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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
MARCELLA FERNANDES DE SOUZA
ACÚMULO DE AMIDO POR Chlorella sorokiniana E POSTERIOR
PROCESSAMENTO EM UM CONTEXTO DE BIORREFINARIA
RIO DE JANEIRO
Maio - 2017
Marcella Fernandes de Souza
ACÚMULO DE AMIDO POR Chlorella sorokiniana E POSTERIOR
PROCESSAMENTO EM UM CONTEXTO DE BIORREFINARIA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de
Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências (Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos)
Orientadores: Suely Pereira Freitas, Elba Pinto da Silva Bon e Marcoaurélio
Almenara Rodrigues
Rio de Janeiro
Maio - 2017
Souza, Marcella Fernandes de.
Acúmulo de amido por Chlorella sorokiniana e posterior
processamento em um contexto de biorrefinaria / Marcella
Fernandes de Souza. -- Rio de Janeiro, 2017.
143 f.
Orientadora: Suely Pereira Freitas. Coorientadores: Elba
Pinto da Silva Bon e Marcoaurelio Almenara Rodrigues.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Escola de Química, Programa de Pós Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, 2017.
1. Microalgas. 2. Biorrefinaria. I. Pereira, Suely F., orient. II.
Bon, Elba P.S., coorient. III. Rodrigues, Marcoaurelio A.,
coorient. IV. Título.
MARCELLA FERNANDES DE SOUZA
ACÚMULO DE AMIDO POR Chlorella sorokiniana E POSTERIOR
PROCESSAMENTO EM UM CONTEXTO DE BIORREFINARIA
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de
Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Ciências (Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos)
Aprovada em ____/____/____:
________________________________________________
Suely Pereira Freitas, D.Sc., UFRJ
________________________________________________
Elba Pinto da Silva Bon, PhD, UFRJ
________________________________________________
Marcoaurelio Almenara Rodrigues, D.Sc., UFRJ
________________________________________________
Maria Alice Zarur Coelho, D.Sc., UFRJ
________________________________________________
Donato Alexandre Gomes Aranda, D.Sc., UFRJ
________________________________________________
Mariângela Menezes, D.Sc., UFRJ
________________________________________________
Aline Machado de Castro, D.Sc., CENPES
________________________________________________
Viridiana Santana Ferreira Leitão, D.Sc., INT
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que contribuíram de uma forma ou outra para a
realização do presente trabalho. Em especial, gostaria de agradecer:
À Professora Suely Pereira Freitas, por ter aceitado o papel de orientadora e
sempre ter me incentivado a seguir meu próprio caminho. Também gostaria de
agradecê-la por ter me envolvido no universo das microalgas, que agora me é tão
querido.
À Professora Elba P.S. Bon, por ter me recebido em seu grupo de pesquisa
desde a graduação, despertando meu interesse pela carreira acadêmica, e pela
orientação e inúmeras oportunidades de crescimento nesses últimos 7 anos.
Ao Professor Marcoaurelio A. Rodrigues, por sua revisão cuidadosa de todos
os meus resultados, sempre contribuindo com novas informações para melhor
discuti-los.
À Ayla Santana da Silva, pela parceria também nesses últimos 7 anos, por
todas as nossas conversas que contribuíram para que eu me tornasse uma
pesquisadora melhor e por todo o apoio e disponibilidade nesses anos de doutorado.
À equipe dos laboratórios Enzitec e Bioetanol, pela amizade durante todos
esses anos. Em especial, ao Ricardo S.S. Teixeira, por me auxiliar no entendimento
e discussão de resultados, ao Raul A. Oliveira, pela adaptação das luzes para o
crescimento das microalgas, ao Daniel S. Pereira, pela parceria no artigo publicado
e pelas inúmeras análises realizadas, e a Maria Fernanda S. Mota e Fernanda T.A.
Jorge, pela ajuda tanto experimental quanto nas discussões de resultados.
À Professora Anita F. Valle, pelo apoio inicial nos cultivos de microalgas e por
se mostrar sempre disposta a me auxiliar. À Lília C.O. Barretto, pelo envio das
sementes de moringa e pela amizade no nosso breve convívio. À Professora Ana
Lúcia A. Vendramini, pela oportunidade de parceria e pelo envio das amostras de
celulose de macroalga. Ao Professor Bernardo D. Ribeiro, também por sempre se
mostrar disponível e pelo envio das amilases comerciais.
Aos docentes do setor de Engenharia Bioquímica do DEB, em especial às
professoras Andrea M. Salgado, Maria Antonieta P.G. Couto e Priscilla F.F. Amaral,
pelo auxílio nas atividades didáticas desenvolvidas durante o doutorado, e aos
professores substitutos Mariana M.P. Silva, Caroline A. Cayres e Felipe V.
Nascimento, pelo companheirismo nesse último ano.
Ao CNPq, pela bolsa de estudos.
Por último, mas com certeza não menos importante, gostaria de agradecer à
minha família. Aos meus pais, por sempre me apoiarem nas minhas decisões e
acreditarem em mim, me dando confiança para seguir meu próprio caminho, e
também por dividir comigo tanto minhas angústias quanto minhas conquistas,
tornando tudo mais fácil; em especial, à minha mãe, por todas as horas em que ela
me ouviu treinar antes de alguma apresentação, ajudando a melhorá-la. E ao
Matheus, por ser meu companheiro de discussões acadêmicas, revisão de textos e
de apresentações e por toda sua compreensão nos últimos meses de intenso
trabalho para finalizar a tese.
It’s not love or money that makes the world go round, it’s
photosynthesis - Jirí Masojídek
RESUMO
Souza, Marcella Fernandes de. Acúmulo de amido por Chlorella sorokiniana e
posterior processamento em um contexto de biorrefinaria. Tese (Doutorado) - Escola
de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017
O estabelecimento de uma sociedade sustentável inclui a substituição do petróleo
por matérias-primas renováveis para produção tanto de combustíveis quanto de
commodities e produtos de alto valor agregado. Nesse contexto, as microalgas têm
sido consideradas matérias-primas renováveis para a produção de diferentes
compostos biológicos de interesse industrial, como proteínas, lipídeos e
carboidratos, com a vantagem de prescindir de terras cultiváveis. Os carboidratos,
encontrados principalmente na forma de amido, são uma fonte potencial de glicose,
que pode servir como precursora de diversas moléculas-plataforma. No entanto, a
produção de commodities a partir de microalgas atualmente só é viável
economicamente se associada à obtenção de produtos de alto valor agregado, em
um contexto de biorrefinaria. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi cultivar
uma microalga em condições que favorecessem o acúmulo de carboidratos,
especialmente amido, e propor uma rota sustentável para o uso integral da
biomassa cultivada. Dentre as microalgas estudadas, Chlorella sorokiniana foi a que
apresentou maior concentração celular e maior conteúdo de carboidratos nas
condições de cultivo estudadas. Observou-se que o aumento do tempo de cultivo
favoreceu o acúmulo de amido intracelular, que passou de 8 % na fase exponencial
de crescimento para 28 % na fase estacionária. O acúmulo de amido resultou em
um aumento da densidade celular, auxiliando a etapa de colheita das células por
sedimentação gravitacional. Esta etapa foi também favorecida pelo uso do extrato
salino da semente de moringa (Moringa oleifera) em uma etapa de floculação,
resultando em um aumento da velocidade de sedimentação. Para obtenção de um
xarope de glicose a partir da microalga colhida, um processo de hidrólise enzimática
foi proposto para rompimento da parede celular e despolimerização do amido
intracelular. No entanto, a parede celular da microalga foi resistente à hidrólise com
uma mistura enzimática contendo celulases. Esse resultado, em conjunto com os
resultados de caracterização da fração de carboidratos, sugere um conteúdo
reduzido de celulose na parede celular de C. sorokiniana. Após uma etapa de
moagem das células secas para rompimento da parede celular, a hidrólise
enzimática com amilases fúngicas resultou em um rendimento em glicose de 99 %
em apenas 5 horas. O aumento da carga de sólidos de 5% para 25 % (m/m) resultou
na redução do rendimento para 76 % e no aumento da concentração de glicose em
4,5 vezes, chegando-se a 70 g/L, mostrando a possibilidade de condução da
hidrólise com altas concentrações de sólidos para obtenção de uma corrente
concentrada de glicose. Durante a etapa de hidrólise enzimática, foi observada a
degradação dos pigmentos da microalga; portanto, a extração desses compostos foi
realizada a partir da microalga fresca, em etapa anterior à hidrólise. A extração com
etanol resultou em rendimentos similares aos obtidos com metanol, solvente tóxico
comumente utilizado para esse fim. As células impregnadas com etanol, após a
extração, apresentaram uma taxa de secagem quase 10 vezes superior à obtida
com as células frescas, reduzindo o gasto energético do processo. Após a extração
de pigmentos e hidrólise enzimática, a biomassa residual apresentou teores de 33 %
de proteínas e 27 % de lipídeos, com possível aplicação na alimentação humana e
animal. Os resultados obtidos no presente trabalho possibilitam a proposição de um
processo de extração de pigmentos de alto valor agregado acoplado à obtenção de
glicose e a geração de um resíduo com potencial interesse industrial. No processo
desenvolvido foram utilizadas etapas ambientalmente amigáveis associadas a
procedimentos pouco onerosos na colheita e secagem das microalgas.
Palavras-chave: Chlorella sorokiniana, microalgas, glicose, amido, pigmentos,
biorrefinaria
ABSTRACT
Souza, Marcella Fernandes de. Starch accumulation by Chlorella sorokiniana and its
processing in a biorefinery context. Thesis (Doctorate) - Escola de Química,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017
In order to develop a sustainable society, petroleum has to be substituted by
renewable feedstocks in the production of energy, commodities and high-value
products. In this context, microalgae have been proposed as a renewable feedstock
for the production of different biological compounds with industrial applications, such
as proteins, lipids and carbohydrates, without requiring arable land. Carbohydrates,
found mainly as starch, are a potential source of glucose, which can be used as a
precursor for obtaining several platform molecules. However, the production of
commodities from microalgae is currently economically viable only if associated with
the production of high-value products in a biorefinery approach. Therefore, the aim of
this work was to cultivate a microalga in conditions that would enhance its starch
content and to propose sustainable methods for the processing of this biomass as a
whole. Among the studied microalgae, Chlorella sorokiniana showed the highest
cellular concentration and the highest carbohydrate content in the studied cultivation
conditions. The increase in cultivation time resulted in an intracellular starch
accumulation, from 8 % at the exponential growth phase to 28 % at the stationary
phase. Starch accumulation resulted in an increase in cell density, aiding cell
harvesting by gravitational sedimentation. Sedimentation was also improved by the
addition of a saline extract of Moringa oleifera seeds in a previous flocculation step,
resulting in a faster cell sedimentation rate. To obtain a glucose syrup from the
harvest cells, a enzymatic hydrolysis process was proposed for rupturing the cell wall
and depolymerizing the intracellular starch. However, C. sorokiniana's cell wall was
resistant to the hydrolysis with an enzymatic mixture containing cellulases. This
outcome, together with the results obtained from the characterization of the
carbohydrates fraction of this microalga, suggests a reduced content of cellulose in
C. sorokiniana's cell wall. After cell wall rupture by milling, it was possible to achieve
a 99 % glucose yield whithin 5 hours of hydrolysis with fungal amylases. The
increase in solids loading from 5 % to 25 % (m/m) resulted in a reduction of this yield
to 76 % and a 4.5-fold increase in glucose concentration, with a maximum of 70 g/L,
indicating the feasibility of a high solids loading hydrolysis to obtain a concentrated
glucose stream. During the enzymatic hydrolysis step, it was observed pigment
degradation; therefore, the extraction of these compounds was done from fresh cells,
previously to the enzymatic hydrolysis. The extraction with ethanol yielded similar
results to those obtained for the use of methanol, a toxic solvent commonly used for
this purpose. Ethanol impregnated cells after extraction showed a 10-fold higher
drying rate when compared to fresh cells; this result represents a lower energy
expenditure in the process. After the pigments extraction and the enzymatic
hydrolysis steps, the residual biomass showed a protein content of 33 % and a lipid
content of 27 %, and could be directed to animal feed and human consumption. The
proposed process using the results of the present work enables the obtaining of
glucose, together with pigments, which have a high market value, and a residue with
potential industrial applications, through environmentally benign processes and with
low-cost harvesting and drying steps.
Keywords: Chlorella sorokiniana, microalgae, glucose, starch, pigments, biorefinery
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reprodução assexuada de Chlorella vulgaris ....................................................... 24
Figura 2. Microscopia ótica de Chlorella sorokiniana (UTEX 1663) ...................................... 25
Figura 3. Esquema de um cloroplasto .................................................................................. 25
Figura 4. Fases da fotossíntese com seus principais produtos ............................................ 26
Figura 5. Estrutura da clorofila a e variações nas estruturas das clorofilas b, c e d ............. 27
Figura 6. Síntese de amido e triacilglicerídeos (TAG) a partir da fixação de CO2 pelo ciclo de
Calvin-Benson ..................................................................................................................... 27
Figura 7. Esquema de um lago raceway ............................................................................. 34
Figura 8. Representação esquemática de um reator tubular vertical (a) e horizontal (b) ..... 35
Figura 9. Representação de um fotobiorreator de placas .................................................... 36
Figura 10. Representação de reatores de biofilme com suporte sólido (a), em que a fase
aquosa está em contato direto com as células, e com suporte microporoso (b), em que a
fase aquosa entra em contato com as células apenas por difusão ..................................... 36
Figura 11. Agente floculante catiônico liga-se às partículas negativamente carregadas e cria
"pontes", promovendo sua floculação ................................................................................. 39
Figura 12. Design típico de uma válvula de homogeneização a alta pressão ..................... 43
Figura 13. Biorrefinaria baseada em glicose ........................................................................ 48
Figura 14. Grânulo de amido com destaque para a formação de duplas hélices nas cadeias
de amilopectina .................................................................................................................... 49
Figura 15. Microscopia ótica das microalgas M. homosphaera (a), C. sorokiniana (b) e N.
oleoabundans (c) com lente objetiva de 100x ...................................................................... 53
Figura 16. Agitador orbital New Brunswick Scientific Innova 44R adaptado com luzes
fluorescentes para crescimento de microalgas ................................................................... 53
Figura 17. Moinho vibratório contendo 1 bola ...................................................................... 62
Figura 18. Sementes de moringa secas e após a remoção das cascas ............................... 63
Figura 19. Perfil de crescimento das algas Chlorella sorokiniana, Neochloris oleoabundans e
Mychonastes homosphaera durante 10 dias de cultivo em Bold's Basal Medium em frascos
agitados a 175 rpm .............................................................................................................. 67
Figura 20. Concentração de massa seca de C. sorokiniana (S), N. oleoabundans (N) e M.
homosphaera (H) obtidas após 10, 20 e 30 dias de cultivo. ................................................. 68
Figura 21. Teor de glicose (cinza claro) e açúcares totais (cinza escuro) da biomassa seca
de C. sorokiniana (S), N. oleoabundans (N) e M. homosphaera (H) após 10, 20 e 30 dias de
cultivo......................................................................................................................................68
Figura 22. Acompanhamento do crescimento celular de C. sorokiniana a 30 °C e 225 rpm..
............................................................................................................................................ 72
Figura 23. Correlação linear entre leituras de densidade ótica a 750 nm e 680 nm de um
mesmo cultivo de C. sorokiniana em diferentes momentos. ................................................. 72
Figura 24. Correlação entre densidade ótica a 680 nm e número de células determinados ao
longo do cultivo de C. sorokiniana ....................................................................................... 73
Figura 25. Quantidade de clorofila por célula e teor de amido em diferentes períodos de
cultivo de C. sorokiniana ...................................................................................................... 74
Figura 26. Correlação entre densidade ótica a 680 nm e massa seca determinados ao longo
do cultivo de C. sorokiniana. ................................................................................................ 75
Figura 27. Teores de açúcares encontrados nas microalgas Chlorella sp. (a), Chlorella
sorokiniana (b) e Mychonastes homosphaera (c) quantificados por HPAEC-PAD após a
hidrólise pelo método Northcote por 1 hora, 2 horas, 4 horas e 6 horas. ............................. 78
Figura 28. Perfil de crescimento de Chlorella sorokiniana a 175 rpm, 200 rpm e 225 rpm
durante 10 dias de cultivo. ................................................................................................... 84
Figura 29. Teor de glicose e massa seca de C. sorokiniana em diferentes dias de cultivo a
225 rpm ............................................................................................................................... 85
Figura 30. Perfil de consumo de fosfato, consumo de nitrato e pH durante o cultivo de
Chlorella sorokiniana a 225 rpm. ......................................................................................... 86
Figura 31. Perfil de crescimento celular de Chlorella sorokiniana a 200 rpm em meio original
contendo todos os componentes (Controle), meio original sem elementos-traço (Zn, Mn, Mo,
Cu e Co) e meio contendo apenas macronutrientes acrescidos de ferro (sem EDTA, boro e
elementos-traço). ................................................................................................................. 88
Figura 32. Massa seca e teor de glicose obtidos após 20 dias de cultivo de Chlorella
sorokiniana a 200 rpm em diferentes meios ......................................................................... 88
Figura 33. Massa seca e teor de glicose obtidos após 10 dias de cultivo de Chlorella
sorokiniana a 225 rpm em diferentes meios ......................................................................... 90
Figura 34. Teor de glicose acumulado por células de C. sorokiniana cultivadas em água
deionizada ou meio completo sem nitrato de sódio após diferentes períodos ...................... 92
Figura 35. Perfil de hidrólise enzimática de C. sorokiniana em frascos agitados contendo
12,5 mL e eppendorfs contendo 1,25 mL. ............................................................................ 95
Figura 36. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas de C. sorokiniana com
enzimas produzidas pelos fungos T. reesei (Rut) e A. awamori (Awa) a 50 °C, pH 4,8 ........ 96
Figura 37. Microscopia ótica de células liofilizadas de C. sorokiniana tingidas com iodo após
24 horas de hidrólise com enzimas de A. awamori. ............................................................. 97
Figura 38. Microscopia ótica de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana .................. 99
Figura 39. Perfil de hidrólise enzimática de células moídas de C. sorokiniana, após
liofilização, com enzimas produzidas pelos fungos T. reesei (Rut) e A. awamori (Awa) a 50
°C, pH 4,8 .......................................................................................................................... 100
Figura 40. Atividade percentual relativa de amilase do preparado enzimático de Aspergillus
awamori em diferentes temperaturas e pH 4,8................................................................... 101
Figura 41. Atividade percentual relativa de amilase do preparado enzimático de Aspergillus
awamori em diferentes pHs a 60 °C ................................................................................... 102
Figura 42. Rendimentos em glicose obtidos após 4 horas de hidrólise de células liofilizadas e
moídas de C. sorokiniana com enzimas de A. awamori em diferentes condições de
temperatura e pH ............................................................................................................... 102
Figura 43. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana
com diferentes concentrações do preparado enzimático de A. awamori a 60 °C e pH 4,0. 103
Figura 44. Concentração de glicose e rendimento em glicose obtidos após 4 horas de
hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana com enzimas de A.
awamori a 850 AMU/g glucana, 60 °C e pH 4,0 com diferentes cargas de sólidos ............ 104
Figura 45. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana,
amido de milho cru, após gelatinização a 100 °C por 10 minutos e após moagem por 90
minutos. ............................................................................................................................. 107
Figura 46. Células sedimentadas de C. sorokiniana após 6 horas (a) e 24 horas (b) em uma
proveta contendo 100 mL de suspensão de células ricas em amido .................................. 109
Figura 47. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana apresentando diferentes
teores de amido intracelular (8 % e 22 %) ......................................................................... 109
Figura 49. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana floculadas com
diferentes soluções. ........................................................................................................... 111
Figura 48. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana floculadas com
diferentes concentrações de pó de semente de moringa ................................................... 111
Figura 50. Volume de sedimentado encontrado ao final do processo de floculação e
sedimentação de 10 mL de suspensão de células e massa seca e umidade encontrados
após uma etapa posterior de centrifugação do sedimentado formado pela floculação
utilizando pó de semente de moringa, extrato salino do pó da semente e solução de CaCl2.
.......................................................................................................................................... 113
Figura 52. Extração de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides de C. sorokiniana
com metanol 100 % a 25 °C a partir da biomassa fresca, liofilizada e moída e apenas
liofilizada ............................................................................................................................ 115
Figura 51. Quantificação de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides por extração,
com metanol 100 % a 25 °C, de C. sorokiniana moída antes e após hidrólise enzimática . 115
Figura 53. Extração de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides de C. sorokiniana
fresca com metanol 100 % e etanol 96 % a 25 °C ............................................................. 116
Figura 54. Acompanhamento da secagem de células de C. sorokiniana após a colheita e
após a extração com etanol 96 % ...................................................................................... 118
Figura 55. Fluxograma de processo de uma biorrefinaria de C. sorokiniana para obtenção de
pigmentos, glicose e biomassa seca rica em proteínas e lipídeos ..................................... 118
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Filos de microalgas e suas principais características ................................ 24
Tabela 2. Principais características de sistemas abertos e fechados de cultivo de
microalgas ................................................................................................................. 34
Tabela 3. Método de secagem de algas ................................................................... 41
Tabela 4. Lista de empresas de produção de biocombustíveis a partir de microalgas
.................................................................................................................................. 19
Tabela 5. Rendimento médio de óleo por matéria-prima .......................................... 20
Tabela 6. Modificações no meio de cultivo de C. sorokiniana ................................... 58
Tabela 7. Desvio entre os valores experimentais e calculados pelas regressões
linear e exponencial para o número de células em diferentes dias de cultivo ........... 74
Tabela 8. Teor de glicose determinado após caracterização pelos métodos de
Northcote e NREL de amido, celulose microcristalina (Avicel) e da macroalga
Kappaphycus alvarezii após extração de carragena e das três espécies de
microalgas após remoção do amido por hidrólise enzimática com α-amilase e
amiloglucosidase comerciais. .................................................................................... 81
Tabela 9. Teor de carboidratos, lipídeos e proteínas de diversas espécies de
microalgas ................................................................................................................. 93
Tabela 10. Atividades de celulases totais, β-glicosidases e amilases por grama de
glucana utilizadas nos experimentos de hidrólise ..................................................... 96
Tabela 11. Rendimentos em glicose da hidrólise enzimática de microalgas ricas em
amido ...................................................................................................................... 105
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 23
2.1 MICROALGAS E O GÊNERO Chlorella .......................................................... 23
2.2 METABOLISMO DE MICROALGAS ............................................................... 25
2.3 EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS DE MICROALGAS ......................................... 28
2.4 COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DE MICROALGAS ........................................... 30
2.4.1 Parede celular .............................................................................................. 30
2.4.2 Componentes intracelulares ......................................................................... 31
2.5 SISTEMAS DE CULTIVO DE MICROALGAS ................................................. 33
2.6 PROCESSAMENTO DE MICROALGAS ......................................................... 37
2.6.1 Colheita ........................................................................................................ 37
2.6.2 Secagem ...................................................................................................... 40
2.6.3 Rompimento celular ..................................................................................... 42
2.6.3.1 Homogeneização a alta pressão .................................................................. 42
2.6.3.1 Ultrassom ..................................................................................................... 43
2.6.3.2 Moagem ....................................................................................................... 43
2.6.3.3 Hidrólise enzimática ..................................................................................... 44
2.7 BIORREFINARIA DE MICROALGAS .............................................................. 45
2.7.1 Proteínas ...................................................................................................... 20
2.7.2 Lipídeos ........................................................................................................ 20
2.7.3 Amido ........................................................................................................... 48
2.7.4 Clorofilas e carotenoides .............................................................................. 50
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 52
3.1 Objetivo geral .................................................................................................. 52
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 52
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 53
4.1 Microalgas e condições de cultivo ................................................................... 53
4.2 Seleção da microalga ...................................................................................... 54
4.2.1 Massa seca .................................................................................................. 54
4.2.2 Determinação do conteúdo de carboidratos ................................................. 54
4.2.3 Análise dos carboidratos por HPAEC........................................................... 55
4.3 Seleção das metodologias de quantificação e acompanhamento celular ....... 55
4.4 Seleção da metodologia de caracterização da fração de carboidratos de
microalgas do gênero Chlorella ................................................................................. 56
4.5 Estudo do cultivo de C. sorokiniana ................................................................ 57
4.6 Determinação do teor de proteínas ................................................................. 58
4.7 Determinação do teor de lipídeos .................................................................... 59
4.8 Hidrólise enzimática ........................................................................................ 59
4.8.1 Produção de enzimas ................................................................................... 60
4.8.2 Determinação das atividades de FPase e β-glicosidase .............................. 61
4.8.3 Determinação da atividade de amilase ........................................................ 61
4.8.4 Moagem ....................................................................................................... 62
4.8.5 Estudo das condições de hidrólise ............................................................... 62
4.8.6 Hidrólise do amido de milho comercial ......................................................... 62
4.9 Colheita de C. sorokiniana .............................................................................. 63
4.9.1 Sedimentação gravitacional ......................................................................... 63
4.9.2 Floculação e sedimentação .......................................................................... 63
4.9.2.1 Preparo do pó e dos extratos de semente de moringa................................. 63
4.9.2.2 Experimentos de floculação ......................................................................... 64
4.10 Extração de pigmentos .................................................................................... 64
4.11 Secagem de células de C. sorokiniana ........................................................... 65
4.12 Tratamento estatístico dos dados .................................................................... 65
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 66
5.1 Seleção da microalga de interesse .................................................................. 66
5.1.1 Considerações finais .................................................................................... 70
5.2 Metodologias de caracterização e quantificação de Chlorella sorokiniana ...... 71
5.2.1 Estudo da metodologia de quantificação e acompanhamento do crescimento
celular.........................................................................................................................71
5.2.2 Estudo da metodologia de caracterização quanto ao teor de carboidratos .. 75
5.2.2.1 Redução do tempo de hidrólise ácida e validação da metodologia .............. 76
5.2.2.2 Hidrólise ácida de controles e de microalgas sem amido ............................. 80
5.2.3 Considerações finais .................................................................................... 83
5.3 Estudo do cultivo de Chlorella sorokiniana ...................................................... 84
5.3.1 Estudo da influência da frequência de agitação no crescimento de C.
sorokiniana ................................................................................................................ 84
5.3.2 Cinética de acúmulo de carboidratos em C. sorokiniana ............................. 85
5.3.3 Influência dos componentes do meio de cultivo no acúmulo de amido por C.
sorokiniana ................................................................................................................ 87
5.3.4 Comparação com dados da literatura .......................................................... 92
5.3.5 Considerações finais .................................................................................... 94
5.4 Processamento de Chlorella sorokiniana em um contexto de biorrefinaria ..... 94
5.4.1 Hidrólise enzimática de Chlorella sorokiniana .............................................. 94
5.4.1.1 Redução do volume de hidrólise .................................................................. 95
5.4.1.2 Hidrólise enzimática de células liofilizadas ................................................... 96
5.4.1.3 Hidrólise enzimática de células moídas ....................................................... 99
5.4.1.4 Estudo das condições de hidrólise ............................................................. 101
5.4.1.5 Aumento da carga de sólidos ..................................................................... 103
5.4.1.6 Avaliação da hidrólise do amido de C. sorokiniana .................................... 105
5.4.2 Colheita de Chlorella sorokiniana por sedimentação gravitacional ............ 108
5.4.3 Extração de pigmentos de C. sorokiniana e fluxograma do processo ........ 114
5.4.4 Considerações finais .................................................................................. 119
6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 121
7 TRABALHOS FUTUROS .................................................................................. 122
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 123
ANEXO .................................................................................................................... 143
19
1 INTRODUÇÃO
A busca por fontes de energia alternativas ao petróleo, incentivada pelas
crises do petróleo dos anos 1970, impulsionou pesquisas relacionadas ao uso de
matérias-primas renováveis. Além do forte apelo ambiental, a descentralização da
produção de energia tem como vantagem uma maior autonomia dos países não
produtores de petróleo, visto que as reservas petrolíferas conhecidas estão
concentradas em uma pequena parcela do mundo e o preço do petróleo está sujeito
a variações por motivos geopolíticos. Apesar de a questão energética apresentar
uma importância significativa, paralelamente se faz necessário o desenvolvimento
de novas rotas sustentáveis de obtenção de diversos produtos derivados do
petróleo, como plásticos, resinas, borrachas, dentre outros.
De forma a atender essa demanda, vem sendo fortalecido o modelo de
biorrefinaria que, semelhante a uma refinaria de petróleo, seria capaz de produzir
diversos compostos a partir de matérias-primas renováveis. Essa abordagem
permite a obtenção combinada de produtos de alto valor agregado e commodities,
possibilitando a produção dessas últimas a preços competitivos (JONG e
JUNGMEIER, 2015).
Uma das biomassas que tem se destacado é a de microalgas devido a sua
alta produtividade e por apresentar diversas moléculas de interesse em sua
composição, como proteínas, carboidratos e lipídeos, além de conter compostos
minoritários de alto valor agregado, como pigmentos, ácidos graxos poli-insaturados
(PUFAs) e aminoácidos essenciais (SPOLAORE et al., 2006). Essa biomassa
apresenta diversas vantagens sobre os cultivos agrícolas: i) possui alta eficiência
fotossintética; ii) não requer terras aráveis; iii) não necessita de água potável; iv) não
apresenta sazonalidade (SAYRE, 2010). Além da possibilidade de uso de águas
residuais de estações de tratamento, o CO2 necessário para o cultivo de microalgas
pode ser obtido de plantas industriais, com a linha de gás de combustão sendo
desviada para o meio de cultivo aquoso (CHEAH et al., 2014). Essas alternativas
minimizam os custos com nutrientes para o meio de cultivo e auxiliam no tratamento
de efluentes industriais e na captação de CO2 que seria liberado para o ambiente.
A ideia de utilizar microalgas como matéria-prima energética existe desde o
final da década de 1950, ganhando destaque a partir dos anos 1970 com as crises
do petróleo (CHEN et al., 2009). De 1978 a 1996, o departamento de energia dos
20
EUA (DOE) investiu US$25 milhões em um programa do NREL (National Renewable
Energy Laboratory) de pesquisas para combustíveis a partir de algas, o que permitiu
grandes avanços no conhecimento acerca de microalgas (SHEEHAN et al., 1998).
O cultivo de microalgas com fins comerciais já vendo sendo realizado há
décadas, com destaque para a Ásia e a América do Norte. Apesar das vantagens, o
processo de produção de microalgas em escala industrial atualmente só é
economicamente competitivo se direcionado para produtos de alto valor agregado.
Tal constatação reforça a necessidade do modelo de biorrefinaria para o uso dessa
biomassa como fonte de matéria-prima para produção de commodities (WIJFFELS e
BARBOSA, 2010).
As pesquisas em todas as etapas de cultivo e processamento de microalgas
têm, ainda, como desafio aumentar os rendimentos com uma concomitante redução
dos custos. No upstream, duas etapas consideradas onerosas são a colheita e a
secagem, necessárias para concentrar a biomassa algal e possibilitar um
downstream mais eficiente. Apesar de algumas estimativas atuais preverem que a
colheita representaria apenas 5-7 % do custo total do processo, esse valor pode
atingir até 23 % para correntes diluídas, como as obtidas em sistemas de cultivo
abertos (RUIZ et al., 2016). Além disso, devido à baixa concentração de biomassa
no meio, os equipamentos de separação devem apresentar uma capacidade de
processamento de altos volumes e/ou vazões, aumentando ainda mais o custo com
instalação e operação. Nesse sentido, uma etapa de floculação associada a uma
posterior centrifugação se apresenta como uma alternativa para redução desses
custos (WIJFFELS e BARBOSA, 2010). Mesmo após a colheita, a biomassa ainda
apresenta uma alta umidade, maior do que 70 % (UDUMAN et al., 2010), e, por isso,
uma etapa de secagem é geralmente necessária para seu processamento posterior.
Devido à natureza complexa da biomassa algal, são necessários diversos
solventes e processos para seu fracionamento completo. Em sua maioria, as
pesquisas abordam a extração de apenas um composto de interesse da biomassa
algal, com destaque para a fração lipídica visando a produção de biodiesel (CHISTI,
2007). Estudos mais recentes consideram também a extração de carotenoides,
pigmentos e ácidos graxos poli-insaturados, entre outros (CHEW et al., 2017). O
processo de extração é realizado, mais comumente, com solventes orgânicos em
geral altamente tóxicos e que vão de encontro aos princípios da química verde.
Nesse contexto, o uso de solventes menos tóxicos e ambientalmente mais
21
amigáveis que sejam eficientes na extração de um ou mais compostos de interesse
poderá contribuir para o desenvolvimento de biorrefinarias de microalgas (JEEVAN
KUMAR et al., 2017).
Além de lipídeos e pigmentos, algumas espécies de microalgas acumulam
altos teores de carboidratos, principalmente na forma de amido intracelular, que
pode ser hidrolisado enzimaticamente para obtenção de um xarope de glicose
(JOHN et al., 2011). A glicose tem inúmeras aplicações em processos químicos e
bioquímicos para geração de moléculas com potencial para substituição de diversos
derivados de petróleo (BOZELL e PETERSEN, 2010). No entanto, tanto a hidrólise
do amido como os processos de extração citados acima são dificultados pela
presença da parede celular em algumas espécies de microalgas, gerando a
necessidade de uma etapa de ruptura dessa estrutura (GÜNERKEN et al., 2015).
Um dos métodos propostos na literatura é a hidrólise enzimática (GERKEN et al.,
2013); porém, devido ao alto custo associado à utilização de enzimas, outros
métodos de ruptura também são estudados, como métodos físicos ou químicos. No
contexto de biorrefinaria, os métodos físicos são mais adequados, pois não afetam a
composição da biomassa algal, enquanto que métodos químicos podem degradar
alguns componentes de interesse industrial (VANTHOOR-KOOPMANS et al., 2013).
Além da dificuldade de acesso a esse amido intracelular, as microalgas, de
um modo geral, apresentam em sua composição baixos teores de amido quando
cultivadas em um meio nutricionalmente balanceado, apresentando altos teores de
proteínas. É necessário que se promova algum fator de estresse, em geral
associado à depleção de um nutriente, para que o mecanismo de acúmulo de amido
seja disparado (DRAGONE et al., 2011). No entanto, essa condição pode acarretar a
redução da produtividade ou da concentração de biomassa. Uma avaliação
consistente de diferentes condições de cultivo torna-se imperativa quando se deseja
obter elevada produtividade de uma corrente concentrada com células ricas em
amido.
Diante deste cenário, neste trabalho foi estudado o acúmulo de amido pela
microalga verde Chlorella sorokiniana (Chlorophyta) de forma a favorecer o acúmulo
de amido intracelular. A recuperação da microalga por floculação e/ou sedimentação
gravitacional foi proposta e o processamento da biomassa para recuperação de
clorofilas, carotenoides e glicose avaliado. Dessa forma, procurou-se integrar estes
processos visando elevados rendimentos associados à preservação das frações
22
proteicas e lipídicas, que podem ser aproveitadas para a formulação de alimentos
funcionais.
23
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 MICROALGAS E O GÊNERO Chlorella
As algas são organismos simples, em sua maioria fotossintéticos, não
apresentando raízes, caules e folhas (ANDERSEN, 2013). São responsáveis por
metade da atividade fotossintética mundial, com grande parte ocorrendo nos
oceanos (FALKOWSKI e RAVEN, 2007). Devido à grande diversidade de espécies,
variando entre microscópicas e macroscópicas, não há um consenso sobre a
definição desse grupo de organismos.
O surgimento de algas eucarióticas está associado a um evento de
endossimbiose entre uma cianobactéria e um organismo eucarioto, motivo pelo qual
o cloroplasto, organela responsável pela fotossíntese, possui seu próprio DNA.
Apesar de amplamente aceita atualmente, essa teoria foi questionada durante
muitas décadas (MARTIN e KOWALLIK, 1999). Seu nascimento data do início do
século XX, após a constatação de que cloroplastos não eram sintetizados de novo,
mas sim se reproduziam por fissão binária, além das evidências de que eles
sobreviviam em células anucleadas e de sua semelhança morfológica com
cianobactérias (MERESCHOKWSKY, 1905). Dessa endossimbiose surgiram três
grupos de algas, chamadas Archaeplastida: Glaucophyta, algas vermelhas
(Rhodophyta) e algas verdes (Chlorophyta e Charophyta) (ADL et al., 2005). As
demais algas surgiram de uma endossimbiose secundária entre um organismo não
fotossintetizante e uma alga vermelha ou verde (KEELING, 2004). A Tabela 1
apresenta os atuais filos em que são encontradas microalgas e suas principais
características.
Microalgas verdes do gênero Chlorella são organismos unicelulares que
possuem um formato esférico, não apresentando flagelos. Pertencem à ordem dos
Chlorelalles, da classe Trebouxiophyceae, filo Chlorophyta. Elas foram inicialmente
descritas por Martinus W. Beyerinck, em 1890, como um gênero contendo quatro
espécies (BEYERINCK, 1890), porém hoje em dia são conhecidas diversas espécies
de algas pertencentes ao gênero, com 43 espécies sendo taxonomicamente aceitas
(GUIRY, 2017). Sua classificação taxonômica é dificultada devido a sua morfologia
simples, sendo alvo de constantes pesquisas (HUSS et al., 1999; BOCK et al.,
2011). Sua reprodução ocorre de forma assexuada, com a formação de autoesporos
(Figura 1), não tendo sido observada nenhuma reprodução sexuada em microalgas
24
desse gênero (YAMAMOTO et al., 2004). Microalgas do gênero Chlorella acumulam
carbono primariamente na forma de amido, que se encontra no interior de seus
cloroplastos (BALL et al., 2011).
Tabela 1. Filos de microalgas e suas principais características (adaptado de KEELING, 2004)
Filo Habitat principal Endossimbiose Pigmentos
Glaucophyta água doce Primária Clorofila a, ficobilinas
Rhodophyta água doce, marinho Primária Clorofila a, ficobilinas
Chlorophyta água doce Primária Clorofilas a e b
Charophyta água doce Primária Clorofilas a e b
Haptophyta marinho Secundária Clorofilas a e c
Dinophyta água doce, marinho Secundária Clorofilas a e c
Euglenophyta água doce Secundária Clorofilas a e b
Cercozoa marinho Secundária Clorofilas a e b
Cryptophyta água doce, marinho Secundária Clorofilas a e c
Stramenopiles água doce, marinho Secundária Clorofilas a e c
Figura 1. Reprodução assexuada de Chlorella vulgaris: a) célula madura, b) divisão celular, c) autoesporo, d) autoesporo eclodido (adaptado de YAMAMOTO et al., 2004)
Chlorella sorokiniana (Figura 2) é uma microalga verde que pode ser cultivada
em água doce ou salina e consome tanto carbono inorgânico, realizando
fotossíntese, quanto carbono orgânico. Devido a essa versatilidade, seu crescimento
em diversos efluentes, industriais ou domésticos, tem sido estudado (KOBAYASHI et
al., 2013; LIZZUL et al., 2014; RAMANNA et al., 2014). Essa espécie foi nomeada
em homenagem a Constantine Sorokin, responsável por seu isolamento,
inicialmente classificando-a como Chlorella pyrenoidosa Chick, linhagem 7-11-05
(SOROKIN, 1959). Essa classificação foi modificada para C. sorokiniana pelo
trabalho de SHIHIRA e KRAUSS (1965). Sua classificação, segundo KESSLER
(1978), se dá devido à presença de atividade de hidrogenase em anaerobiose, à
ausência de produção de carotenoides secundários (não associados à fotossíntese)
em condições de depleção de nitrogênio e ao seu crescimento termotolerante a 38
°C. Após o trabalho de KESSLER e HUSS (1992) de reclassificação de 58 linhagens
25
de Chlorella da coleção de algas da University of Texas (UTEX), 13 linhagens antes
classificadas como C. pyrenoidosa, C. vulgaris e C. ellipsoidea foram reclassificadas
como C. sorokiniana.
2.2 METABOLISMO DE MICROALGAS
As microalgas possuem em sua composição celular cerca de 50 % de
carbono em massa seca, podendo apresentar três tipos de metabolismo quanto à
assimilação desse elemento: (i) autotrófico, utilizando carbono inorgânico como fonte
de carbono na forma de CO2 ou bicarbonato; (ii) heterotrófico, quando na ausência
de luz e na presença de carbono orgânico, como acetato ou açúcares; e (iii)
mixotrófico, utilizando tanto carbono inorgânico quanto orgânico (GROBBELAAR,
2013).
Microalgas que apresentam metabolismos autotróficos e mixotróficos realizam
fotossíntese, rota metabólica pela qual carbono inorgânico, na forma de CO2, e
energia luminosa são convertidos em matéria orgânica. As reações envolvidas na
fotossíntese ocorrem nos cloroplastos (Figura 3). Essas organelas são compostas
por uma fase aquosa, o estroma, e por membranas de lipoproteínas, os tilacoides,
que contém os complexos fotossintéticos (STAEHELIN, 1986).
Figura 2. Microscopia ótica de Chlorella sorokiniana (UTEX 1663) - aumento de 1000x (Fonte: Autoria própria)
Figura 3. Esquema de um cloroplasto (adaptado de FALKOWSKI e RAVEN, 2007)
26
Essa rota metabólica consiste em uma sequência de reações de oxirredução
e pode ser dividida em duas fases: uma luminosa e outra de assimilação de carbono
(Figura 4) (EMERSON e ARNOLD, 1931).
A fase luminosa consiste em uma cadeia fotossintética de transporte de
elétrons, similar à que ocorre nas membranas mitocondriais. Ela ocorre no tilacoide e
usa a energia luminosa para foto-oxidar a água, reduzir o NADP+ e sintetizar ATP.
Oxigênio molecular é o subproduto da reação (FALKOWSKI e RAVEN, 2007).
Para que a fase luminosa ocorra, a energia luminosa deve ser captada por
meio de complexos entre os pigmentos fotossintéticos e proteínas. Esses complexos
formam estruturas embebidas nas membranas tilacoides, chamadas de antenas
(GROSSMAN et al., 1995), que são responsáveis pela captação e a transferência da
energia luminosa para sistemas especializados chamados de fotossistemas. No
fotossistema, existe um par de clorofilas especial, denominado centro de reação,
que recebe a energia das antenas e promove a fotoquímica, iniciando assim a
cadeia de transporte de elétrons fotossintética (KOK e BEINERT, 1962).
Nas algas podem ser encontrados três tipos de pigmentos fotossintéticos:
clorofilas, carotenoides e ficobilinas (BIDIGARE et al., 1990). Existem quatro tipos
distintos de clorofilas (a, b, c e d), porém todas possuem um anel porfirínico
coordenado por um íon de Mg2+, o que lhes confere uma cor esverdeada. Elas
diferem entre si pelas cadeias substituintes do anel porfirínico (Figura 5), o que
resulta em propriedades espectrais distintas (FALKOWSKI e RAVEN, 2007). A
clorofila a está presente em todos os organismos que realizam fotossíntese
oxigênica, enquanto que a presença dos outros tipos de clorofilas está relacionada
ao filo a que o organismo pertence (KEELING, 2004).
Carotenoides apresentam cor amarelo-alaranjada e atuam tanto como
pigmentos acessórios quanto na proteção da célula contra irradiâncias excessivas e
radicais livres (SANDMANN et al., 1993). São produzidos em diferentes
concentrações dependendo da espécie e das condições de cultivo (GUEDES et al.,
2011). Já as ficobilinas são os pigmentos acessórios encontrados apenas em algas
vermelhas e cianobactérias, ampliando o espectro de comprimentos de onda
Figura 4. Fases da fotossíntese com seus principais produtos (adaptado de MASOJÍDEK et al., 2013)
27
passíveis de absorção pela célula além dos já absorvidos pela clorofila a (BEALE,
1993).
As moléculas de NADPH e ATP produzidos na fase luminosa são utilizados
na fase de assimilação como agente redutor e fonte de energia, respectivamente.
Essa fase ocorre no estroma e converte CO2 em carboidratos em uma série de
reações conhecidas como ciclo de Calvin-Benson (CALVIN, 1961). Em ambientes
aquáticos, o suprimento de CO2 para as células se dá através de reações de
equilíbrio entre as concentrações de bicarbonato, carbonato e CO2. No entanto,
mesmo quando bicarbonato é consumido pela célula, ele somente é assimilado na
forma de CO2, a única espécie que reage com a enzima RuBisCO (ribulose-1,5-
bifosfato carboxilase oxigenase (E.C. 4.1.1.39) (COOPER et al., 1969).
Apesar de carboidratos serem considerados os principais produtos da
fotossíntese, moléculas do Ciclo de Calvin-Benson também originam lipídeos (Figura
6), além de aminoácidos e ácidos orgânicos (CALVIN, 1961).
Figura 5. Estrutura da clorofila a e variações nas estruturas das clorofilas b, c e d (adaptado de FALKOWSKI e RAVEN, 2007)
Figura 6. Síntese de amido e triacilglicerídeos (TAG) a partir da fixação de CO2 pelo ciclo de Calvin-Benson. "..." representam etapas não apresentadas na figura. RuBP - ribulose difosfato; G3P - gliceraldeído-3-fosfato; 3PGA - ácido-3-fosfoglicérico (Fonte: elaboração própria)
28
Além de fotossíntese, as microalgas também realizam respiração quando
crescidas tanto heterotroficamente e mixotroficamente quanto autotroficamente
(GEIDER e OSBORNE, 1989). A respiração ocorre sem necessidade de energia
luminosa e, por isso, diferencia-se da fotorrespiração. Nessa segunda rota
metabólica respiratória, carbono orgânico é convertido a CO2 sem nenhum ganho
metabólico. Esse fenômeno ocorre de forma significativa em condições de alta
irradiância, temperatura e alta relação de concentração de O2/CO2, nas quais a
enzima Rubisco passa a atuar como uma oxigenase, catalisando a reação do O2
com a ribulose bifosfato (BAUWE et al., 2012).
A respiração é uma via metabólica que consiste, de forma simplificada, no
consumo de O2 e carbono orgânico e na produção de CO2, de energia na forma de
ATP e de moléculas precursoras para vias anabólicas. Apesar de a fotossíntese
também fornecer moléculas precursoras, somente pela respiração as células são
capazes de sintetizar 2-oxoglutarato, precursora da síntese de glutamato, que é
necessário para a síntese de diversos aminoácidos e das clorofilas. Por essa razão,
a respiração em microalgas ocorre mesmo na presença de luz (LARKUM et al.,
2003).
2.3 EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS DE MICROALGAS
Além de carbono, obtido através das vias metabólicas descritas, outros
nutrientes também são necessários para a promoção do crescimento celular, como
nitrogênio, potássio, magnésio, cálcio, enxofre e fósforo. Íons metálicos são também
necessários para o crescimento celular, porém em quantidades-traço. Dependendo
da exigência da espécie, vitaminas também podem ser necessárias. Um agente
quelante, como o EDTA, normalmente é utilizado visando reduzir ligações
indesejadas entre os diversos íons presentes no meio de cultivo, mantendo-os
solúveis e biodisponíveis. Além disso, cloreto de sódio é utilizado em diferentes
concentrações dependendo do habitat natural da microalga a ser cultivada
(VONSHAK, 1986).
O nitrogênio pode corresponder a mais de 10 % da composição celular,
dependendo da espécie e das condições de cultivo (KUMAR et al., 2014), fazendo
parte principalmente das moléculas proteicas da célula. O nitrogênio geralmente é
fornecido na forma de nitrato; no entanto, compostos orgânicos como ureia e
29
amônia, que possuem maior disponibilidade do que o nitrato, também podem ser
usados (SOLETTO et al., 2005; ARUMUGAM et al., 2013).
O fósforo é um nutriente essencial para o crescimento celular, apesar de estar
presente na biomassa em teores próximos a 1 % (HAAS e RUSSELL-WELLS,
1935). Ele atua nas reações de transferência de energia, na síntese de ácidos
nucleicos, DNA e outras moléculas importantes (RAGHOTHAMA, 1999). As
microalgas assimilam fósforo na forma de fosfato e, segundo resultados
preliminares, não são capazes de assimilá-lo em sua forma reduzida (LOERA-
QUEZADA et al., 2015).
O cálcio participa na assimilação de nitrato por microalgas do gênero
Chlorella e Scenedesmus (DVORÁKOVÁ-HLADKÁ, 1976) e na assimilação de
fosfato inorgânico por microalgas do gênero Scenedesmus (KYLIN e DAS, 1967). O
cálcio também faz parte do complexo de oxidação da água do fotossistema II (PS II)
(BRUDVIG, 2008).
O magnésio está presente na clorofila, ocupando uma posição central em sua
estrutura, e portanto é essencial para que a célula possa produzir esse composto e
realizar a fotossíntese (FIEDOR et al., 2008).
O ferro é um componente essencial para o metabolismo celular, atuando nos
processos de respiração e fotossíntese como cofator nas cadeias de transporte de
elétrons (BRIAT et al., 2007), além de ser necessário também para a fixação de
nitrogênio (GLASS et al., 2009) e síntese de DNA (ZHANG, 2014).
Elementos-traço como zinco, manganês, molibdênio, cobre, cobalto e boro
são comuns em meios de cultivo de microalgas. Esses elementos atuam
principalmente como cofatores em diversos sistemas. Por exemplo, cobre está
presente em diversas enzimas, como a plastocianina, que atua no sistema de
transporte de elétrons na fotossíntese (FORK e URBACH, 1965), enquanto o
manganês apresenta uma atuação na oxidação da água no processo fotossintético
(RENGER e RENGER, 2008). Apesar de cianobactérias e vegetais superiores
apresentarem boro em sua composição, algas verdes, como as do gênero Chlorella,
aparentam não necessitar da adição desse nutriente em seu meio de cultivo,
apresentando-o em quantidades quase nulas em sua composição (GERLOFF,
1968).
A luz é um fator importante para o crescimento celular de microalgas. Mesmo
na presença de concentrações adequadas de nutrientes, o crescimento celular pode
30
se mostrar limitado se a mesma não estiver disponível nos níveis requeridos
(HARUN et al., 2014). Para um uso eficiente de luz, deve-se buscar uma boa relação
entre turbulência e intensidade luminosa de forma a se minimizar o efeito de
autossombreamento, que ocorre em cultivos muito densos (AGUSTÍ, 1991; LAU et
al., 1995), permitindo dessa forma maximizar a conversão de energia luminosa em
energia bioquímica na forma de proteínas, carboidratos e lipídeos. Esse efeito,
apesar de aparentemente negativo para a cultura, pode colaborar para uma maior
taxa fotossintética quando bem controlado. Em 1954, PHILLIPS JR. e MYERS
concluíram, ao analisar culturas densas de Chlorella, que esse movimento das
células de uma região de baixa intensidade luminosa para uma de alta, resulta em
um maior crescimento celular se realizado em intervalos de 1 a 100 ms. Desde
então, essa observação foi comprovada por diversos outros grupos, que se utilizam
de cultivos densos ou de flashes de luz para simular essa condição. Para que esse
estímulo seja efetivo, as células devem permanecer no escuro um período dez
vezes maior do que o de exposição à luz (RICHMOND, 2013).
2.4 COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DE MICROALGAS
2.4.1 Parede celular
Paredes celulares estão presentes na maioria dos reinos, fazendo parte da
estrutura celular de plantas, fungos, bactérias e algas (BOWMAN e FREE, 2006;
SALTON e HORNE, 1951; VARNER et al., 1989). Sua composição varia tanto entre
reinos quanto espécies e até mesmo em uma mesma espécie em diferentes
estágios de desenvolvimento (GUNNISON e ALEXANDER, 1975; LOOS e MEINDL,
1982).
As microalgas apresentam uma grande diversidade de paredes celulares,
incluindo espécies que não possuem essa estrutura (OREN, 2005). Algumas
espécies apresentam paredes com escamas de sílica (KRÖGER e POULSEN, 2008)
ou carbonato de cálcio (BOROWITZKA et al., 1974), enquanto que as algas verdes
apresentam paredes compostas por açúcares, como glucanas, pectinas ou
glicoproteínas, variando com a espécie (DOMOZYCH et al., 2012). Diversas algas
apresentam também em sua parede celular uma camada externa de algenana, um
biopolímero resistente à ação química e enzimática (ATKINSON et al., 1972). Essa
molécula é definida como um polímero alifático, não-hidrolisável, composto por
31
ácidos graxos mono ou di-insaturados em cadeias com cerca de 30 monômeros
conectados por ligações éter e éster que conferem sua recalcitrância (BLOKKER et
al., 1998), apesar de cadeias com maior número de monômeros terem sido descritas
(ALLARD et al., 2002).
A parede celular de algas do gênero Chlorella é composta por uma matriz
polissacarídica fibrilar, contendo diversos monômeros como glicose, galactose,
rhamnose, arabinose e manose, e por uma estrutura chamada parede celular rígida
(NORTHCOTE et al., 1958; TAKEDA, 1991). Segundo um amplo estudo realizado
por TAKEDA (1991), espécies de algas do gênero Chlorella podem apresentar dois
tipos dessa estrutura: uma composta principalmente por glucana e manana e outra
apresentando glucosamina como o principal constituinte. No entanto, esse estudo
apenas reporta a presença de glucana na parede celular rígida, sem avaliar se esta
estaria na forma de celulose, além de reportar que a presença de glucana não pode
ser generalizada para todas as espécies desse gênero. Apesar disso, a celulose é
comumente reportada como constituinte da parede celular rígida de espécies de
Chlorella (AGUIRRE e BASSI, 2013; CHEN et al., 2016; YIN et al., 2010).
Um estudo posterior continuou a investigação da parede celular de algas do
gênero Chlorella e propôs uma redivisão desse gênero, classificando como espécies
de Chlorella verdadeiras ("true-Chlorella") as que apresentam parede celular de
glucosamina, grupo no qual C. sorokiniana foi incluída, enquanto as outras espécies
seriam classificadas como semelhantes a Chlorella ("Chlorella-like") (HUSS et al.,
1999). Em 2010, o sequenciamento do genoma de uma espécie de Chlorella
verdadeira, Chlorella variabilis, confirmou a ausência de proteínas responsáveis pela
síntese de celulose (BLANC et al., 2010). Foram encontradas proteínas que atuam
na síntese de quitina e quitosana, polímeros de glucosamina, assim como proteínas
responsáveis por sua degradação (quitinases e quitosanases), que estariam
possivelmente relacionadas à quebra da parede celular durante a reprodução. Um
polímero similar à quitina já havia sido reportado em uma espécie de Chlorella em
1995 (KAPAUN e REISSER, 1995).
2.4.2 Componentes intracelulares
As microalgas são principalmente compostas por proteínas, lipídeos e
carboidratos. A proporção entre essas macromoléculas está sujeita a variações,
32
possibilitando que a composição celular de microalgas seja modulada pela alteração
das condições de cultivo e na composição do meio.
Uma microalga em sua fase exponencial e em condições usuais de
crescimento geralmente apresenta alto conteúdo proteico, de cerca de 40-50 % em
base seca (PARSONS et al., 1961). No entanto, polissacarídeos e lipídeos são
acumulados em condições subótimas de multiplicação celular, como depleção de
nitrogênio, fósforo ou enxofre no meio de cultivo (BRÁNYIKOVÁ et al., 2011;
TAKESHITA et al., 2014; LI et al., 2015). Em concentrações baixas de nitrogênio, as
células mantêm sua capacidade fotossintética, porém com taxas reduzidas, e o
carbono fixado é redirecionado da síntese proteica para a síntese dessas reservas
de carbono (LI et al., 2011). Nessas condições, também se observa uma redução do
teor celular de clorofila e um aumento de carotenoides secundários (MINHAS et al.,
2016) .
As microalgas que são capazes de acumular tanto amido quanto lipídeos em
condição de depleção nutricional, como as pertencentes ao gênero Chlorella,
geralmente acumulam amido como reserva de curto a médio prazo, com alteração
do metabolismo para acúmulo de lipídeos como reserva de longo prazo se a
situação de estresse for prolongada (LI et al., 2015). O acúmulo de amido é
realizado com menor gasto energético do que o acúmulo de lipídeos; no entanto, a
energia liberada pelo catabolismo de lipídeos é maior do que a liberada pela
degradação de amido (SUBRAMANIAN et al., 2013). Algumas espécies mutantes,
em que a via metabólica de produção de amido foi inibida, apresentaram maior
acúmulo de lipídeos do que as linhagens selvagens em condições de depleção de
nitrogênio, confirmando que ambas moléculas tem a mesma função de reserva de
carbono e energia (RAMAZANOV e RAMAZANOV, 2006; LI et al., 2010). No
entanto, a supressão da síntese de amido nem sempre resulta em um maior
acúmulo de lipídeos, indicando que o mecanismo de partição de carbono em
microalgas segue rotas mais complexas (SIAUT et al., 2011).
Quando expostas a altas intensidades luminosas, as células reduzem seu
conteúdo de clorofila a e outros pigmentos de captação luminosa, enquanto
aumentam seu teor de carotenoides secundários, que atuam como protetores contra
o estresse oxidativo; o contrário é verdadeiro para situações de baixa irradiância
luminosa (MACINTYRE et al., 2002; SEYFABADI et al., 2011). O conteúdo de amido
e de lipídeos também tende a aumentar com o aumento da intensidade luminosa
33
(FRIEDMAN et al., 1991; SEYFABADI et al., 2011). No entanto, alguns lipídeos
específicos, como ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), geralmente aumentam
com o decréscimo da intensidade luminosa por estarem associados aos tilacóides,
que aumentam de número de forma a equilibrar a eficiência fotossintética em
ambientes com luz reduzida (GUEDES et al., 2010; SEYFABADI et al., 2011).
Em relação à temperatura, sua redução leva a uma mudança no perfil lipídico
e não na quantidade de lipídeos, aumentando o número de insaturações dos
lipídeos de membrana de forma a torná-las mais fluidas e estáveis nas baixas
temperaturas (NISHIDA e MURATA, 1996). Já o teor de carotenoides tende a ser
maior com o aumento da temperatura, tanto por uma elevação nas taxas de reação
enzimáticas que levam à sua síntese (LIU e LEE, 2000) quanto por uma ampliação
da produção de radicais livres, o que induziria a síntese de carotenoides como
antioxidantes (TJAHJONO et al.,1994).
Condições de estresse, em geral, acabam por afetar de forma negativa a
geração de biomassa microbiana, apesar de gerar o acúmulo de moléculas de
interesse. Assim, são necessários estudos que avaliem ambos os fatores de forma a
se chegar a condições de cultivo favoráveis ao acúmulo da molécula-alvo sem
redução expressiva no crescimento celular.
2.5 SISTEMAS DE CULTIVO DE MICROALGAS
O cultivo em larga escala de microalgas já é feito há algumas décadas em
tanques abertos (open ponds), que apresentam um baixo custo de instalação e
operação, porém apresentam baixas concentrações finais de biomassa
(BOROWITZKA, 1999). Com o objetivo de produzir microalgas para a obtenção de
novos produtos, inclusive commodities, diversos estudos têm sido conduzidos para
determinar qual o melhor sistema de cultivo a ser adotado, aberto ou fechado
(JORQUERA et al., 2010; DAVIS et al., 2011; RICHARDSON et al., 2012). A Tabela
2 apresenta as principais características de ambos os sistemas de cultivo.
Os sistemas abertos recebem iluminação direta do sol, enquanto os
fotobiorreatores podem ser colocados ao ar livre para aproveitar a iluminação natural
ou podem ser iluminados artificialmente com controle dessa variável de processo.
34
Tabela 2. Principais características de sistemas abertos e fechados de cultivo de microalgas (adaptado de GROBBELAAR, 2009)
Parâmetro Sistemas abertos Sistemas fechados
Risco de contaminação Alto Baixo
Perda de água Alta Baixa
Perda de CO2 Alta Praticamente nula
Controle de processo Complicado Menos complicado
Dependência do clima Alta Variável
Manutenção Fácil Difícil
Custos de construção Baixos Altos
Concentração final de biomassa Baixa Alta
Problema de superaquecimento Baixo Alto
Concentração de O2 dissolvido Baixa Alta
Existem alguns tipos de tanques abertos, sendo os raceways os mais
comumente utilizados para cultivo comercial de microalgas (BOROWITZKA, 1999).
Esses tanques são rasos de forma a permitir uma boa iluminação em toda sua
extensão e são caracterizados pela presença de um agitador que faz com que a
água percorra um circuito (CHISTI, 2016), conforme ilustrado na Figura 7.
Uma das principais desvantagens de sistemas abertos é a contaminação por
microrganismos que podem competir com a microalga pelos nutrientes
(BOROWITZKA, 1999). Espécies que crescem em ambientes com condições mais
drásticas, como Spirulina em ambientes alcalinos ou Dunaliella salina em alta
salinidade, são mais indicadas para esses sistemas, apesar de espécies sem essas
peculiaridades já terem sido cultivadas em sistemas abertos sem problemas de
contaminação significativos (ANSELL et al., 1963; MOHEIMANI e BOROWITZKA,
2006). Outras desvantagens consistem na dificuldade de se manter condições
Figura 7. Esquema de um lago raceway (adaptado de BAHADAR e BILAL KHAN, 2013)
35
constantes de cultivo e o alto custo com a etapa de colheita devido à baixa
concentração final de biomassa (CARVALHO et al., 2006).
Os sistemas fechados são geralmente fotobiorreatores compostos por placas
ou tubos de material transparente organizados de forma horizontal ou vertical
(CARVALHO et al., 2006), havendo também configurações de cultivo em galões ou
em bolsas de plástico (BOROWITZKA, 1999). Os fotobiorreatores apresentam
diversas vantagens como alta produtividade e alta concentração final de biomassa
(DAVIS et al., 2011), alta razão superfície/volume e menor risco de contaminação,
além de permitirem um maior controle das variáveis do sistema (CARVALHO et al.,
2006).
Dentre as diversas configurações possíveis, os mais comuns são os reatores
tubulares e os de placas (BOROWITZKA, 1999). Os reatores tubulares são formados
por tubos paralelos, posicionados verticalmente ou horizontalmente (Figura 8), feitos
de material transparente de forma a maximizar a penetração de luz. Outro design
possível é o helicoidal, que maximiza a penetração de luz, permite um melhor
controle de temperatura e promove uma melhor transferência de CO2 para o meio de
cultivo (MORITA et al., 2002).
Já os reatores de placas possibilitam uma grande área superficial para
iluminação e possuem um design simples (Figura 9). Sua inclinação também pode
ser ajustada de forma a aproveitar ao máximo a luz solar (CARVALHO et al., 2006).
Figura 8. Representação esquemática de um reator tubular vertical (a) e horizontal (b) (adaptado de (UGWU e AOYAGI, 2012)
36
Além dos reatores de tubos e placas, uma configuração que vem sendo
estudada é a de reatores de biofilme, em que as células são cultivadas em um meio
sólido ou microporoso (Figura 10). Esse modo de cultivo foi utilizado nos primeiros
cultivos de microalga no século XIX e, apesar de abandonado com os avanços dos
cultivos em suspensão, alguns grupos atualmente propõe a volta dessa configuração
de forma a se obter maiores densidades celulares em menores volumes de cultivo
(PODOLA et al., 2017; BLANKEN et al., 2017).
Existem também sistemas híbridos em estudo, como por exemplo o da
companhia americana Green Star Products, que combinou um sistema fechado com
um tanque aberto, permitindo a manutenção da temperatura do sistema mesmo com
baixas temperaturas externas (CHEN et al., 2009).
De um modo geral, pode-se dizer que não existe uma configuração de
fotobiorreator ideal; essa depende da espécie a ser cultivada e do produto de
interesse. No entanto, existem alguns parâmetros comuns a todas as configurações
de forma a se obter o máximo de produtividade: promover uma mistura adequada;
promover uma transferência de massa eficiente de forma a manter o suprimento de
CO2 e minimizar o acúmulo de O2 no sistema; apresentar uma alta razão
superfície/volume; operar em uma temperatura próxima da ótima para a espécie
Figura 9. Representação de um fotobiorreator de placas (adaptado de CARVALHO et al., 2006)
Figura 10. Representação de reatores de biofilme com suporte sólido (a), em que a fase aquosa está em contato direto com as células, e com suporte microporoso (b), em que a fase aquosa entra em contato com as células apenas por difusão (adaptado de PODOLA et al., 2017)
37
cultivada; e apresentar uma inclinação adequada de forma a maximizar a eficiência
fotossintética (ZITTELLI et al., 2013). Os gargalos nesse setor são o custo de
instalação e os custos de operação dos reatores (RICHARDSON et al., 2012). O
principal desafio consiste em reduzir drasticamente o consumo de energia com
iluminação, em caso de luz artificial, com manutenção da temperatura e com trocas
gasosas. O escalonamento de grande parte das configurações existentes
atualmente também é uma dificuldade (BOROWITZKA, 1999).
2.6 PROCESSAMENTO DE MICROALGAS
O processamento de microalgas após o cultivo consiste basicamente de três
etapas: colheita, em que há o aumento da concentração celular; secagem, em que
há redução da umidade da biomassa; e downstream, que pode consistir de um ou
mais processos de beneficiamento e/ou fracionamento da biomassa e geralmente
envolve uma etapa de ruptura celular. A seguir essas etapas são descritas em mais
detalhes.
2.6.1 Colheita
A concentração de biomassa de microalgas ao final do cultivo em sistemas
concentrados apresenta um valor entre 0,02 % e 0,06 % (m/v) (UDUMAN et al.,
2010). Portanto, a microalga deve ser colhida de seu meio de cultivo e concentrada
de forma a reduzir a quantidade de água presente, facilitando o processamento
posterior. A colheita é dificultada pelo pequeno tamanho celular das microalgas, sua
baixa velocidade de sedimentação e a baixa concentração celular no meio de
cultivo. Existem diversas técnicas de colheita de microalgas, porém esse processo
ainda está em fase de estudo e otimização de forma a minimizar seu custo,
possibilitando a obtenção de commodities a partir de microalga (BARROS et al.,
2015).
A colheita por filtração apresenta vantagens como facilidade de
escalonamento, reduzido gasto energético e ausência de aditivos químicos
(GERARDO et al., 2014). No entanto, a necessidade de troca constante da
membrana devido a incrustações torna a filtração menos competitiva (WEI et al.,
2014). A redução do fluxo pela membrana e o aumento da resistência não ocorrem
somente devido à formação de torta na superfície da membrana, mas também pelo
entupimento dos poros por bactérias e pedaços de células (RICKMAN et al., 2012).
38
Opções para redução desse fenômeno são retrolavagem (CHEN et al., 2012),
aumento do tamanho dos poros (RICKMAN et al., 2012), vibração magnética (BILAD
et al., 2012) e borbulhamento de ar (WICAKSANA et al., 2012), dentre outros.
O método mais comum de colheita é a centrifugação, empregado tanto em
escala laboratorial quanto industrial. No entanto, devido ao seu elevado gasto
energético, esse método só é viável para obtenção de produtos de alto valor
agregado (PIENKOS e DARZINS, 2009). Para produção de commodities, a
centrifugação pode ser associada a um processo de pré-concentração por flotação
ou por floculação e sedimentação, por exemplo, reduzindo o volume a ser
centrifugado e, portanto, os custos de instalação e operacionais com essa etapa
(SCHLESINGER et al., 2012).
Na flotação, as células das microalgas são impulsionadas para cima por
bolhas de ar ou de gás. Devido ao pequeno diâmetro das microalgas, esse processo
é efetivo para a colheita de apenas algumas espécies e, em geral, precisa ser
associado à adição de floculantes para aumentar o tamanho de partícula e a eficácia
do método (HANOTU; BANDULASENA; ZIMMERMAN, 2012)
Algumas espécies de microalgas são passíveis de sedimentação gravitacional
devido a sua alta densidade (HASSANPOUR et al., 2015). Esse processo é muito
eficiente em termos de consumo energético, porém muito lento e aplicável a poucas
espécies. No entanto, a sedimentação pode ser acelerada quando associada a uma
etapa de floculação, que induz uma aglomeração da biomassa, formando flocos que
são mais facilmente separados (TEIXEIRA et al., 2012). Esse método de colheita
tem ganhado atenção pela sua facilidade e baixo custo, podendo ser realizada pela
adição de polímeros floculantes, pela modificação do pH do meio (PÉREZ et al.,
2017), pela adição de eletrólitos (DAS et al., 2016) ou pelo co-cultivo de microalgas
com outros microrganismos como fungos filamentosos (ZAMALLOA et al., 2017).
Na sedimentação natural de microalgas, duas forças opostas atuam: (i) forças
repulsivas, uma vez que as microalgas possuem cargas superficiais negativas, que
dificultam sua agregação quando as células estão distantes; e (ii) forças atrativas de
Van de Waals, que prevalecem em pequenas distâncias, atraindo as células umas
às outras (MOLINA GRIMA et al., 2013). A carga superficial negativa de microalgas
deve-se à presença de grupos carboxílicos na superfície celular, que se apresentam
dissociados e, portanto, com carga negativa em pHs acima de 4-5 (ZAMALLOA et
al., 2017). Os agentes floculantes ou os eletrólitos neutralizam essas cargas
39
superficiais negativas, facilitando a aglomeração. Estes podem também criar
ligações ("pontes") entre si (Figura 11), juntando as partículas às quais estão
aderidos (VANDAMME et al., 2013)
Os eletrólitos mais usados são sais de alumínio ou ferro, apresentando
eficiências de recuperação variáveis dependendo da espécie estudada (BARROS et
al., 2015; ŞIRIN et al., 2012). No entanto, por se tratar de metais que ficarão retidos
na biomassa floculada, esse tipo de floculante não é recomendado, mesmo que em
concentrações baixas, para uso em colheita de microalgas para produção de ração
animal ou para consumo humano. Além disso, já foi demonstrado que, ao se utilizar
sais de alumínio, não é possível reciclar a água para um novo cultivo, uma vez que
essa se torna tóxica para as microalgas (FAROOQ et al., 2015).
Nesse sentido, os floculantes poliméricos são mais promissores, como amido
catiônico (VANDAMME et al., 2010) e quitosana (RASHID et al., 2013). A quitosana
apresenta alta eficiência de recuperação e não contamina a biomassa; no entanto,
seu preço é impeditivo para aplicação em larga escala. Já o amido catiônico
apresenta um preço menor, porém possui uma menor eficiência, necessitando de
uma maior dosagem (VANDAMME et al., 2010).
Uma alternativa mais promissora, por se tratar de um floculante natural, é o
uso das sementes de árvores do gênero Moringa, com destaque para Moringa
oleifera. Moringa é uma planta originária do Sul da Ásia, mas que se disseminou por
diversas partes do mundo que apresentam clima tropical, como a América do Sul,
incluindo o Brasil, principalmente na região Nordeste. É uma árvore capaz de
crescer em regiões áridas e é inteiramente comestível (folhas, raízes, flores,
sementes e casca), sendo considerada uma das soluções para alimentação nessas
regiões (BARRETTO et al., 2016). É considerada pela FAO (Organização de
Figura 11. Agente floculante catiônico liga-se às partículas negativamente carregadas e cria "pontes", promovendo sua floculação (Fonte: elaboração própria)
40
Alimentos e Agricultura das Nações Unidas) como uma cultivar importante para
alimentação adulta e infantil, além de reduzir a erosão do solo.
Estudos de tratamento de águas indicaram o pó da semente de moringa como
uma alternativa para locais em que não há estações de tratamento, já que se trata
de uma tecnologia simples, barata e de fácil aplicação (ALI et al., 2009). O
coagulante presente na moringa foi caracterizado como de origem proteica, e sua
ação reside na neutralização das cargas negativas pela ação de peptídeos
catiônicos, permitindo que as moléculas em suspensão se agreguem e sedimentem
(NDABIGENGESERE et al., 1995).
Recentemente, uma proteína de M. oleifera foi isolada e caracterizada como
possuindo atividade coagulante. A Mo-CBP3, uma proteína que se liga à quitina
(Chitin Binding Protein), possui resíduos de arginina nas posições 104, 111 e 116 e
de glutamina nas posições 124, 125 e 126, expostos ao solvente quando em
solução. Esses resíduos também estão presentes em outras proteínas com ação
floculante e, portanto, podem ser responsáveis por essa característica nos
preparados de sementes de M. oleifera (ULLAH et al., 2015). Lectinas, proteínas que
possuem propriedades aglutinantes, também foram isoladas de preparados de
sementes de M. oleifera e colaboram para suas propriedades floculantes (SANTOS
et al., 2009).
Existem poucos estudos investigando a aplicação de derivados de M. oleifera
para a colheita de microalgas. As eficiências de recuperação reportadas são acima
de 80 %, indicando que a semente de moringa é um potencial floculante para este
fim (ABDUL HAMID et al., 2016; TEIXEIRA et al., 2012).
2.6.2 Secagem
Após a etapa de colheita, a microalga ainda apresenta alta umidade, em torno
de 75-85 % (UDUMAN et al., 2010). Apesar de existirem diversos esforços para o
desenvolvimento de processos de extração de compostos de interesse a partir da
biomassa úmida (CHAUDRY et al. , 2015), a maior parte das tecnologias
empregadas utiliza a biomassa de microalgas após uma etapa de secagem. A
Tabela 3 apresenta diversos métodos de secagem já avaliados para microalgas com
suas vantagens e limitações.
41
Tabela 3. Método de secagem de algas (adaptado de BECKER, 1994 apud CHEN et al., 2009)
Método Vantagens Limitações
Tambor rotativo
Rápido e eficiente
Custo alto
Spray-drying
Rápido e eficiente
Custo alto
Secagem ao sol
Baixo custo
Lento, dependente do tempo, possibilidade de fermentação da biomassa
Fluxo cruzado
Mais rápido que secagem ao sol, menor custo que tambor rotativo
Custo alto
Secagem a vácuo
Processo suave, preserva os constituintes celulares
Custo alto, produto se torna higroscópico
Liofilização
Processo suave, preserva os constituintes celulares
Custo alto, lento
A secagem industrial da biomassa de microalgas geralmente é
energeticamente intensiva, utilizando-se de técnicas como spray-drying, liofilização e
secagem a vácuo. A secagem natural, ao sol, é o método mais econômico, porém
apresenta diversas desvantagens como degradação da biomassa devido ao tempo
elevado de processamento e dependência de condições climáticas (MOLINA-GRIMA
et al., 2013).
Existem alternativas à secagem ao sol que visam potencializar o calor
absorvido pelo sistema de secagem pela utilização de materiais como vidro e
poliuretano, promovendo uma elevação de até 40 °C acima da temperatura
ambiente (PRAKASH et al., 1997). Um outro método muito utilizado é a secagem por
convecção, em que uma corrente de ar quente é utilizada para reduzir a umidade da
biomassa. Para ambos os métodos, a temperatura de secagem deve ser ajustada de
forma a se minimizar a degradação de componentes celulares como lipídeos
(OLIVEIRA et al., 2010).
Apesar de a secagem contribuir em grande parte para os custos de produção
de microalgas (SHARMA et al., 2013), não são muitos os trabalhos publicados nessa
área e ainda não se chegou a uma conclusão acerca do melhor método de secagem
que possua um custo baixo com elevada manutenção da integridade da composição
celular.
42
2.6.3 Rompimento celular
Para recuperação de compostos intracelulares, como lipídeos, pigmentos e
carboidratos, de microalgas com parede celular é necessária uma primeira etapa de
rompimento dessa estrutura de forma a permitir o acesso a esses componentes. No
entanto, não há um método de rompimento celular que seja igualmente eficaz para
todas as microalgas, já que a composição da parede celular varia de acordo com a
espécie (DOMOZYCH et al., 2012).
Diversos mecanismos foram propostos para ruptura celular de microalgas,
como tratamento ácido, alta pressão (OLMSTEAD et al., 2013), micro-ondas,
moagem, autoclavagem, choque osmótico e sonicação (LEE et al., 2010), dentre
outros.
Os métodos físicos são os mais interessantes por não contaminarem nem
degradarem o conteúdo interno da microalga (VANTHOOR-KOOPMANS et al.,
2013), ao contrário dos métodos químicos; porém costumam ser energeticamente
custosos. Outra alternativa promissora é a hidrólise enzimática pelo uso de
hidrolases e/ou proteases que, apesar do alto custo das enzimas, tem a vantagem
de ser altamente específica (GERKEN et al., 2013). A seguir são descritos os
métodos mais comumente utilizados no processamento de microalgas.
2.6.3.1 Homogeneização a alta pressão
A homogeneização a alta pressão consiste na circulação de uma suspensão
de células que é forçada, por bombeamento, através do orifício da válvula, colidindo
com a parede do anel de impacto, conforme ilustrado na Figura 12. O rompimento
celular ocorre por diversos mecanismos que ainda estão sendo elucidados, como
turbulência, atrito (MILLER et al., 2002), impacto (KELLY e MUSKE, 2004) e
cavitação (CLARKE et al., 2010).
Estudos econômicos levam a crer que esse processo só seria viável para
suspensões concentradas de algas (YAP et al., 2015). Dependendo do composto de
interesse, um custo adicional é o de resfriamento, pois, a cada passagem pela
válvula, a temperatura do meio sobe cerca de 2 °C para cada 10 MPa aplicados, o
que poderia causar a decomposição de compostos termossensíveis (LEE et al.,
2012).
43
2.6.3.1 Ultrassom
O princípio de ação do ultrassom consiste em ciclos de alta e baixa pressão,
dando origem a bolhas de vácuo que colidem com a biomassa e resultando em um
fenômeno chamado de cavitação, que acaba por romper a parede celular da
microalga (GREENLY e TESTER, 2015). Existem dois tipos básicos de ultrassom: a
ponteira e o banho. É possível adicionar materiais particulados, como pérolas, para
aumentar a eficiência da ruptura das células (KING, 2014). A associação com
solventes também é possível, permitindo uma ruptura da parede celular juntamente
com a transferência de compostos intracelulares para o meio extracelular
(PARNIAKOV et al., 2015).
Como a energia do ultrassom se dissipa rapidamente em áreas longe da
fonte, existem limitações para o tamanho dos reatores de ultrassom. Como as ondas
de ultrassom são criadas por um transdutor localizado no fundo do banho, é possível
utilizar vários transdutores em células diferentes para ampliação de escala do
equipamento (PANIWNYK et al., 2009). Apesar de escalonável, há evidências que o
ultrassom não é eficaz para determinadas espécies (HALIM et al., 2012).
2.6.3.2 Moagem
A moagem de microalgas normalmente é realizada em moinho de pérolas,
que rompe as células pelo impacto dessas com as pérolas de moagem (POSTMA et
al., 2016). O contato das células com as pérolas é promovido por um agitador
rotatório dentro do vaso contendo a suspensão de células e pérolas. Após a
Figura 12. Design típico de uma válvula de homogeneização a alta pressão (Fonte: http://www.substech.com)
44
agitação, as pérolas podem ser separadas por sedimentação (DOUCHA e
LÍVANSKÝ, 2008). Parâmetros importantes do processo são tamanho e material das
pérolas, tempo de residência e características da suspensão de células, como
concentração e viscosidade (DOUCHA e LIVANSKY, 2008).
Esse método é considerado energeticamente intensivo. No entanto, uma nova
configuração de moinho para ruptura celular de microalgas foi proposta por
BALASUNDARAM et al. (2012) de forma a reduzir o gasto energético da operação.
O equipamento utilizado foi um moinho de bolas, ou seja, sem o agitador rotatório
comum aos moinhos de pérolas, sendo agitado por rolamentos localizados na parte
inferior de uma câmara cilíndrica. Essa configuração levou a um aumento de
temperatura de apenas 6 °C após 2 horas de uso e um consumo de 1,87 kWh/ kg de
biomassa seca processada, pelo menos duas vezes menor do que os reportados
para outros métodos físicos de ruptura celular.
Outro moinho de bolas com menor gasto energético também foi proposto por
(KOBAYASHI e ITAYA, 2015). Apesar de esse moinho ter sido avaliado para
moagem de material lignocelulósico, a nova configuração apresentou um gasto
energético muito inferior, de 0,4 kWh/kg de biomassa processada, reforçando a ideia
de que novas configurações de moinhos podem vir a superar o problema de alto
consumo de energia associado a esses equipamentos.
2.6.3.3 Hidrólise enzimática
A hidrólise enzimática da parede celular das microalgas é uma alternativa
interessante para o rompimento celular devido à alta especificidade das enzimas,
não causando a degradação de produtos intracelulares. Além disso, é um processo
que necessita de condições brandas e apresenta baixo consumo energético sem
geração de resíduos. No entanto, o alto custo das enzimas pode ser uma barreira
para sua utilização em escala industrial para produção de commodities (KLEIN-
MARCUSCHAMER et al., 2012). É necessário também um estudo prévio da
composição da parede celular de forma a escolher a mistura enzimática mais
adequada para cada microalga (GERKEN et al., 2013).
CHOI et al. (2010) reportaram o rompimento da parede celular de
Chlamydomonas reinhardtii por tratamento com α-amilase comercial rica em
proteases, uma vez que a parede celular dessa microalga é composta por
glicoproteínas. Outro estudo conduzido com várias enzimas concluiu que a parede
45
celular de C. vulgaris foi suscetível à ação de quitinase, lisozima, pectinase e
pectiolase (GERKEN et al., 2013).
Além do uso de enzimas comerciais, outra abordagem que tem sido utilizada
é a co-cultura de microalgas com bactérias ou vírus que produzem enzimas capazes
de degradar sua parede celular. CHEN et al. (2013), ao utilizarem o preparado
enzimático secretado pela bactéria Flammeovirga yaeyamensis co-cultivada com a
microalga C. vulgaris, aumentaram em quase 100 % o rendimento de extração de
lipídeos da microalga hidrolisada. Outro estudo utilizou infecção por vírus como
estratégia para aumentar o rendimento de hidrólise do amido de Chlorella variabilis
em 80 % (CHENG et al., 2013).
Uma alternativa que ainda está em fase preliminar de estudos é o uso de
enzimas da própria alga em um processo denominado autólise, que ocorre
naturalmente durante o processo de divisão celular. Algumas enzimas envolvidas
nesse processo já foram identificadas; no entanto, os únicos trabalhos de indução de
autólise em algas foram realizados com o objetivo de mitigar os fenômenos de maré
vermelha e superproliferação (DEMUEZ et al., 2015).
2.7 BIORREFINARIA DE MICROALGAS
Atualmente existem diversas empresas visando a obtenção de commodities a
partir de microalgas. No entanto, essas empresas, em sua maioria, iniciam suas
atividades com a produção de compostos de alto valor agregado de forma a garantir
a segurança econômica de seu negócio. Uma relação dessas empresas e de seus
produtos pode ser encontrada na Tabela 4.
Essa tendência observada confirma a ideia de que, de forma a se sustentar a
obtenção de combustíveis e commodities a partir de microalgas, é necessário que se
utilize a abordagem das biorrefinarias, que possibilitam a obtenção de diversos
produtos a partir de uma mesma matéria-prima. Esse modelo permite a produção de
moléculas de alto valor agregado juntamente com commodities, tornando o processo
mais economicamente atrativo, além de valorizar o aproveitamento total da
biomassa, reduzindo ou eliminando totalmente a produção de resíduos.
Dentre os diversos produtos que podem ser obtidos a partir de microalgas,
destacam-se proteínas para suplemento alimentar ou ração animal, lipídeos para
produção de biodiesel ou obtenção de PUFAs e pigmentos e carboidratos para
bioetanol.
46
Tabela 4. Lista de empresas de produção de commodities a partir de microalgas (elaboração própria)
Empresa Produtos País Site
A2BE Carbon Capture Biocombustíveis, alimentos e fertilizantes EUA http://www.algaeatwork.com/
AlgaEnergy Ração, fertilizantes, suplementos alimentares, cosméticos e
biocombustíveis
Espanha http://www.algaenergy.es/
Algaen Corporation Biocombustíveis, suplementos alimentares e bioprodutos
EUA http://algaen.com/
Algae Systems Bio-óleo e fertilizantes EUA http://algaesystems.com/
Algae.Tec Nutracêuticos, biocombustíveis e ração Austrália http://algaetec.com.au/
Algenol Biofuels Pigmentos, fertilizante, etanol e bio-óleo EUA http://algenol.com/
Aquatic Energy Biodiesel, gasolina, plásticos e bioprodutos
EUA http://www.aquaticenergy.com
BFS Biopetróleo Bio-óleo e PUFAs Espanha http://www.biopetroleo.com/
Cellana Suplemento alimentar, ração, biocombustível e PUFAs
EUA http://cellana.com/
Genifuel* Bio-óleo EUA http://www.genifuel.com/
Muradel* Bio-óleo, oleoquímicos, fertilizantes e ração
Austrália http://www.muradel.com/
Photon 8 Biocombustíveis, PUFAs e ração EUA http://www.photon8.com/
Sapphire Energy Biocombustíveis, PUFAs e ração EUA http://www.sapphireenergy.com/
Solarvest BioEnergy Biohidrogênio, PUFAs e proteína Canadá http://solarvest.ca/
* empresas que usam outras matérias-primas além de microalgas
47
2.7.1 Proteínas
As microalgas são excelentes fontes de proteínas, não só pela quantidade,
que pode chegar a 70 % de seu peso seco, mas também pela qualidade.
Microalgas, de um modo geral, possuem em sua composição todos os aminoácidos
essenciais para a alimentação humana (BECKER, 2007).
Apesar dessas características, a entrada da proteína de microalgas no
mercado enfrenta dificuldades devido à sua cor verde e ao sabor forte de algumas
espécies. Uma alternativa é o uso de hidrolisados de proteínas para adição em
alimentos (KOSE e ONCEL, 2015). Portanto, o emprego dessa fonte de proteína na
alimentação humana ainda precisa ser melhor estudado. No entanto, o uso de
microalgas em alimentação animal não enfrenta essas barreiras, e já existem
diversos estudos comprovando benefícios desse uso (Becker, 2013; YAAKOB et al.,
2014).
2.7.2 Lipídeos
Com a crise do petróleo, foram realizados investimentos em pesquisas para
obtenção de biocombustíveis a partir de microalgas, com destaque para o biodiesel.
Certas espécies de microalgas, quando cultivadas sob estresse, exibem conteúdo
lipídico acima de 30 % (m/m seca) que, ao ser recuperado, pode ser utilizado na
produção de biodiesel por transesterificação (MATA et al., 2010).
Um dos fatores que despertaram grande interesse pelas microalgas é seu alto
rendimento de óleo por área cultivada. A Tabela 5 compara o rendimento de
microalgas com os rendimentos obtidos com oleaginosas utilizadas tradicionalmente
na produção de biodiesel. Com base nesses dados, pode-se calcular que as
microalgas têm potencial para produzir mais de 100 vezes a quantidade de óleo
contida na soja por unidade de terra cultivada.
Tabela 5. Rendimento médio de óleo por matéria-prima (adaptado de Chisti, 2007)
* 30 % de óleo na biomassa (peso seco)
Cultura Rendimento de óleo (L.ha-1)
Milho 172 Soja 446
Canola 1190 Jatropha 1892
Coco 2689 Palma 5950
Microalga* 58.700
48
De acordo com (SCHMITZ et al., 2012), a produção de biodiesel de microalga
requer ainda uma redução do custo operacional de cerca de dez vezes. Além disso,
a extração de lipídeos deve ser otimizada, com menor uso de solventes e redução
da extração de impurezas (SCOTT et al., 2010).
As microalgas são também fontes de ácidos graxos de alto valor agregado,
como os PUFAs (polyunsaturated fatty acids) (SPOLAORE et al., 2006). Diversos
PUFAs são considerados essenciais para humanos, precisando ser adquiridos por
meio da alimentação (SIMOPOULOS, 2002). As microalgas sintetizam esses ácidos
graxos, sendo uma fonte alternativa interessante de ácidos eicosapentaenóico (EPA)
e docosahexaenóico (DHA) (MARTINS et al., 2013). Apesar de o mercado de
PUFAs estar em pleno crescimento, os preços dos óleos derivados de microalgas
ainda não são competitivos (BOROWITZKA, 2013). Para consumo humano, uma
alternativa para redução de custos seria o consumo da microalga inteira ou de um
farelo de microalga rico em lipídeos.
2.7.3 Amido
Além de lipídeos, diversas espécies de microalgas podem acumular grandes
quantidades de amido intracelular. Esse amido é uma potencial fonte de glicose que
tem sido proposta para uso na produção de etanol de terceira geração (JOHN et al.,
2011). A glicose pode ser utilizada na produção de diversas moléculas-plataforma
por processos químicos e bioquímicos, dando origem a uma biorrefinaria baseada
em glicose, como esquematizado na Figura 13.
Figura 13. Biorrefinaria baseada em glicose (montada a partir de informações de BOZELL e PETERSEN, 2010 e THE BREW PROJECT, 2006)
O amido é um polímero insolúvel e semi-cristalino de glicose cuja unidade
fundamental é a maltose, um dímero de glicose apresentando ligação α-1,4. Esse
polímero é constituído por duas frações distintas, a amilopectina e a amilose. A
amilose consiste em uma cadeia linear de maltose sem ramificações, enquanto que
49
a amilopectina apresenta também ligações α-1,6, ramificando sua estrutura
(TAKEDA et al., 1987).
As moléculas de amido armazenadas intracelularmente são sempre
encontradas na forma de grânulos (BULÉON et al., 1998), conforme exemplificado
na Figura 14. Esses grânulos são formados principalmente devido à presença de
amilopectina. As cadeias originadas das ramificações se alinham e formam hélices
duplas, dando origem às seções cristalinas das cadeias de amido, que são
insolúveis e responsáveis pelo colapso da estrutura no formato granular. Já as
frações de cadeia próximas aos pontos de ramificação fazem parte das seções
amorfas do polímero (IMBERTY et al., 1991).
Devido a essa natureza cristalina, o amido em sua forma nativa não é
facilmente degradado. No entanto, ao ser aquecido, o amido sofre um processo de
gelatinização (RATNAYAKE e JACKSON, 2008), que resulta na desorganização das
frações cristalinas, e se torna mais suscetível à hidrólise por amilases (DETTORI-
CAMPUS et al., 1992; SLAUGHTER et al., 2001). Diversos fatores determinam a
extensão e a taxa de hidrólise dos grânulos de amido, incluindo o tamanho e a
morfologia do grânulo e a razão de amilose e amilopectina presente (SVIHUS et al.,
2005). Em geral, a hidrólise de amidos ricos em amilopectina é mais rápida do que a
dos ricos em amilose (TESTER et al., 2006).
Para a hidrólise completa do amido, diversas enzimas são necessárias. As
principais são as α-amilases (EC 3.2.1.1), as β-amilases (EC 3.2.1.2) e as
amiloglucosidases (EC 3.2.1.3), que atuam nas ligações α-1,4; a primeira atua
Figura 14. Grânulo de amido com destaque para a formação de duplas hélices nas cadeias de amilopectina (BALL et al., 2011)
50
internamente na despolimerização das cadeias, liberando dextrinas, enquanto que
as outras atuam a partir dos terminais não redutores, liberando maltose e glicose,
respectivamente. Outras enzimas, chamadas isoamilase (EC 3.2.1.68) e pululanase
(EC 3.2.1.41), hidrolisam as ligações α-1,6, atuando nas ramificações e auxiliando a
ação das primeiras.
Na bem estabelecida indústria de etanol de milho, o amido de milho passa por
duas etapas subsequentes de hidrólise enzimática de forma a gerar um xarope de
glicose. A primeira etapa consiste na liquefação, na qual α-amilase comercial de
bactérias termorresistentes do gênero Bacillus é utilizada em temperaturas de 90 a
110 °C; nessa temperatura o amido também é gelatinizado. Em seguida, ocorre a
etapa de sacarificação, com atuação de amiloglucosidases fúngicas a 60-70 °C
(SÁNCHEZ e CARDONA, 2008)
Apesar de esse processo ser bem estabelecido, o mesmo gera altos gastos
energéticos. Uma alternativa é a hidrólise de amido a baixas temperaturas, sem
necessidade prévia de uma etapa de gelatinização. Diversas amilases já foram
descritas como sendo capazes de digerir amido in natura, sem a necessidade dessa
etapa; no entanto, em geral são necessárias maiores quantidades de enzima do que
para a hidrólise do amido gelatinizado (ROBERTSON et al., 2006).
Na indústria de etanol de milho, a hidrólise ácida foi substituída pela hidrólise
enzimática. No entanto, existem diversos grupos que ainda utilizam esse processo
ácido para hidrólise de microalgas, obtendo altos rendimentos (HO et al., 2013a;
MARKOU et al., 2013). A associação de ácido com um processo físico também já foi
testada. O processo de explosão a vapor para a microalga Nannochloropsis
gaditana resultou em uma liberação de 37 % da glicose presente na composição da
microalga. Com a adição de 1,7 % de ácido sulfúrico, esse valor subiu para 65 %
(LORENTE et al., 2015). Processos químicos não são muito indicados para
processamento de microalgas, pois podem acentuar a degradação de compostos
intracelulares, prejudicando a utilização da biomassa extraída em processos
posteriores de valorização da biomassa algal (VANTHOOR-KOOPMANS et al.,
2013).
2.7.4 Clorofilas e carotenoides
Outros produtos de interesse derivados de microalgas são as clorofilas e os
carotenoides. Clorofilas são usadas como pigmentos na indústria alimentícia,
51
principalmente depois que legislações mais rígidas começaram a desencorajar o uso
de corantes sintéticos (DOWNHAM e COLLINS, 2000).
Carotenoides são moléculas com ação antioxidante, sendo importantes
aditivos alimentares para reduzir as reações de oxidação que provocam efeitos
negativos, seja pela degradação de vitaminas e lipídeos, seja pela conferência de
sabores desagradáveis (GUEDES et al., 2011). Assim como com os pigmentos
sintéticos, aditivos alimentares também estão sujeitos a legislações mais rigorosas,
sendo substituídos por alternativas naturais. As microalgas são excelentes fontes de
carotenoides, com algumas espécies, como Dunaliella salina, já sendo produzidas
em escala industrial com esse propósito (ABD EL-BAKY e EL-BAROTY, 2012)..
Essas moléculas também possuem valor nutricional, com diversos carotenoides
sendo precursores de vitamina A (KRINSKY e JOHNSON, 2005).
O processo clássico de extração desses pigmentos é conduzido com
solventes orgânicos, geralmente associado a um processo de rompimento celular
(WILTSHIRE et al., 2000) ou aumento da permeabilidade celular, como micro-ondas
(PASQUET et al., 2011) e ultrassom (SOARES et al., 2016). O metanol e a acetona
são amplamente utilizados nesse processo, com o primeiro apresentando, em geral,
uma capacidade melhor de extração para algas verdes. No entanto, ambos são
solventes tóxicos (RITCHIE, 2006).
Como alternativa à extração com solventes orgânicos, a técnica de extração
com fluidos supercríticos (SFE) é utilizada, com destaque para o uso de CO2
(MACÍAS-SÁNCHEZ et al., 2009). CO2 é escolhido devido a seu baixo custo e ampla
disponibilidade, além de ser razoavelmente inerte e apresentar uma baixa
temperatura crítica de 31,1 °C, com pressão crítica de 7,38 MPa.
A vantagem da SFE é a possibilidade de retirada do solvente pela simples
redução da pressão do sistema, retornando-o à fase gasosa (HERRERO et al.,
2006). Suas principais desvantagens são o alto custo com equipamentos e o alto
gasto energético quando comparado com técnicas tradicionais de extração
(FERREIRA et al., 2013).
A extração convencional com solventes orgânicos permanece como a escolha
industrial; no entanto, preocupações ambientais crescentes e legislações mais
rígidas impõem uma necessidade de mudança desse processo. Portanto, novas
técnicas devem ser estudadas e viabilizadas industrialmente ou solventes
biocompatíveis devem ser introduzidos no processo convencional.
52
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar o acúmulo de amido em uma microalga verde e processá-la por
hidrólise enzimática e extração com etanol, em um contexto de biorrefinaria, para
recuperação de glicose, pigmentos e biomassa seca.
3.2 Objetivos específicos
• Selecionar uma microalga verde capaz de acumular um alto teor de amido
intracelular;
• Validar metodologias de caracterização de carboidratos da microalga
selecionada;
• Estudar as condições de cultivo que estimulam o acúmulo de amido na
microalga selecionada;
• Estudar a hidrólise enzimática do amido intracelular de forma a maximizar o
rendimento e a concentração final de glicose;
• Avaliar a possibilidade de colheita por sedimentação gravitacional das células
ricas em amido;
• Avaliar a extração de pigmentos usando etanol como solvente;
• Caracterizar a biomassa residual quanto aos teores de proteínas, lipídeos e
carboidratos.
53
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Microalgas e condições de cultivo
As microalgas utilizadas pertencem às espécies Chlorella sorokiniana Shihira
& Krauss (UTEX1663), Mychonastes homosphaera (anteriormente denominada
Chlorella homosphaera Skuja; LEAF0708, isolada de ambientes continentais do
interior de São Paulo nos anos 90) e Neochloris oleoabundans Chantanachat & Bold
(UTEX1185), apresentadas na Figura 15.
Figura 15. Microscopia ótica das microalgas M. homosphaera (a), C. sorokiniana (b) e N. oleoabundans (c) com lente objetiva de 100x (Fonte: Autoria própria)
As microalgas foram crescidas em agitador orbital (New Brunswick Scientific
Innova 44R) adaptado com luzes brancas fluorescentes de 19 W tipo luz do dia sob
irradiância de 100 µmol.m-2.s-1 (luz fotossinteticamente ativa) medidas por meio de
um radiômetro equipado com um detector quântico com correção cosseno (LI-COR),
conforme apresentado na Figura 16.
Os cultivos foram conduzidos a 30 °C e o meio utilizado foi o Bold's Basal
Medium (BBM) (NICHOLS e BOLD, 1965) contendo (g.L-1): 0,25 NaNO3; 0,025
CaCl2.2H2O; 0,075 MgSO4.7H2O; 0,098 K2HPO4.3H2O; 0,175 KH2PO4; 0,025 NaCl;
0,05 EDTA; 0,031 KOH; 0,00498 FeSO4.7H2O; 0,011 H3BO3; e os seguintes
elementos-traço (mg/L): 9,0 ZnSO4.7H2O; 14,4 MnCl2.4H2O; 0,71 MoO3; 1,57
CuSO4.5H2O; 0,5 Co(NO3)2.6H2O. As células foram cultivadas em Erlenmeyers de
500 mL contendo 200 mL de meio, coletadas por centrifugação a 8500 x g por 5
a b c
Figura 16. Agitador orbital New Brunswick Scientific Innova 44R adaptado com luzes fluorescentes para crescimento de microalgas (Fonte: Autoria própria)
54
minutos, congeladas, liofilizadas e estocadas em freezer. O crescimento celular foi
acompanhado por densidade ótica (DO) a 680 nm. Todos os cultivos foram iniciados
com uma DO em torno de 0,1, correspondendo a cerca de 2x106 células.mL-1. A
rotação e o tempo de cultivo foram variados com os diferentes experimentos e são
indicados ao longo dos resultados.
4.2 Seleção da microalga
As três microalgas foram cultivadas nas condições descritas inicialmente a
175 rpm por 30 dias com acompanhamento do crescimento por meio de amostras
retiradas diariamente nos primeiros 10 dias e leitura em espectrofotômetro a 680 nm.
Após 10, 20 e 30 dias de cultivo, as células foram colhidas e caracterizadas quanto a
sua massa seca e seu conteúdo de carboidratos.
4.2.1 Massa seca
Para determinação da massa seca, 10 mL do meio de cultivo contendo as
células foram filtrados em membrana de éster de celulose de 0,22 µm (Merck, Brasil)
previamente secas em estufa a 105 °C e pesadas. As membranas com as células
foram colocadas em estufa a 105 °C até peso constante.
4.2.2 Determinação do conteúdo de carboidratos
O conteúdo de carboidratos foi determinado inicialmente mediante hidrólise
ácida com ácido sulfúrico em duas etapas segundo o protocolo publicado pelo
National Renewable Energy Laboratory (NREL) (WYCHEN e LAURENS, 2013). A
análise dos monômeros resultantes foi realizada em HPAEC (High Performance
Anion Exchange Chromatography) nas condições cromatográficas descritas abaixo.
Para determinação do conteúdo de amido, as células foram moídas e foi utilizado
um kit enzimático de amilases (Megazyme, EUA), conforme descrito a seguir: 100
mg de células moídas foram incubadas com etanol 80 % a 80 °C por 5 minutos e
posteriormente centrifugadas e o sobrenadante, descartado; o procedimento foi
repetido 2 vezes. Em seguida, as células extraídas foram incubadas com 3 mL de
uma solução de 100 U/mL de α-amilase termoestável em tampão acetato de sódio
pH 5 por 6 min a 100 °C. A mistura reacional foi então transferida para um banho a
50 °C e incubada por 30 min com a adição de 0,1 mL de uma solução de 3300 U/mL
55
amiloglicosidase. A mistura foi então centrifugada e o sobrenadante foi diluído e sua
concentração de glicose foi determinada em analisador bioquímico (YSI 2700).
Apesar de essa metodologia de determinação de amido ser amplamente
utilizada, ela é dependente de uma moagem efetiva da amostra para exposição do
amido à ação enzimática. Além disso, a enzima amiloglicosidase utilizada
apresentava uma concentração de glicose livre muito alta, exigindo que um branco
da enzima fosse feito a cada dosagem. Por essas possíveis interferências no
método de determinação de amido e pela necessidade de uma grande quantidade
de amostra (100 mg), os resultados do presente trabalho são apresentados em teor
de glicose, tendo-se em mente que mais de 90 % da glicose de C. sorokiniana,
como mostrado nos resultados, está presente na forma de amido.
4.2.3 Análise dos carboidratos por HPAEC
As análises dos açúcares (celobiose, glicose, xilose, galactose, arabinose,
sacarose, frutose, rhamnose e manose) foram realizadas no equipamento Ion
Chromatography System 5000 (ICS-5000, Dionex Ltd., Canadá) utilizando um
sistema de HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography and
Pulse Amperometric Detection). O software utilizado foi o Chromeleon 6.8 (Dionex
Ltd., Canadá). O sistema de colunas utilizado foi composto pela pré-coluna
CarboPac PA1 (4 x 50 mm, Thermo Scientific Ltd., EUA) e coluna analítica
CarboPac PA1 (4 x 250 mm, Thermo Scientific Ltd., EUA); ambas foram mantidas a
15 °C. A fase móvel utilizada foi água deionizada (Milli-Q) grau reagente tipo I (18 ou
mais megaohm-cm de resistividade), descarbonatada e filtrada em filtro de 0,2 μm,
com fluxo de 1,25 mL por minuto; entre os tempos 42 min e 52 min de corrida, a fase
móvel foi substituída por NaOH 300 mM. No pós-coluna, foi adicionada uma solução
de NaOH 450mM com fluxo de 0,4 mL por minuto.
4.3 Seleção das metodologias de quantificação e acompanhamento celular
Para quantificação do crescimento celular de C. sorokiniana, foram realizadas
leituras de densidade ótica em diferentes momento do cultivo, com diluição
apropriada, nos comprimentos de onda de 750, 730, 680, 660, 600, 560, 540 e 480
nm, comumente reportados na literatura (CHOJNACKA e NOWORYTA, 2004;
GRIFFITHS et al., 2011; LI et al., 2013; HO et al., 2013a; HO et al., 2013b). Os
comprimentos próximos de 680 nm ou 480 nm são utilizados por representarem
56
picos de absorção de clorofilas e/ou carotenoides (LICHTENTHALER e
BUSCHMANN, 2005). Os demais comprimentos, de 750nm ou próximos a 550 nm,
são utilizados pelo motivo oposto: leituras a 750 nm não apresentam nenhum pico
de absorção de pigmentos e leituras em torno de 550 nm correspondem a um
mínimo local de absorção da clorofila. Portanto, esses comprimentos resultariam em
uma quantificação apenas da biomassa formada, sem efeito da variação do
conteúdo de pigmento com o tempo de cultivo (GRIFFITHS et al., 2011;
MOHEIMANI et al., 2013).
Essas leituras foram correlacionadas com as medidas de massa seca,
realizadas conforme descrito anteriormente, e com a contagem de células, realizada
em câmara de Neubauer espelhada. As regressões linear e exponencial foram
obtidas com o uso do software SigmaPlot (v. 10.0).
4.4 Seleção da metodologia de caracterização da fração de carboidratos de
microalgas do gênero Chlorella
Para a seleção da metodologia de caracterização de carboidratos a ser
utilizada para C. sorokiniana, outras duas microalgas foram utilizadas com diferentes
teores de carboidratos de forma a validar a metodologia para uso mais amplo.
Foram utilizadas a microalga comercial Chlorella sp. (Lot 1404181102, Fuqing King
Dnarmsa, Fuqing City, China), com baixo teor de carboidratos, e a microalga
Mychonastes homosphaera, cultivada de acordo com RODRIGUES e BON (2011) a
fim de acumular um alto teor de carboidratos. O conteúdo de carboidratos foi
analisado segundo o método de uma etapa de hidrólise ácida com ácido sulfúrico
9,1 % (m/m) descrito por NORTHCOTE et al. (1958). Esse método consiste na
hidrólise ácida de 4 mg de células liofilizadas com 2 mL de ácido sulfúrico 9,1 %
(m/m) a 100 °C por 6 horas. Tempos menores de 1, 2 e 4 horas também foram
testados. Os hidrolisados foram neutralizados pela adição de CaCO3 e analisados
por HPAEC-PAD, como descrito anteriormente. Os resultados obtidos com esse
método foram comparados aos encontrados com o método publicado pelo NREL
(WYCHEN e LAURENS, 2013). Os açúcares redutores totais foram quantificados
pelo método do DNS e expressados em glicose-equivalentes (SUMNER, 1925).
Além das microalgas, polissacarídeos comerciais foram caracterizados pelos
dois métodos enumerados acima de forma a verificar a eficiência de ambos.
Celulose microcristalina (Avicel®, Fluka, Milwaukee, USA) e amido de milho
57
(Maizena®, Unilever, São Paulo, Brazil) foram usados como representantes de
celulose e amido, respectivamente. A macroalga vermelha Kappaphycus alvarezii
(Rhodophyta), após extração de carragena de forma a aumentar seu conteúdo de
celulose, foi igualmente caracterizada por ambos os métodos como um substrato
real rico em celulose.
De forma a comparar a eficiência de ambos os métodos para a hidrólise dos
carboidratos estruturais das espécies avaliadas, as microalgas foram submetidas à
hidrólise enzimática de seu amido intracelular, após moagem, utilizando amilases
comerciais, de acordo com o protocolo da Megazyme. O procedimento foi repetido
duas vezes e os materiais resultantes foram lavados com água destilada até que
nenhuma glicose fosse detectada no sobrenadante. As algas sem amido foram
liofilizadas e hidrolisadas pelas duas metodologias de caracterização.
4.5 Estudo do cultivo de C. sorokiniana
O crescimento de C. sorokiniana foi avaliado inicialmente nas rotações de
175, 200 e 225 rpm nas mesmas condições descritas no item 4.1. Amostras foram
retiradas nos primeiros 10 dias de cultivo para cálculo das taxas específicas de
crescimento na fase exponencial e comparação dos perfis de crescimento.
Na rotação de 225 rpm, foi realizado um acompanhamento da massa seca,
conforme descrito anteriormente, e do teor de glicose pelo método de NORTHCOTE
et al. (1958) com o tempo reduzido de 2 horas. Para essas análises, foram retiradas
amostras nos dias 3, 6, 10, 13, 17, 20 e 25 de cultivo. Nos sobrenadantes dessas
amostras foram realizadas a quantificação de nitrato (COLLOS et al., 1999) e de
fosfato total (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 1999).
As modificações realizadas no meio de cultivo de C. sorokiniana nos
experimentos de avaliação dos fatores que influenciam o acúmulo de amido estão
apresentadas na Tabela 6, assim como o tempo de cultivo e a rotação de cada
experimento. A concentração de NaCl permaneceu igual à descrita anteriormente
em todos os experimentos.
Nesses experimentos, as células foram cultivadas em meio completo por 14
dias, centrifugadas em tubos estéreis, os sobrenadantes foram descartados e as
células foram ressuspendidas em seus respectivos meios antes de serem
inoculadas nos frascos de cultivo. Adicionalmente, células cultivadas por 10 dias
foram também centrifugadas como descrito e inoculadas em meio completo sem
58
nitrato de sódio ou em água deionizada e foram cultivadas por 21 dias a 200 rpm.
Em todos os experimentos, a massa seca e o teor de glicose finais foram
determinados pelos métodos descritos anteriormente.
Tabela 6. Modificações no meio de cultivo de C. sorokiniana. Todas as concentrações são apresentadas em g.L-1 Experimento Condições NaNO3 CaCl2 MgSO4 KxHyPO4 EDTA FeSO4 H3BO3 Traços
Controle 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,05 0,005 0,011 0,013
Macro + Fea 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0 0,005 0 0
Sem ETb 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,05 0,005 0,011 0
Meio 1 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,05 0,005 0,011 0,013
Meio 2 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0 0 0 0
Meio 3 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0 0,005 0 0
Meio 4 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,05 0,005 0 0
Meio 5 200 rpm, 20
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,025 0,005 0 0
Meio C 225 rpm, 10
dias
0,25 0,025 0,075 0,273 0,05 0,005 0,011 0,013
Meio Ca 225 rpm, 10
dias
0,25 0 0,075 0,273 0,05 0,005 0,011 0,013
Meio P 225 rpm, 10
dias
0,25 0,025 0,075 0 0,05 0,005 0,011 0,013
Meio S 225 rpm, 10
dias
0,25 0,025 0 0,273 0,05 0,005 0,011 0,013
a - Macronutrientes + Fe; b - Sem elementos-traço
4.6 Determinação do teor de proteínas
O teor de proteínas foi determinado pelo método de Lowry (LOWRY et al.,
1951) precedido de uma etapa de solubilização das proteínas presentes na
microalga. As células moídas foram incubadas com 0,5 mL de água e 0,5 mL de
uma solução de SDS 5 % a 100 °C por 5 minutos. A solução de SDS foi preparada
dissolvendo-se a quantidade apropriada de SDS em glicerol, que foi escolhido como
solvente para garantir a dissolução total do detergente e reduzir a turbidez final da
solução. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi
59
analisado pelo método de Lowry e os resultados comparados com uma curva padrão
de albumina.
4.7 Determinação do teor de lipídeos
O teor de lipídeos foi determinado pelo método de Bligh & Dyer modificado,
descrito a seguir. 50 mg de células moídas foram submetidas à extração com 2 mL
de clorofórmio, 4 mL de metanol e 1,6 ml de água em um tubo de plástico com
tampa por 1 hora a temperatura ambiente com agitação vigorosa de 10 em 10
minutos. Essa mistura foi centrifugada e o sobrenadante foi recuperado em um novo
tubo. A biomassa foi novamente extraída com 4 mL de clorofórmio, 2 mL de metanol
e 1,6 mL de água nas mesmas condições descritas acima. Ambos os sobrenadantes
foram misturados e acrescentados de 2 mL de clorofórmio e 2 mL de água. Essa
mistura foi centrifugada e a fase orgânica foi recuperada em uma placa de vidro
previamente pesada e deixada para secar em uma capela para posterior
determinação da massa de lipídeos recuperada.
4.8 Hidrólise enzimática
Inicialmente investigou-se a possibilidade de redução do volume de hidrólise
devido à quantidade reduzida de amostra. Para tal, foram conduzidos ensaios
contendo 20 FPU.g-1 glucana e 60 BGU.g-1 glucana de uma mistura enzimática dos
sobrenadantes dos fungos Trichoderma reesei Rut C-30 e Aspergillus awamori
simultaneamente em frascos de 25 mL contendo 12,5 mg de massa total da mistura
de biomassa, enzimas e tampão citrato de sódio 0,05 M (pH 4,8) e em tubos tipo
Eppendorf contendo 1,25 mg de massa total. Da massa total dos ensaios, 1 % (m/m)
correspondeu a células de C. sorokiniana. As hidrólises foram conduzidas a 50 °C e
200 rpm por 24 horas e as amostras foram centrifugadas e analisadas em analisador
bioquímico (YSI 2700). Todos os experimentos subsequentes, exceto quando
explicitado o contrário, foram conduzidos nos tubos tipo Eppendorf com 1,25 mg de
massa total e 1 % (m/m) de sólidos (células de C. sorokiniana). Em todos os ensaios
foi acrescentada azida de sódio de forma a evitar a contaminação dos mesmos.
60
Os rendimentos de hidrólise foram calculados segundo a Eq. 1:
Rendimento em glicose (%) = (Cglicose − Cglicose 0) ∗ Vlíquido
Mtotal ∗ Csólidos ∗ Tglicose (Eq. 1)
onde: Cglicose = concentração de glicose no hidrolisado (g/L) Cglicose0 = concentração de glicose no tempo 0h (g/L) Vlíquido = Mtotal - Msólidos (L) Mtotal = massa total do ensaio de hidrólise (sólidos + enzimas + tampão) (g) Csólidos = carga de sólidos no ensaio de hidrólise (%) Tglicose = teor de glicose proveniente do amido na biomassa (%)
4.8.1 Produção de enzimas
Para produção de enzimas pelo fungo T. reesei RUT C-30, foi feito um cultivo
para a produção de pré-inóculo em frascos de 500 mL com 100 mL de meio de
Mandels (MANDELS e WEBER, 1969) contendo (g.L-1): 0,3 de ureia, 1,4 de
(NH4)2SO4, 2,0 de KH2PO4, 0,3 de CaCl2, 0,3 de MgSO4 . 7H2O, 0,25 de extrato de
levedura, 0,75 de peptona e 7,5 de avicel. Foram adicionados os seguintes
elementos-traço (mg.L-1): 5 de FeSO4.7 H2O, 20 de CoCl2.6 H2O, 16 de MnSO4.4
H2O, 14 de ZnSO4.7H2O. Os meios foram inoculados com 1 mL (1 % do volume do
meio) de suspensão de esporos e incubados por três dias a 30 ºC e 200 rpm. Os
cultivos para produção das enzimas foram realizados em frascos de 500 mL
contendo 100 mL de meio de Mandels adaptado, no qual a concentração de extrato
de levedura foi elevada para 6,0 g.L-1, a peptona foi retirada, foram adicionados 6
g.L-1 de milhocina e o avicel foi substituído por lactose ou farelo de trigo em uma
concentração de 30 g.L-1 (GOTTSCHALK et al., 2010). Os meios foram inoculados
com 10 mL do pré-inóculo (10 % volume do inóculo) e os frascos foram incubados
por sete dias a 30 ºC e 200 rpm. O tampão utilizado foi o fosfato de sódio 100 mM,
pH 6.
Para o fungo Aspergillus awamori linhagem 2B.361 U2/1, o pré-inóculo foi
realizado em meio contendo 1,2 g.L-1 NaNO3, 3,0 g.L-1 KH2PO4, 6,0 g.L-1 K2HPO4,
0,2 g.L-1 MgSO4.7H2O, 0,05 g.L-1 CaCl2, 12 g.L-1 extrato de levedura e 30 g.L-1 farelo
de trigo (GOTTSCHALK et al., 2010). O meio foi inoculado também com 1 mL de
suspensão de esporos e incubado por 3 dias a 30 ºC. Um volume de 10 mL de pré-
inóculo foi então transferido para um novo meio de cultivo com a mesma
composição descrita acima para produção de enzimas durante 7 dias a 30 ºC e 200
61
rpm. Todos os cultivos foram realizados em equipamento marca New Brunswick
Scientific modelo Innova 44.
4.8.2 Determinação das atividades de FPase e β-glicosidase
A atividade de FPase foi determinada seguindo a metodologia descrita pelo
NREL - National Renewable Energy Laboratory (ADNEY e BAKER, 2008), em que
uma unidade de papel de filtro (FPU) é definida como a quantidade de enzima
necessária para degradar 4 % de uma fita de papel de filtro (equivalente a 2 mg de
glicose) após uma reação de 60 minutos.
Para a determinação da atividade de β-glicosidase, foi utilizada a metodologia
descrita pela IUPAC (GHOSE, 1987) com modificações: 500 μL de uma solução de
celobiose (Sigma-Aldrich C-7252) 15 mM foram reagidos com 500 μL da enzima
apropriadamente diluída em tampão citrato de sódio 0,05 M pH 4,8 por 30 minutos a
50 °C. A mistura enzimática foi então incubada a 100 °C por 5 minutos para finalizar
a reação. A concentração de glicose resultante foi lida em analisador bioquímico
(YSI 2700). Uma unidade de atividade enzimática (BGU) foi definida como a
quantidade de glicose liberada, em μmol, após 1 minuto de reação enzimática.
4.8.3 Determinação da atividade de amilase
Para determinação da atividade total de amilase, foi desenvolvido um método
analítico utilizando-se amido solúvel como substrato. A solução de amido solúvel 1%
(m/v) foi preparada conforme descrito a seguir: 1 g de amido solúvel foi dissolvido
em 50 mL de água destilada fervente; após 5 minutos de fervura, 50 mL de água
destilada gelada foram adicionados e misturou-se até a obtenção de uma solução
límpida. Para o ensaio enzimático, foram usados os mesmos volumes do ensaio de
β-glicosidase: 500 μL da solução de amido e 500 μL da enzima diluída em tampão
citrato de sódio 0,05 M pH 4,8. A concentração de glicose resultante foi lida em
analisador bioquímico (YSI 2700). De forma a se determinar o tempo de reação,
foram conduzidos ensaios de 5, 10 e 15 minutos e o tempo de 5 minutos foi
escolhido. Uma unidade de atividade enzimática (AMU) foi definida como a
quantidade de glicose liberada, em μmol, após 1 minuto de reação enzimática.
62
4.8.4 Moagem
O tratamento de moagem foi realizado com 0,5 g de células liofilizadas ou o
equivalente de células úmidas em moinho de bola vibratório (Fritsch, Alemanha) por
90 minutos em uma amplitude de 1,5 mm (Figura 17).
4.8.5 Estudo das condições de hidrólise
Para determinação das melhores condições de hidrólise, os ensaios de
determinação de atividade enzimática de amilases no sobrenadante do fungo A.
awamori foram conduzidos a diferentes temperaturas e pH 4,8. Após a determinação
da temperatura em que se obteve o máximo de atividade, essa variável foi fixada em
60 °C e o pH foi variado incubando-se a enzima em tampão citrato de sódio 0,05 M
com diferentes valores de pH.
Para o cálculo da carga enzimática a ser utilizada nos ensaios de hidrólise em
condições diferentes do que 50 °C e pH 4,8, a atividade enzimática de amilases foi
determinada nas novas condições de hidrólise de forma se corrigir o volume utilizado
para a real atividade por volume de sobrenadante.
Para os ensaios com carga de sólidos acima de 1 % (m/m), a massa total do
ensaio de hidrólise foi aumentada para 12,5 g de forma a minimizar problemas de
transferência de massa devido a uma homogeneização ineficaz.
4.8.6 Hidrólise do amido de milho comercial
A hidrólise do amido de milho comercial foi conduzida nas mesmas condições
que a hidrólise das células de C. sorokiniana. O amido de milho moído foi tratado
conforme descrito anteriormente e o amido de milho gelatinizado foi aquecido a 100
Figura 17. Moinho vibratório contendo 1 bola (Fritsch, Alemanha) (Fonte: http://www.alemmar.net.br)
63
°C por 10 minutos na presença de tampão, mas na ausência de enzimas. Após a
gelatinização, a mistura foi resfriada e as enzimas foram acrescentadas.
4.9 Colheita de C. sorokiniana
4.9.1 Sedimentação gravitacional
Inicialmente, a colheita por sedimentação gravitacional foi analisada
visualmente pela deposição de células no fundo de uma proveta contendo 100 mL
de uma suspensão de células com concentração de 0,7 g.L-1 e teor de amido de 28
%. De forma a verificar a influência do teor de amido intracelular na sedimentação
gravitacional, células colhidas após 12 e 20 dias foram transferidas para tubos de
plástico e sua sedimentação foi acompanhada pela retirada de amostras do meio da
altura da coluna de líquido e posterior leitura da densidade ótica a 680 nm.
4.9.2 Floculação e sedimentação
4.9.2.1 Preparo do pó e dos extratos de semente de moringa
As sementes de Moringa oleifera Lam. foram colhidas secas no Campus São
Cristóvão da Universidade Federal do Sergipe. Ao serem recebidas no Laboratório
Bioetanol, as sementes foram descascadas e colocadas para secar em estufa a
vácuo a 40 °C. A seguir, as sementes descascadas foram trituradas manualmente
com grau e pistilo e peneiradas em peneira vibratória (Fritsch, Alemanha) de forma a
se obter um pó de granulometria inferior a 180 µm. A Figura 18 apresenta as
sementes de moringa secas e após a remoção das cascas.
Figura 18. Sementes de moringa secas e após a remoção das cascas
64
Para obtenção dos extratos da semente, 5 g de pó foram extraídos com 100
mL de água destilada ou solução de NaCl 1M sob agitação a 300 rpm por 30
minutos. Após a extração, a mistura foi filtrada em um pré-filtro de fibra de vidro
(Whatman, Maidstone, Reino Unido) e acondicionada em tubos de plástico sob
refrigeração.
4.9.2.2 Experimentos de floculação
Experimentos de floculação geralmente são realizados em equipamentos do
tipo Jar Test. No entanto, esses equipamentos exigem um volume muito grande de
amostra. De forma a reduzir o volume necessário, os experimentos foram realizados
em frascos de 25 mL contendo 10 mL de suspensão de células de C. sorokiniana,
agitados em shaker orbital a 200 rpm por 30 minutos seguido por uma agitação a 75
rpm por 30 minutos. Em seguida, o conteúdo dos frascos foi lentamente vertido em
tubos de plástico de 15 mL de forma a não desestabilizar os flocos formados, as
amostras foram retiradas na metade da coluna de líquido e sua absorvância foi lida a
680 nm.
Inicialmente, o pó de semente de moringa foi utilizado nas concentrações de 1
g.L-1, 0,8 g.L-1 e 0,6 g.L-1. Em seguida, foram utilizados os extratos aquoso e salino
da semente, obtidos conforme descrito acima, em concentrações equivalentes a 1
g.L-1, ou seja, foram usados 200 μL de extrato a 5 % (m/v) para cada 10 mL de
suspensão de células.
O volume final de sedimentado após 24 horas de sedimentação foi medido
diretamente pela graduação do tubo de plástico. As células floculadas e
sedimentadas nas melhores condições testadas foram posteriormente centrifugadas
e a umidade e as massa finais obtidas foram determinadas para comparação.
4.10 Extração de pigmentos
O teor de clorofila foi determinado por extração de 1 mg de células secas e
moídas com 5 mL de metanol 100 % a 25 °C por 1 hora (tempo suficiente para
extração total, observada pela perda de cor da biomassa) em um ambiente de baixa
luminosidade com agitação vigorosa de 10 em 10 minutos. Foi feita a leitura da
absorvância do sobrenadante da extração, após centrifugação, e os teores de
clorofilas a e b foram calculados pelas equações cromáticas de LICHTENTHALER e
WELLBURN (1983) para metanol puro (Eq. 2 e Eq. 3) e somados.
65
Ca = 15.65A666-7.34A653 (Eq. 2)
Cb = 27.05A653-11.21A666 (Eq. 3)
Para quantificação e extração dos pigmentos na biomassa fresca, foi
calculada a massa seca do cultivo e o mesmo volume de suspensão de células foi
transferido para diferentes tubos plásticos e o sobrenadante foi descartado após
centrifugação.
A extração de pigmentos com etanol foi realizada com o mesmo procedimento
utilizado para o metanol. Para determinar qual equação cromática usar, foi feita uma
extração com metanol e os pigmentos foram liofilizados e ressuspendidos em
metanol e etanol. Nessas amostras foi feita uma varredura de picos em diversos
comprimentos de onda e, no intervalo de 400 a 700 nm, foi observada uma variação
na posição dos picos menor que 1 %. As equações cromáticas relativas a metanol e
etanol foram utilizadas também na mesma amostra de pigmentos extraída com
etanol, e os valores calculados por ambas não apresentaram diferença
estatisticamente significativa para os resultados de clorofilas a e b. Portanto, optou-
se por manter os cálculos com a equação de metanol mesmo para os pigmentos
extraídos com etanol de forma a eliminar a interferência dessa variação na
interpretação dos resultados.
4.11 Secagem de células de C. sorokiniana
A comparação da velocidade de secagem de células de C. sorokiniana
úmidas com água ou após extração de pigmentos com etanol foi comparada pelo
acompanhamento do peso de tubos de plástico contendo 1 g de células úmidas com
umidade inicial de cerca de 85 % colocados em uma capela com ventilação ligada.
4.12 Tratamento estatístico dos dados
Os resultados experimentais de duplicatas ou triplicatas independentes foram
comparados pelo teste de Fisher LSD (p<0,05) usando o software STATISTICA (v.
7.0). As barras de erro dos gráficos foram plotadas baseando-se no desvio-padrão
das duplicatas ou triplicatas realizadas.
66
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A apresentação dos resultados desse trabalho encontra-se dividida em quatro
partes. Na primeira parte, será abordada a seleção de uma espécie de microalga a
partir de três espécies potenciais para acúmulo de carboidratos e moléculas de
interesse, segundo a literatura. Na segunda parte, serão avaliadas metodologias
para acompanhamento do crescimento e caracterização da microalga selecionada,
tendo em vista de que não há consenso sobre a melhor metodologia a ser
empregada para o acompanhamento de cultivos e caracterização de microalgas. Na
terceira parte, o cultivo da microalga selecionada será estudado a fim de reduzir seu
tempo de cultivo e determinar os fatores que afetam seu acúmulo de amido. Por fim,
na quarta parte será apresentada uma proposta tecnológica baseada em um total
aproveitamento da biomassa em um conceito de biorrefinaria com ênfase em
processos ambientalmente amigáveis.
5.1 Seleção da microalga de interesse
As microalgas verdes Chlorella sorokiniana, Mychonastes homosphaera
(denominada anteriormente Chlorella homosphaera) e Neochloris oleoabundans
foram inicialmente selecionadas por apresentarem crescimento autotrófico e
mixotrófico e acúmulo de carboidratos e outros compostos de interesse, como
lipídeos e carotenóides (LI et al., 2014; MORALES-SÁNCHEZ et al., 2013;
RODRIGUES e BON, 2011; TANADUL et al., 2014). Essas características
possibilitam o uso futuro de fontes de carbono orgânicas e o processamento das
microalgas visando a obtenção de diversos produtos de interesse em um contexto
de biorrefinaria.
O crescimento celular em condições autotróficas em geral resulta em uma
menor concentração final de biomassa do que em condições heterotróficas ou
mixotróficas (CHEIRSILP e TORPEE, 2012; CHOJNACKA e NOWORYTA, 2004; LI
et al., 2014). No entanto, cultivos mixotróficos e heterotróficos apresentam maior
chance de contaminação do que cultivos autotróficos por apresentarem carbono
orgânico, geralmente açúcares, dissolvido no meio de cultivo. Por esse motivo, o
crescimento autotrófico foi utilizado nesse estudo para seleção de uma microalga
com potencial para acúmulo de amido.
67
O perfil de crescimento autotrófico das três espécies foi acompanhado
inicialmente até o 10º dia de cultivo e os resultados se encontram na Figura 19. As
três algas exibiram uma fase de crescimento exponencial curta, estendendo-se até
aproximadamente o 4º dia, com taxas específicas de crescimento de 0,348 d-1, 0,308
d-1 e 0,278 d-1 para C. sorokiniana, N. oleoabundans e M. homosphaera,
respectivamente. Após a fase exponencial, seguiu-se uma fase de desaceleração do
crescimento até o 10º dia, não tendo sido observada a fase estacionária em nenhum
dos casos no período avaliado. Apesar de as três espécies apresentarem um perfil
inicial similar de crescimento, a desaceleração no crescimento de M. homosphaera
foi mais acentuada que para as demais, resultando em um menor crescimento a
partir do 4º dia de cultivo.
Figura 19. Perfil de crescimento das algas Chlorella sorokiniana, Neochloris oleoabundans e Mychonastes homosphaera durante 10 dias de cultivo em Bold's Basal Medium em frascos agitados a 175 rpm. Os pontos representam a média de três ensaios independentes.
As algas foram caracterizadas, após diferentes tempos de cultivo, quanto à
sua massa seca, apresentada na Figura 20, e ao teor em glicose e açúcares totais
da sua biomassa, apresentados na Figura 21. Após 10 dias, as três espécies
apresentaram concentrações de massa seca semelhantes, de aproximadamente
0,15 g/L. M. homosphaera apresentou o maior teor em glicose e açúcares totais
(14,8 % e 24,0 %, respectivamente), seguida por N. oleoabundans (11,5 % e 16,9 %,
respectivamente) e C. sorokiniana (6,9 % e 11,1 %, respectivamente).
Como o cultivo de 10 dias resultou em um baixo acúmulo de biomassa e
baixos teores em glicose, o tempo de cultivo foi estendido para 20 e 30 dias. As
68
espécies C. sorokiniana e N. oleoabundans apresentaram comportamento similar
em relação ao acúmulo de biomassa, avaliado por sua massa seca, atingindo a
mesma produção de biomassa em 30 dias (Figura 20).
M. homosphaera apresentou uma produção de biomassa mais lenta,
alcançando, após 30 dias de cultivo, uma massa seca 40% menor do que a obtida
no cultivo das outras duas espécies no mesmo período. Esses resultados são
consistentes com os perfis de crescimento obtidos até o 10º dia de cultivo, em que
as duas primeiras espécies apresentaram crescimentos similares, enquanto M.
homosphaera apresentou um crescimento mais lento a partir do 4º dia. As maiores
Figura 21. Concentração de massa seca de C. sorokiniana (S), N. oleoabundans (N) e M. homosphaera (H) obtidas após 10, 20 e 30 dias de cultivo.
Figura 20. Teor de glicose (cinza claro) e açúcares totais (cinza escuro) da biomassa seca de C. sorokiniana (S), N. oleoabundans (N) e M. homosphaera (H) após 10, 20 e 30 dias de cultivo.
69
produtividades de biomassa seca, de 24,4 mg.L-1.dia-1 e 24,3 mg.L-1.dia-1, foram
alcançadas pelas linhagens de C. sorokiniana e N. oleoabundans, respectivamente,
após 30 dias de cultivo. A linhagem de M. homosphaera atingiu uma produtividade
de apenas 14,5 mg.L-1.dia-1.
O teor de glicose da espécie C. sorokiniana aumentou com o tempo de
cultivo, dobrando após 20 dias (14,0 %) e quadruplicando após 30 dias (29,0 %) em
relação ao conteúdo apresentado pela cultura de 10 dias (6,9 %) (Figura 21). Já N.
oleoabundans apresentou um aumento de apenas 26 % no teor em glicose após 20
dias (14,5 %), dobrando o teor após 30 dias de cultivo (22,8 %) em relação ao
apresentado após 10 dias de cultivo (11,4 %). A espécie M. homosphaera não
apresentou diferença significativa em sua composição em glicose durante o período
de cultivo estudado (14,8 % e 16,0 % após 10 e 30 dias de cultivo, respectivamente).
Não foi observada uma mudança significativa no teor total dos outros
açúcares com o aumento do tempo de cultivo. Portanto, o aumento do conteúdo de
açúcares totais observado ao longo do tempo de cultivo foi devido apenas ao
acúmulo de glicose (Figura 21).
O teor de amido variou de 70 a 95% do teor de glicose total das três espécies
estudadas em todos os tempos de cultivo analisados. O acúmulo desse
polissacarídeo em microalgas é estimulado pela depleção de certos nutrientes no
meio, como nitrogênio, fósforo e enxofre (BRÁNYIKOVÁ et al., 2011). No entanto, as
três microalgas estudadas apresentaram teores significativos de glicose e, portanto,
de amido em sua composição já nos primeiros 10 dias de cultivo, antes da fase
estacionária de crescimento (Figura 21), momento em que todos os nutrientes ainda
estavam presentes no meio de cultivo. Esse acúmulo durante a fase de crescimento
exponencial já foi reportado tanto para C. sorokiniana quanto para N. oleoabundans
e representa uma reserva de carbono para consumo durante o processo de
respiração noturna (KLOK et al., 2013; LI et al., 2015).
A depleção de algum nutriente pode ser responsável pela intensificação do
acúmulo de amido tanto em C. sorokiniana como em N. oleoabundans entre o 20° e
o 30° dias de cultivo. Como essas duas espécies apresentaram perfis de
crescimento similares (Figura 19), essa depleção deve ter ocorrido simultaneamente
para ambas. Apesar de N. oleoabundans, como o próprio nome sugere, ser uma
espécie utilizada para obtenção de lipídeos, já foi reportado o acúmulo de amido
70
inicial após a depleção de nitrogênio, sendo seguido pelo aumento do teor de
triglicerídeos (Klok et al., 2013).
M. homosphaera, por apresentar um crescimento mais lento, pode não ter
consumido esses nutrientes de forma expressiva e, por isso, o mecanismo de
acúmulo de amido não foi disparado além do nível basal de 15 %, que se manteve
constante durante os 30 dias de cultivo. Essa espécie já foi reportada com um teor
de glicose de 60 % (m/m) em base seca (RODRIGUES e BON, 2011). No entanto,
essa condição foi alcançada quando cultivada em meio WC (GUILLARD e
LORENZEN, 1972), que contém vitaminas e 66% menos nitrogênio do que o meio
BBM (NICHOLS e BOLD, 1965).
Os dados experimentais obtidos no crescimento de C. sorokiniana confirmam
ser esta a mais eficiente, dentre as espécies testadas, em acumular amido após 30
dias de cultivo. A glicose foi correspondente a cerca de 30 % da composição da
biomassa seca e a hidrólise com amilases comerciais revelou que mais de 90 %
dessa glicose está presente na biomassa na forma de amido.
A espécie C. sorokiniana é caracterizada como uma microalga de interesse
para uso industrial devido ao seu rápido crescimento (LI et al., 2013) e sua tolerância
a altas temperaturas, irradiâncias luminosas e concentrações de CO2 (MORITA et al.
2000), características que permitem que essa espécie seja cultivada aproveitando a
luz solar mesmo em climas quentes e com a utilização de gases efluentes de
indústrias, que apresentam elevadas concentrações de CO2.
5.1.1 Considerações finais
A microalga Chlorella sorokiniana apresentou uma alta produtividade em
biomassa e o maior conteúdo de carboidratos totais dentre as espécies estudadas,
além do maior teor de glicose. A hidrólise enzimática por amilases revelou que mais
de 90 % da glicose está presente na biomassa na forma de amido. Devido a esses
fatores, a espécie C. sorokiniana foi selecionada para a realização dos experimentos
subsequentes.
71
5.2 Metodologias de caracterização e quantificação de Chlorella sorokiniana
5.2.1 Estudo da metodologia de quantificação e acompanhamento do
crescimento celular
Diversas metodologias de acompanhamento do crescimento celular de
microalgas são encontradas na literatura. As mais usuais são massa seca,
contagem de células e medida da densidade ótica (MOHEIMANI et al., 2013). Essas
técnicas podem ser correlacionadas pela elaboração de curvas-padrão, que
possibilitam o acompanhamento da densidade ótica, a técnica mais simples dentre
as três citadas, e sua conversão para número de células ou massa celular, que
refletem melhor o comportamento da cultura (GRIFFITHS et al., 2011).
De forma a avaliar se a densidade ótica poderia ser utilizada para o
acompanhamento do crescimento celular de C. sorokiniana, a massa seca e o
número de células por volume de cultura foram determinados em diferentes
momentos do cultivo e correlacionados com a densidade ótica da cultura.
O crescimento celular de C. sorokiniana acompanhado por contagem de
células, massa seca e medidas de densidade ótica em diferentes comprimentos de
onda está apresentado na Figura 22. Nas condições utilizadas, as células de C.
sorokiniana entraram na fase estacionária de crescimento próximo ao 10º dia de
cultivo, atingindo nesse momento uma concentração celular de 2,5x107 células/mL
que foi mantida nos dias subsequentes (Figura 22).
Os diferentes comprimentos de onda utilizados para medir a densidade ótica
resultaram em curvas de crescimento com perfis semelhantes (Figura 22). Foi
possível correlacionar os resultados obtidos no comprimento de onda de 680 nm
com os valores encontrados nos demais comprimentos de onda com coeficientes de
determinação (R2) acima de 0,995, conforme exemplo apresentado na Figura 23.
Portanto, as leituras de densidade ótica medidas a 680 nm foram selecionadas para
serem correlacionadas com a contagem de células e a massa seca do cultivo, uma
vez que esse comprimento de onda é um dos mais reportados na literatura.
72
Figura 22. Acompanhamento do crescimento celular de C. sorokiniana a 30 °C e 225 rpm. Foram realizadas medidas de densidade ótica em diferentes comprimentos de onda, contagem de células ( ) e determinação da massa seca (colunas) nas amostras retiradas após 0, 3, 6, 10, 13, 17 e 20 dias de cultivo.
Uma correlação linear entre densidade ótica e número de células somente foi
alcançada para dados obtidos na fase exponencial e de desaceleração de
crescimento, com um valor de R2 de 0,992. Considerando-se o intervalo total de
crescimento, incluindo a fase estacionária, foi possível estabelecer uma correlação
exponencial assintótica entre esses dados, com um R2 de 0,982 para os diferentes
comprimentos de onda, conforme apresentado na Figura 24. Foi ajustada uma
equação do tipo y = a(1-exp(-bx)), em que y corresponde ao número de células/mL e
x corresponde à densidade ótica.
Figura 23. Correlação linear entre leituras de densidade ótica a 750 nm e 680 nm de um mesmo cultivo de C. sorokiniana em diferentes momentos.
73
A correlação exponencial assintótica pode ser explicada pelo aumento
gradual da densidade ótica mesmo após a cultura ter entrado em estado
estacionário, ou seja, o aumento na densidade ótica não foi devido ao aumento do
número de células. Esse comportamento também não pode ser relacionado com o
aumento do teor de clorofila das células, uma vez que esse se manteve estável
entre o 10° e o 17° dias de cultivos, com uma ligeira queda até o 20° dia, conforme
apresentado na Figura 25. No entanto, nesse período houve um acúmulo de amido
intracelular mais acentuado. O teor de amido aumentou de 8 % para 26 % (m/m) da
massa seca celular entre o 10° e o 20° dias de cultivo (Figura 25). O acúmulo de
amido já foi reportado como sendo responsável por um aumento no tamanho das
células (RODRÍGUEZ-LÓPEZ, 1966; BHATNAGAR et al., 2010), o que poderia
causar o aumento da densidade ótica do cultivo.
Para os valores obtidos nos primeiros dias de cultivo, o ajuste linear resultou
em desvios entre os valores estimado e experimental menores que o ajuste
exponencial, conforme dados apresentados na Tabela 7. No entanto, a partir do 10°
dia, a correlação exponencial apresentou desvios entre os valores calculados e
experimentais de no máximo 6,3 %, enquanto que a correlação linear apresentou
desvios superiores a 24 %.
Figura 24. Correlação entre densidade ótica a 680 nm e número de células determinados ao longo do cultivo de C. sorokiniana. São apresentadas as correlações linear, correspondente aos primeiros pontos, e exponencial assintótica, correspondente a todos os pontos obtidos.
74
Tabela 7. Desvio entre os valores experimentais e calculados pelas regressões linear e exponencial para o número de células em diferentes dias de cultivo
Um padrão distinto foi observado para a correlação entre massa seca e
densidade ótica. Para os dados do 3º ao 17º dia de cultivo, foi encontrada uma
correlação linear com R2 igual a 0,969, conforme apresentado na Figura 26. No
entanto, a partir do 17º dia, houve um acúmulo de amido que resultou em um
aumento significativo da massa seca, porém sem um aumento correspondente na
densidade ótica (Figura 22). Esse desvio acarretou em um valor teórico, calculado
pela correlação linear, 31 % menor do que seu valor experimental correspondente.
LIANG et al. (2009) encontraram uma correlação de potência entre a
densidade ótica e a massa seca no cultivo de C. vulgaris. Essa mesma correlação
foi aplicada para os dados do presente trabalho e foi encontrado um valor de R2 de
0,96, indicando que essa correlação ajusta de forma satisfatória o comportamento
experimental observado. No entanto, diversos estudos trabalham com curvas-padrão
lineares correlacionando densidade ótica e massa seca, mesmo quando trabalhando
com cultivos estendidos em que há acúmulo de amido (HO et al., 2013; KUMAR et
al., 2014; LI et al., 2013; MORITA et al., 2000).
Dia de cultivo Desvio - linear Desvio - exponencial
3 5,5 % 11 %
6 4,6 % 5,7 %
10 24 % 6,3 %
14 30 % 4,8 %
17 49 % 3,2 %
20 62 % 0,3 %
Figura 25. Quantidade de clorofila por célula (colunas) e teor de amido (pontos) em diferentes períodos de cultivo de C. sorokiniana
75
Caso apenas a fase exponencial seja estudada, curvas-padrão lineares
podem ser utilizadas com correlações satisfatórias entre os valores teóricos e os
experimentais, conforme ilustrado na Figura 26. No entanto, quando cultivos
prolongados são considerados, especialmente objetivando a modificação da
composição celular pelo acúmulo de uma molécula de interesse, o uso de curvas-
padrão deve ser considerado com cautela e a curva-padrão deve ser construída ao
longo do cultivo, e não apenas em um dia específico.
Em vista desses resultados, o acompanhamento do crescimento de C.
sorokiniana pode ser feito por medição da densidade ótica, correlacionando-a com o
número de células por meio de uma curva-padrão com regressão exponencial
assintótica. No entanto, para a determinação da massa celular produzida, é
necessária a quantificação final pela técnica de massa seca. O desvio acentuado da
massa seca experimental em relação ao valor calculado pela regressão linear em
função da densidade ótica pode ser utilizado como indicativo do acúmulo de amido
e, portanto, do momento em que deve ser realizada a colheita.
5.2.2 Estudo da metodologia de caracterização quanto ao teor de
carboidratos
Nos estudos de seleção da microalga, foi utilizada a metodologia publicada
pelo NREL (National Renewable Energy Laboratory) para quantificação de
carboidratos de microalgas, que consiste em uma etapa inicial de hidrólise com
ácido sulfúrico 72 % (m/m) a 30 °C seguida por uma etapa com ácido sulfúrico 4 %
Figura 26. Correlação entre densidade ótica a 680 nm e massa seca determinados ao longo do cultivo de C. sorokiniana.
76
(m/m) a 121 °C (WYCHEN e LAURENS, 2013). Essa metodologia é similar à
utilizada para materiais lignocelulósicos, porém em escala reduzida, e portanto ela é
capaz de hidrolisar materiais recalcitrantes como a celulose, reportada em algumas
espécies de microalgas (KIM et al., 1996; IMAI et al., 1999).
Mesmo com a redução de escala proposta pelo NREL, essa metodologia
utiliza uma quantidade de biomassa considerável, de 25 mg, quando se leva em
consideração as baixas concentrações obtidas em cultivos de microalgas (0,7 g/L,
no presente estudo). Adicionalmente, é uma metodologia que envolve manipulação
da amostra para homogeneização e diluição durante o procedimento, podendo
acarretar em erros experimentais significativos. Por último, apesar de essa
metodologia apresentar bons resultados para microalgas, ela ainda não foi otimizada
para essa biomassa (WYCHEN e LAURENS, 2013).
Uma outra metodologia disponível na literatura para caracterização do teor de
carboidratos de microalgas é a descrita por NORTHCOTE et al. (1958), que consiste
em apenas uma etapa de hidrólise com ácido sulfúrico 9,1 % (m/m) a 100 °C. Essa
metodologia utiliza uma quantidade reduzida de biomassa (4 mg) e reagentes,
porém envolve um tempo de hidrólise de 6 horas e também não foi otimizada.
Microalgas podem apresentar diversas estruturas e composições,
dependendo da espécie estudada e das condições de cultivo, e por isso não existem
métodos padronizados para sua caracterização. Em vista disso, as duas
metodologias de hidrólise ácida de microalgas acima descritas foram comparadas de
forma a se determinar qual seria utilizada no restante do trabalho.
Além da microalga selecionada, Chlorella sorokiniana, outras duas microalgas
foram utilizadas nesse estudo de forma a se abranger diferentes faixas de teor de
carboidratos totais. M. homosphaera cultivada no meio WC (GUILLARD e
LORENZEN, 1972) foi escolhida pelo seu alto conteúdo de carboidratos e Chlorella
sp., uma microalga comercial, pelo seu baixo teor de carboidratos.
5.2.2.1 Redução do tempo de hidrólise ácida e validação da
metodologia
De forma a reduzir o tempo da metodologia de Northcote, foram testados os
tempos alternativos de 1, 2 e 4 horas de hidrólise além das 6 horas propostas pelo
método. A Figura 27 apresenta os teores de açúcares determinados após hidrólise
77
das três espécies por diferentes períodos. Os resultados encontrados com o método
NREL também estão apresentados.
Glicose foi o açúcar mais abundante em todos os hidrolisados,
correspondendo a 7 %, 28 % e 73 % (m/m) da massa seca de Chlorella sp., C.
sorokiniana e M. homosphaera, respectivamente, como mostrado na Figura 27.
Galactose foi o segundo monossacarídeo mais abundante, com teores entre 3 e 4
%. Esses resultados estão de acordo com os reportados por NORTHCOTE et al.
(1958) para C. pyrenoidosa. CHENG et al. (2011) também identificaram galactose,
juntamente com xilose e manose, como o açúcar mais abundante em paredes
celulares de quatro espécies de Chlorella.
O período de 1 hora não foi suficiente para promover a hidrólise completa dos
carboidratos de Chlorella sp. a monômeros solúveis (Figura 27a). Os teores totais e
de cada açúcar foram significativamente menores para esse tempo do que os
encontrados após tempos mais longos de hidrólise. Para as algas C. sorokiniana e
M. homosphaera, o tempo de 1 hora parece ter sido suficiente para a hidrólise total
dos principais carboidratos, apesar de os teores de rhamnose, xilose e manose de
C. sorokiniana (Figura 27b) e o de rhamnose de M. homosphaera (Figura 27c) terem
apresentado uma menor percentagem nos hidrolisados de 1 hora.
Para as três espécies utilizadas, os teores de açúcares totais encontrados nos
hidrolisados foram similares para tempos de hidrólise variando de 2 a 6 horas, sem
diferença estatística entre eles (Figura 27). A única diferença estatisticamente
significativa foi encontrada para a manose no hidrolisado de 2 horas de Chlorella sp..
No entanto, essa diferença não afetou o teor total de açúcar devido à baixa
quantidade presente nessa alga. Em vista dos resultados obtidos para diferentes
tempos de hidrólise, o período de 2 horas foi escolhido como o mais curto para a
hidrólise completa dos carboidratos em monômeros solúveis, independente do
conteúdo de carboidratos da microalga utilizada.
78
Figura 27. Teores de açúcares encontrados nas microalgas Chlorella sp. (a), Chlorella sorokiniana (b) e Mychonastes homosphaera (c) quantificados por HPAEC-PAD após a hidrólise pelo método Northcote por 1 hora (branco), 2 horas (cinza claro), 4 horas (cinza) e 6 (cinza escuro). Teores de açúcares quantificados pelo método NREL também estão apresentados (preto). Valores para um mesmo açúcar (médias e desvios-padrão de triplicatas) com a mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Fisher LSD test (p>0.05). * valores abaixo do limite de quantificação
79
Comparando-se os resultados do método de Northcote com os obtidos pelo
método NREL, observou-se que, para as três linhagens testadas, os teores de
glicose e açúcares totais determinados por ambos os métodos foram similares, sem
diferença estatística entre eles (Figura 27). Diferenças foram observadas no teor de
rhamnose de Chlorella sp. (1,5 % e 1,2%) e nos teores de rhamnose (0,5 % e 0,3 %)
e xilose (0,2 % e 0,1 %) de C. sorokiniana para os métodos de Northcote e NREL,
respectivamente. Essas pequenas diferenças, considerando-se os teores reduzidos
desses açúcares nas microalgas, não impactaram de forma significativa na
caracterização do perfil de açúcares. Entretanto, o método de Northcote resultou em
maiores conteúdos desses açúcares nos três casos destacados (Figura 27), o que
reflete uma possível subestimação do conteúdo desses açúcares presentes em
baixas concentrações pelo método NREL.
Na caracterização de carboidratos por hidrólise ácida, monossacarídeos
produzidos durante o processo podem ser degradados pelo ácido, levando a
menores concentrações finais e, consequentemente, a erros na determinação do
teor de carboidratos. Portanto, padrões dos monossacarídeos encontrados nas
espécies utilizadas foram submetidos a ambos os métodos de caracterização e suas
recuperações foram calculadas. Foram encontradas recuperações para os métodos
de Northcote e NREL, respectivamente, de 94,8 % e 97,3 % para glicose, 93,0 % e
94,6 % para galactose, 92,1 % e 92,1 % para xilose, 93,2 % e 94,7 % para manose,
95,5 % e 96,2 % para rhamnose e 95,7 % e 93,5 % para arabinose. Esses
resultados indicam que ambos os métodos resultam em uma baixa degradação dos
açúcares.
Alguns açúcares não usuais foram reportados em hidrolisados de espécies de
Chlorella (TAKEDA, 1988). Esses açúcares são diferentes dos normalmente
encontrados em algas e plantas, como a fucose. Como a cromatografia líquida
empregada somente quantifica os monômeros para os quais foi utilizado um padrão
correspondente, o método de DNS para quantificação de açúcares redutores totais
foi empregado para comparação. Foram encontrados teores de açúcares totais de
12,8 ± 0,9 % e 12,1± 0,8 % para Chlorella sp., 34,9 ± 2,7 % e 33,0 ± 1,8 % para C.
sorokiniana e 75,7 ± 1,5 % e 77,5 ± 2,9 % para M. homosphaera quando utilizados o
método de DNS e os resultados de HPAEC, respectivamente. Os teores de
açúcares redutores totais determinados colorimetricamente foram similares aos
determinados por cromatografia líquida após 2 horas de hidrólise pelo método de
80
Northcote para as três espécies utilizadas, sem diferenças estatísticas entre eles.
Portanto, açúcares não usuais, se presentes, estão em pequenas concentrações
que não afetam a determinação do teor total de açúcares. Essa conclusão se limita a
açúcares neutros, pois nenhum método específico foi utilizado para identificar
açúcares ácidos, como ácidos urônicos, que também podem estar presentes na
parede celular de espécies de Chlorella (TAKEDA, 1991).
O método de Northcote em uma etapa, utilizando-se ácido sulfúrico diluído
(9,1 % (m/m)), foi eficaz para a determinação do teor total de açúcares em
microalgas com diferentes conteúdos de carboidratos. A hidrólise total de
carboidratos a monômeros solúveis foi alcançada após 2 horas de hidrólise com
resultados semelhantes aos obtidos até 6 horas de hidrólise e com menor desvio-
padrão. Períodos de hidrólise de até 6 horas podem ser utilizados sem perda de
açúcares por degradação. As vantagens do método consistem em sua simplicidade,
flexibilidade e reduzido uso de amostra e reagentes. No método NREL, é necessária
a manipulação da amostra durante a primeira hora para homogeneização e diluição,
os períodos de tempo são fixos e devem ser estritamente seguidos, e a quantidade
de amostra recomendada é 6 vezes maior do que a do método de Northcote com
uma quantidade de ácido 1,5 vezes maior.
5.2.2.2 Hidrólise ácida de controles e de microalgas sem amido
A parede celular de algas do gênero Chlorella é composta por duas
estruturas: uma matriz polissacarídica e uma parede celular rígida. A matriz contém
diversos monômeros, como os identificados nesse estudo (glicose, galactose,
rhamnose, arabinose e manose), e é hidrolisável com ácidos fracos. Já a parede
celular rígida é composta por glicose e manose ou por glucosamina e é hidrolisada
apenas por ácido sulfúrico 72 % - 4 % (p/p) ou ácido clorídrico 6 M, respectivamente
(NORTHCOTE et al., 1958; TAKEDA, 1991).
No presente estudo, rendimentos equivalentes de hidrólise em glicose foram
encontrados para os métodos de Northcote, com ácido sulfúrico a 9,1 % (p/p), e
NREL, com ácido sulfúrico a 72 % - 4 % (p/p). Esse resultado levantou a questão
sobre a capacidade do ácido sulfúrico a 9,1 % (p/p) de hidrolisar a parede celular
rígida. Adicionalmente, segundo NORTHCOTE et al. (1958), o resíduo obtido após
solubilização da parede celular de Chlorella por álcali foi hidrolisado com o ácido
sulfúrico a 9,1 % e considerado como sendo celulose. Portanto, foi necessário
81
avaliar se de fato o ácido nessa concentração seria capaz de hidrolisar celulose de
forma eficiente.
De forma a avaliar a capacidade de hidrólise dos dois métodos estudados
quando aplicados a diferentes macromoléculas, os polissacarídeos comerciais
amido e celulose microcristalina foram hidrolisados pelos dois procedimentos. A
macroalga vermelha Kappaphycus alvarezii, após extração de carragena de forma a
aumentar seu teor de celulose (MASARIN et al., 2016), foi utilizada como uma fonte
natural de celulose. Não foi observada diferença estatística entre os métodos para a
hidrólise de amido, como pode ser observado pelos dados apresentados na Tabela
8. A hidrólise do amido ocorre facilmente devido à sua estrutura predominantemente
amorfa quando submetida ao calor (RATNAYAKE e JACKSON, 2008), que a torna
suscetível à ação do ácido diluído. No entanto, a hidrólise da celulose microcristalina
foi completa apenas quando se aplicou o método NREL. Neste, o ácido concentrado
atua na estrutura cristalina da celulose, desorganizando-a e permitindo que o ácido
diluído hidrolise as cadeias de celulose, liberando glicose.
Um resultado similar foi observado para a hidrólise da celulose de K. alvarezii,
com um teor de glicose de 42 % determinado pelo método NREL, enquanto que o
método de Northcote resultou em um teor de apenas 6,1 %. Esses resultados
confirmam a recalcitrância da celulose frente ao método de Northcote e contradizem
as conclusões acerca da presença de celulose no resíduo da solubilização alcalina
da parede celular de C. pyrenoidosa. Esse resíduo deve ser considerado como outra
glucana que não celulose, ou até como um heteropolissacarídeo, uma vez que
galactose foi também encontrada no hidrolisado dessa fração.
Tabela 8. Teor de glicose determinado após caracterização pelos métodos de Northcote e NREL de amido, celulose microcristalina (Avicel) e da macroalga Kappaphycus alvarezii após extração de carragena e das três espécies de microalgas após remoção do amido por hidrólise enzimática com α-amilase e amiloglucosidase comerciais.
Teor de glicose (%)
Northcote NREL
Amido 89,3 ± 3,1 89,3 ± 2,1
Avicel 3,43 ± 0,05 97,8 ± 3,8
Macroalga 6,09 ± 0,62 42,5 ± 0,2
Chlorella sp. 0,751 ± 0,033 1,05 ± 0,01
C. sorokiniana 1,11 ± 0,12 1,99 ± 0,25
M. homosphaera 1,34 ± 0,07 1,73 ± 0,04
82
Como as celuloses não foram hidrolisadas em níveis significativos pelo
método de Northcote, o conteúdo de amido das microalgas utilizadas foi
determinado e as biomassas, após hidrólise do amido, foram caracterizadas de
forma a se estudar melhor seus polissacarídeos estruturais. Como mostrado na
Tabela 8, o teor de glicose presente após a remoção do amido foi reduzido
drasticamente, de 7,00 %, 28,0 % e 73,0 %, para 0,751 %, 1,10 % e 1,34 %, quando
usado o método de Northcote, e 1,05 %, 1,99 % e 1,73 %, quando quantificado pelo
método NREL, para as microalgas Chlorella sp., C. sorokiniana e M. homosphaera,
respectivamente.
Houve uma diferença significativa entre os teores de glicose determinados por
ambos os métodos, com o método de Northcote resultando em teores de glicose 28
%, 44 % e 22 % inferiores aos do método NREL para Chlorella sp., C. sorokiniana e
M. homosphaera, respectivamente, após a hidrólise do amido. Essa diferença foi
mascarada pela presença de amido na caracterização das células íntegras, já que
esse polissacarídeo é totalmente hidrolisado por ambos os métodos e representa
cerca de 85 % ou mais do total de glicose nas células. Esse resultado sugere a
hidrólise de um polissacarídeo mais recalcitrante pelo método NREL.
A glicose encontrada após hidrólise do amido pode ser advinda do amido
residual que as amilases não foram capazes de acessar devido a células não
rompidas ou do conteúdo de glicose presente na matriz da parede celular. Uma
pesquisa mais aprofundada é necessária para identificar a fonte da glicose
hidrolisada apenas pelo método NREL.
A presença de celulose na parede celular rígida de espécies de Chlorella é
um assunto controverso (BLANC et al., 2010). No entanto, alguns trabalhos, como o
de CHEN et al. (2016), afirmam incorretamente que toda a glicose encontrada após
a hidrólise ácida de microalgas do gênero Chlorella é derivada de celulose, sem
levar em consideração a presença de amido.
Diversos trabalhos de hidrólise enzimática fortalecem a ideia de que a
celulose não está presente em quantidades expressivas em espécies de Chlorella.
MAHDY et al. (2014) utilizaram preparações enzimáticas ricas em celulases ou
proteases como pré-tratamento para a digestão anaeróbica de Chlorella vulgaris,
encontrando melhores resultados após tratamento com proteases. Outro estudo com
C. vulgaris demonstrou que a alga utilizada não foi suscetível ao tratamento com
celulase, obtendo-se os melhores rendimentos de hidrólise com pectinases (KIM et
83
al., 2014). GERKEN et al. (2013) estudaram o impacto da adição de diversas
enzimas no cultivo em placa de 14 espécies de Chlorella. Somente C. emesonii
mostrou sensibilidade à presença de celulases, porém seu crescimento não foi
totalmente inibido por essas enzimas. No entanto, ao adicionar celulase juntamente
com lisozima, que atua na degradação de polímeros formados por glucosaminas, as
células de C. vulgaris se tornaram mais irregulares do que com a adição de apenas
lisozima. Os autores concluem que a celulose não apresenta um papel importante
na integridade da parede celular dessa alga, porém uma pequena quantidade de
celulose pode estar presente nessa estrutura.
A parede celular de microalgas foi descrita como representando apenas de 3
a 6 % da massa seca total da célula (TAKEDA, 1991). Portanto, mesmo que
presente, a celulose somente poderia contribuir com uma pequena porcentagem da
massa seca das células, não podendo resultar em teores altos de glucana de 20 %
ou mais, como comumente reportados para algas do gênero Chlorella (FU et al.,
2010; ZHENG et al., 2012). Essa pequena porcentagem é confirmada em alguns
trabalhos de caracterização da parede celular de espécies de Chlorella. CHENG et
al. (2013) caracterizaram a parede de C. variabilis e concluíram que a contribuição
de glicose em polissacarídeos estruturais corresponde a menos de 5 % da massa
seca da célula, enquanto MAKOOI et al. (1976) reportaram conteúdos de "celulose"
(glucana) de no máximo 2,5 % em uma espécie de Chlorella.
5.2.3 Considerações finais
Para o acompanhamento do crescimento de C. sorokiniana, optou-se por
utilizar a densidade ótica a 680 nm, comprimento de onda amplamente reportado na
literatura. No entanto, para quantificação da massa celular obtida ao final do cultivo,
conclui-se ser necessário o uso da técnica de peso seco.
Quanto à caracterização do teor de carboidratos, o método de Northcote
apresentou boa correlação com o método NREL, usualmente utilizado em
caracterizações de microalgas. Esse método se mostrou adequado para
polissacarídeos mais facilmente hidrolisáveis, apresentando menores rendimentos
para polímeros de glicose recalcitrantes. Como a microalga selecionada, Chlorella
sorokiniana, se mostrou adequadamente caracterizada pelo método de Northcote
modificado, esse método foi adotado pelo restante do trabalho devido à sua
flexibilidade e uso reduzido de amostra.
84
5.3 Estudo do cultivo de Chlorella sorokiniana
5.3.1 Estudo da influência da frequência de agitação no crescimento de C.
sorokiniana
Com o objetivo de aumentar a velocidade de crescimento da microalga C.
sorokiniana e reduzir o tempo de cultivo para acúmulo de amido, inicialmente de 30
dias, foram realizados cultivos nas mesmas condições anteriores, porém em
diferentes frequências de agitação. Na Figura 28 apresenta-se os perfis de
crescimento obtidos para os primeiros dias de cultivo.
Pode-se observar que o aumento da frequência de agitação favoreceu a
transferência de massa no meio com consequente aumento da taxa específica de
crescimento, resultando em taxas específicas de 0,306, 0,516 e 0,756 d-1 para as
rotações de 175, 200 e 225 rpm, respectivamente. Esse comportamento sugere que
a disponibilidade de CO2 era limitante nas condições de menor rotação.
Em vista desses resultados, a rotação de 225 rpm foi selecionada para a
continuidade dos experimentos de cultivo da microalga Chlorella sorokiniana. A
influência do uso de aeração ativa para suprimento de CO2 no crescimento dessa
microalga deve ser alvo de estudos futuros visando a otimização das condições de
cultivo, que estão além do escopo desse trabalho.
Figura 28. Perfil de crescimento de Chlorella sorokiniana a 175 rpm, 200 rpm e 225 rpm durante 10 dias de cultivo.
85
5.3.2 Cinética de acúmulo de carboidratos em C. sorokiniana
A evolução da massa seca e o perfil de acúmulo de glicose (amido) foram
avaliados a 225 rpm durante 25 dias, conforme ilustrado na Figura 29. Estes
resultados foram comparados com o consumo de nitrato e fosfato, apresentado na
Figura 30, de forma a correlacionar a depleção de algum desses nutrientes com o
acúmulo de amido.
Figura 29. Teor de glicose (cinza claro) e massa seca (cinza escuro) de C. sorokiniana em diferentes dias de cultivo a 225 rpm
Pode-se observar na Figura 29 que a massa seca da microalga apresentou
um aumento gradual entre os dias 3 e 17, com um aumento mais acentuado entre os
dias 17 e 20 de cultivo. Já o teor de glicose apresentou um ligeiro aumento entre os
primeiros dias de cultivo, com uma aceleração a partir do 13° dia. Ambos os
parâmetros alcançaram seus valores máximos no 20° dia de cultivo, sem diferença
estatística com os valores obtidos no 25° dia. Portanto, com o aumento da
frequência de agitação, foi possível reduzir o tempo de cultivo de 30 para 20 dias,
resultando em um aumento de produtividade de 40 % (24 mg.L-1.dia-1 a 175 rpm
para 34 mg.L-1.dia-1 a 225 rpm).
O aumento acentuado do teor de amido a partir do 13° dia de cultivo pode ser
correlacionado com a depleção de nitrato no meio de cultivo; a concentração desse
nutriente medida no meio de cultivo nesse mesmo dia foi igual a 0,02 g.L-1, indicando
que mais de 90 % da concentração inicial havia sido consumida (Figura 30). A
composição de nitrogênio elementar de C. sorokiniana foi reportada com valores
86
entre 6 % e 9 % para células com conteúdo de carboidratos similar ao do presente
estudo (KUMAR et al., 2014; LORENTE et al., 2015). Portanto, a partir de uma
concentração inicial de 0,25 g.L-1 de NaNO3 (0,04 g.L-1 de nitrogênio), seria possível
produzir entre 0,44 g.L-1 e 0,67 g.L-1 de biomassa, resultado próximo ao encontrado
nesse estudo, confirmando que, de fato, todo o nitrogênio inicialmente disponível foi
consumido pela microalga.
A depleção tanto de fósforo como de enxofre também são reportadas como
responsáveis pelo acúmulo de amido em microalgas (BRÁNYIKOVÁ et al., 2011). A
concentração de fosfato no meio de cultivo utilizado apresentou uma leve redução
inicial, porém, a partir do 5° dia, manteve-se constante, em torno dos 0,15 g.L-1
(Figura 30). O fósforo representa uma pequena porcentagem da massa seca celular
de microrganismos e, portanto, era esperado que a microalga não consumisse os
0,25 g.L-1 iniciais de fosfato presentes no meio de cultivo. O excesso de fosfato
explica-se pela função tamponante que os dois sais de fosfato apresentam no meio
de cultivo, e cuja depleção poderia levar a uma mudança acentuada no pH do meio.
Entretanto, mesmo sem a depleção dos sais de fosfato, foi observada uma variação
no pH do cultivo, de 6,5 inicialmente até 9,5 nos primeiros 13 dias de cultivo,
baixando para 8,5 nos dias subsequentes.
Figura 30. Perfil de consumo de fosfato, consumo de nitrato e pH durante o cultivo de Chlorella sorokiniana a 225 rpm.
87
A concentração de enxofre não foi acompanhada durante o cultivo. No
entanto, a composição elementar de enxofre de C. sorokiniana é reportada entre
0,46 % e 0,77 % (KUMAR et al., 2014; LORENTE et al., 2015). A concentração de
enxofre inicial do meio de cultivo utilizado foi em torno de 0,01 g.L-1, porém somente
0,005 g.L-1 seriam necessários para alcançar uma produção de biomassa de 0,7
g.L-1, levando-se a crer que o enxofre, assim como o fósforo, também está presente
em excesso no meio e, portanto, não foi responsável pelo acúmulo de amido.
5.3.3 Influência dos componentes do meio de cultivo no acúmulo de amido
por C. sorokiniana
O valor máximo obtido de teor de amido para Chlorella sorokiniana nas
condições utilizadas foi próximo a 30 % e esse acúmulo foi correlacionado à
depleção de nitrogênio do meio, condição já amplamente reportada como sendo
responsável por esse fenômeno.
Visando uma maximização do teor de amido intracelular, realizou-se um
estudo da composição do meio de cultivo de forma a verificar a necessidade dos
componentes do meio original e o impacto de cada um no acúmulo de amido. Os
perfis de crescimento obtidos em 3 condições (descritas no item 4.5) estão
apresentados na Figura 31. Apesar de 225 rpm ter sido escolhida como a melhor
frequência de agitação, esses experimentos foram realizados em etapa anterior, na
frequência de 200 rpm, quando a mesma estava sendo avaliada.
Pode-se observar que tanto o meio controle quanto o meio com
macronutrientes e ferro apresentaram perfis de crescimento similares, enquanto que
o meio sem os elementos-traço apresentou um crescimento inicial mais lento, apesar
de ter alcançado o mesmo patamar dos demais próximo ao 15º dia de cultivo.
Ambos os meios modificados não apresentavam os elementos-traços, portanto o
menor crescimento observado não pode ser atribuído à ausência dos mesmos. No
entanto, o meio sem elementos-traço apresentava EDTA na mesma quantidade que
o meio controle, porém com menos espécies químicas a serem queladas. Portanto,
o EDTA, agora em excesso, pode ter se ligado a outras espécies, antes livres,
minimizando sua disponibilidade no meio e reduzindo assim a velocidade de
crescimento da microalga.
88
A influência da concentração de EDTA e da ausência de ferro no crescimento
de C. sorokiniana pode ser observada na Figura 32 a partir dos resultados obtidos
com diferentes meios de cultivo, descritos no item 4.5.
As células cultivadas no meio 2, contendo apenas os macronutrientes,
apresentaram um crescimento inicial satisfatório, porém atingiram a fase
estacionária na metade do tempo das demais, resultando em um crescimento 60 %
menor. Essas células também apresentaram a menor massa seca e o menor teor
em glicose ao final do cultivo, confirmando a necessidade do acréscimo de ferro ao
meio de cultivo (Figura 32). A deficiência de ferro pode causar redução tanto na
atividade fotossintética quanto na respiratória, uma vez que esse metal atua no
Figura 31. Perfil de crescimento celular de Chlorella sorokiniana a 200 rpm em meio original contendo todos os componentes (Controle), meio original sem elementos-traço (Zn, Mn, Mo, Cu e Co) e meio contendo apenas macronutrientes acrescidos de ferro (sem EDTA, boro e elementos-traço).
Figura 32. Massa seca (pontos) e teor de glicose (colunas) obtidos após 20 dias de cultivo de Chlorella sorokiniana a 200 rpm em diferentes meios: 1 - meio original; 2 - apenas macronutrientes; 3 - meio 2 + solução de ferro; 4 - meio 3 + EDTA 0,05 g.L-1; 5 - meio 3 + EDTA 0,025 g.L-1.
89
transporte de elétrons em ambas as vias metabólicas, levando a um menor
crescimento celular e menor acúmulo de amido (BRIAT et al., 2007).
As células cultivadas nos demais meios contendo ferro apresentaram massa
seca e teor de glicose próximos, entre 0,67 e 0,72 g.L-1 e 23 % e 26%,
respectivamente, sem diferenças significativas (p>0,05). Porém, as células
cultivadas no meio 4, contendo os macronutrientes acrescidos de ferro e EDTA na
concentração original, apresentaram a menor taxa específica de crescimento (0,166
d-1), confirmando a observação anterior de que o EDTA, presente na concentração
original em um meio com menos espécies químicas, retardaria o crescimento celular.
O meio 5, contendo a metade da concentração de EDTA do meio 4, apresentou uma
taxa de crescimento significativamente maior (0,331 d-1), porém ainda menor do que
a taxa obtida com o meio original (0,428 d-1). Apesar de o meio 3, sem EDTA, ter
apresentado a maior taxa específica de crescimento (0,506 d-1) e teor de glicose
satisfatório, é recomendado manter esse componente no meio de cultivo devido a
seu papel na manutenção dos componentes do meio solubilizados, impedindo sua
precipitação e dificuldade de assimilação pelas células. No entanto, comprovou-se
que sua concentração deve ser correlacionada com a quantidade de nutrientes
dissolvidos no meio, evitando que o agente quelante retarde o crescimento da
microalga de interesse, deixando-a mais vulnerável a contaminações.
O cultivo que serviu de pré-inóculo para os experimentos com meios
modificados foi realizado no meio controle contendo todos os nutrientes. De forma a
minimizar a interferência desses componentes nos resultados obtidos com as
modificações do meio, as células do meio controle foram centrifugadas e o
sobrenadante foi descartado antes da inoculação nos meios modificados. Mesmo
sem essa interferência, os meios que não continham boro e elementos-traço
apresentaram o mesmo crescimento que o meio completo. Portanto, as quantidades
necessárias desses nutrientes de forma a manter o crescimento saudável de C.
sorokiniana são muito inferiores às acrescentadas ao meio de cultivo original. Esses
resultados indicam que C. sorokiniana é uma espécie com baixa exigência
nutricional, tornando-a interessante para cultivo em um contexto industrial. Um
estudo mais aprofundado deve ser conduzido de forma a determinar a real
necessidade desses nutrientes no metabolismo de C. sorokiniana, evitando-se
gastos desnecessários com nutrientes em cultivos de maior escala.
90
Apenas o meio de cultivo com deficiência em ferro resultou em uma mudança
significativa, porém negativa, no teor de amido final de C. sorokiniana. Portanto, em
seguida buscou-se estudar a influência dos macronutrientes no acúmulo de amido e
os resultados obtidos estão apresentados na Figura 33.
Foi observado que a ausência de cloreto de cálcio não afetou o acúmulo de
amido por C. sorokiniana e nem o seu crescimento nos primeiros 10 dias de cultivo,
uma vez que tanto os resultados de massa seca quanto de teor de glicose obtidos
nessa condição (0,28 g.L-1 e 7,1 %, respectivamente) foram similares aos obtidos
com o meio controle (0,27 g.L-1 e 7,5 %, respectivamente). No entanto, o
prolongamento do tempo de cultivo resultou em uma massa seca 27 % e um
acúmulo de amido 19 % menor no meio de cultivo sem cloreto de cálcio em
comparação ao meio controle, indicando que esse nutriente é necessário, porém
aparenta estar em excesso no meio original.
A retirada dos demais nutrientes exerceu efeito significativo tanto na massa
seca quanto no teor de glicose obtidos. A retirada do nitrato de sódio resultou em um
crescimento praticamente nulo após 10 dias, não sendo possível obter biomassa
suficiente para a caracterização quanto ao teor de glicose. Esse resultado indica
que, se a depleção de nitrogênio é a estratégia a ser adotada para acúmulo de
amido, ela deve ser obtida pela extensão do tempo de cultivo de forma a permitir
que as células consumam todo o nitrogênio disponível, apresentando assim um
Figura 33. Massa seca (pontos) e teor de glicose (colunas) obtidos após 10 dias de cultivo de Chlorella sorokiniana a 225 rpm em diferentes meios: meio C - meio controle contendo todos os nutrientes; meio P - meio C sem os sais de fosfato; meio S - meio C sem o sulfato de magnésio; meio Ca - meio C sem o cloreto de cálcio.
91
crescimento satisfatório, e depois iniciem a fase de acúmulo mais acentuado de
amido após a depleção do nitrogênio. Não é recomendado utilizar uma restrição de
nitrogênio inicial, uma vez que o crescimento celular está diretamente ligado à sua
presença e essa estratégia resultaria em um crescimento celular baixo.
A microalga apresentou crescimento tanto no meio em que foi retirado o
fosfato quanto no meio sem sulfato de magnésio, apesar de a massa seca
alcançada nesses meios ter correspondido a apenas 68 % e 51 %, respectivamente,
da alcançada no meio controle. No entanto, o teor de glicose nesses meios
apresentou um aumento de 2,4 e 3,5 vezes em relação ao controle, alcançando 18
% e 27 % para os meios sem fósforo e sem sulfato de magnésio, respectivamente,
indicando que de fato esses macronutrientes podem ser associados ao acúmulo de
amido em C. sorokiniana e que sua ausência, apesar de afetar negativamente o
crescimento celular, não resulta em um crescimento nulo. Portanto, a concentração
desses nutrientes no meio de cultivo deve ser investigada de forma a se obter um
balanço entre crescimento celular satisfatório e acúmulo de amido.
Diversas microalgas já foram descritas como capazes de acumular fosfato na
forma de grânulos de polifosfato. Esse acúmulo pode acontecer tanto em resposta a
um período de falta de fosfato como também pela presença de uma alta
concentração de fosfato no meio de cultivo (EIXLER et al., 2006). Portanto, a maior
massa seca obtida no cultivo sem fosfato pode ser resultante de um consumo inicial
da reserva intracelular de fosfato. Após seu esgotamento, as células teriam iniciado
o processo de acúmulo de amido, porém com alguns dias de atraso em relação às
células com deficiência em sulfato de magnésio, e por isso teriam apresentado um
menor teor de amido.
De um modo geral, resultados similares foram reportados para Chlorella sp.
cultivada em ausência de nitrato, fosfato e sulfato (BRÁNYIKOVÁ et al., 2011). As
células cultivadas em ausência de nitrato não apresentaram aumento da massa
seca inicial, enquanto que as células cultivadas tanto em ausência de sulfato quanto
de fosfato apresentaram crescimento, apesar de discreto. No entanto, os autores
observaram que a falta de sulfato resultou em um crescimento superior do que a
ausência de fosfato, resultado inverso ao encontrado no presente estudo. Também
foram observadas diferenças mais acentuadas entre o teor de amido no presente
trabalho do que as reportadas pelos autores. Possivelmente espécies diversas
apresentam respostas diferentes frente à falta de algum nutriente no meio de cultivo.
92
Mesmo após as diferentes modificações realizadas no meio de cultivo, o valor
máximo de teor de glicose obtido permaneceu um pouco abaixo de 30 %. Assim,
uma última estratégia foi testada visando aumentar esse teor com base em dados
reportados na literatura indicando que a transferência de células cultivadas em
meios plenos de nutrientes para um meio deficiente em nitrogênio (DRAGONE et al.,
2011) ou para água deionizada (HO et al., 2013) resulta em um maior acúmulo de
carboidratos. Portanto, células colhidas no início do cultivo e que apresentavam
baixo conteúdo de amido (em torno de 8 %) foram transferidas para um meio
completo sem nitrato de sódio ou para água deionizada e seu conteúdo de amido foi
acompanhado. Estes resultados estão apresentados na Figura 34.
Pode-se observar que ambas as condições resultaram em teores de glicose
finais iguais de 28 %. No entanto, as células transferidas para a água deionizada
acumularam amido mais rapidamente do que as células transferidas para o meio
completo sem nitrato. Esse resultado indica um possível efeito sinérgico entre as
diferentes depleções nutricionais que acionam o mecanismo de acúmulo de amido
em C. sorokiniana. Um período de cultivo maior do que 2 semanas levou à redução
dos teores de amido em ambas as condições, indicando uma possível mudança de
metabolismo do acúmulo de amido para o acúmulo de lipídeos (LI et al., 2015).
5.3.4 Comparação com dados da literatura
Segundo resultados do presente estudo e dados reportados na literatura para
a microalga C. sorokiniana (KOBAYASHI et al., 2013; KUMAR et al., 2014; LI et al.,
Figura 34. Teor de glicose acumulado por células de C. sorokiniana cultivadas em água deionizada (cinza claro) ou meio completo sem nitrato de sódio (cinza escuro) após diferentes períodos. O inóculo foi feito com uma cultura cultivada em meio completo e colhida antes que o nitrogênio fosse totalmente consumido, apresentando um teor de glicose de 8 %.
93
2015; TAKESHITA et al., 2014), pode-se concluir que essa microalga apresenta um
limite de acúmulo de amido próximo a 30 %, a partir do qual o teor de amido começa
a diminuir se a situação de estresse for prolongada. Na melhor condição de acúmulo
de amido encontrada, essa microalga apresentou um teor de carboidratos totais de
35 % (28 % de amido), um teor de proteínas de 26 % e um teor de lipídeos de 21 %
(m/m) em base seca.
Na Tabela 9 apresenta-se resultados reportados na literatura quanto ao teor
de carboidratos, lipídeos e proteínas presentes em diversas espécies de microalgas.
Comparando-se os resultados obtidos no presente estudo com a microalga C.
sorokiniana com os dados reportados na Tabela 9 para o acúmulo de carboidratos
em microalgas, pode-se concluir que essa espécie apresenta um bom potencial para
acúmulo de amido, apesar de outras microalgas serem capazes de acumular teores
superiores. No entanto, microalgas que apresentam teores de amido superiores a 30
% apresentam teores reduzidos de proteínas ou lipídeos. Em um contexto de
biorrefinaria, em que se deseja obter diversos produtos a partir de uma mesma
matéria-prima, uma composição balanceada de proteínas, lipídeos e carboidratos,
como a apresentada por C. sorokiniana nas condições utilizadas no presente estudo,
pode vir a ser economicamente mais atrativa. O açúcar poderia ser recuperado para
produção de commodities, enquanto que os lipídeos e as proteínas poderiam
originar produtos com maior valor agregado.
Tabela 9. Teor de carboidratos (teor de amido apresentado em parêntesis), lipídeos e proteínas de diversas espécies de microalgas
Espécie Carboidratos
(amido) (%)
Lipídeos
(%)
Proteínas
(%) Referência
Arthrospira platensis ~ 60 ~ 5 ~ 25 MARKOU et al., 2013
Chlamydomonas fasciata n.d. (43,5) n.d. 30,4 ASADA et al., 2012
Chlamydomonas
reinhardtii 59,7 (43,6) n.d. 9,2 CHOI et al, 2010a
Chlorella variabilis 53,9 (37,8) 24,7 19,8 CHENG et al., 2013
Chlorella vulgaris 50,4 (31,3) 11,6 23,3 HO et al., 2013
Dunaliella salina 32 6 57 BECKER, 2007
Mychonastes
homosphaera 60 (55) 26 6 Dados internos
Chlorella sorokiniana 35 (28) 21 26 Presente estudo
n.d. - não determinado
94
5.3.5 Considerações finais
Foi possível aumentar a produtividade em biomassa seca de C. sorokiniana
pelo ajuste da frequência de agitação, o que indica que maiores produtividades
podem ser alcançadas em um sistema com aeração ativa e um design mais
apropriado para cultivo de microalgas.
Os resultados obtidos indicam que o meio para cultivo de C. sorokiniana
utilizado inicialmente apresenta nutrientes em excesso que podem ser retirados ou
ter sua concentração reduzida sem comprometer o crescimento celular. O acúmulo
de amido pelas células nas condições de cultivo utilizadas foi correlacionado à
depleção de nitrogênio no meio, apesar de ter sido comprovada que a ausência
tanto dos sais de fosfato quanto de enxofre também pode levar a um maior acúmulo
de amido pela microalga.
O máximo teor de glicose alcançado para C. sorokiniana em todas as
condições testadas foi em torno de 30 %, o que, juntamente com dados da literatura,
leva a crer que esse é o limite biológico da microalga estudada. Essa microalga
apresentou uma composição balanceada de carboidratos, proteínas e lipídeos, o
que é uma característica interessante para o processamento em uma biorrefinaria.
5.4 Processamento de Chlorella sorokiniana em um contexto de biorrefinaria
5.4.1 Hidrólise enzimática de Chlorella sorokiniana
A hidrólise enzimática de C. sorokiniana foi investigada com o objetivo de
recuperar, na forma de um xarope de glicose, o amido acumulado intracelularmente
por essa microalga. Essa glicose pode ser utilizada em processos posteriores para
produção de diversas moléculas de interesse (BOZELL e PETERSEN, 2010).
Uma etapa inicial necessária para o processo é o rompimento da parede
celular de forma a permitir que as amilases tenham acesso ao amido intracelular.
Conforme os resultados de caracterização dos carboidratos de C. sorokiniana (item
5.2.2), a celulose, se presente, é um componente minoritário da parede celular
dessa microalga e, portanto, a hidrólise apenas com celulases pode não ser efetiva.
A parede celular de microalgas do gênero Chlorella já foi hidrolisada com enzimas
como pectinases (KIM et al., 2014), quitinases (GERKEN et al., 2013) e proteases
(MAHDY et al., 2016). Com base nesses dados, foi utilizada inicialmente uma
95
mistura enzimática composta pelos sobrenadantes do cultivo dos fungos
filamentosos Trichoderma reesei e Aspergillus awamori. T. reesei é comumente
utilizado para produção de celulases, enquanto que fungos do gênero Aspergillus
apresentam alta produção de amilases; no entanto, ambos os fungos são capazes
de produzir proteases (KREDICS et al., 2005; NEGI e BANERJEE, 2009),
pectinases (OLSSON et al., 2003; BOTELLA et al., 2007) e quitinases (SEIDL et al.,
2005; AWAD et al., 2014).
5.4.1.1 Redução do volume de hidrólise
Devido à pequena quantidade de biomassa produzida em cada batelada, foi
feito um estudo de redução da escala de hidrólise, comparando-se os resultados
obtidos em frascos agitados com 12,5 mL de volume útil com os alcançados em
tubos tipo Eppendorf® com 1,25 mL de volume útil. A escolha de uma carga de
sólidos de 1 % (m/m) foi igualmente motivada pela quantidade reduzida de biomassa
disponível. Os perfis de hidrólise encontrados estão apresentados na Figura 35.
Ambas as condições presentes na Figura 35 apresentaram o mesmo perfil de
hidrólise enzimática, com a condição de menor volume resultando em rendimentos
ligeiramente superiores, porém sem diferença estatisticamente significativa entre os
rendimentos finais. Portanto, os experimentos subsequentes foram realizados na
menor escala avaliada, a não ser quando explicitado o contrário.
Figura 35. Perfil de hidrólise enzimática de C. sorokiniana em frascos agitados contendo 12,5 mL e eppendorfs contendo 1,25 mL.
96
5.4.1.2 Hidrólise enzimática de células liofilizadas
O primeiro aspecto investigado relativo à hidrólise enzimática da fração de
carboidratos de C. sorokiniana foi a possibilidade de rompimento de sua parede
celular pela ação de enzimas. Para tal, foram utilizadas células após liofilização e
misturas enzimáticas produzidas por dois fungos filamentosos: Trichoderma reesei
Rut C-30, produtor de celulases, e Aspergillus awamori, produtor de β-glicosidases e
amilases. Foram utilizadas inicialmente cargas enzimáticas de celulases e β-
glicosidases usualmente utilizadas na hidrólise de materiais celulósicos (20 FPU/g
de glucana e 60 BGU/g de glucana). A Tabela 10 contém as atividades de celulases,
β-glicosidases e amilases presentes em cada experimento e a Figura 36 apresenta
os perfis de hidrólise encontrados para cada preparado enzimático utilizado.
Tabela 10. Atividades de celulases totais (FPU), β-glicosidases (BGU) e amilases (AMU) por grama de glucana utilizadas nos experimentos de hidrólise. As diferentes atividades foram obtidas a partir dos sobrenadantes dos fungos Trichoderma reesei Rut C-30 (Rut) e Aspergillus awamori (Awa).
FPU BGU AMU
U/g glucana
Awa 0,4 60,0 540,0
Rut 20,0 2,9 4,8
Rut + Awa 20,4 62,9 544,8
Rut AMU* 2240,5 319,3 540,0 * preparado enzimático idêntico ao Rut, porém utilizado em maior volume de forma a resultar na mesma atividade de AMU que o preparado Awa
Figura 36. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas de C. sorokiniana com enzimas produzidas pelos fungos T. reesei (Rut) e A. awamori (Awa) a 50 °C, pH 4,8. O controle corresponde às mesmas condições de hidrólise, porém sem adição de enzimas.
97
O ensaio contendo o sobrenadante do fungo T. ressei (Rut) não apresentou
diferença estatística quando comparado ao controle. Adicionalmente, o ensaio
contendo sobrenadantes de ambos os fungos (Rut + Awa) apresentou o mesmo
perfil de hidrólise do ensaio contendo apenas o sobrenadante do fungo A. awamori
(Awa), indicando que apenas as enzimas de A. awamori foram capazes de atuar na
hidrólise da microalga. Pode-se concluir, portanto, que a hidrólise observada não foi
resultante da ação de celulases, uma vez que as enzimas de A. awamori não
apresentam atividade celulolítica expressiva.
De forma a confirmar se a glicose liberada era resultado da ação de amilases,
foi conduzido um ensaio contendo um volume maior de enzimas de T. reesei (Rut
AMU) a fim de se obter a mesma atividade de amilase apresentada no ensaio com
as enzimas de A. awamori (Figura 36). Não foi encontrada diferença
estatisticamente significativa entre os rendimentos de hidrólise em ambas as
condições, o que indica que a glicose foi de fato liberada pela ação de amilases.
As células hidrolisadas foram observadas em microscópio ótico. O tingimento
com iodo permitiu identificar a presença de amido intracelular nas células pós-
hidrólise (Figura 37). No entanto, diversas células sem tingimento foram observadas,
sendo essas provavelmente a fonte do amido que foi hidrolisado. Não foi observado
nenhum rompimento celular significativo, porém nenhum teste foi feito para
comprovar essa observação.
Apesar de haver sido observada liberação de glicose com as enzimas
utilizadas na hidrólise das células liofilizadas, os rendimentos finais em glicose foram
baixos, alcançando-se um máximo de 23 %. Este rendimento foi similar ao reportado
por LEE et al. (2015), que alcançaram um rendimento final de 27,4 % para células
íntegras de Chlorella sp..
Figura 37. Microscopia ótica de células liofilizadas de C. sorokiniana tingidas com iodo após 24 horas de hidrólise com enzimas de A. awamori.
98
Existem poucos estudos sobre o efeito do processo de liofilização na estrutura
de microalgas; no entanto, alguns estudos reportam o declínio da eficiência de
extração de lipídeos em algas liofilizadas (CRAMPON et al., 2013; MOUAHID et al.,
2013). Portanto, a liofilização também poderia exercer um efeito negativo sobre a
hidrólise devido a mudanças estruturais na parede celular. A hidrólise enzimática,
nas mesmas condições utilizadas para as células liofilizadas, foi conduzida em
células frescas logo após a colheita, sem nenhum método de secagem prévio. Os
rendimentos obtidos com as células frescas foram inferiores aos obtidos com as
células liofilizadas (11,5 % e 22,0 %, respectivamente), indicando que a parede
celular de C. sorokiniana, mesmo sem liofilização, não é hidrolisável pelos
preparados enzimáticos utilizados. Esse resultado também indica que a liofilização
auxilia no rompimento de algumas células, possivelmente pela formação de cristais
de gelo intracelulares, que podem causar danos à parede celular.
A formação de protoplastos (células sem parede celular) de C. sorokiniana foi
investigada por RUSSELL (1995). A autora avaliou a resistência da parede celular
dessa espécie frente à atuação de diferentes enzimas e concluiu que a presença de
rhamnose e de proteínas na parede celular era o fator aparentemente responsável
pela recalcitrância dessa parede. Em um estudo mais recente sobre a hidrólise da
parede celular de C. sorokiniana, YIN et al. (2010) demonstraram ser possível o
rompimento dessa estrutura por um preparado enzimático produzido por uma
bactéria do gênero Cellulomonas. Apesar de o estudo enfatizar a atuação de
celulases como responsável pelo rompimento da parede, a presença de proteases
foi identificada no preparado utilizado pelos autores e a concentração de proteínas
no hidrolisado foi cerca de 10 vezes maior do que a de açúcares redutores. Esses
resultados indicam que as proteases, ao invés das celulases, foram mais
importantes no rompimento da parede celular de C. sorokiniana.
Portanto, proteases parecem ser necessárias para a ruptura das células de C.
sorokiniana de forma a possibilitar que as amilases tenham acesso ao amido
intracelular. Apesar de ambos os fungos estudados serem reportados como
produtores de proteases, as condições em que essas enzimas são secretadas em
quantidades expressivas podem não corresponder às condições selecionadas para
a produção das enzimas utilizadas no presente trabalho. Ademais, a hidrólise da
fração proteica de C. sorokiniana de forma a liberar o amido intracelular não estaria
de acordo com os objetivos desse estudo. Se a hidrólise de proteínas ocorresse, os
99
aminoácidos seriam solubilizados em conjunto com a glicose, necessitando-se uma
etapa adicional de separação de forma a se aproveitar a fração proteica como
suplemento nutricional.
5.4.1.3 Hidrólise enzimática de células moídas
Uma vez que as enzimas testadas não foram eficazes no rompimento da
parede celular de C. sorokiniana, foi empregado um tratamento físico de moagem
para ruptura dessa estrutura e exposição do amido intracelular à ação das enzimas.
De forma a verificar a eficiência da moagem como método de ruptura, foi feita a
contagem de células antes e após a passagem pelo moinho vibratório e observação
em microscópio (Figura 38). Apenas poucas células íntegras foram verificadas após
a moagem, resultando em uma eficiência de ruptura acima de 99 %.
Figura 38. Microscopia ótica de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana. A seta vermelha destaca uma das poucas células íntegras que foram encontradas
A Figura 39 apresenta os rendimentos de hidrólise das células moídas obtidos
com os preparados enzimáticos de T. reesei e A. awamori com as mesmas
atividades reportadas na Tabela 10. Novamente foram observados perfis similares
para as hidrólises conduzidas com a mistura dos sobrenadantes de ambos os
fungos (Rut + Awa) e com apenas as enzimas de A. awamori (Awa). No entanto, os
rendimentos obtidos apenas com as enzimas de T. reesei (Rut) foram superiores aos
observados no experimento controle para as células moídas. Esse aumento pode
ser relacionado a uma maior disponibilidade de substrato com as células moídas,
permitindo que a reduzida atividade de amilase presente no preparado de T. reesei
resultasse em uma liberação de glicose mais expressiva do que quando utilizou-se
células não moídas.
Observou-se que as celulases também não apresentaram atuação expressiva
na hidrólise das células moídas, uma vez que novamente encontrou-se resultados
similares para as misturas enzimáticas awa e Rut + awa. Esse resultado pode ter
100
duas implicações: (i) presença de um teor reduzido de celulose na camada interna
da parede celular; (ii) presença de uma parede celular que corresponda a um
percentual mínimo da massa total da célula. Ambas as implicações corroboram os
resultados de caracterização que indicaram um teor reduzido de celulose em relação
à massa total celular.
Com o rompimento da parede celular por moagem, foi possível alcançar uma
alta conversão de amido em glicose, com rendimentos de 90 % após apenas 6 horas
de hidrólise. Esse resultado indica que o preparado enzimático de A. awamori é
eficiente na hidrólise do amido de C. sorokiniana.
A moagem das células frescas também foi testada de forma a se evitar a
etapa de secagem da biomassa e tornar o processo menos oneroso. No entanto, um
rendimento em glicose de apenas 32 % foi observado para a alga fresca moída. A
observação em microscópico ótico revelou que, após a moagem, a maioria das
células permaneceu íntegra, sem rompimento da parede. A baixa eficiência da
moagem úmida pode ser atribuída ao caráter pastoso das células úmidas, que
promoveu uma redução no coeficiente de atrito entre a bola, a biomassa e a parede
do moinho. Esse fenômeno foi comprovado pela observação de espaços sem
biomassa onde a bola atingiu a parede do moinho.
Figura 39. Perfil de hidrólise enzimática de células moídas de C. sorokiniana, após liofilização, com enzimas produzidas pelos fungos T. reesei (Rut) e A. awamori (Awa) a 50 °C, pH 4,8. O controle corresponde às mesmas condições de hidrólise, porém sem adição de enzimas.
101
5.4.1.4 Estudo das condições de hidrólise
Uma vez estabelecido que os melhores resultados de hidrólise foram obtidos
com o uso da microalga seca e moída e que as amilases são as enzimas
responsáveis pela liberação de glicose da biomassa de C. sorokiniana, buscou-se
estabelecer quais seriam as melhores condições operacionais de temperatura, pH e
carga enzimática. A Figura 40 apresenta a variação da atividade enzimática do pool
amilolítico de A. awamori com o aumento da temperatura.
A temperatura em que as amilases de A. awamori apresentaram atividade
máxima foi de 60 °C. Foi observado um aumento constante da atividade entre as
temperaturas de 30 °C e 60 °C e uma queda brusca na atividade em temperaturas
acima de 70 °C, com a atividade próxima a zero a 80 °C devido à desnaturação
proteica.
Na temperatura de maior atividade, foi feita uma avaliação da atividade
amilolítica em diferentes valores de pH, chegando-se a uma atividade máxima em
pH 4,0 (Figura 41). A atividade de amilase foi superior para valores de pH mais
ácidos, com uma queda acentuada em valores de pH maiores do que 5.
Figura 40. Atividade percentual relativa de amilase do preparado enzimático de Aspergillus awamori em diferentes temperaturas e pH 4,8
102
Para os ensaios nos quais o amido solúvel foi usado como substrato, o ajuste
das condições de temperatura e pH possibilitou o aumento da atividade enzimática
em até 50 %. Conforme observa-se na Figura 42, o aumento da atividade enzimática
foi também observado na hidrólise do substrato real.
Neste caso, o mesmo volume de enzima alcançou maiores rendimentos nas
condições modificadas (60 °C, pH 4,0) quando comparado com as condições iniciais
(50 °C, pH 4,8).
Após a determinação das condições ideais de pH e temperatura, buscou-se
ajustar a carga enzimática (atividade de amilase por grama de glucana) para a
Figura 42. Atividade percentual relativa de amilase do preparado enzimático de Aspergillus awamori em diferentes pHs a 60 °C
Figura 41. Rendimentos em glicose obtidos após 4 horas de hidrólise de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana com enzimas de A. awamori em diferentes condições de temperatura e pH. Para todos os ensaios, foi utilizado o mesmo volume de preparado enzimático, correspondendo a 540 AMU/g de glucana na condição de 60 °C e pH 4,0.
103
hidrólise do amido de C. sorokiniana. Os perfis de hidrólise obtidos com diferentes
concentrações de enzima se encontram na Figura 43.
As três cargas enzimáticas testadas resultaram em um mesmo rendimento
em glicose após 4 horas de hidrólise. No entanto, o aumento de 540 AMU/g de
glucana para 850 AMU/g de glucana traduziu-se em um aumento nas taxas iniciais
de hidrólise, além de possibilitar a redução de pelo menos 1 hora no tempo de
processamento. O aumento da carga enzimática para além de 850 AMU/g glucana
não resultou em um ganho significativo na velocidade de hidrólise.
Com base nestes resultados, a carga de 850 AMU/g de glucana foi escolhida
para os experimentos subsequentes contendo um maior teor de sólidos. Além da
redução do tempo total de hidrólise, essa carga promoveu uma maior velocidade
inicial de hidrólise, característica favorável em hidrólises com altas cargas de sólido,
em que a liquefação inicial da biomassa auxilia na redução da viscosidade do
sistema, permitindo uma melhor homogeneização da mistura (MODENBACH e
NOKES, 2013).
5.4.1.5 Aumento da carga de sólidos
Todos os ensaios anteriores foram realizados com uma carga de sólidos de
1%, em que quase nenhum efeito de resistência quanto ao transporte de massa foi
observado. No entanto, em uma realidade industrial, a carga de sólidos deve ser a
maior possível de forma a gerar uma corrente de saída concentrada no produto de
Figura 43. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana com diferentes concentrações do preparado enzimático de A. awamori a 60 °C e pH 4,0.
104
interesse, reduzindo assim os custos de instalação e operação do processo
(Modenbach e Nokes, 2013).
De forma a verificar a influência do aumento da carga de sólidos no
rendimento final de hidrólise, foram realizados ensaios contendo um teor de sólidos
entre 5 % e 30 % (m/m). Para esses ensaios, o volume de hidrólise foi aumentado
para 12,5 mL de forma a permitir uma melhor mistura do sistema e evitar que o
volume reduzido prejudicasse os rendimentos obtidos. Na Figura 44, ilustra-se os
resultados de concentração e rendimento em glicose obtidos após 4 horas de
hidrólise com as diferentes cargas.
Foi possível observar que, com o aumento da concentração de sólidos de 5 %
para 30 % (m/m), o rendimento em glicose final passou de 98 % para 61 % após 4
horas de hidrólise. Apesar da perda de 39 % no rendimento, o aumento da carga de
sólidos possibilitou um aumento da concentração de glicose final de 433 %,
passando de 15 g.L-1 para 80 g.L-1. A queda de rendimento foi mais acentuada entre
25 % e 30 % de sólidos. A condição de 30 % foi a única que apresentou uma
consistência pastosa, com maior resistência ao escoamento. Possivelmente, em
uma configuração de reator com agitação mecânica, seria possível obter
rendimentos mais elevados para a carga de sólidos de 30 % devido a uma melhor
homogeneização e um melhor contato entre enzimas e substrato. Conjuntamente,
esses resultados demonstram a possibilidade de condução da hidrólise de células
Figura 44. Concentração de glicose (colunas) e rendimento em glicose (pontos) obtidos após 4 horas de hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana com enzimas de A. awamori a 850 AMU/g glucana, 60 °C e pH 4,0 com diferentes cargas de sólidos
105
moídas de C. sorokiniana em altas cargas de sólidos de forma a se obter uma
corrente concentrada em glicose para posterior processamento.
5.4.1.6 Avaliação da hidrólise do amido de C. sorokiniana
A Tabela 11 apresenta o rendimento em glicose reportado em outros
trabalhos para a hidrólise enzimática de amido de microalgas. Pode-se constatar
uma grande variação nos resultados obtidos por diferentes grupos, sendo reportados
tempos de hidrólise desde 1 hora até 72 horas. Em dois casos, não foram avaliados
tempos menores de hidrólise (MARŠÁLKOVÁ et al., 2010; HO et al., 2013), e um
terceiro utilizou uma mistura enzimática rica em pectinase sem avaliar a atividade de
amilase da mesma, que possivelmente estava em baixa concentração (KIM et al.,
2014).
Tabela 11. Rendimentos em glicose da hidrólise enzimática de microalgas ricas em amido
Microalga Tratamento Carga de
sólidos
Rendimento
em glicose
Referência
Chlorella sp. Moagem 22 g/L 97 % (24 h) MARŠÁLKOVÁ et
al., 2010
Chlorella vulgaris Sonicação/
Autoclave
10 g/L 79 % (24 h) HO et al., 2013
Chlorella vulgaris Moagem 100 g/L 79 % (72 h) KIM et al., 2014
Chlorella sp. Extração de lipídeos 50 g/L 93,4 % (3 h) LEE et al., 2015
Chlamydomonas
reinhardtii
Proteases/
Liquefação
50 g/L 94 %
(30 min)
CHOI et al., 2010
Scenedesmus
dimorphus
Moagem/
Gelatinização
20 g/L 95,8 % (1 h) CHNG et al., 2016
C.sorokiniana Moagem 111 g/L 94 % (4 h) Presente estudo
As concentrações de sólidos utilizadas pelos diferentes grupos variam de 10 a
100 g/L. Portanto, foi escolhida a carga de 10 % (m/m) avaliada no presente estudo
para comparação dos resultados da literatura. O resultado obtido nesse estudo foi
comparável ao reportado por LEE et al. (2015) na hidrólise de células de Chlorella
sp. após extração de lipídeos, conforme apresentado na Tabela 11.
Os outros dois trabalhos apresentados na Tabela 11 realizaram a hidrólise
enzimática com uma etapa de gelatinização ou liquefação anterior, alcançando
rendimentos similares ao presente trabalho, porém em tempos menores (CHOI et al.,
2010; CHNG et al., 2016). A gelatinização consiste em um aquecimento do material
amiláceo de forma a romper a estrutura cristalina do mesmo, tornando a molécula de
amido mais amorfa e mais suscetível à ação enzimática (RATNAYAKE e JACKSON,
106
2008). Já a etapa de liquefação consiste em utilizar α-amilase termoestável a altas
temperaturas de forma a reduzir o grau de polimerização do amido. Portanto, a
mistura contendo amiloglucosidases, ao ser adicionada, encontra um material muito
mais facilmente hidrolisável, resultando em tempos reduzidos de processamento.
Os processos de gelatinização e liquefação são tradicionalmente utilizados na
indústria de etanol de milho (SÁNCHEZ e CARDONA, 2008). No entanto, essas
etapas geram desvantagens ao processo, como alto gasto energético com
aquecimento e resfriamento. Uma solução é a hidrólise "fria" do amido, ou seja, em
temperaturas abaixo da temperatura de gelatinização, também denominada de
hidrólise de amido cru (ROBERTSON et al., 2006; CINELLI et al., 2015).
No presente trabalho, a maior temperatura de hidrólise utilizada foi 60 °C,
abaixo das temperaturas de gelatinização reportadas para amidos de microalgas,
que se situam em geral entre 65 °C e 70 °C (DESCHAMPS et al., 2006;
MARŠÁLKOVÁ et al., 2010). A gelatinização de amido de cereais geralmente
também ocorre nessa faixa de temperatura (RATNAYAKE e JACKSON, 2008).
Portanto, pode-se afirmar que, a 50 °C, moléculas de amido, de um modo geral, não
sofrem gelatinização. Como não houve uma diferença muito expressiva entre as
taxas de hidrólise com o aumento da temperatura de 50 °C para 60 °C, pode-se
inferir que as hidrólises conduzidas nesse estudo foram realizadas abaixo da
temperatura de gelatinização do amido de C. sorokiniana. No entanto, não se deve
descartar a possibilidade de uma desestruturação parcial do grânulo do amido a 60
°C (KOUTINAS et al., 2004) , o que poderia explicar o ligeiro aumento na velocidade
de reação a 60 °C quando comparada com a alcançada a 50 °C para uma mesma
carga enzimática.
Mesmo sem a etapa de gelatinização, o amido cru de C. sorokiniana foi
altamente suscetível à hidrólise enzimática pelas enzimas de A. awamori. Esse
fungo já foi reportado como sendo produtor de amilases capazes de hidrolisar
amidos não-gelatinizados (HAYASHIDA, 1975; MATSUBARA et al., 2004;
KOUTINAS et al., 2004; DE CASTRO et al., 2011). Portanto, a alta taxa de hidrólise
encontrada poderia estar associada a três fatores: (i) alta capacidade hidrolítica das
enzimas de A. awamori quando se utiliza amido cru como substrato, (ii)
desestruturação do grânulo de amido pelo tratamento com moagem e (iii) alta
suscetibilidade do amido de C. sorokiniana à hidrólise enzimática. De forma a testar
essas hipóteses, a hidrólise de amido de milho comercial (Maizena®) in natura, após
107
gelatinização e após moagem foi comparada com a de células moídas de C.
sorokiniana com a mesma carga de sólidos e os resultados estão apresentados na
Figura 45.
Em relação à hipótese (i), as enzimas de A. awamori foram capazes de
promover apenas a hidrólise parcial do amido de milho cru e, portanto, não
apresentaram alta eficiência para a hidrólise "fria" desse substrato. No entanto, após
a moagem, os rendimentos de hidrólise do amido cru foram muito superiores aos
obtidos com o amido cru, apesar de ligeiramente inferiores aos obtidos com o amido
gelatinizado, alcançando um rendimento final em glicose de 85 % após 90 minutos.
Esse resultado indica que a hipótese (ii) é válida e que a moagem tem efeitos sobre
a estrutura do grânulo de amido, tornando-o mais suscetível à ação enzimática e
com um perfil de hidrólise próximo ao obtido com o amido gelatinizado. De fato, foi
observado que o amido moído apresentou maior solubilidade a frio do que o amido
in natura.
O efeito de moagem nas propriedades de amidos de cereais já foi
amplamente estudado, uma vez que a danificação dos grânulos do amido impacta
diretamente nas características do produto final. Foi reportado que a moagem afeta
tanto a estrutura granular quanto as estruturas a nível molecular de amidos (LI et al.,
2014), explicando as maiores taxas e os maiores rendimentos de hidrólise do amido
Figura 45. Perfil de hidrólise enzimática de células liofilizadas e moídas de C. sorokiniana, amido de milho cru, após gelatinização a 100 °C por 10 minutos e após moagem por 90 minutos.
108
moído quando comparados com os obtidos com o amido sem tratamento. Além
disso, durante a moagem, o atrito da bola com a biomassa e as paredes do moinho
pode ter criado hot spots, resultando em um aquecimento que pode ter ocasionado
uma gelatinização parcial do amido moído.
Em relação à hipótese (iii), as taxas de hidrólise do amido de C. sorokiniana
moída foram muito superiores às obtidas com a hidrólise do amido de milho cru.
Porém, conforme demonstrado, esse resultado poderia ser consequência do
tratamento por moagem. Resultados similares foram reportados por TANADUL et al.
(2014) quanto à hidrólise de amido purificado de uma linhagem de C. sorokiniana
quando comparada com a hidrólise de diferentes biomassas amiláceas, como milho,
arroz e trigo. Todos os cereais apresentaram uma menor taxa de hidrólise do que a
apresentada pelo amido de microalga quando hidrolisados com α-amilase de
Aspergillus niger. No entanto, nesse trabalho também foi usada uma técnica de
moagem para rompimento da parede celular anterior ao isolamento dos grânulos de
amido da microalga e, portanto, a maior suscetibilidade reportada também pode ser
associada à etapa de moagem, e não a características intrínsecas do amido da
microalga que o tornariam mais suscetíveis à hidrólise. Estudos de hidrólise do
amido intracelular de microalgas devem ser conduzidos em células tratadas com
técnicas menos abrasivas de rompimento celular de forma a verificar a
digestibilidade desse amido in natura.
Esses resultados indicam que o amido de C. sorokiniana, após a etapa de
moagem para rompimento celular, não necessita de um processo prévio de
gelatinização. Portanto, em um contexto industrial, poderia ser utilizada a hidrólise
"fria" para processamento desse amido, favorecendo a implementação de
tecnologias com menor gasto energético, o que poderia compensar o gasto
energético associado à etapa de moagem.
5.4.2 Colheita de Chlorella sorokiniana por sedimentação gravitacional
Os resultados de hidrólise enzimática indicaram que o tratamento com moinho
de bolas foi mais efetivo para a biomassa seca, apresentando baixa eficiência para a
biomassa úmida. Portanto, buscou-se na etapa de colheita associar métodos
tradicionais e com baixo gasto energético para concentração da biomassa de modo
a favorecer energeticamente a etapa de secagem.
109
Conforme pode ser observado na Figura 46a, a sedimentação gravitacional
de C. sorokiniana ocorreu praticamente durante as primeiras 6 horas. Após 24 horas
(Figura 46b), obteve-se um clarificado esbranquiçado e pouco turvo, indicando que
todas as células estavam depositadas. Este resultado é particularmente relevante,
pois na literatura são raros os registros de colheita por sedimentação pela
similaridade de densidade entre as microalgas e o meio de cultivo.
Figura 46. Células sedimentadas de C. sorokiniana após 6 horas (a) e 24 horas (b) em uma proveta contendo 100 mL de suspensão de células ricas em amido
Pode-se constatar que o teor de amido celular apresentou um efeito
significativo na velocidade de sedimentação das células de C. sorokiniana. A Figura
47 mostra a diferença entre os perfis das células em suspensão obtidos com células
com baixo teor de amido (8 %) e com alto teor de amido (22 %).
Como esperado, a velocidade de sedimentação das células ricas em amido
foi maior do que das células com menor teor de amido. Esse resultado indica que o
acúmulo de amido pelas células auxilia no processo de sedimentação gravitacional.
Resultados similares foram reportados para culturas de Scenedesmus obliquus
(LAVOIE e NOÜE, 1987). Os autores reportaram a sedimentação gravitacional das
células sem associação com um evento de autofloculação e atribuíram esse
a b
Figura 47. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana apresentando diferentes teores de amido intracelular (8 % e 22 %). Pontos representam a média de duplicatas experimentais.
110
fenômeno ao aumento da densidade celular durante o envelhecimento da cultura
devido ao aumento do conteúdo de carboidratos das células. O mesmo fenômeno foi
reportado por HASSANPOUR et al. (2015) durante o cultivo de uma cultura mista de
microalgas. Os autores utilizaram as diferenças de densidade entre microalgas ricas
em amido e microalgas ricas em lipídeos de forma a enriquecer o cultivo com
apenas uma delas por sedimentação gravitacional, uma vez que as ricas em amido
apresentaram velocidades de sedimentação superiores às ricas em lipídeos.
Apesar de as células de C. sorokiniana sedimentarem sem o auxílio de
nenhum aditivo, o processo de sedimentação gravitacional nestas condições
operacionais não é competitivo quando se trata de produção em larga escala. Para
superar essa restrição, foi estudado o uso de um aditivo natural com ação floculante
de forma a acelerar a colheita por sedimentação. Para tal, foi selecionado o pó de
semente de moringa, uma vez que esse biofloculante mostrou-se eficaz na colheita
de microalgas (TEIXEIRA et al., 2012; ENDUT et al., 2015; BAHARUDDIN et al.,
2016).
Os experimentos de floculação foram conduzidos no pH final do cultivo de C.
sorokiniana, próximo de 8,5, pH no qual as proteínas coagulantes de moringa
apresentam carga positiva (NDABIGENGESERE et al., 1995). TEIXEIRA et al.
(2012) reportaram que a melhor eficiência de floculação foi reportada em pH próximo
de 9 e BARRADO-MORENO et al. (2016) não observaram nenhuma influência do
pH entre os valores de 5 a 9.
Como pode ser observado na Figura 48, a eficiência de sedimentação foi
afetada negativamente pela redução da concentração do floculante. A maior
eficiência de recuperação, de 84 %, foi alcançada após 60 minutos de sedimentação
na concentração de 1g.L-1. Apesar do resultado satisfatório e próximo ao reportado
por TEIXEIRA et al. (2012), a concentração de floculante utilizada foi superior à
concentração de células na suspensão (0,7 g.L-1), condição inadequada para um
processamento industrial, uma vez que aumentaria em 140% a quantidade de
massa a ser processada.
111
Em vista desse resultado, foram conduzidos experimentos com o extrato
aquoso e os extratos salinos do pó de semente de moringa na concentração
proporcional de 1 g.L-1, apresentados na Figura 49. Para fins comparativos
apresenta-se na mesma figura os resultados controle, observados apenas com as
soluções salinas de NaCl e CaCl2.
Figura 49. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana floculadas com diferentes concentrações de pó de semente de moringa. O controle foi realizado nas mesmas condições, porém sem adição do floculante. Pontos representam a média de duplicatas experimentais.
Figura 48. Sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana floculadas com diferentes soluções. O controle foi realizado sem adição do floculante. Os controles de NaCl e CaCl2 foram conduzidos apenas com as soluções salinas, sem o extrato da semente. Também está apresentado o resultado obtido com 1 g.L-1 de pó de semente de moringa para comparação. Pontos representam a média de duplicatas experimentais.
112
O extrato aquoso do pó de semente de moringa apresentou uma eficiência
baixa de floculação, não diferindo significativamente do controle sem nenhum agente
floculante. O mesmo resultado foi observado para o ensaio com a solução de NaCl.
No entanto, o extrato da semente obtido com essa mesma solução apresentou uma
alta atividade floculante, atingindo, após 1 hora de sedimentação, uma recuperação
de 80 %, sem diferença estatística do resultado obtido com o pó de moringa na
mesma concentração. Esses resultados estão de acordo com os reportados por
OKUDA et al. (1999), em que o extrato salino da semente da moringa apresentou
uma capacidade floculante 7 vezes maior do que o extrato aquoso. Os autores
atribuem esse resultado ao fenômeno de salting in, que aumentaria a solubilidade
das proteínas coagulantes, aumentando sua extração na solução salina.
Além de NaCl, CaCl2 também foi proposto para a extração das proteínas
coagulantes da semente da moringa (CARVALHO et al., 2016). No entanto, o
experimento conduzido apenas com a solução aquosa de CaCl2, sem o extrato de
semente de moringa, apresentou uma alta eficiência de sedimentação, variando de
83 % de recuperação, após 5 minutos de sedimentação, até 96 %, após 1 hora.
Esses resultados demonstram a excelente capacidade floculante da solução de
CaCl2 e não justificam a adição de uma etapa de extração de proteínas de moringa
para serem utilizadas em conjunto com essa solução salina. Um resultado similar foi
reportado por MORIOKA et al. (2014) para a colheita de Chlorella sp. usando uma
concentração de 2 g.L-1 de CaCl2, a mesma utilizada no presente estudo. No
entanto, estudos utilizando concentrações menores reportaram uma menor
eficiência de colheita de microalgas com esse sal, indicando que sua eficácia está
atrelada ao uso de uma alta concentração de floculante (FERRIOLS e AGUILAR,
2012; PÉREZ et al., 2015). A capacidade floculante de CaCl2 pode ser atribuída à
carga positiva do íon de Ca2+, que atua neutralizando as cargas negativas da
superfície das células, permitindo que as mesmas se agreguem.
Após a floculação, a biomassa resultante contendo células e agente floculante
ainda apresenta uma alta umidade, podendo ser submetida a uma etapa de
centrifugação posterior antes de seguir para a etapa de secagem. Portanto, o
volume final obtido após a floculação é um parâmetro importante que irá impactar no
dimensionamento da centrífuga.
113
Além disso, a umidade e a massa final obtidas após a centrifugação também
devem ser avaliadas durante a escolha do agente floculante. A Figura 50 apresenta
esses resultados para os diferentes agentes floculantes utilizados.
Conforme afirmado anteriormente, o pó da semente de moringa, apesar de
apresentar uma eficiência alta de floculação, resultou em um aumento da massa
final de sólidos em cerca de 140 %, característica indesejável em um agente
floculante. Tanto o extrato da semente de moringa com a solução de NaCl quanto a
solução de CaCl2 resultaram em um aumento menor da massa final, de 50 %, porém
ainda expressivo. O volume de sedimento obtido ao final da floculação com a
solução de CaCl2 foi mais de 10 vezes superior ao obtido no experimento controle de
sedimentação gravitacional e cerca de 3 vezes superior ao obtido com o extrato
salino da semente; além disso, o uso desse floculante resultou na maior umidade
final encontrada após a centrifugação. Esses resultados apontam que, apesar da
alta eficiência floculante, o uso do CaCl2 não seria indicado para a colheita de
microalgas.
O extrato salino da semente de moringa foi o agente floculante, dentre os
testados, que apresentou resultados mais promissores. Além de resultar em um
menor aumento da massa final quando comparado ao uso do pó, a utilização do
extrato permite uma maior valorização da semente de moringa, uma vez que a torta
Figura 50. Volume de sedimentado encontrado ao final do processo de floculação e sedimentação de 10 mL de suspensão de células e massa seca e umidade encontrados após uma etapa posterior de centrifugação do sedimentado formado pela floculação utilizando pó de semente de moringa, extrato salino do pó da semente e solução de CaCl2. O controle correspondeu ao sedimentado gerado após sedimentação gravitacional sem adição de floculantes.
114
obtida após a extração salina pode ser utilizada para extração de lipídeos, como
fertilizante ou para formulação de ração animal, permitindo que o floculante agregue
renda ao processo (GHEBREMICHAEL et al., 2005). De forma a reduzir o aumento
da massa final provocado pelo uso do floculante, a utilização das proteínas
coagulantes purificadas deve ser investigada (GHEBREMICHAEL et al., 2005).
Estudos futuros também devem incluir avaliação do reúso da água de cultivo após a
colheita das células com floculantes derivados da semente da moringa, pois a
literatura reporta possível toxicidade em águas tratadas com esses biofloculantes
(ROLIM et al., 2011; AL-ANIZI et al., 2014). Outro parâmetro importante que não foi
avaliado no presente estudo é o efeito do uso de moringa nas etapas posteriores de
processamento da microalga, como a hidrólise enzimática.
5.4.3 Extração de pigmentos de C. sorokiniana e fluxograma do processo
De forma a se obter um produto de alto valor agregado que auxiliasse na
atratividade econômica do processamento de C. sorokiniana para obtenção de
glicose, foi estudada a extração de pigmentos dessa microalga. O teor de clorofilas
de C. sorokiniana após 20 dias de cultivo foi expressivo, correspondendo a cerca de
2,5 % de sua massa seca, apesar de na fase exponencial de crescimento esse teor
ter representado cerca de 5 % da massa seca de células. PASQUET et al. (2011)
reportaram teores menores, de cerca de 1 % e 0,65 % (m/m seca), para
Cylindrotheca closterium e Dunaliella tertiolecta, respectivamente. Teores de clorofila
similares aos encontrados no presente estudo, de cerca de 3 % (m/m), foram
reportados para Neochloris oleoabundans (LI et al., 2008) e Dunaliella tertiolecta
(SONG et al., 2016).
Pode-se observar que houve uma redução no teor de pigmentos após a
hidrólise enzimática, conforme apresentado na Figura 51. A redução do teor de
ambas as clorofilas em quase 50 % pode ser associada principalmente ao pH ácido
da hidrólise (pH 4), apesar de a degradação dessas moléculas por tratamentos
térmicos também ter sido reportada (ERGE et al., 2008). Em condições ácidas, o íon
magnésio presente na posição central do anel porfirínico é substituído por
hidrogênios, transformando as clorofilas, que apresentam cor verde, em feofitinas,
que apresentam cor marrom-azeitonado (GUNAWAN e BARRINGER, 2000).
115
Já a redução dos carotenoides pode ser explicada pela sua alta reatividade,
uma vez que, por serem antioxidantes, eles são mais suscetíveis a reações de
oxidação estimuladas tanto por luz quanto por temperatura (BOON et al., 2010).
Frente a esses resultados, concluiu-se que a extração de pigmentos deveria
ser realizada em etapa anterior à hidrólise enzimática. Para tal, poderia ser utilizada
a microalga fresca logo após a colheita ou a microalga seca antes ou após a etapa
de moagem. Portanto, essas três condições foram comparadas quanto à eficiência
de extração de pigmentos e os resultados estão apresentados na Figura 52.
Figura 52. Quantificação de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides por extração, com metanol 100 % a 25 °C, de C. sorokiniana moída antes (cinza claro) e após (cinza escuro) hidrólise enzimática
Figura 51. Extração de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides de C. sorokiniana com metanol 100 % a 25 °C a partir da biomassa fresca (cinza), liofilizada e moída (cinza escuro) e apenas liofilizada (cinza claro)
116
Pode-se observar que a extração a partir da microalga fresca apresentou uma
eficiência muito superior à obtida com células liofilizadas para os três pigmentos
quantificados. PASQUET et al. (2011) reportaram o depósito de células em camadas
superpostas após liofilização de C. closterium e o achatamento e a formação de
camadas contínuas de células de D. salina. Essas características podem levar à
dificuldade de difusão do solvente para a região intracelular e, assim, reduzir a
eficiência de extração de pigmentos.
No entanto, após a moagem e, portanto, o rompimento da parede celular e o
aumento da área superficial, a eficiência de extração de clorofilas após a liofilização
atingiu valores similares aos obtidos a partir das células frescas, sem diferenças
estatisticamente significativas (p>0,05) entre eles. Somente o teor de carotenoides
extraído foi menor para as células moídas, possivelmente devido à degradação
térmica ocorrida durante a moagem, uma vez que essas moléculas são altamente
reativas. Diante desses resultados, escolheu-se realizar a extração de pigmentos a
partir de células frescas recentemente colhidas.
A seguir, o etanol foi testado como substituto do metanol, por ser um solvente
menos tóxico e obtido de fontes renováveis (CHEMAT et al., 2012). Os resultados de
extração com ambos os alcoóis estão apresentados na Figura 53.
Os resultados apontam a possibilidade de substituição do metanol por etanol,
uma vez que não foram observadas diferenças estatisticamente significativas
(p>0,05) entre as eficiências de extração encontradas para os dois solventes
testados. Um resultado similar foi reportado por HENRIQUES et al. (2007) para a
microalga Nannochloropsis gaditana. Apesar de obterem resultados finais similares
Figura 53. Extração de clorofila a (chl a), clorofila b (chl b) e carotenoides de C. sorokiniana fresca com metanol 100 % (cinza claro) e etanol 96 % (cinza escuro) a 25 °C
117
para ambos os solventes, os autores reportaram uma extração mais rápida com
metanol; no entanto, a extração realizada por eles não foi conduzida com
homogeneização ao longo do processo e a extração com etanol foi conduzida em
baixas temperaturas. No presente trabalho, em que as amostras foram
constantemente homogeneizadas e as extrações foram conduzidas na mesma
temperatura, ambos os solventes apresentaram a mesma eficiência de extração
após 1 hora. A similaridade de eficiência de extração observada para os dois
solventes pode ser atribuída a suas polaridades próximas, resultando em afinidades
praticamente equivalentes pelos pigmentos extraídos.
Apesar de ambos os solventes testados apresentarem alta polaridade, foi
observada uma alta extração de carotenoides, que são moléculas apolares, de 4,5
mg/g de biomassa seca. Esse valor é próximo ao reportado por KUMAR et al. (2014)
para C. sorokiniana, de 4,2 mg/g de biomassa seca para a soma dos teores de β-
caroteno e astaxantina extraídos com uma mistura de acetona e hexano.
A secagem pode ser uma etapa onerosa no processamento de microalgas
(CHEN et al., 2009). No entanto, no presente trabalho demonstrou-se ser possível a
extração de pigmentos a partir da microalga fresca recém colhida, sem necessidade
de uma etapa de secagem anterior. Após a extração de pigmentos, a biomassa
extraída estaria impregnada de etanol, e não mais de água; portanto, sua secagem
seria mais rápida, uma vez que o etanol apresenta maior volatilidade do que a água
e, por isso, necessita menos energia para ser transferido para a fase gasosa. Para
confirmar essa hipótese, a secagem por convecção foi acompanhada para células
recém colhidas e para células após a extração com etanol, conforme apresentado na
Figura 54.
Pode-se observar que a secagem das células após extração com etanol 96 %
foi quase 10 vezes mais rápida do que das células recém-colhidas quando
submetidas a uma secagem por convecção. Esse resultado pode vir a implicar em
uma economia energética significativa em uma escala industrial.
118
A partir dos resultados de extração de pigmentos e os resultados
apresentados para a hidrólise de C. sorokiniana, foi possível montar um fluxograma
de processo de uma possível biorrefinaria de microalgas para a obtenção de
pigmentos, glicose e biomassa residual rica em proteínas e lipídeos, apresentado na
Figura 55.
Figura 55. Fluxograma de processo de uma biorrefinaria de C. sorokiniana para obtenção de pigmentos, glicose e biomassa seca rica em proteínas e lipídeos. A seta pontilhada na etapa de colheita representa a possibilidade de adição do biofloculante estudado de forma a acelerar a colheita por sedimentação gravitacional.
A biomassa inicial apresentou em torno de 35 % de carboidratos (28 %
amido), 2,5 % de clorofila, 26 % de proteínas e 19% de lipídeos. Após a extração de
Figura 54. Acompanhamento da secagem de células de C. sorokiniana após a colheita e após a extração com etanol 96 %
119
pigmentos e a hidrólise enzimática, a biomassa residual apresentou em torno de 15
% de carboidratos (carboidratos estruturais mais glicose residual da hidrólise), 33 %
de proteínas e 27 % de lipídeos.
Essa biomassa seca pode ser utilizada tanto na indústria de alimentos quanto
na de ração animal como uma fonte de aminoácidos essenciais e lipídeos poli-
insaturados. VANTHOOR-KOOPMANS et al. (2013) compararam os perfis de
aminoácidos e de lipídeos de diversas espécies de microalgas com farelo de soja e
óleo de palma, respectivamente, e concluíram que as microalgas apresentam todos
os aminoácidos contidos no farelo de soja e que seu conteúdo lipídico é mais
diversificado do que do óleo de palma, apresentando um maior conteúdo de ácidos
graxos poli-insaturados. Especificamente para C. sorokiniana, o perfil de lipídios
obtidos no meio BBM por CONCAS et al. (2016) apresentou uma alta proporção dos
ácidos graxos linoleico (ω-6) e linolênico (ω-3), essenciais para a nutrição humana.
Em relação ao perfil de aminoácidos, YIN et al. (2010) reportaram a presença de
todos os 8 aminoácidos essenciais no hidrolisado proteico de C. sorokiniana.
No presente trabalho não foi feito o processamento contínuo de uma mesma
biomassa por todas as etapas até se chegar à biomassa seca final. Portanto, o
fluxograma proposto ainda deve ser estudado de forma a se determinar os impactos
de cada etapa no processo subsequente.
5.4.4 Considerações finais
Os resultados de hidrólise de células liofilizadas não moídas de C. sorokiniana
com celulases indicaram que a celulose não está presente nas camadas externas da
parede celular dessa microalga, uma vez que não foi possível romper essa estrutura
com enzimas celulolíticas. Após moagem, o amido intracelular de C. sorokiniana
mostrou-se altamente suscetível à hidrólise enzimática por amilases. Foi possível
alcançar rendimentos próximos a 70 % em apenas 5 horas com o aumento da carga
de sólidos na hidrólise para 30 % (m/m), com uma concentração de glicose final no
hidrolisado de 80 g.L-1.
A colheita por sedimentação gravitacional de células de C. sorokiniana ricas
em amido foi possível e esse processo teve seu tempo reduzido com a adição de um
biofloculante proveniente de sementes de moringa.
A extração de pigmentos de C. sorokiniana foi possível a partir das células
frescas, sem uma etapa de secagem anterior, com etanol, um solvente menos tóxico
120
do que os utilizados tradicionalmente. Células extraídas, impregnadas por etanol,
apresentaram uma taxa de secagem quase 10 vezes superior às células úmidas
recém-colhidas.
Com esses resultados, foi possível montar um possível fluxograma para o
processamento de C. sorokiniana visando a obtenção de pigmentos, glicose e uma
biomassa seca rica em proteínas e ácídos graxos poli-insaturados.
121
6 CONCLUSÕES
Em vista dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que a
microalga Chlorella sorokiniana apresenta potencial como matéria-prima para
processamento em um contexto de biorrefinaria.
Essa microalga mostrou-se ser pouco exigente nutricionalmente,
apresentando crescimento normal em meios de cultivo com quantidade reduzida de
micronutrientes, o que pode levar a menores custos com aquisição de nutrientes.
Com o ajuste do tempo de cultivo, foi possível induzir o acúmulo de amido e produzir
uma biomassa com composição balanceada de carboidratos, proteínas e lipídeos.
Foi possível realizar um processo de colheita por sedimentação gravitacional,
que apresenta reduzido consumo energético. Neste caso, o extrato salino de
semente de moringa foi destacado como um possível biofloculante para acelerar
esse processo.
O amido intracelular de C. sorokiniana mostrou-se suscetível à hidrólise
enzimática após uma etapa de moagem, alcançando altos rendimentos em glicose
em um reduzido tempo de processamento e sem a necessidade de uma etapa de
gelatinização, fatores que também podem levar a um menor consumo energético no
processamento.
A extração de pigmentos, que são produtos de alto valor agregado, mostrou-
se tecnicamente viável a partir da biomassa úmida utilizando etanol como solvente a
temperatura ambiente. A biomassa impregnada com etanol apresentou altas taxas
de secagem.
Por fim, foi produzida uma biomassa residual rica em proteínas e lipídeos com
possível aplicação nas indústrias de alimentos e ração animal.
Coletivamente, os resultados desse trabalho destacam a possibilidade de
obtenção e processamento da biomassa da microalga C. sorokiniana com redução
de gastos energéticos pela integração dos processos de cultivo, colheita, extração
de pigmentos e hidrólise enzimática.
122
7 TRABALHOS FUTUROS
• Estudo mais detalhado da composição do meio de cultivo de C.
sorokiniana a fim de melhor determinar suas reais exigências nutricionais;
• Estudo da viabilidade de reciclo da água de cultivo;
• Estudo da hidrólise de amido de C. sorokiniana após rompimento da
parede celular por técnicas mais brandas;
• Estudo da floculação de C. sorokiniana com derivados de semente de
moringa e seu impacto no processamento da biomassa e no reciclo da
água de cultivo;
• Otimização das condições operacionais de extração de pigmentos usando
etanol como solvente e impacto da extração no processamento da
biomassa.
123
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143
ANEXO
Publicação relacionada ao tema da tese:
Souza, M.F., Pereira, D.S., Freitas, S.P., Bon, E.P.S., Rodrigues, M.A. Neutral
sugars determination in Chlorella: Use of a one-step dilute sulfuric acid hydrolysis
with reduced sample size followed by HPAEC analysis. Algal Research, 24 (A),
2017, 130–137
Publicação em periódico durante o período do doutorado:
Silva, A.S., Souza, M. F., Ballesteros, I., Manzanares, P., Ballesteros, M., Bon,
E.P.S. High-solids content enzymatic hydrolysis of hydrothermally pretreated
sugarcane bagasse using a laboratory-made enzyme blend and commercial
preparations. Process Biochemistry 51 (10), 2016, 1561–1567
Capítulos de livros publicados durante o período do doutorado:
Souza, Marcella Fernandes; Teixeira, Ricardo Sposina Sobral ; da Silva, Ayla Sant’;
Ferreira-Leitão, Viridiana Santana ; da Silva Bon, Elba Pinto . Chlorine-Free Biomass
Processing: Enzymatic Alternatives for Bleaching and Hydrolysis of Lignocellulosic
Materials. In: Pietro Tundo; Liang-Nian He; Ekaterina Lokteva; Claudio Mota. (Org.).
Chemistry Beyond Chlorine. 1ed.: Springer International Publishing, 2016, v. 1, p.
241-268.
SILVA, A. S. ; SA, L. R. V. ; AGUIEIRAS, E. C. G. ; SOUZA, M. F. ; TEIXEIRA, R. S.
S. ; CAMMAROTA, M. C. ; BON, E.P.S. ; FREIRE, D. M. G. ; FERREIRA-LEITAO, V.
. Biocatalysis: Two Important Opportunities for Brazilian Sustainable Development.
In: Goutam Brahmachari; Arnold L. Demain; Jose L. Adrio. (Org.). Biotechnology of
Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications.
1ed.Londres: Academic Press (Elsevier), 2016, v. 1, p. 545-571.
Textos em jornais de notícias/revistas:
SILVA, A. S. ; SOUZA, M.F. Do ouro negro ao ouro branco: biorrefinarias baseadas
em glicose. Inovativa, , v. 17(3), p. 10 - 11, 02 fev. 2017.
Prêmios:
Mensão Honrosa, VI Encontro Brasileiro de Química Verde (2016)
Segundo Lugar, My Thesis in 180s, Swissnex - NanoTera (2017)
![RESULTADO - facepe.br · microcrustÁceo daphnia sp. (crustacea, cladocera) cultivado em sistema de bioflocos com a inoculaÇÃo da microalga chlorella sp. (beyerinck [beijerinck],](https://img.document.onl/doc/110x75/60770d1ea0011c0c415c6c03/resultado-microcrustceo-daphnia-sp-crustacea-cladocera-cultivado-em-sistema.jpg)
