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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
Padrões cromossômicos e mapeamento de genes ribossomais 18S e 5S
em peixes pelágicos Atlânticos
Rodrigo Xavier Soares
Natal-RN
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
Padrões cromossômicos e mapeamento de genes ribossomais 18S e 5S
em peixes pelágicos Atlânticos
Rodrigo Xavier Soares
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ecologia da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ecologia.
Orientador: Dr. Wagner Franco Molina
Natal-RN
2012
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Soares, Rodrigo Xavier. Padrões cromossômicos e mapeamento de genes ribossomais 18S e 5S
em peixes pelágicos Atlânticos / Rodrigo Xavier Soares. - Natal, RN, 2012.
60 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.
Programa de Pós-Graduação em Ecologia.
1. Citogenética de peixes. – Dissertação. 2. Peixes pelágicos, – Dissertação. 3. Coryphaenidae. –
Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 597.3
Dedico essa dissertação aos meus
pais Canindé e Josenaide.
In memoriam ao meu avô João Alves
Xavier pelo incentivo inicial.
''Sei que o meu trabalho é uma gota no
oceano, mas sem ele, o oceano seria menor.''
(Madre Teresa de Calcutá)
AGRADECIMENTOS
Queria agradecer de antemão a minha família, meus pais Francisco Canindé e
Josenaide Xavier, minha irmã Renata e cunhado Heitor, minhas tias, tios e avós que
deram educação e incentivo para que seguisse a carreira escolhida para minha vida
além da compreensão e por esperarem ansiosos por minha volta em todas as
expedições.
Também venho agradecer:
Ao professor Wagner Molina por ter confiado em minha competência e me
orientado, dando suporte total para que esse trabalho se torne de conhecimento
público. Assim como o Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Centro de
Biociências, em particular ao professor André Megali e o secretário Jair pela presteza
em resolver todos nossos pepinos.
Agradecer aos professores Alexandre Magno Cavalcante e Guilherme Fulgencio
pela oportunidade de prestar-lhes assistência ao ensino com a bolsa REUNI e pela
consciência ao entender os momentos que tive que me ausentar das atividades por
estar em campo.
Aos amigos, Maria Vitória, Janaína e ao casal Wania e Sanderson pais da
afilhada mais linda, Clarissa, que torceram pelo êxito do meu trabalho. Sem esquecer
dos mais antigos, Saraiva, Cezar, Rômulo, Renner e Pedro que apesar do pouco contato
sempre se mostraram atuantes nos momentos necessários. Também não podendo
esquecer de Camila, Clarisse e Ivete que se fizeram presente em muitos anos da minha
vida assim como nesses dois anos de mestrado, além de toda a família Mota de Caicó
que sempre me acolheu com a maior atenção.
À galerinha do LGRM: Gideão, Paulo, Clóvis, Amanda, Uedson, Eurico, Alyson,
Pablo, Calado, Layse, Inailson, Cris, Emanuel, Guinga, Roberta, George, as duplas Bebê
e Delícia, Divana e Washington e Valdir Velho e Waldir boy pela ajuda e pela
companhia nos momentos de distração dos trabalhos.
Aos colegas e companheiros de expedição: Natan, Hudson, André batista,
Ivana, Pavio e Andreia, que ajudando ou não nas coletas, foram importantes no
aprendizado de outras áreas de pesquisa, na cozinha ou simplesmente pela agradável
companhia em lugares remotos.
A todos os colegas da graduação, da pós-graduação, do café e da resenha, em
especial: Cadu, Elena e sua Maya, Taulli, Geomar, Dayse, Mariquinha e seus
funcionários.
Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No. 556793/2009-9), ao IBAMA pela
licença de coleta (Processo No. 19135/1) e à SECIRM, Marinha do Brasil, Transmar e
seus funcionários, que deram condições logísticas que tornaram possível as expedições
ao ASPSP para coletas.
SUMÁRIO
Lista de Figuras e Tabela VIII
Lista de Abreviaturas X
Resumo XI
Abstract XII
1. INTRODUÇÃO
1.1. Peixes: aspectos introdutórios 1
1.2. Família Scombridae 3
1.3. Família Coryphaenidae 4
1.4. Abordagens citogenéticas em estudos taxonômicos e populacionais em
peixes
5
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral 9
2.2. Objetivos específicos 9
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material 10
3.2. Métodos
3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos 12
3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo 13
3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolo 13
3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva 13
3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos 14
3.2.6. Hibridação in situ fluorescente FISH
3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridação 14
3.2.6.2. Hibridação cromossômica 15
4. CAPÍTULOS
4.1. Capítulo I - Estase cariotípica em quatro peixes Scombridae do
Atlântico. Mapeamento clássico e marcação por dual-color FISH de
marcadores ribossomais nos cromossomos
16
4.2. Capítulo II - Cromossomos sexuais múltiplos e mapeamento físico de
genes DNAr 18S/5S por dual-color FISH em dourados-do-mar (Perciformes,
Coryphaenidae)
32
5. CONCLUSÕES 51
6. REFERÊNCIAS 53
Lista de Figuras e Tabela
Figura 1. Espécies da família Scombridae: Thunnus albacares (a), Thunnus obesus (b), Acanthocybium solandri (c), e Scomberomorus brasiliensis (d).
10
Figura 2. Espécies da família Coryphaenidae: Coryphaena hippurus ♂ (a) e
♀ (b). Coryphaena equiselis ♂ (c) e ♀ (d).
11
Figura 3. Mapa dos pontos de coleta das espécies de Scombridae e Coryphaenidae analisadas.
11
CAPÍTULO I
Figura 4. Ponto de coleta das espécies de Scombridae analisadas. Setas indicam as correntes oceânicas atuantes. Em destaque o mapa do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, Brasil.
20
Figura 5. Cariótipos de A. solandri (a), S.brasiliensis (b), T. albacares (c) e T. obesus (d) com coloração convencional pelo Giemsa (esquerda). Os quadros, em cada cariótipo, destacam a correspondência entre os sítios Ag-RONs e CMA3
+/DAPI- com padrão conjulgado. Os padrões heterocromáticos, apresentados por cada uma das espécies, estão evidenciados à direita. Barra = 5 µm.
22
Figura 6. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) identificados por dual-color FISH em A. solandri (a), S. brasiliensis (b), T. albacares (c) e T. obesus (d). Barra = 5 µm.
23
Tabela I.
Dados citogenéticos para a família Scombridae.
25
CAPÍTULO II
Figura 7. Distribuição geográfica das espécies C. equiselis (a) e C. hippurus (b).
35
Figura 8. Padrão cariotípico de fêmea (a) e macho (b) de C. equiselis e fêmea de C. hippurus (c). Coloração Giemsa (esquerda) e bandamento C (direita); em (b) o sistema X1X2Y está destacado. Sítios Ag-RONs com padrão conjugado CMA3
+/DAPI- dos pares organizadores nucleolares estão apresentados nos quadros à direita. Barra = 5 µm.
38
Figura 9. Mapeamento cromossômico de sítios DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) identificados por dual-color FISH, em C. equiselis e C.
39
hippurus. Cariótipo de fêmea de Coryphaena equiselis (X1X1X2X2) (a), com sistema heterogamético presente no cariótipo do macho (X1X2Y) em destaque. Os sítios DNAr 18S e 5S nos cariótipos de fêmea de C. hippurus (b), estão localizados sobre os mesmos pares cromossômicos de C. equiselis (par 2 e par 24, respectivamente). Barra = 5 µm.
LISTA DE ABREVIATURAS
2n – Número diploide
a – Acrocêntrico
AFLP – Amplified fragment lenght polymorphism
AgNO3 – Nitrato de prata
Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação com
nitrato de prata
ASPSP – Arquipélago de São Pedro e São Paulo
AT – Adenina e Timina
Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário
BC – Bandamento C
CMA3 – Cromomicina A3
DAPI – 4`4’,6-diamidino-2-fenilindol
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DNAr/rDNA – Ácido desoxirribonucleico ribossômico
FAO – Food and Agriculture Organization
FISH – Fluorescence in situ hybridization
GC – Guanina e Citosina
HCl – Ácido clorídrico
ICCAT – International Commission for the Conservation of Atlantic Tunas
IUCN – International Union for Conservation of Nature
KCl – Cloreto de potássio
LGRM – Laboratório de Genética de Recursos Marinhos
m – Metacêntrico
n – Número amostral
NF – Número fundamental
RN – Rio Grande do Norte
RNAr/rRNA – Ácido ribonucleico ribossômico
RONs – Regiões organizadoras de nucléolo
sm – Submetacêntrico
st – Subtelocêntrico
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
ZEE – Zona econômica exclusiva
RESUMO
Os estudos citogenéticos em peixes vêm contribuindo significantemente para um
melhor conhecimento sobre a biodiversidade marinha, apresentando informações
voltadas à caracterização, evolução e conservação de espécies e estoques pesqueiros.
Entre as espécies marinhas cujos dados citogenéticos são menos conhecidos se
destacam as formas pelágicas, que apesar da importância econômica e de esforços
conservacionistas vêm sofrendo grande pressão da pesca artesanal e industrial. O
presente trabalho caracterizou citogeneticamente seis espécies de grandes peixes
pelágicos no Atlântico, pertencentes à Ordem Perciformes, dentre elas, quatro
espécies de Scombridae, Thunnus albacares, T. obesus, Scomberomorus brasiliensis e
Acanthocybium solandri e duas de Coryphaenidae, Coryphaena equiselis e C. hippurus
utilizando métodos citogenéticos clássicos, como coloração convencional, bandamento
C e Ag-RONs, e moleculares, através da coloração com fluorocromos AT e GC-
específicos e mapeamento de famílias multigênicas ribossomais 18S e 5S. A
identificação de padrões filogenéticos e marcadores citotaxonômicos entre as espécies
e a presença de cromossomos sexuais em pelo menos uma espécie de Coryphaenidae,
são particularmente úteis na formulação de hipóteses filogenéticas, bem como em
comparações entre grupos e populações.
Palavras-chave: Citogenética de peixes, Coryphaenidae, cromossomos sexuais
múltiplos, evolução cromossômica, peixes pelágicos, Scombridae.
ABSTRACT
Cytogenetic studies in fish have been contributed significantly to a better
understanding of the marine biodiversity, presenting information related to
characterization, evolution and conservation of species e fisheries stocks. Among the
marine species which cytogenetic data are less well known pelagic forms are detached,
that despite the economic importance and conservation efforts have been suffering
great pressure from the artisanal and industrial fisheries. The present work
characterized cytogenetically six species of large pelagic fish in the Atlantic, belonging
to the Order Perciformes, among them, four species of Scombridae, Thunnus
albacares, T. obesus, Scomberomorus brasiliensis and Acanthocybium solandri and two
Coryphaenidae, Coryphaena equiselis and C. hippurus using Classical cytogenetic
methods as conventional staining, C-banding and Ag-NORs and molecular through
staining fluorochromes AT and GC-specific and mapping of ribosomal multigene
families, 18S and 5S. The identification of phylogenetic patterns and cytotaxonomic
markers between the species and the presence of sex chromosomes in at least one
species of Coryphaenidae, are particularly useful in the formulating of phylogenetic
hypotheses, as well as comparisons between groups and populations.
Keywords: Fish cytogenetics, Coryphaenidae, multiple sex chromosomes, chromosome
evolution, pelagic fish, Scombridae.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Peixes: aspectos introdutórios
Os peixes formam um grupo parafilético surgido no Siluriano e têm como
representantes atuais os Agnatha, peixes sem mandíbula, como lampreias e peixes
bruxa; Chondrichthyes, peixes cartilaginosos, como tubarões e raias; Actynopterygii,
peixes com esqueleto ósseo de nadadeiras raiadas; e Sarcopterygii, peixes de
nadadeiras lobadas. Constituído por aproximadamente 28.000 espécies,
representando mais da metade das espécies dos vertebrados viventes. Dessas
espécies, 43% vivem exclusivamente em águas interiores apesar de cobrir apenas 1%
da superfície da terra. Já os oceanos, representam 70% da superfície terrestre e
abrigam cerca de 15.800 espécies (Nelson, 2006).
Apesar dos avanços no conhecimento deste grupo, existem ainda muitas
lacunas sobre as características citogenéticas para diversos grupos (Arai, 2011),
sobretudo dos representantes marinhos pelágicos de alto valor comercial. A
importância econômica de várias espécies pelágicas e o risco iminente de
sobreexploração de estoques são condições decisivas para aumento da informação
biológica das espécies visando subsidiar o segmento da pesca, um importante setor
econômico para diversas populações, entre elas a região do Nordeste brasileiro (Lee,
1957; Hazin et al., 1994). Adicionalmente, informações sobre parâmetros biológicos e
genéticos têm propiciado melhores condições para o uso de espécies marinhas na
aquicultura (Prescod & Hunte, 1997; Lee & Ostrowski, 2001; Volpe, 2005).
Os peixes apresentam elevada diversidade morfológica, podendo exibir corpo
achatado, alongado, fusiforme, comprimidos lateralmente, anguiliformes, filiformes
entre outros. O corpo pode ser revestido por escamas ou desnudo, com ou sem
coloração, de acordo com seus hábitos alimentares, sexuais ou de defesa. Da mesma
forma, apresentam também grande variação de tamanho. Como exemplo de tamanho
reduzido, Trimmatom nanus (Gobiidae), constitui um dos menores vertebrados
existentes, atingindo apenas 10 mm. Como extremos de peso e tamanho, pode-se
listar o atum azul, Thunnus thynnus, um dos maiores peixes ósseos, o qual pode passar
dos 4,20 metros e atingir cerca de 650 kg, e o tubarão-baleia, Rhincodon typus, a maior
espécie conhecida de peixe, que pode alcançar 12 metros (Nelson, 2006).
2
Assim como a morfologia, o comportamento dos peixes é bem diversificado,
podendo apresentar hábitos bentônicos, quando apresentam uma relação mais
estreita com o substrato, nectônicos, quando se movem livremente na linha d’água e
dentre eles os pelágicos, quando vivem na zona iluminada nadando próximo à
superfície da água. Cabe ressaltar que os peixes pelágicos geralmente apresentam
comportamento migratório e atingem maiores dimensões corporais que peixes
demersais (Szpilman, 2000). Devido a essas características, os peixes pelágicos em
geral apresentam grande valor comercial, sendo por isso, intensamente explorados
pela pesca industrial, artesanal e recreativa pelo mundo (Collette & Nauen, 1983).
O Brasil produz cerca de 40.000 toneladas de atuns e afins ao ano,
representando 6,66% das capturas realizadas no oceano Atlântico, contudo apesar do
volume, em nível mundial mostra-se insignificante (Oliveira, 2009). O Estado do Rio
Grande do Norte detém a maior parte de sua frota industrial composta por
embarcações atuneiras, e representa um dos Estados brasileiros de maior produção de
atuns e afins (Lins, 2011). Alcançando em 2011 um incremento em torno de 80% na
produção industrial do atum com o aporte de navios japoneses na sua frota pesqueira
(Mendes, 2011).
Algumas espécies pelágicas estão extremamente ameaçadas, principalmente
pela pesca industrial que, com novas tecnologias, vem nas últimas décadas
aumentando a capacidade de exploração, ocasionando vertiginosa queda nos
estoques. Esta condição torna-se evidente em relatórios recentes que apontam que
45% dos estoques mundiais conhecidos e explorados já estão plenamente explorados,
28% estão em sobrepesca, 19% apresentam-se esgotados e somente 8% encontram-se
em recuperação (FAO, 2010).
Em função de sua alta mobilidade, os peixes pelágicos realizam extensas
migrações transoceânicas, desta forma podem ser capturados por várias nações
dentro ou fora de suas ZEE’s (Zona Exclusiva Econômica) com diferentes aparelhos de
pesca o que dificulta a ação de planos de manejo. Quando em águas de uso comum a
exploração arbitrária desses recursos incentiva a competição entre pescadores e o
investimento em tecnologia das frotas pesqueiras (Castello, 2007), acentuando a
dificuldade de controle do manejo e avaliação de estoques pesqueiros, tornando essas
medidas possíveis apenas através de esforços conjuntos de várias nações.
3
Para regular exploração de pescado mundial a FAO (Food and Agriculture
Organization) instituiu organizações de manejo da pesca de atuns e afins, como o
ICCAT (International Commission for the Conservation of Atlantic Tunas), responsável
pelo manejo dos estoques pesqueiros dentro ou fora das jurisdições nacionais. Estas
organizações também são responsáveis por desenvolver pesquisas e manter uma base
de dados que reúna informações como quantidade de desova, recrutamento, captura,
mortalidade e tamanho dos estoques.
Os peixes pelágicos mais explorados geralmente se apresentam em forma de
grandes cardumes como as sardinhas (Clupeidae) e peixes-voadores (Exocoetidae) e/
ou grande tamanho corpóreo como atuns, cavalas, serras e bonitos (Scombridae),
espadartes (Xiphiidae), agulhões (Istiophoridae), dourados (Coryphaenidae) e
tubarões. Um dos exemplos que podem ser citados de espécies pelágicas ameaçadas
de extinção é representado pela espécie Thunnus thynnus, o Atum-azul Atlântico. Esta
espécie atualmente se encontra na lista vermelha da IUCN, em função da depleção de
seus estoques (Safina, 1996). De fato, esta é apenas uma das diversas formas
pertencentes à família Scombridae, um grupo sob olhar atento de tratados
internacionais, devido ao recurso econômico que representa e dos riscos à
conservação. Além deste grupo, outros como a pequena família Coryphaenidae
(Perciformes) se destacam tanto pelo valor da pesca comercial, como por proporcionar
divisas da pesca esportiva/recreativa.
Visto a grande importância dos peixes pelágicos e sua deficiência de dados
citogenéticos, neste estudo são apresentados dados citogenéticos de seis espécies das
famílias Scombridae e Coryphaenidae, duas importantes famílias pelágicas.
1.2. Família Scombridae
Scombridae apresenta 51 espécies, divididas em 15 gêneros, distribuídas em
mares tropicais, subtropicais e temperados e são conhecidos popularmente por atuns,
bonitos, serras e cavalas. Algumas espécies de maior porte são encontradas em águas
oceânicas, regiões nas quais realizam migrações transoceânicas, enquanto as de porte
menor habitam águas costeiras, podendo em alguns casos frequentar estuários para
alimentação (Collette & Nauen, 1983; Nelson, 2006). Esta família apresenta
4
características morfológicas e fisiológicas particulares como formato hidrodinâmico do
corpo e grande força muscular, que proporciona uma atividade natatória
extremamente eficiente (Shadwick & Syme, 2008), impulsionada pela alta taxa de
oscilação da nadadeira caudal e mínima ondulação do corpo. Além da natação, os
músculos proporcionam também a produção de calor que é transmitida a órgãos por
uma rede de vasos sanguíneos chamada rete mirabilis através de uma circulação
contra-corrente. A heterotermia corporal, mantém a temperatura de partes do corpo
mais elevada que a temperatura da água, possibilitando a passagem por águas frias, o
que representa um dos eventos evolutivos mais significantes dos teleósteos modernos
(Block et al., 1993; Clark et al., 2009).
No Atlântico são encontradas 23 espécies de Scombridae, onde
especificamente da região Centro-Atlântica Ocidental são conhecidas 16 espécies e na
costa do Rio Grande do Norte tem-se ocorrência para 10 espécies (Collette & Nauen,
1983; Garcia). Alguns representantes destacam-se na indústria da pesca por alcançar
grandes dimensões, pela qualidade da carne e dos produtos do seu beneficiamento, a
partir do qual atingem valor comercial elevado (Carpenter, 2002; Fromentin & Ravier,
2005; Porch, 2005).
1.3. Família Coryphaenidae
A família Coryphaenidae, cujas espécies são internacionalmente conhecidas
como dolphinfishes e no Brasil como dourados-do-mar, pertence à Ordem Perciformes.
Composta por apenas duas espécies, Coryphaena hippurus Linnaeus, 1758 e C.
equiselis Linnaeus, 1758, epipelágicas com ampla distribuição pelos oceanos tropicais e
subtropicais (Collette, 1986), que apresentam grande importância para a pescaria
artesanal, comercial e esportiva. Embora os padrões de migração e distribuição de
estoques sejam ainda pouco conhecidos, parecem estar atrelados à frequência sazonal
em áreas de pesca (Palko et al., 1982; Oxenfort & Hunt, 1986). Aparentemente seus
estoques não estão superexplotados, decorrente de sua acelerada reprodução e
crescimento (Campos et al., 1993) o que promove elevada taxa de resiliência à pesca
(Seafood Watch, 2007). Devido a características de crescimento e a sua eficiência de
conversão de alimento em peso corpóreo, os dourados se mostram candidatos
5
favoráveis à produção em cativeiro (Schekter, 1982; Kraul, 1989; Benetti et al., 1995;
Prescod & Hunt, 1997; Lee & Ostrowski, 2001). Ambas as espécies são importantes
integrantes da cadeia ecológica dos oceanos tropicais e subtropicais, onde se revelam
predadores generalistas se alimentando de alta variedade de peixes e invertebrados,
provavelmente com estratégia de forrageamento oportunista, assim como a maioria
dois peixes pelágicos tropicais (Oxenford, 1999).
Filogeneticamente, estudos morfológicos em Coryphaenidae e Rachycentridae
têm postulado 138 características ósseas em comum entre essas famílias, o que as
classificam como grupos-irmãos e monofiléticos (O’Tole, 2002). Este agrupamento está
inserido em um grupo monofilético maior, a subordem Carangoidei formado por cinco
famílias, Carangidae, Rachycentridae, Nematistiidae, Coryphaenidae e Echeneidae
(Springer & Smith-Vaniz, 2008).
Entre os Carangoidei, estudos citogenéticos têm se restringido a algumas
espécies de Carangidae, Echeneidae e Rachycentridae (e.g. Lee & Loh, 1975; Rodrigues
et al., 2007; Jacobina et al., 2011), que apesar de demonstrar conservadorismo de
número cromossômico, apresenta elevada diversidade estrutural, na maioria das
espécies.
1.4. Abordagens citogenéticas em estudos taxonômicos e populacionais em peixes
Nos últimos anos a citogenética de peixes vem acumulando dados que
permitem estabelecer tendências evolutivas e relacionamentos filogenéticos entre as
diferentes famílias, espécies e populações (Artoni et al., 2000). Validações taxonômicas
e padrões populacionais são de grande importância para a conservação e manejo de
estoques naturais (Carvalho-Costa et al., 2008).
Apesar do espectro de utilização dos dados citogenéticos, 12,2% das espécies
de peixes foram cariotipadas (Arai, 2011) sendo que até 1996 menos de 2% das
espécies de peixes marinhos foram assim descritas (Brum, 1996). No ambiente
marinho, mesmo com o grande conservadorismo encontrado em alguns grupos
filogenéticos, análises mais amplas revelam grandes variações cariotípicas estruturais e
numéricas, podendo apresentar, por exemplo, desde 2n=264 no esturjão chinês,
Acipenser sinensis (Zhou et al., 2008), 2n=48, característico de um grande número de
6
famílias e espécies Perciformes como, por exemplo, espécies do gênero Haemulon
(Haemulidae) (Motta-Neto et al., 2011), até 2n=12, em Gonostoma bathyphylum (Post,
1974).
Variações genéticas no ambiente marinho podem ser principalmente
encontradas em espécies que se mostram adaptadas ou isoladas em ambientes
singulares, como, as que são associadas a recifes de corais e ilhas oceânicas, onde as
massas de água que os circundam funcionam como a barreira geográfica que limita a
dispersão (Palumbi, 1994; Rocha, 2003). Diferente das espécies pelágicas, que em geral
apresentam adultos migradores, na maioria dessas espécies a forma mais ativa de
dispersão acontece na fase inicial da vida, o período larval pelágico, onde as mesmas
são carreadas pelas correntes até a fase de assentamento (Gordeeva, 2010).
Tendo em vista que a falta de barreiras geográficas e que as correntes marinhas
facilitam o fluxo gênico, grandes agregações para desova que limitam os efeitos da
deriva gênica e a capacidade intrínseca de dispersão à grandes distâncias, é esperada
baixa diversidade genética em espécies pelágicas marinhas (Palumbi, 1994; Jorgensen
et al., 2005). No entanto alguns estudos têm demonstrado que nestas formas é
possível a ocorrência de estruturação de estoques e populações pelágicas através de
fatores ambientais, como decorrentes de paleoníveis dos oceanos, criando ou
destruindo barreiras geográficas e mudanças nas direções de correntes marinhas
aumentando ou diminuindo a distância geográfica entre populações, além de fatores
espécie-específicos como capacidade de dispersão, comportamento de homing e
retenção larval (Palumbi, 1994; Graves, 1996; McLean et al., 1999; Avise, 2000; Bahri-
Sfar et al., 2000; Zardoya et al., 2004).
Os Perciformes, ordem mais diversificada de peixes com aproximadamente
10.033 espécies (Nelson, 2006), apresenta, em grande parte de suas espécies, um
padrão marcante de conservadorismo cromossômico, tendo como número diplóide
mais frequente 48 cromossomos acrocêntricos (Molina, 2007; Motta-Neto et al.,
2011). Contudo, em alguns casos apresentam diferenças quanto ao DNA repetitivo e
regiões organizadoras de nucléolos que têm permitido identificar marcadores
citotaxonômicos efetivos além dos processos envolvidos na evolução cariotípica
(Galetti et al., 2000) dos grupos. Vários rearranjos estruturais cromossômicos como,
inversões pericêntricas, fusões e fissões cêntricas, têm sido apontados isolados ou em
7
associação, como mecanismos preponderantes, da diversificação cariotípica em
populações naturais de alguns grupos Perciformes.
Entre os Perciformes, cromossomos sexuais ocorrem em baixa frequência.
Rearranjos estruturais podem promover heteromorfismo cromossômico entre os
sexos, estabelecendo um bloqueio da recombinação cromossômica meiótica,
envolvendo a acumulação de genes de determinação sexual em um ou mais alossomos
(Kasahara, 2009). Vários sistemas podem ser identificados a partir de heteromorfismos
sexuais, desde sistemas simples XX/XY e ZZ/ZW, quanto múltiplos derivado destes.
Dentre os vertebrados, peixes, anfíbios e répteis apresentam sistemas cromossômicos
sexuais bastante diversificados podendo ou não apresentar cromossomos
diferenciados entre sexos (Almeida & Foresti, 2001; Devlin & Nagahama, 2002; Volff et
al., 2007; Kitano & Peichel, 2011).
Sabe-se que em torno de 10% dos peixes descritos cariotipicamente
apresentam heteromorfismo cromossômico sexual (Devlin & Nagahama, 2002). O
surgimento de sistemas cromossômicos sexuais pode acontecer particularmente entre
espécies de um gênero ou família de forma independente de seus parentes (Mank et
al., 2006). Alterações em sistemas sexuais são eventos de grande importância para
especiação no ambiente marinho, já que estas podem promover o isolamento
reprodutivo entre indivíduos (Kitano & Peichel, 2011). Os peixes por apresentarem
grande variedade de sistemas de cromossomos sexuais, com heterogametia masculina
e feminina, disseminados em grupos ou espécies próximas, se apresentam como
modelos favoráveis, na investigação da gênese de cromossomos sexuais diferenciados.
Até o momento, se desconhecem registros de sistemas de cromossomos sexuais em
teleósteos marinhos pelágicas de grande porte.
O pequeno volume de informações citogenéticas de peixes pelágicos se deve
em parte às dificuldades de coleta e manuseio de espécimes oceânicos de grande
porte. Como resultado, a maior parte dos dados cromossômicos se refere a algumas
espécies de pequenos pelágicos, como Engraulis morda, que exibiu estabilidade
cariotípica, com 2n=48 acrocêntricos, entre duas populações ao sul de São Francisco –
EUA (Uribe-Alcocer, 1996).
Entre grandes peixes pelágicos alguns estudos citogenéticos foram realizados
em Chondrichthyes, entre eles Prionace glauca, Sphyrna lewini (Asahida & Ida, 1995).
8
Entre os Teleostei, como a família Scombridae, apenas nove espécies possuem
cariótipos descritos, dentre elas Thunnus thynnus, Scomber tapeinocephalus (Ida et al.,
1978), Katsuwonus pelanis e Auxis thazara (Ida et al., 1993). Contudo, a maior parte
dos dados cromossômicos conhecidos para peixes pelágicos se baseiam
exclusivamente em técnicas citogenéticas convencionais, apresentando dados do valor
diploide e número fundamental.
Técnicas citogenéticas convencionais e moleculares são de grande importância
na identificação de diversificação cromossômica. Tem sido e empregadas na
formulação de hipóteses filogenéticas (Feldberg et al., 2003; Cross et al., 2006) bem
como, proposições taxonômicas e na identificação de diferenciações populacionais
dando suporte, por fim, ao manejo e conservação de estoques pesqueiros (Almeida-
Toledo, 1998). Visto a validade das informações citogenéticas e a carência delas no
que diz respeito aos grandes peixes pelágicos, o presente trabalho apresenta e discute
os aspectos carioevolutivos de espécies de duas famílias de peixes pelágicos no
Atlântico, as famílias Scombridae e Coryphaenidae.
9
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Diante das razões elencadas, o presente estudo visou caracterizar através de
técnicas citogenéticas resolutivas os aspectos cromossômicos de espécies pelágicas de
alto valor ecológico e econômico das famílias Scombridae e Coryphaenidae
(Perciformes). Os padrões cromossômicos encontrados para o Atlântico permitirão
comparações futuras com novas populações de outras regiões geográficas,
subsidiando possíveis delimitações de espécies e sua conservação biológica.
2.2 Objetivos específicos
Caracterizar cromossômicamente por meio de bandamento C, Ag-RONs, e
coloração com fluorocromos base-específicos CMA3/DAPI das espécies da
família Scombridae, Thunnus obesus, T. albacares, Acanthocybium solandri e
Scomberomorus brasiliensis e da família Coryphaenidae, Coryphaena equiselis e
C. hippurus.
Mapear as sequências das subunidades ribossomais DNAr 5S e 18S por meio de
dual-color FISH para as espécies analisadas das famílias Scombridae e
Coryphaenidae.
Identificar marcadores citotogenéticos para as famílias e espécies analisadas e
das tendências evolutivas nos cariótipos das espécies estudadas.
Caracterizar a possível presença de sistema de cromossomos sexuais na família
Coryphaenidae.
Avaliar os níveis de diversificação cariotípica presentes nas espécies pelágicas
analisadas relacionando com hábitos demersais de outros Perciformes de
menor mobilidade.
10
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material
Os exemplares das espécies Thunnus albacares (Bonnaterre, 1788) (n=8, 2
machos, 4 fêmeas, 2 imaturos), Thunnus obesus (Lowe, 1839) (n=2, 2 fêmeas) (Figura
1, a e b), Acanthocybium solandri (Cuvier 1832) (n=6, 3 machos e 3 fêmeas) (Figura 1c),
Coryphaena hippurus Linnaeus, 1758 (n=3, 3 fêmeas) e Coryphaena equiselis Linnaeus,
1758 (n=3, 2 machos e 1 fêmea) (Figura 2) foram coletadas no Arquipélago de São
Pedro e São Paulo (Figura 3) (00o56’N e 029o22’W), localizado a aproximadamente
1.100km da costa do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil através da pescaria
comercial por linh de mão e corrico múltiplo. Os espécimes de Scomberomorus
brasiliensis Collette, Russo & Zavala-Camin, 1978 (n=5, todos imaturos) (Figura 1d)
foram coletados nas praias de Ponta Negra (05°53’S e 035°10’W) e Galinhos (05°05’S e
036°16W), situadas no litoral do Rio Grande do Norte (Figura 3) através da pesca por
rede de arrasto. Os Scombridae foram identificados de acordo com Collette & Nauen
(1983) e os Coryphaenidae de acordo com Gibbs & Collette (1959). Todos os
exemplares foram sexados por exame macroscópico das gônadas.
.
Figura 1. Espécies da família Scombridae: Thunnus albacares (a), Thunnus obesus (b), Acanthocybium solandri (c), e Scomberomorus brasiliensis (d). Barra = 5cm.
b a
c d
11
.
.
Figura 2. Espécies da família Coryphaenidae: Coryphaena hippurus ♂ (a) e ♀ (b). Coryphaena equiselis ♂ (c) e ♀ (d). Barra = 5cm.
Figura 3. Mapa dos pontos de coleta das espécies de Scombridae e Coryphaenidae analisadas.
a b
c d
12
3.2. Métodos
3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos
Para obtenção de cromossomos mitóticos, dois protocolos foram utilizados
após a captura dos exemplares. Dependendo do tamanho e condições dos exemplares,
fragmentos do tecido renal anterior e posterior foram adicionados em meio de cultura
RPMI 1640 de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990), onde
sucintamente, foram dissociados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 através de
aspirações com seringas de vidro de 10 ml até obter um mistura homogênea, onde foi
adicionado 5 gotas de colchicina 0,025%, deixando agir por 30 minutos em
temperatura ambiente. Após o processo anterior o material foi centrifugado por 10
minutos à 800 rpm. Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 8 ml da solução
hipotônica de KCl à 0,075M, que após ser homogeneizada agiu por 28 minutos em
temperatura ambiente. A suspensão celular foi pré-fixada com 0,5 ml de solução de
metanol e ácido acético (3:1) recém-preparado. Após homogeneização a suspensão foi
centrifugada por 10 minutos. O processo de fixação do material foi repetido por 3
vezes, antes das suspensões celulares serem estocadas à -20oC em tubos Eppendorf de
2,5 ml.
Uma segunda fonte de material mitótico foi simultaneamente obtida através do
cultivo de linfócitos (Moorhead et al., 1960). A partir da coleta de cerca de 2ml de
sangue por punção cardíaca, com uma seringa estéril heparinizada, 10 gotas de sangue
total foram adicionadas a frascos estéreis de 5ml com meio de cultura RPMI 1640 com
soro fetal bovino e fitohemaglutinina. A cultura foi mantida à 27°C por 72 horas.
Decorrido este tempo, foram adicionadas 3 gotas de colchicina 0,025%, deixando agir
por 30 minutos com posterior centrifugação por 10 minutos à 800 rpm. Após o
descarte do sobrenadante e misturado a 8 ml de KCl a 0,075M agindo por 28 minutos
em temperatura ambiente. Após este passo a prefixação do material, posterior fixação
e armazenagem ocorreu como previamente descrito.
As preparações de cromossomos mitóticos a partir de suspensões celulares
foram realizadas em condições de campo, nas dependências do Laboratório da Estação
Científica do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, próximo às áreas de captura,
enquanto as análises citogenéticas foram realizadas nas instalações físicas do
13
Laboratório de Genética de Recursos Marinhos na Universidade Federa do Rio Grande
do Norte (UFRN).
3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo
As suspensões celulares foram gotejada sobre uma lâmina recoberta por um
filme de água destilada aquecido à 60°C e corada com solução de Giemsa à 5%, diluída
em tampão fosfato pH 6,8.
As análises foram realizadas em microscópio óptico de epifluorescência
Olympus™ BX50 e fotografadas sob aumento de 1.000X através de sistema digital de
captura Olympus DP70 utilizando o software DPController 1.2.1.108 (Olympus Optical
Co. Ltd.). Cerca de trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. As melhores
metáfases foram selecionadas para montagem do cariótipo a partir da nomenclatura
preconizada por Levan et al. (1964) com modificações, onde os cromossomos foram
definidos, quanto à posição dos centrômeros, em metacêntricos (m), com a razão
entre o braço maior e menor (RB) variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm),
RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e acrocêntricos (a), RB>7,01.
3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos
A detecção de regiões organizadoras de nucléolo foi obtida pela técnica de
impregnação por prata, idealizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina
previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 6 gotas de solução
gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml água e 0,5ml ácido fórmico), e 3
gotas de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi homogeneizada com
a extremidade de uma lamínula e recoberta por ela sendo então incubada em estufa à
60°C, até obtenção da cor amarelo escuro. Após a remoção da lamínula com jatos de
água destilada, eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações
podiam ser coradas por cerca de 20s com o corante Giemsa à 5%.
3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva
A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C,
segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa
14
a 37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâmina foi imersa em HCl 0,2 N por
14 minutos em temperatura ambiente, sendo lavada com água destilada e seca.
Posteriormente a lâmina foi mergulhada em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C
por cerca de 1 minuto e 45 segundos sendo rapidamente lavadas em HCl 0,1N e
posteriormente água destilada. Após secar ao ar, a lâmina foi então imersa em solução
salina 2xSSC à 60°C em estufa por 40 minutos. Para análise o material foi corado com
Giemsa 5% por 8 minutos.
3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos
Fluorocromos base-específicos foram utilizados para detectar regiões ricas em
pares de bases, como a Cromomicina A3 (CMA3) para pares de bases GC e DAPI para
regiões ricas em pares de bases AT, de acordo com Carvalho et al. (2005). As lâminas
com suspensão celular foram coradas com 30µl de CMA3 0,5 mg/ml cobertas com
lamínulas e depositadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água
destilada após 30 a 60 minutos, coradas com 30 µl de DAPI 2µl/ml, cobertas por
lamínulas e colocada em câmara úmida, no escuro, por 15 minutos. Posteriormente as
lâminas foram lavadas com água destilada e montadas com tampão glicerol-Mcllvaine
pH 7,0 (1:1) coberto com lamínula e selado com esmalte incolor. As lâminas foram
então guardadas à 4oC em câmara escura e analisadas após 3 dias com
fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus™ BX50) com filtros apropriados, em
aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo sistema digital Olympus
DP70 com uso do software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.).
3.2.6. Hibridação in situ fluorescente - FISH
3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridização
Para a sonda 18S foi utilizada uma sequência de DNA in tandem isolada do
DNA de Prochilodus argenteus (Hatanaka & Galetti, 2004). E a sonda 5S foi obtida a
partir do DNA nuclear da espécie Leporinus elongatus (Martins & Galetti, 1999). A
sonda corresponde a um segmento de 1.400pb do gene 18S e 500-200pb do gene 5S,
obtido via PCR do DNA nuclear. A sonda 18S foi marcada por nick
15
translation digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda rDNA 5S foi marcada por nick
translation biotina-14-dATP (Roche) , de acordo com as especificações do fabricante.
3.2.6.2. Hibridização cromossômica
FISH (Fluorescence in situ hybridization) foi realizada em metáfases mitóticas
(Pinkel et al., 1986) das espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando
sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de
DNAse (20mg / mL em 2 × SSC ) à 37 °C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl
10mM ) à 37 °C por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em
seguida desidratados em um série alcoólica. Os cromossomos foram, então,
desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72 °C por 5 minutos. A solução de
hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextran e a
sonda desnaturada (5 ng/µl). Após hibridação, overnight à 37 °C, as lâminas foram
lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42 °C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C por 15
minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da
sonda foi detectado usando avidin-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-
digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos
foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml). As análises da FISH e registro
fotográfico foram realizadas conforme descrito para as análises de fluorocromos.
16
4.1 Capítulo 1
Estase cariotípica em quatro peixes Scombridae do Atlântico. Mapeamento de
marcadores clássicos e por dual-color FISH nos cromossomos
Soares, R. X., Bertollo, L.A.C, Costa, G. W.W.F. & Molina, W. F.
Resumo
Os peixes da família Scombridae apresentam um padrão biogeográfico modelado por hábitos pelágicos, alta capacidade natatória e, em geral, comportamento migratório de suas espécies. Estudos genéticos voltados ao manejo e conservação de algumas espécies mais intensamente exploradas já são relativamente frequentes. Contudo, análises citogenéticas são bastante escassas entre os Scombridae. Neste estudo estão sendo analisados os cromossomos de quatro espécies desta família, provenientes do entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, região Meso-Atlântica, utilizando coloração convencional, Ag-RONs, bandamento C, coloração com fluorocromos CMA3/DAPI e double-FISH com sondas de DNAr 18S e 5S. Acanthocybium solandri (wahoo) e Scomberomorus brasiliensis (spanish mackerel) apresentam 2n=48 cromossomos (2st+46a; NF=50), enquanto Thunnus albacares (yellowfin tuna) e T. obesus (bigeye tuna) também com 2n=48 cromossomos, compartilham outra estrutura cariotípica (2m+2sm+44a; NF=52). Discretos blocos heterocromáticos estão presentes nas regiões centroméricas dos cromossomos. Sítios DNAr 18S/Ag-RONs/CMA3
+/DAPI- estão localizados nos braços curtos de um par subtelocêntrico, aparentemente homeólogo entre as espécies, consistindo no par no. 1 em A. solandri e S. brasiliensis e no par no. 2 nas duas espécies de Thunnus. Os genes DNAr 5S estão conservativamente presentes em todas as espécies no par no. 24. Os padrões citogenéticos evidenciam um elevado grau de conservadorismo cromossômico entre as espécies analisadas. Entretanto, as espécies do gênero Thunnus apresentam uma maior diferenciação cariotípica comparativamente a A. solandri e S. brasiliensis, a qual é decorrente de inversões pericêntricas que diversificaram as fórmulas cariotípicas, representando o principal mecanismo envolvido na diferenciação do cariótipo desse grupo de peixes.
Palavras chave: Atuns, citogenética de peixes, peixes pelágicos, marcadores cromossômicos.
17
Karyotype stasis in four Atlantic Scombridae fishes. Mapping of classical and dual-
color FISH markers on chromosomes
Soares, R. X., Bertollo, L.A.C, Costa, G. W.W.F. & Molina, W. F.
Abstract
Fish from the family Scombridae exhibit a biogeographical pattern modeled by pelagic habits, high swimming ability and migratory behavior of its species. Genetic studies aimed at the management and conservation of some more intensely exploited species are already relatively common. However, cytogenetic analyses are scarce among Scombridae. The present study analyzes the chromosomes of four species of this family from the vicinity of the São Pedro and São Paulo Archipelago in the Mid-Atlantic region, using conventional staining, Ag-NORs, C banding, CMA3/DAPI fluorochrome staining and double-FISH with 18S and 5S rDNA probes. Acanthocybium solandri (wahoo) and Scomberomorus brasiliensis (spanish mackerel) showed 2n=48 chromosomes (2st+46a; NF=50), while Thunnus albacares (yellowfin tuna) and T. obesus (bigeye tuna), also with 2n=48 chromosomes, share another karyotype structure (2m+2sm+44a; NF=52). Discrete heterochromatic blocks are present in the centromeric regions of chromosomes. 18S rDNA/Ag-NORs/CMA3
+/DAPI-sites are located on the short arms of a subtelocentric pair, apparently homologous between the species, consisting of pair no. 1 in A. solandri and S. brasiliensis and pair no. 2 in the two Thunnus species. The 5S rDNA genes are conservatively present in all the species on pair no. 24. Cytogenetic patterns showed a high degree of chromosomal conservatism between the species analyzed. However, species from the genus Thunnus displayed comparatively greater karyotypic differentiation than A. solandri and S. brasiliensis, resulting from pericentric inversions that diversify karyotypic formulas, representing the primary mechanism involved karyotype differentiation in this group of fish.
Keywords: Tuna, fish cytogenetic, pelagic fish, chromosome markers.
18
Introdução
A família Scombridae (Perciformes) abriga espécies de grande valor econômico
e sob significativo impacto da atividade pesqueira mundial (Bjørndal & Brasão, 2006),
distribuindo-se por todos os oceanos tropicais e subtropicais. É composta por 51
espécies, na sua totalidade predadores de topo, que habitam regiões costeiras e mar
aberto onde realizam migrações transoceânicas (Collette & Nauen, 1983; Nelson,
2006). De fato, a transposição de espaços oceânicos, devido à alta capacidade
natatória dos Scombridae, permite elevada taxa de dispersão, o que promove fluxo
gênico e conectividade genética entre vastas áreas geográficas (Pujolar et al., 2003).
Em espécies de peixes marinhos as análises citogenéticas mais recentes vêm
contribuindo, juntamente com marcadores moleculares, na identificação de variações
geográficas e divergências populacionais (Motta-Neto et al., 2011c; Accioly et al., in
press), assim como processos de especiação (Molina et al., 2011, 2012). Esses dados
também são aplicáveis ao manejo e conservação genética. Entretanto, as informações
citogenéticas em grandes peixes pelágicos se mostram escassas e, quando existentes,
são baseadas em metodologias clássicas de análises, o que restringe um melhor
entendimento carioevolutivo e comparações filogenéticas (Ida et al., 1978; Ratty et al.,
1986, Ida et al., 1993).
Em geral, os padrões cromossômicos dos Perciformes marinhos têm revelado
baixa variabilidade do número cromossômico, bem como da macroestrutura
cariotípica (Brum, 1996; Cipriano et al., 2008; Arai, 2011). Estas condições vêm sendo
reafirmadas para alguns grupos, mesmo sob o escrutínio de metodologias mais
resolutivas da citogenética molecular (Motta-Neto et al., 2011a, b, c; Calado et al.,
2012). No presente estudo estão sendo disponibilizadas as primeiras informações dos
padrões cromossômicos de quatro espécies de peixes pelágicos da família Scombridae,
provenientes do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), utilizando técnicas de
citogenética clássica (coloração com Giemsa, impregnação por nitrato de prata (Ag-
RONs), bandamento C) e molecular (coloração com fluorocromos base-específicos
CMA3/DAPI e dual-color FISH com sondas de DNAr 5S e 18S). Os resultados evidenciam
o conservadorismo cromossômico em Scombridae, podendo possibilitar inferências
sobre a sua história evolutiva. Adicionalmente, os marcadores cromossômicos obtidos
19
podem ser ferramentas úteis para os planos de conservação e o manejo de estoques
desse grupo.
Material e métodos
As espécies Acanthocybium solandri (N=5), Thunnus albacares (N=8) e Thunnus
obesus (N=2), foram coletadas no Arquipélago de São Pedro e São Paulo (00o56’N e
029o22’W) (Figura 4), localizado no Atlântico Central, e distante aproximadamente
1.100km da costa brasileira e Scomberomorus brasiliensis (N=5) na costa do Rio
Grande do Norte nas praias de Ponta Negra (05°53’S e 035°10’W) e Galinhos (05°05’S e
036°16W). As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de fragmentos da
porção anterior do rim de A. solandri, S. brasiliensis e T. albacares que foram
conservados em meio de cultura celular RPMI 1640, para posterior obtenção de
cromossomos mitóticos in vitro, de acordo com Gold et al. (1990). Nos exemplares de
T. obesus, além da metodologia precedente, também foram realizados cultivos de
sangue periférico a 27°C por 72 horas em meio de cultura RPMI 1640 (Cultilab, São
Paulo, Brasil) (Moorhead et al., 1960). As regiões organizadoras de nucléolos (RONs)
foram evidenciadas pela impregnação por nitrato de Prata (Howell & Black, 1980). O
bandamento C, utilizado para identificar regiões heterocromáticas, seguiram o
protocolo de Sumner (1972). A análise de regiões ricas em bases GC e AT foram
realizadas a partir de coloração com os fluorocromos base-específicos Cromomicina A3
(CMA3) e DAPI (Carvalho et al., 2005), respectivamente.
Dual-color FISH (fluorescence in situ hybridization) foi realizada com base na
metodologia de Pinkel et al. (1986). Foram utilizadas sondas de DNAr 5S e DNAr 18S. A
sonda de DNAr 18S consistiu de uma sequência in tandem isolada de Prochilodus
argenteus (Hatanaka & Galetti, 2004), marcada por nick translation com digoxigenina-
11-dUTP (Roche), enquanto a sonda DNAr 5S foi obtida da espécie Leporinus elongatus
(Martins & Galetti, 1999), sendo marcada com biotina-14-dATP (Invitrogen).
Suspensões celulares foram gotejadas sobre lâminas recobertas com um filme
de água aquecida a 60oC. Cerca de 30 metáfases foram analisadas para cada indivíduo,
a fim de determinar o número diplóide das espécies. As melhores metáfases foram
fotografadas em microscópio de epifluorescência Olympus BX50, acoplado com um
sistema de captura digital de imagens Olympus DP70.
20
Os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos
(sm), subtelocênticos (st) e acrocêntricos (a), com base em Levan et al. (1964). Para o
cálculo do número fundamental (NF), ou número de braços cromossômicos, os
cromossomos m, sm e st foram considerados com dois braços e os cromossomos
acrocêntricos com um único braço.
Figura 4. Locais de coleta das espécies de Scombridae analisadas (indicados pelas estrelas amarelas). Setas indicam as correntes oceânicas atuantes. Em destaque o mapa do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, Brasil.
Resultados
Todas as espécies compartilharam o mesmo valor diplóide, 2n=48
cromossomos, entretanto com diferenças intergenéricas quanto às fórmulas
cariotípicas. Assim, A. solandri e S. brasiliensis apresentam o cariótipo composto por
dois cromossomos subtelocêntricos e 46 cromossomos acrocêntricos (NF=50),
enquanto T. albacares e T. obesus apresentam cariótipos compostos por dois
cromossomos metacêntricos, dois cromossomos submetacêntricos e 44 cromossomos
acrocêntricos (NF=52) (Figura 5a, b, c, d). Discretas bandas heterocromáticas foram
evidenciadas nas regiões centroméricas dos cromossomos, apresentando-se mais
conspícuas nos braços curtos dos pares cromossômicos subtelocêntricos, para A.
21
solandri e S. brasiliensis, e submetacêntricos, nas espécies do gênero Thunnus. (Figura
5, à direita). A impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) (Figura 5, em destaque) e
mapeamento de sequências DNAr 18S (Figura 6), identificaram sítios ribossomais
exclusivos nos braços curtos do par cromossômico no. 1, em A. solandri e S.
brasiliensis, e nos braços curtos do par cromossômico no. 2 para as espécies do gênero
Thunnus. Regiões heterocromáticas ricas em bases GC foram também localizadas
nessas mesmas regiões, em correspondência com os sítios das RONs (Figura 5, em
destaque). Sequências de DNAr 5S foram mapeadas nas regiões terminais dos braços
curtos do par cromossômicos no. 24 em todas as espécies (Figura 6).
22
Figura 5. Cariótipos de Acanthocybium solandri (a), Scomberomorus brasiliensis (b), Thunnus albacares (c) e T. obesus (d) com coloração convencional pelo Giemsa (esquerda). Os quadros, em cada cariótipo, destacam a correspondência entre os sítios Ag-RONs e CMA3
+/DAPI- com padrão conjulgado. Os padrões heterocromáticos, apresentados por cada uma das espécies, estão evidenciados à direita. Barra = 5 µm.
23
Figura 6. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) identificados por dual-color FISH
em Acanthocybium solandri (a), Scomberomorus brasiliensis (b), Thunnus albacares (c)
e T. obesus (d). Barra = 5 µm.
Discussão
Todas as quatro espécies de Scombridae compartilham o mesmo número
diplóide, 2n=48 cromossomos, considerado basal para representantes da Ordem
Perciformes e o de maior representatividade entre os peixes marinhos da costa
brasileira (Brum, 1996; Molina, 2007; Cipriano et al., 2008). Entretanto, apesar do
número cromossômico conservado, a presença de cromossomos bibraquiais evidencia
a ocorrência de rearranjos cromossômicos durante a evolução cariotípica dessas
espécies.
Os padrões cariotípicos apresentados pelas quatro espécies permitem dividi-las
em dois grupos de cariótipos, que diferem basicamente quanto aos pares
cromossômicos bibraquiais. O primeiro grupo, representado por A. solandri e S.
24
brasiliensis, possui apenas um par subtelocêntrico, sendo todos os demais
cromossomos acrocêntricos. Este par subtelocêntrico, no. 1 no cariótipo, é
possivelmente homeólogo entre as duas espécies, apresentando tamanho similar e
sítios de RONs (Ag-RONS/DNAr 18S) localizados em mesma posição nos braços curtos.
O segundo grupo, representado pelas duas espécies do gênero Thunnus, T. albacares
T. obesus, apresenta no cariótipo um par de cromossomos metacêntricos, exclusivos
destas espécies. Este par, de aparente relevância citotaxonômica intergenérica,
provavelmente é resultante de uma inversão pericêntrica ocorrida em um par
cromossômico acrocêntrico, presente nos cariótipos mais basais apresentados pelas
espécies A. solandri e S. brasiliensis. O segundo par cromossômico das duas espécies
de Thunnus, apesar de apresentar morfologia diferente (sm), tem similaridade de
tamanho e compartilha a presença de RONs com o par cromossômico no. 1 (st) de A.
solandri e S. brasiliensis. Tais similaridades provavelmente são indicativas da
homeologia desses cromossomos, mantidos evolutivamente com poucas modificações.
Considerando o cariótipo basal para teleósteos correspondente a 2n=48 cromossomos
acrocêntricos (NF=48) (Ohno, 1974; Brum & Galetti, 1997), os resultados presentes em
Scombridae coincidem com a filogenia proposta por Collette & Russo (1979), onde
Acanthocybium (NF=50), grupo irmão de Scomberomorus (NF=50), é apresentado
como grupo basal a Thunnus (NF=52-62), que demonstra maior derivação em relação
ao número de elementos bibraquiais.
Peixes da família Scombridae se notabilizam por um marcado conservadorismo
numérico dos cromossomos, onde as 12 espécies já analisadas (Tabela 1) exibem
2n=48 cromossomos (Ida et al., 1978; Ratty et al., 1986; Ida et al., 1993; presente
estudo), caracterizando uma acentuada condição simplesiomórfica nos Perciformes.
Contudo, apesar dos caracteres cromossômicos se mostrarem conservativos em alguns
casos, mesmo entre gêneros distintos como Acanthocybium, Scomber e
Scomberomorus (2st+46a), ou entre as espécies de Katsuwonus (48a), eles se
apresentam potencialmente discriminatórios entre espécies (Tabela 1). Os padrões
cariotípicos divergentes, representados por distintas fórmulas cariotípicas e de valores
de NF (Tabela 1), resultaram provavelmente de inversões pericêntricas, as quais
representam um dos principais rearranjos cromossômicos envolvidos na diferenciação
cariotípica dos grandes grupos marinhos (Takai & Ojima, 1987; Molina & Galetti, 2004).
25
Tabela I. Dados citogenéticos para a família Scombridae.
Espécie 2n Cariótipo NF RONs Referências
Acanthocybium solandri 48 2st+46a 50 2 Presente estudo
Auxis rochei 48 - 50 - Ida et al., 1993
Auxis thazard 48 48a 48 - Ida et al., 1993
Katsuwonus pelamis 48 48a 48 - Ida et al., 1993
Katsuwonus pelamis 48 48a 48 - Ratty et al., 1986
Scomber australasicus 48 2st+46a 50 - Ida et al., 1978
Scomber japonicus 48 2st+46a 50 2 Murofushi et al., 1979
Scomberomorus brasiliensis 48 2st+46a 50 2 Presente estudo
Thunnus alalunga 48 2m+2sm+2st+42a 54 - Ratty et al., 1986
Thunnus albacares 48 2m+2sm+2st+42a 54 - Ratty et al., 1986
Thunnus albacares 48 2m+2sm+44a 52 2 Presente estudo
Thunnus orientalis 48 4m+6sm+4st+34a 62 - Khuda-Bukhsh & Das, 2007
Thunnus obesus 48 2m+2sm+44a 54 2 Presente estudo
Thunnus thynnus 48 2m+2st+44a 52 - Ida et al., 1978
Thunnus thynnus 48 2m+4st+42a 54 - Ida et al., 1993
Em muitas famílias de Teleósteos a heterocromatina parece ter desempenhado
um importante papel na evolução cariotípica, além de ser apontada como relevante
marcador citotaxonômico (Galetti et al., 2000). Contudo, entre os Scombridae, esta
característica parece ter pouca relevância na diferenciação cariotípica das espécies. De
fato, blocos heterocromáticos bem discretos estão localizados principalmente nas
regiões centroméricas dos cromossomos, correspondendo ao padrão compartilhado
por um grande número de Perciformes marinhos (Motta et al., 2011a, b, c). Blocos
heterocromáticos mais conspícuos ocorrem apenas em posição equilocal aos cístrons
das RONs que, como na maioria das espécies de peixes e anfíbios, se apresentam GC-
ricas (Schmid & Guttenbach, 1988).
Sítios de DNAr 5S, em condição sintênica aos genes 45S, constituem uma
condição pouco freqüente entre os peixes (e.g. Pendás et al., 1994; Morán et al., 1996;
Martins & Galetti, 2000, 2001). O mapeamento físico de sequências 5S tem revelado,
na maioria das espécies de peixes, uma localização intersticial, parecendo ser uma
tendência geral para este grupo (Galetti & Martins, 2004). Entretanto, esta condição
não está presente nas espécies de Scombridae ora analisadas, que apresentam estes
sítios em posição terminal e filogeneticamente conservados nos menores pares do
cariótipo (par no. 24). É provável que a pequena diversidade cariotípica presente nos
Scombridae possa estar atrelada à extrema capacidade migratória de algumas
26
espécies, à semelhança do que tem sido proposto para algumas espécies recifais com
alto potencial dispersivo, mediado por um extenso período pelágico larval (Molina &
Galetti, 2004).
A quase totalidade dos dados citogenéticos disponíveis para Scombridae
provêm de espécies oriundas do Pacífico. Os resultados previamente descritos para a
população de Thunnus albacares do Pacífico (Ratty et al., 1986), revelam uma fórmula
cariotípica com 2m+2sm+2st+42a (NF=54). A presença de seis cromossomos
bibraquiais difere da amostra do Atlântico ora analisada que, embora apresente o
mesmo número diplóide (2n=48), apresenta um cariótipo diferenciado com
2m+2st+44a (NF=52). Apesar das divergências populacionais poderem resultar de
diferentes esquemas metodológicos empregados na classificação dos cromossomos,
não se pode descartar a existência de algum grau de diferenciação cariotípica entre as
populações de T. albacares do Atlântico e do Pacífico.
Os dados cromossômicos das quatro espécies de Scombridae são os únicos
para populações originárias do Atlântico. Conforme já ressaltado, as inversões
pericêntricas se destacam como o principal mecanismo envolvido nas modificações
referentes à macroestrutura cariotípica desse grupo. Mais recentemente tem se
reavaliado o papel das inversões na evolução das espécies, atribuindo a elas traços
adaptativos favoráveis a novas condições ambientais (Hofmann & Rieseberg, 2008),
bem como eventos que levam ao isolamento pós-zigótico, sugerido como significante
para especiação no ambiente marinho (Molina & Galetti, 2004). O mapeamento
citogenético dos sítios ribossomais 18S e 5S, aqui apresentados, configuram as
primeiras informações sobre a localização dessas sequências gênicas entre as espécies
de Scombridae. Estes marcadores se mostraram insuficientes para a distinção entre as
duas espécies de Thunnus, T. albacares e T. obesus. De fato, baixa variação genética
tem sido observada entre espécies deste gênero, mesmo quando do uso populacional
de marcadores AFLP (Han & Ely, 2002). Contudo, juntamente com as fórmulas
cariotípicas, os sítios de DNAr 18S permitiram uma boa diferenciação intergenérica.
Devido à extensa distribuição geográfica apresentada pelas espécies dos três gêneros,
ora analisados, os padrões citogenéticos evidenciados poderão permitir a identificação
de possíveis formas crípticas ou de estruturação genética a partir do escrutínio de
27
outras populações, fornecendo assim dados relevantes para a conservação desta
família de grande interesse para a indústria pesqueira de diversos países.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No.
556793/2009-9), ao IBAMA pela licença de coleta (Processo No. 19135/1) e a SECIRM
pelas condições logísticas para condução deste estudo em campo e a José Garcia Jr.
pela identificação taxonômica das espécies.
Referências
Accioly, I.V., Bertollo, L.A.C., Costa, G.W.W.F., Jacobina, U.P., Molina, W.F. (2012).
Chromosomal population structuring in Carangids (Perciformes) between
northeastern and southeastern of Brazil coast. African Journal of Marine Science.
(in press).
Arai, R. (2011). Fish karyotypes: A check list. Tokyo: Springer, 280p.
Bjørndal, T., Brasão, A. (2006). The East Atlantic Bluefin Tuna fisheries: Stock collapse
or recovery? Marine Resource Economics, 21: 193–210.
Brum, M. J. I. (1996). Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazilian Journal of
Genetics, 19 (3): 421-427.
Brum, M. J. I., Galetti, P. M. (1997). Teleostei plan ground karyotype. Journal of
Computational Biology, 2: 91-102.
Calado, L. L., Bertollo, L. A. C., Costa, G. W. W. F., Molina, W. F. (2012). Cytogenetic
studies of Atlantic mojarras (Perciformes – Gerreidae): chromosomal mapping of
5S and 18S ribosomal genes using double FISH. Aquaculture Research.
DOI: 10.1111/j.1365-2109.2012.03089.x. (Online).
Carvalho, R., Soares Filho, W. S., Brasileiro-Vidal, A. C., Guerra, M. (2005). The
relationships among lemons, limes and citron: A chromosomal comparison.
Cytogenetic Genome Research, 109: 276-282.
Cipriano, R. R.; Fenocchio, A. S.; Artoni, R. F.; Molina, W. F.; Noleto, R. B.; Kantek, D. L.
Z.; Cestari, M. M. (2008). Chromosomal studies of five species of the Marine
fishes from the Paranaguá Bay and the karyotypic diversity in the marine
28
Teleostei of the Brazilian coast. Brazilian Archives of Biology and Technology, 51:
303-314.
Collette, B. B.; Nauen, C. E. (1983). Scombrids of the world. An annotated and
illustrated catalogue of tunas, mackerels, bonitos and related species known to
date. FAO Fisheries Synopsis, 2: 137p.
Collette, B. B., Russo J. L. (1979). An introduction to the Spanish mackerels, genus
Scomberomorus. In Proceedings of Colloquium on the Spanish and King Mackerel
Resources of the Gulf of Mexico, edited by E.L. Nakamura & H.R. Bullis, Jr. Gulf
States Marine Fish.Commission, 4: 3-16.
Galetti Jr., P. M., Martins, C. (2004). Contribuição da hibridação in situ para o
conhecimento dos cromossomos dos peixes. In: FISH: Conceitos e Aplicações na
Citogenética (Ed. M Guerra). Editora da SBG, 61-88.
Galetti Jr., P. M., Aguilar, C. T., Molina, W. F. (2000). An overview on marine fish
cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55.62.
Gold, J. R., Lee, C., Shipley, N. S., Powers, P. K. (1990). Improved methods for working
with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding.
Journal Fish Biology, 37: 563-575.
Han, K., Ely, B. (2002). Use of AFLP analyses to assess genetic variation in Morone and
Thunnus species. Marine Biotechnology, 4: 141-145.
Hatanaka, T., Galetti Jr., P. M. J. (2004). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA
genes in the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes,
Prochilodontidae). Genetica, 122: 239-244.
Hoffmann, A. A., Rieseberg, L. H. (2008). Revisiting the impact of inversions in
evolution: from population genetic markers to drivers of adaptive shifts and
speciation? Annual Review of Ecology and Systematics, 39: 21-42.
Howell, W. M., Black, D. A. (1980). Controlled Silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer a 1-step method. Experientia, 36:
1014-1015.
Ida, H., Murofushi, M., Fujiwara, S., Fujino, K. (1978). Preparation of fish chromosomes
by in vitro colchicine treatment. Japan Journal Ichthyology, 24: 281-284.
29
Ida, H., Oka, N., Terashima, H., Hayashizaki, K. I. (1993). Karyotypes and cellular DNA
contents of three species of family Scombridae from Japan. Nippon Suisan
Gakkaishi, 50(8): 1319-1323.
Khuda-Bukhsh, A. R., Das, J. K. (2007). Cytogenetic analyses in eight species of
teleostean fishes (Pisces): karyotypes, multiple Ag-NORs, sex chromosomes.
Research & Reviews in BioSciences, 1: 47–52.
Levan, A., Fredga, K., Sandeberg, A. A. (1964). Nomenclature for centromeric position
on chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
Martins, C., Galetti Jr., P, M. (1999). Chromosomal localization of 5S rRNA genes
in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, 7: 363-
367.
Martins, C., Galetti Jr., P. M. (2000). Conservative distribution of 5S rDNA loci in
Schizodon (Pisces, Anostomidae) chromosomes. Chromosome Research, 8: 353-
355.
Martins, C., Galetti Jr., P. M. (2001). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is
it a general rule for fishes? Genetica, 111: 439–446.
Molina, W. F. (2007). Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In: Fish
cytogenetics (Pisano, E., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Kapoor, B.G. eds.). Science
Publishers, Enfield, 69-110.
Molina, W. F., Costa, G. W. W. F., Cioffi, M. B., Bertollo, L. A. C. (2011). Chromosomal
differentiation and speciation in sister-species of Grammatidae (Perciformes)
from the Western Atlantic. Helgoland Marine Research, 1: 1-17.
Molina, W. F., Galetti Jr., P. M. (2004). Multiple pericentric inversions and chromosome
divergence in the reef fishes Stegastes (Perciformes, Pomacentridae). Genetics
and Molecular Biology, 27: 543-548.
Molina, W. F., Motta-Neto, C. C., Sena, D. C. S., Cioffi, M.B., Bertollo, L. A. C. (2012).
Karyoevolutionary aspects of Atlantic hogfishes (Labridae Bodianinae), with
evidence of an atypical decondensed argentophilic heterochromatin. Marine
Genomic, 1: 1-8.
Moorhead, P. S., Nowell, P. C., Mellmam, W. J., Battips, D. M., Hungerford, D. A.
(1960). Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral
blood. Experimental Cell Research, 20: 613-616.
30
Morán, P., Martínez, J. L., Garcia-Vásquez, E., Pendás, A. M. (1996). Sex chromosome
linkage of 5S rDNA in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytogenetics and
Cell Genetics, 75: 145-150.
Motta-Neto, P. A., Lima-Filho, P. A.,Araújo, W. C., Bertollo, L. A. C., Molina, W. F.
(2011a). Differentiated evolutionary pathways in Haemulidae (Perciformes):
karyotype stasis versus morphological differentiation. Reviews in Fish Biology
and Fisheries, DOI: 10.1007/s11160-011-9236-4. (Online).
Motta-Neto, C. C., Cioffi, M. B.,Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2011b). Extensive
chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of
the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology, 401: 75-79.
Motta-Neto, C. C., Cioffi, M. B.,Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2011c). Molecular
cytogenetic analysis of Haemulidae fish (Perciformes): Evidence of evolutionary
conservation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 407: 97-100.
Murofushi, M., Aoki, H. (1979). Karyological study in Scomber japonicus. Rep. Mishima
Res. Inst. Sci. Liv., Nihon Univ., 2: 37-40.
Nelson, J. S. (2006). Fishes of the World. New York: John Wiley and Sons, 4: 624p.
Ohno, S. (1974). Protochordata, Cyclostomata and Pisces. In John, B. (Ed.). Animal
Cytogenetics, 4: 1-92.
Pendás, A. M., Móran, P., Freije, J. P., Garcia-Vásquez, E. (1994). Chromosomal location
and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon 5S rDNA.
Cytogenetics and Cell Genetics, 67: 31-36.
Pinkel, D., Straume, T., Gray, J. W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-
sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy
Science, USA, 83: 2934-2938.
Pujolar, J. M., Roldán, M. I., Pla, C. (2003). Genetic analysis of tuna populations,
Thunnus thynnus thynnus and T. alalunga. Marine Biology, 143: 613-621.
Ratty, F. J., Song, Y. C., Laurs, R. M. (1986). Chromosomal analysis of albacore, Thunnus
alalunga, and yelwwfin, Thunnus alabacares, and skipjack, Katsuwonus pelamis,
tuna. Fishery Bulletin: 84(2): 469.
31
Schmid, M., Guttenbach, M. (1988). Evolutionary diversity of reverse (R) fluorescent
chromosome bands in vertebrates. Chromosoma, 97: 101-114.
Sumner, A. T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304-306.
Takai, A., Ojima, Y. (1987). Comparative chromosomal studies in three balistid fishes.
Kromosomo, 47/48: 1545-1550.
32
4.2. Capítulo 2
Cromossomos sexuais múltiplos e mapeamento físico de genes DNAr 18S/5S por
dual-color FISH em dourados-do-mar (Perciformes, Coryphaenidae)
Soares, R. X., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G. W.W.F., Molina, W. F.
Resumo
Os dourados-do-mar (Coryphaenidae) são predadores pelágicos distribuídos por todos os oceanos tropicais e subtropicais, com marcada relevância para a pesca comercial, artesanal e esportiva. Esta pequena família é formada pelas espécies Coryphaena hippurus e C. equiselis, das quais se desconhecem aspectos cromossômicos, apesar do recente avanço em dados citogenéticos para Perciformes. Neste trabalho, ambas as espécies foram analisadas citogeneticamente usando diferentes técnicas de coloração (C-, Ag-, and CMA3 banding) bem como hibridação fluorescente in situ (FISH) para detectar sítios DNAr 18S e DNAr 5S. Fêmeas de C. hippurus, apresentaram 2n=48 cromossomos, com 2m+4sm+42a (NF=54). Por sua vez, em C. equiselis, onde ambos os sexos puderam ser analisados, as fêmeas apresentaram 2n=48 cromossomos, 2m+6sm+40a, enquanto que os machos exibiram 2n=47 cromossomos, 3m+6sm+38a (NF=56), indicando a presença de um sistema de cromossomos sexuais múltiplos do tipo X1X1X2X2/X1X2Y. O cromossomo neo-Y, metacêntrico, provavelmente originado por fusão Robertsoniana entre cromossomos acrocêntricos, se destaca como o de maior tamanho no cariótipo dos machos. Os sítios Ag-RON/DNAr 18S e DNAr 5S, localizam-se respectivamente nos braços curtos dos pares cromossômicos acrocêntricos 2 e 24, aparentemente homeólogos entre as duas espécies. Sistemas de cromossomos sexuais são raros nos Perciformes e o caso ora apresentado constitui a primeira descrição em uma espécie pelágica marinha. Esta condição implica em importantes subsídios filogenéticos em relação a outros grupos proximamente relacionados, bem como sobre a própria gênese do sistema. Palavras-chave: peixes marinhos, diferenciação cariotípica, sistema X1X1X2X2/X1X2Y, fusão Robertsoniana.
33
Multiple sex chromosomes and physical mapping of DNAr 18S/5S by dual-color FISH
in dolphinfish (Perciformes, Coryphaenidae)
Soares, R. X., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G. W.W.F., Molina, W. F.
Abstract
The dolphinfishes (Coryphaenidae) are pelagic predators, distributed over all tropical and subtropical oceans, with a strong relevance to commercial fishing, artisanal and sportive. This small family is composed by the species Coryphaena hippurus and C. equiselis, from which chromosomal aspects are unknown, despite recent advances in cytogenetic data for Perciformes. In this work, both species were cytogenetically analyzed using different techniques staining (C-, Ag-, and CMA3 banding) as well as fluorescent in situ hybridization (FISH) to detect 5S and 18S rDNA. Females C. hippurus, showed 2n = 48 chromosomes, with 2m+4sm+42a (FN = 54). In turn, in C. equiselis, where both sexes could be analyzed, the females presented 2n=48 chromosomes, 2m+6sm+40a, while the males exhibited 2n=47 chromosomes, 3m+6sm+38a (FN = 56), indicating the presence of a multiple sex chromosome system type X1X1X2X2/X1X2Y. The neo-Y chromosome, metacentric, probably originated by Robertsonian fusion between acrocentric chromosomes, stands out as the larger in the male karyotype. The Ag-NOR/DNAr 18S and 5S rDNA sites, are located respectively in the short arms of acrocentric chromosome pairs 2 and 24, apparently homologous between the two species. Sex chromosomes systems are rare in the Perciformes and the case presented here constitutes the first description in a marine pelagic species. This condition implies in important phylogenetic subsidies in relation to other groups closely related, as well as on the own system genesis. Keywords: marine fish, karyotype differentiation, X1X1X2X2/X1X2Y system, Robertsonian fusion.
34
Introdução
Os grandes peixes pelágicos marinhos, apesar de representarem um relevante
componente da biodiversidade dos oceanos, dispõem em geral de dados citogenéticos
marcadamente incipientes, sobretudo devido à logística envolvida na sua obtenção.
Estes grupos taxonômicos constituem um modelo particularmente valioso de evolução
cariotípica, contrastante com espécies marinhas recifais demersais de menor
vagilidade. Barreiras biogeográficas eficientes para espécies demersais são, em muitos
casos, insuficientes para restringir o fluxo gênico de grandes migradores pelágicos
(Palumbi, 1994), com possíveis tamponamentos da diversificação cariotípica destas
espécies.
Entre os Perciformes marinhos, a subordem Carangoidei, do qual faz parte a
pequena família Coryphaenidae (Springer & Smith-Vaniz, 2008), tem revelado um
elevado conservadorismo diplóide, onde a maior parte das espécies apresenta 2n=48
cromossomos (Chai et al., 2009; Arai, 2011; Accioly et al., in press). Coryphaenidae é
composta por apenas duas espécies epipelágicas, Coryphaena hippurus (Linnaeus,
1758) (Common dolphinfish) e C. equiselis (Linnaeus, 1758) (Pompano dolphinfish),
distribuídas por todos os oceanos tropicais e subtropicais (Collette, 1986) (Figura 7).
Ambas as espécies constituem um importante recurso da pesca industrial, artesanal e
esportiva explorado pelas frotas pesqueiras de muitos países (FAO, 1994; Lasso &
Zapata, 1999). Análises enzimáticas nestas duas espécies revelam alelos exclusivos que
apontam marcada diferenciação genética entre elas (Pujolar & Pla, 2002),
Características morfológicas como a presença de dois canais pré-nasais
ossificados, rara para Percoidei, aloca claramente Coryphaenidae na subordem
Carangoidei. Esta subordem forma um grupo monofilético composto pelas famílias
Echeneidae, Rachycentridae, Carangidae, Nematistiidae e Coryphaenidae (Johnson,
1984; Ditty & Shaw, 1992; Ditty et al., 1994; Reed et al., 2002; Springer & Smith-Vaniz,
2008) condição também apoiada por análises filogenéticas moleculares recentes (Gray
et al., 2009).
No presente estudo são apresentados os dados citogenéticos das duas espécies
que compõem a família Coryphaenidae, C. hippurus e C. equiselis, apresentando seus
padrões heterocromáticos, regiões ricas em bases GC e o mapeamento cromossômico
dos genes ribossomais 5S e 18S por experimentos de dual-color FISH. Um sistema de
35
cromossomos sexuais múltiplos está sendo descrito para C. equiselis, constituindo a
primeira descrição de cromossomos sexuais em grandes Perciformes pelágicos. Em
função do grande potencial migratório do gênero Coryphaena (Beardsley Jr., 1967;
Campos et al., 1993), a existência deste sistema em C. equiselis mostra-se uma
característica importante, propiciando inferências sobre a sua origem e ancestralidade,
com possíveis implicações filogenéticas.
Figura 7. Distribuição geográfica das espécies Coryphaena equiselis (a) e C. hippurus (b).
Material e Métodos
As análises citogenéticas foram desenvolvidas em três exemplares fêmeas de C.
hippurus e três exemplares de C. equiselis (dois machos e uma fêmea), coletados no
Arquipélago de São Pedro e São Paulo (00°56’N e 029°22’W), região meso-Atlântica.
a
36
Todos os exemplares foram sexados por exames macroscópicos das gônadas e
identificados taxonomicamente de acordo com Gibbs & Collette (1959). Fragmentos de
tecido renal foram utilizados para a obtenção de cromossomos mitóticos, pela
interrupção in vitro do ciclo celular (Gold et al., 1990). As regiões organizadoras de
nucléolos (RONs) foram detectadas pela impregnação por nitrato de prata (AgRONs),
segundo Howell & Black (1980), enquanto que as regiões heterocromáticas foram
evidenciadas pelo bandamento C (Sumner, 1972). Colorações com os fluorocromos
Cromomicina A3 e DAPI foram utilizadas para evidenciar regiões cromossômicas GC- ou
AT-ricas (Carvalho et al., 2005). Dual-color FISH foi realizada segundo Pinkel et al.
(1986), com pequenas adaptações, para o mapeamento citogenético dos genes
ribossomais utilizando sondas de DNAr 5S e 18S.
Para obtenção da sonda 18S foi utilizada uma sequência de 1.400 pb de DNA in
tandem isolada do DNA do peixe Prochilodus argenteus (Hatanaka & Galetti, 2004),
marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche), segundo instruções
do fabricante. A sonda de DNAr 5S, com 500-200 pb, foi obtida a partir do DNA
nuclear do peixe Leporinus elongatus (Martins & Galetti, 1999) marcada por nick
translation com biotina-14-dATP (Roche), também segundo instruções do fabricante.
As metáfases foram fotografadas em um fotomicroscópio de epifluorescência
Olympus™ BX50, com sistema digital de captura Olympus DP70. Os cromossomos
foram classificados em metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e
acrocêntricos (Levan et al., 1964).
Resultados
A espécie C. equiselis apresentou valores diploides distintos entre os sexos, com
fêmeas apresentando 2n=48 cromossomos e fórmula cariotípica composta por
2m+6sm+40a (NF=56) e os machos com 2n=47 cromossomos e fórmula cariotípica
composta por 3m+6sm+38a (NF=56) (Figura 8a, b). No cariótipo do macho se destacam
três cromossomos desprovidos de homólogos, sendo dois acrocêntricos,
tentativamente indicados como correspondentes aos de número 5 e 8 no cariótipo das
fêmeas, e um grande cromossomo metacêntrico, ausente nas fêmeas (Figura 8b, em
destaque). Os exemplares de fêmeas de C. hippurus apresentam 2n=48 cromossomos
37
com fórmula cariotípica composta por 2m+4sm+42a (NF=54) (Figura 8c). Não foi
possível a obtenção de espécimes machos desta espécie.
Nas duas espécies, os sítios Ag-NORs foram localizados nos braços curtos do par
2 (submetacêntrico) (Figura 8, em destaque), apresentando também coloração positiva
à CMA3 e negativa ao DAPI. Dual-color FISH com sondas DNAr 18S e 5S evidenciaram
que estas subunidades ribossomais se localizam em cromossomos distintos (Figura 9).
Os sítios 18S correspondem à localização das Ag-RONs nas duas espécies, enquanto
que os sítios 5S estão localizados nos braços curtos do menor par cromossômico (par
24), também em ambas as espécies.
Os blocos heterocromáticos são reduzidos, discretamente evidenciados na
região centromérica dos cromossomos, sendo mais conspícuos nas regiões
correspondentes aos sítios das RONs/DNAr 18S e DNAr 5S (Figura 8). O padrão
heterocromático do cromossomo metacêntrico, exclusivo dos machos de C. equiselis,
revelou um segmento heterocromático intersticial no braço longo, aparentemente
similar ao presente nos homólogos do par 5 das fêmeas, em posição equivalente.
38
Figura 8. Padrão cariotípico de fêmea (a) e macho (b) de Coryphaena equiselis e fêmea de C. hippurus (c). Coloração Giemsa convencional (esquerda) e bandamento C (direita); em (b) os cromossomos X1X2Y estão sendo destacados. Os sítios Ag-RONs, com padrão conjugado CMA3
+/DAPI- (par 2), estão apresentados nos quadros à direita. Barra = 5 µm.
39
Figura 9. Mapeamento cromossômico de sítios DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) identificados por dual-color FISH, em Coryphaena equiselis (a) e C. hippurus (b). Cariótipo de fêmea de C. equiselis (X1X1X2X2) (a), com sistema heterogamético presente no cariótipo do macho (X1X2Y) em destaque. Os sítios de DNAr 18S e 5S estão localizados sobre os mesmos pares cromossômicos (par 2 e par 24, respectivamente), em ambas as espécies. Barra = 5 µm.
Discussão
As características cariotípicas das fêmeas e machos de C. equiselis permitem
concluir que esta espécie é portadora de um sistema de cromossomos sexuais
múltiplos do tipo X1X1X2X2/X1X2Y, onde o grande cromossomo metacêntrico, exclusivo
dos machos, corresponde ao cromossomo neo-Y e os cromossomos X1 e X2
provavelmente correspondam aos de números 5 e 8 do cariótipo das fêmeas. As duas
espécies do gênero monotípico Coryphaena apresentam dimorfismo sexual na fase
adulta, no qual os machos desenvolvem uma característica crista óssea na frente da
cabeça (Beardsley Jr., 1967; Collette, 1981). A relação entre dimorfismo sexual e
cromossomos sexuais diferenciados é pouco conhecida. Cromossomos sexuais
diferenciados poderiam desempenhar um importante papel na evolução do
dimorfismo sexual (Rice, 1984), uma vez que constituem a única parte do genoma que
difere entre os sexos (Mank, 2009). Assim, pelo menos em C. equiselis, esta correlação
pode ser de fato válida, considerando o dimorfismo cromossômico e morfológico entre
os sexos, presente nesta espécie. Adicionalmente, além dos aspectos ontogenéticos e
fisiológicos, a heterogametia cromossômica é também capaz de promover ou propiciar
40
a especiação através do isolamento reprodutivo entre as espécies, destacadamente no
ambiente marinho, visto o reduzido número de barreiras geográficas ou graus
variáveis de isolamento populacional (Galetti et al., 2000; Kitano et al., 2009).
O padrão cariotípico geral das duas espécies de Coryphaena, reconhecidamente
com hábitos migradores (Oxenford & Hunt, 1986) e ampla distribuição geográfica,
poderia se equiparar aos padrões cariotípicos conservados, encontrados em espécies
recifais demersais com extenso potencial dispersivo larval que, para algumas famílias,
tende a uma menor diversidade cariotípica (Molina & Galetti, 2004a; Sena & Molina,
2007a). De fato, ambas as espécies analisadas apresentam o valor diplóide
considerado basal para Perciformes, 2n=48 cromossomos (Galetti et al., 2000).
Adicionalmente ainda emergem dos cariótipos de Coryphaenidae outros padrões
cromossômicos conservados, como sítios ribossomais principais simples e reduzido
conteúdo heterocromático, localizado em regiões centroméricas ou terminais.
Por sua vez, a existência de heterogametia cromossômica masculina em C.
equiselis, devida a um sistema de cromossomos sexuais múltiplos X1X1X2X2/X1X2Y,
representa uma condição derivada, bem como a primeira ocorrência de cromossomos
sexuais para Echeneoidea (Rachycentridae + Coryphaenidae + Echeneidae) ou da
monofilética subordem Carangoidei. Análises envolvendo diversos grupos de peixes
têm indicado que sistemas de cromossomos sexuais diferenciados podem surgir
repetidas vezes, através de eventos independentes, em um mesmo táxon (Almeida-
Toledo & Foresti 2001; Devlin & Nagahama, 2002; Cioffi et al. 2011; Kitano & Peichel,
2011). Em relação à Coryphaenidae, a ausência de dados para indivíduos machos de C.
hippurus impossibilita, no entanto, a delimitação da extensão e datação da origem
desse sistema múltiplo em período anterior ou posterior a especiação destas espécies,
mas poderia representar uma forte barreira reprodutiva entre elas, sobretudo em um
cenário de extensa sobreposição geográfica.
Cromossomos sexuais diferenciados são relativamente raros em espécies
marinhas (Galetti et al., 2000). Dentre estes casos, sistemas múltiplos X1X1X2X2/X1X2Y,
têm sido os mais frequentemente relatados, como em espécies Antárticas da família
Channichthyidae, Chaenodraco wilsoni, C. hamatus, C. myersi, Chionobathyscus dewitti
(Morescalchi et al., 1992), em Callionymidae, nas espécies Callionymus beniteguri e C.
ornatipinnis (Murofushi et al., 1983), em Monodactylidae, Monodactylus argenteus
41
(Suzuki et al., 1988), em Lutjanidae, Lutjanus quinquelineatus (Ueno & Takai, 2008),
entre outros. Em Perciformes a gênese de sistemas múltiplos em grande parte se deve
a mecanismos de fusão Robertsoniana envolvendo cromossomos acrocêntricos (Ueno
& Takai, 2008; Kitano & Peichel, 2011). Adicionalmente, translocações robertsonianas
além de relacionadas à formação de sistemas sexuais múltiplos, em autossomos estão
associadas a variabilidade e diversificação cariotípica de vários grupos de peixes
marinhos (Galetti et al., 2006). A fixação de translocações recíprocas tem sido
identificada em diversos grupos, entre eles, em espécies das famílias Gobiidae (e.g.
Thode et al., 1988), Apogonidae (e.g. Araújo et al., 2010), bem como também de forma
polimórfica transitória, em outros grupos como nos pomacentrídeos da subfamília
Chrominae (Molina & Galetti, 2002).
Em C. equiselis o cromossomo neo-Y tem, aproximadamente, o dobro do
tamanho dos maiores cromossomos acrocêntricos do cariótipo. Este cromossomo
parece, de fato, ter sido originado da fusão cêntrica de dois cromossomos
acrocêntricos, correspondentes a um dos homólogos do par 5 e do par 8 do cariótipo
das fêmeas. Assim sendo, paralelamente à formação do cromossomo neo-Y, os
cromossomos remanescentes de cada um desses pares passam a representar os
cromossomos X1 e X2, respectivamente. A presença de um discreto bloco
heterocromático em posição intersticial no cromossomo 5 e no braço longo do Y,
sugere o provável envolvimento deste cromossomo na fusão cêntrica formadora do
neo-Y.
No sistema X1X2Y, descrito para C. equiselis, o reduzido conteúdo
heterocromático se apresenta evolutivamente pouco dinâmico, uma vez que, à
exceção do bloco intersticial presente no braço longo do neo-Y, reflete a condição
basal largamente compartilhada presente nos Perciformes. Esta pequena quantidade
de heterocromatina, que se mostra neutra aos fluorocromos empregados, se encontra
presente nos pares envolvidos na translocação (X1/X2). O estabelecimento de sistemas
múltiplos deve inicialmente ser estabelecido por estado polimórfico, com tendência à
fixação, contrariamente aos graus variáveis de heterocromatinização presentes em
alguns sistemas simples, que possibilitam inferir estados iniciais de diferenciação de
um crescente cromossomo Y (Ueno & Takai, 2008). Estes resultados também implicam
que, depois dos rearranjos cromossômicos, não ocorreram posteriores diferenciações
42
entre os cromossomos sexuais, corroborando a ideia que os rearranjos cromossômicos
são eles mesmos passos cruciais na diferenciação dos cromossomos sexuais múltiplos
e não requerem adicional heterocromatinização (Cioffi et al., 2011).
A comparação cariotípica entre fêmeas de C. equiselis e de C. hippurus
(homogaméticas), revela um mesmo número diploide, com algumas diferenças quanto
ao cariótipo. O menor número fundamental do cariótipo feminino de C. hippurus
(2n=54), em relação a C. equiselis (2n=56), se deve a presença de um par acrocêntrico,
presente na primeira, ao invés de um par submetacêntrico presente em C. equiselis.
Esta diferença estrutural discernível pode ser atribuída a um evento de inversão
pericêntrica, um dos mecanismos mais comuns na diversificação cariotípica dos
Perciformes (e.g. Molina, 2007). Apesar de indicações preliminares e diante de uma
filogenia ainda não resolvida frente aos estudos moleculares existentes (Gray et al.,
2009), a presença de um maior número de cromossomos acrocêntricos em C. hippurus
poderia ser indicativo de uma condição mais basal em relação a C. equiselis.
O mapeamento das sequências de DNAr 5S e 18S em cromossomos
aparentemente homeólogos nas duas espécies de Coryphaenidae revelaram o
pequeno dinamismo evolutivo associado a estas famílias multigênicas nesse grupo. De
fato, comparações com Rachycentridae (Jacobina et al., 2011), grupo irmão de
Coryphaenidae, formado pela espécie monotípica Rachycentron canadum, bem como
alguns Carangidae (Sola et al., 1997; Rodrigues et al., 2007) indicam que a localização
de sequências 18S, nos braços curtos de um único par cromossômico de tamanho
equivalente, constitui uma condição basal, sugerindo uma extensa homeologia. As
marcações equilocais referentes às sequências de DNAr 18S e sítios Ag-NORs descarta
a existência de sítios adicionais polimórficos ou latentes. São escassos os dados de
mapeamento da subunidade ribossômica 5S em Carangoidei. Em C. hippurus e C.
equiselis estas sequências também se apresentam simples e invariáveis, conservadas
exclusivamente sobre o menor par cromossômico (par 24), contrastando com a
presença de dois sítios 5S no único representante da família Rachycentridae, R.
canadum (Jacobina et al., 2011) analisado. Em muitos vertebrados, os genes de RNAr
5S, como em Coryphaenidae, estão localizados sobre um único par cromossômico
(Suzuki et al., 1996), embora em peixes possam ser encontrados variando de um a
diversos pares (Mazzei et al., 2004). Sequências 5S localizadas em apenas um par
43
cromossômico têm sido relatadas em várias espécies de peixes, como esturjões,
enguias, garoupas e baiacus (Fontana et al., 1998; Martínez et al., 1996; Tagliavini et
al., 1999; Fischer et al., 2000; Sola et al., 2000). Esta característica parece representar
uma condição basal para o grupo (Martins & Galetti, 1999; 2001), visto que é a mais
frequente em Teleósteos com cariótipos tipicamente basais (2n=48 acrocêntricos). Ao
contrário da posição terminal observada em Coryphaenidae, um posicionamento
intersticial destes sítios é a mais comumente observado em peixes, sugerindo algum
grau de proteção contra eventos disruptivos promovidos por rearranjos estruturais
(Mantovani et al., 2005).
Padrões genéticos e citogenéticos em peixes têm sido associados aos seus
potenciais dispersivos (e.g. Hoarau et al., 2002; Molina & Galetti, 2004a). De fato, é
bem estabelecido que a fixação de inversões e translocações sejam acentuadas por
processos vicariantes levando à diversificação cariotípica (Sites & Moritz, 1987). No
ambiente marinho, onde existem menos partições biogeográficas que em áreas
continentais, em geral, as espécies parecem apresentar uma menor diversificação
cariotípica (Brum, 1995).
Algumas famílias de peixes recifais exibem marcada derivação cariotípica, como
Pomacentridae, Gobiidae, Scaridae, Apogonidae, entre outros (Ene, 2003; Molina &
Galetti, 2004b; Sena & Molina, 2007b; Araújo et al., 2010). Por outro lado, pouco ainda
se sabe sobre os padrões cariotípicos dos grandes peixes pelágicos neríticos, que
apresentam adultos migradores capazes de empreender longas jornadas até sítios de
reprodução (Collette & Nauen, 1983; Graves, 1998). As escassas informações
citogenéticas disponíveis, bem como o modesto nível de análise normalmente
empregado, restringem as inferências sobre o nível de diversificação cariotípica
apresentado por esses peixes. Em Coryphaenidae, apesar da alta vagilidade e grande
tamanho populacional, a macroestrutura cariotípica presente na família (2n=48;
NF=54-56) demonstra padrões cariotípicos próximos daqueles observados em outros
Carangoidei, como Carangidae (46<2n<56; NF=48-78) e Rachycentridae (2n=48; NF=54)
(Arai, 2011). Entretanto, apesar desta relativa conservação, é digna de destaque a
diferenciação do sistema X1X2Y em C. equiselis, representando um caráter
seguramente derivado em relação às demais espécies dos grandes Perciformes
pelágicos. Vale destacar que em Rachycentron canadum, espécie monotípica
44
pertencente à família Rachycentridae, e que forma um grupo monofilético com
Coryphaenidae (Gray et al., 2009), não há evidências de cromossomos sexuais
diferenciados (Jacobina et al., 2011). Neste contexto, a extensão do presente estudo
nos machos de C. hippurus, constatando a existência ou não de cromossomos sexuais
diferenciados também nesta espécie, fornecerá importantes subsídios para
caracterizar uma sinapomorfia para a família Coryphaenidae ou uma autapomorfia
exclusiva de C. equiselis, bem como as possíveis implicações desse sistema de
cromossomos sexuais na especiação desse grupo.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No.
556793/2009-9), ao IBAMA pela licença de coleta (Processo No. 19135/1) e a SECIRM
pelas condições logísticas para condução deste estudo em campo.
Referências
Accioly, I. V., Bertollo, L. A. C., Costa, G. W. W. F., Jacobina, U. P., Molina, W. F. (2012).
(in press). Chromosomal population structuring in Carangids (Perciformes)
between northeastern and southeastern of Brazil coast. African Journal of
Marine Science.
Almeida-Toledo, L. F., Foresti, F. (2001). Morphological differentiated sex
chromosomes in neotropical freshwater fish. Genetica, 111: 91-10.
Arai, R. (2011). Fish karyotypes: A check list. Tokyo: Springer, 280p.
Araujo, W. C., Martinez, P. A., Molina, W. F. (2010). Mapping of ribosomal DNA by
FISH, EcoRI digestion and replication bands in the Cardinalfish Apogon
americanus (Perciformes). Cytologia, 75: 1109-117.
Beardsley Jr., G. L. (1967). Age, growth, and reproduction of the dolphin, Coryphaena
hippurus, in the Straits of Florida. Copeia, 1967: 441-451.
Brum, M. J. I. (1995). Correlações entre a filogenia e a citogenética dos peixes
teleósteos. Sociedade Brasileira de Genética – Série Monografias, 2: 5-42.
45
Campos, J. A., Segura, A., Lozono, O., Madrigal, E. (1993). Ecología básica de
Coryphaena hippurus (Pisces, Coryphaenidae) y abundancia de grandes pelágicos
en el Pacífico de Costa Rica. Revista de Biologia Tropical, 41: 783-790.
Carvalho, R., Soares Filho, W. S., Brasileiro-Vidal, A. C., Guerra, M. (2005). The
relationships among lemons, limes and citron: A chromosomal comparison.
Cytogenetic Genome Research, 109: 276-282.
Chai, X., Li, X., Lu, R., Clarke, S. (2009). Karyotype analysis of the yellowtail kingfish
Seriola lalandi lalandi (Perciformes: Carangidae) from South Australia.
Aquaculture Research, 40: 1735-1741.
Cioffi, M. B., Sánchez, A., Marchal, J. A., Kosyakova, N., Liehr, T., Trifonov, V., Bertollo,
L. A. C. (2011). Whole chromosome painting reveals independent origins of sex
chromosomes in closely related forms of a fish species. Genetica, 139: 1065-
1072.
Collette, B. B. (1981). Coryphaenidae. In: W. Fischer (Bianchi, G. & Scott, W.B. eds.)
FAO species identification sheets for fishery purposes. Eastern Central Atlantic
(Fishing Areas 34, 47). Department of Fisheries and Oceans Canada and FAO,
Rome.
Collette, B.B. (1986). Coryphaenidae. In Fishes of the NorthEastern Atlantic and the
Mediterranean, II. (Whitehead, P. J . P., Bauchot, M. L., Hureau, J. C., Nielsen, J.,
Tortonese, E. eds), Paris: Unesco, 845-846.
Collette, B. B.; Nauen, C. E. (1983). FAO species, catalogue. Vol. 2. Scombrids of the
world. An annotated and illustrated catalogue of tunas, mackerels, bonitos and
related species known to date. FAO Fishery Synopsis, 2: 137.
Devlin, R. H., Nagahama, Y. (2002). Sex determination and sex differentiation in fish:
An overview of genetic, physiological, and environmental influences.
Aquaculture, 208: 191-364.
Ditty, J. G., Shaw. R. P. (1992). Larval development, distribution, and ecology of cobia
Rachycentron canadum (family: Rachycentridae) in the northern Gulf of Mexico.
Fishery Bulletin, 90: 668-677.
Ditty, J. G., Shaw, R. P., Grimes, C. B., Cope, J. S. (1994). Larval development,
distribution, and abundance of common dolphin, Coryphaena hippurus, and
46
pompano dolphin, C. equiselis (family: Coryphaenidae), in the northern Gulf of
Mexico. Fishery Bulletin. 92: 275-291.
Ene, A. C. (2003). Chromosomal polymorphism in the goby Neogobius eurycephalus
(Perciformes: Gobiidae). Marine Biology, 142: 583-588.
FAO (Food and Agricultural Organization). (1994) FAO yearbook 1992. Fishery
statistics. Catches and landings. FAO Fisheries Series No. 43, FAO Statistics Series
No. 120, Vol. 74. FAO, Rome, 677p.
Fischer, C., Costaz, C. O., Crollius, H. R., Dasilva, C., Jaillon, O., Bouneau, L., Bonillo, C.,
Weissenbach J., Bernot, A. (2000). Karyotype and chromosomal location of
characteristic tandem repeats in the pufferfish Tetraodon nigroviridis.
Cytogenetics and Cell Genetics 88: 50–55.
Fontana, F., Tagliavini, J., Congiu, L., Lanfredi, M., Chicca, M., Laurente, C., Rossi, R.
(1998). Karyotypic characterization of the great sturgeon, Huso huso, by multiple
staining techniques and fl by multi in situ hybridization. Marine Biology, 132:
495–501.
Galetti Jr., P. M., Aguilar, C. T., Molina, W. F. (2000). An overview on marine fish
cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55-62.
Galetti Jr., P. M., Molina, W. F., Affonso, P. R. A. M., Aguilar C. T. (2006). Assessing
Genetic Diversity of Brazilian Reef Fishes by Chromosomal and DNA Markers.
Genetica ('s-Gravenhage), Holanda, 126(1-2): 161-177.
Gibbs, R. H., Collette, B. B. (1959). On the identification, distribution, and biology of the
dolphins, Coryphaena hippurus and C. equiselis. Bulletin of Marine Science of the
Gulf Caribbean, 9: 117-152.
Gold, J. R., Li, C., Shipley, N. S., Powers, P. K. (1990). Improved methods for working
with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding.
Journal of Fish Biology, 37: 563-575.
Gray, K. N., McDowell, J. R., Collette, B. B., Graves, J. E. (2009). A molecular phylogeny
of the remoras and their relatives. Bulletin of Marine Science, 84: 183-198.
Graves, J. E. (1998). Molecular insights into the population structures of cosmopolitan
marine fishes. Journal of Heredity, 89: 427–437.
47
Hatanaka, T., Galetti Jr., P. M. (2004). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes
in the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes,
Prochilodontidae). Genetica, 122: 239-244.
Hoarau, G., Rijnsdorp, A. D., Van der Veer, H. W., Stam, W. T., Olsen, J. L. (2002).
Population structure of plaice (Pleuronectes platessa L.) in northern Europe:
microsatellites revealed large-scale spatial and temporal homogeneity.
Molecular Ecology, 11: 1165–1176.
Howell, W. M., Black, D. A. (1980). Controlled silver staining of nucleolus organizer
region with protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36:
1014-1015.
Jacobina U. P., Cioffi M. B., Souza L. G. R., Calado, L. C., Tavares M., Mazella-Jr, J.,
Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2011). Chromosome mapping of repetitive
sequences in Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae): implications
for karyotypic evolution and perspectives for biotechnological uses. Journal of
Biomedicine and Biotechnology, 2011: 218-231.
Johnson, G. D. (1984). Percoidei: development and relationships. In: H. G. Moseret aL,
eds. Ontogeny and Systematics of Fishes. Spec. Publ No.l, American Society of
Ichthyologists and Herpetologists. Allen Press, Lawrence. 464-498.
Kitano, J., Peichel, C. L. (2011). Turnover of sex chromosomes and speciation in fishes.
Environmental Biology of Fishes. DOI: 10.1007/s10641-011-9853-8. (Online).
Kitano, J., Ross, J. A., Mori, S., Kume, M., Jones, F. C., Chan, Y. F., Absher, D. M.,
Grimwood, J., Schmutz, J., Myers, R. M., Kingsley, D. M., Peichel, C. L. (2009). A
role for a neo-sex chromosome in stickleback speciation. Nature, 461: 1079-
1083.
Lasso, J., Zapata, L. (1999). Fisheries and biology of Coryphaena hippurus (Pisces,
Coryphaenidae) in the Pacific coast of Colombia and Panama. Scientia Marina,
63: 387-399.
Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. A. (1964). Nomenclature for centromeric position on
chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
Mantovani, M., Abel, L. D. S., Moreira-Filho, O. (2005). Conserved 5S and variable 45S
rDNA chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces,
Characidae). Genetica, 123: 211-216.
48
Mank J. E. (2009). Sex chromosomes and the evolution of sexual dimorphism: lessons
from the genome. American Naturalist, 173: 141-150.
Martínez, J. L., P. Morán, E. Vázquez, G., Pendás, A. M. (1996). Chromosomal
localization of the major and 5S rRNA genes in the European eel (Anguilla
anguilla). Cytogenetics and Cell Genetics, 73: 149–152.
Martins, C., Galetti Jr. P. M. (1999). Chromosomal localization of 5S rDNA genes in
Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research 7: 363-367.
Martins, C., Galetti Jr., P. M. (2001). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is
it a general rule for fishes? Genetica 111: 439–446.
Mazzei, F. L., Ghigliotti, L., Bonillo, C., Coutanceau, J. P., Ozouf-Costaz, Pisano, E.
(2004). Chromosomal patterns of major and 5S ribosomal DNA in six icefish
species (Perciformes, Notothenioidei, Channichthyidae). Polar Biology, 28: 47-55.
Molina, W. F. (2007). Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In: Fish
cytogenetics (Pisano, E., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Kapoor, B.G. eds.). Science
Publishers, Enfield, 69 – 110.
Molina, W. F., Galetti Jr., P. M. (2002). Robertsonian rearrangements in the reef fish
Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5S RNAr
genes. Genetics and Molecular Biology, 25: 373 – 377.
Molina, W. F., Galetti Jr., P. M. (2004a). Multiple pericentric inversions and
chromosomal divergence in the reef fishes Stegastes (Perciformes,
Pomacentridae). Genetics and Molecular Biology. Ribeirão Preto, 27(4): 443-448.
Molina, W. F., Galetti Jr., P. M. (2004b). Karyotypic changes associated to the
dispersive potential on Pomacentridae (Pisces, Perciformes). Journal of
Experimental Marine Biology and Ecology, 309: 109-119.
Morescalchi, A., Hureau, J. C., Olmo, E, Ozouf-Costaz, C., Pisano, E., Stanyon, R. (1992).
A multiple sex-chromosome system in Antarctic ice-fishes. Polar Biology, 11:
655–661.
Murofushi, M., Nishikawa, S., Yosida, T. H. (1983). Cytogenetical studies on fishes. V.
Multiple sex chromosome mechanism (XX-Y) found in two dragonet fishes.
Proceedings of the Japan Academy, 59: 58-61.
49
Oxenford, H. A., Hunt, W. (1986). A preliminary investigation of the stock structure of
the dolphin, Coryphaena hippurus in the Western Central Atlantic. Fishery
Bulletin, 84: 451–460.
Palumbi, S. R. (1994). Genetic divergence, reproductive isolation, and marine
speciation. Annual Review of Ecology and Systematics, 25: 547–572.
Pinkel, D., Straume, T., Gray, J. W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-
sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy
Science, USA, 83: 2934–2938.
Pujolar, J. M., Pla, C. (2002). Occurrence of dolphinfish (Coryphaena hippurus) and
pompano dolphinfish (Coryphaena equiselis) in the Canary islands revealed by
genetic analysis. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 36:
339-343.
Reed, D. L., Carpenter, K. E., Gravelle, M. J. (2002). Molecular systematics of the jacks
(Perciformes: Carangidae) based on mitochondrial cytochrome b sequences
using parsimony, likelihood and Bayesian approaches. Molecular Phylogenetics
and Evolution, 23: 513-524.
Rice, W. R. (1984). Sex chromosomes and the evolution of sexual dimorphism.
Evolution, 38: 735-742.
Rodrigues, M. M., Baroni, S., Almeida-Toledo, L. F. (2007). Karyological characterization
of four marine fish species, genera Trachinotus and Selene (Perciformes:
Carangidae), from the southeast Brazilian coast. Cytologia, 72: 95-99.
Sena, D. C. S., Molina, W. F. (2007a) Chromosomal rearrangements associated with
pelagic larval duration in Labridae (Perciformes). Journal of Experimental Marine
Biology and Ecology 353: 203–210.
Sena, D. C. S., Molina, W. F. (2007b) Robertsonian rearrangements and pericentric
inversions in Scaridae fish (Perciformes). Genetics and Molecular Research, 6: 75-
580.
Sites, J. W., Moritz, C. (1987). Chromosome evolution and speciation revisited.
Systematic Zoology, 36: 153-174.
50
Sola, L., Cipelli, O., Gornung, E., Rossi, A. R., Andaloro, F., Crosetti, D. (1997).
Cytogenetic characterization of the greater amberjack, Seriola dumerili (Pisces:
Carangidae), by different staining techniques and fluorescence in situ
hybridization. Marine Biology, 128: 573-577.
Sola, L., De Innocentiis, S., Gornung, E., Papalia, S., Rossi, A. R., Marino, G., De Marco,
P., Cataudella, S. (2000). Cytogenetic analysis of Epinephelus marginatus (Pisces:
Serranidae), with the chromosome localization of the 18S and 5S rRNA genes and
of the (TTAGGG)n telomeric sequence. Marine Biology, 137: 47–51.
Springer, V. G., Smith-Vaniz, W. P. (2008). Supraneural and pterygiophore insertion
patterns in carangid fishes, with description of a new Eocene carangid tribe
+Paratrachinotini, and a survey of anterior anal-fin pterygiophore insertion
patterns in Acanthomorpha. Bulletin of the Biological Society of Washington, 16:
1-73.
Sumner, A. T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304.
Suzuki, A., Taki, Y., Takeda, M., Akatsu, S. (1988). Multiple sex chromosomes in a
Monodactylid fish. Ichthyological Research, 35: 198-101.
Tagliavini, J., Williot, P., Congiu, L., Chicca, M., Lanfredi, M., Rossi, R., Fontana, F.
(1999). Molecular cytogenetic analysis of the karyotype of the European Atlantic
sturgeon, Acipenser sturio. Heredity, 83: 520–525.
Thode, G., Martínez, G., Ruiz J. L., Lopéz, J. R. (1988). A complex chromosomal
polymorphism in Gobius fallax (Gobiidae, Perciformes). Genetica, 76: 65-71.
Ueno, K., Takai, A. (2008). Multiple sex chromosome system of X1X1X2X2/X1X2Y type in
lutjanid fish, Lutjanus quinquelineatus (Perciformes). Genetica, 132: 35–41.
51
5. CONCLUSÕES
Os Scombridae analisados apresentaram conservadorismo quanto ao número
cromossômico basal dos Perciformes e de outras características estruturais do
cariótipo (padrões heterocromáticos, sítios ribossomais DNAr 5S e 18S)
consideradas ancestrais para os representantes desta Ordem.
Foram idendificadas para os Scombridae estudados duas estruturas
cariotípicas diferenciadas, que coincidem com estudos sistemáticos
morfológicos. Um padrão formado por A. solandri e S. brasiliensis, e outro pelas
espécies de Thunnus, evidenciando poucos macrorrearranjos cromossômicos
durante a evolução do grupo, mas conspicuamente aplicáveis como
marcadores citotaxonômicos ou filogenéticos.
O conservadorismo cariotípico em Scombridae é apoiado por evidências de
possíveis cromossomos homeólogos portadores de sítios ribossomais
AgRONs/DNAr 18S e DNAr 5S intergenérico nas quatro espécies de Scombridae
analisados.
Inversões pericêntricas se destacam como o principal mecanismo envolvido nas
modificações cromossômicas responsável pela diferenciação da macroestrutura
cariotípica dos Scombridae.
O mapeamento de genes ribossomais 5S e 18S em Scombridae e
Coryphaenidae demonstram localização não sintênica.
Os sexos homogaméticos de Coryphaena equiselis e C. hippurus demonstraram
mesmo número diploide com diferenças estruturais aparentemente
decorrentes de inversões pericêntricas o mecanismo de diversificação
cariotípica mais comum em Perciformes. Os padrões cromossômicos permitem
clara distinção entre as espécies.
O mapeamento cromossômico das sequências DNAr 18S e 5S apresentaram
baixa dinâmica evolutiva entre as espécies da família Coryphaenidae onde as
marcações foram localizadas na mesma região em cromossomos homeólogos.
A espécie Coryphaena equiselis mostrou-se portadora de heteromorfismo
cromossômico, relacionado a presença de um sistema cromossômico sexual
múltiplo do tipo X1X1X2X2/X1X2Y, no qual o cromossomo neo-Y presente nos
52
representantes machos deve ter origem da fusão cêntrica de dois autossomos
acrocêntricos.
Os padrões cariotípicos dos peixes pelágicos aqui estudados parecem apoiar a
hipótese de marcado conservadorismo cromossômico associada ao potencial
dispersivo das espécies, condição que se apresenta marcadamente variável em
peixes recifais. Apesar de alguma divergência quanto ao padrão basal da
Ordem Perciformes, os cariótipos mostram macroestrutura conservada entre
espécies de mesmo gênero.
53
6. REFERÊNCIAS
Almeida-Toledo, L. F. (1998). Cytogenetic markers in neotropical freshwater fishes. In:
Malabarba, L. R.; Reis, R. E.; Vari, R. P.; Lucena, Z. M.; Lucena, C. A. S. Phylogeny
and classification of neotropical fishes, EDIPUCRS. Porto Alegre, 583-588.
Almeida-Toledo, L. F., Foresti, F. (2001). Morphologically differentiated sex
chromosomes in neotropical freshwater fish. Genetica, 111: 91-100.
Arai, R. (2011). Fish karyotypes: A check list. Tokyo: Springer, 280p.
Artoni, R. F., Vicari, M. R., Bertollo, L. A. (2000). Neotropical fish cytogenetics:
methods, results and perspectives. Biological and Health Sciences, 6(1): 43-60.
Asahida, T., Ida, H. (1995). Hayashizaki, K. Karyotypes and Cellular DNA Contents of
Some Sharks in the Order Carcharhiniformes. Japanese Journal of Ichthyology,
42: 21-26.
Avise, J. C. (2000). Phylogeography: The history and formation of species. Harvard
University Press, Cambridge, 447p.
Bahri-Sfar, L., Lemaire, C., Hassine, B. O. K., Bonhomme, F. (2000). Fragmentation of
sea bass populations in the western and eastern Mediterranean as revealed by
microsatellite polymorphism. Proceedings of the Royal Society of London Series
B. Biological Sciences, 267: 929-935.
Benetti, D., Iverson, E. Ostrowski, A. (1995). Growth rates of captive dolphin,
Coryphaena hippurus, in Hawaii. Fishery Bulletin, 93(1): 152-157.
Block, A. B., Finnerty, J. R., Stewart, A F. R., Kidd, J. (1993). Evolution of Endothermy in
fish: mapping physiological traits on a molecular phylogeny. Science, 260: 210-
214.
Brum, M. J. I. (1996). Cytogenetic studies of Brazilian marine fish. Brazilian Journal of
Genetics, 19(3): 421-427.
Campos, J. A., Segura, A., Lizano, O., Madrigal, E. (1993). Ecologia básica de
Coryphaenidae hippurus (Pisces: Coryphaenidae) y abundancia de otros grandes
pelágicos em el Pacifico de Costa Rica. Revista Biologia tropical 41(3): 783-790.
54
Carpenter, K. E. (2002). The living marine resources of the Western Central Atlantic.
The livingmarine resources of theWestern Central Atlantic. Volume 3: Bony fishes
part 2 (Opistognathidae to Molidae), sea turtles and marine mammals. FAO
Species Identification Guide for Fishery Purposes and American Society of
Ichthyologists and Herpetologists Special Publication No. 5. Rome, Food and
Agriculture Organization of the United Nations, 1375-2127.
Carvalho, R., Soares Filho, W. S., Brasileiro-Vidal, A. C., Guerra, M. (2005). The
relationships among lemons, limes and citron: A chromosomal comparison.
Cytogenetic Genome Research, 109: 276-282.
Carvalho-Costa, L. F., Hatanaka, T., Galetti Jr., P. M. (2008). Evidence of lack of
population substructuring in the Brazilian freshwather fish Prochilodus costatus.
Genetics and Molecular Biology, 31: 377-380.
Castello, J. P. (2007). Gestão sustentável dos recursos pesqueiros, isto é realmente
possível? Pan-American Journal of Aquatic Sciences, 2(1): 47–52.
Christ, A., Toth, G. P., Mccarthy, H. W., Torsella, J. A., Smith, M. K. (1996). Monthly
variation in sperm motility in common carp assessed using computer-assisted
sperm analysis (CASA). Journal of Fish Biology, 48(6): 1210–1222.
Clark, T. D., Rummer, J. L., Sepulveda, C. A., Farrell, A. P., Brauner, C. J. (2009). Reduced
and reversed temperature dependence of blood oxygenation in an ectothermic
scombrid fish: implications for the evolution of regional heterothermy? Journal
of Comparative Physiology B, 180: 73–82.
Collette, B. B. (1986). Coryphaenidae. Fishes of the North-Eastern Atlantic and the
Mediterranean, II (Whitehead P. J . P. , Bauchot M.-L., Hureau J.-C., Nielsen J. &
E. Tortonese, eds), Paris: Unesco, 845-846.
Collette, B. B., Nauen, C. E. (1983). FAO species, catalogue. Vol. 2. Scombrids of the
world. An annotated and illustrated catalogue of tunas, mackerels, bonitos and
related species known to date. FAO Fisheries Synopsis, 2:137.
Cross, I; Merlo, A., Machado, M., Infante, C., Cañavate, J. P., Rebordinos, L. (2006).
Cytogenetic characterization of the sole Solea senegalensis (Teleostei:
Pleuronectiformes: Soleidae): Ag-NOR, (GATA)n, (TTAGGG)n and ribosomal genes
by one-color and two-color FISH. Genetica, 128: 253-259.
55
Cuvier, G.; Valenciennes, A. (1832). Des Scombéroïdes. Tome huitième. Livre
neuvième, Histoire Naturelle Des Poissons, 8: 1-509.
Devlin, R. H., Nagahama, Y. (2002). Sex determination and sex differentiation in fish:
An overview of genetic, physiological, and environmental influences.
Aquaculture, 208:191-364.
FAO. (2010). The State of World Fisheries and Aquaculture - SOFIA. Disponível em
<http: www.fao.org> Acesso em: 20/03/2012.
Feldberg, E., Porto, J. I. R., Bertollo, L. A. C. (2003). Chromosomal changes and
adaptation of cichlid fishes during evolution. A. L. Val and B.G. Kapoor (eds.), Fish
Adaptation. Science Publishers, Inc, Enfield – NH, USA, 285-308.
Fromentin, J. M., Ravier C. (2005). The East Atlantic and Mediterranean bluefin tuna
stock: looking for sustainability in a context of large uncertainties and strong
political pressures. Bulletin of Marine Science, 76: 353-362.
Galetti Jr., P. M., Aguilar, C. T., Molina, W. F. (2000). An overview on marine fish
cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55.62.
Garcia Jr, J. (2006). Inventário das espécies de peixes da costa do Estado do Rio Grande
do Norte e aspectos zoogeográficos da ictiofauna recifal do Oceano Atlântico.
Natal, Departamento de Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Biociências, 125p.
Gibbs, R. H., Collette, B. B. (1959). On the identification, distribution, and biology of the
dolphins, Coryphaena hippurus and C. equiselis. Bulletin of Marine Science of the
Gulf Caribbean, 9: 117-152.
Gold, J. R.; Lee, C.; Shipley, N. S.; Powers, P. K. (1990). Improved methods for working
with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding.
Journal of Fish Biology, 37: 563-575.
Gordeeva, N. V. (2010). On structure of species in pelagic fish: the results of
populational - Genetic analysis of four species of lanternfish (Myctophidae) from
the Southern Atlantic. Journal of Ichthyology, 51(2): 152-165.
Graves J. E. (1996). Conservation genetics of fishes in the pelagic marine realm. In:
Avise JC, Hamrick JL (eds.), Conservation Genetics: Case Histories from Nature.
Chapman & Hall, New York, 335-366.
56
Hatanaka, T., Galetti Jr., P. M. (2004). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes
in the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes,
Prochilodontidae). Genetica, 122: 239-244.
Hazin, F. H. V. , Lessa, R. P. T., Coimbra, M. R., Souza, R. C., Arraes, R., Pantoja Jr, P. S.,
Matsui, N. (1994). Distribution and relative abundance of tunas and billfishes in
the southwestern equatorial Atlantic. Iccat Collective Volume Of Scientific
Papers, Madri, 41(1): 309-324.
Howell, W. M., Black, D. A. (1980). Controlled Silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developper a 1-step method. Experientia, 36:
1014-1015.
Ida, H., Murofushi M., Fujiwara S., Fujino K. (1978). Preparation of fish chromossomes
by in vitro colchicine treatment. Japan. Journal of Ichthyology, 24: 281-284.
Ida, H., Oka, N., Terashima, H., Hayashizaki, K. I. (1993). Karyotypes and cellular DNA
contents of three species of family Scombridae from Japan. Nippon Suisan
Gakkaishi, 50(8): 1319-1323.
Jacobina U. P., Cioffi M. B., Souza L. G. R., Calado, L. C., Tavares M., Mazella-Jr, J.,
Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2011). Chromosome mapping of repetitive
sequences in Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae): implications
for karyotypic evolution and perspectives for biotechnological uses. Journal of
Biomedicine and Biotechnology, 2011: 218-231.
Jorgensen, H. B. H., Hansen, M. M., Bekkevold D., Ruzzante, D. E., Loeschcke, V. (2005).
Marine landscapes and population genetic structure of herring (Clupea harengus
L.) in the Baltic Sea. Molecular. Ecology, 14(10): 3219–3234.
Kasahara, S. (2009). Introdução à pesquisa citogenética de vertebrados. Ribeirão Preto,
SP. Sociedade Brasileira de Genética, 1: 160.
Kitano, J., Peichel, C. L. (2011). Turnover of sex chromosomes and speciation in fishes.
Environmental Biology of Fishes. DOI: 10.1007/s10641-011-9853-8. (Online).
Kraul, S. (1989). Review and current status of the aqua cultur e potential for the
mahimahi, Coryphaena hippurus. Advances in tropical aquaculture, Tahiti.
AQUACOP, IFREMER. Actes Colloq., 9: 445-459.
57
Lee, M. H., Loh, P. C. (1975). Some properties of an established fish cell line from the
marine fish, Caranx mate (Omaka). Proceedings of the Society for Experimental.
Biology and Medicine, 150: 40-48.
Lee, C. S., Ostrowski, A. C. (2001). Current status of marine finfish larviculture in the
United States. Aquaculture 200(1–2): 89–109.
Lee, R. E. K. D., (1957). Report to the government of Brazil on tuna fishery
development (northeastern cost of Brazil). Roma: FAO Rep., 739: 53.
Levan, A., Fredga, K., Sandberg A. (1964). Nomenclature for centromeric position on
chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
Lins, J. E. (2011). Implicações socioeconômicas e ambientais da atividade pesqueira no
Nordeste do Brasil. 3º Congresso Brasileiro de Biologia
Marinha: programação, resumos das palestras, mesas-redondas e painéis
institucionais, 82-83.
Mank, J. E., Promislow, D. E. L., Avise, J. C. (2006). Evolution of alternative sex-
determining mechanisms in teleost fishes. Biol. J. Linn. Soc., 87: 83–93.
Martins, C., Galetti Jr., P. M. (1999). Chromosomal localization of 5S rRNA genes
in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, 7: 363-
367.
McLean, J. E., Hay, D. E., Taylor, E. B. (1999). Marine population structure in an
anadromous fish: life-history influences patterns of mitochondrial DNA variation
in the eulachon, Thaleichthys pacificus. Molecular Ecology, 8, 143-148.
Mendes, A. (2011). Parceria pode dar novo fôlego às vendas de atum. Disponível em
<http://tribunadonorte.com.br/noticia/parceria-pode-dar-novo-folego-as-
vendas-de-atum/183344> Acesso em: 20/03/2012.
Molina, W. F. (2007). Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In: Fish
cytogenetics (Pisano, E., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Kapoor, B.G. eds.). Science
Publishers, Enfield, 69-110.
Moorhead P. S.; Nowell P. C.; Mellmam W. J.; Battips D. M.; Hungerford D. A. (1960).
Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood.
Experimental Cell Research, 20: 613-616.
58
Motta-Neto, C. C., Cioffi, M. B., Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2011). Extensive
chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of
the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and
Ecology, 401: 75–79.
Nelson, J. S. (2006). Fishes of the World. 4 ed. New York: John Wiley an Dons Inc.,
624p.
Oliveira, R. B. A. (2009). Qualidade de atuns tipo exportação capturados pelo espinhel
pelágico no litoral de Pernambuco e Rio Grande do Norte, Brasil. Recife,
Departamento de Ciências Domésticas, UFRPE, 107p. (Dissertação).
O'Toole, B. (2002). Phylogeny of the species of the superfamily Echenoidea
(Perciformes: Carangoidei: Echeneidae, Rachycentridae, and Coryphaenidae),
with an interpretation of echeneid hitchhiking behaviour. Canadian Journal of
Zoology, 80: 596-623.
Oxenford, H. A. (1999). Biology of the dolphinfish (Coryphaena hippurus) in the
western central Atlantic: A review. Sci. Mar., 63(3-4): 277-301.
Oxenford, H. A., Hunte, W. (1986). A preliminary investigation of the stock structure of
the dolphin, Coryphaena hippurus, in the western central Atlantic. Fishery
Bulletin, 84(2): 451-460.
Palko, B. J., Beardsley, G. L., Richards, W. J. (1982). Synopsis of the biological data on
dolphin-fishes, Coryphaena hippurus Linnaeus and Coryphaena equiselis
Linnaeus. FAO Fisheries Synopsis Rep (130); NOAA Tech. Rep. NMFS Circ., (443):
28p.
Palumbi, S. R. (1994). Genetic divergence, reproductive isolation, and marine
speciation. Annual Review of Ecology and Systematics, 25, 547-572.
Pinkel, D.; Straume, T.; Gray, J. W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-
sensivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 83: 2934-2938.
Porch, C. E. (2005). The sustainability of Western Atlantic bluefin tuna: A warm
blooded fish in a hot blooded fishery. Bulletin of Marine Science, 76: 363-384.
59
Post, A. (1974). Ergebnisse der Forschungsreisen des FFS “Walther Herwig” nach
Sudamerika. XXXIV. Die Chromosomen von drei Arten aus der Familie
Gonostomatidae(Osteichthyes, Stomiatoidei). Arch. FischWiss., 25: 51-55.
Prescod, S., Hunte, W. (1997). A preliminary reporto n the feasibility of farming
dolphinfish (Coryphaena hippurus) on the northwest coast of Barbados, W.I.
(Abstract only) Proc. Gulf Caribb. Fish. Inst., 49: 52.
Rocha, L. A. (2003). Patterns of distribution and processes of speciation in Brazilian
reef fishes. Journal of Biogeography, 30: 1161-1171.
Rodrigues, M. M., Baroni, S., Almeida-Toledo, L. F. (2007). Karyological characterization
of four marine fish species, genera Trachinotus and Selene (Perciformes:
Carangidae), from the southeast Brazilian coast. Cytologia, 72: 95-99.
Safina, C. (1996). Thunnus thynnus (Eastern Atlantic stock). In: IUCN 2010. IUCN Red
List of Threatened Species. Disponível em <www.iucnredlist.org.> Acesso em:
29/06/2010.
Seafood Watch (2007). Mahi Mahi (Dolphinfish) Coryphaena hippurus. Jesse Marsh and
Robert Mazurek. Fisheries Research Analysts. Monterey Bay Aquarium, p. 53.
Schekter, R. C. (1982). Mariculture of dolphin Coryphaena hippurus: Is it feasible? Proc.
Gulf & Caribbean Fisheries Institute, 35th annual session, 27-32.
Shadwick, R. E.; Syme, D. A. (2008). Thunniform swimming: muscle dynamics and
mechanical power production of aerobic fibres in yellowfin tuna (Thunnus
albacares). The Journal of Experimental Biology, 211: 1603-1611.
Springer, V. G., Smith-Vaniz, W. P. (2008). Supraneural and pterygiophore insertion
patterns in carangid fishes, with description of a new Eocene carangid tribe
+Paratrachinotini, and a survey of anterior anal-fin pterygiophore insertion
patterns in Acanthomorpha. Bulletin of the Biological Society of Washington, 16:
1-73.
Sumner, A T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304-306.
Szpilman, M. (2000). Peixes marinhos do Brasil: guia prático de identificação. Rio de
Janeiro, 288p.
60
Uriber-Alcocer, M., VAldés-Morales, N., Diaz-Jaimes, P., Hornelas-Orozco, Y., Arenas, V.
(1996). Comparación de los Cariótipos de lãs poblaciones dentral y sureña de La
anchoveta Engraulis mordax, Girard 1854 (Engraulidae, Pises). Ciências Marinas,
22 (3): 361-376.
Volff, J. N., Nanda, I., Schmid, M., Schartl, M. (2007). Governing sex determination in
fish:regulatory putsches and ephemeral dictators. Sex Dev, 1(2): 85-99.
Volpe, J. (2005). Dollars without sense: The bait for big-money tuna ranching around
the world. BioScience, 55(4): 301-302.
Zardoya, R., Castilho, R., Grande, C., Favre-Krey, L., Caetano, S., Marcato, S., Krey, G.,
Patarnello, T. (2004). Differential population structuring of two closely related
fish species, the mackerel (Scomber scombrus) and the chub mackerel (Scomber
japonicus), in the Mediterranean Sea. Molecular Ecology, 13: 1785-1798.
Zhou, G. Z., Gui, L., Li, Z. Q., Yuan, X. P., Zhang, Q. Y. (2008). Establishment of a Chinese
sturgeon Acipenser sinensis tail-fin cell line and its susceptibility to frog iridovirus.
Journal of Fish Biology, 73: 2058–2067.
