
amplamente segundo o mês de coleta, resaltando o fato de o experimento ter ocorrido
em um ano atípico. Concentrações seminais elevadas de ácido cítrico associadas à cor
de ejaculado branco amarelado podem ser um indicativo de sêmen de qualidade inferior
nessa espécie.
46
REFERÊNCIAS
ALVAREZ, C. A.; MORAES, G. V.; SCAPINELLO, C. et al. Efeito da suplementação
de selenometionina e vitamina C sobre as características quantitativas e qualitativas do
sêmen de coelho. Animal Science, 28: 177-185, 2006.
ALVARIÑO, M. R. Control de la reproducción en el conejo. Ediciones Mundi – Presa.
Madrid, 1993.
AMANN, R. P.; LAMBIASE Jr. J. T. The Male Rabbit: I. Changes in semen
characteristics and sperm output between puberty and one year of age. Journal of
Reproduction e Fertility, 14: 329-332, 1967.
AMANN, R.P. Effect of ejaculation frequency and breed on semen characteristics and
sperm output of rabbits. Journal of Reproduction e Fertility, 11: 291-293, 1966.
ANAND, R. S. The carbohydrates of buffalo and goat semen. Journal of
Reproduction e Fertility, 32: 97-10, 1973.
BELL, D. J.; MITCHELL, S. Effects of female urine on growth and sexual maturation
in male rabbits. Journal of Reproduction e Fertility, 71: 155 – 160, 1984.
BERRY, M. N.; MAZZACHI, R. D.; PEJAKOVIC, M. et al. Enzymatic determination
of potassium in serum. Clinical Chemistry. May;35(5):817-20, 1989.
BLACKSHAW, A. W. The effects of potassium and calcium salts on the motility of
ram, rabbit and bull spermatozoa. The Journal of Physiology, I20, 465-470, 1953.
BLACKSHAW, A. W.; SALISBURY, G. W. Factors influencing metabolic activity of
bull spermatozoa. II. Cold-shock and its prevention. Journal Dairy Science, v. 40, p.
1099 – 1106, 1957.
CASTELLINI, C.; CARDINALI, R.; DAL BOSCO, A. Lipid composition of the main
fractions of rabbit semen. Theriogenology, v. 65, n. 4, p. 703-712, 2006.
CASTELLINI, C.; LATTAIOLI, P.; MORONI, M. et al. Effect of seminal plasma on
the characteristics and fertility of rabbit spermatozoa. Animal reproduction science,
63: 275 – 282, 2000.
47
CASTELLINI, C.; MOURVAKI, E.; DAL BOSCO, A. et al. Vitamin E Biochemistry
and Function: A Case Study in Male Rabbit. Reproduction in Domestic Animals, 42,
248–256 (2007).
CATUNDA, A. G. V.; AGUIAR, G. V.; LIMA, I. C. C. et al. Characterization of
ejaculates from crossbreed male goats raised in tropical environment. Revista
Portuguesa de Ciências Veterinárias, (2011) 110 (577-580) 59-67.
CHANG, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa. Recent Progress in the
Endocrinology of Reproduction. p. 131. Academic Press, New York, 1959.
DAL BOSCO, A.; SCUOTA, S.; CASTELLINI, C. et al. Study of an artificial vagina to
reduce the microbial contamination of rabbit semen. World Rabbit Science, 1996, 4-
201-204.
DEL NIÑO JESUS, A.; MUÑOZ, L.; JOSA, A. et al. Modifications of some parameters
of the rabbit ejaculate after ablation of the vesicular gland. World Rabbit Science, v. 5,
n. 1, p. 3 – 5, 1997.
DESJARDINS, C.; KIRTON, K. T.; HAFS, H. D. Sperm output of rabbits at various
ejaculation frequencies and their use in the design of experiments. Journal of
reproduction and fertility, (1968) 15, 27-32.
EL-AZIM, A. A.; EL-KAMASH, E. M.. Evaluation of semen quality and its relation to
mating system for some breeds of rabbits under environmental conditions in the middle
of egypt. Egypt. Poultry Science Journal, 31: 467-480, 2011.
HAGEN, D. R.; GILKEY, A. L.; FOOTE, R. H. Spermatozoal velocity and motility and
relationship to fertility in the rabbit inseminated with low sperm numbers. World
Rabbit Science, 10 (4), 135–140, 2002.
HOLTZ, W.; FOOTE, H. Composition of Rabbit Semen and the Origin of Several
Constituents. Biology of Reproduction, v.18, n. 2, p.286 -292, 1978b.
HOLTZ, W.; FOOTE, H. The anatomy of the reproduction system in male dutch rabbits
(Oryctolagus cuniculus) with special emphasis on the accessory sex glands. Journal of
Morphology, v. 158, p. 1 – 20, 1978a.
48
HUGGINS, C.; NEAL, W. Coagulation and liquefaction of semen : proteolytic enzymes
and citrate in prostatic fluid. The Journal of Experimental Medicine. 1942 Dec 1; 76
(6) : 527-41.
HUMPHREY, G. F.; MANN, T. Studies on the Metabolism of Semen 5. CITRIC ACID
IN SEMEN. Biochemistry, 1949, v. 44, p. 7-15.
IRRG – INTERNACIONAL RABBIT REPRODUCTION GROUP. Guidelines for the
handling of rabbit bucks and semen. World Rabbit Science, v. 13, p. 71 – 91, 2005.
KAVANAGH, J. P. Sodium, potassium, calcium, magnesium, zinc, citrate and chloride
content of human prostatic and seminal fluid. Journal of reproduction and fertility,
(1985) 75, 35-41.
KAYA, A.; AKSON, M.; TEKELI, T. Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics, ionic composition and enzymatic of seminal plasma in ram. Small
Ruminant Research, v. 44, p. 153-158, 2002.
LUKÁČ, N.; MASSÁNYI, P.; KROČKOVA, J. et al. Relationship between trace
element concentrations and spermatozoa quality in rabbit semen. Slovak. Journal of
Animal Science, 42, 2009 SUPPLEMENT 1: 46-50.
MACARI, M.; MACHADO, C. R. Sexual maturity in rabbits defined by the physical
and chemical characteristics of the semen. Laboratory Animals (1978) 12, 37-39.
MANN, T. 1946. Studies on the metabolism of semen: 3. fructose as a normal
constituent of seminal plasma site of formation and function of fructose in semen.
Biochemistry, J., 40: 481 – 491.
MANN, T. The Biochemistry of semen and of the male reproductive tract. London:
Methuen and Co., 1964, 493p.
MANN, T.; PARSONS, U. 1947. Effect of testicular hormone on the formation of
seminal fructose. Nature, 160: 294.
MENDOZA, G.; WHITE, I. G.; CHOW, P. Studies of chemical components of Angora
goat seminal plasma. Theriogenology, 32, 455-466, 1989.
MUKHERJEE, D. P.; JOHARI, M. P.; BHATTACHARYA, P. The gelatinous mass in
rabbit semen. Nature, v. 168, p. 422 – 423, 1951.
49
MÜLLER, B.; KIRCHNER, C. Influence of seminal plasma proteins on motility of
rabbit spermatozoa. Journal of reproduction and fertility, 45: 167-172, 1978.
OKAB, A. B. 2007. Semen characteristics and plasma testosterone of New-Zealand
male rabbits as affected by environmental temperatures. Slovak. Journal of Animal
Science, 40: 161 – 167.
PARSONS, U. Fructose in rabbit semen: a study of normal fluctuations, and changes
evoked by testosterone and stilboestrol. Journal of Endocrinology, v. 6, p. 412 – 422,
1950.
QUESENBERRY, K. E.; DONNELLY, T. M.; HILLYER, E. V. Biology, Husbandry,
and Clinical Techniques of Guinea Pigs and Chinchillas. In: Quesenberry KE, Carpenter
JW, eds. Ferrets, Rabbits and Rodents: Clinical Medicine and Surgery. 2nd ed., p.232 –
244, Philadelphia, PA: Elsevier; 2004.
QUINN, L. R. C.; MOTT, G. O.; BISSCHOFF, W. V. A. et al. Beef production of six
tropical grasses in central Brazil. In: Internacional Grassland Congress, 9, 1965, São
Paulo. Proceedings... São Paulo: Secretaria de Agricultura – DPA, 1965. V., p. 1015-
1020.
ROCA, J.; MARTINEZ, E.; VÁSQUEZ, J. M. Seasonal variation in frutose and citric
acid in seminal plasma of Murciana-Granadina goats. Small Ruminant Research, 10:
219-226, 1993.
SAFFRAN, M.; DENSTEDT, O. F. A rapid method for the determination of acid citric.
Journal Biology Chemical, v.175, n.10, p.849-55, 1948.
SCAPINELLO, C.; MORAES, G. V.; SOUZA, M. L. R. et al. Influência de diferentes
níveis de metionina+cistina sobre a produção de sêmen de coelhos Nova Zelândia
Branco. Revista Unimar, 19: 923-931, 1997.
SCHALES, O.; SCHALES, S. S. A simple and accurate method for the determination
of chloride in biological fluids. Journal of Biological Chemistry,1941 140: 879-884.
STRATTON, L. G.; EWING, L. L.; DESJARDINS, C. Efficacy of testosterone-filled
polydimethyl-siloxane implants in maintaining plasma testosterone in rabbits. Journal
of reproduction and fertility, (1973) 35, 235.
50
STRZEŻEK, J.; WYSOCKI, P.; KORDAN, W. et al. Proteomics of boar seminal
plasma – current studies and possibility of their application in biotechnology of animal
reproduction. Reproductive Biology, 5:279- 290, 2005.
USANI, P. H.; SKANDHAN, K. P.; VALSA, C. et al. Sodium and potassium in normal
and pathological seminal plasma. Acta Europaea Fertilitatis, 1988 Nov-Dec;
19(6):333-6.
ZANIBONI, L.; GLIOZZI, T.; MALDJIAN, A. et al. Fatty acid and tocopherol
composition of semen components in the rabbit. In Proc. 8th World Rabbit Congress,
September 2004, Puebla, Mexico, 365-370, 2004.
51
CAPITULO III – MAPAS ELETROFORETICOS DO PLASMA SEMINAL DE
COELHOS
52
RESUMO
Este estudo teve como objetivos conhecer o perfil protéico mensal do plasma
seminal de coelhos criados em clima tropical e suas possíveis correlações com
parâmetros seminais e bioquímicos de coelhos criados em clima tropical. Foram
utilizados 20 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, criados em sistema flat-deck,
alimentados com ração comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por
semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e
concentração espermática. Após as avaliações os ejaculados foram centrifugados para
obtenção do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Um
“pool” mensal de PS de todos os animais foi feito para avaliação das concentrações de
proteínas totais. Foi verificado uma concentração média de 2,73 ±0,31 µg/dl de
proteínas totais nas amostras de plasma seminal. Foram confeccionados dois géis de
eletroforese bidimensional 2D-PAGE corados com nitrato de prata, com gradiente de
pH entre 3 – 10, malha de 15% e uma concentração de 100 µg de proteínas por
amostra, para cada mês. Os géis foram analisados no software Image Master 2D
Platinum 6.0. ®
. O gel que continha o maior número de spots (555 spots) foi o do mês
de maio, e o gel com menor número spots (71 spots) foi verificado em janeiro, mas
houve ampla variação mensal na quantidade de spots detectados. A maioria dos spots
presentes no plasma seminal de coelhos tem pI abaixo de 8 e, destes spots, cerca de 40%
tem pI ácido, a distribuição dos spots em função do pI foi homogênea ao longo do ano.
A distribuição dos spots em função do peso molecular variou amplamente entre os
meses. Com exceção dos meses de fevereiro, maio e novembro, a maioria das proteínas
apresentaram peso molecular acima de 100 kDa. O número de spot protéicos
correlaciona-se moderada e positivamente com as proteínas totais (r=0,57; p<0,05) e
com o ácido cítrico (r=0,59; p<0,05). A análise in silico dos spots encontrou 1.411
proteínas compatíveis com os bancos de dados Swiss-Prote e TrEMBL (UniProtKB).
Nas condições em que esse estudo foi desenvolvido pode-se concluir que o perfil
protéico de coelhos apresenta grande parte das proteínas com afinidade a meio ácido e
com alto peso molecular e a ferramenta de análise bioinformática não oferece resultados
coerentes com os obtidos em gel de eletroforese, mas permite uma estimativa das
prováveis proteínas que podem ser encontradas.
Palavras chave: Proteínas, nitrato de prata, eletroforese bidimensional, bioinformática
53
ABSTRACT
This study aimed to identify the monthly protein spots typical in seminal plasma of
rabbits on tropical climate and its possible correlation with seminal and biochemical
parameters of rabbits raised in tropical climate. 20 rabbits of New Zealand White, raised
in the flat-deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a
week, and then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm
concentration. After the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal
plasma, which was stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly seminal plasma
"pool" of all animals was made for evaluation of total protein concentrations. It was
found an average concentration of 2.73 ± 0.31 mg / dl total protein in samples of
seminal plasma. From the quantification of total protein were prepared two-dimensional
electrophoresis gels stained SDS-PAGE with silver nitrate, with a pH gradient between
3 – 10, mesh 15% and a concentration of 100 mg of protein per sample for each month .
Gels were analyzed with the Image Master 2D Platinum 6.0. ® software. The gel
containing the most spots (555 spots) was the gel for the month of May, and the gel
with fewer spots (71 spots) was observed in January, but no effect of month on the
amount of spots was detected. The majority of spots present in seminal plasma of
rabbits have pI below 8, and these spots, about 40% have pI acid, the distribution of the
spots as a function of pI was homogeneous throughout the year. The distribution of
spots depending on the molecular weight varied widely between the months. Except the
months of February, May and November, the majority of proteins showed molecular
weight above 100 kDa. The number of spot protein positively and moderately correlated
with total protein (r = 0.57, p <0.05) and citric acid (r = 0.59, p <0.05). In silico analysis
of 1411 protein spots found compatible proteins with the Swiss-Prote database and
TrEMBL (UniProtKB). In the conditions in which this study was conducted it can be
concluded that the protein profile of rabbits has largely protein with affinity acidic and
high molecular weight, there was no influence of months of the year on the amount of
protein spots detected and the tool bioinformatics analysis does not provide consistent
results with those obtained in gel electrophoresis, but it allows an estimate of the
probable proteins that can be found.
Key-word: Proteins, silver nitrate, two-dimensional electrophoresis, bioinformatics.
54
1. INTRODUÇÃO
As proteínas do PS exercem múltiplos efeitos sobre a função espermática e
desempenham um importante papel na capacitação dos espermatozoides, traduzido por
um complexo processo que habilita a célula espermática a penetrar, através da zona
pelúcida, por meio da reação acrossômica (CALVETE et al., 1994; JONAKOVA et al,
2000).
Alguns autores descreveram que a habilidade fertilizante do espermatozoide
seria, em grande parte, determinada pelas proteínas espermáticas localizadas no
acrossoma e peça intermediária, conhecidas como fonte de enzimas metabólicas
especialmente ativas, cujas liberações em grandes quantidades podem indicar danos na
membrana plasmática do espermatozoide (BITTMAR e KOSINIAK, 1992).
As proteínas do plasma seminal são compostas principalmente por albuminas e
globulinas e pequenas quantidades de peptídeos e aminoácidos não proteícos
(KULKARNI et al., 1996). Segundo Strezek et al, (1985) em veados, a globulina é a
principal proteína em atividade durante o período reprodutivo e que o seu nível
decresce gradativamente durante o período de quiescência reprodutiva.
Segundo Okab (2007), em coelhos da raça Nova Zelândia Branca criados em
clima temperado, as concentrações de proteínas totais, albumina e globulina no plasma
seminal foram influenciadas de maneira significativa pela estação do ano. As maiores
concentrações desses metabólitos foram encontradas no verão, enquanto que na
primavera foram observadas as menores concentrações, sugerindo portanto, que a
qualidade do sêmen é melhor no verão devido ao aumento da concentração dessas
proteínas na sua composição (OKAB, 2007; STREZEK, 1985).
As proteínas do PS parecem ser importantes para manutenção da motilidade em
touros e carneiros, pela melhoria da viabilidade espermática, e por protegerem a
membrana espermática dos espermatozoides de suínos e ovinos dos danos causados
pelas baixas temperaturas de preservação (BARRIOS et al., 2000; PÉREZ-PÉ et al.,
2001). Em eqüinos, o aumento da concentração de proteínas no sêmen pouco
concentrado diminuiu a congelabilidade do mesmo (BITTMAR e KOSINIAK, 1992).
Estudos também têm demonstrado que as algumas proteínas do plasma, tipo BSP, são
55
responsáveis por promoverem o efluxo de colesterol e fosfolipídios da membrana
espermática (MOREAU e MANJUNATH, 2000), mesmo quando adicionada a
espermatozoides do epidídimo (THÈRIEN et al., 1999).
Por tudo isso, algumas proteínas presentes no plasma seminal tem sido estudadas
para serem utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, uma vez que o
sucesso do manejo reprodutivo depende da escolha de bons reprodutores, ou como
aditivos no processo de conservação e industrialização do sêmen. Há poucos relatos de
estudos nessa área em coelhos. Um conhecimento mais detalhado dessas proteínas
poderia ajudar a compreender melhor os fenômenos fisiológicos referentes à função
espermática e a fertilidade nesta espécie.
56
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Local do experimento
O experimento foi conduzido nas instalações do Setor de Cunicultura do
Departamento de Zootecnia/UFC (Fortaleza, Ceará) e as análises foram realizadas no
Laboratorio de Estudos em Reprodução Animal situado a 3°45’02” de Latitude Sul,
38°32’35” de Longitude Oeste a 15.5 m acima do nível do mar. O clima, segundo a
classificação de Koeppen, é do tipo AW, quente e úmido, suas médias térmicas são de
26 a 27 °C, com máximas de 30 °C e mínimas de 19 °C, a umidade relativa do ar é de
82 % no litoral do estado do Ceará/Brasil.
2.2. Manejo dos animais experimentais e coleta do sêmen
Vinte coelhos da raça Nova Zelândia Branco foram treinados para coleta de
sêmen usando uma vagina artificial de vidro italiana (DAL BOSCO et al., 1996) e uma
fêmea em estro foi usada como manequim. Os ejaculados foram obtidos duas vezes por
semana de cada macho durante um ano, totalizando 104 amostras de sêmen por animal.
A fração gel, quando presente, foi removida conforme recomenda o IRRG (2005).
Amostras de sêmen contendo urina foram desprezadas. Logo após a coleta, cada
ejaculado foi avaliado quanto ao volume, cor (branco, branco amarelado, branco-
perolado ou marfim) e aspecto (branco, aquoso ou cremo-leitoso). A concentração
espermática (x109sptz/mL) foi determinada por meio de câmara de Neubauer com
sêmen diluído (1:100) em tampão formol salina (IRRG, 1995). As amostras de sêmen
foram diluídas em solução fisiológica para avaliação subjetiva (microscopia óptica;
Olympus CX40) do vigor (escala de 0 a 5) e motilidade progressiva espermática (0-
100%). Em seguida, as amostras de sêmen de cada animal foram imediatamente
centrifugadas a 2.500g/20 min/+4°C. O sobrenadante (plasma seminal) foi congelado a -
18°C. Um “pool” mensal de PS de todos os animais foi feito para avaliação das
concentrações de proteínas totais.
57
2.3. Quantificação das proteínas totais
A concentração das proteínas totais nos diferentes meses foi determinada através
do método do biureto, utilizando kit industrializado da Labtest, especifico para a
quantificação de proteínas. O procedimento foi realizado com o auxilio do
espectrofotômetro, modelo BEL Photonics SP 1105®
.
As amostras foram realizadas em duplicata e a média aritmética da duplicata foi
considerada a concentração mensal de proteínas totais.
2.4. Eletroforese 2D
2.4.1. Reidratação das strips
As strips utilizadas foram de 13 cm com gradiente de pH entre 3-10. A solução
de reidratação foi adicionada uma amostra de plasma seminal, equivalendo a 100 µg de
proteínas, essa solução composta, foi colocada em contato com a strip por um período
de aproximadamente 16 h em uma bandeja de reidratação Immobiline
DryStrip
Reswelling Tray®
, mantida em temperatura ambiente.
A solução de reidratação é composta por Uréia (1,26 g), Tiuréia (0,456 g),
CHAPAS (0,06 g), IPG Buffer 3-10 (15µL), Azul de Bromofenol 1 % (~ 6 µL), H2O
mili-Q (~ 3 mL) e DTT (0,0014 g/0,5mL).
Para cada mês em analise, foram utilizadas duas strips e consequentimente
foram confeccionados e analisados dois géis por mês.
2.4.2. Focalização Isoelétrica
Após o período de reidratação as strips foram levadas ao focalizador (ETTAN TM
IPGphor IITM®
), programado para seguir a curva de focalização descrita na tabela 5.
Ao final do período de focalização (07h 25min), as strips foram levadas a um
freezer (-80°C), por um período indeterminado.
58
Tabela 5 – Curva de focalização adotada.
Passo Voltagem (V) Tempo (h:mm)
Step 500 1:30
Gradiente 1000 1:30
Gradiente 8000 3:00
Step 8000 1:25
Total - 7:25
2.4.3. Confecção do gel
A segunda dimensão da eletroforese foi realizada em gel vertical homogêneo de
poliacrilamida. Os géis foram confeccionados com malha de 15%. A solução do gel esta
na tabela 6.
Tabela 6 – Composição da solução de gel-malha 15%.
Solução A (Acrilamida + Bisacrilamida)......................................................... 43,75 mL
Acrilamida.............................................................................................. 150 g
Bisacrilamida.......................................................................................... 4 g
H2O destilada q.s.p................................................................................. 500 mL
Solução B (Tris + HCl)...................................................................................... 21,9 mL
Tris.......................................................................................................... 90,85 g
H2O destilada + HCl, ajustar o pH para.............................................. 8,8
H2O destilada q.s.p................................................................................ 500 mL
H2O destilada..................................................................................................... 20,5 mL
SDS 10%............................................................................................................. 875 µL
SDS.......................................................................................................... 1 g
H2O destilada.......................................................................................... 10 mL
Persulfato de Amônio (APS) 10%.................................................................... 394 µL
Persulfato de Amônio............................................................................ 0,1 g
H2O destilada.......................................................................................... 1 mL
TEMED............................................................................................................... 65,5 µL
Após a polimerização do gel, a cuba de eletroforese vertical foi mantida sobe
refrigeração em uma temperatura de 5° C.
59
2.4.4. Equilíbrio das strips
Antes de serem colocadas em contato com o gel as strips sofreram o processo de
equilibro dividido em dois estágios com uma solução composta por: Uréia (18,025 g),
Solução B (2,5 mL), Glicerol (17,25 mL), SDS (1 g), Azul de Bromofenol 1 % (~ 6 µL)
e H2O q.s.p. (50 mL), no primeiro estagio de 15 min a solução de equilíbrio era
adicionada a 0,1 g de DTT e no segundo estagio, também de 15 min, a solução de
equilíbrio era adicionada a 0,25 g de Iodo Acetamida.
2.4.5. Separação eletroforética das proteínas
A separação eletroforética das proteínas foi feita em cuba de eletroforese
vertical, resfriada com a adição de bolsas de gelo, mantendo uma temperatura media de
10 ° C. A cuba foi conectada a uma fonte do modelo FB3000 Fisher Scientific®
, cuja
programação de corrida esta descrita na tabela 3.
Depois de equilibradas as strips foram colocadas sobre o gel de segunda
dimensão e cobertas com uma solução de agarose: Tris (0,1515 g), Glicina (0,72 g),
SDS (0,05 g), H2O q.s.p. (50 mL), Agarose (0,25 g) e Azul de Bromofenol 1 % (~ 6
µL). O tampão de corrida utilizado foi o Tris-glicina: Tris (60,0 g), Glicina (288,2 g),
SDS (20 g) e H2O q.s.p. (2 L).
Antes da adição da solução de agarose foi adicionado 3 µL de marcador
molecular embebido em um recorte pequeno de papel filtro, na extremidade acida da
strip.
Tabela 7 – Protocolo adotado na separação eletroforética das proteínas.
Fase Voltagem
(V)
Amperagem
(mA)
Potência Tempo (h: mm)
1 300 30 10 0: 30
2 500 40 30 3: 30
3 600 70 90 4: 00
2.4.6. Coloração e revelação do gel
O protocolo seguido foi o sugerido por Blum et al., (1987), modificado. Todos
os trabalhos nesta etapa foi realizado na ausência de luz.
60
Ao final da separação eletroforética das proteínas os géis foram retirados das
placas para serem corados, as soluções foram preparadas instantes antes do uso e foram
utilizadas na seguinte sequência. Solução de Fixação (Etanol (160 mL), Ácido Acético
10% (40 mL) e H2O MILI-Q q.s.p. (400 mL)) por 16 h; Etanol 30% três vezes de
20min; H2O MILI-Q por 20 min; Solução de sensibilização (Tiossulfato de sódio (0,08
g) e H2O MILI-Q q.s.p. (400 mL)) por 1min; H2O MILI-Q três vezes de 20seg; Solução
de nitrato de prata 0,2% (Nitrato de prata (0,8 g), Formaldeído 37% (216 µL) e H2O
MILI-Q q.s.p. (400 mL)) por 20min; H2O MILI-Q três vezes de 20seg; Solução de
Revelação (Carbonato de sódio 3% (12g), Formaldeído 37% (540 µL), Tiossulfato de
sódio 0,02% (10 mL) e H2O MILI-Q q.s.p. (400 mL)) por 5min; H2O MILI-Q por
30seg; Solução de Parada (Glicina (2 g) e MILI-Q q.s.p. (400 mL)) por 5min; H2O
MILI-Q duas vezes de 10min.
2.4.7. Digitalização e leitura do gel
Os géis foram scaneados, utilizando um Image Scanner - Amersham
Biosciences®
e analisados no software Image Master 2D Platinum 6.0. ®
, para detecção
dos spots, a partir dos pesos moleculares e os pontos isoelétricos então foi realizada uma
análise in silico das possíveis proteínas nos bancos de dados UniProtKB/Swiss-Prot e
UniProtKB/TrEMBL, utilizando o programa Expasy tagldent tool®
(http://web.expasy.org/tagident/).
2.5. Analise estatística
O experimento foi conduzido entre setembro de 2009 a agosto de 2010, foram
utilizados 20 coelhos. Para análise dos dados utilizou-se o programa estatístico SAS
versão 9.1 (2003). Procedeu-se ao estudo da análise de variância utilizando-se o
procedimento ANOVA do SAS para testar o efeito do mês de coleta do sêmen sobre o
número de spots. As médias mensais foram comparadas pelo teste SNK com 5% de
probabilidade de erro.
Procedeu-se ainda ao estudo das correlações simples de Pearson utilizando a média
mensal, para observação do grau de associação, entre número de spots e parâmetros
61
bioquímicos de coelhos. Para verificar o ponto isoelétrico e peso molecular dos spots
protéicos foram utilizados gráficos com as distribuições de freqüência.
62
3. RESULTADOS
Foi verificado uma concentração média de 2,73 ±0,31 µg/dl de proteínas totais
nas amostras de plasma seminal. A partir desse valor foi calculada a quantidade de
amostra a ser colocada para reidratação das strips (tiras) de modo que cada uma
contivesse 100µg de proteínas na amostra. A quantidade média de amostra de plasma
seminal por tira ficou em torno de 5,31 µL.
O gel que continha a maior expressão (555 spots) foi o do mês de maio, e o gel
com menor expressão (71 spots) foi verificado em janeiro, houve efeito do mês sobre a
quantidade de spots detectados. Os resultados da frequência mensal dos spots protéicos
em função do pI e do peso molecular estão expressos nas figuras 1 e 2.
Pode-se perceber que houve uma repetição de 84,75% ±4,41 dos spots avaliados.
A maioria dos spots presentes no plasma seminal de coelhos tem pI abaixo de 8
e, destes spots, cerca de 40% tem pI ácido (figura 1), essa distribuição foi homogênea ao
longo dos meses.
Figura 1 – Distribuição de frequência mensal dos spots em função do ponto isoelétrico.
63
A distribuição dos spots em função do peso molecular variou amplamente entre
os meses (figura 2). Com exceção dos meses de fevereiro, maio e novembro, a maioria
das proteínas apresentaram peso molecular acima de 100kDa.
Figura 2 – Distribuição de frequência mensal dos spots em função do peso molecular.
O gel na figura 3 ilustra o perfil protéico do plasma seminal de coelhos Nova
Zelândia Brancos. Nesse gel foram detectados 335 spots e aqueles com maior
intensidade foram observados em ponto isoelétrico ácido. Um grupo de 8 spots de 83.5
a 91,7 kDa e pI de 4,2 a 4,89 apresenta quase 26% do total de intensidade dos spots
(caixa 1), enquanto outro grupo de 20 spots de 27 a 46,5 kDa e pI de 5,3 a 8,5
corresponde a 37,3% do total de intensidade (caixa 2). Na caixa 3verifica-se um spot de
105,4 kDa com pI 4,78 que corresponde a 5% do total de intensidade dos spots. Esse
padrão foi verificado nos demais géis analisados.
O número de spot protéicos correlacionam-se moderada e positivamente com as
proteínas totais (r=0,57; p<0,05) e com o ácido cítrico (r=0,59; p<0,05).
64
Figura 3 – Mapa eletroforético (2D – SDS PAGE) do plasma seminal de coelhos.
Quando foram realizadas as análises in silico dos spots no software Expasy
tagldent tool utilizando como base de busca o peso molecular (KDa) e os pontos
isoelétricos (pI) de cada spot nos bancos de dados Swiss-Prote TrEMBL, foram
encontradas 1.411 proteínas compatíveis com os bancos de dados. Dentre estas
proteínas estão, provavelmente, as apolipoproteínas AI e C4, glutationas, Acidic
Seminal Fluid Protein (aSFP), anidrase carbônica que estavam presentes em quase todos
os géis e parecem ter função importante no plasma seminal de coelhos.
65
4. DISCUSSÃO
A gama de pH mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas, mas
como pouco se sabe do perfil protéico de coelhos utilizou-se um intervalo de pH maior.
A maior parte dos spots verificados na eletroforese bidimensional apresentava um perfil
ácido. Verificou-se nesse estudo correlação do número de spots com a concentração de
ácido cítrico. Pesquisa anterior mostrou que o pH do sêmen está fortemente
correlacionado com a presença de ácido cítrico, de forma que quanto maior a sua
concentração no plasma seminal menor se torna o pH (KAVANAGH, 1985). A maior
parte do ácido cítrico e das proteínas do plasma seminal é produzida e secretada pelas
glândulas vesiculares (HUMPHREY e MANN, 1949) e está associado com a
maturidade sexual (STRATTON et al., 1973). Também é aceito que o ácido cítrico pode
estar envolvido com o fenômeno de gelificação, coagulação e subsequente liquefação
que normalmente ocorre no sêmen de certas espécies (HUGGINS e NEAL, 1942;
HUMPHREY e MANN, 1949; MANN, 1964).
Grande parte das proteínas detectadas no gel de eletroforese possuía alto peso
molecular. O perfil protéico do plasma seminal de coelhos, quando comparado a de
outros mamíferos, mostra um padrão similar de distribuição de spots, mas o peso
molecular desses spots são mais altos quando comparados aos de bovinos
(MANJUNATH et al., 1993), homem (STARITA-GERIBALDI et al., 2001) e carneiro
(BERGERON et al., 2005).
Verificou-se que houve influência dos meses do ano na quantidade de spots
protéicos. Segundo Souza et al. (2009) fatores como pluviosidade pode afetar o
conteúdo protéico do sêmen de caprinos. Entretanto, Catunda et al. (2012) não
observaram diferenças na quantidade de proteínas no sêmen de caprinos quando
comparou a época seca com a chuvosa. O proteoma reflete o conjunto de proteínas
produzidas por uma célula em um determinado momento ou estado fisiológico do
organismo, sendo assim, pode haver modificações em diferentes situações.
Poucos estudos foram utilizados para caracterizar as proteínas do plasma
seminal dos coelhos, especialmente no que se refere a análise proteômica. A análise in
silico foi realizada no intuito de predizer as proteínas detectadas em gel de eletroforese.
Essa análise leva em consideração o ponto isoelétrico e o peso molecular dos spots no
66
gel, em relação ao organismo de interesse. Ao selecionar um spot o programa busca na
base de dados proteínas já identificadas que estejam próximos aquele pI ou peso
molecular, oferecendo, muitas vezes, diversas opções de proteínas, devendo-se,
portanto, selecionar aquelas mais próximas do spot de interesse. Mesmo assim,
observou-se dados discrepantes daqueles obtidos pela eletroforese, como por exemplo
uma grande quantidade de prováveis proteínas de baixo peso molecular. Pelo programa
a proteína de maior peso molecular tem em torno de 70 KDa, enquanto pela análise do
gel observou-se que a maior parte das proteínas tem mais de 100 KDa. Acredita-se que
os escassos dados sobre proteômica de coelhos tenha contribuído para isso, uma vez que
os dados acessados possam equivaler não à espécie em questão, mas aos mamíferos em
geral, já que grande parte dos estudos sobre proteínas do plasma seminal é relacionada
com espécies de mamíferos domésticos como bovinos, suínos e ovinos ou com o
homem (PILCH e MANN, 2006).
Foram obtidas muitas proteínas em cada gel analisado. Percebeu-se proteínas
relacionadas ao processo de capacitação de espermatozoides, a mecanismos de proteção
da membrana plasmática, na prevenção do stress oxidativo e do ataque imunológico (
albumina, aSFP, clusterinas, chaperonas e outras), a reação acrossômica e interação
oócito-espermatozoide (fosfolipase A2 e osteopotina, por exemplo), associadas com a
interação e modulação de componentes da matriz extracelular (clusterinas, catepsinas e
metaloproteinases)e com a motilidade espermática. Dentre tantas, destacam-se as
apolipoproteínas AI e C4, glutationas, a proteína ácida do fluido seminal (aSFP)
eanidrase carbônica que foram verificadas em quase todos os géis analisados e já são
amplamente estudadas como componentes importantes do plasma seminal. É provável
que inúmeras outras proteínas relatadas tenham papel importante nos processos
reprodutivos de coelhos, mas tenham sido acessadas com nomenclatura diferente. Seria
realmente mais precisa a análise dos spots por espectrometria de massa para a
identificação confiável das proteínas e, em seguida, a utilização de ferramentas de
bioinformática para validação, busca de estrutura e função dessa proteína.
As Glutationas S-transferases, por exemplo, observadas em quase todos os géis,
são um grupo de proteínas do plasma seminal que desempenham um papel protetor
contra os danos espermáticos provocados pelo estresse oxidativo, visto que sua presença
no sêmen resulta em melhores taxas de concentração, motilidade e morfologia
67
espermáticas, dessa forma, aumentando a capacidade fertilizante do sêmen (ALVAREZ
e STOREY, 1989; RAIJMAKERS et al., 2003; CHABORY et al., 2010). A glutationa é
um reservatório natural de poder redutor, o qual pode ser usado rapidamente pelas
células como uma defesa contra o estresse oxidativo (LUBERDA, 2005). Desse modo,
baixa capacidade defensiva do sêmen tem sido implicada como fator promotor de
infertilidade (STOREY, 1997). Além disso, em situação de estresse, a diminuição de
glutationa seminal reduz significativamente a qualidade do sêmen (ESKIOCAK et al.,
2005). Segundo Attia e Kamel (2012), o aumento de glutationa (glutathione peroxidase;
superoxide dismutase; glutathione S-transferase) no sêmen de coelhos resultou em
melhora significativa da qualidade seminal.
As apolipoproteinas também são conhecidas como clusterinas, e também foram
encontradas no plasma seminal de coelhos. Elas são responsáveis por controlar o
metabolismo de lipoproteínas em tecidos e células. Diversos tipos dessas proteínas tem
sido citados, as principais são apoE, apoB, apoA-I, apoA-II, apoA-IV, apoC-I, apoC-II,
e apoC-Ill (MAHLEY et al., 1984). O presente estudo sugere a presença de ApoA-I e
ApoC IV. A ApoA-I está associada a imunoglobulinas formando o complexo sperm
activating protein (SPAP), que ativam a motilidade espermática durante sua viagem
através do aparelho reprodutor feminino (LEIJONHUFVUD et al., 1997). Estudo
realizado em bovinos afirmaram que a ApoA-I presente nas lipoproteínas de alta
densidade contribuem para induzir o processo de capacitação espermática, em especial a
reação acrossômica (MANJUMATH et al., 1989; THERIEN et al., 1997).
A proteína ácida do fluído seminal bovino (aSFP) foi relacionadas à alta
congelabilidade do sêmen (JOBIM et al., 2009). Em touros, esta proteína é secretada
pelas vesículas seminais (EINSPANIER et al., 1991 e WEMPE et al., 1992), ampolas e
epidídimo (WEMPE et al., 1992). A aSFP também foi detectada em outros animais
como caprinos, ovinos, suínos, ratos, cães e humanos (EINSPANIER et al., 1994;
WENPE et al., 1992). Dostalova et al., (1994) verificaram que a aSFP liga-se somente à
superfície do espermatozoide ejaculado, porém, para que ocorra a fertilização in vitro, é
necessário a liberação desta proteína da membrana espermática. Este fato sugere que a
aSFP não atua como molécula de ligação à zona pelúcida e sim como fator
decapacitante do espermatozoide, desta forma, não possuindo papel na interação de
gametas. Schöneck et al., (1996) sugeriram que a aSFP pode ser responsável pela
68
preservação da membrana do espermatozoide, possuindo um efeito antioxidativo na
peroxidação lipídica da membrana da célula espermática in vitro. O peróxido é
produzido e liberado pelas membranas das células mortas, em detrimento dos
espermatozoides vivos (SHANNON, 1978). Conseqüentemente, a presença da aSFP,
quantitativamente superior nos reprodutores de alta congelabilidade do sêmen, pode
explicar o poder de preservação da membrana do espermatozoide contra a peroxidação
(JOBIM et al., 2004).
Outra proteína que foi objeto de estudo foi anidrase carbônica. Porém, o papel
fisiológico desta enzima, em suas diferentes isoformas, ainda não está completamente
esclarecido. Estudos histoquímicos demonstraram a atividade da anidrase carbônica em
testículos, ductos eferentes, epidídimo, canal deferente, vesícula seminal e próstata em
algumas espécies, como ratos (COHEN et al., 1976; WALDEYER e HÄUSLER, 1959),
touros (GOYAL et al.,1980), javali (EKSTEDT et al., 1991; RODRIGUEZ-
MARTINEZ et al.,1990) e coelhos (EKSTEDT e RIDDERSTÅLE, 1992). A anidrase
carbônica foi aparentemente relacionada com a secreção do plasma seminal, uma vez
que, a injeção de inibidor especifico, a acetazolamida, causou uma diminuição na
secreção de fluido testicular. Harris e Goto (1984), utilizando diferentes doses de
acetazolamida em frangos de corte, encontraram correlação positiva significativa entre a
concentração de anidrase carbônica e a atividade dos testículos e ducto deferente,
volume total de sêmen, concentração espermática e o volume de plasma seminal
produzido. Setchell e Brown (1972) encontraram resultados semelhantes em ratos. Isto
enfatiza que as alterações no equilíbrio ácido-base exerce influência sobre a função
reprodutiva do macho. Por estar envolvida no metabolismo do CO2, a anidrase
carbônica apresenta influencia indireta na maturação, transporte ou motilidade dos
espermatozoides de frangos (HARRIS e GOTO, 1984).
Percebe-se, portanto a importância do estudo de proteínas do plasma seminal
para entender diversos aspectos do processo reprodutivo de machos e esse
conhecimento pode implicar na melhoria da fertilidade de um plantel e no incremento
das biotecnias da reprodução.
69
5. CONCLUSÃO
Nas condições em que esse estudo foi desenvolvido pode-se concluir que o perfil
protéico de coelhos apresenta grande parte das proteínas com afinidade a meio ácido e
com alto peso molecular e a ferramenta de análise bioinformática (Expasy tagldent
tool®
) não oferece resultados coerentes com os obtidos em gel de eletroforese, mas
permite uma estimativa das prováveis proteínas que podem ser encontradas.
70
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Espera-se a identificação das proteínas pela espectrometria de massa e a
validação das estimativas realizadas pela plataforma Expasy. A partir daí seria possível
orientar os estudos sobre proteínas do plasma seminal de coelhos que pudessem
futuramente auxiliar na obtenção de marcadores de fertilidade em machos cunícolas e
de melhores resultados na criopreservação do sêmen.
71
REFERÊNCIAS
ALVAREZ, J. G.; STOREY, B. T. Role of glutathione peroxidase in protecting
mammalian spermatozoa from loss of motility caused by spontaneous lipid
peroxidation. Journal: Gamete Research , vol. 23, no. 1, pp. 77-90, 1989.
BARRIOS, B.; PÉREZ-PÉ, R.; GALLEGO, M. et al. Seminal Plasma Proteins Revert
the Cold-Shock Damage on Ram Sperm Membrane. Biology of Reproduction, v.63, p.
1531-1537, 2000.
BERGERON, A.; VILLEMURE, M.; LAZURE, C. et al. Isolation and characterization
of the major proteins of ram seminal plasma. Molecular Reproduction and
Development, v.71, p.461-470, 2005. Disponível em:
<http://www3.interscience.wiley.com/journal/110494312/abstract?CRETRY=1eSRETR
Y=0>. Acesso em: 20. Ago. 2013.
BITTMAR, A.; KOSINIAK, K. The role of selected biochemical components of equine
seminal plasma in determining suitability for deep-freezing. Archivum Veterinarium
Polonicum, Wroclaw Norwida, v. 32, p. 17-28, 1992.
BLUM, H.; BEIER, H.; GROSS, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA
and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis (1987) 8, 93-99.
CALVETE, J. J.; NESSAU, S.; MANN, K. et al. Isolation and biochemical
characterization of stallion seminal plasma proteins. Reproduction Domestic Animal,
Berlim, v. 29, p. 411-426, 1994.
CATUNDA, A. G. V.; AGUIAR, G. V.; LIMA, I. C. C. et al. Characterization of
ejaculates from crossbreed male goats raised in tropical environment. Revista
Portuguesa de Ciências Veterinárias, (2011) 110 (577-580) 59-67.
CHABORY, E.; DAMON, C.; LENOIR, A. et al. Mammalian glutathione peroxidases
control acquisition and maintenance of spermatozoa integrity. Journal of Animal
Science, 88:1321–1331, 2010.
72
COHEN, J. P.; HOFFER, A. P.; ROSEN, S. Carbonic anhydrase localization in the
epididymis and testis of the rat: histochemical and biochemical analysis. Biology of
Reproduction, (1976)14:339-346.
DAL BOSCO, A.; SCUOTA, S.; CASTELLINI, C. et al. Study of an artificial vagina to
reduce the microbial contamination of rabbit semen. World Rabbit Science, 1996, 4-
201-204.
DOSTALOVA, Z.; CALVETE, J. J.; SANZ, L. et al. Immunolocalization and
quantitation of acidic seminal fluid protein(aSFP) in ejaculated, swim-up, and capacited
bull spermatozoa. Biological chemistry Hoppe-Seyler, v.375, p.457-461, 1994.
EINSPANIER, R.; EINSPANIER, A.; WEMPE, F. et al. Characterization of a new
bioactive protein from bovine seminal fluid. Biochemical and Biophysical Research
Communications, v.179, p.1006-1010, 1991.
EINSPANIER, R.; KRAUSE, L.; CALVETE, J. J. et al. Bovine seminal plasma aSFP:
localization of disulfide bridges and detection of three different isoelectric forms. FEBS
Letters, v.344, p.61-64, 1994.
EKSTEDT, E.; RIDDERSTRÅLE, Y.; PLÖEN, L. Histochemical localization of
carbonic anhydrase in the testis and epididymis of the boar. Acta Anatomica, (1991)
141:257-261.
ESKIOCAK, S.; GOZEN, A. S.; YAPAR, S. B. et al. Glutathione and free sulphydryl
content of seminal plasma in healthy medical students during and after exam stress.
Human Reproduction Vol.20, No.9 pp. 2595–2600, 2005.
GOYAL, H. O.; FERGUSON, J. G.; HRUDKA, F. Histochemical activity of carbonic
anhydrase in testicular and excurrent ducts of immature, mature intact and androgen-
deprived bulls. Biology of Reproduction, (1980) 22:991-997.
HARRIS, G. C.; GOTO Jr, K. Carbonic anhydrase activity of the reproductive tract
tissues of aged male fowls and its relationship to semen production. Journal of
reproduction and fertility, (1984) 70, 25 – 30.
HUGGINS, C.; NEAL, W. Coagulation and liquefaction of semen : proteolytic enzymes
and citrate in prostatic fluid. The Journal of Experimental Medicine. 1942 Dec 1; 76
(6) : 527-41.
73
HUMPHREY, G. F.; MANN, T. Studies on the Metabolism of Semen 5. CITRIC ACID
IN SEMEN. Biochemistry, 1949, v. 44, p. 7-15.
IRRG – INTERNACIONAL RABBIT REPRODUCTION GROUP. Guidelines for the
handling of rabbit bucks and semen. World Rabbit Science, v. 13, p. 71 – 91, 2005.
JOBIM M. I. M.; GREGORY, R. M.; MATTOS, R. C. Proteínas do plasma seminal
relacionadas a congelabilidade do sêmen bovino. Revista Brasileira de Reprodução
Animal, Supl, Belo Horizonte, n.6, p.25-31, dez. 2009.
JOBIM, M. I. M.; OBERST, E. R.; SALBEGO, C. G. et al. Two-dimensional
polyacrylamide gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their relation
with semen freezability. Theriogenology, v.61, p.255-266, 2004.
JONAKOVA, V.; MANASKOVA, P.; KRAUS, M. et al. Sperm Surfece Proteins in
Mammalian Fertilization. Molecular Reproduction and Development, Praga, v. 56, p.
275-277. 2000.
KAMEL, K. I.; ATTIA, Y. A. Effect of dietary lecithin supplementation on
improvement semen quality, reproductive performance plasma biochemical traits and
antioxidant changes in rabbit bucks. Egyptian Poultry Science, v. 31, p. 667-680,
2011.
KAVANAGH, J. P. Sodium, potassium, calcium, magnesium, zinc, citrate and chloride
content of human prostatic and seminal fluid. Journal of reproduction and fertility,
(1985) 75, 35-41.
KULKARNI, B. A.; DHANDES, S. G.; PATANKAR, D.D. Seminal plasma protein
profiles of Murrah and Surti buffalo bulls. In: Indian Journal of Animal Science, v.
66, p. 900 – 903, 1996.
LEIJONHUFVUD, P.; ÅKERLOF, E.; POUSETTE, Å. Structure of sperm activating
protein. Molecular Human Reproduction, v.3 n.3 pp. 249–253, 1997.
LUBERDA, Z. The role of glutathione in mammalian gametes. Reproductive Biology,
v. 5, n.1, p. 5-17, 2005.
MAHLEY, R. W.; THOMAS, L.; INNERARITY, S. C. et al. Plasma lipoproteins:
apolipoprotein structure and function. Journal of Lipid Research, Volume 25, p. 1277
– 1294, 1984.
74
MANJUMATH, P.; MARCEL, Y. L.; UMA, J. et al. Apolipoprotein A-I Binds to a
Family of Bovine Seminal Plasma Protein. The Journal of Biological Chemistry. v,
264, n. 28, p. 16853-16857,1989.
MANJUNATH, P. CHANDONNET, L. LEBLOND, E. Major Proteins of Bovine
Seminal Vesicles Bind to Spermatozoa. Biology of Reproduction, 49, 27-37 (1993).
MANN, T. The Biochemistry of semen and of the male reproductive tract. London:
Methuen and Co., 1964, 493p.
MOREAU, R.; MANJUNATH, P. Characteristics of the cholesterol eflux induced by
novel seminal phospholipid-binding proteins. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1487,
p. 24-32, 2000.
OKAB, A. B. Semen characteristics and plasma testosterone of New-Zealand male
rabbits as affected by environmental temperatures. Slovak. Journal of Animal Science,
v. 40, p. 161 – 167, 2007.
PÉREZ-PÉ, R.; CÉBRIAN-PÉREZ, J. A.; MUIÑO-BLANCO, T. Semen plasma
proteins prevent cold-shock membrane damage to ram spermatozoa. Theriogenology,
v.56, p.425-434, 2001.
PILCH, B.; MANN, M. Large-scale and high-confidence proteomic analysis of human
seminal plasma. Genome Biology, 7, 1-10, 2006.
RAIJMAKERS, M. T.; ROELOFS, H. M.; STEEGERS, E. A. et al Glutathione and
glutathione S-transferases A1-1 and P1-1 in seminal plasma may play a role in
protecting against oxidative damage to spermatozoa. Fertility and Sterility, Vol. 79,
No. 1, January 2003.
RODRIGUEZ-MARTINEZ, H.; EKSTEDT, E.; EINARSSON, S. Acidification of
epididymal fluid in the boar. International Journal of Andrology (1990)13:238-243.
SCHÖNECK, C.; BRAUN, J.; EINSPANIER, R. Sperm viability is influenced in vitro
by the bovine seminal protein a SFP: effects on motility, mitochonrial activity and lipid
peroxidation. Theriogenology, v.45, p.633-642, 1996.
SETCHELL, B. P.; BROWN, B. W. The effect of metabolic alkalosis, hypotension and
inhibitors of carbonic anhydrase on fluid secretion of rat testis. Journal of
reproduction and fertility, IS, 235-240, 1972.
75
SHANNON, P. Factors affecting semen preservation and conception rates in cattle.
Journal of reproduction and fertility, v.54, p.519-527, 1978.
SOUZA, A. F.; LEITÃO, M. C. G.; BATISTA, A. M. et al. Proteínas do plasma
seminal de caprinos relacionadas com o índice pluviométrico e a qualidade do
sêmen. Ciência Rural [online]. 2009, vol.39, n.4, pp. 1155-1161. Epub Mar 27, 2009.
ISSN 0103-8478.
STARITA-GERIBALDI, M.; POGGIOLI, S.; ZUCCHINI, M. et al. Mapping of
seminal plasma proteins by two-dimensional gel electrophoresis in men with normal
and impaired spermatogenesis. Molecular Human Reproduction, v. 7, n.8, p. 715-
722, Aug. 2001.
STOREY, B. T. Biochemistry of the induction and prevention of lipoperoxidative
damage in human spermatozoa. Molecular Human Reproduction, vol.3 no.3 pp. 203–
213, 1997.
STRATTON, L. G.; EWING, L. L.; DESJARDINS, C. Efficacy of testosterone-filled
polydimethyl-siloxane implants in maintaining plasma testosterone in rabbits. Journal
of reproduction and fertility, (1973) 35, 235.
STREZEK, J.; KRZYWINSKI, A.; SWIDOWICKS, K. Seasonal changes in the
chemical composition of red deer (Cerous elaphus) semen. In: Animal Reproduction
Science, vol. 9, p. 195 – 204, 1985.
THERIEN, I.; MOREAU, R.; MANJUNATH, P. Bovine Seminal Plasma Phospholipid-
Binding Proteins Stimulate Phospholipid Efflux from Epididymal Sperm. Biology of
Reproduction, v. 61, p. 590-598, 1999.
THÉRIEN, I.; SOUBEYRAND, S.; MANJUNATH, P. Major proteins of bovine
seminal plasma modulate sperm capacitation by high-density lipoprotein. Biology of
Reproduction, v. 57, p. 1080-1088, 1997.
WALDEYER, A. e HÄUSLER, G. Histochemical studies of the carbonic anhydrase
activity of vas deferens and its accessory glands in the Mus Rattus. Acta
biologica et medica Germanica, (1959) 2:568-589.
76
WEMPE, F.; EINSPANIER, R.; SCHEIT, K. H. Characterization by cDNA cloning of
the mRNA of a new growth factor from bovine seminal plasma: acidic seminal protein.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v.183, p.232-237, 1992.
