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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
Jéssica Priscila do Nascimento Santana
Extração e Caracterização do material proteico e lipídico da microalga
Monoraphidium sp. visando uma perspectiva biorrefinária
Natal/RN
2016
Jéssica Priscila do Nascimento Santana
Extração e Caracterização do material proteico e lipídico da microalga
Monoraphidium sp. visando uma perspectiva biorrefinária
Monografia submetida ao Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Química. Orientador: Profª Drª Marta Costa
Natal/RN 2016
Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto de Química - IQ
Santana, Jéssica Priscila do Nascimento.
Extração e caracterização do material proteico e lipídico da
microalga Monoraphidium sp. visando uma perspectiva
biorrefinária / Jéssica Priscila do Nascimento Santana. -
Natal, RN, 2016.
43 f: il.
Orientador: Profª Drª Marta Costa.
Monografia (graduação) - Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Instituto de
Química.
1. Química orgânica - Monografia. 2. Extração (Química) -
Microalgas - Monografia. 3. Biomassa - Monografia. 4. Lipídios
- Extração - Monografia. 5. Proteínas - Extração - Monografia.
I. Costa, Marta. II. Título.
CDU 547(02)
Jéssica Priscila do Nascimento Santana
Extração e Caracterização do material proteico e lipídico da microalga
Monoraphidium sp. visando uma perspectiva biorrefinária
Aprovada em:___/___/___
BANCA EXAMINADORA:
_____________________________________________ Profª Drª Marta Costa (Orientadora)
Instituto de Química – UFRN
_____________________________________________ Ms Anderson Fernandes Gomes (Examinador)
Instituto de Química – UFRN
_____________________________________________ Suzan Ialy Gomes de Medeiros (Examinadora)
Instituto de Química – UFRN
Monografia submetida ao Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do titulo de Bacharel em Química, na Área de concentração em Química Orgânica.
Dedico este trabalho primeiramente a Deus
que iluminou о meu caminho durante esta
caminhada e aos meus pais, por sua
capacidade de acreditar em mim е investir
em mim. Mãe, sеυ cuidado е dedicação fоі
que deram, em alguns momentos, а
esperança pаrа seguir. Pai, sυа presença
significou segurança е certeza de qυе não
estou sozinha nessa caminhada.
“Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e os seus planos serão bem-sucedidos.”
(Provérbios 16:3)
AGRADECIMENTOS
Quero, primeiramente, agradecer a Deus por toda força, por ter me
amparado durante todos esses anos de graduação, sem Ele, de fato, eu não
estaria aqui.
Quero agradecer aos meus amados pais Agna Vânia e Luiz Júnior e
meus amados avós maternos Maria e Antônio que me deram total apoio e
suporte quando decidi cursar Química Bacharelado. Pelas palavras de carinho
e força, pelas orações de encorajamento e por acreditar e confiar em mim. Amo
muito vocês!
Ao meu querido e amado primo João Paulo Varela que sempre esteve
comigo em toda a minha vida e na minha graduação não foi diferente.
Ao meu grande amigo da graduação que com certeza levarei para toda a
minha vida, Alisson Cliford.
Às melhores amigas que a graduação me deu: Deusielly Avelar, Sheeza
Duarte, Anne Natália, Taiannie Soriano, Raphaella Cabral e Blênda Nagyla. Por
todas as noites acordadas estudando, por cada lágrima, de alegria e tristeza,
por todas as brincadeiras e por todas as horas que passamos juntas. Quero
leva-las para sempre comigo!
À Deusielly Avelar por sempre estar ao meu lado e me amparar nos
momentos em que mais precisei, quero leva-la sempre comigo!
À Sheeza Duarte por ser uma amiga muito especial e querida e me fazer
rir nas horas em que precisava de um ombro amigo, quero leva-la sempre
comigo!
À minha professora e orientadora Marta Costa por todo conhecimento
que me passou e, principalmente, pela oportunidade cedida para ser voluntária
em seu laboratório. Muito obrigada professora!
Aos meus companheiros de laboratório: Anderson Gomes, Victor Reis e
Carlos A. Kramer, por tornar os dias de trabalho mais divertido.
Quero agradecer especialmente a Rusceli Diego, que desde que
comecei minha experiência em orgânica, sempre me deu apoio e me ajudou
bastante, você faz parte desta conquista também!
A professora Renata Mendonça por ter me iniciado na pesquisa e ter me
acompanhado nos primeiros anos de graduação.
Ao meu querido professor Jones de Andrade, que sempre me ajudou e
me propôs a incrível oportunidade de ver em pratica a termodinâmica.
Enfim, a todos aqueles que me ajudaram direta ou indiretamente, que de
alguma forma me auxiliaram na realização deste trabalho, o meu muito
obrigada!
RESUMO
Microalgas têm sido de grande interesse para a produção de
biocombustíveis na última década. Recentemente, o desenvolvimento e o foco
foram alterados no sentido de utilizar microalgas nos alimentos, tanto para
seres humanos quanto para animais, bem como no setor farmacêutico e
químico. Dessa forma, o processo biorrefinário visa o emprego total da matéria
prima, neste caso, a biomassa microalgal, sem deixar rejeitos no meio
ambiente. Microalgas contêm quantidades elevadas de lípidos, proteinas e
hidratos de carbono, os quais todos podem ser utilizados para diferentes
mercados. Um dos usos dos lípidos é como materia prima para a produção de
biocombustíveis. As proteinas purificadas podem ser utilizadas na alimentação,
saúde e mercado de produtos químicos. O presente trabalho avalia as
características do ML (material lipídico) e MP (material proteico) a partir da
extração da biomassa microalgal Monoraphidium sp. com a ajuda dos métodos
espectroscópicos, Uv-vís (ultravioleta e vísivel) e FTIR (Espectroscopia na
Região do Infravermelho com transformada de Fourier), foi possível obter a
confirmação da extração desses metabolitos primários.
Palavras-chave: Material lipídico. Material proteico. Monoraphidium sp..
Biorrefinaria
LISTA DE FIGURAS
Figura 1a –
Diferentes tipos de algas, Phaeophyceae.......................... 15
Figura 1b –
Diferentes tipos de algas, Rhodophyceae.......................... 15
Figura 1c –
Diferentes tipos de algas, Chlorophyceae.......................... 15
Figura 2 –
Microalga Monoraphidium sp.............................................. 18
Figura 3 –
Fluxograma de obtenção do material lipídico e proteico.... 26
Figura 4 –
Extração do ML da biomassa microalgal.......................... 27
Figura 5 –
Liofilizador ENTERPRISE I................................................. 28
Figura 6 –
Gráfico da concentração de proteina pela Absorbância..... 30
Figura 7a –
Extração 2h do ML em banho ultrassônico......................... 32
Figura 7b –
Extração 4h do ML em banho ultrassônico......................... 32
Figura 7c –
Extração 6h do ML em banho ultrassônico......................... 32
Figura 8 –
Espectros das extrações do ML em diferentes tempos...... 34
Figura 9a –
Espectro UV-Vis da extração com tempo de 2 horas......... 35
Figura 9b –
Espectro UV-Vis da extração com tempo de 4 horas......... 35
Figura 9c –
Espectro UV-Vis da extração com tempo de 6 horas......... 35
Figura 10 –
Quantificação do MP pelo método de Bradford (1976)...... 36
Figura 11 –
Espectro de infravermelho da extração 4 horas do ML a partir da biomassa residual do MP............................
38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição geral de diferentes algas.......................................
16
Tabela 2 - Conteúdo lipídico, biomassa residual (BR) e a variância referente aos processos extrativos realizados com a biomassa da microalga, assim como, aspectos físicos dos extratos Monoraphidium sp. em diferentes tempos...................
31
Tabela 3 - Conteúdo lipídico, biomassa residual (BR) e a variância referente aos processos extrativos realizados com a biomassa residual após a extração da proteína, assim como, aspectos físicos dos extratos Monoraphidium sp. em um tempo de 4 horas.......................................................................
37
LISTA DE ABREVIATURAS
ML – Material lipídico
MP – Material Proteico
BR – Biomassa residual
BRMP – Biomassa residual do material proteico
MLBRMP – Material lipídico da biomassa residual do material proteico
FTIR – Fourier Transformer Infrared Spectroscopy – Espectroscopia na
Região do Infravermelho com transformada de Fourier
UV-Vís – Ultravioleta/Visível
BSA – Albumina Sérica Bovina
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO.................................................................................. 15
1.1
ALGAS.............................................................................................. 15
1.1.1
Microalgas....................................................................................... 16
1.1.2
O gênero Monoraphidium............................................................... 17
1.2
BIORREFINARIAS............................................................................ 18
1.3
POTENCIAL ENERGÉTICO............................................................. 19
1.4
PROTEÍNAS...................................................................................... 19
1.5
LIPÍDIOS........................................................................................... 20
1.6 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE METABÓLITOS PRIMÁRIOS........
21
1.7 TÉCNICAS ESPECTROSCOPICAS.................................................
22
1.7.1 Espectroscopia na Região de Infravermelho Médio....................
23
1.7.2 Espectroscopia na Região do Uv-Vís............................................
23
2.
OBJETIVOS........................................................................................ 24
2.1
OBJETIVOS GERAIS......................................................................... 24
2.2
OBJETIVOS ESPECIFICOS............................................................... 24
3. METODOLOGIA.................................................................................
25
3.1 OBTENCAO E TIPO DE MICROALGA...............................................
25
3.2 EXTRACAO DO ML DA MICROALGA...............................................
27
3.3 EXTRACAO DO MP DA MICROALGA...............................................
27
3.4 EXTRAÇÃO DO ML PROVENIENTE DA BIOMASSA RESIDUAL PÓS-EXTRAÇÃO DO MATERIAL PROTEICO (MLBRMP)................
28
3.5 TRATAMENTOS ESTATISTICO DOS DADOS E CALCULO DO TEOR LIPIDICO EXTRAIDO...................................................................................
28
3.6
CARACTERIZACAO ESPECTROSCOPICA POR UV-VIS..........................
28
3.7 CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA POR FTIR....................
29
3.8
QUANTIFICAÇÃO DO MP DA MICROALGA..................................... 29
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 31
4.1 EXTRAÇÕES DO MATERIAL LIPÍDICO DA MICROALGA................
31
4.2 CARACTERIZAÇÕES ESPECTROSCÓPICAS DO ML MICROALGAL.....................................................................................
33
4.2.1 Caracterização por FTIR...................................................................
33
4.2.2 Caracterização por UV-vís...............................................................
34
4.3 QUANTIFICAÇÃO DO MP MICROALGAL.........................................
36
4.4 EXTRAÇÃO DO ML DA BRMP...........................................................
37
4.4.1 Caracterização do MLBRMP............................................................
37
5. CONCLUSÃO.....................................................................................
39
6.
REFERÊNCIA..................................................................................... 40
15
1– INTRODUÇÃO
1.1- ALGAS
As algas são organismos unicelulares, microscópicos e fotossintéticos
normalmente encontrados em sistemas aquáticos e marinhos frescos. Estes
organismos consomem três componentes principais: a luz solar, o dióxido de
carbono e água para produzir quantidades significativas de metabólitos
primários (GHASEMI et al., 2012).
As algas podem ser classificadas em macroalgas (filamentosa) e
microalgas (fitoplâncton). As macroalgas, também conhecida como algas, são
divididas em três categorias principais com base na pigmentação. Estes são
Phaeophyceae (algas marrons), Rhodophyceae (algas marinhas vermelhas) e
Chlorophyceae (algas verdes). Igualmente, as microalgas são organismos
unicelulares divididos em quatro classes. Estes são Bacillariophyceae
(diatomáceas), Chlorophyceae (algas verdes), Cianophyceae (algas azuis) e
Chrysophyceae (algas douradas), como indicada na Figura 1. Além disso,
dependendo da espécie e condições de cultivo empregadas podem possuem
alto teor de óleo, em torno de 76,5% (DEMIRBAS, 2010; LI et al, 2014).
Figura 1: Diferentes tipos de algas. a) Phaeophyceae b) Rhodophyceae c) Chlorophyceae
Fonte:a)http://portphillipmarinelife.net.au/species/11137,2016;b)http://cfb.unh.edu/phycokey/Ch
oices/Rhodophyceae/ Macroreds/AHNFELTIA/Ahnfeltia_image_page.htm
,2016;c)https://www.landcareresearch.co.nz /resources /identification /algae/identification-
guide/interpretation/ indicator-taxa/natural-wetlands/nitella,2016
16
A Tabela 1 mostra a composição de algumas biomassas de algas, que
são geralmente constituídas de lipídios, carboidratos e proteinas.
Tabela 1: composição geral de diferentes algas
Alga Proteinas Carboidratos
Lipídios
Chorella vulgaris 51-58 12-17
14-22
Chorella pyrenoidosa 57 26
2
Euglema gracilis 39-61 14-18
14-20
Scenedesmus obliquus 50-56 10-17
12-14
Fonte: Autor, 2016
1.1.1- Microalgas
As microalgas são organismos procariontes ou eucariontes,
fotossintéticos, que crescem rapidamente e vivem em condições adversas
devido à sua estrutura unicelular ou multicelular simples envolvendo enorme
diversidade de formas e funções ecológicas, sendo também aproveitadas em
atividades econômicas. De forma geral, apresentam elevadas taxas de
crescimento, condição que proporciona alta produção de biomassa em
intervalos de tempo curtos. A produtividade de sistemas algaceos é superior a
de quaisquer culturas agrícolas conhecidas. Dessa forma, diversas espécies
são cultivadas para produzir substâncias específicas e de alto valor agregado,
tais como, ácidos graxos, ácidos aminados e pigmentos fotossintetizantes (LI et
al.,2008; PULZ E GROSS, 2004).
Muitas microalgas são potencialmente úteis para produção em grande
escala, entretanto, a escolha de espécies envolve questões diversas, tais como
a velocidade de crescimento. Essas variáveis são influenciadas por alguns
fatores como o meio de cultura utilizado, período de cultivo, a intensidade
luminosa, a temperatura, a salinidade e o foto período. Nesse sentido, existe
uma demanda por pesquisas prospectivas de fisiologia e composição química
de microalgas para identificar espécies úteis à aplicações comerciais (BROWN
et al., 1997).
17
Atualmente, muitos estudos estão sendo conduzidos sobre a utilização
de microalgas em tratamento de águas residuais e para a produção de
biocombustíveis.
A biomassa microalgal apresenta uma composição química heterogênea
que favorece sua aplicação como matéria prima biorrefinária através de
processamento sustentável visando reaproveitar e agregar valor aos
subprodutos decorrentes da produção de biocombustíveis. Entre os
subprodutos que podem ser gerados e aproveitados está a biomassa residual
rica em material proteico bruto (mais de 30% da biomassa seca). Além disso,
estima-se que 100 milhões de toneladas de proteínas serão adicionalmente
produzidas a partir de biomassa da indústria de biocombustível (CHISTI, 2007;
SKJANES et al., 2007 TRIVEDI et al., 2015).
1.1.2- O gênero Monoraphidium.
O gênero Monoraphidium pertence à família das Selenastraceae, algas de
água doce com taxonomia incerta. Geralmente possuem formato alongado, em
linha reta ou curva, e se reproduzem exclusivamente por auto esporulação. O
teor lipídico pode chegar a 56%, dependendo eventualmente das condições de
cultivo empregadas. A biomassa microalga da espécie Monoraphidium sp. tem
mostrado resultados relevantes em processos de biossorção visando a
recuperação de metais pesados e o decorrente tratamento de efluentes nas
industrias (YU et al., 2012; PALMIERI, GARCIA e MELNIKOV, 2000).
18
Figura 2: Microalga Monoraphidium sp.
Fonte: Osti, et al. 2010
O cultivo da biomassa microalgal apresenta versatilidade em relação à
utilização de água, podendo ser cultivada em ambiente aquático doce ou
salgado e também em efluentes de águas residuais impróprias para o consumo
humano (HARUM, JASON e CHERRINGTON, 2011).
1.2- BIORREFINARIAS
A diversificação energética, tendo em vista impulsionar o uso de fontes
renováveis, passou a ser algo essencial para o desenvolvimento sustentável.
Portanto, a procura por recursos limpos que permitam assegurar as
necessidades energéticas futuras constitui um dos maiores desafios da
atualidade. O emprego da biomassa para produção de biocombustível é uma
alternativa válida para minimizar impactos ambientais, dependência econômica
e energética do petróleo (CHEN et al., 2011; DEMIRBAS, 2010)
Biorrefinária é um processo industrial, onde a biomassa é convertida em
uma gama de compostos bioquímicos, materiais e produtos energéticos. O
processamento biorrefinário baseia-se na utilização da biomassa de forma
abrangente, visando o aproveitamento completo da matéria prima, sendo o
objetivo minimizar a geração de resíduos (ZHU, 2015; ZHU et al., 2014).
19
O cultivo de biomassa a partir das microalgas é considerado como uma
forma de superar nossa dependência atual dos combustíveis fósseis, tais como
os rendimentos elevados da área em comparação com outras culturas, alta do
petróleo conteúdos em algumas cepas, as taxas de consumo de água baixa, e
a possibilidade de produção de microalgas em terras inférteis. Estas vantagens
têm atraído várias empresas petrolíferas, a investir nesta área. Além de que,
um estudo recente indicou que a produção de biocombustíveis de microalgas
está relativamente perto de ser uma economia viável, dada a evolução
esperada em ambas as condições de mercado e tecnologia de produção
(MASCARELLI, 2009; STEPHENS et al., 2010).
1.3- POTENCIAL ENERGÉTICO
Energia é visto como uma linha de base para o desenvolvimento econômico
e social, uma vez que melhora os padrões de vida e status sociais. Entretanto,
o número de atividades humanas e o amplo uso de combustíveis fósseis para o
transporte, fabricação e geração de energia tem contribuído significativamente
para a emissão de gases de efeito estufa e outros poluentes nocivos,
resultando em mudanças climáticas indesejadas no mundo (JAKHRANI, 2012;
CHEN et al. 2011; BATAN, 2010).
Microalgas foram inicialmente exploradas pela sua capacidade de acumular
proteínas e, ao longo do tempo, o interesse por essa biomassa tomou um novo
rumo especialmente durante as duas últimas décadas com o aumento da
demanda por esse tipo de energia. Essa biomassa provou ser uma importante
fonte de metabolitos primários. Assim, muitos dos estudos concentraram-se na
extração de lipídios e de proteínas, negligenciando o potencial de microalgas
para produzir esses e outros componentes de alto valor (FOLEY, 2011).
1.4- PROTEÍNAS
Proteínas são originadas a partir de cadeias longas de aminoácidos,
macromoléculas biológicas que possuem em sua estrutura ligações peptídicas.
Considerando-se que elas não são pigmentos de microalgas por isso são
20
pouco valorizados, com exceção da alimentação humana e animal
(SOLOMONS, 2012; BECKER, 2004; SPOLAORE et al., 2006).
Por ser composta de diferentes aminoácidos, consequentemente a
qualidade nutricional de uma proteína é determinada basicamente pelo teor,
proporção e a disponibilidade de seus aminoácidos (BECKER, 2004).
A maioria dos dados publicados na literatura sobre as concentrações de
proteínas em microalgas são baseados em estimativas das proteínas brutas,
comumente usado na alimentação humana e animal. A qualidade nutricional de
uma proteína é determinada basicamente pelo teor, proporção e da
disponibilidade de seus aminoácidos (RADAKOVITS et al, 2010).
As proteinas purificadas podem ser usadas no mercado de produtos
químicos de alimentos, rações, saúde (RADAKOVITS et al., 2010).
1.5- LIPÍDIOS
São compostos de origem biológica que possuem solubilidade em
solventes apolares, porém existem lipídios de cadeias polares que são
solubilizados em solventes polares. O nome lipídio vem da palavra grega lipos,
que significa gordura e diferentemente das proteinas e carboidratos, os lipídios
são definidos através de seu isolamento e não pela sua estrutura. A extração
de lipídios com solvente apolar é muito comum, mas apenas uma parte da
fração de lipídio total é obtida. Como existem também lipídios de cadeias
polares ao se usar a extração com solventes apolares esses lipídios polares
não são extraídos (SOLOMONS, 2012).
Muitos ácidos carboxílicos são encontrados como ésteres de glicerol e
triacilgliceróis. A composição lipídica microalgal inclui ácidos graxos saturados
e insaturados com 12 a 22 átomos de carbono, alguns deles da família ω-3 e
ω-6 e que podem ser convertidos principalmente em biodiesel. Vale ainda
ressaltar, que o ambiente, os nutrientes empregados e as fases do cultivo
21
podem afetar a composição dos ácidos graxos (MATA, 2010; GOUVEIA,
OLIVEIRA, 2009).
1.6- MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE METABÓLITOS PRIMÁRIOS
O processo de extração de biomassa microalgal (seca ou úmida), bem
como sua eficácia, representa um importante avanço na obtenção desses
metabolitos. Por isso, é essencial encontrar um método eficaz para aumentar o
rendimento de extração de uma maneira geral (LEE et al, 2010; MERCER E
ARMENTA, 2011).
Vários métodos já têm sido utilizados para este fim, a maioria deles são
assistidas com solvente, tal como, extração de Soxhlet com n-hexano, o
método Bligh e Dyer que consiste em uma mistura de solventes
clorofórmio/metanol e extração de fluido supercrítico com CO2 ou metanol
(RANJAN, A. PATIL, C. MOHOLKAR, V., 2010; HALIM et al., 2012; BLIGH E
DYER, 1959; ANDRICH et al., 2005; PATIL et al., 2010).
No entanto, existem outros processos que não são necessários a
assistência de solvente. Utilizam moinhos de esferas, prensagem, enzima,
pirólise, ultrassom e micro-ondas, campo elétrico pulsado e de liquefação
hidrotermal (RICHMOND, 2004; SANDER E MURTHY, 2009; DU et al., 2011;
BROWN, DUAN E SAVAGE, 2010).
Estudos recentes tentam desenvolver estratégias de extrações de lipídios e
proteínas que sejam eficazes quanto ao rompimento da parede celular através
da associação de solventes e técnicas de perturbação (BALASUBRAMANIAN,
YEN DOAN e OBBARD, 2013; CHENG et al., 2011;. HALIM et al., 2012;
ULKER D. et al., 2014).
Assim, a composição química de microalgas, as suas características
morfológicas e estruturais também influenciam a eficiência de solubilização de
proteina. Algumas proteinas são difíceis de solubilizar por causa da sua
natureza hidrofóbica, ou devido à presença de uma ligação dissulfeto entre
moléculas de proteinas que induzem a diminuição da solubilidade da proteína.
A solubilidade proteica pode ser melhorada em meio alcalino. No entanto, no
22
caso de tratamento alcalino, a atenção deve ser dada para evitar saponificação
de lipídios intracelulares (SHEN et al., 2008).
A essa resistência da célula microalgal, tal como a natureza química do
material a ser extraído, são alguns dos aspectos que reagem à seleção de
método a ser empregado (CRAVOTTO et al., 2008).
De acordo com a literatura existem alguns tipos de determinação de
proteínas. O método Lowry e o método de Bradford são efetuados por
espectrofotometria, sendo o método de Lowry utilizado para detectar proteína
através da reação catalisada por cobre e fenol de Folin. Essa reação química
detecta ligações peptídicas e também é sensível a alguns aminoácidos tais
como tirosina e triptofano (LEGLER et al., 1985).
No método de Bradford, o corante azul brilhante (Coomassie Brilliant Blue)
está ligado à proteína, principalmente por resíduos de arginina e para um grau
inferior em histidina, lisina, tirosina, triptofano e resíduos de fenilalanina. A
ligação entre os aminoácidos e o corante é atribuída as forças de Van der
Waals e as interações hidrofóbicas (COMPTON E JONES, 1985).
1.7- TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS
As técnicas espectroscópicas englobam diferentes faixas no espectro
eletromagnético, tais regiões podem possibilitar relevantes informações
relacionadas às estruturas de moléculas orgânicas, devido as diferentes
alterações quânticas. O FT-IR também pode ser utilizado para as
determinações de conteúdo lipídico e proteico em microalgas (SKOOG et al.,
2009; LV et al., 2010).
1.7.1- Espectroscopia na Região de Infravermelho Médio
A região do infravermelho médio (400-4000 cm-1) e mais utilizada para
identificação de grupos funcionais orgânicos. Assim, quando as moléculas são
submetidas a radiação na faixa do infravermelho, se excitam para atingir um
estado de maior energia. Neste caso, o processo de absorção refere-se às
23
frequências de radiação equivalentes às frequências vibracionais naturais da
molécula analisada, e a energia absorvida aumenta a amplitude dos
movimentos vibracionais das ligações na molécula. No entanto, apenas
moléculas com ligações que possuem um momento dipolo variante em função
do tempo, decorrente de movimentos vibracionais ou rotacionais são capazes
de absorver energia na região do infravermelho (PAVIA, et al., 2010).
Aminoácidos existem como zwitterions (sais internos) e exibem
espectros que são combinações de carboxilatos e sais de amônia primária.
Apresentam estiramento NH3+, como uma banda muito larga, dobramento N−H
(assimétrico/ simétrico) e estiramento COO- (assimétrico/ simétrico) (PAVIA, et
al 2010).
1.7.2- Espectroscopia na Região do Uv-Vís
A espectroscopia no ultravioleta visível (UV-Vís) abrange a região de
190 – 800 nm, sendo esta faixa de pouca utilidade na elucidação estrutural.
Porém, combinadas a informações cedidas pelos espectros de infravermelho
podem gerar informações valiosas. No caso, da espectroscopia no UV-Vís, as
transições que resultam em absorção de radiação eletromagnética nesta região
do espectro ocorrem entre níveis de energia eletrônicos Quando uma molecula
absorve energia, um eletron e promovido de um orbital ocupado para um orbital
desocupado de maior energia. Em geral, a transição mais provável e do orbital
ocupado de maior energia para o orbital desocupado de menor energia. As
transições mais viáveis nessa região do espectro são do tipo 𝜋 → 𝜋* e 𝑛 → 𝜋*
por envolverem um conteúdo menor de energia. Contudo, e possível observar
bandas de absorção referentes a pigmentos (ricos em sistemas π), assim
como, a presença de ligações duplas conjugadas na composição química
analisada. (PAVIA, et al 2010).
24
2 – OBJETIVOS
2.1- OBJETIVO GERAL:
Avaliar a possiblidade de maximizar o uso da biomassa microalgal da
espécie Monoraphidium sp. em uma perspectiva biorrefinária, a partir da
extração e caracterização de seu material lipídico e proteico.
2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Extrair o material proteico presente na biomassa microalgal úmida, em
meio alcalino, empregando vias mecânicas para rompimento celular;
Liofilizar a biomassa microalgal;
Extrair o material lipídico hexanico utilizando sonicação para rompimento
celular;
Caracterizar os extratos proteico e lipídico por FTIR;
Quantificar o material proteico utilizando o método de Bradford;
25
3 – METODOLOGIA
Neste tópico serão apresentados os métodos equipamentos e reagentes
utilizados para a extração do ML e MP e suas respectivas caracterizações.
Nessa metodologia foram utilizados os seguintes equipamentos:
Ultrassom UNIQUE, modelo ultracleaner 1400;
Centrifuga REFRIGERATED CETRIFUGE EXCELSA 4, modelo
280 R;
Liofilizador de marca - ENTERPRISE I, utilizando o gás N2;
Espectrofotômetro UV-Vis NIR;
Espectrofotômetro JASCO, modelo FTIR- 4200;
Tris-HCl com concentração de 1M e pH 7,5;
Software Graphpad prism versão 5.03;
n-hexano grau P.A
Diclorometano grau P.A
O reagente Coomassie Brilliant Blue
Espectrofotômetro de micro placas da empresa BioTek,
3.1- OBTENCAO E TIPO DE MICROALGA
As amostras da Monoraphidium sp. foram cedidas pelo projeto de
pesquisa: “Implementação de uma planta piloto para produção de biomassa de
microalgas, visando a obtenção de biodiesel”, parceria Petrobras/CENPES-
UFRN a amostra usada foi cultivada na fazenda Samiza, localizada na Cidade
de Extremoz /RN, Brasil.
26
ML: Material Lipídico
MP: Material Proteico
MLBR: Material Lipídico resultante biomassa residual do MP
Figura 3: Fluxograma de obtenção do material lipídico e proteico
Extração ML
Caracterização por
FTIR e UV-Vís
Caracterização por Bradford e UV-Vís
Caracterização por FTIR
Microalga Monoraphidium sp.
Trituração
Peneiração 80 mesh Extração MP Extração MLBR
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3.2- EXTRACAO DO ML DA MICROALGA
A biomassa seca foi triturada com auxílio de um almofariz e pistilo e
homogeneizada pela passagem numa peneira de 80 mesh. A extração do ML
foi realizada com um sistema de rompimento celular, empregando-se 500 mg
de biomassa, 150 mL de n-hexano e 3 intervalos de tempo (2, 4, e 6 horas).
Figura 4: Extração do ML a partir da biomassa microalgal.
Fonte: AUTOR, 2016
Neste caso a extração foi feita através do banho ultrassônico em um
determinado tempo submetendo o material aos efeitos da cavitação causada
por um banho de ultrassom. Posteriormente, filtrou-se a fração lipídica e fez-se
a remoção do solvente usando um rotaevaporador a temperatura de 60°C para
obtenção do material lipídico puro.
3.3- EXTRACAO DO MP DA MICROALGA
800 mg de biomassa seca foi utilizada para a extração do MP. O tampão
extrator foi o Tris-HCl com concentração de 1M e pH 7,5, sendo utilizado em
torno de 5 mL para 800 mg de biomassa. Posteriormente, a mistura resultante
foi sonicada por 10 min em um ultrassom UNIQUE, modelo ultracleaner 1400, e
em seguida centrifugada sob-refrigeração durante 10 min a 5000 rpm e 5 °C
em uma centrifuga REFRIGERATED CETRIFUGE EXCELSA 4, modelo 280 R.
O sobrenadante (MP) foi recolhido para posterior quantificação e a biomassa
residual (BRMP) liofilizada e armazenada a -20 °C.
28
3.4 – EXTRAÇÃO DO ML PROVENIENTE DA BIOMASSA RESIDUAL PÓS-
EXTRAÇÃO DO MATERIAL PROTEICO (MLBRMP)
A biomassa resultante do processo de extração do MP foi inicialmente
seca em um liofilizador de marca - ENTERPRISE I, utilizando o gás N2, como é
mostrado na Figura 5. A amostra depois seca foi submetida à extração do ML
de acordo com método descrito no tópico 3.2.
Figura 5: Liofilizador ENTERPRISE I
Fonte: AUTOR, 2016
3.5- TRATAMENTOS ESTATISTICO DOS DADOS E CALCULO DO TEOR
LIPIDICO EXTRAIDO
As análises foram realizadas em duplicata e determinou-se a média e o
desvio padrão das medidas. Os dados estatísticos foram tratados no software
Graphpad prism versão 5.03, utilizando um teste ANOVA.
3.6- CARACTERIZACAO ESPECTROSCOPICA POR UV-VIS.
A caracterização espectroscópica na região do UV-Vís foi realizada em
um espectrofotômetro UV-Vis NIR, através da dissolução de aproximadamente
0,05 mg de ML em 3 mL do solvente que foi usado como extrator. Este mesmo
29
solvente foi usado como branco na análise. Foi realizada varredura na faixa de
200 a 800 nm, com intervalos de 1 nm e medidas de absorbância de 0 -1 A.
3.7- CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA POR FTIR
A preparação prévia da amostra consiste na dissolução do material lipídico
em diclorometano e deposição dessa solução sobre um disco de KBr, que são
mantidas em repouso ate a total evaporação do solvente e decorrente
formação de um filme fino sobre a pastilha. A análise por FTIR foi realizada em
um espectrofotômetro JASCO, modelo FTIR- 4200, faixa espectral de 600 –
4000 cm-1, com resolução máxima 0,5 cm-1 e 32 varreduras.
Quando uma molécula absorve energia, um elétron é promovido de um
orbital ocupado para um orbital desocupado de maior energia. Para as
moléculas, a absorção no UV acontece, em geral, em uma ampla faixa de
comprimentos de onda, pois, as moléculas possuem muitos modos excitados
de vibração e de rotação. Compostos altamente coloridos devem conter um
sistema conjugado de cadeia longa, que seria exatamente o caso dos lipídios,
pois possuem uma cadeia longa alifática.
Dessa forma, o uso desse tipo de técnica tem como finalidade observar a
presença principalmente de pigmentos contidos nos extratos hexanicos.
3.8 – QUANTIFICAÇÃO DO MP DA MICROALGA
As diferenças entre os ensaios de Lowry e Bradford pode ser esperado
porque esses procedimentos usam princípios diferentes. O ensaio de Lowry
detecta proteínas através da redução do reagente Fenol de Folin catalisada por
cobre. Esta reação detecta ligações peptídicas, mas é também altamente
sensível aos aminoácidos específicos, tais como tirosina e triptofano (Legler et
al., 1985). No ensaio de Bradford, o corante Coomassie Brilliant Blue está
vinculado por uma proteína, principalmente por resíduos de arginina (Compton
e Jones, 1985). Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e
macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais
básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto
30
peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do
corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm
A concentração proteica foi determinada utilizando o sobrenadante da
amostra e empregando o método descrito por Bradford (1976). Esse método é
colorimétrico e tem como determinar a presença ou não de proteínas na
amostra a partir da mudança de coloração. O reagente Coomassie Brilliant
Blue, presente no reagente de Bradford, se torna azul ao se ligar à arginina e
aminoácidos aromáticos das proteínas. utilizando-se um espectrofotômetro de
micro placas, podemos estimar a concentração de proteínas. Para essa
determinação foi utilizado albumina sérica bovina (BSA) como padrão. A
concentração de proteína (mg/mL) foi determinada pela equação da reta obtida
pela seguinte curva padrão representada na Figura 6:
Figura 6: Gráfico da concentração de proteina pela Absorbância.
Onde: y é absorbância e x a concentração do MP expressa em mg/mL.
31
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo serão discutidos os resultados referentes às extrações do
material lipídico (ML) e material proteico (MP) da microalga Monoraphidium sp.
além disso, dados espectroscópicos serão incluídos para confirmar a extração
dos metabólitos primários microalgais, assim como, para verificar possíveis
modificações estruturais dos constituintes dos extratos durante os processos
extração. A empregabilidade da BRMP (biomassa residual da extração do
material proteico) foi avaliada tendo como base o ML presente na amostra após
o processo extrativo.
4.1 – EXTRAÇÕES DO ML DA MICROALGA
As análises foram realizadas em duplicata e determinou-se a média e o
desvio padrão das medidas. O teste ANOVA de fator único apresentou um
valor de F= 416,3438>Fcrítico= 9,5520, portanto o fator tempo possui influência
significativa sobre o ML extraído. Comentar que quanto maior o valor de F mais
significativo é o parâmetro estudado sobre material lipídico extraído.
A Tabela 2 mostra os diferentes tempos submetidos na extração do ML
e BR, seus respectivos rendimentos e coloração (Figura 8).
Tabela 2: Conteúdo lipídico, biomassa residual (BR) e a variância referente aos processos extrativos realizados com a biomassa da microalga, assim como, aspectos físicos dos extratos Monoraphidium sp. em diferentes tempos.
Fonte: Autor, 2016
A análise das médias do ML extraído permite observar que entre o
intervalo de 2 – 6 horas implica que o tempo tem significativa importância.
Quanto maior o tempo submetido à extração da biomassa maior será a
quantidade de ML extraído, pois a eficiência do rompimento celular utilizado
banho ultrassônico melhorado, ocorrendo dessa forma uma melhor extração do
ML. As extrações de 4 horas e 6 horas apresentaram valores de rendimento
próximos, dessa forma, relacionando o custo benéfico, o melhor tempo para a
Tempo (h) ML (%) BR (%) 𝜎2 Cor
2 10,50 + 0,763 72,8 0,583 Amarelo
4 27,61 + 0,764 63,4 0,551 Laranja
6 33,71 + 0,976 66,6 0,953 Laranja
32
extração seria de 4 horas. A Figura 8 mostra o aspecto do ML nos diferentes
tempos de extração.
O rendimento da BR da microalga Monoraphidium se mostrou bastante
promissor, pois essa BR poderá ser aplicada em diversas partes da indústria
biorrefinária. O uso de microalgas para a produção de biocombustíveis é uma
alternativa válida para diminuir os impactos ambientais causados pelos
combustíveis não fosseis. Essa produção de biocombustíveis a partir de
microalgas baseia-se primeiramente na produção de biomassa com elevadas
produtividades. Dessa forma, a BR torna-se uma matéria prima biorrefinária,
visando a importância do reaproveitamento completo dessa matéria prima.
Figura 7: a) Extração 2h do ML em banho ultrassônico. b) Extração 4h do ML em banho ultrassônico.
c) Extração 6h do ML em banho ultrassônico
33
4.2 CARACTERIZAÇÕES ESPECTROSCÓPICAS DO ML MICROALGAL 4.2.1- Caracterização por FTIR
Alguns lipídios são compostos principalmente por cadeias alifáticas de
ácidos graxos (ésteres), outros possuem cadeias polares caracterizando outro
tipo de classificação. Esses compostos possuem características marcantes no
espectro de infravermelho, como a banda C=O bastante intensa que aparece
entre 1750 e 1735 cm-1 característico de éster. Nos espectros do ML da Figura
8 mostra essa banda bem intensa em 1745 cm-1, caracterizando que ocorreu a
extração de um composto com o grupo carboxila presente em sua estrutura.
Outra banda bastante intensa aparece entre 1153 cm-1 referentes ao
estiramento C−O presente nos ésteres. Apesar de alguns grupos de carbonila
de ésteres aparecem nas mesmas regiões que alguns grupos cetonas, mas
essas podem ser eliminadas ao se observar esse estiramento C−O intenso e
largo. Pode-se observar um estiramento C−H referente a carbono sp3 bastante
intenso localizado em 2919 cm-1 mostrando a confirmação da presença de uma
cadeia carbônica alifática.
34
Figura 8: espectros das extrações do ML em diferentes tempos.
Existem duas grandes diferenças observadas nesses espectros de
diferentes tempos de extrações. No espectro de extração de 2h aparece uma
banda larga e intensa após 3400 cm-1, essa banda pode ser atribuída a uma
ligação O−H bastante intensa, isso pode ocorrer devido o tempo entre a
estocagem e a analise do material, ocorrendo então a presença de umidade.
Outra diferença importante observada nesses espectros é a presença de
uma banda fraca em aproximadamente 1620 cm-1 que está caracterizada pela
conjugação de ligações C=C. Esse estiramento só aparece no espectro de 4h
e 6h de extração.
4.2.2 – Caracterização por UV-vís
A espectroscopia do ultravioleta e visível (UV-vís), as transições que
resultam em absorção de energia eletromagnética nessa região do espectro
ocorrem em níveis de energia eletrônicos. Os principais pigmentos
35
carotenoides (majoritariamente) e clorofila (esporadicamente). (PAVIA, et al.
2010)
Figura 9: a) Espectro UV-Vis da extração com tempo de 2 horas. b) Espectro UV-Vis da extração com tempo de 4 horas. c) Espectro UV-Vis da extração com tempo de 6 horas.
Como pode ser observado nos espectros da Figura 9, aparecem duas
bandas de absorções entre 250 e 360 nm. Uma dessas bandas indica
geralmente uma transição 𝑛 → 𝜋* em comprimentos de ondas maiores
(aproximadamente em 300 nm) e outra transição, neste caso, 𝜋 → 𝜋* em
comprimentos de onda menores (aproximadamente 250 nm). Esses tipos de
absorções entre 200-250 nm geralmente são atribuídas à presença de
insaturações C=C. Ratificando a presença de compostos com características
de ligações duplas.
36
4.3 - QUANTIFICAÇÃO DO MP MICROALGAL
Como um resultado, a reatividade de qualquer dos ensaios para uma
determinada proteína irá ser uma função da composição da proteína e a
afinidade de se ligar ao corante. Como é observada na Figura 10 quanto mais
azul a amostra estiver mais quantidades de MP existem, dessa forma,
mostrando a presença de proteínas naquela amostra.
A concentração proteica para microalga Monoraphidium sp. foi de 0,765
+ 0,0123 mg/mL, essa concentração está aceitável. De acordo com a literatura
a concentração de proteína detectada pelo método escolhido para a
quantificação, Bradford, é entre 0,14 e 0,97. Assim sendo, a concentração
encontrada no ensaio de Bradford dentro dos padrões existentes na literatura.
Figura 10: Quantificação do MP pelo método de Bradford (1976)
Fonte: Autor, 2016
A biomassa microalgas está progressivamente sendo utilizada como
fonte de energia renovável pela sua gama de compostos energéticos.
Produzido industrialmente pelo seu alto teor lipídico, mas também pelo alto teor
de proteína utilizada tanto na área de biocombustíveis quanto na área
alimentícia (BECKER, 2007; LUBITZ, 196; SEYFABADI, et al, 2011).
37
4.4- EXTRAÇÃO DO ML DA BRMP
A Tabela 3 mostra os resultados da extração do ML após a extração do
MP. A BR do MP foi submetida ao mesmo método descrito no item 3.2, dessa
forma os resultados obtidos para essa extração estão descritos abaixo.
Tabela 3: Conteúdo lipídico, biomassa residual (BR) e a variância referente aos processos extrativos realizados com a biomassa residual após a extração da proteína, assim como, aspectos físicos dos extratos Monoraphidium sp. em um tempo de 4 horas.
Tempo (h) ML (%) BR (%)
4 21,82 62,76
O tempo de extração de 4 horas em solvente hexano e banho
ultrassônico, não se mostrou muito promissor para a extração do ML após a
extração do MP. Pois como se pode observar o rendimento total do ML foi
muito baixo comparado com o rendimento do ML sendo extraído antes da
extração do MP. Isso pode ser característico, pois para se obter um resultado
eficaz da extração do MP deve-se utilizar um meio alcalino, dessa forma não
pode evitar a saponificação dos lipídios intracelulares.
4.4.1 Caracterização do MLBRMP
Figura 11: Espectro de infravermelho da extração 4 horas do ML a partir da biomassa residual do MP
38
Comparando o espectro da Figura 11 com a Figura 8 houve um
deslocamento da carbonila, antes essa carbonila estava em 1745 cm-1, na
Figura 11 esse estiramento C=O está localizado em 1720 cm-1 caracterizando
um sal de ácido carboxílico. Esse tipo de molécula apresenta um estiramento
O−H com uma banda muito larga entre 3116 e 3664 cm-1 como é mostrado no
espectro da Figura 11. Também aparece um estiramento em 1377 cm-1,
caraterístico de um estiramento C−O.
Devido a biomassa dessa extração já ter sofrido uma mudança no pH
quando se extraiu o MP, essa mudança de meio acarretou a saponificação do
material lipídico ácido intracelular, transformando-o em um sal derivado de
acido carboxílico. Por esse motivo, o rendimento total do ML foi diminuído e
não apenas o ML que não foi saponificado, extraído.
39
5 – CONCLUSÃO
As microalgas mostram-se como fontes promissoras para a extração de
lipídios e proteínas, uma vez que apresentam um rápido crescimento e
necessitam de menores áreas de cultivos, além de consumir grandes
quantidades de gás carbônico.
O método de extração empregado para a microalga Monoraphidium sp.
se mostrou muito promissor, pois conseguiu o rompimento da parede celular
microalgal e extrair o ML e o MP. Através das análises por UV-Vis associado
aos espectros de infravermelho, observa-se que o extrato por hexano remove
constituintes de menores comprimentos de onda, predominantemente
triglicerídeos.
O ML extraído da biomassa residual após a extração do MP mostrou um
perfil espectroscópico diferente do ML extraído da biomassa virgem. Dessa
forma, esse material foi saponificado e transformado em um sal de acido
carboxílico diferente do que queria ser obtido. Porem o acido carboxílico é um
dos constituintes principais da biomassa microalga, podendo obter possíveis
valores energéticos.
40
6 – REFERÊNCIAS
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