UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · PDF fileimunoistoquímica para VIP (A, B), VP (C, D) e NPY (E ... frequentemente precedem o aparecimento dos sinais motores e são

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

CINTHYA MONTENEGRO DE VASCONCELOS SILVA

AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SONO/VIGILIA EM UM MODELO CRÔNICO DE

PARKINSONISMO EM RATOS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Natal

2016

CINTHYA MONTENEGRO DE VASCONCELOS SILVA

AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SONO/VIGILIA EM UM MODELO CRÔNICO DE

PARKINSONISMO EM RATOS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, para

obtenção do título de Mestre em

Psicobiologia.

Orientadora: Profª Drª Rovena Clara

Engelberth

Natal

2016

Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Sistema de

Bibliotecas Biblioteca Central Zila Mamede / Setor de Informação e Referência

Silva, Cinthya Montenegro de Vasconcelos. Avaliação do perfil de sono/vigilia em um modelo crônico de parkinsonismo em ratos / Cinthya Montenegro de Vasconcelos Silva. - Natal, RN, 2016.

86 f. : il. Orientador: Rovena Clara Galvão Januário Engelberth. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.

1. Doença de Parkinson - Dissertação. 2. Sintomas não-

motores - Dissertação. 3. Sistema de temporização circadiano - Dissertação. 4. Ritmos biológicos - Dissertação. 5. Imunoistoquímica - Dissertação. I. Engelberth, Rovena Clara Galvão Januário. II. Título.

RN/UF/BCZM CDU 616.858

Título: Avaliação do perfil de sono/vigilia em um modelo crônico de parkinsonismo em

ratos

Autora: Cinthya Montenegro de Vasconcelos Silva

Data da defesa: 13/05/2016

Banca Examinadora:

___________________________________

Prof. Dr. José Ronaldo dos Santos

Universidade Federal de Sergipe, SE

___________________________________

Profa. Dra. Rovena Clara Engelberth

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

___________________________________

Prof. Dr. Mario André Leocadio Miguel

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais por sempre terem apoiado todas as decisões que tomei ao longo da

vida, possibilitando que eu chegasse até aqui.

Aos colegas de laboratório por proporcionar um convívio agradável durante todo o

período de mestrado, em especial a Thiago, Marília, Carlos, Diego e Kayo, por toda a

ajuda na construção deste trabalho, pelo apoio nos momentos de dificuldade e pelo

ótimo convívio que sempre mantivemos.

À minha orientadora, prof. Dra. Rovena Engelberth, que sempre me motivou, e com

muita paciência e atenção, dedicou seu valioso tempo para me orientar em cada passo

deste trabalho, compartilhando comigo suas idéias, conhecimentos e experiências.

A todos os amigos que direta ou indiretamente me incentivaram na conclusão deste

trabalho, em especial aos meus amigos desde a graduação: Anthony, Arthur, Bárbara,

Edilaine, Laíse, Nelson, Sabina e Tainá, por compartilhar comigo tantos momentos de

diversão e cumplicidade nos últimos 7 anos.

Ao laboratório de farmacologia da UFRN pelo fornecimento dos animais e

equipamentos de vídeo.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................1

1.1- Sistema de Temporização Circadiano..................................................................3

1.1.1- O Núcleo Supraquiasmático (NSQ)...................................................................8

1.2- STC e Parkinson..................................................................................................9

1.3- Modelos animais de DP.....................................................................................16

2- JUSTIFICATIVA.....................................................................................................22

3- OBJETIVOS...........................................................................................................23

4- HIPÓTESES E PREDIÇÕES.................................................................................24

5- METODOLOGIA....................................................................................................25

5.1- Sujeitos e design experimental...........................................................................25

5.2- Procedimentos Experimentais.............................................................................26

5.2.1- Teste de catalepsia..........................................................................................26

5.2.2- Registros cronobiológicos................................................................................26

5.2.3- Perfusões e microtomia....................................................................................28

5.2.4- Processamentos do material............................................................................29

5.3- Captação dos dados...........................................................................................30

5.4- Análise estatística...............................................................................................31

6- RESULTADOS.......................................................................................................32

6.1- Comportamento de catalepsia............................................................................32

6.2- Avaliação da distribuição temporal do sono........................................................33

6.3- Avaliação da fragmentação do sono...................................................................41

6.4- Avaliação neuroquímica do NSQ........................................................................41

7- DISCUSSÃO.........................................................................................................43

7.1- Efeitos motores do tratamento crônico com reserpina........................................43

7.2- Sintomas não-motores precedem o aparecimento dos sinais motores na

DP.............................................................................................................................46

7.2.1- Sono................................................................................................................50

7.4- Avaliação neuroquímica do NSQ........................................................................57

8- CONCLUSÕES.....................................................................................................61

REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO...........................................................................62

ANEXO

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação simplificada dos mecanismos intracelulares responsáveis

pela geração dos ritmos circadianos em mamíferos. 5

Figura 2: Esquema ilustrando os componentes básicos do sistema de temporização

circadiano. 8

Figura 3: Principais mecanismos gerados por alterações no sistema circadiano e

implicados com o agravamento da DP. 11

Figura 4: Representação esquemática do procedimento experimental. 31

Figura 5: Efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg (grupo RES6M - n=9 e grupo

RES10M - n=4) ou veículo (grupo CTR6M - n=8 e grupo CTR10M - n=4) no

comportamento de catalepsia. 32

Figura 6: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o

tempo de sono (em minutos) no intervalo 1 (ZT0-ZT6). 35








tempo de sono entre os dias 6-8 (início às 0h do dia 6). 39/40

ii

Figura 11: Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre a

quantidade de despertares por dia. 41

Figura 12. Fotomicrografia em campo claro de secções coronais do encéfalo de ratos

CTR6M (A, C e E) e RES6M (B, D e F), em nível médio, mostrando a

imunoistoquímica para VIP (A, B), VP (C, D) e NPY (E, F). 42

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Listagem de anticorpos 30

iv

ABREVIATURAS

5-HT Serotonina

6-OHDA 6-hidroxidopamina

CTR6M Controle 6 meses

CTR10M Controle 10 meses

DA Dopamina

DP Doença de Parkinson

EEG Eletroencefalograma

FIG Folheto intergeniculado

GABA Ácido gama-aminobutírico

GSH Glutationa reduzida

L-dopa Levodopa

LPS Lipopolissacarídeo

MPTP 1-metil-4-fenil-1-2-3-6-tetraidropiridina

NPY Neuropeptídeo Y

NSQ Núcleo Supraquiasmático

QSN Qualidade Do Sono Noturno

RD-1 Composto derivado da rodanina

RES6M Reserpina 6 meses

RES10M Reserpina 10 meses

v

SARA Sistema Ativador Reticular Ascendente

SDE Sonolência Diurna Excessiva

SNpc Substância Negra parte compacta

STC Sistema de Temporização circadiano

TGH Trato geniculohipotalâmico

TH Tirosina Hidroxilase

TRH Trato retinohipotalâmico

VIP Polipeptídeo Intestinal Vasoativo

VLPO Núcleo pré-óptico ventrolateral

VMAT1 Transportadores vesiculares de monoaminas tipo 1

VMAT2 Transportadores vesiculares de monoaminas tipo 2

VP Vasopressina

VPAC1 Receptor de VIP tipo 1

vi

RESUMO

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa e progressiva com

espectro clínico variado. Além dos sintomas motores clássicos, também podem surgir

complicações não-motoras, destacando-se problemas cognitivos, psiquiátricos e

autonômicos. Evidências demonstram que tais sintomas não-motores

frequentemente precedem o aparecimento dos sinais motores e são extremamente

relevantes, dado o impacto negativo que causam na qualidade de vida dos indivíduos.

Os sintomas não-motores podem apresentar múltiplas causas, dentre as quais, uma

possível disfunção do sistema circadiano. Dessa forma, diversos processos

fisiológicos influenciados pelo sistema de temporização circadiano (STC), como o

ciclo sono/vigília, podem se mostrar alterados em pacientes acometidos pela DP.

Nesse estudo, buscou-se avaliar o perfil do comportamento de sono/vigília em um

modelo crônico de DP em ratos, comparando com possíveis alterações

neuroquímicas no núcleo supraquiasmático (NSQ), o principal marcapasso do STC.

Para isto, ratos Wistar jovens (6 meses) e de meia idade (10 meses) foram

submetidos a um tratamento com administração repetida de reserpina (0,1mg/kg)

durante 20 dias. Ao longo do tratamento foram realizadas análises comportamentais

do sono, bem como a avaliação motora dos indivíduos. Após o fim do tratamento,

foram realizadas análises imunoistoquímicas no NSQ dos animais. Nossos

resultados mostraram que o tratamento crônico com reserpina promoveu

comprometimento motor progressivo tanto nos animais jovens quanto nos de meia

idade, sendo notados prejuízos significativos a partir do 12º dia de tratamento. Além

disso, as análises comportamentais revelaram perturbações no ciclo sono/vigília dos

animais tratados em comparação aos indivíduos controle, incluindo avanço na fase

de sono e aumento na fragmentação do sono. Tais alterações foram observadas a

vii

partir do 6º dia de tratamento, ou seja, anteriormente ao aparecimento dos sintomas

motores. As análises imunistoquímicas não permitiram observar efeitos significativos

do tratamento com reserpina sobre a composição neuroquímica do NSQ. Assim,

nossos dados reiteram a observação de que os sintomas não-motores precedem o

surgimento dos sintomas motores na DP e são extremamente importantes para o

diagnóstico clínico precoce da doença.

Palavras chave: Doença de Parkinson, Sintomas não-motores, Sistema de

Temporização Circadiano, Ritmos Biológicos, imunoistoquímica.

viii

ABSTRACT

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative and progressive disorder with varied

clinical spectrum. In addition to the classic motor symptoms may also emerge non-

motor complications, highlighting cognitive, psychiatric and autonomic problems.

Evidence shows that such non-motor symptoms often precede the onset of motor signs

and are extremely relevant given the negative impact they have on the quality of life of

the individuals. Non-motor symptoms may present multiple causes, among which a

possible dysfunction of the circadian system. Therefore, many physiological processes

influenced by the circadian timing system (CTS) as the sleep / wake cycle can show

alterations in PD patients. In this study we sought to evaluate the profile of sleep/wake

behavior in a chronic model of PD in rats compared with possible neurochemical

changes in the suprachiasmatic nucleus(SCN), the main pacemaker of the CTS. To

this end, young (6 months) and middle-age (10 months) wistar rats were subjected to

a treatment with repeated administration of reserpine (0.1 mg / kg) for 20 days. During

treatment sleep behavioral analysis were performed as well as the motor assessment

of the individuals. After the end of treatment, immunohistochemical analyzes were

performed in the SCN of the animals. Our results showed that chronic treatment with

reserpine promoted progressive motor impairment both in young as in middle-age

animals. It is noticed significant losses from the 12th day of treatment. Furthermore,

the behavioral analyzes revealed disturbances in sleep / wake cycle of the treated

animals compared to control subjects, including advanced sleep phase and increased

sleep fragmentation. Such changes were observed from the 6th day of treatment, prior

to the onset of motor symptoms. The immunohistochemical analysis not allowed to

observe significant effects of treatment with reserpine on the neurochemical

composition of the SCN. Thus, our data support the observation that non-motor

ix

symptoms precede the onset of motor symptoms in PD and are extremely important

for early clinical diagnosis of the disease.

Keywords: Parkinson's disease, non-motor symptoms, circadian timing system,

biological rhythms, immunohistochemistry.

1

1. INTRODUÇÃO

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa que afeta

cerca de 1 a 2% das pessoas acima de 65 anos de idade, sendo prevalente no sexo

masculino (Stokes, 2000; Aminoff, 2002). Esta enfermidade é caracterizada

clinicamente pelo início insidioso de sintomas motores como tremor, rigidez

muscular, bradicinesia e anormalidades posturais. Histopatologicamente, se

caracteriza, principalmente, por uma progressiva diminuição de neurônios

dopaminérgicos na substância negra parte compacta (SNpc), com a consequente

redução da inervação dopaminérgica no estriado (Bury e Pienaar, 2013). De maneira

adicional, a formação de agregados protéicos no interior do citoplasma dos

neurônios, denominados corpos de Lewy, constituem outra característica de

diagnóstico histopatológico da DP (Spillantini et al., 1997; Dauer e Przedborski,

2003).

Estudos sugerem que neurônios não-dopaminérgicos localizados em áreas

mais dispersas como tronco cerebral e sistema olfatório são também afetados na

DP, resultando na deficiência de outros neurotransmissores monoaminérgicos,

incluindo serotonina e noradrenalina (Braak et al., 2004). Concomitantemente com a

carência de dopamina, a depleção destes outros neurotransmissores termina por

ocasionar também a manifestação de sintomas não-motores na doença, que

compreendem alterações autonômicas, sensoriais e neuropsiquiátricas, como por

exemplo, depressão, ansiedade, apatia, alterações de personalidade, distúrbios do

sono e disfunções cognitivas, as quais progridem à demência em aproximadamente

30-40% dos casos (Cummings e Mega, 2003; Blonder e Slevin, 2011). Os sinais não-

motores podem preceder o aparecimento dos sintomas motores e são extremamente

relevantes, visto a frequência com que se apresentam e o impacto negativo que

2

causam na qualidade de vida dos pacientes, e, portanto, possibilitam um diagnóstico

mais cedo de DP (Chaudhuri et al., 2005; Chaudhuri e Naidu, 2008).

Atualmente, os tratamentos para DP são extremamente limitados, com terapias

que fornecem um mero alívio sintomático, mas falham em retardar o processo de

neurodegeneração (Cranwell-Bruce, 2010). Uma abordagem terapêutica comum

envolve estratégias de substituição da dopamina, utlizando principalmente o

precursor de dopamina Levodopa (L-dopa) em combinação com um inibidor

periférico de dopa descarboxilase (Benserazida ou Carbidopa). Embora bem-

sucedido no início, este tratamento medicamentoso de longo prazo leva à perda de

eficácia e efeitos secundários graves, incluindo discinesia (Bury e Pienaar, 2013).

Por outro lado, como o estresse oxidativo também desempenha um papel

importante na patogênese da DP, o tratamento neuroprotetor com antioxidantes

farmacológicos ou naturais pode ser útil para retardar ou prevenir o aparecimento de

sintomas da doença (Yacoubian e Standaert, 2009). Siddique et al. (2013)

demonstraram o potencial de extratos vegetais para melhorar disfunções motoras

em moscas transgênicas expressando forma de tipo selvagem do gene alfa-

sinucleína humano, cuja mutação está associada a casos de parkinsonismo familiar.

Além disso, estudos têm demonstrado potencial neuroprotetor de extrato de raiz de

Decalepis hamiltonii no rato albino e Drosophila (Jahromi et al., 2013; Haddadi et al.,

2013, 2014). Em estudo mais recente, foi observado que o RD-1 (composto derivado

da rodanina) atenuou o prejuízo na síntese de ATP e consequentemente nos

processos celulares dependentes de ATP, protegendo células neuronais contra

injúrias neurotóxicas ocasionadas pelo MPTP (1-metil4-fenil-1-2-3-6-

tetraidropiridina), uma neurotoxina usada em modelos animais da DP que provoca

3

sintomas da doença de forma permanente ao destruir neurônios dopaminérgicos

presentes na substância negra (Ren et al., 2015).

Inúmeros processos fisiológicos influenciados pelo sistema circadiano podem

sofrer alterações em pacientes acometidos pela DP. Por exemplo, o sistema nervoso

autônomo está sujeito à regulação circadiana: o equilíbrio entre os tônus simpático e

parassimpático varia em sincronia com o ciclo circadiano (Jain e Goldstein, 2012).

Em indivíduos saudáveis, o tônus parassimpático predomina durante o período

noturno / sono e age para reduzir a frequência cardíaca e a pressão. Estudos

demonstram que a regulação circadiana do sistema nervoso autônomo é

interrompida em pacientes com DP e esta perturbação provoca mudanças na

pressão arterial e frequência cardíaca, acarretando problemas como a hipotensão

ortostática (Kallio et al., 2000; Jain, 2011).

De maneira importante, distúrbios do sono também são frequentemente

exibidos pelos pacientes da DP, os quais relatam insônia primária, síndrome das

pernas inquietas e hipersônia em cerca de 90% dos casos (Stevens et al., 2004;

Thorpy e Adler, 2005; Ferreira et al., 2006; Matsui et al., 2006). Tais desordens

podem apresentar múltiplas causas, dentre as quais uma possível disfunção

circadiana, que apesar de pouco explorada na literatura, apresenta potencial papel

na patogênese dos sintomas não motores na DP (Videnovic e Golombek, 2013;

Willison et al., 2013).

Dessa forma, o sistema circadiano representa um alvo atraente como

potencial modulador de progressão da DP e da qualidade de vida dos pacientes.

1.1 Sistema de Temporização Circadiano

4

O movimento de rotação da Terra sobre seu eixo combinado ao movimento

de translação do planeta ao redor Sol, ocasiona tanto flutuações diárias quanto

sazonais no fotoperíodo, intensidade de luz, temperatura e disponibilidade de

alimento (Coomans et al., 2015) Assim, a maioria dos organismos vivos, desde

cianobactérias até os seres humanos, desenvolveu dispositivos endógenos capazes

de medir o tempo (relógios internos) que lhes permitem antecipar o horário do dia de

forma proativa e, dessa forma, organizar padrões periódicos de comportamento,

fisiologia e atividade bioquímica, os chamados ritmos biológicos. A presença destes

relógios internos permite uma melhor adaptação do organismo às mudanças que

ocorrem no ambiente e, dessa maneira, elevam a probabilidade de sobrevivência do

indivíduo (DeCoursey e Krulas, 1998). Outra importante característica dos ritmos

biológicos é que, apesar de serem influenciados por pistas ambientais - como por

exemplo variações de temperatura, ciclos de marés e estações da lua - eles

persistem, mesmo na ausência destas, confirmando assim, que são gerados por um

mecanismo endógeno.

Diversos organismos exibem um padrão rítmico claro, que oscila em uma

duração de aproximadamente 24 horas em uma enorme variedade de processos

bioquímicos, fisiológicos e comportamentais, os denominados ritmos circadianos

(Dibner et al., 2010). O mecanismo molecular subjacente à geração dos ritmos

circadianos é baseado em alças de feedback negativo e positivo, que atuam de forma

interconectada para regular a transcrição de genes do relógio (genes clock) e o

funcionamento de suas respectivas proteínas. O processo se inicia quando os

fatores de transcrição CLOCK e Bmal1 formam dímeros e promovem a transcrição

de famílias de genes-alvo: Period (Per1, Per2, Per3) e Cryptochrome (Cry1, Cry2),

levando ao aumento nos níveis das proteínas Per e Cry no citoplasma da

5

célula.Quando os níveis de Per e Cry atingem um limiar, elas então formam

heterodímeros e retornam ao nucleo celular, onde inibem a transcrição promovida

por CLOCK/Bmal1 (Kriegsfeld e Silver, 2006). Este ciclo de feedback dura

aproximadamente 24h, levando assim à geração de variações rítmicas de funções

celulares em diferentes tecidos e, consequentemente, à orquestração circadiana de

diversos processos regulatórios responsáveis por manter a homeostase corporal

(Bozek et al.,2009; Mazzoccoli et al., 2012; Figura 1). De forma adicional a este

circuito, outro ciclo de feedback negativo atua sobre receptores nucleares ROR (α,

ᵦ,ᵧ) para inibir a transcrição de Bmal1, contribuindo também para a precisão e

robustez do relógio (Welsh et al., 2010).

Figura 1. Representação simplificada dos mecanismos intracelulares responsáveis pela

geração dos ritmos circadianos em mamíferos (Adaptado de Kriegsfeld e Silver, 2006).

Em mamíferos, os ritmos circadianos são gerados e mantidos por um

sistema complexo e organizado: o sistema de temporização circadiano (STC), o qual

6

é constituído por um marcapasso central, vias de entrada que permitem a chegada

das informações ambientais e vias de saída que dão acesso aos eferentes fisiológicos

e comportamentais (Golombek e Rosestein, 2010; Figura 2). De forma mais

abrangente, o STC compreende ainda um número de osciladores periféricos ao longo

do corpo, orquestrados pelo marcapasso central, tanto por meio de vias neuronais,

através do sistema nervoso autônomo, quanto através de pistas humorais rítmicas

(como a oscilação circadiana de cortisol e os níveis de melatonina no sangue), e

ainda por meio de sinais sistêmicos, tais como os ciclos de temperatura (Barclay et

al., 2012).

O chamado marcapasso central do STC é representado pelo núcleo

supraquiasmático (NSQ), um par de aglomerados de pequenos neurônios situados

no hipotálamo anterior, imediatamente dorsal ao quiasma óptico e de cada lado do

terceiro ventrículo (Cassone et al., 1988). Essa estrutura foi descrita como

marcapasso ainda na década de 70, sendo confirmado definitivamente na década

seguinte, onde estudos verificaram que transplantes de NSQ fetal permitiam

recuperar a ritmicidade circadiana de animais tornados arrítmicos em consequência

da lesão bilateral do NSQ (Drucker-Colin, 1984; Ralph et al., 1990), ratificando-o

assim, como estrutura responsável por gerar e modular ritmos biológicos.

Com relação ao aspecto neuroquímico, o NSQ apresenta algumas variações

entre espécies, já tendo sido descritas inúmeras substâncias que atuam como

neurotransmissores ou neuromoduladores, sendo elas: vasopressina (VP),

polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), neuropeptideo Y (NPY), ácido gama-

aminobutírico (GABA), serotonina (5-HT), glutamato, colecistoquinina, encefalina,

somatostatina, bombesina, peptídeo liberador de gastrina, peptídeo relacionado ao

7

gene da calcitonina, substância P, angiotensina II, hormônio liberador de tireotropina,

tirosina hidroxilase, ubiquitina e óxido nítrico (Reuss, 2003).

Dentre as vias de entrada, destaca-se o trato retinohipotalâmico (TRH),

constituído por fibras originárias de células ganglionares da retina que percorrem o

nervo óptico e carreiam informações fóticas até o NSQ (Hendrickson et al., 1972;

Moore e Lenn, 1972). Trata-se da principal via sincronizadora dos ritmos circadianos

ao ciclo claro-escuro, sendo que na ausência de todas as outras vias visuais, o TRH

é suficiente para manter a sincronização comportamental ao ciclo claro-escuro (Klein

e Moore, 1979). Uma segunda via de aferência é representada pelo trato

geniculohipotalâmico (TGH), que transmite informações do folheto intergeniculado

do tálamo (FIG) até a porção ventrolateral do NSQ. Essa via tem como principal

mediador o NPY. Existe ainda uma terceira via de entrada para o NSQ, representada

pela projeção serotoninérgica proveniente dos núcleos da rafe, em especial o núcleo

mediano, que modula o NSQ em resposta a estímulos não-fóticos e indiretamente a

estímulos fóticos (Morin e Blanchard, 1999).

Além do NSQ, outro importante componente do STC é o FIG do tálamo, um

homólogo do núcleo pré-geniculado em primatas. Trata-se de uma fina lâmina celular

localizada entre os núcleos ventral e dorsal do complexo geniculado lateral do tálamo

de roedores (Hickey e Spear, 1976). O FIG recebe entrada retiniana das mesmas

células ganglionares que se projetam para o NSQ (Pickard, 1989). Contudo, não tem

um efeito direto na sincronização do ciclo claroescuro e sim na modulação da

transmissão da informação não-fótica ao NSQ, participando assim, no processo de

integração entre estímulos fóticos e não-fóticos.

Devido às suas conexões anatômicas, é possível que o FIG também esteja

associado com os sistemas visomotor e de sono/excitação (Horowitz et al., 2004;

8

Morin e Blanchard, 2005). Ademais, evidências morfológicas demonstram que o FIG

participa na via de sinalização da retina para as células neuroendócrinas

hipotalâmicas (Horvath, 1998).

Figura 2. Esquema ilustrando os componentes básicos do sistema de temporização

circadiano. (Cavalcante et al, 2006).

1.1.1 O Núcleo Supraquiasmático (NSQ)

O NSQ apresenta variações quanto à forma tridimensional, volume,

densidade e tamanho das células entre as espécies estudadas. Morfologicamente

cada NSQ, em camundongo, possui cerca de 10.000 neurônios (Abrahamson e

Moore, 2001); em ratos os valores são de aproximadamente 8.000 (Van den Pol,

1980) à 10.971 ± 1.179 (Moore et al., 2002). Estruturalmente, esses neurônios

estão divididos em duas subpopulações, os que recebem projeções do TRH e TGH

são produtores de VIP e estão localizados na porção ventrolateral do núcleo,

também chamada de “core”. A outra subpopulação é caracterizada por produzir VP

9

e está localizada na região dorsomedial do núcleo, ou “shell” (Abrahamson e

Moore, 2001; Morin, 2007; Mammen e Jagota, 2011).

O NSQ despontou como um importante elemento na sincronização circadiana

a partir de estudos realizados no início dos anos 70, quando trabalhos envolvendo

lesões nessa estrutura mostraram uma perda na função circadiana (Moore; Eichler,

1972) e estudos de projeções retinianas mostraram aferências diretas da retina,

que terminam na porção ventrolateral do NSQ, constituindo o TRH (Hendrickson et

al, 1972; Moore; Lenn, 1972). Estudos subsequentes confirmaram-no como

estrutura responsável por gerar e modular ritmos biológicos, sendo ele, muitas

vezes referido como o marcapasso central do STC. Dentre estes, podem-se

ressaltar estudos eletrofisiológicos que mostraram que células do NSQ

apresentavam ritmicidade circadiana na sua frequência de disparo de potenciais

de ação (Gillette, 1991), bem como na atividade metabólica (Schwartz, 1991;

Newman, 1991).

Várias evidências têm confirmado o NSQ como um marcapasso mestre,

devido sua necessidade para a marcação temporal e subsequente alocação

temporal da execução de comportamentos. Foi demonstrado que o transplante de

tecidos contendo NSQ para o cérebro de animais arrítmicos promove a restauração

do ritmo no animal receptor (Ralph et al., 1990). Além disso, os ritmos são

restaurados com o período do doador e o disparo neural do ritmo nas células do

NSQ persiste em preparações de tecido no qual o NSQ é isolado do restante do

cérebro (Green e Gillette, 1982).

1.2 STC e Parkinson

10

A ruptura do sistema de temporização circadiano é capaz de afetar

negativamente a qualidade do sono, o estado de alerta, o desempenho cognitivo,

o controle motor, a saúde mental e o metabolismo (Mohawk et al., 2012). Muitas

destas funções tornam-se prejudicadas em doenças neurodegenerativas, como a

doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington, nas quais

várias áreas do cérebro, incluindo os núcleos envolvidos na regulação dos ritmos

circadianos, são afetadas por processos neurodegenerativos (Bonaconsa et al.,

2013; Hastings e Goedert, 2013). Logo, não é de se admirar que esses distúrbios

relacionem-se frequentemente com a alteração progressiva dos ciclos normais de

repouso-atividade, do sono e do estado de alerta. Tal perturbação dos ritmos

circadianos não só contribui para a morbidade e má qualidade de vida, mas também

pode estar envolvido na progressão do processo patogênico em si (Videnovick et

al., 2014).

Os mecanismos moleculares subjacentes à perda neuronal no Parkinson

não são totalmente conhecidos, mas sabe-se que a disfunção mitocondrial,

incluindo alterações na bioenergética, homeostase do cálcio e geração de espécies

reativas de oxigênio, representam críticos processos envolvidos na morte celular

que caracteriza a DP (Schapira et al., 1989, 1990; Pienaar e Chinnery, 2013). Neste

sentido, estudos mostraram que alterações circadianas como a deleção de um

importante gene do relógio - o Bmal1 - leva à disfunção mitocondrial, com

consequente aumento do nível de espécies reativas de oxigênio em órgãos

periféricos (Kondratov et al., 2006; Khapre et al., 2011; Lee et al., 2011). Além disso,

foi observado que a alteração mitocondrial pode ser um defeito que ocorre

precocemente na patogênese da DP e parece estar fortemente relacionado com a

11

progressão de seus sintomas. (Park et al., 2009; Morais et al., 2010; Xie et al.,

2010).

Da mesma forma, perturbações no sistema imune também parecem estar

relacionadas com a evolução da DP. Sabe-se que o relógio molecular é encontrado

em muitas das células-chave envolvidas na resposta imune, e assim, muitos

parâmetros imunes apresentam variações circadianas, incluindo os níveis de

citocinas e contagens de células imunocompetentes. Dados recentes

demonstraram que as proteínas relógio podem regular diretamente a expressão de

citocinas pró-inflamatórias através da via de sinalização de NF-kB (Cermakian et

al., 2013). Logo, alterações no sistema circadiano podem acarretar modificações

na resposta imune, ocasionando o aparecimento de altos níveis de citocinas

próinfalamórias e inflamação crônica pelo corpo. Em conjunto, esses dados

sugerem que diversos mecanismos desencadeados pelo comprometimento do

sistema circadiano estão envolvidos com a progressão da DP (Figura 3).

Figura 3. Principais mecanismos gerados por alterações no sistema circadiano e

implicados com o agravamento da DP. (Adaptado de Willison et al, 2013).

Distúrbios em vários ritmos fisiológicos são consistentemente documentados

em pacientes com DP (Videnovic e Golombek, 2013). Inúmeros estudos relataram

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969996114002551#bb0405

12

flutuações diárias de fatores clínicos e biológicos na DP, incluindo a atividade

motora diária suprimida (Van Hilten et al., 1993; Bonuccelli et al., 2000), perda do

ritmo circadiano normal da pressão arterial e da frequência cardíaca (Pursiainen et

al., 2002; Ejaz et al., 2006) , sono prejudicado e alerta durante o dia (Comella, 2007;

Verbaan et al., 2008), bem como flutuações das catecolaminas (Sowers e

Vlachakis, 1984), cortisol (Hakamäki et al., 1998) e os níveis de melatonina (Fertl

et al., 1993; Bordet et al., 2003), sugerindo modificações do sistema circadiano na

DP.

Pacientes com DP frequentemente sofrem de mais de um sintoma causado

por disfunção do sistema nervoso autônomo (Goldstein, 2003), sendo que a maior

parte destes apresenta pelo menos um sintoma cardiovascular (Stuebner et al.,

2013). Estudos envolvendo 24h de monitorização ambulatorial da pressão arterial

em pacientes com DP demonstrou uma reversão do ritmo circadiano normal da

pressão arterial, aumento da variabilidade da pressão arterial diurna, hipotensão

pós-prandial, e pressão arterial noturna elevada (Senard et al., 1992; Kallio et al.,

2000). Ademais, exames eletrocardiográficos revelaram uma diminuição da

atividade simpática durante o dia, combinada com a perda de variabilidade da

frequência cardíaca circadiana e desaparecimento do pico simpático da manhã

(~08:00–10:00 h) (Devos et al., 2003).

No contexto das variações dos níveis de melatonina na DP, muitas

evidências já foram obtidas. Em estudo com 26 pacientes de DP, com ou sem

complicações motoras, que foram tratados com agentes dopaminérgicos, foi

observada uma diminuição da amplitude da flutuação de melatonina por parte

desses indivíduos, como também um avanço de fase de secreção nessas pessoas,

em comparação com os pacientes recém-diagnosticados que ainda não estavam

13

recebendo tratamento (Bordet et al., 2003). Estes achados sugerem uma tendência

para uma mudança de fase e uma redução da amplitude da secreção de melatonina

durante a evolução da DP e enfatizam a necessidade de investigar os efeitos da

medicação dopaminérgica na função circadiana. Da mesma forma, em outro estudo

realizado utilizando 20 pacientes com DP, uma amplitude reduzida do ritmo de

melatonina foi observada (Videnovic et al., 2014).

Com relação às variações de cortisol no Parkinson, um estudo com 12

pacientes de DP mostrou que a taxa média da produção de cortisol durante 24h foi

maior e a curva média de secreção de cortisol mostrou-se mais linear (indicando

uma variação diurna reduzida) no grupo DP (Hartmann et al., 1997). Ainda com

relação às alterações em ritmos fisiológicos verificadas na doença parkinsoniana,

já foi ressaltado que o ritmo de temperatura corporal está preservado na DP

(Pierangeli et al., 2001), entretanto, a temperatura corporal basal encontra-se

diminuída em pacientes com sintomas da doença (Cagnacci et al., 1990). Além

disso, pacientes de DP em comorbidade com depressão exibem ritmos circadianos

de temperatura retal alterados e reduzidas amplitudes de temperatural corporal

(Suzuki et al., 2007).

Flutuações circadianas no desempenho visual, medidas através da

sensibilidade ao contraste, são também modificadas na DP (Struck et al., 1990),

sendo que tais alterações se devem provavelmente à regulação prejudicada de

dopamina da retina, que exibe um ritmo circadiano endógeno independente dos

ciclos claro-escuro (Wirz-Justice et al., 1984). Como as alterações circadianas na

sensibilidade ao contraste pode ocorrer independentemente das oscilações

circadianas em sintomas motores, é possível que a retina e outras estruturas

14

anatômicas envolvidas no processamento visual tenham diferentes limiares de

resposta à sinalização circadiana de dopamina (Dearry e Burnside, 1986).

Alterações nos padrões normais de sono são descritas na DP, chegando a

afetar até 90% dos pacientes (Raggi et al., 2013). A etiologia desses distúrbios

deve-se, provavelmente, a múltiplos fatores, incluindo a influência de

características motoras associadas à DP no sono, efeitos adversos de

medicamentos antiparkinsonianos e neurodegeneração de áreas centrais que

regulam o sono, como o núcleo da rafe e locus coeruleus.

Em estudo recente, Setthawatcharawanich et al. (2014) analisaram a

prevalência de sonolência diurna excessiva (SDE) e a qualidade do sono noturno

(QSN) em pacientes de DP idosos. SDE foi relatada por 15,1% dos pacientes

enquanto que QSN deficiente foi descrita por 37% dos pacientes, havendo

diferenças significativas entre os doentes e o grupo controle. A análise também

mostrou que distúrbios de sono e necessidade de medicamentos para dormir

apresentaram escores significativamente mais elevados para os indivíduos

doentes. Além disso, 20,5% dos pacientes de DP vivenciaram ataques súbitos de

sono enquanto estavam dirigindo, se alimentando ou trabalhando.

No que concerne às flutuações dos sintomas motores no Parkinson, vários

estudos de actigrafia revelaram nível mais baixo no pico de atividade e menor

amplitude do ciclo de atividade-repouso em pacientes idosos com DP em

comparação a idosos saudáveis (Porter et al., 2008; Verbaan et al., 2008). Também

foi visto que pacientes com DP têm um padrão mais fragmentado de atividade,

apresentando transições de períodos com atividade elevada para períodos de baixa

atividade, levando assim, a ritmos menos previsíveis de atividade-repouso em

relação aos que são vistos em pessoas idosas saudáveis (Whitehead et al., 2008).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Setthawatcharawanich%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25632617

15

Este padrão diário observado parece ser independente do sincronismo de

medicações dopaminérgicas e, desta forma, pode estar relacionado com a

regulação circadiana dos sistemas dopaminérgicos. Em apoio a esta hipótese,

verifica-se que a capacidade de resposta dos sintomas motores da PD a

tratamentos dopaminérgicos diminui ao longo do dia, apesar da ausência de

alterações significativas na farmacocinética da L-dopa (Bonuccelli et al., 2000).

Estudos mostram que a dopamina (DA) está intimamente relacionada com

a função do relógio circadiano: a DA pode modular a expressão de genes relógio

tanto in vivo quanto in vitro (Gravotta et al., 2011, Imbesi et al., 2009; McClung et

al., 2005) e ainda, foi demonstrado que a lesão do sistema nigroestriatal perturba

os ritmos diários e circadianos de repouso/atividade e expressão de genes relógio

no estriado (Gravotta et al., 2011). Na retina, a dopamina é responsável por modular

a expressão rítmica de melanopsina, um fotopigmento encontrado em células

ganglionares da retina, que tem sido implicado na regulação circadiana (Sakamoto

et al., 2005).

Uma evidência adicional para o papel da DA no sistema de temporização

circadiana vem de lesões neuroquímicas com injeção de 6-hidroxidopamina (6-

OHDA), as quais rompem padrões circadianos normais de comportamento e

expressão do gene relógio Per2 (Hood et al., 2010). Além disso, existem trabalhos

que demonstram os fortes efeitos circadianos de drogas dopaminérgicas, como a

cocaína e a metamfetamina alterando os ritmos circadianos em roedores (Ironside

et al., 2010; Glass et al., 2012). Resultados obtidos em camundongos mostraram

que o tratamento com metamfetamina pode restaurar o ritmo circadiano de atividade

locomotora, em animais que tiveram o seu NSQ lesionado eletronicamente (Honma






16

et al., 1987), indicando assim que drogas dopaminérgicas podem modular o sistema

circadiano mesmo na ausência do relógio circadiano central.

Apesar da vasta demonstração das alterações circadianas durante a

evolução da DP, na literatura, as alterações neuroquímicas e morfológicas nas

estruturas do sistema de temporização dos ritmos circadianos ainda são

negligenciadas (Videnovic e Golombek, 2013).

1.3 Modelos animais de DP

A etiologia da DP é desconhecida em grande parte dos pacientes, porém,

acredita-se que o distúrbio decorra de uma combinação multifatorial,

compreendendo tanto elementos genéticos, quanto ambientais (Kandel et al., 2014).

Nesse sentido, os modelos animais de DP têm se mostrado altamente eficazes na

busca de pistas sobre a causa subjacente da doença, bem como no desenvolvimento

de novas estratégias terapêuticas e na compreensão da natureza dos processos

patogênicos envolvidos na perda neuronal (Duty e Jenner, 2011).

Muito embora o parkinsonismo para o qual uma clara etiologia genética

possa ser atribuída represente apenas 8-10 % de todos os casos diagnosticados de

DP, significantes achados a respeito do conhecimento e da classificação da

patologia vêm sendo obtidos nas pesquisas com modelos genéticos. Neste contexto,

incluem-se novas descobertas relacionadas a casos de parkinsonismo familiar, como

por exemplo, formas hereditárias da doença causadas pela mutação de genes que

seguem um modo autossômico dominante de transmissão - incluindo alfa-sinucleína

e Quinase rica em repetição de leucina 2 - e genes autossômicos recessivos como

17

Parkin, identificado como principal causador de Parkinsonismo de início precoce

(Wider et al., 2010a,b; Bury e Pienaar, 2013).

Atualmente, existem modelos animais genéticos de DP em diferentes

organismos-modelo, incluindo roedores, Drosophila melanogaster e Caenorhabditis

elegans (Moore et al., 2005). Tais modelos oferecem a vantagem de analisar

minuciosamente a atuação de genes e proteínas implicados na DP, fornecendo

assim, robustas evidências moleculares e bioquímicas sobre a patologia em questão.

As técnicas empregadas nos modelos genéticos baseiam-se, sobretudo, na

superexpressão gênica autossômica dominante ligada ao parkinsonismo e no

desenvolvimento de linhagens de animais transgênicos knock-in/knock-out para

determinados genes autossômicos recessivos, relacionados às formas hereditárias

recessivas da doença (Dawson et al., 2010; Kurz et al., 2010; Li et al., 2010). Os

animais knock-out transportam um gene que foi funcionalmente inativado para criar

uma diminuição na expressão e perda da função, enquanto que os knock-in são

produzidos através da inserção de um gene em um locus exato onde fica

superexpresso. Ambos os mecanimos decorrem da introdução artificial de uma

mutação especificamente relacionada à DP no DNA de células germinativas, por

meio de recombinação homóloga, utilizando células-tronco embrionárias injetadas

em blastocistos. Esta é então repassada às gerações seguintes através da

reprodução dos animais (Bury e Pienaar, 2013).

Por outro lado, uma ampla gama de modelos animais farmacológicos

encontra-se também disponível para o estudo da DP. Estes permitem que várias

características fenotípicas da doença humana possam ser mimetizadas em animais,

especialmente roedores, e envolvem, na sua grande maioria, a administração aguda

18

de substâncias neurotóxicas, tais como reserpina, haloperidol, rotenona, paraquat,

6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP).

No modelo do haloperidol, esta substância é administrada de forma aguda

e após 60 minutos os animais passam a manifestar sintomas como rigidez muscular

e catalepsia (Sanberg, 1980). O haloperidol age ao antagonizar receptores

dopaminérgicos do tipo D2 e em menor extensão os do tipo D1 nos neurônios

espinhosos médios que compõem as vias indireta e direta do circuito motor,

respectivamente, levando ao aparecimento dos déficits motores observados nos

animais. Outro estudo demonstrou ainda que a administração aguda de haloperidol

reduz o teor de dopamina, noradrenalina e serotonina no estriado (Kulkarni et al.,

2009). Nesse modelo, a eficácia de novos agentes anti-parkinsonianos é avaliada

através da inversão da rigidez e/ou da catalepsia.

No modelo da 6-OHDA, a caracterização do análogo hidroxilado da

dopamina (6-OHDA) como uma toxina indutora de degeneração de neurônios

dopaminérgicos no trato nigro-estriatal, o tornou um modelo largamente utilizado na

indução do parkinsonismo em roedores (Ungerstedt, 1968). Neste modelo, a 6-

OHDA é injetada diretamente no trato nigro-estriatal, onde no interior dos neurônios

dopaminérgicos inicia o processo de degeneração através da combinação de

estresse oxidativo e disfunção respiratória mitocondrial. O modelo 6-OHDA também

imita muitas das propriedades bioquímicas características da DP, incluindo redução

dos níveis de dopamina e tirosina hidroxilase no estriado (enzima limitante no

processo de biossíntese da dopamina). Dados obtidos permitem sugerir a existência

de uma ligação entre a patogênese da 6-OHDA e da DP, pois após a detecção de 6-

OHDA no estriado e na urina de pacientes de Parkinson tratados com L-dopa

(Andrew et al., 1993), foi constatado que a 6-OHDA pode representar um

19

componente endógeno da DP ou ainda, que pode desempenhar um importante papel

no processo de estresse oxidativo aumentado e na degeneração acelerada de

células da substância negra residual em pacientes que receberam L-dopa (Müller et

al., 2004).

MPTP (1-metil-4-fenil-1-2-3-6-tetraidropiridina) é uma neurotoxina potente

usada para mimetizar a DP em uma ampla gama de organismos, incluindo primatas

não-humanos , porcos-da-índia , ratos , e gatos ( Chiueh et al , 1984; Schneider et al.,

1986; Meredith et al., 2008) . Por ser lipofílico, o MPTP atravessa rapidamente a

barreira hematoencefálica e é convertido no metabólito tóxico MPP+. Uma vez

acumulado em neurónios dopaminérgicos , o MPP + induz a neurotoxicidade,

principalmente através da inibição do complexo I da cadeia de transporte de elétrons

mitocondrial, resultando na depleção de ATP e aumento do estresse oxidativo (Nicklas

et al., 1985; Mizuno et al., 1987).

Roedores tratados com reserpina constituíram um dos primeiros modelos

animais utilizados na pesquisa da DP, sendo este modelo fundamental na primeira

demonstração da eficácia terapêutica do que ainda continua a ser o tratamento

padrão-ouro para DP, a L-dopa (Carlsson et al., 1957). Do ponto de vista da doença,

o modelo da reserpina também fez contribuições importantes para a nossa

compreensão da relação entre a depleção de monoaminas e os sintomas

parkinsonianos.

A reserpina age inibindo os transportadores vesiculares de monoaminas,

VMAT1 e 2. Isto leva à perda de capacidade de armazenamento e, por conseguinte,

o esgotamento de monoaminas cerebrais e periféricas, incluindo noradrenalina,

serotonina e dopamina, já tendo sido observado que a reserpina produz cerca de

85% de perda dopaminérgica na SNpc e mais de 95% de depleção de dopamina no

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3234449/#A009316C107



20

corpo estriado 2h após a injeção (Heeringa e Abercrombie, 1995). Do ponto de vista

comportamental, a reserpina induz características de acinesia e rigidez dos membros

posteriores em ratos que são representativos dos sintomas associados à DP.

Estudos sobre a DP fazem uso da administração aguda de reserpina para

induzir o parkinsonismo farmacológico temporário, obtendo sintomas como

catalepsia, tremores e rigidez muscular (Kaur e Starr, 1995; Nakagawa et al., 1997).

Em tais trabalhos, a dose de reserpina empregada, geralmente, promove

comprometimento motor grave, excluindo a possibilidade de outras análises

comportamentais, incluindo tarefas cognitivas. No entanto, alguns estudos

demonstraram comprometimento da memória, na ausência de alterações motoras

após a administração de doses únicas mais baixas de reserpina (Carvalho et al.,

2006; Fernandes et al., 2008).

Estudo realizado por Fernandes et al. (2012) mostrou que a administração

repetida de uma dose baixa (0,1 mg/kg) de reserpina induz um aparecimento gradual

de sinais motores de parkinsonismo farmacológico em ratos. Em um trabalho

posterior, Santos et al. (2013) demonstraram que o tratamento repetido com

reserpina (0,1 mg/kg) induziu uma perda de memória antes do aparecimento gradual

dos sinais motores, como também causou o aumento da ansiedade nos animais

tratados, uma característica observada em pacientes com DP. Portanto, o modelo

de administração repetida de reserpina apresenta uma validade de face estendida

quando comparado a outros modelos animais da doença, sendo capaz de imitar a

natureza progressiva dos sintomas na DP, de tal forma que pode ser utilizado para

os estudos da plasticidade e dos mecanismos subjacentes à doença. Assim sendo,

o presente trabalho usará como modelo de parkinsonismo farmacológico o

tratamento com reserpina em baixa dose (0,1mg/kg) para avaliação da

21

patogenicidade subjacente aos sintomas não-motores da doença, mais

especificamente sobre o perfil de sono/vigília, utilizando para tanto um modelo em

caráter crônico, que ainda é pouco explorado na literatura.

22

2. JUSTIFICATIVA

Os sintomas não-motores são exibidos com alta frequência na DP, afetando

negativamente a qualidade de vida dos pacientes e seus cuidadores. Inúmeros

estudos têm mostrado que o aparecimento de tais sintomas pode preceder o

surgimento dos sintomas motores clássicos, utilizados para diagnóstico na clínica e,

desta forma, o reconhecimento aliado a um maior entendimento sobre os sintomas

não-motores teria implicações importantes para a melhoria do diagnóstico e

tratamento precoce da DP. Uma possível disfunção circadiana subjacente tem sido

apontada como uma das múltiplas causas de muitas dessas desordens não-motoras,

tais como os distúrbios do sono e alterações autonômicas. Contudo, apesar da

possível importância do sistema -circadiano na patogênese dos sintomas não-

motores da DP, pouco tem sido explorado a respeito desse tema na literatura,

principalmente quando se trata da utilização de modelos crônicos para o estudo

dessa patologia.

De forma adicional, levando-se em consideração ainda o envelhecimento do

sistema circadiano, torna-se interessante o estudo do aparecimento dos sintomas

parkinsonianos – tanto motores quanto não-motores – entre indivíduos mais velhos.

Assim, no presente trabalho, utilizamos um modelo animal crônico para a

Doença de Parkinson (Modelo da Reserpina). Realizamos a análise comportamental

do perfil de sono/vigília apresentado pelos animais nesse modelo, bem como, uma

análise neuroquímica dos principais componentes do NSQ, comparando animais

jovens (6 meses) e de meia idade (10 meses) para avaliar também o possível efeito

da idade sobre os parâmetros analisados.

23

3. OBJETIVOS

- Objetivo Geral

O presente estudo visa promover a avaliação comportamental do perfil de

sono/vigília em um modelo animal crônico para a doença de Parkinson, comparando

com possíveis alterações neuroquímicas no núcleo supraquiasmático.

- Objetivos Específicos

• Avaliar o padrão de sono/vigília apresentado pelos animais ao longo da

progressão da doença;

• Fazer uma correlação entre os comportamentos observados durante o

estabelecimento do modelo animal de Parkinson com os resultados obtidos

através das análises imunoistoquímicas no NSQ desses animais.

• Analisar o conteúdo neuroquímico dos neurotransmissores VIP, VP, e NPY

no NSQ através da técnica de imunoistoquímica, comparando animais

tratados com controles.

24

4. HIPÓTESES E PREDIÇÕES

Hipótese 1: O tratamento crônico com reserpina promove perturbações nos padrões

normais de sono e vigília.

Predição 1: Devido a depleção de monoaminas ocasionada pela reserpina, os

processos regulados pelo sistema ativador reticular ascendente (SARA) -

responsável por promover a vigília - dependentes da participação de sistemas

monoaminérgicos, são alterados.

Hipótese 2: O NSQ apresenta alterações neuroquímicas decorrentes do tratamento

crônico com reserpina.

Predição 2: Com o estabelecimento do processo patogênico ocorre uma diminuição

dos componentes neuroquímicos no núcleo supraquiasmático, que podem alterar o

papel funcional dessa estrutura na geração e manutenção dos ritmos biológicos.

Hipótese 3: Mudanças no comportamento de sono/vigília correlacionam-se a

alterações no NSQ decorrentes da exposição ao tratamento crônico com reserpina.

Predição 3: Devido a interferência no NSQ, diversos ritmos biológicos regulados por

essa estrutura podem se mostrar alterados, dentre eles, os ritmos de atividade

locomotora e ciclo sono/vigília.

25

5. METODOLOGIA

5.1.Sujeitos e design experimental

Foram utilizados, no total, 25 ratos Wistar machos (320-480g), com idades de

6 (n=17) e 10 (n=8) meses, acomodados em gaiolas plásticas equipadas com

bebedouro, tampa de grade com suporte para a ração e cama de maravalha. Os

animais foram expostos a ciclo claro/escuro 12h:12h, com luzes acesas às 06h30 e

tiveram acesso ad libitum a água e ração (Labina- Purina®). Todas as gaiolas foram

colocadas dentro de uma sala livre de interferências externas, local em que foram

mantidas durante todo o período experimental e onde foram realizados os testes. Os

procedimentos experimentais usados nesse estudo foram aprovados pelo Comitê de

Ética para Uso Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob o

protocolo nº 017/2015.

A droga utilizada foi a reserpina (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO),

dissolvida em ácido acético glacial e água destilada. O Veículo consistiu na mesma

quantidade de ácido acético e água destilada como na solução de reserpina. Estas

soluções foram injetadas por via subcutânea (sc). Os animais foram submetidos a

um período de habituação no qual foram manuseados durante 10 min por 5 dias,

antes do início dos procedimentos experimentais. Posteriormente, os ratos foram

divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo de animais controle com 6 meses

de idade (CTR6M: n =8), grupo de animais tratados com reserpina com 6 meses de

idade (RES6M: n =9), grupo de animais controle com 10 meses de idade (CTR10M:

n=4) e grupo de animais tratados com reserpina com 10 meses de idade (RES10M:

n=4). Os animais receberam injeções subcutâneas de veículo (CTR6M/ CTR10M) ou

0,1 mg / kg de reserpina (RES6M/RES10M), em um volume de 1 ml / kg de peso

26

corporal, a cada dois dias (10 injeções). Os ratos de todos os grupos foram

sacrificados 48 h após a 10ª injeção. O procedimento experimental está

esquematizado na figura 4.

5.2. Procedimentos experimentais

5.2.1. Teste de catalepsia

Todos os animais foram submetidos ao teste antes da 1ª injeção e, posteriormente,

a cada dois dias, uma hora antes de cada injeção. O comportamento de catalepsia

foi avaliado colocando-se o animal com ambas as patas dianteiras sobre uma barra

horizontal de vidro elevada 9,0cm da superfície de apoio das patas traseiras. O tempo

que cada animal permaneceu nessa posição foi quantificado em segundos, até um

limite de 180 s. Foi utilizado o valor da média de três exposições realizadas

consecutivamente.

5.2.2.Registros Cronobiológicos

Coleta de dados comportamentais de sono

Nesta etapa do delineamento experimental todos os animais foram filmados por um

sistema de câmera de vídeo (Webcam HD 720P C270 Logitech). O estado de sono

foi identificado por comportamentos facilmente observados e bem descritos na

literatura, que incluem a adoção de uma postura de sono espécie específica com os

olhos fechados (Campbell e Tobler, 1984; Nicolau et al., 2000). Dessa forma,

identificamos os animais em estado de sono somente quando exibiram

27

simultaneamente os seguintes comportamentos: estavam posicionados de lado ou

curvados com a cabeça voltada para seu ventre, seus olhos estavam fechados e se

não fizeram nenhum movimento além de breves alterações transitórias na postura

por pelo menos 40s (Schwatz e Smale, 2005; Loh et al., 2010; Kudo et al., 2011). O

comportamento de sono/vigília foi gravado diariamente durante todo o período de

tratamento e analisado visualmente em janelas de 5min. Para fins de análise, cada

dia foi dividido em quatro intervalos iguais: intervalo 1(ZT0-ZT6), intervalo 2 (ZT6-

ZT12), intervalo 3(ZT12-ZT18) e intervalo 4(ZT18-ZT24), sendo ZT0 o momento em

que as luzes eram acesas (06h30). As janelas em que os animais apresentaram

comportamento de sono foram somadas e utilizadas para determinar a quantidade

total de tempo de sono em cada intervalo.

Análise da distribuição temporal de sono 12-12h (Dias 6-8)

Além do registro do comportamento de sono nos 4 intervalos diários, foi realizada

uma análise acerca do tempo total de sono a cada 12h, iniciando às 0h do 6º dia de

tratamento até as 23h59 do 8º dia. Foram utilizados os mesmos parâmetros

comportamentais considerados na etapa anterior para fim de avaliação do estado de

sono. O comportamento de sono/vigília foi analisado visualmente em janelas de

5min. As janelas em que os animais apresentaram comportamento de sono foram

somadas e utilizadas para determinar a quantidade total de tempo de sono a cada

12h.

28

Avaliação da fragmentação do sono

Através da análise dos vídeos também procuramos observar o aspecto de

fragmentação do sono, tanto dos animais tratados com reserpina quanto dos animais

dos grupos controle. Para tanto, foi realizada a contagem da quantidade de

despertares que cada animal apresentou por dia. Ao final de cada dia, as médias de

cada grupo experimental foram calculadas, servindo de base para o cálculo das

médias gerais exibidas por cada grupo no fim do período experimental.

5.2.3. Perfusões e Microtomia

Após a finalização dos testes comportamentais, todos os ratos foram anestesiados

por via intraperitoneal (i.p.) utilizando tiopental na dose de 90 mg/kg de peso do

animal. Em seguida foram perfundidos transcardicamente com a impulsão de

solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Liquemine,

Lilly, 2 ml/1000ml de solução salina) com o objetivo de lavar o sistema circulatório do

animal prevenindo a formação de coágulos e possibilitando a melhor penetração do

fixador nos tecidos. Em seguida foi introduzida solução fixadora (paraformaldeído a

4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, acrescido de ácido pícrico a 0,2% e

glutaraldeido a 0,2%) através de uma bomba peristáltica. Os encéfalos foram

retirados da cavidade craniana, por fratura dos ossos da calota craniana, em seguida

pós-fixados na mesma solução fixadora, acrescida de sacarose a 30% por 4 horas e

então colocados em outra solução de sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH

7,4, até serem cortados no criostato. Foram obtidas secções frontais de 30 µm, as

quais foram distribuídas sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido

contendo tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. Cada um desses compartimentos recebeu 1

29

de 6 secções, de maneira que a distância entre uma secção e a seguinte seja de

aproximadamente 180 µm. Estes cortes foram armazenados em uma solução

anticongelante a base de etileno-glicol e tampão fosfato, e, posteriormente,

conservados a 4ºC até as reações de imunoistoquímica ou de coloração.

5.2.4. Processamentos do material

Processamento Imunoistoquímico

Séries diferentes foram submetidas à análise imunoistoquímica, empregando o

protocolo ABC (avidina-biotina-complexo peroxidase). Nesta análise, anticorpos

específicos foram usados para identificar a expressão de neurotransmissores (ver

tabela 1). As secções de um compartimento de cada vez foram lavadas (5 vezes de

8 minutos) com tampão fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4, sob agitação automática, e pré-

tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PB por 20 minutos para inativação

da peroxidase endógena. Os cortes foram então colocados em contato com um

anticorpo específico (primário) diluído em PB contendo Triton-X 100 (ICN

Biomedicals) a 0,4% e albumina bovina a 2% durante, aproximadamente, 18 a 20

horas (25ºC). Em seguida, as secções foram colocadas em contato com o anticorpo

secundário biotinilado, diluído em Triton X 100 a 0,4%, por 2 horas. Após esta etapa,

os cortes foram incubados numa solução contendo avidina e biotina (0,5%)

previamente diluída (30 minutos antes) em Triton-X 100, por 2 horas. Para visualizar

a reação, os cortes foram colocados num recipiente em contato com um cromógeno,

uma solução de diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St Louis, MO, USA) a 2,5% diluída

30

em PB (0,1M / pH 7,4). A reação final foi revelada adicionando-se uma solução

contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,03% como substrato.

Tabela 1: Listagem de anticorpos. Ticorpos

5.3. Captação dos dados

Os cortes foram montados em lâminas de vidro previamente gelatinizadas com

gelatina-alúmem-cromo. Após secarem à temperatura ambiente, as lâminas foram

mergulhadas em uma solução de tetróxido de ósmio a 0,05%, por 30 segundos, para

intensificação da reação. Posteriormente, passaram pelos processos de

desidratação em álcoois de concentrações gradativamente maiores e

deslipidificação com xilol, e, em seguida, foram cobertas com lamínulas usando-se

DPX. A avaliação dos resultados imunoistoquímicos foi realizada com o auxílio de

um microscópio óptico (Olympus, BX-41) utilizando campo claro ou escuro conforme

a necessidade. As imagens foram digitalizadas usando uma câmera (Nikon, DXM-

1200) acoplada ao microscópio e conectada a um computador, sendo

Antígeno Anticorpo

Primário

Anticorpo

Secundário

NPY Coelho

[1:1000]

Cabra [1:1000]

VIP Coelho

[1:1000]

Cabra [ 1:1000]

Jackson

VP Coelho

[1 : 1000]

Cabra [1:1000]

Jackson

31

subsequentemente operacionalizadas para ajuste de brilho e contraste com o

programa Adobe Photoshop 7.0.

5.4. Análise estatística

Significâncias estatísticas entre os quatro grupos experimentais para o

comportamento de catalepsia e avaliação da distribuição temporal de sono foram

determinadas por meio de ANOVA para medidas repetidas seguida por post hoc com

teste de Tukey. Para avaliação da fragmentação do sono foi realizada ANOVA de

uma via seguida por post hoc com teste de Tukey. Para todos os testes, os valores

foram considerados significativamente diferentes se p<0,05. As análises foram

realizadas através do IBM SPSS Statistics for Windows (versão 20.0. Armonk, NY).

Valores expressos como média ± desvio padrão da média (D.P.).

Figura 4. Representação esquemática do procedimento experimental.

32

6.RESULTADOS

6.1. Comportamento de Catalepsia

ANOVA para medidas repetidas revelou efeitos significativos do tratamento

(p<0,001), tempo - representado pelos dias de tratamento - (p<0,001) e a interação

tratamento x tempo (p<0,001) sobre o comportamento de catalepsia. A

administração repetida de reserpina promoveu um aumento progressivo no tempo

de catalepsia apresentado pelos grupos RES6M e RES10M, que apresentaram

diferenças significativas com relação aos grupos CTR6M e CTR10M,

respectivamente, desde o 12º dia de tratamento (48h após a 6ª injeção) até o 20º dia

de tratamento (48h após a 10ª injeção). Ademais, o grupo RES10M exibiu duração

do tempo de catalepsia significativamente superior ao grupo RES6M, a partir do 16º

dia de tratamento, isto é, 48h após a 8ª injeção (fig. 5).

Figura 5. Efeito (Média±DP) do tratamento com reserpina 0,1mg/kg (grupo RES6M - n=9 e

grupo RES10M - n=4) ou veículo (grupo CTR6M - n=8 e grupo CTR10M - n=4) no

comportamento de catalepsia. Setas indicam injeção de reserpina ou veículo. As diferenças

significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas

seguida por post hoc com teste de Tukey. *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com

relação a CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.

33

6.2. Avaliação da distribuição temporal do sono

ANOVA para medidas repetidas mostrou que houve efeito do tratamento, tempo

(representado pelos dias de tratamento) e interação tratamento x tempo sobre o

tempo total de sono em cada um dos intervalos analisados. Intervalo 1 (ZT0-ZT6):

tratamento (p<0,001), tempo (p<0,001), tratamento x tempo (p<0,001); intervalo

2(ZT6-ZT12): tratamento (p=0,003), tempo (p<0,001), tratamento x tempo (p=0,001);

intervalo 3 (ZT12-ZT18): tratamento (p<0,001), tempo (p<0,013), tratamento x tempo

(p<0,001); intervalo 4 (ZT18-ZT24): tratamento (p=0,001), tempo (p<0,001),

tratamento x tempo (p=0,001).

Os resultados revelam que no início da fase de sono (ZT0-ZT6, fig. 6), os

animais do grupo RES6M apresentam maior tempo de sono em comparação ao seu

controle, conforme mostra a figura 6B. Contudo, no ZT6-ZT12 (fig.7), vemos que a

situação se inverte, tendo os animais do grupo CTR6M maior tempo de sono do que

os indivíduos tratados de mesma idade, como pode ser melhor visualizado na figura

10C. No início da fase de atividade dos animais (ZT12-ZT18, fig. 8), percebemos que

não existe diferença significativa no tempo de sono entre os indivíduos dos grupos

CTR6M e RES6M. Porém, no ZT18-ZT24(fig.9), os indivíduos RES6M passam a

exibir maior tempo de sono em comparação ao seu controle, sendo possível

perceber que há um avanço na fase de sono desses animais (fig. 9B).

Adicionalmente, podemos observar que no início da fase de atividade dos animais

(ZT12-ZT18, fig. 8), os grupos CTR10M e RES10M exibem perfis de sono

semelhantes aos grupos CTR6M e RES6M, respectivamente conforme pode ser

visto nas figuras 10C e 10D.

34

Ao comparar os grupos controle, vemos que no início da fase de sono (ZT0-

ZT6, fig.6), os animais de ambos os grupos apresentam menor tempo de sono em

comparação ao final dessa fase (ZT6-ZT12, fig.7. Média do tempo de sono no ZT0-

ZT6 - CTR6M:141±3,8min, CTR10M: 150±4,5min; média do tempo de sono no ZT6-

ZT12 – CTR6M: 218,5±4,5min, CTR10M:187,5±4,2min). Contudo, também podemos

observar que no ZT6-ZT12 o grupo CTR10M apresenta menor tempo de sono em

comparação ao grupo CTR6M. Já durante a fase de atividade (ZT12-ZT18, fig.8), os

animais do grupo CTR10M exibem maior tempo de sono em comparação ao CTR6M.

No que se refere aos grupos tratados com reserpina, foi visto que no início da

fase de sono (ZT0-ZT6, fig.6) ambos os grupos apresentam uma maior

desestabilização no perfil de sono e o grupo RES10M mostra uma queda progressiva

no tempo total de sono com o decorrer do tratamento, conforme pode ser visto na

figura 6C. No final da fase de sono (ZT6-ZT12, fig.7), ambos os grupos tratados com

reserpina mostram sono mais estabilizado ao longo do tratamento, com o grupo

RES10M exibindo tempo de sono significativamente inferior ao grupo ao grupo

RES6M, como demonstrado na figura 7B. Durante a fase de atividade dos animais

(ZT12-ZT18 e ZT18-ZT24, figuras 8 e 9 respectivamente), vemos que o grupo

RES10M apresenta maior tempo de sono em comparação aos animais do grupo

RES6M.

35

INTERVALO 1 (ZT0-ZT6/ 06h30-12h30)

Figura 6. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de sono

(em minutos) no intervalo 1 (ZT0-ZT6). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9; grupo

CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As diferenças

significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas repetidas seguida

por post hoc com teste de Tukey *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05 com relação a

CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.

A C

B D

36

INTERVALO 2 (ZT6-ZT12/ 12h30-18:30)







A

B

C

D

37

INTERVALO 3 (ZT12-ZT18/ 18:30-0h30)







A

B

C

D

38

INTERVALO 4 (ZT18-ZT24/ 0h30-06h30)







A

B

C

D

39

Análise da distribuição temporal de sono 12-12h (Dias 6-8)

ANOVA para medidas repetidas revelou efeito significativo do tratamento [F(3,24)

=43,48; p=0,001], tempo - representado pelas horas - [F(5,105) = 57,40; p<0,001] e

interação tratamento x tempo [F(15,105) =58,41; p<0,001].

200

250

300

350

400

450

12h 24h 36h 48h 60h 72h

Tem

po

de

son

o (

min

)

CTR6M CTR10M

*

200

250

300

350

400

450

12h 24h 36h 48h 60h 72h

Tem

po

de

son

o (

min

)

RES6M RES10M

Δ

Δ

A

B

40

Figura 10. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre o tempo de

sono entre os dias 6-8 (início às 0h do dia 6). Grupo CTR6M - n=8; grupo RES6M – n=9;

grupo CTR10M – n=4; grupo RES10M – n=4. Dados expressos como média±DP. As

diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por ANOVA para medidas

repetidas seguida por post hoc com teste de Tukey. *p<0,05 com relação a CTR6M; #p<0,05

com relação a CTR10M; Δp<0,05 com relação a RES6M.

200

250

300

350

400

450

12h 24h 36h 48h 60h 72h

Tem

po

de

son

o (

min

)

CTR6M RES6M

* *

**

*

200

250

300

350

400

450

12h 24h 36h 48h 60h 72h

Tem

po

de

son

o (

min

)

CTR10M RES10M

# #

##

D

C

41

6.3. Avaliação da fragmentação do sono

A análise da quantidade de despertares durante o estado de sono por dia, realizada

através de ANOVA de uma via, revelou diferenças significativas entre os grupos

[F(3,24) = 6,49; p=0,003]. Post hoc de Tukey mostrou que o grupo RES6M exibiu

maior número de despertares quando comparado ao grupo CTR6M.

Figura 11. Observação do efeito do tratamento com reserpina 0,1mg/kg sobre a quantidade

de despertares por dia. Grupo CTR6M - n=8, grupo RES6M - n=9, grupo CTR10M - n=4,

grupo RES10M - n=4. As diferenças significativas entre os grupos foram determinadas por

ANOVA de uma via (post hoc com teste de Tukey). Dados expressos como média±DP.

*p<0,05 com relação a CTR6M.

6.4. Avaliação neuroquímica do NSQ

Ao se comparar qualitativamente as fotomicrografias do NSQ dos animais CTR6M

com os animais RES6M não é possível observar qualquer alteração na expressão

dos componentes avaliados, VIP (fig. 12 A e B); VP (fig. 12 C e D); NPY (fig. 12 E e

F).

42

CTR6M RES6M

CTR6M RES6M

Figura 12. Fotomicrografia em campo claro de secções coronais do encéfalo de ratos CTR6M

(A, C e E) e RES6M (B, D e F), em nível médio, mostrando a imunoistoquímica para VIP (A,

B), VP (C, D) e NPY (E, F). Abreviações: 3v: terceiro ventrículo; qo: quiasma óptico. Barra:

100um.

VP

NPY

qo

A B

C D

F E

VIP

43

7. DISCUSSÃO

7.1. Efeitos motores do tratamento crônico com reserpina

No presente estudo, investigamos os efeitos da administração crônica de

uma baixa dose de reserpina (0,1mg/kg) sobre o ciclo sono/vigília de ratos e sobre

alguns principais componentes neuroquímicos do NSQ.Os dados obtidos com a

avaliação do tempo de catalepsia, 48h após cada injeção, revelaram que o tratamento

foi capaz de induzir um prejuízo motor, de forma gradual, tanto no grupo de animais

tratados com seis meses de idade, quanto nos animais tratados com dez meses.

Estes resultados corroboram com estudos anteriores, nos quais ratos nas idades de

seis e sete meses, submetidos ao mesmo protocolo experimental, também exibiram

déficit motor gradual ao serem avaliados no teste de catalepsia (Fernandes et al.,

2012; Santos et al., 2013).

De maneira adicional, vimos que os animais de ambos os grupos, tratados

com reserpina, começaram a exibir prejuízo motor significativo, com relação ao seu

respectivo controle, no dia 12 (48h após a 6ª injeção), enquanto que em estudos

prévios (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013) essa diferença se deu a partir do

dia 14, isto é, 48h após a 7ª injeção. Visto que o procedimento experimental e forma

de análise utilizados foram similares e, os animais do grupo RES6M possuíam idade

igual ou bastante aproximada à idade dos indivíduos abordados nesses outros

trabalhos, hipotetizamos que esta diferença pode ser justificada pelas próprias

variações individuais naturalmente existentes entre os sujeitos experimentais e tendo

seu comportamento avaliado em dias e ambientes diferentes. Já com relação aos

animais do grupo RES10M, a própria idade dos indivíduos pode ter contribuído para

44

o aparecimento dos efeitos motores mais precocemente. Ademais, notamos que a

partir do dia 16 o grupo RES10M exibiu tempo de catalepsia significativamente

superior ao grupo RES6M, indicando assim que além do dano causado pela

reserpina, a idade também pode ter atuado como um agravante para o maior

comprometimento motor nos animais de 10 meses de idade (Rasmussen et al., 1999;

Rex Et al., 2005).

A reserpina inibe os transportadores vesiculares de monoaminas, VMAT1 e

2, impedindo a captação dessas moléculas para as vesículas de armazenamento, o

que resulta na depleção de monoaminas nos terminais axônicos, tanto centrais

quanto periféricos. Esta redução está intimamente relacionada ao desenvolvimento

dos sintomas motores observados neste estudo, assim como ocorre na clínica da DP,

onde a depleção da dopamina estriatal provoca o desenvolvimento de características

motoras como bradicinesia e rigidez (Decressac e Barker, 2012).

Estudo realizado por Patil et al.(2012), no qual ratos Wistar foram tratados

com reserpina (1mg/kg) a cada dois dias durante cinco dias, demonstrou que o

fármaco foi capaz de induzir catalepsia nos animais de forma tempo-dependente.

Neste trabalho, observou-se que o pré-tratamento com vitamina E (10mg/kg), um

potente antioxidante, inibiu significativamente a catalepsia induzida pelo tratamento

com reserpina. Além disso, nesse mesmo estudo foi visto que animais tratados com

reserpina exibiram aumento nos níveis de peroxidação lipídica e níveis reduzidos de

enzimas antioxidantes, como catalase e superóxido dismutase, sugerindo assim a

geração de radicais livres e consequente aumento do estresse oxidativo. De fato,

diversos estudos já demonstraram que o tratamento com reserpina eleva os níveis

de estresse oxidativo no cérebro (Abílio et al., 2003; Teixeira et al., 2008),

notadamente em virtude do metabolismo de dopamina no citoplasma celular,

45

sugerindo-se que esse mecanismo pode estar relacionado ao dano neuronal

envolvido com o efeito prejudicial da reserpina sobre a função motora.

É sabido que com o envelhecimento do cérebro, há um aumento na formação

e liberação de espécies reativas de oxigênio, com consequentes alterações estruturais

e funcionais na membrana celular, aumento da oxidação de proteínas e danos ao

DNA. Tendo isso em vista, inúmeros estudos foram realizados no intuito de avaliar se

o avançar da idade também afeta a resposta do sistema de defesa antioxidante

enzimático celular contra o estresse oxidativo exógeno (Benzi et al., 1989; Benzi et

al., 1990; Ochi, 1993). Foi verificado que o estresse oxidativo induzido em animais de

diferentes idades, pode ocasionar diferentes efeitos em diferentes regiões cerebrais,

dependendo do tipo de agente oxidante utilizado. Ao analisar os efeitos da

administração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e do cicloexano, observou-se que

ambos reduzem a concentração de glutationa reduzida (GSH) no prosencéfalo de

ratos Wistar adultos em comparação a jovens (H202: -23% e cicloexano: -38%). Além

disso, foi observado que outro agente indutor de estresse oxidatico, o terc-butil-

hidroperóxido, promoveu uma depleção considerável nos níveis de GSH em diversas

regiões cerebrais de ratos adultos em comparação a jovens, tendo efeito mais

marcante no corpo estriado (Adams et al., 1993; Benzi e Moretti, 1995). Assim, o

aumento dos níveis de estresse oxidativo ocasionado pela reserpina associado aos

danos oxidativos resultantes do próprio envelhecimento cerebral, podem justificar o

prejuízo motor mais pronunciado que foi observado entre os animais do grupo

RES10M.

46

7.2 Sintomas não-motores precedem o aparecimento dos sinais motores na DP

Apesar dos indícios motores serem tradicionalmente tratados como foco clínico na

DP, evidências crescentes têm demonstrado que o espectro clínico da doença é mais

amplo, abrangendo também sintomas não-motores que incluem depressão, déficits

cognitivos, desordens autonômicas e distúrbios do sono (Riedel et al., 2010; Erro et

al., 2012). Os sintomas não-motores podem estar presentes em qualquer estágio da

patologia, já tendo sido demonstrado inclusive, que o aparecimento desses sintomas

pode preceder a emergência dos sintomas motores em anos e até décadas, afetando

negativamente a qualidade de vida dos pacientes e, sendo em muitos casos, motivo

de hospitalização (Chaudhuri et al., 2006; Tolosa et al., 2007).

No presente trabalho, observamos que a reserpina promoveu efeitos sobre o

comportamento de sono dos animais por volta do 6º dia de tratamento, enquanto que

os efeitos motores somente foram notados a partir do 12º dia, sendo o primeiro

trabalho a demonstrar esse resultado em um modelo progressivo, visto que os demais

utilizam modelos agudos ou mutantes. Esses resultados corroboram com os achados

obtidos em estudos clínicos da DP (Abbott et al., 2001; O’Sullivan et al., 2008). Em

trabalho realizado por Takahashi, 2013, 469 pacientes japoneses de DP foram

investigados através de questionários de triagem para desordem do sono REM, a qual

é caracterizada por uma perda da atonia muscular esquelética normal, permitindo aos

pacientes executar fisicamente sonhos muito vívidos ou desagradáveis (Olson et al.,

2000). Como resultado, viu-se que o transtorno foi detectado em 146 pacientes (31%),

e em 53 destes, os sintomas de desordem do sono REM precederam o início dos

sintomas motores (Takahashi, 2013). Da mesma forma, outros estudos já sugeriram

que sintomas de desordem do sono REM podem preceder o desenvolvimento dos

47

sinais motores na DP em mais de 40% dos pacientes (Schenck et al., 1996; Chaudhuri

et al., 2006).

De maneira interessante, estudos de imagem realizados em pacientes com

desordem do sono REM, indicaram uma pequena, mas significativa redução na

captação estriatal de dopamina, o que pode ser sugestivo de DP pré-clínica

(Eisensehr et al., 2000). Além disso, Uchiyama et al.(1995) relataram um caso de

autópsia em que se observou a presença de eventuais corpos de Lewy estriatais no

cérebro de um paciente que sofreu com desordem do sono REM durante 20 anos,

mas não exibia nenhuma evidência clínica de DP.

Em estudo realizado por O’Sullivan et al. (2008) buscou-se correlacionar a

apresentação de sintomas não-motores na DP retrospectivamente à confirmação do

diagnóstico clínico-patológico. Usando informações armazenadas em banco de dados

para doenças neurológicas, provenientes de 433 pacientes que posteriormente foram

diagnosticados com DP, viu-se que 21% deles apresentavam algum tipo de sintoma

não-motor, sendo os mais comuns a dor (15%), disfunção urinária (3,9%) , ansiedade

ou depressão (2,5%). Foi observado ainda que a exibição de sintomas não-motores

foi associada a um atraso no diagnóstico da doença, visto que os pacientes que

mostravam esses sintomas foram mais propensos a terem um diagnóstico errôneo

inicialmente e serem encaminhados a médicos de outras especialidades, que não a

neurologia, em comparação aos pacientes que já demonstravam sintomas motores.

Sintomas gastrointestinais são também comuns na DP e podem anteceder o

desenvolvimento da doença . Estudo prospectivo relatado por Abbott et al. (2001),

seguiu os hábitos intestinais de 7000 homens por 24 anos e mostrou que aqueles com

constipação inicial ( < 1 movimento intestinal/ dia ) tiveram um risco três vezes maior

de desenvolver DP após um intervalo médio de 10 anos, em comparação aos

48

individuos que não apresentaram tal sintoma inicialmente. Cersosimo e Benarroch

(2008), revisando o controle neural do sistema gastrointestinal na DP, propuseram

que há um envolvimento precoce do núcleo dorsal vagal e também dos neurônios

intrínsecos do sistema nervoso entérico na DP, o que poderia estar relacionado ao

aparecimento pré-motor da constipação.

A depressão é outro sintoma não-motor associado à DP (Burn, 2002; Remy

et al., 2005). Estima-se que 10-45% dos pacientes com DP sejam afetados por esse

distúrbio, que pode surgir pelo menos em parte, como resultado de dano a

neurotransmissão serotonérgica, bem como, por mecanismos noradrenérgicos e

dopaminérgicos no sistema límbico (Burn, 2002; Remy et al., 2005). Diversos

trabalhos demonstraram que os sintomas de depressão podem anteceder o

desenvolvimento da DP (Nilsson et al., 2001; Schurmann et al., 2002; Lauterbach et

al., 2004). Em estudo comparativo entre pacientes com DP ou distonia realizado por

Lauterbach et al (2004), observou-se que os pacientes com DP tiveram um

diagnóstico primário de fobia simples e uma depressão atípica secundária precedendo

a DP com mais frequência do que os pacientes com distonia.

Nagayama e Kimura (2015) revisando as características de depressão

observada durante a fase pré-clínica da DP, observaram que a maioria dos relatos

indicaram que a depressão precedendo o início da DP foi um fator de risco significativo

para o desenvolvimento da doença. Ainda nesse contexto, um estudo de coorte

retrospectivo mostrou que no momento do diagnóstico da DP, 9,2 % dos pacientes

tinham um diagnóstico de depressão em algum momento na vida, em comparação

com 4,2% dos indivíduos controle (Schurmann et al., 2002).

Disfunções autonômicas representam outro importante achado não-motor

observado precocemente na DP. Buscando avaliar a denervação simpática cardíaca

49

que ocorre na DP, Fujishoro et al.(2008) utilizaram imunoistoquímica para tirosina

hidroxilase (TH) para detectar fibras nervosas simpáticas no epicárdio de 4 controles

normais, 11 casos com corpos de Lewy eventuais e 14 casos de DP. Como resultado,

notou-se que a inervação simpática cardíaca foi significativamente menor nos casos

de DP do que nos controles normais e casos com corpos de Lewy eventuais. Também

foi visto que as fibras TH - imunorreativas correlacionaram com a fase da DP, sendo

que a degeneração simpática cardíaca esteve presente desde a fase pré-sintomática

da donça.

Em conjunto, esses dados reforçam a ideia de que a possibilidade de

diagnosticar a DP de forma precoce, em comparação ao que atualmente é realizado,

permitiria introduzir novas estratégias terapêuticas possivelmente capazes de modular

a evolução da doença em um estágio crucial. Além disso, a identificação dos sintomas

não-motores pode ser crítica para a definição de populações de risco para futuros

estudos de prevenção da DP (Adler e Beach, 2016).

Evidências sugerem que o desenvolvimento precoce dos sintomas não-

motores da DP envolve vários sistemas neuronais e relaciona-se, inclusive, com a

manifestação de sinucleinopatias em estruturas extra nigrais (Wolters e Braak, 2006;

Dickson et al., 2008). Em importante estudo imunoistoquímico realizado por Braak et

al (2003), visando avaliar a progressão dessas sinucleinopatias relacionadas com DP,

observou-se que na DP, as lesões decorrentes de sinucleinopatias (corpos de Lewy

com imunocoloração de alfa- sinucleína) começam a se desenvolver algum tempo

antes do aparecimento da disfunção motora. Através dos resultados, Braak introduziu

o conceito de processo patológico da DP classificado em seis fases cronologicamente

distintas. Por meio dessa classificação é possivel identificar que o acometimento das

sinucleinopatias na substância negra não se torna evidente até o estágio 3, quando

50

então começam a aparecer os primeiros sintomas motores da DP. Anteriormente a

esse estágio, as lesões afetam estruturas do trato olfatório anterior e do sistema

nervoso autônomo, como por exemplo, o sistema nervoso entérico , cardíaco e plexo

pélvico (Hague et al., 1997; Iwanaga et al., 1999). Em seguida, as lesões passam a

afetar os neurônios pertencentes ao sistema de formação reticular, incluindo o núcleo

dorsal da rafe e núcleo reticular do tálamo (ambas responsáveis por regular os

mecanismos de excitação e consciência), bem como o complexo noradrenérgico do

locus coeruleus, responsável pela modulação de mecanismos de atenção , controle

da dor e sono REM (Scherder et al., 2005), contribuindo para o aparecimento de

sintomas não-motores ainda nessa fase, dentre os quais se incluem as alterações no

comportamento de sono.

7.2.1. Sono

O sono é definido como um estado ativo caracterizado pela diminuição da

vigilância e capacidade de resposta que é rapidamente reversível (Arias-Carrión et al.,

2011; Murillo-Rodriguez et al., 2012). Muito se discute a respeito do seu real propósito,

sendo que várias evidências permitem inferir que o sono apresenta importancia

funcional. Dentre estas evidências, se destacam: (1) o sono tem persistido na

evolução; (2) acomodações são feitas para permitir o sono em diferentes ambientes e

estilos de vida; (3) é uma função regulada homeostaticamente (privação do sono é

seguido por compensação do sono); (4) alterações fisiológicas graves resultam da

privação de sono prolongado em animais (Rechtschaffen, 1998; Siegel, 2005).

Estudos revelaram que o sono é regulado por dois processos (Borbely, 1982;

Daan et al., 1984): um processo homeostático (processo S) dependente do sono e da

vigília - aumenta durante a vigília e diminui durante o sono, dentro de uma faixa de

51

valor média que oscila com uma periodicidade que normalmente é sincronizada ao dia

e à noite pelo marcapasso circadiano; e um processo controlado pelo marcapasso

circadiano (processo C). O sono é desencadeado quando o processo S se aproxima

do limite superior do C , e a vigília é acionada quando o processo S atinge o limiar

mais baixo. Em condições padrão (sono monofásico), esse processo ocorre duas

vezes a cada ciclo circadiano (Borbely e al., 2016).

Evidências crescentes têm demonstrado que há uma interação entre os dois

processos de regulação do sono (Achermann, 1999; Achermann e Borbely, 2003; Dijk

e Archer, 2010). Dados humanos, obtidos em modelos de protocolo de

dessincronização forçada, mostraram que a amplitude circadiana de muitas funções

neurocomportamentais foi modulada pela pressão do sono homeostático: uma menor

amplitude circadiana foi encontrada quando a pressão do sono foi alta e a amplitude

aumentada quando a pressão do sono foi reduzida (Boivin et al., 1997; Wyatt et al.,

1999). Outras evidências indicam que o sono homeostático e a regulação circadiana

também interagem a nível molegular/genético (Deboer, 2007; Franken, 2013).

Modelos com animais knockout para os principais genes relógio (Per, Clock, Bmal1,

Cry1, Npas2) mostrou não somente alteração no relógio circadiano, mas também

modificação em marcadores do sono homeostático. Porém, em animais tornados

arrítmicos por lesão do NSQ, o sono homeostático não é interrompido, indicando

assim que os dois processos são regulados separadamente (Tobler et al., 1983;

Trachsel et al., 1992).

No presente trabalho, verificamos os efeitos do tratamento prolongado com

reserpina sobre o comportamento de sono em roedores. Em um primeiro momento,

avaliamos diariamente a distribuição temporal do sono total exibido pelos animais ao

longo do tratamento, dividindo as 24 horas do dia em quatro intervalos: intervalo 1

52

(ZT0-ZT6), intervalo 2 (ZT6-ZT12) , intervalo 3 (ZT12-ZT18) e intervalo 4 (ZT18-ZT24).

Os resultados mostraram que o tratamento com reserpina alterou o tempo total de

sono exibido pelos animais tratados em comparação aos indivíduos controle. No inicio

da fase de sono (ZT0-ZT6), os individuos tratados com reserpina apresentaram maior

tempo de sono em comparação ao controle. Já no final da fase de sono (ZT6-ZT12),

esse comportamento se inverte, tendo os animais controles maior tempo de sono.

Durante a fase de atividade, vimos que no início (ZT12-ZT18) não existem diferenças

no tempo total de sono exibido pelos grupos tratados ou não tratados, porém no final

desta fase (ZT18-ZT24), os animais tratados com reserpina passam a apresentar

tempo de sono mais elevado em comparação ao controle.

Com relação a esse aspecto, nossos resultados divergem de dados obtidos

em trabalhos anteriores. Em estudo realizado por Kudo et al.(2011), avaliou-se a

distribuição temporal de sono em uma linhagem transgênica de ratos com

superexpressão de alfa-sinucleína (ASO), uma molécula cuja mutação é

extensivamente implicada em casos familiares da DP, em comparação a ratos

controle. O tempo total de sono por dia foi determinado pela análise dos mesmos

parâmetros comportamentais utilizados no presente estudo. Os resultados revelaram

uma interação significativa entre o genótipo e o intervalo de tempo considerado, porém

naquele estudo os animais mutantes apresentaram maior tempo de sono ao final do

dia (ZT6-ZT12) quando comparados aos controles e menor tempo de sono ao final da

noite (ZT18-ZT24) em comparação ao controle, sendo contrário ao que foi observado

no estudo atual. Contudo, tanto naquele estudo quanto no atual, foi visto que no início

da fase de atividade (ZT12-ZT18) não existem diferenças no tempo de sono entre os

animais controle e os tratados ou com mutação.

53

Além disso, os dados obtidos com a análise da distribuição temporal do sono

nos permitem observar que no final da fase de atividade (ZT18-ZT24), os animais

tratados com reserpina exibem maior tempo de sono em comparação ao controle.

Este resultado é semelhante ao que frequentemente se observa no aspecto clínico da

doença, no qual os pacientes de DP muitas vezes apresentam sono excessivo durante

o dia, prejudicando suas atividades e o convívio social. Estudos relatam que o sono

diurno excessivo chega a afetar cerca de 50% dos pacientes de DP, atuando como

um marcador pré-motor da doença que pode estar relacionado ao risco aumentado

de desenvolver a patologia (Abbott et al., 2005; Dhawan et al., 2006).

Como discutido anteriormente, o sistema circadiano apresenta influência

sobre o mecanismo de sono e vigília. O núcleo supraquiasmático, principal

marcapasso do sistema de temporização circadiano, apresenta projeções para alguns

sistemas responsáveis pela regulação do sono, como por exemplo, a zona

subparaventricular ventral, cujos neurônios recebem informações necessárias para a

organização de ciclos diários de sono/ vigília, e o núcleo dorsomedial do hipotálamo

(Lu et al., 2001; Saper et al., 2005). Projeções eferentes da zona subparaventricular

são integradas no núcleo dorsomedial do hipotálamo e os neurônios dessa região

conduzem os ciclos circadianos de sono, atividade, alimentação e secreção de

corticosteroides (Lu et al., 2001; Saper et al., 2005). O núcleo dorsomedial do

hipotálamo, por sua vez, é a origem das projeções para o núcleo pré-óptico

ventrolateral (VLPO), uma importante região responsável por promover o sono ao

inibir grupos celulares integrantes do sistema ativador reticular ascendente (SARA),

que desencadeia a vigília, bem como para a área hipotalâmica lateral, cujos neurônios

produtores de orexina contribuem para estabilizar o sistema de ativação e manter a

vigília (Saper et al., 2005). Dessa forma, sugere-se que a degeneração neuronal

54

dentro dessas áreas, ainda nos estágios 1 e 2 de Braak, podem explicar o

aparecimento precoce da sonolência diurna excessiva (Chaudhuri e Naidu, 2008).

Através da análise da distribuição temporal do sono, os resultados também

evidenciam que no ZT18-ZT24 (final da fase de atividade) há um avanço na fase de

sono dos animais do grupo RES6M (fig. 9B), corroborando com dados obtidos em

trabalhos anteriores, nos quais outros ritmos circadianos foram também analisados

em modelos animais para DP. Utilizando o modelo com injeção estriatal bilateral de 6-

OHDA, Ben e Bruguerolle (2000) avaliaram possíveis modificações nos ritmos

circadianos de temperatura, atividade locomotora e frequência cardíaca, por

telemetria. Os resultados obtidos demonstraram que a lesão pela 6-OHDA promoveu

modificações nos três ritmos circadianos avaliados, incluindo uma redução

significativa na amplitude do ritmo de frequência cardíaca e avanço de fase nos três

ritmos. Esses dados indicam que tanto em nosso estudo quanto no estudo anterior, a

perturbação da ritmicidade circadiana pode estar relacionada com a depleção de DA,

visto que inúmeros trabalhos demonstram que a DA é capaz de modular o relógio

circadiano em diversos níveis (Witkovsky, 2004; Sakamoto et al., 2005; Dorenbos et

al., 2007; Ruan et al., 2008).

Ainda nesse contexto, em outro estudo realizado com o modelo animal de

DP com 6-OHDA (Boulamery et al., 2010), a influência de L-dopa nos ritmos

circadianos de temperatura, frequência cardíaca e atividade locomotora em ratos foi

avaliada após lesão estereotáxica com 6-OHDA. Notou-se que quando a ritmicidade

circadiana foi abolida, o tratamento com L- dopa melhorou ou acelerou a recuperação

dos ritmos, sendo o efeito mais pronunciado para o ritmo de frequência cardíaca. Já

quando os ritmos circadianos não foram abolidos, mas perturbados, o tratamento

com L- dopa não melhorou as mudanças induzidas por 6-OHDA nos ritmos de


55

temperatura e atividade locomotora, porém um efeito significativo foi observado para

o ritmo de frequência cardíaca. Esses resultados indicam que a administração de L-

dopa não é capaz de equilibrar totalmente a depleção de DA, contudo mostram que

alterações nos ritmos podem ser parcialmente revertidas pela infusão de L-dopa.

Os resultados revelam que no início da fase de sono (ZT0-ZT6, fig. 6), os

animais do grupo RES6M apresentam maior tempo de sono em comparação ao seu

controle (fig. 6B). Contudo, no ZT6-ZT12 (fig.7), vemos que a situação se inverte,

tendo os animais do grupo CTR6M maior tempo de sono do que os indivíduos

tratados de mesma idade (fig. 10C). Sabendo-se que o sono promove claramente

um efeito revigorador sobre o cérebro (Saper et al., 2005), nossos dados sugerem

que os indivíduos RES6M possuem sono revigorador logo no início da fase de sono,

enquanto que os CTR6M mais tardiamente. Isso pode ser modulado pelo

componente homeostático de regulação do sono, o qual busca uma recuperação até

um determinado ponto de ajuste quando é perturbado. Logo, os animais RES6M ao

serem privados de sono no final da fase de atividade, irão buscar a restauração da

homeostase do sistema, exibindo um tempo maior de sono precocemente. Estudos

com eletroencefalograma (EEG) demonstraram que após um período de privação de

sono, o sono NREM é tipicamente exibido primeiro, sendo a atividade de ondas

lentas exibida no EEG de sono NREM o principal marcador do processo

homeostático durante o sono (Dijk et al., 1990; Borbely et al., 2016).

Nossos resultados também permitem notar que durante a fase de atividade

(ZT12-ZT18 e ZT18-ZT24, figuras 8 e 9 respectivamente), o grupo RES10M apresenta

maior tempo de sono em comparação aos animais do grupo RES6M, evidenciando

não só o efeito do tratamento com reserpina sobre o perfil normal de sono dos

indivíduos, como também o efeito da idade sobre este aspecto. De fato, com o

56

envelhecimento, muitos aspectos do sistema de regulação circadiana sofrem

modificações, podendo contribuir para a maior incidência de perturbações do sono -

como por exemplo a sonolência diurna excessiva - em indivíduos idosos,

principalmente naqueles que apresentam doenças neurodegenerativas como

agravante (Van Someren, 2000).

Analisando-se a fragmentação do sono, observamos que o grupo RES6M

apresentou maior quantidade de despertares em comparação ao seu controle, fato

não observado entre os animais do grupo RES10M e CTR10M. Hipotetizamos que o

baixo número de sujeitos nestes grupos tenha contribuído para a ausência de

diferença significativa. O aumento na fragmentação do sono constitui outro importante

achado clínico frequentemente visto entre os pacientes de DP (Bjornara et al., 2014).

Estudos mostram que a sonolência diurna excessiva com cochilos frequentes e os

chamados “ataques de sono”' têm sido relatados em 15-50 % dos pacientes

(Hobson et al., 2002; Brodsky et al., 2003, além de já ter sido evidenciada a presença

de distúrbios noturnos na DP, como o sono noturno fragmentado (Arnulf et al., 2002;

Rye et al., 2004). Em trabalho realizado por Prudon et al., 2014, buscou-se avaliar a

prevalência de distúrbios do sono em pacientes recentemente diagnosticados com DP

em comparação a indivíduos saudáveis, e como resultado, foi visto que houve

aumento na quantidade de cochilos diurnos apresentados pelos pacientes com DP,

reafirmando assim a alta prevalência desse sinal clínico no Parkinson.

Tais distúrbios do sono evidenciados na DP assemelham-se aos principais

sintomas da narcolepsia (Arnulf et al., 2000; Overeem et al., 2001), uma doença

crônica caracterizada por sonolência diurna excessiva e “súbitos episódios de sono”,

causada pela perda de neurônios produtores de hipocretina/orexina (Peyron et

al.,2000; Saper et al., 2005). Dessa forma, é possível que o aparecimento da

http://brain.oxfordjournals.org/content/130/6/1577?ijkey=1d42601c0aa39cabd774e04e96170c5cf1c73f6d&keytype2=tf_ipsecsha#ref-20







57

fragmentação do sono na DP esteja relacionado à neurodegeneração no sistema

hipocretina/orexina. Os neuônios produtores de orexina estão localizados na área

hipotalâmica lateral e possuem projeções ascendentes para o córtex cerebral, bem

como projeções descendentes para todos os grupos celulares monoaminérgicos e

colinérgicos integrantes do SARA, responsáveis por promover e manter a vigília

(Saper et al., 2005). Neste sentido, trabalhos já relataram perda significativa de

neurônios produtores de hipocretina no hipotálamo de pacientes com DP em

comparação a indivíduos saudáveis (Fronczek et al.,2007; Thannickal et al., 2007),

com um deles mostrando uma associação significativa entre a perda de células

produtoras de hipocretina e a gravidade da doença (Fronczek et al., 2007).

7.3. Avaliação neuroquímica do NSQ

Neste trabalho, buscamos investigar a ocorrência de possíveis alterações

na composição neuroquímica do NSQ após o tratamento crônico com reserpina.

Avaliamos qualitativamente a presença de NPY, VIP e VP no NSQ de ratos tratados

com 6 meses em comparação com animais controle de mesma idade. Nossos

resultados não evidenciaram diferenças significativas entre os animais tratados e os

não-tratados com relação à nenhuma das substâncias pesquisadas. Contudo, dados

presentes na literatura revelam o envolvimento de tais substâncias em mecanismos

implicados na patogênese da DP em outras estruturas cerebrais (Sundquist et al.,

1983; Stoddard et al., 1991; Delgado e Ganea, 2003).

O NPY é amplamente expresso em todo o sistema nervoso central, onde

exerce importantes funções fisiológicas, bem como participa de processos implicados

http://brain.oxfordjournals.org/content/132/12/3308.long#ref-20



58

em condições patológicas como nas doenças neurodegenerativas (Decressac e

Barker, 2012). Estudos anatômicos e funcionais revelaram que o NPY interage com o

sistema dopaminérgico: Vuillet et al.(1989) examinando a relação estrutural entre as

projeções nigroestriatais e nerônios NPY no estriado de ratos observaram contatos

sinápticos diretos, corroborando os achados obtidos em estudos anteriores, nos quais

após denervação dopaminérgica no estriado, usando 6-OHDA houve um aumento

significativo no número de neurónios NPY no estriado e no núcleo accumbens

(Kerkerian et al., 1986; Salin et al., 1990). Utilizando outro modelo neurotóxico de DP

com MPTP, foi observado um aumento semelhante no número de neurónios NPY no

estriado de camundongos (Obuchowicz et al., 2003). Estes estudos demonstraram

que a via dopaminérgica nigroestriatal regula neurônios NPY do estriado, enquanto

outros estudos farmacológicos demonstraram que o mecanismo inverso também

ocorre. Kerkerian-Le Goff et al.(1992) demonstraram que a injeção

intracérebroventricular de NPY induz um aumento dose-dependente na liberação de

dopamina no estriado, assim como Adewale e colaboradores (2005, 2007) mostraram

que a administração de NPY diretamente no estriado promove a síntese e liberação

de dopamina. Em consonância com as observações feitas nos modelos animais, foi

visto que cérebros de pacientes de DP também apresentam um aumento no número

de células que expressam o NPY , especialmente no núcleo caudado e putâmen

(Cannizzaro et al., 2003). Estudos visando avaliar os efeitos do NPY em culturas de

células e modelos animais de DP revelaram que o NPY foi capaz de proteger

neurônios dopaminérgicos contra a toxicidade induzida pela 6-OHDA tanto in vitro

quanto in vivo (Decressac et al., 2011), indicando assim uma possível ação

neuroprotetora do NPY na DP.

59

Evidências têm demonstrado as propriedades neuroprotetoras de VIP

(Brenneman e Eiden, 1986; Gozes et al., 1987; Festoff et al., 1996). Delgado e Ganea

(2003a) mostraram que VIP pode proteger contra inflamações induzidas pela

endotoxina bacteriana lipopolissacarídeo (LPS) em neurônios embrionários de rato. O

tratamento com LPS normalmente resulta em profunda perda de células neuronais, o

que pensa-se ser mediado pelo aumento da ativação da microglia. Logo, VIP

provavelmente impede a neurodegeneração pela desativação da microglia e da

produção de mediadores pró-inflamatórios pela ligação ao receptor de VIP tipo 1

(VPAC1) (Delgado e Ganea, 2003a). Isso tem importantes implicações terapêuticas,

já que a perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é uma causa primária

da PD. Em um estudo utilizando um modelo animal de DP, a administração sistêmica

de VIP foi bem-sucedida na reversão dos déficts motores, mas não impediu o declínio

nos níveis de dopamina do estriado. Além disso , foi observado que o VIP foi capaz

de preservar os neurônios possivelmente por induzir a secreção de agentes

neuroprotetores pelos mastócitos cerebrais, tais como o fator de crescimento do nervo

(Tunçel et al., 2005; Korkmaz et al., 2009). Em um estudo similar usando nodelo

animal de DP, o tratamento com VIP diminuiu significativamente a perda neuronal

dopaminérgica na substãntia negra (Delgado e Ganea, 2003b). Mais uma vez ,

verificou-se que as capacidades terapêuticas do VIP foram conduzidas através da

desativação da microglia mediada por VPAC1 e a subsequente produção de

mediadores citotóxicos, tal como interleucina 1β e fator de necrose tumoral α.

VP afeta o metabolismo de catecolaminas em núcleos específicos do cérebro

(Tanaka et al. 1977). Neste sentido, estudos realizados com o fator inibidor da

liberação do hormônio estimulante de melanócito, um composto com a mesma

estrutura química de VP, evidenciaram que o referido composto foi capaz de aumentar

60

a síntese de DA no sitema dopaminérgico nigroestriatal e potencializar alterações

comportamentais induzidas por L-dopa em animais (Van Ree et al., 1978). Além

disso, em ensaios clínicos o fator inibidor da liberação do hormônio estimulante de

melanócito demonstrou atividade antiparkinsoniana e melhorou o desempenho

psicomotor e funções cognitivas em combinação com o tratamento com L-dopa

(Gerstenbrand et al., 1978; Schneider 1978), sugerindo assim que o tratamento com

VP também possa exibir efeitos antiparkinsonianos.

Quando focamos especialmente no NSQ e na DP, não há trabalhos na

literatura que demonstrem ou que correlacionem os aspectos neuroquímicos do NSQ

e a DP. Por isso, novos estudos fazem-se necessários para entender o que ocorre no

NSQ para que ele interceda, possivelmente, amplificando os sinais não-motores da

DP (Willison et al., 2013) quando está com algum déficit funcional.

61

8.CONCLUSÕES

- Os resultados demonstram que o tratamento repetido com baixa dose de reserpina

(0,1mg/kg) foi capaz de promover um déficit motor nos animais cronicamente tratados

quando comparados aos indivíduos controle;

- Os achados obtidos nos registros comportamentais de sono mostram que houve um

efeito significativo do tratamento com reserpina sobre o ciclo sono/vigília, incluindo

avanço na fase de sono e aumento na fragmentação do sono;

- Os dados obtidos no presente estudo reiteram a observação de que os sintomas

não-motores precedem o surgimento dos sintomas motores na DP, sendo de extrema

importância o seu reconhecimento para o diagnóstico precoce na clínica;

- Os resultados mostram a eficiência do tratamento com reserpina no estabelecimento

de um modelo progressivo para a DP, reafirmando a importância deste tipo de estudo

para a avaliação do aparecimento gradual de sinais motores do Parkinson induzido

em animais, tal como acontece em humanos.

LIMITAÇÕES DO TRABALHO

Neste estudo, a avaliação neuroquímica foi limitada devido à degeneração dos cortes

durante o processo de imunoistoquímica, em especial devido à fragilidade da

estrutura de interesse (NSQ). Dessa forma, não foi possível realizar a análise

quantitativa de células no NSQ e a medição por densidade óptica dos níveis de

expressão das substâncias estudadas, bem como a análise qualitativa do NSQ dos

animais com 10 meses de idade. Dada à ausência das informações neuroquímicas

quantitativas, não foi realizada a correlação entre os comportamentos motores e de

sono/vigília observados durante o estabelecimento do modelo animal de DP, com os

resultados obtidos através das análises imunoistoquímicas no NSQ dos animais.

62

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ANEXO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE · PDF fileimunoistoquímica para VIP (A, B), VP (C, D) e NPY (E ... frequentemente precedem o aparecimento dos sinais motores e são