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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Aplicação da Espectrometria de Massas Ambiente
por Paper Spray Ionization na Identificação e Quantificação
de Cocaína e no Controle de Qualidade de Bebidas
Flávia Tosato
Dissertação de Mestrado em Química
Vitória
2016
Flávia Tosato
Aplicação da Espectrometria de Massas Ambiente
por Paper Spray Ionization na Identificação e Quantificação
de Cocaína e no Controle de Qualidade de Bebidas
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química
do Centro de Ciências Exatas da
Universidade Federal do Espírito Santo
como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Química, na área de
Química Forense.
Orientador: Prof. Dr. Wanderson
Romão
VITÓRIA
2016
Aplicação da Espectrometria de Massas Ambiente
por Paper Spray Ionization na Identificação e Quantificação de
Cocaína e no Controle de Qualidade de Bebidas
Flávia Tosato
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre em Química.
Aprovada em 09/12/2016 por:
__________________________________________
Prof. Dr. Wanderson Romão
Universidade Federal do Espírito Santo
Orientador
__________________________________________
Prof. Dr. Paulo Roberto Filgueiras
Universidade Federal do Espirito Santo
__________________________________________
Prof. Dr. Fabrício Souza Pelição
Perito da Polícia Civil do Espírito Santo
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, 09 de dezembro de 2016
A minha mãe e familiares que são o meu suporte para
caminhar e estão sempre ao meu lado quando preciso.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada seria, sempre me sustentando,
acalentando meus choros e me fortalecendo. A Nossa Senhora que é minha mãe do
Céu e sempre me protege por onde eu caminhar.
A minha mãe, Maria José Tosato, que mesmo sem entender, aceita minhas
decisões e por me amar de uma forma que não tem explicação, ao meu pai,
Wanderley Malta Zago, e a minha tia NilcéiaTozattoZago, por me apoiar, auxiliar,
amar, cuidar, e ensinar durante toda minha vida, sem eles eu não chegaria a
qualquer lugar.
Aos meus primos, Gabriel TozattoZago e Dayana TozattoZago, por serem
como irmãos para mim, sempre me aconselhando e incentivando os meus sonhos e
a minha família Zago que sempre estão torcendo por mim.
Agradeço ao Guilherme Vasconcelos Borgui, pela grande paciência,
companheirismo, atenção e amor que tem comigo não só na construção deste
trabalho e sim em todos os dias. Agradeço a Deus por ter você como meu anjo na
Terra.
Aos meus sogros Luis e Alcineia por me terem como uma filha, e minha
cunhada Glendha.
Agradeço aos meus amigos Priscilla, Alanyella, Cléo e Adriano por todo apoio,
carinho, preocupação e amizade.
A toda equipe do Laboratório de Petroleômica e Forense que apoiou e
incentivou o trabalho, Lilian, Heloisa, Heloá, Fernanda, Lindamara Bruno, Eloison,
Rayana, Larissa, Eliane, que ajudaram tanto com amizade e incentivos quanto como
mão de obra. Em especial a Jade, Nayara e Radigya pela amizade que cultivamos
nesse tempo. E a todos do LabPetro que não pouparam esforços para ajudar.
Ao Wanderson Romão, pela orientação durante todo o desenvolvimento não
só deste trabalho, mas desde de 2013. Seus ensinamentos e advertências foram de
grande importância, não só para esse trabalho, pois muitos são os ensinamentos
que levarei para minha vida acadêmica profissional e pessoal.
Ao professor Paulo que teve muita paciência em me ensinar essa tal de
quimiometria e por aceitar em participar da minha banca juntamente com o perito
Fabricio Pelição, contribuindo para o crescimento do meu trabalho.
Ao corpo docente do PPGQUI da UFES que contribuiu para conhecimento
que adquiri, apoio e ajudou para a minha formação.
A Polícia Civil do Estado do Espírito Santo por disponibilizar o material de
pesquisa. Às agências CAPES, FAPES e CNPq pelo suporte às minhas pesquisas.
Agradeço a todos que me ajudaram de forma direta ou indireta.
[...] É preciso que eu suporte duas ou três
lagartas se eu quiser conhecer as borboletas [...]
(O Pequeno Príncipe - Antoine de Saint-Exupéry)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama geral do espectrômetro de massas.4 ......................................... 19
Figura 2. Esquema geral do espectrômetro de massas Ion trap LTQ-XL, Thermo
Scientific. ................................................................................................................... 23
Figura 3. Etapas de obtenção e purificação de cloridrato de cocaína. ...................... 27
Figura 4. Estrutura da cocaína na forma de base livre (a) e na forma de cloridrato (b)
em equilíbrio ácido/base com seus respectivos valores de pKa e pKb.16 ................. 28
Figura 5. Estruturas dos principais adulterantes. ...................................................... 29
Figura 6. Diagrama dos diferentes tipos de cromatografia.23 .................................... 30
Figura 7. Cálculo do fator de retenção. ..................................................................... 31
Figura 8. Sistemas de eluição de CCD avaliados para a identificação de cocaína e
seus adulterantes: fenacetina, lidocaína, benzocaína e cafeína. .............................. 34
Figura 9. Ilustração do desenho experimental. Cada mancha de CCD foi transferido
para um frasco com metanol e 0,1 v / v% de HCOOH. A solução resultante foi, em
seguida, transferida para a fonte de PS(+)-MS. ........................................................ 35
Figura 10. A Otimização do sistema de CCD variando (a) métodos de aplicação
(micropipeta, capilares de sílica e micro-seringa); (b) volume (µL); e (c) concentração
do analito (mg.mL-1). ................................................................................................. 37
Figura 11. Placas de CCD utilizando os seguintes sistemas de eluição: (a)
CHCl3:CH3OH:CH3OH (75:20:5 v %); (b) CH3CH2OCH2CH3:CHCl3 (50:50 %); e (c)
CH3OH:NH4OH (100:1.5 v %). .................................................................................. 38
Figura 12. Variação da razão dos solventes do sistema de eluição CH3OH:NH4OH
em: (a) 99.5:0.5 v%; (b) 99:1.0 v%; (c) 97.5:2.5 v%; (d) 97:3 v%; (e) 96.5:3.5 v%. . 40
Figura 13. Variação da concentração dos padrões a partir de 0,5 a 14 mg.mL-1 na
CCD com o sistema CH3OH:NH4OH (99,5:0,5 %v). .................................................. 41
Figura 14. Espectros de PS(+)-MS dos padrões benzocaína, cafeína, lidocaína,
fenacetina e cocaína em função da concentração: 0,5; 4,0; 10,0 e 14,0 mg mL-1. ... 42
Figura 15. PS(+)-MS/MS para os padrões de (a) benzocaína, (b) cafeína, (c)
lidocaína, (d) fenacetina e (e) cocaína. ..................................................................... 43
Figura 16. Curvas de calibração para a cocaína, benzocaína, cafeína, lidocaína e
fenacetina. ................................................................................................................. 44
Figura 17. Extração de cerveja utilizando Chromabond® C18ec cartucho de SPE
com água/metanol. .................................................................................................... 53
Figura 18. Ilustração da metodologia experimental. a) Foram aplicados 20 µL de
cada extrato das cervejas no papel triangular e submetidos a ionização no PS-MS.
b) Após as variações de concentração com whisky e cachaça a solução resultante
foi aplicada a 10 µL no papel triangular e feita a ionização no PS-MS. ..................... 54
Figura 19. Espectros de PS(+)MS relacionados à para análise das amostras brutas
das 10 marcas de cerveja. ........................................................................................ 56
Figura 20. Espectros de PS(+)MS para as quatro frações produzidas para duas
típicas marcas de cerveja Pilsen e Lager (marca 4 e marca 8). ................................ 57
Figura 21. Espectros de PS(+)-MS das 10 amostras de cerveja (extrato 4) após a
evaporação do solvente. ........................................................................................... 58
Figura 22. Gráfico de SCORES-3D obtido dos dados dos espectros adquiridos no
modo PS(+)-MS. PC1 = 16,24%, PC2 = 13,95% e PC4 = 9,01%. ............................ 59
Figura 23. Gráfico de Loadings gerado a partir dos dados dos espectros obtidos no
modo PS(+)-MS para o quarto extrato após a evaporação do solvente. ................... 60
Figura 24. Espectros das blendas de whisky e cachaça por PS(+)-MS. A partir da
letra (a) a (k) é demonstrado o aumento da porcentagem de cachaça na mistura
binária. ...................................................................................................................... 61
Figura 25. Região de maior interesse nos conjuntos de espectros de whisky e
cachaça, adquiridos no PS(+)-MS na construção do modelo PLS. ........................... 62
Figura 26. Curva de calibração paras as blendas de whisky e cachaça a partir dos
espectros obtidos no PS-MS no modo positivo. ........................................................ 62
Figura 27. Espectros de PS(-)-MS das blendas de whisky/cachaça. ........................ 63
Figura 28. Região de maior interesse nos conjuntos de espectros de whisky e
cachaça, adquiridos no PS(-)-MS na construção do modelo PLS. ............................ 64
Figura 29. Curva de calibração e parâmetros medidos a partir da blenda de whisky e
cachaça no PS-MS no modo negativo. ..................................................................... 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Alguns adulterantes de cocaína e seus efeitos no SNC.16 ......................... 28
Tabela 2. Valores de Rf para os padrões de fenacetina, cafeína, cocaína, benzocaína
e lidocaína. ................................................................................................................ 39
Tabela 3. Valores de Rf dos padrões para diferentes proporções da fase móvel (em
% de volume) de CH3OH:NH4OH. ............................................................................. 40
Tabela 4. LOD observada na CCD e calculada para o PS(+)-MS para cada padrão 45
Tabela 5. Valores de sinais proporção de m / z 304/290 correspondente à cocaína /
benzoilecgonina obtido por PS (+) análise por MS de nove repetições de cinco dias
diferentes................................................................................................................... 45
Tabela 6. Análise de Variância (ANOVA) dos resultados individuais obtidos em cinco
dias diferentes por PS (+) MS da relação de cocaína / benzoilecgonina. ................. 46
Tabela 7. Marcas de cervejas exploradas no trabalho bem como o teor alcoólico e
classificação entre Pilsen e Lager. ............................................................................ 52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
MS – Mass spectrometry
EI – Ionização por elétrons
CI - Ionização química
ESI - Electrospray Ionization
MALDI – Dessorção e ionização por laser favorecida por matriz
DART– Direct analysis in real time
DESI – Desorption electrospray
EASI – Easy ambient sonic-spray ionization
PS-MS – Paper spray mass spectrometry
TOF- Tempo de voo
IT – Ion trap
RF – Radiofrequencia
ICR – Ressonância ciclotrônica de íons
FT – Transformada de Fourier
B – Campo magnético
LTQ XL - Linear trap quadupole XL
CCD – Cromatografia em camada delgada
LD – Limite de detecção
LQ – Limite de quantificação
UV - Ultravioleta
MeOH – Metanol
ACN - Acetonitrila
SPE – Extração em fase sólida
PCA – Análise de componentes principais
PLS – regressão de mínimos quadrados parciais
RMSEP – Erro médio de previsão
LISTA DE SÍMBOLOS
°C – Grau Celsius
g – Grama
μ – Micro
L – Litro
m – Mili
%V - Porcentagem em volume
min – Minuto
m/z – Razão massa carga
Nº – Número
ppm – Partes por milhão
kV – Quilovolt
rms - Root Mean Square
nm – Nanometro
Rf – Fator de retenção
RESUMO
Análises rápidas, baratas e eficientes são necessárias para as rotinas
laboratoriais, principalmente quando aplicada em química forense. As utilizações
de fontes ambientes permitem que as análises sejam diretas e rápidas. Assim,
são opções inovadoras para melhorar a sensibilidade e seletividade. Neste
trabalho, foi desenvolvida uma metodologia utilizando a espectrometria de
massas ambiente por paper spray ionization mass spectrometry (PS-MS) para
diferentes matrizes de dados: (i) identificar e quantificar cocaína e seus
adulterantes a partir da cromatografia em camada delgada acoplada ao PS-MS;
(ii) realizar a discriminação ou classificação de dez marcas brasileiras de
cervejas em pilsen e lager; e (iii) identificar a falsificação controlada de Uisque
com cachaça visando quantificar o volume de cachaça adicionado na mistura.
Na análise de cocaína e adulterantes, os padrões foram identificados na CCD e
analisados por PS-MS, e uma curva de calibração foi otimizada. A cerveja foi
previamente fracionada usando a metodologia de extração em fase sólida (SPE)
com água/metanol e os quatro extratos foram caracterizados no modo positivo
de ionização, PS(+)MS. Para ambos os casos, foram aplicados de 20 µL do
analito sobre a superfície do papel do PS-MS. Na quantificação de cachaça em
misturas de whisk-cachaça. Os resultados indicam que, utilização da CCD
acoplado ao PS-MS possibilita a identificação de cocaína e seus adulterantes
uma ótima linearidade paras as curvas foi encontrada (cocaína (R2 = 0,9989),
benzocaína, (R2 = 0,9934), a cafeína (R2 = 0,9988), a fenacetina (R2 = 0,9966), e
a lidocaína (R2 = 0,9987)) e LOD inferior ao da técnica de CCD. Para as
amostras de cerveja os sinais de açúcares se sobressaem sobre os demais
grupos, e após a extração com água/metanol foi possível distinguir os espectros
das diferentes marcas de cervejas e classifica-las em pilsen e lager pela técnica
de PCA. Utilizando o PS(±)-MS e PLS com seleção de variáveis foi possível
estimar quantitativamente o teor de cachaça misturado ao uísque. Com isso,
utilização de fontes ambientes, como PS mostra-se eficaz para identificação de
diversas matrizes, facilitando as análises de rotina.
Palavras-Chaves: paper spray ionization, fonte ambiente de ionização,
cocaína, adulterantes, cerveja, whisky.
ABSTRACT
Rapid, inexpensive and efficient analyzes are required for laboratory routines,
especially when applied in forensic chemistry. Uses of the environment sources allow
the analyzes to be direct and fast. Thus, they are innovative options to improve
sensitivity and selectivity. In this work, a methodology was developed using
environmental mass spectrometry by paper spray ionization mass spectrometry (PS-
MS) for different data matrices: (i) to identify and quantify cocaine and its adulterants
from PS-coupled chromatography -MS; (Ii) discriminate or classify ten Brazilian beer
brands in pilsen and lager; And (iii) to identify the controlled counterfeit of whiskey
with cachaça in order to quantify the volume of cachaça added in the mixture. In the
analysis of cocaine and adulterants, the standards were identified in the CCD and
analyzed by PS-MS, and a calibration curve was optimized. The beer was previously
fractionated using the solid phase extraction (SPE) methodology with water /
methanol and the four extracts were characterized in positive ionization mode, PS (+)
MS. For both cases, 20 μL of the analyte was applied to the PS-MS paper surface. In
the quantification of cachaça in blends of whisk-cachaça. The results indicate that the
use of Cdc coupled to PS-MS allows the identification of cocaine and its adulterants.
A good linearity for the curves was found (cocaine (R2 = 0.9989), benzocaine, (R2 =
0.9934) Caffeine (R2 = 0.9988), phenacetin (R2 = 0.9966), and lidocaine (R2 =
0.9987)) and LOD lower than that of the CCD technique. For the beer samples the
signs of sugars stand out over the other groups, and after extraction with water /
methanol it was possible to distinguish the spectra of the different beer brands and
classify them in pilsen and lager by the PCA technique. Using PS (±) -MS and PLS
with variable selection it was possible to estimate quantitatively the cachaça content
mixed with whiskey. With this, the use of environmental sources, such as PS, is
effective for identification of several matrices, facilitating routine analyzes.
Keywords: ionization environment, ionizing environment, cocaine,
adulterants, beer, whiskey.
Sumário
1 CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ................................................................... 18
1.1 Espectrometria de Massas ................................................................. 18
1.1.1. Métodos de Ionização Ambiente ................................................... 19
1.1.2. Analisadores de Massas ............................................................... 22
1.1.3. Espectrômetro de massas Ion trap LTQ XL .................................. 23
1.1.4. Espectrometria de Massas por Ressonância Ciclotrônica de Íons
com Transformada de Fourier (FT-ICR MS) ......... Erro! Indicador não definido.
2 CAPÍTULO 2: ANÁLISE DE COCAÍNA POR CROMATOGRAFIA EM
CAMADA DELGADA ALIADA A PS-MS ................................................................... 26
2.1 Cocaína .............................................................................................. 26
2.2 Adulterantes ....................................................................................... 28
2.3 Técnicas análiticas ................................ Erro! Indicador não definido.
2.3.1 Cromatografia ................................................................................ 29
2.4 Análise estatística .............................................................................. 31
2.5 OBJETIVOS DO CAPITULO 2 ........................................................... 32
2.5.1 Objetivo Geral ................................................................................ 32
2.5.2 Objetivos Específicos .................................................................... 32
2.6 PROCEDIMENTOS ............................................................................ 32
2.6.1 Materiais e reagentes .................................................................... 32
2.6.2 Análise de Cocaína e Adulterantes por CCD e PS(+)-MS ............. 32
2.7 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................ 36
2.7.1 Drogas Ilícitas: Análise de Cocaína e Adulterantes por CCD e
PS(+)-MS 36
2.8 CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 2 ........................................................ 46
3 CAPÍTULO 3: ANÁLISE DE WHISKIE E CERVEJA POR PS-MS. ........... 47
3.1 Bebidas alcóolicas .............................................................................. 47
3.1.1 Cerveja .......................................................................................... 47
3.1.2 Cachaça – água ardente ............................................................... 48
3.1.3 Whisky ........................................................................................... 49
3.2 Quimiometria ...................................................................................... 50
3.3 OBJETIVOS ....................................................................................... 50
3.3.1 Objetivo Geral ................................................................................ 50
3.3.2 Objetivos Específicos .................................................................... 50
3.4 PROCEDIMENTOS ............................................................................ 51
3.4.1 Materiais e reagentes .................................................................... 51
3.4.2 Análise de bebidas por SPE e PS(±)-MS ...................................... 51
3.5 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................ 55
3.6 CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 3 ........................................................ 66
4 CONCLUSÃO ........................................................................................... 67
5 REFERENCIA BIBLIOGRAFICA .............................................................. 68
18
1 CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO
1.1 Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas (do inglês “mass spectrometry” - MS) é uma
técnica que se baseia na ionização de moléculas e átomos, realizando de forma
eficiente a separação dos íons com base nas diferentes razões massa/carga (m/z),
sendo m a massa em u [massa atômica unificada, chamada também de Dalton (Da)]
e z a carga formal.1
Essa técnica não analisa átomos ou moléculas no estado fundamental,
apenas espécies ionizadas. Dessa forma, para a análise dos íons necessita-se a
formação dos mesmos a partir de fontes de ionização, que devido aos avanços
tecnológicos tem evoluído constantemente buscando ampliar o campo de aplicação.2
A espectrometria de massas é uma técnica analítica com ampla aplicação vista a
sua alta sensibilidade e velocidade de análise.1,3
A Figura 1 mostra um esquema geral de um espectrômetro de massas, no
qual seu funcionamento inicia-se pela introdução da amostra, ionização do analito
por uma fonte que pode trabalhar a pressão atmosférica ou reduzida (10-6 mbar), um
analisador (responsável pela resolução e qualidade do sinal), e detector que é
responsável por contabilizar os íons e transformar sinais em corrente elétrica, que
posteriormente são convertidos na razão m/z em um espectro.1,4
19
Figura 1. Diagrama geral do espectrômetro de massas.4
Dentre os componentes que compõem o espectrômetro de massas, a fonte
de ionização e o analisador são partes com grande importância. Pois cada fonte de
ionização possui características de ionização e com isso, tipos específicos de
compostos são analisados. As diferentes formas de ionização juntamente com
analisadores de massas são o que determinam a aplicabilidade da MS.5
As fontes de ionização então, demonstram a variedade da técnica, pois a
partir delas é possível determinar os tipos de analitos a serem estudados. Assim
existem diferentes métodos de ionização aplicáveis para uma diversidade de
amostras, que vão desde moléculas apolares e voláteis por ionização por elétrons
(EI) ou ionização química (CI) podendo ser moléculas polares e de alta massa molar
analisada por ionização por eletrospray (ESI), também dessorção e ionização por
laser favorecida por matriz (MALDI)) chegando a técnicas de ionização ambiente
que possibilitam analises rápidas, diretas com alto rendimento e não necessitando
de abertura de amostra, como nas fontes direct analysis in real time (DART),
desorption electrospray (DESI), easy ambient sonic-spray ionization (EASI), além do
paper spray (PS) que facilitam a introdução da amostra no espectrômetro.4,6
1.1.1. Métodos de Ionização Ambiente
Atualmente a busca pela facilidade nas análises, e o preparo das amostras é
uma das preocupações, e novas técnicas têm sido geradas em que há a formação
de íons sob condições ambientes para posteriormente serem analisados por MS.7
20
As fontes de ionização ambientes estão sendo mais exploradas devido a sua
simplicidade em comparação com as fontes que eram utilizadas sob alto vácuo. A
vasta gama dessas fontes recentemente desenvolvidas, despertaram interesse
significativo pela busca de aplicações em vários campos de interesse acadêmico ou
industrial.8 Acontecem em condições ambientes que possibilitam a análise
diretamente da superfície, onde as amostras foram aplicadas com o mínimo ou
nenhum pré-tratamento.9-11 Essas fontes, começaram a ser relatadas na literatura a
partir de 2004, com DESI, DART entre outras, quem foram sendo criadas e
modificadas ao longo dos anos.12
1.1.1.1 Paper Spray
A fonte de ionização PS criada em 2010 pelo grupo do Prof. Dr. R.G Cooks, é
derivada do ESI, sendo simplesmente constituída de um fio soldado a uma garra de
jacaré fixado a um papel de formato triangular, ao qual é umedecido e aplicado uma
alta voltagem. Por capilaridade, os analitos presentes na amostra migram até as
extremidades do papel.13,14 O estudo do mecanismo que ocorre no PS, tem sido
discutido.13,15
Como dito, o PS é derivado do ESI, e com isso espera-se que o processo de
ionização seja similar, campo elétrico, oriundo da aplicação de alta voltagem (3-5 kV)
no papel, induz a formação de um spray, contendo gotículas carregadas, na forma
de cone de Taylor, que após a dessolvatação gera íons positivos ou negativos
(dependendo no modo de ionização) em fase gasosa (Figura 1).13,16
A interação da amostra na superfície porosa do papel é o principal processo
responsável pelo movimento dos analitos que serão dessolvatados durante a
formação do spray próximo à entrada do espectrômetro de massas e a partir deste
processo tem-se a dessorção do analito em sua forma iônica a partir do papel.1414 A
duração do spray é em torno de 60 segundo, pois neste intervalo o solvente da
amostra evapora e assim a amostra pulverizada. O tempo pode ser relacionado ao
volume de amostra aplicado no papel.17 Outros fatores também podem influenciar na
ionização, como o ângulo do corte, distância da entrada do espectrômetro, tudo isso
pode interferir na sensibilidade, limite de detecção, entre outras respostas do
equipamento.14
21
1.1.1.1.1. Aplicações de Paper Spray
Levando em consideração as condições atuais nos laboratórios analíticos,
onde a busca por praticidade, custos, rapidez das análises são tão almejados.
Esperava-se que as novas fontes ambientes crescessem em variadas aplicações tão
rapidamente.18
O PS-MS é um exemplo dessas fontes ambientes, quanto aos mecanismos
dos processos de ionização nos modos positivo e negativo estão sendo estudados,
sua aplicação tem sido em variados compostos e matrizes.19
Liu e colaboradores (2010) analisaram diversos compostos como heroína,
cocaína, entre outras substâncias utilizando como matriz sangue bovino, além disso,
fez testes com 6 tipos de superfícies diferentes, incluindo quatro papéis de diferentes
tamanhos de poros, papel de fibra de vidro e papel de cromatografia19. Manicke et al
(2010) quantificou dois fármacos em sangue e observou que com a adição de
padrão interno é possível quantificar esses fármacos que não sofrem interação com
as proteínas presentes no sangue20.
Análises de analitos sólidos depositados em papel incluindo fármacos,
nucleótidos, fosfolípidos, derivados de colesterol, peptídeos pequenos e vários
hidrocarbonetos e muitos compostos de baixo peso molecular que são solúveis em
solventes não-polares, podem ser ionizados como demonstra Li e colaboradores
(2011), em que utilizou hexano para ionizar o grupo de moléculas citado acima.21
Uma comparação entre um triplo quadrupolo e um ion trap foi feita, além da
comparação do uso de um papel cromatográfico e um papel com revestimento de
sílica para a análise de um conjunto de fármacos e foi encontrado que o triplo
quadrupolo (0.1 ng.mL-1) apresenta uma melhor resposta em relação ao ion trap (
10-20 ng.mL-1) e o papel de sílica tem uma melhoria de 5-50 vezes para esses
analitos22. Manicke e colaboradores (2011) também conseguiu concentrações de
ng.mL-1 em moléculas terapêuticas em sangue seco utilizando padrão interno23.
Ainda sobre papel com revestimento para facilitar a ionização, foi relatado a
utilização de papel revestido com grafite para a ionização de biomoléculas, e
demonstrou um aumento de 600 vezes para a detecção do sinal (m/z)24.
22
Um estudo tamanho das gotas e velocidade foi avaliado por Espy et al (2012)
utilizando um anemómetro de partículas Doppler de fase bidimensional e foi feito
uma avaliação da velocidade em função do aumento da voltagem aplicada e
distância do papel.15
Muitas são as aplicações dessa fonte, dentre elas destaca-se o uso para
análise de fármacos em biofluidos25, determinação de designer drugs26, no controle
de qualidade de alimentos27, para análise de inibidores de corrosão em oleoduto28,
acompanhamento de reações químicas inorgânicas29, identificação de quinonas in
situ30, discriminação de espécies de cândidas. Em um estudo, compostos foram
ionizados a partir do PS-MS com nenhuma voltagem aplicada utilizando papel de
filtro como substrato e os resultados encontrados foram compatíveis quando
aplicado alguma voltagem31; para estudo de triagem para a identificação de pesticida
em frutas e vegetais32, também pode ser usado para a diferenciação de tipos de
canetas em apreensões de promissórias falsificadas33, análise qualitativa de
designer drugs a partir de selos apreendidos34, discriminação de marcas de cerveja
pelo valor comercia35 também foram analisado por PS-MS entre outras matrizes.
1.1.2. Analisadores de Massas
Como são muitas as formas de ionização, surgiram também vários tipos de
analisadores de massas. Cada analisador, possuem eletrônica e princípio físico
particular.4
A propriedade física dos íons é medida pelo analisador a partir da razão
massa/carga. Os diferentes tipos de analisadores, tem por princípio de
funcionamento por campos elétricos e magnéticos (estáticos ou dinâmicos) que
podem ser isolados ou combinados. E entre eles, uma das diferenças, está na
maneira pela qual tais campos são usados para conseguir a separação dos íons.
Obtendo então cada um suas vantagens e desvantagens.36
Diferenças como resolução, que é a capacidade de medir o m/z
experimental com a mínima diferença do m/z teórico, possibilitando deduzir uma
fórmula molecular com base nos defeitos de massa, e exatidão que é medida
através do erro calculado em ppm do desvio da medida feita experimentalmente
em relação a valor teórico. Essas duas características, diferem por exemplo, os
23
tipos de analisadores existentes. O quadrupolo, o tempo de vôo (TOF), ion trap
(IT), ressonância ciclotrônica de íons, são exemplos de analisadores de massas.4
1.1.3. Espectrômetro de massas Ion trap LTQ XL
O Ion trap (IT) é um dispositivo que usa um campo elétrico e
radiofrequência oscilante para armazenar íons.3636
De maneira geral, ITs podem ser considerados um quadrupolo dobrado a
fim de formar um circuito fechado, ou mais especificamente, um eletrodo
hiperbólico na forma circular é colocado entre dois eletrodos hiperbólicos. A
amostra, é ionizada a partir da fonte, passando pelas lentes focalizadoras,
skimmer, e passando por quadrupolos e um octapolo (que funcionam apenas no
modo RF), no analisador, que é composto com duas lentes, sendo uma frontal e
uma traseira (que tem por finalidade o controle da quantidade de íons), e uma
câmara de trapeamento linear.36-39
No analisador quadrupolar, potenciais elétricos são adaptados afim de
selecionar os íons a partir da sua razão m/z, os íons que estão em movimentação
são esfriados por gás inerte diminuindo sua energia cinética, e com isso os
fazendo “viajar” no eixo axial (eixo z) dentro do quadrupolo e indo para o sistema
detecção.36
Figura 2. Esquema geral do espectrômetro de massas Ion trap LTQ-XL, Thermo Scientific.40
24
1.1.4. Espectrometria de Massas por Ressonância Ciclotrônica de Íons com
Transformada de Fourier (FT-ICR MS)
A técnica de ressonância ciclotrônica de íons (ICR) foi criado no ano de 1930
por Lawrence e colaboradores; No ano de 1950, foi feita a junção da técnica de ICR
a espectrometria de massas por Sommer e colaboradores. Em 1974, Comisarow e
Marshall também introduziu a transformada de Fourier (FT) juntamente com o ICR e
a MS.41
Essa junção das técnicas e conceitos, fez com que o analisador de
ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FT-ICR ou
simplesmente FT-MS) fosse considerado, o tipo mais complexo de analisadores de
massas. E com isso faz essa técnica tenha uma ampla faixa de aplicação.1
Os íons possuem um movimento circular, e a frequência de cada um deles é
de acordo com o m/z que não é dependente da velocidade dos mesmos, e esse
movimento é causado pelo campo magnético (B). Assim, um íon de massa m e
carga q, se move perpendicularmente ao campo. Os íons de cargas contrarias terão
orbitas em sentidos opostos.41,42
A figura 3 ilustra, que a cela de ICR é composta por pratos de
aprisionamento, excitação e detecção, aonde armazena os íons e determina a razão
m/z dos mesmos baseado na frequência ciclotrônica, a partir da presença de um
campo magnético aplicado. Essa frequência é inversamente proporcional à razão
m/z. O sinal do ICR é detectável apenas se os íons estiverem um movimento
sincronizado. Para a obtenção dos íons em fase (sincronizados), um campo elétrico
(RF) é aplicado uniformemente com a mesma frequência ciclotrônica, e assim os
íons passam a ser detectados. Do sinal de ICR digitalizado em domínio de tempo,
pela transformada de Fourier e é obtido um espectro em frequência e por cálculos
matemáticos, o mesmo é transformado em domínio de massas.(Figura 3).43
25
Figura 3. Esquema de funcionamento da cela de ICR.44
O FT-ICR MS possui uma grande faixa de detecção, com alto poder de
resolução de massa (m/Δm > 300 000 a 9,4 T, onde m é o valor de m/z do íon
analisado e ∆m a largura do pico a meia altura), resolução de massa (menor
diferença de massa entre dois picos de igual magnitude tal que o vale entre eles é
uma fração especificada da altura do pico: m2 − m1 > 0.003 Da), e precisão de
massa (ppm ou rms) que permite a separação e detecção dos íons pertencentes a
amostra estudada, assim o controle do número de íons dentro da cela de ICR é
essencial para obtenção de valores ótimos de resolução, exatidão e relação sinal-
ruído.36, 41,42,45
26
2 CAPÍTULO 2: ANÁLISE DE COCAÍNA POR CROMATOGRAFIA EM
CAMADA DELGADA ALIADA A PS-MS
2.1 Cocaína
Historicamente era conhecida como a “planta divina dos Incas”, as folhas
mais antigas de coca (Erythroxylum cocaLam. - Erythroxylaceae) foram descobertas
na região do Peru. Os espanhóis em contato com os índios descobriram que
costumavam mascar folhas de coca. A partir do século XIX, na Europa, a droga teve
seu uso espalhado sendo indicadas para o tratamento de depressão, fadiga,
neurastenia e também dependências, então passou a ser vendida de várias
maneiras, nas farmácias, como medicação. Já em 1914, o comércio e uso foram
proibidos, assim o consumo quase desapareceu, voltando novamente apenas a
partir da década de 60.46
O processo de extração de cocaína e seus derivados é feito a partir das
folhas de coca por diversos métodos, envolvendo vários solventes orgânicos
(querosene, thinner, etc.) e reações químicas que utilizam bases e ácidos. Nestes
processos, relativamente simples, são extraídas diversas substâncias inorgânicas e
orgânicas, principalmente os derivados de alcaloides (aminas cíclicas que possuem
anéis heterocíclicos contendo nitrogênio) do tipo tropanos.
Dependendo do tipo do processo de extração, pode-se encontrar uma
variação dos componentes, assim como traços de reagentes utilizados para a
extração e obtenção da pasta-base de coca. Além dos componentes da planta e dos
reagentes da extração, podem ser encontrados os diluentes e adulterantes no
entorpecente. Todas essas substâncias são utilizadas como subsídios para obter
informações sobre a forma de preparo da cocaína e seus derivados (Figura 3).47
27
Figura 4. Etapas de obtenção e purificação de cloridrato de cocaína.48
A cocaína pode ser consumida de diferentes formas, podendo ser aspirado
sob forma de um sal, o cloridrato de cocaína, popularmente conhecido como “pó”.
Este sal é solúvel em água o que permite ser consumido pela via intravenosa. Ainda,
pode ser encontrada sob a forma de base, conhecida como crack e “merla”, que por
serem pouco solúveis em água e voláteis quando aquecidas, são fumadas em
“cachimbos” ou cigarros de tabaco ou maconha.49
A Figura 4 demonstra a cocaína em equilíbrio ácido/base formando o
cloridrato cocaína e cocaína na forma de base livre. A protonação/desprotonação
deve ocorrer no grupo amino do núcleo tropano.50
28
Figura 5. Estrutura da cocaína na forma de base livre (a) e na forma de cloridrato (b) em equilíbrio
ácido/base com seus respectivos valores de pKa e pKb.48
O mecanismo de ação da cocaína no SNC aumenta a liberação e prolonga o
tempo de atuação de alguns hormônios como à dopamina, noradrenalina e
serotonina, que atuam no cérebro. A dopamina está relacionada à situação de
dependência, pois é responsável pela sensação de prazer ao se fazer uso da droga,
assim como outros comportamentos que geram prazer como comer, ter relações
sexuais entre outros. Além disso, está relacionada também ao comportamento motor
fino (atividades que necessitam de maior precisão e coordenação motora).46
2.2 Adulterantes
Normalmente os adulterantes são substâncias anestésicas que são
adicionadas à cocaína/crack com a intenção de aumentar em volume e mitigar o
mesmo efeito que a droga pura provoca ao usuário.51 A Tabela 1 demonstra alguns
adulterantes e como eles agem no SNC.
Tabela 1. Alguns adulterantes de cocaína e seus efeitos no SNC.48
A Figura 5 ilustra a estrutura de quatro adulterantes que foram usados nesse
trabalho bem como seus respectivos valores de pKa.52
29
Figura 6. Estruturas dos principais adulterantes.
2.3 Cromatografia
É uma técnica de separação, que está baseada na diferenciação dos
componentes de uma mistura, através de diferentes interações.53 Collins (2006) traz
o conceito de cromatografia como:
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela.54
Os diferentes tipos de cromatografia diferem a partir dos tipos de interações
possíveis entre os solutos e as fases estacionárias e móveis, podendo ser realizadas
em uma coluna ou de forma planar.55
A Figura 6 demonstra um diagrama que exemplifica melhor os diversos tipos
de cromatografia existentes.
30
Figura 7. Diagrama dos diferentes tipos de cromatografia.53
2.3.1.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)
Do inglês, thin layer chromatography, essa técnica se baseia na adsorção
líquido–sólido, onde a separação ocorre pela afinidade dos componentes do analito
pela fase estacionária em relação a fase móvel.53
A CCD é um método de escolha de análise e comparação de amostras, e
possui como principais vantagens o curto tempo de análise e o seu baixo custo.56
Ela é uma técnica tradicionalmente utilizada para a separação e identificação de
drogas fabricadas ilegalmente.57
O fator de retenção (Rf) é razão entre a distância percorrida pela substância
estudada e a percorrida pela fase móvel, conforme Figura 5. É o principal
parâmetro usado em CCD para determinar a eficiência de separação (seletividade)
ou resolução cromatográfica53 conforme ilustra a Figura 7.
31
Figura 8. Cálculo do fator de retenção.
2.4 Análise estatística
No Brasil, existem duas agências credenciadoras para fiscalizar a
competência de laboratórios de ensaios, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária) e o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial). Estes órgãos disponibilizam guias para o procedimento de validação de
métodos analíticos, respectivamente, a Resolução ANVISA n° 129, de 12 de
fevereiro de 2016 e o documento INMETRO DOQ-CGCRE-008, de agosto/2016.58,59
A curva de calibração univariada de dados é um modelo matemático que cria
uma relação entre o sinal analítico e a concentração do analito, que deve resultar na
melhor linearidade da análise pela minimização dos erros quadrados. O limite de
detecção, LD, representa a menor concentração do analito que pode ser detectada,
porém esse parâmetro não é utilizado para a quantificação. Assim, para
quantificação o limite previsto é chamado de limite de quantificação, LQ, que
representa a menor concentração do analito em análise que pode ser quantificada,
utilizando algum procedimento laboratorial para medição.60,61
Além dessas duas figuras de méritos existe a precisão, que é um método que
avalia as ocorrências nas análises e com isso, sua variabilidade, aferindo a
qualidade das análises em consecutivas medidas de uma mesma amostra.62
32
2.5 OBJETIVOS DO CAPITULO 2
2.5.1 Objetivo Geral
Aplicar a técnica de PS-MS na identificação e quantificação de cocaína a
partir da análise de cromatografia em camada delgada.
2.5.2 Objetivos Específicos
Realizar testes com diversos sistemas de eluição para verificar a melhor
resolução entre os principais adulterantes e a cocaína;
Avaliar a sensibilidade da técnica em função da concentração.
Identificar e quantificar a cocaína e seus principais adulterantes (cafeína,
lidocaína, fenacetina e benzocaína) aliando a técnica de CCD e PS-MS.
2.6 PROCEDIMENTOS
2.6.1 Materiais e reagentes
Paras as análises de drogas ilícitas foram usadas: um padrão de referência
de cocaína fornecida pela Polícia Federal do Rio Grande do Sul (PF-RS), e padrões
de fenacetina, benzocaína (ambos fornecidos pela Sigma-Aldrich, São Paulo),
lidocaína e cafeína anidra (Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro e Bandeirante
Brazmo Industria e Comercio Ltda, São Paulo, respectivamente). Os reagentes
utilizados nas análises de CCD e PS-MS foram metanol grau HPLC (JTBaker), ácido
fórmico a 99% RPE ACS PA (Cario Erba Reagentes), hidróxido de amónio (Sigma
Aldrich), água Milli-Q, clorofórmio, ácido acético glacial e éter etílico, acetonitrila
(Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro).
2.6.2 Análise de Cocaína e Adulterantes por CCD e PS(+)-MS
Para a cocaína e seus adulterantes foram preparadas soluções de diferentes
concentrações (0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0 e 14,0 mg.mL-1) em metanol. As
soluções entre 0,5 e 10,0 mg.mL-1 foram preparadas a partir de solução estoque de
cada padrão contendo 20,0 mg.mL-1.
33
Inicialmente, as formas de aplicação do analito no sistema CCD foram
otimizados, variando o volume de aplicação (5, 10, 15, 20 e 25 L), a forma de
aplicação (micropipeta, capilar de sílica e microseringa), e a concentração do analito
(4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 14,0 e 16,0 mg mL-1). Para esta etapa, foi utilizado cocaína como
analito, sílica gel como fase estacionária com suporte de alumínio e metanol:NH4OH
na proporção de 99,5:0,5 v % como eluente. O sistema CCD foi eluído e revelado na
câmara ultravioleta (UV) com a 254 nm.
Após a otimização do volume de aplicação (10 L), concentração (10 mg mL-
1) e forma de aplicação, três diferentes eluentes foram avaliados para análise de
cocaína e seus adulterantes (lidocaína, cafeína, benzocaína e fenacetina) por CCD.
São eles: i) CHCl3:CH3OH:HCOOHglacial 75:20:5 v %; ii) (C2H5)2O:CHCl3 50:50 v %; e
iii) CH3OH:NH4OH em 100:1.5 v %. Esses três sistemas são comumente
recomendados pelo manual da UNODC.63 O fluxograma apresentado na Figura 8
ilustra o procedimento experimental realizado. O último sistema composto de
CH3OH:NH4OH, teve a razão entre os reagentes variadas na proporção de 0.5:99.5;
1:99; 97.5:2,5; 97:3.0 e 96.5:3.5 v/v % com o objetivo de melhorar a resolução
cromatográfica a partir da variação do pH do meio, Figura 8. Após a otimização da
fase móvel, o LD da técnica de CCD foi visualmente determinado para todos os
ingredientes ativos, no intervalo de concentrações de 0.5 a 14 mg mL-1). As soluções
entre 0.5 a 10 mg mL-1 foram preparadas a partir da solução estoque de 20 mg mL-1.
Todas as placas foram reveladas na câmara ultravioleta (UV) a 254 nm. Os
fatores de retenção (Rf) foram calculados a partir da divisão entre distância
percorrida pela amostra (da) e a distância percorrida pelo solvente (ds) conforme a
equação 1:
Rf = da/ds (eq. 1)
34
Figura 9. Sistemas de eluição de CCD avaliados para a identificação de cocaína e seus
adulterantes: fenacetina, lidocaína, benzocaína e cafeína.
As análises de PS-MS foram realizadas no espectrômetro de massas LTQ XL
(Thermo Scientific, Bremem, Alemanha) com fonte de PS acoplada no modo positivo
de ionização, PS(+), Figura 9.
Em geral, um pedaço de papel (Whatman Grade 1, GE Healthcare, USA) foi
cortado com geometria triangular (base e altura de 1 cm) e fixado a uma garra do
tipo jacaré, conectada a um fio de 0,5 mm ligado ao LTQ XL.64 Foram utilizadas as
seguintes definições: tensão no spray 3 kV, temperatura capilar = 275 ºC, a tensão
no capilar = 50 V. Os espectros de massa de verificação completa foram adquiridos
no modo positivo sobre a faixa 100-1000 m/z. Posteriormente, cada spot do CCD
contendo o analito foi resuspendido em metanol acidificado com HCOOH (0.1 % v) e
10 µL da solução resultante foi aplicado ao papel do PS(+)-MS. A montagem do
protótipo da fonte de PS foi realizada seguindo a descrição de Yang et al. (YANG,
35
WANG, et al., 2012). Uma das vantagens na utilização do espectrômetro de massas
LTQ XL é a não necessidade da utilização de uma fonte externa de alta voltagem,
pois a fonte de PS é alimentada por um potencial gerado a partir da interface da
sonda que era de ESI.
Figura 10. Ilustração do desenho experimental. Cada mancha de CCD foi transferido para um
frasco com metanol e 0,1 v / v% de HCOOH. A solução resultante foi, em seguida, transferida para a
fonte de PS(+)-MS.
A relação entre a intensidade do sinal (y) e a concentração de cocaína ou
adulterante (x) é modelada por uma equação 2 de primeira ordem:
y= ax + b (Eq. 2)
Onde b e a são coeficientes lineares e angulares, respectivamente. A partir da
curva de calibração o LOD foi determinada para cada substância utilizando a
equação 3:
LD=k.s/b1 (Eq.3)
Onde o fator K é número de confiança e escolhido o número de acordo com o
grau desejável (geralmente k = 3 é aceito), b1 é determinado a partir da curva de
calibração e s é o desvio padrão de dez análises do branco.
Uma outra figura de mérito que foi avaliada neste trabalho foi a precisão
(repetibilidade e reprodutibilidade). A repetibilidade mede o erro de uma
determinação individual e são critérios importantes para julgar o desempenho de um
36
procedimento analítico. O desvio padrão da precisão intermediária (σ̂ precisão intermediária)
foi estimada pela equação 465:
σ̂precisão intermediária=�̅�/d2 (Eq.4)
Onde �̅� é a média das razões de compostos cocaína/benzoilecgonina
(304/290 m/z) a 10 mg.mL-1 de uma solução de cocaína. Para este estudo, nove
análises foram realizadas por PS(+)-MS utilizando sempre a mesma solução durante
cinco dias consecutivos. O d2 é um fator que depende do tamanho da amostra.29
Neste estudo foi utilizado d2 = 2.970, que está relacionada com o número de
repetições (n = 9). Em seguida, uma análise de variância foi realizada para avaliar a
influência do fator "dia" na repetibilidade das análises.
2.7 RESULTADO E DISCUSSÃO
2.7.1 Drogas Ilícitas: Análise de Cocaína e Adulterantes por CCD e PS(+)-MS
A fim de avaliar a melhor metodologia de aplicação do analito no sistema
CCD, o formato do spot e seu valor de Rf foram avaliados em função do tipo de
aplicador, (Figura 10a, micropipeta, capilar de vidro e microseringa); da variação do
volume (L) de aplicação (Figura 10b); e da concentração do analito (mg mL-1,
Figura 10c). Monitorando inicialmente o sistema de aplicação, um spot bem
definido, homogêneo e uniforme é observado em todos os casos, Figura 10a.
Portanto, qualquer um dos três sistemas podem ser empregados para análise de
CCD em rotinas forenses. Quando o volume de aplicação é agora avaliado, a área
do spot tem seu tamanho aumentado quando volumes ≥ 15 L de cocaína são
usadas. Esse comportamento pode ser prejudicial para análises de amostras de rua
apreendidas, interferindo na resolução cromatográfica devido a problemas de
coeluição. Portanto, um volume de 10 L foi definido para todos os analitos. Apesar
da técnica de CCD mostra sensibilidade analítica para todas as concentrações
avaliadas (entre 4 e 16 mg mL-1), a concentração de trabalho adotado foi de 10 mg
mL-1.
37
Figura 11. A Otimização do sistema de CCD variando (a) métodos de aplicação (micropipeta,
capilares de sílica e micro-seringa); (b) volume (µL); e (c) concentração do analito (mg.mL-1).
A eficiência do CCD na detecção de padrões de cocaína e seus adulterantes
(fenacetina, cafeína, cocaína, benzocaína e lidocaína) são avaliados agora em
função de três diferentes eluentes (CHCl3:CH3OH:CH3OH, 75:20:5 v%,
CH3CH2OCH2CH3:CHCl3, 50:50 v %); e CH3OH:NH4OH 100:1.5 v %), Figura 11a-c.
Todos os padrões foram preparados a 10 mg mL-1 em metanol, sendo aplicados no
sistema CCD via capilar de sílica. Para o primeiro eluente (CHCl3:CH3OH:CH3OH,
75:20:5 v%, Figura 11a), as manchas são observadas para todos os padrões, além
de possuírem valores similares de Rf (Rf = 0.71-0.76, Tabela 2). Esse resultado
difere ao reportado por Sabino et al.66 Já para o sistema (CH3CH2)2O:CHCl3, 50:50
v% (Figura 11b), uma melhor performance do sistema CCD é observado em relação
a Figura 11a, onde as manchas são bem definidas e resolvidas e melhor
38
identificadas. Neste caso, entretanto, a maioria dos compostos apresentaram
valores similares de Rf (Rf para 0.71 a 0.76, Tabela 3). A única exceção observada
foi para o padrão de cocaína que apresenta Rf = 0.63, Figura 11b. Os melhores
resultados são observados para o sistema CCD quando o eluente CH3OH:NH4OH
(100:1.5 v%) é empregado, onde distintos valores de Rf são observados para a
maior parte dos compostos (Rf variando de 0.69 a 0.81), Figura 11c e Tabela 3. Um
similar sistema de CCD foi também reportado por Nicola et al.67 empregando
clorofórmio/metanol/hidróxido de amônio (100:20:1).
Figura 12. Placas de CCD utilizando os seguintes sistemas de eluição: (a)
CHCl3:CH3OH:CH3OH (75:20:5 v %); (b) CH3CH2OCH2CH3:CHCl3 (50:50 %); e (c) CH3OH:NH4OH
(100:1.5 v %).
39
Tabela 2. Valores de Rf para os padrões de fenacetina, cafeína, cocaína, benzocaína e
lidocaína.
A fim de determinar melhores valores de Rf entre os analitos, aumentando
assim a resolução cromatográfica, o sistema CH3OH:NH4OH teve a sua razão entre
os solventes variada, onde a concentração de NH4OH variou a partir de 0.5 a 3.5 %
produzindo os sistemas 99.5:0.5; 99:1; 97.5:2.5; 97:3; e 96.5:3.5 v%. O sistema de
CCD e os valores de Rf dos padrões são mostrados na Figura 12 e Tabela 3. Note
que o melhor sistema de CCD é obtido quando baixas concentrações de NH4OH são
usadas (< 1 v%). Nesta concentração, a interação entre cocaína com a fase
estacionária aumenta. Isto está relacionado como fato do NH4OH alterar o equilíbrio
ácido/base da molécula, onde a cocaína, por exemplo, é mantida na forma de
cloridrato quando a concentração de NH4OH é reduzida no sistema. De maneira
similar, a cafeína, que tem pka = 14 e alta polaridade, também interage
principalmente com a fase estacionária. Por outro lado, os compostos lidocaína,
benzocaína e fenacetina apresentam menores valores de pka (pKA ≤ 8), interagindo
agora, preferencialmente com a fase móvel. Portanto, o sistema CH3OH:NH4OH na
razão 99.5:0.5 v % foi definido como o de trabalho.
40
Figura 13. Variação da razão dos solventes do sistema de eluição CH3OH:NH4OH em: (a)
99.5:0.5 v%; (b) 99:1.0 v%; (c) 97.5:2.5 v%; (d) 97:3 v%; (e) 96.5:3.5 v%.
Tabela 3. Valores de Rf dos padrões para diferentes proporções da fase móvel (em % de
volume) de CH3OH:NH4OH.
Com objetivo de avaliar o LOD do sistema CCD, a concentração dos analitos
foi variado a partir de 0.5 a 14 mg mL-1 usando CH3OH:NH4OH (99.5:0.5 v%) como
fase móvel (Figura 13). Note que a fenacetina, benzocaína e cafeína se destacam
por apresentar o menor LOD (≥ 0.5 mg mL-1), enquanto que a cocaína e a lidocaína
tiveram LOD ≥ 2.0 e 4.0 mg mL-1, respectivamente (Tabela 4).
41
Figura 14. Variação da concentração dos padrões a partir de 0,5 a 14 mg.mL-1 na CCD com o
sistema CH3OH:NH4OH (99,5:0,5 %v).
Com o objetivo de aumentar a sensibilidade e a seletividade da técnica de
CCD, spots dos padrões foram também analisados pela técnica de PS(+)MS. Para
isto, as manchas reveladas foram extraídas e resuspendidas em metanol acidificado
(0.1 v% de HCOOH). Depois o sobrenadante foi depositado sobre a superfície do
papel de formato triangular com canal de parafina. Após a secagem, os analitos
foram analisados pela técnica de PS-MS em função de sua concentração (0.5, 4, 10
e 14 mg mL-1), Figura 14.
A Figura 14 ilustra os espectros dos padrões de cocaína, benzocaina,
cafeína, lidocaína e fenacetina. Em geral a benzocaína, cafeína e lidocaína são
detectados como molécula protonada, cátion [M+H]+ de m/z 166, 195, e 235,
enquanto a fenacetina é detectada como molécula cátion [M+H]+ m/z 180 e aduto de
sódio, [M+Na]+ de m/z 202. Já para o padrão de cocaína fornecido pela PC-ES,
houve a identificação de um derivado da cocaína, a benzoilecgonina, [M +H]+ m/z
290, um produto da degradação de cocaína. A Estrutura e conectividade dos analitos
42
foram confirmados a partir de experimentos de collision induced dissociation (CID) e
os espectros de PS(+) MS/MS são ilustrados na Figura 15.
Figura 15. Espectros de PS(+)-MS dos padrões benzocaína, cafeína, lidocaína, fenacetina e
cocaína em função da concentração: 0,5; 4,0; 10,0 e 14,0 mg mL-1.
A cocaína (m/z 304), Figura 15a, é caracterizada pela perda de C7H6O2
levando a formação do íon de m/z 182. A Benzocaina (m/z 166), Figura 15b,
apresenta duas perdas neutras. A primeira de C2H2 leva a formação do íon m/z 138,
já a segunda, uma perda de H2O gera o íon m/z 120. O espectro de PS(+)MS/MS da
cafeína, Figura 15c, é caracterizado pela perda de H2O formando o íon m/z 177,
que por uma perda subsequente de CO forma o íon m/z 149. A perda de HCN a
partir do íon de m/z 177 leva a formação do íon m/z 150. É observado
minoritariamente também duas perdas consecutivas de CHO levando a formação
a) Cocaine[C16H19NO4 + H]+
[C17H21NO4 + H]+
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
m/z
0
50
1000
50
1000
50
100
%
0
50
100
304290
290
304
290
290
304
304
0,5
4,0
10,0
14,0
b) Benzocaine
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200m/z
0
50
1000
50
1000
50
100
%
0
50
100
166
166
166
166
[C9H11NO2 + H]+
0,5
4,0
10,0
14,0
[C8H10N4O2 + H]+
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250m/z
0
50
1000
50
1000
50
100
%
0
50
100
195
195
195
195
c) Caffeine
0,5
4,0
10,0
14,0
d) Lidocaine
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300m/z
0
50
1000
50
1000
50
100
%0
50
100 235
235
235
235
[C14H22N2O + H+]0,5
4,0
10,0
14,0
[C10H13NO2 + H]+ [C10H13NO2 + Na]+
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250m/z
0
50
1000
50
1000
50
100
%
0
50
100
180
202
180
202
180202
180
202
e) Phenacetin
0,5
4,0
10,0
14,0
43
primeiramente do íon m/z 163 e em seguida o íon m/z 133. A lidocaina, Figura 15d,
é caracterizada pela fragmentação de C9H10NO formando o íon m/z 86. Já a
fenacetina, Figura 15e, é caracteriza-se pela perda de H2O levando a formação do
íon de m/z 162, e pela perda de C2H4 formando o íon m/z 152. A principal rota de
fragmentação da fenacetina é a perda de C2H2O formando o íon de m/z 138 que por
sua vez perde etileno levando ao íon m/z 110. Finalmente, a benzoilecgnonina,
produto de hidrólise da cocaína, Figura 15f, é caracterizada pela perda de H2O
formando o íon de m/z 272 e por uma perda similar a cocaína, C7H6O2 que leva ao
íon m/z 168.
Figura 16. PS(+)-MS/MS para os padrões de (a) benzocaína, (b) cafeína, (c) lidocaína, (d)
fenacetina e (e) cocaína.
A habilidade da técnica de PS(+)-MS para quantificar cocaína e seus
adulterantes foi avaliado partir da construção de curvas em função da concentração
166
- C2H4
He
60 80 100 120 140 160
m/z
0
100%
138
166
120
-H2Ob)Benzocaine
m/z
195
-C2H3NO-CO
He
50 70 90 130 150 170 1900
100
%
138
195177149133110 163
-H2O
110
-CHO
-HCN
150
-CO
-CHO
235
60 80 100 120 140 160 180 200 220
m/z
0
100
%
86
235
-C9H10NO
He
180
He
-C2H2O-C2H4
60 80 100 120 140 160 180
m/z
0
100
%
138
180152110
162
-H2O
-C2H4
c)Caffeined) Lindocaine
e) Phenacetine
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z
0
100
%
182
304
304
He
- C7H7O2
a) Cocaine
290
He
80 120 160 200 240 280m/z
0
100
%
168
290
272
-C7H5O2
-H2O
f) Benzoylecgnonine
44
do analito, onde a linearidade e o LOD foram reportados, Figura 16 e Tabela 5. As
curvas de calibração construídas para as amostras mostra excelente linearidade
(cocaína (R2 = 0,9989), benzocaína, (R2 = 0,9934), a cafeína (R2 = 0,9988), a
fenacetina (R2 = 0,9966), e a lidocaína (R2 = 0,9987)) e LOD inferior ao da técnica de
CCD. A técnica de PS(+)-MS pode ser usado também para a identificação e
quantificação de ingredientes ativos presentes em spots de CCD de amostras de
cocaína e crack apreendidas pela polícia forense, eliminando assim, resultados
falso-positivos. Além disso, devido a sua enorme simplicidade, a técnica de PS(+)-
MS pode ser acoplado diretamente a outras técnicas de separação como a
cromatografia em papel e para análise de selos de LSD e drogas sintéticas.
Figura 17. Curvas de calibração para a cocaína, benzocaína, cafeína, lidocaína e fenacetina.
y = 0,2427x + 1,8548R² = 0,9987
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15
Inte
ns
ida
de
(1
04)
Concentração (mg/mL)
Lidocaína (m/z 235)
y = 6,6266x + 4,2718R² = 0,9966
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15
Inte
ns
ida
de
(10
3)
Concentração (mg/mL)
Fenacetina (m/z 180)
y = 0,9679x + 4,3307R² = 0,9988
0
5
10
15
20
0 5 10 15
Inte
ns
ida
de
(10
2)
Concentração (mg/mL)
Cafeína (m/z 195)
y = 2,9924x + 4,8823R² = 0,9989
0
10
20
30
40
50
0 5 10 15
Inte
ns
ida
de
(10
2)
Concentração (mg/mL)
Cocaína (m/z 304) LOD: 6 µg/mL
LOQ: 18 µg/mL
LOD: 6 µg/mL
LOQ: 18 µg/mL
y = 1,6482x - 0,5948R² = 0,9934
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15
Inte
ns
ida
de
(10
3)
Concentração (mg/mL)
Benzocaína (m/z 166)LOD: 1 µg/mL
LOQ: 5 µg/mL
LOD: 4 µg/mL
LOQ: 14 µg/mL LOD: 89 µg/mL
LOQ: 296 µg/mL
LOD: 80 µg/mL
LOQ: 265 µg/mL
45
Tabela 4. LOD observada na CCD e calculada para o PS(+)-MS para cada padrão
Para monitorar a precisão do método, consideramos a razão da intensidade
relativa de cocaína/benzoilecgonina (m/z 304/290) detectado nas nove análises.
ATabela 6 ilustra esses valores, onde o valor estimado do padrão de repetibilidade.
A Tabela 7 descreve os testes de variancia realizados no Excel. Nota que, se a
variância dos resultados nos cinco dias é pequena, uma alteração insignificante em
resultados entre análise é feita no mesmo dia. Portanto, a técnica PS(+)-MS mostra
uma boa repetibilidade. A variancia mede a variação total de um dado sistema e
compara-a com a variação total para determinar se tal medição é viável.
Tabela 5. Valores de sinais proporção de m / z 304/290 correspondente à cocaína /
benzoilecgonina obtido por PS (+) análise por MS de nove repetições de cinco dias diferentes
46
Tabela 6. Análise de Variância (ANOVA) dos resultados individuais obtidos em cinco dias
diferentes por PS (+) MS da relação de cocaína / benzoilecgonina.
aSQ = soma dos quadrados. bDF = graus de liberdade, cMQ = mean square.
2.8 CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 2
As análises de CCD acoplada ao PS-MS permitiram a detecção de cocaína e
seus adulterantes obtendo ótimas linearidades (cocaína (R2 = 0,9989), benzocaína,
(R2 = 0,9934), a cafeína (R2 = 0,9988), a fenacetina (R2 = 0,9966), e a lidocaína (R2 =
0,9987)) e LOD inferior ao da técnica de CCD. O método desenvolvido neste
trabalho abre perspectivas de aumentar a confiabilidade da CCD tradicional e rotina
de análises empregados nas unidades de perícia penal, eliminando, assim,
resultados falsos positivos. Maior sensibilidade, selectividade e rapidez pode ser
fornecida no relatório forense, além de permitir a análise quantitativa. Devido à sua
grande simplicidade, o PS(+)-MS técnica também pode ser acoplado diretamente a
outras técnicas de separação, tais como cromatografia em papel, e ser usado para
as análises em outras matrizes, auxiliando ainda mais o trabalho de rotina pericial.
47
3 CAPÍTULO 3: ANÁLISE DE WHISKIE E CERVEJA POR PS-MS.
3.1 Bebidas alcóolicas
O Art. 12 da Lei nº 8.918, em seu segundo inciso diz que bebida alcoólica é a
bebida com graduação alcoólica acima de 0,5 à 24 % v/v a 20°C e as classifica em:
a) bebida alcoólica fermentada: é a bebida alcoólica obtida por processo de fermentação alcoólica; b) bebida alcoólica destilada: é a bebida alcoólica obtida por processo de fermento-destilação, pelo rebaixamento do teor alcoólico de destilado alcoólico simples, pelo rebaixamento do teor alcoólico do álcool etílico potável de origem agrícola ou pela padronização da própria bebida alcoólica destilada; c) bebida alcoólica retificada: é a bebida alcoólica obtida por processo de retificação do destilado alcoólico, pelo rebaixamento do teor alcoólico do álcool etílico potável de origem agrícola ou pela padronização da própria bebida alcoólica retificada;d) bebida alcoólica por mistura: é a bebida alcoólica obtida pela mistura de destilado alcoólico simples de origem agrícola, álcool etílico potável de origem agrícola e bebida alcoólica, separadas ou em conjunto, com outra bebida não-alcoólica, ingrediente não-alcoólico ou sua mistura.68(BRASIL, 2009)(BRASIL, 2009)
Aquarone; Lima e Borzani (1983) definem bebida alcóolica como bebida
refrescante, coquetel (mistura de bebidas), substância líquida, sem fins medicinais e
que possui acima de meio grau de etanol.69
Segundo Passagli (2013) devem ser levados em consideração quatro pontos
para se realizar o estudo do álcool: a) a disponibilidade da droga, visto que a
principal fonte de obtenção é natural, sendo de fácil produção em qualquer lugar do
mundo b) de ser uma substância lícita, mesmo que tenha leis próprias que regem
consumo e produção, os usuários dessa droga tem um livre acesso ao consumo; c)
fornecimento de energia (um grama de álcool equivale a aproximadamente oito
quilocalorias); e d) ampla divulgação da mídia, que não classifica a bebida alcóolica
como uma droga de fato.Erro! Indicador não definido. Dentre as bebidas alcoólicas mais c
onsumidas está aquelas que possuem menor valor agregado, como cerveja,
cachaça e algumas marcas de whisky.70
3.1.1 Cerveja
O Art. 36. da Lei nº 8.918, juntamente com a Normativa 54 de cinco de
novembro de 2001, definem cerveja como a fermentação alcoólica do mosto
48
cervejeiro proveniente de malte de cevada e água, mediante a ação de levedura,
acrescido de lúpulo.
Além disso, a cerveja deve ser classificada quanto ao extrato primitivo
(cerveja leve, comum, extra e forte) quanto à cor (clara e escura), quanto ao teor
alcóolico (sem álcool e com álcool) quanto à proporção de malte de cevada (cerveja
puro malte, cerveja, cerveja proveniente de algum vegetal) e quanto à fermentação
(baixa e alta fermentação).68,71
De acordo com a legislação brasileira cerveja também é dividida em tipos
como é descrito no Art. 39 do Decreto Nº 6.871, DE 4 DE JUNHO DE 2009.
Art. 39. De acordo com o seu tipo, a cerveja poderá ser denominada: Pilsen, Export, Lager, Dortmunder, Munchen, Bock, Malzbier, Ale, Stout, Porter, Weissbier, Alt e outras denominações internacionalmente reconhecidas que vierem a ser criadas, observadas as características do
produto original.68
Ainda que a produção seja feita a partir de matéria prima semelhante, o
produto final (cerveja) pode possuir gostos diferentes. Essa diferença vem
principalmente da constituição das substâncias presentes na produção, como água
mineral, as variações dos ingredientes e distintos métodos que dão origem a
subtipos de cervejas.72
Neste trabalho, apenas as cervejas do tipo lager e pilsen serão utilizadas.
Araujo (2005) define a cerveja lager como aquela de “baixa fermentação” onde as
leveduras formam flocos que permanecem na parte de baixo do tanque fermentador;
e a cerveja pilsen como aquela de coloração mais claras, possuindo um teor
alcoólico médio, e com um sabor mais amargo.73
3.1.2 Cachaça – água ardente
No Brasil, a cachaça é o destilado mais consumido e ocupa o segundo lugar
entre as bebidas alcoólicas, estando atrás apenas da cerveja.74
A aguardente, do Art. 51. Da Lei nº 8.918, é definida como a bebida com
graduação alcoólica entre 38 e 54% em volume, a 20 ºC, adquirida do rebaixamento
do teor alcoólico do destilado alcoólico simples, ou pela destilação do mosto
fermentado. O art. Art. 53. relata que a cachaça é a designação característica e
49
específica da aguardente de cana produzida no Brasil, podendo ser acrescentada
açúcares com até seis gramas por litro, expressos em sacarose.68
A cachaça vem se tornando um importante produto do agronegócio brasileiro
devido a maior qualificação da cadeia produtiva da bebida nos últimos anos.74
3.1.3 Whisky
No Art. 94 da Lei nº 8.918 traz que Uísque, "whisky ou whiskey" é a bebida
com teor alcoólico de 38 a 54% em volume, a 20 ºC, adquirida do destilado alcoólico
simples de cereais envelhecido. A sua produção pode ser completa ou com
porcentagens maltadas, além de ter a possibilidade de adicionar álcool etílico
agrícola, ou destilado alcoólico simples de cereais, assim como, de água para
diminuição do teor alcoólico e de caramelo (o último é usado para acertar a cor).68
O processo de fabricação de whisky envolve as etapas de: maltagem,
moagem, maceração, destilação, fermentação e envelhecimento. Os quatro últimos
estágios são os mais importantes, pois ocorre a conversão do amido do cereal em
açúcar, e logo depois, a transformação em álcool, denominado de “mosto
fermentado de cereais”. O mosto passa por até três destilações simples sucessivas
até originar um líquido transparente. A destilação do mosto produz um tipo de
destilado alcoólico de cereais (maltado, se o cereal for à cevada) que é
encaminhado para o envelhecimento em barris de carvalho, etapa final da
produção.75
Além disso, a legislação brasileira classifica o whisky nas seguintes
denominações: I. whisky puro de malte: whisky feito, exclusivamente, com destilado
de malte envelhecido com o coeficiente de congêneres não inferior a trezentos e
cinqüenta miligramas por cem mililitros em álcool anidro; II. blended whisky ou
whisky cortado: é a bebida resultante da mistura de 30% de destilado de malte
envelhecido com destilados alcoólicos de outros cereais, envelhecido ou não com o
coeficiente de congêneres não inferior a cem miligramas por cem mililitros, em álcool
anidro; III. grain whisky ou whisky de cereais: a partir de cereais reconhecidos
internacionais, sacarificados, total ou parcialmente, por diástases (enzimas que
atuam sobre o amido) da cevada maltada, adicionada ou não de outras enzimas
50
naturais e destilada em alambique ou coluna, envelhecido por um período mínimo de
dois anos com o coeficiente de congêneres não inferior a cem miligramas por cem
mililitros, em álcool anidro; e IV. bourbon whisky: quando o uísque for produzido nos
Estados Unidos da América de acordo com a sua legislação.71
3.2 Quimiometria
A quimiometria utiliza ferramentas matemáticas e estatísticas para extrair
maior informação de dados químicos. Uma das principais aplicações desta área, é a
calibração multivariada de dados que normalmente envolve o uso de um tipo de
medida instrumental para predizer o valor de um parâmetro de base ou
propriedade.76
Atualmente, regressão de mínimos quadrados parciais (PLS) tem sido um dos
métodos mais aplicado para calibração multivariada em química analítica. Essa
ferramenta matemática utiliza uma matriz de dados, onde a matriz X tem os
resultados das análises e em Y as variáveis.77
Além disso, outra ferramenta muito utilizada é análise de componentes
principais (PCA), que consiste em uma transposição da matriz de dados com
objetivo diminuir as variações presentes na matriz original, em um menor número de
componentes.78
3.3 OBJETIVOS
3.3.1 Objetivo Geral
Aplicar a técnica de PS-MS para análises de whiskies e cervejas.
3.3.2 Objetivos Específicos
Identificar a falsificação controlada de whisky com cachaça a partir do volume
de cachaça adicionado na blenda por PS-MS e avaliar quantitativamente essa
adulteração usando regressão por mínimos quadrados parciais (PLS).
Utilizar a fonte ambiente PS-MS para discriminar 10 marcas de cervejas nas
classificações entre o tipo pilsen e lager a partir de análise de componentes
principais (PCA);
51
3.4 PROCEDIMENTOS
3.4.1 Materiais e reagentes
Foram utilizadas para as análises de drogas lícitas: dez marcas de cervejas,
uma marca de whisky e uma de cachaça. Todas as bebidas foram adquiridas em
mercado local. Para as amostras de cerveja foi feito um fracionamento produzindo
quatro distintas frações. Cartuchos de extração em fase sólida (SPE) da marca
Chromabond® C18ec (6 mL, 500 mg) foram obtidos da Macherey-Nagel (Duren,
Germany), largura do poro 60 Â, tamanho de partícula 45 µm.
Os reagentes utilizados nas análises de SPE e PS-MS foram metanol grau
HPLC (JTBaker), água Milli-Q, acetonitrila (Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro).
3.4.2 Análise de bebidas por SPE e PS(±)-MS
Foram analisadas 10 marcas de cerveja e suas descrições são mostradas na
Tabela 2. Em geral, 20 mL de cada amostra foi adicionada a um béquer de 100 mL e
degaseificada usando um banho de ultrassom durante 5 min, para eliminar o CO2.
Após a degaseificação, as amostras foram armazenadas em vidro âmbar na
geladeira.
52
Tabela 7. Marcas de cervejas exploradas no trabalho bem como o teor alcoólico e
classificação entre Pilsen e Lager.
*Informação oriunda do rótulo
Inicialmente, o cartucho de SPE foi previamente ativado usando 5 mL de
metanol e posteriormente, 5 mL de água destilada. O cartucho foi carregado com 5
mL de cerveja degaseificada e o primeiro extrato coletado. Depois, o cartucho foi
recarregado com 5 mL de água destilada e o 2º extrato foi coletado. Para a produção
do 3º extrato, o cartucho foi preenchido com 2 mL de uma solução contendo
água:metanol (75:25 %v) e, finalmente, para a produção do quarto extrato, 2 mL de
metanol foi usado para eluir o cartucho. A Figura 17 ilustra o procedimento realizado
na extração das frações, sendo a metodologia usada adaptada de DENG et al.79
Com objetivo de aumentar a concentração dos metabólitos presentes no
último extrato, Figura 17d, 500 µL da solução foram pipetados e o solvente
evaporado por aproximadamente 15 dias a temperatura ambiente. Depois, foi
adicionado 250 µL de ACN ao extrato restante. Todos os quatro extratos foram
analisados no PS-MS em modo positivo de ionização, PS(+)-MS.
53
Figura 18. Extração de cerveja utilizando Chromabond® C18ec cartucho de SPE com
água/metanol.
Além das análises de cervejas, misturas binárias de whisky/cachaça foram
avaliados por PS-MS em ambos os modos de ionização, PS(±)-MS. A formulação
das misturas binárias contendo whisky-cachaça foram preparadas usando 19
concentrações (0; 0,5; 1; 3; 5; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 95; 97; 99; 99,5 e
100 wt % de cachaça), atingindo uma massa final de 1 g.
Para as blendas de whisky e cachaça foi aplicado 10 µL da solução em papel
cromatográfico para a análise de PS(±)-MS, conforme demonstrado na Figura 18b.
Em seguida foi aplicada um modelo de regressão linear (PLS) para uma
quantificação de adulteração com cachaça.
Para PS(±)-MS, a análise dos extratos de cerveja foram aplicados sobre a
superfície de um papel (Whatman Grade 1, GE Healthcare, EUA) no formato
triangular com as dimensões 7 mm x 12 mm. O papel foi fixado a um clipe de metal,
ligado a um fio de 3-5 mm ligada à entrada de MS. Foi aplicado uma tensão elevada
(-3,8 kV). O ion time accumulation foi 0,060 s e os espectros de PS-MS foram
adquiridas utilizando 16 scans no domínio do tempo em 512k. Um poder de
54
resolução, m/m50% = 62 762 (em que m50% é a largura do pico integral na meia-
altura máxima de pico de m/z 318) e uma precisão massa de < 2 ppm.
Figura 19. Ilustração da metodologia experimental. a) Foram aplicados 20 µL de cada extrato
das cervejas no papel triangular e submetidos a ionização no PS-MS. b) Após as variações de
concentração com whisky e cachaça a solução resultante foi aplicada a 10 µL no papel triangular e
feita a ionização no PS-MS.
Para classificar as amostras de cerveja, após a obtenção do perfil químico por
PS(+)MS, foi utilizado a Análise de Componentes Principais (PCA). As matrizes de
dados foram construídas utilizando apenas os dados dos espectros PS(+)MS do
último extrato (extrato 4). Para a construção de cada matriz foram considerados os
sinais com intensidade relativa maior que 10% obtendo um total de 845 variáveis
(valores de m/z). Uma matriz 20 X 845 foi construída e foi utilizado o MATLAB 7.0
(R2013a) para realizar o pré-tratamento de dados (centrando os valores na média)
bem como a PCA.
Para a criação do modelo de quantificação de cachaça em whisky foi utilizada
a regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS) com a utilização de repeated
double cross validation. As matrizes de dados foram construídas utilizando os dados
dos espectros PS(±)MS. Para a construção de cada matriz foram considerados os
sinais com intensidade relativa maior que 1%. Os dados foram obtidos em triplicata
obtendo uma matriz de 19 X 2793 para o PS(+)MS e 19 X 11789 para o PS(-)MS. As
linhas da matriz foram preenchidas pelas concentrações de cachaça em whisky e
suas respectivas intensidades referente a cada coluna. Foi utilizado o MATLAB 7.0
(R2013a) para realizar a curva foi escolhido 7 e 8 variáveis latentes para positivo e
negativo respectivamente.
55
3.5 RESULTADO E DISCUSSÃO
Para a análise de cerveja, inicialmente, foi analisado a amostra in natura via
PS(+)-MS, Figura 19. Em geral, o perfil químico dos espectros de PS(+)MS para as
amostras de marcas diferentes são similares. Os principais íons identificados foram:
oligossacarídeos com aduto de potássio (m/z 381, 543 e 705 [M + K]+)
correspondendo a maltose, maltotriose e maltotetrose, respectivamente. Essas
espécies estão naturalmente presentes no malte da bebida e também são
reportados por Araujo et al (2005) e Pereira et al. via ESI(+)MS e PS(+)MS/MS,
respectivamente.80,81
As amostras também foram exploradas no modo negativo de ionização, PS(-
)MS. Entretanto, devido a baixa e instável corrente iônica observada, não houve
reprodutibilidade nos resultados. Um similar comportamento foi observado por
Pereita et al (2016)81. Logo, o modo positivo de ionização foi o único explorado para
análise de cerveja.
56
Figura 20. Espectros de PS(+)MS relacionados à para análise das amostras brutas das 10
marcas de cerveja.
A Figura 20 mostra espectros de PS(+)MS para as quatro frações produzidas
para duas típicas marcas de cerveja Pilsen e Lager (marca 4 e marca 8). Nota-se a
redução dos sinais de m/z 381, 543, 867, 885, e 1047 em função da extração. Em
contrapartida, sinais de m/z 279, 293, 301, 307 e 317 são preferencialmente
ionizados além de outros na região de m/z < 800 (IR < ), que são agora detectados,
principalmente no extrato 4 e devem corresponder as espécies fenólicas.
57
Figura 21. Espectros de PS(+)MS para as quatro frações produzidas para duas típicas
marcas de cerveja Pilsen e Lager (marca 4 e marca 8).
Embora as extrações tenham retirados os açúcares ou diminuído a
intensidade deles para a maioria das amostras, os polifenóis, metabólitos
secundários presentes continuam sendo minoritariamente detectados. Além disso,
não houve discriminação das cervejas (por marcas ou tipo de processo de produção,
pilsen/lager) ao longo de todas as frações produzidas a partir do modelo PCA
previamente construído.
Para contornar esse problema, as amostras referentes ao extrato 4 foram pre-
concentradas e resuspendidas em acetonitrila e analisadas novamente por PS(+)-
MS. A Figura 21 destaca íons intenso na região de m/z de 200 a 400, em que se
repetem em todas as amostras de cervejas.
58
Figura 22. Espectros de PS(+)-MS das 10 amostras de cerveja (extrato 4) após a evaporação
do solvente.
Um modelo de PCA foi construído a partir da matriz 20 X 845 a partir dos
espectros de PS(+)MS para o extrato 4. Para a construção do modelo, as cervejas
59
foram identificadas em classes, pilsen (círculo azul) e lager (círculo vermelho),
conforme suas classificações comerciais (identificação no rótulo).
Quatro componentes principais foram necessárias para descrever 50,0% da
variância dos dados de PS(+)-MS (PC1 = 16,24%, PC2 = 13,95%, PC3 = 10,90% e
PC4 = 9,01%). Apesar do baixo valor de variância explicada, o gráfico 3D de scores
da PC1 x PC2 x PC4 mostra a formação de dois grupos, classificados de pilsen e
lager. Essa distinção é realizada ao longo dos quadrantes da PC4, onde para PC4>0
temos as amostras do grupo lager e para PC4≤0, as amostras do grupo pilsen,
Figura 22.
Figura 23. Gráfico de SCORES-3D obtido dos dados dos espectros adquiridos no modo
PS(+)-MS. PC1 = 16,24%, PC2 = 13,95% e PC4 = 9,01%.
A Análise de Componentes Principais fornece também o gráfico de Loadings,
o qual revela, quais as variáveis que tiveram maior influência na construção desse
novo sistema de coordenadas. A Figura 23 mostra o gráfico de Loadings obtido da
matriz de dados no modo PS(+)-MS onde pode ser observado maior destaque para
os cátions de m/z 318, 274, 233, 235, 610 e 302.
60
Figura 24. Gráfico de Loadings gerado a partir dos dados dos espectros obtidos no modo
PS(+)-MS para o quarto extrato após a evaporação do solvente.
Amostras de whisky “batizadas” com diferentes proporções de cachaça foram
analisadas por PS(±)MS, Figura 24 e Figura 26.
Para o modo PS(+)MS, observa-se que com o aumento da concentração de
cachaça, os sinais de açucares (m/z 365, 381, 533 e 707) suprimem a ionização dos
marcadores presentes na amostra de whisky (m/z < 320), Figura 24.
-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
154.0611155.0427155.0631155.1178156.1747156.9822157.0835158.0561158.0924158.0925158.0926158.1539
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7.1886888.3369889.0093889.6024889.9455890.2835890.9902891.2848891.7363892.1914892.7188893.583894.5148895.492896.1272896.5339896.7041896.854897.1313897.522897.6747897.9798899.1316899.1604899.4496900.1236900.8038900.8563900.9644901.1616901.8486901.8767902.1381902.3932902.6857903.5619904.0738904.0817904.2799904.2801904.6983904.7037904.7038904.7047904.7051904.7054904.7069904.7081904.7086905.0308905.3383905.7086905.7089905.7099905.7114905.712906.7511906.9461907.1796907.5146908.3444908.5183909.0387909.1801909.2552909.435909.5411909.8747910.0852910.145910.2229910.4457910.5021910.7295911.5704912.0117912.1725912.3143912.4228913.9614915.3619915.5479916.062916.152916.3397916.4217916.8123917.1888917.4685917.481918.178918.374918.4164918.572919.0121919.1561919.33919.3493919.8657920.3454920.4451920.6995920.7012920.7031920.704921.704921.7043921.7074921.7077923.0879923.2445923.2715924.1502925.1599925.2859925.6334925.7051926.2497927.0903928.3298928.6887929.3583930.4482930.8558931.7365931.9484933.1705933.1844933.9049934.2819934.9087935.0613935.8959936.0267936.4638937.0112937.7375938.6033938.8406939.1826939.8249940.1765940.4877940.8936940.9962941.791942.2451943.038943.5603944.035944.9606945.118945.2916945.3328945.8437946.5223947.7161948.3792948.6137948.6853948.7318948.7319948.7321948.7326948.7337948.7363948.7364949.0837949.2616949.6192949.7357949.7375949.7396949.7398950.2007950.6835950.7524951.2652952.0515952.2024952.3914952.8118953.5169953.6871953.6977954.2741955.3433955.5986955.9642956.6292956.882956.9503957.3628957.8507959.3249959.479959.5709960.1960.825961.6725962.4584963.2569964.4545964.7279964.7291964.7298964.7303964.7316964.7319965.2644965.439965.734965.7383966.9943969.3677969.4275969.6623970.4555970.5212972.0005972.1033973.0101973.0729973.6505974.0896974.8602974.9242975.2594975.4256975.537976.2287976.6355976.7894977.1042977.2755977.9125979.1395980.4898980.6499980.8966981.1575981.4534981.8839982.1317984.7626984.8112985.0853985.5906985.5921986.0642986.3661986.8564987.7379988.6784988.9339990.0111990.8517991.5031991.9515992.1345992.281992.7575992.7583992.7591992.7596992.762992.7627992.7628992.7635993.6037993.7378993.7639993.7647993.7665993.7669994.2245994.7679994.8212995.0986995.2089996.0877996.1112996.1391996.6238996.9655997.0912997.6115997.7522998.0918998.3159999.0411000.04091000.12281000.34011000.45841001.34281001.61051001.77151002.74261003.13961006.71651006.75661007.82731008.4881008.62331008.7541008.75861008.75921008.76061008.76851008.77081009.13061009.26161009.76091010.42861010.59181011.10371013.37131013.50441013.63061013.72321013.8321014.66371015.07771015.18631015.75181016.30331017.01111017.28851017.59151017.66741017.76751018.41811018.73011019.25861019.93731020.24781021.01861021.33911021.79871022.41581023.5951023.68941024.59341024.75281025.7461026.25111026.42021026.92381028.71781028.82161030.32771030.69581031.32821031.82851032.21151032.65051032.91211032.97791033.27731033.37751033.49971034.18381035.02551035.03891035.55851036.78761036.78871036.78881036.79031036.79191036.79251036.90571037.57971037.78961037.79351037.79491038.06091038.8631039.26041039.41021040.28571040.35961040.81121041.48261042.26561042.41661042.56581042.93831043.18831043.24271043.41351043.69241043.87221044.91181045.38181045.46451045.52611046.71521047.02111048.28711049.18141050.32421051.15361052.45091052.46491052.77451052.78551052.78661053.14261053.53311053.7881053.80481054.18321054.2761054.98551055.20671055.30481057.20581057.91058.36171058.39191058.95211059.93371060.60561061.63571062.29351063.2331063.33041064.43191064.78391065.83731066.10191066.56421066.67681066.77041069.60881069.79521069.84141070.80641071.47441074.14941074.88171074.99051075.02021076.53061076.53191076.89921078.21781078.60041078.85781079.14981079.42921079.63911079.68351080.45841080.55361080.62911080.78841080.8171080.81721080.81821080.81851081.8171081.82061081.82191082.57331082.83511083.7291084.33131084.48671084.61191085.1141085.8171085.93461086.36021086.96511087.27491087.38541088.21081088.84291089.74441089.94661090.14731090.37011091.69341092.28551093.6671093.82361094.90941095.07721095.45421096.69811096.80771096.81181097.42641097.47011098.34811098.37231099.99421100.44761100.65751101.08221103.64231104.10191104.7381104.78861105.22621105.28391105.38641107.17571107.57631110.70361111.76441112.25361112.63271113.20521114.31051115.15161116.15691117.71051118.0791118.71621119.02031120.14241120.77891121.16881121.58451122.04451122.82841123.86731124.75961124.84561124.84571124.84771125.84541125.85081127.06111128.67731128.70891130.07721130.51181130.70071132.16241132.86151133.43951134.19121134.24971134.86781135.16291136.42781138.00421138.29571138.87731139.53821139.91421140.8531141.20231142.17921142.77281143.76841143.91171144.0321144.29161146.50041147.12551147.3141148.27861150.18811150.52771152.63771153.59161154.44561155.86241158.59011158.72241159.76851159.93911160.08641160.6831160.82011163.45891163.99861164.56151165.04761165.62351165.90321166.20961166.64651167.37151167.78051168.52811168.87611169.25161169.88641170.42791170.4671170.70951171.221171.77391173.66821176.81481176.84231177.39311178.7221179.35471182.02371182.22191183.71311183.85211188.89391189.47771190.11111191.37491192.6791192.96981193.84871193.8491193.85151194.71941194.8511194.85221194.86321195.07721195.85541195.85651196.07221196.85071196.9791198.07341198.0931199.64431200.85061201.19061202.10841202.28371203.22731205.55931205.6751206.37021207.20531207.48141207.9361209.22671209.82081209.82171210.06511210.50391210.70181210.82391210.82461212.89931213.86261214.61091215.06791217.78611218.00361219.12891219.94111222.58061222.67651223.05381223.1111223.87871224.61531224.78671225.4051227.40131227.98651230.79231231.59931231.75681232.80891234.67411237.01181238.40251239.60111241.3341241.34561241.72811242.22531242.25321242.4361242.57261242.65811243.36721243.38651244.45671245.02081245.02781245.4711246.03981246.59391246.62531246.80791246.98141247.45431249.16081250.11941250.42371250.55181250.56211250.97421251.16371251.73411251.79081252.40721252.57651253.14721253.16861253.60011253.61381253.75471253.81341253.93441254.28751254.36661254.40441254.45431254.46461254.46571254.54031254.88891255.07161255.08181255.10411255.32841256.04061256.44861256.45261257.49231258.07161258.2481258.88521261.19751262.11241262.15631262.31891263.69651263.72881264.18361264.35111264.36911265.60671266.11211266.83841267.79681269.56671269.66651269.66821270.31291270.60191271.03691272.49491273.89171274.70591274.95821275.35281276.61711276.98561278.62071278.91531280.4851280.6681280.82831281.07841281.18481281.89481283.44571283.99231284.32021284.58341284.92281285.85661286.56631288.26861290.68011291.75641292.38431293.261293.75951293.89931294.93691295.6751298.67841299.6339
61
Figura 25. Espectros das blendas de whisky e cachaça por PS(+)-MS. A partir da letra (a) a
(k) é demonstrado o aumento da porcentagem de cachaça na mistura binária.
O modelo PLS com seleção de variáveis, foi construído com 7 variáveis
latentes, além disso, os coeficientes de regressão do modelo PLS mostram
relevância na região de aproximadamente de m/z de 200 a 350 (Figura 25).
62
Figura 26. Região de maior interesse nos conjuntos de espectros de whisky e cachaça,
adquiridos no PS(+)-MS na construção do modelo PLS.
O modelo PLS apresentou erro médio de previsão (RMSEP) de 10,9 %v/v,
com coeficientes de determinação para previsão de 0.9249. A Figura 26 demonstra
a curva de calibração adquirida pelo modelo PLS bem como os valores de LOD,
LOQ e coeficiente de linearidade. Estes parâmetros mostram boa relação entre os
valores previstos pelo modelo PLS (Figura 26). Os valores de LOD e LOQ foram de
12,5 %v/v e 41,7 %v/v, respectivamente.
Figura 27. Curva de calibração paras as blendas de whisky e cachaça a partir dos espectros
obtidos no PS-MS no modo positivo.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
m/z
Ave
rag
e in
ten
sity
63
Para a análise das blendas de whisky/cachaça no PS(-)-MS. De maneira
similar ao PS(+)MS, os espectros de PS(-)-MS das misturas binárias mostram um da
diminuição dos sinais de m/z 200-350 em função da concentração de cachaça,
Figura 27.
Figura 28. Espectros de PS(-)-MS das blendas de whisky/cachaça.
O modelo PLS foi construído com 8 variáveis latentes, além disso, os
coeficientes de regressão do modelo PLS mostram relevância em diversos valores
de m/z ao longo da faixa de 200 a 900 Da (Figura 28). Esse comportamento é
diferente ao observado para o modelo PLS construído no modo positivo, onde se
concentraram na região de m/z 200, Figura 27.
64
Figura 29. Região de maior interesse nos conjuntos de espectros de whisky e cachaça,
adquiridos no PS(-)-MS na construção do modelo PLS.
O modelo PLS apresentou erro médio de previsão (RMSEP) de 7,97 %v/v,
com coeficientes de determinação para previsão de 0.9592. A Figura 29 demonstra
a curva de calibração adquirida pelo modelo, os parâmetros mostram boa relação
entre os valores previstos pelo modelo PLS. Os valores de LD e LQ foram de 12,6
%v/v e 41,9 %v/v, respectivamente, que são semelhantes ao obtidos no modo
PS(+)-MS. Por outro lado, erro de previsão para o PS(-)MS é menor do que o
PS(+)MS. Este resultado está relacionado ao maior número de variáveis presentes
no modo negativo (11789) em relação ao positivo (2793), discrimando assim, melhor
o comportamento o modelo PLS construído no modo PS(-).
100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
10
20
30
40
50
60
70
80
m/z
Ave
rag
e in
ten
sity
65
Figura 30. Curva de calibração e parâmetros medidos a partir da blenda de whisky e
cachaça no PS-MS no modo negativo.
Os valores de LD detectado a partir do modelo PLS proposto, ~13%, são
satisfatórios para o produto comercial estudado, visto que o whisky é uma bebida de
alto valor comercial. Levando em consideração essa característica de mercado
nacional, é de se esperar um maior nível de adulteração da bebida (wt % de
cachaça > 10 %). Nagato (2001) relata que um grau de adulteração de 70% para um
total de 110 amostras de whisky comerciais analisadas.70
Os resultados de PS(+)-MS em cerveja possibilitaram a construção de um
modelo qualitativo, utilizando a análise de componentes principais. Esse modelo
possibilitou a separação das amostras de cerveja em pilsen e lager como descritas
nos rótulos de cada uma. As análises iniciadas irão prosseguir com a identificação
dos sinais de cada extrato, para melhor caracterizar as cervejas.
Com a adulteração controlada de cachaça em whisky, por PS(+/-)-MS em
ambos os métodos de ionização foi possível estimar os valores de LD (~13%, ) e
levar a discussão da proporção de adulteração que vem ocorrendo para o comércio.
A utilização dos resultados instrumentais em conjunto da quimiometria
possibilitou extrair informações, como variáveis importantes que muitas vezes não
são observadas sem o auxílio dessas ferramentas matemáticas.
66
3.6 CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 3
Os resultados de PS(+)-MS em cerveja possibilitaram a construção de um
modelo qualitativo, utilizando a análise de componentes principais. Esse modelo
possibilitou a separação das amostras de cerveja em pilsen e lager como descritas
nos rótulos de cada uma. As análises iniciadas irão prosseguir com a identificação
dos sinais de cada extrato, para melhor caracterizar as cervejas.
Com a adulteração controlada de cachaça em whisky, por PS(+/-)-MS em
ambos os métodos de ionização foi possível estimar os valores de LD (~13%, ) e
levar a discussão da proporção de adulteração que vem ocorrendo para o comércio.
A utilização dos resultados instrumentais em conjunto da quimiometria
possibilitou extrair informações, como variáveis importantes que muitas vezes não
são observadas sem o auxílio dessas ferramentas matemáticas.
67
4 CONCLUSÃO
Através das matrizes utilizadas neste trabalho, foi possível comprovar que a
fonte ambiente Paper Spray Ionization é de grande valia para as análises químicas,
visto as diversas vantagens que oferece a técnica.
Por fim, conclui-se que a utilização e estudos de fonte ambiente, como o
paper spray, permite a análise de diversas matrizes. A técnica destaca-se devido a
rapidez nas análises e aliado ao menor custo quando comparado outras fontes para
a espectrometria de massas, auxiliando a rotina laboratorial e a aplicação das
ciências forense.
68
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