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Universidade Federal do Pará
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
DIAGNÓSTICO E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA ANAPLASMOSE E
THEILERIOSE EQUINA NO ESTADO DO PARÁ
ELTON BRITO EVERTON
Belém - Pará
2014
ELTON BRITO EVERTON
DIAGNÓSTICO E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA ANAPLASMOSE E
THEILERIOSE EQUINA NO ESTADO DO PARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Pará
como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Evonnildo Costa
Gonçalves
Co-orientador: Prof. Dr. André Marcelo
Conceição Meneses
Belém - Pará
2014
ELTON BRITO EVERTON
DIAGNÓSTICO E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA ANAPLASMOSE E
THEILERIOSE EQUINA NO ESTADO DO PARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Pará como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Co-orientador:
Prof. Dr. André Marcelo Conceição Meneses
Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese
Instituto de Saúde e Produção Animal, UFRA
Profa. Dra. Juliana Simão Nina de Azevedo
Universidade Federal Rural da Amazônia/Capanema
Profa. Dra. Dra. Hilma Lúcia Tavares Dias
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Prof. Dr. Ednaldo da Silva Filho (Suplente)
Instituto de Ciências Agrárias, UFRA
Belém - Pará
2014
Aos meus pais e irmão, por toda a paciência, pelo carinho
e amor incondicional.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me acompanhado em todos os momentos me dando
força para superar barreiras e obstáculos que surgiram no meu caminho. E por ter me
dado pais maravilhosos dos quais eu tenho muito orgulho.
Aos meus pais Francisco Everton e Lacir Celestino que me criaram e
educaram, mostrando os valores morais e éticos da vida, que deram apoio em todos os
momentos que precisei, por acreditarem e confiarem em mim, por me darem todo amor
e carinho que pais podem oferecer aos seus filhos. Ao meu irmão Elder Everton por ser
meu amigo e companheiro, sempre me ajudando, apoiando e incentivando nos estudos.
Ao meu orientador Evonnildo Gonçalves, pelo exemplo de profissional e
capacidade, espero um dia me tornar metade do profissional que és, e possuir metade do
conhecimento que tens. Obrigado, por ter me aceito e dado essa oportunidade de me
qualificar, agradeço pelos ensinamentos e “paciência”.
Ao meu co-orientador Andre Meneses, por disponibilizar o material para o
desenvolvimento da minha pesquisa.
Aos meus amigos do Laboratório que me ajudaram a fazer a parte prática desse
projeto, e em especial ao Leopoldo Moraes que me ajudou em toda essa caminhada,
muitas vezes me dando força para que não desistisse no meio do caminho.
Aos meus amigos pessoais (sem citar nome para não esquecer de ninguém) que
de alguma forma me ajudaram com palavras de apoio, risos, brincadeiras e
descontração, pois só quem está nessa batalha sabe o quanto é estressante.
À Universidade Federal do Pará, ao Programa de Pós Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários (PPGBAIP) e à coordenação deste, pela oportunidade
de ingresso em um dos cursos de pós-graduação mais conceituados do Brasil.
Aos professores do PPGBAIP pelas aulas ministradas e pelos valiosos
conhecimentos compartilhados.
Á CAPES pelo suporte financeiro ao longo desses 24 meses de pesquisa.
SUMÁRIO
RESUMO 3
ABSTRACT 4
1 INTRODUÇÃO 5
1.1 ENFERMIDADE DOS EQUINOS 5
1.2 ANAPLASMOSE EQUINA 6
1.2.1 Microbiologia 7
1.2.2 Relação Vetores/ Agentes 8
1.2.3 Patogenia e Sinais Clínicos 10
1.2.4 Diagnóstico 11
1.2.5 Epidemiologia 13
1.3 THEILERIOSE EQUINA 14
1.3.1 Microbiologia 18
1.3.2 Vetores 19
1.3.3 Ciclo Biológico 20
1.3.4 Patogenia e Sinais Clínicos 22
1.3 DIAGNÓSTICO 23
1.3 EPIDEMIOLOGIA 26
1.4 JUSTIFICATIVA 27
2 OBJETIVO GERAL 28
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS 29
3.1 AMOSTRAGEM 29
3.2 ANÁLISES MOLECULARES 30
3.2.1 Detecção de Anaplasma phagocytophilum 30
3.2.2 Detecção de Theileria equi 31
3.3 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR 32
3.4 ANÁLISE DOS DADOS 32
4 RESULTADOS 33
5 DISCUSSÃO 38
5.1 PREVALÊNCIA DE Anaplasma phagocytophilum 38
5.2 PREVALÊNCIA DE Theileria equi 39
6 CONCLUSÃO 42
REFERÊNCIAS 43
RESUMO
Dentre muitas doenças que podem acometer os eqüídeos a anaplasmose e a theileriose
destacam-se como as duas principais hemoparasitoses causadoras de grandes perdas
econômicas, seja com o impedimento de importação ou exportação, tratamento da
enfermidade ou morte dos animais infectados. Dada à escassez de dados na região norte,
este estudo teve como objetivo investigar a prevalência do protozoário piroplasmida
Theileria equi e da bactéria zoonótica rickettsial Anaplasma phagocytophilum em
equídeos do estado do Pará. Amostras de sangue foram obtidas de 155 equídeos de
cinco diferentes regiões do estado do Pará. A presença dos dois patógenos foi avaliada
por meio de teste molecular nested-PCR (Reação em Cadeia de Polimerase), resultando
em quatro amostras (2,58%) positivas para A. phagocytophilum e 93 (60,00%) para T.
equi. Em comparação com táxons de outras regiões do globo, a análise de diversidade
das sequências nucleotídicas obtidas na presente pesquisa revelou pouca variabilidade
genética tanto para A. phagocytophilum quanto para T. equi. Este é o primeiro estudo a
utilizar técnicas moleculares para investigar e diagnosticar infecções por A.
phagocytophilum e T. equi em equídeos na região norte e o primeiro a relatar esses
animais como portadores desses parasitos no estado do Pará.
Palavras chave: Hemoparasitoses, equinos, anaplasmose, theileriose, nested-PCR
ABSTRACT
Among many diseases that can affect the equine anaplasmosis and theileriosis stand out
as the two main hemoparasitoses that causes large economic losses, either with the
prevention of importation or exportation, treatment of illness or death of infected
animals. Given the lack of data in the region north this study aimed to investigate the
prevalence of piroplasmid protozoan Theileria equi and zoonotic bacteria Anaplasma
phagocytophilum in horses in the state of Pará. Blood samples were obtained from 155
horses from five different regions of Pará. The presence of both pathogens was
evaluated by nested-PCR (Polymerase Chain Reaction) molecular test, resulting in four
samples (2.58%) were positive for A. phagocytophilum and 93 (60.00%) T. equi.
Compared with taxa from other regions of the globe, the diversity analysis of the
nucleotide sequences obtained in this study showed little genetic variation for bothA.
phagocytophilum and for T. equi. This is the first study to use molecular techniques to
investigate and diagnose infections with A. phagocytophilum and T. equi in horses in
northern region and the first to report these animals as carriers of parasites in the state of
Pará.
Keywords: Hemoparasitosis, equines, anaplasmosis, theileriosis, nested-PCR.
5
1 INTRODUÇÃO
A equideocultura brasileira é representada por uma grande quantidade de raças,
inseridas em vários setores da economia (Silva et al., 1995). O Brasil tem o maior
plantel equino da América Latina, o que movimenta cerca de 7,5 bilhões de reais e
envolve vários segmentos de mercado, dos quais se destaca os insumos, a criação e a
destinação final. Isto compõe a base do denominado Complexo do Agronegócio do
Cavalo, que gera em torno de 3,2 milhões de empregos (Almeida, 2010).
O efetivo dos rebanhos de equídeos do estado do Pará é de 419.869 animais
(IBGE, 2011), sendo que a maior parte desses animais está localizada nas regiões rurais,
contando com animais mestiços para trabalho e animais de raças para exposição e a
prática de esporte (Galo, 2006).
Apesar de originalmente serem utilizados como meio de transporte ao longo
dos anos, os equídeos têm sido incluídos em diversas outras áreas de atuação tais como:
lazer, esportes e terapia (Baptista, 2010) forçando uma estreita relação com o homem,
logo, o conhecimento das enfermidades que podem acometer os equídeos é de grande
importância, não somente do ponto de vista da clínica médico veterinária, mas também
de saúde pública, visto que algumas dessas enfermidades podem apresentar caráter
zoonótico (Urquhart, 1998; Bakken & Dumler, 2006; Parra, 2009).
1.1 ENFERMIDADE DOS EQUINOS
Os equídeos podem ser acometidos por uma gama de enfermidades que afetam
os mais diferentes sistemas orgânicos desses animais, segundo Pierezan (2009), refere
em estudo sobre prevalências de enfermidades em equinos que os sistemas mais
acometidos são: digestivo, com maior prevalência para alterações no posicionamento do
intestino, seguido pelo músculo esquelético, sendo as fraturas a principal afecção;
nervoso, cujas enfermidades de maior frequência são a leucoencefalomalácia e a
tripanossomíase; respiratório, sendo a depressão causada por anestésicos a principal
causa de morte relacionada a esse sistema; tegumentar, com neoplasmas e pitiose como
as principais enfermidades e, o hematopoiético, em que a anemia infecciosa equina e as
hemoparasitoses constituem os maiores problemas.
6
As doenças comumente denominadas hemoparasitoses, são causadas por
organismos chamados de hemoparasitos, que podem ser transmitidos aos animais e ao
homem por vetores mecânicos e/ou biológicos (Rodríguez-Vivas, 2000).
As hemoparasitoses são enfermidades de distribuição mundial que causam
efeitos deletérios na saúde dos rebanhos, principalmente sobre a produtividade e
rentabilidade dos sistemas de produção desenvolvidos nas diferentes regiões
(Tamasaukas et al., 2000). Essas doenças são causadoras de perdas à atividade pecuária,
sendo considerado um grave problema de ordem sanitária à pecuária nacional
(Cavalcante, 2002). Acometem várias espécies, sendo responsáveis por diversas
manifestações clínicas, que podem culminar com o óbito do animal (O’Dwyer, 2000;
Torres et al., 2004).
Dentre as hemoparasitoses que acometem equídeos destacam-se a anaplasmose
e a theileriose, que têm ampliado sua distribuição geográfica devido ao acesso dos
vetores artrópodes a novos nichos ecológicos, representado, assim, um novo desafio
para a medicina veterinária e humana (André, 2008).
Estas enfermidades afetam diretamente o sistema produtivo uma vez que são
responsáveis por grandes perdas econômicas, devido à impossibilidade de importação e
exportação, ao baixo rendimento dos animais em provas, elevado custo de tratamento e
mortalidade dos animais acometidos (Cavalcante, 2002).
1.2 ANAPLASMOSE EQUINA
A anaplasmose granulocítica equina (AGE) é uma doença de importância
médico veterinária e zoonótica que foi relatada pela primeira vez em 1969 na Califórnia
(Stannard, 1969). A AGE é causada pela bactéria Anaplasma phagocytophilum,
primeiramente descrita em 1930 como Rickettsia phagocytophila, mas cuja classificação
sofreu várias modificações, incluindo sua renomeação para Cytoecetes phagocytophila,
Ehrlichia phagocytophila (Dumler, 2001).
Com o advento da engenharia genética, Dumler (2001), partindo de análises
moleculares constatou que E. phagocytophila, agente da febre da carraça em
bovinos, ovinos e caprinos, bem como o agente causal da erliquiose granulocítica
humana e a espécie E. equi eram semelhantes a organismos do gênero Anaplasma sendo
então reclassificados em uma única espécies, A. phagocytophilum.
7
Atualmente, A. phagocytophilum é um organismo taxonomicamente incluído
no Filo Proteobacteria, Classe Alphaproteobacteria, Ordem Rickettsiales, Família
Anaplasmataceae e gênero Anaplasma (Dumler, 2001). No intuito de manter a
coerência com a nomenclatura atual, o termo Anaplasmose Granulocítica Equina (AGE)
passou a ser utilizado como referência à síndrome clínica produzida em equídeos
(Uehlinger et al., 2011).
1.2.1 Microbiologia
A. phagocytophilum é uma bactéria gram-negativa, intracelular obrigatória,
com tropismo por célula da linhagem granulocítica, sendo comumente encontrada como
inclusões intracitoplasmáticas, também denominadas, mórula (Figura 1) (Uehlinger et
al., 2011; Calderón & Delgardo, 2013). É uma bactéria pleomórfica, em geral cocóide,
que pode variar de 0,4 µm a 1,3 µm, podendo atingir tamanhos próximos a 2 µm de
diâmetro (Lai et al., 2009; Rikihisa, 2011). No entanto, segundo Lai et al. (2009) pouco
se conhece acerca dos fatores bacterianos que regulam seu crescimento e
desenvolvimento intracelular.
A. phagocytophilum é uma das quatro espécies do gênero Anaplasma, que têm
especificidades por diferentes células do hospedeiro. Para esta espécie as células
hospedeiras primárias são os granulócitos, principalmente neutrófilos e com menos
frequência eosinófilos (Rikihisa, 2011; Uehlinger et al., 2011), contudo, infecções de
células endoteliais já foram mostradas in vivo e in vitro (Munderloh et al., 2004; Herron
et al., 2005).
Figura 1 - Inclusão intracitoplasmática (Mórula) de A. phagocytophilum (seta) em neutrófilo de
equino. (Fonte: http://veterinaryrecord.bmj.com/content/166/21/646/F1.expansion.html).
8
1.2.2 Relação Vetores/Agentes
Os vetores do agente da anaplasmose granulocítica são carrapatos do gênero
Ixodes, incluindo as espécies Ixodes ricinus na Europa, Ixodes persulcatus na Europa e
Ásia, Ixodes scapularis e Ixodes pacificus na América do Norte (Foley, 2004). A A.
phagocytophilum também já foi detectada em Ixodes ricinus e Ixodes ventalloi em
Portugal (Santos et al., 2009), além do carrapato da espécie Hyalomma marginatum
(M’Ghirbi et al., 2012).
Ghafar (2012), estudando a prevalência e caracterização molecular do
bioagente A. phagocytophilum, encontrou evidências genômicas desta bactéria em
carrapatos da espécie Rhipicephalus sanguineus propondo este artrópode como possível
vetor da anaplasmose granulocítica humana no Egito. No Brasil, suspeita-se que as
espécies Amblyomma cajennense também esteja envolvidos na transmissão da
anaplasmose (Ferrão, 2006).
Uma vez infectados durante o repasto sanguíneo em animal contaminado, o
hospedeiro invertebrado mantém a bactéria viável desde a fase larvária até o estágio
adulto, sendo transmitido ao mamífero durante novo repasto, não havendo evidências de
transmissão horizontal (Rikihisa, 2011).
Após a inoculação no hospedeiro vertebrado, o microrganismo possui duas
formas de desenvolvimento, onde pequenas células densas e tubulares (CDT) se aderem
e penetram nas células alvo e células reticuladas grandes que são diferenciadas a partir
de CDT, que se multiplica por fissão binária no interior de fagossomos formando
mórulas e amadurecem novamente em células CDT causando lise celular permitindo
assim, a bacteremia e com isso a infecção de novas células (Rikihisa, 1991; Munderloh
et al., 1999; Dumler, 2003; Khon et al., 2008).
A colonização das células do hospedeiro é facilitada pelos componentes
presentes na saliva do carrapato vetor, que exercem uma atração quimiotática e
estimulam o rolamento de neutrófilos pelo endotélio vascular, o que facilita a
penetração da A. phagocytophilum nas células alvo, por meio de endocitose (Munderloh
et al., 2004).
Além dos equídeos, cães, gatos, humanos, ruminantes, roedores e aves são
considerados hospedeiros definitivos de A. phagocytophilum, sendo importante salientar
que os animais silvestres atuam como reservatórios do patógeno e que as aves
9
migratórias facilitam a disseminação do vetor artrópode (Dumler et al., 2001; Bowman
et al., 2009).
Existem diversas cepas de A. phagocytophilum circulantes na natureza, com
suscetibilidade variável de acordo com a espécie de mamífero capaz de ser infectada.
Segundo o ciclo de vida proposto por Rikihisa (2011) (Figura 2), em carrapatos do
gênero Ixodes, a bactéria A. phagocytophilum pode não ser transmitida de forma eficaz
do estágio adulto infectado para os ovos, assim, as larvas não estão infectadas após a
primeira metamorfose.
Figura 2 - Ciclo de vida da A. phagocytophilum. Diversas cepas (A, B, C, D, E, F) de A.
phagocytophilum estão em circulação na natureza, e a suscetibilidade entre as diferentes
espécies de mamíferos para as diferentes estirpes bacterianas pode variar. A A. phagocytophilum
não é passada de forma eficaz do carrapato adulto infectado (Ixodes sp.) para ovos, assim, as
larvas não são infectadas. Carrapatos na fase larval, de ninfa ou adultos podem adquirir cepas de
A. phagocytophilum através do repasto sanguíneo em animais infectados. Uma vez presente do
nos estágios de larva ou ninfa, o bioagente é mantido no hospedeiro invertebrado através da
metamorfose e muda para o próximo estágio de vida e transmitida ao hospedeiro vertebrado
susceptível, através de um novo repasto sanguíneo. A susceptibilidade das espécies de animais a
estirpes de A. phagocytophilum representadas é uma proposta, sendo a maioria não comprovada
experimentalmente. [Fonte: Adaptado de Rikihisa (2011)].
10
Vetores no estágio de larva, ninfa ou na fase adulta adquirem cepas de A.
phagocytophilum através do repasto sanguíneo em animais infectados e uma vez
portador durante as fases larva ou ninfa o bioagente é mantido no artrópode até a fase
adulta e transmitido através do repasto sanguíneo a um hospedeiro susceptível à cepa
em questão (Rikihisa, 2011).
1.2.3 Patogenia e Sinais Clínicos
O curso clínico da AGE depende do tempo de duração da doença e da idade do
animal. Segundo Plier et al. (1999), equinos jovens geralmente apresentam
manifestações clínicas menos graves.
O período de incubação é em media de 14 dias, e o animal infectado pode
apresentar doença subclínica ou sinais clínicos característicos da enfermidade como
febre, depressão, anorexia, relutância ao movimento, edema dos membros, icterícia,
petéquias, ataxia e em alguns casos arritmias ventriculares (Madigan, 1993), além de
complicações reprodutivas, como aborto e espermiogênese alterada (Stuen, 2007).
Hilton et al. (2008) descreveram um caso de anaplasmose equina, com sinais
clínico semelhantes aos descritos acima, incluindo orquite e decúbito, decorrente da
miodegeneração (rabdomiólise) causada pela infecção de A. phagocytophilum. Franzén
et al. (2007), relataram o óbito de um equino infectado experimentalmente,
apresentando sequelas da doença, infecção secundária e traumas decorrentes da ataxia,
contudo, Parra (2009), refere que mortes associadas à infecção pela A. phagocytophilum
não são frequentes. O parasitismo pode resultar na redução do crescimento e ganho de
peso, além do aumento da taxa metabólica e exigências nutricionais, decorrentes de
reações inflamatórias e/ou a produtos do metabolismo da bactéria (Smith, 2006).
Nos animais não tratados, a anaplasmose pode ser uma doença autolimitante
que dura em torno de duas ou três semanas, no entanto, equídeos infectados podem
apresentar lesões traumáticas decorrentes da ataxia ou estarem predispostos a infecções
secundárias (Madigan, 1993).
Alterações laboratoriais em equídeos enfermos consistem em leucopenia,
trombocitopenia, anemia, além de leucograma de inflamação quando ocorre infecção
secundária (Madigan, 1987). Em cavalos infectados experimentalmente as repostas
imunitárias desenvolvem-se em média por volta de 21 dias após a infecção (Van Andel,
1998), e a imunidade pode persistir por mais dois anos (Madigan, 1987).
11
Doenças como encefalite, hepatopatias, púrpura hemorrágica e anemia
infecciosa equina, podem ser diagnóstico diferencial por apresentarem condições
clínicas semalhantes a AGE (Madigan, 1993), além de babesiose causada por Babesia
caballi (Bermann et al., 2002).
1.2.4 Diagnóstico
A anaplasmose é uma doença relatada em algumas regiões do Brasil, sendo
estes relatos baseados em várias formas de diagnósticos diretos e indiretos (Aguiar et
al., 2007; Carlos et al., 2007; Oliveira et al., 2008; Saito et al., 2008).
A observação das alterações clínicas e hematológicas é comumente empregada
para oferecer uma diagnose provisória da infecção, contudo essas alterações podem ser
confusas e variáveis, obrigando o uso de exames mais precisos para confirmação de um
diagnóstico definitivo (Waner et al., 2001; Cohn, 2003). A obtenção de um diagnóstico
definitivo requer técnicas mais acuradas, como pesquisa de inclusões em esfregaços
sanguíneos e de capa leucocitária, cultivo celular, testes sorológicos e moleculares
(Dagnone et al., 2003; Morais et al., 2004).
A microscopia direta é o método de rotina, capaz de mostrar as inclusões
intracitoplasmáticas (mórula) em células mononucleares sanguíneas, a partir do
esfregaço, sanguíneo ou de capa leucocitária (Woody & Hoskins, 1991; Plier et al.,
1999), podendo a identificação do agente etiológico ser realizada pelo método coloração
de Wright, que identifica as mórulas do A. phagocytophilum no interior de células
granulocítica (Goodman et al., 1996).
Essa técnica tem a vantagem de ser rápida e confirmatória, entretanto possui
baixa sensibilidade devido ao pequeno número de células infectadas com mórulas, além
de ser dependente da experiência do microscopista (Mylonakis et al., 2003; Passos et
al., 2005).
Outro método de diagnóstico envolve a cultura celular de granulócitos, que de
acordo com Mutani & Kaminjolo (2001), tem se mostrado mais eficiente quando
comparado com o tradicional método de visualização microscópica em esfregaço
sanguíneo. No entanto, a cultura de células é reservada a laboratórios de pesquisas
especializados (Little, 2010), portanto pouco aplicada na rotina médico-veterinária.
Técnicas sorológicas também podem ser usadas para efetuar o diagnóstico de
infecções causadas por Rickettsias (Cohn, 2003). Os anticorpos são detectados a partir
12
da segunda semana após o início dos sintomas clínicos (Bonoldi, 2009). Dentre essas
técnicas as mais utilizadas são reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Miranda, 2010).
A RIFI é usada para detectar anticorpos contra os antígenos de superfície
(Lester, 2005). A técnica consiste de duas etapas, primeiro uma reação específica,
formando o complexo antígeno-anticorpo, seguida pela utilização de um marcador FITC
(Isotiocianato de Fluoresceína), que se liga ao complexo formado, permitindo a
visualização da reação em microscópico de imunofluorescência. O teste possui alta
sensibilidade e especificidade (Ferrão, 2006), contudo, este pode apresentar resultados
falso-positivos, pois os anticorpos podem permanecer muito tempo após o tratamento
e/ou cura, e resultados falso-negativos, caso as amostras de soro sejam coletadas no
período inicial da doença, onde as imunoglobulinas IgGs ainda não são detectáveis. Em
geral, as IgGs só poderão ser detectadas a partir de 8 a 18 dias após a infecção, assim,
sugere-se a utilização de soros pareados com intervalo de 4 a 8 semanas, para o
acompanhamento da curva de IgG do animal (Ferrão, 2006).
Se comparados os dois testes sorológicos, a RIFI apresenta a vantagem de ser
quantitativo, no entanto, o ELISA é um teste rápido que utiliza agente altamente
específicos confirmando infecções ativas ou passadas (Miranda, 2010).
Apesar das vantagens dos testes sorológicos, estes não possuem a capacidade
de diferenciar todos os agentes da família Anaplasmataceae (Waner et al., 2001),
devendo ser considerada a possibilidade de ocorrência de reações cruzadas entre esses
organismos, tendo que recorrer a testes complementares para a confirmação do
diagnóstico (Rikihisa et al., 1994; Sukasawat et al., 2000; Couto, 2003; Aguiar et al.,
2007).
As técnicas moleculares, que permitem amplificações do material genômico
(DNA), como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vêm sendo cada vez mais
empregadas como métodos complementares aos outros testes de diagnóstico de
hemoparasitos (Rodriguez, 1997). A PCR é uma técnica rápida, sensível e específica
para a detecção genômica de muitos microrganismos (Rodriguez, 1997) que permite
superar a dificuldade do diagnóstico diferencial encontrada em outras técnicas (McBride
et al.,1996).
Este método pode detectar o DNA dos microrganismos antes do aparecimento
de anticorpos na circulação sanguínea propiciando um diagnóstico mais rápido e
13
preciso, quando comparado com a sorologia. A PCR apresenta como desvantagem a
necessidade da padronização da técnica e sequenciamento dos produtos do teste, caso
ocorra resultados duvidosos (Miranda, 2010), em especial quando se utiliza iniciadores
não específicos, que podem gerar resultados imprecisos.
Métodos de diagnóstico moleculares permitem a detecção direta do agente,
além da possível comparação com outras linhagens por meios do sequenciamento do
DNA. Contudo, no Brasil a caracterização genética bem como a análise das relações
filogenéticas dos agentes da família Anaplasmataceae são limitadas (Dagnone et al.,
2003).
1.2.5 Epidemiologia
A anaplasmose granulocítica é uma enfermidade de distribuição mundial,
sendo a sazonalidade e a distribuição geográfica da infecção pela A. phagocytophilum,
proporcional à sazonalidade e a distribuição geográfica dos seus vetores (Dumler, 2001;
Greene, 2006), e ocorre com maior frequência em áreas de clima temperado (Telford et
al., 1996; Bown et al., 2008). No verão, devido à maior ocorrência de carrapatos, há
uma maior probabilidade de novas infecções pela bactéria A. phagocytophilum (Waner
et al., 2001).
A AGE vem sendo relatada em vários países do mundo, como no Canadá
(Burgess et al., 2012; Uehlinger et al., 2011), Colômbia (Calderón & Delgado, 2013),
Estados Unidos (Siska et al., 2012) e França (Bermann et al., 2002).
Ebany et al. (2008) avaliando 793 amostras sanguíneas de equídeos, através de
técnica sorológica (RIFI), constatou prevalência de 16,89% (134/793) em animais da
Itália Central. Hansen et al. (2010), utilizando técnica sorológica ELISA, analisaram
390 amostras sanguíneas de diversas regiões da Dinamarca encontrando presença de
anticorpos anti-A. phagocytophilum em 22,3% (87/390) das amostras testadas.
M’ghirbi et al. (2012), avaliando a infecção pela A. phagocytophilum em
equídeos, no norte na Tunísia, por meio da RIFI e teste molecular (nested-PCR)
relataram prevalências de 10% (6/60) e 13% (8/60) respectivamente. No Chile,
Jorqueira & Ortiz (2012), estudando a população de animais de um centro esportivo,
encontraram através de técnica sorológica (RIFI) prevalência de 8% (4/50) dentre os
animais estudados.
14
Segundo Salvagni et al. (2010), no Brasil o relato do agente causador de AGE,
assim como de seus vetores naturais, são escassos. No Rio de Janeiro, por meio de
técnica sorológica (RIFI) foram encontrados cavalos portadores de anticorpos anti-A.
phagocytophilum (Santos et al., 2009a).
Salvagni et al. (2010) compararam o método ELISA com a detecção do 16S
rDNA de A. phagocytophilum por técnicas moleculares (PCR e PCR-nested) em 20
animais do Centro-Oeste brasileiro. Como resultado desta análise os autores observaram
que 65% (13/20) dos animais amostrados apresentaram sorologia positiva, enquanto o
DNA do bioagente não foi detectado em nenhuma amostra.
Parra (2009), em estudo semelhante, comparou três diferentes técnicas de
diagnóstico: microscopia óptica, ELISA indireto e nested-PCR. A análise de 250
amostras de equinos de diversas áreas do estado de São Paulo permitiu evidenciar que
3% (7/250) foram positivas pela técnica sorológica, enquanto nenhuma amostra
mostrou-se positiva, seja pela pesquisa da bactéria em esfregaço sanguíneo ou pela
técnica molecular.
1.3 THEILERIOSE EQUINA
A piroplasmose equina é uma doença infecciosa intraeritrocitária de equídeos,
que tem como vetores biológicos espécies de carrapatos e como agente etiológico
hemoprotozoários do gênero Babesia e Theileria (Fonseca, 2012).
Essa doença tem destaque no meio equestre, por ser uma das principias
doenças parasitarias que acometem equídeos, gerando grandes perdas econômicas como
mortalidade, morbidade, despesas com tratamentos e queda no rendimento atlético dos
animais, além da restrição da comercialização e proibição do trânsito de cavalos
soropositivos em alguns países como os Estados Unidos, Canadá, Austrália, Japão e
alguns países da Europa e da América Latina (Fonseca, 2012).
De Waal & Van Heerden (2004) relatam que o primeiro caso de piroplasmose
equina registrado foi descrito por em 1883 na África do Sul, sendo denominada "Febre
do Antraz”. Uma condição similar foi descrita e denominada “Febre Biliar” em 1890 e
como “Malária Equina” em 1956 na África Ocidental.
Nantes & Zappa (2008) relataram que a primeira descrição de um dos parasitos
causadores da piroplasmose equina foi feita em 1899 e que mais tarde Charles Louis
Alphonse Laveran, em meados de 1901, examinando esfregaços sanguíneos de cavalos
15
encontrou um microrganismo intraeritrocitário que denominou de Piroplasma equi. de
Waal & Van Heerden (2004), referem que duas espécies morfologicamente distintas,
infectando cavalos no Zimbábue, foram identificadas por Koch em 1904, o qual
demonstrou que ambos os parasitos infectavam cavalos e propôs a denominação de
Piroplasma caballi para o parasito de maior tamanho e a manutenção da nomenclatura
Piroplasma equi para o parasito de menor tamanho.
O nome “piroplasma” originou-se pelo fato de que os parasitos, depois da
multiplicação, têm frequentemente forma de pêra. A nomenclatura piroplasmose ainda
sobrevive neste meio, também porque ambas, babesiose e theileriose, são comumente
agrupadas juntas seguindo a designação “piroplasmoses” (Uilenberg, 2006).
Posteriormente, em revisão sobre sistemática e nomenclatura, foi proposta a
reclassificação das duas espécies de piroplasmas equinos dentro do gênero Babesia,
ficando o antigo gênero como sinonímia (Peirce, 1975), tornando-os Babesia equi
(Laveran, 1901) e Babesia caballi (Nuttall & Strickland, 1912).
Mehlhor & Schein (1998) reclassificaram o protozoário B. equi em Theileria
equi por este apresentar tamanho menor comparado com outras espécies do gênero
Babesia, ter um estágio do ciclo de vida em linfócitos dos hospedeiros mamíferos,
desenvolvimento nas glândulas salivares dos seus vetores assim como no gênero
Theileria e, como base em dados moleculares, ser filogeneticamente próximo de
organismos do gênero Theileria. Reforçando esta relação, Kappmeyer et al. (1993)
encontraram uma proteína de superfície em B. equi homóloga as das espécies de
Theileria.
Schnittger et al. (2012), realizou uma inferência Bayesiana utilizando
aproximadamente 600 sequências do gene ribossomal – rRNA 18S, e a árvore
filogenética resultante (Figura 3) demonstrou a parafilia do gênero Babesia, bem como
que o táxon atualmente conhecido como Theileria equi não pode ser considerado uma
espécie pertencente ao grupo Theileria stricto sensu (Figura 3, clado V) nem ao grupo
Babesia stricto sensu (Figura 3, clado VI).
16
Figura 3 - Árvore consenso a partir de 170.000 amostras de árvores pela análise
bayesiana de 603 sequências do gene 18S rRNA de Piroplasmida, com
Cardiosporidium como grupo externo. A escala indica o número inferido de
substituições. Cada legenda da sequência mostra a anotação da sequência, em alguns
casos também com o número de acesso. Múltiplas sequências das mesmas espécies (ou
proximamente relacionadas) foram colapsadas se elas formam um clado, com os
números nos colchetes indicando o número de sequências envolvidas. Probabilidades
posteriores estão indicadas nos ramos principais. Fonte: Schnittger et al. (2012)
17
A análise de 150 genes diferentes, com base nas sequências deduzidas de
aminoácidos, de oito organismos Apicomplexa que tiveram seus genomas totalmente
sequenciados, gerou uma árvore filogenética não enraizada (Figura 4), sugerindo que a
solução mais apropriada para o organismo T. equi seria sua alocação em um gênero
distinto de Theileria e Babesia (Kappmeyer et al., 2012)
Figura 4 - Árvore filogenética de apicomplexas sequenciados. Árvore de distribuição
de probabilidade posterior representando o melhor escore de likelihood (probabilidade
de 1.0) seguindo análise bayesiana de 150 polipetídeos concatenados em oito táxons. O
código dos táxons são Pf (Plasmodium falciparum), Pv (Plasmodium vivax), Tg
(Toxoplasma gondii), Cp (Cryptosporidium parvum), Bb (Babesia bovis), Te (Theileria
equi), Tp (Theileria parva), Ta (Theileria annulata). Fonte: Kappmeyer et al. (2012).
18
Taxonomicamente o protozoário Theileria equi está, atualmente, classificado
no filo Aplicompexa, classe Sporozoea, subclasse Piroplasmea, ordem Piroplasmida,
família Theileriidae, gênero Theileria (Mehlhorn & Schein, 1998). Dados adicionais são
necessários para determinar a colocação final do parasito e, portanto, este estudo irá
utilizar a denominação mais recente, T. equi.
1.3.1 Microbiologia
Theileria equi é um hemoprotozoário intraeritrocitário de equídeos, que junto
com a Babesia caballi, compreendem os parasitos que infectam hemácias de equídeos
(de Wall, 1992). Esse piroplasma é caracterizado por formas intraeritrocitárias que
podem ser em forma de pêra, arredondada ou amebóide (Homer et al., 2000).
Os esporozoítos de Theileria inicialmente penetram em linfócitos nos quais
formam esquizontes. Os merozoítos liberados dos esquizontes entram nas hemácias
onde crescem em formas não pigmentadas de piroplasmas e multiplicam-se gerando
quatro células, formando tétrades muitas vezes em forma de “cruz de malta” (Figura 5)
(Feldman, 2000; Uilenberg, 2006).
Em esfregaço sanguíneo observa-se em eritrócitos o protozoário T. equi como
pequenas inclusões arredondadas com aproximadamente 1 a 2 μm de diâmetro
(Feldman, 2000). As espécies desse gênero não produzem esporos, não possuem
flagelos, cílios ou formam pseudópodes, sua locomoção ocorre por flexão ou
deslizamento. São caracterizados pela presença de complexo apical menos desenvolvido
e sua reprodução assexuada ocorre por fissão binária ou esquizogônia em eritrócitos de
mamíferos (Homer et al., 2000; Chauvin et al., 2009).
19
Figura 5 - Merozoítos de T. equi formando tétrades em “cruz de malta” (Seta) no
interior de um eritrócito de equino. Fonte:
https://googledrive.com/host/0B1IL5zI60TcWN2FoRUs3Tm5xVTg/babesia%20equi%
202.jpg.
1.3.2 Vetores
Os vetores dos parasitos causadores da babesiose são carrapatos que pertencem
à subordem Ixodides e à família Ixodidae (Nizoli, 2005), pertencentes a diversos
gêneros, dos quais se destacam: Dermacentor, Hyalomma e Rhipicephalus, que são
endêmicos de áreas tropicais e subtropicais do mundo (Ali et al., 1996).
Por um longo período o vetor da T. equi nas Américas era desconhecido, uma
vez que carrapatos das espécies Anocentor nintens e Amblyomma cajennense, que
infectam naturalmente equinos, pareciam não ter a capacidade de desempenhar papel
vetoral (Pfeiffer Barbosa, 1993). Em pastagens onde equinos são mantidos em conjunto
com bovinos o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus tem potencial para
parasitar equinos (Falce, 1983), segundo pesquisas de Piotto (2009) infestações por
carrapatos das espécies Anocentor nitens, Rhipicephalus (Boophilus) microplus e
Amblyomma cajennense em equinos da América do Sul já foram associados a casos de
theileriose.
No Brasil, suspeita-se que o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
pode ser vetor da T. equi (Nizoli et al., 2008). Segundo Ueti et al. (2005) esse carrapato
possui a capacidade de se infectar, mesmo em cavalos em estágios crônicos da doença,
onde a parasitemia é relativamente baixa, obtendo sucesso na transmissão da doenças
para animais saudáveis.
20
1.3.3 Ciclo Biológico
De acordo com o ciclo biológico (Figura 6), o carrapato infecta-se ao ingerir
células sanguíneas contaminadas com o parasito, sendo a forma contaminante os
gametócitos, iniciando o processo de gametogênese no vetor (Uilenberg, 2006; Bhoora,
2009). Os gametócitos diferenciam-se em gametas femininos e masculinos no intestino
do vetor e se fundem tornando-se zigotos móveis (Melhorn & Schein, 1998; Uilemberg,
2006; Bhoora, 2009).
Os zigotos são imaturos e não se multiplicam, evoluem no intestino do
hospedeiro invertebrado, para posteriormente invadirem a hemolinfa, dirigindo-se para
as glândulas salivares. Quando o vetor se infecta, o próximo estágio torna-se infeccioso,
no entanto larvas recém-eclodidas não possuem capacidade infecciosa (Uilenberg,
2006). Quando o próximo estágio do vetor se fixa em um hospedeiro, ocorre a
esporogônia e maturação dos esporozoítos nas glândulas salivares, e a transmissão
ocorre através da inoculação de saliva infectada (Baptista, 2010).
O esporozoíto constitui o último estágio do desenvolvimento dos parasitos de
Theileria sp. dentro das células das glândulas salivares do carrapato, e é transmitido ao
hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. Quando um carrapato adulto
infectado se fixa ao hospedeiro, são necessários três a quatro dias de alimentação para
que se complete a maturação dos parasitos dentro das glândulas salivares do carrapato e
os esporozoítos maduros sejam libertados (Rolão, 2004).
Após ser inoculado por um carrapato infectado, o parasito T. equi pode ser
encontrado em linfócitos e eritrócitos dos hospedeiros vertebrados (Melhorn & Schein,
1998). Inicialmente T. equi penetra e multiplica-se nos linfócitos, onde formam os
denominados esquizontes, na forma de macroesquizontes, que posteriormente se
diferenciam em microesquizontes, esta segunda forma possui um grande número de
merozoítos. O desenvolvimento dos merozoítos de T. equi está completo
aproximadamente ao nono dia após a sua inoculação in vitro, ou no décimo terceiro dias
após a fixação dos carrapatos ao hospedeiro. Os merozoítos maduros ocupam uma
grande parte dos linfócitos o que acarreta na lise celular liberando as estruturas
parasitárias (Ali et al., 1996). Estes merozoítos têm um tamanho que varia entre 1,5 a 2
μm e vão invadir os eritrócitos do hospedeiro, iniciando a sua reprodução por fissão
binária (Melhorn & Schein, 1998; De Waal & Van Heerden, 2004).
21
Após penetrarem nas hemácias se diferenciam em trofozoítos, que se
multiplicam por merogônia, dando origem a quatro merozoítos, que formam a “Cruz de
Malta” (Simpson et al., 1967; De Waal, 1992).
Figura 6 - Diagrama representativo do ciclo de vida de T. equi. 1: esporozoíto
inoculado junto com a saliva; 2: macroesquizonte; 3: microesquizonte; 4: merozoíto; 5:
eritrócito mostrando a formação típica da “Cruz de Malta”; 6: gametócitos; 7: fusão dos
gametas; 8: zigoto; 9-12:desenvolvimento do oocinete; 13: oocinetes em crescimento
originando esporontes multinucleados; 14: divisão dos esporontes multinucleados em
pequenos esporoblastos, que posteriormente originam esporozoítos. G: gametócito; IV:
vacúolo interno; M: merozoíto; N: núcleo; NH: núcleo da célula hospedeira; S:
esporozoíto; SB: esporoblasto; SP: esporonte ST: esquizonte (Fonte: adaptado de
Melhorn & Schein, 1998; Baptista, 2010).
22
As éguas portadoras podem transmitir T. equi para suas crias e isso pode resultar
em abortos ou na ocorrência de theileriose neonatal, mas pesquisas sugeriram que o
potro pode nascer como portador assintomático (Allsopp et al., 2007), que podem não
desenvolver a doença enquanto este estiverem protegido pelos anticorpos maternos
(Robinson, 1992). Outra forma de transmissão da theileriose é a iatrogênica onde pode
ocorrer a inoculação de sangue contaminado pelos pararasitos por meio de fômites
contaminados (Roncati, 2006).
1.3.4 Patogenia e Sinais Clínicos
A theileriose equina é uma doença de apresentação aguda, subaguda ou crônica
(De Waal, 1992; Nizoli, 2005). E vários são os fatores que influenciam no grau de
severidade dos sinais clínicos como idade, imunocompetência, estado nutricional e co-
infecção com outros patógenos (Homer et al, 2000; Dias, 2008). Além da
patogenicidade da cepa e dose do inóculo (Guimarães et al., 1997).
Hailat et al. (1997) e Nogueira et al. (2005) relatam que a imunossupressão
induzida por meio de restrição alimentar, aplicação de corticóides ou esforço físico
intenso predispõe as manifestações clínicas da theileriose.
Apesar do pouco conhecimento em relação à patogênese das infecções
causadas por T. equi, acredita-se que este parasito possua uma patogênese similar a de
outras espécies do gênero Theileria (De Waal & Van Heerden, 2004). Contudo, T. equi
é considerado mais patogênico que B. caballi, causando maior número de casos de
hemoglobinúria e mortes (Camacho et al., 2005), e o seu período de incubação varia de
12 a 19 dias (De Waal et al., 1990; De Waal, 1992).
As infecções por T. equi produzem um quadro de anemia hemolítica
progressiva em equinos (Hailat et al., 1997; Souza et al., 2007), sendo a patogenia da
enfermidade relacionada com a lise de eritrócitos, que ocorre durante a invasão e
multiplicação do parasito nesta célula (Souza et al., 2007), resultando em redução da
capacidade de transporte de oxigênio, causando diminuição do desempenho de equinos
de esporte (Hailat et al., 1997).
A doença aguda é caracterizada por febre, podendo ser de caráter intermitente,
anemia, letargia, icterícia, hepato e esplenomegalia, hemólise intra e extravascular,
hemoglobinúria e hemorragias petequiais em mucosas, podendo em alguns casos, levar
a morte (Schein, 1988; De Wall, 1992; Knowles, 1996). Casos de mortalidade
23
relacionados por infecções de T. equi são relativamente baixos, em geral os animais
resistem à fase aguda da doença, tornado-se portadores do parasito (Schein, 1988).
Sinais clínicos inespecíficos como inapetência, perda de peso e alterações
reprodutivas são comuns durante a fase crônica da infecção (Schein, 1988). Nessa fase a
parasitemia é baixa e a principal manifestação é anemia que, mesmo sendo moderada
leva à diminuição do desempenho físico dos animais (Nogueira et al., 2005),
principalmente quando se trata de animais de competição (Cunha et al., 1996; Pereira et
al., 2004)
A fase crônica da doença ocorre devido à adaptação do parasito as defesas
naturais do hospedeiro. A reagudização de quadros crônicos com agravamento dos
sinais clínicos é comum em situações de stress, treinamento intensivo, doenças
intercorrentes e imunossupressão, sejam por restrição alimentar ou uso de
corticosteróides (Souza et al., 2007; Nogueira et al., 2005).
Segundo Zooba et al., (2008) e Cunha et al. (2005), as alterações laboratoriais
mais frequentes são diminuição na contagem de hemácias, plaquetas e concentração de
hemoglobina, além de neutropenia, linfopenia, diminuição do fibrinogênio plasmático e
aumento da concentração de bilirrubina, ureia e aspartato amino transferase (AST).
Cunha et al. (1998) e Souza et al. (2007) referem que durante a fase aguda da
infecção ocorre uma rápida diminuição dos valores de hematócrito, porém este
parâmetro não sofre alterações significativas durante a fase crônica, não havendo
diferença em relação aos valores do hematócrito em equinos não infectados e
portadores de T.equi.
1.3.5 Diagnóstico
Várias técnicas são utilizadas e veem sendo desenvolvidas para o diagnóstico
de theileriose equina. Estas incluem desde as mais básicas como detecção e
diferenciação de protozoários com base nos sinais clínicos, inoculação de sangue em
animais susceptíveis, até técnicas mais modernas como diagnósticos sorológicos e
moleculares (Baptista, 2010).
O diagnóstico preciso para a detecção específica do parasito causador da
piroplasmose equina é de grande valor, pois o protozoário T. equi induz infecções de
maior severidade e é mais resistente ao tratamento do que o protozoário B. caballi
(Moretti et al., 2010).
24
Devido à possibilidade de infecções mistas de T. equi e B. caballi e de os sinais
clínicos das doenças serem inespecíficos e facilmente confundidos com outras
enfermidades, torna-se quase impossível diferenciar esses parasitos apenas com base
nos sinais clínicos (De Waal, 1992; Salim et al., 2008; Bhoora, 2009; Moretti et al.,
2010).
Desde meados de 1967, o diagnóstico da piroplasmose equina é baseado na
identificação do parasito nas hemácias de equídeos suspeitos (Henriques, 2006) através
da microscopia óptica de esfregaço sanguíneo (Roncati, 2006). A identificação do
agente por meio dessa técnica constitui um diagnóstico definitivo, embora tal método
apresente restrições principalmente durante a fase crônica da doença, decorrente de um
menor número de hemácias infectadas (Alhassan et al., 2007a), o que pode incorrer em
um grande número de falso-negativos (De Wall et al., 1988; Cunha et al., 1998).
Segundo Böse et al.(1995) o esfregação sanguíneo é um excelente método de
diagnóstico para a detecção da piroplasmose equina in loco, tendo como vantagem ser
relativamente barato e prático, além de proporcionar detalhes morfológicos dos
parasitos e permitir a identificação das espécies, sendo uma boa escolha nos casos de
infecção aguda. Estudos demonstram que o esfregaço sanguíneo pode detectar cerca de
32% dos animais infectados (Roncati, 2006).
Outro método de diagnóstico é a técnica da cultura in vitro. Esta metodologia
exige pessoal qualificado e um nível tecnológico elevado, podendo apenas ser utilizadas
em amostras de sangue fresco, tendo um período longo para obtenção de resultados e o
número de amostras analisadas é baixo, limitando a sua aplicação como teste de
diagnóstico (Baptista, 2010).
A técnica de cultura in vitro tem maior sensibilidade para T. equi, devido a esse
parasito se propagar mais rapidamente que os parasitos de B. caballi (Alhassan et al.,
2007b). Esta técnica é um método bastante específico para a detecção direta dos
protozoários T. equi, especialmente em infecções subclínicas e crônicas (Alhassan et al.,
2007b).
Os métodos indiretos consistem na mensuração da produção de anticorpos
resultantes da resposta imunológica contra o parasito. Entre os principais estão a Reação
de Imunofluorescência Indireta, o Teste de Fixação do Complemento (TFC) e o ELISA
competitivo (c-ELISA) (Piotto, 2009).
25
O TFC foi considerado um método de referência para detecção de anticorpos
contra os agentes causadores da piroplasmose equina (Brüning, 1996), no entanto, a
sensibilidade do teste é baixa nos animais portadores de infecções crônicas ou na fase
inicial da doença (Böse et al., 1995; Pereira et al., 2004). O TFC possui um grande
número de resultados falso-negativos quando a quantidade de anticorpos é muito baixa
ou quando anticorpos anticomplemento estão presentes no soro (Nizoli, 2005).
A RIFI é um teste para detecção de anticorpos específicos, possui boa
especificidade e sensibilidade (Böse & Peymann, 1994), é relativamente barato e os
reagentes utilizados são facilmente encontrados (Böse et al., 1995). Este método
permite o diagnóstico diferencial entre B. caballi e T. equi e é mais sensível do que o
teste de fixação de complemento em relação ao animal com infecções crônicas ou pós-
tratamento. As desvantagens desta técnica são diferenciar uma reação negativa de uma
reação fracamente positiva, a leitura dos resultados demanda um grande tempo, além de
que os resultados obtidos sofrem influência pelo julgamento subjetivo do operador que
faz a padronização (Böse et al., 1995).
De maneira geral o TFC e a RIFI possuem algumas desvantagens, assim, com
intuito de aperfeiçoar o diagnóstico da theileriose foi desenvolvido o c-ELISA. Esta
técnica possui maior sensibilidade e especificidade ao diagnóstico dessa doença quando
comparada às outras técnicas sorológicas (Rhalem et al., 2001). No ano de 2004, a
Organização Mundial de Saúde definiu a utilização da técnica de c-ELISA como teste
oficial para exportação de animais para países livres da doença (USA, 2006).
A utilização de técnicas moleculares a exemplo da PCR é considerada mais
trabalhosa e requer equipamentos específicos, entretanto possui boa especificidade e
sensibilidade que pode variar de 78% (Farah et al., 2003) a 95,7% (Battsetseg et al.,
2002). Segundo Roncati (2006) a PCR detecta um maior número de animais infectados
quando comparados com o esfregaço sanguíneo. A PCR como método de diagnóstico
utilizando duas etapas de amplificação (PCR e nested-PCR), com base na amplificação
do gene Equine Merozoit Antigen-1 (EMA-1) do bioagente T. equi, detecta parasitemias
iguais a 0,000006% demonstrando uma alta sensibilidade, por esses motivos esta
técnica vem sendo muito empregada na identificação de infecções causadas por T. equi
(Nizole, 2005).
O diagnóstico diferencial de theileriose equina inclui outras causas de anemia
hemolítica como púrpura hemorrágica e arterite viral equina (Henry, 1993; Zeimer &
26
Bloom, 1999), além de anemia infecciosa equina, doenças imunomediada e intoxicações
por oxidantes (Morris, 2000).
1.3.6 Epidemiologia
Ambos os protozoários causadores da piroplasmose equina estão difundidos
amplamente em áreas tropicais e subtropicais do mundo (Avarzed et al., 1997; Kerber et
al., 1999), sendo T. equi mais prevalente (Friedhoff et al., 1990). A prevalência da
doença é um reflexo da distribuição dos vetores biológicos (Pfeifer Barbosa et al., 1995;
Avarzed et al., 1997).
Alguns países são considerados livres da existência dos parasitos entre eles
Canadá, Austrália, Japão, Alemanha, Irlanda, Holanda, Nova Zelândia e Reino Unido
(Nantes & Zappa, 2008; Ogunremi et al., 2008). Segundo Bashiruddin et al., (1999)
apesar da piroplasmose equina ter sido introduzida na Austrália ela não se estabeleceu
devido a inexistência do carrapato vetor. De acordo com Nantes & Zappa, (2008)
relatos da piroplasmose no norte da Europa são inexistentes apesar da existência de
vetores.
A piroplasmose equina causada por T. equi vem sendo relatada em vários
países do mundo como: Mongólia (Battsetseg et al., 2001), Espanha (Camacho, 2005),
Itália (Moretti et al., 2010), Índia (Chhabra et al., 2012), Turquia (Acicci et al., 2008) e
Argentina (Aguirre et al., 2004).
No Brasil, a theileriose tem caráter endêmico e com poucos casos de doença
clínica, entretanto animais de áreas não endêmicas quando são levados a áreas que
possuem o parasito podem desenvolver a doença clínica culminando com o óbito do
animal (Baldani et al., 2006).
Segundo Botteon (1996) em estudo de prevalência de T. equi utilizando RIFI
como método de diagnóstico, em equinos mantidos em diferentes sistemas de criação,
animais criados extensivamente tem maior prevalência (89,6%) em relação aos equinos
criados em estabulação permanente (45%).
Cunha et al. (1996), em estudos epidemiológicos realizados no Rio Grande do
Sul utilizando RIFI para detecção de anticorpos anti-T. equi detectaram prevalência de
57,9%. Em Goiás, Linhares (1994) utilizando o mesmo método de diagnóstico
encontrou prevalência de 94,7% para T. equi na região, caracterizando a área como de
estabilidade enzoótica para a enfermidade.
27
Bittencourt et al. (1997) em estudo de prevalência para theileriose equina, na
região de Seropédica e áreas vizinhas, no Estado do Rio de Janeiro analisando 78
amostras sanguíneas utilizando TFC, demonstraram prevalência de 84,6% para T. equi.
Parra (2009), em estudo comparativo de três métodos de diagnóstico em 250
amostras sanguíneas de equídeos do estado de São Paulo, obteve resultado de 38,4%,
46% e 36% de positividade, respectivamente, nos testes de pesquisa direta em
microscópio óptico, c-ELISA e nested-PCR para Theileria equi.
Em estudo sobre determinação da prevalência da theileriose equina, por meio
de Imunofluorescência Indireta (IFA), em algumas regiões do estado do Pará, Pfeizer
Barbosa et al. (2000) encontraram positividade de 30,83% na Ilha de Marajó, 85,48%
na microrregião Bragantina e 69,79% no município de Paragominas.
1.4 JUSTIFICATIVA
Devido ao estado do Pará possuir um grande rebanho de equinos aliado a
grande importância desses animais no âmbito econômico e a proximidade deste com o
homem se faz necessário o conhecimento das principais enfermidades que podem
acometer esses animais, principalmente devido ao seu potencial zoonótico.
Na região Norte e Nordeste pesquisas epidemiológicas sobre os principias
parasitos do sangue de equídeos são escassas, principalmente quando se utiliza métodos
moleculares para realização do diagnóstico. Neste sentido a presente pesquisa apresenta
caráter original, por ser a primeira a investigar a ocorrência da anaplasmose
granulocítica equina e theileriose equina no estado do Pará.
28
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a ocorrência e diversidade genética de Anaplasma phagocytophilum
e Theileria equi em rebanhos de equídeos do estado do Pará.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Padronizar protocolo de método molecular para a detecção do DNA de Anaplasma
phagocytophilum e Theileria equi no sangue de equídeos infectados;
- Investigar a ocorrência de infecção por Anaplasma phagocytophilum e Theileria equi
em equídeos em diversas regiões do estado do Pará;
- Caracterizar as relações filogenéticas da linhagem na área de estudo em comparação
com táxons de outras regiões do globo terrestre.
29
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 AMOSTRAGEM
Um total de 155 amostras sanguíneas, sendo 87 machos e 68 fêmeas,
demonstradas na Tabela 1, foram obtidas de equídeos, independentes de raça, sexo,
idade, manejo ou estado clínico do animal. Estes animais eram oriundos de Belém,
quando atendidos no Projeto Carroceiro da Universidade Federal da Amazônia –
UFRA, dos municípios de Barcarena, Castanhal, Goianesia e do arquipélago da Ilha do
Marajó.
Tabela 1 - Amostragem obtida para o presente estudo.
Localidade Macho Fêmea Total
Belém 48 3 51
Barcarena 12 34 46
Castanhal 17 23 40
Goianésia 9 2 11
Ilha do Marajó 1 6 7
Total 87 68 155
Para obtenção do material biológico os animais foram contidos, tentando
proporcionar o mínimo de estresse possível. Em seguida foi realizada assepsia e por
venipunção jugular, seguindo protocolos preconizados por Matos e Matos (1988) e
Smith (2006), realizada a coleta de 3 mL de sangue com auxílio de tubo à vácuo,
devidamente identificados, contendo anticoagulante EDTA (Ácido Etilenodiamino
Tetra-Acético).
Após a colheita, o material foi devidamente alocado em caixa térmica contendo
gelo químico para conservação e transportado para o Laboratório de Tecnologia
Biomolecular da Universidade Federal do Pará (LTB/UFPA), Campus Belém. Todas as
amostras foram armazenadas a 4ºC até o seu processamento.
O DNA genômico de cada amostra foi extraído através do método fenol-
clorofórmio seguindo procedimentos padrões descritos por Sambrook et al. (1989) e
armazenado a uma temperatura de -20ºC até a realização dos procedimentos
moleculares para detecção dos hemoparasitos.
30
3.2 ANÁLISES MOLECULARES
3.2.1 Detecção de Anaplasma phagocytophilum
A presença de A. phagocytophilum foi avaliada com uso de protocolo de
nested-PCR, o qual foi baseado na amplificação de fragmento do gene ribossomal 16S,
cujos iniciadores são específicos para o parasito seguindo protocolo previamente
validado por Parra (2009). Assim, foi realizada uma primeira reação de volume total de
25 µL contendo 10-20 ng de DNA molde, 2,0 mM de MgCl2, 2,5 mM de cada dNTP, 10
mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador Aph E/Aph EF (Parra, 2009)
e 1 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®). A segunda reação, também realizada em
um volume de 25 µL, continha 1 µL do produto da primeira reação, 2,0 mM de MgCl2,
2,5 mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador
Aph IR/Aph IF (Parra, 2009). O perfil de amplificação da PCR e da nPCR para o
agente A. phagocytophilum estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2 - Protocolo de reação de amplificação para Anaplasma phagocytophilum.
Processos Número de ciclos Temperatura (°C) Tempo
Desnaturação térmica 1 94 5’
Anelamento 40
94 30”
55 30’
72 1’
Extensão final 1 72 5’
O DNA de uma amostra sabidamente infectada com A. phagocytophilum
(gentilmente cedida pela Dra. Rosangela Zacarias Machado/Unesp-Jaboticabal) foi
utilizada como controle positivo de reação e como controle negativo utilizou-se água
bidestilada estéril. A positividade desta amostra foi confirmada com base no
sequenciamento nucleotídico do fragmento amplificado na segunda reação e sua
comparação com a sequência AY969013 obtida do GenBank. Água bidestilada estéril
foi utilizada como controle negativo.
Todos os produtos de PCR foram visualizados após eletroforese em gel de
agarose 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA), coloração com o GelRed™
Nucleic Acid Stain (Biotium®) e visualizados em fotodocumentador E-BOX VX2
(Vilber Lourmat®). Um marcador de peso molecular de 100 pb (DNA ladder
Invitrogen®
) foi utilizado para estimar o tamanho de cada fragmento amplificado.
31
3.2.1 Detecção de Theileria equi
A presença de T. equi foi avaliada com uso de protocolo de nested-PCR, o qual
foi baseado na amplificação de fragmentos do gene EMA-1, cujos iniciadores são
específicos para o parasito segundo protocolo estabelecido por Baldani et al. (2010).
Assim, foi realizada uma primeira reação de volume total de 25 µL contendo
10-20 ng de DNA molde, 2,0 mM de MgCl2, 2,0 mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-
HCl, 50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador Eeq ER/ Eeq EF (Baldani et al. 2010) e 1
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®
). A segunda reação, também realizada em um
volume de 25 µL, continha 1 µL do produto da primeira reação, 1,5 mM de MgCl2, 2,5
mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 5 µM de cada iniciador Eeq
IR/ Eeq IF (Nicolaiewsky et al., 2001). O perfil de amplificação da PCR e da nPCR
para o agente T. equi estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3 - Protocolo de reação de amplificação para Theileria equi.
Reação Processos Número de
ciclos
Temperatura
(°C) Tempo
1ª
Reação
Desnaturação térmica 1 94 4’
Anelamento 40
94
60 30’
72
Extensão final 1 72 4’
2ª
Reação
Desnaturação térmica 1 94 5’
Anelamento 35
94
60 30’
72
Extensão final 1 72 5’
O DNA de uma amostra sabidamente infectada com T. equi (gentilmente
cedida pela Dra. Rosangela Zacarias Machado/Unesp, Jaboticabal) foi utilizada como
controle positivo de reação e como controle negativo utilizou-se água bidestilada estéril.
A positividade desta amostra foi confirmada com base no sequenciamento nucleotídico
do fragmento amplificado na segunda reação e sua comparação com a sequência
KC347577 obtida do GenBank. Água bidestilada estéril foi utilizada como controle
negativo.
32
Todos os produtos de PCR foram visualizados após eletroforese em gel de
agarose 1,5% em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA), coloração com o GelRed™
Nucleic Acid Stain (Biotium®) e visualizados em fotodocumentador E-BOX VX2
(Vilber Lourmat®). Um marcador de peso molecular de 100 pb (DNA ladder
Invitrogen®
) foi utilizado para estimar o tamanho de cada fragmento amplificado.
3.3 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
As amostras positivas para A. phagocytophilum e T. equi foram selecionadas
para o sequenciamento como descrito a seguir: após a excisão da banda com tamanho
correspondente, do gel de agarose, o produto amplificado na segunda reação foram
purificado com auxílio do GFX PCR DNA and gel purification kit (GE Healthcare®),
ligado ao plasmídeo pGEM-T vector (Promega), que foi por sua vez inserido, através de
choque térmico em Escherichia coli JM109 (Promega®). O fragmento clonado foi
obtido de clones recombinantes por PCR de colônias usando
os iniciadores M13F/M13R e sequenciado automaticamente em no ABI 3500XL
Genetic Analyzer (Applied Biosystems®), de acordo com as especificações do
fabricante. O programa BioEdit (Hall, 1999) foi usado para o alinhamento e edição
manual das sequências obtidas.
3.4 ANÁLISE DOS DADOS
Para o delineamento estatístico os dados referentes aos achados de A.
phagocytophilum e T. equi foram dispostos em tabelas de distribuição de frequência
relativa e absoluta e comparados com os dados descritos na literatura.
As sequências de A. phagocytophilum e T. equi obtidas foram comparadas com
sequências disponíveis no GenBank através da ferramenta Basic Local Alignment
Search Tool – BLAST (Altschul et al., 1990), disponível no sítio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. As analises filogenéticas foram realizadas com base
no método Neighbor-Joining, modelo Kimura-2-Parâmetros, através do programa
MEGA 6.0 (Tamura, 2013).
33
4 RESULTADOS
No presente estudo, a ocorrência de infecções de anaplasmose e theileriose foi
investigada pelo exame de nested PCR em equídeos de diferentes localidades do Estado
do Pará.
As reações de Anaplasma phagocytophilum geraram produtos de 546 pares de
bases (Figura 7) e as reações de Theileria equi geraram produtos de 102 pb (Figura 8)
ambas para as segunda reações (nested-PCR), corroborando Parra (2009) e Baldani et
al. (2010). As frequências de distribuição dos testes das 155 amostras analisadas para os
hemoparasitos estudados estão apresentadas na Tabela 4.
A distribuição dos casos positivos e negativos mostra que, em função do sexo,
os machos foram mais acometidos para as duas hemoparasitoses, conforme
demonstrado na Tabela 5.
Figura 7 - Segunda reação para detecção de Anaplasma phagocytophilum com
amplificação de 546 pb. AN = amostra negativa; AP = amostra positiva; CN = controle
negativo; CP = controle positivo; M = marcador molecular 100 pares de bases (pb); Seta
= 500 pb.
34
Figura 8 - Segunda reação para detecção de Theileria equi com amplificação de 102pb.
AN = amostra negativa; AP = amostra positiva; CN = controle negativo; CP = controle
positivo; M = marcador molecular 100 pares de bases (pb); Seta = 100 pb.
Tabela 4 - Frequência de distribuição dos resultados para Anaplasma phagocytophilum
e Theileria equi na população de estudo.
Resultado Parasito
Anaplasma phagocytophilum Theileria equi
Negativos 97,42% (151/155) 40% (62/155)
Positivos 2,58% (4/155) 60% (93/155)
Tabela 5 - Frequência de distribuição dos resultados Anaplasma phagocytophilum e
Theileria equi m função do sexo dos animais.
Resultado Anaplasma phagocytophilum Theileria equi
Macho Fêmea Macho Fêmea
Negativo 95,4% (83/87) 100% (68/68) 35,63% (31/87) 45,59% (31/68)
Positivo 4,6% (4/87) 0% (0/68) 64,36% (56/87) 54,41% (37/68)
35
Da comparação da sequência nucleotídica parcial (546 pb) de Belém do 16S
rDNA de A. phagocytophilum obtida neste estudo com aquelas do Genbank, foram
observados apenas seis sítios polimórficos (Tabela 6). Igual número de sítios
polimórficos, isto é, seis, foram observados na comparação dos 102 pb do gene EMA - 1
de Theileria equi da amostra oriunda da Ilha do Marajó com seis outras sequências
nucleotídicas de T. equi de outras regiões do globo terrestre (Tabela 7).
Tabela 6 - Polimorfismo do 16S rDNA de Anaplasma phagocytophilum de Belém, Pará
em comparação a seis cepas de A. phagocytophilum de outras localidades.
País Acesso
GenBank
Sítios de nucleotídeosa
36 67 97 125 181 344
Brasil (Belém) G A A C G C
Áustria JX173652 . . . . . .
Suécia AY527214 . . . . . .
Coréia do Sul AF470701 A . . . . .
Japão AY969013 . . G . . .
Rússia HQ629917 . . . . . .
Brasil EU287434 . G . T C T
a os números representam a posição nucleotídica da sequência do 16S rDNA da cepa de A.
phagocytophilum “Belém”; os pontos (.) indicam a mesma base nucleotídica nas mesmas
posições do 16S rDNA de outras cepas de A. phagocytophilum.
Tabela 7 - Polimorfismo do gene EMA - 1 de Theileria equi da Ilha do Marajó, Pará em
comparação com seis cepas de T. equi de outras localidades.
País Nº GenBank Sítios de nucleotídeosa
3 11 23 25 27 76
Ilha do Marajó G T T C G C
Brasil AF261824 . . . . . .
E.U.A XM004829445 . . . . . .
Japão AB015220 . . . . . .
África do Sul JQ782603 . . . . . .
Índia KC347577 . . . . . .
África do Sul JQ782604 A C C A A T
a os números representam a posição nucleotídica da sequência do gene EMA - 1 da cepa de
Theileria equi “Ilha do Marajó”; os pontos (.) indicam a mesma base nucleotídica nas
mesmas posições do gene EMA - 1 de outras cepas de T. equi.
36
A conservação das sequências nucleotídicas obtidas tanto para A.
phagocytophilum quanto para T. equi confirmou a estreita relação filogenética entre as
linhagens do estado do Pará e aquelas de outras localidades do mundo (Figuras 9 e 10).
Figura 9 - Árvore filogenética baseada nas análises de sequências parciais do gene 16S
rDNA de A. phagocytophilum, gerada a partir do método Neighbor-Joining, modelo
Kimura-2-Parâmetros. Rickettsia rickettsii. Os números nos nós indicam os valores de
bootstrap com 1000 pseudoréplicas.
37
Figura 10 - Árvore filogenética baseada nas análises de sequências parciais do gene EMA-1 de
T. equi, gerada a partir do método Neighbor-Joining, modelo Kimura-2-Parâmetros. O número
acima do nó indica o valor de bootstrap com 1000 pseudoréplicas.
38
5 DISCUSSÃO
5.1 PREVALÊNCIA DE ANAPLASMA PAGHOCITOPHYLUM
A AGE já foi observada em diversas partes do mundo (Bermann et al., 2002;
Uehlinger et al., 2011; Burgess et al., 2012; Siska et al., 2012; Calderón & Delgado,
2013). Estudos epidemiológicos sobre a anaplasmose em equinos encontraram
positividade entre 0% a 65% variando de acordo com a metodologia empregada sendo
principalmente avaliada através de métodos sorológicos, moleculares e/ou microscopia
direta (Parra, 2009; Salvagni et al., 2010).
No presente estudo foram diagnosticados 2,58% (4/155) dos animais, positivos
para A. paghocitophylum, esses resultados se aproximam dos dados obtidos por
Jorquera & Ortiz (2012) que encontraram uma prevalência de 8% (4/50) por meio do
método de diagnóstico sorológico (RIFI) para anaplasmose equina e diferem dos
encontrados por M’Ghirbi et al. (2012) que utilizando RIFI e PCR, obtiveram
prevalências superiores, 67% (40/60) e 13% (8/60) respectivamente, sendo este último
o único a referir positividade em equinos através de técnica molecular.
Isso sugere um baixo percentual de infecção por A. phagocytophilum no Brasil,
contudo, vale ressaltar que estudos moleculares sobre a ocorrência de bioagentes da
família Anaplasmataceae em equídeos brasileiros são limitados (Dagnone et al., 2003).
Neste sentido, Salvagni et al. (2010) identificaram 65% (13/20) dos animais com
sorologia positiva para A. phagocytophilum porém nenhum animal foi positivo quando
testados por meio da técnica molecular (PCR). Parra (2009), também só observou
animais positivos (7/250) quando testados por ELISA, sendo os mesmos animais
negativos ao exame microscópico e nested-PCR.
Excluindo-se os resultados dos testes sorológicos de Salvagni et al. (2010), que
podem ser resultantes de reações cruzadas, a baixa prevalência de infecção por A.
phagocytophilum em equinos no Brasil pode ser um reflexo da baixa ocorrência dos
principais artrópodes vetores, visto que, o parasitismo por carrapatos do gênero Ixodes
foi observado apenas em animais silvestres, sendo as espécies encontradas I. amarali
(Faccini et al., 1999), I. loricatus (Muller et al., 2005) e I. luciae (Luz et al., 2013), que
não foram ainda relacionadas com a transmissão da AGE. Contudo, a presença desta
bactéria em equinos como mostrado no presente estudo aponta para a necessidade de
mais estudos epidemiológicos uma vez que, devido a ausência de um vetor específico, o
39
bioagente A. phagocytophilum pode estar se adaptando a outros artrópodes, dentre os
quais destacam-se A. cajennense e R. sanguineus (Ferrão, 2006; Ghafar, 2012; Santos,
2013).
De fato, a presença de A. phagocytophilum em A. cajennense (Santos et al.,
2013) e em R. sanguineus (Santos et al., 2013), pode explicar a presença desta bactéria
em alguns eqüinos no Brasil. Essa infecção poderia ser resultante de um parasitismo
acidental ou até mesmo da adaptação deste último vetor a um novo hospedeiro
vertebrado, isto é, os equinos, de qualquer forma isto corrobora a baixa prevalência de
A. phagocytophilum em equinos no Brasil.
Tais resultados comprovam que o presente estudo, no conhecimento do autor, é
o primeiro a detectar, com base em testes moleculares, a positividade para A.
phagocytophilum em equinos no Brasil.
O baixo nível de polimorfismo do 16S rDNA entre diferentes cepas de A.
phagocytophilum, sugere que este é um bom marcador para a detecção molecular, mas
que um estudo de variabilidade genética mais refinado deve ter como base outro
marcador que apresente maior taxa de evolução. Isto seria útil para a investigação de se
esta conservação é generalizada do ponto de vista genômico ou se existem regiões
gênicas que seriam mais apropriadas aos estudos de epidemiologia molecular.
5.2 PREVALÊNCIA DE THEILERIA EQUI
A detecção sorológica de piroplasmas em equinos é bastante difundida pelo
mundo, tendo vários relatos com prevalências variando entre 6,66% (Piotto et al., 2009)
e 100% (Baldani et al., 2010). Dentre os testes sorológicos o c-ELISA é considerado
teste padrão ouro para o transito de equinos segundo OIE (USA, 2006). Contudo, apesar
de bem difundidos os testes sorológicos são passíveis de falhas, e existem vários fatores
a serem considerados que podem gerar resultados falso-positivos ou falso-negativos,
dentre os quais se destacam: a produção de imunoglobulinas pouco hábeis em fixar o
complemento, o uso de fármacos babesicidas, além de apresentar uma baixa
sensibilidade em animais portadores de infecções crônicas ou na fase inicial da doença
principalmente devido a baixa quantidade de anticorpos (McGuire et al., 1971; Bose et
al., 1995; Pereira et al., 2004; Nizoli, 2005).
As técnicas moleculares surgem como alternativa para o diagnóstico da
infecção por piroplasmas, por serem altamente sensíveis e específicas permitindo o
40
diagnóstico em infecções agudas e crônicas servindo ainda como método de
identificação de animais portadores (Foley & Pedersen, 2001; Jensen et al., 2001;
Santos, 2008).
Poucos estudos utilizando técnicas moleculares foram referidos no mundo para
a pesquisa de prevalência de T. equi. Baptista (2010) encontrou positividade variando
entre 11,7% (19/162) e 15,2% (12/79) em equinos de diversas regiões de Portugal
através de nested-PCR e Qablan et al. (2013) encontraram ocorrência de 18,8%
(54/288) através de multiplex-PCR para theileriose equina em animais na Jordânia . Os
dados das pesquisas supracitadas, mesmo que diferindo em espaço amostral, foram
inferiores quando comparados ao do presente estudo que mostra positividade de 60%
(93/155) também utilizando um método molecular. O resultado do presente estudo é o
que mais se aproxima do estudo de Friedhoff et al. (1990) que afirma que cerca de 90%
da população mundial de equinos está exposta ao protozoário T. equi.
No Brasil, existem poucos relatos de estudos envolvendo o uso de técnicas
moleculares para a pesquisa de piroplasmas em equinos e estes são encontrados nas
regiões nordeste, centro-oeste e sudeste, com prevalências variando entre 45% e 100%
(Salvagni et al., 2010; Leal et al., 2011; Peckle et al., 2013), mostrando que a presente
pesquisa encontra-se dentro dos limites já referenciados no Brasil.
As taxas referidas no presente estudo mostram o caráter endêmico da T. equi
no Brasil, uma vez que corroboram os estudos de Peckle et al. (2013), com base em
método molecular (real time - PCR), que relatam ocorrência de 81% (253/314) de
positividade em animais de duas regiões do estado do Rio de Janeiro (Seropédica e
Petrópolis). Em São Paulo, Parra (2009) e Baldani et al. (2010), utilizando os mesmos
iniciadores da presente pesquisa, referem prevalências de 35% (90/250) e 63,53%
(108/170) respectivamente, validando a metodologia do presente estudo e tornando-a
ainda mais fidedigna.
Na região norte do Brasil a prevalência de T. equi foi relatada apenas com base
em testes sorológicos. Em um destes relatos, Kerber et al. (1997) observaram que 90%
dos animais são soropositivos para theileriose. No entanto, tais resultados não
corroboram Pfeifer Barbosa et al. (2000) que encontraram prevalências semelhantes
apenas no município de Bragança (85,48%), contudo, prevalências mais baixas foram
descritas para outras regiões do Estado do Pará, isto é, 30,83% na Ilha do Marajó e
69,79% em Paragominas. Apesar de ter como base um diferente método diagnóstico, os
41
dados dos municípios de Bragança e Paragominas de Pfeifer Barbosa et al. (2000) são
os que mais se aproximam aos dados do presente estudo.
Nizole (2008) sugere que o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
esteja associado ao ciclo da theileriose, sendo que em algumas regiões do estado do
Pará é comum encontrar Rhipicephalus (Boophilus) microplus parasitando equinos
(Pereira et al., 1998), fato este que justificaria a alta prevalência do parasito.
Embora não existam informações sobre a epidemiologia molecular de T. equi
em outros estados da região norte do Brasil, a alta prevalência do presente estudo
confirma a hipótese de que devido suas condições climáticas, esta região apresente taxas
de infecção superiores às observadas para as regiões sudeste e sul. Tal fato é confirmado
pela localização geográfica da cidade de Belém, que situada às margens da Baía do
Guajará (01°26’06”S; 48°26’16”W), de acordo com a classificação de Köppen, possuí
clima quente e úmido (Abreu et al., 2004), favorecendo o ciclo biológico do vetor em
todos os meses do ano, e consequentemente o aumento da prevalência de theileriose em
equinos desta região.
Assim como observado para A. phagocytophilum, o baixo nível de
polimorfismo do gene EMA - 1 entre diferentes cepas de T. equi sugere que este é um
bom marcador para a detecção molecular, mas que um estudo de variabilidade genética
mais refinado deve ter como base outro marcador que apresente maior taxa de evolução.
42
6 CONCLUSÕES
De acordo com as análises aqui realizadas pôde-se concluir que:
Os bioagentes Anaplasma phagocytophilum e Theileria equi ocorrem em
equinos no estado do Pará.
O método molecular utilizando nested-PCR, com amplificação do gene 16S
rDNA e EMA-1, para a detecção de Anaplasma phagocytophilum e Theileria
equi respectivamente, é eficaz para diagnóstico.
A ocorrência da bactéria Anaplasma phagocytophilum é inferior a do
protozoário Theileria equi nos rebanhos de equídeos do estado do Pará.
As cepas de Anaplasma phagocytophilum e Theileria equi circulantes no
estado do Pará apresentam baixa variabilidade genética quando comparadas
com cepas de outras regiões do globo terrestre.
43
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