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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
PATRÍCIA GUERRA PEIXE GONÇALVES
Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina na Doença Periodontal
Natal/RN
2016
PATRÍCIA GUERRA PEIXE GONÇALVES
Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina na Doença Periodontal
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Patologia Oral. Orientador: Prof. Dr. Bruno Cesar de Vasconcelos Gurgel.
Natal/RN
2016
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Gonçalves, Patrícia Guerra Peixe. Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina na Doença Periodontal / Patrícia Guerra Peixe Gonçalves. – Natal, RN, 2016. 56 f.: il.
Orientador: Profº. Drº. Bruno Cesar de Vasconcelos Gurgel. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Doenças periodontais– Dissertação. 2. CD34 – Dissertação. 3.
Podoplanina – Dissertação. 4. Angiogênese – Dissertação. 5. Linfangiogênese. – Dissertação. I.Gurgel, Bruno Cesar de Vasconcelos II. Título. RN/UF/BSO Black D64
“Deves saber que foste criado para
ascensão, mas que só é fácil descer.
Subir exige trabalho, paciência,
perseverança, condições essenciais para
o encontro do amor e da sabedoria.”
André Luiz (Psicografado por Chico Xavier)
Agradecimentos
Agradeço a Deus e aos espíritos amigos por mais esta oportunidade de
crescimento profissional e amadurecimento. Agradeço a Deus por esta família que
colocou no meu caminho, me dando tanto carinho, amor, me enchendo de cuidados,
e que me incentiva em todos os meus projetos de vida.
À Luiza Moreira Gonçalves, minha mãe do coração, que é o motor da família.
Sempre com palavras e gestos motivadores, me faz caminhar sempre para o
progresso. Sempre fazendo tudo por mim, pela Raphaela e por todos.
Ao Luiz Roberto Loureiro Gonçalves, meu pai do coração. Agradeço por toda
preocupação e palavras de incentivo, pois sei que todas as suas atitudes e palavras
são com o intuito de me fazer alcançar degraus mais altos na vida.
À Raphaela Guerra Peixe Gonçalves, sei que estas palavras só chegarão ao
seu conhecimento quando tiver mais madura. Filha, você é a luz da minha vida. Por
vezes é minha bússola, meu norte. Apesar dos seus 4 anos, já me faz aprender
tanto com seu jeito meigo, carinhoso e amoroso, com suas frases que por vezes não
são compatíveis com a idade, que me fazem repensar e aprender contigo todos os
dias. Te amo minha linda flor do meu jardim. Minha linda margarida.
Ao Raphael Moreira Gonçalves. Sabe que se estou completando e
conquistando mais esta vitória na minha vida é porque você me ajudou a chegar
aqui. Sempre preocupado comigo, querendo o melhor e incentivando para sempre
crescer. Falar “muito obrigada”, não expressa tamanha gratidão que tenho por você.
À Roberta Guerra Peixe. Minha referencia de família de sangue, com
memórias intensas, principalmente das músicas que cantávamos, dos longos áudios
atuais de conversas, encurtando distâncias que sempre foram evidentes em nossas
vidas. Amo-te irmã. Obrigada pela torcida, pela amizade, pelo amor e pelos
conhecimentos farmacêuticos.
Sempre digo que foi uma benção de Deus voltar aos estudos. Lecionar foi
uma descoberta muito gratificante e a equipe pedagógica do SENAC/RN me ajudou
muito neste primeiro contato com a arte de ser professor. Passar na seleção do
mestrado foi ter o direito ao passe para esta profissão tão admirada por mim.
Agradeço imensamente a todos os professores do programa de pós-graduação em
patologia oral da UFRN, da clínica de estomatologia, das disciplinas de bioestatística
e bioestatística aplicada, da disciplina de metodologia do ensino superior e do Curso
de Iniciação à Docência. Cada um, com suas características específicas, passou
uma face do amor que tem pela odontologia e por lecionar. Deixo aqui o meu “muito
obrigado” aos professores: Prof. Dra. Lélia Batista de Souza, Prof. Dra. Lélia Maria
Guedes Queiroz, Prof. Dra. Ana Miryan Costa de Medeiros, Prof. Dr. Ângelo
Giuseppe Roncalli da Costa Oliveira, Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Prof.
Dr. Carlos Augusto Galvão Barbosa, Prof. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira,
Prof. Dra. Erika dos Reis Gusmão Andrade, Prof. Dra. Hebel Cavalcanti Galvão,
Prof. Dr. José Diniz Junior, Prof. Dr. Kênio Costa Lima, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto,
Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Prof. Dra. Patrícia Teixeira de Oliveira,
Prof. Dra. Roseana de Almeida Freitas e Prof. Dra. Rosiane Viana Zuza Diniz.
De uma forma especial quero agradecer ao Prof. Dr. Bruno Cesar de
Vasconcelos Gurgel por me orientar de forma humana, por sempre me apoiar e
ajudar com os projetos. Quero parabenizá-lo pela competência. Professor, o senhor
é um exemplo a ser seguido. Que Deus ilumine seus caminhos e abençoe sua
família.
Além da equipe acima citada, não posso deixar de agradecer aos funcionários
que sempre me auxiliaram ao longo desses dois anos. Equipe que compartilhei
conversas animadas e sorrisos largos. Obrigada Graça Maia, Maria de Lourdes
Maciel, Idelzuíte Bezerra de Souza, Sandovânia Maria de Oliveira, Ricardo Kleiber
de Lima Silva, Hévio Lucena, Patrícia Barroca de Medeiros Costa, Joana D`arc
Fonseca, Kátia Cristina Lourenço Silva de Oliveira, Cecília Isabel dos Santos,
Hadassa Danielle da Silva Bulhões, Mônica Karina Santos Reis, Mateus Carvalho de
Lima, Juliana Miranda Felix, Jaqueline Tavares da Silva, Jéssica Souza Martins,
Ossean Fernandes da Costa.
Aos meus amigos de jornada, tenho muito que agradecer e admirar. Além de
competentes, humanos e com características inerentes as suas personalidades, que
ficarão para sempre em minha memória. Sinto-me acolhida nesta família patológica,
pois me ajudaram em diversos momentos e compartilhamos de inúmeras fases e
acontecimentos. Vocês estarão sempre em minha memória. Muito obrigada Amanda
Katarinny Goes Gonzaga, Ana Luiza Dias Leite de Andrade, Andréia Ferreira do
Carmo, Angélica Lopes Cordeiro Mandú, Clarissa Favero Demeda, Denise Helen I.
P. Oliveira, Eduardo Alonso Cruz Monroy, Fernanda Gianini Antunes, Francisco
Jadson Lima, Hugo Costa Neto, Jamile Marinho Bezerra da Silva, Jefferson da
Costa Tenório, Laudenice de Lucena Pereira, Laura Priscila Barbosa de Carvalho,
Leorik Pereira da Silva, Luciana Eloisa da Silva Castro, Luiz Arthur Barbosa da Silva,
Mara Luana Batista Severo, Marcelo Anderson Barbosa Nascimento, Maria Luiza
Diniz de Souza Lopes, Marianna Sampaio Serpa, Melka Coêlho Sá, Natália
Guimarães Barbosa, Rafaella Bastos Leite, Rodrigo Propino Mafra, Roseane
Carvalho Vasconcelos, Salomão Israel Monteiro Lourenço Queiroz, Thalita Santana
Conceição, Tiago João da Silva Filho, Vilson Lacerda Brasileiro Junior e Viviane
Alves de Oliveira Maia.
Agradeço a Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte -
FAPERN, pelos auxílios financeiros que possibilitaram a realização deste trabalho.
Resumo
RESUMO
A inflamação gengival decorrente da colonização por microrganismos
periodontopatogênicos associada à resposta do hospedeiro, gera eventos
imunológicos e vasculares, em virtude da liberação e atuação de mediadores
inflamatórios. Dentro desta perspectiva, este estudo teve por objetivo avaliar a
angiogênese e linfangiogênese em 90 espécimes de biópsias de tecido gengival
clinicamente saudável, com gengivite e com periodontite crônica. Os cortes
histológicos foram avaliados em sua morfologia pela coloração de hematoxilina e
eosina, e pela técnica de imunoistoquímica através da imunomarcação de CD34 e
podoplanina, para avaliar, respectivamente, a contagem microvascular de vasos
sanguíneos e linfáticos. Os resultados mostraram que há correlação entre a
contagem microvascular de vasos sanguíneos e linfáticos (p=0,03), porém, mostrou
que na periodontite crônica há menos números de vasos linfáticos do que no tecido
gengival clinicamente saudável (p=0,01). A podoplanina mostrou marcação no
epitélio presente e a intensidade de marcação está relacionada positivamente com a
intensidade do infiltrado inflamatório (p=0,03). Concluiu-se neste estudo que não foi
observado aumento do número de vasos sanguíneos e linfáticos com o aumento da
gravidade da doença periodontal. A podoplanina encontra-se mais expressa
associada a um maior infiltrado inflamatório, provavelmente tendo outra função na
doença periodontal, e não somente como marcador da linfangiogênese. As
sinalizações presentes no processo inflamatório, bem como o real papel da
vasculatura sanguínea e linfática gengival ainda não estão totalmente elucidadas.
Palavras-chaves: Doenças Periodontais. Angiogênese. CD34. Linfangiogênese.
Podoplanina.
Abstract
ABSTRACT
Angiogenesis and lymphangiogenesis are changes that occur due to gingival
inflammation caused by microorganisms present in the biofilm, as well as the
migration of immune cells and secretion of mediators in the aggressed site. This
study aimed to research angiogenesis and lymphangiogenesis in 90 specimens of
clinically healthy, with gingivitis and chronic periodontitis gingival tissue biopsies. The
histological sections were evaluated by hematoxylin and eosin and the
immunohistochemical technique through immunostaining for CD34 and podoplanin.
To evaluate the angiogenic and lymphangiogenic indexes we performed a
microvessel counting technique. The results showed that there is a correlation
between the indexes (p = 0.030), however, we observed that periodontitis showed
less lymphatic vessels than clinically healthy gingival tissue (p = 0.016). Podoplanin
showed positive staining in the basal layers of the epithelium, and we observed a
relationship between immunostaining intensity and the intensity of inflammatory
infiltrate, with more intense staining in the presence of severe inflammatory infiltrate
(p = 0.033). For this study, we concluded that there are fewer blood vessels in
periodontitis compared with clinically healthy gingiva. The signaling present in the
inflammatory process and the actual role of gingival blood and lymphatic vasculature
are not fully understood, with further studies on angiogenesis and lymphangiogenesis
being suggested.
Keywords: Periodontal Diseases. Angiogênesis. CD34. Lymphangiogenesis.
Podoplanin.
Lista de Ilustrações
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Imunopositividade para os marcadores CD34 e Podoplanina.
35
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação do diagnóstico clínico com a idade. Natal, RN. 2016.
33
Tabela 2. Associação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e o
diagnóstico clínico. Natal, RN. 2016.
34
Tabela 3. Relação da contagem microvascular de vasos sanguíneos e
linfáticos com o diagnóstico clínico. Natal, RN. 2016.
36
Tabela 4. Relação da marcação da podoplanina no epitélio com o
diagnóstico clínico e a intensidade do infiltrado inflamatório.
Natal, RN. 2016.
36
Lista de Abreviaturas e Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANG: Angiopoietina.
CEP/UFRN: Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
CMV: Contagem microvascular.
DAB: Solução de di-aminobenzida.
DC: Diagnóstico Clínico.
EUA: Estados Unidos da América.
FGF-2: Do inglês fibroblast growth fator - 2, traduzido como fator de crescimento
fibroblástico - 2.
G: Gengivite.
H/E: Hematoxilina e Eosina.
HGF: Do inglês Hepatocyte Growth Factor, traduzido como fator de crescimento de
hepatócitos.
ICAM: Do Inglês intercellular adhesion molecule-1, traduzido como molécula de
adesão intercelular.
IGF: Do inglês insulin-like growth factor, traduzido como fator de crescimento
semelhante à insulina.
IL1β: Interleucina 1 beta.
IL4: Interleucina 4.
IL8 : Interleucina 8.
IL13: Interleucina 13.
IMAGEJ: Do inglês Image Processing and Analisis in Java, traduzido como análise e
processamento em Java.
JAM: Do inglês juntional adhesion molecule, traduzido como molécula de adesão
juncional.
LYVE-1: Do inglês lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 traduzido
como receptor hialurônico de endotélio vascular linfático-1.
MMP: Metaloproteinase da matriz.
n: Número.
NF-KB: Do inglês nuclear factor kappa, traduzido como fator nuclear kappa beta.
NOS: Óxido nítrico sintaxe.
P: Periodontite.
PDGFB: Do inglês platelet-derived growth fator, traduzido como fator de crescimento
plaquetário B.
PROX-1: Do inglês homeobox-1 transcription fator, traduzido para fator de
transcrição homeobox-1.
Q25: Quartil 25.
Q75: Quartil 75.
r: Correlação.
RN: Estado do Rio Grande do Norte.
S: Saudável.
SOX-8: SRY (Sex Determining Region Y)-Box 8.
SPSS: Do inglês Statistical Package for the Social Sciences, traduzido como pacote
estatístico para a sociedade científica.
TCLE: Termo de Consentimento Livre Esclarecido.
TNF: Do inglês tumor necrosis fator, traduzido como fator de necrose tumoral.
TRIS: Tris-hidroximetil-aminometano.
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
USA: United States of America.
VCAM: Do inglês vascular cell adhesion molecule, traduzido como molécula de
adesão vascular.
VEGF: Do inglês vascular endotelial growth factor, traduzido como fator de
crescimento endotelial vascular.
VEGFR3: Do inglês vascular endothelial growth factor receptor-3, traduzido para
receptor do fator de crescimento endotelial vascular 3.
Máx.: Máximo.
Med: Mediana.
Mín.: Mínimo.
mm: Milímetro
μm: Micrômetro.
%: Percentagem.
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ____________________________________________ 22
2 MATERIAIS E MÉTODOS __________________________________ 26
2.1 IMPLICAÇÕES ÉTICAS _____________________________________ 27
2.2 TIPO DE ESTUDO _________________________________________ 27
2.3 POPULAÇÃO _____________________________________________ 27
2.4 AMOSTRA _______________________________________________ 27
2.4.1 Critérios para seleção da amostra ___________________________ 28
2.4.1.1 Critérios de inclusão ______________________________________ 28
2.4.1.2 Critérios de exclusão ______________________________________ 28
2.5 ESTUDO MORFOLÓGICO __________________________________ 28
2.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO ______________________________ 29
2.7 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO_____________________ 29
2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA _____________________________________ 30
3 RESULTADOS ____________________________________________ 32
4 DISCUSSÃO ____________________________________________ 37
5 CONCLUSÃO _____________________________________________ 43
REFERÊNCIAS ___________________________________________ 45
APÊNDICE _______________________________________________ 49
ANEXO __________________________________________________ 52
Introdução
23
1 INTRODUÇÃO
A angiogênese e a linfangiogênese são eventos vasculares que ocorrem na
inflamação gengival dada à liberação de subprodutos provenientes de
microrganismos presentes no biofilme dentário, bem como da migração de células
de defesa e secreção de mediadores inflamatórios no local da agressão.
(KASPRZAK et al., 2013; BERSGGREEN; WIIG, 2014; GONZALES, 2015).
A angiogênese é regulada através de uma interação complexa de sinais
moleculares mediados por fatores de crescimento que envolve a remodelação da
matriz extracelular, migração de células endoteliais e a proliferação, diferenciação e
anastomose capilar (ADAMS; ALITALO, 2007).
Estímulos angiogênicos são modulados por citocinas e fatores de
crescimento, tais como interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 8 (IL-8),
metaloproteinases da matriz (MMP 2 e 9), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),
fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C E VEGF-
D), fator de crescimento fibroblástico (FGF-2), angiopoietinas (ANG 1) e fator de
crescimento plaquetário B (PDGFB) (ADAMS; ALITALO, 2007; KASPRZAK et al.,
2012, 2013).
Através destes estímulos, o endotélio vascular sanguíneo expressa
moléculas de adesão, como por exemplo, CD105, CD31, CD34, neuropilina,
molécula de adesão intercelular (ICAM), molécula de adesão celular vascular
(VCAM-1), moléculas de adesão juncional 3 (JAM-3) e E-selectina. (ADAMS;
ALITALO, 2007; UEKI et al., 2008; KASPRZAK et al., 2013; CIMPEAN; RAICA,
2015).
O CD 34 é uma glicoproteína transmembrana, agrupada na família CD34 e é
da subfamília das sialomucinas. É expressa em células-tronco hematopoiéticas, no
endotélio vascular de pequenos vasos, em algumas linhagens de células
neoplásicas. Liga-se à L-selectina presente na maioria dos leucócitos, auxiliando
na fase de adesão e rolamento dos leucócitos, é expressa ao longo do
estabelecimento da inflamação e durante o reparo, sendo por este motivo utilizada
como marcador angiogênico (KASPRZAK et al., 2013).
Alguns fatores de crescimento que induzem o processo de angiogênese,
como o VEGF, também geram estímulo para a linfangiogênese, outros são
liberados por ceratinócitos e células imunes. A rede linfática atua no processo
24
inflamatório com a função de drenar o excesso de fluido extracelular do leito capilar
para retornar à circulação sanguínea e capturar antígenos para apresentação ao
sistema imune no compartimento linfóide (por exemplo, nos nódulos linfáticos)
(MOUTA; HEROULT, 2003).
O sistema linfático passa por alterações durante a inflamação, tanto na
ampliação do calibre dos vasos, como na formação de novos vasos a partir dos
pré-existentes. As alterações nos vasos linfáticos são estimuladas por citocinas e
fatores de crescimento, que podem ter ação pró-linfangiogênica ou anti-
linfangiogênica. Tais estímulos são gerados pela presença de VEGF- C e D, óxido
nítrico sintaxe (NOS), TNF-α, IL-1, fator nuclear - kappa beta (NF-kβ), ANG2, FGF,
fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento plaquetário
(PDGF), fator de crescimento insulínico (IGF 1 e 2), dentre outros no local da injúria
(MOUTA; HEROULT, 2003; ADAMS; ALITALO, 2007; BERGGREEN et al., 2009;
KIM; KATARU; KOH, 2012).
Os marcadores do endotélio linfático estudados são o VEGFR3,
podoplanina, desmoplaquina, JAM 1 e 2, SOX-18, PROX-1 e o LYVE-1 e
comumente são usados em pesquisas da rede linfática (MOUTA; HEROULT, 2003;
ADAMS; ALITALO, 2007; UEKI et al., 2008; KIM; KATARU; KOH, 2012;
BERGGREEN; WIIG, 2013; CIMPEAN; RAICA, 2015). A podoplanina é uma
proteína transmembrana utilizada como marcador altamente específico de vasos
linfáticos, sendo expressa nas células endoteliais dos vasos linfáticos, e não de
vasos sanguíneos (CIMPEAN; RAICA, 2015). É expressa também em outros tipos
celulares, como podócitos, osteoblastos, osteócitos, ceratinócitos basais, células
mioepiteliais, miofibroblastos da próstata, células de Schwann, células granulosas
do ovário, células dendríticas foliculares e em células neoplásicas. Possui a função
de mediar a adesão de células inflamatórias, células endoteliais dos vasos
linfáticos e apresenta propriedades de contração celular e reorganização do
citoesqueleto. (MIYAZAKI, Y. et al., 2011; KASHYAP; REDDY, 2015; CIMPEAN;
RAICA, 2015).
A angiogênese e a linfangiogênese estão presentes na evolução da doença
periodontal e alguns estudos mostram o aumento dos vasos linfáticos e sanguíneos
(KASPRZAK et al., 2013; BERSGGREEN; WIIG, 2014). Porém todas as vias de
modulação não foram completamente desvendadas e nem todos os marcadores
foram usados na vasculatura. Por este motivo, o objetivo desta pesquisa é estudar
25
a angiogênese através da imunnomarcação do CD34, e a linfanfiogênese através
da podoplanina, em biópsias de tecidos gengivais com diagnóstico clínico de
gengiva clinicamente saudável, gengivite crônica e periodontite crônica.
Materiais e Métodos
27
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 IMPLICAÇÕES ÉTICAS
Os procedimentos para a realização deste estudo respeitaram as diretrizes e
normas que regulamentam as pesquisas envolvendo seres humanos, aprovadas
pela Resolução 466/12 de 12 de dezembro de 2012, do Conselho Nacional de
Saúde. O mesmo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa de Seres
Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN) e foi
aprovado com o parecer de número 1.325.555.
2.2 TIPO DE ESTUDO
Este estudo transversal retrospectivo consistiu de uma avaliação descritiva,
comparativa e retrospectiva, constituída pela observação, análise e registro das
expressões imunoistoquímicas do CD34 e da podoplanina em tecido gengival.
2.3 POPULAÇÃO
Todos os casos com o diagnóstico clínico de gengiva clinicamente saudável,
gengivite e periodontite crônica arquivados no setor de Anatomia Patológica da
Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), entre os anos de 1970 e 2015.
2.4 AMOSTRA
A amostra foi intencional e por conveniência, composta por 90 espécimes de
tecidos gengivais, onde 30 casos com diagnóstico clínico de gengiva clinicamente
saudável (sem sinais clínicos de inflamação, ausência de sangramento à
sondagem, sem perda de inserção clínica e sem perda óssea radiográfica), 30
casos com diagnóstico clínico de gengivite crônica (sangramento à sondagem, sem
perda de inserção clínica e sem perda óssea radiográfica) e 30 casos com
diagnóstico clínico de periodontite crônica (profundidade de sondagem > 4 mm,
perda de inserção clínica 3 mm, com perda óssea radiográfica e sangramento à
28
sondagem), seguindo os critérios de diagnóstico da Academia Americana de
Periodontia (ARMITAGE, 1999), arquivados no setor de Anatomia Patológica da
Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
2.4.1 Critérios para a seleção da amostra
2.4.1.1 Critérios de inclusão
Foram incluídos os casos de pacientes previamente recrutados de projetos
aprovados por comitê de ética e publicados com os mesmos critérios de inclusão e
exclusão deste estudo.
Como critérios de inclusão seria pacientes com o diagnóstico clínico de
gengiva clinicamente saudável, gengivite crônica e periodontite crônica de
pacientes sistemicamente saudáveis, maiores que 18 anos, com os dados
completos na ficha cadastral e com material biológico suficiente nos blocos de
parafina para o desenvolvimento da pesquisa.
2.4.1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os pacientes portadores de gengivites associadas a outros
fatores que não sejam ao biofilme dentário; que tenham feito uso de antibióticos ou
antimicrobianos locais ou sistêmicos pelo menos 03 (três) meses antes do
procedimento; e fumantes.
2.5 ESTUDO MORFOLÓGICO
A análise morfológica foi realizada sob microscopia de luz, a partir de cortes
histológicos de 5 μm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina
(H/E). Esta avaliação teve por objetivo fazer uma análise descritiva das
características anatomopatológicas observadas em cada caso, como também
verificar a qualidade dos espécimes teciduais para posterior preparo dos cortes
para imunoistoquímica. Os aspectos investigados foram:
Análise das características dos epitélios presentes:
29
Alterações no epitélio: hiperparaceratinizado, hiperceratinizado,
acantose, hiperplasia, atrofia, espongiose, exocitose, degeneração
hidrópica, duplicação da camada basal, ulceração.
Análise das características do tecido conjuntivo:
Densidade do tecido conjuntivo (denso, variado ou frouxo).
Intensidade do infiltrado inflamatório (leve, moderado e intenso).
Tipo de infiltrado inflamatório (linfoplasmocitário, linfocitário e misto).
2.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
Todos os espécimes foram fixados em formol a 10% e emblocados em
parafina foram submetidos a cortes histológicos de 3 µm de espessura, montados
em lâminas de vidro, preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-
silano (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA). Posteriormente, os espécimes
passaram pela técnica de imunoistoquímica.
Os cortes foram submetidos às etapas de desparafinização, reidratação e
recuperação gênica (CD34 com citrato pH 6.0 Pascal; Podoplanina com
TRIS/EDTA pH 9.0 Pascal). Posteriormente, foi realizado o bloqueio de peroxidase
endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes, após lavar em água corrente, e
posteriormente, incubada em proteína block (Thermo Scientific, Runcorn, UK) para
bloquear ligações inespecíficas. Em seguida, lavagens com tris-hidroximetil-
aminometano (TRIS, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) (pH 7,4).
A incubação dos anticorpos primários foi feita: CD34, diluição 1:1500, por 60
min no sistema de visualização ADVANCE TM (Dako North America Inc., Capinteira,
CA, USA); e Podoplanina, diluição 1:600, em overnight, no sistema de visualização
HI-DEF (HRP, Polymer System). Após esta incubação, foi realizada revelação com
a di-aminobenzida (DAB, Sigma Chemical, St louis, MO, USA) em câmara escura,
passando por água destilada e contra coloração com Hematoxilina de Mayer. O
processo foi finalizado com desidratação, diafanização e montagem da lâmina.
2.7 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUíMICO
30
As lâminas coradas pela técnica de imunoistoquímica com CD34 e
podoplanina foram analisadas em microscopia de luz, quantitativamente, através
do índice angiogênico e do índice linfangiogênico (AGARVAL et al., 2014), por um
examinador previamente calibrado (CD34: Kappa = 0,931; Podoplanina: Kappa =
0,939). Os índices angiogênico e linfangiogênico foram determinados empregando-
se a técnica de contagem microvascular (CMV), em que cinco áreas aleatórias
significativas com maior imunomarcação de vasos (“Hot spot”) foram selecionadas,
sob o aumento de 40x. Em seguida, no aumento de 100x, foram quantificados
manualmente com o auxilio do programa ImageJ (Image Processing and Analisis in
Java), com o objetivo de evitar a recontagem de estruturas. Desse modo, o
resultado foi expresso pelo número médio de vasos nestas áreas em cada uma das
amostras e posteriormente feito uma média para cada grupo. Durante o
procedimento, qualquer célula ou grupo celular endotelial imunomarcado
positivamente separado dos microvasos adjacentes e de outros constituintes do
tecido conjuntivo, assim como os vasos contendo lúmen, foram considerados como
um vaso unitário. Foram contados como vasos, ainda, estruturas ramificadas e com
descontinuidade na sua conformação.
2.8 ANALISE ESTATÍSTICA
Os dados clínicos, morfológicos e imunoistoquímicos foram tabulados no
programa Microsoft Excel® 2000 e posteriormente exportados para o programa
estatístico Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) versão 20.0, no qual
foram realizadas as análises estatísticas.
Assumindo a não normalidade da amostra, os testes não paramétricos de
Kruskal-Wallis e Mann-Whitney foram usados para verificar as diferenças
significativas entre os três grupos e a idade do paciente (idade do paciente x
diagnóstico clínico), e dos três grupos e marcadores dentro de cada grupo (CMV do
imunomarcador CD34 x diagnóstico clínico; CMV do imunomarcador podoplanina x
diagnóstico clínico; marcação da camada basal do epitélio pela podoplanina x
intensidade do infiltrado inflamatório). Para a correlação entre os índices
angiogênico e linfangiogênico, utilizou-se a correlação de Spearman. O teste do
Qui-quadrado foi realizado para as associações significativas (intensidade do
infiltrado inflamatório x diagnóstico clínico).
31
Para todos os testes estatísticos utilizados neste estudo, o nível de
significância foi estabelecido em 5% (p<0,05).
Resultados
33
3 RESULTADOS
No presente estudo foram utilizadas 90 amostras de tecido gengival de 60
mulheres (66,7%) e de 30 homens (33,3%). A idade variou de 18 a 69 anos,
mediana de 34,08 ± 11,61 anos, e sua relação com o diagnóstico clínico mostrou
que o aumento da idade está relacionado com os casos de periodontite crônica
(p<0,001) (Tabela 1).
Tabela 1. Relação do diagnóstico clínico com a idade. Natal, RN. 2016.
Diagnóstico
Clínico n Mediana Q25 – Q75
Média dos
Postos p p*
Gengiva
Clinicamente
Saudável
30 27 23,8 – 33,5 33,58
0,001
S X G: 0.097
Gengivite
Crônica 30 32,5 26 – 42,3 44,42 S X P: <0,001
Periodontite
Crônica 30 36,5 31,8 – 45,5 58,40 G x P: 0,036
Testes não-paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney–pós-teste Bonferroni. Legenda: n, número de casos; Q25, Quartil 25; Q75, Quartil 75; p*: valor de p do pós-teste; S, gengiva clinicamente saudável; G, gengivite crônica; P, periodontite crônica. FONTE: Autor. Natal, RN. 2016.
Os espécimes passaram por avaliação das características histológicas a
cerca do epitélio e das suas características. Cem porcento dos espécimes tinham a
presença de epitélio oral, 18,9% (17 casos) ainda apresentavam epitélio juncional e
4,4% (4 casos) apresentaram epitélio do sulco. As alterações apresentadas no
epitélio oral foram: degeneração hidrópica 94,4% (85 casos), acantose 78,9% (71
casos), espongiose 66,7% (60 casos), exocitose 48,9% (44 casos), hiperplasia
44,4% (40 casos), hiperplasia da camada basal 16,7% (15 casos),
hiperparaceratinizado em 6,7% (6 casos), ulceração 2,2% (2 casos), atrofia 1,1% (1
caso). O epitélio juncional em 100% dos casos (17 casos) apresentou-se
espongiótico, com presença de degeneração hidrópica e exocitose, enquanto que o
sulcular não apresentou alterações.
Na lâmina própria, o tecido conjuntivo mostrou-se predominantemente denso
(85,5%), apresentando infiltrado inflamatório linfocitário em 54% dos casos,
linfoplasmocitário em 42,5% e misto em 3,5%.
34
Ao realizar-se a associação da intensidade do infiltrado com o diagnóstico
clínico, optou-se pela junção das intensidades leve e moderada, por finalidade
estatística, facilitando a análise dos resultados. O resultado mostrou que os casos
diagnosticados como gengiva clinicamente saudável estavam associados a um
infiltrado inflamatório leve ou moderado (tabela 2).
Tabela 2. Associação entre a intensidade do infiltrado e o diagnóstico clínico. Natal, RN.
2016.
Diagnóstico Clínico
p
Intensidade do Infiltrado
Inflamatório
Gengiva Clinicamente
Saudável
Gengivite Crônica
Periodontite Crônica
n % n % n %
Leve e Moderado
23 76,7 16 53,3 10 54,4 0,003
Severo 7 23,3 14 46,7 20 45,6
Teste Qui-quadrado. Legendas: n, número de casos; %, percentagem. FONTE: Autor. Natal, RN. 2016.
Na análise imunoistoquímica, foi observada em todos os espécimes a
positividade para o marcador CD34 em vasos sanguíneos, com marcação
citoplasmática e/ou membranar (figuras 1A e 1B), e o marcador podoplanina em
vasos linfáticos (figuras 1C e 1D) e camada basal do epitélio (figuras 1D e 1E), com
marcação citoplasmática e membranar. A análise da marcação foi quantitativa,
através CMV sanguínea e linfática, respectivamente, para o CD34 e podoplanina.
A correlação feita entre a CMV sanguínea (CD34) e a CMV linfática
(podoplanina) mostrou-se fraca, porém significativa e positiva, demonstrando que
quando há um aumento da quantidade de vasos sanguíneos, há também o
aumento dos linfáticos (r = 0,229; p=0,030).
A relação da CMV sanguínea e linfática com o diagnóstico clínico está
apresentada na tabela 3. A relação do imunomardador podoplanina com o
diagnóstico clínico foi significativa (p=0,048). A diferença significativa está entre o
grupo de gengiva clinicamente saudável com o de periodontite crônica (p=0,017),
Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos gengivite crônica x
gengiva clinicamente saudável (p=0,256) e gengivite crônica x periodontite crônica
(p=0,826).
35
Figura 1. Imunopositividade para os marcadores CD34 e Podoplanina. A - Fotomicrografia evidenciando a imunopositividade dos vasos sanguíneos para o marcador CD34. Vasos linfáticos (círculo) não marcados pelo anticorpo (ADVANCE, 40x). B - O CD34 apresenta imunomarcação de estruturas luminais e unidades celulares. Na fotomicrografia é evidenciado o padrão citoplasmático (ADVANCE, 100x). C - Fotomicrografia evidenciando a imunopositividade dos vasos linfáticos para o marcador podoplanina. Vaso sanguíneo (círculo) não marcado pelo anticorpo (HI-DEF, 100x). D - Positividade dos vasos linfáticos e da camada basal do epitelio, com marcação membranar, para o imunomarcador podoplanina (HI-DEF, 100x). E - Positividade para a podoplanina restrita à camada basal (HI-DEF, 100x).
B A
C D
E
36
Tabela 3. Relação da contagem microvascular sanguínea e linfática com o diagnóstico
clínico. Natal, RN. 2016.
DC n Mín. Máx. Med. Q25 - Q75 Média dos
postos p
p*
CMV sanguínea (CD34)
S 30 3,4 11 7,4 6,2 - 8,4 46,40
0,261
G 30 5,0 11,2 8,0 5,8 - 9,2 50,52
P
30
4,2
11,2
6,6
6,0 - 7,4
39,58
CMV linfática (Podoplanina)
S 30 1,0 6,4 2,5 2,0 - 3,3 53,05
0,048
SXG: 0,256 GXP: 0,826 SXP: 0,017
G 30 1,2 5,0 2,2 1,8 - 2,8 46,78
P 30 1,0 3,8 2,0 1,8 - 2,5 36,67
Teste não paramétrico Kruskal-Wallis e Mann-Whitney - Pós-teste Bonferroni. Legenda: DC, diagnóstico clínico; n, número de casos, Mín., mínimo; Máx, máximo; Med., mediana; Q25, quartil 25; Q75, quartil 75; p* valor de p no pós-teste, S, gengiva clinicamente saudável; G, gengivite crônica; P, periodontite crônica. FONTE: Autor. Natal, RN. 2016.
O imunomarcador CD34 mostrou-se negativo nos epitélio oral, sulcular e
juncional. A podoplanina foi positiva na camada basal dos epitélios em 88,9%
(n=80) dos casos. A marcação da podoplanina no epitélio mostrou-se maior nos
casos de gengivite crônica e periodontite crônica, sendo esta diferença
estatisticamente significativa (p=0,033). Houve significância estatística em relação
à intensidade do infiltrado inflamatório (p=0,016), apresentando-se forte a
imunomarcação quando o infiltrado inflamatório apresentou-se intenso (Tabela 4).
Tabela 4. Relação da marcação da podoplanina no epitélio com o diagnóstico clínico e a
intensidade do infiltrado inflamatório. Natal, RN. 2016.
Marcação da Podoplanina no Epitélio
Inexistente/Fraco Moderado/Forte n % n % p
Diagnóstico Clínico
Gengiva Clinicamente
Saudável 15 51,7 15 24,6
0,033 Gengivite Crônica
6 20,7 24 39,3
Periodontite Crônica
8 27,6 22 36,1
Intensidade do Infiltrado Inflamatório
Leve
13
44,8
11
18
0,016 Moderado 8 27,6 17 27,9
Severo 8 27,6 33 54,1
Teste Qui-quadrado. FONTE: Autor. Natal, RN. 2016.
Discussão
38
4 DISCUSSÃO
Microrganismos e seus componentes presentes no biofilme dentário
estimulam a formação de processo inflamatório durante o período da injúria aos
tecidos periodontais. Na tentativa de debelar tal processo, células inflamatórias
migram para a área afetada para debelar o agente agressor (GONZALES, 2015).
Neste estudo, foi observado que mesmo na gengiva clinicamente saudável, onde
não havia sinal clínico de doença, havia presença de infiltrado inflamatório
leve/moderado, mostrando que provavelmente as alterações histológicas
acontecem antes da doença ser identificada, pelo contato do biofilme dental com o
tecido periodontal, como mostrou Page e Schroeder (1976) em um estudo com
cães.
Além de migração celular, até para que esta seja realizada com maior
eficiência, alterações vasculares são observadas no local da injúria. No inicio, os
vasos sanguíneos sofrem dilatação, mas ao continuarem os estímulos pró-
angiogênicos, novos vasos são formados a partir dos pré-existentes. Este aumento
da rede vascular sanguínea é considerado um fator importante para a destruição
dos tecidos periodontais (KASPRZAK et al., 2012). Por este motivo, estudos sobre
os fatores pró-angiogênicos e anti-angiogênicos, células imunes e células
presentes nos tecidos, além da presença de vasos sanguíneos na evolução da
doença são importantes para entender a patogênese da doença periodontal e
buscar terapias que possam agir como colaboradoras para o processo de remissão
ou controle do problema.
Objetivando avaliar a angiogênese, estudos utilizaram imunomarcadores
para vasos sanguíneos ou fatores pró-angiogênicos, como VEGF (ARTESE et al.,
2010; KASPRZAK et al., 2012), CD31, CD105 (KASPRZAK et al., 2012), CD34
(PENMETSA et al., 2015), fator VIII, NOS (ARTESE et al., 2010), comparando
grupos com periodontite crônica e periodonto saudável. Estes estudos mostraram
que todos os imunomarcadores supracitados estão mais expressos nos casos de
periodontite do que no tecido saudável, sugerindo que há um aumento de vasos
sanguíneos ao longo da evolução da doença periodontal. No presente estudo foi
observado maior número de vasos sanguíneos na gengivite que no grupo
saudável, contudo sem significância estatística (p=0,261), mostrando que a
39
realização de estudos incluindo a gengivite na amostra pode ajudar na
compreensão da angiogênese em todas as doenças periodontais.
A remodelação vascular é uma característica reconhecida na inflamação
crônica, mas nem todos os tecidos apresentam resposta semelhante. O fator de
crescimento importante para a patogênese da doença periodontal é o VEGF e está
relacionado com o aumento da densidade microvascular nos casos de periodontite
agressiva e crônica (ARTESE et al., 2010). Segundo Kasprzak et al. (2012), há o
aumento do número de vasos sanguíneos na doença periodontal, verificado
também pela relação do VEGF/CD31, e através da relação CD105/ CD31 que,
além da marcação das células endoteliais, foi observada a presença de vênulas de
endotélio alto pós-capilar na gengiva inflamada, que não é encontrada no tecido
saudável. Outros estudos mostraram que tanto fatores extrínsecos como
intrínsecos estão envolvidos na indução da angiogênese (ARTESE et al., 2010;
HSU et al., 2011; KASPRZAK et al., 2012; PENMETSA et al., 2015).
Este estudo teve o propósito de comparar, através da contagem
microvascular, a angiogênese e a linfangiogênese na doença periodontal usando o
CD34 e a podoplanina, respectivamente. Foi observada uma fraca correlação
positiva entre a contagem microvascular do CD34 e da podoplanina (p=0,030),
mostrando que há um aumento de vasos sanguíneos e linfáticos, mas não com a
mesma intensidade. Não há estudos prévios que comparem a mediana de vasos
sanguíneos com a de vasos linfáticos na doença periodontal com esses
marcadores. O estudo dos fatores de indução e controle de ambos os processos e
a quantidade de vasos presentes em cada momento, permitirá uma melhor
compreensão desta diferença da indução do processo de neoformação dos vasos.
Bersggreen e Wiig (2013) comentaram que a linfangiogênese representa um
fator de proteção para pacientes com doença periodontal contra a perda óssea. A
linfangiogênese é inicialmente estimulada para conter o edema intersticial e para
facilitar a resposta imune celular de forma indireta. Há poucos estudos sobre o
papel dos vasos linfáticos nas infecções crônicas. O presente estudo mostrou que
há diminuição do número de vasos linfáticos ao comparar os casos de gengiva
clinicamente saudável e os de periodontite crônica (p=0,017), sugerindo os vasos
linfáticos possam ter seu aumento em número na fase aguda do processo
inflamatório com o objetivo de limitar o dano tecidual (HUGGENBERGER et al.,
2011), e, com a cronificação da inflamação, pode sofrer uma adaptação,
40
permanecendo os vasos linfáticos ampliados periodontite crônica e com estímulo
linfangiogênico menor (MKONYI et al., 2012).
Que a inflamação estimula a linfangiogênese é um fato concebido, mas
todas as interações entre as moléculas presentes no processo, células
inflamatórias e células endoteliais linfáticas não foram completamente
caracterizadas (CIMPEAN; RAICA, 2015). Tan, Chong e Angeli (2014), observaram
que no processo de linfangiogênese em tecido inflamado estão presentes
macrófagos, células dendríticas, células B e neutrófilos (modulando o VEGF-A e
secretando VEGF-D). Além do sistema imune, células presentes no tecido
participam da neoformação linfática como os ceratinócitos epidermais, células
estromais tipo fibroblastos reticulares (ambos secretam VEGF-A). Com função de
fazer o controle do processo, Células T inibem a linfangiogênese através da
secreção de interferon-gama (IFNγ). O estudo de Cimpean e Raica (2015)
corrobora a presença do IFNγ no local da inflamação, e comenta que é o
responsável pelo papel crucial das células T (CD4+ e CD8+) no controle da
linfangiogênese. Junto das células T, também participam os mastócitos,
plasmócitos e eosinófilos como colaboradores anti-linfangiogênicos.
A literatura é ampla quando se avalia os elementos pró-angiogênicos e pró-
linfangiogênicos, entretanto, quase não há pesquisas de como este processo é
regulado na doença periodontal, ou se quando esta foi tratada, haverá redução do
número de vasos linfáticos. Esse estudo, por se tratar de uma avaliação
transversal, não há como avaliar a relação de causa-efeito desses marcadores e a
ocorrência da doença. Os pacientes deveriam apresentar o diagnóstico clínico de
gengivite e periodontite crônicas no momento do procedimento cirúrgico, porém
não se pode afirmar a atividade da doença naquele momento.
Este estudo avaliou a imunomarcação do CD34 e da podoplanina presente
no epitélio oral e no tecido conjuntivo. O imunomarcador CD34 foi avaliado em
relação às estruturas por ele marcadas. Mostrou-se positivo somente na membrana
celular e citoplasma das células endoteliais e células presentes no conjuntivo, que
foram interpretadas como células estimuladas a formarem vasos sanguíneos.
Neste estudo não houve marcação no epitélio oral e nem nos epitélios sulcular e
juncional nos 90 casos deste estudo, o que difere em relação aos resultados
obtidos no estudo piloto de Lavu e Suresh (2009), que analisou o CD34 em 15
biópsias de gengiva saudável e observaram que o CD34 era imunopositivo em 10
41
espécimes na região basal e parabasal do epitélio e em 12 espécimes em células
endoteliais. Penmetsa et al. (2015) não observaram marcação no epitélio oral, e
utilizaram o CD34 por ser um bom marcador de vasos sanguíneos, e por não
marcar vasos linfáticos. No entanto, ainda não foi possível identificar as razões
para essas divergências entre os estudos mencionados.
No presente estudo, a podoplanina foi positiva na camada basal dos
epitélios (oral, sulcular e juncional) na maioria dos casos e teve marcação no
endotélio linfático em 88,9% dos casos. A marcação da podoplanina no epitélio
mostrou-se maior nos casos de gengivite crônica e periodontite crônica ao
comparar com o grupo da gengiva clinicamente saudável (p=0,033). Na presença
de um infiltrado inflamatório escasso, não havia imunomarcação ou apresentava-se
fraca. Em relação à intensidade do infiltrado inflamatório, apresentou mais forte a
imunomarcação quando presente um infiltrado inflamatório severo (p=0,016).
Corroborando este estudo, o estudo de Miyazaki et al. (2009) mostrou a
imunomarcação da podoplanina no epitélio. No trabalho de Mitariu et al. (2015),
qual buscou identificar vasos linfáticos em tecido saudável localizado nas mucosas
jugal, gengival, papilar e labial, através dos imunomarcadores podoplanina e CD31,
observaram que os vasos linfáticos estavam localizados, de forma mais expressiva,
na camada subepitelial e de forma mais escassa, na submucosa em todos os
sítios, não fazendo menção a marcação no epitélio presente. Já Miyazaki et
al.(2009) realizaram um estudo em tecido gengival e tentaram relacionar a gengiva
saudável com a doença periodontal. Os autores observaram que as células
endoteliais linfáticas e as células basais do epitélio oral e sulcular eram
imunopositivas para a podoplanina. E a imunomarcação da podoplanina está
relacionada com a intensidade do infiltrado inflamatório, sendo diretamente
proporcional à intensidade do infiltrado inflamatório.
Reunindo os resultados do estudo de Miyazaki et al. (2009) com o deste,
pode-se concluir que a podoplanina marca além de vasos linfáticos do tecido
gengival, a camada basal do epitélio. Sua relação de intensidade de marcação está
diretamente ligada à presença de infiltrado inflamatório. Como a podoplanina
apresenta propriedades de contração celular e reorganização do citoesqueleto
(MIYAZAKI et al., 2011), ela pode estar associada à migração apical do epitélio
(MIYAZAKI et al, 2009), precisando de mais estudos para a comprovação desta
hipótese.
42
Estudos relacionando a progressão da doença periodontal e fatores pró-
angiogênicos e anti-angiogênicos devem ser realizados para que seja
compreendido como se inicia o estímulo para a neoformação vascular, com a
cascata de sinalizadores associados. Se há realmente aumento, e como ele se
apresenta ao longo da evolução da doença periodontal, e após o tratamento
periodontal realizado, como se encontraria a rede de vasos sanguíneos para assim
investigar a real função dos vasos sanguíneos e como se apresentam ao longo da
evolução e remissão da doença no tecido gengival. Este estudo somente
quantificou o número de vasos presentes em tecido clinicamente saudável, na
gengivite crônica e na periodontite crônica, não utilizando nenhum fator de
crescimento ou citocina.
Conclui-se com este estudo que na periodontite crônica há menor número de
vasos linfáticos do que no tecido gengival saudável, mostrando que não é em toda
patologia que há proliferação contínua. Esse resultado mostra que o papel e os
sistemas de regulação da angiogênese e linfangiogênese precisam ser elucidados.
Estudos em animais, induzindo a doença periodontal, visando observar a
evolução da doença e a resposta após o tratamento periodontal e utilizando outros
marcadores angiogênicos e linfangiogênicos podem elucidar ou suscitar novos
questionamentos sobre o funcionamento e a função da vasculatura periodontal.
Conclusões
44
5 CONCLUSÃO Este estudo que avaliou através da imunomarcação do CD34 e da podoplanina, a
angiogênese e a linfangiogênese, concluiu que:
Na gengiva clinicamente saudável, havia presença de infiltrado inflamatório
leve/moderado.
A podoplanina, além de ser positiva nas células endoteliais linfáticas, também
se mostrou imunopositiva na camada basal dos epitélios na maioria dos
casos, com relação positiva com a intensidade do infiltrado inflamatório,
mostrando exercer outro papel na doença periodontal.
A angiogênese tem uma correlação significativa fraca com a linfangiogênese,
porém positiva.
Não foi observado aumento do número de vasos sanguíneos e linfáticos com
o aumento da gravidade da doença periodontal.
Referências
46
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Apêndice
50
APÊNDICE A
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE ODONTOLOGIA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para o(a) senhor(a) participar da pesquisa “Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina no Tecido Gengival de Pacientes Saudáveis e com Doença Periodontal”, que é coordenada pela Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel. Sua participação é voluntária, o que significa que o(a) senhor(a) poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.
Essa pesquisa procura estudar a angiogênese através da imunoexpressão do CD34 e a linfangiogênese através da imunomarcação da podoplamina em tecidos gengivais saudáveis, com gengivite e com periodontite.
Caso decida aceitar o convite, o(a) senhor(a) não irá passar por nenhum outro procedimento clínico ou cirúrgico uma vez que este material já se encontra guardado no laboratório de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN e assim, não haverá qualquer desconforto. Assim, concordando em participar da pesquisa o(a) senhor(a) autorizará apenas o manuseio do material já recolhido durante a biópsia (retirada cirúrgica de material) realizada previamente.
Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será revelado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Tendo em vista que a pesquisa será desenvolvida com material arquivado, não necessitando de qualquer intervenção no(a) senhor(a), o(a) senhor(a) o risco será mínimo, pois a pesquisa será realizada utilizando o material da lesão removido no tratamento cirúrgico da sua enfermidade, que ocorreu no passado sem nenhum vínculo com esta pesquisa. Enfatizamos que o tratamento executado no(a) senhor(a) à época do seu atendimento, é o indicado para o seu caso, portanto o(a) senhor(a) não será submetido(a) a mais nenhum procedimento terapêutico com a finalidade de participar desta pesquisa.
Os benefícios esperados com a realização desse estudo podem não ser diretamente aplicados no(a) senhor(a), mas certamente poderão contribuir para ampliar os conhecimentos a respeito da doença aqui estudada, especialmente com relação à contribuição para um maior entendimento sobre como se processa o
51
desenvolvimento da doença em questão. Se houver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, o(a) senhor(a) será ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se o(a) senhor(a) sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta pesquisa, terá direito a indenização.
O(A) senhor(a) ficará com uma cópia deste Termo e qualquer dúvida a respeito desta pesquisa poderá ser esclarecida diretamente com a Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelo telefone (84) 3215-4138. Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, localizado no Campus Universitário da UFRN, ou pelo telefone (84) 3215-3135
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará pra mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa: “Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina no Tecido Gengival de Pacientes Saudáveis e com Doença Periodontal”, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em congressos e/ou publicações científicas desde que nenhum dado possa me identificar Natal,____/_____/_____
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DECLARAÇÃO DO PESQUISADOR RESPONSÁVEL Como pesquisador responsável pela pesquisa “Estudo Imunoistoquímico do CD34 e Podoplanina no Tecido Gengival de Pacientes Saudáveis e com Doença Periodontal”, declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante deste estudo, assim como mantar a confidencialidade e sigilo sobre a identidade do mesmo. Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido estarei infringido as normas e diretrizes propostas pelas Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde – CNS que regulamenta pesquisas envolvendo seres humanos. Natal,____/_____/_____
____________________________________________________ Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel
Pesquisador Responsável Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal/RN, CEP: 59056-000
Digital
Anexo
53
ANEXO A
54
55
56
