UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ INSTITUTO DE … · primeiro lugar acreditou em minha pessoa e aceitou-me no LAMAP ainda sem ... pontos de mar adjacentes a cada ... água do mar adjacente

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS

MARINA TERESA TORRES RODRÍGUEZ

Streptococcus E Enterococcus ISOLADOS DE ÁGUAS MARINHAS E DE

GALERIAS PLUVIAIS NA COSTA DE FORTALEZA - PERFIL DE

RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS

FORTALEZA

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca Rui Simões de Menezes

R614s Rodriguez, Marina Teresa Torres.

Streptococcus e Enterococcus isolados de águas marinhas e de galerias pluviais na

costa de Fortaleza: perfil de resistência a antibióticos / Marina Teresa Torres Rodriguez. –

2015.

143f.: il. color., enc. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Instituto de Ciências do Mar,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais, Fortaleza, 2015.

Área de Concentração: Utilização e Manejo de Ecossistemas Marinhos e Estuarinos.

Orientação: Profª. Drª. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira.

Co-Orientação: Profª. Drª. Oscarina Viana de Sousa.

1. Streptococcus. 2. Ambientes Aquáticos - Contaminação. I. Título.

CDD 579.355


Streptococcus E Enterococcus ISOLADOS DE ÁGUAS MARINHAS E DE



Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Marinhas Tropicais da

Universidade Federal do Ceará como

requisito parcial para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Marinhas Tropicais. Área de

concentração: Utilização e manejo

de ecossistemas marinhos e

estuarinos

Orientadora: Profa. Dra. Regine

Helena Silva dos Fernandes Vieira

Co-Orientadora: Profa. Dra. Oscarina

Viana de Sousa

FORTALEZA

2015


Streptococcus e Enterococcus ISOLADOS DE ÁGUAS MARINHAS E DE



Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Marinhas Tropicais, da

Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial para a

obtenção do Título de Doutor em

Ciências Marinhas Tropicais. Área de

concentração: Utilização e manejo

de ecossistemas marinhos e

estuarinos

Aprovada em ___/___/___

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira (Orientadora) Universidade Federal do Ceará (UFC)

________________________________________ Profa. Dra. Leda Cristina Santana Mendonça

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

______________________________________

Profa. Dra. Suzana Claudia Silveira Martins

Universidade Federal do Ceará (UFC)

________________________________________

Prof. Dr. Rodrigo Maggioni Universidade Federal do Ceará (UFC)

________________________________ Profa. Dra. Kamila Vieira Mendonça

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Dedicatória

A meus grandes amores:

Minha mãe e minha avó

Meu esposo e minha filha.

Obrigada a todos por ser o motor

que me ajuda a continuar lutando

pela vida.

Agradecimentos

À minha orientadora Profa Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira que em

primeiro lugar acreditou em minha pessoa e aceitou-me no LAMAP ainda sem

me conhecer. Exemplo de profissional e pesquisadora. Obrigada pelo seu

apoio, ajuda, confiança e compreensão.

À minha co-orientadora Profa Oscarina Viana de Sousa, exemplo de

pesquisadora e professora. Obrigada por me brindar com todos seus

conhecimentos nos momentos certos. Exemplo de paciência e dedicação.

Obrigada por me permitir contar com sua ajuda, carinho e amizade.

À minha amiga Cristiane Teles de Carvalho pela sua amizade, apoio e carinho

e por estar presente em todo momento que eu precisei. Obrigada Cris!!!

À minha amiga Gleire Rodrigues por todo seu apoio, amizade, compreensão,

incentivo e conhecimentos no trabalho que tem sido de muita ajuda e alívio

para minha alma. Obrigada mesmo.

Ao meu amigo Daniel Rodrigues, obrigada pela sua amizade, ajuda e apoio no

desenvolvimento do meu trabalho.

À Rosa Rebouças, obrigada por sua amizade, apoio e carinho.

À Edirsana Carvalho, obrigada pela ajuda, por me ensinar e apoiar nos

primeiros passos no desenvolvimento do meu trabalho no LAMAP.

A todos os integrantes do LAMAP, que deles também tive o apoio,

conhecimentos, compreensão e carinho. Obrigada.

Muito obrigada ao LABOMAR por me permitir cursar a pós graduação.

Aos meus grandes amigos que ainda de longe fortalecem minha alma. Aos

meus ʺAngeles brasileirosʺ, obrigada pela cumplicidade e carinho. Aos meus

ʺAngeles cubanosʺ, obrigada por sua existência.

A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização desta

pesquisa.

Resumo

O termo estreptococos fecais abrange bactérias dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus com diferentes significado sanitário e características de

sobrevivência. Enterococcus tem sido sugerido como indicador de

contaminação fecal em águas marinhas já que numerosos estudos relacionam

a exposição a águas com a presença dessas bactérias, a ocorrência de

doenças e a infecções em humanos. O aumento dessas bactérias em

ambientes aquáticos resistentes a antimicrobianos, resultado do amplo

emprego dessas substâncias na terapêutica humana e veterinária, é motivo de

preocupação. O objetivo desta pesquisa foi quantificar e identificar bactérias

contaminantes dos gêneros Streptococcus e Enterococcus em duas galerias

pluviais (Galeria Riacho Maceió-G1 e Galeria frente à praia do Meireles-G2) e

pontos de mar adjacentes a cada galeria (P1 e P2) na orla da cidade de

Fortaleza estabelecendo padrões de resistência a antimicrobianos. Foram

realizadas cinco coletas contínuas com periodicidade semanal nos quatro

pontos selecionados. Os valores das Contagens Padrão em Placas variaram

de ≤10 na galeria G2 a 192 x 102 UFC /100 mL na galeria G1 e para os pontos

de água de mar de 1x 102 em P2 a 94 x 102 UFC/ 100 mL em P1. Uma vez

realizadas as provas bioquímicas, 192 estirpes (86,45%) foram identificadas

como pertencentes ao gênero Enterococcus e 26 (13,54%) ao gênero

Streptococcus. Seis espécies de Enterococcus foram identificadas, sendo E.

faecium a espécie de maior frequência. Foi observada alta resistência (˃ 50%)

a ceftriaxone, clindamicina, cefotaxime e estreptomicina. A resistência

antimicrobiana (36 perfis) foi observada em 96,15% das cepas testadas. De

156 cepas testadas no antibiograma, 137 (87,88%) apresentaram

multirresistência (29 perfis). O maior valor de IRA (0,05) foi apresentado pelos

isolados de galeria. O índice MRA ≥ 0,2 foi encontrado em 131/150 cepas

resistentes (87,33%). Resistência associada a genes cromossômicos ou

indicativa de possível transferência plasmidial foi verificada nos isolados após

cura plasmidial. Alta diversidade genética dos isolados multirresistentes

analisados confirmou a necessidade da abordagem polifásica na identificação

de espécies ambientais.

Palavras-chave: Indicadores. Multirresistência. Ambientes aquáticos. Box-PCR.

Abstract

The term of faecal streptococci are represented by bacteria from Streptococcus

and Enterococcus genera with different sanitary significance and survival

characteristics. Enterococcus genera have been suggested as indicators of

fecal contamination in marine waters since numerous studies related to water

exposure with the presence of these bacteria and the occurrence of

gastrointestinal diseases and acute febrile respiratory illness. A motive to

concern in relation to the increase of the population of these bacteria in aquatic

environments resistant to antimicrobials resulting mainly from the widespread

use of these substances in human and veterinary therapy. The aim of this

research was to quantify and identify contaminating bacteria of the genera

Streptococcus e Enterococcus in water of two storm sewers (Riacho Maceió

gallery-G1 and the Gallery in front to Meireles beach-G2) and points of

adjacent sea to every gallery (P1 and P2) on the edge of the Fortaleza city,

establishing antimicrobial resistance patterns. There were 5 continuous

collections with a weekly periodicity in the four selected points. The values of

the standard plate counts ranged from ≤10 in G2 gallery to 192 x 102 UFC /100

mL in G1 gallery and the sea water points from ≤10 in P2 to 94 x 102 UFC/ 100

mL in P1. Once carried out the biochemical tests, 192 strains (86.45%) were

identified as belonging to the genus Enterococcus and 26 strains (13.54%) to

the genus Streptococcus. Six Enterococcus species were identified and E.

faecium was the higher frequency. It showed high resistance (˃ 50%) to

ceftriaxone, clindamycin, cefotaxime and streptomycin. Antimicrobial resistance

(36 profiles) was observed in 96.15% of the strains. Of the 156 strains tested in

antibiotic susceptibility test, 137 (87.88%) showed multidrug resistance (29

multidrug resistance profiles). The highest IRA value (0.05) was presented by

the gallery isolates. The MRA index ≥ 0.2 was found in 131/150 resistant strains

(87.33%). Resistance associated with chromosomal genes or indicative of

possible plasmid transfer was verified in isolated after plasmid cure. High

genetic diversity from multidrug resistant analyzed isolates confirmed the

necessity to polyphasic approach in order to identify environmental strains.

Key words: Indicators. Multidrug resistance. Aquatic environments. Box-PCR

Lista de ilustrações

Figura 1- Localização geográfica das galerias (G1 e G2) e dos

pontos de água do mar (P1 e P2) na cidade de Fortaleza-

CE.....................................................................................

63

Figura 2 - Fluxograma dos procedimentos para a quantificação de

Streptococcus e Enterococcus nas galerias G1 e G2 e

nos pontos de mar P1 e P2, em Fortaleza,

Ceará.................................................................................

65

Figura 3 - Caracterização fenotípica de bactérias dos gêneros

Streptococcus e Enterococcus baseada na fermentação

de carboidratos: manitol, sorbitol, arabinose, rafinose,

sacarose e lactose. (Fonte: LAMAP)................................

67

Figura 4 - Caracterização fenotípica de bactérias dos gêneros

Streptococcus e Enterococcus baseada na

descarboxilação da arginina. (Fonte: LAMAP)..................

68

Figura 5 - Prova de produção de pigmento amarelo para a

identificação de espécies de Enterococcus. (Fonte:

CONCEIÇÃO, 2008).........................................................

69

Figura 6 - Hemólises α, β ou Ƴ observadas em ágar sangue para a

identificação de espécies dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus.

(Fonte:https://www.google.com.co/search?q=hemolises&

biw=1366&bih=608&source=lnms&tbm=isch&sa=X&sqi=

2&ved=0CAYQ_AUoAWoVChMIvamWuoblxgIVzGk-

Ch0KLA_H).....................................................................

70

Figura 7 - Teste de produção da enzima pirrolidonil arilamidase

(PYR) para a identificação fenotípica de espécies dos

gêneros Streptococcus e Enterococcus. (Fonte:

LAMAP)............................................................................

71

Figura 8 - Teste de motilidade para a identificação fenotípica de

espécies dos gêneros Streptococcus e Enterococcus.

(Fonte: LAMAP)..................................................................

72

Figura 9 - Fluxograma da técnica do antibiograma realizado com os

isolados das amostras de água das galerias (G1 e G2) e

de água do mar (P1 e P2), em Fortaleza,

Ceará..................................................................................

73

Figura 10 - Fluxograma do procedimento de cura plasmidial,

realizado com os isolados de Enterococcus sp. e

Streptococcus sp. das amostras de água das galerias

(G1 e G2) e do mar (P1 e P2) em Fortaleza, Ceará...........

75

Figura 11 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das

contagens no maior valor contável para cada ponto de

coleta: galerias (G1 e G2) e pontos de água do mar (P1 e

P2) com e sem o emprego de caldo Todd-Hewitt, em

Fortaleza, Ceará................................................................

82

Figura 12 - Espécies identificadas nos isolados das amostras de

água das galerias (G1 e G2) e nos pontos de mar (P1 e

P2) analisados, em Fortaleza, Ceará................................

84

Figura 13 - Porcentagem de espécies de Streptococcus e

Enterococcus isoladas em cada tipo de amostra

analisada: galerias (G1 e G2) e pontos de água do mar

adjacentes (P1 e P2), em Fortaleza, Ceará.......................

85

Figura 14 - Percentual de suscetibilidade/resistência a diferentes

antimicrobianos de 156 cepas de Streptococcus e

Enterococcus isoladas das amostras de água das

galerias (G1 e G2) e nos pontos de mar (P1 e P2)

analisados, em Fortaleza, Ceará.......................................

88

Figura 15- Perfil de similaridade de cepas Streptococcus e

Enterococcus cepas de água de galerias e de ponto de

mar adjacente na cidade de Fortaleza-Ceará, baseado na

presença e ausência de bandas no gel de Box-

PCR....................................................................................

103

Figura 16- Avaliação do poder discriminatório das provas

bioquímicas nos isolados de Streptococcus e

Enterococcus analisados....................................................

105

Lista de tabelas

Tabela 1 - Iniciadores e condições de termociclagem utilizados na

investigação molecular das amostras de Streptococcus

e Enterococcus................................................................

76

Tabela 2- Composição e concentrações empregadas nas reações

na investigação molecular dos isolados de

Streptococcus e Enterococcus........................................

76

Tabela 3 - Parâmetros físico-químicos das amostras nos pontos

estudados: Amostras de água da Galeria Riacho Maceió

(G1), amostras de água da Jusante à saída da Galeria

do Riacho Maceió (P1), amostras de água da Galeria da

Praia do Meireles (G2), amostras de água da Jusante à

saída da Galeria da praia do Meireles (P2) em

Fortaleza-Ceará................................................................

78

Tabela 4 – Contagem Padrão em Placas (CPP) de UFC de

Enterococcus/ 100 mL nos pontos avaliados: Amostras

de água da Galeria Riacho Maceió (G1), amostras de

água do mar adjacente à Galeria do Riacho Maceió

(P1), amostras de água da Galeria da Praia do Meireles

(G2), amostras de água do mar adjacente à Galeria da

praia do Meireles (P2) em Fortaleza-Ceará.....................

80

Tabela 5 - Perfil de multirresistência de cepas de Streptococcus e

Enterococcus isoladas de galerias (G1 e G2) em

Fortaleza, Ceará.............................................................

95

Tabela 6 - Perfil de multirresistência de cepas de Streptococcus e

Enterococcus isoladas em pontos de mar (P1 e P2) em

Fortaleza, Ceará. ...........................................................

96

Tabela 7 - Resultados após tratamento de cura de plasmídio em

isolados de galeria (G1 e G2) e água do mar (P1 e P2)

em Fortaleza, Ceará......................................................

100

Tabela 8- Resultados para cada antimicrobiano testado após

tratamento de cura de plasmídio em isolados de galeria

(G1 e G2) e água do mar (P1 e P2) em Fortaleza, Ceará

101

Sumário

1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 18

2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................... 21

2.1 Particularidades dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus................................................................................

21

2.1.1 Taxonomia................................................................................... 21

2.1.1.1 Taxonomia do gênero Streptococcus .......................................... 21

2.1.1.2 Taxonomia do gênero Enterococcus ........................................... 22

2.1.2 Características gerais................................................................ 23

2.1.2.1 Características gerais do gênero Streptococcus......................... 23

2.1.2.2 Características gerais do gênero Enterococcus.......................... 24

2.1.3 Identificação de espécies.......................................................... 24

2.1.3.1 Identificação de espécies do gênero Streptococcus................... 24

2.1.3.2 Identificação de espécies do gênero Enterococcus.................... 26

2.1.4 Patogenia e virulência............................................................... 27

2.1.4.1 Patogenia e virulência dos Streptococcus................................... 27

2.1.4.2 Patogenia e virulência dos Enterococcus.................................... 31

2.2 Bactérias do gênero Enterococcus em ambientes

aquáticos....................................................................................

34

2.2.1 Estressores ambientais............................................................ 34

2.2.1.1 Radiação solar............................................................................. 34

2.2.1.2 Salinidade.................................................................................... 35

2.2.1.3 Influência da variação espaço-temporal e de marés sobre das

densidades de bactérias indicadoras de poluição fecal..............

36

2.2.1.4 Eventos de Chuva........................................................................ 37

2.2.1.5 Predação...................................................................................... 38

2.2.1.6 Escassez de nutrientes e sobrevivência...................................... 39

2.3 Enterococcus como indicador de contaminação em águas

com fins recreativos .................................................................

41

2.4 Resistência antibiótica ............................................................. 46

2.4.1 Resistência antibiótica do grupo Streptococcus...................... 46

2.4.1.1 Estudos de resistência antibiótica e de mecanismos de

resistência em patógenos do gênero Streptococcus..................

51

2.4.2 Resistência antibiótica do grupo Enterococcus...................... 55

2.4.2.1 Resistência intrínseca................................................................. 55

2.4.2.2 Resistência extrínseca ............................................................... 57

2.4.2.3 Estudos de resistência antimicrobiana e de transferência de

resistência no grupo Enterococcus .............................................

58

3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................ 62

3.1 Contextualização da área de estudo........................................ 62

3.1.1 Características sócio-económicas do Bairro Meireles.......... 62

3.2 Georreferenciamento dos Pontos de coleta............................ 62

3.3 Procedimento de coleta............................................................ 63

3.3.1 Determinação dos parâmetros físico-químicos...................... 63

3.4 Quantificação de Streptoccus sp e Enterococcus sp............... 64

3.4.1 Análises estatísticas...................................................................... 65

3.5 Identificação de bactérias dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus.................................................................................

65

3.5.1 Identificação em gênero............................................................. 65

3.5.2 Identificação em espécie............................................................ 66

3.5.2.1 Prova de fermentação de carboidratos......................................... 66

3.5.2.2 Prova da descarboxilação da arginina.......................................... 67

3.5.2.3 Prova de produção do pigmento................................................... 68

3.5.2.4 Prova de hemólises...................................................................... 69

3.5.2.5 Prova- PYR- Produção da enzima pirrolidonil arilamidase......... 70

3.5.2.6 Motilidade..................................................................................... 71

3.6 Teste de antibiograma através do método de difusão em

discos ........................................................................................

72

3.7 Cálculo do índice de resistência (IRA) e Determinação do

índice de múltipla resistência a antimicrobianos

(MRA)...........................................................................................

74

3.8 Técnica da cura de plasmídio.................................................. 74

3.8.1 Análises Estatísticas.................................................................... 75

3.9 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)................................ 75

3.9.1 Extracção de DNA cromossômico das cepas de

Streptococcus e Enterococcus....................................................

75

3.9.2. Condições de Box-PCR............................................................. 76

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................. 78

4.1 Parâmetros físico-químicos das amostras de galerias e do

mar ..............................................................................................

78

4.2 Quantificação de Streptooccus sp e Enterococcus sp.............. 79

4.3 Identificação em gênero ............................................................ 83

4.4 Identificação em espécie.......................................................... 83

4.5 Susceptibilidade aos antimicrobianos.................................... 88

4.6 Cura plasmidial......................................................................... 99

4.7 Box-PCR ................................................................................... 102

5 CONCLUSÕES........................................................................... 106

REFERÊNCIAS.......................................................................... 107

ANEXO A - PRECIPITAÇÕES DIARIAS – LITORAL DE

FORTALEZA (MAIO – JUNHO/2013)........................................

144

Rodríguez, M. T. T. Streptococcus e Enterococcus isolados de águas marinhas e de galerias.............. 18

1 INTRODUÇÃO

A água é um elemento vital para a existência de todos os

organismos vivos, mas esse recurso é colocado em risco devido ao

crescimento populacional com o consequente aumento da demanda desse

recurso para diferentes usos (CARR et al., 2010).

O crescimento das populações humanas em cidades costeiras nem

sempre é acompanhado da melhora da infraestrutura de saneamento básico, o

que constitui um problema ambiental e de saúde pública. Os esgotos

domésticos lançados diretamente ao mar, sem qualquer tipo de tratamento,

carregam uma variedade de microrganismos patogênicos que põem em risco a

saúde do homem e do ambiente (WHO, 1998; PINTO; OLIVEIRA, 2011). A

contaminação das águas recreacionais por material fecal pode conduzir a

problemas de saúde entre os usuários devido à presença de organismos

infecciosos (WHO, 2003).

Existem regulamentos de órgãos para vigiar as condições sanitárias

(qualidade microbiológica) de águas destinadas à recreação, identificar a fonte

de contaminação e proteger os usuários dos efeitos nocivos resultantes.

(DORFMAN; ROSSELOT, 2009).

Em águas recreacionais, os organismos utilizados como indicadores

de contaminação servem para classificar os corpos d’água quanto a sua

condição sanitária e o potencial risco à saúde dos usuários. Embora um

indicador individual não possa predizer significativamente a presença de todos

os patógenos na água, o acompanhamento a longo prazo desses organismos

proporciona uma forma segura de avaliar o grau de contaminação potencial por

patógenos nos corpos de água receptores, permitindo a avaliação de risco (WU

et al., 2011).

Enterococcus tem sido sugerido como indicador de contaminação

fecal em águas marinhas, uma vez que, numerosos estudos relacionam a

exposição a águas com a presença dessa bactéria e a ocorrência de doenças

gastrointestinais e doença respiratória aguda febril (FLEISHER et al., 1996;

PRUSS, 1998; WADE et al., 2003). É importante destacar que apesar das

limitações do uso de indicadores, a presença de bactérias de origem fecal em

corpos d’água implica um risco potencial sério à saúde dos usuários dessas

águas (PAYMENT; LOCAS, 2011).


Embora os estreptococos e enterococos possam causar infecções

em humanos, na comunidade e nos hospitais, os enterococos não foram

reconhecidos como importantes agentes causais de infecções nosocomiais até

os anos 70. Com o incremento da resistência aos antimicrobianos de uso

comum, o grupo de bactérias pertencentes ao gênero Enterococcus foi

colocado como um dos principais desafios da terapêutica clínica em infecções

de alto risco (TEIXEIRA; MERQUIOR, 2013).

O emprego amplo dos antimicrobianos na terapêutica humana e

veterinária vem possibilitando a seleção e disseminação de bactérias com

capacidade de resistência a essas substâncias e que acabam sendo

introduzidas nos ambientes através de descarte de efluentes. Nesse cenário,

as bactérias Gram-positivas são motivo de grande preocupação entre a

comunidade científica, já que vêm se tornando um problema na terapêutica

antiinfecciosa (TAVARES, 2000).

Bactérias do gênero Enterococcus possuem resistência intrínseca a

várias drogas de uso comum e acumulam mutações e genes exógenos que

conferem resistência adicional (ARIAS; MURRAY, 2012). Embora as bactérias

do gênero Streptococcus sejam mais susceptíveis a ação de antimicrobianos

que os Enterococcus sp., elas possuem plasmídios relacionados a resistência

antibiótica que facilitam a transferência de material genético entre bactérias

(KATAJA et al., 1999; DHANARANI et al., 2009).

Embora a qualidade das águas recreacionais marinhas já seja

monitorada por programas implantados em vários estados brasileiros, e

existam critérios microbiológicos estabelecidos pela legislação vigente,

Resolução Nº. 274 (BRASIL, 2000) que define os critérios de balneabilidade,

cresce o interesse e a preocupação pelo controle e vigilância dos ambientes

marinhos costeiros que o homem dispõe e precisa utilizar de forma cada vez

mais segura ( FERREIRA; ANDRADE;COSTA, 2013; OLIVEIRA, 2010; VIEIRA

et al., 2011).

A beleza das praias de Fortaleza torna a cidade um importante

destino turístico nacional. Entretanto, como outras cidades costeiras, apresenta

uma precariedade do sistema de tratamento sanitário de esgotos que acaba

poluindo suas orlas (LOURENÇO et al., 2006; VIEIRA; OLIVEIRA; SOUSA,


2007) o que torna a exposição a essas águas com atividades de contato

primário um risco para seus frequentadores.

Nas capitais costeiras, um importante veículo de contaminação das

praias são as galerias pluviais, responsáveis, somente, pela coleta de águas da

chuva. Porém, muitas vezes os efluentes domésticos são lançados

clandestinamente nas mesmas. O efluente dessas galerias é lançado

diretamente no mar, sem tratamento prévio, alterando a qualidade das águas

(FERREIRA; ANDRADE; COSTA, 2013).

Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo quantificar e

identificar bactérias contaminantes (Streptococcus e Enterococcus), em duas

galerias pluviais (galeria Riacho Maceió e galeria em frente à Praia do

Meireles) e em dois pontos de água de mar adjacentes a cada galeria na orla

da cidade de Fortaleza estabelecendo padrões de resistência a

antimicrobianos.

Como objetivos específicos, citam-se:

(1) Quantificar bactérias entéricas dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus em águas captadas em galerias pluviais na cidade de Fortaleza e

nas águas marinhas influenciadas pela descarga dessas galerias;

(2) Isolar e identificar, através de provas bioquímicas as estirpes de

Streptococcus e Enterococcus ;

(3) Determinar o perfil fenotípico de resistência a antibióticos das

estirpes de Streptococcus e Enterococcus isoladas;

(4) Verificar a relação entre perfis de resistência múltiplos

encontrados;

(5) Estabelecer a origem genotípica nos casos de multirresistência

através de procedimento de “cura” de plasmídios;

(6) Realizar PCR-Box para avaliar a similaridade genética entre

isolados ligados à multirresistência.


2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Particularidades dos gêneros Streptococcus e Enterococcus

2.1.1 Taxonomia

2.1.1.1 Taxonomia dos Streptococcus

O gênero Streptococcus pertence à ʺfamília streptococcaceaeʺ

possui uma grande diversidade de espécies com características biológicas e

exigências nutricionais muito variadas (HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA,

2001).

A localização taxonômica da ʺfamília Streptococcaceaeʺ foi

questionada, e o número de espécies de estreptococos e de bactérias similares

a estreptococos foi aumentado. Foram realizadas várias modificações na

taxonomia dos estreptococos do grupo D, com a criação de um novo gênero,

Enterococcus e a descrição de várias espécies novas de origem humana e

animal, relacionadas genética e fenotipicamente com os enterococos

(KONEMAN et al., 2001).

Em anos recentes, a taxonomia dos estreptococos tem sofrido uma

grande revisão após o desenvolvimento de métodos moleculares de

identificação, prevalecendo diferenças de opiniões sobre a nomenclatura de

alguns estreptococos entre os sistemas de identificação do Reino Unido e os

dos Estados Unidos (UK STANDARDS FOR MICROBIOLOGY

INVESTIGATIONS, 2014).

Thompson et al. (2013) reconheceram 99 espécies de Streptococcus

muitas das quais estão associadas com doenças em humanos e animais.

Atualmente, a lista de nomes presentes na nomenclatura (LPSN, sigla em

inglês) apresenta 111 espécies com vinte e duas sub-espécies pertencentes a

esse gênero (LPSN, 2015) e a coleção germânica de micro-organismos

(DSMZ) reconhece 136 membros do gênero, 115 espécies e vinte e uma sub

espécies (DSMZ, 2015).


2.1.1.2 Taxonomia dos Enterococcus

O termo enterococos foi utilizado por primeira vez na França por

Thiercelin, em 1899, para descrever o grupo de bactérias dispostas em cadeias

curtas, diplococos e com resposta positiva à coloração de Gram (PITA, 2002).

Em 1937, Sherman JM., divide o grupo Streptococcus em quatro

grandes grupos: pyogenes, láctico, viridans e enterococos. Dentro do grupo

dos enterococos observou que as bactérias possuíam facilidade de

crescimento a temperaturas altas e baixas, maior tolerância a sais e bílis

comparada com o resto dos outros grupos, ponto alto de morte térmica e maior

capacidade redutora e resistência ao azul de metileno.

Com os avanços a nível molecular a partir de evidências genéticas,

Schleifer e Kilpper – Balz (1984) propuseram transferir Streptococcus faecalis e

Streptococcus faecium que até então estavam dentro do gênero Streptococcus

para um gênero diferente: Enterococcus. A classificação taxonômica passou a

ser outra, ficando três gêneros: Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus.

Embora tenha sido sugerida essa separação, a edição do Manual de

Bergey (1986) citou um único gênero, Streptococcus (com seis grupos) mais

por conveniência prática, do que por taxonomia. Os estreptococos recobrados

de fezes estavam agrupados em dois desses grupos (SINTON; DONNISON;

HASTIE, 1993).

A partir de então, um grupo de cocos taxonomicamente heterogêneo

associado com o trato gastrointestinal de humanos e animais de sangue quente

foi nomeado ʺestreptococos fecaisʺ. Este grupo abrange bactérias do gênero

Enterococcus, os estreptococos de fonte não humana, Streptococcus bovis e

Streptococcus equinus e estreptococos de fontes não fecais, pertencentes ao

grupo viridans como, por exemplo, S.mitis e S. salivarius (BITTON, 2005; LLEÓ

et al., 2005; PINTO et al., 1999).

Dos ʺestreptococos fecaisʺ, o grupo de bactérias pertencentes ao

gênero Enterococcus tem sido utilizado e proposto em sua regulamentação

com preferência como indicador de contaminação fecal em ambientes

aquáticos marinhos (ASBOLT; GRABOW; SNOZZI, 2001; WHO, 2006). Por

esta razão, no presente estudo o gênero Enterococcus foi abordado com maior

profundidade.


Byappanahalli et al. (2012) descreveram 36 espécies dentro do

gênero Enterococcus originários de diferentes habitats e distribuídas em cinco

grupos: E. faecalis (6 espécies), E. faecium (11 espécies), E. avium (9

espécies), E. gallinarum (2 espécies), E. cecorum (2 espécies) e 6 espécies

sem agrupamento. Atualmente, a coleção germânica de micro-organismos

(DSMZ) apresenta 54 espécies conhecidas e duas sub-espécies pertencentes

a esse gênero (DSMZ, 2015).

2.1.2 Características gerais

2.1.2.1 Características gerais dos Streptococcus

As bactérias do gênero Streptococcus são bactérias gram-positivas,

que crescem aos pares ou em cadeias curtas, anaeróbias facultativas. Esses

micro-organismos são catalase-negativos e oxidase-negativos (KONEMAN et

al., 2001). Além disso, são imóveis e não formadores de esporos

(HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA, 2001).

Os estreptococos são considerados fastidiosos, com crescimento

lento e podem necessitar de fatores nutricionais para seu isolamento e

caracterização (FACKLAM, 2002).

Estreptococos, enterococos e aerococos de importância médica são

homofermentadores (o único produto da fermentação da glicose é o ácido

láctico) (KONEMAN et al., 2001). Com exceção do Streptococcus pneumoniae

(S.pneumoniae), os estreptococos não são solúveis em bílis e não realizam a

liquefação da gelatina (HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA, 2001).

Os estreptococos estão amplamente distribuídos na natureza. Uns

são parte da microbiota normal dos mamíferos e podem se comportar como

oportunistas. Espécies patógenas podem produzir diversas e variadas

infecções no homem e nos animais (FORBES; SAHM; WEISSFELD, 2007;

GOMES, 2013).


2.1.2. 2 Características gerais dos Enterococcus

As bactérias do gênero Enterococcus são: de forma ovóide, podendo

aparecer como células únicas, agrupadas aos pares ou em cadeias curtas

(MURRAY, 1990). São bactérias Gram-positivas, não esporuladas e embora

possam apresentar uma pseudocatalase, em geral, são catalase negativa,

(HARDIE; WHILEY, 1997; MURRAY, 1990), podem ter mobilidade ou ser

imóveis (SHEWMAKER et al., 2011; De GRAEF et al., 2003; SUKONTASING

et al., 2007), a presença de pigmento amarelo também pode diferir entre

espécies (NASER et al., 2005; ŠVEC et al., 2001). Bactérias do gênero

Enterococcus compartilham inúmeros e diferentes habitats e assim pode-se

encontrar enterococos de origem humana (CARVALHO et al., 2006; TYRREL

et al., 2002), animal (FORTINA; MORA; MANACHINI, 2004; KOORT et al.,

2004; RAHKILA et al., 2011), de plantas (M ER et al., 2001; ŠVEC;

BRYNDOVÁ, 2012; ŠVEC et al., 2012), de insetos (ŠVEC et al., 2006; COX ;

GILMORE, 2007), do solo (COLLINS; FARROW; JONES, 1986; LAYTON et al.,

2010), de água potável (ŠVEC et al., 2006), de água superficial (ŠVEC et al.,

2001) e de água do mar (ŠVEC et al., 2005). Com o desenvolvimento de novos

métodos padronizados e menos laboriosos para a identificação de espécies

crescem o número de ambientes explorados e com ele o conhecimento de

novos habitats para esse gênero (BYANNAPAHALLI et al., 2012).

2.1.3 Identificação de espécies

2.1.3.1 Identificação de espécies de Streptococcus

Com o fim de criar uma classificação prática dos estreptococos,

diferentes características têm sido levadas em conta na sua identificação,

dentre elas: a morfologia das colônias e as reações hemolíticas; as

especificidades sorológicas da substância da parede celular (que indicam o

grupo) e outros antígenos de parede ou de cápsula; as reações bioquímicas e

de resistência a fatores químicos e físicos; e as características ecológicas.

Provas fenotípicas adicionais e ensaios moleculares têm sido realizados para o

estudo das relações das espécies entre si (HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA,

2001).


Sobre ágar sangue, as espécies de estreptococos podem apresentar

diferentes graus de hemólises (β-hemólise total, α -hemólise parcial) ou não

apresentar hemólise. Além disso, estreptococos hemolíticos, podem ser

caracterizados pelo sistema de agrupamento de Lancefield (UK STANDARDS

FOR MICROBIOLOGY INVESTIGATIONS, 2014). Os antígenos detectados por

esse sistema de agrupamento são polissacarídeos de parede celular

(estreptococos dos grupos A, B, C, F e G oriundos de humanos) ou ácidos

lipoteicóicos de parede celular (estreptococos do grupo D e espécies de

Enterococcus). Embora algumas cepas de estreptococos viridans possuam

antígenos similares que reagem de modo cruzado com antissoros específicos

do grupo dos estreptococos β-hemolíticos, os membros desse grupo não

possuem qualquer dos antígenos de Lancefield de parede celular conhecidos

(KONEMAN et al., 2001).

Provas fenotípicas básicas (FACKLAM; ELLIOT, 1995) podem

ajudar na identificação presuntiva de cocos Gram positivos catalase negativa

(estreptococos, grupo viridans e enterococos) como são a produção de

pirrolidonil-arilamidase (PYR, sigla em inglês), produção de leucina

aminopeptidase (LAP, sigla em inglês) e crescimento em 6,5% de NaCL

(RUOFF, 2002).

O uso de testes com substâncias fluorogênicas e cromogênicas para

a detecção de enzimas pré-formadas combinadas com mais testes bioquímicos

tradicionais tais como fermentação de carboidratos, esculina e hidrólise da

arginina têm sido úteis na identificação de espécies de Streptococcus,

particularmente do grupo viridans (KIKUSHI et al., 1995; HARDIE; WHILEY,

1997; BOSSHARD et al., 2004; SALVADOR et al., 2005; NHO et al., 2009).

Embora possível a diferenciação de Streptococcus e Enterococcus

bioquimicamente através de testes fenotípicos, as provas bioquímicas não

garantiam a identificação segura, de forma inequívoca ao nível de espécie

(BOSSHARD et al., 2004). Os métodos moleculares constituem uma das

ferramentas mais valiosas para a identificação e tipificação de isolados do

gênero Streptococcus tais como a tipificação em sequência multilocus (DUNNE

et al., 2011; SUN et al., 2005; JONES et al., 2003), PCR ( POYART et al.,

2007; BRITO; RAMIREZ; LENCASTRE, 2003; VITALI et al., 2002) e


eletroforese em gel de campo pulsado (CÔRREA et al., 2009; OLIVEIRA et al.,

2005; MOYO; MAELAND; BERG, 2002).

2.1.3.2 Identificação de espécies de Enterococcus

Os métodos para a identificação de espécies enterocócicas são

essencialmente, baseados em suas características fenotípicas (SHEWMAKER

et al., 2011). A forma mais fácil de identificar fenotipicamente o grupo

enterococos é mediante a utilização de chaves de provas bioquímicas

convencionais (FACKLAM; COLLINS, 1989).

A maior parte da identificação presuntiva dos enterococos tem sido

baseada nas respostas frente a diferentes provas bioquímicas: hidrólises da

esculina, crescimento em caldo Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com

6,5% de NaCl e habilidade de crescer a 10°C e 45°C (FACKLAM ; ELLIOT,

1995; MURRAY, 1990). As provas presuntivas (incluindo entre elas a prova

com L-pirrolidonil-beta-naftilamida– PYR) apresentam vantagens sobre as

provas confirmatórias já que são menos complexas para sua execução e

menos dispendiosas (FACKLAM et al., 1982).

As provas bioquímicas utilizadas para a identificação confirmatória

de espécies de Enterococcus têm sido avaliadas em diferentes estudos prévios

(FACKLAM; COLLINS, 1989; KNUDTSON; HARTMAN, 1992; MANERO;

BLANCH, 1999) sendo dispostas em forma de tabelas ou chaves

classificatórias.

Shewmaker et al. (2011) reavaliaram o posicionamento taxonômico

de algumas espécies dentro do gênero Enterococcus baseados na chave

classificatória proposta por Teixeira; Carvalho e Facklam (2007). Essa

classificação foi baseada na formação de ácido na presença de diferentes

substratos tais como: lactose, sacarose, manitol, arabinose, rafinose e sorbitol

entre outros. Também foi contemplada a hidrólise da arginina, a produção de

pigmento e a motilidade entre outros. Os autores concluíram sobre a

importância de testar diferentes isolados de Enterococcus procedentes de

diferentes fontes para uma ampla variedade de características bioquímicas que

facilitem a utilização de esquemas ou chaves mais abrangentes.


Os métodos clássicos de identificação bioquímica dependentes da

atividade enzimática ou da utilização de determinados substratos consomem

muito tempo e às vezes não identificam todas as espécies, estabelecendo suas

próprias limitações (CHAMPAGNE et al., 2011). Para contornar essas

limitações, têm sido desenvolvidos métodos de tipificação e identificação

molecular tais como tipificação em sequência multilocus, PCR e eletroforese

em gel de campo-pulsado (FANG et al., 2012; KLIBI et al., 2012; MOHANIA et

al., 2008; MORAES et al., 2013; NALLAPAREDY et al., 2002; NASER et al.,

2005; RYU et al., 2013).

A distribuição das espécies varia em diferentes áreas geográficas

(FISCHER; PHILLIPS, 2009). Estudos realizados por Kuhn et al. (2003),

reportaram o predomínio de E. faecalis e E. faecium em amostras clínicas e

fontes ambientais na Espanha e o Reino Unido, já na Suécia a incidência de E.

hirae é superior a de E. faecium. A diversidade de espécies é menor entre

isolados de amostras clínicas que em isolados ambientais, sendo E. faecalis a

espécie de maior freqüência, o que pode ser atribuído aos fatores de virulência

que elas possuem. Outros autores destacam a presença de diferentes espécies

enterocócicas em diferentes ambientes (frutas, vegetais, água, solo e amostras

clínicas) assim como sua abundância (ABRIOUEL et.al., 2008; RIBOLDI et.al.,

2009).

2.1.4 Patogenia e virulência

2.1.4.1 Patogenia e virulência dos Streptococcus

Os estreptococos estão distribuídos como organismos comensais

causando uma série de enfermidades no homem e nos animais, sendo

saprófitos do leite e produtos lácteos. Espécies patogênicas e não patogênicas

estão presentes na pele, mucosas do trato digestivo, genital e respiratório

(GOMES, 2013).

A infecção estreptocócica no homem vai dar lugar a uma ampla

variedade de manifestações clínicas em dependência da espécie relacionada,

suas propriedades biológicas infectantes, do ponto de entrada da infecção, dos

tecidos infectados e da natureza da resposta do hospedeiro (HERNÁNDEZ;

VIVANCO; SILVA, 2001).


Entre as principais espécies reconhecidas como agentes

patogênicos humanos estão: Streptococcus pyogenes (S.pyogenes - grupo A),

Streptococcus agalactiae (S.agalactiae - grupo B), espécies dos grupos C, G e

F, Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae), Streptococcus bovis (S.bovis) e

o grupo viridans (HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA, 2001).

Alguns dos quadros clínicos mais importantes relacionados com o

gênero Streptococcus são: faringites estreptocócica (BINGEN et al., 2004),

otites média (ALONSO et al., 2013), amigdalites (HEIRSTRAETEN, et al.,

2012), pneumonia (YOSHIOKA et al., 2011), meningites (CAMILLI et al., 2008),

infecção do trato urinário (POULSEN et al., 2012), bacteremias ( REINERT et

al., 2001), endocardites ( GOULD et al., 2012), septicemia (HAMID; SAKI; ALI,

2015), etc.

A estrutura antigênica dos estreptococos é complexa. As espécies

patogênicas possuem várias características que contribuem para sua virulência

entre elas estão: antígenos de superfície - proteínas M, fator de opacidade

(antígeno de superfície celular associado à proteína M) e cápsula de ácido

hialurônico. Também são capazes de produzir vários produtos extracelulares:

toxinas eritrogênicas A, B e C, estreptolisinas (S e O), hialuronidase,

desoxirribonucleases e estreptoquinases. No caso particular do S.pneumoniae,

sua virulência está associada com sua capacidade de resistência à fagocitose,

resistência fundamentalmente relacionada com a cápsula polissacarídica. Entre

outros fatores relacionados com a virulência do pneumococo estão a produção

de adesina, pneumolisina e autolisina, assim como a proteína pneumocócica

de superfície – PspA (HERNÁNDEZ; VIVANCO; SILVA, 2001; KONEMAN et

al., 2001).

Diferentes estudos têm avaliado a presença de fatores de virulência

em diferentes espécies patogênicas:

Os genes de fatores de virulência de Streptococcus pyogenes,

estreptococo do grupo A (GAS, sigla em inglês) foram estudados por Dhanda;

Vohra e Kumar, (2011) de isolados de garganta de crianças com faringites e de

portadores assintomáticos. Foi comprovada a presença de fatores de virulência

por associação com o tipo emm (gene – proteína M) em faringites. Foram

obtidas combinações genotípicas variadas de fatores de virulência em isolados

de estreptococos do grupo A (GAS, sigla em inglês) de pacientes com infecção


na garganta de diferente severidade. Foi confirmado por Terao (2012) que

Streptococcus pyogenes está equipado com uma ampla variedade de fatores

de virulência para invadir os tecidos humanos comprometendo a imunidade do

hospedeiro.

Rojagopal (2009) revisou as funções de alguns fatores de virulência

bem caracterizados em Streptococcus agalactiae, estreptococos do grupo B

(GBS, sigla em inglês) com ênfase na regulação de sua expressão. Fatores

críticos para sua patogenia como toxinas formadoras de poros e

polissacarídeos capsulares foram revisados entre outros. A expressão

apropriada dos fatores de virulência em resposta ao ambiente do hospedeiro

proporciona uma vantagem de sobrevivência em estreptococos do grupo B

(GBS, sigla em inglês), portanto, uma infecção exitosa implica a expressão

apropriada dos produtos do gene em resposta ao ambiente do hospedeiro.

Rosa-Fraile, Dramsi e Spellerberg (2014) estudaram dois determinantes

fenotípicos β-hemolisinas/citolisinas e um pigmento vermelho utilizados no

diagnóstico microbiológico. A produção de hemolisinas e pigmento está

regulada por um sistema de dois componentes CovS/R que coordena a

expressão de fatores de virulência múltiplas em GBS.

Foram examinados três isolados de Streptococcus iniai, o maior

patógeno de peixes, com níveis variáveis de virulência. A aderência e invasão

de células ou a resistência a peptídios antimicrobianos não parecem

representar um passo crítico em enfermidades invasivas por S.iniae. A

capacidade de evitar o aclaramento fagocítico e a morte oxidativa parecem ser

os componentes críticos de virulência na patogênese (BUCHANAN et al.,

2008).

Napimoga et al. (2005) revisaram a transmissão e diversidade dos

fatores de virulência em diferentes genótipos de Streptococcus mutans

(S.mutans). Os principais fatores de virulência associados com a produção de

cáries dentais incluem a adesão (papel de S.mutans no biofilme dentário),

acidogenicidade e tolerância a ácidos. A diversidade genotípica, a frequência

de sorotipos e a detecção de mutacinas (bacteriocinas) em isolados de

S.mutans de indivíduos livres de cáries e com cáries ativas foram analisadas

por Braga et al. (2013). Diferentes mutacinas serviram a diferentes propósitos

durante o processo de colonização por S.mutans. O estudo destaca a maior


diversidade genotípica em indivíduos com cáries dentais e maior frequência do

sorotipo c e os genes de mutacinas I,III e IV na população estudada.

Isolados do grupo viridans (VGS, sigla em inglês) foram examinados

por Presterl et al. (2005) como potenciais produtores de biofilme em pacientes

com endocardites e sepsis. Foi comprovada a persistência do biofilme ainda

com exposição a concentrações definidas de penicilina, teicoplanina, e

moxifloxacina. A habilidade de formar biofilme pode ser um fator de virulência

do agente causal e contribui com a gravidade da enfermidade e a ausência de

resposta à terapia com antimicrobianos.

Anderson e Feldman (2011) estudaram os fatores de virulência

envolvidos nas estratégias do sistema imune do Streptococcus pneumoniae

observando as respostas do hospedeiro. A ocultação no biofilme por parte do

patógeno respiratório proporciona um ambiente que pode conduzir à adaptação

genética e ao incremento de sua virulência quando as defesas do hospedeiro

estão comprometidas. Outra conclusão foi abordada no estudo de Sánchez et

al. (2011). Os autores concluíram que o biofilme não contribui diretamente para

o desenvolvimento de infecções estreptocócicas invasivas, em vez disso, pode

conferir uma inatividade do crescimento durante a colonização.

Streptococcus suis (S.suis), o maior patógeno suíno, responsável

por importantes perdas econômicas, também surge como importante agente

em zoonoses de meningites e na síndrome do shock tóxico estreptocócico. A

potencial contribuição de seus fatores de virulência em cada passo da

patogenia foi examinada por Fittipaldi et al. (2011). S. suis é capaz de se aderir

às células epiteliais do trato respiratório superior de suínos e humanos.

Diferentes adesinas estão envolvidas nesse processo de adesão. A

sobrevivência de S.suis em sangue é fundamental para a enfermidade. A

cápsula polissacarídea e modificações dos componentes celulares protegem a

bactéria da fagocitose. Fatores presentes, principalmente na parede celular

bacteriana (tais como lipoproteínas), disparam a liberação de mediadores

inflamatórios do hospedeiro que conduzem à síndrome do schok tóxico

estreptocócico.

Wang et al. (2011) investigaram se a produção de biofilme formada

por S. suis poderia alterar a aderência, virulência, a expressão gênica e a

imunogenicidade. Mudança na estrutura da bactéria pode causar diferenças no


nível de expressão dos genes de virulência. As células do biofilme estão

envolvidas por um complexo polissacarídeo, o que poderia influenciar nos

fatores de virulência secretados pela bactéria.

2.1.4.2 Patogenia e virulência dos Enterococcus

Os enterococos são organismos comensais utilizados pela indústria

dos alimentos como probióticos trazendo benefícios sa de humana e animal

( R ES, 2014; REHAIEM et al., 2014). Embora muitas espécies

sejam consideradas comensais, patógenos oportunistas como E. faecalis e E.

faecium e outras espécies desse gênero têm sido de particular importância

como agentes causais de infecções nosocomiais (FARIÑAS ; TORRES, 2007;

PÉREZ; MARTÍNEZ; ZHURBENKO, 2010), incluindo bacteremias,

endocardites, infecções do trato urinário, e outras infecções (ÁLVAREZ et al.,

2007; ÁLVAREZ et al., 2008; PO; OH; TAN, 2006). Existem diferentes fatores

que determinam a virulência nas espécies de Enterococcus (FISHER;

PHILLIPS, 2009): (1) habilidade para penetrar (colonizar) o trato

gastrointestinal; (2) habilidade para se aderir a proteínas extracelulares; e (3)

habilidade de se aderir ao epitélio do trato urinário, epitélio da cavidade oral e

células embrionárias humanas dos rins. Acredita-se que a maioria das

infecções seja endógena, por translocação de bactérias por meio das células

epiteliais do intestino, causando infecção através dos nódulos linfáticos, assim

pode se espalhar por outras células dentro do organismo (FRANZ;

HOLPZAPFEL; STILES, 1999).

A maioria dos Enterococcus (ao contrário dos Streptococcus e

Staphylococcus) não produz um conjunto de toxinas inflamatórias potentes,

mas possuem muitos genes que codificam proteínas de adesão que podem

mediar a aderência aos tecidos do hospedeiro, o que tem sido consistente com

seu papel patogênico em casos de endocardite infecciosa (ARIAS ; MURRAY,

2012).

A produção de biofilmes é essencial como causa de infecções do

trato urinário e endodôntico, assim como em endocardites (FISHER; PHILLIPS,

2009). Existem fatores de virulência secretados pelas diferentes espécies de

Enterococcus: citolisinas, também chamadas hemolisinas (KOCH et al., 2004),


e enzimas hidrolíticas (hialuronidases, gelatinases, e proteases séricas

(MUNDY; SAM ; GILMORE, 2000; SEMEDO et al., 2003).

Os enterococos também produzem fímbrias de aderência

(conhecidas como fímbrias Ebp, ou pili da Endocardite e biofilme) que

poderiam intervir na aderência aos tecidos do hospedeiro (NALLAPAREDY et

al., 2006). Este componente tem sido detectado em cepas de enterococos

procedentes de água e alimentos (COBO et al., 2008).

Os enterococos não possuem fatores de virulência comumente

encontrados em muitas outras bactérias, mas a presença de determinados

fatores de virulência unida à resistência antibiótica intrínseca e adquirida em

associação com doenças e infecções em humanos explica a eficiência desse

grupo como patógeno oportunista (GIRAFFA, 2002).

Diferentes estudos têm avaliado a presença de fatores de virulência

em diferentes tipos de amostras:

Semedo et al. (2003) investigaram a presença de alguns fatores de

virulência (citolisinas, adesinas e enzimas hidrolíticas) em 164 isolados de

alimentos e clínicos (de origem humana e veterinária). Não foi detectada

atividade da hialuronidase. Foi observada uma alta incidência para os genes

que codificam adesão superficial. Na comparação da atividade gelatinase,

predominante nos isolados clínicos, lípases e DNAse foram detectadas

principalmente em isolados de alimentos, destacando sua menor importância

como determinantes de virulência. Foi concluído que as cepas clínicas

parecem estar associadas com um alto potencial de virulência. Cepas

ambientais, comensais e de alimentos carregam alguns determinantes de

virulência.

Creti et al. (2004) realizaram um estudo sobre os determinantes de

virulência (novos e conhecidos) em isolados de E. faecalis de diferentes fontes

(clínicas, de indivíduos saudáveis e do ambiente) com o objetivo de estudar a

possível correlação da presença dos fatores de virulência em cada cepa e sua

fonte de isolamento. Os autores concluíram que isolados de E.faecalis de

diferentes fontes possuíam padrões distintivos de fatores de virulência. Em

geral os isolados de endocardites e do ambiente estavam equipados com

menor número de fatores de virulência comparados com os de outras fontes


avaliadas. Os isolados do trato urinário foram os que apresentaram maior

número de fatores.

Uma coleção de enterococos, isolados de amostras clínicas, frutas e

vegetais, e água e solo foi investigada em relação à presença dos genes ebp

(pilis associado à Endocardite e biofilme). Isolados de E.faecalis de amostras

clínicas (94,59%) também como todos os isolados de frutas e vegetais e dois

dos três isolados de água e solo transportavam ebpA, ebpB e ebpC. A análise

molecular para E.faecium revelou que aproximadamente 81,81% dos isolados

de água e solo transportavam os três genes quando comparado com a baixa

incidência detectada entre isolados de vegetais (68.42%) e amostras clínicas

(33.33%). Foi sugerido pelos autores que populações enterocócicas de

ambientes específicos podem também diferir na sequência de genes que

codificam pili. Tais variações podem ser importantes para produzir pili funcional

podendo ter sérias implicações na capacidade dos isolados para a adesão e

colonização (COBO et al., 2008).

Trivedi, Cupakova e Karpiskova (2011) estudaram sete

determinantes de virulência e a susceptibilidade microbiana a oito antibióticos

em enterococos isolados de alimentos na República Tcheca. Eles encontraram

que 88,4% dos isolados portavam um ou mais genes de virulência. Foi

comprovada a hemólise em espécies diferentes de E. faecalis e E. faecium.

Também foi confirmado que espécies diferentes de E. faecalis e E. faecium

carregavam genes de virulência.

Ahmad, Dada e Usup (2014) realizaram a avaliação da persistência

de coliformes fecais cultiváveis contra a de isolados de enterococos de

diferentes origens: cepas com genes de virulência recuperadas de água de

praia, fezes humanas, isolados clínicos e com resistência à vancomicina. Os

isolados foram inoculados em águas marinhas e doces estéreis e incubados

durante cinco semanas. Os autores destacaram a persistência de todos os

isolados de enterococos à temperatura de 29˚C (até três semanas) em águas

marinhas e doces, mantendo seus genes de virulência, o que determina um

perigo potencial para a saúde pública.


2.2 Bactérias do gênero Enterococcus em ambientes aquáticos

A segurança na qualidade microbiológica dos ambientes aquáticos

utilizados para fins recreacionais é um problema no mundo todo (LAYTON et

al., 2010).

Diferentes estudos (DUFOUR; WADE; KAY, 2012; COLFORD et al.,

2012; FLEISHER et al., 2010; WADE et al., 2003, 2006, 2010) destacam a

correlação positiva entre as densidades de enterococos e a incidência de

doenças e infecções em indivíduos expostos por atividades de contato primário

em águas doces e marinhas, indicando a eficácia dessas bactérias como

indicadores da possível presença de micro - organismos patógenos.

2.2.1 Estressores ambientais

A existência de fatores ambientais (bióticos e abióticos) tais como:

radiação solar, concentração de nutrientes no meio, salinidade, temperatura,

pH e outros, como inativadores de bactérias do gênero Enterococcus em

ambientes aquáticos têm sido citados em diferentes estudos:

2.2.1.1 Radiação solar

Davies-Colley, Bell e Donninson (1994) investigaram a inativação de

coliformes fecais e enterococos em efluentes de águas residuais diluídas em

água de mar. Os autores concluíram que os enterococos precisavam de duas a

três vezes mais radiação que os coliformes fecais para serem inativados.

Noble, Lee e Schiff (2004) estudaram os efeitos da temperatura, a

carga bacteriana, os sólidos totais em suspensão e a radiação solar sobre

bactérias indicadoras da qualidade microbiológica das águas (E. coli,

coliformes totais e enterococos) em água doce e marinha. Eles concluíram que

a inativação das bactérias indicadoras não depende da fonte original de

contaminação. Destacaram que os enterococos foram inativados mais

rapidamente que E. coli sob luz solar.

Dorsey et al. (2010) estudaram a redução de bactérias indicadoras

fecais (coliformes totais e fecais, enterococos e E.coli) em um pântano de água

de mar visando futuras implicações para a tomada de medidas de restauração

dessa zona, na Califórnia, Estados Unidos. Eles relataram que o pântano age


como fonte e dissipador de bactérias indicadoras fecais dependendo das

condições de maré e da exposição à luz solar.

2.2.1.2 Salinidade

Com relação à salinidade é importante assinalar o fato que bactérias

do gênero Enterococcus são capazes de tolerar altas concentrações de sais

(16,5%) comparada com E. coli e com os coliformes fecais, o que contribui para

sua melhor atuação como indicador de risco à saúde humana em ambientes

recreacionais marinhos do que membros do grupo coliforme

(BYAPPANAHALLI et al., 2012).

Alguns trabalhos têm comentado sobre a relação inversa entre a

detecção de enterococos e a salinidade (BERNARDO, 2007; PINTO;

PEREIRA; OLIVEIRA, 2012; STRADIOTTO, 2013).

Na Nova Zelândia, Sinton et al. (2002) mediante experimentos com

mesocosmos utilizando águas doces e marinhas inoculadas com água residual

ou com um inóculo de lagoa de estabilização de residuais, observaram maior

persistência dos enterococos em águas doces que em águas marinhas. Os

enterococos de esgotos brutos responderam de forma mais sensível à

salinidade que aqueles da lagoa de estabilização.

Anderson, Whitlock e Harwood (2005) pesquisaram a persistência e

a sobrevivência de bactérias indicadoras fecais (coliformes fecais, E. coli e

enterococos) em águas doces, marinhas e sedimentos, mediante experimentos

em mesocosmos. As taxas de diminuição de coliformes fecais foram,

significativamente, mais baixas que as de enterococos em águas doces, mas

não foram, significativamente, diferentes em águas marinhas.

Carr et al. (2010) avaliaram o uso combinado de enriquecimento

com a técnica da PCR para a detecção de Salmonella em águas costeiras e

sedimentos do Mississipi e a correlação da possível presença com níveis de

enterococos e variáveis climatológicas. Foi relatada uma correlação altamente

significativa entre a presença detectável de Salmonella e o valor médio na

contagem de enterococos. Foi observada uma relação inversa entre a

frequência de detecção e os níveis de salinidade, turbidez e radiação solar.


2.2.1.3 Influência da variação espaço-temporal e de marés sobre a densidade

de bactérias indicadoras de poluição fecal

É conhecido que bactérias fecais variam numa escala de tempo

menor que 24 horas (um dia), com ciclos de marés e com a radiação solar

(BOEHM; WEISBERG, 2005; BOEHM, 2007).

A distribuição e os fatores que afetam o número de E.coli,

enterococos e Clostridium perfringens em água e solo num ambiente

subtropical influenciado por marés foram estudados por Desmarais, Solo-

Gabriele e Palmer (2002). E. coli e enterococos foram encontrados em baixos

níveis em sedimentos subsuperficiais ao contrário de C. perfringens. Nos

sedimentos, em locais mais distantes da costa, o número dessas bactérias

declinou sugerindo que o conteúdo da água desempenha um papel crítico na

habilidade desses indicadores em manter suas populações no ambiente.

Resultados experimentais revelaram um aumento significativo na multiplicação

de E.coli e enterococos com a simulação das marés em sedimentos úmidos.

Foi observado que com mudanças no estado da maré e ondas induzidas pelo

vento, esses microrganismos presentes na margem do rio, podem ser

carreados para a água, elevando seu número além daquele advindo de fezes.

Boehm e Wesberg (2005) exploraram o impacto das marés sobre os

níveis de bactérias indicadoras fecais em 60 praias do sudeste da Califórnia

para predizer a qualidade da água e deduzir informações sobre a localização

de bactérias indicadoras fecais (coliformes fecais, E. coli e enterococos) numa

praia em particular. As marés afetaram as concentrações de enterococos em

58/60 praias (97%). A concentração de enterococos foi mais elevada durante a

maré alta do que durante a maré baixa.

Converse et al. (2012) correlacionaram as medições de bactérias do

gênero Enterococcus por diferentes métodos (qPCR e método de cultivo) em

três praias do sul da Califórnia. Os autores também examinaram a influência da

hora do dia e variações sazonais na fonte de contaminação. As concentrações

de Enterococcus spp. variaram por método e por praia estudada. As

correlações foram significativamente superiores no período da manhã do que à

tarde. A hora do dia afetou a relação entre os resultados dos dois métodos

testados nas praias estudadas. Os resultados ratificaram o efeito inativador da

radiação solar sobre Enterococcus spp.


A variação diurna na ocorrência de espécies do gênero

Enterococcus em águas marinhas oceânicas foi estudada por Maraccini,

Ferguson e Boehm (2012). Baseado em análises de similaridade foi observado

que a distribuição de espécies durante o dia era significativamente diferente

daquela da noite. Enterococcus sp. com pigmento amarelo, foram mais comuns

de dia que durante a noite indicando uma vantagem competitiva sob condições

de luz solar.

Um estudo foi conduzido por Enns et al. (2012) para determinar

como variações temporais e espaciais na coleta de amostras de água de praia

afetam nas decisões de gestão baseadas em medições de enterococos. Era

também objetivo dos autores determinar se a presença de enterococos poderia

predizer a presença de S. aureus, patógeno da pele. O estudo analisou 238

amostras. As medições de enterococos foram afetadas pelos locais das

coletas. Os níveis de enterococos nas águas superficiais (até 50 cm

profundidade) foram significativamente maiores que aqueles encontrados em

locais mais profundos. Com relação à variação temporal, as amostras foram

agrupadas em manhã, tarde e noite. Os níveis de enterococos encontrados na

manhã, coletados à profundidade do joelho, foram significativamente mais

baixos que os encontrados à noite. Foram encontradas variações em diferentes

horas da manhã (cedo e tarde). Não foram encontradas diferenças

significativas entre os níveis de enterococos encontrados à tarde e noite.

Somente duas amostras de S.aureus foram meticilina resistente. Foi concluído

que o tempo e o local, no momento da coleta de amostra, podem influenciar,

nos níveis de enterococos e, subsequentemente, nas decisões de

gerenciamento de praias.

2.2.1.4. Eventos de Chuva

A contaminação microbiológica das águas costeiras piora após

períodos de chuva (DWIGHT et al., 2011).

A avaliação da qualidade microbiológica da água de praia (medições

de bactérias indicadores fecais: coliformes fecais, E. coli e enterococos)

durante os eventos de clima úmido do sul da Califórnia foi realizada por Griffith

et al. (2009). Foram encontrados valores de concentrações de enterococos que

excediam os limites da qualidade da água (˃ 10 vezes) mais frequentemente


durante o período úmido do que no seco. As maiores ocorrências foram 24

horas após o evento de chuva, decaindo, significativamente, nos dias

seguintes.

Bordeaux et al. (2012) avaliaram os efeitos de chuva sobre a

concentração de bactérias indicadoras de contaminação fecal, enterococos

após 72 horas de eventos de chuva em duas praias com características

geográficas diferentes: uma praia completamente aberta com acesso ao

oceano e uma fechada, cujas águas não se misturavam com o oceano aberto.

Foram observadas concentrações de enterococos que superaram valores

limites em alguns locais na praia aberta após três dias de evento de chuva. Na

praia fechada, esses valores foram observados após cinco dias de evento de

chuva. Segundo os autores, as variações nas concentrações de enterococos

podem depender da circulação e transporte local da água.

Semenza et al. (2012) coletaram dados diários da qualidade

microbiológica da água (concentrações médias de enterococos) e de

precipitação no período que abrange seis anos em 78 praias no sul da

Califórnia. Os dados foram usados para elaboração de um modelo linear com

escala temporal. Foi encontrada associação positiva entre a precipitação e a

contaminação microbiológica da água (p˂ 0, 001). E também que a diminuição

relativa da contaminação das águas costeiras durante este século pode ter

implicações positivas para a incidência de doenças infecciosas entre os

usuários de águas recreacionais.

2.2.1.5 Predação

A infecção viral tem sido o mecanismo responsável pela eliminação

de uma grande parte da comunidade autóctone de diferentes ambientes

aquáticos (FUHRMAN; NOBLE, 1995; THINGSTAD, 2000). Estudos têm sido

realizados analisando ʺenterofagosʺ (bacteriófagos que infectam bactérias do

gênero Enterococcus) de diferentes amostras ambientais visando sua utilização

como indicador de fontes microbianas (BONILLA et al., 2010; PURNELL;

EBDON; TAYLOR, 2011). Em pesquisa de Byappanahalli et al. (2012), esses

vírus foram considerados um importante elemento predador das populações de

enterococos, enquanto Purnell, Ebdon e Taylor (2011) pesquisaram esses


bacteriófagos no ambiente visando seu potencial como indicador de fonte

microbiana.

A atividade de protozoários no ambiente aquático é considerada o

principal processo biológico de controle da densidade de bactérias alóctones

entre as quais se pode encontrar bactérias do gênero Enterococcus (BARCINA;

LEBARON; VIVES-REGO, 1997; SERVAIS et al., 2007).

Menon, Billen e Servais (2003) investigaram a mortalidade

bacteriana (bactérias autóctones e fecais) em águas marinhas e águas doces.

Nos dois ambientes, as taxas de mortalidade de diferentes bactérias fecais e

autóctones estiveram na mesma ordem de magnitude. A atividade protozoária

do plâncton foi o processo de mortalidade dominante nos dois ambientes,

sendo atribuída a essa atividade uma redução de 90% da população bacteriana

autóctone e fecal no rio e na área costeira. Anterior a este estudo, Andersson,

Larsson e Hagstrom, (1986), estudaram o efeito de um microflagelado

heterótrofo sobre a distribuição do tamanho de células bacterianas em água de

mar, reportando valores altos na redução do volume da célula bacteriana em

águas marinhas.

É importante destacar que algumas outras experiências têm

documentado a redução nas concentrações de enterococos pela presença de

protozoários em águas marinhas e doces (DAVIES et al., 1995; HARTKE et al.,

1998; MENON; BILLEN; SERVAIS, 2003).

2.2.1.6 Escassez de nutrientes e sobrevivência

Quando bactérias do gênero Enterococcus transitam de um

ambiente favorável e rico em nutrientes (trato gastrointestinal de animais) para

ambientes aquáticos oligotróficos, elas são expostas a fatores ambientais

abióticos dentre eles, a escassez de nutrientes, que reduz sua sobrevivência

no ambiente (BYAPPANAHALLI et al., 2012).

Para determinar se a resistência à escassez de nutrientes era

significativa na sobrevivência de bactérias liberadas no ambiente, Sinclair e

Alexandre (1984) realizaram um estudo com espécies que diferiam em sua

capacidade de resposta para suportar condições nutricionais desfavoráveis.

Foram utilizados isolados de água do lago, de pele e de boca de humanos. E.

faecalis, S. aureus, B.subtilis e Streptococcus sp. perderam facilmente sua


viabilidade na ausência de nutrientes orgânicos. Foi sugerido pelos autores que

bactérias susceptíveis à escassez de nutrientes não persistem em ambientes

pobres ou onde não conseguem competir por nutrientes orgânicos. Sendo

assim, a resistência à escassez de nutrientes é condição necessária, mas não

suficiente para a persistência em ambientes pobres ou que apoiam uma

intensa competição interespecífica.

O fenômeno denominado viável, mas não cultivável (VBNC, sigla em

inglês) descreve uma estratégia de sobrevivência na qual a bactéria, frente a

condições adversas, tem sua divisão celular impedida. Nesta fase a bactéria

perde sua habilidade para formar colônias em meios de cultura convencionais,

mas são ainda viáveis com atividade metabólica (LLEÓ; TAFI; CANEPARI,

1998), mantêm suas propriedades patogênicas (PRUZZO et al., 2002) e podem

retomar a divisão quando as condições forem restauradas (LLEÓ et al., 2001)

O estresse promovido pelo esgotamento de fontes de carbono e

glicose como fonte de energia e incubação em microcosmos oligotróficos

destacou a resistência apresentada por E. faecalis em situações de estresse

ambiental o que pode estar correlacionado com um incremento da síntese de

muitas proteínas (HARTKE et al., 1998; GIARD et al., 2000). Além disso, a

inanição a carboidratos pode aumentar a resistência a múltiplos estressores:

etanol, hipocloreto de sódio, pH ácido, estresse oxidativo, calor (HARTKE et al.,

1998; LAPLACE et al., 1997).

Diferentes estudos pesquisaram a existência do estresse nutricional

induzido em células viáveis, mas não cultiváveis, de bactérias do gênero

Enterococcus (HEIM et al., 2002; LLEÓ et al., 2005; LLEÓ; TAFI; CANEPARI,

1998).

Métodos moleculares devem ser aplicados na avaliação de

enterococos viáveis, mas não cultiváveis, uma vez que, estabelecem grandes

diferenças nas análises das densidades de enterococos em amostras

ambientais, se comparado aos métodos convencionais (LI et al., 2014;

VENIERI et al., 2011).


2.3 Enterococcus como indicador de contaminação em águas com fins

recreativos

A necessidade de determinar quando um corpo de água está

contaminado com esgoto foi reconhecido uma vez que enfermidades

transmitidas por a água tais como febre tifoide, shigellosis, amebíases e cólera

constituíam uma ameaça diária e era conhecido o esgoto como fonte de

contaminação desses patógenos. Métodos confiáveis para a detecção e

isolamento de muitas destas bactérias patógenas não estavam disponíveis.

Quatro descobertas importantes conduziram ao presente sistema de avaliação

higiênica da qualidade da água baseada nas concentrações de bactérias fecais

( FUJIOKA, 1997):

1. Escherich em 1885 determinou que bactérias coliformes estavam em

elevado número e sempre eram detectadas em fezes e esgoto;

2. Klein e Houston em 1899 reportaram a possibilidade de diluir esgoto

mais de 10’ 000 vez e ainda detectar a presença de bactérias coliformes.

3. Scott em 1932 propôs como standard de qualidade da água marinha

para o banho uma concentração <1000 coliformes/100 mL.

4. Foi realizado por Stevenson em 1953, o primeiro estudo epidemiológico

nos Estados Unidos que reportou a associação entre concentrações

elevadas (˃2000/100 m ) de bactérias coliformes em praias de águas

doces e incidência elevada de enfermidades em banhistas. Importante

destacar que esta relação não foi observada para águas marinhas.

Uma vez reconhecida as limitações dos standards de coliformes, a

Agencia de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA, sigla em

inglês) iniciou em 1972 um projeto, com duração de dez anos, para

desenvolver prioritariamente testes específicos para vários indicadores,

incluindo E.coli, enterococos e Clostridium perfingens. Esses dados eram

necessários para completar um estudo epidemiológico e microbiológico

visando determinar as concentrações de nove indicadores microbiológicos

diferentes da qualidade da água marinha de praias em Nova York city,

Boston e Nova Orleans. Como resultado do estudo, de todos os

microrganismos avaliados, as concentrações de enterococos em águas


marinhas foram as únicas que correlacionaram com a incidência de

enfermidades diarreicas entre banhistas (FUJIOKA, 1997).

Diferentes critérios devem ser levados em conta antes que um

organismo indicador seja considerado confiável para prever risco à saúde

(HACH COMPANY, 2000):

1. O organismo deve ser exclusivamente de origem fecal e estar presente

em residual fecal fresco.

2. O organismo deve estar presente em maior número que o patógeno

associado.

3. O organismo deve ser mais resistente a condições de estresse

ambiental e persistir por maior tempo que o patógeno.

4. Não deve proliferar em grande extensão no ambiente.

5. O organismo indicador deve ser detectado, enumerado e identificado por

métodos simples, confiáveis e baratos.

Dentro dos microrganismos que se enquadram nestes critérios estão

os estreptococos fecais e enterococos (HACH COMPANY, 2000).

Dos estreptococos fecais, S. bovis e S. equinus podem ser

ocasionalmente detectados e não sobrevivem por largos períodos de tempo na

água pelo que provavelmente não podem ser quantificados. Assim, embora

possam ter outros habitats, os enterococos podem ser reconhecidos para

propósito de exame da água, como indicadores de contaminação fecal

(ASHBOLT; GRABOW; SNOZZI, 2001).

Os enterococos são recomendados pela Organização Mundial da

Saúde (WHO) e a Agência Ambiental dos Estados Unidos (EPA) como

indicadores preferenciais de contaminação na avaliação da qualidade

microbiológica de águas marinhas utilizadas para atividades recreacionais

(USEPA, 2012; WHO, 2006). O Canadá e a Austrália destacam o gênero

Enterococcus como indicador padrão na qualidade das águas marinhas

(GUIDELINES FOR CANADIAN RECREATIONAL WATER QUALITY, 2009;

NHMRC, 2008). O Brasil como outros países, tem incluído os enterococos

como um dos indicadores de contaminação, regulamentado para a avaliação

de águas recreacionais marinhas (BRASIL, 2000).

Águas destinadas à recreação incluem como fontes de enterococos

esgoto, residuais agrícolas e urbanos, águas pluviais, fezes de animais,


resíduos de banhistas, barcos, detritos vegetais (Ex: sargaço), água

subterrânea contaminada, solos, sedimentos e areias (BOEHM; SASSOUBRE,

2014)

Resultados interessantes na detecção de enterococos em ambientes

recreacionais têm sido apresentados por diversos autores (BACHOON et al.,

2010; KINZELMAN et al., 2003; PHILLIPS et al., 2011; SATO et al., 2005).

Com o objetivo de selecionar o melhor indicador na avaliação da

contaminação da água marinha foram analisados alguns indicadores

microbianos (coliformes totais e fecais, estreptococos fecais e colifagos) em

águas costeiras de praia por Hamzah et al. (2011) na Malásia. Foi obtido um

aumento no número de coliformes totais (98%), coliformes fecais (86%) e

estreptococos fecais (99%), o que os fêz concluir que esses três parâmetros

microbiológicos podiam ser utilizados na avaliação microbiológica dessas

águas.

Abualtayef et al. (2014) realizaram uma avaliação da qualidade

microbiológica (coliformes fecais, estreptococos fecais e Pseudomonas) em

águas costeiras destinadas à recreação na Faixa de Gaza, Palestina. Foi

utilizada a técnica de membrana filtrante. Os coliformes fecais apareceram em

apenas 61% e as pseudomonas em 31% das amostras analisadas. Os

estreptococos fecais estiveram presentes em 100% das amostras.

O estudo de Maipa, Alamanos e Bezirtzoglou (2001) investigou as

relações entre o número de coliformes totais, coliformes fecais, E. coli,

estreptococos fecais, localização, tempo e fatores sazonais por um período de

quatro anos em água do mar de praias (n=4) do noroeste da Grécia. Para a

detecção dos indicadores foi utilizada a técnica de membrana filtrante. Todos

os indicadores bacterianos apresentaram números elevados nos meses de

verão, mas neste estudo os coliformes fecais e E.coli apresentaram os

melhores resultados como indicadores sensíveis em águas marinhas.

Dionisio et al. (2001) avaliaram a qualidade microbiológica de água

de mar contaminada com esgoto de uma zona importante localizada em Rio

Farmosa (Algarve, Portugal). Os indicadores microbiológicos (coliformes totais,

coliformes fecais, E. coli, estreptococos fecais, colifagos, Pseudomonas

aeruginosa e C. albicans) foram enumerados por filtração com membrana. A

presença de coliformes totais em concentrações superiores às de


microorganismos indicadores de contaminação fecal (coliformes fecais e

estreptococos fecais) sugeriu que a contaminação presente na zona analisada

não era só de origem fecal.

Alm, Burke e Spain (2003) nos Estados Unidos avaliaram o potencial

de areia de água doce e úmida como reservatórios de bactérias intestinais. O

estudo esteve acompanhado da medição das densidades de populações

cultiváveis de bactérias indicadoras fecais na água e na areia a uma

profundidade de 20 cm. A enumeração de bactérias indicadoras em ambos

ambientes foi realizada mediante o uso da técnica de membrana filtrante. Os

enterococos foram mais numerosos no extrato de areias de 5-10 cm de

profundidade e a E. coli foi mais numerosa em 0-5 cm. A areia, em comparação

com a água, resultou mais acumulativa de enterococos do que de E.coli.

Em outro habitat aquático, Byappanahalli et al. (2003) examinaram o

crescimento potencial de E. coli e enterococos na macroalga Cladophora

(Chlorophita). As contagens de E. coli e enterococos foram realizadas mediante

a técnica de membrana filtrante. Foi concluído que os lixiviados de alga

continham substâncias capazes de favorecer o crescimento de E. coli e

enterococos. Os resultados indicaram que Cladophora proporcionou um

ambiente adequado para a persistência por periodos longos e o crescimento

em condições naturais de bactérias indicadoras de qualidade.

A quantificação de bactérias indicadoras fecais em sargaço de

praias marinhas ao longo da costa da California foi realizado por Imamura et al.

(2011) assím como foi examinada a influência da presença de sargaço na

concentração das bactérias indicadoras fecais em sedimentos e água de mar.

A técnica de filtração por membrana foi utilizada para a enumeração de E. coli

e enterococos. Ficou demonstrado que o sargaço de praia é um importante

reservatório de bactérias indicadoras fecais uma vez que sua presença pode

aumentar os níveis dessas bactérias na água e sedimentos marinhos.

Também nos Estados Unidos, Mote, Turner e Lipp (2012)

investigaram a distribuição, persistência e possível crescimento de bactérias

enterocócicas em detritos e comunidades planctônicas em águas costeiras. Os

enterococos associados ao plâncton contribuíram com 95% dos enterococos

cultiváveis na amostra de água bruta. A densidade de enterococos variou

grandemente entre frações de plâncton e datas de coleta.


Piggot et al. (2012) documentaram a presença de enterococos

associados com biofilmes em sedimentos em oito praias do sul da Flórida. Os

níveis de enterococos foram superiores nas areias da zona supratidal onde

eles apresentam uma relação não linear com polímeros extracelulares

excretados (SPE), componente primário do biofilme. Os níveis de enterococos

alcançaram um pico maior a níveis intermediários de SPE o que sugeriu que os

biofilmes promoveram a sobrevivência dos enterococos, mas também inibiram

os enterococos com o desenvolvimento do biofilme nas areias de praia.

Estudos com resultados interessantes na detecção de enterococos

em ambientes aquáticos marinhos no Brasil são particularizados:

Silva et al. (2008) avaliaram as condições higiênico sanitária das

praias de São Luis, estado do Maranhão, mediante a utilização de enterococos

como indicadores. Foi utilizada a técnica de fermentação em tubos múltiplos

para a enumeração de enterococos. Foram encontrados valores elevados de

enterococos (acima do valor máximo permitido) em todas as praias. Os

maiores valores de densidades de enterococos foram obtidos no período

chuvoso.

Oliveira e Pinhata (2008) avaliaram a densidade, a composição

por espécies e a resistência antimicrobiana de bactérias do gênero

Enterococcus em água de mar e areias de duas praias marinhas recreacionais

com diferentes níveis de contaminação no estado de São Paulo. As amostras

de água e de areia foram filtradas e suas membranas foram colocadas em

meio seletivo para sua análise. As duas praias (água e areia) apresentaram

como espécies predominantes E. faecalis e E. faecium. A areia seca

apresentou maiores densidades de Enterococcus sp. e maior frequência de

cepas resistentes do que areia úmida e água de mar.

Os resultados apresentados destacam o papel das diferentes fontes

de enterococos em águas recreacionais como reservatórios e disseminadores

de bactérias indicadoras em ambientes aquáticos.


2.4 Resistência antibiótica

2.4.1 Resistência antibiótica dos Streptococcus

O tratamento com antibióticos pode ser considerado a maior

mudança no ambiente para os organismos comensais e patógenos

(CLAVERYS et al., 2000).

O gênero Streptococcus apresenta uma variedade de genes de

resistência antibiótica (especialmente a macrolídeos, tetraciclinas, cloranfenicol

e aminoglicosídeos) que podem ser levados por elementos genético tais como:

elementos conjugativos e integrativos (ICEs, sigla em inglês), transposons,

plasmídios, bacteriófagos e elementos quiméricos. Determinantes de

resistência antibiótica múltipla são com frequência observados em tais

elementos (VARALDO, MONTANARI; GIOVANETTI, 2009).

Embora não disponíveis mecanismos de resistência intrínsecos para

as diferentes combinações bactéria-antibiótico, a possibilidade na aquisição de

genes de resistência é suficiente no processo. As bactérias têm uma ordem

complexa de mecanismos para compartilhar e disseminar seus determinantes

de resistência úteis (RICE, 1998).

Os mecanismos de resistência variam para os diversos patógenos

representantes do gênero Streptococcus com os diferentes antibióticos. Embora

a resistência a β-lactâmicos continue crescendo, antibióticos como a penicilina

e as cefalosporinas continuam como antibióticos de seleção tradicionais

utilizados no tratamento terapêutico de suas infecções (LIÑARES et al., 2010;

BRENCIANI et al., 2014). Em pacientes com alergia β-lactâmicos,

macrolideos e lincosaminas constituem uma alternativa na terapêutica

(ARDANUY et al., 2010).

Embora uma resistência crescente, a penicilina continua

representando o tratamento de escolha para as infecções provocadas por

Streptococcus pneumoniae (SANDE-BRUINSMA et al., 2008; STEVENS, 2009;

WEBER; DIAS; COSTA, 2010).

A resistência a β-lactâmicos no pneumococo tem emergido com o

desenvolvimento de genes em mosaico codificando proteínas de união à

penicilina alterada (PBPs, sigla em inglês) com afinidade diminuída por

antibióticos β-lactâmicos (CHAMBERS, 1999; HAKENBECK et al., 1999).

Alterações múltiplas das proteínas que se ligam à penicilina são responsáveis


pelas diferenças na resistência de cepas de pneumococos à penicilina e às

cefalosporinas de terceira geração como cefotaxime e ceftriaxone (COFFEY et

al., 1995; DAVIES; SHANG; BUSH, 2006; HAKENBECK et al., 2012 ).

Em Streptococcus pneumoniae a transformação genética natural é

essencial para sua plasticidade. A captação do DNA pneumocócico assim

como DNA de espécies relacionadas presentes no mesmo nicho ecológico (ex.

estreptococos orais) é um mecanismo poderoso para a rápida evolução o que

pode contribuir para a variabilidade do genoma em Streptococcus pneumoniae.

(CLAVERYS et al., 2000).

Estreptococos orais resistentes à penicilina (Streptococcus oralis e

Streptococcus mitis) constituem o reservatório genético para a resistência a β-

lactâmicos em Streptococcus pneumoniae (BRYSKIER, 2002), provavelmente

como doadores de algumas das sequências que substituem partes de genes

"sensíveis" nos genes pbp mosaico de isolados pneumocócicos resistentes à

penicilina (HAKENBECK et al., 1999).

A seleção da resistência à penicilina em S.pneumoniae,

frequentemente, involve a aquisição de mutações em um sistema transportador

de ferro que incrementa a tolerância à acumulação de espécies reactivas do

oxigênio induzidas pelo antibiótico. Isso pode ser traduzido pelo aumento da

sobrevivência que permite a seleção de determinantes de resistência mais

importantes, tais como, a acumulação de mutações pontuais nas PBPs (FANI

et al., 2011).

O incremento da resistência a β-lactâmicos (penicilina e

cefalosporinas) por estreptococos do grupo viridans em pacientes

inmunocomprometidos (oncologia pediátrica e de adultos) tem sido bem

documentado (MARRON et al., 2001; REINERT et al., 2001). Dentro do grupo

viridans, Streptococcus mitis é o grupo que apresenta a maior taxa de

resistência à penicilina (GERSHON et al., 2002; HAN; KANAMA; ROLSTON,

2006; LYYTIKÄINEN et al., 2004).

Afortunadamente, resistência à penicilina não tem sido detectada em

Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae (REINERT et al., 2001)

possivelmente porque estes organismos falham em adquirir plasmídios que

levam um gene β-lactamase, ou o alto custo incorrido quando as proteínas de


união à penicilina envolvidas na síntese da parede celular sofrem mutações

que baixam a afinidade para a penicilina (HORN; ZABRISKIE, 1998).

Embora confirmada a união filogenética de Streptococcus pyogenes

e Streptococcus uberis (WARD et al., 2009), Haenni et al. (2010)

demonstraram que a susceptibilidade diminuída à penicilina pode se observar

em Streptococcus uberis (patógeno ambiental, causa comum de mastites

bovina) após tratamento repetido com concentrações incrementadas da droga

in vitro. A susceptibilidade diminuída foi correlacionada com mutações

específicas em genes que produzem PBPs.

Três mecanismos de resistência aos macrolídeos têm sido

documentados em isolados do gênero Streptococcus (ERGIN; ERCIS;

HAÇELIK, 2006):

(a) Modificação do sitio alvo mediada por metilases de resistência à

eritromicina e codificadas por genes erm(A) e genes erm(B) conferindo

resistência a macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B, expressando o

fenótipo MLSB , expressão que pode ser constitutiva ou induzível (SEPPÄLÄ et

al., 2003)

(b) Efluxo ativo da droga por proteína de efluxo unida à membrana e

codificada pelo gene mef(A) conferindo resistência a macrolídeos (14- e 15-

membros só) expressando o fenótipo M. Duas subclasses do gene mef(A) têm

sido caracterizadas: o gene mef(A) em Streptococcus pyogenes e o gene

mef(E) em Streptococcus pneumoniae . O elemento que carrega o gene mef(A)

é um transposon defectivo (Tn1207.1) e o elemento que contem o gene mef(E)

é um MEGA elemento com uma montagem genética para o efluxo do

macrolídeo (ERGIN; ERCIS; HAÇELIK, 2006).

(c) Mutação no sitio ribosomal 23S rRNA ou genes de proteína

ribosomal expressando fenótipo MS que confere resistência a macrolídeos e

estreptogramina B (SEPPÄLÄ et al., 2003).

Os maiores mecanismos de resistência a macrolídeos em

Streptococcus pneumoniae são a modificação do alvo e o efluxo da droga

(AMBROSE; NISBET; STEPHENS, 2005). A resistência aparece por presença

primariamente do gene erm(B) que tipicamente confere alto nível de resistência

a macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina B (fenótipo-MLSB ) ou mef(A)

que confere baixo nível de resistência a macrolideos apenas (fenotipo-M)


(WIERZBOWSKI et al., 2007). Dos genes mef, a subclasse mef(A) é

amplamente disseminada em S.pneumoniae e S. pyogenes (MINGOIA et al.,

2015) e genes mef(E) são encontrados em S.pneumoniae e outros

estreptococos mas não são comuns em S.pyogenes (KLAASSEN; MOUTON,

2005). A subclasse mef(I), com 91,4% de homologia com mef(A) do transposon

Tn1207.1, também está presente em S.pneumoniae (COCHETTI et al., 2005).

Resistência à tetraciclina (tet(M)), cloranfenicol (cat) e macrolídeos

(erm(B) e/ou mef(A/E)) em S.pneumoniae, conferida pela aquisição de genes

específicos que estão associados por elementos genéticos móveis, incluindo as

famílias dos transposons Tn916 e Tn5252 (WYRES et al., 2013).

Genes erm(A), erm(B), mef(A) e mef(E) têm sido detectados em

Streptococcus agalactiae em diferentes estudos (CAI; KONG; GILBERT, 2007;

DUTRA et al., 2014). Uma variedade de genes de resistência à eritromicina,

tais como mef(A), emr(A), e o mais encontrado erm(B) têm sido associados

com genes de resistência à tetraciclina (VARALDO; MONTANARI;

GIOVANETTI, 2009).

Foi relatada transferência conjugativa de genes de resistência à

eritromicina e tetraciclina (ermA, ermB, mef, tetM and tetO) mediada por

transposon (cTns) pertencente à família Tn916 em estreptococos do grupo B

de isolados humanos e bovinos (PINTO et al., 2014).

Em estreptococos do grupo B, os genes conferindo resistência a

macrolídeos estão em elementos genéticos que resultam da inserção de

elementos transponíveis dentro do genoma de um profago portador

(VARALDO; MONTANARI; GIOVANETTI, 2009).

Em Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis foi demonstrada a

presença do gene erm(T) levado por um plamídio quase idêntico ao encontrado

em S.pyogenes e S.agalactiae o que evidencia a transferência horizontal de um

plasmídio que leva erm(T) entre estreptococos (PALMIERI et al., 2013).

Três genes de resistência à eritromicina têm sido identificados em

Streptococcus pyogenes. O determinante erm(B), uma subclasse erm(A)

comumente referida como erm(TR) e um determinante menos conhecido

erm(T) (VARALDO; MONTANARI; GIOVANETTI, 2009). Enquanto erm(TR) e

erm(T) codificam para a resistência induzível à eritromicina, o gene erm(B)

pode codificar resistência constitutiva em alguns Streptococcus pyogenes e


induzível em outros (BRENCIANI et al., 2012). Em Streptococcus pyogenes

tem sido caracterizados uma variedade de elementos genéticos que levam erm

para transferir resistência à eritromicina, incluindo diversos elementos

integrativos e conjugativos (ICEs, sigla em inglês) levando erm(TR) (CAMILLI

et al., 2008; BRENCIANI et al., 2011; GIOVANETTI et al., 2012) e plasmídeos

estreitamente relacionados levando erm(T) (WOODBURY et al., 2008;

PALMIERI et al., 2013).

fago Фm46.1, comum em S.pyogenes, transporta os genes de

resistência mef(A) e tet(O) (BRENCIANI et al., 2010) e não tem sido relatados

em outras espécies mas é transferível in vitro entre isolados de S.pyogenes

(GIOVANETTI et al., 2003; DI LUCA et al., 2010). Experimentos de

transferência e retransferência do fago em S.pyogenes e S.suis demonstraram

que S.pyogenes é o hospedeiro natural e usual do fago Фm46.1 (GI VANE I

et al., 2015).

A distribuição de fenótipos resistentes a macrolideos entre

estreptococos viridans é semelhante aos encontrados em S.pyogenes, com

predominância do fenótipo M. O gene erm(B) que codifica para o fenótipo MLSB

é o mesmo no grupo dos estreptococos viridans que em S.pneumoniae.

(SEPPÄLÄ et al., 2003). O gene mef(E), transportado tipicamente por um mega

elemento, foi substituído por mef(G) em uma variante do mega elemento em

Streptococcus mitis (S.mitis) (BRENCIANI et al., 2014). mef(I) tipicamente

unido a catQ (gene que codifica resistência ao cloranfenicol) no elemento único

nomeado módulo Q (MINGOIA et al., 2015) foi substituído por mef(E) em

variantes do módulo IQ de diferentes espécies do grupo viridans (BRENCIANI

et al., 2014).

Determinantes de resistência em Streptococcus suis à tetraciclina,

macrolídeos, aminoglicosídeos, cloranfenicol, e sais de cádmio entre outras

drogas têm sido recentemente identificados. Os genes de resistência são

levados por elementos genéticos similares àqueles reportados em outros

patógenos como Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e

Streptococcus agalactiae, compartindo igual sitio de inserção no cromossomo

bacteriano (PALMIERI; VARALDO; FACINELLI, 2011).


2.4.1.1 Estudos de resistência antibiótica e de mecanismos de resistência em

patógenos do gênero Streptococcus.

Um estudo multicêntrico de vigilância global de patógenos do trato

respiratório superior "PROTEKT" (sigla em inglês) foi realizado por Mendes et

al. (2003). Isolados de Streptococcus pneumoniae (518) e S.pyogenes (277)

entre outros, foram avaliados para sua susceptibilidade frente a diferentes

antimicrobianos (beta-lactâmicos, macrolídeos e glicopeptídeos entre outros),

em diferentes centros de Argentina, Brasil (Brasília, Florianópolis e São Paulo)

e México. Em todos os casos, Streptococcus pyogenes permaneceu

susceptível à penicilina. Consideráveis variações na resistência à penicilina

foram observadas entre os diferentes centros dos países participantes. No

Brasil, a resistência à penicilina variou de < 5% em três centros a 30% em

Brasilia. Alta prevalência de resistência a macrolídeos foi observada com

15,3% de resistência à eritromicina incluindo 6,5% relatada no Brasil (a mais

baixa em relação ao México-27,6% e Argentina-10,9%). Todos os isolados

foram susceptíveis a vancomicina e teicoplanina.

Megged et al. (2013) investigaram a incidência de mecanismos de

resistência a macrolídeos em isolados de estreptococos β-hemolíticos e

pneumococos em Israel. As taxas de resistência à eritromicina e clindamicina

foram 19,4% e 13,4% para S.pneumoniae e 4,7% e 1,6% para estreptococos

do grupo A (GAS, sigla em inglês), 17% e 17% para estreptococos do grupo B

(GBS, sigla em inglês), e 38,8% e 27,8% para estreptococos do grupo G (GGS,

sigla em inglês), respectivamente. O mecanismo de resistência mais comum

para todos os estreptococos foi MLSB constitutiva (cMLSB). A prevalência de

resistência a macrolídeos e a distribuição de mecanismos de resistência difere

entre estreptococos β-hemolíticos e S.pneumoniae, com GBS, GGS e

S.pneumoniae apresentando as mais altas taxas de resistência.

A resistência a macrolídeos e tetraciclina de 898 isolados de

estreptococos grupo A coletados de 1994-2006 na Espanha, foi estudada por

Rubio-López et al. (2012). Duzentos e noventa e cinco isolados (32.8%)

apresentaram resistência à eritromicina. O fenótipo mais comum de resistência

a macrolídeos foi o fenótipo M (76,9%) seguido do fenótipo constitutivo cMLSB

(20.3%), induzível iMLSB (2.7%) com envolvimento dos seguintes genes de

resistência: mef(A) (89.5%), msr(D) (81.7%), erm(B) (37.3%) e erm(A) (35.9%).


Por outro lado, 61 isolados foram resistentes à tetraciclina. Os genes de

resistência à tetraciclina tet(O) e tet(M) foram similares a tet(M), alcançando

valores de cerca de 40%. Genes erm(B) e tet(M) estiveram representados em

quase todas as cepas, enquanto erm(A), mef(A) e tet(O) apareceram em

menos da metade delas.

A epidemiologia de isolados de estreptococos do grupo A (GAS,

sigla em inglês) assim como a caracterização dos mecanismos de resistência a

macrolídeos e seus fenótipos, foi motivo de estudo de Huang et al. (2014).

Foram testados onze antibióticos (penicilina, ceftriaxone, cefotaxima, cefepime

eritromicina, clindamicina, tigeciclina, tetraciclina, vancomicina, levofloxacina e

linezilida). Não foi observada resistência à penicilina, ceftriaxone e

vancomicina. As taxas de resistência à eritromicina, clindamicina e tetraciclina

foram de: 16.4%, 2,1% e 63,8%, respectivamente. A taxa de resistência à

tetraciclina foi superior em isolados resistentes à eritromicina (90,6%)

comparada com a de isolados sensíveis à eritromicina (77,0%). O fenótipo M

(70,9%) foi o fenótipo mais comum de resistência a macrolídeos em isolados

resistentes à eritromicina com todos os isolados, exceto um, apresentando

mef(A).

Nakamura et al. (2011) realizaram um estudo de 100 isolados

clínicos de Streptococcus agalactiae recobrados do trato genitourinário de

pessoas não grávidas no Rio de Janeiro durante o período de Janeiro/2008 a

Agosto/2009. Todos os isolados foram susceptíveis a ceftazidime, penicilina e

vancomicina. Foi observada resistência à clindamicina (5%), eritromicina (11%)

e tetraciclina (83%) e resistência intermediária à eritromicina (4%) e tetraciclina

(6%). Isolados com valores intermediários e de resistência à eritromicina

apresentaram os seguintes fenotipos: M (n = 3), resistência constitutiva (cMLSB

n = 5) e resistência induzível (iMLSB n = 7). Determinantes de resistência erm e

mef foram detectados em isolados apresentando os fenotipos MLSB and M,

respectivamente.

Um total de 392 isolados de estreptococos grupo B, incluindo 363

cepas de humanos e 29 de origem bovino foram analisados por Pinto et al.

(2013) no Brasil. Todas as cepas foram susceptíveis à penicilina, vancomicina

e levofloxacina. Resistência a clindamicina (20.7%-bovino e 1.9%-humano),

cloranfenicol (1,5%-humano), eritromicina (27.6%-bovino e 4%-humano),


rifampicina (0,7%-humano) e tetraciclina (89.6%-bovino e 89.2%-humano) foi

observada. Entre as cepas resistentes à eritromicina foram detectados os

genes: mef(A)/(E), erm(A) e principalmente erm(B). Fenotipos MLSB

constitutivo e M foram igualmente distribuídos entre 23 isolados resistentes à

eritromicina. O fenótipo constitutivo MLSB prevaleceu nos isolados bovinos

(75%) e o fenótipo M prevaleceu entre os humanos (60%).

A prevalência e as bases genéticas da resistência a MLSB,

tetraciclina, cloranfenicol e kanamicina em 164 isolados de estreptococos do

grupo viridans (GVS, sigla em inglês) da microbiota humana foram estudadas

por Zolezzi et al. (2004). De 164 isolados, 125 foram identificados como

Streptococcus mitis, 28 Streptococcus oralis, 7 Streptococcus sanguinis, 3

Streptococcus salivarius e 1 foi identificado como Streptococcus anginosus. O

fenótipo M foi o prevalente entre VGS (59,15%). Único fenótipo encontrado

para Streptococcus sanguinis. O segundo fenótipo predominante foi MLSB

constitutivo com Streptococcus oralis exibindo a mais alta porcentagem

(46,43%). O fenótipo MLSB induzível foi o menos frequente entre GVS. O gene

erm foi detectado em todas as cepas com fenotipo MLSB constitutivo e

induzível. Este gene foi encontrado em combinação com o gene mef(A/E) em

45,76% dos isolados com fenótipo constitutivo MLSB e no 52,63% dos isolados

com fenotipo induzível MLSB. Nenhum dos isolados continha o gene erm(A),

subclasse erm(TR), erm(A), ou erm(C).

Isolados de estreptococos (99) (compreendendo S.pneumoniae

n=15, e do grupo viridans [n=84; por ex. Streptococcus salivarius (n=30),

Streptococcus mitis (n=17), Streptococcus sanguinis (n=11), Streptococcus

oralis (n=10), Streptococcus parasanguinis (n=6), Streptococcus gordonii (n=3),

Streptococcus infantis (n=3), Streptococcus cristatus (n=2), Streptococcus

anginosus (n=1) e Streptococcus australis (n=1)] ) resultados da expectoração

de 25 pacientes adultos com fibrose cística, foram examinados para avaliação

de resistência à eritromicina. Setenta e quatro por cento dos isolados foram

resistentes à eritromicina dos quais 25,3% apresentaram o gene erm(B), 1,0%

o gene mef(A), 75,8% mef(E) e erm(B)+mef(E) 11,1%. Pneumococcus foram os

mais susceptíveis à eritromicina (60% dos isolados resistentes). Organismos do

grupo viridans podem agir como reservatório de determinantes de resistência a

macrolídeos para outros patógenos (TAZUMI et al., 2009).


Leclercq et al. (2005) estudaram 128 isolados identificados como

Streptococcus gallolyticus (Streptococcus bovis), incluindo isolados clínicos,

três isolados de gato e dois de cachorro coletados no período de 1994 – 2003.

Setenta e seis isolados (59,4%) apresentaram valores intermediários ou

resistentes à eritromicina. Entre eles, 64 (84,2%) apresentaram resistência

cruzada à eritromicina e clindamicina indicando um fenótipo induzível iMLSB.

Um isolado mostrou valores intermediários à eritromicina e susceptível à

clindamicina indicando fenótipo M. Foi observada alta resistência à tetraciclina

(77,7%). Com frequência foi detectada resistência combinada à eritromicina e

tetraciclina. Das 76 cepas resistentes à eritromicina, foi observada a presença

de genes erm(B) em 73, uma contendo mef(A) e duas erm(B)+mef(A). Entre os

isolados resistentes à tetraciclina (77,7%), o determinante mais comum foi

tet(M).

A susceptibilidade à penicilina, eritromicina, clindamicina e

telitromicina foi investigada em 155 isolados de estreptococos do grupo viridans

(VGS, sigla em inglês) e 18 isolados de Streptococcus bovis isolados de

sangue no período de 1998-2003. Dos 155 VGS, 72 isolados pertenciam ao

grupo Streptococcus mitis, outros grupos incluíam Streptococcus anginosus (49

isolados), Streptococcus sanguis (21 isolados), Streptococcus salivarius (11

isolados) e Streptococcus mutans (2 isolados). S.mitis mostrou a mais alta taxa

de resistência à penicilina, 45%. Além disso, de 13 cepas com alta resistência à

penicilina, 12 pertenciam ao grupo S.mitis e uma ao grupo S.salivarius. As

porcentagens de resistência à eritromicina e clindamicina foram de 45,6% e

27,7%, respectivamente. A resistência à eritromicina variou por espécies. Os

isolados do grupo S.bovis apresentaram as mais altas taxas de resistência à

eritromicina e clindamicina. Sessenta e um por cento dos isolados resistentes à

eritromicina apresentaram fenótipo constitutivo cMLSB (com fenótipo

predominante em S.anginosus e S.bovis), 35% com fenótipo M (fenótipo

predominante em S.sanguis e S.salivarius) e 4% de fenótipo induzível iMLSB.

Genes erm(B) estiveram presentes em todos os isolados do fenótipo

constitutivo e induzível MLSB e ausentes em todos os isolados com fenótipo M.

mef(A) foi detectado na maioria dos isolados com fenótipo M e em 8 isolados

com fenótipo constitutivo cMLSB. Estas cepas foram S.mitis (4), S.anginosus

(3) e S.bovis (1) (RODRIGUEZ-AVIAL et al., 2005).


2.4.2 Resistência antibiótica dos Enterococcus

É cada vez mais frágil a barreira que separa o grupo Enterococcus

como grupo inofensivo de bactérias comensais do trato gastrointestinal de

animais de sangue quente, daquelas bactérias patógenas causais de sérias

infecções de importância clínica (GIRAFFA, 2002).

Depois da introdução com sucesso dos antimicrobianos na terapia

de diferentes infecções, numerosos patógenos têm apresentado diferentes

estratégias de resistência aos antimicrobianos incluindo modificação e

inativação da droga, exclusão do antibiótico e alteração do alvo (GROHMANN;

MUTH; ESPINOSA, 2003).

A plasticidade genética do gênero Enterococcus, sua habilidade em

adquirir e/ou desenvolver rapidamente resistência contra antimicrobianos de

importância clínica e transferir esses determinantes de resistência a outros

micro-organismos mais patogênicos tornam um desafio, o tratamento

terapêutico das infecções causadas por eles (KOCH et al., 2004).

A resistência no gênero Enterococcus pode ser dividida em dois

tipos gerais. A resistência inerente ou propriamente intrínseca, presente em

todas ou na maioria das espécies, e na resistência adquirida (MURRAY, 1990).

2.4.2.1 Resistência intrínseca

A resistência intrínseca é aquela codificada dentro do núcleo do

genoma (KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014). Os enterococos possuem

resistência intrínseca a muitos antibióticos β-lactâmicos, cefalosporinas,

lincosamidas e em menor escala a aminoglicosídios (ARIAS; CONTRERAS;

MURRAY, 2010; TAVARES, 2000).

Dois mecanismos estão envolvidos na resistência a β-lactâmicos:

alterações das proteínas de união à penicilina e a produção de β-lactamase

(FONTANA et al., 1990; ARIAS ; M RRA , 2012). s antibióticos β-lactâmicos

inibem o crescimento bacteriano por servir de substrato suicida para as

proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs). ma vez modificado o antibiótico β-

lactâmico, as PBPs são inativadas, evitando assim, a síntese contínua da

parede celular (KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014). A maioria dos isolados

clínicos de E.faecium com resistência a β-lactâmicos estão associados a

mutações ou superprodução de PBPs (MURRAY, 2000)


O mecanismo associado a β-lactamases é raramente encontrado em

Enterococcus. Udo et al. (2003) realizaram um estudo de prevalência e

resistência antimicrobiana em isolados de enterococos de hospitais em Kuwait.

Foram analisados 415 isolados de amostras clínicas dos quais 12,5% foram

resistentes ampicilina, mas não foi detectada atividade β-lactamase.

Embora seja rara a resistência mediada por β-lactamases em

Enterococcus, esse fato já foi relatado em isolados clínicos de E.faecalis

(MURRAY; MEDERSKI-SAMAROJ,1983).

Em relação à ampicilina, é conhecida que modificações na PBP5

estão associadas ao aumento na expressão da resistência, mas a maioria dos

estudos que reportam esta associação tem sido realizada em isolados clínicos

não isogênicos, onde poderiam estar implicados outros fatores desconhecidos

além das PBP5 (KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014).

A terapia bactericida de infecções enterocócicas, normalmente,

requer o uso combinado e sinérgico da adição de um aminoglicosídio a um β-

lactâmico (MAROTHI; AGNIHOTRI; DUBEY, 2005). As bactérias do gênero

Enterococcus apresentam um nível de resistência aos aminoglicosídios de

baixo a moderado o que está relacionado com o baixo nível de captação ou

permeabilidade desses agentes o que pode ser incrementado pela adição de

um β-lactâmico (CHO, 2000; SOOD et al., 2008).

Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium possuem resistência

intrínseca às cefalosporinas. É conhecido que um grupo de determinantes

genéticos intervém nesta resistência como, por exemplo, proteínas ligadoras de

penicilina (Pbp5) de baixa afinidade, dois componentes do sistema de

transdução de sinais e uma das enzimas envolvida na síntese de precursores

de peptidoglicano (Mur AA) entre outros. Por outro lado, os Enterococcus são

intrinsecamente resistentes à clindamicina, resistência mediada pelo produto

do gene 1sa, mas esta resistência é ainda pobremente definida (KRISTICH;

RICE; ARIAS, 2014).

Com relação à resistência a macrolídeos e a lincosaminas, os genes

erm e mef têm sido descritos, sendo erm(B) o predominante em enterococos

(88%). Um segundo mecanismo de resistência a lincosamidas tem sido

descrito em E. faecium, mecanismo mediado pela enzima lincosamida


nucleotidil transferase (linB), que cataliza a 3-(5´-adenilación) da lincomicina e

a clindamicina (ABRIOUEL et al., 2008).

2.4.2.2 Resistência extrínseca

A resistência adquirida pode ser por mutação no DNA já existente o

que ocorre durante o processo reprodutivo da bactéria e resulta em erros na

sequência de bases que formam o DNA cromossômico; ou pela aquisição dos

genes causadores do fenômeno, constituindo uma resistência transferível. Esta

resistência faz-se através dos mecanismos de transdução (mediada por

bacteriófagos), transformação (captação do DNA livre resultante de lise

bacteriana) e conjugação (contacto célula-célula com transferência de

plasmídios ou transposons) (COSTA; LOUREIRO; MATOS, 2013; BARBOSA ;

LEVI, 2000; LIVERMORE, 2003).

Os genomas de enterococos multirresistentes consistem em mais de

25% de elementos móveis, indicando a acumulação de elementos de

resistência a drogas e a fatores de virulência (PAULSEN et al., 2003).

Os Enterococcus, com frequência, adquirem resistência através do

intercâmbio de genes que codificam a resistência realizada sobre transposons

conjugativos, plasmídios responsáveis das ferromonas e outros plasmídios de

ampla gama de hospedeiros (HUYCKE; SAHM; GILMORE, 1998).

A resistência a glicopeptídeos está caracterizada pela presença dos

genes van, sendo os fenótipos VanA e VanB os de maior importância clínica e

com maior incidência em E.faecium. Os genes van estão localizados em

plasmídios ou transposons, o que facilita sua disseminação mediante

transferência horizontal (ABRIOUEL et al., 2008).

Elementos genéticos móveis estão frequentemente presentes no

grupo Enterococcus. Determinados plasmídios enterocócicos apresentam um

amplo espectro de hospedeiros entre bactérias Gram positivas, mas só são

expressos no acoplamento sobre superfícies sólidas. Outros plasmídios são

mais específicos de enterococos, cuja transferência eficiente pode se realizar

em caldo e codifica uma resposta a ferromonas produzidas pelo receptor

(CLEWELL, WEAVER, 1990).

Os transposons conjugativos (elementos não plasmidíais) estão

amplamente disseminados entre os enterococos e são elementos DNA móveis


codificando todas as funções necessárias para a transposição intracelular e a

conjugação intercelular (GROHMANN; MUTH; ESPINOSA, 2003).

Genes tet que expressam a resistência à tetraciclina, tet(K) e tet(L)

codificam para bombas de efluxo, sendo tet(L) o mais frequente em

enterococos, podendo estar localizado no cromossomo bacteriano ou em

plasmídios conjugativos. Por outro lado, genes tet(M), tet(O) y tet(S) codificam

para proteínas que proporcionam resistência a tetraciclina e a minociclina

mediante proteção do ribossomo, sendo tet(M) o mais comum em enterococos.

Geralmente está localizado no cromossomo associado a elementos

transponíveis do tipo Tn916 ou pode estar presente em plasmídios

conjugativos (ABRIOUEL et al., 2008).

2.4.2.3 Estudos de resistência antimicrobiana e de transferência de resistência

em Enterococcus

Gomes et al. (2008) avaliaram a prevalência de Enterococcus spp.

em alimentos no Brasil (leite pasteurizado e cru, produtos cárneos, queijos e

vegetais). Foram aplicados protocolos fenotípicos e de PCR para a

identificação das espécies. Foram realizadas provas de gelatinase, hemolisinas

e hidrólises dos sais biliares a todos os isolados de enterococos. Foram

comprovados os determinantes de virulência e a susceptibilidade

antimicrobiana em isolados de E. faecalis e E. faecium. Os isolados resistentes

aos antimicrobianos foram avaliados para a formação de biofilme e aderência a

células de mamífero. De 120 amostras de alimento analisados, 52,5% foram

positivos para enterococos (carne e queijo foram os alimentos mais

contaminados). E. faecium foi a espécie mais frequente. A resistência

antibiótica (gentamicina, tetraciclina e eritromicina) e os genes que codificam os

determinantes de virulência, foram mais frequentes em E. faecalis que em E.

faecium. Isolados de E. faecium e E. faecalis antibiótico resistentes foram

agrupados por amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD-PCR, sigla em

inglês) e foi notada uma distribuição dispersa. A resistência não esteve

relacionada a um clone particular. A disseminação dos fatores de virulência e

da resistência das duas espécies em isolados e diferentes tipos RAPD,

destacou o potencial patogênico das duas espécies.


O primeiro relato da ocorrência de isolados de E. faecium

vancomicina resistentes (VRE, sigla em inglês) em água potável, efluentes e

ambientes aquáticos, foi realizado por Morris et al. (2012). Duzentos e

dezessete (217) isolados de E. faecium foram enumerados (50 de efluente e

167 de outras fontes de água). Isolados de enterococos resistentes à

vancomicina foram detectados na saída da planta de tratamento de água

residual e em uma só amostra de água potável sugerindo uma potencial

transmissão a humanos através da contaminação ambiental.

Castillo-Rojas et al. (2013) determinaram os perfis bioquímicos e a

susceptibilidade antimicrobiana de isolados de E. faecalis e E. faecium de

amostras clínicas e ambientais (águas subterrâneas, água de pântano da

cidade de Xochimilco e águas tratadas da área Metropolitana da cidade de

México). Foram estudados 121 isolados, 30 de amostras clínicas e 90 de

amostras ambientais. A identificação de espécies foi realizada mediante o

ensaio Multiplex-PCR. Vinte e oito (28) cepas foram analisadas mediante

eletroforese de campo pulsante (PFGE, siglas em inglês). Os isolados clínicos

apresentaram maior resistência antimicrobiana que os isolados de água.

Embora algumas cepas parecessem estar relacionadas, isolados de humanos

e clínicos apresentaram alta diversidade genética em PFGE. Os autores

concluíram que os enterococos isolados de humanos e da água foram

geneticamente diferentes, mas a água poderia representar uma rota de

transmissão e uma fonte de genes de resistência que poderiam facilmente ser

transmitidos a outras espécies bacterianas diferentes.

Novais et al. (2005) analisaram isolados de enterococos

vancomicina resistentes de esgotos de hospitais e amostras de água de rio na

cidade de Porto, Portugal. Foram coletadas 26 amostras: doze de esgoto, de

água a montante dos hospitais, e 14 foram coletadas de águas à jusante das

instituições de saúde. Foi utilizado o ensaio Multiplex-PCR para a identificação

das espécies e da resistência antimicrobiana. Os isolados de enterococos

resistentes à vancomicina (VRE, sigla em inglês) foram genotipados mediante

eletroforese em gel de campo pulsante (PFGE, sigla em inglês) Foram

investigados os genes que codificam a resistência a aminoglicosídios,

estreptograminas e macrolídios assim como alguns determinantes de

virulência. Experimentos de conjugação foram realizados. Foram detectados


genes vanA, vanB e vanC1 nos isolados VRE de enterococos. A transferência

de vanA foi obtida em 54% dos isolados. Quatro dos transconjugantes

albergaram vanA, genes de alta resistência à gentamicina e eritromicina,

erm(B), aph(2) e determinantes de virulência. Foram identificados nove tipos

através de PFGE entre isolados VRE de esgoto e dois tipos de isolados VRE

do estuário. Os perfis de resistência antibiótica e de virulência variável entre

isolados de diferentes tipos PFGE sugeriram possíveis eventos de

transferência horizontal de múltiplos genes. Foi concluído que clones

particulares e elementos móveis levando genes de resistência e determinantes

de virulência associados a instituições de saúde poderiam estar contaminando,

continuamente, o ambiente comunitário através das águas residuais.

Em um estudo analisando a abundância e diversidade de bactérias

do gênero Enterococcus de amostras hospitalares na cidade de Porto Alegre

(RG, Brasil) foi constatada a maior frequência de E. faecalis (92,8%) entre os

isolados e a dominância de um clone, resistente a gentamicina, originário de

diferentes hospitais. Esses resultados sugeriram a existência de disseminação

intra e inter hospitalar de grupos clonais de E. faecalis carreando genes de

resistência (D A EVED ; DIAS; TEIXEIRA, 2006).

Maki et al. (2009) analisando a sequência nucleotídica completa do

plasmídio relacionado à resistência pKL0018R, extraído da bactéria patogênica

para peixes, Lactococcus garvieae, encontraram uma sequência de genes

estruturais de 12Kb (genes “backbone”) idêntica a do plasmídio pRE25 extraído

de bactérias E. faecalis isoladas de linguiças fermentadas cruas. Esse

resultado comprovou a relação direta entre os dois plasmídios e sua

capacidade de propagação no ambiente. Isso sugere que essa sequência

estrutural do plasmídio possui uma ampla gama de hospedeiros e que, por

isso, é capaz de disseminar elementos genéticos móveis contendo genes de

resistência no ambiente.

Essa proximidade com outros grupos bacterianos através da troca

de elementos genéticos móveis é uma característica apresentada pelos

Enterococcus e que tem relação com a maleabilidade genômica desse gênero.

A capacidade em adquirir e transferir determinantes de resistência e a

habilidade inerente de resistir a agentes antimicrobianos são atributos


determinantes na habilidade de adaptação dessas bactérias em ambientes

severos (ARIAS ; MURRAY, 2012).


3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Contextualização da área de estudo

3.1.1 Características sócio-económicas do Bairro Meireles

O bairro do Meireles com 2,58 Km2 de extensão possui uma

densidade populacional de 36,982 habitantes representando 1,5% da

população de Fortaleza, pertence à Secretaria Executiva Regional II. Bairro

verticalizado, considerado o mais rico de Fortaleza com uma renda média

anual de R$3659,54. Em relação à saúde, o bairro, não tem hospital distrital

nem Distrito de Saúde, mas possui a Escola Nacional de Saúde e uma grande

parte das unidades privadas vinculadas ao Sistema Único de Saúde (SUS) em

Fortaleza. Em relação ao abastecimento de água, esta é considerada excelente

com 96,73% dos domicílios conectados à rede de abastecimento pública.

Contudo, isso não quer dizer que neste bairro não existam problemas de

pobreza e desigualdade (IPECE, 2012 ).

Meireles, bairro elitizado e com alto atendimento pela rede de

esgotamento sanitário, apresenta problemas pelas ligações clandestinas de

suas galerias pluviais, já que em lugar de realizar o escoamento das águas de

chuva funciona como esgoto clandestino liberando diretamente no mar, e desta

forma contaminando a orla de Fortaleza (CAMILA, 2010; BENTO, 2011).

3.2 Georreferenciamento dos Pontos de coleta

Foram selecionadas duas galerias pluviais: Galeria Riacho Maceió

(G1) e galeria em frente à praia do Meireles (G2) e dois pontos de água do mar

adjacente a cada galeria (P1 e P2) respectivamente na cidade de Fortaleza,

Ceará (Figura 1). Os locais de coleta foram georreferenciados com o uso de

equipamento de geolocalização (GPS) Garmin III Plus. Os pontos de coleta nas

galerias G1 e G2 estão localizados nas coordenadas: lat. -3º 43' 21.9174” long.

-38º 29' 3.048” e lat. -3º 43' 21.6768” long. -38º 30' 17.2038”. As coordenadas

dos pontos de coleta nos pontos de água do mar (“P1 e P2) são: lat. -3º 43’

19.1712” long. -38º 29' 2.1588” e lat. -3º 43' 20.3766” long. -38º 30' 16.5852”,

respectivamente.


Figura 1 – Localização geográfica das galerias (G1 e G2) e dos pontos de água do mar (P1 e

P2) na cidade de Fortaleza-CE.

3.3 Procedimento de coleta

Foram realizadas cinco coletas contínuas com periodicidade

semanal nos quatro pontos selecionados: galerias G1 e G2; pontos de água do

mar adjacentes a cada galeria (P1 e P2). Para sua análise, cada amostra foi

coletada em frasco de vidro âmbar estéril com capacidade de 1L e transportada

para o laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado (LAMAP) do

Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR) da Universidade Federal do Ceará

(UFC), em um tempo inferior a 30 minutos. Todas as coletas foram realizadas

no período da manhã e com observações da ocorrência de chuva em dias

anteriores.

3.3.1 Determinação dos parâmetros físico-químicos

No momento da coleta foi conferida a temperatura das amostras de

água com auxílio de um termômetro (INCOTERM). Foram medidos em

laboratório a salinidade, através de um refratômetro de marca ATAGO S/MILL,

e o pH, utilizando-se um potenciômetro de marca MARCONI-PA 200P.


Foram levados em conta os dados pluviométricos registrados pela

estação de Castelão (orla de Fortaleza), dois dias anteriores e no dia da coleta,

mediante consulta na página da WEB da Fundação Cearense de Meteorologia

(FUNCEME, 2015).

3.4 Quantificação de Streptococcus sp. e Enterococcus sp.

Bactérias dos gêneros Streptococcus e Enterococcus foram

quantificadas pelo método de Contagem Padrão em Placa (CPP) de acordo

com World Health Organization (WHO, 2000), utilizando- se a técnica da

membrana filtrante (APHA-AWWA-WPCF, 1992). Para favorecer o isolamento

e recuperação de bactérias do gênero Streptococcus, foi utilizado um

enriquecimento em caldo Todd-Hewitt (Composto) recomendado para a

estimulação do crescimento, uma vez que esses organismos crescem

lentamente e requerem fatores adicionais para seu isolamento e identificação

(FACKLAM, 2002).

Assim as amostras, após homogeneização, foram diluídas em salina

a 0,85% (10-1 a 10-5). Cada diluição foi preparada em duplicata e filtrada

utilizando-se membranas de Éster de celulose (45 µm de poro - 47 mm de

diâmetro). Uma membrana de cada diluição foi colocada em caldo Todd-Hewitt

por duas horas à temperatura ambiente para favorecer o crescimento. Todas

as membranas foram colocadas sobre a superfície de uma placa contendo

Ágar m-Enterococcus (BD-Difco) como meio seletivo, com incubação por 48 h

a 35ºC. Colônias com coloração vermelha, castanha ou rosa, foram

quantificadas e replicadas em caldo e Ágar Brain Heart Infusion (BHI - meio

composto) com incubação a 35°C ± 0,2oC por 24 h/cada para sua posterior

confirmação em gênero. As contagens foram expressas em Unidades

Formadoras de Colônias (UFC)/ 100 mL de amostra testada.

Os procedimentos descritos acima estão apresentados na forma de

esquema na figura 2


Figura 2 - Fluxograma dos procedimentos para a quantificação de Streptococcus e

Enterococcus nas galerias G1 e G2 e nos pontos de mar P1 e P2, em Fortaleza, Ceará.

3.4.1 Análises estatísticas

Na comparação dos maiores valores das contagens de

estreptococos e enterococos e no número de isolados por cada tipo de amostra

analisada com e sem a utilização do caldo Todd-Hewitt foi utilizada a prova não

paramétrica Wilcoxin Exato (FIELD, 2009).

3.5 Identificação de bactérias dos gêneros Streptococcus e Enterococcus

3.5.1 Identificação em gênero

Todos os isolados foram testados para as seguintes características

do gênero Enterococcus: cocos gram positivos, agrupados aos pares ou

cadeias curtas, catalase negativa, hidrólise da esculina, crescimento em caldo

BHI a 45ºC por 24 horas e em presença de 6,5% de NaCl (MANNERO;

BLANCH, 1999). Semelhantes características morfológicas e tintoriais, catalase

negativa, esculina variável, sem crescimento em caldo BHI a 45ºC por 24 horas


e em presença de 6,5% de NaCl foram consideradas positivas para o gênero

Streptococcus (FACKLAM; ELLIOT, 1995; KONEMAN et al., 2001).

3.5.2 Identificação em espécie

A identificação em espécies foi realizada por meio de testes

bioquímicos convencionais, segundo Mannero e Blanch (1999), baseados na

fermentação dos carboidrados: manitol (Difco, EUA), sorbitol (Merck,

Alemanha), arabinose (Inlab, Brasil), rafinose (Inlab, Brasil), sacarose

(Reagem, Brasil) e lactose (Inlab, Brasil); na descarboxilação da arginina

(Difco, EUA); detecção da produção de pigmento amarelo, hemólises em ágar

sangue e motilidade-SIM. A prova da hidrólise da L-pirrolidonil-β-naftilamida

(PYR- sigla em inglés) foi realizada e interpretada segundo especificações do

fabricante e conforme sugerido por Koneman et al. (2001). Na fermentação de

carboidratos e a descarboxilação da arginina foi utilizado o vermelho de fenol

(Merck-Germany) como indicador de pH.

3.5.2.1 Prova de fermentação de carboidratos

A fermentação dos carboidratos foi realizada utilizando-se uma

solução de vermelho de fenol (VF) como indicador (0,018 gramas de VF por

cada 100mL de água destilada). A base foi preparada a partir de componentes:

10g de bactopeptona (Difco, França); 3 g de extrato de carne (Difco, França);

um grama de dextrose (Difco, França) foi acrescida de cinco gramas de cada

carboidrato (Glicose, lactose, e manitol). Os carboidratos arabinose, rafinose e

sorbitol, foram filtrados com membranas de Ester de celulose (45 µm de poro -

47 mm de diâmetro). Tubos preparados com e sem (controle) carboidratos

foram inoculados com 100µl da bactéria a partir de uma cultura com 18-24

horas de crescimento, a 35°C. Os resultados foram acompanhados durante 5

dias em incubação a 35 ± 0,2°C e foi considerado positivo quando a cor do

meio alterava de rosa para amarelo intenso (Figura 3).


Figura 3 -. Caracterização fenotípica de bactérias dos gêneros Streptococcus e Enterococcus

baseada na fermentação de carboidratos: manitol, sorbitol, arabinose, rafinose, sacarose e

lactose.

(Fonte: LAMAP)

3.5.2.2 Prova da descarboxilação da arginina

A fermentação da arginina foi realizada utilizando-se uma solução de

vermelho de fenol (VF) como indicador (0,02 gramas de VF por cada 100 ml de

água destilada). A base (1000 ml) foi preparada a partir de componentes: 10 g

de bactopeptona (Difco, França); 3 g de extrato de levedura (Difco, França); um

grama de dextrose foi acrescido de 5 gramas de D-arginina (Difco, França)..

Paralelamente, cada cepa foi inoculada em um tubo contendo o mesmo meio

basal, porém sem arginina (controle). Após a inoculação de 100µl da bactéria,

foi acrescentado, assepticamente, 1 mL de óleo mineral estéril, seguido por

incubação até 7 dias. O meio inoculado tem viragem para amarelo como

resultado da produção de ácido oriundo da glicose existente no meio basal.

Quando a reação positiva ocorre, o meio torna-se alcalino, de cor púrpura e, o

tubo controle permanece ácido, de cor amarela (Figura 4).


Figura 4- Caracterização fenotípica de bactérias dos gêneros Streptococcus e Enterococcus

baseada na descarboxilação da arginina.

(Fonte: LAMAP)

3.5.2.3 Prova de produção do pigmento

A prova de produção de pigmento amarelo foi realizada em Ágar

Brain Heart Infusion (BHI - Difco, EUA) e o pigmento foi detectado com o

auxílio de um cotonete. As colônias que apresentaram uma coloração amarela

intensa foram consideradas positivas (presença do pigmento) e a ausência de

coloração ou presença de uma coloração creme ou amarela pálida foram

consideradas negativas (ausência do pigmento) (KONEMAN et al., 2001)

(Figura 5).


Figura 5- Prova de produção de pigmento amarelo para a identificação de espécies de

Enterococcus..

(Fonte: CONCEIÇÃO, 2008)

3.5.2.4 Prova de hemólise

Sangue de carneiro desfibrinado (5mL por cada 100 ml de base) foi

acrescentado ao meio Blood ágar Base Nº. 2 (Difco, França). Placas de Ágar

sangue foram inoculadas por estrias para a observação de hemólises: β-

hemólise completa dos eritrócitos do sangue, α- hemólise parcial (observação

de zona esverdeada ao redor da estria) e Ƴ sem hemólises (MANNERO e

BLANCH, 1999) (Figura 6).


Figura 6- Hemólises α, β ou Ƴ observadas em ágar sangue para a identificação de espécies

dos gêneros Streptococcus e Enterococcus.

(fonte:https://www.google.com.co/search?q=hemolises&biw=1366&bih=608&source=lnms&tbm

=isch&sa=X&sqi=2&ved=0CAYQ_AUoAWoVChMIvamWuoblxgIVzGk-Ch0KLA_H)

3.5.2.5 Prova- PYR - Produção da enzima pirrolidonil arilamidase

O teste do PYR foi realizado utilizando-se um kit comercial (PYR

Teste Probac, Brasil). Através deste teste foi verificada a produção da enzima

pirrolidonil arilamidase que hidrolisa o substrato L-pirrolidonil-β-naftilamida.

Essa reação libera β-naphtylamida livre que produz uma coloração vermelho-

cereja na presença de p-dimetil 8 aminocinamaldeído a 0,01%. Conforme

instruções do fabricante, o disco de papel contendo o substrato foi umedecido

com água destilada estéril, em seguida foi feito um esfregaço da bactéria a ser

identificada com o auxílio de uma alça de platina. Após 5 minutos, adicionou-se

uma gota do PYR reagente (p-dimetil-aminocinamaldeído a 0,01%). O

desenvolvimento de uma cor vermelha-cereja caracterizou um resultado

positivo e a coloração amarela ou alaranjada um resultado negativo

(KONEMAN et al., 2001) (Figura 7).


Figura 7- Teste de produção da enzima pirrolidonil arilamidase (PYR) para a identificação

fenotípica de espécies dos gêneros Streptococcus e Enterococcus.

(Fonte: LAMAP)

3.5.2.6 Motilidade

Para o teste de motilidade inoculou-se, com o auxílio de uma agulha

de níquel-cromo longa, tubos contendo o meio semi-sólido Sulfeto-Indol-

Motilidade (SIM) (Difco, França), que, em seguida foram incubados por 24

horas a 35oC. O teste foi considerado positivo quando foi detectada uma zona

difusa de crescimento projetada a partir da linha de inoculação sem produção

de H2S (KONEMAN et al., 2001) (Figura 8).


Figura 8- Teste de motilidade para a identificação fenotípica de espécies dos gêneros

Streptococcus e Enterococcus.

(Fonte: LAMAP)

Foi calculada a frequência (porcentagem) de isolados

(Streptococcus e Enterococcus) em cada tipo de água analisada.

3.6 Teste de antibiograma

O teste de antibiograma foi realizado através do método de difusão

em discos (BAUER; KIRBY; SHERRIN, 1966).

Para o antibiograma foram utilizados os seguintes discos comerciais

com antimicrobianos pertencentes a diferentes famílias, das marcas BBL e

LABORCLIN: β-lactâmicos – ampicilina (BBL) – AMP (10g); penicilina (BBL)

– PEN (10UI) Aminoglicosídeos – gentamicina BBL) – GEN (10g);

estreptomicina (LABORCLIN) – EST (10mg); Cloranfenicol – cloranfenicol

(BBL) – C (30g); Tetraciclina – tetraciclina (BBL) – TET (30g);

Cefalosporinas de terceira geração – ceftriaxona (BBL) – CRO (30g);–

cefotaxima (LABORCLIN) - CTX (30g); Glicopeptídios – vancomicina

(LABORCLIN) – VAN (30g) – teicoplanina (LABORCLIN) – TEI (30g);

Macrolidios – eritromicina (LABORCLIN) – ERI (15g); Lincosamidas –

clindamicina (LABORCLIN) – CLI (2g). Os antimicrobianos e os valores de

corte foram selecionados e interpretados (respectivamente) segundo a

orientação técnica ditada pelo Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI,


2013). Os resultados foram visualizados após 24 horas de incubação a 35ºC

(Figura 9).

Para avaliar a resistência dos isolados frente aos antibióticos

testados, foram levados em conta os seguintes critérios:

a) Valores de resistência ˃ 50% foram considerados altos

b) Valores entre 25-50% foram considerados médios

c) Valores de resistência <25% foram considerados baixos.

Figura 9 - Fluxograma da técnica do antibiograma realizado com os isolados das amostras de

água das galerias (G1 e G2) e de água do mar (P1 e P2), em Fortaleza, Ceará.


3.7 Cálculo do índice de resistência (IRA) e Determinação do índice de

múltipla resistência a antimicrobianos (MRA)

Os resultados do antibiograma foram utilizados para obtenção dos

índices de resistência das cepas aos antimicrobianos testados (IRA) (JONES et

al., 1986) e o de múltipla resistência (MRA) (KRUMPERMAN, 1983).

IRA = y/(n x)

onde:

y = Total do número de resistentes

n = número de isolados

x = número de antimicrobianos testados

MRA = a/b

onde:

a = número de antimicrobianos aos quais o isolado foi resistente.

b = número de antimicrobianos aos quais os isolados foram

expostos.

3.8 Técnica da cura de plasmídio

As cepas que apresentaram resistência a mais de um antibiótico de

famílias diferentes foram submetidas técnica de “cura” de plasmídio de

acordo com Molina-Aja et al. (2002) utilizando-se o caldo LB (Luria-Bertani –

Difco) suplementado com 0,85% de NaCl e tendo como agente de cura o

corante acridine-orange (SIGMA - A 6014) na concentração de 100μg/m . As

cepas crescidas nesse meio durante 24h a 35ºC, sob agitação constante,

foram novamente submetidas ao teste de antibiograma frente aos

antimicrobianos aos quais se mostraram resistentes (Figura 10).

Outro agente de cura foi testado em iguais condições do corante

acridine-orange, o detergente Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, sigla em inglês)

nas concentrações de 0,5% e 1% (KEYHANI et al., 2006) visando comprovar

sua eficiência como agente curagênico.


Figura 10 - Fluxograma do procedimento de cura plasmidial, realizado com os isolados de

Streptococcus sp. e Enterococcus sp. das amostras de água das galerias (G1 e G2) e do mar

(P1 e P2) em Fortaleza, Ceará.

3.8.1 Análises estatísticas

Na comparação da eficiência dos tratamentos de “cura” com os dois

agentes utilizados, foi aplicado o teste de McNemar (FIELD, 2009).

3.9 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

3.9.1 Extração de DNA cromossômico dos isolados Streptococcus e

Enterococcus

A extração de DNA total foi realizada a partir de culturas crescidas

em caldo infusão cérebro coração (caldo BHI-Difco) a 37°C/72 h, e segundo o

protocolo estabelecido por Shankar et al. (1999). O BoxA1R foi utilizado como

iniciador na amplificação dos fragmentos 16S do DNA total (PCR)

(VERSALOVIC et al., 1994) que permite estabelecer o grau de similaridade

entre as estirpes. Os iniciadores foram sintetizados pela INVITROGEN (Tabela

1).


Tabela 1- Iniciadores e condições de termociclagem utilizados na investigação molecular das

amostras de Streptococcus e Enterococcus.

Genes Sequência dos iniciadores (5’- 3’)

Ciclos Condições de Termociclagem

Amplicons (pb)

d

Fonte

BoxA1R 5’ctacggcaaggcgacgctgacg3’

1 95°C/2s

30

94°C/3s Versalovic

et al., (1994)

92°C/30s 400 a 2500

50°C/1min

65°C/8min Albufera et

al., 2009

1 65°C/8min

3.9.2 Condições de Box-PCR

A análise de similaridade entre as cepas foi baseada na presença ou

ausência de bandas específicas geradas a partir da amplificação com iniciador

específico BoxA1R. As diferenças e similaridades foram analisadas

visualmente de acordo com o comportamento de migração das bandas dos

produtos da reação de PCR .

Em todas as amplificações foram utilizadas como controle as

seguintes cepas de referência: Enterococcus faecalis 29212 Enterococcus

faecium INCQS 00071, Streptococcus sp. INCQS 00114 e Streptococcus

mutans INCQS 00446. O DNA total extraído foi amplificado por Box-PCR em

termociclador -Techne (Tabela 2).

Tabela 2- Composição e concentrações empregadas nas reações na investigação molecular

dos isolados de Streptococcus e Enterococcus.

Reagentes da reação (μ ) BOX-PCR

Tampão 10x 2,5 dN P’s (2,5 mM) 1,0 MgCl2 (25 mM) 2,0

Iniciador BoxA1R (99.300 ƿM) 1,0 aq polimerase (5 ⁄μ ) 0,25

DNA 1,0 Volume da reação 25,0

As amostras contendo o DNA amplificado foram analisadas em gel

de agarose 2% (Pronadisa; CONDA). A corrida foi realizada em uma cuba


horizontal de eletroforese (DIGEL; DGH12/DGH14) a 80V/400 mA com duração

de 5 h em solução tampão TBE 1 X. O gel de agarose foi corado com o

“RedGel" (concentração recomendada pelo fabricante) para possibilitar a

visualização dos produtos amplificados no transluminador (Espectroline-UV)

com luz ultravioleta. O gel foi documentado em sistema de fotodocumentação

digital Kodac EDAS290. Um marcador de tamanho molecular de 1kb (Sigma)

foi usado como padrão para o tamanho molecular dos genes.

Os perfis gerados pelo BOX-PCR foram analisados usando-se o

programa estatístico BioDiversity Professional Beta (MACALEECE et al., 1998).

Esses perfis facilitam a determinação de possíveis relações clonais entre os

isolados estudados.


4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Parâmetros físico-químicos das amostras de água das galerias e do

mar.

O pH das amostras variou de 6,86 a 8,25 na galeria G1 e de 7,59 a

8,22 na galeria G2. Os valores de salinidade oscilaram de 0 (para as galerias) a

40 (para água do mar- P2). A temperatura oscilou de 30ºC a 32ºC na galeria

G1 e de 28ºC a 31ºC na Galeria G2 (Tabela 3).

Tabela 3 - Parâmetros físico-químicos das amostras nos pontos estudados: Amostras de água

da Galeria Riacho Maceió (G1), amostras de água da Jusante à saída da Galeria do Riacho

Maceió (P1), amostras de água da Galeria da Praia do Meireles (G2), amostras de água da

Jusante à saída da Galeria da praia do Meireles (P2) em Fortaleza-Ceará.

COLETAS Parâmetros

físico-químicos

Riacho Maceió Praia do Meireles

G1 P1 G2 P2

1°

pH 7,29 7,39 7,59 7,48

Salinidade 0 30 7 40

Temperatura 32°C 31°C 29°C 30°C

2°

pH 6,70 6,94 7,88 7,25



3°

pH 8,25 7,55 8,22 7,56



4°

pH 7,38 7,33 8,05 7,43



5°

pH 6,86 7,15 7,72 7,32




Os valores de pH conferidos nas águas de mar, avaliadas,

apresentaram-se dentro da faixa de aceitação (7,0 – 8,0) proposta pelo

CONAMA (BRASIL, 2000).

As contagens de bactérias obtidas nas galerias G1 e G2 com valores

de pH de 8,25 e 8,22, respectivamente, ratificam o critério de que bactérias

pertencentes ao gênero Enterococcus são capazes de crescer a pH de 9,6

(CETESB, 2012).

Silva et al. (2008) encontraram variação de 7,0 a 8,0 no pH na água

do mar das praias do litoral do estado do Maranhão quando estudavam sua

contaminação por Enterococcus. Monteiro (2013) identificou Enterococcus

avaliando algumas praias do litoral cearense, e os valores detectados de pH

nas águas do mar variaram de 7,60 à 8,40, os de salinidade de 36 a 39 e as

temperaturas entre 27ºC e 28ºC.

4.2 Quantificação de Streptococcus sp. e Enterococcus sp.

Os valores de CPP de estreptococos e enterococos variaram de ≤10

na galeria G2 (coleta 4) a 192 x 102 UFC /100 mL (coleta 2) na galeria G1 e

para os pontos de água de mar de ≤10 (coleta 5) a 94 x 102 UFC/ 100 mL

(coleta 2) em P1 (Tabela 4) .


Tabela 4 – Contagem Padrão em Placas (CPP) de UFC de Streptococcus e Enterococcus/ 100

mL nos pontos avaliados: Amostras de água da Galeria Riacho Maceió (G1), amostras de água

do mar adjacente à Galeria do Riacho Maceió (P1), amostras de água da Galeria da Praia do

Meireles (G2), amostras de água do mar adjacente à Galeria da praia do Meireles (P2) em

Fortaleza-Ceará.

COLETAS

Caldo Todd-

Hewitt

Riacho Maceió Praia do Meireles

G1 P1 G2 P2

1o + 62 x 102 76 x 102

90 x 102

36 x 102 4x102

- 79 x 102 41 x 102 11 x 102

2o + 116 x 102 94x 102 41 x 102 61 x 102

- 192 x 102 58 x 102 114 x 102 33 x 102

3o + 170 x 102 2 x 102 54 x 102 16 x 102

- 35 x 102 2 x 102 31 x 102 3 x 10 2

4o + 18 x 10 2 2 x 102 27 x 102 8 x 10 2

- 10 x 102 ≤10 ≤10 2 x 102

5o + 81 x 102 ≤10 36 x 102 6 x 102

- 83 x 102 ≤10 29 x 102 1 x102

+: enriquecimento com caldo Todd-Hewitt; -: Sem enriquecimento com caldo Todd-Hewitt

Na presente pesquisa foram encontradas quantidades de

Enterococcus/100 mL acima do permitido pela legislação (Brasil, 2000) para

amostras de água do mar (P1 e P2). A legislação brasileira considera as águas

impróprias para balneabilidade quando os valores de Enterococcus estão

acima de 100 UFC/100 mL em duas ou mais amostras, durante o período de

cinco semanas.

Os resultados ratificam a informação de que bactérias pertencentes

ao gênero Enterococcus podem sobreviver por mais tempo em águas marinhas

devido a sua capacidade de tolerar altas concentrações de sais (HARWOOD;

WHILOOK; WHITHINGTON, 2000). Graves e Weaver (2010) afirmaram que a

distribuição dessas bactérias pode mudar devido a fatores ambientais e a


distanciamento de fontes de esgoto. Carvalho et al. (2014) encontraram

maiores quantidades de Enterococcus nas amostras coletadas próximo a um

emissário submarino, do que em pontos mais distantes da costa de Fortaleza.

Embora Ruoff (2002) detalhe a intolerância a sais no grupo viridans

como característica fenotípica para sua identificação, Facklam (2002) destaca a

possibilidade de uma resposta variável por parte de outros representantes do

gênero Streptococcus ante a presença de NaCL.

As maiores contagens nas águas das galerias (G1 e G2) e nos

pontos de água de mar adjacente (P1 e P2) foram observadas na segunda

coleta (Tabela 2). Segundo registros, a coleta foi precedida de chuva intensa e

de grande atividade antropogênica pelo início das obras de recuperação do

mercado de Mucuripe. Com relação aos dados pluviométricos, é importante

destacar que não existe uma estação perto dos pontos de coleta analisados,

mas, coincidentemente, a estação do Castelão-orla de Fortaleza (ANEXO - A)

registrou 3,8 mm de chuva nesse mesmo horário e dois dias antes (2,1 mm), o

que poderia apoiar os valores das contagens encontradas para essa coleta.

Deve-se levar em conta a distância que existe entre os pontos de coleta na orla

de Fortaleza, e as estações de registro dos níveis de precipitações diários mais

próximas, a fim de se evitar possíveis erros nas interpretações da influência

dos eventos de chuva sobre a concentração de enterococos nas águas

costeiras estudadas.

Estudos prévios têm demonstrado a influência dos eventos de chuva

no aumento das concentrações de bactérias indicadoras fecais carregadas

pelas galerias (ELMIR et al., 2007; RATHNAYAKES; HARGREAVES;

HUYGENS, 2011). A zona litorânea e a zona de lavagem (zona que pode

submergir na maré alta) podem estar associadas com muitas fontes (animais e

humanos) favorecendo a sobrevivência de bactérias indicadoras de

contaminação (SHIBATA et al., 2004).

As concentrações de Streptococcus e Enterococcus (níveis baixos e

altos) encontradas nas análises das amostras de água das galerias e do mar

podem ter sido influenciadas pela interação de fatores ambientais tais como as

marés, radiação solar e as chuvas, entre outros (ENNS et al., 2012).

Não foram observadas diferenças significativas (p ˃0,05) nos valores

das contagens de Streptococcus e Enterococcus em UFC/100 mL para cada


ponto de coleta sem e com o uso do caldo Todd-Hewitt como meio de

enriquecimento (Figura 11). Embora o caldo Todd-Hewitt seja indicado e

utilizado com sucesso como caldo de enriquecimento seletivo para

microrganismos fastidiosos tais como os estreptococos em amostras clínicas,

(DÍAZ; NIEVES, 2008; BOSH-MESTRES; MARTÍN-FERNÁNDEZ; ANTA-

LOSADA, 2003) os resultados da presente pesquisa destacam a importância

dos fatores ambientais (salinidade, radiação solar entre outros) afetando o

desenvolvimento e sobrevivência do grupo ʺestreptococos fecaisʺ.

Figura 11 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das contagens no maior valor

contável para cada ponto de coleta: galerias (G1 e G2) e pontos de água do mar (P1 e P2) com

e sem o emprego de caldo Todd-Hewitt, em Fortaleza, Ceará.

A metodologia empregada utilizando-se a técnica de filtração

(APHA-AWWA-WPCF, 1992) com utilização de Agar m-Enterococcus como

meio seletivo e incubação por 48 horas a 35°C, resultou eficiente na detecção e

quantificação de Streptococcus e Enterococcus nas amostras analisadas.

Estudos para a enumeração de estreptococos fecais e Enterococcus têm

empregado igual procedimento nas análises de amostras ambientais (ALM;

BURKE; SPAIN, 2003, LIPP et al., 2001; POTE et al., 2009).


4.3 Identificação em gênero

De um total de 296 isolados (universo) foi possível identificar 192

cepas, das quais duas estirpes pertenciam ao gênero Streptococcus (0,67 %) e

64,19% (190 estirpes) pertenciam ao gênero Enterococcus.

Similares testes para a discriminação de bactérias dos gêneros

Streptococcus e Enterococcus têm sido utilizados por diferentes autores e

agências regulatórias (APHA-AWWA-WPCF, 1992; FERGUSON et al., 2005;

MONTEIRO, 2013; UK STANDARDS FOR MICROBIOLOGY

INVESTIGATIONS, 2014).

A porcentagem de isolados identificada como não enterococos nas

águas analisadas (17,5% nas galerias e 7,69% nos pontos de água de mar) é

similar aos valores relatados por Ferguson et al. (2005) de 11,4% – 25,5% de

recuperação de não- Enterococcus em águas marinhas. Ryu et al. (2013)

determinaram abundância e distribuição de espécies de Enterococcus em

fezes de quatro animais domesticados, 13 espécies de vida selvagem e sete

espécies aviárias, assim como de água de estuários na Califórnia e de um rio

em Porto Rico. De 439 isolados ambientais, 91% foram identificados como

Enterococcus spp. e 7% como não-Enterococcus ou bactérias não

classificadas (2%).

Embora não tenha sido possível realizar a identificação de todos os

isolados não enterocócicos, está bem documentado que bactérias dos gêneros

Aerococcus, Pediococcus, Lactococcus e Leuconostoc podem crescer em

meios convencionais para a avaliação de Enterococcus (FACKLAM; HOLLINS;

COLLINS, 1989; FERGUSON et al., 2005; RYU et al., 2013).

4.4 Identificação em espécie

Uma vez realizadas as provas bioquímicas para a identificação das

espécies, vinte e seis estirpes apresentaram resposta negativa frente à prova

PYR (gênero Streptococcus – 13,54 %), das quais duas foram identificados

como S. mutans e o restante (24 estirpes) foram agrupadas como

Streptococcus ou outros gêneros afins. Cento e sessenta e seis estirpes (86,45

%) apresentaram resultados positivos na prova PYR (gênero Enterococcus),

sendo isolados: E. faecium (n = 67; 34, 89%), E. gallinarium (n = 29 ; 15,10%),

Enterococcus spp. (n = 28; 14,58%); E. mundtii (n = 15; 7,81%), E. raffinosus (n


= 12; 6,25%) E. casseliflavus (n =11; 5,72%) e E. faecalis (n = 4;

1,93%).(Figura 12).

Figura 12 - Espécies identificadas nos isolados das amostras de água das galerias (G1 e G2) e

nos pontos de mar (P1 e P2) analisados, em Fortaleza, Ceará.

Em relação à identificação de S. mutans em amostras de águas,

diferentes autores reportam a aparição dessa espécie e de outras do gênero

Streptococcus em águas marinhas (FERGUSON et al., 2013; MARACCINI;

FERGUSON; BOEHM, 2012).

No presente estudo seis espécies de Enterococcus foram

identificadas, sendo E. faecium a espécie de maior frequência e E. faecalis a

com menor número de isolados. Resultados similares em relação à espécie

dominante (E. faecium) foram encontrados em um estudo sobre a distribuição

estacional de E. coli e Enterococcus em areias de duas praias na cidade de

Indiana, Estados Unidos (BYAPPANAHALLI et al., 2006). Ferguson et al.

(2013) também reportaram E. faecium (44%) como espécie dominante em

isolados de Enterococcus de águas marinhas e águas residuais mediante a

utilização do Método 1600 da Agência de Proteção Ambiental dos Estados

Unidos (método de filtração com membrana).

Outros estudos relatam uma grande diversidade de espécies

encontradas em ambientes aquáticos. Alipour et al. (2014) publicaram a

descoberta de quatro espécies (E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum e E.

casseliflavus) em águas de río e costeiras do nordeste do Irã, mas E. faecium e

E. faecalis foram as espécies de maior frequência. E. faecalis e E. casseliflavus


foram identificadas por Mote, Turner e Lipp (2012) em plâncton e águas

marinhas. Importante destacar que a prevalência de espécies em águas

receptoras vai depender de fatores ambientais, incluindos a área geográfica e

as fontes potenciais, entre outros (MOORE; GUZMAN; McGEE, 2008).

Este estudo permitiu identificar bactérias dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus em duas fontes potenciais de contaminação e dois pontos

adjacentes (receptores) de águas costeiras, facilitando a identificação da

distribuição das espécies isoladas em cada tipo de amostra analisada.

Na comparação da distribuição de espécies por tipo de amostra

analisada (galeria e ponto de mar), o número total de isolados (Streptococcus e

Enterococcus) utilizados para o cálculo da frequência em cada tipo de amostra

foi de 114 para galerias e 78 para água do mar (Figura 13).

Figura 13 - Porcentagem de espécies de Streptococcus e de Enterococcus isoladas em cada

tipo de amostra analisada: galerias (G1 e G2) e pontos de água do mar adjacentes (P1 e P2),

em Fortaleza, Ceará.

Dos isolados identificados em galerias, a ordem de maior a menor

frequência das espécies foi a seguinte: E. faecium ˃ Streptococcus sp.

Enterococcus sp. ˃ E. gallinarum ˃ E.mundtii ˃ E. raffinosus ˃ E.casseliflavus

˃ E. faecalis. E. gallinarum e espécies pigmentadas como E. casseliflavus e E.


mundtii, possuem diferentes habitat: humanos, animais, plantas e solo


Isolados Streptococcus sp. foram identificados em maior número nas

galerias (20 - 17,54%) que nos pontos de água de mar (6 - 7,69%). É

importante destacar que na diferenciação de cocos Gram (+), isolados do

gênero Streptococcus (representantes do grupo viridans, S. bovis e não

viridans) e de gêneros afins (Lactococcus e Leuconostoc) têm sido reportados

com resposta variável ao crescimento frente a 6,5% de NaCL (FACKLAM;

HOLLINS; COLLINS, 1989; FACKLAM; ELLIOT, 1995; FACKLAM, 2002).

Maschieto et al. (2004) trabalhando com isolados de Enterococcus

do trato intestinal de pacientes de um hospital universitário, no Brasil,

identificaram E.faecium com maior frequência em relação a espécies também

isoladas: E. faecalis, E. gallinarum e E. casseliflavus, entre outras.

O percentual 15,8% de isolados identificados somente como

Enterococcus sp. pode ser atribuído a resultados de provas ambíguas com

baixo poder discriminatório. A identificação taxonômica dos estreptococos e

enterococos torna- se problemática já que são grupos diversos de cocos gram-

positivos que compartilham características fenotípicas comuns com outros

gêneros afins (M ER et al., 2001; UK STANDARDS FOR MICROBIOLOGY

INVESTIGATIONS, 2014). Castillo-Rojas et al. (2013) compararam E. faecalis

e E. faecium de isolados de água e amostras clínicas e concluíram que esses

isolados podem diferir, já que as chaves bioquímicas tradicionais estão,

geralmente, baseadas em respostas obtidas de micro-organismos provenientes

de amostras clínicas.

Bactérias pertencentes aos gêneros Globicatella, Aerococcus e

Lactococcus com produção da enzima pirrolidonil arilamidase são capazes de

crescer em caldo com 6,5% de NaCL, hidrolizar a esculina e crescer a 45°C o

que faz difícil sua diferenciação (FACKLAM; ELLIOT, 1995; UK STANDARDS

FOR MICROBIOLOGY INVESTIGATIONS, 2014). Isolados de A.viridans têm

sido frequentemente reportados como falsos positivos na avaliação e

distribuição de espécies de Enterococcus em águas marinhas (FEERST;

HOVENDON; ATHERHOLT, 2002; MOORE; GUZMAN; McGEE, 2008;

FERGUSON et al., 2013).


Os pontos de água de mar exibiram outra distribuição de espécies:

E. faecium ˃ E. gallinarum ˃ Enterococcus sp.˃ Streptococcus sp.> E. mundtii>

E. raffinosus > E. casseliflavus ˃ E. faecalis.

Espécies pigmentadas como E. casseliflavus e E. mundtii possuem

vantagens competitivas sobre espécies de Enterococcus não pigmentadas em

águas marinhas porque o pigmento exerce um efeito protetor à inativação solar

(MARACCINI; FERGUSON; BOEHM, 2012). No estudo, esta vantagem não foi

evidenciada, sendo E.casselifavus e E.mundtii espécies encontradas entre as

de menor número em águas pluviais e em águas marinhas receptoras. Os

resultados obtidos destacam a importância do aporte da fonte contaminante

(galeria) ao corpo receptor marinho na distribuição de espécies

enterococcócicas.

Padrões e agencias regulatória relacionam a prevenção de

contaminação e o risco potencial à saúde com a presença de bactérias do

gênero Enterococcus em águas recreacionais costeiras (USEPA,2012; USEPA,

1986; WHO, 2000). Assim destaca-se a importância na determinação da

distribuição de espécies enterocóccicas em águas receptoras e possíveis

fontes contaminantes (MOORE; GUZMAN; McGEE, 2008).

As bactérias do gênero Streptococcus de importância médica podem

ser divididas em três grandes grupos (PUMAROLA et al., 1992): Os

estreptococos β-hemolíticos, especialmente os pertencentes aos grupos

sorológicos A, B, C, F e G; os enterococos e os estreptococos pertencentes ao

grupo Viridans. Streptococcus pneumoniae (α- hemolítico), agente causal de

meningites bacteriana, pneumonia, otites médias e sinusites é considerado

pela Organização Mundial da Saúde(OMS) como a principal causa de morte

por pneumonia em 1 milhão de pessoas jovens (de um estimado de 5 milhões

de mortes) cada ano ( KLUGMAN; GREENWOOD, 2003).

Embora seja certo que E. faecalis e E. faecium são de particular

importância em infecções em humanos (ARIAS; CONTRERAS; MURRAY,

2010; H RNER et al., 2005), espécies como E. raffinosus, E. gallinarum e E.

casseliflavus entre outras, podem ser consideradas patógenos oportunistas de

interesse uma vez que têm sido reportados em diferentes estudos de isolados

clínicos (GUEVARA et al., 1996; TOGNERI; LOPARDO; CORSO, 2003;

TOLEDO et al., 2004).


4.5 Susceptibilidade aos antimicrobianos

A evolução e disseminação da multirresistência antibiótica de

bactérias dos gêneros Streptococcus e Enterococcus representam grandes

desafios para a clínica humana no tratamento de infecções causadas por estes

microrganismos (DÍAZ; SÁNCHEZ; MARTÍN, 2008; ARIAS; CONTRERAS;

MURRAY, 2010; KORONA-GLOWNIA; SIWIEC; MALM, 2015).

Cento e cinquenta e seis cepas, das 192 (81,25%) foram submetidas

a testes de susceptibilidade a 12 antimicrobianos e foram selecionadas por sua

representatividade nas diferentes espécies identificadas e locais de detecção

(Figura 14).

Figura 14 - Percentual de susceptibilidade/resistência a diferentes antimicrobianos de 156

cepas de Streptococcus e Enterococcus isoladas das amostras de água das galerias (G1 e G2)

e nos pontos de mar (P1 e P2) analisados, em Fortaleza, Ceará.

AMP – ampicilina, CTX – cefotaxima, CRO – ceftriaxona, CLI – clindamicina, C –

cloranfenicol, GM – gentamicina, ERI – eritromicina, EST – estreptomicina, P –

penicilina, TEI – teicoplanina, TET – tetraciclina, VAN – vancomicina. S-sensível; R-

Resistente; I- Intermediário.


Neste estudo, as bactérias mostraram alta resistência (˃ 50%) a

CR (92,3%) ˃C I (80,1%) ˃C X (74,4%) ˃ES (66,7%). ma resistência

média (50-25%) foi apresentada frente a TET (29,5%) e uma baixa resistência

(˂ 25%) para GM (19,9%) ˃ERI (10,3%) ˃C (3,21%) ˃AMP (1,92%) ˃PEN

(0,64%)˃VAN e EI (0%).

A resistência às cefalosporinas de terceira geração (ceftriaxona-

CRO e cefotaxima-CTX) está relacionada com a diminuição da afinidade das

proteínas de união à penicilina (PBPs, sigla em inglês) 1a e 2x devido a

eventos de recombinação genética e a acumulação de mutações pontuais nos

genes pbp (COFFEY et al., 1995; CHIU et al., 2007). Não é uma resistência

mediada por ß-lactamases uma vez que o uso de antibióticos com

bloqueadores dessas enzimas não constitui uma vantagem no tratamento de

cepas resistentes (PRADO; PERRET, 2001).

Dentre as cefalosporinas de terceira geração, ceftriaxona (CRO

possui vantagens na toxicocinética e toxicodinâmica quando é comparada com

cefotaxime (CRAIG, 1998).

Os altos valores de resistência obtidos nos isolados frente às

cefalosporinas são verdadeiramente alarmantes se levarmos em conta que

ceftriaxona e cefotaxima são importantes drogas utilizadas no tratamento de

infecções estreptocócicas adquiridas na comunidade: pneumonia, otites média

e aguda e sinusites agudam, assim como infecções mais invasivas: meningites

e bacteremias (APPELBAUM, 2002; CHIU et al., 2007; LYYTAKAINEN et al.,

2004; MARRON et al., 2001; NAGAI et al., 2000).

Por outro lado, bactérias do gênero Enterococcus são tolerantes à

atividade (normalmente bactericida) de agentes ativos na parede celular, tais

como β-lactâmicos. As cefalosporinas exibem a menor atividade frente a esse

grupo de micro-organismos, atividade que pode variar entre as diferentes

espécies de enterococos (KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014).

Embora seja conhecida a resistência natural a clindamicina e o

mesmo não seja um antibiótico de eleição utilizado no tratamento de infecções

enterocócicas, é importante o estudo da resistência a este antibacteriano em

razão de sua ampla disseminação no ambiente. Além disso, existe o fato de

sua resistência cruzada com outras classes de antibióticos, os macrolídeos e


estreptograminas utilizados na prática clínica e veterinária (BRENCIANI et al.,

2007; GOMES, 2013; KRISTICH; RICE; ARIAS, 2014; LECLERCQ, 2002).

Perfis de resistência de isolados de Enterococcus spp. em águas

residuais municipais e de um hospital em Alice, Província Leste do Cabo, África

do Sul, foram determinados por Iweriebor et al.(2015). Dez antibióticos foram

testados pelo método de difusão em disco. Os isolados apresentaram altos

valores de resistência frente a todos os antibióticos testados os quais oscilaram

entre 67-100%. Peter, Mathew e Sacharias (2012) identificaram isolados do

gênero Enterococcus resistentes a antimicrobianos (12) de várias fontes de

água potável. Todos os isolados apresentaram resistência a mais de um

antibiótico testado e todos foram resistentes à clindamicina

Isolados de enterococos procedentes de amostras clínicas e de

origem equina foram avaliados para o estudo de seus perfis de resistência

frente a 19 antimicrobianos usando o método de difusão em disco. Cefdinir e

cefotaxima (cefalosporinas de terceira geração) estiveram entre os antibióticos

aos quais os isolados apresentaram maior resistência (96,5 e 89,1%

respectivamente). Valores altos de resistência (>50%) também foram

reportados para clindamicina (73,4%) (SINGH, 2009).

Importante destacar que dentro dos antibióticos testados, a

estreptomicina resultou no quarto lugar como antimicrobiano com maior valor

de resistência (66,7%) por parte dos isolados estudados. Aminoglicosídeos

como estreptomicina e gentamicina agem por união a 16S rRNA da subunidade

30S ribosomal e interferem com a sínteses proteica (KRISTICH; RICE; ARIAS,

2014). Se for levado em conta o valor de resistência intermediária para este

antibiótico (11,54%) como possível resistência futura, a problemática é

preocupante em função do desafio que poderia representar a sua utilização na

terapêutica sinérgica e combinada com agentes da parede celular em infecções

enterocócicas (BALDINI; SELZER, 2008; BENDER et al., 2009) assim como

frente a infecções estreptocócicas (GRAHAM; GOULD, 2002; REINERT et al.,

2001).

Valores de resistência baixos (19,87%) foram obtidos frente à

gentamicina. Resultados similares de resistência foram relatados para a

gentamicina (23,07%) em estirpes de Streptococcus agalactiae isolados de

mastites bovina, no Irã (EBRAHIMI et al., 2008).


Valores de resistência média a tetraciclina (29,49%) e baixos ao

cloranfenicol (3,21%) foram encontrados nos isolados. Brenciani et al. (2014)

também reportaram valores de resistência média (27,4%) e baixos (2,7%) a

tetraciclina e cloranfenicol respectivamente, para isolados Streptococcus do

grupo viridans de amostras clínicas. Sadowy et al. (2014) investigaram a

susceptibilidade antibacteriana de isolados enterocócicos em águas residuais e

seu receptor marinho. Valores de resistência média à tetraciclina também

foram relatados para água residual crua (26,3%) e água receptora marinha

(27,6%).

Os genes de resistência a tetraciclina e ao cloranfenicol estão

localizados em plasmídios de resistência (JACOB; HOBBS, 1974) ou no

cromossomo (HORODNICEANU; BOUGUELERET; BIETH, 1981), com

frequência associadas com os genes de resistência a macrolídeos,

lincosamidas e estreptograminas B (MLSB, sigla em inglês) (KATAJA et al.,

1999). Genes tet(M) e erm(B) que codificam resistência a tetraciclina e a

eritromicina, respectivamente, estão frequentemente juntos e podem ser

herdados (AYER et al., 2007).

Sessenta e três (63) isolados clínicos de S.pyogenes resistentes à

eritromicina e tetraciclina foram investigados por Giovanetti et al. (2003), na

Itália. Os autores queriam investigar a presença dos genes que codificam

resistência à eritromicina por metilação (erm(A) e erm(B)) e por bomba de

effluxo (mef(A)), assim como a presença de genes que codificam resistência à

tetraciclina por proteínas de protecção ribossomal tet(M) e tet(O) e por bomba

de effluxo tet(K) e tet(L). Foi o primeiro relato da presença do gene tet(O) em

S.pyogenes mostrando que ele pode estar ligado com outro gene e se mover

mediante conjugação de um cromossomo a outro.

Dada et al. (2012) avaliaram 42 isolados de Enterococcus

procedentes de amostras de águas recreacionais marinhas (praia) na Malásia,

para investigar a susceptibilidade a nove antibióticos. Os autores reportaram

altos valores de resistência ao ceftriaxone (86,60%). Foram obtidos valores

médios frente à eritromicina para E.faecalis (40%) e E.faecium (46%) e valores

baixos (< 25%) para Enterococcus spp. (16,66%).


Denamiel et al. (2013) determinaram os perfis de resistência em

S.bovis isolados de mastites bovina frente a antibióticos de uso prático na

clínica veterinária. S.bovis mostrou valor médio de resistência a eritromicina

(41,2%).

No presente estudo, a eritromicina foi o antibiótico ao qual os

isolados se mostraram mais susceptíveis, com percentual de resistência de

10,3% entre as estirpes. Nesse percentual não estão considerados os marcos

de resistência intermediária encontrados. Essa resistência intermediária indica

uma tendência da população bacteriana para tornar-se resistente a ação da

substância sendo, portanto, um indicativo de resistência futura. Entre os

isolados, 13 cepas apresentaram esse perfil frente a eritromicina e 11 a

eritromicina mais gentamicina. O problema se agrava, chamando a atenção

para a possibilidade de que essa resistência intermediária possa ser transferida

a outros patógenos no ambiente.

Similar ao que acontece com outras bactérias, a entrada de

bactérias resistentes dos gêneros Streptococcus e Enterococcus em ambientes

aquáticos procedentes de descargas residuais constitui uma importante fonte

de resistência no ambiente (KÜMMERER et al., 2004). A ciclagem de cepas

resistentes em hospitais, atividades veterinária, comunidade e reservatórios

naturais de águas favorecem os processos de disseminação e transferência da

resistência (MEIRELLES-PEREIRA et al., 2002).

Embora a resistência antimicrobiana tenha sido estudada por suas

sérias implicações clínicas como fator limitante na escolha dos agentes

terapêuticos e no incremento de falhas potenciais para seu tratamento,

igualmente sérios resultam os efeitos ecológicos e epidemiológicos dessa

resistência (RICE, 2007; TRAVERS; BARZA, 2002). Do ponto de vista

ecológico, é importante considerar a ecologia dos genes de resistência e a

ecologia das bactérias resistentes que carreiam esses genes (KÜMMERER et

al., 2004). Cepas com dureza ecológica mais ampla possuem uma vantagem

mais universal, a bactéria é capaz de crescer em vários nichos ecológicos

interconectados. Este fato e sua capacidade de adaptação a hospedeiros

alternativos poderiam amplificar sua habilidade em adquirir novos

determinantes em termos de virulência e resistência, mantendo,


simultaneamente, suas capacidades naturais (COSTA; LOUREIRO; MATOS,

2013).

É de notar que a maioria das cepas foi susceptível à teicoplanina

(100%), vancomicina (98%), penicilina (99%) e ampicilina (98%). Três cepas

foram resistentes a ampicilina, duas delas identificadas como E. faecium e uma

E. casseliflavus, incluindo uma que apresentou resistência a penicilina e a

ampicilina (E. faecium). Nenhuma cepa foi resistente a todos os antibióticos

testados. Essa resistência a ampicilina pode ser devida a modificações das

PBPs (proteínas de união a penicilina) ou a produção de β-lactamases

(PALAVECINO, 2001). A baixa resistência encontrada nos isolados frente a

ampicilina (1,92%) e glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina) foi similar aos

resultados relatados por Bender et al. (2009) na análise de isolados de

amostras clínicas, na cidade de Porto Alegre, Brasil.

Antibióticos β-lactâmicos como a penicilina, não têm um marcado

efeito bactericida sobre Enterococcus, diferentemente da sua atividade frente a

Streptococcus (ARIAS ; MURRAY, 2012). Ainda assim, a resistência a β-

lactâmicos em micro-organismos pertencente ao gênero Streptococcus

continua crescendo e com ela o interesse no estudo do uso dessas substâncias

no diagnóstico das infecções estreptocócicas (ALCAIDE et al., 2001; SMITH;

JACKSON; KENNEDY, 2004; GOULD et al., 2012; GOLDSMITH et al., 2015).

Enterococcus não apresentam suscetibilidade intrínseca a β-

lactámicos, com a susceptibilidade podendo variar entre as espécies e entre os

antimicrobianos β-lactâmicos. Por exemplo, espécies como E. faecium podem

ser um pouco mais resistentes que E. faecalis (KRISTICH; RICE; ARIAS,

2014).

Teicoplanina foi o único antibiótico ao qual todos os isolados

testados apresentaram sensibilidade. A resistência a vancomicina foi

apresentada por três cepas (duas pertencentes ao gênero Enterococcus e uma

ao Streptococcus) que apresentaram valores intermediários (1,92%).

Vancomicina e teicoplanina apresentam espectro de ação

(glicopeptídeos) e eficácia similares (BUGANO et al., 2011). Sader et al. (2001)

realizaram um estudo de vigilância multicêntrica com isolados de cocos Gram

positivos agentes causais de infecções adquiridas na comunidade e nos

hospitais em 15 países de America Latina. S.pneumoniae, Streptococcus do


grupo viridans e outros estreptococos β-hemolíticos foram testados para sua

susceptibilidade a diferentes antibióticos. Todos os estreptococos foram

susceptíveis a vancomicina e a teicoplanina.

Foi avaliada a atividade in vitro de nove antibióticos frente a 631

isolados Streptococcus de cinco instituições brasileiras como parte do

programa de vigilância denominado Local Synercid® Microbiologic Assessment

of Resistance Trends (L-SMART). Semelhante ao estudo multicêntrico de

Sader et al. (2001), os isolados de S.pneumoniae, Streptococcus do grupo

viridans e outros estreptococos β-hemolíticos foram susceptíveis a vancomicina

e a teicoplanina (MENDES et al., 2002). Streptococcus isolados de produtos

diários susceptíveis também a vancomicina foram reportados por Gad, Abdel-

Hamid e Farag (2014).

É conhecido que enterococos vancomicina resistentes (VRE) são

importantes patógenos de infecções sistêmicas em indivíduos debilitados e

com supressão do sistema imune (HÖRNER, 2005).

Embora a resistência a vancomicina por parte do gênero

Enterococcus seja hoje um fenômeno frequentemente reportado por diferentes

autores (IVERSEN et al., 2002; KWON et al., 2012; LATA et al., 2009), o

isolamento de duas cepas com valores de resistência intermediários em

amostras de água serve de alerta de possíveis riscos para a saúde pública.

Castillo-Rojas et al. (2013) compararam a susceptibilidade antibiótica

e as relações genéticas de isolados de E. faecium e E. faecalis de amostras

clínicas e ambientais. Eles reportaram 34 perfis de resistência em resposta aos

dez antibióticos testados encontrando perfis de resistência comuns entre as

dos isolados de casos clínicos e de água.

A resistência antimicrobiana (36 perfis) foi observada em 96,15%

das cepas testadas. Cerca de noventa e três por cento (92,95%) das cepas

(137) apresentaram multirresistência (29 perfis). Foram encontradas cepas

resistentes até a sete antimicrobianos, dos doze testados (Tabelas 5 e 6). O

perfil mais dominante (34 cepas) esteve representado por três grupos de

antimicrobianos: cefalosporinas (CRO – ceftriaxone, CTX – cefotaxima),

aminoglicosídeo (EST – estreptomicina), e lincosamidas (CLI – clindamicina).


Tabela 5 – Perfil de multirresistência de cepas de Streptococcus e Enterococcus isoladas de

galerias (G1 e G2) em Fortaleza, Ceará.

Perfil de resistência Isolados Espécies MRA IRA

CRO-EST-CLI-CTX 23

E.faecium (7) E.gallinarum (4) Streptococcus sp.(8) E. casseliflavus(1) Enterococcus sp.(2) E. raffinosus (1)

0,33

CRO-TET-EST-CLI-CTX 11

E.faecium (3) E.gallinarum (3) E.faecalis (1) E. casseliflavus (1) Streptococcus sp.(1) Enterococcus sp.(2)

0,41

CRO-CLI-CTX 7

E. faecium (2) Enterococcus sp.(3) E. casseliflavus (1) Streptococcus sp. (1)

0,25

CRO-GM-EST-CLI-CTX 5

E.faecium (1) E. mundtii (1) E. gallinarum (1) E. casseliflavus (1) Enterococcus sp.(1)

0,41

CRO-EST-CLI 4 E.faecium (2) E. mundtii (1) E. gallinarum (1)

0,25

CRO-TET-CLI-CTX 4

E. mundtii (1) E.faecium (1) E.gallinarum (1) Streptococcus sp. (1)

0,33

CRO-TET-ERI-EST-CLI-CTX 3 E.faecium (2) E.raffinosus (1) 0,5

CRO-GM-CLI-CTX 2 E. mundtii (1) Enterococcus sp.(1) 0,33

CRO-EST-CTX 2 E.faecium (2) 0,25

CRO-TET-EST-CLI 2 E.faecalis (1) E.faecium (1)

0,33

CRO-TET-CTX 2 E.faecium (1) E.mundtii (1)

0,25

CRO-TET-GM-EST-CLI-CTX 2 E.gallinarum (2) 0,5

EST-CLI 2 E.faecium (1) E.gallinarum (1)

0,16

CRO-EST 1 E.faecium (1) 0,16

CRO-GM-EST-CLI 1 Enterococcus sp.(1) 0,33 CRO-GM-ERI-EST-CLI 1 E.gallinarum (1) 0,41

CRO-GM-EST-CTX 1 E. faecium (1) 0,33 CRO-EST-CLI-CTX-P-AMP 1 E.faecium (1) 0,5

CRO-TET-CLI 1 E. faecium (1) 0,25 CRO-TET-GM-ERI-EST-CLI-CTX 1 E.faecium (1) 0,58

CRO-ERI-CLI-CTX 1 Streptococcus sp.(1) 0,33 CRO-C-CLI-CTX 1 E.mundtii (1) 0,33

CRO-AMP-TET-CTX 1 E.faecium (1) 0,33 CRO-TET-GM-EST-CTX 1 Streptococcus sp. (1) 0,41

ERI-TET 1 E.faecium (1) 0,16 81 0,050


Tabela 6 – Perfil de multirresistência de cepas de Streptococcus e Enterococcus isoladas em

pontos de mar (P1 e P2) em Fortaleza, Ceará.

Perfil de resistência Isolados Espécie MRA IRA

CRO-EST-CLI-CTX 11

E.faecium (2) E.gallinarum (3) Streptococcus sp. (2) E. faecalis (1) E.mundtii (1) Enterococcus sp.(1) E.casseliflavus (1)

0,33

CRO-GM-EST-CLI-CTX 7

E.faecium (3) E. raffinosus (1) E. gallinarum (1) Enterococcus sp. (2)

0,41

CRO-CLI-CTX 5

E. mundtii (1) E.gallinarum (1) E.faecalis (1) Steptococcus sp.(1) E. casseliflavus (1)

0,25

CRO-EST-CLI 4 E.faecium (3) E.casseliflavus (1) 0,25

CRO-TET-EST-CLI-CTX 4

E.faecium (1) E.gallinarum (1) Enterococcus sp.(1) E.mundtii (1)

0,41

CRO-TET-GM-EST-CLI-CTX 4 E.faecium (1) E.gallinarum (2) E. casseliflavus (1)

0,5

CRO-GM-EST-CLI 3 E.gallinarum (2) E.faecium (1) 0,33

CRO-EST-CTX 3 E.faecium (1) E.gallinarum (1) Enterococcus sp.(1)

0,25

CRO-TET-EST-CLI 2 E.faecium (2) 0,33

CRO-ERI-CLI-CTX 2 E.casseliflavus (2) 0,33 CRO-TET 1 E.gallinarum (1) 0,16

CRO-TET-C-GM-ERI-CLI 1 E. faecium (1) 0,5 CRO-GM-CLI-CTX 1 Enterococcus sp. (1) 0,33

CRO-TET-CLI-CTX 1 Enterococcus sp. (1) 0,33 CRO-TET-GM-ERI-EST-CLI-CTX 1 E.faecium (1) 0,58

CRO-TET-C-ERI-EST-CLI-CTX 1 E.raffinosus (1) 0,58 CRO-TET-CLI 1 Enterococcus sp. (1) 0,25

CRO-TET-ERI-EST-CLI 1 E.mundtii (1) 0,41 CRO-ERI-EST-CLI-CTX 1 E.mundtii (1) 0,41

CRO-AMP-ERI-CLI-CTX 1 E.casseliflavus (1) 0,41 EST-CLI 1 E.faecium (1) 0,16

56 0,031


As cepas isoladas das galerias apresentaram o maior valor do índice

de resistência antibiótica (IRA) (0,05) comparado com o valor encontrado para

as cepas isoladas de água do mar (0,03). Vinte e cinco perfis de

multirresistência estiveram representados nas galerias contra 21 nos pontos de

água do mar.

É conhecido que estreptococos do grupo viridans podem trocar

material genético com outras bactérias que compartilham seu habitat

desempenhando um papel significativo na transferência de determinantes da

resistência a estreptococos mais patógenos tais como S. pneumoniae e

S.pyogenes (BRYSKIER, 2002).

Skórczewski e Mudryck (2012) reportaram também valores de IRA

(0,40) para bactérias heterotróficas aquáticas isoladas de águas superficiais e

subsuperficiais e IRA de 0,30 para bactérias planctônicas.

O índice de múltipla resistência antibiótica (MRA) ≥ 0,2 foi

encontrado em 137/150 cepas resistentes (91,33%). As bactérias isoladas das

águas de galeria e do mar apresentaram valores do MRA de 0,58 em duas

cepas de E.faecium (de galeria e da água do mar) mostrando um perfil de

resistência CRO-TET-GM-ERI-EST-CLI-CTX e de E.raffinosus de água

marinha apresentou o perfil CRO-TET-C-ERI-EST-CLI-CTX. Os valores de

MRA encontrados nas águas avaliadas indicam o potencial de persistência de

cepas multirresistentes no ambiente estudado.

Isolados bacterianos de bacias hidrográficas mostrando resistência

antibiótica múltipla têm sido relatados por diferentes autores (DADA et al.,

2012; MONDINO et al., 2003 LECLERCQ et al., 2013).

A múltipla resistência antibiótica mostrada pelos isolados

Streptococcus faz lembrar a múltipla resistência apresentada por pneumococos

especialmente a resistência a macrolídeos e as tetraciclinas assim como ao

cloranfenicol associada com sua plasticidade genética única mediada por

eventos de recombinação carregando elementos genéticos móveis (ROBERTS;

MULLANY, 2011; KORONA- GLOWNIAK; SIWIEC; MALM, 2015). Elementos

genéticos estreptocócicos levando determinantes de resistência a macrolídeos

levam também outros genes conferindo resistência a uma variedade de

antibióticos como o cloranfenicol, tetraciclinas, aminoglicosídeos entre outros

(VARALDO; MONTANARI; GIOVANETTI, 2009).


Os perfis de resistência mais frequentem em galerias e em pontos

de água de mar foram: CRO-EST-CLI-CTX (23 cepas das galerias e 11 das

águas do mar), CRO-TET-EST-CLI-CTX (11 cepas das galerias e quatro das

águas do mar), CRO-CLI-CTX (sete das galerias e cinco das águas do mar),

CRO-GM-EST-CLI-CTX (cinco das galerias e sete das águas do mar) e CRO-

EST-CLI (quatro cepas das galerias e das águas do mar). Importante destacar

que na análise de espécies por perfil, cepas da mesma espécie apresentaram

igual perfil nas águas das galerias e nas águas do mar, indicando o aporte na

carga bacteriana com resistência das galerias ao corpo receptor marinho.

Desvantagens adaptativas ao ambiente marinho foram observadas para

isolados Streptococcus sp. presentes nas galerias e ausentes em perfis

similares nos pontos de água do mar. É sabido que bactérias do gênero

Enterococcus apresentam vantagens em relação à persistência e multiplicação

no ambiente devido a sua tolerância a vários fatores ambientais: pH alcalino,

altas temperaturas e concentrações de cloreto de sódio (MURRAY, 1990; UK

STANDARDS for MICROBIOLOGY INVESTIGATIONS, 2014).

Por outro lado, as galerias apresentaram oito perfis de resistência

que não estão representados nos pontos de água de mar (perfis de resistência

específicos). E.faecium foi a espécie mais representativa com cinco perfis

específicos (CRO-EST; CRO-GM-EST-CTX; CRO-EST-CLI-CTX-P-AMP; CRO-

AMP-TET-CTX e ERI-TET) e um compartilhado com E.mundtii (CRO-TET-

CTX) seguem em ordem E.mundtii com um perfil específico cada (CRO-C-CLI-

CTX) e Streptococcus sp. (CRO-TET-GM-EST-CTX). Seguem em ordem E.

casseliflavus, E.gallinarum e E.raffinosus cada espécie com um perfil

específico. Diferentemente, nos pontos de água do mar foram detectados

quatro perfis de resistência que não estão representados nas galerias,

espécies com perfis específicos (únicos, não compartilhados com o resto das

espécies) estiveram representadas por E. faecium (CRO-TET-C-GM-ERI-CLI),

E.gallinarum (CRO-TET), E.casseliflavus (CRO-AMP-ERI-CLI-CTX) e E.

raffinosus (CRO-TET-C-ERI-EST-CLI-CTX) com um perfil específico cada.

Diferentes habitats (humanos-animais-insectos-plantas) têm sido

relatados para E.fecium, E. raffinosus, e E. gallinarum. Espécies pigmentadas

como E.mundtii e E.casseliflavus estão associadas com plantas e solo



Os resultados da presente pesquisa em relação à múltipla

resistência antibiótica mostrada pelos isolados Streptococcus e Enterococcus

nas amostras de água (galeria e ponto do mar) se assemelham aos resultados

gerados no estudo de Ruban e Gunaseelan (2011) em isolados de

Enterococcus de sedimentos da Bacia de Kryshna Godavary, na India. Os

autores encontraram múltipla resistência de Enterococcus como indicador da

sua capacidade em inativar a ação dos antimicrobianos.

A susceptibilidade a antimicrobianos (oito) em bactérias do gênero

Enterococcus (81) isoladas de amostras de água coletadas nas cercanias do

emissário submarino em Fortaleza, (Brasil) foi determinada por Carvalho et al.

(2014). Os autores reportaram 24 perfis de múltipla resistência com valores de

MRA que variaram de 0,25 a 0,87.

Embora tenha sido diferente o intervalo de variação de MRA

encontrado na presente pesquisa (0,16 a 0,58), foram valores de múltipla

resistência MRA = 0,25 (resistência associada a três dos doze antimicrobianos

testados) e MRA = 0,58 (resistência associada a sete dos doze antimicrobianos

testados). As diferenças no valor de MRA podem ser atribuídas à origem dos

isolados estudados e ao número de antibióticos testados em ambos os

estudos.

4.6 Cura plasmidial

Das cepas submetidas ao tratamento de “cura” com laranja de

acridina (50 representativas de 29 perfis de multirresistência e dos diferentes

pontos de coleta, com e sem a utilização do caldo Todd-Hewitt), 72% (36/50)

mantiveram o mesmo perfil (contando os valores intermediários como possíveis

resistentes) (Tabela 7). Essa característica é demonstrativa de resistência

potencialmente cromossômica. As três cepas que apresentaram resistência

aos β-lactâmicos (penicilina-ampicilina) perderam essa característica após a

“cura”, indicando origem plasmidial.


Tabela 7- Resultados para cada agente de cura testado após tratamento de cura de plasmídio

em isolados de galeria (G1 e G2) e água do mar (P1 e P2) em Fortaleza, Ceará.

Número de isolados por perfil

LA SDS

No. de cepas

testadas

50 %

potencialmente

cromossômicas

No. de cepas

testadas

27 %

potencialmente

cromossômicas

No. de cepas

com igual perfil

após cura

plasmidial

28

72

No. de cepas

com igual

perfil após

cura

plasmidial

9

40,74

No. de cepas

com valores

intermediários

8

No. de cepas

com valores

intermediários

2

% origem

plasmidial

% origem

plasmidial

No. de cepas

com valores

susceptíveis

14

28

No. de cepas

com valores

susceptíveis

16

59,25

É importante destacar que 27/50 cepas apresentaram crescimento

em SDS como agente de “cura”. A sensibilidade extrema ao detergente SDS

em bactérias G(+) tem sido reportada por diferentes autores (KRAMER et al.,

1984; KEYHANI et al., 2006). No tratamento de cura plasmidial com SDS

(0,5% e 1%), 40,74% das cepas (11/27) mantiveram o mesmo perfil (contando

os valores intermediários como possíveis resistentes) (tabela 7), incluindo a

cepa No. 110 (E.raffinosus) que apresentou um perfil de sete antibióticos

(CRO-TET-C-ERI-EST-CLI-CTX) mantendo esse mesmo perfil, após

tratamento de “cura”, demonstrativo de resistência potencialmente

cromossômica.

Duas cepas que apresentaram resistência à ampicilina perderam

essa característica após a “cura” com SDS, resultado que concorda com o


obtido com laranja de acridina, indicando origem plasmidial. Não se logrou o

crescimento frente a SDS da cepa que apresentava resistência à penicilina.

Valores intermediários frente aos antibióticos testados após a “cura”

com laranja de acridina foram apresentados por 14 de 50 cepas testadas

(tabela 8). Os antibióticos com maior número de isolados com valores

intermediários foram gentamicina (três cepas) e clindamicina (duas cepas).

Seguem em ordem: estreptomicina, ceftriaxona, eritromicina e cloranfenicol

com uma cepa cada. Resultados diferentes com SDS foram apresentados em

relação a isolados com valores intermediários frente a diferentes antibióticos.

Duas cepas apresentaram valores intermediários (2/27) após a “cura” frente à

gentamicina.

Tabela 8- Resultados para cada antimicrobiano testado após tratamento de cura de plasmídio

em isolados de galeria (G1 e G2) e água do mar (P1 e P2) em Fortaleza, Ceará

-: Não testado

Embora os resultados tenham sido diferentes em relação aos

valores intermediários e susceptíveis com a utilização dos dois agentes de

“cura”, é necessário destacar que as cefalosporinas de terceira geração (CRO

e CTX) são importantes drogas no tratamento de infecções estreptocócicas

(DOERN et al., 1996; KARLOWSKY et al., 2003), por outro lado, os

aminoglicosídios: gentamicina e estreptomicina são recomendados na

Antibiótic

o

Número de isolados por perfil

Resistentes Intermediários Susceptíveis

LA SDS LA SDS LA SDS

CRO 42 25 1 0 3 0

CLI 37 12 2 0 2 10

CTX 32 17 0 0 2 1

EST 28 17 1 0 5 2

TET 19 6 0 0 5 6

GM 4 0 3 2 4 4

ERI 9 2 1 0 3 2

C 3 1 1 0 0 0

AMP 0 0 0 0 3 1

P 0 - - - 1 -


terapêutica clínica para uso sinérgico no tratamento de infecções por

Enterococcus (ARIAS; CONTRERAS; MURRAY, 2010).

Ao aplicar o teste de Mc Nemar na comparação dos tratamentos de

“cura” não foram encontradas diferenças significativas entre os dois

tratamentos (Laranja de acridine e SDS) razão pela qual não se pode afirmar

se um tratamento foi mais eficiente que o outro para as cepas estudadas.

4.7 Box-PCR

Analisando-se o dendrograma (Figura 15) pode-se constatar a

formação de três grupos principais. Um (grupo A-GA) que agrupa duas estirpes

de Enterococcus sp. (244 e 234) isoladas de galerias (G1 e G2

respectivamente). Outro (grupo B-GB) que abrange duas estirpes: E.mundtii e

E.raffinosus isolados de pontos de mar (76 M1 e 275 M2) e um (grupo C-GC)

que agrupa duas estirpes: E.mundtii e Streptococcus sp.(52 G2 e 124 G2)

ambas isoladas da galeria G2. A metodologia foi capaz de distinguir 22

ecotipos atendendo a uma definição que considera a ecologia das cepas além

de sua distância evolutiva (KONSTANTINIDIS; TIEDJE, 2005).


Figura 15- Perfil de similaridade de isolados Streptococcus e Enterococcus isolados

de água de galerias e de ponto de mar adjacente na cidade de Fortaleza-Ceará,

baseado na presença e ausência de bandas no gel de Box-PCR.

Um elemento Box é um elemento de DNA repetido e altamente

conservado que foi identificado pela primeira vez no cromossomo bacteriano de

Streptococcus peneumoniae (MARTIN et al., 1992). A técnica de Box-PCR tem

sido utilizada por diferentes autores no estudo da identificação genotípica e de

fatores de virulência e resistência de Streptococcus e Enterococcus em

amostras clínicas e ambientais (ABDELSALAM; EISSA; CHEN, 2015;

JACKSON et al., 2012; KNUTSEN et al., 2006; NAYAK; BADGLEY;

HARWOOD, 2011; SIREKBASAN et al., 2015).

As reações Box-PCR foram capazes de produzir perfis de até 25%

de similaridade indicando baixo poder discriminatório do método sobre as

cepas incluídas no estudo. Cepas com similaridade ˃94% (valor limite) podem

pertencer a igual espécie permitindo uma variação no conteúdo de genes entre

5-35%, revelando a diversidade genética dentro de uma espécie (GORIS et al.,

2007; KONSTANTINIDIS; TIEDJE, 2005).


Zdragas et al. (2008) investigaram isolados de enterococos no

interior da bacia de Thermaikos, Grécia. Os autores identificaram 121 estirpes

de enterococos baseados nas características fenotípicas e genotípicas dos

isolados vancomicina resistentes. Foi obtido baixo poder discriminatório do

método de amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD-PCR, sigla em

inglês) (similaridade ≥ 76%) comparado com electroforese em gel de campo

pulsado (PFGE, sigla em inglês) (similaridade ≥ 90%).

Ran et al. (2013) estudaram a ocorrência de enterococos em areia,

sedimentos, água e solo na bacia hidrográfica do Lago Superior, Estados

Unidos. Foi examinada a diversidade genética de isolados de E.faecalis pela

técnica de DNA fingerprinting em gel de electroforese com agarose horizontal

acoplada ao uso de amplicones marcados por fluorescência (HFERP) (técnica

similar a PCR de sequências repetitivas baseado em DNA fingerprinting, mas

utilizando substâncias fluorescentes). Foi tomado como valor de corte o valor

de similaridade mínimo da cepa utilizada como controle (≥ 95%). Entre 516

isolados examinados foram identificados 148 genotipos. Os valores de

similaridade variaram de 9,8 a 94,9%, com a maioria dos isolados sendo ≥ 60%

similares entre si.

m limite de similaridade ≥ 50% agrupou uma grande parte das

estirpes estudadas, entretanto, o agrupamento dessas estirpes foi

independente do local de isolamento e tipo de amostras analisadas o que pode

indicar a presença de diferentes clones.

A comparação de Box-PCR com PFGE para determinar relação

genética de enterococos de diferentes ambientes (água superficial e

subterrânea e aves domésticas) foi realizada por Jackson et al. (2012).

Enterococos isolados de vários ambientes apresentaram uma similaridade ˃

70% no Box-PCR e ˃ 50% em PFGE. E.faecium mostrou alta diversidade

genética já que os clones foram agrupados independentemente da fonte de

origem nas metodologias moleculares utilizadas. Resultados similares foram

observados neste estudo.

A construção de um dendrograma de similaridade entre os isolados

bacterianos, baseado nos perfis fenotípicos: morfologia, perfis bioquímicos e de

resistência antimicrobiana, deixa claro que a adaptação ao ambiente ou matriz

é determinante na similaridade entre as estirpes, que se traduz na capacidade


das bactérias de sobreviverem ou se multiplicarem no ambiente (fitness

bacteriano) (Figura 16) (ANDERSSON; HUGHES, 2010).

Figura 16- Avaliação do poder discriminatório das provas bioquímicas nos isolados de

Streptococcus e Enterococcus analisados.

Diferenças na expressão fenotípica podem ser observadas entre

espécies patógenas em função da adaptação a diferentes nichos ecológicos

(COENYE et al., 2005; COHAN; KOEPPEL, 2008).

Comparando os resultados obtidos com Box-PCR e as provas

fenotípicas convencionais pode-se afirmar, da mesma forma, (MOORE et al.,

2006; THOMPSON et al., 2013; ZDRAGAS et al., 2008), que embora testes

fenotípicos sejam ainda de incalculável valor na identificação de diferentes

espécies, o estudo taxonômico polifásico (caracterização fenotípica e

genotípica) é uma abordagem mais eficiente na garantia da precisão dos

resultados.


5 CONCLUSÕES

Considerando os resultados obtidos nesta pesquisa foi

possível detectar a presença de bactérias dos gêneros Streptococcus e

Enterococcus em águas captadas de galerias pluviais e nas águas

marinhas influenciadas pela descarga destas.

Pode-se determinar mediante a quantificação de bactérias

dos gêneros Streptococcus e Enterococcus nas águas avaliadas, o

aporte da carga bacteriana das galerias ao fluxo de entrada e

contaminação das águas marinhas da orla de Fortaleza.

A utilização do caldo Todd-Hewitt não mostrou eficiência no

favorecimento do crescimento das bactérias alvo (Streptococcus e

Enterococcus).

Um percentual alto (96,79%) de isolados apresentou

resistência a um ou mais antibióticos testados o que destaca o risco

maior por exposição a agentes potencialmente patogênicos.

A alta multirresistência detectada nas culturas isoladas

mostrou percentuais alarmantes frente a antimicrobianos de uso comum

na terapêutica clínica, o que justifica a importância da vigilância e

controle deste grupo de microrganismos no ambiente.

Pode-se verificar, mediante a cura plasmidial, que a

resistência apresentada pelos isolados, indicativa de transferência

plasmidial, ratifica a capacidade dessas bactérias em adquirir e

disseminar determinantes de resistência antibiótica.

Os gêneros Streptococcus e Enterococcus devem ser

reconhecidos por sua potencial contribuição à dispersão da resistência

nos ambientes aquáticos (pluviais e marinhos), fato de interesse e

importância para a saúde pública.

Diversidade genética alta dos isolados multirresistentes

Streptococcus e Enterococcus analisados foi observada mediante a

utilização de Box-PCR indicando a necessidade de uma abordagem

polifásica na identificação de espécies em estirpes ambientais.


REFERÊNCIAS

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YOSHIOKA, C.R.M.; MARTINEZ, M.B.; BRANDILEONE, M.C.C.; RAGAZZI, S.B.; GUERRA, M.L.L.S.; SANTOS, S.R.; SHIEH, H.H.; GILIOS, A.E. Analysis of invasive pneumonia-causing strains of Streptococcus pneumoniae: serotypes

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ANEXO A - PRECIPITAÇÕES DIARIAS – LITORAL DE FORTALEZA (MAIO – JUNHO/2013)

Fonte:http://www.funceme.br/app/calendario/produto/municipios/maxima/diario?

data=hoje.

*Os dados de referencia estão destacados em negrita em acordo ao horário da coleta e os

dados no horário da chuva relativa.

Estação/

Chuva

Relativa

DATA COLETA-Hora

05/05/13 06/05/13 07/05/13

1

(10: 30 ás 11:00)

CASTELÃO 0,0 mm 1,0 mm 0,0 mm

Chuva

Relativa

7:00 04/05/13 ás

7:00 05/05/13

7:00 05/05/13 ás

7:00 06/05/13

7:00 06/05/13 ás

7:00 07/05/13

12/05/13 13/05/13 14/05/13

2

(11: 05 ás 11:40),


Chuva

Relativa

7:00 11/05/13 ás

7:00 12/05/13

7:00 12/05/13 ás

7:00 13/05/13

7:00 13/05/13 ás

7:00 14/05/13

19/05/13 20/05/13 21/05/13

3

(10: 30 ás 11:05)


Chuva

Relativa

7:00 18/05/13 ás

7:00 19/05/13

7:00 19/05/13 ás

7:00 20/05/13

7:00 20/05/13 ás

7:00 21/05/13

26/05/13 27/05/13 28/05/13

4

(10: 55 ás 11:25)


Chuva

Relativa

7:00 25/05/13 ás

7:00 26/05/13

7:00 26/05/13 ás

7:00 27/05/13

7:00 27/05/13 ás

7:00 28/05/13

02/06/13 03/06/13 04/06/13

5

(10: 55 ás 11:30)


Chuva

Relativa

7:00 01/06/13 ás

7:00 02/06/13

7:00 02/06/13 ás

7:00 03/06/13

7:00 03/06/13 ás

7:00 04/06/13




Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ INSTITUTO DE … · primeiro lugar acreditou em minha pessoa e aceitou-me no LAMAP ainda sem ... pontos de mar adjacentes a cada ... água do mar adjacente