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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MARÍLIA MEDEIROS FERNANDES DE NEGREIROS
MODIFICAÇÕES QUÍMICAS DE POLISSACARÍDEOS DAS
ALGAS LOBOPHORA VARIEGATA E DICTYOTA MERTENSII
POTENCIALIZAM SUAS ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS.
NATAL
2019
MARÍLIA MEDEIROS FERNANDES DE NEGREIROS
MODIFICAÇÕES QUÍMICAS DE POLISSACARÍDEOS DAS
ALGAS LOBOPHORA VARIEGATA) E DICTYOTA MERTENSII
POTENCIALIZAM SUAS ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS.
Tese apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de Doutora
em Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira
Rocha.
NATAL
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Negreiros, Marilia Medeiros Fernandes.
Modificações químicas de polissacarídeos das algas Lobophora variegata e Dictyota mertensii potencializam suas atividades
farmacológicas / Marilia Medeiros Fernandes de Negreiros. - Natal, 2019.
173 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Bioquímica. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
1. Polissacarídeo neutro - Tese. 2. Polissacarídeo sulfatado - Tese. 3. Algas marrons - Tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de
Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 547.458
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que tudo vê, tudo sente e está em todos os lugares,
inclusive em cada palavra destes agradecimentos.
Obrigada a meus pais (Porfírio e Verônica Negreiros) e irmã (Beatriz Negreiros)
por proverem os caminhos os quais me levaram aqui hoje, por darem muito mais do
que apoio as minhas escolhas profissionais, e sim, tornarem os meus sonhos os de
vocês também. Mãe, eu sou imensamente inspirada pela sua garra, sua vontade de
ser melhor, não melhor do que os outros, mas melhor do que é agora. Pai, a ternura
pode vir de muitas formas, não sei por que, mas a sua forma vem carregada de
verdade e por isso é tão boa. Bibi e Ricardo vocês são as pessoas, distantes, mais
perto de mim e isso me da a certeza de que terei sempre vocês para contar. Família
obrigada por me ensinarem muitos dos valores os quais defendo e que me ajudaram
e me ajudarão. E é claro, pelos momentos, pelas emoções, pelas leseiras, pela paz,
pela sabedoria, pelos bens, pela força, pelas lições e pelo amor. Muito obrigada.
Agradeço ao restante de minha família. Sejam tios, tias, primos, primas, avôs,
avós e agregados. Que com uma palavra, uma “leseira”, um exemplo, um sorriso ou
um gesto, fizeram parte da minha história, e a historia da humanidade não pode ser
escrita sem falar da história daqueles que viveram e marcaram. Quero deixar um
agradecimento especial a minha tia e madrinha Joana Darc Medeiros, que me
concedeu um lar e imenso apoio ao meu caminho estudantil. Ela foi e é a minha
companhia de almoço de todos os sábados. É uma de minhas melhores amigas. Tia-
madrinha, obrigada por sua imensurável generosidade.
Quero agradecer ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, por sua
preciosa orientação neste trabalho e na minha formação pessoal-profissional, me
ensinando sobre: compromisso, liderança e correção. Obrigada por me corrigir com
preocupação, por querer qualidade e por vibrar as conquistas. Obrigada por todos os
momentos de diversão e por reunir meus queridos amigos do laboratório nos
cogitados almoços do laboratório. Obrigada.
À Israel Luz, por adoçar minha vida em todos os sentidos. Você é o sorriso
bobo que me abobalha e faz perceber o quão leve é a vida. É a cara de bravo que
traz consigo o peso e a responsabilidade no que faz e também me faz ter este senso
de responsabilidade. Você é a falta de frescura que faltava nas minhas frescuras.
Algumas pessoas podem passam uma vida inteira sem encontrar uma razão para
ficar junto, sou feliz porque com você eu não encontro uma razão para não estar.
A todos os amigos que ganhei junto com Rael, seus pais, primos/primas , tias e
tios, amigos, amigas e agregados por me acolherem sejam em sua família de
sangue ou sejam em sua família “que se escolhe”. Vocês são pessoas que me
ensinam sobre identidade só pelo fato de vocês “serem vocês”, sinceros, e eu não
poderia pedir nada melhor.
Às minhas eternas amigas: Eriana Rebouças, Liliane Jales, Clara Manuella e
Cristina Chaves. Pelo que foi dito quando queria escutar, pelo que foi dito quando
não queria escutar, pelas confidencias de coisas simples a decisões importantes, por
serem presentes em minha vida até na ausência de localidade. Por serem
consolação e também a inspiração. Em totalidade, pela amizade incondicional.
À Ana Clara Gurgel, Vitória Lívia, Dênis Freire, Vinícius Costa. Obrigada por
serem meus grandes amigos. Amigos que escutam, desabafam, compartilham,
compreendem, dividem, prestigiam e me fazem estar mais completa. Obrigada por
me mostrarem que um coração cheio de amigos é também um coração que cabe
mais amigos para ficar novamente cheio de amigos.
A todos os meus amigos da graduação do curso de Ciências Biológicas:
Amanda, Julieth, Tábata, Juliana, Sylvia, Alexandre, João Paulo, Sávio, Guilherme,
Fernando, Marcelo, Émile, Victor e a muitos outros amigos da grande Biologia, pelos
estudos em grupo, pela união, pelos reencontros e pela amizade. Obrigada 2009.1.
Aos meus professores de graduação, por todo o conhecimento acadêmico-
científico e erudito, construídos.
À minha turma de mestrado, doutorado e muitos outros com quem cursei
disciplinas e convivi em congresso e corredores do departamento. Por toda a união,
amizade, discussões de artigos e ajuda com os compromissos “compromissados” e
“descompromissados” que fazem parte do mundo da pós-graduação.
Obrigada aos meus queridos amigos dos Patins. Obrigada à Bruno, Priscila,
Angelita, Fábio, João Victor, Aninha, às crianças maravilhosas (Isa, Clarinha, Mari,
Gabriel, Luíza, Brenda) e seus pais incríveis que guardo no coração. Aos amigos do
grupo patins Jardins e também aqueles de outros estados. Vocês me ensinaram
muito sobre a diversidade da amizade. Ensinaram-me muito sobre o esporte e o
esporte me ensinou muito sobre eu mesma. Obrigada.
À todos do laboratório BIOPOL, que tem nome de um lugar, mas ganha
adjetivos como se fosse “gente”. Grande Biopol, família Biopol, amada Biopol. Nele
(lugar/gente) encontrei amigos: Jailma, amiga incrivelmente generosa e divertida,
pude ter essa dimensão ao ver o quanto você é querida por todos; Larisse, amiga
mais bem astral de todos os tempos, muito bom contar e me divertir com você;
Almino, obrigada pela paciência em me ensinar metodologias de laboratório tirar
dívidas e tomar cafés filosóficos na copa; Gabriel e popó (Diêgo), pessoas
incrivelmente divertidas e dispostas a ajudar; Vinícius, Raniere, e Max, muito boas
companhias, obrigada pelas partidas de “UNO”; Adriana, amiga determinada que
sonha junto; Mônica, amiga de grande simpatia e simplicidade; Ivan, contador de
boas histórias; Karoline, conhecedora da computação acadêmica; Mayra e Talita, as
amigas que chegam sempre com um sorriso no rosto; Eder o cara que resolve os
problemas; Leonardo, Cinthia Telles, Jefferson, Mariana, Dayanne, Rafael, Ruth,
Pablo, Fabiana, gostaria de ser sua aluna em uma aula de como ser professora.
Joana, Regina, Jessyka, pessoas incrivelmente competentes e boas de coração que
pude ter o prazer de compartilhar momentos no laboratório.
Obrigada também os amigos integrantes do GicoBio, por compartilharem
espaços, cafés, experimentos e momentos.
E não poderia de deixar de agradecer imensamente à Rony, um amigo
extremamente verdadeiro em tudo que faz e fala; Moacir, aquele amigo que sempre
chega com um rorrizo e um lanche para a hora do café; Raynara, amiga cúmplice de
bancada, obrigada por me ajudar nos experimentos, você é uma pessoa
incrivelmente leve e agradável de conviver e ter ao lado; Monique, você é um
exemplo de equilíbrio, pacencia e disposiçao, seja para ajudar, seja para curtir
ótimos momentos; Weslley, obrigada por ser aquela pessoa que cresce e faz crescer
todos que estão ao seu redor, Lucas Alighieri, o autor da frase que motiva a todos
todos os dias: energia la em cima; Cynthia, pessoa de incrível sensibilidade
emocional e parece que sabe tudo que o outro sente; Lucas Lisboa, pessoa
incrivelmente boa que facilmente conquistou a todos; Mayla, amiga alegre que
chegou com a melhor energia de baton vermelho e Jayane, a modelo mais simpática
que eu conheço e provavelmente a mais verdadeira de todas. Tramém percebo que
é difícil agradecer pelos sentimentos, pois eles fazem mais sentido para mim junto
com os momentos, então obrigada por: tomar café, escutar, comer sonhos, tomar
café, comer pastel, tomar face, passar mal de tanto rir, comer no RU, tomar café de
novo, solucionar problemas, e tomar café de novo, problematizar, e de novo tomar
café, comer em C&T, chorar, falar sobre comida, lamentar, comemorar aniversários,
fazer experimentos que dão errado, pirar, comer bolos, fazer experimentos que dão
certo, comemorar, discordar sobre séries/filmes, discutir sobre aquele artigo bizarro,
discutir sobre aquele artigo massa, e por fazer ciência com a energia lá em cima.
Obrigada.
E aos demais amigos do laboratório que passaram por lá e permanecem na
memória. Obrigada às novas integrantes do laboratório, que a cada dia aprenderão
como é bom fazer parte de algo que você não controla, mas que controla você. Nas
palavras de Hugo, o laboratório ganha vida ao ser preenchido por pessoas, á todos
vocês sei que posso entrar para perguntar e sair sem ter me arrependido de assim
ter feito. Obrigada.
Gostaria de agradecer, a todos, por algo que não é comum de agradecer.
Obrigada pelas dores. Não falo das dores promovidas pela malícia, inveja ou
descaso. Falo das dores que ensinam, as dores da distância, as dores dos erros
acidentais, as dores sofridas juntos, a vida de pos graduação é sermos
constantemente avaliados, obrigada por não me julgar e verem em mim o que eu
posso ser.
À banca de qualificação, Jailma, Leandro e Raniere, pelo aceite em participar
na banca de minha qualificação, pelas contribuições indicadas para munir este
trabalho.
À banca de defesa, Mariana, Cinthia, Naysandra e Eder pelo aceite de
participar na banca de defesa e por contribuir para este trabalho e minha formação.
À Jussier Vitoriano por realizar comigo o processo de carboxilação por DBD e á
Clodomiro Alves Junior do Centro Integrado de Inovação Tecnológica do Semiárido
(CiTED), Universidade Federal Rural do Semi-Árido, pela disponibilidade e
fornecimento do local e material para realização dos ensaios de DBD.
À Prof. Ana Katarina e ao Dr. Francisco Paulo Freire pelo auxílio e manuseio
dos materiais e equipamentos necessários para a realização deste trabalho.
Ao departamento de Química pelas análises de infravermelho e à Mayara e
Francimarpor realizar as análises e ajudar imensamente no manuseio do programa
de interpretação dos dados.
Aos meus professores de mestrado, por todo o conhecimento construído.
Aos colegas e funcionários do departamento de bioquímica pela disposição e
prontidão em ajudar.
Á Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Curso de Ciências
Biológicas.
À CAPES, CNPq e ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica, pelo
financiamento e condições que proveram o desenvolvimento deste trabalho.
RESUMO
Laminarinas (1,3-β-glucanas) e fucanas (polissacarídeos sulfatados
constituídos de L-fucose sulfatada) são sintetizadas por algas marrons e possuem
diversas atividades farmacológicas descritas. Todavia, os polissacarídeos e suas
atividades podem ser modificados, potencializando-as ou não. E para tal, são
utilizadas várias técnicas, como por exemplo, aquelas denominadas de métodos
verdes. Diante do exposto, e tendo em mente que o litoral potiguar, assim como o
nordestino, detém várias espécies de algas marinhas que não tiveram seus
polissacarídeos neutros e sulfatados estudados completamente, este trabalho teve
como objetivo realizar uma prospecção das principais modificações químicas em
polissacarídeos neutros (laminarinas) da alga Lobophora variegata e polisscarídeos
sulfatados (fucanas) da alga Dicytiota mertensii e verificar as suas atividades
farmacológicas, escolhendo as melhores modificações para caracterização
estrutural. As algas foram coletadas na praia de Pirangi, Natal, RN, lavadas e
submetidas à proteólise. Com o uso de fracionamento diferencial com acetona e
técnicas de separação por massa molecular, foi obtido uma laminaria de 12,4 kDa.
Análises físico-químicas mostraram que a laminarina (LM) era constituída apenas de
glicose. As técnicas de descarga da barreira dielétrica (DBD), sulfatação e
galificação foram utilizadas paar se obter as laminarinas modificadas denominadas
LMC, LMS e LMG. As modificações promoveram diferentes quantidades de inserção
dos grupos funcionais: com LMS observou-se 1,4% de sulfato, com LMG observou-
se 1,5% de ácido gálico e com LMC observou-se 11,7% de ácidos urônicos. A
modificação que mais potencializou as atividades antioxidantes de laminarinas foi a
galificação, por isso, LM e LMG tiveram sua estrutura elucidada por Ressonância
Magnética Nuclear (RMN). Os dados obtidos pelas análises de RMN corroboram
com os dados anteriores, comprovando a estrutura da laminarina em LM e
laminarina galificada em LMG. LM e LMG não foram citotóxicas e não alteraram o
ciclo celular de células normais de rim canino (MDCK) em comparação com o
controle. Em parelelo, foi possível obter fucanas da alga D mertensii por meio de
proteólise e precipitação com metanol. Além disso, sintetizou-se nanopartículas de
prata com a fucana, que foi denominada de NF. O sétimo dia foi o dia ótimo de
síntese desta partícula, cujo tamanho foi de aproximadamente 104 nm. As NF
tiveram forma arredondada e distribuição do tamanho bastante homogêneo,
estabilidade por 16 meses e apresentaram uma maior atividade antitumoral
(1mg/mL) comparada à fucana. Com NF também se obteve melhor atividade
antibacteriana do que com a fucana nativa e as atividades imunomodulatórias
(produção de oxido nítrico e produção de citocinas) tiveram resultados semelhantes
comparando-se NF com fucanas nativas. No geral, observou-se que a galificação foi
a melhor modificação química em laminarinas de L. variegata e as NF
potencializaram as atividades farmacológicas das fucanas.
Palavras-chave: polissacarídeo neutro, polissacarídeo sulfatado, algas marrons,
plasma a frio.
ABSTRACT
Laminarin (1,3-β-glucan) and fucan (sulfated polysaccharide consisting of sulfated L-
fucose) are synthesized by brown seaweeds and have several pharmacological
activities described. However, polysaccharides and their activities can be modified,
increasing their activities. Thereunto, various techniques are used, such as those
called green methods. Given the above, and bearing in mind that the potiguar coast,
as well as the northeastern, holds several species of seaweed that have not had their
neutral and sulfated polysaccharides completely studied, this work aimed to prospect
the main chemical modifications in neutral polysaccharides (laminarins) from
Lobophora variegata and sulfated polyscarides (fucanas) from Dicytiota mertensii
and verify their farmacological activities, choosing the best modifications for structural
characterization. Algae were collected at Pirangi beach, Natal, RN, washed and
submitted to proteolysis. Using acetone differential fractionation and molecular mass
separation techniques, a 12.4 kDa laminarin was obtained. Physicochemical analysis
showed that laminarin (LM) consists only of glucose. Dielectric barrier discharge
(DBD), sulfation and galification techniques were used to obtain modified laminarins
called LMC, LMS and LMG. The modifications promoted different amounts functional
groups inserted: for LMS 1.4% of sulfate was observed, for LMG 1.5% of gallic acid
and LMC 11.7% of uronic acids. The modification that most enhanced the antioxidant
activities of laminarins was galification, therefore, LM and LMG had their structure
elucidated by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The data obtained by NMR
analysis corroborate with the previous data proving the structure of laminarin in LM
and gallified laminarin in LMG. LM and LMG were not cytotoxic and did not alter the
cell cycle of normal canine kidney cells (MDCK) compared to the control. In parallel, it
was possible to obtain fucans from D. mertensii after proteolysis and precipitation
with methanol. Therefore, silver nanoparticles with fucan called NF were synthesized
and called NF. The seventh day was the optimal synthesis day for this particle,
whose size was approximately 104 nm. The NF had a round shape very
homogeneous size distribution, and stability for 16 months and showed a higher
antitumor activity (1mg / mL) compared to fucan. NF also had better antibacterial
activity than native fucan and immunomodulatory activities (nitric oxide production
and cytokine production) had similar results when compared to NF with native
fucans. In general, it we observed that the gallification was the best chemical
modification in L. variegata laminarins and the NF potentiated the pharmacological
activities of the fucans.
Keywords: neutral polysaccharide, sulfated polysaccharide, brown algae, cold
plasma.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Representação da diversidade de protistas entre eucariotos. Amoebozoa,
nucletmycea e Holozoa juntos formam a Amorphea; Diaphoretickes inclui
Crypista, Chloroplastida e Embryophyta, Rhodophyceae, Haptista, Rhizaria,
Alveolata (Apicomplexa, Dinoflagellata, Ciliata), Stramenopiles e
Phaeophyta de acordo com Adla et al. (2019). O filo Phaeophyta (antes
denominado algas marrons) está destacado por um retângulo. ................. 28
Figura 2- Estruturas químicas das extremidades redutoras das laminarinas de cadeia
M e G de acordo com Kadam, Tiwari & O´Donnel, (2015). Em (A) a
estrutura da laminarina com ligações β-(13) e extremidade redutora com
monossacarídeo do tipo manitol (cadeia M), em (B) a estrutura da
laminarina com ligações β-(13) e extremidade redutora com
monossacarídeo do tipo glicose (cadeia G)................................................ 33
Figura 3- Reação de sulfatação de acordo com Foster (1997). Reação que ocorre
pela inserção de trióxido de enxofre (SO3) a um oxigênio que fazia parte de
outra molécula. ........................................................................................... 36
Figura 4- Esquema de um equipamento de descarga de barreira dielétrica (DBD). 1-
ociloscópio, 2- fonte de energia, 3- dielétrico, 4- Gás hélio. Azul= Amostra;
Rosa= Plasma; Verde= Material dielétrico; Preto= Eletrodos. .................... 39
Figura 5 - Representação da estrutura do ácido gálico. Anel aromático indicado no
centro, grupo carboxila circulado em vermelho, grupos hidroxila circulados
em azul e posições do anel aromático denominados em verde. ................ 42
Figura 6- Esquema de um possível mecanismo de inserção de ácido gálico em
polissacarídeos. Na imagem mostra-se a inserção em dextrana. Os radicais
hidroxila, gerados pela interação entre os componentes do par redox, ataca
os átomos-H em R-metileno (CH2) ou grupos hidroxila (OH) do
hidroximetileno do polissacarídeo. AA = ácido gálico. ................................ 43
Figura 7- Alga marinha Lobophora Variegata (J. V. Lamouroux) .............................. 48
Figura 8 - Alga marinha Dictyota mertensii (Martius) Kützing.................................... 49
Figura 9- Esquema de extração dos polissacarídeos. Resumidamente, as algas L.
variegata e D. mertensii foram submetidas a delipidção e proteólise. Em
seguida, o sobrenadante de L. variegata foi precipitado com volumes
crescentes de acetona e as frações foram denominada: F0,3; F0,5; F0,8;
F1,0 F1,5 e F2,0. Posteriormente, as frações F0,8 e F1,0 foram utilizandas
no sistema de separação por tamanho molecular, obtendo-se as frações:
<10 kDa, >30 kDa e >10<30 kDa sendo esta última formada de
laminarinas. Em paralelo, o sobrenadante de D. mertensii foi precipitado
com 2 voumes de metanol para obtenção das fucanas. ............................ 53
Figura 10- Representação do processo de separação com uso de dispositivos de
separação por tamanho molecular (Amicon® Ultra-15 Centrifugal filter). ... 55
Figura 11- Representação esquemática de como ocorreram os tratamentos com
peróxido de hidrogênio em células MDCK. ................................................ 68
Figura 12- Perfil eletroforético da Fucana A (50µg) caracterizada por Rocha et al.
(2005) (Fuc); 100 µg da laminarina sulfatada (LMS); 100 µg de laminarina
nativa (LM; 100 µg de laminarina carboxilada (LMC); e 100 µg de
laminarina galificada (LMG). ....................................................................... 78
Figura 13- Perfil de absorção de luz visível da laminarina nativa e da fucana A
caracterizada por Rocha et al. (2005) (A); laminarina nativa e laminarina
sulfatada (B); laminarina nativa e carboxilada (C) e laminarina nativa e
galificada (D); As amostras foram preparadas a 1 mg/mL. ........................ 79
Figura 14- Perfil de cromatografia de exclusão por tamanho em HPLC da laminarina
nativa (LM); laminarina sulfatada (LMS); laminarina carboxilada (LMC) e
laminarina galificada (LMG); As amostras foram aplicadas a 10 mg/mL. ... 80
Figura 15- Atividade quelante de cobre de 50 µg/mL; 100 µg/mL e 500 µg/mL da
laminarina nativa (em preto) e laminarinas sulfatada (azul) laminarina
carboxilada (verde) e laminarina galificada (vermelho). O padrão de ácido
gálico (em cinza) foi utilizado na quantidade contida nas concentrações
usadas de LMG. Como se verificou que existe 1,48% de ácido gálico em
LMG então foi utilizado 1,5% das concentrações 50; 100 e 500 (ou seja,
0,75; 1,5 e 7,5 µg/mL). Letras diferentes representam diferença significativa
entre LM ou LMS ou LMC ou LMG em diferentes concentrações; números
diferentes representam diferença significativa entre LM e LMS ou entre LM
e LMC ou entre LM e LMG na mesma concentração (P < 0,05). ............... 82
Figura 16- Atividade antioxidante total de 100µg de LM, LMS, LMC e LMG.
Laminarina nativa (LM, em preto) e laminarinas sulfatada (LMS, em azul)
laminarina carboxilada (LMC, em verde) e laminarina galificada (LMG, em
vermelho) O padrão de ácido gálico (em cinza) foi utilizado na quantidade
contida nas concentrações usadas de LMG. Como se verificou que existe
1,48% de ácido gálico em LMG então foi utilizado 1,5% de 100µg (ou seja,
1,5 µg/mL). Asterisco (*) representa diferença significativa entre LM e outra
amostra (P < 0,05). ..................................................................................... 84
Figura 17- Atividade de poder redutor de LM, LMS, LMC e LMG. Laminarina nativa
(LM, em preto) e laminarinas sulfatada (LMS, em azul) laminarina
carboxilada (LMC, em verde) e laminarina galificada (LMG, em vermelho).
O padrão de ácido gálico (em cinza) foi utilizado na quantidade contida nas
concentrações usadas de LMG. Como se verificou que existe 1,48% de
ácido gálico em LMG então foi utilizado 1,5% das concentrações 50; 100 e
500 µg/mL (ou seja, 0,75; 1,5 e 7,5 µg/mL). Letras diferentes representam
diferença significativa entre as diferentes concentrações numa mesma
amostra; números diferentes representam diferença significativa entre LM e
as laminarinas modificadas na mesma concentração (p < 0,05). ............... 85
Figura 18- Espectro de infravermelho de LM (em preto) e LMG (em vermelho). A
seta indica a presença do sinal que está presente em LMG e não em LM.87
Figura 19- Espectro de RMN de LM (A) e LMG (B) com ênfase no pico na região de
6.60 ppm (C) representando hidrogênios de anel aromático. ..................... 88
Figura 20 - Espectro de 2D-RMN (HSQC) de LM. Letras se referem a sistemas de
spin e números se referem à posição dos sistemas de spin. ..................... 89
Figura 21- Atividade redutora de MTT de células tratadas com H2O2 e
posteriormente com LM ou LMG por 24h frente a linhagem de células
renais de cachorro (MDCK) (Efeito reparador). Os valores estão expressos
como média ± desvio padrão nas concentrações de 125, 250 e 500 µg/mL.
Letras diferentes representam diferença significativa entre o controle com
peróxido e o controle sem peróxido ou entre as diferentes concentrações
de uma amostra; números diferentes representam diferença significativa
entre os controles e as amostras (p < 0,05). .............................................. 90
Figura 22- Atividade redutora de MTT de células tratadas com H2O2 junto com LM ou
LMG por 24h frente a linhagem de células renais de cachorro (MDCK)
(Efeito concomitante). Os valores estão expressos como média ± desvio
padrão nas concentrações de 125, 250 e 500 µg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre o controle com peróxido e o
controle sem peróxido ou entre as diferentes concentrações de uma
amostra; números diferentes representam diferença significativa entre os
controles e as amostras (p < 0,05). ............................................................ 91
Figura 23- Atividade redutora de MTT de células tratadas com LM ou LMG por 24h,
posteriormente com H2O2 por 1h e depois com meio com soro por mais 24h
frente a linhagem de células renais de cachorro (MDCK) (Efeito preventivo).
Os valores estão expressos como média ± desvio padrão nas
concentrações de 125, 250 e 500 µg/mL. Letras diferentes representam
diferença significativa entre o controle com peróxido e o controle sem
peróxido ou entre as diferentes concentrações de uma amostra; números
diferentes representam diferença significativa entre os controles e as
amostras (p < 0,05). ................................................................................... 92
Figura 24- Análise da sobrevivência celular por citometria de fluxo de células MDCK
marcadas com anexina (eixo x) e iodeto de propídio (PI) (eixo y). ............. 93
Figura 25- Análise de citometria de fluxo de células MDCK marcadas com PI (eixo y)
mostrando a distribuição no ciclo celular. População Sub-G1: indicativo de
morte celular por danos no DNA; População G1 indica células vivas na fase
G1; População S: indicativo de células passando pela fase de síntese;
G2/M indicativo de células na fase G2 indo para a divisão. ....................... 94
Figura 26 - Perfil de absorção de luz de nanopartículas de D. mertensii (A) Perfil de
absorção de luz, varredura de 350 a 600 nm, de nanopartículas de D.
mertensii. (B) Perfil de absorção de luz, na região de 403 nm, de
nanopartículas de D. mertensii aferidas nos dias: zero, dois, cinco, seis,
sete e oito (de sua síntese). No canto superior direito o aumento da
absorção em relação ao tempo. ................................................................. 96
Figura 27 - Imagens de microscopia de força atômica das nanopartículas de fucana.
A seta evidencia uma nanopartícula. Observa-se nanopartículas são
esféricas. .................................................................................................... 97
Figura 28 - Distribuição do tamanho (histograma) das nanopartículas de prata
contendo fucana. Com maior número de partículas com tamanho entre 71 e
105 nm........................................................................................................ 97
Figura 29 - Gráfico de estabilidade da nanopartícula de fucana. Valores
representados por médias e seus respectivos desvios padrões. Não
ocorreu diferença significativa entre os diferentes tempos. ........................ 98
Figura 30 - Atividade redutora de MTT de células de fibroblasto (3T3) incubados com
fucanas ou NF por 24h. Os valores estão expressos como média ± desvio
padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1 mg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre fucana ou NF em diferentes
concentrações; números diferentes representam diferença significativa
entre fucana e NF na mesma concentração (p < 0.05). ........................... 100
Figura 31- Atividade redutora de MTT de células de melanoma de camundongos
(B16F10) incubados com fucanas ou NF por 24h. Os valores estão
expressos como média ± desvio padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1
mg/mL. Letras diferentes representam diferença significativa entre fucana
ou NF em diferentes concentrações; números diferentes representam
diferença significativa entre fucana e NF na mesma concentração (p <
0.05). ........................................................................................................ 101
Figura 32 - Atividade redutora de MTT de células de macrófagos (RAW 264.7)
incubados com fucanas ou NF por 24h. Os valores estão expressos como
média ± desvio padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1 mg/mL. Letras
diferentes representam diferença significativa entre fucana ou NF em
diferentes concentrações; números diferentes representam diferença
significativa entre fucana e NF na mesma concentração (p < 0.05). ........ 102
Figura 33 - Concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima de
fucanas e nanopartículas de fucanas (NF) de D. mertensii contra E. coli
expressa em densidade óptica e incubada com diferentes concentrações
(10, 50, 100, 200, 300 e 500 µg/mL). “*” – Concentração bactericida
mínima. Controle positivo (Cont+) (meio, bactéria e antibiótico), controle
negativo (Cont-) (meio e bactéria). ........................................................... 103
Figura 34- Concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima de
Fucana e nanopartículas de fucana (NF) de D. mertensii contra S. aureus
expressa em densidade óptica e incubada com diferentes concentrações
(10, 50, 100, 200, 300 e 500 µg/mL). “*” – Concentração bactericida
mínima. Controle positivo (Cont+) (meio, bactéria e antibiótico), controle
negativo (Cont-) (meio e bactéria). ........................................................... 104
Figura 35- Ensaio de produção de óxido nítrico (NO) por células de macrófago de
camundongo (RAW) incubadas com 0,001 mg/mL de Fucana ou NF e
incubados com LPS (+) e sem LPS (-). Letras diferentes representam
diferença significativa entre fucana e NF; números diferentes representam
diferença significativa entre fucana ou NF e o controle (p < 0.05). Cont. -
Controle negativo. .................................................................................... 105
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Algas conhecidas por sintetizarem laminarinas. ....................................... 34
Tabela 2- Trabalhos que identificaram atividade antioxidante potencializada por
processos de sulfatação. .......................................................................... 37
Tabela 3- Atividades de polissacarídeos modificados com Descarda de barreira
dielétrica (DBD). ....................................................................................... 40
Tabela 4 – Tabela que resume os ensaios realizados com os polissacarídeos de L.
variegata e D. mertensii. ........................................................................... 73
Tabela 5- Rendimentos das frações F0,3; F0,5; F0,8; F1,0; F1,5; F2,0. 100%
representa a quantidade total de polissacarídeos obtidos. ....................... 75
Tabela 6- Rendimentos das subfrações <10 kDa, >10<30 kDa e >30 kDa.100%
representa a quantidade total de polissacarídeos obtidos de F0,8-F1,0. . 75
Tabela 7- Resultados de recuperação da laminarina sulfatada (LMS), laminarina
carboxilada por DBD (LMC) e laminarina galificada (LMG) em comparação
a laminarina não modificada (LM). ........................................................... 76
Tabela 8- Resultados das dosagens de proteínas, compostos fenólicos, sulfato e
composição monossacarídica de F0,8-F1,0; Laminarinas (LM);
laminarinas sulfatadas (LMS); laminarina carboxilada (LMC) e laminarina
galificada (LMG). nd – não detectado. ...................................................... 77
Tabela 9- Capacidade sequestradora de radical superóxido de F0,8-F1,0; LM e LMS
em concentrações de 500 e 1000 µg/mL. O padrão de ácido gálico
(isolado) foi utilizado na quantidade contida nas concentrações usadas de
LMG. ......................................................................................................... 81
Tabela 10- Características físico-químicas e atividades antioxidantes de LM, LMS,
LMC e LMG. ............................................................................................. 86
Tabela 11- Espectro de infravermelho de LM e LMG (posição dos sinais). .............. 87
Tabela 12 - Correlações obtidas das análises de 1H e 13C de LM. ............................ 89
Tabela 13 - Rendimentos de obtenção de polissacarídeos (% em relação à massa de
algas) e nanopartículas (% em relação à fucana). ................................... 95
Tabela 14- Resultados das dosagens de proteínas e compostos fenólicos. ............. 99
Tabela 15 – Espectroscopia de disperção de raios-X (EDX) de fucana e
nanopartícula de fucana (NF). .................................................................. 99
Tabela 16 - Espectro de infravermelho da fucana e na nanopartícula de fucana (NF).
................................................................................................................. 99
Tabela 17- Resultados de ensaio de produção de citocinas (identificação de IL-2;
INF-γ e TNF-α; IL-4; IL-6 e IL-10; IL-17A em µM) por macrófagos
incubados com 0,001 mg/mL de fucanas e NF. ..................................... 106
Tabela 18- Sistema de spins obtidos das análises de 1H e 13C de LM em
comparação com a literatura. ................................................................. 127
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
OC Grau Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosina trifosfato
AKT “Phosphoinositide-3-kinase–protein kinase B/Akt”
ANOVA Análise de variância
BIOPOL Laboratório de Biotecnoligia de Polímeros Naturais
BR Brasil
BSA Albumina sérica bovina
CA Carolina
CAT Capacidade Antioxidante Total
CATA Catalase peroxidase
CBA Cytometric Bead Array
cm Centímetros
COSY Correlated SpectroscopY
CTV Cloreto de brometo de N-cety-N-N-N-trimetilamonio
Cu2+ Atividade quelante de cobre
DAMP Padrão molecular associados ao dano
DCC Receptor de Netrin
DBD Descarga de barreira dielétrica
DHBA Ácido 2,3- Diidroxibenzoico
DLS Dispersão de luz dinâmica
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimetil-sulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EDTA Ácido etilenodimino tetra-acético
ERK Sinal de regulação de cinase
EUA Estados Unidos da America
FBS Soro Fetal bovino
F0,8 Fração 0,8
F0,8-1,0 Fração 0,8-1,0
F1,0 Fração 1,0
Fe2+ Atividade quelante de ferro
g Grama
G Gravidade
Gli Glicose
G1 Gap 1
G2-M Gap 2-Meiose
h Hora
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HeLa Células de câncer cervical humano
HK-2 “Hexokinase 2”
HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho
HSQC “Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy”
IF2α Interferon α
IL Interleucina
IUPAC “International Union of Pure and Applied Chemistry”
INF- γ Interferon- γ
kDa Quilodaltons
LM Laminarina nativa
LMC Laminarina carboxilada
LMG Laminarina galificada
LMS Laminarina sulfatada
LSP Lipopolissacarídeo
M Molar
mg Miligrama
mM Milimolar
MAPK MAP-Kinase
MDA “Multiple displacement amplification”
MDCK Madin-Darby Canine Kidney cells (Células renais de cachorro)
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenil tetrazolium bromide
NBT Nitroblue tetrazolium
NF Nanopartícula de fucana
NJ New Jersey
NO Óxido nítrico
O2- Sequestro do radical superóxido
OH- Sequestro do radical hidroxila
OR Oregon
PDA 1,3-diaminopropano
PE Ficoeritrina
pH Potencial hidrogêniônico
PI Iodeto de propídio
ppm Parte por milhao
Q1 Quadrante 1
Q2 Quadrante 2
Q3 Quadrante 3
Q4 Quadrante 4
RAW Células de macrófago de camundongo
RB Gene do retinoblastoma
RCS Espécies derivadas do enxofre do cloro
RMN Ressonância magnética nuclear
RN Rio Grande do Norte
RNS Espécies reativas de nitrogênio
ROS Espécies reativas de oxigênio
RSS Espécies derivadas do enxofre
SPM Scanning Probe Microscope
SFB Soro fetal bovino
SH Grupos sulfidrila
SOD Superóxido desmutase
Sub-G1 Sub Gap 1
TCA Ácido tricloroacético
TGF-β Fator de crescimento de fibroblasto
Th2 T helper cells 2 (células T auxiliares tipo 2)
Th17 T helper cells 17 (células T auxiliares tipo 17)
TMSP Trimetilsilil propionato de sódio
TNF-α Fator de necrose tumoral α
TNFR Receptor de fator de necrose tumoral α
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 27
1.1. ALGAS ......................................................................................................... 27
1.1.1. Classificação das algas ............................................................................ 27
1.1.2. O uso tradicional das algas ...................................................................... 29
1.2. POLISSACARÍDEOS DE ALGAS MARRONS ............................................. 29
1.2.1. Fucanas ................................................................................................... 30
1.2.2. Laminarinas (β-glucanas de algas) .......................................................... 32
1.3. MODIFICAÇÕES QUÍMICAS POR MÉTODOS VERDES ........................... 35
1.3.1. Sulfatação por ácido sulfurico .................................................................. 35
1.3.2. Modificação por plasma de barreira dielétrica .......................................... 37
1.3.3. Ácido gálico e sua conjugação com moléculas ........................................ 40
1.3.4. Síntese de nanopartículas ........................................................................ 44
1.3.4.1. Nanopartículas metálicas ...................................................................... 44
1.3.4.2. Nanopartículas de prata ........................................................................ 45
1.4. Fonte de obtenção dos polissacarídeos ....................................................... 45
1.4.1. Alga Lobophora variegata ........................................................................ 45
1.4.2. Alga Dictyota mertensii ............................................................................. 46
2 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 47
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 47
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 48
3.1. MATERIAL ALGAL....................................................................................... 48
3.2. BACTÉRIAS UTILIZADAS PARA ENSAIOS ANTIBACTERIANOS ............. 49
3.3. CÉLULAS EUCARIÓTICAS UTILIZADAS PARA ENSAIOS DE REDUÇÃO
DE MTT ............................................................................................................ 49
3.4. OUTROS MATERIAIS ................................................................................. 50
3.4.1. Reagentes ................................................................................................ 50
3.4.2. Equipamentos .......................................................................................... 51
3.5. MÉTODOS ................................................................................................... 53
3.5.1. Extração dos Polissacarídeos .................................................................. 53
3.5.1.1. Delipidação ........................................................................................... 54
3.5.1.2. Proteólise .............................................................................................. 54
3.5.1.3. Precipitação e fracionamento dos polissacarídeos ............................... 54
3.5.1.4. Separação com uso dos dispositivos de separação por tamanho
molecular/ Centricons (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter) .............................. 55
3.5.2. Modificação dos polissacarídeos ............................................................. 56
3.5.2.1. Modificação das laminarinas de L. variegata por sulfatação ................. 56
3.5.2.2. Modificação das laminarinas de L. variegata por descarga de barreira
dielétrica (DBD) (carboxilação) .......................................................................... 56
3.5.2.3. Modificação das laminarinas de L. variegata por adição de ácido gálico
(galificação) ........................................................................................................ 57
3.5.3.4. Síntese de nanopartículas de prata com fucanas de D. mertensii ........ 57
3.5.3. Caracterização físico-química .................................................................. 57
3.5.3.1. Eletroforese em gel de agarose das laminarinas de L. variegata .......... 57
3.5.3.2. Caracterização por espectroscopia de luz visível.................................. 58
3.5.3.3. Dosagem de proteínas presente nas amostras ..................................... 58
3.5.3.4. Dosagem de compostos fenólicos presente nas amostras ................... 59
3.5.3.5. Teor de sulfato das amostras ................................................................ 59
3.5.3.6. Teor de Ácidos urônicos ........................................................................ 60
3.5.3.7. Composição monossacarídica .............................................................. 60
3.5.3.8. Espectroscopia de disperção de raios-X (EDS) .................................... 60
3.5.4. Caracterização estrutural dos polissacarídeos ......................................... 61
3.5.4.1. Análise de infravermelho das amostras ................................................ 61
3.5.4.2. Análise do tamanho molecular das amostras ........................................ 61
3.5.4.3. Análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de LM e LMG ......... 61
3.5.4.4. Avaliação do tamanho e carga da nanopartícula .................................. 62
3.5.4.5. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) ......................... 62
3.5.5. Avaliação das atividades farmacológicas dos polissacarídeos modificados
........................................................................................................................... 62
3.5.5.1. Avaliação das atividades antioxidantes in vitro de laminarinas ............. 62
3.5.5.1.1. Avaliação da capacidade do sequestro de íons superóxido (O2-) das
amostras ............................................................................................................ 62
3.5.5.1.2. Avaliação da capacidade do sequestro de radical hidroxila (OH-) das
amostras ............................................................................................................ 63
3.5.5.1.3. Avaliação da capacidade quelante de ferro (Fe2+) das amostras ....... 63
3.5.5.1.4. Avaliação da capacidade quelante de cobre (Cu2+) das amostras ..... 64
3.5.5.1.5. Avaliação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) das amostras .... 64
3.5.5.1.6. Avaliação do poder redutor ................................................................ 65
3.5.5.2. Avaliação das atividades antioxidantes de LM e LMG em cultura de
células ................................................................................................................ 65
3.5.5.2.1. Determinação da condição da injúria ................................................. 65
3.5.5.2.2. Avaliação da capacidade das células, previamente tratadas com
peroxido de hidrogênio e posteriormente tratadas com amostras, reduzirem o
MTT (efeito reparador). ...................................................................................... 66
3.5.5.2.3. Avaliação da capacidade das células, concomitantemente tratadas
com peroxido de hidrogênio e amostras, reduzirem o MTT (efeito concomitante).
........................................................................................................................... 67
3.5.5.2.4. Avaliação da capacidade das células, previamente tratadas com
amostras e posteriormente tratadas com peroxido de hidrogênio, reduzirem o
MTT (efeito preventivo). ..................................................................................... 67
3.5.5.3. Análises de citometria de fluxo de células tratadas com LM e LMG ..... 68
3.5.5.3.1. Análise da viabilidade celular por meio de citometria de fluxo de
células marcadas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) (viabilidade
celular). .............................................................................................................. 68
3.5.5.4.1. Avaliação da Concentração inibitória mínima (MIC) das amostras .... 70
3.5.5.4.2. Avaliação da concentração bactericida mínima (MBC) ..................... 70
3.5.5.5. Análise da atividade redutora de MTT da fucana e sua nanopartícula . 71
3.5.5.6. Análise da atividade imunomodulatória da fucana e sua nanopartícula.
........................................................................................................................... 71
3.5.5.6.1. Ensaio de produção de óxido nítrico das amostras da fucana e sua
nanopartícula ..................................................................................................... 71
3.5.5.6.2. Ensaio de produção de citocinas por células incubadas com da fucana
e sua naopartícula .............................................................................................. 71
3.5.5.7. Análises estatísticas dos ensaios .......................................................... 72
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 74
4.1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS ....................................................................... 74
4.2.1. Rendimentos da extração e modificações ................................................ 74
4.2.2. Caracterização físico-química das amostras ............................................ 76
4. 2.2.1. Dosagens das amostras ....................................................................... 76
4.2.2.2. Perfil das amostras ................................................................................ 77
4.2.2.3. Tamanho molecular das amostras ........................................................ 79
4.2.3. Determinação das atividades antioxidantes das amostras ....................... 80
4.2.3.1. Sequestro de radical superóxido ........................................................... 80
4.2.3.2. Sequestro de radical hidroxila ............................................................... 81
4.2.3.3. Atividade quelante de ferro ................................................................... 81
4.2.3.4. Atividade quelante de cobre .................................................................. 82
4.2.3.5. Atividade antioxidante total ................................................................... 83
4.2.3.6. Poder redutor ........................................................................................ 84
4.2.4. Caracterização estrutural, atividades farmacológicas de LM e LMG ........ 86
4.2.4.1. Caracterização estrutural ...................................................................... 86
4.2.4.1.1. Perfil de infravermelho ....................................................................... 86
4.2.4.1.2. Perfil de RMN ..................................................................................... 88
4.4.2. Atividades antioxidantes e citoprotetora de LM e LMG. ........................... 89
4.4.2.1. Atividades antioxidantes de LM e LMG em células MDCK. .................. 90
4.2.4.2.2. Atividades citoprotetora e influência no ciclo celular de células tratadas
com LM e LMG. .................................................................................................. 92
4.3. PARTE 2 - Polissacarídeos de Dictyota mertensii ....................................... 95
4.3.1. Rendimentos da extração e da síntese das nanopartículas ..................... 95
4.3.2. Análise por espectroscopia UV-visível da formação das nanopartículas. 95
4.3.3. Caracterização estrutural das nanopartículas .......................................... 96
4.3.3.1 Microscopia de Força Atômica e Microscopia Eletrônica de Varredura . 96
4.3.3.2. Determinação do tamanho da fucana e da nanopartícula ..................... 97
4.3.3.3. Determinação do potencial zeta e estabilidade das nanopartículas ...... 98
4.3.4. Caracterização química das amostras ..................................................... 98
4.3.4.1. Dosagens das amostras ........................................................................ 98
4.3.4.2. Análise de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
........................................................................................................................... 99
4.3.4.3. Atividades antiproliferativas ................................................................... 99
4.3.4.4. Atividades antibacterianas .................................................................. 102
4.3.4.5. Atividades imunomodulatórias ............................................................ 104
4.3.4.5.1. Ensaio de produção de óxido nítrico de macrófagos incubados com as
amostras .......................................................................................................... 104
4.3.4.5.2. Ensaio de produção de citocinas de macrófagos incubados com as
amostras .......................................................................................................... 105
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 107
5.1. PARTE 1- Polissacarídeos de Lobophora variegata .................................. 107
5.1. PARTE 2 – Polissacarídeos de Dictyota mertensii .................................... 137
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 146
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 147
27
1 INTRODUÇÃO
1.1. ALGAS
1.1.1. Classificação das algas
A denominação “alga” segundo Lourenço, (2006) não indica valor taxonômico,
pois este termo designa organismos que não compartilham de somente um ancestral
comum, por isso, são muito distintos quanto à origem. No entanto, Vidotii, &
Rollemberg (2004), esclarecem que este termo ainda é amplamente utilizado e é
válido ao designá-lo a um grupo de organismos que se assemelham quanto a
ocupação de um mesmo nicho ecológico, assim, sucintamente, seus hábitos as
reúnem em uma mesma linha de estudo.
As algas podem ser classificadas por seu tamanho: microalgas são algas de
dimensão microscópica e macroalgas são algas de dimensão macroscópica,
(LOURENÇO, 2006), e ambas também são consideradas grupos polifiléticos, ou
seja, sem um ancestral comum a todos os descendentes.
A filogenia das algas passou por diversas mudanças. As mais recentes
incluem: primeiramente a separação das algas marrons das algas vermelhas e
verdes por Adla et al. (2012). Além disso, estes autores também reavaliaram os
grupos de algas marrons, verdes e vermelha e as denominaram como Phaeophyta,
Chlorophyta, e Glaucophyta, respectivamente.
Posteriormente, Ruggiero et al. (2015) visando uma melhor didática sobre o
entendimento dos grupos taxonômicos resolveu reorganizar os seres vivos a fim de
categorizá-los de modo que os táxons que sejam de um mesmo “grau de
ancestralidade”, dando-lhes novos nomes. O super-reino dos eucariotos, por
exemplo, ficou dividido em: Protozoa, Chromista, Fungi, Plantae e Animal.
Discordando com Ruggiero et al. (2015), Adla et al. atualizaram a classificação
de 2012 em seu trabalho de 2019 (figura 1), esclarecendo que os trabalhos de
filogenia são incumbidos de estabelecer relação de parentesco entre os organismos
e que as nomenclaturas ficam incumbidas aos comitês de nomenclatura. Estes
autores ainda ressaltam que a novas proposições de nomes/clados muitas vezes
não perduram e não chegam a ter utilidade devido a inconsistências filogenéticas
esclarecidas logo em seguida. Assim os autores consideram que a formalização de
um clado seja realizado quando este for consolidado e respeitado pelos comitês
28
acadêmicos por meio de um processo formal e lento de votação para conservar ou
rejeitar nomes. Esta última versão proposta por Adla et al. (2019) encontra-se
sumarizada na figura abaixo onde destaca-se o filo Stramenopiles, no qual encontra-
se as algas marrons como as desta tese.
Figura 1- Representação da diversidade de protistas entre eucariotos. Amoebozoa,
nucletmycea e Holozoa juntos formam a Amorphea; Diaphoretickes inclui Crypista,
Chloroplastida e Embryophyta, Rhodophyceae, Haptista, Rhizaria, Alveolata
(Apicomplexa, Dinoflagellata, Ciliata), Stramenopiles e Phaeophyta de acordo com
Adla et al. (2019). O filo Phaeophyta (antes denominado algas marrons) está
destacado por um retângulo.
Fonte: Figura adaptada de Adla et al. 2019.
É possível que o leitor dessa tese encontre outras denominações taxonômicas.
Na verdade as classificações propostas por Adla et al. (2019) ou Ruggiero et al.
(2015) não são contraditórias nem complementares. Elas são interpretações
diferentes a respeito dos diferentes modos de classificar os organismos. Por isso,
29
muitos autores ainda seguem a utilização do termo alga. Por este motivo, nesta tese
utiliza-se o termo alga mesmo reconhecento seu histórico polifilético.
1.1.2. O uso tradicional das algas
Apesar da população mundial não acompanhar as classificações das algas, as
macroalgas estão em seu cotidiano. A utilização humana mais tradicional das algas
é o consumo como alimento, pois baseando-se em evidências arqueológicas Wells
et al. (2017) explicam que as algas já vêm sendo utilizadas na dieta humana por
milhares de anos. Já no panorama atual, Martínes-Hernández at al., (2017) discorre
que macroalgas são tradicionalmente consumidas pela população dos países
asiáticos, principalmente do Japão, China e Coréa, e em menor quantidade, nos
demais países. O valor nutricional destes organismos, segundo Wells et al. (2017)
deve-se a presença de proteínas, polissacarídeos, ácidos graxos, minerais,
vitaminas e polifenois.
Há uma grande tendência para o aumento da demanda por produtos de algas,
que de acordo com Wells et al. (2017), está ocorrendo devido a um foco no uso mais
amplo de produtos de algas. De acordo com Hafting et al. (2012) as algas estão
cada vez mais sendo comercializadas como “alimentos funcionais” ou
“nutraceuticos”. De acordo com o mesmo autor, estas denominações descrevem
compostos bioativos ou fitoquímicos que além de desempenhar papel na nutrição
também podem ter outras propriedades como terapeuticas.
A grande diversidade de algas contribui para uma variedade de aplicações em
atividades humanas, pois de acordo com Bast, (2014) estima-se que 200 espécies
de algas tenham alguma utilização humana. Além disso, Jin et al. (2016) igualmente
destacam que o aumento no valor econômico de algas também está relacionado
com o potencial uso de seus polissacarídeos como fármacos e Martínes-
Hernandezeat al. (2017) complementam que, particularmente as algas marrons são
fontes promissoras de polissacarídeos com atividades farmacológicas interessantes
para o tratamento de doenças.
1.2. POLISSACARÍDEOS DE ALGAS MARRONS
É justo dizer que os polissacarídeos de algas são os materiais, proveniente de
alga, mais amplamente consumidos, muitas vezes inconscientemente. Isso porque
30
os polissacarídeos de algas são incorporados frequentemente em bebidas, carne e
produtos lácteos (WELLS et al., 2017).
Existem diversos tipos de polissacarídeos de origem algal. Cada taxon de alga
possui a característica de sintetizar alguns polissacarídeos específicos (MORYA,
KIM & KIM, 2012). De acordo com Zvyagintseva et al. (2003) os principais
polissacarídeos extraídos de algas marrons são os alginatos, heteroglucanas e β-
glucanas (laminarinas). Chater et al. (2015) acrescentam que além dos
polissacarídeos citados as algas marrons também sintetizam fucanas.
Dentre os polissacarídeos citados, as fucanas são os polissacarídeos com mais
pesquisas referentes à atividades farmacológicas incluindo: antioxidante (DORE et
al., 2014; SELLIMI et al., 2014); antiproliferativa (NOBRE et al., 2013; ZEID et al.,
2014) antiinflamatória (HWANG et al., 2015; DORE, et al., 2014; ALBUQUERQUE et
al., 2013) anticoagulante (MAGALHAES et al., 2011; MELO et al., 2013) e antiviral
(HAYASHI, 2008; JIAO et al., 2011).
Essas atividades são em parte dependentes do sulfato, pois a região química a
qual o grupo sulfato está localizado no polissacarídeo tem papel crucial no
reconhecimento molecular deste polímero (ARAÚJO et al., 2013). Porém, a
disponibilidade dos polissacarídeos sulfatados, assim como de fucanas, não é
grande, tanto em quantidade quanto em número de organismos que são capazes de
sintetizá-los (BEDINI, et al., 2017).
Por outro lado, polissacarídeos neutros são extremamente abundantes na
natureza tanto em massa como em diversidade de organismos que os sintetizam
(Novak, et al., 2009). Segundo Wells et al. (2017) o polissacarídeo neutro mais
abundante de algas marrons são as glucanas e este autor ainda enfatiza que as
glucanas são o segundo tipo de polissacarídeo mais abundante destas algas,
ficando atrás somente dos alginatos (polissacarídeos carregados). Um tipo particular
de glucana são as laminarinas, estas estão entre os três produtos funcionais mais
bem consolidados na indústria de polissacarídeos de algas marrons (HAFTING et
al., 2012).
1.2.1. Fucanas
As fucanas são polissacarídeos que apresentam α-L-fucose sulfatada na sua
composição. Alguns autores consideram que os polissacarídeos que possuem mais
de 90% de fucose sulfatada na sua estrutura são chamados de fucanas e os outros
31
polissacarídeos que possuem menos fucose sulfatada são denominados de
fucoidans (BERTEAU & MULLOY, 2003). Contudo, outros autores utilizam as
denominações heterofucanas e homofucanas para polissacarídeos com fucose
sulfatada que possuem ou não outros monossacarídeos, respectivamente, na sua
composição (MAGALHAES et al., 2011; FERNANDES-NEGREIROS et al., 2018).
Porém, a questão de nomenclatura das fucanas ainda não está totalmente definida.
Um exemplo clássico é o de homofucanas extraídas da alga Fucus vesiculosus, que
devido ao nome da alga são chamadas de fucoidans (JIAO et al., 2011).
As Fucanas encontram-se presentes em todas as algas marrons até agora
estudadas (RAPOSO, MORAIS & MORAIS, 2015). Por outro lado, fucanas quase
não são encontradas nos demais grupos de algas marinhas. Contudo, é possível
que ocorra uma exceção. Da alga Gloiopeltis tenax foi extraído um polissacarídeo
sulfatado, que foi purificado por cromatografia de troca iônica e gel filtração. Este
polissacarídeo tem em sua composição fucose, manose e galactose (20.03%,
10.35%, e 10.57%, respectivamente), além de ácido uronico (9,9%,) cujo tipo não foi
identificado, e sulfato (8,2%). Os autores afirmam que os grupos sulfato estão
ligados na posição 2 de alguns resíduos de fucoses (LIM & RYU, 2009). Todavia, as
técnicas utilizadas por esses autores para comprovarem a sulfatação da fucose, bem
como, se realmente havia L-fucose não foram bem exploradas. O que sugere cautela
ao se afirma de que G. tenax sintetiza uma heterofucana.
As fucanas apresentam diversas atividades descritas na literatura (NEGREIROS,
2015). As atividades farmacológicas das fucanas dependem de diversos fatores
como rearranjos e exposição de determinados grupos moleculares (JIAO et
al.,2011), massa molecular (MORYA, KIM & KIM, 2012), a presença de grupos
substituintes (WANG et al., 2013), a presença de grupos carregados (XIE et al.,
2015), a distribuição desses pela molécula, o local da ramificações ou não (LI, et al.,
2008), a composição monossacarídica e os tipos de ligações inter e intra molecular
que esses possuem (LI, et al., 2008). Além disso, Laurienzo et al. (2010) discorreram
que modificações químicas em polissacarídeos, e consequente mudança da sua
estrutura e atividades, tem despertado bastante interesse em pesquisas. Assim,
modificações de moléculas que já contem atividades farmacológicas permite a
possibilidade de potencializar ainda mais estas atividades de modo que mesmo em
pequenas quantidades forneçam um maior efeito.
32
1.2.2. Laminarinas (β-glucanas de algas)
Laminarina, laminaran ou leucosin são denominações dadas para uma classe
específica de β-glucanas de algas. Estes polissacarídeos assim como todas as β-
glucanas são formados de monômeros de glicose. Porém, de forma específica para
as laminarinas Alderkamp et al. (2007) definiram estes polissacarídeos como
homoglucanas que tem uma cadeia principal formada por ligações β-(13).
Laminarinas comumente são descritas com massa molecular de aproximadamente 5
kDa porém, laminarinas de maior massa molecular também já foram relatadas como
as de: 8 kDa (SPICER et al., 2017) e laminarinas de 19-27 kDa (Menshova et al.,
2014), estes últimos indicaram que as algas marrons Eisenia bicyclis produzem
diferentes tipos de laminaranas, dependendo do habitat e do tempo de colheita da
alga. As laminarinas também podem ser ramificadas e de acordo com Chizhov et al.
(1998) o espaçamento entre as ramificações β-(16), a posição e o tamanho destas
ramificações são fatores que conferem a singularidade de cada laminarina. Outro
fator igualmente importante para a diversidade de laminarinas inclui o tipo do último
resíduo que fica localizado na extremidade redutora destes polissacarídeos que
pode ser de dois tipos: o manitol e a glicose. No primeiro caso, as laminarinas são
classificadas de laminarinas com cadeia tipo M e no segundo caso elas são
classificadas de laminarinas com cadeia tipo G. Abaixo encontra-se a estrutura
química das extremidades de cada tipo de laminarina (Figura 2). Wells et al. (2017)
relata que o tipo de estrutura primária de laminarinas (M ou G) está relacionada com
o tipo de atividade farmacológica.
33
Figura 2- Estruturas químicas das extremidades redutoras das laminarinas de
cadeia M e G de acordo com Kadam, Tiwari & O´Donnel, (2015). Em (A) a estrutura
da laminarina com ligações β-(13) e extremidade redutora com monossacarídeo
do tipo manitol (cadeia M), em (B) a estrutura da laminarina com ligações β-(13) e
extremidade redutora com monossacarídeo do tipo glicose (cadeia G).
Fonte: Figura adaptada de Kadam, Tiwari & O´Donnel, (2015).
As laminarinas podem ser encontradas em diversas algas marrons (Tabela 1) e
apresentam diferentes atividades farmacológicas, como antitumoral, anti-
inflamatória, imunomodulatória, anticoagulante e também desempenha funções
dietéticas (KADAM, TIWARI & DONNEL, 2014; MENSHOVA et al., 2014).
Mais recentemente as laminarinas têm sido apontadas como ótimo biomaterial
de carreamento/ endereçamento de medicamentos. O endereçamento de moléculas
bioativas tem se expandido para diversos ramos inclusive na otimização de
antioxidantes em aditivos alimentares/ materiais biomédicos (YU et al., 2018;
SANJEEWA et al., 2017).
34
Tabela 1- Algas conhecidas por sintetizarem laminarinas.
Algas Referência
Ascophyllum nodosum Kadam et al. (2015)/ MacArtain et al. (2007)
Eisenia bicyclis Ermakova et al. (2013)/ Choi, Kim & Lee (2011)
Laminaria japonica Zha et al. (2012)
Laminaria digitata Voronova et al. (1991) /MacArtain et al. (2007)/
Deville et al. (2004)
Laminaria saccharina Yvin et al., (1999)/ Devillé et al. (2004)
Laminaria hyperborea Kadam et al. (2015a)/ Kadam et al. (2015b)/ Holdt
& Kraan (2011)
Sargassum fusiforme Jin et al. (2014)
Sargassum linifolium Abdel-Fattah & Hussein (1973)
Saccharina longicruris
Saccharina latissima
Rioux et al. (2010)
Haug & Jensen (1954)
Undaria pinnatifida
Fucus vesiculosus
Undaria pinnatifida
Je et al. (2009)
Rioux et al. (2007)
Je et al. (2009)
Fonte: Autoria própria.
Paiva (2016) extraiu polissacarídeos de L. variegata, fracionou com acetona
(obtendo as frações F0,3; F0,5; F0,8; F1,0; F1,5 e F2,0), e identificou laminarinas
contaminadas com fucanas na fração F1,0, então ele realizou mais um passo de
purificação (centrifugação com uso de dispositivos de filtação com poros de
diferentes tamanhos) e obteve laminarinas purificadas ao se coletar o material que
passou pelo filtro com poro de 30 kDa e ficou retido no filtro de 10 kDa (tendo um
tamanho médio de 20 kDa).
Por ser um polissacarídeo neutro laminarinas podem ser bastante úteis na
compreensão de como alguns grupamentos funcionais (adicionados quimicamente)
podem influenciar na estrutura e atividades farmacológicas destas moléculas. Assim,
uma alternativa para obter-se polissacarídeos com atividades farmacológicas
potencializadas pode ser por meio de modificações dos polissacarídeos nativos com
a inserção de grupos químicos.
35
1.3. MODIFICAÇÕES QUÍMICAS POR MÉTODOS VERDES
A modificação de moléculas tem se tornado amplamente estudada no intuito de
compreender como os grupamentos químicos podem modificar as atividades
farmacológicas e a estrutura destas moléculas (Li et al., 2016).
Existe uma forte preocupação com o uso de técnicas de modificação que não
causem muitos prejuízos ao meio ambiente, ou seja, que utilizem poucos ou nenhum
reagentes nocivos à natureza sendo, portanto, estas técnicas de modificação
química denominadas de "química verde".
A química verde emergiu de uma série de ideias existentes e de esforços para se
fazer pesquisas no período que precedeu a década de 1990, no contexto de dar
atenção aos problemas da poluição química e do esgotamento de recursos. O
desenvolvimento da química verde na Europa e nos Estados Unidos foi ligado a uma
mudança nas estratégias para resolver problemas ambientais através de novos
métodos (VACCARO, 2016).
A síntese verde concentra-se na utilização de materiais de baixo custo, eficazes,
biocompatíveis, que causam poucos danos ao meio ambiente e com um menor
número de passos de execução para obter o do produto final. A síntese
“completamente verde” é tida como um avanço a mais na síntese verde, pois nesse
caso utiliza-se apenas água, como solvente, e extratos aquosos de vegetais e
moléculas extraídas de fontes naturais, como no caso de algas, como redutores e/ou
estabilizantes (RAVEENDRAN; FU; WALLEN, 2003).
A seguir se descrevem técnicas tidas como amigáveis ao meio ambiente e que
foram utilizadas aqui nesta tese.
1.3.1. Sulfatação por ácido sulfurico
A sulfatação de polissacarídeos é um processo no qual o produto da reação são
polissacarídeos contendo grupamentos sulfato (SO4). Porém, para que esta reação
ocorra é necessário a inserção de trióxido de enxofre (SO3) a um oxigênio que fazia
parte do grupamento hidroxila do polissacarídeo (ou hidroxila de outra molécula). É
importante salientar que esta ligação carbono-oxigênio-enxofre é o que define a
sulfatação (FOSTER, 1997) (Figura 3).
36
Figura 3- Reação de sulfatação de acordo com Foster (1997). Reação que ocorre
pela inserção de trióxido de enxofre (SO3) a um oxigênio que fazia parte de outra
molécula.
Fonte: Figura adaptada de Foster, (1997).
Grande parte dos métodos de sulfatação utiliza de ácido sulfúrico como
fornecedor de grupos sulfato e propanol como agente estabilizante da reação. Vale
salientar que estes métodos normalmente não sulfatam todas as posições de todos
os monossacarídeos do polissacarídeo, isso porque de acordo com Möller et al.
(2012) a posição em que uma hidroxila é substituída por sulfato esta relacionada
com as posições das ligações glicosídicas (pois estas posições não vão estar
disponíveis para a sulfatação) e também com as posições das primeiras sulfatações
(pois vão dificultar a sulfatação de posições adjacentes à região já sulfatada).
A sulfatação comumente aumenta a atividade antioxidante de polissacarídeos,
como já foi observado nos trabalhos de Ma et al. (2017) e Barahona et al. (2011) e
diversos outros trabalhos como mostra a tabela 2. Porém, alguns compostos são
menos susceptíveis a sulfatação que outros, consequentemente a técnica não é
efetiva para todos.
37
Tabela 2- Trabalhos que identificaram atividade antioxidante potencializada por
processos de sulfatação.
Polissacarídeo e/ou fonte:
Teor de sulfato (%) ou
grau de substituição
(GS)
Referência
Lentinan de Lentinus edodes 1,45 e 1,57 GS Feng et al. 2010
Artemisia sphaerocephala 0,51 – 1,24 GS Wang et al, 2014
Porphyra haitanensis
Auricularia auricular
2,48-39,2 %
0,90 e 0,78 GS
Zhang et al, 2010
Zhang et al, 2011
Artemisia sphaerocephala 7,62-11,58 % Wang et al. 2010
Tricholoma lobayense 1,22 GS Xuehui et al, 2016
Pleurotus eryngii 2,9-12,5 % Jung et al. 2011
Adenanthera pavonina, C. férrea e D.
gardneriana
0,72-0,82 GS Marques et al, 2015
Quitosana 9,55-12,54 % Zhong et al. 2007
Enterobacter cloacae 1,88-9,4% Jin et al. 2011
Galactomananas de goma 0,89 – 1,42 GS Wang et al. 2012
Dictyophora indusiata
Cyclocarya paliurus
Tricholoma lobayense
0,58-1,55 GS
0,24-6,82%
13,6 %
Deng et al. 2015
Xie et al. 2014
Li et al. 2016
Ulva pertusa
Seda de milho
Sphallerocarpus
Cordyceps gunnii
Ganoderma atrum
Ganoderma atrum
Phoma herbarum
30,8 e 32,8%
0,17-1,35 GS
0,42 – 1,01 GS
0,33 GS
0,65 - 3,43 GS
0,35; 0,74 e 1,14 GS
1,01 e 1,36 GS
Qi et al. 2005
Chen et al. 2013
Xu et al. 2016
Zhu et al. 2013
Chen et al. 2015
Zhang et al. 2015
Yang, Gao & Tan 2005
Grau de substituição – GS. Fonte: Autoria própria.
Em contrapartida, a inserção de grupos diferentes do grupo sulfato pode
significar uma maior chance de modificar a molécula como também potencializar
sua atividade. Este é o caso da técnica de modificação de polissacarídeos por
descarga de barreira dielétrica (DBD).
1.3.2. Modificação por plasma de barreira dielétrica
O DBD é uma técnica na qual se utiliza o plasma como agente modificador da
amostra trabalhada. O plasma é um gás parcialmente ionizado contendo partículas
38
carregadas (elétrons e íons), radiação, térmica, luz visível, radiação ultravioleta,
campo eletromagnético e radicais (Alves Jr, 2001).
Os principais tipos de plasma são o de baixa pressão e o atmosférico. O plasma
de baixa pressão é aquele em que é inserido sobre um material em uma estrutura a
vácuo. Pela necessidade do vácuo e a formação de calor durante o processo, esta
técnica se torna inviabilizada quando se utiliza uma grande quantidade de material
ou materiais sensíveis a temperatura como tecidos e polímeros (ALVES JR, 2001).
Por outro lado, a utilização de plasma atmosférico ocorre sem a formação de
grande calor, técnica também conhecida como plasma a frio (Cold atmospheric
plasma). Nesta técnica, o gás é fracamente ionizado sob as condições atmosféricas
abaixo de 40 oC.
O aparato usado para geração da DBD consiste em uma fonte de voltagem
controlada por um ociloscópio, este, responsável por medir e analisar a diferença de
potencial (DDP) em função do tempo, existente no sistema. Para a formação do
plasma é utilizado um gás que é inserido no tubo em contato com o dielétrico (que
está acoplado à fonte de energia e ao osciloscópio). O dielétrico tem função de isolar
o sistema e também espalha o plasma, distribuindo-o por toda a superfície da
amostra. Vale salientar que o plasma formado é estável e uniforme (figura 4).
Durante o processo de formação do plasma ocorre a ruptura do gás, que está
entre os eletrodos do equipamento, por meio de microdescargas rápidas que se
distribuem pelo dielétrico (KOGELSCHATZ, 2002). Uma fração de átomos e
moléculas gasosas colidem com elétrons e isso resulta em mais excitação, ionização
e dissociação enquanto o plasma continua frio (KLÄMPFL, 2012). Neste processo é
formado um plasma homogêneo, não equilibrado, cujos principais grupos químicos
observados são: H, NO, CN, O3, e os radicais: H, O, N e N2+ (MACHALA et al.,
2007). Quando as espécies reativas atingem a superfície do substrato, novos grupos
funcionais podem ser formados com a quebra da cadeia da molécula, substituições e
recombinações de átomos podem ocorrer promovendo modificações da superfície
do material (JORDÁ-VILAPLANA et al., 2014).
39
Figura 4- Esquema de um equipamento de descarga de barreira dielétrica (DBD). 1-
ociloscópio, 2- fonte de energia, 3- dielétrico, 4- Gás hélio. Azul= Amostra; Rosa=
Plasma; Verde= Material dielétrico; Preto= Eletrodos.
Fonte: Autoria própria.
De acordo com Manakhov et al. (2015) o tratamento de polímeros com plasma
atmosférico tem a capacidade de produzir uma variedade de espécies quimicamente
ativas o que lhe conferem grupos químicos (incluindo grupos carboxílicos, aminas e
hidroxílicos) que podem modificar suas propriedades e atividades. Esta técnica é
menos tóxica que as modificações químicas e modificam somente a superfície dos
polímeros. Além disso, Jorda-Vilaplana et al. (2014) apontam que tratamentos
químicos podem gerar desperdícios que podem ser danosos ao meio ambiente
como por exemplo a carbonização química (Chopra et al., 2006)
Abaixo (tabela 3), expõem-se com mais detalhes, atividades de polissacarídeos
modificados com DBD relacionadas com os resultados obtidos nessa dissertação.
Entre os diferentes grupos reativos depositados pela pressão atmosférica em
técnicas de DBD Manakhov et al. (2015) e Hody et al. (2010) destacam que a
inserção de grupos carboxílicos (COOH) são os mais amplamente usados para
aplicações biotecnológicas graças a sua reatividade e estabilidade no ar.
40
Tabela 3- Atividades de polissacarídeos modificados com Descarda de barreira
dielétrica (DBD).
Atividade Referência
Aumento da polaridade Pankaj et al. (2015)
Aumento da gelificação Molina et al. (2014)
Adesiva Ren, et al. (2017)
Antimicrobiano Macêdo et al. (2013)
Antimicrobiano Nawalakhe et al. (2013)
Aumento da adesão celular Silva et al. (2008)
Aumento da polaridade Theapsak et al. (2012)
Aumento da polaridade Dorraki et al. (2015)
Aumento da adesão celular
Girard-Lauriault et al. (2009)/ Zeniieh et
al. (2013)/ Guex et al. (2014)/ Lee et al.
(2008)
Inserção de ácidos carboxílico Jorda-Vilaplana et al. (2014)
Fonte: Autoria própria.
Além disso, é relatado na literatura que o aumento no conteúdo de grupos
carboxílicos podem resultar em aumento de atividades farmacológicas (YANG & DU,
2003). Tendo em vista as grandes vantagens de se modificar materiais por
caboxilação por DBD, esta técnica foi utilizada para se identificar possíveis
alterações nas atividades antioxidantes.
Não há relatos na literatura sobre melhoria na atividade antioxidante de
moléculas modificadas por meio da técnica de DBD. Pois isso neste trabalho
também se realizou modificação química por inserção de uma molécula já conhecida
por sua potente ação antioxidante, o ácido gálico.
1.3.3. Ácido gálico e sua conjugação com moléculas
De acordo com Badhani, Sharma & Kakkar, (2015) o ácido gálico (ácido 3,4,5-
tri-idroxibenzóico) é um composto fenólico natural que consiste em um anel
aromático, três grupos hidroxila e um ácido carboxílico, sua estrutura é planar e de
baixo peso molecular. Ele é comumente extraído de plantas e possui alto poder
41
antioxidante além de já serem relatadas (por Badhani, Sharma & Kakkar, (2015)
também atividades: anticâncer, anti-inflamatório, antimicrobiano, antimelanogênico,
antiviral, antialérgico, neuroprotetivo e hepatoprotetivo. Os mesmo autores relataram
que o ácido gálico é um protetor eficiente contra danos oxidativo causados por
espécies reativas normalmente encontradas em sistemas biológicos como: radical
hidroxila, radical superóxido, peroxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Tendo em
vista este grande efeito o ácido gálico já é amplamente utilizado como fármaco,
cosmético, alimento, na confecção de embalagens de alimentos e na indústria como
antiaderente e anticorrosivo (Badhani, Sharma & Kakkar, 2015).
Por outro lado, é conhecido também por autores como Strlic et al. (2002) que o
ácido gálico pode exibir tanto atividades antioxidantes como também pro-oxidantes,
caracterizando um comportamento dual. Badhani, Sharma & Kakkar, (2015)
propuseram que a atividade antioxidante do ácido gálico esta relacionada à
estabilidade dos grupos hidroxil. A adição de radicais nos grupos hidroxil podem
então ter influência na atividade antioxidante deste composto. Adicionalmente Galato
et al. (2001) mostraram que quando grupos hidroxil do anel aromático são
substituídos a atividade antioxidante do ácido gálico aumenta.
Outros trabalhos tém se detido a investigar a estabilidade da molécula quando
modificadas em diferentes posições. A saber, os anéis aromáticos possuem
denominações próprias para posições, sendo elas: orto, meta e para, indicadas na
figura 5.
42
Figura 5 - Representação da estrutura do ácido gálico. Anel aromático indicado no
centro, grupo carboxila circulado em vermelho, grupos hidroxila circulados em azul e
posições do anel aromático denominados em verde.
Fonte: Adaptado de Queiroz, 2019.
Por exemplo, estudos de Galato et al. (2001) relatam que a presença de um
grupo doador em uma posição para (como um novo composto inserido, no caso
metil) e a retirada de um elétron na posição orto estabiliza a molécula, sendo
possível compreender então porque a inserção de um radical em uma das três
hidroxilas promove a tendência do ácido gálico doar seu elétron, aumentando sua
atividade antioxidante no teste de sequestro de radical DPPH. Derivados de ácido
gálico já foram relatados também para atividades: de sequestro de radical peroxil,
azida, e hidroperoxil
O ácido gálico, apesar de forte antioxidante, pode ter sua atividade
potencializada por meio de conjugação com outras moléculas. A conjugação já foi
realizada em estudo de Curcio, et al. (2009) em que realizou-se uma de conjugação
de ácido gálico por um procedimento de criação de radicais. Este procedimento se
baseia no uso de H2O2/ácido ascórbico para formar uma região redox que envolve a
oxidação do ácido ascórbico pelo H2O2 em temperatura ambiente (KITAGAWA, et
al., 2006). Posteriormente em um único passo um radical pode ser adicionado (como
um polissacarídeo) ao ácido gálico (figura 6). Os autores relatam que o uso deste
sistema redox permite a geração de um polissacarídeo funcional, com alto
43
rendimento e sem a necessidade de mão de obra especializada ou geração de
compostos tóxicos, sendo, portanto, um processo que não agride o meio ambiente.
A incorporação do ácido gálico em quitosana forneceu um conjugado com alto
poder antioxidante (92% de inibição do radical DPPH e 60% de quelação do radical
hidroxil). A capacidade antioxidante da quitosana por outro lado, era considerada
baixa (14% e 17% para as mesmas atividades, respectivamente).
Figura 6- Esquema de um possível mecanismo de inserção de ácido gálico em
polissacarídeos. Na imagem mostra-se a inserção em dextrana. Os radicais
hidroxila, gerados pela interação entre os componentes do par redox, ataca os
átomos-H em R-metileno (CH2) ou grupos hidroxila (OH) do hidroximetileno do
polissacarídeo. AA = ácido gálico.
Fonte: Figura adaptada de Queiroz (2019).
A quitosana por outro lado, é uma fonte de polissacarídeos de fonte animal.
Uma grande desvantagem de se utilizar polissacarídeos animais como fontes de
compostos antioxidantes com aplicação para os seres humanos está na proximidade
filogenética entre ao humanos os demais animais. Consequentemente
contaminantes alérgenos e/ou patogênicos como príons, vírus e proteínas podem
44
desencadear diversos distúrbios. Por outro lado, polissacarídeos de algas não
oferecem esse risco devido a distância evolutiva entre seres humanos e algas,
tornando-se então uma fonte confiável de obtenção de polissacarídeos (Jiao, et al.,
2011).
Até o momento, no entanto, nenhum polissacarídeo neutro de alga teve sua
estrutura modificada de modo a potencializar a atividade antioxidante. Por outro
lado, polissacarídeos sulfatados já tiveram suas atividades antioxidantes descritas e
não tiveram suas atividades antitumoral, antibacteriana e imunomodulatória
investigadas.
1.3.4. Síntese de nanopartículas
1.3.4.1. Nanopartículas metálicas
Comumente nanopartículas são descritas como material ou propriedade que
ocorre em dimensões de escala nanométrica entre 1 e 100 nm (DREADEN et al.,
2012). Porém, outros autores estipulam um tamanho diferente para a definição de
nanopartículas; Satyavani et al, (2011) se referem a partículas com tamanho maior
que 100 nm e menor que 1 µm. Para esta tese, utilizar-se-á a definição abordada por
Satyavani.
As nanopartículas metálicas possuem características singulares em relação a
outros tipos de nanopartículas. As nanopartículas metálicas, por exemplo, possuem
menor tamanho e maior superfície de reatividade, o que permite a interação com
outras moléculas (PARVEEN; MISRA; SAHOO, 2012). A aplicabilidade das
nanopartículas incluem diversas áreas da indústria como a aeroespacial, química,
eletrônica, energética, cosmetológica (STARK et al., 2015), alimentícia, ambiental,
biomédica, dentre outras (MULLER; SHEGOKAR; KECK, 2011).
As nanopartículas podem ser compostas por diversos metais como ouro,
cobre, estrôncio, zinco, ou prata (CHO et al., 2008; PARVEEN; MISRA; SAHOO,
2012). Um dos tipos de nanopartícula metálica sintetizada por processos verdes que
vem sendo utilizado com polissacarídeos é a nanopartícula de prata (NEGREIROS
2015).
45
1.3.4.2. Nanopartículas de prata
A prata, desde os primórdios, vem chamando a atenção por suas diversas
aplicações na área médica como no caso do tratamento de queimaduras
(CASTELLANO et al., 2007) e de algumas infecções de pele ou tecido subcutâneo,
como abscessos perianais (KLASEN, 2000). Em escala nanométrica, a prata tem
gerado interesse de pesquisadores de diferentes áreas desde o início da era da
nanotecnologia. A prata é moldável e maleável, possui elevada condutividade
térmica e elétrica, além de ser um oxidante forte. Nanopartículas de prata
apresentam aplicações promissoras em diversos campos da ciência e tecnologia
(RAI et al., 2015).
As nanopartículas de prata são agregados de átomos de prata que variam de
diâmetro e apresentam diferenças em relação às propriedades da prata metálica.
Estas possuem propriedades farmacológicas importantes. Alguns exemplos são a
atividade antifúngica contra o Cladosporium cladosporoides, o Aspergillus niger e
também contra a Candida albicans (KIM et al., 2009). Além disso, apresenta ainda
as atividades anti-inflamatória (YILMA et al., 2013), citotóxica contra células tumorais
(GURUNATHAN et al., 2013; KASSAS; ATTIA, 2014) e antiangiogênica
(BAHARARA et al., 2014).
Diante das propriedades que as nanopartículas de prata apresentam e
visando utilizá-las na terapêutica é interessante entender o processo de síntese,
como no caso do processo de síntese em fase líquida ou coloidal que apresentam
reações químicas em solventes conduzindo à formação de coloides.
Uma das fontes de substâncias que podem ser utilizadas na síntese verde de
nanopartículas de prata são os polissacarídeos de fontes naturais (YOUSEFZADIA
et al., 2014). Muitas são as atividades relatadas na literatura de nanopartículas de
prata com polissacarídeos (VIANA 2017).
1.4. Fonte de obtenção dos polissacarídeos
1.4.1. Alga Lobophora variegata
L. variegata é amplamente distribuída pelo mundo como nas regiões do: Caribe,
Oceano Índico, Mar Vermelho (KREMB et al., 2014), Austrália, Mediterrâneo, e litoral
brasileiro (MEDEIROS et al., 2008). Essa alga pode crescer a profundidades de até
46
25 metros (STEVENINCK; BREEMAN, 1987) e é encontrada principalmente em
ambientes tropicais (TAYLOR 1960). A L. variegata apresenta elevada habilidade de
adaptação e importância ecológica quando analisada como indicadora de
contaminação ambiental e de herbivorismo além de ser elementar na biota marinha
para várias espécies de peixes e crustáceos (COEN; TANNER, 1989).
Vários estudos demonstram o potencial uso de L. variegata como organismo de
alto valor ecológico, nutricional e farmacológico (RODRIGUES et al., 2009), inclusive
dos seus polissacarídeos (MEDEIROS et al., 2008).
1.4.2. Alga Dictyota mertensii
A alga D. mertensii foi descrita em 1859 por Kützing Friedrich, esta é uma
macroalga bentônica de ocorrência restrita à região tropical do Brasil (FREITAS,
NUNES & PAULA, 2007). Ela possui características típicas do seu gênero como cor
marrom-amarelada ou marrom-esverdeada, fixas ao substrato por numerosos
rizóides, apresentando talo achatado, parenquimatoso, em forma de fita, às vezes
torcido em espiral, sem nervura, ramificado dicotomicamente e folíolos com margens
lisas ou denteadas (FREITAS, NUNES & PAULA, 2007).
D. mertensii sintetiza diferentes polissacarídeos que já são pesquisados quanto
ao potencial biológico, como por exemplo: atividade anticoagulante (MARQUES et
al., 2019); antiviral (QUEIROZ et al.,2008); antioxidante e capaz de inibir células
cancerígenas (COSTA et al., 2010).
Desse modo, pode-se observar que estes organismos marinhos (L. variegata e
D. mertensii), são importantes fontes de polissacarídeos bioativos.
Diante do exposto, e tendo em mente que o litoral potiguar, assim como o
nordestino, detém várias espécies de algas marinhas que não tiveram seus
polissacarídeos neutros e sulfatados estudados completamente, este trabalho teve
como objetivo realizar uma prospecção das principais modificações químicas em
polissacarídeos neutros (laminarinas) da alga Lobophora variegata e polisscarídeos
sulfatados (fucanas) da alga Dicytiota mertensii e verificar as suas atividades
antioxidantes in vitro, escolhendo as melhores modificações para caracterização
estrutural.
47
2 OBJETIVO GERAL
Extrair polissacarídeos das algas Lobophora variegata e Dictyota mertensii,
modificá-los quimicamente por diferentes técnicas e identificar algumas de suas
atividades farmacológicas.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Extrair laminarinas da alga Lobophora variegata;
Sintetizar laminarinas modificadas por DBD, sulfatação e galificação;
Caracterizar físico-quimicamente as laminarinas nativas e modificadas,
fucanas nativas e modificadas quanto ao: teor de polissacarídeos,
composição monossacarídica, contaminantes, perfil eletroforético, tamanho
molecular e espectroscopia de UV-visível;
Avaliar a atividade antioxidante in vitro das laminarinas nativas e modificadas;
Identificar a estrutura da laminarina modificada com a melhor atividade
antioxidante e laminarina nativa por meio de espectroscopia de infravermelho
e ressonância magnética nuclear.
Identificar a ação antioxidante da laminarina modificada com a melhor
atividade antioxidante e laminarina nativa em células de rim de cachorro
(MDCK) sob diferentes condições de estresse oxidativo;
Extrair fucanas da alga Dictyota mertensii;
Sintetizar nanopartículas de prata com fucanas;
Caracterizas as nanopartículas de fucanas quanto ao tamanho, carga, forma
e composição;
Avaliar a as atividades antitumoral, antibacteriana e imunomodulatória de
fucanas e nanopartículas de fucanas.
48
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAL ALGAL
A alga Lobophora variegata (J. V. Lamouroux) (Tombamento UFRN 25510;
Figura 7) foi coletada na praia de Pirangi (Rio Grande do Norte, Brasil, 6o 00’ 50,72’’
S/35o 10’ 83,52’’ O) e a alga Dictyota mertensii (Martius) Kützing (Tombamento
UFRN 25516; Figura 8) foi coletada na praia de Maracajaú (Rio Grande do Norte,
Brasil, 5o 40’ 99.40’’ S/ 35o 31’ 08.86’’ O). Elas foram levadas ao laboratório de
Biotecnologia de Polímeros Naturais – BIOPOL, lavadas, desidratadas, trituradas e
armazenadas protegidas da luminosidade e do calor até o momento de sua
utilização.
Figura 7- Alga marinha Lobophora Variegata (J. V. Lamouroux)
Fonte: Paiva, (2016)
49
Figura 8 - Alga marinha Dictyota mertensii (Martius) Kützing
Fonte: Silva, (2019)
3.2. BACTÉRIAS UTILIZADAS PARA ENSAIOS ANTIBACTERIANOS
Utilizaram-se as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia
coli ATCC 25922 (cepas padrões da American Type Culture Collection). Estas, foram
descongeladas, e para serem “ativadas” foram transferidas parra 2 mL de caldo de
infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion Broth, HiMedia, Mumbai, Índia) e
incubadas a 37 °C por 24 h. Posteriormente as bactérias foram semeadas em ágar
nutriente (Nutrient Agar, HiMedia®) e incubadas a 37 °C por 24 h.
3.3. CÉLULAS EUCARIÓTICAS UTILIZADAS PARA ENSAIOS DE REDUÇÃO DE
MTT
As células normais 3T3 (Mouse embryonic fibroblast cells NIH/3T3 ATCC ®
CRL-1658™) e as células tumorais B16F10 (Mus musculus skin melanoma ATCC®
CRL 6475™) células de rim de cachorro (MDCK, ATCC® CCL-34) e macrófagos de
camundongo (RAW 264.7) foram mantidas em meio DMEM contendo 10% de soro
50
fetal bovino (FBS) e antibióticos (estreptomicina 10mg/mL e penicilina 10.000
unidades) e incubadas a 37 oC e 5% de CO2.
3.4. OUTROS MATERIAIS
3.4.1. Reagentes
- Azul de toluidina, acetona, ácido clorídrico, álcool etílico e brometo de
cetiltrimetilamônio P.A., citrato de sódio, cloreto de bário, peróxido de hidrogênio e
sulfato de ferro hetahidratado foram adquiridos da CRQ (Diadema, SP, Brasil).
Ácido etilenoaminoacético (EDTA) proveniente da VETEC (Duque de Caxias, RJ,
Brasil);
Bacto-Gelatina adquirido da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA).
- Ácido sulfúrico, álcool metílico, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio
dibasico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio, sulfato de ferro heptahidratado
foram adquiridos da Diadma (SP, Brasil);
- Ácido etilenodiminotetracético (EDTA) e metanol foram obtidos da VETEC (Duque
de Caxias, RJ, Brasil; e São Paulo, Brasil respectivamente);
- Ácido gálico foram comprados da CAQ Casa da Quimica Ind. E Com. (Diadma, SP,
Brasil);
- Metionina proveniente da Synth (Diadema, SP, Brasil).
- Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT), cloreto de sódio, 1,3-
diaminopropano acetato,ferrozina, riboflavina, nitrito de sódio, albumina sérica
bovina e violeta de pirocatecol, L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-
glucose, D-arabnose, D-ramnose e ácido D-glucurônico foram adquiridos da Sigma-
Aldrich (São Paulo, SP, Brasil);
- Agarose (Standart Low-MR) proveniente da BioRAd Laboratories (Richmond, CA,
EUA);
- Cloreto de ferro e reagente Folin-Ciocalteau foram adquiridos da Merk (Darmstadt,
Alemanha);
- Fenol e Molibdato de amônia sulfato de cobre, sulfato de potássio e sulfato de
sódio foram adquiridos da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio de
Janeiro, RJ, Brasil);
- Ácido acético glacial P.A. e Sulfato de cobre II foram obtidos da CRB–Cromato
produtos químico Ltda (São Paulo, Brasil);
51
- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) foi obtido da FLUKA (Alemanha);
- Prozima (Preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750)
adquirids da Prozyn Biosolutions, São Paulo, Brasil;
- Salicilato de sódio adquirido da FLUKA (Steinheim, Germany);
- Nitrato de prata foi obtido da CASA AMERICANA (Sta. Cecília – SP).
- DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) e soro fetal bovino (SFB) foram
obtidos da Cultilab (Campinas, SP, Brasil).
- Nitrato de prata foi obtido da CASA AMERICANA (Sta. Cecília – SP).
- Filtro de seringa de 0,45 µm foi obtido da TPP Spritzen (Switzerland);
- Kit Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine foi obtido da BD
Biosciences (San Diego, CA, USA);
- Brain Heart Infusion Broth, Nutrient Agar e Mueller Hinton foram obtidos da
HiMedia® (Mumbai, Índia);
3.4.2. Equipamentos
- Agitador orbital modelo 255-B, banho maria e estufa modelo 515 de 2013 foram
adquiridos da FANEM Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
- Cuba para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e Col
(1968), da Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
- Fontes de corrente contínua regulável desenvolvida pelo Dr. H. Rzeppa, Tecnica
Permatron Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Osmose reversa, Dertin Pump (Diaphragm Pump) Modelo 8809, Resina MB478,
Work Pressure:70PSI, Volts: 24VDC, (São Paulo, SP, Brasil).
- Balança analítica de precisão e bomba a vácuo foi obtido da TECNAL (Piracicaba,
SP, Brasil);
- Centrifuga refrigerada da Thermo scientific, Modelo Sorvall Legend XRT, 2014
(Alemanha).
- Espectrofotômetro digital DR500 UV/VIS da Hach Company (Loveland, Colorado,
EUA);
- Liofilizador - FreeZone4.5 foi obtido da Labcon;
- Medidor de pH Orion Research, modelo 701 A/digital lonalyer (Cambrige, MA,
EUA);
- Bomba a vácuo da TECNAL mdelo TE-058 (Piracicaba, SP, Brasil);
52
- Sistema HPLC, Merck (Richmond, CA, EUA) com coluna LiChroCART 250-4
LiChospher 100 NH2 (10µm) acoplada.
- Sistema HPLC, em coluna Agilent Hi-plex H 7.7x300mm (São Paulo, SP, Brasil).
- Bancada de fluxo laminar Pachane Pa300 (Piracicaba), SP, Brasil);
- Espectrofotômetro de microplacas foi obtido da Epoch – BioTek (Winooski, VT,
USA);
- Microscópio NIKON Eclipse Ti-U (Melville, NY, EUA);
- Sistema de purificação de água BarnsteadTM NanopureTM – DISCONTINUED
modelo 7146 e 7155 foi obtido da Thermo Scientific (California, USA);
- Microscópio de força atômica (Scanning Probe Microscope SPM) modelo 9700, ano
2011, da SHIMADZU (Kyoto, Japan);
- Espectrômetro FTIR- 8400S, modelo IRAffinity-1 (Shimadzu, Japão);
- Espectrometro de ressonância magnética nuclear Bruker Avance III HD 600 MHz
(Bruker BioSpin Corporation, 138 Billerica, MA, USA),
- Incubadora Themoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110
(USA);
- Microscópio de força atômica (Scanning Probe Microscope SPM) modelo 9700, ano
2011, da SHIMADZU (Kyoto, Japan);
- Zeta Plus - Zeta Potential Analyzer, ano 2012, foi obtido da Brookhaven (New York,
USA);
- Espectrometro de disperção de raio-X (MEV-HITACHI) Marca Bruker, modelo
Auriga modelo XFlash Detector.
53
3.5. MÉTODOS
3.5.1. Extração dos Polissacarídeos
Abaixo (figura 9) resume-se de forma esquemática o processo de extração dos
polissacarídeos de L. variegata e D. mertensii que vão ser explicados adiante.
Figura 9- Esquema de extração dos polissacarídeos. Resumidamente, as algas L.
variegata e D. mertensii foram submetidas a delipidção e proteólise. Em seguida, o
sobrenadante de L. variegata foi precipitado com volumes crescentes de acetona e
as frações foram denominada: F0,3; F0,5; F0,8; F1,0 F1,5 e F2,0. Posteriormente, as
frações F0,8 e F1,0 foram utilizandas no sistema de separação por tamanho
molecular, obtendo-se as frações: <10 kDa, >30 kDa e >10<30 kDa sendo esta
última formada de laminarinas. Em paralelo, o sobrenadante de D. mertensii foi
precipitado com 2 voumes de metanol para obtenção das fucanas.
Foram necessário mais passos de purificação em L. varigata em comparação
com D. mertensii, isso porque para L. variegata além de conter poissacarídeos
sulfatados comtém outros polissacarídeos e por isso mais passos foram necessários
54
para obteção da laminarina. Já D. mertensii possui grandes quantidades de fucana,
por isso menos passos de purificação foram necessários.
3.5.1.1. Delipidação
Cada espécie de alga seca triturada (L. variegata ou D. mertensii) passou por
um processo de despigmentação/ delipidação como foi descrito por Rocha et al.
(2005). Para tal, dois volumes de etanol PA foi adicionado ao Becker contendo cada
alga. Cada material foi misturado junto a álcool e ficou em repouso por 24 h, à
temperatura ambiente. A cada saturação do etanol, identificado visualmente,
realizou-se a renovação do solvente. Após a sexta troca os pós foram separados do
etanol por filtração, seco à temperatura ambiente e exposto ao sol. Obtendo-se
assim o pós de algas delipidados de L. variegata e D. mertensii.
3.5.1.2. Proteólise
Com o intuito de liberar os carboidratos que estavam ligados ou associados a
proteínas da matriz extracelular, ou de outas estruturas, utilizou-se uma mistura de
proteases alcalinas comercial (Prozina). Para tal cada pó de alga delipidado foi
suspenso em solução salina (0,25 M de NaCl) e proteolisado em pH 8 com o uso de
Prozima (15mg/g de pó delipidado), durante 18 h, a 60 oC. Neste processo, ocorreu
quebra das proteínas contidas nos fragmentos da alga, liberação e solubilização dos
polissacarídeos na solução salina. As soluções de polissacarídeos foram separadas
do material sólido por filtragem e centrifugadas a 9500 x g por 15 minutos, 4 ºC
como descrito anteriormente (ROCHA et al. 2005) para a obtenção do sobrenadante
rico em polissacarídeos.
3.5.1.3. Precipitação e fracionamento dos polissacarídeos
Para os polissacarídeos de L. variegata contidos no sobrenadante foram
fracionados pela adição de volumes crescentes de acetona (0,3v; 0,5v; 0,8v; 1,0v;
1,5v e 2,0v) como descrito por Rocha et al. (2005). Entre cada adição de acetona a
suspensão foi centrifugada a 4 ºC, 8.000 x g por 20 min e o precipitado foi coletado.
Os precipitados foram denominados de acordo com o volume de acetona necessário
para sua obtenção, assim, obteve-se seis frações de polissacarídeos que foram
55
denominados: F0,3; F0,5; F0,8; F1,0; F1,5 e F2,0. As frações obtidas foram secas
em pressão reduzida, trituradas e pesadas para análise dos rendimentos.
Para os polissacarídeos de D. mertensii adicionaram-se dois volumes de
metanol aos sobrenadantes provenientes da centrifugação (soluções ricas em
polissacarídeos), e a nova mistura foi mantida a 4 °C, por um período de 12 h.
Posteriormente, as soluções foram centrifugadas a 9500 x g por 15 minutos a 4 °C e
os precipitados foram secos em pressão reduzida, triturados e pesados para análise
dos rendimentos.
Já para a alga D. mertensii os polissacarídeos foram precipitados com uso de
dois volumes de metanol e posteriormente centrifugada a 4 ºC, 8.000 x g por 20 min
e o precipitado foi coletado. Por fim, o polissacarídeo foi seco em pressão reduzida,
triturados e pesados.
3.5.1.4. Separação com uso dos dispositivos de separação por tamanho
molecular/ Centricons (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter)
As frações F0,8 e F1,0 de L. variegata foram diluídas em água (10 mg/mL) e
submetida a fracionamentos utilizando-se de dispositivos de separação por tamanho
molecular (Amicon®Ultra-15 Centrifugal filter) que apresentam membranas com
poros de tamanhos específicos (30 e 10 kDa; figura 10). O uso destes dispositivos
foi associado à centrifugação (4500 x g/20 minutos).
Figura 10- Representação do processo de separação com uso de dispositivos de
separação por tamanho molecular (Amicon® Ultra-15 Centrifugal filter).
Fonte: Manual da Amicon®
56
A laminarina foi obtida do material que passou pelo filtro de 30 kDa e ficou
retido no filtro de 10 kDa (ou seja, possui tamanho maior que 10 kDa e menor que 30
kDa). Posteriormente elas foram liofilizadas e acondicionadas em frascos fechados e
à temperatura ambiente até o uso.
3.5.2. Modificação dos polissacarídeos
3.5.2.1. Modificação das laminarinas de L. variegata por sulfatação
A síntese de laminarinas sulfatada ocorreu de acordo com Telles et al. (2011).
De maneira breve, n-propanol foi resfriado e ácido sulfúrico foi adicionado
lentamente ao n-propanol resfriado (proporção de 1 de ácido sulfúrico: 4 de n-
propanol). Posteriormente adicionou-se a laminarina em pó para ficar em
concentração final de 40 mg/mL. O material foi armazenado a 6 oC por 90min.
Posteriormente o material foi centrifugado a 25000 x g por 15 min a 10 oC e lavado 3
vezes de n-propanol com o mesmo volume de n-propanol (para cada lavagem)
utilizado no passo anterior. Após a última lavagem a laminarina sulfatada foi
suspensa em água destilada, congelado e liofilizado para armazenagem.
3.5.2.2. Modificação das laminarinas de L. variegata por descarga de barreira
dielétrica (DBD) (carboxilação)
A aplicação da descarga de barreira dielétrica (plasma) na laminarina foi
realizada de acordo com a metodologia proposta por Napartovich et al (2001) com
modificações no Centro Integrado de Inovação Tecnológica do Semiárido (CiTED),
Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, Brazil. O plasma foi gerado
utilizando gás hélio com fluxo de 1L/min, aplicado na voltagen de 15 kV, com
frequência de 4 kHz, por 1 minuto em descarga, com a amostra em estado seco.
O aparato utilizado para a geração do plasma DBD é composto pela entrada do
gás, tubo onde foi gerado o plasma, placa de metal, onde a membrana ficou
depositada, o dielétrico que ao mesmo tempo em que isola o sistema, também
espalha o plasma, distribuindo-o por toda a superfície da placa e consequentemente
sobre a amostra e o local onde é aplicada a descarga. O esquema é demonstrado
na figura 4.
57
3.5.2.3. Modificação das laminarinas de L. variegata por adição de ácido gálico
(galificação)
A síntese de laminarinas conjugadas com ácido gálico ocorreu de acordo com
Curcio et al. (2009). De maneira breve a síntese ocorreu da seguinte forma: em um
tubo cônico (de 50 mL) 50mg da laminarina foi dissolvida na concentração de
10mg/mL em água destilada. Então 100 µL de H2O2 1,2% contendo 5,4 mg de ácido
ascórbico foi adicionada. Após 30 min de descanso 21,87 mg de ácido gálico
(equivalente para ficar ácido gálico 1:1 dissacarídeo de laminarina) foi adicionado a
esta solução, levemente aquecida para solubilização e permanecendo em descanso
protegida da luz à 25 oC sob ar atmosférico por 24h. A solução foi então dialisada
com uso de um dispositivo de separação por tamanho molecular (de 3 kDa). A
solução de laminarina galificada foi congelada e liofilizada para posterior utilização.
Vale salientar que utra proporções de ácido gálico : dissacarídeo foram testadas,
como a proporção de 0,5:1 e a proporção de 2:1. Porém a proporção que promoveu
maiores valores de ácido gálico em LMG foi a proporção utilizada (1:1).
3.5.3.4. Síntese de nanopartículas de prata com fucanas de D. mertensii
Soluções de 10 mg/mL de polissacarídeo, foram adicionadas às soluções de
nitrato de prata (1 mM) em uma proporção de 1:9 e mantidas em repouso
(DIPANKAR & MURUGAN, 2012, modificado). A absorbância da solução de
nanopartícula foi verificada a cada dois dias por meio de espectrofotômetro de UV-
visível. Quando não ocorreu mais acréscimo de absorção, a solução foi centrifugada
duas vezes a 11500 x g por 20 minutos. O precipitado obtido foi liofilizado e
denominado de nanopartícula de fucana (NF).
3.5.3. Caracterização físico-química
3.5.3.1. Eletroforese em gel de agarose das laminarinas de L. variegata
Objetivando-se de identificar a presença de polissacarídeos sulfatados, bem
como identificar a uniformidade das amostras, estas foram submetidas a uma corrida
eletroforética como descrito abaixo (DIETRICH; DIETRICH, 1976).
58
O gel de agarose foi preparado na concentração de 0,6 % em tampão 1,3 -
diaminopropano acetato em 0,05M (PDA) pH 9,0 e colocado sob lâminas de vidro
(5,0 cm X 7,5 cm X 1,5 mm).
Alíquotas de 5µL de soluções a 10 mg/mL das amostras foram aplicadas no
gel descrito acima. A corrida eletroforética ocorreu a 110V por 1 hora (DIETRICH;
DIETRICH, 1976) dentro de uma cuba refrigerada a 4 ºC, em tampão PDA pH 9,0,
ligada a uma fonte Bio-Rad modelo PowerPac HC, partindo do polo negativo. Em um
dos poços do gel foram aplicados 5 μL de vermelho de Cresol, corante que serviu de
padrão de referência para a corrida.
Após a corrida eletroforética o gel foi submerso em 0,01% de brometo de N-
cety-N-N-N-trimetilamônio (CTV) (CETAVLON) por quatro horas. Posteriormente o
gel foi retirado, submetido a uma corrente de ar quente desidratado com auxílio de
papel filtro e em seguida corado com azul de toluidina 0,6%. O excesso do corante
foi removido com uma solução descorante contendo 1% de ácido acético: 50% de
etanol e 49% de água (formando a solução descorante). O gel foi novamente seco e
escaneado para posteriores análises.
3.5.3.2. Caracterização por espectroscopia de luz visível
Os polissacarídeos de L. variegata e suas modificações foram solubilizadas em
água destilada a 1 mg/mL e analisadas por espectroscopia de luz visível no
Espectrofotômetro FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil) em uma varredura de 190
nm à 800 nm.
A nanopartícula de fucana de D. mertensii teve absorbância verificada no
comprimento de onda entre 350 – 600 nm durante 15 dias no Espectrofotômetro
FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil).
3.5.3.3. Dosagem de proteínas presente nas amostras
A dosagem de proteínas de todas as amostras ocorreu com o uso do método
de Bradford (1976). Este método é baseado na interação entre o corante BG-250
(coomassie brilliant blue R-250) e as cadeias laterais básicas ou aromáticas dos
aminoácidos. Esta interação promove o deslocamento do equilíbrio do corante para
a forma aniônica, que por sua vez confere uma coloração azul que pode ser
monitorada por meio de espectrofotômetro no comprimento de 595 nm. O ensaio foi
59
realizado em temperatura ambiente e utilizou-se albumina sérica bovina (BSA) como
padrão para obtenção da equação da reta.
3.5.3.4. Dosagem de compostos fenólicos presente nas amostras
A dosagen de compostos fenólicos ocorreu com do método de Athukorala, Kim
& Jeon (2006). Neste, o reagente de Folin Ciocalteau é reduzido pelos compostos
fenólicos presentes nas amostras este processo promove a mudança de coloração
do reagente para a cor verde, que pode ser monitorada no comprimento de onda de
765 nm pelo espectrofotômetro. Quanto maior a coloração, maior a quantidade de
compostos fenólicos. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e protegido da
luz. Utilizou-se ácido gálico como padrão para obtenção da equação da reta.
3.5.3.5. Teor de sulfato das amostras
Para este teste, as amostras foram primeiramente hidrolisadas em HCl 6N, por
6h a 100 ºC. Após a hidrolise as amostras foram secas em um recipiente junto a
hidróxido de sódio para ocorrer a neutralização do ácido em um dessecador. Após
repetir o procedimento anterior três vezes as amostras foram submetidas ao teste de
dosagem de sulfato com uso do método de Dodgson & Price, (1962). Neste, o
sulfato é detectado por meio da complexação com o reagente gelatina-bário,
formando partículas suspensas que são detectadas devido a turbidimetria da
solução. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e utilizou-se sulfato de
sódio como padrão para obtenção da equação da reta.
O grau de substituição (DS) que designa a média de grupos sulfatos presente
em cada resíduo de açúcar foi determinado a partir do teor de enxofre, utilizando a
seguinte formula, em que S% = percentual de enxofre.
Em seguida, o resultado obtido acima é aplicado na fórmula abaixo:
Onde:
60
162 representa 1 mol da unidade repetitiva (hexose);
3200 representa a massa atômica do enxofre (32g) x 100
102 reresenta 1 mol do éster substituinte (SO3Na)-1
S representa o teor de enxofre dado em porcentagem (WHISTLER & SPENCER,
1964).
3.5.3.6. Teor de Ácidos urônicos
A dosagem de ácidos urônicos ocorreu pelo método de Cesaretti, M., et al.
(2003). Neste teste quantifica-se os ácidos urônicos na amostra pela reação de suas
carboxilas com o carbazol, dando uma coloração rosa. Após a adição do carbazol a
reação foi mantida protegida da luz a 100oC por 10 min e depois resfriada para
posterior mensuração em espectrofotômetro à 525 nm. Quanto maior a coloração,
maior a quantidade de ácidos urônicos. Utilizou-se o ácido glucurônico como padrão
para obtenção da equação da reta.
3.5.3.7. Composição monossacarídica
Os polissacarídeos de L. variegata foram hidrolisados (HCl 2 N, 2 horas, 100
ºC) e os monossacarídeos constituintes das frações foram determinados por
cromatografia descendente de papel.
A Cromatografia descendente de papel foi realizada em papel Whatman No1
no seguinte sistema de solvente: Butanol:Piridina:Água (2:3:1,5). Após a corrida o
papel foi seco a temperatura ambiente, passado em nitrato de prata e seco
novamente. Em seguida o papel foi passado em uma solução em NaOH 40% de
etanol e seco a temperatura ambiente. Posteriormente o papel foi passado em uma
solução de tiossulfato, lavado em água corrente, seco e escaneado para
identificação dos monossacarídeos. Foram usados os padrões de: glicose, xilose,
fucose, manose, arabinose e ácido glucurônico.
3.5.3.8. Espectroscopia de disperção de raios-X (EDS)
Análise de espectroscopia de disperção de raio-X das amostras foram realizadas
no equipamento MEV-HITACHI no Laboratório de Microscopia Eletrônica de
Varredura (LABMEV) no Departamento de Engenharia de Materiais (DEMat) da
61
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Foram feitas no mínimo 3
análises em campos distintos.
3.5.4. Caracterização estrutural dos polissacarídeos
3.5.4.1. Análise de infravermelho das amostras
Para as análises de infravermelho laminarinas nativas e laminarinas galificadas
de L. variegata, fucanas e nanopartículas de fucanas de D. mertensii, foram
analisadas. 5 mg de cada uma foi prensada com a mesma quantidade de KBr, e o
material resultante foi levado ao Espectrômetro Shimadzu FTIR-8400S. Foram
realizadas 30 varreduras para cada amostra na faixa compreendida entre 400 cm-1 e
4000 cm-1 a temperatura ambiente. A correção da linha de base ocorreu no
programa IRSolution versão 1.60SU1 (Shimadzu).
3.5.4.2. Análise do tamanho molecular das amostras
Os tamanhos moleculares das laminarinasnativa e das laminarinas modificadas
foram determinados por cromatografia de exclusão por tamanho em um HPLC
Accela (Thermo scientific, Massachusetts , EUA) com uso de uma coluna Waters
250 (Dimensões 7.8x300mm Walers Corp., Massachusetts, EUA) utilizando-se água
ultrapura 0,1M NaNO2 em fluxo de 0,6mL e forno à 30 oC.
3.5.4.3. Análise de ressonância magnética nuclear (RMN) de LM e LMG
Foram realizadas análises de RMN em laminarinas nativas e laminarinas
galificadas de L. variegata. Estas análises foram realizadas na Universidade Federal
do Paraná, UFPR, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, ACF Centro
Politécnico. A espectroscopia de RMN foi conduzida com uso de um espectrômetro
Bruker Avance III HD 600 MHz (Bruker BioSpin Corporation, 138 Billerica, MA, USA),
em água deuterada (D2O) 99,9% e as análises foram realizadas a 70 ºC. As
amostras foram preparadas segundo protocolo do laboratório de análise,
resumidamente 20 mg da amostra foi solubilizada em 0,5 mL de D2O e então
centrifugada. Apenas o sobrenadante foi transferido para tubos de RMN de 5 mm e
então submetido aos experimentos unidimencionais (1H e 13C) e bidimensionais
(HSQC) à 70°C. Os deslocamentos químicos, expressos em δ (ppm), foram
determinados utilizando dimetil-sulfóxido (DMSO) com δ de 2,67 e 39,9 ppm para 1H
62
e 13C, respectivamente, de acordo com as recomendações da IUPAC. Os
experimentos bidimensionais: 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC foram utilizados para os
assinalamentos dos deslocamentos químicos do composto isolado e,
posteriormente, sua caracterização estrutural. Todos os espectros, uni e
bidimensionais, foram analisados no software TopSpin versão 2.1. Os desvios
químicos foram expressos em δ em relação ao trimetilsilil propionato de sódio
(TMSP) em δ = 0,00 de acordo com as recomendações da IUPAC.
3.5.4.4. Avaliação do tamanho e carga da nanopartícula
Medições de dispersão de luz dinâmica (DLS) e Potencial Zeta das fucanas e
nanopartículas de fucanas de D. mertensii foram realizadas a 25 oC no equipamento
Zeta Potential Analyzer – Brookhaven, para a determinação do tamanho e carga
superficial das NF, respectivamente.
Além disso, o tamanho das nanopartículas em DLS foi verificado uma vez ao
mês durante 16 meses para verificação da estabilidade da nanopartícula de fucana.
3.5.4.5. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Imagens de MEV de nanopartículas de fucanas de D. mertensii foram
realizadas pelo Transmission electron microscopes Penta FET® Precision –
OXFORD Instruments, no Centro de Tecnologia do Gás e Energias (CTGás), Brasil,
Natal, RN. Para isso, uma gota da solução de nanopartícula foi colocada sobre uma
lamínula, este material foi seco em pressão reduzida e a lamínula foi colocada no
MEV. Foram feitas no mínimo 3 imagens em campos distintos. Todas as imagens
foram avaliadas quanto à forma das nanopartículas de fucanas.
3.5.5. Avaliação das atividades farmacológicas dos polissacarídeos modificados
3.5.5.1. Avaliação das atividades antioxidantes in vitro de laminarinas
3.5.5.1.1. Avaliação da capacidade do sequestro de íons superóxido (O2-) das
amostras
Neste teste verifica-se a capacidade da amostra sequestrar o nitroblue
tetrazolium (NBT) ativado por meio da redução fotoquímica pelo sistema Riboflavina-
Luz-NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971; DASGUPTA, 2007). Quanto menor a
63
intensidade da coloração, menos NBT disponível para a ativação fotoquímica,
portanto, maior atividade sequestradora. Para a realização deste teste 3 mL da
solução reagente contendo: tampão fosfato (50 mM, pH 7,8), metionina (13 mM),
riboflavina (2 μM), EDTA (100 μM), NBT (75 μM) e 1 mL de solução contendo as
frações polissacarídicas em diferentes concentrações (10-2000 µg/mL), foram
incubadas sob iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A produção do azul
de formazan foi monitorada pelo aumento da absorbância a 560 nm. O ensaio foi
realizado em temperatura ambiente o branco foi protegido da luz e as amostras
foram submetidas à luz intensa para a ativação do NBT livre. Utilizou-se ácido gálico
como padrão e este também foi usado nas concentrações contidas na laminarina
galificada.
3.5.5.1.2. Avaliação da capacidade do sequestro de radical hidroxila (OH-) das
amostras
O potencial de sequestro do radical hidroxila pode ser simulado pelo método
FeCl2/H2O2. O princípio no método é baseado na reação dos radicais hidroxilas que
reagem com o salicilato de sódio formando o intermediário ácidodiidroxibenzoico
(DHBA), que é monitorado a 510 nm em espectrofotômetro (SMIRNOFF, 1985).
Quanto menor a coloração menos radical hidroxila disponível para a reação, assim,
verifica-se maior atividade sequestradora. Para a realização deste teste, o radical
hidroxila foi gerado utilizando-se 3 mL de tampão de fosfato de sódio (150 mM, pH
7.4), que continha 10 mM de FeSO4.7H2O, 10 mM de EDTA, 2 mM de salicilato de
sódio, 30% de H2O2 e concentrações diferentes dos polissacarídeos. O radical foi
gerado devido à reação de Fenton (Fe2 + + H2O2 → Fe3+ + OH-+ OH.). Para o controle
foi utilizado tampão fosfato em substituição ao peróxido de hidrogênio. Após
incubação a 37 ºC por 1 hora, a presença de radical hidroxila foi medida através da
absorbância a 510 nm. O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e protegido
da luz. O ácido gálico foi utilizado como padrão e também foi usado nas
concentrações contidas na laminarina galificada.
3.5.5.1.3. Avaliação da capacidade quelante de ferro (Fe2+) das amostras
Neste teste o Fe2+ livre forma um complexo com a ferrozina, adquirindo uma
coloração rosa, a intensidade desta coloração é acompanhada por
64
espectrofotômetro em 562 nm (BORG, 1993; WANG et al., 2008). Para avaliar a
capacidade quelante de ferro das amostras, elas foram pipetadas em diferentes
concentrações junto a uma mistura de reação constituída de cloreto de ferro II (0,05
mL, 2 mM) e ferrozina (0,2 mL, 5 mM). Após agitação por alguns segundos, a
mistura foi mantida a temperatura ambiente por 10 minutos para que ocorressem as
reações necessárias e posteriormente a absorbância da solução foi medida a 562
nm.
Quanto maior a capacidade da amostra em quelar o ferro, menos ele estará
disponível para formação do complexo e, portanto, menor será a coloração. EDTA
foi utilizado como padrão e ácido gálico foi usado nas concentrações contidas na
laminarina galificada.
3.5.5.1.4. Avaliação da capacidade quelante de cobre (Cu2+) das amostras
Com a utilização do reagente violeta de pirocatecol, foi possível a identificação
de cobre livre em solução (MEGÍAS et al., 2009). Este reagente se associa ao cobre
na solução conferindo uma coloração que pode ser acompanhada por meio de um
espectrofotômetro em 632 nm, quanto menor a coloração, menor a quantidade de
cobre livre e maior a capacidade da amostra de quelar este íon.
O teste foi realizado em microplaca. Em cada poço, foram adicionadas
amostras em diferentes concentrações (0,1 – 2,0 mg/mL), violeta de pirocatecol (4
mM) e sulfato de cobre II pentahidratado (50 µg/mL), sendo a mistura
homogeneizada após a adição de cada item. A absorbância foi medida a 632 nm.
EDTA foi utilizado como padrão e ácido gálico foi usado nas concentrações contidas
na laminarina galificada.
3.5.5.1.5. Avaliação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) das amostras
Nesse ensaio verifica-se a capacidade da amostra em doar elétrons para o
molibdato (VI), formando o molibdato (V). Este se associa ao fostato presente,
formando o complexo fosfomolibdato. Em pH ácido este complexo adquire uma
coloração esverdeada que pode ser mensurada em espectofotômetro à 695 nm
(PRIETO, 1999). Para realizar o ensaio as amostras foram adicionadas em uma
solução reagente (28 mM de fosfato de sódio, 0,6 M de ácido sulfúrico, 4 mM de
molibdato de amônia). O ensaio foi realizado em temperatura ambiente e colocada
65
em estufa á 100 oC por 90 minutos. Utilizou-se ácido gálico como padrão. Ácido
gálico foi usado nas concentrações contidas na laminarina galificada
3.5.5.1.6. Avaliação do poder redutor
Nesse teste verifica-se a capacidade da amostra em doar elétrons (em um
ambiente relativamente neutro) para o ferrocianeto de potássio (Fe+3) formando o
ferrocianeto de potássio reduzido (Fe+2). Este na presença do cloreto de ferro forma
uma coloração azul-esverdeada conhecida como azul de Prússia que pode ser
mensurada em espectrofotômetro à 700nm (ATHUKORA; KIM; JEON, 2006).
Para avaliar o poder redutor, 4 mL de solução contendo as amostras em
diferentes concentrações (50, 100 e 500 µg/mL) foram misturadas ao tampão fosfato
(0,2 M, pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1%) e incubados por 20 minutos a 50 ºC.
A reação foi interrompida pela adição de TCA (ácido tricloroacético) a 10%. Por fim,
adicionou-se água destilada e cloreto de ferro (0,1%). Ácido gálico foi usado nas
concentrações contidas na laminarina galificada
Pela análise de todos os ensaios antioxidantes in vitro foi escolhida a melhor
modificação de laminarinas para os ensaios posteriores.
3.5.5.2. Avaliação das atividades antioxidantes de LM e LMG em cultura de
células
As células MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™, células de rim de cachorro)
foram mantidas em meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e
antibióticos (estreptomicina 10mg/mLe penicilina 10.000 unidades) e incubadas a 37
oC e 5% de CO2.
3.5.5.2.1. Determinação da condição da injúria
Esse método foi adaptado de Ouyang (2011) e foi realizado como se segue:
Para se realizar esta etapa de experimentos, inicialmente foi necessário se
determinar a melhor condição de dano. O modelo celular escolhido foi a linhagem de
rim de cachorro MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™). As células foram plaqueadas
em placas de 96 poços em uma densidade de 5 x 103 células/poço e mantidas em
repouso para adesão por 24 horas, à 37 °C e 5% CO2. Posteriormente, o meio foi
trocado por um novo, sem a presença de SFB contendo diferentes concentrações de
66
peróxido de hidrogênio (0,1 até 5 mM) por 1h. Posteriormente o meio com peróxido
de hidrogênio foi retirado e colocado um meio de cultura DMEM com SFB. Após 24
horas de incubação, observou-se que a capacidade das células em reduzir o MTT e
verificou-se que na condição de 3 mM as células sofriam dano suficiente para
diminuir a redução do MTT em 50%. Concentrações maiores que 3 mM promoveram
um dano muito acima de 50%, já o controle sem peróxido de hidrogênio não teve
dano algum pelo ensaio de redução de MTT (dados não mostrados).
Nos ensaios abaixo os todos os tratamentos tiveram 4x103 células/poço que
cresceram em placa de 96 poços com meio DMEM com SFB durante 24h.
Posteriormente ocorreu a sincronização do ciclo celular das células, para tal foi
retirado o meio com soro e adicionado o meio sem soro e incubados por mais 24h.
3.5.5.2.2. Avaliação da capacidade das células, previamente tratadas com
peroxido de hidrogênio e posteriormente tratadas com amostras, reduzirem o MTT
(efeito reparador).
Para este ensaio o meio sem soro foi trocado por DMEM sem soro com 3 mM de
peróxido de hidrogênio e incubado por uma hora. As células do controle sem
peróxido que recebem meio com SFB sem peróxido de hidrogênio. Após uma hora
de exposição ao peróxido de hidrogênio o meio foi retirado da placa e foi adicionado
meio com soro contendo as amostras (LM e LMG) em diferentes concentrações
(125; 250 e 500 µg/mL). Após incubar por 24h a viabilidade celular foi determinada
pelo teste colorimétrico de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
(MTT; MOSMANN, 1983) substituindo-se o sobrenadante por meio sem FBS
adicionado de 1 mg/mL de MTT e incubados por 4 h a 37 °C. Após este período de
incubação, o sobrenadante foi removido e os cristais de formazan foram
solubilizados em etanol 99%. A placa foi mantida sob agitação para
homogeneização por 15 minutos, à temperatura ambiente, e a absorbância foi
medida à 570 nm em um leitor de microplaca (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA).
Para o controle de ácido gálico foi utilizado a concentração de ácido gálico
contida nas concentrações usadas de LMG e incubados por 24h. Como se verificou
que existe 1,48% de ácido gálico em LMG então foi utilizado 1,5% das
concentrações 0,125; 0,25 e 0,5 (ou seja, 1,875; 3,75 e 7,5 µg/mL). Também foi feito
um controle com peróxido em que foi utilizado DMEM com SFB e peróxido. Para
controle sem preróxido foi utilizado DMEM com SFB sem peróxido. A absorbância do
67
controle sem peróxido foi considerada como 100% de redução do MTT e os valores
das células tratadas foram calculados como percentual do controle negativo.
Na figura 11 encontra-se uma representação esquemática de como ocorreu o
tratamento.
3.5.5.2.3. Avaliação da capacidade das células, concomitantemente tratadas
com peroxido de hidrogênio e amostras, reduzirem o MTT (efeito concomitante).
O meio sem soro foi trocado por DMEM com soro contendo as amostras (LM e
LMG) em diferentes concentrações (125; 250 e 500 µg/mL) mais 3 mM de peróxido
de hidrogênio e incubados por 1h. Posteriormente o meio é retirado e substituído por
meio com soro e incubado por 24h. Após a incubação a viabilidade celular foi
determinada pelo teste colorimétrico de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
tetrazolium bromide (MTT; MOSMANN, 1983) como descrito acima.
Para o controle de ácido gálico foi utilizado a concentração de ácido gálico
contida nas concentrações usadas de LMG (como citado acima) e incubados por
24h. Para o controle com peróxido foi usado somente DMEM com soro e peróxido.
Para controle sem peróxido utilizou-se DMEM com soro sem peróxido.
Na figura 11 encontra-se uma representação esquemática de como ocorreu o
tratamento.
3.5.5.2.4. Avaliação da capacidade das células, previamente tratadas com
amostras e posteriormente tratadas com peroxido de hidrogênio, reduzirem o MTT
(efeito preventivo).
O meio sem soro foi trocado por DMEM com soro contendo as amostras (LM e
LMG) em diferentes concentrações (125; 250 e 500 µg/mL) e incubadas por 24h.
Posteriormente o meio com soro e amostras foram retirados e colocados meio sem
soro com 3 mM de peróxido de hidrogênio e incubado por uma hora. Após isto o
meio foi retirado e colocado meio com soro. Após incubar por 24h a viabilidade
celular foi determinada pelo teste colorimétrico de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; MOSMANN, 1983). como descrito acima.
Para o controle de ácido gálico foi utilizado a concentração de ácido gálico
contida nas concentrações usadas de LMG (como citado acima). Para o controle
68
com peróxido foi utilizado DMEM com soro e peróxido. Para controle sem peróxido
utilizou-se DMEM sem soro sem peróxido.
Na figura 11 encontra-se uma representação esquemática de como ocorreu o
tratamento:
Figura 11- Representação esquemática de como ocorreram os tratamentos com
peróxido de hidrogênio em células MDCK.
Fonte: Autoria própria.
3.5.5.3. Análises de citometria de fluxo de células tratadas com LM e LMG
3.5.5.3.1. Análise da viabilidade celular por meio de citometria de fluxo de células
marcadas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) (viabilidade celular).
Para realização deste ensaio celular foi utilizado um kit Anexina V-FITC/PI
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, com
pequenas modificações. As células MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™) foram
cultivadas em placas de 6 poços em meio DMEM suplementado com 10% de SFB e
incubadas a 37 oC e 5% de CO2. Após 24 h, o meio foi removido e as células foram
69
carenciadas por 24 h com meio sem SFB. Posteriormente, o meio foi aspirado e foi
adicionado um novo meio DMEM com SFB e amostras (LM e LMG) na concentração
de 125 µg/mL. Além disso, também foi realizado um controle (não tratado) contendo
somente meio de cultura DMEM com SFB e um controle de ácido gálico na
concentração correspondente a quantidade contida em 125 µg/mL de LMG (ou seja,
1,875 µg/mL de ácido gálico).
Após o tratamento, as células foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS
gelado e ressuspendidas em 100 μL de tampão de ligação disponível no kit.
Posteriormente 5 μL de Anexina V-FITC e 1 μL de iodeto de propídio (PI) foram
adicionados e a mistura foi incubada por 30 minutos no escuro. Finalmente, 400 μL
do tampão de ligação foram adicionados às células, com posterior mensuramento,
de no mínimo, 10 mil eventos, em citômetro de fluxoa mistura foi analisada por
citometria de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) e(BD
FACSCalibur) . A percentagem de células em apoptose foi determinada com, no
mínimo, 10 mil eventos pelo citômetro de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences,
Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva, version 6.1.2 (Becton Dickson,
Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram analisados no software FlowJo
(FlowJo, Ashland, OR, EUA).
3.5.5.3.2. Análise do ciclo celular por meio de citometria de fluxo de células
marcadas com PI (ciclo celular).
Para análise do ciclo celular, as células MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™)
foram cultivadas em placas de 6 poços em meio DMEM suplementado com 10% de
SFB e incubadas a 37 oC e 5% de CO2. Após 24 h, o meio foi removido e as células
foram carenciadas por 24 h com meio sem SFB. Posteriormente, o meio foi aspirado
e foi adicionado um novo meio DMEM com SFB e amostras (LM e LMG) na
concentração de 125 µg/mL. Este foi novamente incubado a 37 oC e 5% de CO2 por
24h. Após o tratamento ocorreu uma etapa de tripsinização e duas lavagens com
PBS, as células foram permeabilizadas com 90 μL de Triton X-100 (Sigma, St. Louis,
MO, EUA) 0,1% e tratadas com 10 μL de RNAse (4 mg/mL) (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EUA) por 1 h a 37º C. Em seguida, foram marcadas com 5 μL de iodedo de
propídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Além disso, também foi realizado um
controle negativo (não tratado) de células mantidas em meio de cultura DMEM
contendo 10% de SFB. A marcação foi quantificada no citômetro de fluxo
70
(FACSCanto II, BD Biosciences, Eugene, OR, EUA) com o software FACSDiva,
versão 6.1.2 (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os resultados foram
analisados no software FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA).
3.5.5.4. Análise da atividade antibacteriana de fucana e sua nanopartícula
3.5.5.4.1. Avaliação da Concentração inibitória mínima (MIC) das amostras
A MIC também chamada de concentração mímima bactericida de fucana e
nanopartícula de fucana de D. mertensii foram adicionados em diferentes
concentrações (500, 300, 200, 100, 50, 20 e 10 µg/mL, - cada concentração em
triplicata -) ao meio Mueller Hinton, HiMedia® e transferidos para microplaca de 96
poços. Em paralelo, as bactérias ativadas, que cresceram por 24 h em ágar
nutriente, foram ajustadas quanto a turvação da solução em escala de Macfarland
(0,5 x 108 UFC/mL) para conter aproximadamente 1 x 108 UFC/mL, e então foi
retirado 10 µl dessa solução que foram adicionados aos poços da microplaca
contendo amostras (concentração do inóculo por poço foi de 5 x 105 UFC/mL).
Para o controle positivo (poços com bactéria e antibiótico) foi utilizado
antibiótico gentamicina e para o controle negativo (poços com bactéria sem
antibiótico) adicionou-se somente solução salina (NaCl) e meio. O crescimento
bacteriano foi verificado, após 24 h de incubação a 37 °C, por densidade ótica em
560 nm. MIC foi interpretado como a menor concentração, de cada amostra, que foi
capaz de impedir completamente o crescimento bacteriano. A atividade foi exposta
depois de descontados a leitura dos brancos de todas as amostras. Este ensaio
verifica a atividade bacteriostática das amostras.
3.5.5.4.2. Avaliação da concentração bactericida mínima (MBC)
MBC também chamada de concentração mínima bactericida de fucana e
nanopartícula de fucana de D. mertensii foram submetidas as bactérias por 24 h em
MIC, foram semeadas em Agar nutriente (Nutrient Agar, HiMedia) e incubadas por
24 h e 48 h para verificar o crescimento bacteriano. As placas foram verificadas
visualmente quanto à presença de colônias e aquelas em que não se identificou
colônias foram separadas a fim de se identificar a menor concentração da amostra
que promoveu morte de todas as bactérias, e essa foi intitulada de concentração
bactericida mínima (MBC). Este ensaio verifica a atividade bactericida das amostras.
71
3.5.5.5. Análise da atividade redutora de MTT da fucana e sua nanopartícula
Para os testes, 0,5 x 104 células cresceram em placa de 96 poços com meio
DMEM contendo as amostras em concentrações de 0,01; 0,05; 0,1 e 1 mg/mL por 24
h (cada concentração em triplicata). A viabilidade celular foi determinada pelo teste
colorimétrico de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT;
MOSMANN, 1983).
3.5.5.6. Análise da atividade imunomodulatória da fucana e sua nanopartícula.
3.5.5.6.1. Ensaio de produção de óxido nítrico das amostras da fucana e sua
nanopartícula
Células de macrófago de camundongo (RAW 264.7) foram cultivadas em
placas de 24 poços (com 3x105 células/poço) com meio DMEM contendo 10% de
soro fetal bolvino (FBS) e antibióticos (estreptomicina 10 mg/mL e penicilina 10.000
unidades). Após 24 h de incubação para que houvesse a adesão celular, o meio foi
substituído por um novo meio contendo as amostras. Para o controle adicionou-se
somente novo meio.
Após 24 h de permanência com as amostras, 100 µL do sobrenadante de cada
triplicata, foi retirado e adicionado a 100 µL do reagente de Griess, (1% de
sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico e 0,1% naphthlethylenediamine
dihydrochoride em água) em placas de 96 poços. A presença de óxido nítrico foi
evidenciado pela mudança de coloração (com a adição ao reagente) que foi
acompanhada em leitor de microplaca á 540 nm. Para controle foram utilizados
meios de cultura de células de macrófagos induzidos à produção de óxido nítrico
(NO) por lipoproteínas (LPS) e meios de cultura de células não induzidas à produção
de NO, controle positivo e negativo, respectivamente. Como padrão utilizou-se o
nitrito de sódio. Também foi realizado ensaio de MTT com células RAW incubadas
com 0,001 mg/mL de cada amostra.
3.5.5.6.2. Ensaio de produção de citocinas por células incubadas com da fucana
e sua naopartícula
Macrófagos de camundongo (RAW 264.7) foram cultivadas em placas de 24
poços (com 3x105 células/poço) com meio DMEM contendo 10% de soro fetal
72
bolvino (FBS) e antibióticos (estreptomicina 10 mg/mL e penicilina 10000 unidades).
Após a adesão celular com 24 h o meio foi removido e adicionou-se um novo meio
contendo as amostras. Para o controle adicionou-se somente novo meio. Após 24 h
de permanência com as amostras o sobrenadante foi retirado para avaliação quanto
a concentração de interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-6 (IL-6),
interferon- γ (INF-γ), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-17A (IL-17A) e
interleucina-10 (IL-10), conforme os procedimentos indicados no kit.
A determinação ocorreu por Cytometric Bead Array (CBA) Mouse
Th1/Th2/Th17 Cytokine (BD). Este kit CBA contém esferas de captura de tamanho
conhecido que estão conjugadas com um anticorpo primário específico. Quando
estas esferas foram incubadas com os meios de cultura coletados, as diferentes
esferas se ligaram a analítos específicos (de citocinas específicas). Por sua vez o
anticorpo primário foi submetido ao contato com o reagente de detecção e ligou-se a
um anticorpo secundário contendo ficoeritrina. A presença de ficoeritrina (PE)
forneceu sinal de florescência proporcionalmente a quantidade de analito ligado a
cada esfera de captura, portanto, permitiu a identificação de citocinas pela
intencidade da fluorescência do reagente de detecção. Os ensaios foram realizados
de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante e a leitura realizada
em citômetro de fluxo (FACSCANTO II, BD Bioscience).
3.5.5.7. Análises estatísticas dos ensaios
Para cada ensaio foi realizado três experimentos independentes e os dados
foram expressos em média ± desvio padrão. Os dados foram analisados por analise
de variância (ANOVA), seguido do do teste de comparação de médias Student
Newman-Keuls (p<0,05) para determinar diferenças significativas entre as amostras
testadas. O programa utilizado nas análises estatísticas foi o GraphPadPrism versão
5,0, 2014 (La Jolla, CA, USA).
Abaixo encontra-se a tabela 4 que resume todos os métodos realizados com
cada amostra.
73
Tabela 4 – Tabela que resume os ensaios realizados com os polissacarídeos de L.
variegata e D. mertensii.
Ensaio/Teste Polissacarídeos de L.
variegata
Polissacarídeos de D.
mertensii
Sulfatação, modificação por
DBD e galificação; LM -
Síntese de nanopartículas; - Fucana
Eletroforese, UV- visível, teor
de proteínas, fenólicos e
sulfato;
LM, LMS, LMC, LMG Fucana e NF
Teor de ácidos urônicos,
composição
monossacarídica e tamanho
molecular;
LM, LMS, LMC, LMG -
Infravermelho; LM e LMG Fucana e NF
RMN; LM e LMG -
DLS, potencial zeta e MEV; - Fucana e NF
Antioxidantes in vitro; LM, LMS, LMC, LMG -
Antioxidantes em células; LM e LMG -
Morte celular, ciclo celular; LM e LMG -
Atividades antibacterianas; - Fucana e NF
Atividade redutora do MTT; - Fucana e NF
Atividade imunomodulatória - Fucana e NF
Fonte: Autoria própria. “-“ representa ausência deste ensaio.
74
4 RESULTADOS
4.1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Os resultados desta tese estão divididos em duas partes para um melhor
entendimento dos experimentos. A primeira parte contempla os resultados obtidos
com as laminarinas de L. variegata, suas modificações por sulfatação, descarga de
barreira dielétrica e galificação e avaliação da potencialização das atividades
antioxidantes in vitro e em cultura de células. Enquanto na segunda parte,
contempla-se a extração de fucanas de D. mertensii, síntese de nanopartículas de
prata com estas fucanas e avaliação da potencialização das atividades
antibacteriana, antitumoral e imunonomodulatória.
4.2. PARTE 1 – Polissacarídeos de Lobophora variegata
4.2.1. Rendimentos da extração e modificações
Como descrito em métodos, foram obtidos polissacarídeos extraídos de L.
variegata. Observa-se na tabela 5 que a fração para qual se obteve o melhor
rendimento foi a F0,8 (com rendimento de 47,50 ± 14,9%), seguidas da fração F1,5
(27,13 ± 12,13%) e F1,0 (com 24,01 ± 12,01%). De maneira intermediária a fração
F0,5 teve rendimento de 15,13 ± 8,45%. Já os menores rendimentos foram obtidos
com as frações F2,0 e F0,3 (rendimento de 3,48 ± 2,1% e 6,27 ± 3,21%,
respectivamente).
As frações de maior rendimento (F0,8, F1,0 e F1,5) foram então submetidas ao
fracionamento por meio de dispositivos de separação por tamanho molecular,
chamados centricons. Dentre estas, as frações F0,8 e F1,0 foram as que com elas
pôde-se obter polissacarídeos neutros (não sulfatados) com o mesmo tamanho
molecular (entre 10 e 30 kDa de acordo com os tamanhos do filtros utilizados na
centrifugação por tamanho molecular). Por este motivo, as extrações seguintes
foram realizadas de modo que F0,8 e F1,0 foram misturadas tornando-se F0,8-F1,0.
75
Tabela 5- Rendimentos das frações F0,3; F0,5; F0,8; F1,0; F1,5; F2,0. 100%
representa a quantidade total de polissacarídeos obtidos.
Fração Rendimento (%)
F0,3 6,27 ± 3,21
F0,5 15,13 ± 8,45
F0,8 47,50 ± 14,9
F1,0 24,01 ± 12,01
F1,5 27,13 ± 12,13
F2,0 3,48 ± 2,1
Fonte: Autoria própria.
Após a separação de F0,8-F1,0 com uso dos centricons foram obtidos três
subfrações. Uma subfração com tamanho menor que 10 kDa, sendo chamada de
<10 kDa; uma fração entre 10 kDa e 30 kDa, sendo chamada de >10<30 kDa e uma
subfração maior que 30 kDa sendo chamada de >30 kDa. Os rendimentos obtidos
para estas subfrações estão apresentados na tabela 6. Nesta tabela observa-se que
os polissacarídeos de maior tamanho (>30 kDa) foram os polissacarídeos nos quais
conseguiu-se obter maior rendimento (60,13 ± 8,93%) seguidos da subfração <10
kDa e >10<30 kDa, com rendimentos de 34,17 ± 10,20 e 5,68 ± 2,61,
respectivamente.
Tabela 6- Rendimentos das subfrações <10 kDa, >10<30 kDa e >30 kDa.100%
representa a quantidade total de polissacarídeos obtidos de F0,8-F1,0.
Subfração Rendimento (%)
<10 kDa 34,17 ± 10,20
>10<30 KDa 5,68 ± 2,61
>30 KDa 60,13 ± 8,93
Fonte: Autoria própria.
Conhecendo-se que algas marrons produzem polissacarídeos neutros
chamados laminarinas de tamnho entre 10 e 30 kDa a partir desse momento a
subfração >10<30 kDa será denominada de laminarina (LM).
Com LM foram realizadas três modificações: sulfatação, carboxilação e
galificação e estes polissacarídeos foram então chamados de LMS, LMC e LMG,
respectivamente.
76
Os resultados de recuperação do material após cada modificação estão
apresentados na tabela 7. Resumidamente, a maior porcentagem de recuperação
ocorreu após a carboxilação por DBD que pôde ser obtido todo o material inicial
(portanto, 100 ± 0,6 % de recuperação). Em seguida observa-se maior percentual de
recuperação com a modificação por galificação que pôde ser obtido 61,4 ± 5% de
recuperação de LMG com relação à LM. Por fim o menor percentual de recuperação
ocorreu com a sulfatação, obtendo-se 58,5 ± 8% de recuperação de LMS com
relação à LM.
Tabela 7- Resultados de recuperação da laminarina sulfatada (LMS), laminarina
carboxilada por DBD (LMC) e laminarina galificada (LMG) em comparação a
laminarina não modificada (LM).
Polissacarídeo
modificado Recuperação (%)
LMS 58,5 ± 8%
LMC 100 ± 0,6%
LMG 61,4 ± 5%
Fonte: Autoria própria.
4.2.2. Caracterização físico-química das amostras
4. 2.2.1. Dosagens das amostras
Quanto à composição química determinaram-se os teores de proteínas, sulfato,
grupos carboxila e compostos fenólicos das amostras (tabela 8). Com uso dos
resultados das doságens identifica-se que o maior valor de proteínas ocorreu com
F0,8-F1,0, com 2,78%. Valores intermediários com LMG (0,4%) e nenhuma proteína
foi detectada em LMS e LMC.
Ainda observa-se na tabela 8 que somente ocorreu sulfato em LMS (1,4% ou
grau de sulfatação de 0,068) já nas demais amostras não foram detectadas sulfato.
Em contrapartida, de modo exclusivo em LMC, constatou-se ácidos urônicos
(11,7%) já nas demais amostras este polissacarídeo não foi identificado. Por fim,
observa-se que não hove compostos fenólicos em LM, LMS e LMC quantidades
intermediárias (0,8 %) com a amostra F0,8-F1,0; e o maior teor ocorreu com a
amostra LMG (1,5 % ± 0,17).
77
Os dados obtidos de espectroscopia de disperção de raio-X corroboraram com
os de dosagens das amostras, indicando a presença de carbono e oxigênio em
todas as amostras e a presença de sulfato em LMS.
Tabela 8- Resultados das dosagens de proteínas, compostos fenólicos, sulfato e
composição monossacarídica de F0,8-F1,0; Laminarinas (LM); laminarinas
sulfatadas (LMS); laminarina carboxilada (LMC) e laminarina galificada (LMG). nd –
não detectado.
Amostras Proteínas
(%)
Sulfato
(%)
Ácidos
urônicos (%)
Compostos
fenólicos (%)
Composição monossacarídica (%)
Gli1
Gal1
Ac Glu1
Fuc1
F0,8-F1,0 2,8 ± 0,1 nd nd 0,8 ± 0,03 42,15 20,07 17,98 19,79
LM 0,2 ± 0,01 nd nd 0 ± 0 100 0 0 0
LMS nd 1,4 ± 0,34 nd 0 ± 0 100 0 0 0
LMC nd nd 11,7 ± 3,6 0 ± 0 100 0 0 0
LMG 0,4 ± 0,04 nd nd 1,5 ± 0,2 100 0 0 0
1Composição monossacarídica das amostras. Gli- Glicose, Gal- Galactose, Ac Glu- Acido
glucurônico e Fuc- Fucose. Fonte: Autoria própria.
Com relação a composição monossacarídica (tabela 8) observa-se que a
amostra F0,8-F1 é composta de glicose, galactose, ácido glucurônico e fucose nas
proporções de 42,1%, 20,07%, 17,98%, e 19,78%, respectivamente. Por outro lado,
LM, LMS, LMC e LMG possuem apenas glicose. Isto indica que o processo de
separação das laminarinas com uso dos dispositivos de filtração foi eficiente e que
LM, assim como as modificações, são homoglucanas.
4.2.2.2. Perfil das amostras
Na figura 12 é possível observar que as LM, LMC e LMG não apresentam
metacromasia e as LMS apresentam. Além disso, as LMS possuem um perfil de
corrida com maior mobilidade eletroforética que a fucana A.
Eclarece-se que a fucana A é um polissacarídeo sulfatado de alga já bem
caracterizado quanto a mobilidade eletroforética, além de ter sua estrutura
elucidada, por isso foi utilizado neste trabalho como padrão de comparação com
relação à metacromasia de polissacarídeos sulfatados de algas.
Na figura 13 encontram-se os perfis de absorção de luz visível de LM em
comparação com fucana A (figura 13a), LMS (figura 13b), LMC (figura 13c) e LMG
(figura 13d). Nota-se que a fucana A, LMC e LMG tiveram um perfil de absorção de
78
luz muito semelhantes entre si e diferentes (com menor absorção) que LM. Além
disso, LMS teve um perfil de absorção de luz mais semelhante com LM. Ainda assim
a absorção foi um pouco menor que LM na região de 310 cm-1 e maior que LM na
região a partir de 400 cm-1.
Figura 12- Perfil eletroforético da Fucana A (50µg) caracterizada por Rocha et
al. (2005) (Fuc); 100 µg da laminarina sulfatada (LMS); 100 µg de laminarina nativa
(LM; 100 µg de laminarina carboxilada (LMC); e 100 µg de laminarina galificada
(LMG).
Fonte: Autoria própria.
79
Figura 13- Perfil de absorção de luz visível da laminarina nativa e da fucana A
caracterizada por Rocha et al. (2005) (A); laminarina nativa e laminarina sulfatada
(B); laminarina nativa e carboxilada (C) e laminarina nativa e galificada (D); As
amostras foram preparadas a 1 mg/mL.
Fonte: Autoria própria.
4.2.2.3. Tamanho molecular das amostras
Na figura 14 observou-se que as LM apresentaram tamanho médio que variou
entre 10 e 14 kDa com predominância na população de 12,4 kDa. As amostras LMS,
LMC e LMG também tiveram tamanho variando predominantemente entre aquelas
regiões citadas, apresentando picos que indicam tamanhos médios de 12,8 kDa;
12,6 kDa e 12,8 kDa, respectivamente. Por isso, de modo geral, ocorreu pequena
diferença de tamanho.
80
Figura 14- Perfil de cromatografia de exclusão por tamanho em HPLC da laminarina
nativa (LM); laminarina sulfatada (LMS); laminarina carboxilada (LMC) e laminarina
galificada (LMG); As amostras foram aplicadas a 10 mg/mL.
Fonte: Autoria própria. Eixo x indica tempo de retenção em segundos.
4.2.3. Determinação das atividades antioxidantes das amostras
4.2.3.1. Sequestro de radical superóxido
Com uso do ensaio de sequestro do radical superóxido verificou-se a
capacidade das amostras sequestrarem este radical, como pode ser observado na
tabela 9.
Observou-se que somente a concentração de 0,5 mg/mL de F0,8- F1,0 teve
atividade sequestradora de radical superóxido (atividade de 7,75% de sequestro). As
demais amostras não apresentaram atividade sequestradora deste radical. O padrão
de ácido gálico (isolado) foi utilizado na quantidade contida nas concentrações
usadas em LMG e não se verificou atividade.
81
4.2.3.2. Sequestro de radical hidroxila
Com uso do ensaio de sequestro de radical hidroxila determinou-se a
capacidade das amostras sequestrarem este radical. Foi constatado que nenhuma
das amostras (LM, LMS, LMC e LMG) foi capaz de sequestrarem este radical em
nenhuma concentração testada (até 2mg/mL). O padrão de ácido gálico (isolado) foi
utilizado na quantidade contida nas concentrações usadas de LMG e também não
se verificou atividade (tabela 9).
Tabela 9- Capacidade sequestradora de radical superóxido de F0,8-F1,0; LM e LMS
em concentrações de 500 e 1000 µg/mL. O padrão de ácido gálico (isolado) foi
utilizado na quantidade contida nas concentrações usadas de LMG.
Amostras Concentração
(µg/mL)
Atividade
F0,8 e F1 500 7,75 ± 0,05
1000 0 ± 0,21
LM 500 0 ± 0,06
1000 0 ± 0,2
LMS 500 0 ± 0,14
1000 0 ± 0,08
LMC 500 0 ± 0,06
1000 0 ± 0,2
LMG 500 0 ± 0,17
1000 0 ± 0,22
Fonte: Autoria própria.
4.2.3.3. Atividade quelante de ferro
Com uso do ensaio quelante de ferro determinou-se a capacidade das
amostras quelarem este íon. Foi constatado que nenhuma das amostras (LM, LMS,
LMC e LMG) foi capaz de quelar o íon ferro em nenhuma concentração testada (até
2mg/mL). O padrão de ácido gálico (isolado) foi utilizado na quantidade contida nas
concentrações usadas de LMG e não se verificou atividade.
82
4.2.3.4. Atividade quelante de cobre
Com uso do ensaio quelante de cobre determinou-se a capacidade das
amostras quelarem este íon. Os resultados obtidos para a capacidade quelante de
íons cobre estão representados na figura 15.
Figura 15- Atividade quelante de cobre de 50 µg/mL; 100 µg/mL e 500 µg/mL da
laminarina nativa (em preto) e laminarinas sulfatada (azul) laminarina carboxilada
(verde) e laminarina galificada (vermelho). O padrão de ácido gálico (em cinza) foi
utilizado na quantidade contida nas concentrações usadas de LMG. Como se
verificou que existe 1,48% de ácido gálico em LMG então foi utilizado 1,5% das
concentrações 50; 100 e 500 (ou seja, 0,75; 1,5 e 7,5 µg/mL). Letras diferentes
representam diferença significativa entre LM ou LMS ou LMC ou LMG em diferentes
concentrações; números diferentes representam diferença significativa entre LM e
LMS ou entre LM e LMC ou entre LM e LMG na mesma concentração (P < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
Nesta figura observa-se as LM na concentração de 50 µg/mL tem capacidade
de quelar cerca de 40% do ions cobre. Na concentração de 100 µg/mL observa-se
que esta atividade foi acrescida para cerca de 50% de atividade, e não teve
diferença significativa comparada a concentração de 500 µg/mL. Com relação as
LMS observa-se que esta teve menor atividade que as LM em todas as
concentrações, com valores de cerca de 30% de atividade na concentração de
50µg/mL e pouco mais de 40% de atividade para as concentrações de 100 e
83
500µg/mL. Observa-se também que a atividade de ambas LMC e LMG tiveram
maior atividade que as LM. Com LMC as concentrações de 50 e 100 µg/mL tiveram
atividades de 43% e 54% de quelação, respectivamente, atividades semelhante à
LM. Somente na concentração de 500 µm que a atividade foi significativamente
maior que LM, obtendo atividade de cerca de 70%.
LMG à 50µg/mL teve atividade de cerca de 60% e as concentrações de 100
µg/mL e 500µg/mL tiveram atividade de 73% e 77%, respectivamente. Esta amostra
foi a que teve maior atividade, tendo sua atividade cerca de 1,5 vezes maior que LM
para todas as concentrações.
Por fim observa-se que o ácido gálico isolado teve menor atividade que LM
(11%, 38% e 50% com 0,75 µg, 1,5 µg e 7,5 µg, respectivamente) quando
adicionado a quantidade equivalente à existente nas amostras de LMG nas
concentrações de LMG utilizadas (ou seja 1,5% da concentração de LMG, ver tabela
7).
4.2.3.5. Atividade antioxidante total
Com uso do ensaio da capacidade antioxidante total determinou-se a
capacidade das amostras doarem elétrons em meio ácido. Os resultados obtidos
para a capacidade antioxidante total estão representados na figura 16.
Na figura 16 observa-se que LMG foi a única capaz de ter atividade
antioxidante total. Esta atividade foi de quase 89 mg de ácido ascórbico por grama
de amostra. Por outro lado, o ácido gálico por se só não teve atividade quando
adicionado a quantidade equivalente à existente nas amostras de LMG (ou seja,
1,5%).
84
Figura 16- Atividade antioxidante total de 100µg de LM, LMS, LMC e LMG.
Laminarina nativa (LM, em preto) e laminarinas sulfatada (LMS, em azul) laminarina
carboxilada (LMC, em verde) e laminarina galificada (LMG, em vermelho) O padrão
de ácido gálico (em cinza) foi utilizado na quantidade contida nas concentrações
usadas de LMG. Como se verificou que existe 1,48% de ácido gálico em LMG então
foi utilizado 1,5% de 100µg (ou seja, 1,5 µg/mL). Asterisco (*) representa diferença
significativa entre LM e outra amostra (P < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
4.2.3.6. Poder redutor
Com uso do ensaio de poder redutor determinou-se a capacidade das
amostras doarem elétrons em condição neutra (do ensaio in vitro). Os resultados
obtidos para a capacidade antioxidante total estão representados na figura 17.
Nesta figura 17 observa-se que LM 50 µg/mL e 100 µg/mL tiveram atividades
semelhantes (próximo a 5%), por outro lado, LM na concentração de 500 µg/mL
exibiu uma atividade de 68,4 mg de acido ascórbico por grama de amostra, bem
maior que as menores concentrações. Além disso, LMC nas concentrações de 50,
100 e 500 µg/mL tiveram atividades semelhantes a LM nas mesmas concentrações.
Por outro lado, observa-se que LMS não possui atividade nas concentrações
50 e 100 µg/mL e teve atividade de 24,8 mg de equivalente de acido ascórbico por
grama de amostra na concentração de 500 µg/mL. Já com LMG obteve-se maior
atividade que com LM em todas as concentrações testadas. De maneira sucinta: 50
µg/mL teve atividade de cerca de 10 mg de equivalente de acido ascórbico por
85
grama de amostra, 100 µg/mL teve atividade de 24,8 mg de equivalente de acido
ascórbico por grama de amostra, e 500 µg/mL teve atividade de cerca de 90 mg de
equivalente de acido ascórbico por grama de amostra.
Figura 17- Atividade de poder redutor de LM, LMS, LMC e LMG. Laminarina nativa
(LM, em preto) e laminarinas sulfatada (LMS, em azul) laminarina carboxilada (LMC,
em verde) e laminarina galificada (LMG, em vermelho). O padrão de ácido gálico
(em cinza) foi utilizado na quantidade contida nas concentrações usadas de LMG.
Como se verificou que existe 1,48% de ácido gálico em LMG então foi utilizado 1,5%
das concentrações 50; 100 e 500 µg/mL (ou seja, 0,75; 1,5 e 7,5 µg/mL). Letras
diferentes representam diferença significativa entre as diferentes concentrações
numa mesma amostra; números diferentes representam diferença significativa entre
LM e as laminarinas modificadas na mesma concentração (p < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
De modo geral, as principais análises químicas e os ensaios antioxidantes in
vitro estão suscitados na tabela 10. Nessa tabela observa-se que LMG foi a amostra
com maiores atividades antioxidantes.
86
Tabela 10- Características físico-químicas e atividades antioxidantes de LM, LMS,
LMC e LMG.
Análises LM LMS LMC LMG
Recuperação (%) - 58,5 100 61,4
Proteínas (%) 2,8 nd nd 0,41
C. fenólicos (%) 0,06 0 0 1,48
Sulfato (%) nd 1,29 nd nd
Carboxilas (%) nd Nd 11,7 nd
Massa molec. (kDa) ~12 ~12 ~12 ~12
O2- (%) - - - -
OH- (%)
- - - -
Fe2+
(%)
- - - -
Cu2+
(%)
++ ++ +++ +++
CAT (eq) X X X XXX
Poder redutor (eq) XX X XX XXX
Legenda: (+): Atividade >0 e <30%; (++): Atividade de 31 a 60%; (+++): Atividade de 61 á 100%; (X):
0-30 mg de equivalência de ácido ascórbico; (XX): 31-70 mg de equivalência de ácido ascórbico;
(XXX): Mais que 70 mg de equivalência de ácido ascórbico. Eq – Equivalencia de ácido ascórbico.
Massa molec. – Massa molecular. (-) sem atividade. Fonte: Autoria própria.
4.2.4. Caracterização estrutural, atividades farmacológicas de LM e LMG
4.2.4.1. Caracterização estrutural
4.2.4.1.1. Perfil de infravermelho
Os principais sinais dos espectros de infravermelho das LM e LMG estão
resumidos na Tabela 11 e os perfis de absorção de infravermelho estão na figura 18.
Em todas as amostras notam-se picos de absorções nas regiões: 3400 cm-1; 3000
cm-1; 1000 cm-1; 1100 cm-1 e 890 cm-1, ou seja, os perfis de identificação de picos
foram semelhantes entre LM e LMG. Com exceção do sinal na região de 1730 cm-1
em LMG que não ocorreu em LM.
87
Tabela 11- Espectro de infravermelho de LM e LMG (posição dos sinais).
Grupo
químico O–H C–H
C=O de éster
(ligação ao
ác. gálico)
C-O-C C-O Configuração
β
Número de
onda (cm-1)
3400 3000 1740 1100 1000 890
LM 3402,8 2924,0 - 1078,6 1041,7 876,7
LMG 3396,6 2927,1 1737,5 1076,9 1038,0 891,2
Fonte: Autoria própria.
Figura 18- Espectro de infravermelho de LM (em preto) e LMG (em vermelho). A
seta indica a presença do sinal que está presente em LMG e não em LM.
Fonte: Autoria própria.
88
4.2.4.1.2. Perfil de RMN
Por meio da análise de RMN 1H foi possível observar (figura 19) que os sinais
de LM e LMG são semelhantes. Pode-se observar também que LMG diferentemente
de LM possui um sinal em 6,60 ppm
Figura 19- Espectro de RMN de LM (A) e LMG (B) com ênfase no pico na região de
6.60 ppm (C) representando hidrogênios de anel aromático.
Fonte: Autoria própria.
Também foi realizado uma análise de Heteronuclear single quantum coherence
spectroscopy (HSQC) com LM e LMG. Os espectros foram semelhantes por isso na
figura 20 se expõe apenas o espectro de LM. Na figura 20 é possível observar que
existe correlações entre sinais , estas correlações estão organizados na tabela 12.
89
Figura 20 - Espectro de 2D-RMN (HSQC) de LM. Letras se referem a sistemas de
spin e números se referem à posição dos sistemas de spin.
Fonte: Autoria própria.
Tabela 12 - Correlações obtidas das análises de 1H e 13C de LM.
Resíduos A B
Posição/Núcleo H C H C
1 4.81 101.5 4.55 101.8
2 3.62 72.2 3.36 72.3
3 3.83 83.7 3.60 83.7
4 3.57 67.2 3.46 68.8
5 3.56 74.8 3.74 73.6
6 3.97 59.9 4.25 67.9
6' 3.78 3.92
Fonte: Autoria própria.
4.4.2. Atividades antioxidantes e citoprotetora de LM e LMG.
90
4.4.2.1. Atividades antioxidantes de LM e LMG em células MDCK.
Na figura 21 encontram-se os resultados de capacidade das células MDCK
reduzirem o MTT quando tratadas com peróxido de hidrogênio por 1h, retirado o
meio de cultura e tratado com amostras durante 24h (ensaio reparador).
Nesta figura observa-se que os tratamentos com as amostras foram todos
semelhantes entre si e semelhantes com o controle com o ácido gálico e com o
controle com peróxido de hidrogênio. A única diferença estatística significante se
deu entre o controle sem peróxido e os demais tratamentos.
Figura 21- Atividade redutora de MTT de células tratadas com H2O2 e
posteriormente com LM ou LMG por 24h frente a linhagem de células renais de
cachorro (MDCK) (Efeito reparador). Os valores estão expressos como média ±
desvio padrão nas concentrações de 125, 250 e 500 µg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre o controle com peróxido e o controle sem
peróxido ou entre as diferentes concentrações de uma amostra; números diferentes
representam diferença significativa entre os controles e as amostras (p < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
As capacidades de redução do MTT das células MDCK tratadas com as
amostras em concomitância com o peróxido de hidrogênio esta ilustrada na figura
22. Nesta figura observa-se que todas as amostras tiveram pelo menos 100% de
redução do MTT (semelhante ao controle negativo). Mais detalhadamente LM já na
91
menor concentração testada (125 µg/ml) estimulou as células a reduzirem o MTT em
mais de 150% em comparação com 100% do controle negativo. Além disso, LMG
também foi capaz de estimular as células MDCK a reduzir o MTT, atingindo até
cerca de 170% de redução do MTT na concentração de 500 µg/mL. O controle de
ácido gálico obteve resultados de redução do MTT em torno de 120% (semelhante
ao controle negativo).
Figura 22- Atividade redutora de MTT de células tratadas com H2O2 junto com LM
ou LMG por 24h frente a linhagem de células renais de cachorro (MDCK) (Efeito
concomitante). Os valores estão expressos como média ± desvio padrão nas
concentrações de 125, 250 e 500 µg/mL. Letras diferentes representam diferença
significativa entre o controle com peróxido e o controle sem peróxido ou entre as
diferentes concentrações de uma amostra; números diferentes representam
diferença significativa entre os controles e as amostras (p < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
Na figura 23 encontram-se os resultados de capacidade das células MDCK
reduzirem o MTT quando tratadas com as amostras durante 24h, posteriormente
tratadas com peróxido de hidrogênio por 1h e por fim mantidos em meio com soro
por 24h (ensaio preventivo).
92
Nela observa-se que o maior valor de MTT foi observado para LM na
concentração de 125 µg/mL. Em seguida tem-se LM na concentração de 250 e 500
µg/mL. A maior estimulação de LMG para que as células MDCK reduzam o MTT
ocorreu na concentração de 125 µg/mL, já as maiores concentrações (250 e 500
µg/mL) tiveram menor redução (22 e 10% de redução do MTT, respectivamente).
Figura 23- Atividade redutora de MTT de células tratadas com LM ou LMG por 24h,
posteriormente com H2O2 por 1h e depois com meio com soro por mais 24h frente a
linhagem de células renais de cachorro (MDCK) (Efeito preventivo). Os valores estão
expressos como média ± desvio padrão nas concentrações de 125, 250 e 500
µg/mL. Letras diferentes representam diferença significativa entre o controle com
peróxido e o controle sem peróxido ou entre as diferentes concentrações de uma
amostra; números diferentes representam diferença significativa entre os controles e
as amostras (p < 0,05).
Fonte: Autoria própria.
Com relação ao ácido gálico isolado observou-se que na maior concentração
(7,5 µg/mL) ele foi capaz de estimular as células a reduzirem 50% do MTT,
semelhantemente ao controle com peróxido.
4.2.4.2.2. Atividades citoprotetora e influência no ciclo celular de células tratadas
com LM e LMG.
93
Por meio de citometria celular obteve-se a figura 24. Nela observa-se que as
células não tratadas e as células tratadas (com ácido gálico, LM e LMG) foram em
sua maioria marcadas com pouca intensidade com anexina e iodeto de propídio.
Assim, não observou-se dano e por isso as amostras não foram citotóxicas.
Figura 24- Análise da sobrevivência celular por citometria de fluxo de células MDCK
marcadas com anexina (eixo x) e iodeto de propídio (PI) (eixo y).
Fonte: Autoria própria.
Na figura das células não tratadas (canto superior esquerdo) observa-se que
94,1% delas esta no quadrante 4 (Q4), na figura das células tratadas com ácido
gálico, laminarina (LM) e laminarina galificada (LMG) observa-se que 94,5%, 94,1%
e 92,4% delas está em Q4, respectivamente. Já nos demais quadrantes observa-se
que juntos eles somam 5,86%; 5,48%; 5,94% e 7,08% nas células não tratadas,
tratadas com ácido gálico, laminarina (LM) e laminarina galificada (LMG).
94
Por meio da análise de citometria de celulas marcadas com PI obteve-se a
figura 25. Nela observa-se que as células não tratadas tiveram 1,29 % de células em
sub-G1, as células tratadas com LM tiveram 2,68% e as células tratadas com LMG
tiveram 1,24% marcadas em sub-G1. Observa-se também que células tratadas com
LM tiveram picos de G1 e G2-M menos acentuados que as células não tratadas,
obtendo-se 21,4% de células em G1, 19,5% das células em S e 56% das células em
G2-M. Já nas células tratadas com LMG os picos em G1 e G2-M estão pronunciados
assim como nas células não tratadas obtendo-se 32% de células em G1, 19,2% das
células em S e 47,4% das células em G2-M.
Figura 25- Análise de citometria de fluxo de células MDCK marcadas com PI (eixo y)
mostrando a distribuição no ciclo celular. População Sub-G1: indicativo de morte
celular por danos no DNA; População G1 indica células vivas na fase G1; População
S: indicativo de células passando pela fase de síntese; G2/M indicativo de células na
fase G2 indo para a divisão.
Fonte: Autoria própria.
95
4.3. PARTE 2 - Polissacarídeos de Dictyota mertensii
4.3.1. Rendimentos da extração e da síntese das nanopartículas
Na tabela 13 observam-se os valores médios de rendimento da extração de
fucanas e da síntese de nanopartículas de prata contendo fucanas a partir da
metodologia descrita em métodos.
Tabela 13 - Rendimentos de obtenção de polissacarídeos (% em relação à massa de
algas) e nanopartículas (% em relação à fucana).
Alga marinha Fucana (%) Nanopartícula (%)
Dictyota mertensii 7,26 ± 2,93 49,0 ± 3,0
Fonte: Autoria própria
4.3.2. Análise por espectroscopia UV-visível da formação das nanopartículas.
O processo de síntese de nanopartículas foi acompanhado com o uso de
espectrofotômetro na região de 350 a 600 nm.
Na figura 26A apresenta-se o perfil de absorção de luz das nanopartículas de
prata sintetizadas com fucanas de D. mertensii (NF). Na figura 26B, observa-se um
aumento no valor de absorbância com o passar dos dias, principalmente, na região
que corresponde ao comprimento de 403 nm. Nessa região os valores de densidade
óptica anotados no primeiro dia corresponderam 0,750 e cresceram a um valor de
2,000 e 2,200 nos sexto e sétimo dias, respectivamente. A partir daí o valor se
manteve constante até o décimo quinto dia, último dia de análise do perfil de
absorção de luz das NF.
Com o passar do tempo, a preparação das nanopartículas mudou da coloração
de amarelo-claro para castanho-escuro.
96
Figura 26 - Perfil de absorção de luz de nanopartículas de D. mertensii (A) Perfil de
absorção de luz, varredura de 350 a 600 nm, de nanopartículas de D. mertensii. (B)
Perfil de absorção de luz, na região de 403 nm, de nanopartículas de D. mertensii
aferidas nos dias: zero, dois, cinco, seis, sete e oito (de sua síntese). No canto
superior direito o aumento da absorção em relação ao tempo.
Fonte: Autoria própria.
4.3.3. Caracterização estrutural das nanopartículas
4.3.3.1 Microscopia de Força Atômica e Microscopia Eletrônica de Varredura
Na imagem de microscopia de força atômica (MFA) constata-se que as
nanopartículas apresentaram formas esféricas (figura 27).
97
Figura 27 - Imagens de microscopia de força atômica das nanopartículas de fucana.
A seta evidencia uma nanopartícula. Observa-se nanopartículas são esféricas.
Fonte: Autoria própria.
4.3.3.2. Determinação do tamanho da fucana e da nanopartícula
Com o uso de análises em dispersão de luz dinâmica (DLS) a nanopartícula de
fucana (NF) foi caracterizada por tamanho médio (104,38 ± 2,17 nm) e a distribuição
dos tamanhos em histograma (tabela 28).
Figura 28 - Distribuição do tamanho (histograma) das nanopartículas de prata
contendo fucana. Com maior número de partículas com tamanho entre 71 e 105 nm.
Quantidade de nanopartículas expressa em porcentagem. Fonte: Autoria própria.
98
4.3.3.3. Determinação do potencial zeta e estabilidade das nanopartículas
O potencial zeta das nanopartículas foi de -19,15 ± 1,8. Além disso, o seu
tamanho foi periodicamente mensurado por um período total de 16 meses (figura
29). O tamanho médio de LM variou entre máximo de 116,3 nm e mínimo de 94,4
nm; portanto, tiveram tamanho médio pouco modificado com o armazenamento,
além disso, essa variação não foi significativa.
Figura 29 - Gráfico de estabilidade da nanopartícula de fucana. Valores
representados por médias e seus respectivos desvios padrões. Não ocorreu
diferença significativa entre os diferentes tempos.
Fonte: Autoria própria.
4.3.4. Caracterização química das amostras
4.3.4.1. Dosagens das amostras
Quanto à composição química foi determinado o teor de proteínas e compostos
fenólicos das fucanas e nanopartículas de fucanas (tabela 14). Os valores
observados para proteínas foram não detectado para fucana e de 0,14 ± 0,01 para
NF. Por outro lado, observou-se valores semelhantes de compostos fenólicos entre
fucanas e nanopartículas de fucanas, sendo 1,0 ± 0,02 e 1,4 ± 0,03%
respectivamente.
99
Tabela 14- Resultados das dosagens de proteínas e compostos fenólicos.
Amostra Proteínas (%) Compostos fenólicos (%)
Fucana nd 1,0 ± 0,02
NF 0,14 ± 0,01 1,4± 0,03
Os dados foram apresentados em média percentual com respectivo desvio padrão. nd - Não
detectado nas condições avaliadas. Fonte: Autoria própria.
Além disso, também foi ralisado uma espectroscopia de raio-X que detectou os
elementos sulfato, oxigênio, carbono nas duas amostras, e prata em NF, como
indicado na tabela 15.
Tabela 15 – Espectroscopia de disperção de raios-X (EDX) de fucana e
nanopartícula de fucana (NF).
Amostra Sulfato (%) Oxigênio (%) Carbono (%) Prata (%)
Fucana 0,95 54,82 41,69 0
NF 0,54 33,44 62,16 1,45
Fonte: Autoria própria.
4.3.4.2. Análise de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
Os principais sinais dos espectros de infravermelho de fucanas e de NF estão
resumidos na Tabela 16. Em todas as amostras notam-se picos de absorções
característicos nas regiões: 3400 cm-1; 3000 cm-1; 1274 cm-1, 1045 cm-1 e 810-850
cm-1, ou seja, os perfis de identificação de picos foram semelhantes entre a fucana e
a nanopartícula de fucana.
Tabela 16 - Espectro de infravermelho da fucana e na nanopartícula de fucana (NF).
Grupo
químico
O–H
C–H
C-O-C
S=O
C–O–
SO3
C–O–
S
"redução
do
nitrato
de prata"
Fucana 3418,7 2941,5 1080,1 1228,8 1036,1 810,8 -
NF 3429,1 2942,0 1082,3 1130,4 1035,8 811,0 1383,8
Fonte: Autoria própria.
4.3.4.3. Atividades antiproliferativas
100
As capacidades de redução do MTT das células 3T3 e das células B16F10
tratadas com as amostras estão ilustradas nas figuras 30 e 31 respectivamente.
Figura 30 - Atividade redutora de MTT de células de fibroblasto (3T3) incubados
com fucanas ou NF por 24h. Os valores estão expressos como média ± desvio
padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1 mg/mL. Letras diferentes representam
diferença significativa entre fucana ou NF em diferentes concentrações; números
diferentes representam diferença significativa entre fucana e NF na mesma
concentração (p < 0.05).
Fonte: Autoria própria.
Na figura 30, observa-se que em geral há pouca diminuição na viabilidade
celular para concentrações menores (0,05 e 0,1 mg/mL) em todas as amostras
testadas. Por outro lado, encontra-se expressiva diminuição na viabilidade celular
em concentrações altas (1 mg/mL), com maior morte celular com NF.
Já com relação às células tumorais B16F10 (figura 31) observa-se diminuição
na viabilidade celular com NF, com 24h de tratamento, e esta diminuição na
viabilidade foi maior que a de fucanas.
101
Figura 31- Atividade redutora de MTT de células de melanoma de camundongos
(B16F10) incubados com fucanas ou NF por 24h. Os valores estão expressos como
média ± desvio padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1 mg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre fucana ou NF em diferentes concentrações;
números diferentes representam diferença significativa entre fucana e NF na mesma
concentração (p < 0.05).
Fonte: Autoria própria.
Com células RAW (figura 32) observou-se que as concentrações de 0,05 e 0,1
mg/mL não alteraram a redução do MTT pelas células. Já na concentração de 1
mg/mL tanto fucana como NF tiveram menor redução do MTT (com cerca de 50% de
redução).
102
Figura 32 - Atividade redutora de MTT de células de macrófagos (RAW 264.7)
incubados com fucanas ou NF por 24h. Os valores estão expressos como média ±
desvio padrão nas concentrações de 0,05; 0,1 e 1 mg/mL. Letras diferentes
representam diferença significativa entre fucana ou NF em diferentes concentrações;
números diferentes representam diferença significativa entre fucana e NF na mesma
concentração (p < 0.05).
Fonte: Autoria própria.
4.3.4.4. Atividades antibacterianas
Com o uso do ensaio de concentração inibitória mínima (MIC) e concentração
bactericida mínima (MBC) analisou-se a capacidade das nanopartículas atuarem
como agente bacteriostático e bactericida, respectivamente, contra as bactérias S.
aureus e E. coli.
Nas figuras 33 e 34 observa-se que a fucana não foi capaz de diminuir a
proliferação das bactérias. Porém, com a NF obtém-se diminuição da proliferação
(MIC) e morte bacteriana (MBC) de E. coli em concentrações de 50 ug/mL (Figura
33). Já quando esta nanopartícula é submetida contra S. aureus corre uma menor
atividade, tendo-se valor de 50 ug/mL para MIC e 100 ug/mL para MCB) (Figura 34).
103
Figura 33 - Concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima de
fucanas e nanopartículas de fucanas (NF) de D. mertensii contra E. coli expressa em
densidade óptica e incubada com diferentes concentrações (10, 50, 100, 200, 300 e
500 µg/mL). “*” – Concentração bactericida mínima. Controle positivo (Cont+) (meio,
bactéria e antibiótico), controle negativo (Cont-) (meio e bactéria).
Fonte: Autoria própria.
104
Figura 34- Concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima de
Fucana e nanopartículas de fucana (NF) de D. mertensii contra S. aureus expressa
em densidade óptica e incubada com diferentes concentrações (10, 50, 100, 200,
300 e 500 µg/mL). “*” – Concentração bactericida mínima. Controle positivo (Cont+)
(meio, bactéria e antibiótico), controle negativo (Cont-) (meio e bactéria).
Fonte: Autoria própria.
4.3.4.5. Atividades imunomodulatórias
4.3.4.5.1. Ensaio de produção de óxido nítrico de macrófagos incubados com as
amostras
Neste ensaio verificou-se a capacidade das amostras alterarem a liberação de
óxido nítrico pelas células de macrófagos de camundongo (figura 35).
Também se observa que macrófagos incubados sem a presença do LPS
aumentaram a produção de óxido nítrico (NO) na presença de fucanas. Já na
presença de lipopolissacarídeos (LPS) (indutor da resposta imune) os macrófagos
não tiveram diferença significativa na produção de NO quando incubados com
fucanas ou NF.
105
Figura 35- Ensaio de produção de óxido nítrico (NO) por células de macrófago de
camundongo (RAW) incubadas com 0,001 mg/mL de Fucana ou NF e incubados
com LPS (+) e sem LPS (-). Letras diferentes representam diferença significativa
entre fucana e NF; números diferentes representam diferença significativa entre
fucana ou NF e o controle (p < 0.05). Cont. - Controle negativo.
Fonte: Autoria própria.
4.3.4.5.2. Ensaio de produção de citocinas de macrófagos incubados com as
amostras
Aferindo-se a capacidade de produção de citocinas Th1 (IL-2; INF-γ e TNF-α),
Th2 (IL-4; IL-6 e IL-10) e Th17 (IL-17A) pelos macrófagos incubados com fucanas,
observou-se que sem a presença de LPS, ocorreu aumento na produção TNF-α
quando as células foram incubadas com todas as amostras.
Quando os macrófagos foram incubados com LPS e as amostras verificou-se
que nenhuma delas alterou o nível de TNF-α em relação ao controle (Tabela 17).
Macrófagos incubados com fucanas e NF aumentaram a produção de IL-6 com
relação ao controle. Macrófagos com estímulo de LPS e incubados com NF tiveram
pequeno aumento na produção de IL-10.
Observa-se também que as fucanas e NF não foram capazes de estimular a
produção de IL-2, IL-4, INF-γ e IL-17A (tabela 17).
106
Tabela 17- Resultados de ensaio de produção de citocinas (identificação de IL-2;
INF-γ e TNF-α; IL-4; IL-6 e IL-10; IL-17A em µM) por macrófagos incubados com
0,001 mg/mL de fucanas e NF.
LPS TNF-α IL-6 IL-10 IL-2 IL-4 INF-γ IL-17A
Cont. - 598,72 0 0 0 0 0 0
+ 6999,08 9286,63 0 0 0 0 0
Fucana - 7607,47 7815,49 0 0 0 0 0
+ 7072,19 11362,74 15,28 0 0 0 0
NF - 7296,48 7522,00 0 0 0 0 0
+ 7768,28 11695,65 15,28 0 0 0 0
Incubados com LPS (+) e sem LPS (-). Cont. – Controle. Fonte: Autoria própria.
107
5 DISCUSSÃO
Visando uma discussão mais direcionada, as discussões dos resultados desta
tese também foram distribuídas em duas parte, a discussão parte 1 se refere aos
resultados parte 1 e a discussão parte 2 se refere aos resultados parte 2.
5.1. PARTE 1- Polissacarídeos de Lobophora variegata
O fracionamento do extrato proteolisado de L. variegata com uso de acetona
permitiu a obtenção de seis frações ricas em polissacarídeos. Este resultado
corrobora com as frações já relatadas por Paiva (2016), quando também foram
obtidas seis frações ricas em polissacarídeos com a mesma alga.
Com uso da precipitação fracionada com acetona foi possível obter frações com
constantes dielétricas diferentes (graus de solubilidade), isso porque com a adição
crescente de acetona foi diminuindo-se a camada de solvatação e a precipitação de
polissacarídeos mais solúveis. Dessa forma quanto mais acetona era necessário
para precipitar um polissacarídeo maior foi sua solubilidade. A escolha da acetona
ocorreu devido a existência de trabalhos que indicam a acetona como bom reagente
de precipitação (ROCHA et al., 2005; PAIVA, 2016) provavelmente porque apresenta
menor constante dielétrica.
Com uso das frações F0,8 e F1,0 foi possível a purificação (por meio de
dispositivos de separação por tamanho molecular) do mesmo polissacarídeos de
tamanho entre 10-30 kDa (Tabela 6). Por este motivo essas duas populações de
polissacarídeos foram misturadas. Além disso, F0,8 e F1,0 também foram
misturadas (chamada F0,8-F1,0) nas extrações realizadas em seguida pois já que
seus polissacarídeos purificados são o mesmo e seriam juntos não fazia sentido
purificá-los separadamente.
Já foi caracterizado por Paiva (2016) que os polissacarídeos com tamanho entre
10-20 kDa obtidos da F1,0 de L. variegata são β-glucanas do tipo laminarinas (LM),
e, por este motivo, elas foram assim denominadas. O rendimento obtido para LM
apesar de ser baixo quando comparado ao rendimento das outras frações, é elevado
comparado a outros polissacarídeos purificados como relatado por Alves (2011).
Com uso da tabela da composição monossacarídica das frações obtidas
observa-se que a fração F0,8-F1,0 é uma mistura de polissacarídeos contendo
108
glicose, galactose, ácido glucurônico e fucose. Por outro lado, a LM contém somente
glicose, tratando-se, portanto, de uma homoglucana.
Na figura 1 observam-se os perfis de absorção de luz da laminarina nativa e dos
polissacarídeos modificados (além da fucana A como comparativo de polissacarídeo
sulfatado). Observa-se nestes perfis que as laminarinas galificadas e carboxiladas
tiveram uma menor absorbância que LM a partir do comprimento de onda de 310
cm-1. Esse perfil foi semelhante ao da fucana A, porém, discrepante ao perfil da
laminarina sulfatada. É conhecido que o perfil de absorção de luz visível tem relação
com a estrutura de moléculas (WU et al., 2016; CHOI, KIM & LEE 2011). Assim, a
partir destes resultados espera-se que a sulfatação tenha influenciado pouco na
estrutura da laminarina sulfatada (que manteve semelhança com a laminarina
nativa). Por outro lado, espera-se que a carboxilação e a galificação tenham
modificado a estrutura da laminarina de maneira bastante significante causando as
alterações no perfil de absorção de luz observado.
Com relação ao rendimento de recuperação dos polissacarídeos modificados
quimicamente observa-se que a maior recuperação ocorreu para LMC.
Provavelmente isso se deve ao fato que a técnica de DBD não necessita de muitos
passos de manipulação da amostra, pois esta é tratada pelo equipamento de DBD
na forma seca e também recuperada em sua forma seca. Por outro lado, as outras
técnicas de modificação (sulfatação e galificação) necessitam de passos em que as
laminarinas estejam diluídas em um líquido e após os procedimentos para a
modificação química o material volta a ser seco o que pode justificar as perdas.
Entre as técnicas de galificação e sulfatação é possível observar na tabela 6 que a
técnica de galificação permitiu obter uma maior recuperação de material comparada
ao material recuperado por sulfatação.
O rendimento de recuperação de polissacarídeos modificados quimicamente
usualmente não é relatado na literatura, ao invés disso, é relatado o quanto do
grupamento foi adicionado às moléculas como relatado por Queiroz et al. (2019) e
Curcio et al. (2009), por este motivo não foi possível comparações entre os
rendimentos (em massa) obtidos desta tese com o os rendimentos da literatura .
Por meio da caracterização do perfil eletroforético (figura 12), identificou-se que
as laminarinas sulfatadas migram mais que a fucana A (polissacarídeo sulfatado
bem caracterizado e de estrutura elucidada por Leite et al., 1998), indicando que a
laminarina sulfatada tem maior mobilidade eletroforética que a fucana A. Por outro
109
lado, as demais laminarinas (LM, LMC e LMG) não tiveram coloração evidenciada no
gel, isso provavelmente se deve ao fato destas laminarinas não apresentarem
grupos sulfato ligados a carbono, condição necessária, de acordo com Dietrich &
Dietrich, (1976), para que o corante azul de toluidina core o polissacarídeo.
Observando-se os dados de caracterização da composição química das
amostras foi possível detectar diminuição na contaminação por proteínas com a
purificação da fração F0,8-F1,0 para a LM (pois LM tem menor teor protéico que
F0,8-F1,0). Além disso, não foi detectado proteínas em LMS e LMG.
O pequeno aumento no valor de proteínas em LMG em relação a LM pode ter
ocorrido não pelo real aumento do valor de proteínas, mas porque o ensaio de
quantificação de proteínas por Bradford (1976) se baseia na ligação do corante com
aminoácidos aromáticos. Assim, como o ácido gálico possui propriedades
aromáticas, a presença de proteínas em LMG provavelmente se trata de um falso
positivo. Assim, provavelmente não ocorrem proteínas em LMG assim como em
LMS e LMC indicando que esses passos de modificação química também
contribuíram para a pureza do material. A não detecção de proteínas nessas
laminarinas extraídas de L. variegata também foi relatada no trabalho de Paiva
(2016).
Observando-se a quantidade de compostos fenólicos nota-se que existe uma
menor concentração de compostos fenólicos em LM comparado as frações F0,8 e
F1,0 (cerca de 10 vezes menos compostos fenólicos). Com a observação destes
dados juntamente com a análise dos dados de proteínas descritos acima, pode-se
indicar que o processo de purificação com uso dos dispositivos de separação por
tamanho molecular foi bastante eficiente para purificar LM.
Além disso, observa-se também que LMC quase não apresenta compostos
fenólicos. O pequeno aumento de compostos fenólicos de LMS em comparação a
LM pode ter ocorrido, pois na verdade o teste de dosagem de compostos fenólicos
utiliza como princípio para a dosagem o poder da amostra doar elétrons. Sabe-se
que polissacarídeos sulfatados tem melhor capacidade de doar elétrons, assim o
maior valor neste ensaio pode não ser realmente aumento de compostos fenólicos e
sim aumento da capacidade em doar elétrons. Sendo, provavelmente um valor falso
positivo.
Ainda com relação à quantidade de compostos fenólicos observou-se que LMG
apresentou 1,48% de compostos fenólicos. Como o ácido gálico presente neste
110
conjugado é um composto fenólico, estende-se que este resultado seja o grau de
galificação conseguido pelo ensaio de galificação. Valores de galificação já foram
relatados por vários autores: cerca de 100 mg de ácido gálico por grama de
quitosana já foram obtidos com a galificação deste polissacarídeo (10% de ácido
gálico) de tamanho molecular de 200 kDa. Por outro lado, polissacarídeos menores
tiveram menor inserção de galificação: Curcio et al. (2009) ao usar uma quitosana de
peso molecular de 95 kDa obteve 7 mg de ácido gálico para cada grama de
quitosana (0,7% de ácido gálico), e Queiroz et al. (2019) com quitosana de tamanho
de 58 kDa obteve cerca de 10 mg de ácido gálico para cada grama de quitosan
(cerca de 1% de ácido gálico). A partir desses dados pode-se esperar que o
tamanho do polissacarídeo seja um fator importante para a quantidade de ácido
gálico conjugado. Sendo que quanto maior o polissacarídeo maior será a quantidade
de ácido gálico na conjugação. Sabendo-se que as laminarinas possuem tamanho
entre 10 e 30 kDa, ou seja, menor que a quitosana de Queiroz et al. (2019), infere-se
que ocorreu uma eficiente conjugação já que apesar de menor as laminarinas
tiveram maior porcentagem de ácido gálico que o daquele autor.
Ainda sobre a tabela 8 observa-se que em todas as amostras só ocorreu sulfato
na laminarina sulfatada.
A quantidade de sulfato (1,29% ou grau de sulfatação de 0,068) é menor
comparada a sulfatação realizada em outras glucanas no qual observou-se 5,8% de
sulfato (grau de sufatação de 0,36) (WANG et al., 2005), glucanas de Pleurotus
tuber-regium com grau de substituição entre 1,14 /1,74 (ZHANG et al., 2019) e
também de outros polissacarídeos como no trabalho de Qi et al. (2005), no qual
sulfatou polissacarídeos extraídos de Ulva pertusa e obteve teor de sulfato de 19-
32%; e também menor do que a sulfatação de Ji, Ji & Meng (2013) que obteve
laminarinas com 15,3% de sulfato (grau de substituição de 1,51) e tamanho
molecular entre 5 e 16 kDa.
Um fator que pode ser relacionado à eficiência de sulfatação pode ser o tipo de
reagente de sulfatação utilizado. No caso de Qi et al. (2005), o autor utilizou SO3–
DMF, enquanto que Ji, Ji & Meng (2013) utilizaram piridina-ácido clorosulfônico. Por
outro lado, em trabalho de Wang et al. (2005) sulfatou-se glucanas que obtiveram
5,8% de enxofre (grau de sufatação de 0,36), neste caso utilizou-se o mesmo
método de sulfatação deste estudo (propanol-ácido sulfúrico) e mesmo assim esses
autores obtiveram valores de sulfatação maiores que o nosso.
111
A discrepância no grau de sulfatação também foi observada no trabalho de Tao,
Zhang & Zhang (2009), esses autores sulfataram dois polissacarídeos diferentes
(usando piridina e ácido clorosulfônico) e obtiveram teores de sulfatação também
diferentes (10,3 e 2,6%), este resultado juntamente com a discussão acima indicam
que o reagente de sulfatação não deve ser o único fator que influencia o grau de
sulfatação.
A baixa sulfatação também pode estar relacionada à quantidade de grupos
disponíveis para que a reação de sulfatação ocorra. Laminarinas são β-glucanas
conhecidas por terem estrutura linear longa e a quantidade de ramificações podem
ser variáveis (CHIZHOV et al., 1998), podendo ocorrer muitas ou poucas
ramificações. Em adição a isso, é conhecido que um maior grau de ramificação
promove uma maior solubilidade da laminarina (MIAO et al., 1995) e também a
variedade de grupos disponíveis para a sulfatação. Como constatou-se uma baixa
sulfatação espera-se que LM tenham poucas ramificações comparadas as
laminarinas de Ji, Ji & Meng (2013). Assim, indica-se que o baixo grau de sufatação
obtido esteja relacionado a estrutura da laminarina desta tese.
Por fim, por meio da dosagem de grupos carboxila verificou-se a quantidade
destes grupos presentes nas amostras. Observa-se que somente LMC possui
grupos carboxilas e que esta alteração se deu em 11,7% de carboxilação.
Carboxilação de outras moléculas por DBD já foram constatados em outros
trabalhos como por Nagatsu et al. (2018) em um filme de resina.
O tamanho molecular é uma característica bastante importante dos polímeros.
Como foi visto ele pode inclusive ter relação com o potencial da molécula ser
modificada quimicamente, por isso, o tamanho molecular das amostras foi aferido
por HPLC (figura 14). Na figura 14 é possível observar que ocorre um mesmo perfil
de tamanho dos polissacarídeos, com exceção de LM que possui alguns poucos
polissacarídeos com menor tempo de retenção, todas as outras laminarinas tiveram
tamanho entre 10 e 14 kDa com predominância da população com 12,4 kDa. A partir
destes dados pode-se verificar que as laminarinas modificadas tiveram maior
homogeneidade que LM. Estes dados corroboram também com os resultados
obtidos da composição química na qual as laminarinas modificadas também tiveram
menos contaminantes comparadas a LM. Indicando novamente que as modificações
químicas contribuíram para a homogeneidade dos compostos.
112
Além disso, também se entende que os procedimentos de modificação química
realizados não promoveram quebra do polímero, pois os tamanhos destes
continuaram semelhantes. Por outro lado, o processo de sulfatação normalmente
ocasiona quebra do polissacarídeo como foi verificado em glucanas do fungo
Ganoderma atrum que ao serem sulfatadas tiveram redução do tamanho de 1665
para 484,8 kDa ou 20,9 kDa, dependendo da sulfatação (ZHANG et al., 2015).
Glucanas do fungo Agaricus brasiliensis ao serem sulfatadas também tiveram
redução do tamanho de 608,73 kDa para 127, 20 kDa (LIN et al., 2012) e glucanas
de Sphallerocarpus gracilis tiveram redução de 7,43 para 2,12 kDa (CHEN et al.,
2013; Wang et al., 2012; XU et al., 2016). Além disso, outros trabalhos também
tiveram quebra como: Chen et al. (2013) (de 10,5 x104 para 4,6 x104 kDa); Wang et
al. (2012) (de 25,18 x104 para 1,684 x104 KDa); Zhang et a., (2015) (de 1665 para
484,8 kDa ou 20,9 kDa, dependendo da sulfatação) e Xu et al. (2016) (de 7,43 x105
para 2,12 x105).
Nos processos de carboxilação pode ou não haver quebra dependendo do
método utilizado. A quebra do polissacarídeo por carboxilação já foi identificada em
diversos trabalhos como a Glucanas carboximetiladas do fungo Pleurotus tuber-
regium antes com tamanhos entre 1×104 e 42×104 tiveram tamanho alterado para
2,08 × 104 to 53,2 × 104 Da, ou seja, aumentaram o seu tamanho molecular (ZHANG
et al., 2004). Porém, glucanas do fungo Ganoderma lucidum tiveram diminuição do
tamanho de 13,3 x 104 para 6,3 x 104 (WANG et al., 2009). Os dois métodos de
carboximetilação foram diferentes, indicando que o método pode estar influenciando
na degradação destas glucanas, as demais glucanas carboximetiladas na literatura
não tiveram tamanho molecular verificados. A alteração do tamanho com a
carboxilação em outros polissacarídeos neutros também variou entre a quebra
(PESTOV et al., 2015) ou não (ZHAO et al., 2004) dependendo do método utilizado.
Já a não alteração do tamanho já foi identificado por Zhao et al. (2004) quando
carboxilou quitosana por meio de ligação cruzada de moléculas.
Para galificação pequena quebra (10%) foi observada com a galificação de
quitosana por Queiroz et al. (2019) com peróxido de hidrogênio e redução do
tamanho de quitosana de 98,72 kDa para quitosanas galificadas de 76,92-74,36 kDa
em trabalho de Wu et al. (2016)
Este reagente é utilizado em diversos trabalhos como um reagente que promove
a quebra de polissacarídeos devido a oxidação deste. Por exemplo, trabalho de Qin,
113
Du & Xiao (2002) utilizaram peróxido de hidrogênio para diminuir o tamanho
molecular de quitosanas que mudaram de 498 x103 Da para tamanhos de 51-1,2x103
Da dependendo da concentração de H2O2. Em β Glucanas esta degradação também
já foi relatada por Zhun & Wu (2019) ao utilizarem peróxido de hidrogênio em
diferentes concentrações (0,5-3%) para degradarem curdulan (com 42 × 104 Da
sintetizados por bactérias) e obterem laminarinas.
No trabalho de Wang et al. (2017), peroxido de hidrogênio a 10 mM e 1 mM (foi
utilizado para quebrar β glucanas de cereal, estes autores observara também que a
presença de ácido ascórbico diminui a degradação das β glucanas. Qin, Du & Xiao
(2002) também verificaram que outros fatores como a temperatura também podem
influenciar neste grau de degradação.
Assim a ausência/minimização da degradação das laminarinas desta tese pode
ter ocorrido pela presença de alta concentração de ácido ascórbico e/ou utilização
de temperatura ambiente e/ou utilização de baixa concentração de H2O2 na
metodologia utilizada por nós. Além dos fatores que envolvem as técnicas de
modificação química as laminarinas obtidas de L. variegata podem ter sido
resistentes aos processos de modificação. Ainda havendo a possibilidade de ter
ocorrido a concomitância das duas possibilidades apontadas.
Após a caracterização de LM e das laminarinas modificadas verificou-se a
capacidade antioxidante destas amostras por seis diferentes testes in vitro.
Nenhuma das laminarinas obteve atividade de sequestro de radical superóxido e
de radical hidroxila, nem LM nem nas laminarinas modificadas.
Laminarinas assim como β-glucanas possuem uma baixa atividade antioxidante
(SHEKHAR et al., 2015). Atividade sequestradora de radicais de laminarinas varia
entre as diferentes fontes das laminarinas, por exemplo: laminarinas de Laminaria
digitata possui fraca atividade de sequestro de radical DPPH (1.4-5.3%) já
laminarinas de Cystoseira barbata possui maior atividade de sequestro deste radical
(75% em 2mg/mL) (SELIMI et al., 2018). Além disso, uma laminarina pode ter alta
ativade sequestradora em um teste a não em outro, por exemplo, laminarinas de
Cystoseira barbata possui boa atividade de sequestro de radicais DPPH mas não
possui boa atividade de sequestro de radicais hidroxila (SELIMI et al., 2018).
Os autores deste trabalho ainda indicam que os mecanismos de sequestro de
radicais de laminarinas podem ser associados à sua capacidade de eliminar os
radicais livres através de reações de transferência de hidrogênio e / ou transferência
114
de elétrons e ainda sugerem que a reação de transferência de hidrogênio é mais
provável de ocorrer em polissacarídeos neutros, como o laminarinas (SELIMI et al.,
2018). Atividade de sequestro de radical de β-glucanas também variaram entre os
testes antioxidantes, por exemplo: β-glucanas do fungo Entoloma lividoalbum
tiveram somente 16,6% de atividade de sequestro de radical hidroxila, mas
obtiveram 64,47% de sequestro de radical superóxido na concentração de 200
µg/mL. Glucanas do fungo Lasiodiplodia theobromae tiveram atividade de sequestro
de radical hidroxila de 33,39% a 1,0 mg/mL e atividade de sequestro de radical
superóxido de 13,41% a 1,0 mg/mL (THAIS et al., 2019).
Essas diferenças indicam que as atividades variam com uma mesma glucana.
Porém, de modo geral as glucanas não são boas sequestrantes de radicais hidroxila
e superóxido, pois poucos trabalhos que avaliaram estas atividades de β-glucanas
obtiveram atividades maiores do que 40%, mesmo quando foram utilizadas altas
concentrações como 3 mg/mL (GIESE, et al., 2015).
Polissacarídeos neutros no trabalho de Melo-silveira et al. (2012) também não
foram capazes de sequestrar radical superóxido e radical hidroxila. A ausência de
atividade sequestradora de radical superóxido e de radical hidroxila em laminarinas
de L. variegata já foi relatada por Paiva (2016). Este autor observou nenhuma
atividade com uso de laminarinas, por outro lado, obteve uma pequena atividade de
sequestro do radical superóxido (28%) com possíveis fucanas extraídas desta alga.
Em nosso trabalho, uma baixa atividade de sequestro de radical superóxido também
foi encontrada para a fração F0,8-F1,0. É esperado que esta fração por ainda não
ser purificada também contenha outros polissacarídeos em sua composição, assim,
especula-se que a atividade observada seja proveniente destes polissacarídeos e
não das laminarinas.
As laminarinas modificadas também não apresentarem atividade sequestradora.
Alguns trabalhos mostram que quando polissacarídeos são sulfatados existe uma
tendência ao aumento de suaa atividade antioxidante dos polissacarídeos sulfatados
em comparação com o polissacarídeo nativo. Entretanto esta atividade antioxidante
não aumenta por igual, ela é maior em alguns testes como, por exemplo: o
polissacarídeo do fungo Pleurotus sajor-caju quando foi sulfatado teve aumento na
atividade de poder redutor, porém, não aumentou atividade de sequestro de radical
superóxido (Telles et al. 2011).
115
Além disso, polissacarídeos como os da alga verde Ulva pertusa não tiveram
atividade de sequestro de radical potencializada (QI et al., 2005). Esta autora relata
que, devido a ausência de atividade sequestradora de radical superóxido, a
densidade eletrônica promovida pela sulfatação não deve ser um fator determinante
na atividade sequestradora de radial superóxido.
Do mesmo modo a sulfatação de polissacarídeos pode promover a diminuição
na atividade sequestradora (ZHU et al., 2013; ZHANG et al., 2010). O primeiro autor
detectou diminuição da atividade sequestradora de radical hidroxila e superóxido de
polissacarídeos sulfatados do fungo Cordyceps gunnii (ZHU et al., 2013) e o
segundo observou diminuição da atividade sequestradora de radical DPPH com a
sulfatação de polissacarídeos da alga vermelha Porphyra haitanensis (ZHANG et al.,
2010). As diferenças na influencia do sulfato nas atividades antioxidantes pode ser
um indicativo que a sulfatação atua influenciando de maneira diferente as atividades
antioxidantes.
Laminarinas quando foram sulfatadas não tiveram suas atividades de
sequestro de radical hidroxila e superóxido avaliadas. Porém, já se foi investigado
atividade sequestradora de radical DPPH, e neste estudo, as laminarina da alga
Eisenia icyclis tiveram 7,5% de (CHOI et al., 2013).
Heteroglucanas sulfatadas já tiveram sua atividade sequestradora de radical
superóxido e DPPH investigados: com relação a atividade de sequestro de radical
DPPH observou-se que em a glucanas sulfatada teve maior atividade que as
nativas, do mesmo modo a sulfatação também promoveu aumento da atividade
sequestradora de superóxido (XU et al., 2016). Porém, vale salientar que no trabalho
descrito sulfatação promoveu quebra na glucana de 210 para 59 kDa. Outros
trabalhos que relatam o aumento da atividade de sequestro de radical hidroxila
depois da sulfatação também relatam a quebra da molécula nativa (WANG et al.,
2012). Em um estudo o polissacarídeo nativo não teve seu tamanho exposto (mas
certamente tinha tamanho maior que 10,5 x 104 Da) e mudou para tamanhos de 4,6
x 104 quando sulfatado (WANG et al., 2012).
Em outros polissacarídeos como polissacarídeos sulfatados da alga verde Ulva
pertusa tiveram sua atividade sequestradora de radical superóxido potencializada
(de 75,1 para até 94,3%) com a sulfatação (QI et al., 2005), porém, os
polissacarídeos nativos utilizados já eram sulfatados.
116
Outros trabalhos como o de Chen et al. (2013) e Wang et al. (2012) relataram a
sulfatação e a carboxilação promoveram aumento da atividade de sequestro de
radical hidroxila, porém, estes métodos também ocasionaram quebra da molécula
nativa. No primeiro trabalho o polissacarídeo nativo não teve seu tamanho exposto.
Estes autores também relatam que fizeram várias modificações químicas e que cada
modificação promoveu a formação de polissacarídeos com diferentes tamanhos
moleculares, o maior deles teve tamanho de 10,52 x104 Da enquanto que a
sulfatação originou polissacarídeos de 4,6 x104 e a carboxilação originou
polissacarídeos com tamanho de 3,68 x104. No segundo trabalho a diferença foi
ainda maior, mudando de 25,18 x104 kDa para 1,684 x104 kDa.
Em todos estes trabalhos que se relata o aumento da atividade com a
sulfatação, também é relatado a fragmentação.
É relatado na literatura que a atividade antioxidante dos polissacarídeos está
fortemente ligada ao seu tamanho. De modo que quanto menor o polissacarídeo
maior a atividade antioxidante (SOEIRO et al., 2016). O aumento da atividade
antioxidante com a diminuição do tamanho também já foi relatado diretamente para
laminarinas no trabalho de Choi, Kim & Lee (2011).
A priori pode parecer que os polissacarídeos sulfatados fragmentados
apresentaram maior atividade, entretanto os autores esqueceram de avaliar as
amostras em relação a quantidade de moléculas. É claro que quando sulfataram os
autores fragmentarão a molécula e portanto, quando foram feitos os testes
antioxidantes eles estavam colocando mais moléculas do polissacarídeo sulfatado
do que no polissacarídeo nativo e os polissacarídeos fragmentados e sulfatados em
maior quantidade tiveram maior atividade antioxidante e os autores não fizeram uma
relação entre quantidade de moléculas e atividade por isso fica difícil entender se a
sulfatação realmente aumentou a atividade antioxidante ou se foi o efeito da
comparação das massas iguais e não do numero de moléculas iguais.
Vale salientar que o aumento da atividade antioxidante com a diminuição do
tamanho também já foi relatado diretamente para laminarinas (CHOI et al., 2011)
dos mesmo modo estes autores relacionaram massas iguais e não número de
moléculas, portanto, é bem provável que na verdade se comparasse o numero de
moléculas a atividade seria menor.
Além disso, Qi et al. (2005) mostraram que, diferente da maioria, um dos
polissacarídeos não teve atividade de sequestro de radicais potencializada. Do
117
mesmo modo Zhu et al. (2013) e Zhang et al. (2010) sulfataram polissacarídeos e
observaram diminuição na atividade sequestradora. O primeiro autor detectou
diminuição da atividade sequestradora de radical hidroxila e superóxido de
polissacarídeos sulfatados do fungo Cordyceps gunnii e o segundo observou
diminuição da atividade sequestradora de radical DPPH com a sulfatação de
polissacarídeos da alga vermelha Porphyra haitanensis.
Polissacarídeos de Pleurotus sajor-caju ao serem sulfatados por Telles et al.
(2011) não tiveram atividade sequestradora de radical superóxido já a atividade
sequestradora de radical hidroxila foi aumentada no polissacarídeo sulfatado. Essa
autora relata que, devido a ausência de atividade sequestradora de radical
superóxido, a densidade eletrônica promovida pela sulfatação não deve ser um fator
determinante na atividade sequestradora de radical superóxido. Assim indica-se que
a sulfatação promove diferentes respostas conformacionais em diferentes
polissacarídeos que podem levar tanto ao aumento, permanência ou diminuição da
atividade antioxidante.
Não foram encontrados trabalhos que mostrem a carboxilação de laminarinas,
sendo este estudo o primeiro a relatá-lo. Porém, glucanas carboximetiladas do fungo
Lasiodiplodia theobromae tiveram atividade de sequestro de radical hidroxila
aumentada de 23,83% na nativa para 62,64% na modificada, e com relação a
atividade de sequestro de radical peroxido de hidrogênio não se verificou aumento
da atividade com a carboximetilação (CHOI et al., 2011).
Com relação a carboxilação de outros polissacarídeos observou-se que esta
modificação promoveu aumento da atividade de sequestro de radical hidroxila,
porém, estes métodos também ocasionaram quebra da molécula nativa (Chen et al.,
2013; Wang et al., 2012). Consequentemente, do mesmo modo que se explicou
acima a respeito das incertezas que envolvem o motivo do aumento da atividade
quando se realiza uma modificação com a quebra da molécula, para a carboxilação
também não se pode saber se o aumento da atividade se deu pela carboxilação ou
pelo aumento no numero de moléculas pela degradação.
Além disso, glucanas sulfatadas e carboxiladas de Poria cocos já tiveram sua
atividade de sequestro de radicais DPPH, sequestro de radical superóxido e
sequestro de radical hidroxila identificados, porém, os autores não compararam com
a atividade da glucana nativa, assim só foi possível relacionar que a glucana
carboxilada teve maior atividade, em todos os ensaios citados, do que a glucana
118
sulfatada (WANG et al., 2014).Glucana extraída da parede celular de S. cerevisiae
também foi sulfatada e carboxilada e tiveram suas atividades antioxidantes
avaliadas, porém, como mencionado anteriormente, a glucana nativa não teve
atividade antioxidante avaliada, de modo que somente foi possível comparar que a
atividade de sequestro de radical hidroxila e superóxido foram melhores para
glucana carboxilada em compração com a glucana sulfatada (TANG et al., 2017).
Com relação a galificação também não foram encontrados trabalhos que
mostrem a galificação de laminarinas, sendo o presente estudo o primeiro a realiza-
lo. Além disso, também não foram verificados outros trabalhos que mostrem a
galificação de outras glucanas.
Com relação a outros polissacarídeos alguns trabalhos mostram que quando
polissacarídeos são galificados existe uma tendência ao aumento da atividade
antioxidante dos polissacarídeos galificados em comparação com o polissacarídeo
nativo. Entretanto esta atividade antioxidante não aumenta por igual, ela é maior em
alguns testes como, por exemplo: quitosan galificado teve maior capacidade de
sequestro de radical DPPH e sequestro de radical hidroxila comparados ao quitosan
não conjugado (CURCIO et al., 2009). Por outro lado, quitosana galificada teve o
mesmo efeito de sequestro de radical superóxido comparado ao ácido gálico
sozinho (XIE et al., 2014). Além disso, trabalhos como o que investigou galificações
de quitosana mostra que três diferentes quitosanas galificadas tiveram efeitos
diferentes nas atividades de sequestro de radical ABTS, sequestro de radical DPPH
e sequestro de radial superóxido, de modo que algumas quitosanas galificadas
aumentaram algumas atividade e não outras. As diferenças na influencia da
galificação nas atividades antioxidantes pode ser um indicativo que a adição de
ácido gálico atua influenciando de maneira diferente as atividades antioxidantes.
A atividade antioxidante é dependente de alguns fatores e um deles é a
posição dos grupamentos. Por isso não basta estar sulfatado, carboxilado ou
galificado é importante que a inserção ocorra em posições que favoreçam a
atividade. Além disso, a capacidade de sequestro de radicais tem sido relacionada a
habilidade de transferir elétrons por doar átomos de hidrogênio devido a baixa
energia de dissociação das ligações OH (JIN et a., 2011). O não aumento da
atividade de sequestro de radicais das laminarinas modificadas também pode ser
dar pelo fato que durante as modificações as laminarinas tiveram suas hidroxilas
ocupadas pelos grupos inseridos (sulfato, carboxila e ácido gálico) reduzindo ainda
119
mais a chance de hidroxilas atuarem doando átomos de hidrogênio para conferir a
atividade sequestradora.
De maneira complementar, relata-se que ensaios in vitro de atividade
sequetradora de radicais não podem, sozinhos, estabelecer um panorama geral em
uma resposta in vivo (Badhani et al., 2015). Por isso mesmo que as amostras não
tenham apresentado atividade antioxidante nos ensaios in vitro, ainda assim podem
ter efeito contra radicais in vivo.
Outra estratégia para diminuir o efeito maléficos de radicais hidroxilas é pela
ação quelante (ZOU et al., 2019). Isso porque os íons participam no processo de
geração destes radicais (UEDA at al., 1996). Os íons ferro e cobre ocorrem em
grande quantidade nos organismos e a diminuição de seus efeitos oxidativo são de
grande relevância para o funcionamento normal das células (DROUIN et al., 1996),
por isso, avaliou-se a capacidade das amostras quelarem estes íons (figura 15).
Assim, não se verificou atividade quelante de ferro com nenhuma das amostras
(dados não mostrados).
Procurando-se investigar na literatura como a sulfatação influencia na atividade
antioxidante encontrou-se uma grande dificuldade em comparar os polissacarídeos
nativos com os sulfatados sem que os sulfatados tivessem seu tamanho alterado
(degradado) pela modificação, pois os trabalhos mostram a degradação do
polissacarídeo com a sulfatação (YANG, et al., 2005).
Mais detalhadamente observou-se que a atividade quelante de laminarinas de
Cystoseira barbata possuiu atividade quelante de ferro de 78% em concentrações de
20 mg/mL e os autores relatam que é possível que esta atividade seja aumentada
por meio de modificações químicas.
Procurando-se investigar na literatura como a sulfatação influencia na atividade
quelante de ferro identificou-se que glucanas sulfatadas de Dictiopteris Justii não
apresentaram atividade quelante de ferro, porém, essas glucanas apresentaram
atividade quelante de cobre (MELO et al., 2013). Ainda verificou-se que diferentes
glucanas sulfatadas tem diferentes atividades quelantes de cobre (MELO et al.,
2013).
Em outros polissacarídeos encontrou-se a ausência de atividade quelante de
ferro com a sulfatação, como nos polissacarídeos de fungos e seu derivado
sulfatado (TELLES et al., 2011) e em polissacarídeos de Phoma herbarum que
foram sulfatados (YANG et al., 2005).
120
Por outro lado, outros trabalhos relatam que a sulfatação promove aumento da
atividade de quelação de ferro, porém, também ocasionou quebra da molécula
nativa (WANG et al., 2012; YANG et al., 2005; ZANG et al., 2015). Em um trabalho
ocorreu mudança de tamanho de 25,18 x104 kDa para 1,684 x104 kDa, já em outro
mudou de 1665 kDa para polissacarídeos de 484,8 kDa ou 20,9 kDa (dependendo
da sulfatação). Como já foi abordado, o tamanho influencia na atividade antioxidante
dos polissacarídeos, assim, não é possível garantir se a maior atividade se deu pelo
aumento no número de moléculas ou por adição dos grupos sulfato.
Não foram encontrados trabalhos que relatem a atividade quelante de
laminarinas carboxiladas. Na verdade, poucos trabalhos realizaram carboxilação em
glucanas e nenhum deles identificou atividade antioxidante destas moléculas
(WANG et al., 2017). Por isso, procurou-se entender como a carboxilação influenciou
na atividade quelante de outros polissacarídeos. A carboxilação de polissacarídeos
de milho não promoveram aumento da atividade quelante de ferro comparado ao
polissacarídeo nativo (SHUHAN et al., 2013). Em adição a isso, o trabalho de Qi et
al. 2005, também observou-se que a atividade quelante de ferro de polissacarídeos
com baixo grau de sulfatação não teve atividade quelante de ferro significativamente
diferente do polissacarídeo nativo, indicando que talvez sejam necessários muitos
grupos substituídos para que um polissacarídeo adquira esta atividade.
Pela ausência de atividade quelante de ferro em todas as amostras (incluindo
nas laminarinas modificadas) infere-se que nenhuma das modificações foram
capazes de potencializar a atividade quelante de ferro de LM.
A ausência de atividade quelante de ferro já foi verificada em polissacarídeos de
fungos e seu derivado sulfatado em estudo de Telles et al. (2011) e em
polissacarídeos sulfatados de Phoma herbarum por Yang et al. (2005).
Já a galificação, verificada por Queiroz et al. (2019) promoveu o aumento da
atividade quelante de ferro de quitosana. Porém, é importante ressaltar que não é
somente a adição de grupos funcionais que irá promover o aumento da atividade
antioxidante. Wang et al. (2013) relata que a quantidade de grupos sulfato não é
proporcional a atividade sequestradora de radicais. Isto porque a atividade
antioxidante ocorre de maneira muito mais complexa do que a presença ou não de
grupos funcionais, ela na verdade esta relacionada com a estrutura que o polímero
assume.
121
Por isso, indica-se que nenhuma das modificações foi capaz de potencializar a
atividade de laminarinas de L. variegata, pois não modificaram a estrutura de LM de
modo a conferir atividade quelante de ferro.
Por outro lado, observa-se na figura 15 que LM obteve maior atividade quelante
de cobre (cerca de 40% de atividade com 0,05 mg/mL e mais que 50% de atividade
nas concentrações 0,1 e 0,5mg/mL). A atividade quelante de cobre de laminarinas
de L. variegata em nosso estudo foi semelhante a atividade relatada por Paiva
(2016), este autor também obteve cerca de 55% de atividade na maior concentração
testada.
Este efeito quelante de cobre é uma atividade antioxidante importânte para a
sobrevivência celular, como relatado anteriormente, por isso a identificação de
maneiras para se potencializar essa atividade também é de grande relevância.
Com relação a atividade quelante de cobre de LMS observou-se que em todas
as concentrações a presença de sulfato diminuiu a atividade quelante de cobre
comparado a LM. Por outro lado, as LMC tiveram maior atividade que LM na maior
concentração e LMG teve maior atividade que LM em todas as concentrações
testadas.
De maneira indireta a atividade a atividade quelante de cobre essa relacionada a
peroxidação lipídica e esta atividade foi verificada por Choi, Kim & Lee (2011) em
polissacarídeos de Inonotus obliquus. Esses autores observaram que a inibição da
peroxidação lipídica dos polissacarídeos neutros foi a mesma comparado a
polissacarídeos que foram sulfatados. Assim, mesma atividade de inibição de
peroxidação lipídica pode indicar então uma mesma atividade quelante de cobre
e/ou ferro.
Buscou-se compreender melhor quais modificações estruturais seriam
responsáveis pelas alterações de atividade observadas. Tivemos uma possível
explicação ao ler o trabalho de Wang et al., (2013), este autor relata que a
quantidade de grupos sulfato não é proporcional a atividade sequestradora de
radicais. Isso porque a atividade antioxidante ocorre de maneira muito mais
complexa do que a presença ou não de grupos funcionais, ela na verdade está
relacionada com a estrutura que o polímero assume.
Além disso, outros autores como Gyurcsik e Nagy (2000) também indicam que
as propriedades quelantes são relacionadas ao posicionamento dos grupos OH
dentro da molécula. Mais detalhadamente, estes autores relatam que hidroxilas
122
posicionadas de forma consecutivas axial-axial-axial ou axial-equatorial-axial
apresentam melhor configuração para estabilizar íons. Consequentemente sua
estrutura tem importante papel nesta atividade.
Assumindo-se esta narrativa é possível fazer uma relação entre a LMS ser a
única que teve menor atividade antioxidante comparada a LM e também ser a única
com perfil de absorção de luz visível diferentes das fucana A, LMC e LMG (Figura
13). Já LMC e LMG que tiveram perfil de absorção de luz visível semelhantes
tiveram maior atividade que as LM. Possivelmente a estrutura semelhante entre LMC
e LMG possibilitou tanto a maior atividade quelante de cobre como o mesmo perfil
de absorção de luz visível.
Polissacarídeos carboxilados não tiveram atividade quelante de cobre descritos
na literatura, sendo este trabalho o primeiro. Porém, de maneira indireta a atividade
quelante de cobre foi apontada por Ma, et al. (2012) e Choi, Kim & Lee (2011).O
primeiro autor não identificou alteração entre o polissacarídeo nativo e o carboxilado,
porém, o segundo autor relatou que polissacarídeos carboxilados foram capazes de
inibir a peroxidação lipídica, apesar de ter sido observado diminuição no tamanho,
este autor indicou que esta atividade pode ter-se dado em parte por uma possível
atividade quelação de cobre. Assim espera-se que os grupos carboxila sejam em
parte importantes para a atividade quelante de cobre.
Por outro lado, obteve-se melhores atividades quelante de cobre com LMG
(chegando a atingir quase 80% de atividade) comparado a atividade de LM e
também comparado a atividade do ácido gálico isolado.
A galificação não promoveu aumento da atividade quelante de cobre em
quitosanas galificadas (com 58 kDa e galificação de 1%) por Queiroz et al. (2019),
este autor justifica que a galificação em quitosana deve ter ocorrido em grupos
amina e que estes grupos amina possuem um importante papel na atividade
quelante de cobre. No caso da LM obtidas neste trabalho não há presença de
grupos amina, logo, a atividade quelante de cobre não está relacionado a este
grupo. Para LM espera-se que a galificação tenha ocorrido em grupos hidroxila, e
provavelmente em hidroxilas que são pouco importantes para a atividade quelante
de cobre, pois como já foi discutido nem todos os grupos químicos são importante
para uma atividade antioxidante. Consequentemente a galificação proporcionou a
adição de novos grupos importantes para a atividade quelante de cobre.
123
Outra maneira de polissacarídeos atuarem como antioxidante é por meio da
capacidade de doação de elétrons, por isso, verificou-se a capacidade das amostras
doarem elétrons pelo teste de capacidade antioxidante total (CAT) e poder redutor.
Observando-se os resultados de CAT (figura 16) percebe-se que LM, LMS, LMC
e o ácido gálico isolado não são capazes de doar elétrons por meio deste teste. Por
outro lado, LMG teve grande capacidade de doar elétrons (chegando à equivalência
de quase 100 mg de ácido ascórbico).
CAT já foi avaliado em polissacarídeos neutros no trabalho de Melo-silveira et al.
(2012) os pesquisadores deste trabalho obtiveram equivalência de 48,5 mg de ácido
ascorbico por grama de amostra. Porém, em polissacarídeos neutros do fungo
Pleurotus sajor-caju verificou-se equivalencia de 8mg/g e, portanto, muito baixa
(TELLES et al., 2011). A partir destas discrepâncias indica-se que a atividade de
CAT varia entre os polissacarídeos neutros.
A ausência de atividade por CAT com uso de polissacarídeos sulfatados já foi
relatado por Telles et al. (2011) que ao sulfatar polissacarídeos neutros (constituídos
de galactose, glucose e manose), não obteve aumento da pouca atividade que tinha,
indicando que nem sempre a sulfatação é capaz de conferir à amostra a atividade de
CAT. Além disso, trabalhos com polissacarídeos carboxilados não tiveram CAT
verificados em outros trabalhos.
A CAT de polissacarídeos galificados já foi pesquisado por Curcio et al. (2009)
ao usar uma quitosana de peso molecular de 95 kDa e 0,7% de ácido gálico e por
Queiroz et al. (2019) em quitosanas galificadas (com tamanho de 58 kDa e
galificação de 1%). No primeiro trabalho não foi observado nenhum aumento na
CAT, por outro lado, no segundo trabalho obteve-se equivalência de ácido ascórbico
de 300 µg para quitosana não conjugada e mais de 600 µg com uso de quitosana
galificada. Este autor também aponta que apesar da atividade ser baixa o efeito da
galificação se mostrou bastante eficiente para este polissacarídeo. Por isso, pode-se
dizer que no presente estudo a galificação se tornou ainda mais eficiente, pois o
aumentou a atividade de CAT foi de quase 90 mg, ou seja, mais de 90 vezes mais
potente que a atividade de quitosana galificada por Queiroz.
Outra maneira de avaliar a capacidade de polissacarídos de doarem elétrons é
com uso do teste de poder redutor (figura 17). Neste teste verificou-se que LM
apresentou boa atividade (cerca de 70%) na maior concentração testada (500
µg/mL). Este resultado foi muito melhor que o observado por Melo-silveira et al.,
124
(2012) que não obtiveram nenhuma atividade ao testar polissacarídeos neutros
extraído da sabugo de milho.
Polissacarídeo neutro do fungo Pleurotus sajor-caju também obteve boa
atividade de poder redutor, com atividade de 35% (TELLES et al., 2011). Este
resultado ainda foi menor que o verificado com LM, desta tese.
Com relação as laminarinas modificadas observou-se que: LMS possui menor
atividade que LM para todas as concentrações testadas (sendo significativamente
menos nas concentrações de 100 e 500 µg/mL); LMC, em todas as concentrações,
apresentou a mesma atividade comparada a LM (não apresentando diferença
estatisticamente significativa); e LMG teve maior atividade que LM para todas as
concentrações testadas (esta diferença foi significante em todas as concentrações),
além disso, o ácido gálico isolado não teve atividade antioxidante em nenhuma
concentração testada.
Trabalhos como o de Xu et al. (2016) relatam que a sulfatação promoveu
aumento da atividade de sequestro poder redutor de polissacarídeos de
Sphallerocarpus gracilis, porém, estes métodos também ocasionaram quebra da
molécula nativa de modo que o polissacarídeo sulfatado teve cerca de um quarto da
tamanho do nativo (mudando de 7,43 x105 para 2,12 x105). Assim, também não é
possível afirmar se a maior atividade do polissacarídeo sulfatado se deu por
diminuição do tamanho ou por adição dos grupos sulfato.
Normalmente a presença de sulfato no polissacarídeo esta relacionado com
aumento no poder redutor (MELO-SILVEIRA et al., 2012; ZHANG et al., 2010;
TELLES et al., 2011), por outro lado, o trabalho de Qi et al. (2005) mostra que
quando polissacarídeos são sulfatados com baixo grau de sulfatação pode não
haver diferença significativa no poder redutor entre o polissacarídeo nativo e o
sulfatado quando ambos são utilizados em altas concentrações (0,8mg/mL). Este
pode ser um indicativo que um baixo grau de sulfatação pode não ser suficiente para
conferir boa atividade de poder redutor.
Além disso, existem trabalhos como o de Ma et al. (2012) que relatam que
polissacarídeos sulfatado e carboxilados de Inonotus obliquus tiveram suas
atividades de poder redutor inalteradas em comparação com o polissacarídeo nativo.
Em adição a isso Chen et al. (2015) relataram a diminuição da atividade de poder
redutor do polissacarídeo sulfatado comparado ao polissacárido nativo de
Ganoderma atrum resultados que foram semelhantes ao desta tese. Chen et al.
125
(2015) relatam que a diminuição dos grupos hidroxila e a conformação do
polissacarídeo de modo a diminuir a capacidade da molécula de doar hidrogênios
podem ter sido os fatores a explicar o ocorrido. Do mesmo modo esta explicação
também pode ser aplicada para os resultados obtidos nesta tese.
A carboxilação de polissacarídeos de Inonotus obliquus não tiveram diferença
significativa comparado ao polissacarídeo nativo com relação a atividade de poder
redutor (MA , et al., 2012). Os mesmos autores indicam que o não aumento da
atividade pode estar relacionado ao baixo grau de carboxilação (grau de substituição
de 0,35). Do mesmo modo o grau de carboxilação também pode ter sido um fator
limitante para o não aumento da atividade de LMG em relação a LM.
Curiosamente a pesar do ácido gálico não possuir poder redutor a LMG teve
maior poder redutor que LM (chegando a 90% de atividade). Estes dados foram
semelhantes ao obtido em outros polissacarídeos galificados, pois a galificação
também potencializou a atividade de poder redutor quando quitosana foi galificada
(QUEIROZ et al., 2019), obtendo 100% de atividade na concentração de 250 µg/mL.
Além disso, Xie et al. (2014) também relatou que conjugado de ácido gálico com
quitosana também resultou em aumento no poder redutor. O que corrobora com os
dados do nosso estudo. Salienta-se também que os dois trabalhos citados acima
indicaram que a atividade aumentada não esta relacionada a atividade que o ácido
gálico isolado possui e sim que o conjugado formado tem uma maior atividade que
seu percussor. Com base nos dados expostos, nosso trabalho também pode se
encaixar nesta ideia.
Com uso da tabela 10, observa-se que LMG foi a única amostra que obteve
melhores atividades antioxidantes nos testes de CAT e poder redutor compactado a
LM, além disso, foi a que teve maior atividade quelante de cobre consequentemente
indica-se que a galificação foi a modificação que melhor potencializou as atividades
antioxidantes in vitro das laminarinas.
Procurando compreender qual a estrutura de LMG, assim como LM, foi
caracterizada por análise de infravermelho. Na tabela 11 e figura 18 observou-se,
respectivamente, os principais sinais e o perfil de absorção do infravermelho.
Tanto em LM como em LMG verificou-se uma intensa absorção nas regiões:
3400 cm-1 e 3000 cm-1 característicos de estiramento dos grupos O-H e C-H,
respectivamente (WANG, et al., 2010), confirmando a presença de componentes
orgânicos. As absorções nas regiões de 1100 cm-1 (estiramento assimétrico entre C-
126
O-C) e 1000 (estiramento C-O) são característicos de ligações glicosídicas de
polissacarídeos (LIU et al., 2013; WOLKERS, et al., 2004), por isso confirma-se que
LM e LMG são polissacarídeos, corroborando com os dados obtidos de análises
químicas.
Os sinais em 890 cm-1 podem ser atribuídos a presença de ligações do tipo β
(JIN et al., 2012) entre os seus monossacarídeos, estes dados juntamente com os
de composição monossacarídica indicam a presença de β-glucanas em LM.
O sinal na região de 1730 cm-1, presente em LMG (em 1737 cm-1) e ausente em
LM, foi relacionado a formação de uma ligação éster entre a hidroxila do
polissacarídeo e a carboxila do ácido gálico (Liu et al., 2013; SCHREIBER et al.,
2013) indicando assim a conjugação da laminarina com ácido gálico em LMG.
Wu at al., (2016) ao galificar quitosana também observou que nas quitosanas
galificadas ocorreu a presença de sinal na região de 1730 cm-1, que não ocorreu na
quitosana nativa, esse autor relaciona que a presença do sinal em 1730 cm-1 indica
a presença de grupos carbonila característicos de uma vizinhança de ligação ester.
A ligação éster é formada pela ligação do polissacarídeo com o ácido gálico sendo
por isso um forte indício da galificação de LM.
Para maior detalhamento da estrutura de LM foi realizado RMN de LM e LMG a
comparação dos sinais de LM e literatura encontra-se na tabela 18.
127
Tabela 18- Sistema de spins obtidos das análises de 1H e 13C de LM em comparação com a literatura.
Unidade Unidade
estrutural
Shifts, δ (ppm)
Referências: H1
C1
H2
C2
H3
C3
H4
C4
H5
C5
H6a
C6
H6b
-
A
→3)-β-D-
Glcp-(1→
4,81
4,78
4,77
3,62
3,57
3,31
3,83
3,79
3,71
3,57
3,53
3,43
3,57
3,51
3,48
3,97
3,93
3,71
3,78
3,74
3,90
Autoria própria
Usoltseva, et al. (2018)
Maity, et al. (2014)
101,5
103,5
102,9
72,2
74,3
72,8
83,7
86,0
84,5
67,2
69,4
69,6
74,8
76,8
75,6
59,9
61,8
60,8
-
-
-
Autoria própria
Usoltseva, et al. (2018)
Maity, et al. (2014)
B
→3,6)-β-D-
Glcp-(1→
4,55
4,76
4,50
3,36
3,57
3,47
3,60
3,79
3,70
3,46
3,53
3,45
3,74
3,70
3,60
4.25
4,22
3,82
3,92
3,88
4,17
Autoria própria
Usoltseva, et al. (2018)
Maity, et al. (2014)
101,8
103,5
102,6
72,3
74,3
72,8
83,7
85,5
84,4
68,8
69,4
69,6
73,6
75,9
75,0
67,9
69,9
68,8
-
-
-
Autoria própria
Usoltseva, et al. (2018)
Maity, et al. (2014)
Fonte: Autoria própria
128
Baseado nestas análises dos espectros de HSQC foi possível assinalar os dois
sistemas de spin detectados (Tabela 12). O primeiro deles esta relacionado a
presença de →3)-β-D-Glcp-(1→ e o segundo a presença de →3,6)-β-D-Glcp-(1→ .
Estes dados corroboram os dados de composição monossacarídica e de
infravermelho, indicando assim que LM são β-glucanas, mais especificamente,
laminarinas com cadeia principal β-13 e ramificação β-16.
Além disso, LMG apresentou o mesmo perfil de LM com alteração em um sinal
que aparece em LMG que não existia em LM (figura 19). Este sinal em 6,60 ppm já
foi indicado por Queiroz (2019) como indicativo de hidrogênios de anéis aromáticos,
como LMG foi dialisada a presença destes hidrogênios aromáticos indicam a
presença de ácido gálico ligados ao polissacarídeo e portanto, LMG se trata de uma
liminarina galificada.
Após a caracterização de LM e LMG estas amostras foram testadas quanto a
sua capacidade antioxidante contra danos causados por peróxido de hidrogênio
(H2O2) em células.
Sellimi et al. (2014) relataram que o efeito pro-oxidante dos íons ferro deve-se a
reação desse metal de transição com H2O2, produzindo radical hidroxil, que podem
ocasionar danos a diversas moléculas intracelulares (VALKO et al., 2007) danosas
as células inclusive podendo promover a peroxidação lipídica. Por isso, mesmo que
uma amostra não tenha capacidade antioxidante por sequestro de radical hidroxila
ou quelação de íons ferro, essa amostra pode ter ação inibindo os danos que H2O2
promove em células.
Procurando-se compreender a rotina de dado oxidativo sofrido pela população
inferiu-se que o estresse oxidativo ocorre continuamente, isso quer dizer que
qualquer um já sofreu algum dano oxidativo e por isso pode ter sequelas causados
por ele. Para esta situação é indicado então um agente reparador.
Após o dano é deduzível pensar que ocasionalmente o estresse oxidativo
retornar a ocorrer, neste caso é indicado a ação de um antioxidante que atue em
concomitância ao agente estressor, inibindo-o. Por fim é pudente a utilização de
antioxidantes capazes de agirem de forma preventiva contra o dano causado pelo
estresse oxidativo. A capacidade de LM e LMG atuarem nestas três fases de
encontro com o agente oxidativo esta descrita a seguir.
129
Observando-se que no ensaio reparador (figura 21) todos os tratamentos de
células com amostras tiveram redução do MTT em torno de 50%, semelhante ao
controle com peróxido. Esse resultado indica que as amostras não foram capazes de
ter efeito curativo sobre os danos causados pelo peróxido de hidrogênio e também
não promoveram um maior dano que aquele causado pelo H2O2.
O dano causado pelo H2O2 em células pode ser causado pelos radicais livres
formando o radical hidroxila via reação de Fenton ou reação de Haber–Weiss
(SCHRADER & FAHIMI, 2006). Os lipídeos das membranas celulares podem ser
oxidados pelo radical hidroxila gerando lesão a célula, com o tempo da reação o
radical hidroxila pode penetrar no interior das células e causar dano ao ambiente
intracelular (ÇIMEN, 2008).
No entanto o conhecimento atual mostra que a peroxidação lipídica causada por
radicais livres não é o único dano causado pelo H2O2, em vez disso o H2O2 pode
iniciar várias vias de sinalização para efetuar, por exemplo, apoptose e diferenciação
(RHEE, 2006). A amplificação do dano também pode se dar por meio de transdução
de sinal celular para uma resposta inflamatória (DRÖGE, 2002).
Polissacarídeos de chá verde na concentração de 80 µg/mL foram capazes de
atuar de modo reparador contra dano oxidativo em células HK-2, concentrações
acima ou abaixo desta concentração tiveram efeitos menores comparados àquela
concentração (SUN et al., 2018). As amostras desta tese não foram capazes de ter
efeito reparador nas concentrações testadas (125, 250 e 500 µg/mL), ou seja,
observou-se que uma concentração específica pode ter forte influencia na atividade.
Assim a ausência da atividade reparadora de LM e LMG pode ser dar por duas
possibilidades: a primeira é que as amostras tenham efeito reparador em
concentrações acima ou abaixo das testada e a segunda é que o grande dano
celular provocado pelo H2O2 durante 1h de incubação pode ter tido uma intensidade
tal que os efeitos antioxidantes de LM e LMG não foram capazes de reverter a
cascata de sinalização para morte celular, assim os tratamentos não tiveram efeito
pro sobrevivência celular em comparação ao controle positivo.
Por outro lado, observa-se na figura do ensaio concomitante (figura 22) que
células incubadas com LM e LMG tiveram a capacidade de induzir a redução do
MTT de forma mais eficiente do que as células cultivadas somente com meio com
H2O2 e também células incubadas com soro. Isso indica que ambas amostras foram
capazes de impedir o dano causado pelo H2O2 utilizando-se todas as concentrações
130
testadas. Esta atuação pode ter ocorrido por pelo menos duas maneiras. A primeira
delas é que apesar de LM e LMG não terem atividade de sequestro de radical
hidroxila e superóxido nos ensaios in vitro, elas tem capacidade de sequestrar um ou
ambos radicais em células. Outra possibilidade é que mesmo sem atuar diretamente
contra os radicais LM e LMG sejam capazes de induzir uma sinalização celular que
estimule a célula a proteger-se contra a oxidação ou estimule a proliferação celular.
Além disso, a maior redução do MTT comparada ao controle negativo também
indica que as amostras estimularam a proliferação celular e esta estimulação foi
mais pronunciada nas maiores concentrações (500 µg/mL de LM e LMG).
Observando-se o ensaio preventivo (figura 23), nota-se que o tratamento com
LM e sua posterior retirada do meio e indução de stress com peróxido de hidrogênio,
promoveu uma maior redução do MTT que o controle com peróxido (células que
sofreram estresse com H2O2). Este efeito ocorreu nas menores concentrações (125
e 250 µg/mL), porém, não na maior concentração (500 µg/mL).
Buscando-se na literatura ação preventiva de polissacarídeos contra efeitos
oxidativo contatou-se que polissacarídeos extraídos de soja, juntamente com
vitamina E foram caracterizados por prevenirem injurias causada por H2O2 em
modelos renais quando utilizaram-se 0,5 μg/mL do primeiro juntamente com 100
μg/mL do segundo (LI et al., 2016), desempenhando, portanto, uma ação
citoprotetora. Apesar da concentração de polissacarídeo utilizada por esse autor ser
menor do que a que nos identificamos com LM, no trabalho de Li et al. (2016) foi
utilizado polissacarídeo em concomitância com vitamina E. Assim, em um futuro
estudo é possível que LM em ação conjunta com vitamina E possa exercer
resultados ainda mais eficientes que os de polissacarídeos de soja.
Polissacarídeos contendo glicose e fucose extraídos de Dictiopiteris justii e
polissacarídeos de Ulva pertusa também apresentaram capacidade de prevenir
danos oxidativo. O primeiro foi relatado por Melo et al. (2018) como polissacarídeo
capaz de proteger células HEK-293 na concentração de 500µg/mL, já o segundo foi
relatado por Le et al. (2019) como capaz de prevenir a ação oxidativa de peróxido
de hidrogênio por meio do aumento da ação de SOD e CAT nas concentrações de
100 e 200 µg/mL, para SOD e 200 µg/mL, para CAT. As concentrações capazes de
desempenhar ação protetora nos trabalhos citados acima foram maiores que a
necessária para desempenhar o efeito protetor com LM desta tese (125 µg/mL).
Além disso, as concentrações protetoras dos polissacarídeos do trabalho de Le et al.
131
(2019) mostraram-se também tóxicas às células o que pode ser um problema para
possível aplicação clínica. Assim, indica-se que LM tem melhor potencial protetor
contra efeitos oxidativos comparados aos polissacarídeos dos trabalhos anteriores.
De modo curioso a menor concentração de LMG não teve ação protetora. Além
disso, as maiores concentrações de LMG promoveram uma menor redução de MTT
por células. Este pode ser um indicativo de efeito pro-oxidante de LMG.
Procurando-se compreender a razão para o ocorrido verificou-se em trabalho de
Badhani, Sharma & Kakkar (2015) que o ácido gálico tem efeito dual quanto a seu
efeito antioxidante/oxidante. De acordo com estes autores na ausência de H2O2 o
ácido gálico provoca lesão celular através do efeito pro-oxidativo, enquanto que na
presença de H2O2 o ácido gálico inibe a formação de espécies oxidativas por meio
de inibição da atividade enzimática de peroxidases (SERRANO et al., 2010).
Além disso, os mesmos autores relatam que o estresse oxidativo induzido pelo
ácido gálico (na ausência de peróxido de hidrogênio também foi eficiente para inibir
os sinais de sobrevivência celular: MAPK, ERK e AKT, o que pode ser uma
consequência do estresse oxidativo elevado, evidenciado pela oxidação de
biomarcadores (MDA-lys, CML e neurocetais) e alta quantidade de proteínas
ubiquitinadas. No mesmo contexto, os altos níveis de proteínas ubiquitinadas
também podem ser devido a uma baixa atividade proteossômica causada por um
alto estresse do retículo endoplasmático (evidenciado pela alta ativação de IF2α),
reduzindo a capacidade de dobramento do retículo endoplasmático e resultando em
acumulação de proteínas mal dobradas (SERRANO et al., 2010).
Como LMG contém ácido gálico e também possui um padrão antioxidante
quando submetido junto com H2O2 e pro-oxidante quando adicionado antes do H2O2
(ou seja, na ausência de H2O2), espera-se que o efeito dual observado em LMG
ocorra pelos mesmos mecanismos observados no ácido gálico isolado. Por outro
lado, não se observou diferença estatisticamente significativa entre o controle com
peróxido e a concentração de 125 µg/mL de LMG ou todas as concentrações de
ácido gálico, indicando que pelo menos para estas concentrações de ácido gálico
isolado e para esta concentração de LMG não ocorreu efeito oxidativo.
Voltando ao contexto de dano oxidativo sofrido pela população observou-se que
LM teve ótimo efeito antioxidante em concomitância e prevenção ao dano e LMG
teve ótimo efeito antioxidante em concomitância ao dano. Com isso, é possível inferir
os melhores momentos de utilização destes compostos. Vale ressaltar que apesar
132
de LMG ter apresentado um efeito dual anti/pro-oxidante também nota-se que
quando LMG é aplicado em concomitância, tem efeito antioxidante neste caso é
provável que LMG será “consumido” e sua concentração diminuída no organismo. A
diminuição da concentração torna-se então um regulador natural para que LMG em
baixas concentrações não atue como pro-oxidante e sim sem efeito algum, como
mostra a semelhança de viabilidade celular entre a menor concentração de LMG e o
controle com peróxido.
O ácido gálico possui um alto potencial antioxidante e terapêutico, entretanto a
sua utilização vem sendo discutida fora do âmbito de potencial para entrar no âmbito
do real efeito.
Na literatura (VINSON 2019; SCORSATTO et al., 2017; MANACH et al., 2004)
relata-se que compostos fenólicos de modo geral possuem alguns empecilhos para
a sua atuação efetiva como antioxidante: o primeiro deles é que os compostos
fenólicos não são bem absorvidos no sistema digestório humano/animal por isso boa
parte do que é ingerido não irá nem mesmo passar para a circulação sanguínea; o
segundo empecilho se deve a estes compostos fenólicos, ao passarem para sistema
circulatório, serem metabolizados no fígado formando os metabólitos dos compostos
fenólicos, e estes podem ter ação antioxidante totalmente diferente do seu composto
original; por fim o terceiro fator diz respeito aos compostos fenólicos tem ação
antioxidante inespecífica e ao encontrarem qualquer molécula oxidada doa seu
elétron para ela em detrimento de doá-lo para uma molécula oxidada mais
importante.
Estudos também revelam que a ingestão de compostos fenólicos na forma de
frutas ou vegetais (principalmente na forma de conjugados com açucares como
glicose) favorece a sua absorção (ORDÓÑEZ et al., 2018). Mais especificamente
estudo de Natella et al. (2014) mostra que o consumo de extrato de carvalho
contendo ácido gálico, ácido elárgico, oligômeros de ácido gálico e açucares tiveram
uma maior capacidade antioxidante no plasma sanguíneo, atuando também a nível
de expressão gênica no RNA de células humanas.
Outra forma de associar açucares e compostos fenólicos é por meio da
conjugação. Vinson (2019) sugere que compostos fenólicos antioxidantes ao serem
conjugados tornam-se de certa forma protegidos da metabolização pelo fígado e que
ao passarem por este processamento os compostos conjugados podem se
desconjugar e o composto fenólico estará íntegro na circulação para que atue de
133
forma “bioativa”. Além disso, o açúcar conjugado também poderá atuar como um
antioxidante, de forma sinérgica, in vivo (pois juntos no organismo estão protegidos
da metabolização) mesmo que este efeito não tenha sido observado in vitro.
Polissacarídeos de algas podem ser usados como biomateriais tal como são ou
em combinação com outras substancias naturais em sistemas de
administração/entrega de medicamentos (RAPOSO, MORAIS & MORAIS, 2015;
BARCLAY et al., 2019), isso porque polissacarídeos são obtidos de fontes naturais
de modo reprodutível, são biocompatíveis, biodegradáveis e pouco imunogênicos,
além disso, a conjugação de medicamentos com polissacarídeos apresentam várias
vantagens como a formação de um conjugado anfifílico, aumento da solubilidade,
retenção no trato gastrointestinal, maior absortividade, bem como proporcionar uma
metabolização no fígado de modo a não perder atividade do medicamento
(POSOCCO et al., 2015; CUNHA & GRENHA, 2016). Dentre os polissacarídeos de
algas as laminarinas são um biomaterial de carreamento de medicamentos que
podem ser usados no sistema de entrega inclusive na terapia do câncer (YU et al.,
2018; SANJEEWA et al., 2017) isso porque elas são moléculas estáveis que podem
ser modificadas para entrega de fármacos.
Diante da literatura discutida espera-se que LMG além dos efeitos antioxidantes
revelados pelos testes antioxidantes, possa também atuar de forma a melhorar a
absorção pelo sistema digestório e como percussor para a metabolização pelo
fígado e liberação de LM e ácido gálico no sangue de modo a proporcionar a
distribuição destes compostos pelo corpo.
Ao ser pensar em uma possível aplicação farmacológica e/ou alimento funcional
de um composto é necessário saber se este composto é seguro para as células, ou
seja, se ele é tóxico. Com a finalidade de se descobrir a toxicidade de LM e LMG em
células MDCK realizou-se um ensaio de viabilidade celular por análise de citometria
(figura 24) e ciclo celular (figura 25).
Utilizando a metodologia de marcação de células com anexina e PI e análise
em citômetro é possível afirmar que as células viáveis apresentam marcação com
anexina (-) e PI (-), células em apoptose precoce são anexina (+) e PI (+) e células
necróticas são aneina (-) e PI (+) (ZHAO et al., 2009).
Na figura 24 observa-se que todos os tratamentos tiveram marcação com
anexina e PI predominantemente no quadrante 4, semelhantemente ao controle
negativo (sem tratamento). Isso revela uma baixa marcação com anexina (marcador
134
indicativo de apoptose) e PI (marcador indicativo de necrose) consequentemente
encontra-se um resultado que indica uma alta sobrevivência de células em conato
com LM e LMG.
Na figura 25 observa-se que os tratamentos das células com as amostras
promoveu uma diminuição na quantidade de células na fase S de 23,8% no controle
para 19,5% e 19,2% em LM e LMG, respectivamente. Além disso, células tratadas
com LM tiveram um menor numero de células na fase G1 e maior numero de células
na fase G2-M que as células não tratadas, por outro lado, células tratadas com LMG
tiveram um maior número de células em G1 e um menor numero de células em G2-
M que as células não tratadas.
A diminuição na quantidade de células na fase S pode ser um indicativo de que
esta fase esteja ocorrendo de forma mais rápida, consequentemente tanto LM como
LMG podem ter ação facilitadora da síntese de DNA.
A diminuição de G1 e aumento no número de células em G2-M para alguns
autores pode indicar uma parada do ciclo celular e um efeito antiproliferativo (KHAN
et al., 2019; SIDDIQUI et al., 2019), no entanto, este efeito normalmente vem
acompanhado do aumento também da fase S. Já outros autores identificaram que o
aumento de células em fase G2-M (sem o aumento em S) pode corresponder a uma
atividade proliferativa de células saudáveis (CHEN et al., 2016; FU et al., 2018).
Fusté et al. (2019) verificou que β glucanas de cevada com 64 kDa são capazes
de atuar sobre RB (gene do retinoblastoma) de modo a permitir a ativação de Cdks
(ciclinas essenciais no controle do ciclo celular) e consequentemente promover a
proliferação celular. Estes autores ainda enfatizam que nem todos os
polissacarídeos de reservas são capazes de promover esta ação. Sabe-se que
durante a fase G1 existe um ponto de checagem (essencial para a continuidade do
ciclo celular) que envolvem a atuação de ciclinas. Observou-se na figura 24 que LM
foi capaz de diminuir a fase G1 em comparação com o controle negativo, além disso,
lembra-se que no ensaio de MTT identificou-se maior proliferação celular com uso
de LM do que no controle, assim espera-se que a diminuição em G1 ocorra por
aumento na proliferação de modo semelhante ao observado com glucanas de
cevada de Fusté et al. (2019).
No caso de células tratadas com LMG, ocorreu um maior número de células na
fase G1. Este efeito pode ter-se dado por meio da diminuição do número de células
135
mortas (fase sub-G1) e/ou pela retenção das células nesta fase e diminuição do
número de células em fase G2-M.
Na literatura também já se observou o aumento na fase G1 quando
polissacarídeos de chá verde (SUN et al., 2018) e polissacarídeos sulfatados de
algas (MA et al., 2017) foram utilizados em células HK-2 que sofreram dano
oxidativo em comparação com controle negativo. Além disso, o aumento de G1 em
polissacarídeos já é bem relatado como um efeito indicativo de retenção do ciclo
celular (Chen et al., 2016; Khan et al., 2019). Foi sugerido por Chen et al. (2016) que
ligações repetidas de β (13) e β (16) é capaz de desempenhar ação
antiproliferativa em células tumorais. No caso de LM, não teve este comportamento
com células normais, já LMG apresentou um perfil mais semelhante a uma ação
biocompatível com uma ação de retenção no ciclo celular de células normais.
Em concordância a este resultado lembra-se que nos ensaios de MTT, LMG teve
menor efeito proliferativo comparado a LM. Assim, espera-se que LMG teve maior
efeito sobre a retenção do ciclo célular de células saudáveis em comparação com as
células não tratadas e em comparação a LM.
Além disso, observou-se em diversos trabalhos que polissacarídeos com ação
antioxidante comumente é capaz de estimular as células a terem um perfil de ciclo
celular (considerando a quantidade de células e o conteúdo de DNA) mais
semelhante ao do controle negativo/ células não tratadas (KHAN et al., 2019) ou ate
mesmo antiproliferativo. Estes resultados corroboram com os desta tese já que LMG
possui melhor atividade antioxidante in vitro, além de boa atividade antioxidante em
células e também foi biocompatível a células normais desempenhando uma ação de
controle/retenção das células em G1. Assim, é possível que LMG seja um melhor
regulador do ciclo celular/antioxidante comparado a LM.
Em resumo LMG foi à modificação com melhores atividades antioxidantes
observadas in vitro. LM possui ação profilática ao dano oxidativo em células e tanto
LM como LMG foram capazes de atuar impedindo o dano oxidativo quando este foi
submetido em conjunto a aqueles. Além disso, ambas proporcionaram uma alta
sobrevivência celular e LMG teve perfil de ciclo celular semelhantes às células sem
dano. LMG além de sua própria ação antioxidante também pode atuar como um
carreador de ácido gálico à medida que pode ser um facilitador da absorção,
transporte e direcionamento do ácido gálico. Estes resultados e perspectivas trazem
a possiblidade de um tratamento com LM em conjunto com LMG aplicados em
136
concomitância a um estresse oxidativo, atuando, possivelmente, como um
tratamento com grande potencial farmacológico e/ou alimento funcional.
137
5.1. PARTE 2 – Polissacarídeos de Dictyota mertensii
O rendimento da extração dos polissacrídeos extraídos de D. mertensii foi
diferente do obtido com outras algas marrons como o obtido no trabalho de Melo
(2018). Este tipo de variação já foi observado por outros autores e são citados
alguns fatores que fazem com que isso ocorra, dentre eles o método de extração,
sazonalidade e fatores ambientais (GROSSO et al., 2015; COSTA, 2010). Além
disso, o rendimento dos polissacarídeos também pode estar relacionado por uma
caraterística da espécie da alga utilizada (NEGREIROS, 2015).
Foi difícil fazer comparações de rendimento das nanopartículas de
polissacarídeos de algas da literatura com o rendimento das nanopartículas desta
tese, pois poucos trabalhos com nanopartículas de polissacarídeos de algas expõe o
rendimento. Foi encontrado trabalho com nanopartículas de polissacarídeo de
sabugo de milho e verificou-se rendimento de 36,6%, valor menor que o encontrado
neste trabalho (de 49,0 ± 3,0%). O trabalho de Rodríguez-León et al. (2013)
identificou que o rendimento de formação de nanopartículas de prata obtida pode ser
explicada pelo poder redutor de cada extrato, quanto maior o poder redutor do
extrato maior a quantidade de nanopartículas obtidas. Costa et al. (2010) avaliaram
o poder redutor de polisacarídeos de D. mertensii, e identificou poder redutor
moderado em comparação a outros polissacarídeos de algas e este foi maior que a
de polissacarídeos de sabugo de milho que não possui atividade, consequentemente
espera-se que o rendimento de NF tenha sido maior devido à maior capacidade
redutora.
A formação da nanopartícula com fucana foi acompanhada por
espectroscopia, porque de acordo com Gurunathan et al. (2013) a incidência de luz
na prata reduzida presente nas nanopartículas promove a sua excitação, o que
formam uma camada chamada de superfície de plasmon, o que promove o desvio
da luz e, por conseguinte, pode ser detectado numa faixa de comprimento que varia
de 250 a 600 nm, sendo o aumento dos valores de DO na região de 403 nm
apontado por Islam & Mukherjee, (2011) como indicador do aumento na quantidade
de nanopartículas em suspensão, por isso esta faixa de comprimento de onda foi
utilizada para verificar o tempo necessário para a síntese de nanopartículas de
polissacarídeos sulfatados de algas. Já a região menor que o comprimento de 350
nm é característico da prata livre em solução.
138
Vale salientar que o aumento observado na absorção de luz ao longo do
tempo (Figura 26) foi semelhante a aquele relatado durante a síntese de outras
nanopartículas de prata, como as sintetizadas sob agitação com o uso de
polissacarídeos de sabugo de milho (VIANA, et al., 2019) do polissacarídeo natural
da goma da planta Cyamopsis tetragonaloba (PANDEY, GOSWAMI & NANDA,
2012) exopolissacarídeos de fungos (CHEN, YAN & WU, 2015) e polissacarídeos
sulfatados extraídos de algas marinhas (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013) e
também com fucanas extraídas da alga Spatoglossum schöederi (AMORIM et al.,
2016).
Os estudos morfológicos de NF sintetizadas neste trabalho leva a observação
que ela possuem forma esférica (figura 27). Esta geometria já é conhecida para
diversas nanopartículas de prata (OKAFOR, et al., 2013; GURUNATHAN, et al.,
2013; AMORIM et al., 2016). Porém, nanopartículas podem ser amorfas ou
assumirem diferentes formas geométricas. Entretanto, no caso das nanopartículas
de polissacarídeos obtidos de diversas fontes (PANDEY, GOSWAMI & NANDA,
2012; AKMAZ et al., 2013), inclusive nanopartículas feitas com polissacarídeos
sulfatados de algas (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013; AMORIM et al., 2016), a
única forma geométrica identificada até o momento foi a forma esférica. E isso leva à
proposta de que nanopartículas de prata contendo polissacarídeos assumem
exclusivamente a forma esférica.
O fato das nanopartículas com polissacarídeos assumirem sempre a forma
esférica é um ponto positivo, pois nanopartículas arredondas são menos citotóxicas
comparadas outras formas, como por exemplo, triangulares (PAL, TAK & SONG,
2007). Assim, espera-se que as NF deste estudo também sejam pouco tóxicas às
células.
Comparando-se os tamanhos de NF com de outras nanopartículas de
polissacarídeos da literatura, identificou-se que o tamanho de NF foi semelhante ao
de nanopartículas de prata com fucanas sintetizadas por Leung, Wong & Xie (2010)
que tiveram tamanho 78 nm. Já nanopartículas de prata com polissacarídeos de
Chen, Yan & Wu (2015) apresentaram tamanho com 120 nm.
Coradeghini et al. (2013) relatam que nanopartículas muito pequenas podem
apresentar grande citotoxicidade comparadas às nanopartículas maiores. Por outro
lado, nanopartículas grandes não são facilmente absorvidas pelos tecidos,
dificultando a ação em seu respectivo alvo (ELSABAHY & WOOLEY, 2012). Assim,
139
de acordo com estes autores, as nanopartículas com tamanhos 20-200 nm são
particularmente indicadas para possíveis aplicações in vivo, sendo que para alguns
casos, como aplicação de fármacos para o fígado, podem-se utilizar também
nanopartículas com tamanhos de até 500 nm. Como as NF encontram-se nesta faixa
de tamanho, espera-se que também sejam adequadas para aplicações in vivo.
Quando se observa o tamanho das nanopartículas identifica-se o perfil de
distribuição das nanopartículas (figura 28). As interações entre cargas são o principal
fator para a estruturação das nanopartícula, assim, as diferenças na composição e
na quantidade ou posição das cargas, em um polissacarídeo, podem resultar em
variações de tamanho das nanopartículas. Portanto, em um mesmo polissacrídeo
pode conter variações esruturais que resultam em variações no tamanho das
nanopartículas. Porém, neste trabalho, há uma população de nanopartículas
predominante (entre 71-105 nm), o que mostra uma homogeneidade nessa
amostras. Este fato não é tão comum, como por exemplo, no trabalho de El-Rafie,
El-Rafie & Zahran, (2013) encontrou-se nanopartículas de prata com polissacarídeos
de algas que apresentavam grande quantidades de nanopartículas com tamanhos
diferentes que permitia agrupa-las em no mais de cinco populações distintas e sem a
predominância de um tamanho.
Acredita-se que as atividades farmacológicas atribuídas as NF seriam
dependentes principalmente da estrutura na qual se arranja o polissacarídeo contido
nesta nanopartícula, assim, uma maior homogeneidade confere maior segurança no
uso das NF.
Com relação à estabilidade (Figura 29), a NF teve tamanho constante (não
ocorrendo diferença significativa com o passar do tempo). Quanto a estabilidade de
outras nanopartículas de polissacarídeos, na literatura, encontrou-se estabilidade de
25 dias para nanopartículas de prata com chitosan e fucoidan (HUANG & LI, 2014),
dois meses para nanopartículas de exopolissacarídeos de fungos (CHEN, YAN &
WU, 2015) três meses para nanopartículas bimetálicas de ácido gálico (MITTAL,
KUMAR & BANERJEE, 2014), seis meses para nanopartículas de prata com
polissacarídeos de alga (El-RAFIE, El-RAFIE & ZAHRAN, 2013) e 12 meses para
nanopartículas de polissacarídeos de sabugo de milho (VIANA, 2017). Assim,
acreditamos que a estabilidade de NF está entre as nanopartículas com estabilidade
mais extensas já descritas.
140
Em nanopartículas, distinguem-se duas regiões, a região interna e a externa, e
a interação das nanopartículas com o ambiente ocorre a partir da camada externa,
que confere a estas partículas diferentes propriedades, inclusive de carga. O
Potencial Zeta é uma representação numérica que aponta a unidade total de carga
(potencial eletrônico) da superfície de partículas.
Assim, com relação a caracterização da carga superficial das NF por potencial
zeta, identificou-se carga negativa com valor de -19,15 ± 1,8 mV. Também se
encontra, na literatura, nanopartículas com polissacarídeos sulfatados com potencial
zeta negativo. Venkatpurwar & Pokharkar (2011) sintetizaram nanopartículas de
prata com polissacarídeos de algas com potencial zeta negativo de - 35,05 mV.
Estes autores indicam que os polissacarídeos sulfatados são responsáveis por esta
carga.
Nanopartículas de prata contendo fucanas extraídas de S. schöederi obteve
potencial zeta de -18,82 ± 4,85, (AMORIM et al., 2016). Chauvierre et al., (2003)
também obtiveram nanopartículas de polissacarídeos sulfatados com carga
superficial negativa (em torno de – 45 mV), estes autores ainda expõem que
nanopartículas com dextrana (polissacarídeo neutro) apresentaram menor carga
negativa (em torno de -15 mV) comparado às nanopartículas com heparina e
dextranas sulfatadas. Assim, especula-se, assim como ocorreu para Chauvierre et
al. (2003), que a carga negativa das NF provavelmente esteja relacionada com a
presença e exposição de grupos sulfato da fucana.
Outro fator importante sobre a carga negativa das NF é que eles podem ter
sido um fator importante para a boa estabilidade durante os dezesseis meses. Isso
porque, no sistema aquoso, cargas negativas ou positivas conferidas às
nanopartículas contribuem para a repulsão entre elas, impedindo sua agregação e
consequentemente impedindo sua instabilidade (OSTOLSKA & WISNIEWSKA,
2014).
Extratos de polissacarídeos podem apresentar diferentes níveis de
contaminação com outras moléculas (proteínas, lipídeos e compostos fenólicos, por
exemplo) dependendo dos procedimentos realizados para a extração do material. O
teor de compostos fenólicos e proteínas, observado neste trabalho é considerado
baixo (Tabela 14), e muito menor que a contaminação, de nanopartículas, por
proteína detectada em trabalho de El-Rafie, El-Rafie & Zahran (2013). Já a pequena
quantidade de contaminantes também foi observado em nanopartículas contendo
141
fucanas extraídas de S. schöederi (0,01% de proteínas e 0,07% de fenólicos) em
estudo que também utilizou procedimentos de delipidação e proteólise.
Consequentemente indica-se que a utilização de passos de retirada de
contaminantes (como a delipidação e proteólise) que diferem do são esscenciais
para pureza da nanopartícula.
Típicos sinais de infravermelho foram encontrados nos espectros de fucanas e
NF (Tabela 16). Para todas as amostras verificou-se absorção intensa nas regiões:
3400 cm-1 e 3000 cm-1 característicos de estiramento dos grupos O-H e C-H,
respectivamente (WANG, et al., 2010), confirmando a presença de componentes
orgânicos. As absorções em 1000-1100 cm-1 representam vibrações do grupo C-O-C
característico de ligações glicosídicas (TURQUOIS, et al., 1996), por isso confirma-
se que a parte orgânica de fucanas e NF, corroborando com os dados obtidos pelas
análises químicas.
A análise dos perfis de infravermelho ainda exibe absorções nas regiões 1274
cm-1, 1045 cm-1 e 810-850 cm-1, característicos de estiramento assimétrico de S=O,
deformação assimétrica de C-O-SO3 e vibração de flexão de C-O-S,
respectivamente (ALBUQUERQUE, et al., 2004; ZHANG, et al., 2008) confirmando a
presença de grupamentos sulfato ligados as NF.
O pico de absorção específico para a prata em NF sobrepõe-se ao pico de
estiramento de C-O-C na região 1078 cm-1 e não pode ser identificado
separadamente. Por outro lado, nos espectros das NF há o surgimento de um sinal
em 1400 cm-1 que é atribuído à presença da prata reduzida (HE et al., 2013).
Também se observa uma diminuição da intensidade do sinal em 1274 cm-1. Este
sinal é atribuído ao alongamento assimétrico de S=O e sua diminuição indica a
associação dos grupos sulfato com a prata reduzida (HE et al., 2013). Portanto, as
análises de infravermelho confirmaram a ligação dos polissacarídeos à prata
presente na nanopartícula.
Os resultados obtidos dos ensaios de MTT utilizando células normais 3T3
incubadas com NF (figura 31) indicam que em baixas concentrações as NF
promovem pouca morte celular. Isso também ocorre quando outras nanopartículas
de prata com polissacarídeos são incubadas com diferentes células, como por
exemplo, nanopartículas de prata com quiitosana-fucoidan sintetizadas por Huang &
Li (2014) não alteraram a viabilidade celular. Nanopartículas de prata contendo
142
fucanas de S. schöederi também não forem tóxicas em células 3T3 e também em
células HEK 293 (AMORIM et al., 2016).
Já com relação às células tumorais, observa-se que quando as NF foram
incubadas com B16F10, elas induziram uma expressiva citotoxicidade (figura 32).
Um estudo com nanopartículas de prata feitas com extratos de algas mostrou que
estas apresentavam índices de citotoxidade contra células HepG2, MCF-7, HeLa e
Jukat (NAMVAR et al., 2014) que se assemelhavam com aqueles observados com
as NF estudadas aqui. Outro fato interessante é que a atividade citotóxica das NF foi
maior do que aquela observada com nanopartículas de prata feitas com extrato da
bactéria Nocardiopsis sp. sintetizadas por Manivasagan et al. (2013). Estes dados
mostram uma tendência, de que as nanopartículas de algas teriam uma atividade
citotóxica maior do que aquelas sintetizadas com outros materiais. Contudo, mais
estudos com nanopartículas feitas com algas precisam ser realizados para
comprovare esta hipótese.
Observou-se que NF e fucanas tivram a mesma ação antiproliferativa (Figura
32). Por outro lado, maior atividade antiproliferativa de nanopartículas em
comparação a polissacarídeos ocorreram quando nanopartículas de fucanas,
sintetizadas por Kimura, et al. (2013), e fucanas nativas, foram incubadas com
osteosarcoma. Estas nanopartículas foram capazes de induzir a apoptose in vitro e
in vivo e inibir a formação de metástase in vivo. Porém, estes autores não indicaram
como ocorreu esta potencialização da atividade. Além disso, nanopartículas de prata
contendo fucanas de S. schöederi não foram tóxicas em células não tumorais 3T3 e
HEK 293, mas tiveram forte ação antiproliferativa (inibindo 80% das células) em
linhagens tumorais 786-0 e B16F10 (AMORIM et al., 2016).
Para justificar as diferentes citotoxicidades das nanopartículas deve-se levar
em consideração que esta atividade depende de fatores como o tamanho das
nanopartículas (CORADEGHINI et al., 2013) e de sua forma (PAL, TAK & SONG,
2007). As formas de todas as NF foram esféricas, assim, ela não seria um fator para
explicar as diferenças de efeitos comparados a da literatura. NF teve tamanho de
104,4 nm já as nanopartículas de fucana de S. schöederi tiveram namanho de
2010,44 nm. Esta relação tamanho/toxicidade também foi identificada por
Coradeghini et al. (2013) como um fator que aumenta o efeito tóxico, por isso, indica-
se que os menores tamanhos de NF promoveu a toxicidade em células 3T3, como
aqui constatado.
143
Além disso, mesmo observando-se toxixidade para as células normais, espera-
se que NF tenha grande capacidade como agente antitumoral em tratamentos que
realizem aplicação especificamente no local do tumor, um caso bastante realizado
em melanomas.
No presente estudo também se investigou a capacidade de fucanas e NF em
alterar a proliferação bacteriana (Figuras 33 a 34). De forma geral, encontrou-se
pouca atividade antibacteriana com fucanas e grande atividade antibacteriana com
NF.
Existem poucos estudos a respeito de atividade antibacteriana de
polissacarídeos de algas, um destes estudos é o de Jaswir et al. (2014) que
estudaram extratos de algas contendo açúcares. Estes autores também trabalharam
com E. coli e S. aureus e verificaram que seus extratos conseguiram inibir a
proliferação bactériana de S. aureus com uso do ensaio em disco.
Por outro lado, existem muitos estudos com atividade antibacteriana de
nanopartículas de prata (CHEN, YAN & WU, 2015; VENKATPURWAR &
PORKHARKAR, 2011; GIULIO, et al., 2013; YOKSAN & CHIRACHANCHAI, 2009;
AKMAZ et al., 2013), e os efeitos de inibição de proliferação bacteriana
apresentados nestes trabalhos foram menores que os encontrados com NF.
Como por exemplo, a atividade de NF apresentou efeito antibacteriano 10
vezes maior, contra E. coli, e 4 vezes maior, contra S. aureus, comparados a
inibição bacteriana mínima (MIC) de naopartículas de exopolissacarídeos de fungos
estudados por Chen, Yan & Wu, (2015).
Evidencia-se também que NF necessitou de concentrações diferentes para
inibir o crescimento de bactérias diferentes (50µg/mL para E. coli e 100µg/mL para
S. aureus). A maior atividade para algum dos tipos de bactérias (Gram positivas ou
negativas) é apontado por Venkatpurwar & Porkharkar (2011) com um indicativo de
diferentes suceptibilidades destes tipos patogênicos. Porém, não foi possível
identificar nenhuma relação para explicar estas diferentes suceptibilidades.
Outra relação importante que pode-se observar é que em nosso estudo
obtivemos NF com atividade antibacteriana maior que da fucana. (Figuras 33 a 24),
indicando assim, que a formação das nanopartículas contrituiram para este efeito.
O mecanismo antibacteriano de nanopartículas de prata, de forma geral, é
proposto, por Kowshik et al. (2003), que indicam que essas moléculas atuam como
144
reservatórios de íon prata, e a liberação gradual deste íon, de acordo com Sondi &
Salopek-Sondi, (2004) promove danos a membranas, permeabilidade e morte.
Com relação ao mecanismo para o efeito bactericida de NF, propomos duas
possíveis vias de atuação. Em primeiro, propomos que NF possui grande
capacidade de armazenar íons prata e os liberam. Em segundo, propõem-se que a
grande atividade metabólica das bactérias e a necessidade por nutrientes
promoveria a degradação dos polissacarídeos presentes nas nanopartículas e a
liberação mais rápida de prata, essa prata atuaria livre como agente oxidante em
membranas celulares de bactérias.
O efeito antiproliferativo contra tumores e bactérias também podem ocorrer por
produção de NO por macrófagos (MACMICKING, XIE & NATHAN 1997), portanto,
verificamos se as fucanas e NF poderiam participar também nestes processos. Para
isso, avaliamos os níveis de NO em cultura de células de macrófagos incubadas
com diferentes fucanas e NF (Figura 35).
Verificou-se que, quando macrófagos estão atuando contra um possível
patógeno (situação em que macrófagos são incubados com LPS) a concomitante
incubação com fucana não potencializou a produção de NO (figura 35). Por outro
lado, sem a presença do LPS, fucanas e NF promoveram ação imunomodulatória
quando comparados ao controle. Este perfil foi semelhante a estudos de Kouakou et
al. (2013), que obtiveram frações de polissacarídeos que não eram capazes de
alterar a produção de NO em macrófagos induzidos por LPS, porém, os
polissacarídeos tinham ação estimulatória na produção de NO na ausência deste
indutor inflamatório.
O mecanismo pelo qual polissacarídeos sulfatados estimulam a produção de
NO, segundo Leiro et al. (2007), tem relação com a presença e exposição de grupos
sulfatos dos polissacarídeos, que de alguma forma, aumentam a expressão de COX-
2.
Porém, há outras formas de polissacarídeos e nanopartículas de
polissacarídeos estimularem a produção de NO, e por isso, mais estudos são
necessários para que se possa propor o mecanismo de ação das fucanas e de NF.
Com relação à indução de citocinas de macrófagos sem LPS, observou-se que
todas as amostras estimulam a produção de TNF-α e IL-6, além disso, NF induziu
um pouco a produção de IL-10.
145
Por estes resultados sabe-se que NF teve maior capacidade de indução de
citocinas inflamatórias e TNF-α. Outros polissacarídeos de algas (Kouakou et al.,
2013), nanopartículas de prata (MARTÍNES-GUTIERREZ et al., 2012) e
nanopartícula com polissacarídeos (DEVI et al., 2015; Wang et al., 2014) também
foram capazes de estimular a liberação destas mesmas citocinas.
Um ponto positivo para a produção de citocinas é que, segundo Lee et al.
(2010), estas moléculas são importantes na resposta protetora contra a ação
inflamatória prejudicial e excessiva. Assim pode-se apontar as nanopartículas aqui
apresentadas como possíveis agentes imunomoduladores.
A similaridade entre a atividade do polissacarídeo e a nanopartícula do
polissacarídeo, quanto a produção de TNF-α, também foi verificada em estudos de
Friedman et al. (2013). Estes autores relatam que a quitosana e nanopartículas com
quitosana-alginato tiveram a mesma atividade imunomodulatória.
Outro viés para os benefícios que envolvem a regulação imune inclui a ação
supressora de tumores. Por exemplo, o aumento na produção de TNF-α, NO (QI, et
al., 2012) e IL-10 (OFT, 2014) têm correlação com a ação antiproliferativa de
tumores.
Sabendo-se que as citocinas são relacionadas a ação antiproliferativa em
condições in vivo (QI, et al., 2012; OFT, 2014) espera-se, que nesta condição, o
efeito citotóxico de NF contra células tumorais também possa ocorrer por meio da
estimulação de células de defesa.
146
6 CONCLUSÃO
Obteve-se, com uso de técnicas de síntese verde, laminarinas carboxilada,
sulfatada ou galificada de tamanhos moleculares semelhantes com o uso de
condições que promovem pouco impacto ambiental. Estas modificações foram
confirmadas com diferentes técnicas. E especificamente, com relação a laminarina
galificada, a mudança foi também confirmada com uso de espectroscopia de
infravermelho e ressonância magenética nuclear. Dentre as laminarinas, a galificada
foi a que teve maior aumento de atividade antioxidante in vitro em comparação com
a laminarina nativa.
Em células MDCK, a laminarina galificada protegeu essas células de danos
causados por estresse oxidativo devido à presença de peroxido de hidrogênio
quando aplicada em concomitância com esse oxidante. Além disso, essa molécula
não foi citotóxica e não alterou o ciclo celular de células MDCK.
Com as fucanas foi possível sintetizar nanopartículas esféricas, de tamanho
reduzido, estáveis por 16 meses. Além disso, o rearranjo da fucana na forma de
nanopartículas potencializou o seus efeitos antitumoral, antibacteriano e bactericida.
147
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