UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO-CIENTÍFICO Período: Agosto /2014 a Agosto / 2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL TÍTULO DO PROJETO DE PESQUISA: Provenance, transport and storage of sediments in Amazon Rivers Nome do Orientador: Janice Muriel Fernandes Lima da Cunha Nome do Co-orientador: MSc. Marina Vianna Loeb (Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo/MZUSP) Titulação do Orientador: Doutora Faculdade: Ciências Biológicas Unidade: Campus Bragança – IECOS Laboratório: Laboratório de Ictiologia e Biodiversidade Subterrânea da Amazônia TÍTULO DO PLANO DE TRABALHO: Padrões de diversificação no gênero Anchoviella da bacia do rio Xingu Nome do Bolsista: Raissa Leão Reis Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR (X) PIBIC/FAPESPA ( ) PRODOUTOR ( ) PARD - renovação ( ) PIBIC/PIAD ( ) PIBIC/AF-CNPq ( ) PIBIC/AF-UFPA ( ) PIBITI ( ) PADRC

Resumo O gênero Anchoviella compreende 25 espécies de peixes de pequeno porte, no Brasil são consideradas válidas seis espécies de água doce, sendo distribuídas na bacia Amazônica. Avaliar o padrão de diversidade do gênero Anchoviella provenientes de uma mesma localidade, Praia do Pajé, (Volta Grande, Xingu) por meio de análise de DNA mitocondrial permitirá reconstrução da divergência genética e da dinâmica de haplótipos (linhagens mitocondriais) e se ha um padrão congruente com a paisagem geológica a ser analisada. Nesse sentido no presente estudo, caracterizou-se a variabilidade genética do gene mitocondrial COI e cyt b a partir da análise de 21 espécimes (COI) e 17 espécimes (cytb) a fim de se avaliar a variação genética intra e interpopulacional entre os táxons de Anchoviella. As análises populacionais foram conduzidas através do programa Arlequin 3.5.1.2. Os cladogramas com maior probabilidade foram obtidos a partir dos métodos de máxima-verossimilhança (Kimura 2 parâmetros), com dez haplótipos na análise do gene COI, com o registro de uma diversidade haplótipica Hd: 0,7333. Na análise do gene cytb uma diversidade haplotípica Hd: 0.765 mesmo com menor número de espécimes analisados essa diversidade foi maior que observada em COI. A diversidade nucleotídica (por sitio) foi de Pi: 0.04660. Foram registrados 7 haplótipos, 6 para o Xingu e um para localidade de Curuçá, utilizada para fins comparativos de diversidade genética. Os resultados apontaram a divisão entre duas espécies do gênero Anchoviella e através de comparações com as seqüências do banco de dados Genbank pode-se distinguir Anchoviella carrikeri como primeiro registro para esta porção do Xingu. Os altos valores de divergência genética encontrados, podem indicar uma possível radiação evolutiva não tão recente para esses grupos, assim, teriam tido tempo evolutivo suficiente para acumular grandes diferenças genéticas. Entretanto estudos mais detalhados serão necessários para testar as hipóteses e inferir em que momento houve essa diversificação e quais os processos foram responsáveis por esse padrão. Palavras chave: DNA mitocondrial, Anchoviella, diversidade genética

INTRODUÇÃO

As manjubas da família Engraulidae compreende 16 gêneros com 139 espécies de

peixes marinhos, estuarinos e dulcícolas, estes últimos somando 17 espécies no total. No

Brasil, são conhecidos nove gêneros de Engraulidae com 25 espécies, oito destas

restritas à água doce (Whitehead et.al., 1988; Loeb, 2012). O trabalho mais recente sobre

o grupo em questão com abordagem cladística (Di Dario, 2005) corrobora o monofiletismo

da família apontado por Grande & Nelson (1985) As espécies desta família distinguem-se

pelo focinho proeminente e articulação mandibular localizada posteriormente em relação

aos olhos, pequeno a moderado porte (usualmente de 25 a 200 mm de CP). O corpo é

coberto por escamas de tamanho moderado que se destacam facilmente; a linha lateral

está ausente e as nadadeiras não apresentam espinhos (Whitehead et. al., 1988;

Kullander & Ferraris, 2003). Algumas espécies marinhas entram nos ambientes estuarinos

e esporadicamente nos ambientes de água doce, subindo até centenas de km de rios

costeiros e outras espécies parecem estar restritas à água doce.

O gênero Anchoviella Fowler, 1911 compreende 15 espécies de peixes de pequeno à

médio porte, no Brasil são consideradas válidas seis espécies de água doce, cinco destas

ocorrem na bacia Amazônica (Loeb,2012). No Rio Xingu há registro de Anchoviella

carrikeri e Achoviella guianensis, ambas do rio Culuene (afluente do alto Xingu). Os

gêneros Anchoviella, Jurengraulis e Lycengraulis (Engraulidae) foram registrados por nós

na porção mais a montante da Volta Grande, na localidade “praia do Pajé”.

Figura 1: Anchoviella carrikeri (A, holótipo, 54.5 mm SL, e B, 27.3 mm SL) e Anchoviella guianensis (C, holótipo, 29,7 mm SL, and D, 20.4 mm SL), espécies previamente registradas a montante do Rio Xingu .Foto: Marina Loeb

A bacia do rio Xingu possui mais de 500.000km2 e ocupa 24,5% do território do

estado do Pará. O Rio Xingu é um dos tributários da margem direita do Rio Amazonas.

Nasce na altura do paralelo 15º S, no estado do Mato Grosso, na área da Serra do

Roncador, a uns 200 km de Cuiabá, e desemboca logo após de Porto de Moz e Gurupá,

no estuário do Rio Amazonas, pouco ao Norte do paralelo 2º S. Possui mais de 1.600km

de comprimento e corre, na maior parte do seu curso, no sentido S-N. Possui como seu

maior afluente o Rio Iriri, que nasce a aproximadamente 100km ao SW de Altamira e

posteriormente o Bacajá, na Volta Grande, à jusante de Altamira (IBAMA, 2008a). A

ictiofauna do rio Xingu é rica em espécies e apresenta peculiaridades, pois as

características geográficas e hidrológicas da bacia favorecem a diversidade de

microambientes, que levam ao isolamento das populações, através de barreiras

geográficas e climáticas (IBAMA, 2008a).

A construção de uma represa e o desvio do rio pelo canal de derivação deixará a

região, conhecida como Volta Grande, com uma vazão extremamente reduzida. Esta

região será a área do rio com a maior perda de habitats de toda a área afetada. Apesar

das diversas propostas de mitigar este impacto com a chamada “vazão ecológica”,

qualquer diminuição do ritmo atual do ciclo hidrológico terá impactos bastante sérios para

a ictiofauna (IBAMA, 2008a).

As espécies de Anchoviella registrada no Xingu pelo projeto correspondem ao

primeiro registro de ocorrência para a porção de transição entre o médio/baixo Rio Xingu

(Volta Grande). Avaliar o padrão de diversidade do gênero Anchoviella nesta região, por

meio de dados moleculares integrados com aspectos geológicos e estudos da variação

fenotípica, permitirá conhecer parte da história da evolução biológica destes organismos e

potenciais influências da dinâmica geológica que podem ter afetado a feição das

drenagens locais.

JUSTIFICATIVA

Reconhecer potenciais congruências dos padrões de distribuição histórica das

genealogias de diferentes espécies de peixes, seus padrões filogenéticos e

biogeográficos permitirá sugerir eventos geológicos-chaves que moldaram conjuntamente

a evolução da paisagem e parte da complexa história da megabiodiversidade da

Amazônia.

Apesar de ser um dos principais tributários da Amazônia, existem poucos

estudos sobre a ictiofauna do rio Xingu. Ainda, os estudos de licenciamento

ambiental apresentam listas de espécies pouco confiáveis. Devido ao seu enorme

potencial de geração de hidroeletricidade, mega projetos já estão sendo instalados

no Rio Xingu, como a barragem de Belo Monte e outros, que deverão ser

implementados para a bacia, o que pode ocasionar o desaparecimento de boa

parte desta fauna com alto grau de endemismo sem ao menos ser conhecida. A investigação da dinâmica de alteração histórica da paisagem geológica e

biológica na bacia do rio Xingu será importante não apenas por proporcionar uma

compreensão da complexidade natural desta bacia, mas também permitirá registrar e

mensurar temporalmente (antes, durante e depois) a magnitude dos impactos

ocasionados pela construção da hidrelétrica de Belo Monte. Em especial provocará uma

mudança abrupta na região da Volta Grande do Xingu que inclui supressão e alteração

considerável de habitats aquáticos forjados ao longo da história geológica da região.

Desta forma, avaliar os padrões evolutivos das espécies do gênero Anchoviella, por

meio de analise de DNA mitocondrial permitirá acessar a divergência genética e a

dinâmica de distribuição e compartilhamento de haplótipos (linhagens

mitocondriais). Deste modo, espera-se concluir se há um padrão de diversificação

genética em Anchoviella congruente com a paisagem geológica caracterizada pelo

projeto principal. Estudos futuros poderão avaliar o impacto da alteração/supressão

de habitats nesta região da Amazônia.

OBJETIVOS O presente estudo pretende avaliar a variação genética intrapopulacional e

interpopulacional entre os táxons de Anchoviella de ocorrência na bacia de drenagem do

rio Xingu (médio e baixo Xingu) com finalidade de revelar potenciais padrões de

diferenciação das espécies relativas à evolução da paisagem geológica da bacia.

MATERIAL E MÉTODOS

1. Área de estudo

As amostras de Anchoviella (Engraulidae) foram obtidas durante as expedições de campo do projeto principal, no Xingu (Volta Grande) na localidade de “Praia do Pajé”.

Figura 2.Mapa de estudo da localidade “Praia do Pajé” em volta grande no Xingu

2. Extração de DNA genômico

As análises genéticas do presente estudo foram desenvolvidas no Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Campus de Bragança (IECOS), Universidade Federal do

Pará. Foram analisados 21 individuos do gênero Anchoviella para o gene COI e 16 individuos para o gene cytb, juntamente com dados extraídos do genebank (.

A escolha de DNA mitocondrial deveu-se ao fato de algumas peculiaridades desse tipo de material como a origem materna, alta taxa evolutiva, grande número de cópias por célula, ausência de recombinação (devido ao modo de herança materna) (AVISE,1998) sendo portanto ideal para estudos populacionais.

O DNA total foi extraído utilizando-se o kit PROMEGA, de acordo com protocolo do fabricante. O protocolo foi o seguinte:

Extração de DNA a partir de tecido muscular

1- Colocar em um tubo falcon 6µl de solução EDTA 0.5(PH 8.0) e 250µl Nuclei lysis solution , colocar na geladeira (a solução ficará turva depois de gelada);

2- Adicionar cerca de 50 mg de tecido fresco ou preservado em etanol em tubo eppendorf de 1,5 ml ( em caso de tecido preservado em álcool, realizar 2 previamente duas lavagens com 600 µl de água destilada por 2 minutos a 13000 rpm, a cada lavagem, trocar a água dos tubos);

3- Adicionar 300µl da solução gelada de EDTA/ Nuclei lysis solution do passo 1, dentro de tubos eppendorf de 1,5 ml com o tecido;

4- Acrescentar 5µl de ribonuclease e inverter o tubo 3-5 vezes. Incubar os tubos na estufa a 37ºC por 30 minutos . Retirar os tubos da estufa e aguardar 5 minutos para prosseguir;

5- Adicionar 10µl de proteinase k. Incubar por no mínimo 3 horas e 55 ºC em termomixer ou banho Maria. Agitar os tubos no vortex a cada hora. Tenha certeza da total dissolução do tecido antes de prosseguir;

6- Em temperatura ambiente adicionar 100µl de Protein precipitation solution e vortexar vigorosamentee velocidade máxima por 20 segundos. Deixar as amostras no freezer por 5 minutos;

7- Centrifugar por 10 minutos a 13000 rpm; 8- Preparar os tubos novos de 1,5 ml contendo 300µl de isopropanol. Remover

cuidadosamente o sobrenadante contendo o DNA e transferir para os novos tubos (deixando o pellet de proteínas no fundo do primeiro tubo);

9- Misturar gentilmente a solução por inversão, até aparecer nuvens brancas de DNA dentro do tubo formando uma massa visível;

10- Centrifugar por 10 minutos a 13000 rpm em temperatura ambiente. O DNA vai ser visível na forma de um pequeno pellet. Descartar cuidadosamente o sobrenadante;

11- Adicionar 300µl de etanol 70% (preparado na hora) em temperatura ambiente e inverter gentilmente os tubos várias vezes para lavar o DNA. Centrifugar por 10 minutos a 1300 rpm em temperatura ambiente;

12- Descartar o etanol cuidadosamente para não perder o pellet de DNA 13- Inverter cuidadosamente o tubo em papel absorvente limpo. Em seguida colocar

os tubos (abertos) na estufa a 37ºC por 30 minutos; 14- Adicionar 25µl de DNA rehidration solution para reidratar o DNA, e incubar os

tubos (fechados) overnight na estufa a 37ºC; 15- Armazenar o DNA em freezer a -15ºC.

3. Amplificação e sequenciamento dos genes

(Todas as reações foram realizadas em temociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, CA, USA). Os programas utilizados no termociclador iniciavam-se com 3 minutos (min) de desnaturação a 94ºC; seguido por 35 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95ºC, 1 min de anelamento a 55ºC – 57ºC e 1 min de extensão a 72ºC. Uma extensão final por 3 min a 72ºC foi realizada ao final de cada reação.) As PCRs foram realizadas para um volume total de 25 ƒÊl contendo 4 ƒÊl de DNTP (1,25mM), 2,5 ƒÊl de solucao tampao (10X), 2 ƒÊl de MgCl2 (25 Mm), 0,25 ƒÊl de cada iniciador (200 ng/ƒÊl), 1 a 1,5 ƒÊl de DNA genômico (100 ng/ƒÊl), 1U de Taq DNA Polimerase (5U/ƒÊl) e água purificada para completar o volume final de cada reação. Para isolar e amplificar os fragmentos do DNA mitocondrial de 620 pares de bases os primers utilizados para citocromo oxidase I (COI) foram , F= 5' TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC 3', R= 5' TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA 3' Ward et al. (2005). Os primers utilizados para cytb foram : Fishcytb-F e TruccytB- (Sevilla et al., 2007).As PCRs foram realizadas para um volume total de 25 µl contendo 4 µ

Os produtos da amplificação foram purificados com a enzima ExoSAP-IT (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., UK) de acordo com instruções fabricante e submetido ao sequenciamento pelo método di-desoxi terminal (SANGER et al., 1977) com o kit Big Dye 3.1 (Applied Biosystems), seguindo as instruções do fabricante, com eletroforeses no ABI 3500 XL (Applied Biosystems).

4. Visualização do DNA amplificado em gel de agarose Para se verificar a qualidade do material obtido, foram realizadas eletroforeses do DNA em gel de agarose(1%) corado com gel red e os resultados foram avaliados através da visualização do gel sob luz ultravioleta.

5. Alinhamento das sequências e Análise dos dados As sequências de COI e citb obtidas foram alinhadas nos programas Bioedit (HALL, 1999), NAsp versão 5.10.01 (LIBRADO & ROZAS, 2009), criando-se bancos de dados no formato de entrada dos programas de análises genéticas. No programa jModeltest 3.06 (POSADA & CRANDALL, 1998) foram selecionados os modelos de evolução para COI. Através do programa MEGA 5.0 (TAMURA et al.,2011), foi calculada a média de divergência não corrigida (p) para cada população.Os haplótipos divergentes de cada população foram selecionados utilizando-se o programa DNAsp 5.10 (LIBRADO & ROSAS, 2009) e as análises populacionais realizadas através do programa Arlequin 3.5.1.2 (EXCOFFIER & LISCHER, 2010).A rede de haplótipos para cytb foram geradas no programa . As sequências geradas foram comparadas com sequências depositadas no banco de dados público na internet, GenBank ,através de uma procura realizada com o programa blast Ao final desta etapa foram gerados os bancos de sequências (COI com sequências e Cytb com sequências) que compõem a matriz de dados utilizada neste trabalho. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos dados obtidos por sequenciamento foram montados os bancos de

dados, o primeiro é composto por sequências do gene COI (Cytochromo Oxidase

subunited 1), o segundo é composto por sequências do gene Cytb (Cytochromo b) ambos

de origem do DNA mitocondrial.

Gene Citocromo Oxidase subunidade I

Os fragmentos obtidos apresentaram 620 pares de bases com 104 sítios variáveis e 55 informativos para parcimônia (Tabela 1) não foram observadas deleções.

Nº de sítios Total 620 Variáveis 104 Informativos para parcimônia 55 Tabela 1-Número de sítios totais, varáveis e informativos para parcimônia

O cladograma obtido a partir do método de máxima – verossimilhança (usando o modelo TrN+I 2 parametros,Kimura ) que considera a árvore com melhor probabilidade de explicar a natureza dos dados (Figura 3 ), mostra a divisão das populações de Anchoviella em dois grupos principais (clados) evidenciada pela variação dos sítios

Figura 3 .Cladograma obtido por Máxima Verossimilhança(2 parâmetros, Kimura)indicando a separação em dois clados de Anchoviella. Os números representam valores de bootstrap com replicação em 10000 vezes