UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO

NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE

BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA

MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR

ESTREPTOZOTOCINA”

RENATA SOUZA E SILVA

Natal-RN

2019

“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA

MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR

ESTREPTOZOTOCINA”

RENATA SOUZA E SILVA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Biologia Estrutural e

Funcional, do Departamento de Morfologia

da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Morfologia.

Orientadora: Naisandra Bezerra da Silva Farias

Co-orientadora: Danielle Barbosa Morais

Natal-RN

2019

RENATA SOUZA E SILVA

“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA

MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR

ESTREPTOZOTOCINA”

Comissão Examinadora

Fernanda Carolina Ribeiro Dias

Tirzah Braz Petta Lajus

Natal-RN

2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB

Silva, Renata Souza e.

Efeitos do estrato de Allium cepa L. (cebola) e S-

metilcisteína na morfologia testicular de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina / Renata Souza e Silva. - Natal,

2019.

79 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional.

Orientadora: Profa. Dra. Naisandra Bezerra da Silva Farias.

Coorientadora: Profa. Dra. Danielle Barbosa Morais.

1. Diabetes mellitus - Dissertação. 2. Morfofisiologia

testicular - Dissertação. 3. Extrato de cebola - Dissertação. 4.

S-metilcisteína - Dissertação. I. Farias, Naisandra Bezerra da Silva. II. Morais, Danielle Barbosa. III. Universidade Federal

do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.379-008.64

Dedico à

meu avô Kerginaldo Vieira de Souza,

que sempre foi um exemplo de

determinação e sabedoria.

Minha família, que sempre me apoiou e

me disse que com determinação eu

poderia alcançar meus sonhos.

AGRADECIMENTO

Agradeço primeiramente a Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN), onde pude fazer minha graduação e amadurecer bastante. Agradeço também ao

Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PPGBioEF), onde pude

aprender que ser professora é muito mais do que estar na frente de uma sala e falar o

conteúdo, mas sim tentar fazer o aluno se envolver com a aula, participar e entender que

todo conteúdo é aplicável vida.

Agradeço a minha orientadora Naisandra Bezerra da Silva Farias, um exemplo de

pessoa e de profissional. Mesmo estando envolvida em diversos projetos, sendo

coordenadora de um curso de graduação, professora de várias turmas de histologia,

orientadora de vários alunos de mestrado e ainda lida com uma família diariamente, ela

consegue balancear tudo com bom-humor e sabedoria. Se eu for metade do profissional

que ela é, já me darei mais do que satisfeita.

Agradeço a minha co-orientadora Danielle Barbosa Morais por ter me ensinado a

trabalhar com o testículo e me dado a oportunidade de visitar a Universidade Federal de

Viçosa (UFV), onde tive uma das melhores experiências para este trabalho. Agradeço aos

professores Fernando Vagner Lobo Ladd por sempre estar disponível para tirar dúvidas e

explicar como as coisas do programa funcionam. Agradeço também ao professor Pedro

Paulo de Andrade Santos, que me ajudou na leitura das minhas lâminas, assim como de

disponibilizou sua aula preferida de histologia...o que me deixou muito nervosa, porque

não sabia se poderia conseguir dar uma aula que chegasse aos pés da aula ministrada por

ele.

Agradeço ao professor Gustavo Cunha Lima Freire, que sempre foi mais do que

apenas um professor, mas um amigo que me ajudou a aprender que aulas podem ser

ministradas de tantas formas diferentes e que não basta apenas estar presente na sala de

aula, mas se faz necessário mostrar pro aluno que aquele conteúdo não existe apenas para

dificultar a vida e ser cobrado em prova, mas sim como um modo que compreender o

mundo em que vivemos. Com ele eu pude assistir aula, dar aula, aprender a dar aula (ao

ponto de ter um estilo de aula muito parecido com o dele), desenvolver modelos de prova

diferentes...foram diversas experiências as quais eu tenho apenas agradecer e esperar que

essa parceria continue por vários anos.

Agradeço a Fernanda Carolina Ribeiro Dias, uma pessoa maravilhosa que entrou

na minha vida graças a professora Danielle que me apresentou como “a pessoa que me

acompanharia na UFV”. Não sabia eu que na realidade eu ganharia muito mais com

isso...uma co-orientadora, uma orientadora, uma amiga. Ela esteve presente na minha

vida desde o dia em que nos conhecemos e não apenas para me ajudar com o meu trabalho,

mesmo estando a tantos quilômetros de distância. Ela sempre me perguntou como eu

estava, sempre me ofereceu ajuda, sempre me ajudou quando eu estava desesperada e

agora eu tenho o prazer de tê-la na minha banca avaliatória. Agradeço por tudo, pelas

ajudas, por se importar comigo e por ser sempre presente. Espero que nossa amizade

continue pra sempre e que você goste desse trabalho que eu sinto que tem um pedaço de

você nele.

Agradeço ao professor Sergio Luís Pinto da Matta, que além de ter me ensinado

que a terra realiza mais de 13 movimentos (e não apenas dois como sempre ouvimos

falar), também se mostrou um modelo de pessoa e de profissional (basicamente o sonho

do que eu quero ser da minha vida: biomédico e professor de histologia). Ele sempre

esteve descontraído, aberto pra conversa, disposto a ajudar e fazendo brincadeira com o

meu sotaque. Quando disse que o laboratório estaria sempre aberto para mim, o que me

fez sentir bem-vinda e a vontade para trabalhar. Acredito que o tempo que eu passei lá eu

pude enriquecer muito mais o meu trabalho e amadurecer muito mais como ser humano.

Agradeço a todos os alunos de pós-graduação e de iniciação científica do

laboratório de biologia celular e estrutural. Vocês são pessoas maravilhosas, que me

acolheram durante a semana que pude conviver com vocês e me ajudaram a desenvolver

meu trabalho. Todos os almoços, momentos de descontração e piadas tonaram o trabalho

e a saudade de casa muito mais fáceis de aguentar. Sem falar do quanto vocês me

ensinaram sobre como realizar este trabalho. Só tenho a agradecer a todos vocês e esperar

que vocês tenham um futuro brilhante pela frente. Além de desejar “Bom dia”!

Agradeço a minha família, um conjunto de pessoas maravilhosas e exemplos de

vida. Minha mãe Lizélia Maria de Souza, uma mulher que criou três filhos sozinha,

trabalhando dois empregos e fazendo projetos fora parte pra colocar comida na mesa

todos os dias. Hoje em dia, com duas graduações, um mestrado quase finalizado, diversas

especializações e cursos profissionalizantes, um exemplo de vida a ser seguido. Além

dela, o meu pai Edson Alves da Silva, um homem com diversas experiências de vida,

terminando a terceira graduação, um professor, padeiro, pizzaiolo, motorista de

caminhão, pescador, aquacultor, tantos empregos e histórias que a gente não sabe quais

são verdade. Mas mesmo assim, ele é um exemplo de pessoa e de pai. Só tenho a

agradecer por ele estar na minha vida. Amo muito vocês dois!

Agradeço aos meus irmãos por estarem sempre presentes, rirem do meu trabalho

e fazerem piadas com tudo que eu faço na vida. Mas ao mesmo tempo, me dando apoio e

dizendo que eu consigo sim fazer todas as coisas que eu listei pro meu dia. Também

agradeço aos meus amigos, não tenho nem palavras para agradecer o apoio que vocês me

dão. O grupo 9, Os + lindos, Corais, Mestrado BIOEF, DMORte Origem, monitoria de

histologia...se eu fosse citar nome a nome, esses agradecimentos não acabariam nunca,

mas vocês sabem que são especiais pra mim e que sem vocês eu não sairiam do lugar com

esse trabalho.

Mas eu não poderia deixar de agradecer a algumas pessoas em especial.

Primeiramente eu gostaria de agradecer a Daniella Santos, minha sis, minha cheerleader,

a pessoa que comentava comigo sobre cultura coreana, que me apoia a todo momento e

que me mata de orgulho todos os dias. Você é uma pessoa muito especial pra mim e

merece muito amor e apoio. Só tenho a agradecer por esta amizade e espero que o seu

futuro seja tão brilhante quanto a sua pessoa.

Rhudson Cruz, a pessoa que chegou perdido no departamento, mas viramos

amigos instantaneamente. Debatemos sobre projetos, admirei os seus desenhos, tocamos

e cantamos juntos, comemos todas as tardes às 16 horas, você virou professor doutor e eu

fiquei pra trás (por enquanto). Você corrigiu o meu trabalho, realmente corrigiu o meu

trabalho e eu fiquei tão feliz em saber que eu tinha o seu apoio e a sua atenção. Muito

obrigada por tudo, o seu futuro só pode melhorar, porque eu nunca conheci alguém mais

determinado e preparado para alcançar o que almeja. Torço por você e espero que daqui

pra frente eu só escute mais notícias boas sobre você.

Agora eu quero agradecer a pessoa mais maravilhosa da minha vida. Minha amiga,

minha irmã, minha estrela Patrícia Dias Ribeiro. Que pessoa incrível. Você entrou na

minha vida a 14 anos e nunca mais saiu (graças a Deus). Sem você, eu não seria quem eu

sou. Você esteve comigo nos momentos ótimos, bons, ruins e péssimos. É minha amiga,

minha confidente, minha bússola, minha advogada e muito mais. Você me faz sorrir todos

os dias e me acalma quando eu choro. Me ajudou a passar por momentos difíceis que

foram trazidos pelo mestrado e pela vida, seja pessoalmente, por ligação, por mensagem

ou por memes. Você é mais importante pra mim do que os meus cachorros e você sabe

que eles valem mais do que meus órgãos. Muito obrigada por se fazer presente e nunca

me abandonar mesmo eu sendo estranha. Eu te amo!

Fazer mestrado não é uma experiência fácil. Sempre se está cansado, com sono,

preocupado com experimentos, ratos, artigos, bases de pesquisa, reuniões, qualificações,

prazos, futuro, defesa...tanta coisa que as vezes é difícil de respirar. Mas ao mesmo tempo

é extremante gratificante. A experiência de ministrar uma aula, de ter uma turma

chamando você de professora, de escrever um projeto e se orgulhar dele, de ter resultados

positivos e relevantes e de conseguir alcançar as próprias expectativas. Não existem

palavras para agradecer por tudo isso, porém é tudo que eu posso oferecer em troca. Muito

obrigada por tudo, espero ser uma profissional e pessoa melhor daqui pra frente.

Sumário

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 14

2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 15

2.1. Geral ............................................................................................................................... 15

2.2. Específicos ...................................................................................................................... 15

3. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 16

3.1. Diabetes melitos ............................................................................................................. 16

3.2. Morfologia testicular ..................................................................................................... 18

3.3. Danos testiculares causados pelo DM .......................................................................... 19

3.4. Allium cepa L. ................................................................................................................ 20

3.5. S-Metilcisteína ............................................................................................................... 22

4. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 24

Effects of extract Allium cepa L. (onion) and s-metilcystein in testicular morphology of

diabetic rats induced by estreptozotocin ................................................................................. 33

ABSTRACT ............................................................................................................................... 33

INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 34

MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 36

Modelo experimental................................................................................................................. 36

Desenho experimental ............................................................................................................... 37

Protocolo experimental ............................................................................................................. 37

Avaliação de consumo de água e ração ................................................................................... 38

Análises de glicemia .................................................................................................................. 39

Biometria corporal e testicular ................................................................................................ 39

Técnicas Histológicas ................................................................................................................ 39

Análise de dano tecidual ........................................................................................................... 40

Análise Morfométrica ............................................................................................................... 42

• Proporção volumétrica de túbulos seminíferos ............................................................... 42

• Índices tubulossomático e epiteliossomático .................................................................. 42

• Diâmetro tubular médio e comprimento total dos túbulos seminiferos .......................... 42

• Proporção volumétrica do intertúbulo ............................................................................. 43

• Parâmetros relacionados as células de Leydig ................................................................ 43

Técnicas de Imunohistoquímica ............................................................................................... 44

Análise estatística ...................................................................................................................... 45

RESULTADOS .......................................................................................................................... 45

Glicemia e consumo de insumos ............................................................................................... 45

Parâmetros biométricos ............................................................................................................ 46

Escore tecidual ........................................................................................................................... 47

Morfometria testicular .............................................................................................................. 48

Análise qualitativa ..................................................................................................................... 57

6.4. Imunohistoquímica........................................................................................................ 60

DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 63

CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 69

REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 70

CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................................................... 80

RESUMO

Diabetes Melitos (DM) é uma doença complexa, endócrina e difusa caracterizada pela

elevação da glicemia. Uma das complicações recentemente apontada é a infertilidade,

sendo esta caracteriza pela redução dos níveis de testosterona e alterações no epitélio

germinativo dos túbulos seminíferos. O extrato de Allium cepa L. (cebola) já vem sendo

apontado como hipoglicemiante e antilipêmico. O aminoácido extraído deste extrato,

denominado S-metilcisteína, apresenta resultados ainda mais positivos em estudos

diversos. A aquisição de novas terapias que possam auxiliar no tratamento da diabetes é

de extrema importância, pois representa um impacto direto no bem-estar da sociedade.

Assim, este trabalho visou investigar os aspectos bioquímicos, morfofuncionais e

morfométricos do tecido testicular de ratos diabéticos, induzidos por estreptozotocina,

tratados com extrato de A. cepa L. e com o aminoácido S-metilcisteína. Foram utilizados

ratos Wistar, machos (45 dias), pesando de 200-250g, divididos em quatro grupos:

controle normoglicêmico, diabético sem tratamento, diabético tratados com o extrato de

A. cepa L. (400 mg/kg) e diabético tratado com o aminoácido S-metilcisteína (200

mg/kg). O DM foi induzido por estreptozotocina (40 mg/kg via intraperitoneal) e o

tratamento foi realizado por gavagem diariamente por um período de 4 semanas. Após a

eutanásia, os testículos foram coletados para análise histológica da integridade do tecido

(Hematoxilina e Eosina), morfometria (azul de toluidina) e imunohistoquímica para

receptores de testosterona. Ambos os tratamentos foram capazes de reduzir a glicemia

dos animais, porém não foram capazes de interferir em parâmetros biométricos.

Morfometricamente, ambos os tratamentos foram capazes de melhorar o tecido testicular,

elevando a altura do epitélio e diâmetro dos túbulos seminíferos. Porém, os tratamentos

não foram capazes de interferir nos componentes intertubulares. As analises morfológicas

do tecido demonstraram uma melhora visível para ambos os tratamentos e, a

imunohistoquímica apresentou uma melhora na apresentação de receptores para

testosterona para ambos os tratamentos, principalmente para o extrato. O extrato da

cebola apresentou resultados positivos como forma de terapia, principalmente na

disponibilidade de receptores para testosterona. O aminoácido isolado foi capaz de

apresentar resultados ainda melhores de forma generalizada na melhora da integridade do

tecido testicular.

Palavras-chave: Diabetes mellitus, Extrato de cebola, Morfofisiologia testicular,

Imunohistoquímica

ABSTRACT

Diabetes Melitos (DM) is a complex, endocrine and diffuse disease characterized by

elevated glycemia. One of the recently reported complications is infertility, which is

characterized by reduced testosterone levels and changes in the germinal epithelium of

the seminiferous tubules. The extract of Allium cepa L. (onion) has already been reported

as hypoglycemic and antilipemic. The amino acid extracted from this extract, called S-

methylcysteine, presents even more positive results in several studies. The acquisition of

new therapies that may aid in the treatment of diabetes is extremely important, since it

has a direct impact on the well-being of society. This work aimed to investigate the

biochemical, morphofunctional and morphometric aspects of the testicular tissue of

diabetic rats, induced by streptozotocin, treated with extract of A. cepa L. and with the

amino acid S-methylcysteine. Male Wistar rats (45 days) weighing 200-250 g were

divided into four groups: normoglycemic control, diabetic without treatment, diabetic

treated with the extract of A. cepa L. (400 mg / kg) and diabetic treated with the amino

acid S-methylcysteine (200 mg / kg). DM was induced by streptozotocin (40 mg / kg

intraperitoneally) and the treatment was performed by gavage daily for a period of 4

weeks. After euthanasia, the testes were collected for histological analysis of tissue

integrity (Hematoxylin and Eosin), morphometry (toluidine blue) and

immunohistochemistry for testosterone receptors. Both treatments were able to reduce

the glycemia of the animals, but were not able to interfere in biometric parameters.

Morphometrically, both treatments were able to improve the testicular tissue, raising the

height of the epithelium and diameter of the seminiferous tubules. However, the

treatments were not able to interfere with the intertubular components. The morphological

analyzes of the tissue showed a visible improvement for both treatments, and the

immunohistochemistry presented an improvement in the presentation of receptors for

testosterone for both treatments, mainly for the extract. The onion extract presented

positive results as a form of therapy, mainly on the availability of receptors for

testosterone. The isolated amino acid was able to present even better results in a

generalized way in the improvement of the integrity of the testicular tissue.

Key words: Diabetes mellitus, Onion extract, Testicular morphophysiology,

Immunohistochemistry

14

1. INTRODUÇÃO

O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença crônica associada a problemas com a

produção, secreção ou utilização de insulina e, sendo este o hormônio responsável por

regular a glicemia, o indivíduo apresenta altas concentrações de glicose circulante

(BURUL-BOZKURT et al., 2010). Indivíduos que vivem com esta doença tendem a

apresentar maiores riscos de morbidade e mortalidade quando comparados com a

população saudável em geral, apresentando uma menor expectativa de vida quando

comparado a indivíduos saudáveis (OGURTSOVA et al., 2017).

A estimativa de pessoas convivendo com a diabetes tem aumentado

drasticamente, elevando-se de 30 milhões em 1964 para mais de 422 milhões em 2014 e,

acompanhando esta progressão, acredita-se que em 2040 este número seja de

aproximadamente 642 milhões (OGURTSOVA et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2017;

WHO, 2016). O Brasil atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior

prevalência de indivíduos com diabetes, apresentando cerca de 14,3 milhões de pessoas

afetadas, com idades variando entre 20 e 79 anos (OLIVEIRA et al., 2017).

A elevação da glicemia, característica marcante do DM, pode levar ao

desenvolvimento de complicações sistêmicas que incluem cetoacidose, nefropatia,

retinopatia, neuropatia, problemas circulatórios e infertilidade (SCHOELLER et al.,

2012; VAN BELLE et al., 2011). Em portadores do sexo masculino, o DM está envolvida

na redução dos níveis de testosterona, alterações na espermatogênese, alterações na

contagem e mobilidade de espermatozoides e destruição de células de Leydig

(BACCETTI et al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018; KOH, 2007).

Como forma de atenuar os sinais e sintomas de diversas doenças, a população

mundial sempre fez uso de diversos artifícios mais acessíveis como forma de terapia e

tratamento. A utilização de fitoterápicos é algo que já vem sendo utilizado a vários anos

como modo alternativo de tratamento para diversas doenças. Já se sabe que o extrato

obtido da cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia, assim como atenuar o estresse

oxidativo em distúrbio metabólicos relacionados a diabetes (SEETUR R. PRADEEP e

SRINIVASAN 2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017). A aplicação de recursos

para descoberta de novas terapias para tratar a diabetes de modo mais acessível e barato

15

pode auxiliar na redução dos danos causados por esta doença ou até mesmo impedi-los

de acometer os órgãos e sistemas.

Além da utilização dos fitoterápicos, a extração e purificação de componentes

presentes em plantas são necessárias para se entender como os fitoterápicos funcionam

ou se há modos de potencializar o seu funcionamento. S-metilcisteína (SMC) é um

aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do gênero Allium, como alho e

cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram que o SMC apresenta uma

atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011), assim como antidiabéticas

(KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI e AUGUSTI 2002). Porém, não

existem estudos voltados para avaliação da aplicação da S-metilcisteína como tratamento

para os danos causados pelo DM no tecido testicular.

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Verificar a ação do extrato da cebola Allium cepa L. e do aminoácido isolado S-

metilcisteína na prevenção às alterações morfológicas testiculares de ratos diabéticos

induzidos por estreptozotocina.

2.2. Específicos

• Avaliar se houve controle glicêmico relacionado aos tratamentos;

• Avaliar o consumo de insumos pelos animais dos grupos;

• Avaliar parâmetros biométricos como peso corporal, testicular, túnica

albugínea e parênquima testicular;

• Determinar a proporção dos componentes dos túbulos seminíferos e

intertúbulo;

• Obter os índices gonadossomático (IGS), parenquimossomático (IPS),

tubulossomático (ITS), Leydigossomático (ILS);

• Avaliar alterações no comprimento dos túbulos seminíferos por testículo e por

grama de testículo;

16

• Avaliar alterações na altura do epitélio seminífero e o diâmetro dos túbulos

seminíferos;

• Realizar a morfometria das células de Leydig;

• Realizar avaliação histopatológica da integridade do tecido testicular dos

grupos;

• Avaliar por imunohistoquímica a disponibilidade de receptores para

testosterona presentes no tecido testicular entre os grupos.

3. REFERENCIAL TEÓRICO

3.1. Diabetes melitos

O Diabetes mellitus (DM) é um distúrbio metabólico associado a diversas

complicações funcionais e estruturais severas em vários órgãos e sistemas (SADIK, El-

SEWEIDY e SHAKER 2011). Acometendo 8,8% da população mundial (GOBBO et al.,

2015; OGURTSOVA et al., 2017), este distúrbio é caracterizado pela elevação da

concentração de glicose presente na circulação sanguínea (MALANDRINO e SMITH,

2011), um efeito que pode estar associado tanto as alterações na secreção e produção,

assim como na sensibilidade de receptores celulares à insulina (AMERICAN DIABETES

ASSOCIATION, 2010; FALLAH et al., 2017).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) destacou em 2015 que o DM é uma

doença crônica, séria e complexa. Ela pode ocorrer quando o pâncreas não produz insulina

suficiente ou quando o corpo não consegue utilizar a insulina produzida de modo

adequado (WHO, 2016). Nos últimos anos, o número de pessoas com diabetes, assim

como a prevalência dessa síndrome têm aumentado significativamente. Dados de 1980

indicavam que 108 milhões de pessoas viviam com o DM, e esse número subiu para 422

milhões no ano de 2014 (WHO, 2016).

O Brasil atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior prevalência

de indivíduos que sofrem com algum tipo de DM, apresentando, em 2015 cerca de 14,3

milhões de pessoas, com idades variando entre 20 e 79 anos convivendo com esta doença,

perdendo apenas para os Estados Unidos da América (29,3 milhões), Índia (69,2 milhões)

e China (109,6 milhões) (OLIVEIRA et al., 2017). Estes números podem subir

drasticamente até 2040, chegando a 23,3 milhões de indivíduos no Brasil (MILECH et

17

al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017). Essa elevação nos casos de DM está diretamente

relacionada ao aumento da expectativa de vida e do crescimento populacional

(OLIVEIRA et al., 2017). O DM pode ser separado de acordo com sua causa em diversos

tipos, sendo os dois principais o Tipo 1 e o Tipo 2 (OLIVEIRA et al., 2017).

O DM Tipo 1 (DM1) é caracterizado pela destruição das células beta-pancreáticas

que leva à uma deficiência na secreção de insulina para o organismo. Um indivíduo com

DM-1 necessita da utilização de insulina exógena, já que o seu corpo é incapaz de

produzi-la; ou a insulina produzida é insuficiente ou incapaz de realizar sua função

(OLIVEIRA et al., 2017). Essa forma está comumente associada a doenças autoimunes,

alterações em diversos genes ou causas idiopáticas, com sinais e sintomas se

apresentando-se usualmente nos estágios iniciais da vida (OLIVEIRA et al., 2017). O

DM-1 representa 5-10% dos casos de DM no mundo (MILECH et al., 2016).

O DM Tipo 2 (DM2) é caracterizado por defeitos na ação e/ou secreção da insulina

e na regulação da produção hepática de glicose (MILECH et al., 2016). Trata-se de uma

doença poligênica, com forte herança familiar, ainda não completamente esclarecida,

porém comumente associada a outras doenças e estilo de vida como obesidade e

sedentarismo (OLIVEIRA et al., 2017). Com isso, seus sinais e sintomas tendem a

aparecer após os 40 anos de idade, mas não se limitam apenas a este período. Pacientes

com DM-2 não necessitam de insulina como terapia, comumente fazem uso de

hipoglicemiantes orais, porém, com o agravamento da doença, pode-se chegar a

necessidade de uma terapia com insulina. Este tipo de DM pode representar mais de 90%

dos casos totais da doença no mundo (MILECH et al., 2016; SACHDEVA e STOFFERS,

2009).

Estudos realizados em animais indicam que as altas concentrações de glicose por

um tempo prolongado podem resultar em danos intra e extracelulares devido ao

desbalanço entre fatores pro e anti-oxidantes (HRUDA et al., 2010). O processo de

oxidação e produção de radicais livres são comuns dentro do metabolismo de um

organismo normal. Porém, altas concentrações de radicais livres podem iniciar um

processo de peroxidação lipídica, assim como danos a moléculas importantes como

proteínas, carboidratos e o próprio DNA (KUMARI e AUGUSTI, 2002).

Estudos demonstram que existe uma correlação entre a elevação da glicemia,

concentração de insulina circulante e o estresse oxidativo em indivíduos diabéticos

(GOBBO et al., 2015; KUMARI e AUGUSTI, 2002; WANG et al., 2013). Já foi

18

demonstrado que a glicose pode sofrer oxidação na corrente sanguínea quando catalisada

por metais, gerando radicais livres, peróxido de hidrogênio e cetoaldeída reativos (HUNT

et al., 1988).

Este estresse oxidativo desencadeia uma série de alterações em diversas vias de

sinalização celular, levando a modificações intracelulares, que acabam por causar

manifestações de cunho micro e macrovascular (BODEN, 2011; EVANS et al., 2002;

MUNUSAMY e MACMILLAN-CROW, 2009). Em decorrência destes aspectos, o DM

acaba por estar associada a diversas complicações sistêmicas como retinopatia,

nefropatia, neuropatia, doenças coronárias, doenças associadas ao sistema nervoso e até

mesmo infertilidade (ABD El-TWAB et al., 2016; VAN BELLE et al., 2011).

Devido ao surgimento progressivo de tais complicações, o DM promove a

redução na qualidade de vida, assim como maiores riscos de morbidade e mortalidade

quando comparados com a população em geral (OGURTSOVA et al., 2017). De modo

crescente, até mesmo um DM com bom acompanhamento demonstra danos nos órgãos

periféricos (SCHOELLER et al., 2012). Por estes motivos, o DM necessita de um

diagnóstico precoce, associado a um tratamento adequado e modificações no estilo de

vida (AMORIM et al., 2011; FALLAH et al., 2017).

3.2. Morfologia testicular

O testículo é a gônada masculina responsável pela produção dos espermatozoides

(gameta masculino) (DOHLE et al., 2012). São encontrados em pares, protegidos por uma

bolsa composta de diversas camadas de tecido conjuntivo e epitelial, denominada de

escroto (BART, 1831). Além de apresentar uma função reprodutiva, o testículo também

é considerado uma glândula endócrina responsável pela produção e liberação de

testosterona (CORONA et al., 2011; PITTELOUD et al., 2005). Este hormônio é

responsável por estimular a produção dos espermatozoides, assim como o

desenvolvimento de características sexuais secundárias (CORONA et al., 2011;

DHINDSA et al., 2004; PITTELOUD et al., 2005; RATO et al., 2012, 2014).

A regulação da produção deste hormônio está diretamente ligada à secreção do

hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-estimulante (FSH) pela adenohipófise

(SCHOELLER et al., 2012) que, por sua vez, é regulada pela secreção de GnRH pelo

hipotálamo, formando um eixo denominado de eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Em um

19

organismo funcionalmente normal, o hipotálamo libera GnRH , estimulando a secreção

de LH e FSH pela adenohipofise. O LH irá agir nas células de Sertoli e o FSH irá agir nas

células de Leydig, respectivamente, estimulando a espermatogênese. Em um indivíduo

diabético, este eixo se encontra desbalanceado, resultando em alterações na

espermatogênese e infertilidade ou subfertilidade (SCHOELLER et al., 2012). Este pode

ser um dos caminhos por onde a diabetes pode afetar a atividade do tecido testicular, além

do dano testicular direto associado ao estresse oxidativo.

A estrutura testicular é relativamente conservada dentre as espécies e pode ser

dividida em dois compartimentos: germinativo (tubular) e intersticial (DE SIQUEIRA-

SILVA et al., 2018). Estes compartimentos são separados por uma membrana basal e

conjuntos destes dois componentes são separados em lóbulos por uma capa de tecido

conjuntivo denso que circunda todo o testículo e adentra o mesmo, chamada de túnica

albugínea (DE SIQUEIRA-SILVA et al., 2018). No compartimento germinativo é onde

estão localizados os túbulos seminíferos, estruturas responsáveis por produzir os

espermatozoides (BROWN-PETERSON et al., 2002; DE SIQUEIRA-SILVA et al.,

2018; GRIER et al., 2016).

As células da linhagem espermatogênica ficam alojadas dentro destes túbulos,

sendo protegidas, agrupadas, organizadas e estimuladas por células de sustentação

denominadas de células de Sertoli (SCHULZ et al., 2010). No compartimento intersticial

podemos encontrar células de Leydig (responsáveis pela produção de testosterona),

células mióides peritubulares (responsáveis pela contração dos túbulos seminíferos para

auxiliar na expulsão e liberação dos espermatozoides), vasos sanguíneos, nervos, células

do tecido conjuntivo e espaço linfático (CHAVES-POZO et al., 2018; Lo NOSTRO et

al., 2004; NÓBREGA et al., 2009; SCHULZ et al., 2010).

3.3. Danos testiculares causados pelo DM

Diversos modelos de animais diabéticos, assim como em pacientes humanos

demonstram distúrbios relacionados a espermatogênese e/ou fertilidade associados ao

desenvolvimento do DM (SCHOELLER et al., 2012). O DM induz alterações intra e

extracelulares no testículo, causando apoptose das células germinativas, alterações na

produção e liberação da testosterona, o que acaba resultando em subfertilidade ou

infertilidade (KILARKAJE et al., 2014).

20

Os efeitos mais comuns da diabetes ao sistema reprodutor masculino incluem

redução dos níveis de testosterona, redução do peso testicular, alterações na

espermatogênese, alterações na contagem e mobilidade de espermatozoides, destruição

de células de Leydig e alterações teciduais dos componentes testiculares (BACCETTI et

al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018; KOH, 2007). Mesmo conhecendo todos estes

efeitos, ainda não se sabe se estes danos estão diretamente relacionados a hiperglicemia

local ou a alterações hormonais que afetam o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal

(SCHOELLER et al., 2012). Porém, atualmente já é conhecido o fato de que tanto os

testículos quanto os espermatozoides produzem insulina e que a sua expressão encontra-

se reduzida em modelos diabéticos induzidos por estreptozotocina (GÓMEZ et al., 2009;

SCHOELLER et al., 2012).

O avançar do tempo faz com que indivíduos portadores do DM tendam a

desenvolver infertilidade causada por danos testiculares associados a esta síndrome. Isso

pode ocorrer devido ao aumento de radicais livres que são produzidos normalmente

dentro das células, gerando o estresse oxidativo (KILARKAJE et al., 2014). Associado a

isso, a membrana das células germinativas, rica em ácidos graxos poli-insaturados pode

reagir com esses radicais livres que se encontram em concentrações elevadas, causando

o dano no epitélio germinativo (HENKEL R., 2005; SANOCKA e KURPISZ, 2004).

Ademais, no espermatozoide de um indivíduo diabético, a hiperglicemia estimula genes

relacionados à sinalização intracelular, estrutura e movimentação de espermatozoides,

funções de citocinas, estresse oxidativo e pro-oncogenes (KILARKAJE et al., 2014).

Levando-se em consideração, todos os danos que o DM desencadeia, não apenas

no tecido testicular como também no organismo de modo sistêmico, torna-se importante

a aquisição de novas terapias ou terapias combinadas com a insulina. Isto porque a

obtenção de novas formas de tratamento de baixo custo e alta acessibilidade para estas

alterações pode auxiliar na redução dos danos gerados pelo DM, sejam eles gerados

diretamente pela hiperglicemia causada pelo DM ou por danos secundários a órgãos e

sistemas corporais.

3.4. Allium cepa L.

Plantas medicinais vem sendo utilizada como uma forma de tratamento alternativo

e seguro para diversos tipos de doenças. Plantas sempre foram bons exemplares de fontes

medicamentosas e funciona como fonte de diversos medicamentos, seja de forma direta

21

ou indireta (PATIL et al., 2011). A cebola (Allium cepa L.) é um membro da família

Liliaceae, que contempla mais de 250 gêneros e 3700 espécies. Esta vem sendo utilizada

durante muito tempo na medicina tradicional, assim como amplamente utilizada na dieta

(FALLAH et al., 2017). O extrato desta planta tem demonstrado efeitos antidiabético,

antioxidante, anti-hipertensivo, hipoglicêmico, dentre outros (SHENOY et al., 2009).

Foi demonstrada que a cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia associada a

distúrbios metabólicos e estresse oxidativo no tecido hepático e cardíaco de ratos

diabéticos induzidos por estreptozotocina (SEETUR R. PRADEEP e SRINIVASAN

2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017). Ela é rica em dois compostos, onde um

deles já foi apontado como benéfico para a saúde humana: sulfóxidos alquil cisteína

(ACSOs) e flavonoides (PARK, KIM, e KIM 2007). ACSOs estão associados ao sabor e

odor característico apresentado pelas cebolas (GRIFFITHS et al. 2002), porém eles não

são conhecidos por apresentarem nenhum efeito, seja ele benéfico ou maléfico, à saúde.

Os flavonoides são responsáveis pela coloração amarelada do interior, e o exterior

amarronzado, de diversos tipos de cebola (FOSSEN, PEDERSEN, e ANDERSEN 1998).

Dentro do Reino Vegetal, os flavonoides são compostos polifenóis amplamente

distribuídos, composto de aproximadamente 600 membros diferindo entre si em quesitos

como características e estruturas (COOK e SAMMAN, 1996; WANG et al., 2014). Estes

compostos são metabólitos não-energéticos e não-nutritivos presentes em plantas como a

cebola, mirtilo, salsa e banana, e não podem ser produzidos por seres humanos (BRAVO,

1998). Seu efeito antioxidante está associado a redução da concentrações de radicais

livres excedentes responsáveis por causar desbalanço no equilíbrio anti e pro-oxidante,

gerando o estresse oxidativo em tecidos vivos (SULERIA et al. 2015).

De modo geral, os flavonoides exibem diversos efeitos biológicos, como

antibacteriano, antiviral, anti-inflamatório, antialérgico e ação vasodilatadora (E Jr and

KANDASWAMI, 1994; HANASAKI et al., 1994; HOPE et al., 1983). Estes também

inibem a peroxidação lipídica, agressão plaquetária, permeabilidade e fragilidade capilar,

assim como a atividade de enzimas como ciclo-oxigenase e lipoxigenase, que são enzimas

associadas ao processo inflamatório (E Jr e KANDASWAMI, 1994; HODNICK et al.,

1988; HOPE et al., 1983; ROBAK et al., 1988; WINDHOLZ and BROWN, 1978).

Um dos principais exemplos de flavonoides presentes na cebola é a quercetina,

que já é bem conhecida por apresentar efeito antioxidante, reduzindo assim os efeitos

22

causados pela hiperglicemia (KANTER, AKTAS, e ERBOGA 2012). Esta também é

conhecida por reduzir a atividade carcinogênica de diversos alimentos mutagênicos

cozidos, inibir a atividade enzimática associada a vários tipos de células tumorais

(FOSSEN et al., 1998). A quercetina consegue remover espécies extremamente reativas,

como peroxinitrito e o radical hidroxil, que são de extrema importância para iniciar o

processo de estresse oxidativo (D’ANDREA, 2015). Seus efeitos benéficos são

apreciados mundialmente, sendo o seu isolado disponibilizada como suplemento diário

em doses que variam de 200 a 1200 mg diárias em alguns países (D’ANDREA, 2015).

Produtos naturais com efeitos antidiabéticos já vêm sendo apontados como

tratamentos em potencial por serem capazes de mimetizar as propriedades da insulina,

inibir a absorção intestinal de glicose ou processos metabólicos dependentes de insulina,

sendo até mesmo apontados como possíveis curas para o DM (ZAREI et al. 2015). A

cebola já é conhecida por apresentar efeitos que podem auxiliar na redução da glicemia,

agindo também na proteção contra danos causados pela diabetes, assim como podendo

auxiliar na regeneração tecidual de diversos tecidos e órgãos. Com isso, a aplicação de

fitoterápicos como alternativas mais simples e acessível para a sociedade como forma de

controlar e reduzir os danos gerados pela diabetes pode ser uma boa alternativa para

auxiliar na melhora da saúde do paciente.

3.5. S-Metilcisteína

Os estudos relacionados o DM buscam controlar a concentração de glicose

plasmática, lidar com o estresse oxidativo causado nos tecidos e normalizar alterações no

metabolismo de lipídeos (KILARKAJE et al., 2014). S-metilcisteína (SMC) é um

aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do gênero Allium, como alho e

cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram que o SMC já apresenta

uma atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011), assim como

antidiabéticas (KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI and AUGUSTI

2002) bem conhecida de modo sistêmico. Um estudo realizado por Hsu e colaboradores

(2004) demonstrou que uma dose diária de SMC na água por 4 semanas poderia reduzir

a hiperglicemia, hiperlipidemia, dano oxidativo e melhorar o balanço homeostático em

ratos diabéticos.

Uma dieta suplementada com SMC pode retardar a depleção da glutationa

reduzida (GSH), manter a atividade da glutationa peroxidase (GPx) e diminuir o dano

23

gerado por oxidação no sistema nervoso de ratos (CHEN et al. 2007). Isso demonstra que

já é conhecida a capacidade do SMC de reduzir o estresse oxidativo no sistema nervoso,

mas não limitado apenas a esse sistema. Assim como, a pré-ingestão de SMC retardou a

diminuição de dopamina e glutationa, mantendo a atividade de GPx e diminuindo a

concentração de citocinas proinflamatórias no sistema nervoso de camundongos (CHEN

et al., 2007).

O SMC consegue suprimir a ativação de MAPK e NF-κB, assim como aumenta a

taxa de sobrevivência de células PC12 tratadas com fator de crescimento de nervo

submetidas a condições de hipóxia (LIU, HSIA, e YIU 2014), demonstrando que o SMC

pode ter um papel importante na redução do estresse oxidativo tecidual, assim como

auxilia na proteção das células que constituem diversos tecidos. A utilização de SMC

pode ser positiva para diversos órgãos e sistemas, porém pouco se sabe os efeitos deste

aminoácido como forma de terapia para o dano que o DM causa em vários órgãos e

sistemas. Porém, não há trabalhos na literatura aplicando todos estes efeitos benéficos

que a SMC apresenta como uma forma de terapia para os danos que o DM causa no tecido

testicular.

Com isso, este trabalho está em busca de demonstrar a capacidade que o Allium

cepa L e o aminoácido isolado S-metilcisteína pode apresentar como uma forma de

impedir, reduzir ou melhorar as alterações morfológicas que o DM gera, sejam elas

gerados diretamente pela hiperglicemia causada pelo DM ou por danos secundários a

órgãos e sistemas corporais. Os resultados poderão sugerir a efetividade da utilização

deste aminoácido como uma terapia viável ao DM.

24

4. REFERÊNCIAS

ABD El-TWAB, S.M., MOHAMED, H.M., and MAHMOUD, A.M. (2016). Taurine and

pioglitazone attenuate diabetes-induced testicular damage by abrogation of oxidative

stress and up-regulation of the pituitary-gonadal axis. Can. J. Physiol. Pharmacol. 94,

651–661.

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION (2010). Diagnosis and Classification of

Diabetes Mellitus. Diabetes Care 33, S62–S69.

AMORIM, E.M.P., DAMASCENO, D.C., PEROBELLI, J.E., SPADOTTO, R.,

FERNANDEZ, C.D.B., VOLPATO, G.T., and KEMPINAS, W.D.G. (2011). Short- and

long-term reproductive effects of prenatal and lactational growth restriction caused by

maternal diabetes in male rats. Reprod. Biol. Endocrinol. RBE 9, 154.

BACCETTI, B., LA MARCA, A., PIOMBONI, P., CAPITANI, S., BRUNI, E.,

PETRAGLIA, F., and De LEO, V. (2002). Insulin-dependent diabetes in men is

associated with hypothalamo-pituitary derangement and with impairment in semen

quality. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 17, 2673–2677.

BART, A.C. (1831). Observations on the Structure and Diseases of the Testis. Medico-

Chir. Rev. 14, 1–32.

BODEN, G. (2011). Obesity, insulin resistance and free fatty acids. Curr. Opin.

Endocrinol. Diabetes Obes. 18, 139–143.

BRAVO, L. (1998). Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional

significance. Nutr. Rev. 56, 317–333.

BROWN-PETERSON, N.J., GRIER, H.J., and OVERSTREET, R.M. (2002). Annual

changes in germinal epithelium determine male reproductive classes of the cobia. J. Fish

Biol. 60, 178–202.

BURUL-BOZKURT, N., PEKINER, C., and KeELICEN, P. (2010). Diabetes alters

aromatase enzyme levels in gonadal tissues of rats. Naunyn. Schmiedebergs Arch.

Pharmacol. 382, 33–41.

25

CHAVES-POZO, E., GARCÍA-AYALA, A., and CABAS, I. (2018). Effects of Sex

Steroids on Fish Leukocytes. Biology 7.

CHEN, C., YIN, M., HSU, C., and LIU, T. (2007). Antioxidative and anti-inflammatory

effects of four cysteine-containing agents in striatum of MPTP-treated mice. Nutrition 23,

589–597.

COOK, N.C., and SAMMAN, S. (1996). Flavonoids—Chemistry, metabolism,

cardioprotective effects, and dietary sources. J. Nutr. Biochem. 7, 66–76.

CORONA, G., MONAMI, M., RASTRELLI, G., AVERSA, A., SFORZA, A., LENZI,

A., FORTI, G., MANNUCCI, E., and MAGGI, M. (2011). Type 2 diabetes mellitus and

testosterone: a meta-analysis study. Int. J. Androl. 34, 528–540.

COSTA, K.L.C., DA MATTA, S.L.P., DE LUCCA MOREIRA GOMES, M., DE

PAULA, T.A.R., DE FREITAS, K.M., DE ARAÚJO RESENDE CARVALHO, F., DE

ASSIS SILVEIRA, J., DOLDER, H., and CHAMINDRANI MENDIS-HANDAGama,

S.M.L. (2011). Histomorphometric evaluation of the neotropical brown brocket deer

Mazama gouazoubira testis, with an emphasis on cell population indexes of

spermatogenic yield. Anim. Reprod. Sci. 127, 202–212.

D’ANDREA, G. (2015). Quercetin: A flavonol with multifaceted therapeutic

applications? Fitoterapia 106, 256–271.

DE SIQUEIRA-SILVA, D.H., DA SILVA RODRIGUES, M., and NÓBREGA, R.H.

(2018). Testis structure, spermatogonial niche and Sertoli cell efficiency in Neotropical

fish. Gen. Comp. Endocrinol.

DHINDSA, S., PRABHAKAR, S., SETHI, M., BANDYOPADHYAY, A.,

CHAUDHURI, A., and DANDONA, P. (2004). Frequent occurrence of

hypogonadotropic hypogonadism in type 2 diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89,

5462–5468.

DIAS, F.A.L. (2018). EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA RAIZ DE PFAFFIA

GLOMERATA (SPRENG.) PEDERSEN INTERFERE EM PARÂMETROS

REPRODUTIVOS E FERTILIDADE DE CAMUNDONGOS MACHOS ADULTOS.

Universidade Federal de Viçosa (UFV).

26

DOHLE, G.R., ELZANATY, S., and VAN CASTEREN, N.J. (2012). Testicular biopsy:

clinical practice and interpretation. Asian J. Androl. 14, 88–93.

DORST VJ, S.H. (1974). Monotsh Ver Med. 29, No 29, 650-652.

E Jr, M., and KANDASWAMI, C. (1994). The impact of plant flavonoids on mammalian

biology: Implications for immunity, inflammation and cancer. In The Flavonoids:

Advances in Research since 1986, pp. 619–652.

EL-DEMERDASH, F.M., YOUSEF, M.I., and EL-NAGA, N.I.A. (2005). Biochemical

study on the hypoglycemic effects of onion and garlic in alloxan-induced diabetic rats.

Food Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 43, 57–63.

ERSOY, O., and KIZILAY, G. (2018). Effects of fucoidan on diabetic rat testicular tissue.

Biotech. Histochem. 0, 1–9.

EVANS, J.L., GOLDFINE, I.D., MADDUX, B.A., and GRODSKY, G.M. (2002).

Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2

diabetes. Endocr. Rev. 23, 599–622.

FALLAH, V., MAHABADI, J.A., MAHABADI, M.Y., KASHANI, H.H., and NIKZAD,

H. (2017). Protective Effect of Allium cepa (Onion) Seeds (AC) Extract on

Histopathology of Testis in STZ-Induced Male Rats. Int. J. Morphol. 35, 1517–1524.

FLORES, A., WIFF, R., and DÍAZ, E. (2015). Using the gonadosomatic index to estimate

the maturity ogive: application to Chilean hake (Merluccius gayi gayi). ICES J. Mar. Sci.

72, 508–514.

FOSSEN, T., PEDERSEN, A.T., and ANDERSEN, Ø.M. (1998). Flavonoids from red

onion (Allium cepa). Phytochemistry 47, 281–285.

GHANBARI, E., NEJATI, V., NAJAFI, G., KHAZAEI, M., and BABAEI, M. (2015).

Study on the effect of royal jelly on reproductive parameters in streptozotocin-induced

diabetic rats. Int. J. Fertil. Steril. 9, 113–120.

GOBBO, M.G., COSTA, C.F.P., SILVA, D.G.H., de ALMEIDA, E.A., and GOES, R.M.

(2015). Effect of Melatonin Intake on Oxidative Stress Biomarkers in Male Reproductive

Organs of Rats under Experimental Diabetes. Oxid. Med. Cell. Longev. 2015.

27

GÓMEZ, O., BALLESTER, B., ROMERO, A., ARNAL, E., ALMANSA, I.,

MIRANDA, M., MESONERO, J.E., and TERRADO, J. (2009). Expression and

regulation of insulin and the glucose transporter GLUT8 in the testes of diabetic rats.

Horm. Metab. Res. Horm. Stoffwechselforschung Horm. Metab. 41, 343–349.

GRIER, H.J., URIBE, M.C., Lo NOSTRO, F.L., MIMS, S.D., and PARENTI, L.R.

(2016). Conserved form and function of the germinal epithelium through 500 million

years of vertebrate evolution. J. Morphol. 277, 1014–1044.

GRIFFITHS, G., TRUEMAN, L., CROWTHER, T., THOMAS, B., and SMITH, B.

(2002). Onions--a global benefit to health. Phytother. Res. PTR 16, 603–615.

HANASAKI, Y., OGAWA, S., and Fukui, S. (1994). The correlation between active

oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids. Free Radic. Biol. Med. 16,

845–850.

HASIMUN, P., and SUKANDAR, E.Y. (2011). Synergistic Effect of Curcuminoid and

S-methyl Cysteine in Regulation of Cholesterol Homeostasis. Int. J. Pharmacol. 7 268–

272.

HENKEL R. (2005). The impact of oxidants on sperm function. Andrologia 37, 205–206.

HERR, R.R., EBLE, T.E., BERGY, M.E., and JAHNKE, H.K. (1959). Isolation and

characterization of streptozotocin. Antibiot. Annu. 7, 236–240.

HODNICK, W.F., MILOSAVLJEVIC, E.B., NELSON, J.H., and PARDINI, R.S. (1988).

Electrochemistry of flavonoids. Relationships between redox potentials, inhibition of

mitochondrial respiration, and production of oxygen radicals by flavonoids. Biochem.

Pharmacol. 37, 2607–2611.

HOPE, W.C., WELTON, A.F., FIEDLER-NAGY, C., BATULA-BERNARDO, C., and

COFFEY, J.W. (1983). In vitro inhibition of the biosynthesis of slow reacting substance

of anaphylaxis (SRS-A) and lipoxygenase activity by quercetin. Biochem. Pharmacol. 32,

367–371.

28

HRUDA, J., SRAMEK, V., and LEVERVE, X. (2010). High glucose increases

susceptibility to oxidative-stress-induced apoptosis and DNA damage in K-562 cells.

Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czechoslov. 154, 315–320.

HUNT, J.V., DEAN, R.T., and WOLFF, S.P. (1988). Hydroxyl radical production and

autoxidative glycosylation. Glucose autoxidation as the cause of protein damage in the

experimental glycation model of diabetes mellitus and ageing. Biochem. J. 256, 205–212.

ISMAIL, O., AYOOLA, J., OFFOR, U., OLWATOSIN, O., EDWIN, N., ANIEKAN, P.,

and ONYEMAECHI, A. (2018). Histo-morphological and seminal evaluation of

testicular parameters in diabetic rats under antiretroviral therapy: interactions with

Hypoxis hemerocallidea. Iran. J. Basic Med. Sci. 21, 1322–1330.

JOHNSEN, S.G. (1970). Testicular biopsy score count--a method for registration of

spermatogenesis in human testes: normal values and results in 335 hypogonadal males.

Hormones 1, 2–25.

JOHNSON, L., PETTY, C.S., and NEAVES, W.B. (1981). A new approach to

quantification of spermatogenesis and its application to germinal cell attrition during

human spermiogenesis. Biol. Reprod. 25, 217–226.

JONES, M.G., HUGHES, J., TREVOGA, A., MILNE, J., TOMSETT, A.B., and

COLLIN, H.A. (2004). Biosynthesis of the flavour precursors of onion and garlic. J. Exp.

Bot. 55, 1903–1918.

KANTER, M., AKTAS, C., and ERBOGA, M. (2012). Protective effects of quercetin

against apoptosis and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rat testis. Food

Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 50, 719–725.

KEYHANMANESH, R., HAMIDIAN, G., ALIPOUR, M.R., RaANJBAR, M., and

OGHBAEI, H. (2018). Protective effects of sodium nitrate against testicular apoptosis

and spermatogenesis impairments in streptozotocin-induced diabetic male rats. Life Sci.

211, 63–73.

KILARKAJE, N., AL-HUSSAINI, H., and AL-BADER, M.M. (2014). Diabetes-induced

DNA damage and apoptosis are associated with poly (ADP ribose) polymerase 1

inhibition in the rat testis. Eur. J. Pharmacol. 737, 29–40.

29

KOH, P.-O. (2007). Streptozotocin-induced diabetes increases apoptosis through JNK

phosphorylation and Bax activation in rat testes. J. Vet. Med. Sci. 69, 969–971.

KUMARI, K., and AUGUSTI, K.T. (2002). Antidiabetic and antioxidant effects of S-

methyl cysteine sulfoxide isolated from onions (Allium cepa Linn) as compared to

standard drugs in alloxan diabetic rats. Indian J. Exp. Biol. 40, 1005–1009.

KUMARI, K., MATHEW, B.C., and AUGUSTI, K.T. (1995). Antidiabetic and

hypolipidemic effects of S-methyl cysteine sulfoxide isolated from Allium cepa Linn.

Indian J. Biochem. Biophys. 32, 49–54.

LIU, C.-L., HSIA, T.-C., and YIN, M.-C. (2014). s-Methyl cysteine enhanced survival of

nerve growth factor differentiated PC12 cells under hypoxic conditions. Food Funct. 5,

1125–1133.

Lo NOSTRO, F.L., ANTONELI, F.N., QUAGIO-GRASSIOTTO, I., and Guerrero, G.A.

(2004). Testicular interstitial cells, and steroidogenic detection in the protogynous fish,

Synbranchus marmoratus (Teleostei, Synbranchidae). Tissue Cell 36, 221–231.

MALANDRINO, N., and SMITH, R.J. (2011). Personalized medicine in diabetes. Clin.

Chem. 57, 231–240.

MILECH, A., OLIVEIRA, J.E.P.D., and VENANCIO, S. (2016). Diretrizes da Sociedade

Brasileira de Diabetes 2015-2016.

MUNUSAMY, S., and MACMILLAN-CROW, L.A. (2009). Mitochondrial superoxide

plays a crucial role in the development of mitochondrial dysfunction during high glucose

exposure in rat renal proximal tubular cells. Free Radic. Biol. Med. 46, 1149–1157.

NISHIKAWA-OGAWA, M., WANIBUCHI, H., MORIMURA, K., KINOSHITA, A.,

NISHIKAWA, T., HAYASHI, S., YANO, Y., and FUKUSHIMA, S. (2006). N-

acetylcysteine and S-methylcysteine inhibit MeIQx rat hepatocarcinogenesis in the post-

initiation stage. Carcinogenesis 27, 982–988.

NÓBREGA, R.H., BATLOUNI, S.R., and FRANÇA, L.R. (2009). An overview of

functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation

in fish. Fish Physiol. Biochem. 35, 197–206.

30

OGURTSOVA, K., da ROCHA FERNANDES, J.D., HUANG, Y., LINNENKAMP, U.,

GUARIGUATA, L., CHO, N.H., CAVAN, D., SHAW, J.E., and MAKAROFF, L.E.

(2017). IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and

2040. Diabetes Res. Clin. Pract. 128, 40–50.

OLIVEIRA, J.E.P., JUNIOR, R.M.M., and VENCIO, S. (2017). Diretrizes da Sociedade

Brasileira de Diabetes 2017-2018.

PARK, J., KIM, J., and KIM, M.K. (2007). Onion flesh and onion peel enhance

antioxidant status in aged rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo) 53, 21–29.

PATIL, R., PATIL, R., AHIRWAR, B., and AHIRWAR, D. (2011). Current status of

Indian medicinal plants with antidiabetic potential: a review. Asian Pac. J. Trop. Biomed.

1, S291–S298.

PITTELOUD, N., HARDIN, M., DWYER, A.A., VALASSI, E., YIALAMAS, M.,

ELAHI, D., and Hayes, F.J. (2005). Increasing insulin resistance is associated with a

decrease in Leydig cell testosterone secretion in men. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90,

2636–2641.

PRADEEEP, S.R., and SRINIVASAN, K. (2017). Amelioration of hyperglycemia and

associated metabolic abnormalities by a combination of fenugreek (Trigonella foenum-

graecum) seeds and onion (Allium cepa) in experimental diabetes. J. Basic Clin. Physiol.

Pharmacol. 28, 493–505.

PRADEEP, S.R., and SRINIVASAN, K. (2017). Amelioration of oxidative stress by

dietary fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) seeds is potentiated by onion (Allium

cepa L.) in streptozotocin-induced diabetic rats. Appl. Physiol. Nutr. Metab. Physiol.

Appl. Nutr. Metab. 42, 816–828.

RATO, L., ALVES, M.G., SOCORRO, S., CARVALHO, R.A., CAVACO, J.E., and

OLIVEIRA, P.F. (2012). Metabolic modulation induced by oestradiol and DHT in

immature rat Sertoli cells cultured in vitro. Biosci. Rep. 32, 61–69.

RATO, L., ALVES, M.G., CAVACO, J.E., and OLIVEIRA, P.F. (2014). High-energy

diets: a threat for male fertility? Obes. Rev. Off. J. Int. Assoc. Study Obes. 15, 996–1007.

31

ROBAK, J., KORBUT, R., SHIRIDI, F., SWIES, J., and Rzadkowska-Bodalska, H.

(1988). On the mechanism of antiaggregatory effect of myricetin. Pol. J. Pharmacol.

Pharm. 40, 337–340.

SACHDEVA, M.M., and STOFFERS, D.A. (2009). Minireview: Meeting the demand

for insulin: molecular mechanisms of adaptive postnatal beta-cell mass expansion. Mol.

Endocrinol. Baltim. Md 23, 747–758.

SADIK, N.A.H., EL-SEWEIDY, M.M., and SHAKER, O.G. (2011). The antiapoptotic

effects of sulphurous mineral water and sodium hydrosulphide on diabetic rat testes. Cell.

Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 28, 887–898.

SANOCKA, D., and KURPISZ, M. (2004). Reactive oxygen species and sperm cells.

Reprod. Biol. Endocrinol. RBE 2, 12.

SCHOELLER, E.L., SCHON, S., and MOLEY, K.H. (2012). THE EFFECTS OF TYPE

1 DIABTES ON THE HYPOTHALAMIC, PITUITARY AND TESTES AXIS. Cell

Tissue Res. 349, 839–847.

SCHULZ, R.W., de FRANÇA, L.R., LAREYRE, J.-J., Le GAC, F., LeGAC, F.,

CHIARINI-GARCIA, H., NOBREGA, R.H., and MIURA, T. (2010). Spermatogenesis

in fish. Gen. Comp. Endocrinol. 165, 390–411.

SHENOY, C., B PATIL, M., KUMAR, R., and PATIL, S. (2009). Preliminary

phytochemical investigation and wound healing activity of Allium cepa Linn (Liliaceae).

Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 2.

SHOOREI, H., KHAKI, A., KHAKI, A.A., HEMMATI, A.A., MOGHIMIAN, M., and

SHOKOOHI, M. (2018). The ameliorative effect of carvacrol on oxidative stress and

germ cell apoptosis in testicular tissue of adult diabetic rats. Biomed. Pharmacother.

Biomedecine Pharmacother. 111, 568–578.

SILVA, N.A.A. da (1965). Efeito da suplementação com extrato alcoólico das diferentes

partes da melancia (Citrullus lanatus (THUNB.) MATSUM.& NAKAI.) e da L-citrulina

sobre os testículos de camundongos suíços adultos.

32

SULERIA, H.A.R., BUTT, M.S., ANJUM, F.M., SAEED, F., and KHALID, N. (2015).

Onion: Nature Protection Against Physiological Threats. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 55,

50–66.

TAKADA, J., MACHADO, M.A., PERES, S.B., BRITO, L.C., BORGES-SILVA, C.N.,

COSTA, C.E.M., FONSECA-ALANIZ, M.H., ANDREOTTI, S., and LIMA, F.B.

(2007). Neonatal streptozotocin-induced diabetes mellitus: a model of insulin resistance

associated with loss of adipose mass. Metabolism 56, 977–984.VAN BELLE, T.L.,

COPPIETERS, K.T., and VON HERRATH, M.G. (2011). Type 1 Diabetes: Etiology,

Immunology, and Therapeutic Strategies. Physiol. Rev. 91, 79–118.

WANG, L., GUO, L., ZHANG, L., ZHOU, Y., HE, Q., ZHANG, Z., and WANG, M.

(2013). Effects of glucose load and nateglinide intervention on endothelial function and

oxidative stress. J. Diabetes Res. 2013, 849295.

WANG, X., OUYANG, Y.Y., LIU, J., and ZHAO, G. (2014). Flavonoid intake and risk

of CVD: a systematic review and meta-analysis of prospective cohort studies. Br. J. Nutr.

111, 1–11.

WHO (2016). Global report on diabetes.

WINDHOLZ, M., and BROWN, H.D. (1978). “The Merck Index”: the merits of using

computers in publishing. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 18, 129–133.

YIGITTURK, G., ACARA, A.C., ERBAS, O., OLTULU, F., YAVASOGLU, N.U.K.,

UYSAL, A., and YAVASOGLU, A. (2017). The antioxidant role of agomelatine and

gallic acid on oxidative stress in STZ induced type I diabetic rat testes. Biomed.

Pharmacother. Biomedecine Pharmacother. 87, 240–246.

YIN, M., HSU, C., CHIANG, P., and WU, W. (2007). Antiinflammatory and

antifibrogenic effects of s-ethyl cysteine and s-methyl cysteine in the kidney of diabetic

mice. Mol. Nutr. Food Res. 51, 572–579.

ZAREI, A., VAEZI, G., MALEKIRAD, A.A., and ABDOLLAHI, M. (2015).

Hypoglycemic and hypolipidemic activities of Salvia hydrangea in streptozotocin-

induced diabetes in rats. Iran. J. Basic Med. Sci. 18, 417–422.

33

CAPÍTULO 1

Effects of extract Allium cepa L. (onion) and s-metilcystein in testicular morphology

of diabetic rats induced by estreptozotocin

ABSTRACT

Diabetes Melitos (DM) is a complex, endocrine and diffuse disease characterized by

elevated glycemia. One of the recently reported complications is infertility, which is

characterized by reduced testosterone levels and changes in the germinal epithelium of

the seminiferous tubules. The extract of Allium cepa L. (onion) has already been reported

as hypoglycemic and antilipemic. The amino acid extracted from this extract, called S-

methylcysteine, presents even more positive results in several studies. The acquisition of

new therapies that may aid in the treatment of diabetes is extremely important, since it

has a direct impact on the well-being of society. This work aimed to investigate the

biochemical, morphofunctional and morphometric aspects of the testicular tissue of

diabetic rats, induced by streptozotocin, treated with extract of A. cepa L. and with the

amino acid S-methylcysteine. Male Wistar rats (45 days) weighing 200-250 g were

divided into four groups: normoglycemic control, diabetic without treatment, diabetic

treated with the extract of A. cepa L. (400 mg / kg) and diabetic treated with the amino

acid S-methylcysteine (200 mg / kg). DM was induced by streptozotocin (40 mg / kg

intraperitoneally) and the treatment was performed by gavage daily for a period of 4

weeks. After euthanasia, the testes were collected for histological analysis of tissue

integrity (Hematoxylin and Eosin), morphometry (toluidine blue) and

immunohistochemistry for testosterone receptors. Both treatments were able to reduce

the glycemia of the animals, but were not able to interfere in biometric parameters.

Morphometrically, both treatments were able to improve the testicular tissue, raising the

height of the epithelium and diameter of the seminiferous tubules. However, the

treatments were not able to interfere with the intertubular components. The morphological

analyzes of the tissue showed a visible improvement for both treatments, and the

immunohistochemistry presented an improvement in the presentation of receptors for

testosterone for both treatments, mainly for the extract. The onion extract presented

positive results as a form of therapy, mainly on the availability of receptors for

testosterone. The isolated amino acid was able to present even better results in a

generalized way in the improvement of the integrity of the testicular tissue.

34

Key words: Diabetes mellitus, Onion extract, Testicular morphophysiology,

Immunohistochemistry

INTRODUÇÃO

O Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica associada a problemas com a

produção, secreção ou utilização de insulina e, sendo este o hormônio responsável por

regular a glicemia, o indivíduo apresenta altas concentrações de glicose circulante,

sintoma marcante em indivíduos diabéticos (BURUL-BOZKURT et al., 2010). Esta

elevação da glicemia pode levar ao desenvolvimento de complicações sistêmicas que

incluem cetoacidose, nefropatia, retinopatia, neuropatia, problemas circulatórios e

infertilidade (SCHOELLER et al., 2012; VAN BELLE et al., 2011).

Indivíduos que vivem com esta doença tendem a apresentar maiores riscos de

morbidade e mortalidade quando comparados com a população em geral (OGURTSOVA

et al., 2017). A estimativa de pessoas convivendo com a diabetes tem aumentado

drasticamente, elevando de 30 milhões em 1964 para mais de 422 milhões em 2014 e,

acompanhando esta progressão, acredita-se que em 2040 este número chegue a 642

milhões (OGURTSOVA et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2017; WHO, 2016). O Brasil

atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior prevalência de indivíduos

com diabetes, apresentando cerca de 14,3 milhões de pessoas afetadas, com idades

variando entre 20 e 79 anos (OLIVEIRA et al., 2017).

O sistema reprodutor masculino é um dos sistema acometidos pelos danos

causados pelo DM, chegando a 90% o número de indivíduos acometidos por algum

distúrbio na função sexual (ALVES et al., 2013). Os testículo são gônadas presentes em

mamíferos do sexo masculino, sendo responsáveis pela produção de espermatozoides,

assim como a produção e liberação de testosterona, o que faz desse órgão extremamente

importante para reprodução e aquisição das características sexuais secundárias

(CORONA et al., 2011; DOHLE et al., 2012; PITTELOUD et al., 2005).

Este órgão pode ser dividido histologicamente em dois compartimentos, sendo um

(germinativo) onde se alojam as células germinativas e células de Sertoli (células

somáticas responsáveis por sustentação) e outro (intersticial) onde se encontra o tecido

de sustentação responsável por diversas funções, como produção de testosterona e céulas

responsáveis por auxiliar na expulsão dos espermatozoides dos túbulos seminíferos

35

(CHAVES-POZO et al., 2018; Lo NOSTRO et al., 2004; NÓBREGA et al., 2009;

SCHULZ et al., 2010, 2010). O DM está envolvida na redução dos níveis de testosterona,

destruição das células de Leydig, alterações na espermatogênese e alterações na contagem

e mobilidade de espermatozoides (BACCETTI et al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018;

KOH, 2007).

A utilização de fitoterápicos é algo que já vem sendo aplicada a vários anos como

modo alternativo baratas e mais acessíveis de tratamento para diversas doenças. Já se sabe

que o extrato obtido da cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia, assim como atenuar o

estresse oxidativo em distúrbio metabólicos em estudos relacionados a diabetes

(SEETUR R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017).

A aplicação de recursos para descoberta de novas terapias para tratar a diabetes de modo

mais acessível e barato pode auxiliar na redução dos danos causados por esta doença ou

até mesmo impedi-los de acometer os sistemas.

Assim como o uso de fitoterápicos, a extração de componentes destes fitoterápicos

presentes em plantas e saber sua capacidade pode ser uma chave para entender como os

fitoterápicos funcionam ou se há modos de potencializar o seu funcionamento. S-

metilcisteína (SMC) é um aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do

gênero Allium, como alho e cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram

que o SMC apresenta uma atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011),

assim como antidiabéticas (KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI e

AUGUSTI 2002). Porém, não existem estudos voltados para compreender a aplicação da

S-metilcisteína como tratamento para os danos causados pelo DM no tecido testicular.

Este trabalho teve como objetivo avaliar os danos gerados pelo DM no tecido

testicular de ratos diabéticos. De mesmo modo, também avaliar a capacidade do extrato

de Allium cepa L. (cebola) e o aminoácido isolado S-metilcisteína em auxiliar na redução

destes danos e/ou prevenir que a diabetes venha a causar alterações no tecido testicular.

Além disso, comparar a efetividade de ambos estes tratamentos com o intuito de

determinar qual seria a terapia mais indicada para auxiliar na redução destes danos

gerados pelo DM.

36

MATERIAIS E MÉTODOS

Modelo experimental

Para avaliação dos efeitos do extrato da cebola Allium cepa L., assim como do

aminoácido isolado, foi utilizado um modelo experimental de ratos da linhagem Wistar

(Rattus norvegicus albinus) com o DM-1 induzido pela utilização de estreptozotocina

(STZ). A STZ é um componente extraído de uma bactéria gram-negativa Streptomyces

achromogenes, capaz de causar uma destruição parcial ou total das ilhotas pancreáticas,

o que causa alteração na produção da insulina (HERR et al., 1959) e leva ao

desenvolvimento de um quadro hiperglicêmico característico do DM-1.

Este conhecido modelo experimental é capaz de mimetizar os efeitos da diabetes

de modo sistêmico em animais (TAKADA et al., 2007). Partindo desse modelo, a partir

da obtenção dos ratos diabéticos, estes foram dividos em grupos e direcionados para seus

respectivos tratamentos com o extrato da cebola Allium cepa L. e um aminoácido isolado

presente na cebola (S-metilcisteína), para verificar seus efeitos nas alterações

morfológicas do tecido testicular dos ratos portadores de diabetes.

Obtenção e preparo extrato metanólico de Allium cepa L. e sulfóxido de s-

metil-cisteína

O preparo do extrato metanólico de Allium cepa L. foi realizado no Laboratório

de Pesquisa em Matéria Médica (LAPEMM) do Departamento de Medicamentos da

Faculdade de Farmácia da UFBA. As cebolas foram descascadas, cortadas e maceradas a

frio em 3 balões de 1000ml, permanecendo com álcool metílico 99,8% (CH3OH) por 7

dias. Após a filtragem, o extrato foi concentrado sob pressão reduzida em evaporador

rotatório. O processo foi repetido três vezes, chegando a exaustão. O extrato metanólico

após secagem na estufa, teve rendimento de 4,8% e foi mantido em -20°C até a utilização.

O SMCS, com 99% de pureza ( (R)-2-Amino-3-(methylmercapto) propionic acid,

SMLC) foi obtida comercialmente da Sigma-Aldrich®. O extrato de Allium cepa L. e o

SMCS utilizados nos tratamentos in vivo foram solubilizadas em solução salina estéril,

nas concentrações definidas para o experimento.

37

Desenho experimental

Foram utilizados 28 ratos machos da linhagem Wistar, com 45 dias de idade,

pesando cerca de 200-250g. Estes animais foram provenientes do estudo “Avaliação dos

efeitos do extrato Allium cepa L. e S-metilcisteína em ratos diabéticos induzidos por

estreptozotocina” aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais (CEUA), com

protocolo de número 012.018/2017. Os animais foram adquiridos do Biotério do Centro

de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN),

sendo divididos em 4 (quatro) grupos:

• C (animais normoglicêmicos), com tamanho amostra de n = 7;

• DM (animais diabéticos não tratados), com tamanho amostral de n = 7;

• DAC (animais diabéticos tratados com 400 mg/kg o extrato Allium cepa L.), com

tamanho amostral de n = 7;

• DSM (animais diabéticos tratados com 200 mg/kg o aminoácido S-metilcisteína),

com tamanho amostral de n = 7.

Os animais permaneceram alojados em caixas de polipropileno providas de

bebedouro e comedouro disponível ad libitum durante o período de ambientação de uma

semana. Após esse período de adaptação, os animais foram separados em grupos de 3

(três) animais e alocados em caixas (41 x 34 x 16 cm) já determinando quais seriam os

animais que passariam pelo processo de indução da diabetes e mantidos em condições

controladas de temperatura (24±2°C) e de iluminação (ciclo de 12/12 claro e escuro).

Protocolo experimental

Após um período de 14 horas de jejum, os animais dos grupos separados para

indução da diabetes receberam uma dose única de STZ (40 mg/kg) por via intraperitoneal,

dissolvida em 10 mmol/L de solução citrato de sódio (pH 4,5) (CHANDIRASEGARAN

et al., 2018). Após cinco dias da indução, a glicemia de todos os animais que passaram

pelo procedimento foi mensurada por meio de glicosímetro portátil (ONETOUCH,

Ultra®). Animais que apresentaram uma glicemia ≥250 mg/dl foram considerados aptos

a participarem da pesquisa por apresentarem perfil diabético e foram alocados nos grupos

DM, DAC e DSM, recebendo seus tratamentos respectivos.

38

Uma semana após a indução, foi iniciado o tratamento, que teve como duração 30

dias consecutivos, com o extrato Allium cepa L. na dose de 400 mg/kg (FALLAH et al.,

2017) para os animais do grupo DAC e s-metilcisteína na dose de 200 mg/kg (KUMARI

and AUGUSTI, 2002) para os animais do grupo DSM, diluídos em água destilada. Nos

animais dos grupos CT e DM solução salina foi administrados por gavagem. Após a

finalização dos 30 dias de tratamento, 24 horas depois do último tratamento, foi realizada

a eutanásia dos animais (Figura 1). Os animais foram anestesiados e eutanasiados com

isoflurano inalatório e posteriormente foi realizada a coleta de sangue por punção cardíaca

e remoção de ambos os testículos para posterior processamento histoquímico e de

imunomarcações.

Figura 1. Protocolo experimental da indução do DM-1, tratamentos realizados, e

eutanásia para remoção das amostras de órgãos em Ratos Wistar. Os valores entre

parênteses representam a dosagem administrada (i.p. = via intraperitoneal; v.o. = via oral).

Avaliação de consumo de água e ração

Foi realizada a medição do consumo de água e ração diários durante o período

experimental de 30 dias para cada caixa. A ração foi pesada em balança (Marte – Marte

Científica e industrial Ltda - Brasil) a quantidade de ração restante na grade de

alimentação subtraído da quantidade que foi adicionada no dia anterior (250 g de ração

diárias). O consumo de água foi avaliado em proveta plástica a partir da medição do

volume restante de água nos recipientes subtraído do volume total de água que foi

adicionado nos recipientes no dia anterior (1000 mL de água diárias). A partir de uma

média de consumo dentro dos 30 dias do experimento, foi comparado o consumo destes

39

insumos para cada grupo experimental, com o intuito de averiguar se haveria ou não

alteração em seu consumo.

Análises de glicemia

Amostras de sangue de cada animal foram coletadas por punção cardíaca após a

eutanásia dos animais em frascos devidamente etiquetados e sem anticoagulante. Após a

formação do coágulo primário, o sangue foi centrifugado para aquisição do soro, material

utilizado para determinação da glicemia neste estudo. A partir do soro, foi realizada

análise da glicemia dos animais de todos os grupos utilizando-se kits LABTEST (Lagoa

Santa, Minas Gerais, Brasil), de acordo com a metodologia descrita pelo fabricante e

fazendo uso de um analisador bioquímico LABMAX PLENNO (Labtest, Lagoa Santa,

Minas Gerais, Brasil).

Biometria corporal e testicular

Antes da eutanásia dos animais, eles foram pesados individualmente em balança

de precisão (BEL Photonics do Brasil E. C. Ltda – Brasil). Este peso foi utilizado para

posterior comparação entre os grupos experimentais. Os testículos coletados após a

eutanásia foram pesados em balança de precisão (BEL Photonics do Brasil E. C. Ltda –

Brasil). Para determinar o peso do parênquima testicular, a membrana conjuntiva que

recobre o testículo (denominada albugínea), foi retirada e pesada. O valor correspondente

ao seu peso foi subtraído do peso total do testículo, que foi obtido anteriormente. Baseado

nos pesos corporal e testicular foi calculado o índice gonadossomático (IGS, em

porcentagem) a partir da divisão do peso testicular total pelo peso corporal, e multiplicado

por 100 (FLORES et al., 2015). O índice parenquimossomático (IPS, em porcentagem)

foi determinado pela divisão do peso do parênquima testicular pelo peso corporal, e

multiplicado por 100 (SILVA, 1965).

Técnicas Histológicas

Para realização das análises histológicas foram utilizados os 28 animais dos quatro

grupos experimentais. Os tecidos testiculares foram dissecados e fixados em solução de

paraformaldeído 4% por 24 horas. Após a fixação, foi coletado um fragmento do ápice

de um testículo, direito, de cada animal, que em seguida foi desidratado em seis banhos

de 30 minutos de álcool gradativamente mais concentrados (álcool 70%, 80%, 90%, 95%

40

e dois banhos em álcool absoluto). Após a desidratação, o material foi impregnado em

dois banhos de resina, sendo um overnight e um por duas horas. Após a impregnação, o

material foi incluído em historesina (Historesin, Leica Microsystems, Nussloch,

Germany) para posterior secção e alocação em lâminas de vidro para microscopia.

A historesina (monômero de glicolmetacrilato) foi preparada seguindo o protocolo

disponibilizado pelo fabricante, onde foi misturado 50 mL de resina básica a um ativador

(peróxido de benzoila) (sachê de 0,5g), agitando por 5 minutos ou até diluição completa.

Após a diluição, adicionou-se um endurecedor (derivado de ácido barbitúrico), na

proporção de 1 mL de endurecedor para cada 15 mL de resina. Com a resina pronta, pôde-

se realizar o emblocamento em placa de acrílico com o molde para o bloco, da seguinte

maneira: foi adicionado uma camada de resina no molde, e o material foi posicionado,

completando o resto do molde com a resina, e cobrindo o molde com Parafilm

(PARAFILM®, Chicago, EUA), isolando-o do contato com o ar. Ao final do processo, o

material foi armazenado em estufa overnight, sendo posteriormente removido do molde.

Após a remoção do material dos moldes de historesina, os blocos formados foram

microtomizados (RM 2255, Leica Biosystems, Nussloch, Germany) em secções

semisseriadas com espessura de 3 μm, respeitando uma espessura de 40 μm entre os

cortes. Foram feitas 2 lâminas por bloco, cada uma contendo 10 cortes. Uma das lâminas

foi corada em coloração de rotina de Hematoxilina e Eosina (HE) e outra corada em Azul

de toluidina. A preparação destas lâminas foi realizada em colaboração com o laboratório

de Biologia Celular e Estrutural da Universidade Federal de Viçosa (UFV) – MG.

Análise de dano tecidual

A coloração de HE foi utilizada para avaliar alterações teciduais, como

degeneração dos túbulos seminíferos, padrões inflamatórios, entre outras características

de lesão tecidual de modo qualitativo. Para a realização destas análises, foram utilizadas

imagens digitais obtidas em fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200)

equipado com câmera digital (Moticam 58D 5.0 MP).

A análise foi realizada de modo cego e semiquantitativo, identificando-se

alterações teciduais comuns no tecido, assim como a aquisição do Score de Johnsen

(JOHNSEN, 1970) e o Score de Johnsen alterado (DIAS et al., 2019). Segundo esta

classificação, quanto maior o escore entre os túbulos analisados, melhor e mais

41

organizado se encontra o tecido enquanto que, quanto menor o escore, mais alterado e

desorganizado se encontra o tecido. No escore alterado, se considera que no nível 1 os

túbulos estão normais, níveis 2 e 3 correspondem a alterações leves, níveis 4 e 5

apresentam alterações moderadas e, por fim, níveis 6, 7 e 8 correspondem a alterações

severas. Para a realização destes escores, foram necessárias a análise de 200 túbulos em

campos aleatórios (JOHNSEN, 1970) para cada animal dentro dos diferentes grupos.

Quadro 1 – Escore de Johnsen, para padrão histológico testicular (JOHNSEN, 1970).

Escore Nível de espermatogênese

1 Ausência de epitélio seminífero, esclerose tubular

2 Ausência de células germinativas, apenas células de Sertoli

3 Apenas espermatogônias

4 Alguns espermatócitos, espermatogênese estagnada no estágio de

espermatócitos primários

5 Vários espermatócitos

6 Algumas espermátides precoces, espermatogênese estagnada no estágio de

espermátide

7 Nenhuma espermátide tardia, várias espermátides precoces

8 Menos de cinco espermatozoides por túbulo

9 Espermatogênese levemente afetada

10 Espermatogênese completa

Quadro 2 – Escore de Johnsen alterado, para padrão histológico testicular (DIAS,

2018).

Escore Nível de espermatogênese

1 Túbulos íntegros, com células germinativas dispostas no seu sítio de

localização normal e poucos vacúolos

2 Espaços vacuolares na base do epitélio

3 Espaços vacuolares no ápice do epitélio

4 Espaços vacuolares na base e no ápice do epitélio

5 Células espermatogênicas no interior do lúmen e presença de células em

processo de degeneração visível

6 Túbulos contendo apenas células basais (espermatogônias e espermatócitos

primários)

42

7 Túbulos contendo apenas células de Sertoli

8 Túbulos seminíferos desprovidos de células de Sertoli ou germinativas

Análise Morfométrica

A coloração de azul de toluidina foi utilizada para realização da morfometria do

tecido testicular. Nessa análise foi avaliada a densidade percentual e total dos índices

tubulossomático e epiteliossomático, morfometria do túbulo seminífero, concentração

percentual e total de componentes do intertúbulo e parâmetros morfométricos das células

de Leydig. Para as análises morfométricas foram utilizadas imagens digitais obtidas em

fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200) equipado com câmera digital

(Moticam 58D 5.0 MP). Todas as imagens foram analisadas utilizando os softwares

Image J® (National Institute of Health, USA) e Image-Pro plus 5® (Media Cybernetics,

USA).

• Proporção volumétrica de túbulos seminíferos

Para a realização da proporção volumétrica de túbulos seminíferos foi realizada a

contagem de 266 pontos em 20 campos aleatórios, totalizando 5.320 pontos por animal.

O volume dos componentes testiculares (mL) foi estimado considerando o percentual

ocupado por cada constituinte multiplicado pelo peso do parênquima testicular. Levando

em consideração que a densidade do testículo de mamíferos é em torno de 1 g/cm3, a

massa do testículo foi considerada igual ao seu volume (COSTA et al., 2011; JOHNSON

et al., 1981).

• Índices tubulossomático e epiteliossomático

O índice tubulossomático (ITS) foi calculado a partir da divisão do volume de

túbulo seminífero pelo peso corporal x 100. O índice epiteliossomático (IES) foi obtido

pela divisão do volume do epitélio seminífero dividido pelo peso corporal multiplicado

por 100. Foram calculadas as áreas tubulares (ART), luminal (ARL) e epitelial (ARE), de

acordo com as fórmulas: ART= π*RT2, onde RT= raio tubular; ARL= π*RT2, onde RL=

raio luminal; ARE = ART – ARL e a Relação T/E= ART-ARE (DIAS et al., 2019).

• Diâmetro tubular médio e comprimento total dos túbulos seminiferos

O diâmetro tubular médio por animal foi obtido a partir da mensuração de 20

secções transversais de túbulos seminíferos que apresentavam contorno o mais circular

43

possível, sem considerar a fase do ciclo do epitélio seminífero, nem sua posição na

lâmina. Nestas mesmas secções, foi mensurada a altura do epitélio seminífero (média de

duas medidas diametralmente opostas). O comprimento total dos túbulos seminíferos

(CTS/t), em metros, foi estimado a partir do conhecimento do volume ocupado pelos

mesmos nos testículos e do diâmetro tubular médio obtido para cada animal a partir da

divisão do volume do túbulo seminífero (mL) pela área do túbulo seminífero (μm2)

(DIAS, 2018; DORST VJ, 1974). O comprimento total de túbulo por grama de testículo

foi calculado a partir da fórmula: CTS/g = Comprimento total de túbulos /Peso bruto dos

testículos (g).

• Proporção volumétrica do intertúbulo

Para realização da proporção volumétrica do intertúbulo foi realizada a contagem

de 266 pontos em 20 campos aleatórios, o que totalizou 5.320 pontos para cada animal.

O volume (mL) deste componente foi estimado a partir do percentual ocupado pelo

intertúbulo multiplicado pelo volume do parênquima testicular total. Para a aquisição das

proporções volumétricas (%) dos componentes do intertúbulo, foram contados 1.000

pontos projetados no espaço intertubular. Foram quantificados células de Leydig (núcleo

e citoplasma), macrófagos, vasos sanguíneos, espaço linfático e tecido conjuntivo. O

volume (mL) destes componentes foi calculado a partir da porcentagem de cada um

desses componentes/100, multiplicado pelo peso do parênquima de ambos os testículos.

• Parâmetros relacionados as células de Leydig

Para calcular parâmetros relacionados as células de Leydig, foram medidos 30

núcleos de contorno circular, cromatina perinuclear e nucléolo evidente destas células em

cada animal. Para calcular os volumes nuclear (VN), citoplasmático (VC) e das células

de Leydig (VL) foram utilizado as seguintes formulas expressas em μm3: VN = 4/3 πR3,

onde R = raio nuclear; VC=% de citoplasma*VN/% de núcleo; VL=VN+VC. O número

de células de Leydig por testículo (NLT) e por grama de testículo (NLGT) foram

utilizadas as seguintes fórmulas expressas em μm3: NLT=volume que as células de

Leydig ocupam por testículo/volume de uma célula de Leydig, NLGT=volume que a

célula de Leydig ocupa por grama de testículo/volume de uma célula de Leydig. Onde:

Volume que a células de Leydig ocupa por testículo = proporção da célula de Leydig no

testículo*peso do parênquima de um testículo/100, Volume que a célula de Leydig ocupa

44

por grama de testículo = volume que a célula de Leydig ocupa por testículo/peso bruto de

um testículo. Para a realização do índice Leydigossomático (ILS) foi calculado utilizando

fórmula: ILS=volume que a célula de Leydig ocupa nos testículos / PC x 100, onde

PC=peso corporal.

Técnicas de Imunohistoquímica

Para realização das análises imunohistoquímicas foram utilizados os animais que

apresentaram alterações significativas após análise das lâminas coradas em HE. Os

tecidos testiculares foram fixados em solução de paraformaldeído 4% por 24 horas. Após

a fixação, o material foi seccionado e alocado em cassetes, que em seguida foi desidratado

em seis banhos de 60 minutos de álcool gradativamente mais concentrados (álcool 70%,

80%, 90%, e três banhos em álcool absoluto).

Após a desidratação, o material foi impregnado em três banhos de 60 minutos em

xilol e mais três banhos de 60 minutos em parafina. Após a impregnação, o material foi

incluído em parafina (Parafina histológica, Dinâmica química contemporânea Ltda,

Brasil). Após a aquisição dos blocos, cortes foram realizados e colocados em lâminas

silanizadas para realização do processo de imunohistoquímica. As lâminas foram

desparafinizadas por um período de 24 horas em estufa, e em seguida foram direcionadas

para a marcação.

O procedimento foi iniciado a partir de dois banhos de xilol, durante 10 minutos,

para remoção da parafina restante. Em seguida as lâminas passaram por um processo de

reidratação em concentrações decrescentes de álcool (dois álcoois absolutos, 95%, 90%

e 80%), com duração de 3 minutos, cada. Em seguida, foi realizada uma lavagem com

água destilada e as lâminas foram colocadas em banho maria por 30 minutos. Após um

descanso de 20 minutos à temperatura ambiente, as lâminas passaram por dois processos

de inativação de peroxidase com peróxido de hidrogênio por 10 minutos cada, com uma

lavagem com água destilada após cada adição de peroxido de hidrogênio.

Posterior a esta inativação, foi realizado o bloqueio de background por 5 minutos,

seguida por quatro lavagens, sendo a primeira com água destilada e as três subsequentes

com tampão fosfato-salino (PBS). Em seguida, foram adicionados os anticorpos

primários específicos para cada marcação de receptor de testosterona. As lâminas foram

armazenadas em geladeira por 18 horas para que os anticorpos pudessem se ligar aos seus

45

epítopos específicos. Após este período, as lâminas foram lavadas com PBS para remoção

do excesso de anticorpos, sendo em seguida adicionado o anticorpo secundário por 15

minutos.

Em seguida, foi adicionado o conjugado com strept avidina HRP por 30 minutos

para amplificar o resultado da reação. Foram realizadas, posteriormente, duas lavagens

com PBS, sendo seguidas pela adição de diaminobenzidina 3,3’ (DAB) por 10 minutos.

Após uma lavagem com água destilada, foi realizada a contracoloração com hematoxilina

de Harris por 10 minutos. Finalizando a contracoloração, as lâminas foram lavadas,

desidratadas com álcool 95% (um banho) e absoluto (três banhos), três banhos de xilol e,

por fim foram montadas com lamínula e Entelan (Merck).

Para a realização desta análise, foram utilizadas imagens digitais obtidas em

fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200) equipado com câmera digital

(Moticam 58D 5.0 MP). As análises foram realizadas de modo cego e qualitativo,

comparando as marcações de cada grupo, avaliando a presença de células marcadas na

região intertubular e comparando a presença de células marcadas no epitélio dos túbulos

seminíferos.

Análise estatística

Para realização da determinação da normalidade da distribuição dos dados, foi

realizado o teste de Kolmogorov-smirnov no software Bioestat® 5.0 (Instituto Mamirauá,

Brasil). Após a determinação da normalidade dos dados, as análises estatísticas foram

realizadas pelo software GraphPad Prim 6® (GraphPad Software Inc., EUA), sendo

realizado o teste ANOVA one-way para comparar as diferenças entres os grupos. Na

presença de diferenças entre os grupos, comparações múltiplas post hoc foram conduzidas

através do teste de Sidak. Valores de P ≤ 0.05 foram considerados como estatisticamente

significativos, e os resultados foram expressos como a média ± o desvio padrão.

RESULTADOS

Glicemia e consumo de insumos

A partir da comparação da concentração de glicose circulante, foi possível notar

que os grupos diabéticos apresentavam uma glicemia superior, quando comparados com

o grupo controle (Tabela 1). Ambos os grupos tratados com o extrato da Allium cepa L e

46

S-metilcisteína apresentaram uma glicemia inferior ao grupo diabético sem tratamento.

O grupo tratado com a aminoácido S-metilcisteína apresentou uma glicemia inferior

quando comparado ao grupo tratado com A. cepa L. Com isso, é possível inferir que

ambos os tratamentos atuam reduzindo a glicemia dos ratos diabéticos, sendo o

tratamento com o aminoácido isolado mais eficiente (Tabela 1).

Acerca da comparação da média de consumo de água e ração pelos grupos, não

foram vistas diferenças estatísticas relevantes. O consumo de água foi semelhante entre

todos os grupos diabéticos, sendo quatro vezes mais elevado quando comparado ao grupo

controle. Já o consumo de ração foi elevado nos grupos diabéticos (sem e com

tratamento), quando comparado com o grupo controle não diabético (Tabela 1). O que

significa que ambos os tratamentos não foram capazes de conter tanto o consumo de água

e ração de animais diabéticos.

Tabela 1 – Valores de glicemia, consumo de água e consumo de ração dos grupos

experimentais.

CT DM DAC DSM

Glicemia (mg/dL) 121 ± 6.34 700 ± 36.95* 566 ± 35.27*# 513 ± 19.83*#+

Água (mL) 140 ± 5.00 557 ± 31.11* 500 ± 47.9* 559 ± 9.13*

Ração (g) 87 ± 3.9 111 ± 18* 94 ± 10.13* 110 ± 2.86*

Dados expressos como média ± DP.

*Diferença com o grupo controle.

#Diferença com o grupo DM.

+Diferença com o grupo DAC.

Parâmetros biométricos

A partir da comparação das médias de peso dos animais, foi visto que os animais

diabéticos apresentavam um peso inferior quando comparados ao grupo controle não

diabético. Ambos os grupos tratados também apresentavam um peso inferior ao grupo

diabético sem tratamento (Tabela 2). Quanto ao peso testicular, foi visto que os grupos

diabéticos apresentavam um peso inferior, quando comparados ao grupo controle não

diabético. Isso pode indicar nenhum dos tratamentos foi capaz de interferir na perda de

massa testicular. Porém, os grupos tratados não apresentavam diferença estatística entre

eles e nem quando comparados ao grupo diabético sem tratamento (Tabela 2).

47

Avaliando as médias dos pesos da túnica albugínea dos grupos experimentais, foi

possível observar que não havia diferença estatística entre os grupos. O que demonstrou

que a diabetes não interferiu relevantemente no peso desta membrana conjuntiva, assim

como ambos os tratamentos não foram capazes de modificar o peso desta túnica (Tabela

2). Quanto ao peso do parênquima testicular, foi possível observar que os grupos DM e

DAC apresentaram um peso inferior quando comparados ao grupo controle. Porém, o

grupo DSM não apresentou diferença estatística quando comparado a todos os grupos

experimentais, o que demonstra que o tratamento foi capaz de melhorar o peso do

parênquima, mas não de modo eficaz (Tabela 2).

O índice gonadossomático (IGS) dos grupos foi semelhante para todos, o que pode

estar ligado a perda de peso corporal e testicular equivalente entre os grupos. Como os

animais dos grupos diabéticos perderam peso, porém o testículo aumentou o peso, isso

leva a uma elevação no IGS. Nestes mesmos grupos não foi possível observar diferença

com relevância estatística entre os grupos controle e diabéticos (Tabela 2). Assim como

o IGS, o índice parenquimossomático (IPS) também demonstrou semelhança entre os

grupos experimentais, por motivos semelhantes aos observados no IGS (Tabela 2).

Tabela 2 – Parâmetros biométricos, corporal e testicular dos grupos experimentais.

CT DM DAC DSM

Peso corporal (g) 283 ± 39.84 226 ± 21.31* 184 ± 18*# 189 ± 2.65*#

Peso testicular (g) 1.63 ± 0.14 1.35 ± 0.20* 1.21 ± 0.13* 1.25 ± 0.19*

Peso albugínea (g) 0.33 ± 0.12 0.21 ± 0.14 0.23 ± 0.7 0.23 ± 0.9

Peso parênquima (g) 1.3 ± 0.17 1.14 ± 0.23 * 0.98 ± 0.16 * 1.02 ± 0.23

IGS (%) 1,15 ± 0.19 1,19 ± 0.13 1,31 ± 0.09 1,32 ± 0.20

IPS (%) 0.93 ± 0.21 0.96 ± 0.20 1.06 ± 0.14 1.04 ± 0.26

IGS - Índice gonadossomático; IPS – Índice parenquimossomático. Dados expressos como média ± DP.

*Diferença com o grupo controle.

#Diferença com o grupo DM.

Escore tecidual

A partir da realização do escore de Johnsen, que demonstra alterações na

organização tubular, assim como na espermatogênese, foi possível identificar que todos

os grupos diabéticos apresentavam um escore inferior quando comparados ao grupo

controle não diabético. Isso comprova que o DM pode estar interferindo no

48

desenvolvimento adequado da espermatogênese. Por outro lado, ambos os grupos tratados

apresentaram um escore superior ao grupo diabético não tratado, o que demonstra que os

tratamentos podem atenuar os danos morfológicos ou auxiliar no reparo do dano causado

pelo DM. Porém, não houve diferença estatisticamente relevante entre os tratamentos

(Tabela 3).

Assim como o escore de Johnsen, o escore modificado também apresentou

resultados que demonstraram que os túbulos de ratos diabéticos apresentam um escore

superior, quando comparados ao grupo controle não diabético. Isso demonstra, mais uma

vez, que a diabetes está causando alterações nos túbulos seminíferos. Da mesma forma,

os grupos tratados apresentaram um escore inferior, quando comparados com o grupo

diabético não tratado. Demonstrando, novamente, que os tratamentos podem estar

auxiliando na proteção ou reparo dos túbulos seminíferos. Porém, não houve diferença

estatisticamente relevante entre os tratamentos (Tabela 3).

Tabela 3 – Valores dos escore de Johnsen e escore de Johnsen modificado nos grupos

experimentais

CT DM DAC DSM

Escore de Johnsen 9.85 ± 0.1 6.36 ± 0.67* 8.49 ± 0.49*# 9.04 ± 0.43*#

Escore de Johnsen

modificado

1.15 ± 0.1 3.79 ± 0.4* 2.48 ± 0.41*# 2.10 ± 0.39*#

Dados expressos como média ± DP.

*Diferença com o grupo controle.

#Diferença com o grupo DM.

Morfometria testicular

A partir da análise qualitativa da densidade volumétrica percentual e total de

componentes tubulossomático e epiteliossomático, foi possível observar que o grupo

DAC apresentou um percentual tubular (T) superior, quando comparado ao grupo

controle. Quanto aos grupos DM e DSM, não houve diferença estatística entre estes

grupos e o grupo controle (Tabela 4). Porém, quando avaliado o volume tubular total

(VT), não foi possível observar esta elevação (Tabela 4). O que demonstra que os

tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.

Quanto ao volume percentual de epitélio (E), foi possível observar que o grupo

DM apresentou uma menor média, quando comparado ao grupo controle (Tabela 4). Os

grupos DAC e DSM apresentaram um volume percentual de epitélio seminífero superior

ao grupo DM, também não apresentando diferença estatística entre os mesmos e o grupo

49

controle (Tabela 4). Por outro lado, quando avaliado o volume epitelial total (VE), não

houve diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 4). O que demonstra

que os tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.

Comparando a densidade volumétrica percentual de túnica própria (TP), foi

possível observar que os grupo DM apresentou um espessamento desta túnica, por outro

lado, os grupos tratados DAC e DSM não apresentaram resultados estatisticamente

relevantes quando comparados ao grupo controle e DM (Tabela 4). Porém, quando

avaliado a densidade de volume da túnica própria total (VTP), não foi possível observar

diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 4). O que demonstra que os

tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.

Quando comparada as médias da densidade volumétrica percentual (L) e total

(VL) do lúmen dos grupos experimentais, não foi possível observar diferença estatística

relevante entre os grupos (Tabela 4). Avaliando os índices tubulossomático (ITS) e

epiteliossomático (IES), não foi possível observar diferença estatística entre os grupos

experimentais em ambos os índices (tabela 4). O que demonstra que os tratamentos não

foram capazes de interferir neste parâmetro.

Tabela 4 - Densidade volumétrica (%), volume (mL) dos componentes tubulares e

índices tubulossomático e epiteliossomático dos grupos experimentais.

CT DM DAC DSM

T (%) 92.68 ± 0.83 93.36 ± 1.42 94.50 ± 1.20* 94.42 ± 0.68

E (%) 59.11 ± 3.78 54.50 ± 0.89* 59.76 ± 2.33# 58.91 ± 2.59#

TP (%) 9.40 ± 0.46 10.03 ± 0.25* 9.93 ± 0.27 9.69 ± 0.24

L (%) 24.18 ± 3.71 28.83 ± 1.96 24.82 ± 1.99 27.49 ± 4.02

VT (mL) 2.41 ± 0.32 1.96 ± 0.43 1.85 ± 0.29 1.91 ± 0.44

VE (mL) 1.54 ± 0.20 1.15 ± 0.26 1.17 ± 0.18 1.20 ± 0.31

VTP (mL) 0.24 ± 0.03 0.21 ± 0.05 0.19 ± 0.03 0.20 ± 0.04

VL (mL) 0.63 ± 0.14 0.61 ± 0.14 0.49 ± 0.09 0.56 ± 0.17

ITS (%) 0.86 ± 0.20 0.90 ± 0.19 1.00 ± 0.13 0.98 ± 0.24

IES (%) 0.55 ± 0.12 0.52 ± 0.11 0.63 ± 0.08 0.62 ± 0.17

T– percentual de Túbulo seminífero; E - percentual de epitélio seminífero; TP – Percentual de Túnica Própria; L-

Percentual de Lúmen; VT – Volume de túbulo seminífero; VE – Volume de Epitélio; VTP – Volume de Túnica

Própria; VL – Volume de Lúmen; ITS – Índice Tubulossomático; IES – Índice Epiteliossomático. Dados expressos

como média ± DP. *Diferença com o grupo controle.

50

#Diferença com o grupo DM.

Analisando o diâmetro do túbulo seminífero (DT), foi possível observar que o

grupo DM apresenta um diâmetro inferior, quando comparado ao grupo controle (Tabela

5). O grupo DAC não apresentou diferença estatística relevante quando comparado aos

grupos experimentais (tabela 5). Por outro lado, o grupo DSM apresentou um diâmetro

superior, quando comparado aos grupos DM e DAC, porém não apresentou diferença

estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). Isso pode demonstrar uma

capacidade de prevenir a degradação do túbulo seminífero pelo aminoácido isolado.

Quando avaliada a altura do epitélio (AE), podemos observar que o grupo DM

apresentou uma altura inferior quando comparado a todos os grupos experimentais

(Tabela 5). Os grupos DAC e DSM apresentaram um epitélio mais alto quando

comparado ao grupo DM e não apresentaram diferença estatística quando comparado ao

grupo controle (Tabela 5). Resultado semelhante ao observado no diâmetro do lúmen

tubular (DL), onde o grupo DM apresentou um diâmetro superior aos outros grupos

experimentais e os grupos DAC e DSM não apresentaram diferença estatística com o

grupo controle (Tabela 5). O que demonstra que ambos os tratamentos são capazes de

conservar ou melhorar o epitélio do túbulo seminífero.

Avaliando o comprimento total do túbulo seminífero (CTS/s), este apresenta um

comprimento menor no grupo DSM, quando comparado ao grupo DM, porém não

apresenta diferença estatística quando comparado aos grupos experimentais (Tabela 5).

Os grupos controle, DM e DAC não apresentam diferença estatística relevante (Tabela

5). Também quando avaliado o comprimento total do túbulo seminífero por grama de

testículo, não é observada diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 5).

Calculando a área do túbulo seminífero, foi possível observar que o grupo DM

apresenta uma menor área, quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). O grupo

DSM apresenta uma área maior quando comparado ao grupo DM e DAC, também não

apresentando diferença estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). O

grupo DAC não apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo controle e

DM (Tabela 5). Quanto a área do lúmen, foi possível observar que o grupo DM apresentou

uma área maior do que os grupos controle, DAC e DSM (Tabela 5).

Quando avaliada a área do epitélio, pode ser observado que o grupo DM

apresentou uma área menor, quando comparado aos grupos controle, DAC e DSM

51

(Tabela 5). O grupo DSM apresentou uma área maior, quando comparado ao grupo DAC,

porém não apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela

5). Realizando uma relação túbulo/epitélio é possível observar que o grupo DM apresenta

uma relação maior, quando comparado aos grupos experimentais (Tabela 5). Isso é

possível, pois o grupo DM apresenta um diâmetro tubular menor e uma altura epitelial

também menor em relação aos outros grupos experimentais, o que leva a uma elevação

desta relação.

Tabela 5: Morfometria de túbulo seminífero dos grupos experimentais.

CT DM DAC DSM

DT (μm) 379.96±17.00 335.86±12.28* 362.12±19.33 394.25±20.05#+

AE (μm) 104.03±3.37 61.46±4.17* 109.70±5.33# 110.98±5.27#

DL (μm) 171.91±22.22 212.95±14.76* 142.73±20.83# 172.29±15.31#

CTS/t (m) 21.54±4.55 22.26±5.17 18.04±2.97 15.74±4.08#

CTS/g (m/g) 6.57±0.92 8.24±1.18 7.45±1.22 6.24±1.00

Área do túbulo

(μm2x104)

11.35±1.02 8.86±0.65* 10.31±1.09 12.22±1.26#+

Área do lúmen

(μm2x104)

2.35±0.6 3.57±0.48* 1.62±0.47# 2.34±0.43#

Área do epitélio

(μm2x104)

8.99±0.44 5.29±0.36* 8.69±0.73# 9.88±0.91#+

RTE 1.26±0.05 1.68±0.10* 1.19±0.05# 1.24±0.03#

DT – Diâmetro de túbulo; AE- altura do Epitélio; DL- Diâmetro de Lume; CTS/t- Comprimento total de túbulo

seminífero; CTS/g- Comprimento total de túbulo seminífero por grama de testículo e RET – Relação túbulo/Epitélio.

Dados expressos como média ± DP *Diferença com o grupo controle.

#Diferença com o grupo DM.

+ Diferença com o grupo DAC.

A partir da análise do volume percentual do intertúbulo, foi possível observar que

o grupo DAC apresentou um volume inferior, quando comparado ao grupo controle

(Tabela 6). Os outros grupos experimentais não apresentaram diferença estatística entre

eles (Tabela 6). Por outro lado, quando avaliado o volume total, ambos o grupo DAC e

DSM apresentaram um volume inferior, quando comparados ao grupo controle (Tabela

6). Porém, não apresentaram diferença estatística quando comparados ao grupo DM.

52

Avaliando o volume percentual e total de vasos sanguíneos no intertúbulo, não foi

observada diferença estatística relevante entre os grupos experimentais (Tabela 6) apesar

de haver um leve aumento da presença dos vasos nos grupos diabéticos. Quanto ao

volume do espaço linfático, foi visto que percentualmente os grupos DAC e DSM

apresentam um volume inferior, quando comparados ao grupo DM, porém o volume total

foi inferior para todos os grupos diabéticos, quando comparados ao grupo controle

(Tabela 6).

O volume percentual do citoplasma e núcleo das células de Leydig, assim como o

volume total nuclear e volume percentual e total da concentração destas células no

intertúbulo, não foi estatisticamente diferente entre os grupos experimentais (Tabela 6).

Porém, comparando as médias do volume total do citoplasma das células de Leydig, foi

possível observar que o grupo DSM apresentou um volume inferior, quando comparado

ao grupo controle (Tabela 6). Enquanto que os grupos DM e DAC não apresentaram

diferença estatística entre eles e também com o grupo controle. O que demonstra que a

utilização do aminoácido isolado não foi capaz de impedir o dano da hiperglicemia nas

células de Leydig.

O volume percentual de tecido conjuntivo, nos grupos DAC e DSM apresentaram

um volume inferior, quando comparado ao grupo controle, porém não apresenta diferença

estatística relevante em relação ao grupo DM (Tabela 6). Entretanto, quando avaliado o

volume total de tecido conjuntivo, foi evidenciado que todos os grupos diabéticos (DM,

DAC e DSM) apresentaram um volume inferior quando comparado ao grupo controle

(Tabela 6). Por fim, o volume percentual e total de macrófagos no tecido intertubular não

foi estatisticamente diferente entre os grupos experimentais (Tabela 6).

53

54

Tabela 6: Volume percentual e total dos componentes do intertúbulo dos grupos experimentais.

CT DM DAC DSM

Intertúbulo (%) 7.32 ± 0.83 6.64 ± 1.42 5.50 ± 1.20* 5.58 ± 0.68

Vaso sanguíneo (%) 0.43 ± 0.15 0.60 ±0.37 0.59 ±0.17 0.79 ± 0.54

Espaço linfático (%) 1.63 ± 0.31 1.24 ±0.32 0.80 ± 0.29* 0.91 ± 0.25*

Núcleo de Leydig (%) 1.32 ± 0.25 1.58 ±0.44 1.35 ± 0.23 1.34 ± 0.26

Citoplasma de Leydig (%) 0.56 ± 0.12 0.45 ±0.09 0.49 ± 0.17 0.39 ± 0.05

Leydig (%) 1.89 ± 0.33 2.02 ±0.48 1.84 ± 0.39 1.73 ± 0.29

Tecido conjuntivo (%) 3.32 ± 0.45 2.71 ±0.57 2.21 ± 0.62* 2.10 ± 0.38*

Macrófago (%) 0.10 ± 0.12 0.07 ±0.03 0.06 ± 0.03 0.05 ± 0.01

Intertúbulo (mL) 0.19 ± 0.03 0.14 ± 0.04 0.12 ± 0.02* 0.12 ± 0.03*

Vaso sanguíneo (mL) 0.011 ± 0.003 0.013 ± 0.009 0.013 ± 0.004 0.018 ± 0.015

Espaço linfático (mL) 0.042 ± 0.009 0.026 ± 0.008* 0.017 ± 0.005* 0.019 ± 0.008*

Núcleo de Leydig (mL) 0.034 ± 0.008 0.034 ± 0.013 0.029 ± 0.007 0.027 ± 0.006

Citoplasma de Leydig (mL) 0.014 ± 0.003 0.009 ± 0.002 0.01 ± 0.003 0.008 ± 0.002*

Leydig (mL) 0.049 ± 0.012 0.044 ± 0.015 0.04 ± 0.009 0.036 ± 0.008

Tecido conjuntivo (mL) 0.087 ± 0.01 0.058 ± 0.016* 0.048 ± 0.014* 0.044 ± 0.013*

Macrófago (mL) 0.002 ± 0.002 0.001 ± 0.0008 0.001 ± 0.0007 0.0009 ± 0.0002

Dados expressos como média ± DP *Diferença com o grupo controle

55

Avaliando parâmetros morfométricos relacionados a célula de Leydig, pode ser

observado que os grupos diabéticos apresentam um diâmetro nuclear inferior, quando

comparado ao grupo controle (Tabela 7). O grupo DSM apresentou um diâmetro menor,

quando comparado ao grupo DM (Tabela 7). O mesmo padrão foi observado no volume

nuclear desta mesma célula (Tabela 7). Quanto ao volume do citoplasma, foi visto que os

grupos diabéticos apresentaram um volume menor, quando comparados ao grupo

controle, assim como o volume total de células de Leydig (Tabela 7).

No volume total de células de Leydig por testículo e por grama de testículo, foi

observado que não havia diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 7).

O número de células de Leydig por testículo foi superior no grupo DSM, quando

comparado com o grupo controle (Tabela 7), enquanto que os outros grupos

experimentais não apresentaram diferença estatística entre si. Quanto ao número de

células de Leydig por grama de testículo, ambos os grupos tratados (DAC e DSM)

apresentaram um número maior, quando comparados ao grupo controle (Tabela 7). Porém

não houve diferença estatística quando comparados ao grupo DM. Por fim, foi visto que

o índice Leydigossomático foi estatisticamente semelhante entre os grupos experimentais.

56

Tabela 7: Parâmetros morfométricos das células de Leydig dos grupos experimentais.

CT DM DAC DSM

Diâmetro nuclear de

Leydig (μm³)

6.63 ± 0.12 5.77 ± 0.54* 5.39 ± 0.39* 5.10 ± 0.16*#

Volume do núcleo de

Leydig (μm³)

152.88 ± 8.46 102.83 ± 25.55* 82.89 ± 18.94* 69.39 ± 6.43*#

Volume do citoplasma de

Leydig (μm³)

66.06 ± 14.98 29.66 ± 8.71* 30.69 ± 13.43* 20.90 ± 4.88*

Volume de célula de

Leydig (μm³)

218.94 ± 21.66 132.48 ± 30.74* 113.58 ± 31.63* 90.29 ± 10.85*

Volume de Leydig/T

(x106) (μm³)

49710.4 ± 12062.72 44240.55 ± 15320.04 40489.73 ± 9455.07 36349.91 ± 8782.62

Volume de leydig/gT

(x106) (μm³)

15197.33 ± 2955.24 17160.65 ± 7912.57 16699.72 ± 3680.8 14330.01 ± 1764.77

Número de células de

Leydig/T (x106) (μm³)

228.17 ± 54.78 334.02 ± 89.17 368.24 ± 96.21 403.65 ± 93.89*

Número de células de

Leydig/gT (x106) (μm³)

69.72 ± 13.66 129.56 ± 52.81 154.89 ± 52.93* 160.44 ± 27.49*

Índice Leydigossomático

(%)

0.018 ±0.005 0.021 ± 0.008 0.022 ± 0.004 0.019 ±0.005

Dados expressos como média ± DP. *Diferença com o grupo controle.

#Diferença com o grupo DM.

57

Análise qualitativa

Análises qualitativas das lâminas coradas em Hematoxilina-Eosina permitiram

identificar que o grupo controle apresentava um epitélio seminífero integro, com ausência

de alterações morfológicas (Figura 2).

Figura 2 – Secção histologica de túbulos seminíferos de ratos do grupo controle. A e B

aumento de 100x, C e D aumento de 400x.

O grupo diabético sem tratamento apresentou vários túbulos com epitélio

degenerado, possivelmente associado à uma esfoliação epitelial, acumulando células no

lúmen. As células germinativas apresentavam hipertrofia, algumas em processo de

apoptose e com presença de exsudato intertubular. Entre as células dos túbulos

seminíferos, foi possível visualizar a formação de vacúolos e perda de adesão celular,

resultando possivelmente na presença de células do epitélio no espaço intertubular,

culminando em túbulos apresentando alterações em sua linhagem espermatogênica, e

alguns em estágio de degeneração (Figura 3).

A B

C D

58

Figura 3 – Secção histológica de túbulos seminíferos de ratos do grupo diabético sem

tratamento. A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Asterisco vermelho –

Túbulos em degeneração. Seta amarela – Esfoliação do epitélio do túbulo seminífero.

Seta verde – Células em processo de necrose. Seta preta – vacúolos. Seta vermelha –

Células de Leydig.

O grupo tratado com o extrato de Allium cepa L apresentou túbulos em processos

de degeneração, porém poucos túbulos apresentavam esfoliação epitelial. Os túbulos

apresentaram poucas alterações, com reduzido número de células em apoptose. Alguns

túbulos apresentaram perda de adesão celular, resultando em algumas células do túbulo

seminífero soltas no espaço intertubular. As células germinativas apresentaram

hipertrofia e presença de algumas áreas intertubulares apresentando exsudato. Em

comparação com os animais do grupo diabético não tratado, o grupo tratado com A. cepa

L apresentou um tecido mais organizado, com uma menor quantidade de túbulos com

espermatogênese alterada e com poucas alterações intertubulares (Figura 4).

59

Figura 4 – Imagens de túbulos seminíferos de ratos do grupo tratado com Allium cepa L.

A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Asterisco vermelho – Túbulo seminífero

em degeneração. Seta azul – Hipertrofias de células do túbulo seminífero. Seta preta –

Vacúolos no tecido intertubular.

O grupo tratado com o aminoácido S-metilcisteína apresentou poucos túbulos em

processos de degeneração, com pouca esfoliação celular. Alguns animais apresentaram

células germinativas hipertrofiadas, com a presença de alguns vacúolos entre as células

do túbulo seminífero. Não foram identificadas células em apoptose, com poucas

alterações na espermatogênese. De modo geral, o grupo tratado com S-metilcisteína

apresentava um parênquima mais organizado e integro, com poucas alterações quando

comparado ao grupo diabético não tratado e tratado com A. cepa L (Figura 5).

60

Figura 5 – Imagens de túbulos seminíferos de ratos do grupo tratado com S-metilcisteína.

A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Seta amarela – Esfoliação do epitélio

do túbulo seminífero. Seta preta – Vacúolos no tecido intersticial.

Imunohistoquímica

Avaliando qualitativamente as lâminas marcadas por imunohistoquímica para o

receptor de testosterona, foi possível identificar que o grupo DM apresenta uma menor

marcação para estes receptores, quando comparado ao grupo controle não diabético. Os

grupos diabéticos tratados apresentam uma marcação mais evidente, quando comparados

ao grupo diabético não tratado. O grupo tratado com o extrato apresenta uma marcação

mais evidente, quando comparado ao grupo tratado com o aminoácido isolado.

Comparando o grupo controle não diabético e o grupo diabético tratado com o extrato,

ambos apresentavam marcações semelhantes entre ambos os grupos (Figura 6).

61

Figura 6 – Imagens contendo marcação de imunohistoquímica para receptor de

testosterona nos grupos controle (A e B), diabético não tratado (C e D), diabético tratado

com Allium cepa L. (E e F) e diabético tratado com S-metilcisteína (G e H). (A) Presença

de células marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (B) Presença de

células de diversos estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como

células do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (C) Presença de poucas células

marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (D) Presença de algumas

poucas células de estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como

células do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (E) Presença de diversas células

marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (F) Presença de várias

células de estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como células

do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (G) Presença de células marcadas em

castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (H) Presença de células de estágios de

desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como células do intertúbulo

marcadas em castanho (400x).

62

A B

C D

E F

G H

A B

C D

E F

G H

63

DISCUSSÃO

Como pode ser visto nos resultados, a diabetes foi induzida com sucesso, onde os

grupos DM, DAC e DSM apresentaram elevação na sua glicemia, o que divergia do que

era visto no grupo CT. Isso comprova o quadro hiperglicêmico característico da diabetes,

demonstrando a efetividade da indução por STZ. Parâmetros como consumo de água e

ração não se alteraram entre os grupos diabéticos, por outro lado a glicemia foi reduzida

em ambos os grupos tratados. Avaliando o tecido, foi visto que os grupos tratados

apresentaram melhora em diversos parâmetros, dentre eles pode ser apontado: morfologia

tecidual, disponibilidade de receptores para testosterona, parâmetros tubulares e também

demostrou alterações em componentes intertubulares.

A utilização de terapias alternativas como uma forma de auxiliar na redução dos

danos sistêmicos causados pelo DM1 é uma boa forma de prevenir e tratar os sintomas

gerados pela doença e que podem ser visualizados nos pacientes, como por exemplo:

problemas de cicatrização periférica, perda de visão, problemas renais, problemas

cardíacos, alterações no consumo de água/alimentos e infertilidade. Disfunção testicular

em diabéticos pode ser temporária ou permanente dependendo do quão controlada e a

quantos anos se convive com a doença.

O tratamento com o extrato de Allium cepa L. e com S-metilcisteína reduziram a

glicemia dos animais diabéticos, no entanto o aminoácido S-metilcisteína reduziu de

forma mais eficiente a glicemia, sendo significativa a redução entre os grupos tratados.

Estes dados são consistentes com os resultados encontrados por El-Demerdash e

colaboradores (2005) em ratos Sprague–Dawely diabéticos induzidos por aloxan bem

como Yin e colaboradores (2007) em estudo realizado com camundongos Balb/cA e S-

metilcisteína.

Quanto ao consumo de água e ração foi visto que não há diferença entre os grupos

experimentais, o que também é visto em estudos realizados por Yin e colaboradores

(2007), Kumari e colaboradores (2002) e Nishikawa-Ogawa e colaboradores (2006), pois

mesmo com a redução da glicose pelo tratamento os animais continuam diabéticos e a

necessidade de reposição de líquidos permanece, visto que estes animais apresentam alto

nível de diurese. Essa característica de polifagia e polidipsia é bastante comum em

animais e indivíduos diabéticos, assim como não são facilmente alterados em estudos

voltados para tratamento da diabetes.

64

Comumente, a diabetes tende a gerar perda de massa corporal de modo simultâneo

em diversos tecidos e órgãos. Analisando parâmetros biométricos, o peso corporal do

grupo tratado com o estrato de A. cepa L. foi inferior aos grupos controle e diabético sem

tratamento, essa redução de peso foi visualizada por Fallah e colaboradores (2017), porém

a redução não foi significativamente inferior ao grupo diabético sem tratamento. O grupo

tratado com S-metilcisteína também apresentou redução no peso quando comparado com

os grupos controle e diabético sem tratamento, porém em um estudo realizado por Yin e

colaboradores (2007) os animais tratados com diferentes concentrações deste aminoácido

foram capazes de impedir a perda excessiva de peso. Este resultado pode ser explicado

pela diferença em metodologia de utilização do aminoácido, onde neste estudo foi

utilizado o procedimento de gavagem e no estudo realizado por Yin e colaboradores

(2007) o aminoácido foi adicionado a água dos animais.

O peso testicular dos animais diabéticos foi reduzido para todos os grupos, onde

nenhum dos tratamentos foi capaz de elevar ou impedir essa redução. Em um estudo

realizado por Fallah e colaboradores (2017), o tratamento com 400 mg/kg de extrato de

A. cepa L. intraperitonealmente também não foi capaz de impedir a redução do peso

testicular, pelo contrário, a perda de peso foi superior ao grupo diabético não tratado. O

grupo tratado com o aminoácido isolado também não foi capaz de impedir a perda de

peso testicular, o que demonstra que ambos os tratamentos não são capazes de interferir

na perda de massa testicular em animais diabéticos.

Utilizando o peso testicular e corporal, pode-se obter o IGS e a partir da

comparação deste parâmetro entre os grupos, foi possível ver que não houve diferença

significativa entre os grupos. Isso pode acontecer devido a semelhança entre a perda de

peso corporal e testicular visualizada em animais diabéticos, assim como o ganho de peso

corporal e testicular dos animais do grupo controle. No estudo realizado por Ismail e

colaboradores (2018) foi visto um resultado semelhante, onde os animais do grupo

diabético não apresentaram diferença no IGS quando comparado a qualquer grupo

presente no experimento, sendo ele controle ou tratado. Semelhantemente, o IPS também

não apresentou diferença estatística entre os grupos devido a perda de peso uniforme

apresentada pelos animais dos grupos diabéticos e ganho de peso dos animais do grupo

controle.

A diabetes tende a gerar danos no tecido testicular que podem ser visualizados e

classificados dentro do Escore de Johnsen. O escore de Johnsen do grupo diabético sem

65

tratamento foi inferior quando comparado a todos os grupos experimentais. Em estudos

de Ersoy e Kizilay (2018) e Ghanbari e colaboradores (2015) o grupo diabético sem

tratamento apresenta redução do escore e o tratamento foi capaz de melhorar o aspecto

tecidual. Semelhantemente neste trabalho, ambos os tratamentos foram capazes de

melhorar o aspecto tecidual, elevando o escore. Do mesmo modo, o escore de Johnsen

modificado foi inferior no grupo diabético sem tratamento, porém ambos os grupos

tratados apresentaram um maior escore. Isso demonstra que, os tratamentos são capazes

de reduzir ou prevenir o dano causado pelo DM1.

Um estudo realizado por Keyhanmnesh e colaboradores (2018) demonstrou que o

DM é capaz de reduzir o volume dos componentes testiculares. O volume total tubular e

epitelial foram reduzidos e o volume da túnica própria e do lúmen foram aumentados.

Diferentemente deste estudo, os ratos do grupo diabético não apresentaram alterações no

volume total destes componentes. Isto pode ter acontecido, pois o tempo experimental

deste estudo foi de 4 (quatro) semanas enquanto que no estudo de Keyhanmnesh e

colaboradores (2018) a duração foi de 8 (oito) semanas, o que aumentaria a probabilidade

do desenvolvimento de danos mais profundos na integridade testicular gerada pelas

consequências sistêmicas do DM.

Avaliando o percentual de componentes teciduais, foi visto que o grupo DM

apresentou um espessamento na túnica própria dos túbulos seminíferos, porém quando

levado em consideração o volume total, não houve diferença estatística. Os tratamentos

não interferiram no volume total destes componentes testiculares, porém relativamente

foi visto que o tratamento com o extrato foi capaz de elevar a porcentagem de túbulo

seminífero no tecido testicular, assim como a porcentagem de epitélio germinativo. O

tratamento com o aminoácido isolado foi capaz de elevar a porcentagem de epitélio

germinativo, mas semelhantemente não foi capaz de interferir no volume de outros

componentes de modo relativo ou total.

O diâmetro tubular, assim como a altura do epitélio germinativo do grupo DM foi

inferior ao grupo controle, o que é condizente com os achados de Ersoy e Kizilay (2018)

e Shoorei e colaboradores (2018) e comprova que o DM causa danos ao tecido testicular,

causando degradação do epitélio germinativo e reduzindo o diâmetro tubular. O

tratamento com A. cepa L. não foi capaz de melhorar totalmente os danos causados pelo

DM, apenas a integridade epitelial foi mantida. Por outro lado, o tratamento com o

aminoácido isolado foi capaz de gerar um efeito protetor ao tecido tubular, mantendo o

66

diâmetro tubular e altura do epitélio semelhantes ao grupo controle. Assim, o tratamento

com o aminoácido foi capaz de apresentar melhor resultado quando comparado com o

grupo do extrato neste quesito.

Associada as alterações de diâmetro de túbulo seminífero e de altura de epitélio,

o lúmen dos animais do grupo diabético foi superior quando comparado aos grupos

experimentais. Isso ocorre, pois com a degradação o epitélio germinativo, o diâmetro do

lúmen é aumentado. Ambos os tratamentos foram capazes de reduzir este diâmetro de

modo estatisticamente semelhante, o que comprova que os tratamentos podem estar

associados a proteção e/ou auxílio na regeneração do tecido tubular. O DM também foi

capaz de interferir em parâmetros como a área dos componentes tubulares (área do túbulo,

epitélio e lúmen), reduzindo as áreas do túbulo e do epitélio e assim elevando a área do

lúmen.

De modo semelhante, os tratamentos foram capazes de melhorar estes parâmetros,

sendo o tratamento com o aminoácido isolado capaz de interferir, elevando ainda mais a

área do epitélio. A relação entre o volume tubular e o volume epitelial, revela que os

animais do grupo diabético apresentam uma maior relação. Isso ocorre pois, o grupo

diabético apresenta uma redução maior na área do epitélio em comparação a redução a

área do túbulo, o que eleva numericamente esta relação. Os tratamentos atuam reduzindo

essa relação, deixando-a mais próxima ao que é visualizado no grupo controle, o que

comprova que os tratamentos atuam melhorando a integridade tecidual.

A comparação do comprimento total do túbulo seminífero entre os grupos

experimentais demonstrou que os grupo DM e DAC não apresentaram diferença

estatística entre si e também quando comparados ao grupo controle. O grupo tratado com

o aminoácido isolado apresentou uma redução no comprimento total deste componente

testicular. No estudo de Keyhanmnesh e colaboradores (2018), o grupo diabético também

não apresentou diferença com os outros grupos experimentais. Isso pode determinar que

o DM pode estar relacionada a danos ao tecido de modo pontual, como ao epitélio ou ao

tecido intersticial, mas não reduziria o comprimento total dos túbulos seminíferos.

Quando avaliado o tecido intersticial, foi visto que os grupos diabéticos

apresentaram uma redução no volume relativo e total. Porém, quando comparado a

estudos como o realizado por Keyhanmnesh e colaboradores (2018) é visto que os grupos

diabéticos apresentam elevação no volume deste componente. O tecido intersticial em

67

grupos diabéticos estaria preenchendo o espaço deixado pelo tecido tubular degradado

devido ao DM. O estudo de Keyhanmnesh e colaboradores (2018) foi realizado em 8

(oito) semanas, enquanto nesse trabalho foram 4 (quatro), um maior período experimental

pode interferir na degradação do tecido tubular e cicatrização pelo tecido intersticial,

enquanto que em 4 (quatro) semanas isso não pode ser visualizado.

Além disso, a retração do tecido intersticial visualizada nas lâminas poderia ser

um fator interferente no volume relativo e total dos componentes intertubulares.

Componentes como tecido conjuntivo e espaço linfático se apresentaram em volume

reduzido em comparação entre os grupos diabéticos e controle. Essa redução pode estar

ligada diretamente ao DM ou a retração tecidual, o que levaria a diminuição na contagem

morfométrica destes componentes. Porém, poucos são os estudos voltados para

morfometria testicular em animais diabéticos, o que impede a determinação real destas

alterações.

Os animais diabéticos apresentaram redução no volume e diâmetro nuclear das

células de Leydig. Além disso, os animais do grupo tratado com o aminoácido isolado

apresentaram uma redução ainda maior, quando comparado aos grupos DM e DAC. No

estudo realizado por Ismail e colaboradores (2018), os animais do grupo diabético não

apresentaram alterações estatisticamente relevantes nestes parâmetros. Isso pode ocorrer

devido ao fato que o estudo realizado por Ismail e colaboradores (2018) tratava-se de

DM2. O DM2 é caracterizada por danos mais brandos ao tecido testicular por causar

alterações de cunho crônico aos sistemas, enquanto que o DM1 é caracterizada por danos

agudos devido à elevação rápida e baixo controle da glicemia.

Quanto ao número de células de Leydig por testículo, foi visto que não havia

alterações estatística entre os grupos controle, DM e DAC, porém o grupo tratado com o

aminoácido isolado apresentou um aumento na quantidade de células de Leydig presentes

no estroma testicular de forma compensatória a redução do volume destas células e assim

garantindo a manutenção da produção de testosterona. No estudo realizado por

Keyhanmnesh e colaboradores (2018), o grupo diabético sem tratamento apresentou uma

redução na contagem destas células. Isso pode estar relacionado ao tempo de duração do

experimento, o que poderia interferir nos danos ao tecido intersticial, sendo mais evidente

quanto maior o tempo de duração.

68

O testículo apresenta uma composição tecidual bastante característica e de alta

sensibilidade. A diabetes pode gerar diversos danos teciduais que gerarão consequências

vistas como redução do peso testicular, subfertilidade e infertilidade. A partir da análise

de lâminas histológicas é possível ver o motivo do desenvolvimento dessas

características. A análise qualitativa das lâminas histológicas demonstraram que o grupo

diabético apresentou degradação no tecido testicular. Foi possível visualizar que os

túbulos apresentavam atrofia, assim como degradação do epitélio germinativo e

vacuolização do interstício. Resultados semelhantes podem ser vistos em estudos como

os realizados por Ersoy e Kizilay (2018), Ghanbari e colaboradores (2015) e Yigitturk e

colaboradores (2017), onde o grupo diabético não tratado apresenta alterações tanto no

compartimento germinativo como no intersticial.

O grupo tratado com o extrato apresentou melhora significativa em relação ao

grupo diabético. Ao contrário do que foi visto no estudo realizado por Fallah e

colaboradores (2017), onde os animais tratados com o extrato não apresentou alterações

morfológicas em relação ao grupo diabético. O grupo tratado com o aminoácido isolado

apresentou alterações teciduais positivas, em relação ao grupo DM e DAC. O tecido

apresentou uma melhor integridade tecidual, uma aparência mais característica de um

tecido normal, o que pode apontar uma melhor capacidade protetora ou regenerativa desta

forma de tratamento.

A integridade tecidual é bastante importante para manter o funcionamento normal

do tecido e realização de suas funções. A marcação imunohistoquímica para o receptor

de testosterona demonstrou que os animais do grupo diabético apresentavam uma menor

marcação tanto no tecido tubular, como no tecido intersticial. O tratamento com o

aminoácido isolado foi capaz de elevar a marcação deste receptor, demonstrando sua

capacidade de melhor integridade tecidual. No entanto, o tratamento com o extrato da

cebola apresentou um resultado aparentemente ainda melhor, quando comparado com os

grupos DM e DSM. O que aponta para ao extrato sendo capaz de melhorar a

disponibilidade de receptores para testosterona em animais diabéticos.

69

CONCLUSÃO

Os danos testiculares causados pela diabetes foram atenuados ou regenerados pelo

tratamento melhorando o epitélio germinativo e aumentando o número de célula de

Leydig como forma compensatória a redução de volume destas. O principal efeito do

tratamento com o extrato de cebola foi o aumento da disponibilidade dos receptores de

testosterona. Por outro lado, o tratamento com o aminoácido isolado apresentou de modo

geral, resultados ainda melhores podendo ser apontado como uma melhor terapia para

tratar os danos testiculares causados pelo DM.

70

REFERÊNCIAS

ABD El-TWAB, S.M., MOHAMED, H.M., and MAHMOUD, A.M. (2016). Taurine and

pioglitazone attenuate diabetes-induced testicular damage by abrogation of oxidative

stress and up-regulation of the pituitary-gonadal axis. Can. J. Physiol. Pharmacol. 94,

651–661.

ALVES, M.G., MARTINS, A.D., CAVACO, J.E., SOCORRO, S., and OLIVEIRA, P.F.

(2013). Diabetes, insulin-mediated glucose metabolism and Sertoli/blood-testis barrier

function. 1, 10.

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION (2010). Diagnosis and Classification of

Diabetes Mellitus. Diabetes Care 33, S62–S69.

AMORIM, E.M.P., DAMASCENO, D.C., PEROBELLI, J.E., SPADOTTO, R.,

FERNANDEZ, C.D.B., VOLPATO, G.T., and KEMPINAS, W.D.G. (2011). Short- and

long-term reproductive effects of prenatal and lactational growth restriction caused by

maternal diabetes in male rats. Reprod. Biol. Endocrinol. RBE 9, 154.

BACCETTI, B., LA MARCA, A., PIOMBONI, P., CAPITANI, S., BRUNI, E.,

PETRAGLIA, F., and De LEO, V. (2002). Insulin-dependent diabetes in men is

associated with hypothalamo-pituitary derangement and with impairment in semen

quality. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 17, 2673–2677.

BART, A.C. (1831). Observations on the Structure and Diseases of the Testis. Medico-

Chir. Rev. 14, 1–32.

BODEN, G. (2011). Obesity, insulin resistance and free fatty acids. Curr. Opin.

Endocrinol. Diabetes Obes. 18, 139–143.

BRAVO, L. (1998). Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional

significance. Nutr. Rev. 56, 317–333.

BROWN-PETERSON, N.J., GRIER, H.J., and OVERSTREET, R.M. (2002). Annual

changes in germinal epithelium determine male reproductive classes of the cobia. J. Fish

Biol. 60, 178–202.

71

BURUL-BOZKURT, N., PEKINER, C., and KeELICEN, P. (2010). Diabetes alters

aromatase enzyme levels in gonadal tissues of rats. Naunyn. Schmiedebergs Arch.

Pharmacol. 382, 33–41.

CHANDIRASEGARAN, G., ELANCHEZHIYAN, C., and GHOSH, K. (2018). Effects

of Berberine chloride on the liver of streptozotocin-induced diabetes in albino Wistar rats.

Biomed. Pharmacother. Biomedecine Pharmacother. 99, 227–236.

CHAVES-POZO, E., GARCÍA-AYALA, A., and CABAS, I. (2018). Effects of Sex

Steroids on Fish Leukocytes. Biology 7.

CHEN, C., YIN, M., HSU, C., and LIU, T. (2007). Antioxidative and anti-inflammatory

effects of four cysteine-containing agents in striatum of MPTP-treated mice. Nutrition 23,

589–597.

COOK, N.C., and SAMMAN, S. (1996). Flavonoids—Chemistry, metabolism,

cardioprotective effects, and dietary sources. J. Nutr. Biochem. 7, 66–76.

CORONA, G., MONAMI, M., RASTRELLI, G., AVERSA, A., SFORZA, A., LENZI,

A., FORTI, G., MANNUCCI, E., and MAGGI, M. (2011). Type 2 diabetes mellitus and

testosterone: a meta-analysis study. Int. J. Androl. 34, 528–540.

COSTA, K.L.C., DA MATTA, S.L.P., DE LUCCA MOREIRA GOMES, M., DE

PAULA, T.A.R., DE FREITAS, K.M., DE ARAÚJO RESENDE CARVALHO, F., DE

ASSIS SILVEIRA, J., DOLDER, H., and CHAMINDRANI MENDIS-HANDAGama,

S.M.L. (2011). Histomorphometric evaluation of the neotropical brown brocket deer

Mazama gouazoubira testis, with an emphasis on cell population indexes of

spermatogenic yield. Anim. Reprod. Sci. 127, 202–212.

D’ANDREA, G. (2015). Quercetin: A flavonol with multifaceted therapeutic

applications? Fitoterapia 106, 256–271.

DE SIQUEIRA-SILVA, D.H., DA SILVA RODRIGUES, M., and NÓBREGA, R.H.

(2018). Testis structure, spermatogonial niche and Sertoli cell efficiency in Neotropical

fish. Gen. Comp. Endocrinol.

72

DHINDSA, S., PRABHAKAR, S., SETHI, M., BANDYOPADHYAY, A.,

CHAUDHURI, A., and DANDONA, P. (2004). Frequent occurrence of

hypogonadotropic hypogonadism in type 2 diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89,

5462–5468.

DIAS, F.C.R. (2018). EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA RAIZ DE PFAFFIA

GLOMERATA (SPRENG.) PEDERSEN INTERFERE EM PARÂMETROS

REPRODUTIVOS E FERTILIDADE DE CAMUNDONGOS MACHOS ADULTOS.

Universidade Federal de Viçosa (UFV).

DIAS, F.C.R., MARTINS, A.L.P., de MELO, F.C.S.A., CUPERTINO, M.C., GOMES,

M. de L.M., de OLIVEIRA, J.M., DAMASCENO, E.M., SILVA, J., OTONI, W.C., and

da MATTA, S.L.P. (2019). Hydroalcoholic extract of Pfaffia glomerata alters the

organization of the seminiferous tubules by modulating the oxidative state and the

microstructural reorganization of the mice testes. J. Ethnopharmacol. 233, 179–189.

DOHLE, G.R., ELZANATY, S., and VAN CASTEREN, N.J. (2012). Testicular biopsy:

clinical practice and interpretation. Asian J. Androl. 14, 88–93.

DORST VJ, S.H. (1974). Monotsh Ver Med. 29, No 29, 650-652.

E Jr, M., and KANDASWAMI, C. (1994). The impact of plant flavonoids on mammalian

biology: Implications for immunity, inflammation and cancer. In The Flavonoids:

Advances in Research since 1986, pp. 619–652.

EL-DEMERDASH, F.M., YOUSEF, M.I., and EL-NAGA, N.I.A. (2005). Biochemical

study on the hypoglycemic effects of onion and garlic in alloxan-induced diabetic rats.

Food Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 43, 57–63.

ERSOY, O., and KIZILAY, G. (2018). Effects of fucoidan on diabetic rat testicular tissue.

Biotech. Histochem. 0, 1–9.

EVANS, J.L., GOLDFINE, I.D., MADDUX, B.A., and GRODSKY, G.M. (2002).

Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2

diabetes. Endocr. Rev. 23, 599–622.

73

FALLAH, V., MAHABADI, J.A., MAHABADI, M.Y., KASHANI, H.H., and NIKZAD,

H. (2017). Protective Effect of Allium cepa (Onion) Seeds (AC) Extract on

Histopathology of Testis in STZ-Induced Male Rats. Int. J. Morphol. 35, 1517–1524.

FLORES, A., WIFF, R., and DÍAZ, E. (2015). Using the gonadosomatic index to estimate

the maturity ogive: application to Chilean hake (Merluccius gayi gayi). ICES J. Mar. Sci.

72, 508–514.

FOSSEN, T., PEDERSEN, A.T., and ANDERSEN, Ø.M. (1998). Flavonoids from red

onion (Allium cepa). Phytochemistry 47, 281–285.

GHANBARI, E., NEJATI, V., NAJAFI, G., KHAZAEI, M., and BABAEI, M. (2015).

Study on the effect of royal jelly on reproductive parameters in streptozotocin-induced

diabetic rats. Int. J. Fertil. Steril. 9, 113–120.

GOBBO, M.G., COSTA, C.F.P., SILVA, D.G.H., de ALMEIDA, E.A., and GOES, R.M.

(2015). Effect of Melatonin Intake on Oxidative Stress Biomarkers in Male Reproductive

Organs of Rats under Experimental Diabetes. Oxid. Med. Cell. Longev. 2015.

GÓMEZ, O., BALLESTER, B., ROMERO, A., ARNAL, E., ALMANSA, I.,

MIRANDA, M., MESONERO, J.E., and TERRADO, J. (2009). Expression and

regulation of insulin and the glucose transporter GLUT8 in the testes of diabetic rats.

Horm. Metab. Res. Horm. Stoffwechselforschung Horm. Metab. 41, 343–349.

GRIER, H.J., URIBE, M.C., Lo NOSTRO, F.L., MIMS, S.D., and PARENTI, L.R.

(2016). Conserved form and function of the germinal epithelium through 500 million

years of vertebrate evolution. J. Morphol. 277, 1014–1044.

GRIFFITHS, G., TRUEMAN, L., CROWTHER, T., THOMAS, B., and SMITH, B.

(2002). Onions--a global benefit to health. Phytother. Res. PTR 16, 603–615.

HANASAKI, Y., OGAWA, S., and Fukui, S. (1994). The correlation between active

oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids. Free Radic. Biol. Med. 16,

845–850.

74

HASIMUN, P., and SUKANDAR, E.Y. (2011). Synergistic Effect of Curcuminoid and

S-methyl Cysteine in Regulation of Cholesterol Homeostasis. Int. J. Pharmacol. 7 268–

272.

HENKEL R. (2005). The impact of oxidants on sperm function. Andrologia 37, 205–206.

HERR, R.R., EBLE, T.E., BERGY, M.E., and JAHNKE, H.K. (1959). Isolation and

characterization of streptozotocin. Antibiot. Annu. 7, 236–240.

HODNICK, W.F., MILOSAVLJEVIC, E.B., NELSON, J.H., and PARDINI, R.S. (1988).

Electrochemistry of flavonoids. Relationships between redox potentials, inhibition of

mitochondrial respiration, and production of oxygen radicals by flavonoids. Biochem.

Pharmacol. 37, 2607–2611.

HOPE, W.C., WELTON, A.F., FIEDLER-NAGY, C., BATULA-BERNARDO, C., and

COFFEY, J.W. (1983). In vitro inhibition of the biosynthesis of slow reacting substance

of anaphylaxis (SRS-A) and lipoxygenase activity by quercetin. Biochem. Pharmacol. 32,

367–371.

HRUDA, J., SRAMEK, V., and LEVERVE, X. (2010). High glucose increases

susceptibility to oxidative-stress-induced apoptosis and DNA damage in K-562 cells.

Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czechoslov. 154, 315–320.

HUNT, J.V., DEAN, R.T., and WOLFF, S.P. (1988). Hydroxyl radical production and

autoxidative glycosylation. Glucose autoxidation as the cause of protein damage in the

experimental glycation model of diabetes mellitus and ageing. Biochem. J. 256, 205–212.

ISMAIL, O., AYOOLA, J., OFFOR, U., OLWATOSIN, O., EDWIN, N., ANIEKAN, P.,

and ONYEMAECHI, A. (2018). Histo-morphological and seminal evaluation of

testicular parameters in diabetic rats under antiretroviral therapy: interactions with

Hypoxis hemerocallidea. Iran. J. Basic Med. Sci. 21, 1322–1330.

JOHNSEN, S.G. (1970). Testicular biopsy score count--a method for registration of

spermatogenesis in human testes: normal values and results in 335 hypogonadal males.

Hormones 1, 2–25.

75

JOHNSON, L., PETTY, C.S., and NEAVES, W.B. (1981). A new approach to

quantification of spermatogenesis and its application to germinal cell attrition during

human spermiogenesis. Biol. Reprod. 25, 217–226.

JONES, M.G., HUGHES, J., TREVOGA, A., MILNE, J., TOMSETT, A.B., and

COLLIN, H.A. (2004). Biosynthesis of the flavour precursors of onion and garlic. J. Exp.

Bot. 55, 1903–1918.

KANTER, M., AKTAS, C., and ERBOGA, M. (2012). Protective effects of quercetin

against apoptosis and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rat testis. Food

Chem. Toxicol. Int. J. Publ. Br. Ind. Biol. Res. Assoc. 50, 719–725.

KEYHANMANESH, R., HAMIDIAN, G., ALIPOUR, M.R., RaANJBAR, M., and

OGHBAEI, H. (2018). Protective effects of sodium nitrate against testicular apoptosis

and spermatogenesis impairments in streptozotocin-induced diabetic male rats. Life Sci.

211, 63–73.

KILARKAJE, N., AL-HUSSAINI, H., and AL-BADER, M.M. (2014). Diabetes-induced

DNA damage and apoptosis are associated with poly (ADP ribose) polymerase 1

inhibition in the rat testis. Eur. J. Pharmacol. 737, 29–40.

KOH, P.-O. (2007). Streptozotocin-induced diabetes increases apoptosis through JNK

phosphorylation and Bax activation in rat testes. J. Vet. Med. Sci. 69, 969–971.

KUMARI, K., and AUGUSTI, K.T. (2002). Antidiabetic and antioxidant effects of S-

methyl cysteine sulfoxide isolated from onions (Allium cepa Linn) as compared to

standard drugs in alloxan diabetic rats. Indian J. Exp. Biol. 40, 1005–1009.

KUMARI, K., MATHEW, B.C., and AUGUSTI, K.T. (1995). Antidiabetic and

hypolipidemic effects of S-methyl cysteine sulfoxide isolated from Allium cepa Linn.

Indian J. Biochem. Biophys. 32, 49–54.

LIU, C.-L., HSIA, T.-C., and YIN, M.-C. (2014). s-Methyl cysteine enhanced survival of

nerve growth factor differentiated PC12 cells under hypoxic conditions. Food Funct. 5,

1125–1133.

76

Lo NOSTRO, F.L., ANTONELI, F.N., QUAGIO-GRASSIOTTO, I., and Guerrero, G.A.

(2004). Testicular interstitial cells, and steroidogenic detection in the protogynous fish,

Synbranchus marmoratus (Teleostei, Synbranchidae). Tissue Cell 36, 221–231.

MALANDRINO, N., and SMITH, R.J. (2011). Personalized medicine in diabetes. Clin.

Chem. 57, 231–240.

MILECH, A., OLIVEIRA, J.E.P.D., and VENANCIO, S. (2016). Diretrizes da Sociedade

Brasileira de Diabetes 2015-2016.

MUNUSAMY, S., and MACMILLAN-CROW, L.A. (2009). Mitochondrial superoxide

plays a crucial role in the development of mitochondrial dysfunction during high glucose

exposure in rat renal proximal tubular cells. Free Radic. Biol. Med. 46, 1149–1157.

NISHIKAWA-OGAWA, M., WANIBUCHI, H., MORIMURA, K., KINOSHITA, A.,

NISHIKAWA, T., HAYASHI, S., YANO, Y., and FUKUSHIMA, S. (2006). N-

acetylcysteine and S-methylcysteine inhibit MeIQx rat hepatocarcinogenesis in the post-

initiation stage. Carcinogenesis 27, 982–988.

NÓBREGA, R.H., BATLOUNI, S.R., and FRANÇA, L.R. (2009). An overview of

functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation

in fish. Fish Physiol. Biochem. 35, 197–206.

OGURTSOVA, K., da ROCHA FERNANDES, J.D., HUANG, Y., LINNENKAMP, U.,

GUARIGUATA, L., CHO, N.H., CAVAN, D., SHAW, J.E., and MAKAROFF, L.E.

(2017). IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and

2040. Diabetes Res. Clin. Pract. 128, 40–50.

OLIVEIRA, J.E.P., JUNIOR, R.M.M., and VENCIO, S. (2017). Diretrizes da Sociedade

Brasileira de Diabetes 2017-2018.

PARK, J., KIM, J., and KIM, M.K. (2007). Onion flesh and onion peel enhance

antioxidant status in aged rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo) 53, 21–29.

PATIL, R., PATIL, R., AHIRWAR, B., and AHIRWAR, D. (2011). Current status of

Indian medicinal plants with antidiabetic potential: a review. Asian Pac. J. Trop. Biomed.

1, S291–S298.

77

PITTELOUD, N., HARDIN, M., DWYER, A.A., VALASSI, E., YIALAMAS, M.,

ELAHI, D., and Hayes, F.J. (2005). Increasing insulin resistance is associated with a

decrease in Leydig cell testosterone secretion in men. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90,

2636–2641.

PRADEEEP, S.R., and SRINIVASAN, K. (2017). Amelioration of hyperglycemia and

associated metabolic abnormalities by a combination of fenugreek (Trigonella foenum-

graecum) seeds and onion (Allium cepa) in experimental diabetes. J. Basic Clin. Physiol.

Pharmacol. 28, 493–505.

PRADEEP, S.R., and SRINIVASAN, K. (2017). Amelioration of oxidative stress by

dietary fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) seeds is potentiated by onion (Allium

cepa L.) in streptozotocin-induced diabetic rats. Appl. Physiol. Nutr. Metab. Physiol.

Appl. Nutr. Metab. 42, 816–828.

RATO, L., ALVES, M.G., SOCORRO, S., CARVALHO, R.A., CAVACO, J.E., and

OLIVEIRA, P.F. (2012). Metabolic modulation induced by oestradiol and DHT in

immature rat Sertoli cells cultured in vitro. Biosci. Rep. 32, 61–69.

RATO, L., ALVES, M.G., CAVACO, J.E., and OLIVEIRA, P.F. (2014). High-energy

diets: a threat for male fertility? Obes. Rev. Off. J. Int. Assoc. Study Obes. 15, 996–1007.

ROBAK, J., KORBUT, R., SHIRIDI, F., SWIES, J., and Rzadkowska-Bodalska, H.

(1988). On the mechanism of antiaggregatory effect of myricetin. Pol. J. Pharmacol.

Pharm. 40, 337–340.

SACHDEVA, M.M., and STOFFERS, D.A. (2009). Minireview: Meeting the demand

for insulin: molecular mechanisms of adaptive postnatal beta-cell mass expansion. Mol.

Endocrinol. Baltim. Md 23, 747–758.

SADIK, N.A.H., EL-SEWEIDY, M.M., and SHAKER, O.G. (2011). The antiapoptotic

effects of sulphurous mineral water and sodium hydrosulphide on diabetic rat testes. Cell.

Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 28, 887–898.

SANOCKA, D., and KURPISZ, M. (2004). Reactive oxygen species and sperm cells.

Reprod. Biol. Endocrinol. RBE 2, 12.

78

SCHOELLER, E.L., SCHON, S., and MOLEY, K.H. (2012). THE EFFECTS OF TYPE

1 DIABTES ON THE HYPOTHALAMIC, PITUITARY AND TESTES AXIS. Cell

Tissue Res. 349, 839–847.

SCHULZ, R.W., de FRANÇA, L.R., LAREYRE, J.-J., Le GAC, F., LeGAC, F.,

CHIARINI-GARCIA, H., NOBREGA, R.H., and MIURA, T. (2010). Spermatogenesis

in fish. Gen. Comp. Endocrinol. 165, 390–411.

SHENOY, C., B PATIL, M., KUMAR, R., and PATIL, S. (2009). Preliminary

phytochemical investigation and wound healing activity of Allium cepa Linn (Liliaceae).

Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 2.

SHOOREI, H., KHAKI, A., KHAKI, A.A., HEMMATI, A.A., MOGHIMIAN, M., and

SHOKOOHI, M. (2018). The ameliorative effect of carvacrol on oxidative stress and

germ cell apoptosis in testicular tissue of adult diabetic rats. Biomed. Pharmacother.

Biomedecine Pharmacother. 111, 568–578.

SILVA, N.A.A. da (1965). Efeito da suplementação com extrato alcoólico das diferentes

partes da melancia (Citrullus lanatus (THUNB.) MATSUM.& NAKAI.) e da L-citrulina

sobre os testículos de camundongos suíços adultos.

SULERIA, H.A.R., BUTT, M.S., ANJUM, F.M., SAEED, F., and KHALID, N. (2015).

Onion: Nature Protection Against Physiological Threats. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 55,

50–66.

TAKADA, J., MACHADO, M.A., PERES, S.B., BRITO, L.C., Borges-Silva, C.N.,

COSTA, C.E.M., FONSECA-ALANIZ, M.H., ANDREOTTI, S., and LIMA, F.B.

(2007). Neonatal streptozotocin-induced diabetes mellitus: a model of insulin resistance

associated with loss of adipose mass. Metabolism. 56, 977–984.

VAN BELLE, T.L., COPPIETERS, K.T., and VON HERRATH, M.G. (2011). Type 1

Diabetes: Etiology, Immunology, and Therapeutic Strategies. Physiol. Rev. 91, 79–118.

WANG, L., GUO, L., ZHANG, L., ZHOU, Y., HE, Q., ZHANG, Z., and WANG, M.

(2013). Effects of glucose load and nateglinide intervention on endothelial function and

oxidative stress. J. Diabetes Res. 2013, 849295.

79

WANG, X., OUYANG, Y.Y., LIU, J., and ZHAO, G. (2014). Flavonoid intake and risk

of CVD: a systematic review and meta-analysis of prospective cohort studies. Br. J. Nutr.

111, 1–11.

WHO (2016). Global report on diabetes.

WINDHOLZ, M., and BROWN, H.D. (1978). “The Merck Index”: the merits of using

computers in publishing. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 18, 129–133.

YIGITTURK, G., ACARA, A.C., ERBAS, O., OLTULU, F., YAVASOGLU, N.U.K.,

UYSAL, A., and YAVASOGLU, A. (2017). The antioxidant role of agomelatine and

gallic acid on oxidative stress in STZ induced type I diabetic rat testes. Biomed.

Pharmacother. Biomedecine Pharmacother. 87, 240–246.

YIN, M., HSU, C., CHIANG, P., and WU, W. (2007). Antiinflammatory and

antifibrogenic effects of s-ethyl cysteine and s-methyl cysteine in the kidney of diabetic

mice. Mol. Nutr. Food Res. 51, 572–579.

ZAREI, A., VAEZI, G., MALEKIRAD, A.A., and ABDOLLAHI, M. (2015).

Hypoglycemic and hypolipidemic activities of Salvia hydrangea in streptozotocin-

induced diabetes in rats. Iran. J. Basic Med. Sci. 18, 417–422.

80

CONCLUSÕES GERAIS

A aplicação de recursos em estudos voltados para a descoberta de novas terapias

alternativas, acessíveis e baratas para o tratamento do DM é de extrema importância.

Diversos estudos já demonstraram que os danos a longo prazo vistos em indivíduos que

convivem com a diabetes ocorrerão independentemente do quão controlada é a doença.

Com isso, tratar previamente as consequências sistêmicas desta doença pode ser um passo

chave para reduzir estas alterações e elevar a expectativa de vida destes indivíduos.

A diabetes é causadora de danos no tecido testicular de modo que está relacionado

diretamente ao desenvolvimento de subfertilidade e infertilidade. O tratamento com o

extrato da cebola apresentou diversos pontos positivos como forma de terapia para estes

danos, principalmente na disponibilidade para receptores de testosterona. Por outro lado,

o tratamento com o aminoácido isolado apresentou resultados ainda melhores, de modo

geral, podendo ser apontado como uma melhor terapia para tratar os danos testiculares

causados pelo DM.

Este estudo confirma que a diabetes tem um efeito adverso na função do sistema

reprodutor masculino, o que já foi visto em outros estudos como os realizados por

Ghanbari e colaboradores (2015), Shrilatha e Muralidhara (2007) e Sonmez e

colaboradores (2015). Do mesmo modo que este estudo demonstra um efeito protetor do

extrato de Allium cepa L. e de seu aminoácido isolado S-metilciteína. Este estudo é um

dos poucos que avalia este efeito protetor do extrato e o único a avaliar o efeito do

aminoácido isolado contra o dano testicular causado pela diabetes induzida por

estreptozotocina em ratos.

Infelizmente, a escassez de estudos voltados para aplicação da S-metilcisteína,

assim como estudos voltados para a morfometria testicular, torna difícil a comparação de

resultados e determinação da funcionalidade destas terapias alternativas como tratamento

para o DM. Com isso, se faz necessário a realização de mais estudos para determinação

de melhores resultados para terapias voltadas ao tecido testicular danificado pelo DM.