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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA ALINE DE SOUSA BARBOSA FREITAS PEREIRA EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR LIGADURA EM RATOS WISTAR Natal/RN 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO …...Figura 1 - Anatomia do periodonto ..... 9 Figura 2 - Visão esquemática dos biomarcadores chaves relacionados com a progressão da Doença17

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA

ALINE DE SOUSA BARBOSA FREITAS PEREIRA

EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR

LIGADURA EM RATOS WISTAR

Natal/RN

2016

ALINE DE SOUSA BARBOSA FREITAS PEREIRA

EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR

LIGADURA EM RATOS WISTAR

Natal/RN

2016

Aline de Sousa Barbosa Freitas Pereira

EFEITOS DA METFORMINA NA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA POR

LIGADURA EM RATOS WISTAR

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós Graduação em

Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito

para obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva com área de concentração em

Odontologia.

Aprovada em: ___/___/___

Banca examinadora

Prof. Dra Aurigena Antunes de Araujo

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Orientadora

Profa. Dra Leônia Maria Batista

Universidade Federal da Paraíba (UFPB)

Membro Externo

Prof. Dr. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Membro Interno

DEDICATÓRIA

À Deus,

Ao meu marido,

Meus familiares,

Amigos e mestres.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por todas as bênçãos recebidas e por ser meu refúgio e fortaleza, socorro

bem presente na angústia.

Ao meu amado, amigo, esposo Ivison. Sem você e seu apoio esse sonho não teria

sido realizado, obrigada pelo suporte diário e pelo nosso lindo presente que está por vir,

nosso amado Isaac. Nenhuma palavra será suficiente para expressar a minha gratidão pelo

teu companheirismo e paciência ao longo dessa jornada.

Aos meus pais, Adonias e Anabel, pelas orações, palavras de incentivo, amor e

por ter me mostrado o caminho da educação.

Ao meu irmão, Abner, cunhada e sobrinhos pela torcida e pelo amor que mesmo

não estando perto pode-se sentir.

Aos meus sogros, Ivo e Francisca, cunhada e família, pelas orações, incentivos e

carinho de filha e irmã.

As minhas primas, amigos (as) e demais familiares. Sei da torcida de cada um

(a) de vocês e sou grata por todas as palavras de apoio e carinho.

A minha orientadora, Profa. Aurigena Antunes, meu sincero respeito e

admiração por esta professora. Obrigada por me acolher e confiar na capacidade de

desenvolvimento do meu trabalho, pela paciência, horas dedicadas a mim e por todo

conhecimento passado.

A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, principalmente ao

departamento de Farmacologia, junto aos departamentos de Odontologia, Bioquímica,

Morfologia, Microbiologia e Parasitologia por ter proporcionado condições necessárias

para a realização desse trabalho.

A todos envolvidos na Base de Pesquisa em Farmacologia, em especial ao Prof.

Raimundo Araújo e a Profa. Caroline Addison pelos conhecimentos compartilhados.

A Lorena, Dona Neida, Flávio, César, Carla, Lourdinha, Helicarlos e outros

que colaboraram com tanto esforço e horas dedicadas para a realização dessa pesquisa.

Aos meus colegas de turma do PPGSCol, por contribuírem e fazer desse

momento tão importante e especial em minha vida.

Aos alunos de Iniciação científica, pelo apoio durante o desenvolvimento da

pesquisa.

A todos os funcionários dos Departamentos da UFRN envolvidos.

RESUMO

A periodontite é uma doença crônica caracterizada pela inflamação das gengivas,

degeneração dos ligamentos periodontais, osso alveolar e cemento. É considerada uma das

mais importantes causa da perda dentária em adultos. Estudos experimentais têm

apresentado novas alternativas farmacológicas para o tratamento da doença periodontal

com a finalidade de amenizar a inflamação e a perda óssea alveolar. O objetivo desse

estudo foi avaliar os efeitos da Metformina (MET) sobre a inflamação, o estresse oxidativo

e a perda óssea em um modelo de periodontite induzida por ligadura em ratos. Foram

utilizados 120 ratos, albinos, da linhagem Wistar. Os quais foram divididos aleatoriamente

em cinco grupos com 24 animais cada, com os seguintes tratamentos, por 10 dias: (NL)

ausência de ligadura + salina, (L) ligadura + salina, (MET 50) ligadura + 50 mg / kg de

MET, (MET 100) ligadura + 100 mg / kg de MET, e (MET 200) ligadura + 200 mg / kg de

MET. O tecido periodontal foi analisado para determinar a perda óssea e características

histológicas. A imuno-histoquímica foi utilizada para examinar a MMP-9, a COX-2, as

vias de RANK/RANKL/OPG, SOD-1 e da GPx. A análise de Espectroscopia UV-VIS foi

usada para examinar os níveis de malonaldeído (MDA), glutationa (GSH), IL-1β e TNF-α.

A reação da cadeia de polimerase de transcrição reversa foi usada para quantificar a

expressão do gene de AMPK, o NF-кB p65, e HMGB1. O valor de p <0,05 indicou uma

diferença estatística significativa. O tratamento com a MET 50 mg / kg reduziu

significativamente as concentrações de malonaldeído, IL-1β e TNF-α (p <0,05); nenhuma

das doses da MET apresentou diferença estatisticamente significativa (p>0,05) para o

aumento do GSH quando comparado ao grupo L; A dose de MET 50 mg/kg ainda

apresentou fraca coloração para a COX-2, MMP-9, RANK, RANK e SOD-1; exibindo

forte coloração para a GPx e OPG; houve aumento da expressão do AMPK e diminuição

da expressão de NF-Kβ p65 e HMGB1. Os achados revelaram que a Metformina diminui a

resposta inflamatória, o estresse oxidativo e a perda óssea na periodontite induzida por

ligaduras em ratos.

Palavras-chave: Periodontite. Metformina. Inflamação. Perda óssea. Estresse oxidativo.

ABSTRACT

Periodontitis is a chronic disease characterized by gum inflammation, degeneration

of periodontal ligaments, alveolar bone and cementum. It is considered one of the most

important cause of tooth loss in adults. Experimental studies have shown pharmacological

new alternatives for the treatment of periodontal disease in order to alleviate the

inflammation and alveolar bone loss. The aim of this study was to evaluate the effects of

Metformin (MET) on inflammation, oxidative stress and bone loss in a rat model of

ligature-induced periodontitis. Male Wistar albino rats were randomly divided into 5

groups of 24 rats each and given the following treatments for 10 days: (NL) no ligation +

saline, (L) ligation + saline, (MET 50) ligation + 50 mg/kg MET, (MET 100) ligation +

100 mg/kg MET, and (MET 200) ligation + 200 mg/kg MET. Periodontal tissue was

analysed to determine the bone loss and histopathological characteristics.

Immunohistochemical was used to examine MMP-9, COX-2, the RANK/RANKL/OPG

pathway and SOD-1 and GPx. Spectroscopic UV-VIS analysis was used to examine the

levels of Malonaldehyde, glutathione, IL-1β and TNF-α. Reverse transcription polymerase

chain reaction was used to quantify the gene expression of AMPK, NF-кβ p65 and

HMGB1. A p-value of <0.05 indicated a significant difference. Treatment with 50 mg/kg

MET significantly reduced concentrations of malonaldehyde, IL-1β and TNF-α (p < 0.05);

MET any of the doses statistically significant difference (p>0,05) in GSH increased

compared to Group L. Weak staining for COX-2, MMP-9, RANK, RANKL and SOD-1;

strong staining for GPx and OPG. Increased AMPK expression and decreased expression

of NF-кB p65 and HMGB1. Metformin decreases the inflammatory response, oxidative

stress and bone loss in ligature-induced periodontitis in rats.

Key-Words: Periodontitis. Metformin. Inflammation. Bone loss. Oxidative Stress.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Anatomia do periodonto ......................................................................... 9

Figura 2 - Visão esquemática dos biomarcadores chaves relacionados com a

progressão da Doença Periodontal............................................................. 17

Figura 3 - Estrutura química do Cloridrato de Metformina...................................... 23

Figura 4 - Metformina: mecanismo de ação proposto .............................................. 23

Figura 5 - Sequência de colocação da ligadura ........................................................ 30

Figura 6 - Gavagem com sonda de polipropileno .................................................... 31

Figura 7 - Divisão das amostras por grupos de 24 animais ...................................... 33

Figura 8 - Obtenção do Índice de Perda Óssea (IPO) .............................................. 34

Figura 9 - Aspectos macroscópicos da perda óssea alveolar ................................... 44

Figura 10 - Análise histopatológica dos grupos estudados ......................................... 45

Figura 11 - Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando

imunomarcações para RANK, RANK-L, OPG e Catepsina K ................ 48

Figura 12 - Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando

imunomarcações para MMP-9 COX-2, SOD-1 e GPx ............................ 49

Gráfico 1- Efeito da administração oral da Metformina sobre o índice de perda

óssea em ratos submetidos à ligadura................................................... 43

Gráfico 2 - Escores histopatológicos de acordo com o grupo de estudo ................. 46

Gráfico 3 - Efeito da Metformina sobre os níveis de MDA e GSH nos grupos

de estudo ...............................................................................................

50

Gráfico 4 - Efeito da Metformina sobre os níveis de IL-1β e TNF-α nos grupos

de estudo...............................................................................................

51

Gráfico 5 - Efeitos da Metformina na expressão gênica do AMPK, NF-кB p65 e

HMGB1em ratos com Doença periodontal............................................

52

Quadro 1 - Escores para análise histológica dos tecidos periodontais de suporte .. 36

Quadro 2 - Sequência de expressão gênica ............................................................. 41

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µL Microlitros

µg Microgramas

ABP Osso alveolar propriamente dito

AP Osso alveolar

AG Ácidos graxos

AINES Anti-inflamatórios não esteróides

AMP Adenosina monofosfato

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

AMPK Proteína quinase ativada por AMP

BSA Albumina de soro bovino

CAT Catalase

CES Células do estroma da endometriose

COX-1 Cicloxigenase tipo 1

COX-2 Cicloxigenase tipo 2

GADPH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GCF Fluido crevicular gengival

DP Doença periodontal

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA Ensaio de imunoabsorção

ERα Receptor de estrogênio alfa

GPx Glutationa peroxidase

GSH Glutationa

GR Glutationa redutase

HE Hematoxicilina e eosina

HepG2 Hepatócitos humanos insulino-resistentes

H2SO4 Ácido sulfúrico

H2O2 Peróxido de hidrogênio

Hmgb1 Proteína nuclear não-histona com elevada mobilidade

HOCL Ácido hipocloroso

IgG1 Imunoglobulina 1

IgG1 Imunoglobulina 3

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6

IL-12 Interleucina 12

IL-18 Interleucina 18

i.p Intraperitoneal

IPO Índice de perda óssea

Kg Quilograma

LPO Peroxidação lipídica

LPS Lipopolissacarídeos

M Molar

ml Mililitro

mm Milímetro

MDA Malonaldeído

MET Metformina

MMP Metaloproteinases

Micro CT Microtomografia computadorizada

NF кB Fator de transcrição nuclear kappa B

NADPH Nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato

nm nanômetro

NO Óxido nítrico

OPG Osteoprotegerina

O2 Radical superóxido

OH Radical hidroxila

PBS Solução salina tamponada

PL Ligamento periodontal

pg Picograma

PGs Prostaglandinas

PGE2 prostaglandina da série E2

PMN Polimorfonucleares

RC Cemento radicular

RNA Ácido ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

RANK Receptor de ativação do fator nuclear кB

RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear ҡB

RAR Raspagem e alisamento radicular

ROS Espécies reativas de oxigênio

r.p.m. Rotações por minuto

RT PCR Reação de transcrição reversa seguida da reação da polimerase em cadeia

SOD Superóxido dismutase

TIMP Inibidores teciduais de metaloproteinases

TLRs Receptores Toll-like

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

ºC Graus Celsius

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 7

2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 9

2.1 ANATOMIA DO PERIODONTO ............................................................ 9

2.2 DOENÇA PERIODONTAL ...................................................................... 11

2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E PERIODONTITE ........................................ 12

2.4 PERIODONTITE E INFLAMAÇÃO ....................................................... 14

2.5 REMODELAÇÃO ÓSSEA E DOENÇA PERIODONTAL ..................... 19

2.6 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DA PERIODONTITE ......................... 21

2.7 METFORMINA (MET) ........................................................................... 22

2.8 EFEITOS PLEIOTRÓPICOS DA METFORMINA ................................. 24

3 OBJETIVOS ........................................................................................... 27

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 27

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 27

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................. 28

4.1 DESENHO DO ESTUDO ......................................................................... 28

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS .................................................................. 28

4.3 LOCAL DO EXPERIMENTO ................................................................. 28

4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS E GRUPOS ............................... 28

4.5 DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO ........................................ 30

4.5.1 Modelo Experimental da Doença Periodontal ...................................... 30

4.5.2 Tratamento Medicamentoso ................................................................... 31

4.5.3 Eutanásia dos animais ............................................................................. 32

4.5.4 Obtenção e preparo inicial do material para análise ............................ 32

4.6 TIPOS DE ANÁLISES ............................................................................. 33

4.6.1 Análise morfométrica e macroscópica da perda óssea alveolar .......... 33

4.6.2 Análise Histopatológica .......................................................................... 34

4.6.3 Análise Imunohistoquímica da expressão de RANK-L, RANK,

OPG, Catepsina K, COX-2, MMP-9, SOD-1 e GPx nos tecidos

periodontais de suporte ...........................................................................

36

4.6.4 ELISA para dosagem dos níveis de IL-1β e TNF-α nos tecidos

gengivais ....................................................................................................

38

4.6.5 Dosagem de Malonaldeído (MDA) ......................................................... 39

4.6.6 Dosagem de Glutationa (GSH) ............................................................... 39

4.6.7 Expressão gênica por RT PCR (PCR em tempo real) .......................... 40

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 42

6 RESULTADOS ........................................................................................ 43

6.1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR .. 43

6.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA ..................................................................... 44

6.3 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA OS MARCADORES DE

INFLAMAÇÃO E PERDA ÓSSEA ........................................................

47

6.4 EFEITO DO TRATAMENTO COM MET PARA OS MARCADORES

DE ESTRESSE OXIDATIVO ..................................................................

50

6.5 DOSAGEM DE IL-1β E TNF-α ............................................................... 50

6.6 EXPRESSÃO GÊNICA RT-PCR ............................................................ 52

7 DISCUSSÃO .......................................................................................... 54

8 CONCLUSÃO ........................................................................................ 60

REFERÊNCIAS ....................................................................................... 61

ANEXOS .................................................................................................. 72

1 INTRODUÇÃO

A doença periodontal (DP) é uma doença inflamatória, caracterizada pela ruptura do tecido

conjuntivo, perda da inserção e reabsorção do osso alveolar (BIJU et al., 2014). É uma das mais

importantes causas da perda dentária em adultos e a forma mais prevalente de patologia óssea

humana, além de ser um provável fator modificador da saúde sistêmica dos pacientes (GARLET et

al., 2006). Trata-se de uma doença de etiologia bacteriana, pois a cavidade oral abriga uma

quantidade substancial e em constante evolução de espécies microbianas (GRAVES; OATES;

GARLET, 2011). O biofilme bacteriano aderido à superfície dentária desencadeia uma reação

inflamatória intensa, onde as proteases degradam a matriz extracelular e ocasionam a reabsorção do

osso alveolar, conduzindo a uma perda irreversível da inserção do tecido periodontal (SORSA et al.,

2016).

O tratamento tradicional da doença periodontal envolve a raspagem e o alisamento radicular

(RAR), o qual reduz o biofilme e diminui o número de microorganismos (COBB, 2002). No

entanto, mesmo após o tratamento clínico bem-sucedido, ainda há uma grande chance de

reinfecção, causada por biofilmes residuais (CARVALHO et al., 2011). Assim, a associação da

RAR junto à antibioticoterapia local ou sistêmica tem sido sugerida, nesses casos, com a finalidade

de se obter os melhores resultados (PAQUETTE; RYAN; WILDER, 2008; KANER et al., 2007).

Os antiinflamatórios não esteroidais (AINES) também representam uma importante classe

farmacológica estudada há décadas como inibidores da resposta do hospedeiro frente à DP

(OFFENBACHER, 1996).

Eventualmente, outras terapias locais como o uso de clorexidina e óleos essenciais também

são empregadas no tratamento da periodontite. No entanto, essas terapias apresentam algumas

reações indesejadas: sensação de queimadura, sabor amargo, eventual coloração dos dentes e

resistência bacteriana (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010). Outro fator que frequentemente é

desconsiderado é que os antibióticos sistêmicos não penetram diretamente no biofilme subgengival

para eliminar as bactérias (KRAYER et al., 2010). Mediante a essas reações, outros fármacos vem

sendo estudados com a finalidade de eliminar os efeitos indesejáveis dos tratamentos

convencionais.

8

A investigação de novas formas de controle da doença periodontal é de relevante

interesse. Desta forma, alguns agentes moduladores são analisados como potenciais terapias

para a doença periodontal, como o hipoglicemiante oral Metformina (MET), que é uma

biguanida amplamente utilizada como agente antidiabético de primeira linha para o

tratamento de diabetes mellitus tipo 2 (BAK et al., 2010).

Esse fármaco pode apresentar outros benefícios, tais como efeitos antiendometriótico

(TAKEMURA et al., 2007), antiaterogênico (HATTORI et al., 2006), antitumoral

(SCARPELLO; HOWLETT, 2008) e efeitos antiobesidade (PARK et al., 2009). Além disso,

foi demonstrado também que a Metformina exerce um efeito osteogênico em osteoblastos

(CORTIZO et al., 2006). Esse resultado sugere que a MET exerce benefícios em tecidos

ósseos. Assim, baseado nessas informações o presente estudo teve por objetivo determinar o

efeito da Metformina na atividade anti-inflamatória, estresse oxidativo e na perda óssea

alveolar em ratos submetidos à doença periodontal induzida por ligadura.

9

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ANATOMIA DO PERIODONTO

O periodonto (peri=em torno de; odonto=dente) é também chamado de “aparelho de

inserção” ou “tecidos de suporte dos dentes”. Essa estrutura forma uma unidade de

desenvolvimento, biológica e funcional, a qual sofre alterações ocasionadas pela idade e, além

disso, está sujeita a alterações morfológicas relacionadas a modificações funcionais e no meio

bucal. Compreende os seguintes tecidos: (1) Gengiva (G), (2) Ligamento periodontal (PL), (3)

Cemento radicular (RC) e o (4) Osso alveolar (AP) (Figura 1) (LINDHE; KARRING;

ARAÚJO, 2010).

Figura 1. Anatomia do Periodonto

Fonte: Lindhe et al., (2010).

Fig. 1 Componentes Anatômicas do Periodonto: Gengiva (G), Ligamento Periodontal (PL), Cemento

Radicular (RC). O osso alveolar é constituído por dois componentes: Osso Alveolar Propriamente Dito

(ABP) e o Processo Alveolar. (AP).

10

A gengiva é a parte da mucosa mastigatória que cobre o processo alveolar e circunda a

região cervical dos dentes, consiste em uma camada epitelial e um tecido conjuntivo

subjacente, denominado lâmina própria. Ainda é dividida anatomicamente em marginal,

inserida e área interdental. Apesar de cada tipo de gengiva exibir considerável variação na

diferenciação, histologia e espessura, de acordo com a sua demanda funcional, todos os tipos

são especificamente estruturados para funcionar de forma adequada contra danos mecânicos e

microbianos (CARRANZA; NEWMAN, 2011).

O ligamento periodontal (PL) é o tecido conjuntivo frouxo, ricamente vascularizado e

celular, que circunda as raízes dos dentes e une o cemento radicular a lâmina dura ou ao osso

alveolar propriamente dito. O espaço do PL tem a forma de ampulheta e é mais estreito no

nível do terço médio da raiz, sua largura é de cerca de 0,25mm (0,2 - 0,4mm). A presença

dessa estrutura permite que forças produzidas durante a função mastigatória e outros contatos

dentários, sejam distribuídas e absorvidas pelo processo alveolar. Essencial, também, para a

mobilidade dentária (LINDHE; KARRING; ARAÚJO, 2010).

O cemento radicular (RC) é um tecido mineralizado, altamente especializado, que

recobre as superfícies radiculares. Presta-se ainda à inserção das fibras colágenas da inserção

conjuntiva e do ligamento periodontal. Estruturalmente, assemelha-se ao osso, mas difere em

vários aspectos funcionais como a ausência de inervação, não sofre remodelação e reabsorção

fisiológica, não contém vasos sanguíneos e linfáticos, porém se caracteriza pela formação

contínua ao longo da vida. Desempenha diferentes funções: inserir as fibras do PL na raiz e

contribui para o processo de reparo após danos à superfície radicular (LINDHE; KARRING;

ARAÚJO, 2010).

O osso alveolar é formado durante o desenvolvimento fetal por ossificação

intramembranosa, composto por células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos,

osteoclastos e colágeno, constituindo a matriz orgânica. Já a sua matriz inorgânica é formada

por água, fosfato, bicarbonatos, fluoretos e citratos (CARRANZA; NEWMAN, 2011). As

alterações morfológicas relacionadas a idades relatadas no osso alveolar espelham aquelas que

ocorrem em outros sítios ósseos.

11

2.2 DOENÇA PERIODONTAL

A doença periodontal é um termo bastante amplo atribuído a várias condições

patológicas, caracterizadas pela degeneração e inflamação das gengivas, ligamentos

periodontais, osso alveolar e cemento. Estágios mais graves da doença podem ocasionar

também a perda dentária (BIJU et al., 2014).

A forma mais comum da periodontite crônica afeta cerca de 50% da população adulta

no mundo, enquanto que sua forma mais agressiva afeta de 10 a 15% destes indivíduos.

Possui ainda uma alta prevalência em idosos, alcançando mais de 60% de pessoas acima dos

65 anos de idade (CHAPPLE; GENCO, 2013).

São ocasionadas por bactérias residentes no biofilme ao longo da superfície dentária e

da interface entre os tecidos gengivais e o dente, muitas das quais são gram-negativas e

anaeróbicas (PASTER et al., 2001). Os microoganismos fortemente associados como agentes

etiológicos incluem: Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e

Bacteroides Forsythus (ORINGER, 2002).

A periodontite é causada pela infecção polimicrobiana, porém há evidências de que a

extensão da inflamação desta doença pode também resultar da interação entre as espécies

seletivas da microflora oral e da resposta imunitária do hospedeiro (CHEN et al., 2016). No

entanto, Porphyromonas gingivalis W50 é apontado como um dos patógenos mais

proeminentes e altamente associados à periodontite (DARVEAU, 2010; FISCHER et al.,

2013).

A lesão inicial é caracterizada pela resposta dos leucócitos residentes e células

endoteliais a presença do biofilme bacteriano. Nesta fase, não há sinais de inflamação clínica,

mas as alterações nos tecidos podem ser observadas histologicamente. Os produtos

metabólicos das bactérias acionam células do epitélio juncional para produzirem citocinas e

estimulam a produção de neuropeptídeos, que causam vasodilatação dos vasos sanguíneos

locais. Os neutrófilos deixam o ambiente vascular e migram para o local da inflamação em

resposta a quimiocinas liberadas (KAYAL et al., 2013). A lesão precoce segue com aumento

do número de neutrófilos no tecido conjuntivo e o aparecimento de macrófagos, linfócitos,

células plasmáticas, mastócitos e proteínas do complemento, também, são ativadas. Há uma

12

proliferação epitelial observada histologicamente e os sinais clínicos da inflamação gengival,

tais como hemorragia e aumento do fluido crevicular começam a ser visualizados (CEKICI et

al., 2014).

A etapa seguinte é a lesão estabelecida. Esta pode ser considerada como o período de

transição a partir da resposta imune inata para a resposta imune adquirida. Os macrófagos, as

células plasmáticas e os linfócitos T e B são dominantes, com imunoglobulinas (IgG1 e IgG3)

e subclasses de linfócitos B, também, estão presentes. Há um aumento da produção de

colágeno pelos fibroblastos. Clinicamente, observa-se nesta fase o sangramento, alterações de

cor e do contorno gengival. A etapa final é a transição para periodontite, a lesão avançada,

onde há uma reação inflamatória mais profunda e se percebe a perda óssea alveolar

(FIORELLINI; ISHIKAWA; KIM, 2006).

Uma vez aderido à superfície dentária, o biofilme bacteriano ocasiona uma reação

inflamatória intensa, originando proteases que degradam a matriz extracelular e provocam a

reabsorção do osso alveolar, levando assim a uma perda irreversível da inserção dos tecidos

periodontais (BAKER, 2000; KINANE; LAPPIN, 2001). O conhecimento dos mecanismos

imunológicos e como ocorre a regulação das respostas inflamatórios é de fundamental

importância para a compreensão da patogênese de doenças complexas, tais como a

periodontite.

2.3 ESTRESSE OXIDATIVO E PERIODONTITE

Espécies reativas de oxigênio (ROS) e produtos da peroxidação lipídica são

produzidas em quantidades fisiológicas no corpo humano, porém em condições patológicas,

especialmente na inflamação crônica, ocorre a sua produção excessiva (HALLIWELL, 2000).

As ROS é um termo coletivo que inclui os radicais livres derivados de oxigênio (ODFR), tais

como o radical superóxido (O2), radical hidroxila (OH) e radical de óxido nítrico (NO), inclui

também radicais não derivados de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido

hipocloroso (HOCl) (BHATTACHARYYA et al., 2014).

13

A mitocôndria é o principal local de consumo de oxigênio intracelular e a principal

fonte de formação de ROS. As células dos organismos aeróbios produzem a maior parte de

sua energia química através do consumo de oxigênio em nível mitocondrial (AMES, 2004).

O processo do estresse oxidativo é originado a partir da existência de um desequilíbrio

entre compostos oxidantes e antioxidantes, provocando a produção excessiva de radicais

livres ou a diminuição da velocidade de remoção desses. Assim, esse processo conduz à

oxidação de biomoléculas e consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio

homeostático, em que a manifestação é o dano oxidativo potencial contra células e tecidos

(HALLIWEL; WHITEMAN, 2004).

Os sistemas biológicos são constituídos por sistemas antioxidantes altamente

protetores e que são eficientes o suficiente para neutralizar os radicais livres em excesso e

proteger as células contra efeitos nocivos (VALKO et al., 2007). Esses sistemas podem ser

divididos em: enzimáticos e não enzimáticos (PHAM-HUY L.; PHAM-HUY C.; 2008). As

enzimas antioxidantes mais eficazes também conhecidas como "enzimas primárias" são

representadas pela Glutationa Peroxidase (GPx), Catalase (CAT) e a Superóxido Dismutase

(SOD), que impedem a formação ou a neutralização dos radicais livres. Há também as

"enzimas secundárias", tais como a Glutationa Redutase (GR). Os antioxidantes não

enzimáticos são aqueles gerados endogenamente no corpo através de vias metabólicas,

incluindo antioxidantes tiol, melatonina, coenzima Q10, ácido úrico, bilirrubina, proteínas

quelantes de metais, etc. (PHAM-HUY L; PHAM-HUY C, 2008). Nutrientes antioxidantes

estão inclusos entre o sistema de defesa não enzimático, e são compostos exógenos, obtidos a

partir de alimentos ou suplementos alimentares naturais, tais como a vitamina C, a vitamina E,

carotenóides, oligoelementos (Selênio, Enxofre, Zinco), compostos polifenólicos etc

(ASLANI; GHOBADI, 2016).

A peroxidação lipídica (LPO) é um dos principais resultados da injúria tecidual

mediada pelas ROS (DEL RIO; STEWAR; PELLEGRINI, 2005). Quando as ROS interagem

com os ácidos graxos polinsaturados em membranas ou lipoproteínas, ocasionam profundas

alterações na integridade estrutural e função das membranas celulares. Devido a LPO ser um

resultado do estresse oxidativo, numerosos marcadores são utilizados para monitorar este

processo. O Malonaldeído (MDA) é o principal e um dos produtos mais estudados de

peroxidação de ácidos graxos polinsaturados (BALTACIOGLU et al., 2014).

14

A doença periodontal está associada com o aumento dos níveis de parâmetros de

estresse oxidativo. O papel efetivo do aumento do estresse oxidativo e a diminuição da

capacidade antioxidante na patogênese da ruptura do tecido periodontal, são demonstrados em

soro, saliva e no fluido crevicular gengival (GCF). Estes níveis podem ser aumentados de

acordo com o número e tipo de diferentes bactérias periodontais encontradas nas bolsas

periodontais (BALTACIOGLU et al., 2014). Estudos indicam que o excesso de ROS e o

esgotamento dos níveis de antioxidantes no GCF são responsáveis pela ativação local da

inflamação crônica nos tecidos periodontais e pela sua destruição (GHALLAB; HAMDY;

SHAKER, 2015).

Todas as células do corpo são capazes de gerar ROS. Os neutrófilos

polimorfonucleares são de primordial importância no que diz respeito à periodontite. Os

PMNs compreendem a primeira linha de defesa do hospedeiro e estão presentes nos locais da

invasão microbiana. Eles são ativados por mediadores inflamatórios e podem gerar um

aumento dos níveis de ROS, que não só destroem o periodonto, mas também os tecidos

circundantes (RAMESH et al., 2016). As ROS são geradas pelo sistema de nicotinamida-

adenina-dinucleótido fosfato (NADPH) oxidase (Nox) presente nos neutrófilos e que catalisa

a redução de oxigênio molecular para o radical superóxido. As reduções posteriores resultam

na produção de peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. A literatura tem demonstrado que

as ROS regulam a formação e função dos osteoclastos, ou seja, a capacidade de reabsorção

óssea (LEAN et al., 2005).

Estudos relataram o papel das enzimas antioxidantes, incluindo Glutationa Peroxidase

(GPx), a Catalase (CAT), e Superóxido Dismutase (SOD), na periodontite em seres humanos

(AZIZ et al., 2013) e ratos (YAGAN; KESIM; LIMAN, 2014). A SOD pode ser localizada

dentro do ligamento periodontal humano e representa um importante mecanismo de defesa

dentro de fibroblastos gengivais contra a liberação de radicais superóxidos (JACOBY;

DAVIS, 1991).

Brock et al., 2004 observaram que a capacidade antioxidante total em pacientes com

periodontite é significativamente inferior quando comparados com os controles saudáveis.

Ainda há estudos em animais que mostram que a ação antioxidade é maior naqueles que

receberam algum tratamento farmacológico quando comparado aos doentes e não tratados

(ARAÚJO et al., 2014).

15

2.4 PERIODONTITE E INFLAMAÇÃO

Existem microrganismos específicos associados com as formas progressivas da DP.

No entanto, a presença desses microrganismos em indivíduos sem evidência de progressão da

doença sugere que essas alterações correspondem a resposta imunológicas do hospedeiro aos

processos inflamatórios, e não a simples presença dessas bactérias (CEKICI et al., 2014).

Localmente, bactérias e seus subprodutos metabólicos, a exemplo dos

lipopolissacarídeos, estimulam uma resposta imunitária celular na gengiva afetada,

representado por uma densa infiltração de neutrófilos, macrófagos e células linfóides (COBB,

2008). Estas respostas são destinadas para eliminar o desafio microbiano, porém essa reação

pode muitas vezes exacerbar os danos aos tecidos periodontais (MADIANOS; BOBETSI;

KINANE, 2005).

A resposta inflamatória é caracterizada pela secreção desregulada de mediadores

inflamatórios derivados do hospedeiro e pela degradação dos tecidos. Os mediadores mais

extensivamente estudados incluem interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), sendo

esses os primeiros a aparecerem na via patogênica da doença periodontal (GARLET, 2010), a

prostaglandina E2 (PGE2), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), ligante do receptor ativador

do fator nuclear ҡB (RANKL), e as metaloproteinases (MMPs; particularmente MMP-8,

MMP-9 e MMP-13), bem como as citocinas de células T reguladoras (por exemplo, IL-12,

IL-18) e as quimiocinas (PRESHAW; TAYLOR, 2011).

As MMPs constituem uma família de enzimas dependentes de zinco que são

classificadas de acordo com sua semelhança estrutural e seus substratos específicos

(GRENIER; MAYRAND, 2001). As MMPs são divididas em cinco grandes grupos:

colagenases (MMPs 1, 8 e 13); gelatinases (MMPs 2 e 9); estromelisinas (MMPS 3, 10 e 11);

MMPs tipo membrana (MMPs 14, 15, 16 e 17); e outras (SORSA; TJADERHANE; SALO,

2004; SORSA et al., 2006). Estas enzimas podem coletivamente degradar quase todos os

componentes da membrana da matriz extracelular e a membrana basal, a atividade

patologicamente excessiva leva à destruição dos tecidos periodontais (GESELL-SALAZAR et

al., 2013; SORSA; TJADERHANE; SALO, 2004; SORSA et al., 2006).

16

A atividade das MMPs é controlada por alterações no balanço delicado entre a sua

expressão e síntese, tendo como seus principais inibidores endógenos, inibidores teciduais de

metaloproteinases de matriz (TIMPs). O equilíbrio entre as atividades desses inibidores a as

MMPs determinam o grau de degradação da matriz extracelular. Uma variedade de

mediadores bioquímicos, também, influencia nesse equilíbrio como: fatores de crescimento,

hormônio, produtos oncogênicos, e os níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias (USHIDA

et al., 2000). São secretadas ou liberadas por uma variedade de células hospedeiras como:

leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos, osso, células epiteliais e endoteliais

(RYAN; GOLUB, 2000).

As principais MMPs colagenolíticas associadas com a gravidade da doença

periodontal são MMP-8 e MMP-13 (SORSA et al., 2004; LEPPILAHTI et al., 2011). A

elevação da atividade de MMP-8 foi previamente associada com a conversão da gengivite

para periodontite e a progressão da periodontite estabelecida (MANTYLA et al., 2006). Tanto

a MMP-8, como a MMP-9 e a mieloperoxidase (MPO), são liberadas principalmente pelos

neutrófilos sob uma forma latente, são induzidas e ativadas durante a inflamação periodontal

por mediadores inflamatórios do hospedeiro como o TNF-α, IL-1β, espécies reativas de

oxigénio (ROS), incluindo o ácido hipocloroso MPO produzido (SAARI et al., 1990),

proteases microbianas e derivados do hospedeiro (SORSA et al., 1992).

As MMPs 2 e 9 são identificadas como predominantes em casos de DP inflamatória

em humanos e em ratos, estando relacionadas tanto com a gravidade da DP quanto com a

regulação da resposta inflamatória e da migração celular, presentes no processo de reparo

tecidual (ACHONG et al., 2003; SMITH et al., 2004). Um estudo transversal mostrou que os

níveis de MMP-8 e MMP-9 no fluído crevicular gengival foram correlacionados com a

periodontite crônica (BEKLEN et al., 2006).

Lipopolissacarídeos (LPS) presente na membrana de gram-negativos desencadeiam o

recrutamento de polimorfonucleados para o local. Assim, monócitos e macrófagos ativados

liberam várias citocinas pró-inflamatórias principalmente IL-1β e TNF-α que agem

diretamente na inicialização do processo destrutivo, tanto do tecido ósseo por catepsinas e

MMPs produzidas por osteoclastos, bem como, outras colagenases intersticiais que atuam no

tecido mole. Os Fibroblastos e PMN (neutrófilos polimorfonucleares) também podem liberar

MMP’s (GIANNOBILE, 2008) (Figura 2).

17

Figura 2. Visão esquemática dos biomarcadores chaves relacionados com a progressão da doença

periodontal.

Legenda: Eventos iniciais são acionados por LPS a partir do biofilme da placa gram-negativa na

superfície radicular. Como uma primeira linha de defesa, PMNs são recrutados para o local. Os

monócitos e macrófagos ativados respondem à endotoxina através da libertação de citocinas TNF e IL-

1, que regulam os processos mais destrutivos. MMP, potentes enzimas destruidoras de colágeno, são

produzidas por fibroblastos e pelos PMNs. O TNF, IL-1 e o ligante do receptor ativador do fator

nuclear ҡB (RANKL) são elevados em locais ativos e regulam a osteoclastogênese e a destruição

óssea (Adaptado de GIANOBILLE, 2008).

A IL-1β e a IL-6 são citocinas inatas e têm sido caracteristicamente associada com a

migração de células inflamatórias e a osteoclastogênese (GRAVES et al., 2008). O TNF-α é

uma citocina de múltiplos efeitos e que tem várias funções de migração celular para ocasionar

destruição dos tecidos. Ainda possui um alto impacto na migração de células, através da

indução do aumento da regulação de moléculas que promovem à rotação e à adesão dos

neutrófilos a parede do vaso, levando ao extravasamento. O TNF-α também estimula a

produção de quimiocinas envolvidas na migração de células para locais infectados e

inflamados (DINARELLO, 2000). Regula positivamente a produção de IL-1β e a IL-6

(DINARELLO, 2000; GARLET et al., 2007; GRAVES et al., 2008). Ainda está

DENTE

18

correlacionado com a degradação da matriz extracelular e a reabsorção óssea por meio de

ações de promoção da secreção de MMP’s e RANK-L (GARLET et al., 2004; GRAVES et

al., 2008).

Um ponto chave na expressão das citocinas pró-inflamatórias é a ativação celular do

fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). A família do NF-κB (ou família Rel) consiste

de cinco subunidades que incluem: p65 (RelA), cRel, RelB, p50 e p52. Este fator de

transcrição opera tanto em células malignas ou com potencial de malignidade quanto em

células inflamatórias. A forma mais prevalente do NF-ᴋB ativado é o heterodímero composto

por uma subunidade p50 ou p52 e pela subunidade p65, que contém o domínio de

transativação necessário para a indução do gene (LI et al., 2005).

Pode ser ativado por mais de 150 estímulos: radicais livres, citocinas pró-inflamatórias

(IL-1β e TNF-α), lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), substâncias cancerígenas, promotores

tumorais, radiação UV e mais de 150 genes são expressos em sua ativação (ROMIER et al.,

2008). As citocinas, tais como TNF-α e IL-1β são capazes de ativar o NF-ᴋB através da

proteína quinase C e outras cinases, que fosforilam a parte I-ᴋB do complexo citoplasmático,

liberando o NF-ᴋB rapidamente e sem a necessidade de longa síntese proteica, citocinas estas

muito importantes e que estão envolvidas na progressão da DP (CHAPPLE, 1996). A via

clássica ou canônica do NF-ᴋB é a principal via envolvida na sinalização pró-inflamatória e é

ativada por uma gama de estímulos, que incluem citocinas pró-inflamatórias, vírus, receptores

Toll-like (TLRs) e receptores de antígenos (ROMIER et al., 2008). Potenciais aplicações

terapêuticas de inbição do NF-ᴋB são investigadas em modelos animais de artrite reumatóide

(MCINTYRE; SHUSTER; GILLOOLY, 2003).

Essas informações sugerem que a sinalização da via NF-ᴋB deve ter um importante

papel nas doenças periodontais. E esse conceito é suportado não apenas por análise do perfil

de expressão gênica que demonstram aumento tanto de NF-ᴋB e de genes regulados pela via

NF-ᴋB em tecidos periodontais doentes (DEMMER et al., 2008), mas também por estudos in

vitro (CHEN et al., 2008) .

Outra via envolvida na patogênese da doença periodontal envolve a síntese e

liberação de prostaglandinas (PGs) e outros metabólitos do ácido araquidônico dentro dos

tecidos periodontais (HOWELL; WILLIANS, 1993). Estas potentes moléculas estão

associadas à destruição dos tecidos, alterações no metabolismo dos fibroblastos e a reabsorção

19

óssea (KUMAR et al., 2013). As enzimas ciclooxigenases, COX-1 e COX-2, catalisam a

conversão do ácido araquidônico a prostaglandinas. A COX-1 é expressa constitutivamente e

leva à produção de PGs que são particularmente importantes na homeostase, enquanto que a

COX-2 é induzida e leva à formação de PGs envolvidas nos processos inflamatórios

(GARLET, 2010). A atividade das ciclooxigenases foi considerada aumentada em certos

estados inflamatórios, podendo ser induzida nas células por citocinas inflamatórias (SEIBERT

et al., 1994)

Offenbacher, Heasman, Collins (1993), relataram que os níveis de prostaglandina da

série E (PGE-2) no fluido crevicular gengival (GCF) estão correlacionados positivamente com

a inflamação periodontal e a destruição iminente de tecidos. A PGE-2 e o leucotrieno B-4

foram encontrados no fluido crevicular gengival de indivíduos com periodontite agressiva

localizada. Além disso, P. gingivalis estimula o aumento dos níveis PGE-2 e a expressão da

COX-2 no infiltrado de leucócitos in vivo (POULIOT et al., 2000).

Teoricamente, a maior parte da inflamação e alterações destrutivas periodontais que

ocorrem na DP, tais como vermelhidão gengival, edema, degradação do colágeno e perda

óssea poderiam ser causadas pela presença das ações diretas da PGE 2 (KUMAR et al., 2013).

2.5 REMODELAÇÃO ÓSSEA E DOENÇA PERIODONTAL

O osso, incluindo o osso alveolar, é continuamente remodelado por um processo

equilibrado de reabsorção pelos osteoclastos, seguido de deposição pelos osteoblastos

(BAKER, 2000). Os osteoclastos são células grandes multinucleadas envolvidas na

reabsorção óssea fisiológica e patológica. Suas células precursoras surgem a partir da

linhagem hematopoiética formada dentro da medula óssea (CAPPARIELLO et al., 2014). Já

os osteoblastos desempenham um papel crítico no processo de remodelação óssea, formando e

depositando novo material ósseo. Há ainda os osteócitos, que são considerados osteoblastos

terminalmente diferenciados, que tenham chegado ao fim do seu percurso de diferenciação e

estão incorporados dentro da microestrutura do osso (SCHAFFLER; KENNEDY, 2012;

PRICE et al., 2011).

20

Em condições patológicas, tais como periodontite, há um desequilíbrio nos processos

de formação e reabsorção resultando na perda óssea. Este desequilíbrio é devido não somente

a excessiva reabsorção óssea dos osteoclastos, mas também a supressão da diferenciação e

atividade dos osteoblastos (SOUZA; LERNER, 2013). O RANKL (ligante do receptor de

ativação do fator nuclear κβ), seu receptor celular, RANK (receptor de ativação do fator

nuclear кB) e osteoprotegerina (OPG) representam o sistema de regulação molecular chave

para a remodelação óssea. Os efeitos de RANKL são neutralizados pela OPG, que inibe

fortemente a reabsorção óssea pela prevenção do acoplamento RANK-RANKL (KATAGIRI;

TAKAHASHI, 2002).

Na doença periodontal, o aumento dos níveis de RANKL é encontrado em tecidos

doentes, e o seu desequilíbrio com a expressão de OPG pode determinar a gravidade da

doença (GARLET et al., 2004; VALVERDE; KAWAI; TAUBMAN, 2004).

O sistema RANK também contribui para a reabsorção óssea, induzindo a expressão da

Catepsina K, uma proteinase de cisteína produzidas por osteoclastos ativados e envolvidas no

processo de solubilização da matriz óssea (TEITELBAUM, 2000). A Catepsina K é

considerada, muitas vezes, como um importante alvo terapêutico para o direcionamento da

perda óssea em muitas doenças que apresentam a formação ou funcionamento excessivo de

osteoclastos, incluindo a artrite reumatóide, osteoporose pós-menopausa e doença periodontal

(CHEN, et al. 2016).

As citocinas inflamatórias, de modo geral, atuam tanto na iniciação quanto na

manutenção da resposta imune frente aos desafios bacterianos. Existem várias classes de

moléculas que ativam a resposta do hospedeiro e que podem estimular a osteoclastogênese,

direta ou indiretamente, incluindo mediadores à base de lípideos, tais como prostaglandinas

ou leucotrienos, citocinas e quimiocinas (GRAVES; LI; COCHRAN, 2011). O TNF-α está

envolvido na migração dos leucócitos para os tecidos periodontais, na reabsorção óssea

alveolar e na perda da inserção conjuntiva. A IL-1β ocasiona o aumento da secreção dos

níveis de MMPs e diminui a expressão dos TIMPS (inbidores teciduais de metaloproteinases),

desempenhando, portanto, um papel importante na degradação da matriz extracelular na

periodontite e um grande indutor de reabsorção óssea (GRAVES; COCHRAN, 2003).

Bloqueando-se a atividade do TNF-α, por meio de antagonistas ou anticorpos, não

somente há uma redução da resposta inflamatória como também pode haver uma inibição da

21

reabsorção óssea através da diminuição da atividade do RANKL presente no tecido. A

supressão da formação de osteoclastos tem sido observada em modelos animais de artrite

reumatóide através de várias combinações da inibição de TNF-α, IL-1β ou RANKL

(ZWERINA et al., 2004).

2.6 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DA PERIODONTITE

A raspagem e o alisamento radicular (RAR) são partes essenciais consideradas o

padrão ouro para tratamento das doenças periodontais (COBB, 1996). No entanto, uma

pequena proporção de indivíduos tratados e que não respondem a terapia continuam a

apresentar perda de inserção clínica (COLOMBO et al., 2012). Assim, a possibilidade de uma

reinfecção por microorganismos residuais é um forte argumento para a utilização de

tratamentos adjuvantes além da RAR (COBB, 2008).

A literatura tem discutido a possibilidade da terapia antimicrobiana como adjuvante a

terapia mecânica no tratamento da periodontite e tem indicado que o seu uso pode fornecer

benefícios adicionais (HEITZ-MAYFIELD, 2009). Historicamente, o primeiro antibiótico

utilizado como terapia local foi o Actisite (não disponível comercialmente). Actisite foi

fornecido como fibras ocas, não absorvíveis preenchidos com tetraciclina. A fibra era

introduzida na cavidade em torno do dente. O sistema do Actisite, embora muito eficaz,

tornou-se tedioso de usar e possuía a necessidade uma segunda visita para a sua remoção.

Estas questões impulsionaram o desenvolvimento de sistemas absorvíveis para aplicação do

antibiótico. O Atridox (Atrix Laboratories, Fort Collins, CO), foi o primeiro sistema de

antibióticos locais reabsorvíveis, composto por doxiciclina, que possui uma maior meia vida

do que a tetraciclina. Após 7 dias o medicamento era absorvido não sendo necessária uma

segunda visita para a sua remoção. Esse sistema melhorou a aplicação do antibiótico local,

permitindo a colocação do material numa maior profundidade da maioria das bolsas

periodontais, ao contrário das fibras sólidas de Actisite (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD,

2010).

Apesar de mais de 700 espécies bacterianas terem a capacidade de estar presentes no

sulco gengival, apenas um subconjunto de espécies são consistentemente encontradas e

22

associadas com sítios doentes. Com base no espectro de ação, um conhecimento prévio a

cerca do antibiótico e uma pesquisa sobre o perfil das espécies bacterianas no sulco gengival,

é possível escolher o antibiótico que deva ser um agente farmacológico eficaz

(SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2005). No entanto, deve-se ter um cuidado porque nenhum

destes antibióticos é eficaz como monoterapia no tratamento da DP.

A combinação do Metronidazol e Amoxicilina foi realizada para produzir uma maior

redução da profundidade da bolsa periodontal. Um regime de 7 dias de Metronidazol

sistêmico reduziu significativamente a porcentagem de sítios com sangramento em

comparação ao grupo controle (WINKEL et al., 2001). Outros relataram uma redução de 12

meses no sangramento no tratamento com uma combinação de Metronidazol-Amoxicilina em

comparação com um tratamento placebo (LOPEZ; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000).

Preocupações são frequentemente levantadas no que se refere à resistência bacteriana com o

uso do antibiótico sistêmico no tratamento da doença periodontal. Essa resistência pode

eliminar uma droga possivelmente importante ou essencial como possível opção de

tratamento de doenças com um maior potencial risco de vida do que a DP, isoladamente

(WALKER, 1996).

Os anti-inflamatórios não esteróides (AINES) também representam uma classe

farmacológica importante de agentes que têm sido estudados como inibidores da resposta do

hospedeiro na doença periodontal. Estes agentes são bem conhecidos pela capacidade de

prevenir a formação de prostanóides (OFFENBACHER, 1996). Outras terapias locais como

clorexidina e óleos essenciais também são empregadas no tratamento da periodontite. No

entanto, essas terapias apresentam algumas reações indesejadas: sensação de queimadura,

sabor amargo, e eventual coloração dos dentes (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010;

LOPES; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000).

2.7 METFORMINA (MET)

O cloridrato de Metformina faz parte de uma importante classe de hipogliceminantes

orais, as biguanidas (Fig.3). É o agente anti-hiperglicêmico oral mais comumente prescrito,

consumido anualmente por mais de 150 milhões de pessoas em todo o mundo (KONOPKA et

23

al., 2016). Utilizada para diminuir a concentração de glicose no sangue em diabéticos tipo 2,

aumentando a sensibilidade à insulina (GOODARZI; BRYER-ASH, 2005).

Figura 3. Estrutura química do Cloridrato de Metformina

Fonte: Farmacopéia Britânica, 2012.

O mecanismo de ação da Metformina ainda é controverso, podendo ter vários sítios de

ação como: diminuição da produção da glicose hepática, aumento da disponibilidade da

glicose periférica e redução da absorção intestinal da glicose (HUNDAL; INZUCCHI, 2003).

Reduz a gliconeogênese, promove a absorção de glicose e diminui a produção desse açúcar no

fígado (ZHOU et al., 2001). Em menor escala, os níveis de glicose no plasma são reduzidos

pela estimulação da sua captação pelos músculos esqueléticos periféricos e pelo tecido

adiposo, o que é provavelmente secundária à reversão de glicotoxicidade e não a um efeito

farmacológico direto (YU et al., 1999) (Figura 4).

Figura 4. Metformina: mecanismo de ação proposto

Fonte: Adaptado de Hundal e Inzucchi, 2003.

Fígado

Diminui a produção

hepática de glicose

(gliconeogênese)

Músculo esquelético

Melhora a absorção da

glicose periférica

Intestino

Diminuição do apetite

e consumo calórico;

pode diminuir a

absorção intestinal da

glicose

Pâncreas

Aumenta a secreção

de insulina

(provavelmente um

efeito secundário de

diminuição da

glicotoxicidade)

Gordura

Melhora a absorção

da glicose periférica

(provavelmente um

efeito secundário de

diminuiçao

daglicotoxicidade);

pode diminuir a

lipólise

24

Estudos mostram que a AMPK (Proteína quinase ativada por AMP) é uma enzima que

tem a capacidade de induzir uma cascata de eventos intracelulares em resposta a mudanças da

carga energética celular. É um componente-chave para a manutenção do equilíbrio entre

AMP-ATP (HARDIE, 2003; CARLING, 2004).

Trata-se de uma molécula heterotrimérica que contém uma subunidade catalítica (α),

com duas isoformas (α1 e α2), e duas subunidades regulatórias (β e γ), com as seguintes

isoformas (β1, β2, γ1 γ2 e γ3) (CARLING, 2004). Essa proteína é ativada pela fosforilação do

resíduo de treonina 172 da alça de ativação da subunidade α (WINDER et al., 2000). A

ativação é causada pelo decréscimo no conteúdo energético celular, uma vez fosforilada, a

AMPK ativa vias que geram o aumento de ATP, tais como a oxidação de ácidos graxos, ao

mesmo tempo em que inibe as vias anabólicas que consomem o ATP, tal como a síntese de

ácidos graxos (AG). Esses estímulos ativadores podem ser fisiológicos como exercício físico

e contração muscular ou patológicos como deprivação de glicose, hipóxia, estresse oxidativo,

choque osmótico, choque térmico, envenenamento metabólico, isquemia, diminuição do pH,

inibição da glicólise e desacopladores da fosforilação oxidativa (HARDIE, 2003).

A Metformina atua na ativação do AMPK in vitro e in vivo (HAWLEY et al., 2002).

Zang et al. (2004), mostraram que a Metformina estimula a atividade da AMPK no fígado e

no músculo esquelético. Também mostraram que essa enzima é ativada pela MET em cultura

de hepatócitos humanos insulino-resistentes (HepG2). Por fim, este fármaco reduz teor de

lipídios no fígado por ativar a AMPK, mediando assim os efeitos benéficos na hiperglicemia e

resistência à insulina.

Musi et al. (2002), realizaram uma pesquisa em indivíduos diabéticos tipo 2, onde foi

utilizado a Metformina durante 10 semanas. Observou-se que houve um aumento da atividade

da AMPK α2 no músculo esquelético nesses indivíduos.

2.8 EFEITOS PLEIOTRÓPICOS DA METFORMINA

O efeito pleiotrópico nos sistemas biológicos é um fenómeno muito conhecido,

comumente atribuído à complexidade das redes de sinalização intracelulares ou as respostas

25

celulares em tecido específicos. Consequentemente, uma lista crescente de agentes

farmacológicos está sendo relatada para demonstrar o potencial terapêutico em determinadas

patologias que não são comumente relevantes com a sua utilização terapêutica atual

(CORBETT; WILLIAMS; BALLARD, 2015; LEE S; LEE J; NEEMENO, 2016).

A Metformina é um agente antidiabético amplamente utilizado que melhora a

sensibilidade à insulina (GOODARZI; BRYER-ASH, 2005). A literatura tem relatado outros

benefícios desse fármaco em outros locais de ação. O estudo de Takemura et al (2007),

mostrou a ação da Metformina no tratamento da endometriose, avaliou-se a resposta

inflamatória, a produção do hormônio estradiol e a proliferação de células do estroma da

endometriose (CES), por fim o estudo teve por resultado um efeito dose-dependente deste

fármaco.

Hattori et al (2006), relataram em seu trabalho que a MET possui ação antiaterogênica.

O medicamento inibiu a expressão de genes pró-inflamatórios e a adesão molecular por

bloquear o NF-ҡB por meio da ativação do AMPK em células endoteliais vasculares.

Um trabalho in vitro realizado por Kim et al (2016), mostrou que a MET possui

propriedades positivas em relação ao câncer de mama, um dos mecanismos anticancerígenos

da Metformina pode ser atribuído à repressão da expressão e da atividade transcricional do

ERα (receptor de estrogênio alfa). A Metformina pode ser um bom agente terapêutico para o

tratamento do câncer de mama ERα-positivos, inibindo a expressão e função desse receptor.

Uma revisão sistemática com meta-análise de ensaios clínicos randomizados

demonstrou que a Metformina tem uma eficácia moderada na redução do IMC (índice de

massa corpórea) e resistência à insulina em crianças obesas hiperinsulinêmicos e adolescentes

em um curto prazo de 6 meses. No entanto, maiores estudos com um prazo maior e em

populações diferentes são necessários para estabelecer o seu papel no tratamento de crianças

com excesso de peso (PARK et al., 2009).

A MET pode ocasionar um efeito osteogênico em cultura de osteoblastos, é o que

mostra o trabalho de Cortizo (2006). Este estudo avaliou os efeitos da metformina sobre o

crescimento e diferenciação dessa cultura de células, o tratamento de duas células semelhantes

a osteoblastos (UMR106 e MC3T3E1) com Metformina (25-500μM) conduziu a um aumento

dependente da dose da proliferação de células. Aumentou acentuadamente a formação de

26

nódulos de mineralização em 3 semanas em culturas do MC3T3E1. Marycz et al (2016),

realizaram um estudo em camundongos, onde os animais saudáveis foram submetidos a um

tratamento com a Metformina, durante 8 semanas, e posteriormente eutanasiados. Removeu-

se, por via subcutânea abdominal o tecido adiposo e as tíbias de cada animal. Obteve por

resultado que as ASC (células derivadas de tecido adiposo) apresentaram uma ação

proliferativa potencial, gerando uma rede robusta de projeções do citoesqueleto, reduziram a

expressão de marcadores associados à senescência celular e diminuíram a quantidade de

espécies reativas de oxigênio em comparação ao grupo controle. Além disso, demonstrou-se

que estas células possuíam maior potencial de diferenciação osteogênica. Assim a Metformina

aumenta a densidade óssea in vivo.

A MET mostrou inibir a formação de osteoclastos em ratos submetidos a lesões

periapicais experimentais. Os animais receberam o tratamento farmacológico via

intramuscular durante 2 a 4 semanas, após esse período foram eutanasiados e tiveram a

mandíbula removida. A Metformina inibiu as lesões periapicais, possivelmente, diminuindo a

proporção RANKL / OPG, e reduzindo posteriormente o número de osteoclastos e as áreas de

reabsorção óssea (LIU et al., 2012).

Bak et al (2010), realizaram um estudo em ratos, onde os animais foram submetidos

ao desenvolvimento de uma periodontite ocasionada por ligadura na região de primeiro molar

inferior, cada animal recebeu o tratamento farmacológico durante 10 dias e logo após tiveram

suas mandíbulas extraídas e analisadas. A análise foi realizada por Micro CT

(microtomografia computadorizada), mostrando que houve uma redução significativa na

perda óssea alveolar quando comparado ao grupo controle.

27

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a ação do Cloridrato de Metformina em ratos submetidos à Doença Periodontal

induzida por ligadura.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a ação do Cloridrato de Metformina sobre a perda óssea induzida pela

doença periodontal por meio da análise macroscópica e microscópica do periodonto.

Identificar possíveis mecanismos de ação para o Cloridrato de Metformina na doença

periodontal experimental por meio do estudo do seu efeito na expressão de citocinas

inflamatórias (dosagens de IL-1β e TNF-α) e sobre o estresse oxidativo (dosagem de

GSH e MDA).

Realizar a imunohistoquímica por meio de marcadores da inflamação (COX-2),

envolvidos na perda óssea (RANK, RANK-L, OPG, Catepsina K e MMP-9) e na

atividade antioxidante (SOD-1e GPx).

Analisar os efeitos da MET na DP por diferentes vias de sinalização (APMK, NF-кB

p65 e HMGB1).

28

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 DESENHO DO ESTUDO

Trata-se de um ensaio pré-clínico, in vivo, randomizado, cego e controlado por

placebo.

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A utilização e manipulação dos animais seguiu o protocolo aprovado pela Comissão de

Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da UFRN (CEUA), segundo o processo de número

066/2014 (em anexo).

4.3 LOCAL DO EXPERIMENTO

Os procedimentos experimentais e laboratoriais, incluindo o preparo e a manipulação dos

animais, a coleta de materiais orgânicos e os diferentes tipos de análises foram realizados pelo

laboratório de Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN, com o auxílio dos

Departamentos de Bioquímica, Morfologia, Microbiologia e Parasitologia do mesmo centro.

4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS E GRUPOS

O experimento utilizou 120 ratos Wistar com pesos entre 180 e 220g (aproximadamente

60 dias), provenientes do Biotério do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN). Os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas onde todos

receberam água e ração para animais de laboratório (Purina - Nuvilab CR-1autoclavável;

29

Nuvital, SP, Brasil) ad libitum. Permaneceram ainda sob as mesmas condições ambientais,

sala climatizada (22C° ±2°C), e com ciclo claro-escuro de 12-12 horas durante os

experimentos. Os mesmos foram divididos em 5 grupos com 24 animais cada, assim

distribuídos:

Grupo Não Ligado (NL) – Grupo cujos animais não foram submetidos à indução

da doença periodontal (DP). Os animais não receberam nenhum tratamento

farmacológico, sendo tratados apenas com gavagem de solução salina durante 10

dias (solução fisiológica 0,9%).

Grupo Ligado (L) – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por

ligadura. Os animais deste grupo não receberam nenhum tratamento

farmacológico, sendo tratados apenas com gavagem de solução salina durante 10

dias (solução fisiológica 0,9%).

Grupo MET 50 – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por

ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina

durante 10 dias (50 mg/kg/dia, via oral por gavagem).

Grupo MET 100 – Grupo cujos animais foram submetidos à indução da DP por

ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina

durante 10 dias (100 mg/kg/dia, via oral por gavagem).

Grupo MET 200 – Grupo, cujos animais foram submetidos à indução da DP por

ligadura; e que foram tratados com dose única diária de Cloridrato de Metformina

durante 10 dias (200 mg/kg/dia, via oral por gavagem).

30

4.5 DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO

4.5.1 Modelo Experimental da Doença Periodontal

Os animais foram anestesiados por meio de injeção intraperitoneal (i.p) com

Cloridrato de Ketamina 10% (70 mg/kg Vetnil, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Xilazina

2% (10 mg/kg, Calmium, São Paulo, Brasil). A DP foi induzida pela inserção cirúrgica de um

fio de sutura de nylon 3-0 estéril (Polysuture, NP45330, São Paulo, Brasil) na região cervical

do segundo molar superior esquerdo. Este fio foi adaptado de modo que o nó cirúrgico ficasse

voltado para a face vestibular da cavidade oral do animal (Figura 5). Utilizou-se o modelo de

Doença Periodontal desenvolvido por vários autores (CRAWFORD; TAUBMAN; SMITH,

1978; SAMEJIMA; EBISU; KOIDE et al., 1995) e modificado pelo Laboratório de

Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, Faculdade de Medicina do Ceará (LIMA et al., 2000; MENEZES, 2003;

LEITÃO et al., 2004).

Figura 5. Sequência de colocação da ligadura (fio de nylon).

Fonte: Autor, 2016.

Legenda: Anestesia inicial i.p com Cloridrato de Ketamina 10% e Cloridrato de Xilazina 2%. Utilizou-

se o fio de sutura de nylon 3-0, na região cervical do segundo molar superior esquerdo. O nó foi

mantido na face vestibular e o fio inserido subgengivalmente.

31

4.5.2 Tratamento Medicamentoso

Um comprimido de Cloridrato de Metformina (Medley, Campinas, São Paulo, Brasil) 850

mg foi triturado diariamente com o grau e pistilo, em seguida adicionou-se água destilada na

proporção adequada para formação da solução. Cada animal recebeu a droga na concentração

indicada e individualizada, baseada em estudos in vivo, que examinaram a ação da droga em

ratos (REAGAN-SHAW; NIHAL; AHMAD, 2008). A administração da MET nas

concentrações de 50 mg/kg, 100 mg/kg ou 200 mg/kg foi realizada por via oral através de

gavagens diárias durante 10 dias. O procedimento da gavagem trata-se da inserção de uma

sonda de polipropileno para aspiração traqueal com o comprimento de 50 cm e calibre 08 F. A

sonda foi inserida por via oral até a porção gástrica do animal, a solução foi então

impulsionada através do auxílio de uma seringa descartável, o animal é imobilizado pelas

mãos do operador (Figura 6). No dia da indução da doença periodontal a gavagem foi

realizada 2 horas após o procedimento cirúrgico.

Figura 6. Gavagem com sonda de polipropileno

Fonte: Autor, 2016.

32

4.5.3 Eutanásia dos animais

Onze dias após o tratamento inicial, os animais foram eutanasiados por injeção i.p de

Tiopental 80mg /kg (0.5 g Cristália, São Paulo, Brasil), seguido do deslocamento cervical

procedendo-se à obtenção de amostras para as diferentes formas de análise.

4.5.4 Obtenção e preparo inicial do material para análise

Após a eutanásia dos animais as maxilas foram removidas e separadas em duas hemi-

maxilas, para cada grupo de 24 animais. As maxilas esquerdas de 5 animais foram destinadas

para processamento histopatológico e dessas mesmas maxilas, 3 foram utilizadas para o

processamento imunohistoquímico, essas amostras foram fixadas em formol tamponado a

10% por no mínimo 24 horas e, em seguida, submetidas ao tratamento para desmineralização

e inclusão em parafina. Os 19 animais restantes tiveram as duas hemi-maxilas extraídas e

fixadas em formol tamponado a 10% para avaliação do índice de perda óssea (IPO), sendo o

lado esquerdo o qual foi induzida a doença periodontal utilizado como teste e o lado direito

como controle para análise. As amostras dos tecidos gengivais (dos mesmos 19 animais, uma

amostra por animal) foram cuidadosamente removidas do tecido ósseo da região entre os

primeiros e segundos molares esquerdos na face vestibular e congeladas a - 80ºC e destinadas

para análise de citocinas (4 amostras), níveis de MDA (4 amostras) e níveis de GSH (4

amostras), exceto as amostras para a quantificação de RNAm (4 amostras) que previamente

foram armazenadas em reagente Trizol (Life Technologies, California, USA). A figura 7

representa um resumo das análises realizadas, para os diferentes grupos experimentais:

33

Figura 7. Divisão das amostras por grupos de 24 animais.

Fonte: Autor, 2016

4.6 TIPOS DE ANÁLISES

4.6.1 Análise morfométrica e macroscópica da perda óssea alveolar

Após a eutanásia, as hemimaxilas foram excisadas e fixadas em formol tamponado a

10% (19 amostras por grupo), durante 24 horas. Em seguida, todo tecido mole aderido ao

tecido duro foi cuidadosamente removido, sendo este último então imerso em azul de

metileno a 1%, por 5 minutos, para que se pudesse diferenciar a estrutura óssea do dente e,

macroscopicamente, investigar a presença ou não de reabsorção óssea com exposição

radicular. Para a quantificação da reabsorção óssea, as duas hemiarcadas foram acomodadas

com massa de modelar em lâminas. Em seguida, imagens foram capturadas através de um

aparelho de fotografia digital padronizada (Olympus SC30) com aumento de 4 vezes e

posteriormente salvas no formato JPG. As amostras foram colocadas com a face oclusal dos

dentes posicionada perpendicularmente ao aparelho digital. A perda óssea alveolar foi obtida

com o auxílio de um Software de imagem (Adobe Photoshop CS3), onde foi realizada a

medição da área compreendida entre a junção amelo-cementária (JAC) e as cristas ósseas

alveolares. As medidas foram calculadas inicialmente em pixels e posteriormente foram

24 Animais/grupo

19 Morfometria

4 MDA

4 GSH

4 Citocinas

4 RT PCR

5 histopatológico

3 Imunohistoquímica

34

convertidas em mm pelo uso de um padrão de milímetros fixado ao lado das maxilas. Três

medidas foram feitas ao logo da superfície radicular de cada um dos primeiros molares (3

raízes cada) e 2 medidas nos segundos e terceiros molares (duas raízes cada). A perda total do

osso alveolar foi obtida tomando a soma das medições dessas superfícies radiculares (IPO) em

região de maxila esquerda, subtraindo-se os valores do maxilar direito (controle sem

ligadura), em milímetros (CARVALHO et al., 2013) (Figura 8).

Figura 8. Obtenção do Índice de Perda Óssea (IPO)

Legenda: A: Visualização de tecido dentário e ósseo em magnificação de 4X com o padrão em milímetros. B:

Medida, em sete pontos distintos, entre o nível de reabsorção óssea alveolar e a junção amelo-cementária

4.6.2 Análise Histopatológica

Após a eutanásia dos animais suas hemiarcadas (5 amostras por grupo) foram

removidas. Estas foram fixadas em formol tamponado a 10% durante 24 horas, sendo

posteriormente submetidas a tratamento com ácido nítrico a 5%, por aproximadamente 14

A

B

35

dias (trocas diárias do ácido), para a desmineralização. Subsequentemente, foi realizado

processamento histológico detalhado a seguir:

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

Álcool etílico 95°GL (2 minutos);

Álcool etílico I (PA) (5 minutos);

Passagem em xilol, 3 banhos de 1 hora cada;

Inclusão em parafina;

Cortes seriados de 4µm em micrótomo;

Montagem sobre lâminas de vidro;

Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos

cada);

Hidratação em cadeia descendente de etanóis:

Álcool etílico absoluto I (PA) (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (PA) (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (PA) (5 minutos);

Álcool etílico 95°GL (5 minutos);

Álcool etílico 80°GL (5 minutos);

Lavagem em água destilada;

Coloração pelos métodos HE ou Tricrômio de Mallory;

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

Álcool etílico 95°GL (2 minutos)

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Passagens rápidas em xilol (3 trocas);

Montagem das lâminas em resina Permount®

Para análise microscópica das hemiarcadas com a coloração HE, foi considerada a

região entre os primeiros e segundos molares, sendo avaliados os aspectos avaliados: influxo

de células inflamatórias, integridade do osso alveolar e cemento. Foram atribuídos escores

analisados e classificados por um patologista de forma unicego (LEITÃO et al., 2005), de

acordo com o quadro a seguir:

36

Quadro 1 - Escores para análise histológica dos tecidos periodontais de suporte

Fonte: Quadro elaborado através de consulta ao artigo de LEITÃO et al (2005).

4.6.3 Análise Imunohistoquímica da expressão de RANK-L, RANK, OPG, Catepsina K,

COX-2, MMP-9, SOD-1 e GPx nos tecidos periodontais de suporte

Secções de tecido periodontal com 4 μm de espessura (3 amostras por grupo) foram

obtidas utilizando-se um micrótomo e transferidas para lâminas especiais cobertas por

gelatina. Cada amostra foi em seguida desparafinizada e reidratada.

Os cortes de tecido periodontal foram lavados e incubados com os seguintes

anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology, Interprise, Brasil): COX-2, 1: 400; MMP-9,

1: 400;RANK, 1:400, RANKL, 1: 400; OPG, 1: 400; Catepsina K: 1: 400; SOD-1, 1:400 e

GPx, 1:400. Os cortes foram lavados e incubados com os anticorpos secundários estrepto-

avidina conjugada com HRP (Biocare médicos, Concord, CA, EUA) durante 30 minutos. A

imuno-reatividade para MMP-2, RANK, RANK-L, OPG, COX-2, Catepsina K, SOD-1 e GPx

foi visualizada usando um kit para detecção colorimétrica seguindo as instruções do

fabricante (TrekAvidin-HRP rótulo + kit, Biocare médicos, Dako, EUA).

Escores Aspectos histológicos

0

Infiltrado celular ausente ou discreto,

restrito a gengiva marginal;

Processo alveolar preservado;

Cemento preservado

1

Infiltrado celular moderado, presente

na gengiva inserida;

Pequena reabsorção do processo

aveolar;

Cemento preservado

2

Infiltrado celular acentuado, presente

na gengiva e ligamento periodontal;

Processo alveolar com reabsorção

acentuada;

Destruição parcial do cemento

3 Infiltrado inflamatório acentuado;

Completa reabsorção alveolar;

Destruição acentuada do cemento

37

Segue o detalhamento das etapas para imunohistoquímica:

Amostras submetidas a cortes com 3 µm de espessura;

Transferência para lâminas silanizadas;

Desparafinização: 2 banhos em xilol à temperatura ambiente (10 minutos

cada);

Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Álcool etílico 95°GL (5 minutos);

Álcool etílico 80°GL (5 minutos);

Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

Recuperação antigênica (Proteinase K);

Lavagem com PBS;

Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% (10

volumes), em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena

tecidual (10 minutos cada);

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

Aplicação da proteína block por 10 minutos (BSA 0,05% em PBS);

Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

Dupla lavagem com PBS;

Aplicação do anticorpo primário específico e incubação (overnight);

Remoção do excesso do anticorpo primário com a pipeta com PBS;

Aplicação do anticorpo secundário kit DAKO LAB (LSAB+System-HRP);

Dupla lavagem com PBS;

Strepto-avidina HRP (30 minutos);

Dupla lavagem com PBS;

Incubação com DAB (10 minutos);

Lavagem com água destilada;

38

Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5

minutos);

Lavagem com água corrente;

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

Álcool etílico 95°GL (2 minutos);

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Passagens rápidas em xilol (3 trocas);

Montagem das lâminas em resina Permount®

4.6.4 ELISA para dosagem dos níveis de IL-1β e TNF-α nos tecidos gengivais

Amostras gengivais (4 amostras para cada grupo) foram obtidas da região vestibular

dos molares superiores esquerdos e armazenadas a -80°C para posterior análise. Em seguida

foram homogeneizadas e processadas. Os níveis de IL-1β (intervalo de detecção: 62.5–4000

pg/mL; limite mínimo de detecção: 12.5 ng/mL recombinante para ratos IL-1β) e TNF-α

(intervalo de detecção: 62.5–4000 pg/mL; limite mínimo: 50 ng/mL recombinante para ratos

TNF-α) foram determinados utilizando kits comerciais de ELISA (R&D Systems,

Minneapolis, MN, USA), método descrito por Kendall et al., 1983. Todas as amostras

tiveram medidas a 490 nm.

Placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 4°C com anticorpos de

ratos contra IL-1β e TNF-α. Em seguida as placas foram bloqueadas, as amostras e os padrões

foram adicionados em várias diluições em duplicata e incubadas a 4ºC por 24 horas. As placas

foram lavadas três vezes com tampão e os anticorpos foram adicionados aos poços

(biotinilado policlonal de ovelha anti-TNF-α, anti-IL-1β, diluídos a 1: 1000 com tampão de

ensaio de BSA a 1%). Em seguida incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora e

lavadas. Logo após, 50 mL de avidin-HRP (1:5000) foi adicionado. O reagente colorimétrico

o-fenilenodiamina (50 mL) foi acrescentado 15 minutos depois e as placas foram incubadas

39

no escuro a 37°C durante 15-20 minutos. A reação enzimática foi parada com H2SO4 e as

medidas foram realizadas com absorbância de 490nm. Os valores foram expressos em pg/mL.

4.6.5 Dosagem de Malonaldeído (MDA)

Malonaldeído (MDA) é um produto final da peroxidação lipídica, para quantificar o

aumento de radicais livres nas amostras gengivais. O conteúdo de MDA foi medido através do

ensaio descrito por Esterbauer e Cheeseman, 1990. As amostras (4 para cada grupo) foram

suspensas em tampão Trisma 1: 5 (w / v) e cortadas com tesoura durante 15 seg sobre uma

placa arrefecida com gelo. A suspensão resultante foi homogeneizada durante 2 minutos

através de um homogeneizador e foi centrifugada a 2500 x g a 4°C durante 10 min. Os

sobrenadantes foram testados para determinar o teor de MDA e colocadas em microplacas. A

absorbância de cada amostra foi medida a 586nm. Os resultados são expressos como

nanomoles de MDA por grama de tecido.

4.6.6 Dosagem de Glutationa (GSH)

Os níveis de GSH nos tecidos gengivais foram medidos para avaliar a atividade

antioxidante. Às amostras gengivais do tecido preparado foram adicionadas 0,02 M de EDTA,

4 por grupo, e armazenadas a – 80ºC até a sua utilização, método descrito por Costa et. al,

2006. Os tecidos gengivais foram homogeneizados (0,25 mL de 5% solução), adicionadas 320

ml de água destilada e 80 ml de TCA a 50%. As amostras foram centrifugados a 3000 rpm

durante 15 minutos em uma temperatura de 4ºC. Removeu-se o sobrenadante (400 µL) e

adicionou-se 800µL de 0,4 M de tampão Tris pH 8,9 e 20 µL de 0,01 M (5,59 ditiobis-ácido

2-nitrobenzóico) DTNB. A absorbância foi medida a 420 nm, e os resultados foram relatados

como unidades de GSH por miligrama de tecido.

40

4.6.7 Expressão gênica por RT PCR (PCR em tempo real)

A análise do RT-PCR quantitativo (reação de transcrição reversa seguida da reação da

polimerase em cadeia) foi realizada utilizando-se o Primer SYBR Green Master Mix. O RNA

total dos tecidos gengivais foi extraído utilizando-se o reagente Trizol (Life Technologies,

Califórnia, EUA) como descrito anteriormente por Chomczynski e Sacchi (2006). O

isolamento do RNA e o processo de purificação foram feitos com o uso do SV total RNA

Isolation System (Promega Corporation, EUA). A concentração de RNA foi determinada a

partir da densidade óptica a um comprimento de onda de 260 nm (utilizando OD260, unidade

equivalente a 40 µg / ml de RNA). Cinco microgramas do RNA isolado totalmente foram

convertidos para cDNA numa mistura reacional contendo 4µl x 5 tampão de reação, 2µl de

dNTP,(10mM), 20 unidades de inibidor de RNase, 200 unidades de vírus aviário-

mieloblastose (AMV) de transcriptase reversa e 0,5 µg de Primer oligo (dt) (High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kit, Foster City, USA), em um volume total de 20µl. A mistura

foi incubada a 42°C durante 60 min, e a reação foi finalizada por um aquecimento a 70°C

durante 10 min. A expressão gênica foi avaliada por amplificação por PCR utilizando pares de

primers e sua sequência gênica (Quadro 2): GADPH- Rattus norvegicus, HMGB1, NF- кB e

AMPK (Biosystems, USA). Colocados em placas e em seguida inseridas em um

termociclador Step One Plus Plus (Applied Biosystems, EUA), de acordo com as instruções

do fabricante. Para cada 1 × PCR Master Mix, 2,5 ul de cDNA foi adicionado num volume

final de 20 ul. As condições de PCR foram realizadas como se segue: 95°C durante 5 min e

40 ciclos de 30s a 95°C, 30s a 52-60°C (com base no alvo), e 60s a 72ºC. A variação da curva

relativa quantitativa em comparação com o grupo controle (grupo sem ligadura + solução

salina) foi calculada usando o método comparativo Ct, onde Ct é o número do ciclo em que a

primeira fluorescência excede o limiar. Os valores do Ct de cada amostra foram obtidos

subtraindo-se os valores de Ct para o GADPH, do valor Ct do gene alvo. A especificidade dos

produtos resultantes do PCR foi confirmada por meio de curvas de Melting.

41

Quadro 2 - Sequência de expressão gênica

ANÁLISE PRIMER INICIADOR PRIMER REVERSO

GADPH AACTTGGCATCGTGGAAGG GTGGATGCAGGGATGATGTTC

Hmgb1 GAGTACCGCCCAAAAATCAA TCATCCTCCTCGTCGTCTT

NF- Kβ TCTGCTTCCAGGTGACAGTG ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT

AMPK AGCTCGCAGTGGCTTATCAT GGGGCTGTCTGCTATGAGAG Fonte: Autor, 2016

42

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos foram digitados em planilhas eletrônicas, utilizando-se o

Programa Excel (Microsoft Office 2010®), em seguida exportados para o programa

GraphPad Prism 5.0 (versão 5.0, La Jolla, CA, USA) e submetidos à estatística descritiva e

inferencial com intuito de testar as hipóteses levantadas na presente pesquisa. Os dados foram

apresentados por meio de médias ±desvio padrão, ou, quando mais apropriado, como

medianas. Testes de análise de variância (ANOVA) e de Bonferroni foram usados para

cálculo das médias (dados paramétricos) e testes Kruskall-Wallis e Dunn´s foram utilizados

para comparar medianas (dados não paramétricos). O valor de p ˂ 0.05 foi escolhido para

indicar a significância.

43

6 RESULTADOS

6.1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DA PERDA ÓSSEA ALVEOLAR

Animais com doença periodontal induzida por ligadura (L), MET 100 mg / kg e MET

200 mg / kg apresentaram perda óssea alveolar significativa em comparação com o NL (NL =

0.25 ± 0.1 mm; L = 5.0 ± 1.4 mm; MET 100mg/kg= 4.8 ± 1.9; MET 200mg/kg= 5.0 ± 1.8, p

< 0.001). Observou-se que o tratamento com a MET de 50 mg / kg diminuiu o processo de

perda óssea alveolar causada pela DP (MET 50 mg/kg 3.9 ± 1.3; p < 0.05) .Gráfico 1.

Gráfico 1. Efeito da administração oral da Metformina sobre o índice de perda óssea em ratos

submetidos a ligadura .

Legenda: Índice de perda óssea em mm para os grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50

(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met

200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). Os valores são expressos como médias ± DP

(comparação com L *** p <0,001, * p <0,05).

Estes dados também podem ser visualizados na figura 9A, que mostra o aspecto

macroscópico do grupo NL, sem reabsorção do osso alveolar. A figura 9B mostra a aparência

macroscópica do periodonto submetido a doença periodontal, já a figura 9C apresenta o grupo

tratado com MET 50 mg / kg, em que a diminuição da perda óssea foi observada.

44

Figura 9. Aspectos macroscópicos da perda óssea alveolar

Legenda: A) Grupo NL (não ligado) demostrando ausência de reabsorção óssea alveolar. B) Grupo L (ligado)

apresenta severa reabsorção óssea com exposição radicular (setas). C) Grupo tratado com MET 50 mg/kg

demonstra diminuição na perda óssea alveolar (setas). Imagens foram obtidas com magnificação original de 4X.

6.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA

A análise histológica da região entre os primeiros e segundos molares do grupo NL

mostra que a estrutura do periodonto está preservada e que a gengiva, o ligamento

periodontal, osso alveolar e cemento podem ser observados (Figura 10 A, D, G). Já o

histopatológico dos animais do grupo L, que não receberam nenhum tratamento, revelou a

infiltração de células inflamatórias juntamente com grave destruição do cemento e processo

alveolar, recebendo assim um escore 3 (Figura 10 B, E, H).

A B C

45

Figura 10. Análise histopatológicas dos grupos estudados

Legenda: A, D e G: Periodonto Normal. B, E, H: Periodonto de um rato com periodontite (tratados com solução

salina) mostrando osso alveolar e reabsorção do cemento (cemento descontínuo) e infiltração de células

inflamatórias. C: Periodonto de um rato com periodontite (tratado com MET, 50 mg / kg) apresentando

inflamação reduzida e diminuição da perda de osso alveolar F: tratado com MET (100 mg / kg) e I: O tratamento

com MET (200 mg / kg), não apresentando redução de inflamação e aumento da perda de osso alveolar. Os

cortes foram corados com H e E. PL, ligamento periodontal; D, dentina; AB, osso alveolar; c, cemento; a, perda

de massa óssea; b, reabsorção de cemento; c, processo inflamatório; e, diminuição do processo inflamatório.

A perda óssea alveolar foi reduzida nos animais tratados com MET 50 mg / kg em

comparação com o grupo L que não recebeu nenhum tratamento, recebendo um escore médio

NL L

MET 50

MET 100

MET 200

46

Esco

res

his

top

ato

lógi

cos

de 1 (1-1.5; p <0,001) e 3 (3- 3), respectivamente (Gráfico 2). Histopatologicamente pode-se

observar: discreto infiltrado celular restrito à região da gengiva marginal, preservação do osso

alveolar, e cemento intacto no grupo tratado com MET 50 mg / kg (Figura 10C). Os grupos

tratados com MET 100 e 200 mg / kg revelaram uma infiltração de células inflamatórias com

destruição grave do cemento e processo alveolar, os animais deste grupo receberam um escore

de 3 (2-3) e 3 (3-3), respectivamente, (Figura 10 F,I).

Gráfico 2. Escores histopatológicos de acordo com o grupo de estudo.

Legenda: Escores histopatológicos para os grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50 (Ligado

e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met 200

(Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg)

47

6.3 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA OS MARCADORES DE INFLAMAÇÃO E

PERDA ÓSSEA

Os tecidos periodontais do grupo submetido à doença periodontal e sem tratamento

(L) apresentaram imunocoloração acentuada quando comparado ao grupo NL, para os

seguintes anticorpos: RANK, RANK-L, Catepsina K, MMP-9, a COX-2, SOD-1 e GPx

(grupo NL- Figura 11/12 A, D, G, J; grupo L- Figuras 11/12 B, E, H, K; grupo MET 50-

Figuras 11/12 C, F, I, L). Enquanto que se observou uma leve coloração para a OPG (Figura

11H). Já o grupo tratado com MET (50 mg / kg) reduziu a imunocoloração para o RANK,

RANKL, Catepsina K, COX-2, MMP-9 e da SOD-1 nos tecidos periodontais de ratos

submetidos a DP (Figura 11 C, F, L, e Figura 12 C, F, I). Foi observada uma imunomarcação

intensa para OPG e GPx-1, no grupo tratado com MET 50 mg / kg (Figura 11 I; 12 L,

respectivamente).

48

Figura 11. Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando imunomarcações para

RANK, RANK-L, OPG e Catepsina K

Legenda: Ratos do grupo NL (A, D, G, J); Ratos submetidos à ligadura (B, E, H, K); Ratos submetidos a

ligadura e tratados com MET (50 mg / kg) (C, F, I, L). As imagens são mostradas na ampliação de 40X. Barra =

100 um. A seta indica elevada ou moderada imunomarcação no ligamento periodontal ou no osso alveolar.

Asterisco indica coloração leve no ligamento periodontal ou o osso alveolar. Triângulo e asterisco indicam

coloração leve de OPG nos osteoclastos. Triângulo e seta indicam alta imunomarcação dos osteoclastos.

Triângulo indica intensa marcação da Catepsina K no osso alveolar. Asterisco e triângulo indicam leve marcação

de Catepsina K no osso alveolar.

NL L MET50

49

Figura 12. Fotomicrografia dos tecidos periodontais de ratos mostrando imunomarcações para MMP-

9 COX-2, SOD-1 e GPx.

Legenda: Ratos submetidos a solução salina (A, D, G, J); ratos do grupo ligadado (B, E, H, K); ratos submetidos

a ligadura e tratados com MET (50 mg / kg) (C, F, I, L). As imagens são mostradas na ampliação de 40X. Barra

= 100 um. A seta indica coloração alta ou moderada no ligamento periodontal ou o osso alveolar. Asterisco

indica imunomarcação leve no ligamento periodontal ou o osso alveolar.

NL L MET50

50

MD

A (

nm

mo

l/g

de

te

cid

o)

GSH

(m

g d

e N

PH

S/g

de

teci

do

)

6.4 EFEITO DO TRATAMENTO COM MET PARA OS MARCADORES DE ESTRESSE

OXIDATIVO

O tratamento da DP experimental com todas as doses de MET reduziu a atividade de

MDA (p <0,05) (Gráfico 3 A). Foi demonstrado efeito dose-dependente para esse produto da

peroxidação lipídica. O tratamento da DP com MET não reduziu os níveis de GSH (p> 0,05)

em comparação com o grupo L (Gráfico 3 B).

Gráfico 3 . Efeito da Metformina sobre os níveis de MDA e GSH nos grupos estudados.

Legenda: A: Níveid de MDA; B: níveis de GSH. Grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50

(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met

200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). (*p <0.05, ***p < 0.01)

6.5 DOSAGEM DE IL-1β E TNF-α

Os níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β diminuíram no grupo tratado com 50 mg /

kg MET (P <0,05) quando comparado ao grupo L. Entre os grupos tratados com as diferentes

concentrações da Metformina, o grupo MET 50 mg/kg também apresentou os menores níveis

de TNF- α (p <0,05). Gráfico 4.

A B

51

Gráfico 4. Efeito da Metformina sobre os níveis de IL-1β e TNF-α nos grupos estudados.

Legenda: A: Níveis de IL-1β; B: níveis de TNF-α. Grupos NL (grupo não ligado), L (ligado), Met 50

(Ligado e tratado com a MET 50 mg/kg), Met100 (Ligado e tratado com a MET 100 mg/kg) e Met

200 (Ligado e tratado com a MET 200 mg/kg). (*p<0,05).

IL-

(p

g/m

l)

TN

F-

α (

pg

/ml)

A

B

52

6.6 EXPRESSÃO GÊNICA RT-PCR

A dose de MET 50 mg/ kg aumentou a expressão do AMPK em comparação com o

grupo L e NL (p <0,05), mas as doses de MET 100 e 200 mg / kg não obtiveram nenhum

aumento significativo para este gene (Gráfico 5 A). Os grupo tratados com todas as doses de

MET reduziu a expressão de NF-Kβ p65 (p <0,01) (Gráfico 5B) e o grupo com a maior dose

(MET 200 mg/kg) também reduziu a expressão do HMGB1 (p <0,05) em comparação com o

grupo L (Gráfico 5C).

Gráfico 5. Efeitos da Metformina na expressão gênica do AMPK, NF-KB p65 e HMGB1 em ratos

com Doença periodontal.

Ex

pre

ss

ão

re

lati

va

RN

Am

AM

PK

A

53

Legenda: A expressão do RNAm do AMPK foi aumentada em MET 50 mg / kg (* p <0,01 gráfico

5A) e diminuiu em L e no grupo NL. A expressão do RNAm do NF-KB p65 foi diminuída em todos

os grupos tratados com MET e o grupo NL em comparação ao grupo L (* p <0,05 gráfico 5C). Os

níveis de RNAm do HMGB1 diminuiu em todos os grupos, inclusive o grupo NL em comparação com

o grupo L.

Ex

pre

ss

ão

rela

tiva

RN

Am

NF

-KB

p65

E

xp

res

são

rela

tiva

RN

Am

HM

GB

1

B

C

54

7 DISCUSSÃO

A periodontite é uma doença inflamatória caracterizada pela perda de suporte dos

tecidos periodontais e consequente perda dentária (BALTACIOGLU et al., 2014). A literatura

indica que essa doença é causada pela infecção polimicrobiana presente nos tecidos

periodontais, porém há evidências de que a extensão da inflamação pode também resultar da

interação entre as espécies seletivas da microflora oral e da resposta imunitária do hospedeiro

(CHEN et al., 2016).

A raspagem e o alisamento radicular é a técnica mecânica mais comumente

empregada para o tratamento da periodontite, no entanto, mesmo após o tratamento clínico

bem-sucedido, ainda há uma grande chance de reinfecção, causada por biofilmes residuais

(CARVALHO et al., 2011). Nesses casos, por meio do conhecimento da patogênese da DP

pode-se lançar mão de terapias sistêmicas (KRAYER; LEIRE; KIRLWOOD, 2010). Essas

terapias associadas à RAR podem apresentar algumas reações indesejadas como sensação de

queimadura, sabor amargo, eventual coloração dos dentes e resistência bacteriana (KRAYER

et al, 2010; LOPES; GAMONAL; MARTINÉZ, 2000). Buscando-se eliminar os efeitos

adversos produzidos por fármacos convencionalmente empregados no tratamento da

periodontite, uma nova série de agentes terapêuticos tem sido estudada como auxiliares no

controle dessa doença (BAK et al., 2010).

Neste trabalho, avaliou-se o efeito do Cloridrato de Metformina no estresse oxidativo,

perda óssea alveolar, na atividade anti-inflamatória em um modelo de doença periodontal

experimental em ratos Wistar. Bak et al. (2010), em seu estudo em ratos com periodontite,

demonstrou que a Metformina pode reduzir o nível do infiltrado inflamatório celular através

da análise histopatológica, além da perda óssea alveolar verificada pela técnica do micro-CT.

Esse achado pode corroborar com os resultados encontrados neste trabalho, em que a

Metformina na dose de 50mg/kg diminuiu a progressão da DP, bem como regulou o infiltrado

inflamatório celular, preservando as estruturas do cemento e osso alveolar.

Evidências sugerem que a liberação de ROS está diretamente relacionada à progressão

da DP (BROCK et al., 2004; GHALLAB; HAMDY; SHAKER, 2015). Os leucócitos PMN

induzidos por agentes patogênicos são responsáveis pelo aumento da produção desses radicais

livres (anion superóxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila, etc) (BROCK et al.,

2004).

55

A atividade do H2O2 sobre o NF-ᴋB é responsável pela transcrição de várias

citocinas pró-inflamatórias importantes para a patogênese da doença periodontal, incluindo a

IL-2, IL-6, IL-8, interferon-β e o TNF-α. A ativação de NF-ᴋB pode também ser realizada por

endotoxinas bacterianas, IL-1 e pelo TNF- α (CHAPPLE, 1996).

Os lípideos encontram-se entre os substratos mais facilmente oxidáveis e o aumento

da peroxidação lipídica pode ser uma consequência dos danos ocasionados pelas ROS. As

ROS possuem um tempo de vida muito curto e não são facilmente detectadas na destruição

dos tecidos, assim produtos oriundos da peroxidação lipídica, tais como o malonaldeído são

investigados (DEL RIO; STEWAR; PELLEGRINI, 2005). Os níveis de MDA são mais

elevados em pacientes com periodontite crônica ou periodontite agressiva quando comparado

a um grupo saudável (GHALLAB; HAMDY; SHAKER, 2015). O presente estudo mostrou

que o grupo L apresentou altos níveis de liberação do MDA, enquanto que os três grupos

tratados com a Metformina reduziram a liberação desse produto, mostrando efeito regulador

da Metformina para este importante marcador de estresse oxidativo. O estudo de Araújo et al.

(2013), relatou que os níveis do MDA em animais tratados com a Atorvastatina diminuíram o

MDA, apresentando efeito dose-dependente.

A SOD catalisa a reação de dismutação do radical superóxido a peróxido de

hidrogênio. Uma vez que a SOD acelera a criação de H2O2, deve atuar em conjunto com a

GPx, que remove esse radical (NOVAKOVIC, 2013). Lipopolissacarídeos bacterianos

também estimulam a liberação de O2 (radical superóxido) a partir de fibroblastos teciduais

durante a inflamação (ZUABI et al., 1999). O estudo de Novakovic et al. (2013), revelou que

pacientes com periodontite crônica após o tratamento com a RAR (raspagem e alisamento

radicular) apresentaram redução da atividade da SOD na saliva (p>0.05). Akalin et al. (2005),

observaram que a atividade da SOD foi significativamente maior no grupo com a periodontite

crônica do que nos controles (p<0.05). Neste estudo o grupo tratado com MET 50 mg / kg

mostrou baixa imunomarcação para a SOD, ou seja, a propria metformina pode contribuir

com a redução dos radicais livres, o que explica os baixos níveis de SOD. O aumento da

formação de radicais superóxidos, na presença da doença periodontal sem tratamento, pode

levar a uma alta atividade da SOD a fim de estabelecer um equilíbrio entre o estress oxidativo

e a proteção antioxidante.

Novakovic et al. (2013), revelaram que a GPx, na saliva de pacientes com periodontite

crônica e tratados com a RAR, apresentou uma alta atividade. Patel, Rao e Pradeep (2012),

56

verificaram que os níveis de GPx no soro e no GCF (fluido crevicular gengival) foram

maiores nos pacientes com periodontite em comparação com os controles saudáveis. Os

autores destes estudos explicam este fenômeno como um mecanismo compensatório

antioxidante que ocorre em resposta ao aumento de peróxido orgânico sob a ação de radicais

livres no tecido periodontal doente. O grupo tratado com a MET 50mg/kg, neste estudo,

obteve uma imunomarcação mais intensa no que se refere atividade da GPx juntamente com o

grupo grupo L, ou seja, maior atividade de GPx quando comparado ao NL, mostrando que

essa enzima antioxidante deverá manter-se elevada na DP tratada, visto que a doença nesse

período de tratamento (10 dias) está sendo controlada e não aniquilada.

A GSH é um potente antioxidante que evita danos mediados pelas ROS nos

componentes celulares e atua como um cofacor enzimático da GPx na destruição das ROS.

Pacientes com periodontite relataram ter reduzida capacidade antioxidante total na saliva e

menores concentrações de glutationa reduzida (GSH) no soro e no GCF, quando comparados

a indivíduos saudáveis. As altas concentrações de GSH presente no GCF em condições

saudáveis são semelhantes aos encontrados extracelularmente no pulmão e podem representar

uma estratégia anti-inflamatória e de defesa antioxidante importante comum às superfícies

epiteliais expostas (CHAPPLE et al., 2002). Em nosso estudo, o tratamento da DP com

diferentes doses da MET não aumentou significantemente os níveis de GSH (p>0.05) em

comparação ao grupo L (doente e sem tratamento farmacológico), esse achado está em

consonância com o trabalho de Araújo et al., 2014, onde o tratamento da DP com a

Alzizartana não reduziu os níveis de GSH (p> 0,05) em comparação aos animais do grupo L.

A infecção por bactérias periodontopatogênicas é o fator etiológico primário na DP. A

presença desses microorganismos ocasiona uma série de reações químicas em nível celular

onde serão ativadas cadeias de sinalizadores inflamatórios e imunológicos a partir da

produção de citocinas (KAYAL, 2013). Os mediadores envolvidos na via patogênica da DP

incluem a IL-1β, IL-6, PGE2, TNF-α, RANKL e as metaloproteinases (MMPs;

particularmente MMP-8, MMP-9 e MMP-13), bem como as citocinas de células T

reguladoras (por exemplo, IL-12, IL-18) e as quimiocinas (PRESHAW; TAYLOR, 2011).

Constituintes do biofilme estimulam as células hospedeiras para a produção de citocinas pró-

inflamatórias incluindo IL-1β e TNF-α que podem induzir a destruição do tecido conjuntivo e

osso alveolar. Estas citocinas estão presentes nos tecidos periodontais doentes e no fluido

crevicular gengival (GCF) (GEMMELL; MARSHALL; SEYMOUR, 1997).

57

O TNF-α está envolvido na migração dos leucócitos para os tecidos periodontais, na

reabsorção óssea alveolar e na perda da inserção conjuntiva. A IL-1β ocasiona o aumento da

secreção dos níveis de MMPs e diminui a expressão dos TIMPS (inbidores teciduais de

metaloproteinases), desempenhando um papel importante na degradação da matriz

extracelular e um grande indutor de reabsorção óssea (GRAVES; COCHRAN, 2003). Kose et

al., (2016), em uma pesquisa com DP experimental em ratos tratados com a Fucoxantina,

mostrou que houve uma ligeira diminuição na expressão TNF-α e da IL-1β. Esse resultado

também pode ser observado na pesquisa de Kang et al., (2013), em que ratos com artrite e

tratados com a Metformina diminuíram os níveis dessas citocinas pró-inflamatórias. No

presente trabalho, o grupo tratado com a MET 50mg/kg diminuiu expressivamente os níveis

da IL-1β e do TNF- α, apresentando assim propriedades que regulam a inflamação.

Bloqueando-se a atividade do TNF-α não somente há uma redução da resposta inflamatória

como também pode haver uma inibição da reabsorção óssea pela diminuição da atividade do

RANKL (ZWERINA et al., 2004)..

A inflamação observada na periodontite é mediada por ações diretas das

prostaglandinas, particularmente a PGE2 a qual está associada a maior eritema, edema

gengival e intensa perda óssea alveolar (GARLET et al., 2006). As enzimas ciclooxigenases,

COX-1 e COX-2, catalisam a conversão do ácido araquidônico a prostaglandinas (GRAVES;

OATES; GARLET, 2011). Araújo et al. (2014), mostraram que ratos com periodontite sem

tratamento apresentaram imunomarcações acentuadas de COX-2 quando comparados aos

saudáveis. A COX-2 pelo método da imunohistoquímica neste trabalho apresentou resultados

semelhantes.

O sistema RANKL, RANK e OPG representa a regulação molecular chave para a

remodelação óssea. Os efeitos do RANKL são neutralizados pela OPG, que inibe fortemente a

reabsorção óssea por meio da prevenção do acoplamento RANK-RANKL (KATAGIRI;

TAKAHASHI, 2002). As MMPs também podem coletivamente degradar quase todos os

componentes da membrana da matriz extracelular e a membrana basal, a atividade

patologicamente excessiva das MMP’S leva à destruição dos tecidos periodontais (GESELL-

SALAZAR et al., 2013). Dentre as MMPs, a MMP-2 e a MMP-9 têm sido fortemente

associadas com a destruição dos tecidos periodontais (GARLET et al., 2006). Estudo em in

vivo (tíbia de ratas) e in vitro sugerem que a Metformina reduz o RANKL e estimula a

expressão de OPG em osteoblastos, inibe a diferenciação dos osteoclastos e previne a perda

58

óssea em ratas ovarectomizadas (MAI et al., 2011). Esses estudos corroboram com o

resultado desta pesquisa, pois a análise da imunomarcação deste trabalho demonstrou que o

grupo L apresentou forte coloração para o RANK, RANK-L, MMP-9 e fraca coloração para a

OPG. Já a dose de 50mg/kg apresentou fraca imunomarcação para esses anticorpos, assim a

Metformina apresentou a propriedade de regulação do mecanismo da osteoclastogênese e

consequente perda óssea.

A Catepsina K é uma proteinase de cisteína produzidas por osteoclastos ativados e que

estão envolvidas no processo de solubilização da matriz óssea, sendo assim um importante

marcador para atividade de osteoclastos (TEITELBAUM, 2000). Garg, Pradeep e Thorat

(2009) estudaram a relação da Catepsina K com a doença periodontal, observaram que o

grupo com a periodontite apresentou alto nível de atividade para esse marcador no GCF, ao

mesmo tempo em que o grupo tratado com a RAR diminuiu os níveis de Catepsina K.

Indicando assim que houve um acúmulo de osteoclastos nos sítios doentes e uma

amplificação dos sinais de reabsorção no periodonto inflamado pelas citocinas pró-

inflamatórias, TNF-α e IL-1β. Nossos achados estão de acordo com o trabalho citado, pois o

grupo L obteve uma imunomarcação acentuada para a Catepsina K, enquanto que a MET 50

diminuiu esses níveis.

Diferentes tipos de estresses celulares podem conduzir à ativação do AMPK

(HARDIE, 2003). A Metformina ativa a AMPK indiretamente através da inibição da cadeia

respiratória mitocondrial (HAWLEY et al., 2010). Essa enzima suprime a sinalização do NF-

kB indiretamente, através da estimulação de mediadores, SIRT1 (sirtuína 1), PGC-1α

(coativador receptor gama ativado pelo proliferador de peroxissoma), p53 (proteína 53) e

FoxO (fator de transcrição), os quais subsequentemente reprimem a expressão de fatores

inflamatórios (SALMINEN; HYTTINEN; KAARNIRANTA, 2011). AMPK desempenha um

papel importante no metabolismo ósseo regulando o RANK-L (YOKOMOTO-UMAKOSHI

et al., 2016). Tokuda et al. (2012), investigaram ativação da AMPK na síntese de IL-6

estimuladas por trombina nas células MC3T3-E1 semelhantes a osteoblastos e concluíram que

essa enzima regula o metabolismo ósseo.

O presente estudo demonstrou reduções na produção de citocinas pró-inflamatórias,

IL-1β e TNF-α, provavelmente devido ao aumento induzido pela MET na expressão do gene

da AMPK, que por sua vez inibe a expressão do NF-KB p65. O envolvimento da atividade do

59

AMPK na regulação do metabolismo ósseo pode ser demonstrado pela redução da

imunomarcação para o RANKL e o aumento da marcação para OPG, indicando uma maior

atividade dos osteoblastos.

HMGB1 é uma proteína nuclear não-histona com elevada mobilidade, liberada pelos

macrófagos no meio extracelular. Exerce um papel essencial na imunidade inata, esta função é

mediada, pelo menos em parte, pelo receptor para produtos finais de glicação avançada

(RAGE), ou seja, está relacionado à patogênese de múltiplas doenças inflamatórias. O

HMGB1 aumenta o número de moléculas de adesão em células endoteliais, ativa células

dendríticas e as células T e estimula a diferenciação de precursores de osteoclastos na

presença de RANK-L (ZHOU et al., 2008). A via de sinalização HMGB1 pode também ativar

o NF-kB, que aumenta a expressão de diversas citocinas pro-inflamatórias (por exemplo,

TNF-α, IL-1β, IL-6), a proliferação de células e a quimiotaxia (SHEN; LI, 2015). A ativação

do AMPK foi considerado como um dos mecanismos que contribuem para inibição da

atividade do HMGB1, a Metformina melhorou a sobrevivência em um modelo de

endotoxemia letal em ratos inibindo a liberação de HMGB1 (TSOYI et al.,2011). Em nosso

estudo, o tratamento com MET reduziu a expressão do gene do HMGB1, o que representa

uma outra via que envolve a produção de RANKL.

A Metformina apresenta atividade anti-inflamatória, atua na redução do estresse

oxidativo e na perda óssea alveolar. Porém, outros estudos são necessários para efetiva

caracterização dos mecanismos moleculares envolvidos na relação entre o uso dessa

importante droga com doença periodontal. A elucidação destes mecanismos contribuirá para o

desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas voltadas para o controle da

prevalência e da severidade das doenças periodontais, visto que a Metformina é um

hipoglicemiante comumente utilizado, sendo o padrão ouro para o tratamendo da Diabetes

mellitus tipo 2.

60

8 CONCLUSÃO

Esse estudo revelou que o tratamento da doença periodontal induzida por ligadura em

ratos com o Cloridrato de Metformina, na dosagem 50 mg/kg, é efetivo. Essa dose ocasionou

a redução da perda óssea alveolar e da inflamação nos tecidos periodontais, pois os níveis das

citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, foram reduzidos; reduziram os níveis de

Malonaldeído (MDO), diminuíram a expressão de MMP-9, COX-2, RANK, RANKL, SOD-1

e obteve uma maior expressão de OPG e GPx. A dose de MET 50 mg/kg ainda aumentou a

expressão gênica para o AMPK e diminuiu a expressão do NF-KB p65 e HMGB1

comparando-se ao grupo doente e não tratado. Diante disso, observou-se que a Metformina

(50 mg/kg) apresentou efeitos positivos na regulação do estresse oxidativo, ação anti-

inflamatória e osteoproteçã no modelo da periodontite experimental em ratos Wistar.

Contudo, mais estudos são necessários para avaliar a ação da Metformina no contexto clínico.

61

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ANEXOS

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