UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE … · prolil endopeptidase de hidrolisados proteicos da castanha (Umbrina canosai) incorporados em filmes de ágar após digestão gastrointestinal

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE

ALIMENTOS

OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS PROTEICOS DA CASTANHA (Umbrina

canosai) COM ATIVIDADE BIOLÓGICA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES

BIOATIVOS

MERITAINE DA ROCHA

Professor Dr. Carlos Prentice-Hernández

Orientador

Rio Grande, RS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS PROTEICOS DA CASTANHA (Umbrina canosai)

COM ATIVIDADE BIOLÓGICA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES BIOATIVOS

MERITAINE DA ROCHA

Engª de Alimentos

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia e Ciência de

Alimentos como parte dos requisitos

necessários para a obtenção do título de

Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos

Prof. Dr. CARLOS PRENTICE-HERNÁNDEZ

Orientador

RIO GRANDE, RS

2016

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conceder um mundo de possibilidades e de pessoas maravilhosas ao longo da

minha vida.

Aos meus pais, Lourdes e Lorivaldo (In memoriam) pela vida. Em especial, a minha mãe que

por vezes foi pai e mãe. Obrigada por tudo!

Aos meus irmãos, sobrinhos e afilhados que mesmo distantes, estão constantemente presentes

em minha vida. Obrigada pelo apoio, carinho, incentivo e amor.

Ao Rodrigo, por todo amor, compreensão, amizade, companheirismo, paciência e por

compartilhar os mesmos sonhos desde que nos encontramos. Além disso, obrigada pelo maior

presente da minha vida!

Aos meus amigos, Ana, Cari, Claúdio, Dani, Priscila e Shanise pelos momentos

compartilhados.

Ao meu orientador professor Dr. Carlos Prentice, pela confiança, amizade e apoio ao longo de

todos esses anos. Obrigada por todas as palavras de conforto, levarei para minha vida!

Às minhas alunas de iniciação científica, Júlia e Marília, por toda a ajuda, apoio, amizade e

compreensão ao longo do doutorado. Tenho certeza que vocês colherão muitos frutos ao

longo da vida!

À Dr. Michele Moraes de Souza, por todos esses anos de aprendizado, carinho, amizade e

compreensão. Tenho certeza que foi a partir daquela iniciação científica, que muitas coisas

boas aconteceram em minha vida.

À professora Dr. Eliana Badiale Furlong por todos os anos de orientação durante a graduação.

Além da amizade e conhecimento transmitidos.

À professora Dr. Myriam pela amizade, conselhos, conhecimentos e “frases” que levarei para

minha vida.

À Dr. Elvira López-Caballero, por todo o carinho, amizade e conhecimento durante o período

que estive na Espanha. Com certeza guardarei com o maior carinho todo o tempo de

convivência.

Aos pesquisadores Dr. Pilar Montero, Dr. Carmen Gómez-Guillén e Dr. Oscar Martínez

Álvarez por todos os ensinamentos e bons momentos compartilhados.

À Dr. Ailén Alemán pela paciência, ensinamentos, amizade e momentos de descontração

durante o período em Madri. Além da constante disponibilidade em me ajudar.

Aos queridos colegas e amigos que fiz durante o período na Espanha: Alícia, Carlos, Claúdia,

Deysi, Diana, Fernando, Gema, Gyselle, Isa, Javi, Joaquim, Julian, Laura, Maria (s), Nacho,

Rô, Silvia, Tati, Teresa e Vitor. Enfim, obrigada por todos os momentos que me

proporcionaram!

A Eliane, Inajara e Janise por compartilhar as experiências durante o período sanduíche na

Espanha. Também por toda a amizade, apoio, paciência e carinho ao longo dos anos de anos.

Agora novas estapas se iniciam e que sejam bem vindas!

A Sabrine Aquino, por todos esses anos de convivência, ensinamentos e de muita paciência.

Obrigada por me ajudar e proporcionar momentos de crescimento. Levarei muitas coisas boas

para minha vida e espero que tenha deixado algo de bom!

Aos colegas e amigos do Laboratório de Tecnologia de Alimentos que me proporcionaram

momentos de muito conhecimento, alegria e descontração.

A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciência e

Tecnologia de Alimentos, pelos anos de ensinamentos e convivência.

Ao Centro de Microscopia Eletrônica da Região Sul (CEME-Sul), pela disponibilização dos

equipamentos para a realização das análises de Microscopia Eletrônica de Varredura.

Ao professor Dr. Felipe Kessler pela ajuda com a análise de hidrofobicidade.

Aos membros da banca, pela disponibilidade e ajuda ao trabalho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio

financeiro para o desenvolvimento da tese.

À Universidade Federal do Rio Grande, por me proporcionar todos esses anos de crescimento

e conhecimento.

Ao povo brasileiro, que através do pagamento dos impostos possibilitam o desenvolvimento

científico e tecnológico do Brasil.

RESUMO

O objetivo geral do presente estudo foi elaborar e aplicar filmes contendo hidrolisados

proteicos provenientes de castanha (Umbrina canosai) para a conservação de filés de

linguado. Primeiramente, foram obtidos e caracterizados o isolado proteico (IPC) e proteínas

miofibrilares (PMC) da castanha. A partir dessas matérias-primas, foram elaborados oito

hidrolisados em diferentes graus de hidrólise – GH (10 e 20%) utilizando as enzimas Alcalase

e Protamex. Logo, os mesmos foram caracterizados quanto a seu perfil de massa molecular

(MM), composição aminoacídica e propriedades bioativas in vitro tais como atividade

antioxidante, antimicrobiana, anti-hipertensiva e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase IV

(DPP-IV) e prolil endopeptidase (PEP). A seguir, foram elaborados, caracterizados e

aplicados filmes à base de ágar incorporados com a amostra proveniente do tratamento com

maior potencial antimicrobiano e óleo essencial de cravo (OEC) em filés de linguado

armazenados a 5 °C, onde o acompanhamento da vida útil foi realizado através de análises

físico-químicas e microbiológicas. O IPC apresentou um teor superior de proteína de 92,13%,

mais escuro, com maior capacidade de retenção de água e solubilidade no mesmo pH, em

relação a PMC. Entretanto, a PMC apresentou uma ultraestrutura mais compacta e entalpia

total de desnaturação superior ao IPC. Foi verificado que o acréscimo no GH favoreceu a

obtenção de aminoácidos hidrofóbicos, aromáticos e peptídeos com menor MM. Entretanto,

verificou-se que a Alcalase foi efetiva na quebra das proteínas, pois produziu hidrolisados

com menor MM em relação à Protamex. Além disso, foi verificado devido a MM que as

enzimas estudadas possuem maior afinidade pela PMC. A atividade antioxidante foi

influenciada pelo método de determinação, GH e MM. Em geral, o hidrolisado de IPC pela

Alcalase em GH de 20% (tratamento 2), apresentou maior capacidade de captura do radical

ABTS•+

, de quelação de Fe2+

e intermediária de redução do ferro. Entretanto, a maior

capacidade de sequestro do radical livre DPPH• foi verificada para as amostras hidrolisadas

de IPC e PMC, utilizando a Protamex em GH de 10%. Foi verificada a ação antimicrobiana

frente à 7 dos 26 micro-organismos testados, onde a grande maioria dos micro-organismos

inibidos foram os Gram-positivos. O hidrolisado de IPC pela Alcalase em GH de 20%

(tratamento 2), apresentou atividade antimicrobiana frente a maioria dos micro-organismos

inibidos. As maiores inibições da enzima DPP-IV, foram observadas para amostras

hidrolisadas pela Alcalase com maior GH e menor MM, sendo o maior efeito verificado para

a amostra hidrolisada da PMC. As maiores atividades inibitórias da PEP e ECA foram

observadas para as amostras hidrolisadas pela Protamex. Em geral, os filmes incorporados

com o hidrolisado apresentaram maior solubilidade em água, elongação até a ruptura e

umidade, em relação aos filmes incorporados com OEC. Os filés de linguado, revestidos com

filmes incorporados de OEC e hidrolisados apresentaram a inibição de alguns dos micro-

organismos avaliados, mas as características físico-químicas dos filés revestidos por filmes

incorporados com os hidrolisados, ficaram fora dos padrões estabelecidos em relação às bases

voláteis totais. Devido à elevada perda de massa das amostras precisam ser realizadas maiores

avaliações, para comprovar tal efeito em relação ao filme controle.

Palavras-chave: Pescado, hidrolisados, propriedades bioativas, filmes ativos, conservação.

ABSTRACT

Obtainment of protein hydrolysate from Argentine croaker (Umbrina canosai) with

biological activity and and its application on bioactive films

The general objective of this study was to develop and apply films incorporated with protein

hydrolysates from Argentine croaker (Umbrina canosai) for the conservation of Flounder

fillets. First, Argentine croaker protein isolate (CPI) and Argentine croaker myofibrillar

proteins (CMP) were obtained and characterized. From these raw materials eight hydrolysates

with different degrees of hydrolysis - DH (10 and 20%) were prepared using enzymes

Alcalase and Protamex. They were then characterized for their molecular weight profile

(MW), amino acid composition and in vitro bioactive properties such as antioxidant,

antimicrobial, antihypertensive, and inhibitory enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) and

prolyl endopeptidase (PEP). They were thus prepared, characterized and applied agar based

films incorporated to the sample with the highest antimicrobial potential and clove essential

oil (CEO) in Flounder fillets and stored at 5 °C, where the monitoring of shelf life was carried

out through physico-chemical and microbiological analysis. The CPI showed higher protein

content (92.13%), was darker, had increased water retention capacity and solubility in pH in

relation to the CMP. However, the CMP presented a more compact ultrastructure and higher

total denaturing enthalpy than CPI. It was found that the increase in the DH favored the

production of hydrophobic amino acids, and peptides with lower MW. However, it was found

that Alcalase was effective in breaking down proteins, since it produced hydrolysates with

less MW than Protamex. Furthermore, due to MW, it was found that the enzymes studied

have greater affinity for CMP. The antioxidant activity was influenced by the method of

determination, DH and MW. In general, CPI hydrolysed by Alcalase at 20% DH (treatment 2)

showed the greatest ability to capture the ABTS•+

radical, of Fe2+

chelation and intermediate

of the iron reduction. However, the greatest free DPPH• radical sequestration capacity was

observed for the hydrolysed samples of CPI and CMP using Protamex with 10% DH.

Antimicrobial action against 7 tested microorganisms was observed, where the vast majority

of microorganisms inhibited were Gram-positive. The hydrolyzate IPC by Alcalase GH 20%

(treatment 2), presented antimicrobial activity against most microorganisms inhibited. The

greatest inhibition of DPP-IV enzyme, were observed for the samples hydrolyzed by Alcalase

higher with higher DH and lower MW, with the greatest effect observed on the hydrolysed

sample of CMP. The major inhibitory activities of neuropathological and anti-hypertensive

disorders were observed for the samples hydrolysed by Protamex. The films incorporated

with the hydrolysate showed increased water solubility, elongation at break and moisture in

comparison with the control films and those incorporated with CEO. Flounder fillets coated

with CEO incorporated films and hydrolysate showed inhibition of some of the evaluated

microorganisms, but the physicochemical characteristics of the control films and those

incorporated with the hydrolysate was outside the established standards. Due to high loss of

mass of the samples, further evaluation needs to be carried out to confirm this effect in

relation to the control film.

Keywords: fish, hydrolysates, bioactive properties, active films, conservation.

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II – REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 1 - Diferentes polissacarídeos usados para a elaboração de filmes .............................. 57

CAPÍTULO III - DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

ARTIGO I - Propriedades funcionais, térmicas e físico-químicas de proteínas de castanha

(Umbrina canosai) recuperadas por solubilização/precipitação ou processo de lavagem;

Tabela 1 - Composição proximal do músculo, isolado proteico e proteína miofibrilar da

castanha .................................................................................................................................... 92

Tabela 2 - Características físico-químicas e térmicas do isolado proteico e proteína miofibrilar

da castanha ............................................................................................................................... 95

Tabela 3 - Composição de aminoácidos (b.u) do isolado proteico e proteína miofibrilar da

castanha .................................................................................................................................... 98

ARTIGO II - Atividade antioxidante e antimicrobiana apresentada por hidrolisados proteicos

obtidos de proteínas recuperadas do músculo da castanha (Umbrina canosai);

Tabela 1 - Cepas microbianas utilizadas e condições de cultivo para avaliação da atividade

antimicrobiana dos diferentes hidrolisados proteicos ............................................................ 121

Tabela 2 - Composição aminoacídica dos diferentes hidrolisados proteicos......................... 123

ARTIGO III - Atividade anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase IV e

prolil endopeptidase de hidrolisados proteicos da castanha (Umbrina canosai) incorporados

em filmes de ágar após digestão gastrointestinal simulada;

Tabela 1 - Composição aminoacídica dos diferentes hidrolisados proteicos......................... 163

Tabela 2 - Atividade inibitória da dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV), da prolil endopeptidase

(PEP) e da enzima conversora da angiostensina (ECA) dos diferentes hidrolisados proteicos

................................................................................................................................................ 168

Tabela 3 – Espessura, resistência à tração (RT), elongação até a ruptura (ER), permeabilidade

ao vapor de água (PVA), umidade e ângulo de contato da água (ACA) dos filmes com e sem a

incorporação do hidrolisado ................................................................................................... 173

Tabela 4 - Atividade inibitória da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV), da prolil endopeptidase

(PEP) e da enzima conversora da angiostensina (ECA) do hidrolisado proteico de castanha e

dos filmes após a digestão enzimática ................................................................................... 177

ARTIGO IV - Avaliação do uso de filmes de ágar incorporados com hidrolisados proteicos da

castanha (Umbrina canosai) e óleo essencial de cravo para o prolongamento da vida útil de

filés de linguado (Paralichthys orbignyanus).

Tabela 1 – Propriedades dos filmes controle, incorporados com o hidrolisado ou com o óleo

essencial de cravo ................................................................................................................... 197

ANEXO III

Tabela 1- Fluorescência monitorada a 355 nm/460 nm em intervalos de 2 min durante 30 min

da inibição da prolil endopeptidase ........................................................................................ 245

ANEXO IV

Tabela 1- Análise estatística da contagem das bactérias ácido láticas ................................... 246

Tabela 2 - Análise estatística da contagem das enterobactérias ............................................. 246

Tabela 3 - Análise estatística da contagem das Pseudomonas spp......................................... 246

Tabela 4 - Análise estatística da contagem de micro-organismos produtores de H2S ........... 247

Tabela 5 - Análise estatística da contagem mesófilos aeróbios totais .................................... 247

Tabela 6 - Análise estatística da determinação das bases voláteis totais (N-BVT) ................ 247

Tabela 7 - Análise estatística da determinação de pH ............................................................ 248

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II – REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1 - Castanha (U. canosai) ............................................................................................. 29

Figura 2 - Linguado (P. orbignyanus) ..................................................................................... 30

Figura 3 - Ligação peptídica entre os aminoácidos da proteína. .............................................. 31

Figura 4 - Base bioquímica para a obtenção do isolado proteico ............................................ 34

Figura 5 - Métodos de obtenção de peptídeos a partir de proteínas ......................................... 36

Figura 6 - Métodos de obtenção de hidrolisados a partir de proteína ...................................... 37

Figura 7 - Mecanismos de interação dos peptídeos antimicrobianos com as membranas

microbianas. (A) Canal transmembrana; (B) Poro toroidal e (C) Modelo tapete .................... 51

Figura 8 - Mecanismo de ação dos antioxidantes primários .................................................... 53

Figura 9 -Filme elaborado pela técnica de casting .................................................................. 56

Figura 10 - Aplicações de diferentes filmes bioativos ............................................................. 61

CAPÍTULO III - DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

ARTIGO I - Propriedades funcionais, térmicas e físico-químicas de proteínas de castanha

(Umbrina canosai) recuperadas por solubilização/precipitação ou processo de lavagem;

Figura 1 - Fluxograma do processo de obtenção do isolado proteico de castanha .................. 85

Figura 2 - Fluxograma do processo de obtenção das proteínas miofibrilares de castanha ...... 87

Figura 3 - Microscopia eletrônica de varredura do isolado proteico (a) e proteína miofibrilar

(b) da castanha ....................................................................................................................... 100

Figura 4 - Análise termogravimétrica (TGA) do isolado proteico (1) e proteína miofibrilar da

castanha (2) ............................................................................................................................ 100

Figura 5 - Espectros de absorção da região do infravermelho do isolado proteico (1) e proteína

miofibrilar da castanha (2) ..................................................................................................... 102

Figura 6 - Eletroforese em SDS-PAGE do isolado proteico (IPC), proteína miofibrilar da

castanha (PMC) e do padrão (P) de massa molecular ............................................................ 103

Figura 7 - Solubilidade proteica (a) e capacidade de retenção de água (b) do isolado proteico e

proteína miofibrilar da castanha ............................................................................................. 104

ARTIGO II - Atividade antioxidante e antimicrobiana apresentada por hidrolisados proteicos

obtidos de proteínas recuperadas do músculo da castanha (Umbrina canosai);

Figura 1 - Fluxograma do processo de obtenção dos hidrolisados proteicos provenientes da

castanha (U. canosai) ............................................................................................................. 115

Figura 2 - Perfil de massa molecular média dos diferentes hidrolisados proteicos ............... 127

Figura 3 - Captura do radical ABTS•+

pelos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com

diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex ...................................................... 130

Figura 4 - Capacidade de redução do ferro (FRAP) dos hidrolisados proteicos de IPC ou

PMC, com diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex .................................... 132

Figura 5 - Capacidade de quelação de metais dos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com

diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex ....................................................... 135

Figura 6 - Sequestro do radical livre (DPPH) dos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com

diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex ....................................................... 137

Figura 7 - Atividade antimicrobiana frente à B. thermosphacta (a), L. innocua (b), L.

monocytogenes (c) e S. aureus (d) dos diferentes hidrolisados proteicos após 24 horas ....... 138

Figura 8 - Atividade antimicrobiana frente à A. hydrophila (a), Y. enterecolitica (b) e D.

hanseii (c) dos diferentes hidrolisados proteicos após 24 horas ............................................. 139

ARTIGO III - Atividade anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase IV e

prolil endopeptidase de hidrolisados proteicos da castanha (Umbrina canosai) incorporados

em filmes de ágar após digestão gastrointestinal simulada;

Figura 1 - Perfil de massa molecular média dos diferentes hidrolisados proteicos ................ 166

Figura 2 – Filmes elaborados à base de ágar com e sem a incorporação do hidrolisado de

isolado proteico da castanha ................................................................................................... 172

ARTIGO IV - Avaliação do uso de filmes de ágar incorporados com hidrolisados proteicos da

castanha (Umbrina canosai) e óleo essencial de cravo para o prolongamento da vida útil de

filés de linguado (Paralichthys orbignyanus).

Figura 1- Filés de linguado (P. orbignyanus) revestidos pelos filmes dos diferentes

tratamentos e armazenados a 5 ± 1 °C .................................................................................... 193

Figura 2 - Filmes controle (a), com a incorporação de hidrolisado (b) ou óleo essencial de

cravo (c) .................................................................................................................................. 196

Figura 3 – Microscopia eletrônica de varredura dos filmes controle (a), com a incorporação de

hidrolisado (b) e óleo essencial de cravo (c) .......................................................................... 201

Figura 4 – Comportamento do pH (a) e das bases voláteis totais (N-BVT) (b) dos filés de

linguado armazenados a 5 °C, revestidos com os filmes controle ou incorporados com

hidrolisado ou OEC ................................................................................................................ 203

Figura 5 – Perda de massa dos filés de linguado embalados com os filmes controle ou

incorporados com hidrolisado ou OEC armazenados a 5 °C ................................................. 205

Figura 6 – Contagem dos diferentes micro-organismos dos filés de linguados armazenados a

5 °C ......................................................................................................................................... 207

ANEXO I

Figura 1 - Cinética de hidrólise do isolado proteico e proteína miofibrilar de castanha pelas

enzimas Alcalase (a) e Protamex (b) ...................................................................................... 243

ANEXO II

Figura 2 - Teste preliminar da atividade antimicrobiana dos diferentes hidrolisados na

concentração de 5 mg/mL frente a diferentes micro-organismos .......................................... 244

NOMENCLATURA

AAA - Aminoácidos aromáticos

AACN - Aminoácidos carregados negativamente

AACP - Aminoácidos carregados positivamente

AAE - Aminoácidos essenciais

AAH - Aminoácidos hidrofóbicos

ACA - Ângulo de contato com a água

ANE - Aminoácidos não-essenciais

ANOVA - Análise de variância

AOAC - Association of Official Analytical Chemistry

ASTM - American Public Health Association

ATCC - American Type Culture Collection

B - Volume de base consumida

BHI - Ágar Brain Heart Infusion

CI50 - Concentração necessária de amostra para inibir 50% da atividade da enzima

CLAE - Cromatografia liquida de alta eficiência

CRA - Capacidade de retenção da água

DM2 - Diabetes Mellitus tipo 2

DPP-IV - Dipeptidil peptidase - IV

DSC - Calorimetria Diferencial de Varredura

EC - Enzyme Comission

ECA - Enzima conversora da angiotensina – I

ER - Elongação até ruptura

FRAP - Capacidade de redução do ferro

FT-IR - Espectroscopia no infravermelho

GH - Grau de hidrólise

GIP - Polipeptídeo insulinotrópico dependente da glicose

GLP-1 – Peptídeo semelhante ao glucagon 1

IPC - Isolado proteico de castanha

MEV - Microscopia eletrônica de varredura

MM - Massa molecular

MP - Massa de proteína

MRS - Ágar lactobacillus

Nb - Normalidade da base

N-BVT - Bases voláteis totais

OE - Óleo essencial

OEC - Óleo essencial de cravo

PAM - Peptídeos antimicrobianos

PALM – Polissacarídeos de algas marinhas

PCM - Proteína miofibrilar da castanha

PDA - Ágar batata dextrose

PEP - Prolil endopeptidase

pH - Potencial hidrogeniônico

pI - Ponto isoelétrico

pKA - Constante de dissociação

PVA - Permeabilidade ao vapor de água

RT - Resistência à tração

S - Solubilidade

SF - Solução filmogênica

SRL - Sequestro do radical livre

TGA - Análise termogravimétrica

UFC - Unidade formadora de colônia

Y - Opacidade

SUMÁRIO

CAPÍTULO I............................................................................................................................ 24

INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 24

OBJETIVOS ............................................................................................................................ 24

1 INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 25

2 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 27

2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 27

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 27

CAPÍTULO II .......................................................................................................................... 28

REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................... 28

2.1 PESCADO ...................................................................................................................... 29

2.2 PROTEÍNAS DO PESCADO ........................................................................................ 31

2.3 ISOLADO PROTEICO DE PESCADO ......................................................................... 33

2.4 HIDROLISADO PROTEICO ........................................................................................ 35

2.4.1 Hidrolisado proteico de pescado .............................................................................. 38

2.4.2 Enzimas proteolíticas ............................................................................................... 39

2.4.2.1 Alcalase ............................................................................................................. 41

2.4.2.2 Protamex ........................................................................................................... 42

2.4.3 Grau de hidrólise ...................................................................................................... 42

2.5 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS PEPTÍDEOS ............................................................ 44

2.5.1Atividade anti-hipertensiva ....................................................................................... 45

2.5.2 Atividade antidiabética ............................................................................................. 47

2.5.3 Atividade inibidora de desordens neuropatológicas ................................................. 49

2.5.4 Atividade antimicrobiana ......................................................................................... 49

2.5.5 Atividade antioxidante ............................................................................................. 52

2.6 FILMES POLIMÉRICOS .............................................................................................. 55

2.6.1 Filmes à base de polissacarídeos .............................................................................. 57

2.6.1.1 Ágar ................................................................................................................... 58

2.6.2 Filmes bioativos ....................................................................................................... 59

2.6.2.1 Aplicação dos filmes bioativos ......................................................................... 60

3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 62

CAPÍTULO III – DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ................................................ 79

APRESENTAÇÃO .................................................................................................................. 80

ARTIGO I ................................................................................................................................. 81

PROPRIEDADES FUNCIONAIS, TÉRMICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS DE

CASTANHA (Umbrina canosai) RECUPERADAS POR

SOLUBILIZAÇÃO/PRECIPITAÇÃO OU PROCESSO DE LAVAGEM ............................. 81

RESUMO ................................................................................................................................. 82

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 83

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 84

2.1 MATERIAL .................................................................................................................... 84

2.1.1 Pescado ..................................................................................................................... 84

2.1.2 Reagentes .................................................................................................................. 85

2.2 OBTENÇÃO DO ISOLADO PROTEICO ..................................................................... 85

2.3 OBTENÇÃO DAS PROTEÍNAS MIOFIBRILARES ................................................... 86

2.4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MATÉRIAS PRIMAS .................... 87

2.4.1 Composição proximal ............................................................................................... 87

2.4.2 Digestibilidade .......................................................................................................... 88

2.4.3 Composição aminoacídica ........................................................................................ 88

2.4.4 Eletroforese ............................................................................................................... 88

2.4.5 Cor ............................................................................................................................ 89

2.4.6 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) ............................................................ 89

2.4.7 Análise termogravimétrica (TGA) ............................................................................ 90

2.4.8 Espectroscopia no infravermelho (FT-IR) ................................................................ 90

2.4.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ............................................................ 90

2.4.10 Propriedades funcionais .......................................................................................... 91

2.4.10.1 Solubilidade proteica ....................................................................................... 91

2.4.10.2 Capacidade de retenção de água (CRA) .......................................................... 91

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 92

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 92

3.1 COMPOSIÇÃO PROXIMAL ......................................................................................... 92

3.2 DIGESTIBILIDADE PROTEICA .................................................................................. 94

3.3 COR ................................................................................................................................. 95

3.4 PROPRIEDADES TÉRMICAS ...................................................................................... 96

3.5 COMPOSIÇÃO AMINOACÍDICA ............................................................................... 97

3.6 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) ....................................... 99

3.7 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA) ............................................................ 100

3.8 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (FTIR) .............................................. 101

3.9 ELETROFORESE ........................................................................................................ 103

3.10 PROPRIEDADES FUNCIONAIS ............................................................................. 103

3.10.1 Solubilidade proteica (S) e capacidade de retenção de água (CRA) .................... 103

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 105

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 106

ARTIGO II ............................................................................................................................. 110

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE e ANTIMICROBIANA APRESENTADA POR

HIDROLISADOS PROTEICOS OBTIDOS DE PROTEÍNAS RECUPERADAS DO

MÚSCULO DA CASTANHA (Umbrina canosai) ............................................................... 110

RESUMO ............................................................................................................................... 111

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 112

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 113

2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 113

2.1.2 Matéria-prima ......................................................................................................... 113

2.2 ENZIMAS ..................................................................................................................... 114

2.3 OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTEICOS .................................................. 114

2.4 COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS ........................................................................ 117

2.5 PERFIL DE MASSA MOLECULAR .......................................................................... 117

2.6 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES BIOATIVAS DOS HIDROLISADOS ......... 118

2.6.1 Atividade antioxidante ........................................................................................... 118

2.6.1.1 Captura do radical ABTS·+

(2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido

sulfônico) .................................................................................................................... 118

2.6.1.2 Capacidade de redução do ferro (FRAP) ........................................................ 118

2.6.1.3 Capacidade de quelação dos metais ................................................................ 119

2.6.1.4 Sequestro do radical livre DPPH• (2,2–Difenil–1–picrilhidrazila) ................. 120

2.6.2 Atividade antimicrobiana ....................................................................................... 120

2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 122

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 122




3.3.1 Atividade antioxidante ........................................................................................... 129


............................................................................. 129

3.3.1.2 Capacidade de redução do ferro (FRAP) ......................................................... 132

3.3.1.3 Capacidade de quelação de metais .................................................................. 134

3.3.1.4 Sequestro do radical livre DPPH• (2,2–Difenil–1–picrilhidrazila) .................. 136

3.3.1 Atividade antimicrobiana ........................................................................................ 137

4 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 142


ARTIGO III ............................................................................................................................ 150

ATIVIDADE ANTI-HIPERTENSIVA, E INIBITÓRIA DAS ENZIMAS DIPEPTIDIL

PEPTIDASE IV E PROLIL ENDOPEPTIDASE DE HIDROLISADOS PROTEICOS DA

CASTANHA (UMBRINA CANOSAI) INCORPORADOS EM FILMES DE ÁGAR APÓS

DIGESTÃO GASTROINTESTINAL SIMULADA .............................................................. 150

RESUMO ............................................................................................................................... 151

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 152

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 154

2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 154

2.1.1 Matéria-prima ......................................................................................................... 154

2.2 ENZIMAS ..................................................................................................................... 155

2.3 OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTEICOS ................................................... 155

2.4 COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS ......................................................................... 156

2.5 PERFIL DE MASSA MOLECULAR........................................................................... 156


2.6.1 Atividade inibitória da dipeptidil peptidase-IV ...................................................... 157

2.6.2 Atividade inibitória da prolil endopeptidase ........................................................... 158

2.6.3 Atividade anti-hipertensiva ..................................................................................... 158

2.7 Elaboração dos filmes à base de ágar ............................................................................ 159

2.7.1 Caracterização dos filmes ....................................................................................... 159

2.7.1.1 Espessura ......................................................................................................... 159

2.7.1.2 Propriedades mecânicas ................................................................................... 159

2.7.1.3 Permeabilidade ao vapor de água .................................................................... 160

2.7.1.4 Umidade .......................................................................................................... 160

2.7.1.5 Ângulo de contato com a água (ACA) ............................................................ 160

2.8 DIGESTÃO GASTROINTESTINAL ENZIMÁTICA SIMULADA DO FILME ....... 161

2.8.1 Caracterização dos filmes digeridos ....................................................................... 161

2.8.1.1 Atividades anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV e

prolil endopeptidase .................................................................................................... 161






3.3.1 Atividade inibitória da dipeptidil peptidase-IV ...................................................... 167

3.3.2 Atividade inibitória da prolil endopeptidase .......................................................... 169

3.3.3 Atividade anti-hipertensiva .................................................................................... 170

3.4 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES .......................................................................... 172

3.4.1 Espessura e propriedades mecânicas ...................................................................... 172

3.4.2 Permeabilidade ao vapor de água e umidade ......................................................... 174

3.4.3 Ângulo de contato com a água (ACA) ................................................................... 176

3.5 CARACTERIZAÇÃO DO FILME DIGERIDO ATRAVÉS DE SIMULAÇÃO

GASTROINTESTINAL ..................................................................................................... 176

3.5.1 Atividades anti-hipertensiva, e inibitória da dipeptidil peptidase-IV e da prolil

endopeptidase .................................................................................................................. 176

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 177


ARTIGO IV ........................................................................................................................... 185

AVALIAÇÃO DO USO DE FILMES DE ÁGAR INCORPORADOS COM

HIDROLISADOS PROTEICOS DA CASTANHA (Umbrina canosai) E ÓLEO ESSENCIAL

DE CRAVO PARA O PROLONGAMENTO DA VIDA ÚTIL DE FILÉS DE LINGUADO

(Paralichthys orbignyanus) .................................................................................................... 185

RESUMO ............................................................................................................................... 186

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 187

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 188

2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 188

2.1.1 Matéria-prima ......................................................................................................... 188

2.1.2 Enzima .................................................................................................................... 189

2.2 OBTENÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO ......................................................... 189

2.3 ELABORAÇÃO DOS FILMES ................................................................................... 189

2.3.1 Caracterização dos filmes ....................................................................................... 190

2.3.1.1 Espessura ......................................................................................................... 190

2.3.1.2 Propriedades mecânicas ................................................................................... 190

2.3.1.3 Permeabilidade ao vapor de água .................................................................... 190

2.3.1.4 Solubilidade em água....................................................................................... 191

2.3.1.5 Cor, opacidade e transparência ........................................................................ 191

2.3.1.6 Microscopia eletrônica de varredura ............................................................... 192

2.4 USO DE FILMES BIOATIVOS NA CONsERVAÇÃO DO PESCADO .................... 193

2.4.1 pH ............................................................................................................................ 194

2.4.2 Bases voláteis totais (N-BVT) ................................................................................ 194

2.4.3 Perda de massa ........................................................................................................ 194

2.4.4 Análises microbiológicas ........................................................................................ 194



3.1 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES .......................................................................... 195

3.1.1 Espessura e propriedades mecânicas ...................................................................... 196

3.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água ...................................... 198

3.1.3 Cor, opacidade e transparência ............................................................................... 199

3.1.4 Microscopia eletrônica de varredura ....................................................................... 201

3.2 EFEITO DO USO DE FILMES BIOATIVOS NA CONsERVAÇÃO DO PESCADO

............................................................................................................................................. 202

3.2.1 pH e bases voláteis totais (N-BVT) ........................................................................ 202

3.2.2 Perda de massa ........................................................................................................ 204

3.2.3 Análises microbiológicas ........................................................................................ 206

4 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 209


CAPÍTULO IV - CONCLUSÃO GERAL ............................................................................. 216

CAPÍTULO V - REFERêNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 219

APÊNDICE I .......................................................................................................................... 243

APÊNDICE II ......................................................................................................................... 244

APÊNDICE III ....................................................................................................................... 245

APÊNDICE IV ....................................................................................................................... 246

ANEXO I ................................................................................................................................ 249

Universal Protease Activity Assay: Casein as a Substrate ..................................................... 249

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO GERAL

OBJETIVOS

25

1 INTRODUÇÃO GERAL

Atualmente, a exploração dos recursos naturais e o aumento da poluição

ambiental, criaram a necessidade da utilização de co-produtos e espécies de baixo valor

agregado de pescado para o desenvolvimento de produtos de alto valor agregado (NOLSØE;

UNDELAND, 2009). Muitos estudos estão utilizando as espécies subutilizadas para obter

proteínas miofibrilares, isolados e hidrolisados proteicos, que podem ser considerados

produtos de alto valor agregado (CENTENARO, 2011; EL HALAL et al., 2015a;

FERREIRA, 2014; LIMPAN et al., 2010; PIOTROWICZ, 2012; ROCHA et al., 2014;

SILVA; FONSECA; PRENTICE, 2014; YARNPAKDEE et al., 2014; ZAVAREZE et al.,

2014). A castanha (Umbrina canosai) é um pescado amplamente disponível no litoral sul do

Brasil. Entretanto, segundo Lempek, Martins e Prentice (2007) esta é subutilizada e possui

baixo valor comercial, que devido ao seu conteúdo proteico pode ser utilizada para a obtenção

dos produtos anteriormente citados.

Os isolados proteicos de pescado têm apresentado boas propriedades funcionais,

para aplicação em diferentes fórmulas alimentares e também na elaboração de hidrolisados,

pois reduzem o conteúdo de compostos pró-oxidantes que podem afetar a estabilidade dos

mesmos (GEHRING et al., 2011; NOLSØE; UNDELAND, 2009; RAGHAVAN;

KRISTINSSON, 2009a). Além disso, segundo Kristinsson e Liang (2006) o processo de

lavagem para obtenção de proteínas miofibrilares, também pode remover um conteúdo

considerável de lipídios e proteínas sarcoplasmáticas. Esses processos, podem resultar em

hidrolisados proteicos com boas propriedades bioativas. Segundo Gómez-Guillén et al.

(2011), as proteínas possuem peptídeos biologicamente ativos, que são inativos dentro da

sequência proteica, mas podem ser liberados durante a digestão gastrointestinal,

processamento dos alimentos e processos como a hidrólise enzimática.

Esses peptídeos têm apresentado atividades biológicas, tais como antioxidante,

antimicrobiana e inibitória das enzimas conversora da angiostensina (ECA), dipeptidil

peptidase IV (DPP-IV) e prolil endopeptidase as quais estão associadas a hipertensão,

diabetes e desordens neuropatológicas, respectivamente (ALEMÁN; GÓMEZ-GUILLÉN;

MONTERO, 2013; ALEMÁN et al., 2011; CENTENARO, 2011; FONSECA, 2014; JIANG

et al., 2014; PIOTROWICZ, 2012; SILA et al., 2015; ZAVAREZE et al., 2014). Eles

apresentam essas atividades, devido as características ligadas ao tipo de aminoácido,

sequência aminoacídica, massa molecular entre outras (NAJAFIAN; BABJI, 2012;

ONDETTI; CUSHMAN, 1982; SILA et al., 2015; WILSON; HAYES; CARNEY, 2011).

26

Devido aos efeitos adversos de muitos inibidores sintéticos da ECA tais como tosse,

dificuldade para respirar e distúrbio do paladar (CHEN et al., 2012; VYSSOULIS et al.,

2001), resistência microbiana aos antibióticos e conservantes de alimentos, no caso dos

antimicrobianos (SILA et al., 2014), toxicidade e efeito carcinogênico de alguns antioxidantes

(FARVIN et al., 2014) entre outros, o estudo dos hidrolisados tem sido uma alternativa

interessante. Além disso, a aplicação dos peptídeos bioativos em filmes comestíveis é uma

alternativa de funcionalidade dos mesmos, além da possibilidade do uso destes como

embalagens (GIMÉNEZ et al., 2013a, 2013b). O estudo da digestibilidade dos filmes, pode

fornecer informações úteis para o uso desse tipo de material na elaboração de alimentos

funcionais (GIMÉNEZ et al., 2013b).

Na década de 80, com o advento da conscientização ambiental e os aspectos

negativos dos materiais poliméricos sintéticos, a elaboração de filmes passou a ser incentivada

(FALGUERA et al., 2011; TONGNUANCHAN; BENJAKUL; PRODPRAN, 2011). Segundo

Sousa e Gonçalves (2015) os filmes elaborados à base de polissacarídeos de algas marinhas,

tais como o ágar, possuem boa resistência mecânica, propriedades moderadas de barreira ao

O2 e CO2, são comestíveis e facilmente biodegradáveis. Além disso, devido a sua carga neutra

possibilitam a difusão de compostos bioativos. Diante disso, é interessante a incorporação de

peptídeos bioativos no desenvolvimento de filmes ativos, os quais podem ser utilizados na

conservação de alimentos, tais como o pescado.

O pescado é altamente perecível durante o armazenamento sob refrigeração,

devido a rápida multiplicação de micro-organismos naturalmente presentes no mesmo ou

oriundos de contaminação, o que pode resultar em problemas econômicos e/ou relacionados

com a saúde (GÓMEZ-ESTACA et al., 2010; LÓPEZ DE LACEY; LÓPEZ-CABALLERO;

MONTERO, 2014). O linguado (Paralichthys orbignyanus) está distribuído desde o Rio de

Janeiro (Brasil) até a Patagônia (Argentina) no sudoeste do Atlântico, e constitui um

importante recurso pesqueiro nessas áreas sendo considerado importante devido ao seu

elevado preço de mercado, justificando o uso de tecnologias alternativas para a sua

conservação (BOLASINA, 2011; SAMPAIO; BIANCHINI, 2002). Neste contexto, o objetivo

do presente estudo foi elaborar e aplicar filmes incorporados com hidrolisados proteicos,

provenientes de castanha, para a conservação de filés de linguado.

27

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Obtenção, avaliação e aplicação de hidrolisados proteicos da castanha (U. canosai)

com atividades biológicas, em filmes bioativos utilizados para a conservação de

pescado.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter e caracterizar isolados proteicos e proteínas miofibrilares provenientes da

castanha, quanto as suas propriedades físico-químicas e funcionais;

Obter hidrolisados proteicos com diferentes graus de hidrólise, a partir das proteínas

miofibrilares e isolados proteicos da castanha utilizando enzimas proteolíticas;

Avaliar as bioatividades (capacidade antioxidante, antimicrobiana, anti-hipertensiva,

inibitória das enzimas dipeptidil peptidase IV e prolil endopeptidase) apresentadas

pelos diferentes hidrolisados proteicos obtidos;

Elaborar filmes à base de ágar com a incorporação de hidrolisado ou de óleo essencial

de cravo (Eugenia caryophyllata);

Avaliar os filmes elaborados quanto a suas propriedades mecânicas, físicas e de

barreira;

Aplicar e avaliar o efeito de filmes incorporados com hidrolisado ou óleo essencial de

cravo, sobre a conservação de filés de linguado (P. orbignyanus) armazenados a 5 °C

durante 15 dias.

CAPÍTULO II

REVISÃO DA LITERATURA

29

2.1 PESCADO

O pescado pode servir como fonte de compostos funcionais, tais como os ácidos

graxos poli-insaturados, minerais, vitaminas, proteínas e peptídeos bioativos (MARMON,

2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012; RAGHAVAN; KRISTINSSON, 2009). Com base na

massa, cerca de 50 a 65% do pescado corresponde ao músculo, onde os seus principais

constituintes são a umidade (58 - 82%), as proteínas (16 - 21%), os lipídios (0,2 - 25%) e as

cinzas (1,2 - 1,5%). O conteúdo de carboidratos, geralmente, é inferior a 0,5% (MARMON,

2012). Na nutrição humana, o pescado constitui uma fonte de proteína de alto valor biológico,

sendo tão importante quanto a da carne bovina. Em muitos países, principalmente da Europa e

Ásia, é a proteína animal mais consumida. Contudo, por razões culturais e socioeconômicas,

no Brasil apenas 10% da população incorpora o pescado em sua alimentação (GERMANO;

GERMANO, 2015). Segundo dados do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA), a média do

consumo per capita no Brasil alcançou 11,17 kg em 2011 (BRASIL, 2011a).

Segundo o Boletim Estatístico da Pesca e Aquicultura do MPA, o Brasil produziu

em 2011 aproximadamente 1.431.974 toneladas de pescado (BRASIL, 2011a). A pesca

extrativa marinha é a principal fonte de produção de pescado nacional, sendo responsável por

553.670,0 toneladas (38,7% do total de pescado). A Figura 1 mostra a castanha (Umbrina

canosai), a qual habita as águas costeiras do Atlântico Sul, entre os limites aproximados do

Rio de Janeiro (Brasil) e do Rio Colorado (Argentina) (HAIMOVICI; SANTOS; PEREZ,

2006).

Figura 1 - Castanha (U. canosai)

Fonte: www.fishbase.org (2015)

Em 2011, aproximadamente 12.164,8 toneladas de castanha foram capturadas no

Brasil (BRASIL, 2011a). No mesmo período, o Rio Grande do Sul foi responsável pela pesca

marinha extrativa de 34.385,0 toneladas de pescado. Neste contexto, o porto pesqueiro da

cidade do Rio Grande se destaca, pois é o maior centro pesqueiro do estado (BRASIL, 2011).

30

A castanha é uma espécie pertencente a família Sciaenidae, demersal, semi-gorda,

a qual possui hábitos alimentares epi-bentônicos. A castanha atinge cerca de 450 mm de

comprimento e 1,4 kg de massa (FISCHER; PEREIRA; VIEIRA, 2004). Segundo Lempek

(2005), o músculo da castanha possui 77,3% de umidade, 18,3% de proteína, 3,3% de lipídios

e 1,1% de cinzas. Ela é explorada sazonalmente, principalmente, nos meses de inverno e

primavera, quando os adultos migram acompanhando o deslocamento de águas mais frias,

para desovar no litoral do Rio Grande do Sul (HAIMOVICI; SANTOS; PEREZ, 2006). Essa

espécie é abundante e intensamente explorada na plataforma continental do sul do Brasil.

Entretanto, possui baixo valor comercial o qual varia de R$ 0,86 a 1,02 por kg, dependendo

do tipo de pesca realizada (BRASIL, 2011b). Algumas espécies de pescado não são

comumente comercializadas, por não possuírem rendimento satisfatório com relação à

filetagem, devido à estrutura corporal e por apresentarem baixo valor comercial (MARTINS ;

COSTA; PRENTICE, 2009). Além disso, devido à crescente conscientização de que os

recursos marinhos não são infinitos, numerosos esforços têm sido realizados para a melhoria

da utilização de subprodutos e co-produtos pesqueiros, bem como de espécies de baixo valor

agregado, as quais são pouco utilizadas na alimentação (NOLSØE; UNDELAND, 2009).

A Figura 2 mostra o linguado (Paralichthys orbignyanus), a sua distribuição se

estende do estado do Rio de Janeiro (Brasil) até a Patagônia (Argentina), constituindo um

importante recurso pesqueiro nestas áreas (BOLASINA, 2011). Ele é a única espécie adaptada

ao estuário da Lagoa dos Patos, entre as três espécies do gênero Paralichthys pescadas na

região, sendo a de maior porte (OKAMOTO, 2011).

Figura 2 - Linguado (P. orbignyanus)

Fonte: www.fishbase.org (2015)

O linguado possui hábitos demersais, considerado uma espécie magra, é um peixe

carnívoro o qual quando juvenil se alimenta de poliquetas e crustáceos, mas quando adultos,

indivíduos maiores passam a ter importância (BIANCHINI; ROBALDO; SAMPAIO, 2010).

Segundo Müller et al. (2006) o linguado apresenta um conteúdo 81% de umidade, 17,4% de

31

proteínas, 1,60% de lipídios e 1,08% de cinzas. Alguns exemplares, podem atingir mais de

100 cm de comprimento total e massa de aproximadamente 10 kg (BIANCHINI; ROBALDO;

SAMPAIO, 2010; CARNEIRO, 1995; MÜLLER et al., 2006; OKAMOTO, 2011). Seu valor

comercial é elevado e é um importante item da pesca na costa do Rio Grande do Sul, Uruguai

e Argentina (OKAMOTO, 2011). Segundo dados do MPA, o valor comercial do mesmo está

entre R$ 2,07 e 3,55 por kg, dependendo do tipo de pesca realizada (BRASIL, 2011b). Em

2011, aproximadamente 2.682,3 toneladas de linguado foram capturadas, através da pesca

marinha extrativa no Brasil (BRASIL, 2011a).

2.2 PROTEÍNAS DO PESCADO

As proteínas são polímeros complexos compostos por 21 aminoácidos distintos,

interligados por ligações peptídicas como apresenta a Figura 3 (DAMODARAN; PARKIN;

FENNEMA, 2010). Os aminoácidos estão unidos pela formação de ligações covalentes, entre

um grupo α - carboxila de um aminoácido e o grupo α - amina do próximo.

Consequentemente, a água é eliminada do processo obtendo-se resíduos de aminoácidos

ligados entre si, sendo essa ligação denominada ligação peptídica. A proteína se compõe de

muitos aminoácidos, geralmente mais de cem, que são ligados por ligações peptídicas para

formar uma cadeia polipeptídica (CAMPBELL, 2000).

Figura 3 - Ligação peptídica entre os aminoácidos da proteína.

Fonte: Araújo (2012)

Os aminoácidos diferem entre si, devido a sua diferente massa molecular, carga e

polaridade característica. As propriedades químicas e o tamanho da cadeia lateral, bem como

a sequência de aminoácidos, afetam a conformação da molécula, a atividade biológica e

nutricional e as propriedades funcionais da proteína (ARAÚJO, 2011; DAMODARAN;

PARKIN; FENNEMA, 2010).

32

As proteínas do músculo esquelético estão organizadas de acordo com a sua

solubilidade ou função biológica. As funções biológicas, normalmente se referem às

contribuições das proteínas à estrutura do músculo, tal como a contração ou metabolismo,

entre outras. Esta categoria abrange a solubilidade das proteínas do músculo, em diferentes

concentrações de sais e as mesmas estão correlacionadas à localização celular, o que

compreendem três classes de proteínas sendo identificadas como sarcoplasmáticas,

miofibrilares e do estroma (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). As proteínas

sarcoplasmáticas, miofibrilares e conjuntivas compreendem 20 a 30%, 65 a 75% e 3 a 10% do

total da proteína presente no músculo do pescado, respectivamente (FURLONG, 2000;

KOBLITZ, 2014). Segundo Koblitz (2014), o músculo do pescado possui propriedades

diferentes, as quais dependem dos grupos de proteína que o constitui, que podem variar de

acordo com a espécie, tamanho, sexo, época do ano e região de captura.

As proteínas sarcoplasmáticas estão localizadas na porção do sarcoplasma da

célula do músculo, desempenhando funções bioquímicas das células. Além disso, a sua

importância reside em que a maioria possui atividade enzimática (DAMODARAN; PARKIN;

FENNEMA, 2010). As proteínas sarcoplasmáticas são solúveis em água e em soluções com

baixa força iônica (> 0,3 mM) (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Alguns

autores (LIMPAN et al., 2010; NUANMANO; PRODPRAN; BENJAKUL, 2015;

ZAVAREZE et al., 2014) extraíram proteínas sarcoplasmáticas e do estroma do músculo de

diferentes pescados, através de sucessivas lavagens em água e solução salina diluída para a

concentração de proteínas miofibrilares.

As proteínas do estroma, ou dos tecidos conectivos, estão constituídas por

diversos tipos de célula, incluindo fibroblastos que sintetizam o colágeno. Além disso, existe

ainda uma matriz composta por proteínas fibrosas e não fibrosas, incluindo membros da

família do colágeno, tal como a elastina (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). O

tecido conjuntivo é responsável pela sustentação das fibras musculares em estruturas capazes

da manutenção da conexão das mesmas. Entretanto, como os peixes não necessitam muito

esforço para o seu deslocamento na água, consequentemente não necessitam de um tecido

forte e extenso. Desta forma, o pescado possui menor conteúdo de colágeno e elastina, quando

comparado com os animais terrestres (KOBLITZ, 2014).

As proteínas miofibrilares são representadas, principalmente, pelo grupo actina e

miosina, as quais são estruturadas em filamentos e apresentam a função contrátil. São

insolúveis em água e solúveis em soluções salinas concentradas (> 0,05 M) (KOBLITZ,

2014). A miosina é a mais abundante das proteínas estruturais e é importante na capacidade

33

de formação de gel, retenção de água e contém importantes aminoácidos essenciais

(MARMON, 2012).

As proteínas de pescado, estão sendo utilizadas para o desenvolvimento de

produtos de elevado valor agregado. Esses podem contribuir no melhoramento das

propriedades funcionais e no enriquecimento proteico, como novas alternativas para o

desenvolvimento de alimentos através do uso de isolados proteicos, proteínas miofibrilares,

surimi, entre outros (CENTENARO et al., 2007; FREITAS et al., 2011; LEMPEK;

MARTINS; PRENTICE, 2007; PIOTROWICZ, 2012). Por outro lado, as proteínas também

estão sendo avaliadas quanto a obtenção de compostos os quais sejam benéficos para a saúde

dos seres humanos, como os peptídeos bioativos que podem ter propriedades antimicrobianas

(DI BERNARDINI et al., 2011; JIANG et al., 2014), antioxidantes (ALEMÁN et al., 2011;

CENTENARO, 2011), anti-hipertensivas (RAGHAVAN; KRISTINSSON, 2009) entre

outras.

2.3 ISOLADO PROTEICO DE PESCADO

O processo de isolamento de proteínas do músculo de pescado, com a eliminação

simultânea de lipídios e proteínas insolúveis, foi proposta por Hultin e Kelleher (2000). Os

isolados proteicos são comumente obtidos pelo processo de variação de pH (pH- shifting

process) por solubilização proteica por via química (ácida ou alcalina), a partir de co-

produtos, músculo ou de pescado inteiro, seguida de precipitação em seu ponto isoelétrico (pI)

(MATAK; TAHERGORABI; JACZYNSKI, 2015; NOLSØE; UNDELAND, 2009). A Figura

4, explica bioquimicamente a obtenção do isolado proteico através do método de variação de

pH.

As proteínas miofibrilares estão presentes como agregados, são insolúveis em

água e solúveis em soluções salinas concentradas (> 0,05 M) (DAMODARAN; PARKIN;

FENNEMA, 2010; KOBLITZ, 2014; ORDÓÑEZ, 2005). No músculo homogeneizado de

pescado, ocorre uma interação hidrofóbica fraca de proteína-proteína (GEHRING et al., 2011;

MATAK; TAHERGORABI; JACZYNSKI, 2015; UNDELAND et al., 2003). Entretanto, as

cadeias laterais de proteína podem assumir diferentes cargas eletrostáticas, dependendo das

condições em que as mesmas são submetidas. Em valores de pH abaixo ou acima do pI, as

proteínas possuem uma carga líquida positiva ou negativa, respectivamente (DAMODARAN;

PARKIN; FENNEMA, 2010).

34

Figura 4 - Base bioquímica para a obtenção do isolado proteico

Onde: A) No pI as interações proteina-água são mínimas, enquanto que as interações proteína-proteína são

máximas, através ligações hidrofóbicas fracas; B) Com a adição de ácido ou base, as interações proteína-água

aumentam, resultando na solubilidade proteica. (Fonte: Adaptada de Gehring et al., 2011; Matak, Tahergorabi e

Jaczynski, 2015).

Segundo Matak, Tahergorabi e Jaczynski (2015), quando um ácido é adicionado

em uma solução proteica, ocorre a formação de íons hidrônio (H3O+), e a consequente

protonação de algumas cadeias laterais carregadas, tais como os resíduos de glutamil ou

aspartil, resultando em um aumento da carga líquida positiva da solução. Semelhantemente, a

adição de base (OH-) na solução resulta na desprotonação, das cadeias como a tirosil, lisil,

cistenil, triptofanil e arginil entre outras, contribuindo para um aumento de carga negativa

(GEHRING et al., 2011; NOLSØE; UNDELAND, 2009). Segundo Matak, Tahergorabi e

Jaczynski (2015), quando as proteínas possuem cargas líquidas, positivas ou negativas,

iniciam uma interação eletrostática proteína-água, o que diminui as interações hidrofóbicas

proteína-proteína. Consequentemente as moléculas de proteína se tornam mais polares,

ocorrendo um acréscimo no conteúdo de água associada e em torno da mesma, tornando-as

solúveis em água (GEHRING et al., 2011; NOLSØE; UNDELAND, 2009).

No entanto, é possível ajustar o pH de uma solução proteica, de modo que o

número de cargas negativas sobre a superfície da proteína seja igual ao número de cargas

positivas e por conseguinte, a molécula de proteína assume uma carga eletrostática líquida

igual a zero. Esse ponto é denominado ponto isoelétrico (pI) da proteína, o qual depende do

35

tipo de matéria-prima utilizada, mas para um grande número de proteínas encontra-se entre os

pH’s 4,5 e 6,5 (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; GEHRING et al., 2011;

MATAK; TAHERGORABI; JACZYNSKI, 2015). A solubilidade da proteína depende não

apenas das propriedades físico-químicas da molécula, mas também do pH, da força iônica, da

temperatura e do tipo do solvente (ORDÓÑEZ, 2005).

O comportamento isoelétrico das proteínas musculares de pescado, pode ser usado

para recuperar proteínas do processamento de animais aquáticos ou de co-produtos, assim

como de espécies de baixo valor agregado (MATAK; TAHERGORABI; JACZYNSKI,

2015). Segundo Kristinsson e Liang (2006), materiais indesejáveis como a pele, ossos, micro-

organismos, lipídios de membrana e outros resíduos são removidos durante o processo de

centrifugação. Nos processos de solubilização ácida ou alcalina da proteína, quando o

músculo é submetido a pH extremos, as proteínas são parcialmente desdobradas. Desta forma,

ocorrem alterações na parte estrutural e conformacional das proteínas, as quais conduzem a

diferentes propriedades quando recuperadas (KRISTINSSON; HULTIN, 2003). O

processamento do isolado proteico de pescado em pH alcalino, permite a recuperação de

proteínas com propriedades funcionais melhores, entre elas textura ou gelificação, entre

outros. Entretanto, a solubilização ácida resulta em um acréscimo do rendimento proteico.

Além da solubilização ácida, muitos fatores são responsáveis por essa característica, tais

como a fonte muscular, frescor dos filés de pescado, adição de água, pH de solubilização e

precipitação, dentre outros (MARMON, 2012; NOLSØE; UNDELAND, 2009).

A composição proximal do pescado, a qual depende da espécie, idade, estado

fisiológico, época e região da captura, pode influenciar na obtenção de produtos com

diferentes teores de constituintes (ORDÓÑEZ, 2005). Rocha et al. (2013) elaboraram isolado

proteico a partir de carne mecanicamente separada de anchoita (Engraulis anchoita), o qual

obteve um conteúdo de 88,8% de proteínas, 5,5% de umidade, 1,3% lipídios e 1,0% de cinzas.

El Halal et al. (2015) obtiveram um isolado proteico de corvina (Micropogonias furnieri),

com um teor de 89,8% de proteína, 9,2% de umidade, 0,7% de lipídios e 0,8% de cinzas.

2.4 HIDROLISADO PROTEICO

A hidrólise das proteínas é umas das estratégias para melhorar as propriedades

funcionais da proteína, tanto do ponto de vista tecnológico (solubilidade, dispersibilidade,

formação de espuma e emulsificação) como biológico (peptídeos bioativos) (DAMODARAN;

36

PARKIN; FENNEMA, 2010; NAJAFIAN; BABJI, 2012). Segundo Najafian e Babji (2012)

os peptídeos bioativos, desempenham um papel importante na modulação e regulação

metabólica. Estes podem ser utilizados como ingredientes funcionais, nutracêuticos e

farmacêuticos para melhorar a saúde e prevenir doenças (BARROW; SHAHIDI, 2008). Os

peptídeos bioativos estão inativos dentro das sequências das proteínas, mas podem ser

liberados por diferentes processos e em seguida eles exercem várias funções fisiológicas. A

grande maioria dos peptídeos bioativos são gerados espontaneamente in vivo, a partir da

digestão das proteínas que os contêm. Contudo, eles também podem ser obtidos por métodos

in vitro (KORHONEN; PIHLANTO, 2006). São conhecidos três métodos para obtenção

desses peptídeos, como apresenta a Figura 5. Estes métodos são a extração por solvente, a

hidrólise enzimática e a fermentação microbiana de diferentes fontes proteicas.

Figura 5 - Métodos de obtenção de peptídeos a partir de proteínas

Fonte: Adaptado de Najafian e Babji (2012)

A extração com solvente dos peptídeos possui várias desvantagens, como a baixa

seletividade, baixo rendimento em extração e a presença de resíduos tóxicos, que contribui

para a poluição ambiental (ALASALVAR; SHAHIDI; MIYASHITA, 2010; NAJAFIAN;

BABJI, 2012). Na fermentação microbiana, muitas vezes é difícil a separação dos micro-

organismos do produto obtido (HAVENAAR et al., 1992). Devido a isso, o método de

hidrólise enzimática é preferido nas indústrias de alimentos e farmacêuticas. Além disso, os

processos enzimáticos oferecem diversas vantagens quando comparado aos tratamentos

químicos, incluindo altas taxas de reação em condições amenas e com grande especificidade

(BRYKSA; YADA, 2015; NAJAFIAN; BABJI, 2012).

37

A Figura 6 apresenta a reação de hidrólise enzimática, a qual é um processo que

consiste na clivagem da ligação peptídica, existente entre os aminoácidos, onde a molécula da

proteína se rompe em duas partes, como consequência da adição de uma mólecula de água.

Desta forma, ocorre a liberação de um mol de um grupo carboxila e um mol do grupo amino,

para cada ligação clivada (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Segundo Lee

(2015) quando uma protease age com um substrato proteico, a reação catalítica consiste em

três reações consecutivas: 1) formação do complexo de Michaelis entre a cadeia peptídica

original (substrato) e a enzima; 2) quebra das ligações peptídicas e 3) ataque nucleofílico no

restante do complexo para quebrar o outro peptídeo e reconstituir a enzima livre.

Figura 6 - Métodos de obtenção de hidrolisados a partir de proteína

Fonte: Adaptada de Damodaran, Parkin e Fennema (2010)

Segundo Adler-Nissen (1986), as variáveis mais importantes em uma reação

enzimática são: concentração e especificidade da enzima, temperatura e pH da reação, e a

natureza do substrato. O controle das condições de hidrólise enzimática e a escolha adequada

da enzima, permitem a obtenção de produtos com características adequadas a uma dada

aplicação (KUROZAWA; PARK; HUBINGER, 2009).

A hidrólise enzimática altera a conformação da proteína, quebrando as ligações

peptídicas e produzindo peptídeos de cadeia curta, ou seja, de menor massa molecular,

aumentado a disponibilidade de sítios polares, concorrendo para uma maior absorção de água.

Uma das principais consequências da hidrólise enzimática, é o aumento da solubilidade que,

normalmente está associado ao aumento do grau de hidrólise. Entretanto, também resulta na

exposição de grupos hidrofóbicos, que estavam protegidos na estrutura original da proteína

(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; FONSECA, 2014).

38

2.4.1 Hidrolisado proteico de pescado

Diversas espécies de pescado estão sendo utilizadas para a obtenção de

hidrolisados proteicos, seja a partir do músculo ou subprodutos dos mesmos, tais como:

bacalhau (Gadus morhua) (GIRGIH et al., 2015), sardinha (Sardina pilchardus) (GARCÍA-

MORENO et al., 2014), corvina (Micropogonias furnieri) (MARTINS et al., 2014;

ZAVAREZE et al., 2014), castanha (Umbrina canosai) (CENTENARO et al., 2014), anchoita

(Engraulis anchoita) (PIOTROWICZ, 2012) entre outras. O hidrolisado proteico de pescado

em inglês é denominado pela sigla FPH (Fish Protein Hydrolysate), conforme designado pela

Food and Agriculture Organization (FAO), o qual pode ser obtido pela digestão das proteínas

do pescado (OETTERER, 2001). A hidrólise enzimática, é caracterizada por uma fase inicial

rápida, seguida por uma redução da taxa de reação. Isto pode ser associado a diversos fatores,

tais como a diminuição na concentração de ligações peptídicas, a competição entre o substrato

original e os peptídeos formados e a inibição da enzima pelos produtos da hidrólise

(CHALAMAIAH et al., 2012; KRISTINSSON; RASCO, 2000; VALENCIA; PINTO;

ALMONACID, 2014).

A hidrólise enzimática resulta na liquefação do tecido do pescado, que objetiva a

recuperação de proteínas de espécies subtilizadas ou de co-produtos do processamento de

pescado que seriam desperdiçados, através do emprego de enzimas proteolíticas para

solubilização da proteína do pescado, resultando em duas frações: solúvel e insolúvel. A

fração solúvel, que contém a proteína hidrolisada, pode se transformar em produtos com

diferentes funcionalidades e a fração insolúvel pode ser usada na ração animal. A produção de

materiais solúveis que constituem o produto final da hidrólise depende de diversos fatores,

tais como o tipo do reagente químico, enzima, substrato, pH da reação, temperatura, grau de

hidrólise, tempo de hidrólise e proporção da enzima (CHALAMAIAH et al., 2012;

KRISTINSSON; RASCO, 2000). Segundo Kristinsson (2005), a natureza e qualidade das

espécies de pescado são alguns dos fatores que afetam o potencial bioativo dos hidrolisados

elaborados à base do mesmo. Os hidrolisados obtidos a partir do músculo de pescado, podem

conter diversos compostos pró-oxidantes como hemoproteínas e lipídios oxidados. A

contaminação com esses compostos pró-oxidantes, pode diminuir a estabilidade dos

hidrolisados proteicos, bem como afetar suas bioatividades (RAGHAVAN; KRISTINSSON,

2009a). Devido a isso, torna-se interessante o uso de alguns processos que diminuam o

conteúdo desses compostos, tais como o isolamento proteico pelo processo de variação de pH

39

ou através de sucessivas lavagens com solução salina diluída e água resfriada, para extração

dos mesmos (LIMPAN et al., 2010; NOLSØE; UNDELAND, 2009).

2.4.2 Enzimas proteolíticas

Segundo Bryksa e Yada (2015) e Furlong (2000) as enzimas são proteínas,

sintetizadas pelas células, onde a interação entre elas e o substrato resulta em uma reação

específica a uma taxa relativamente rápida. As enzimas proteolíticas ou proteases, catalisam

as reações de hidrólise das ligações peptídicas das proteínas, que são degradadas a peptídeos e

aminoácidos. Constituem um largo e complexo grupo de enzimas que diferem em suas

propriedades, como a especificidade ao substrato, sítio ativo, mecanismos catalíticos, pH e

temperatura ótimos. A especificidade das enzimas proteolíticas, é governada pela natureza dos

aminoácidos e pelos outros grupos funcionais da molécula proteica (MOLINA; PRAZERES;

BALLUS, 2013). As proteases são classificadas segundo o tipo de reação catalisada, tipo

catalítico e estrutura molecular (RAWLINGS; BARRETT; BATEMAN, 2010; TEIXEIRA,

2011). Em 1964, a União Internacional de Bioquímica estabeleceu o número da Enzyme

Comission (EC) para organizar a nomenclatura dada às enzimas proteolíticas (NC-IUBMB,

2015). Essas nomenclaturas foram subdivididas, completando um número de quatro dígitos

precedidos da sigla EC, identificando assim todas as enzimas (CAMPBELL, 2000; MOLINA;

PRAZERES; BALLUS, 2013). As reações foram divididas em seis grandes grupos, de acordo

com o tipo de reação que catalisam, como apresenta o Quadro 1.

O primeiro dígito representa a divisão principal à qual a enzima pertence, de

acordo com a reação que catalisa, sendo divididas em oxidorredutases, transferases,

hidrolases, liases, isomerases e ligases; o segundo identifica a enzima em termos mais

específicos (sub-subclasse); o terceiro declara de maneira mais precisa, o tipo de atividade e o

quarto é o número da série da enzima dentro do subgrupo (DAMODARAN; PARKIN;

FENNEMA, 2010; FURLONG, 2000). Atualmente, os tipos catalíticos de proteases

conhecidos são: cisteína, serina, treonina, aspárticas, ácido glutâmico e metalo proteases, os

quais estão relacionados com os grupos químicos presentes no sítio ativo e são responsáveis

pela hidrólise de ligações peptídicas. Assim, as serina proteases possuem um resíduo

aminoácido de serina no sítio ativo, que atua como nucleófilo, nas proteases de cisteína o

nucleófilo é um resíduo aminoácido de cisteína e nas proteases de treonina o nucleófilo é um

resíduo de treonina N-terminal. Nas proteases aspárticas, ácido glutâmico e metalo proteases,

40

o ataque nucleófilo é mediado por uma molécula de água, ativada por dois resíduos de ácido

aspártico, um resíduo de ácido glutâmico e por um íon metálico, respectivamente

(RAWLINGS; BARRETT; BATEMAN, 2010; TEIXEIRA, 2011).

Quadro 1 - Classificação das seis maiores classes de enzimas segundo a União

Internacional de Bioquímica

Fonte: Adaptada de Molina, Prazeres e Ballus (2013) e Furlong (2000)

As proteases pertencem ao grupo 3 (hidrolases) e subgrupo 4 (hidrolisam ligações

peptídicas). Elas são divididas também em dois grandes grupos, em função do seu mecanismo

de ação em: exopeptidades ou endopeptidades. As endopeptidases hidrolisam ligações

peptídicas internas das proteínas, produzindo peptídeos relativamente grandes. Devido a

natureza química do seu sítio ativo e por seu mecanismo catalítico, as endopeptidades podem

se classificar em serina proteases (EC 3.4.21), cisteína proteases (EC 3.4.22), proteases

aspárticas (EC 3.4.23) e metalo proteases (EC 3.4.24) e treonina proteases (EC 3.4.25). As

endopeptidases, cujo mecanismo catalítico ainda é desconhecido, são incluídas na sub-

subclasse (EC 3.4.99). As exopeptidades, hidrolisam as ligações peptídicas do N- ou C-

terminais das proteínas. Também devido à natureza do centro catalítico, podem classificar-se

em: aminopeptidases (EC 3.4.11), dipeptidases (EC 3.4.13), dipeptidil peptidases (E.C

3.4.14), carboxipeptidades (EC 3.4.16-18), peptidil peptidases (EC 3.4.15) e ômega

peptidades (EC 3.4.19) (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; GUPTA; BEG;

Classes Tipo de reação

EC 1. Oxidorredutases Reações de oxidorredução

EC 2. Transferases Reação de transferência de grupos

EC 3. Hidrolases

Reações de hidrólise (transferência de grupos funcionais

para a água)

EC 4. Liases

Adição ou remoção de grupos para formar ligações

duplas

EC 5. Isomerases Transformam isômeros entre si

EC 6. Ligases Catalisam reações de síntese

41

LARENZ, 2002; KRISTINSSON; RASCO, 2000; MOLINA; PRAZERES; BALLUS, 2013;

NC-IUBMB, 2015; SANTOS; KOBLITZ, 2008).

As enzimas também podem ser classificadas segundo a sua origem em: vegetal,

animal ou microbiana. Contudo, as enzimas provenientes de fontes animais e vegetais são

mais instáveis nas condições de processo. Neste contexto, as enzimas de origem microbiana,

estão se tornando cada vez mais empregadas na indústria de alimentos, pois possuem ampla

variedade de ação catalítica, fácil manipulação genética, disponibilidade regular devido a

ausência de flutuações sazonais e ainda à facilidade para a obtenção das enzimas, tendo em

vista a rápida multiplicação microbiana utilizando meios de cultura de baixo custo (MOLINA;

PRAZERES; BALLUS, 2013). A hidrólise enzimática pode proporcionar um método rápido e

reprodutível para a obtenção dos peptídeos bioativos, mas a composição e a natureza dos

hidrolisados gerados dependem da especificidade de enzimas utilizadas. A especificidade das

proteases afeta o tamanho, a quantidade, composição dos aminoácidos livres, tipo de

peptídeos e suas sequências de aminoácidos, que influenciam a atividade biológica dos

hidrolisados (ENNAAS et al., 2015).

2.4.2.1 Alcalase

A Alcalase (3.4.21.62) é uma endopeptidase bacteriana, produzida a partir da

fermentação submersa do Bacillus licheniformis, sendo classificada como uma serina

protease, a qual é uma protease alcalina (BENÍTEZ; IBARZ; PAGAN, 2008; MOLINA;

PRAZERES; BALLUS, 2013). Segundo Santos e Koblitz (2008), as serina proteases são

caracterizadas pela presença do aminoácido serina no sítio ativo, o qual atua como nucleófilo.

Elas são geralmente ativas em uma faixa de pH 6,5 a 8,5, temperatura de 50 a 70 °C e

apresentam baixa especificidade de substrato (YUST et al., 2010).

A baixa especificidade de substrato, pôde ser verificada em diversos estudos, tais

como no trabalho de Liu et al. (2014), os quais desenvolveram hidrolisados proteicos a partir

de surimi de carpa prateada (Hypophthalmichthys molitrix), em que utilizaram a Alcalase na

temperatura de 60 °C e pH de 8,5; Yust et al. (2010) empregaram a Alcalase em pH 8 e

temperatura de 50 °C, para obter hidrolisado proteico de isolado proteico de grão-de-bico

(Cicer arietinum L.); Bamdad, Wue e Chen (2011) utilizaram cevada (Hordeum vulgare L.)

para a obtenção de hidrolisado proteico utilizando a Alcalase a uma temperatura de 50 °C e

pH 8. Segundo alguns autores (KRISTINSSON; RASCO, 2000; MOLINA; PRAZERES;

42

BALLUS, 2013; DOS SANTOS et al., 2011), a Alcalase é uma enzima promissora e

economicamente viável, em relação às demais enzimas empregadas para hidrolisar proteínas

do músculo de pescado, pois necessita de menor tempo de reação para obter o mesmo grau de

hidrólise que as outras enzimas.

2.4.2.2 Protamex

A Protamex (EC 3.4.21.62; EC 3.4.24.28), é uma mistura de exo- e

endopeptidases bacterianas, produzida a partir do Bacillus sp. Ela é caracterizada como uma

mistura de metalo proteases, serina proteases, proteases aspárticas e carboximetilpeptidase, a

qual possui ampla especificidade (BENÍTEZ; IBARZ; PAGAN, 2008).

Segundo alguns estudos (AHN; KIM; JE, 2014; WANG et al., 2014), a Protamex

possui uma ótima atividade em pH de 7 à temperatura de 50 °C, para diferentes tipos de

substrato, tais como as proteínas provenientes de fonte animal e vegetal. Wang et al. (2014),

obtiveram hidrolisado proteico a partir de milho em condições de temperatura e pH de 50 °C e

7,0, respectivamente. Ahn, Kim e Je (2014) em pH 7,0 e temperatura de 50 °C, elaboraram

hidrolisados de subprodutos de salmão (Salmo salar). Alemán et al. (2011) elaboraram

hidrolisados proteicos a partir de gelatina de pota (Dosidicus giga), utilizando a Protamex nas

condições de temperatura de 60 °C e pH 6,5. Piotrowicz (2012) utilizou carne mecanicamente

separada de anchoita (Engraulis anchoita), como substrato para a obtenção de hidrolisado

proteico utilizando a Protamex na temperatura de 50 °C e em pH 6,5. Através desses estudos,

pode-se verificar que a Protamex atua em diversos tipos de substratos, resultando em

hidrolisados com diferentes atividades, tais como: antioxidante, anti-hipertensiva,

anticancerígena entre outras (AHN; KIM; JE, 2014; ALEMÁN et al., 2011; PIOTROWICZ,

2012).

2.4.3 Grau de hidrólise

O Grau de hidrólise (GH), das proteínas hidrolisadas pelas enzimas determina as

propriedades funcionais e biológicas das mesmas, é um critério quantitativo para medir o

progresso da degradação hidrolítica das proteínas (LEE, 2015). O GH pode influenciar essas

propriedades, uma vez que o comprimento da cadeia peptídica, bem como a exposição de

43

grupos aminos terminais dos peptídeos produzidos, dependem do GH e estão relacionados

com as mesmas (THIANSILAKUL; BENJAKUL; SHAHIDI, 2007). Segundo Adler-Nissen

(1986), o GH é definido como a razão entre o número de ligações peptídicas quebradas e o

número total de ligações peptídicas de determinada proteína, como se mostra na Equação 1:

Onde GH é o grau de hidrólise expresso em %, h é o número de ligações peptídicas

hidrolisadas e htot é o número de ligações peptídicas totais da proteína antes da reação.

As proteínas quando intactas possuem um valor de GH de 0% e completamente

hidrolisadas têm valor de GH de 100%. O GH pode ser determinado através de diferentes

métodos, os quais estão baseados na determinação dos grupos α-amino livres (SNYDER;

SOBOCINSKY, 1975), na determinação de nitrogênio solúvel depois de precipitar a proteína

com ácido tricloroacético (HOYLE; MERRIT, 1994) e na quantificação do próton liberado,

após a ruptura de ligações peptídicas em certos pH’s (ADLER-NISSEN, 1977). A quantidade

de grupos α-amino liberados, é determinada espectrofotometricamente através da reação entre

o ácido trinitrobenzenosulfônico (TNBS) e/ou ortoftalaldeído (OPA) com grupamentos

amino, esses reagentes estão sendo utilizados em diversos estudos (CENTENARO, 2011;

CHI et al., 2014; KILIÇ APAR; ÖZBEK, 2011; WIRIYAPHAN; CHITSOMBOON;

YONGSAWADIGUL, 2012). Entretanto, o ácido TNBS, não reage com alguns aminoácidos

tais como a prolina e hidroxiprolina, e apresenta problemas com interferentes como os

açúcares redutores e amônio. Além disso, o OPA não reage com a prolina e reage

parcialmente com a cisteína (GUADIX et al., 2000). Segundo Fonseca (2014), o método

baseado na determinação de nitrogênio solúvel, fornece um parâmetro e não uma medida de

hidrólise, e o método baseado na determinação dos grupos α-amino livres, utilizando TNBS

como reagente, dificulta o acompanhamento da cinética de hidrólise.

A determinação do GH pelo método de pH-stat, tem sido utilizado em muitos

estudos (GIMÉNEZ et al., 2009; MOSQUERA et al., 2014; NASRI et al., 2013; SILA et al.,

2015), pois possibilita o controle do GH de forma contínua em pH e temperatura constante

(ADLER-NISSEN, 1986). Segundo Lee (2015) e Adler-Nissen (1986), esse método é baseado

no princípio de que o pH é mantido constante durante a hidrólise, por meio de titulação com

GH

htot x 100 (1)

44

base, quando a mesma é realizada em condições alcalinas e neutras. Entretanto, o volume da

base adicionada não está relacionado de forma simples com o GH alcançado, sendo

necessário para estabelecer essa relação, o conhecimento do pK médio dos grupamentos α-

amino liberados na hidrólise.

Segundo Alemán (2011) quando uma ligação amida é hidrolisada entre pH neutro

e alcalino (7 < pH > 10), o grupamento carboxila terminal se dissocia por completo e os

prótons formados se propagam de acordo com o equilíbrio da protonação dos grupos α-amino

liberados, contribuindo para uma diminuição do pH. Cada mol de ligações amida hidrolisadas

resulta em um mol de ânions monovalentes (P-COO-) e um mol de cátions monovalentes,

divididos entre P-NH3+

e H+. A base adicionada para manter o pH constante neutraliza apenas

os prótons, os quais são substituídos pelo cátion da base. A quantidade de base adicionada é

equivalente aos prótons gerados durante a hidrólise, os quais são uma fração de ligações

amida hidrolisada. Esse equilíbrio, permite calcular a fração de ligações amida hidrolisadas

que deve ser neutralizada pela base para manter o pH constante e relacionar o volume gasto

de base com o GH (KUROZAWA; PARK; HUBINGER, 2009).

Raghavan e Kristinsson (2009), avaliaram o efeito de diferentes GH (7,5 e 25%)

dos hidrolisados obtidos de isolado proteico de tilápia pelo método de pH-stat e verificaram

que o acréscimo do mesmo resultou em maior potencial anti-hipertensivo. Liu et al. (2014),

em seus estudos com hidrolisados proteicos de subprodutos de surimi de carpa prateada

(Hypophthalmichthys molitrix) em diferentes GH (10, 20 e 30%), verificaram que a massa

molecular dos hidrolisados diminuía com o acréscimo no GH. Khantaphant, Benjakul e

Kishimura (2011) estudaram a influência de diferentes GH (20, 30 e 40%) de hidrolisados de

lúcio marrom (Lutjanus vitta) sobre as atividades antioxidante e anti-hipertensiva, onde

verificaram, dependendo do método de avaliação desses, que o GH influenciava

positivamente ou negativamente nas mesmas. Devido a isso, é interessante o estudo da

influência de diferentes GH sobre as atividades biológicas dos hidrolisados.

2.5 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS PEPTÍDEOS

Os peptídeos são compostos formados por um pequeno número de aminoácidos, o

qual pode variar de dois a várias dúzias (CAMPBELL, 2000; NAJAFIAN; BABJI, 2012).

Segundo Gómez-Guillén et al. (2011), as proteínas possuem peptídeos biologicamente ativos,

que são inativos dentro da sequência proteica, mas podem ser liberados durante a digestão

45

gastrointestinal, processamento dos alimentos e processos como a hidrólise enzimática. Os

hidrolisados proteicos são fonte de peptídeos bioativos os quais possuem diversas atividades

biológicas, dentre elas a antimicrobiana (DI BERNARDINI et al., 2011; GOTTARDI et al.,

2014), antioxidante (ALEMÁN et al., 2011; KHANTAPHANT; BENJAKUL; KISHIMURA,

2011), anti-hipertensiva (KTARI et al., 2014; LASSOUED et al., 2015; O’LOUGHLIN et al.,

2014), inibitória da dipeptidil peptidase IV, como indicativo do potencial antidiabético

(NONGONIERMA; FITZGERALD, 2013; SILA et al., 2015), inibidora de desordens

neuropatológicas como a depressão, demência senil e Alzheimer (SILA et al., 2015;

WILSON; HAYES; CARNEY, 2011), anticancerígena (ALEMÁN et al., 2011; CHI et al.,

2015; UMAYAPARVATHI et al., 2014), imunomoduladora (SINGH; VIJ; HATI, 2014)

entre outras.

2.5.1Atividade anti-hipertensiva

As doenças cardiovasculares, tais como aterosclerose, acidente vascular cerebral

(AVC) e insuficiência cardíaca, são uma grande preocupação à saúde, pois são as principais

causas de morte na maioria dos países industrializados. Um dos principais fatores de risco das

mesmas, é a hipertensão arterial sistêmica (HAS), definida pela Organização Mundial de

Saúde (OMS), como a ultrapassagem de 90 mmHg para a pressão arterial diastólica e 140

mmHg para a pressão sistólica (BOSCHIN et al., 2014). A hipertensão é um problema

mundial de proporções epidêmicas, afetando cerca de 30% da população adulta na maioria

dos países (BALTI et al., 2013). Segundo a Sociedade Brasileira de Hipertensão (SBH), no

Brasil existem, atualmente, 17 milhões de hipertensos e até o ano de 2025, estima-se que o

número de hipertensos poderá crescer em 80% (SBH, 2015).

A pressão arterial (PA) do corpo humano, é regulada por diversos mecanismos

correlacionados, principalmente por dois sistemas denominados: renina-angiotensina e

calicreína-cinina. Entretanto, o sistema renina-angiotensina é o mais estudado, pois a PA alta

é normalmente tratada com fármacos, tais como captopril e enalapril, que inibem a enzima

conversora de angiotensina (ECA; dipeptidil carboxipeptidase; EC 3.4.15.1), que atua no

sistema renina-angiotensina (AHN et al., 2012; BALTI et al., 2013; LASSOUED et al., 2015).

A renina é uma enzima sintetizada e armazenada sob a forma inativa nas células

justaglomerulares dos rins. Quando a PA diminui, ocorre a liberação da renina para a corrente

sanguínea, resultando na ruptura de seu substrato natural, o angiotensinogênio, e a liberação

46

da angiotensina I (GILMAN et al., 1991). A ECA aumenta a PA, pois catalisa a reação de

hidrólise da angiotesina I (decapeptídeo), produzido pela ação da renina, na qual dois de seus

aminoácidos são removidos para formar a angiostensina II, um octapeptídeo com potente

atividade vasoconstritora. Além disso, a ECA atua simultaneamente no sistema calicreína-

cinina, catalisando a degradação da bradicinina, um nonapeptídeo com potente ação

vasodilatadora (WITHEROW et al., 2001).

Os principais efeitos da angiotensina II consistem na contração das arteríolas,

resultando em um acréscimo da pressão arterial e no estímulo da secreção de aldoesterona

pelas glândulas suprarrenais, um hormônio que induz a retenção de sódio, água e a excreção

de potássio. O acúmulo de água, contribui para um aumento do volume extracelular e,

consequentemente, no aumento da pressão arterial bem como a neutralização da produção da

renina (CARVALHO et al., 2005; TIRELLI; DE NONI; RESMINI, 1997). Desta forma, a

inibição da ECA é necessária para evitar a formação de agentes vasoconstritores como a

angioestensina II, os quais causam a hipertensão, e para potencializar a ação vasodilatadora da

bradicinina (BALTI et al., 2013). Os inibidores da ECA, podem diminuir a atividade da ECA

reduzindo o nível de angiostensina II, exercendo assim um efeito hipotensor nos vasos

sanguíneos (LUNA-VITAL et al., 2014; ROFFMAN, 2004).

Os inibidores sintéticos da ECA, são amplamente utilizados em terapia para a

hipertensão, insuficiência cardíaca e enfarte do miocárdio (BALTI et al., 2013). Embora

eficazes, esses inibidores sintéticos podem causar efeitos colaterais, tais como: tosse,

dificuldade para respirar, distúrbio do paladar, erupção cutânea e a longo prazo, podem

reduzir a eficácia de inibição da ECA (CHEN et al., 2012; VYSSOULIS et al., 2001). Devido

a isso, muitas pesquisas (ALEMÁN; GÓMEZ-GUILLÉN; MONTERO, 2013; ALEMÁN et

al., 2011; KAPEL et al., 2006; LASSOUED et al., 2015; MOSQUERA et al., 2014;

RAGHAVAN; KRISTINSSON, 2009) estão sendo realizadas para avaliar o efeito dos

peptídeos bioativos proveniente de diversas fontes, tais como o pescado, sobre a inibição da

ECA como uma alternativa aos compostos sintéticos utilizados.

Os peptídeos com propriedades inibitórias da ECA possuem algumas

características em comum, a maioria deles são sequências de baixa massa molecular, pois

massas moleculares elevadas dificultam o acesso do peptídeo ao sítio ativo da enzima

(ONDETTI; CUSHMAN, 1982). Segundo Pihlanto (2000), no caso de peptídeos inibidores da

ECA, os mais potentes e específicos peptídeos inibidores, possuem uma estrutura semelhante

e a atividade da ECA é fortemente influenciada pela sequência tripeptídica C-terminal, na

qual os tripeptídeos com triptofano (Tri), tirosina (Tir), fenilalanina (Fen), prolina (Pro) e

47

aminoácidos hidrofóbicos, cadeias laterais aromáticas ou ramificadas, na posição C-terminal

são mais eficazes como inibidores da ECA devido a maior interação entre eles e o sítio ativo

da enzima. A presença de peptídeos com aminoácidos aromáticos no extremo C-terminal, um

resíduo carregado positivamente na posição intermediária e um aminoácido hidrofóbico no

extremo N-terminal, podem ser potenciais inibidores da ECA (WU; ALUKO; NAKAI, 2006).

A formação de peptídeos com atividade biológica, não depende apenas da fonte

proteica, mas da enzima utilizada e condições de hidrólise. Ahn et al. (2012) hidrolisaram

proteínas de subprodutos de salmão (Salmo salar), com GH de aproximadamente 10%

utilizando diferentes enzimas (Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, Pepsina e

Tripsina) e verificaram que as melhores atividades inibitórias da ECA, foram encontradas

utilizando as enzimas Alcalase (56,2%) e Protamex (50,2%), em uma concentração de

hidrolisado de 1 mg/mL. Raghavan e Kristinsson (2009), hidrolisaram o isolado proteico do

músculo de tilápia (Oreochromis niloticus), no qual não verificaram a influência da enzima

utilizada na inibição da ECA. Entretanto, em maior GH (25%) foi verificado que a capacidade

de inibição da ECA foi elevada (73%), quando comparada ao GH de 7,5% (66%). Devido a

isso, torna-se interessante o estudo com diferentes matérias primas, enzimas e GH para

verificar o efeito na inibição da ECA.

2.5.2 Atividade antidiabética

O envelhecimento da população, a crescente urbanização e a adoção de estilos de

vida pouco saudáveis como sedentarismo, dieta inadequada e obesidade são os grandes

responsáveis pelo aumento da incidência e prevalência do diabetes em todo o mundo. O

diabetes é um grupo de doenças metabólicas, caracterizadas por hiperglicemia, associado a

complicações, disfunções e insuficiência de vários órgãos, especialmente olhos, rins entre

outros (BRASÍLIA, 2006). O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), representa 90-95% dos casos

diagnosticados de diabetes no mundo, é caracterizado por múltiplos defeitos patofisiológicos,

incluindo disfunção progressiva das células pancreáticas, resistência à insulina e aumento da

produção de glicose hepática (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2014). O indivíduo com

DM2, apresenta resistência à ação da insulina e o defeito na secreção de insulina manifesta-se

pela incapacidade de compensar essa resistência (BRASÍLIA, 2006).

A ingestão de uma refeição, rica em gorduras e carboidratos, provoca a secreção

das incretinas tais como os hormônios: peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) e o

48

polipepeptídeo insulinotrópico dependente da glicose (GIP). Estes hormônios estão

associados à secreção de enzimas gástricas e pancreáticas, absorção de nutrientes e na

estimulação da secreção da insulina pelo pâncreas, que permite a eliminação da glicose

absorvida (DRUCKER; NAUCK, 2006; HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2014). O tempo de

vida desses hormônios na corrente sanguínea é baixo, pois eles são degradados pela enzima

proteolítica dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV) (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2014;

NONGONIERMA et al., 2015).

A dipeptidil peptidase IV (EC 3.4.14.5) é uma enzima presente na superfície da

grande maioria das células, que exerce a sua atividade enzimática no plasma, onde cliva

peptídeos como a Pro ou a alanina (Ala) na posição N-terminal da cadeia peptídica (DUEZ;

CARIOU; STAELS, 2012). O GLP-1 e o GIP são substratos endógenos para a DPP-IV, pois

esses hormônios possuem a Ala na posição 2 do extremo N-terminal (NONGONIERMA et

al., 2015). Devido a isso, estão sendo estudados substratos peptídicos, que por competição

antagonista, inibam a ação da DPP-IV criando um efeito antidiabético no organismo. A

grande maioria dos inibidores sintéticos, como o Sitagliptin® e o Linagliptin

®, foram

desenvolvidos com base nos conhecimentos da especificidade da enzima pelo substrato

(MCINTOSH et al., 2005; NONGONIERMA et al., 2015). Muito dos inibidores sintéticos,

são derivados de dipeptídeos e possuem baixa massa molecular (DEACON; HOLST, 2006).

Muitos estudos de hidrolisados com capacidade de inibição da DPP-IV,

provenientes de diferentes substratos estão disponíveis como: gelatina da pele de pescado

(Barbus callensis) (SILA et al., 2015) a qual apresentou a uma inibição de 50% da DPP-IV,

utilizando hidrolisado no GH de 10,38% na concentração de 2,75 mg/mL; isolado proteico de

quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) (NONGONIERMA et al., 2015) na concentração de

0,98 mg/mL apresentou uma inibição de 50%; soro de leite (NONGONIERMA;

FITZGERALD, 2013) o qual apresentou a uma inibição de 50% da DPP-IV, utilizando

hidrolisado na concentração de 1,33 mg/mL entre outros. Apesar de um grande número de

trabalhos relacionados a inibição da DPP-IV, poucos estudos com hidrolisados derivados de

pescado são encontrados. Devido a isso, estudos com este tipo de matéria-prima são

interessantes para avaliar a capacidade delas na inibição dessa enzima.

49

2.5.3 Atividade inibidora de desordens neuropatológicas

A enzima prolil endopeptidase (PEP, EC 3.4.21.26), também conhecida como

proliloligopeptidase, é uma serina protease que cliva ligações peptídicas no lado carboxila de

resíduos da Pro, em proteína com massa molecular relativamente pequena (~ 30

aminoácidos), que contém a sequência X-Pro-Y, onde o X é um peptídeo ácido ou amino e Y

pode ser uma amida, um peptídeo, um aminoácido, uma amina aromática ou álcool (SILA et

al., 2015; WILSON; HAYES; CARNEY, 2011). Essa enzima é amplamente distribuída nos

tecidos dos mamíferos, em mais de 20 tipos de tecidos, e apresenta atividade intensa nos

músculos e no cérebro (KALWANT; PORTER, 1991).

Alguns estudos (SILA et al., 2015; WILSON; HAYES; CARNEY, 2011)

sugeriram que a PEP pode ser relacionada com desordens neuropatológicas como a depressão,

esquizofrenia, Alzheimer, distúrbios da memória e do conhecimento. A PEP está envolvida no

metabolismo e na clivagem de pequenos neuropeptídeos como a ocitocina, neurotensina,

angiostensina e bradicinina. Em níveis anormais, faz com que os neuropeptídeos sejam

alterados, afetando o comportamento social, as emoções, a memória e o estresse do indivíduo

(MOMENI et al., 2005). Devido a isso, é importante estudar inibidores da PEP, para melhorar

a memória através do bloqueio do metabolismo dos neuropeptídeos endógenos (TEZUKA et

al.,1999).

Segundo Wilson, Hayes e Carney (2011), são conhecidos dois tipos de inibidores

da PEP, os peptídicos e os não-peptídicos. Os inibidores peptídicos possuem massa molecular

baixa. A presença de Pro no substrato é importante para a obtenção de peptídeos inibidores da

PEP (SILA et al., 2015). Os inibidores peptídicos foram obtidos de hidrolisados de diferentes

tipos de substratos como gelatina da pele de pescado (B. callensis) (SILA et al., 2015), o qual

inibiu 50% da PEP em uma concentração de hidrolisado de 1,78 mg/mL; queijo, músculo de

bacalhau (Gadus morhua), salmão e truta (Oncorhynchus mykiss) (SORENSEN et al., 2004),

os quais verificaram que GH não apresentou relação com o aumento ou diminuição da

capacidade de inibição da PEP.

2.5.4 Atividade antimicrobiana

Os peptídeos antimicrobianos (PAM), estão despertando o interesse como uma

alternativa antimicrobiana aos conservantes químicos de alimentos largamente utilizados

50

(JIANG et al., 2014). Além disso, devido à resistência de algumas cepas bacterianas aos

antibióticos convencionais, estão sendo realizadas pesquisas que visam o desenvolvimento de

antibióticos terapêuticos baseados em PAM (SILA et al., 2014a). Os PAM são produzidos

naturalmente por bactérias, insetos, plantas, invertebrados e vertebrados, como um

componente importante das defesas naturais de organismos vivos. Eles representam uma nova

classe de antibióticos e compostos que prolongam a vida útil dos alimentos (ENNAAS et al.,

2015; GOMES et al., 2015; LI et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012). Entretanto,

atualmente estão sendo obtidos peptídeos antimicrobianos através de hidrolisados proteicos

(JIANG et al., 2014; NAJAFIAN; BABJI, 2012; SILA et al., 2014a).

Os PAM possuem massa molecular abaixo de 10 kDa, têm carga líquida positiva e

cerca de 50% destes são hidrofóbicos. Eles apresentam uma molécula anfipática, a qual possui

regiões hidrofóbicas e hidrofílicas. Uma característica comumente encontrada nos PAM, que

apesar de possuírem diferentes sequências e estruturas, todos eles formam estruturas

anfipáticas, quando ligados às membranas microbianas (LI et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI,

2012; NARAYANA; CHEN, 2015). A maioria dos peptídeos antimicrobianos são catiônicos

e possuem uma carga líquida positiva em pH fisiológico, devido ao elevado teor de arginina e

lisina (que possuem resíduos positivamente carregados) (NAJAFIAN; BABJI, 2012). Além

da capacidade de interagir com a membrana dos micro-organismos, muitos PAM podem ter

alvos intracelulares como o ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) e

proteínas, aos quais podem se ligar, inibindo a síntese desses compostos dificultando a

viabilidade celular dos micro-organismos (LI et al., 2012; WU et al., 2014). A Figura 7

apresenta um, dos diversos mecanismos de inibição dos PAM.

No canal transmembrana, Figura 7A, os peptídeos se ligam à membrana

plasmática tomando a conformação alfa-hélice, seguido da ligação de mais peptídeos à

membrana com a consequente inserção das hélices na bicamada lipídica. Então poros são

formados, fazendo com que ocorra o vazamento do material citoplasmático, seguido da morte

celular. No poro toroidal, Figura 7B, os peptídeos se intercalam aos fosfolipídios para formar

o poro. No modelo tapete, Figura 7C, primeiramente, ocorre a ligação dos peptídeos aos

fosfolipídios da membrana, com um alinhamento do modo que os resíduos hidrofóbicos

fiquem em contato com a cabeça dos fosfolipídios. Dessa forma, ocorre uma reorientação dos

peptídeos para o centro hidrofóbico da membrana, ocorrendo a desintegração da mesma

devido a quebra da curvatura (BROGDEN, 2005).

51

Figura 7 - Mecanismos de interação dos peptídeos antimicrobianos com as membranas

microbianas. (A) Canal transmembrana; (B) Poro toroidal e (C) Modelo tapete

Azul escuro das hélices: representa a face hidrofóbica dos peptídeos; Vermelho das hélices: face hidrofílica dos

peptídeos. Fonte: Brogden (2005).

De acordo com Segura-Campos et al. (2013) o principal mecanismo destrutivo,

para causar em efeito bacteriostático ou bactericida nos micro-organismos, é a alteração na

permeabilidade das membranas biológicas. As interações eletrostáticas entre os peptídeos de

carga positiva e os lipídios aniônicos da superfície dos micro-organismos, bem como a

hidrofobicidade e a flexibilidade são essenciais para a inibição microbiana, pois formam poros

e lesões que degradam a membrana citoplasmática. As atividades antimicrobianas dos

peptídeos, são largamente influenciadas pela estrutura molecular (composição ou sequência

de aminoácidos), comprimento da cadeia e pelo GH obtido. O GH é um parâmetro

importante, para a obtenção de um hidrolisado com atividade biológica reprodutível (SILA et

al., 2014a). Contudo, Jiang et al. (2014) em seus estudos, com hidrolisados proteicos de carpa

prateada, verificaram que dependendo da enzima utilizada como catalisador, o acréscimo no

tempo e no GH não resultaram em maior inibição dos micro-organismos testados. As

proteases utilizadas para a hidrólise, determinam o tamanho e a sequência dos peptídeos

resultantes e por isso afetam a sua atividade. Segundo Gómez-Guillén et al. (2010), as frações

de baixa massa molecular apresentam menos aminoácidos adicionados, favorecendo a

exposição dos aminoácidos e suas cargas, contribuindo para a interação com as membranas

bacterianas causando danos em sua membrana e dificultando a suas sínteses.

Devido ao conhecimento do potencial dos PAM, estão sendo testados hidrolisados

de diversas fontes proteicas, tais como: do músculo de barbos (B. callensis) (SILA et al.,

2014a), onde o mesmo foi testado para inibição frente à Listeria monocytogenes; do músculo

52

de carpa prateada (Hypophthalmichthys molitrix) (JIANG et al., 2014), o qual foi testado

frente aos micro-organismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli, onde verificaram que

os mesmos não inibiram as bactérias testadas; de subprodutos de anchoita (Engraulis

japonicus) (TANG et al., 2015) o qual foi testado frente ao S. aureus. A grande maioria dos

peptídeos antimicrobianos provenientes do pescado possuem funções bactericidas ou

bacteriostáticas frente a vários micro-organismos Gram-negativos e positivos (NAJAFIAN;

BABJI, 2012).

2.5.5 Atividade antioxidante

A oxidação lipídica é um dos principais processos de deterioração em muitos

alimentos, levando a mudanças na qualidade através da produção de odores, aroma e sabor, e

aparência indesejáveis, diminuindo a qualidade nutricional e segurança dos mesmos pela

formação de compostos tóxicos (ARAÚJO, 2011; FARVIN et al., 2014). Além disso, a

oxidação de lipídios pode causar doenças graves, tais como: cardíacas, aterosclerose, câncer,

Alzheimer, Parkinson entre outras (CHALAMAIAH et al., 2012; KHANTAPHANT;

BENJAKUL; GHOMI, 2011; NAJAFIAN; BABJI, 2012). Devido a isso, para a prevenção da

deterioração oxidativa em alimentos e de doenças graves, é importante a inibição da oxidação

lipídica e da formação de radicais livres que ocorrem em alimentos e no corpo

(KHANTAPHANT; BENJAKUL; GHOMI, 2011).

A oxidação é um processo fundamental em organismos aeróbios, particularmente

em vertebrados e humanos, embora leve a formação de radicais livres. A formação de

espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo os radicais livres, tais como o ânion

superóxido (O2-), radicais hidroxila (OH

•), e espécies de não radicalares: como o peróxido de

hidrôgenio (H2O2) e o oxigênio singlete (1O2

-), é uma consequência inevitável devido ao uso

do oxigênio durante a respiração (DI BERNARDINI et al., 2011; NAJAFIAN; BABJI, 2015).

As ERO possuem um ou mais elétrons desemparelhados o que as deixa altamente reativas,

atraindo elétrons de outras substâncias causando o estresse oxidativo em células ou tecidos

(CHALAMAIAH et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012).

Em condições normais, as ERO são neutralizadas pelas defesas antioxidantes do

organismo. Contudo, quando o número dessas moléculas ultrapassa as defesas do organismo,

ocorre o estresse oxidativo causando dano em moléculas biológicas como lipídios, proteínas e

ácidos nucleicos. O estresse oxidativo ocorre em vários estados patológicos, no qual a função

53

celular é interrompida, contribuindo para o envelhecimento e o desenvolvimento de doenças

anteriormente citadas (CHALAMAIAH et al., 2012; DI BERNARDINI et al., 2011;

NAJAFIAN; BABJI, 2012). Para prevenir, retardar ou inibir a oxidação lipídica em indústrias

de alimentos e farmacêuticas, muitos antioxidantes sintéticos estão sendo utilizados, tais

como o butil hidroxianisol (BHA), butil hidroxitolueno (BHT), butil hidroxiquinona (TBHQ)

e galato propila (GP) (ARAÚJO, 2011). Entretanto, o uso de antioxidantes sintéticos como

aditivos em produtos alimentares está sob regulamentação rigorosa, pois oferecem riscos

potenciais à saúde humana e em determinadas concentrações são tóxicos, apresentando efeito

carcinogênico (FARVIN et al., 2014). No Brasil, segundo a Portaria n° 1.044, de 11 de

dezembro de 1998 da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde (SVS/MS), o

limite máximo desses compostos foi estabelecido em carnes e produtos cárneos de 0,01g/100

g para BHA, BHT e GP em produtos cárneos industrializados (BRASIL, 1998). Os

antioxidantes podem interferir no processo oxidativo, doando um átomo de hidrogênio ou um

elétron a radicais formados a partir de lipídios insaturados e podem minimizar estas reações

através da remoção de radicais iniciadores ou intermediários do meio. Essa remoção pode

ocorrer por eliminação do 1O2

- ou através inativação de metais catalisadores, desta forma os

antioxidantes aumentam a estabilidade dos lipídios, entre eles os alimentares (NAJAFIAN;

BABJI, 2012).

Com base em suas funções, os antioxidantes podem ser classificados em

primários, sinergísticos, removedores de oxigênio, biológicos, agentes quelantes e

antioxidantes mistos (SÁNCHEZ-MORENO, 2002). Os antioxidantes primários incluem os

compostos fenólicos, BHA, BHT, TBHQ, tocoferóis entre outros. Eles atuam bloqueando a

ação dos radicais livres formados durante a iniciação e propagação da reação, convertendo-os

em produtos estáveis por meio da doação de hidrogênio ou elétrons (ARAÚJO, 2011;

RAMALHO; JORGE, 2006). A Figura 8, representa o mecanismo de ação dos antioxidantes

primários.

Figura 8 - Mecanismo de ação dos antioxidantes primários

Fonte: Adaptado de Araújo (2012)

Onde AH: antioxidante; ROO· e R

·: radicais livres e A· é um radical inerte.

54

O AH atua removendo os radicais livres (R· e ROO

·), logo que os mesmos são

formados, quando a concentração de ROO· é baixa, ou seja, na fase inicial da oxidação. Em

seguida, formam-se espécies inativas para a reação em cadeia e um radical inerte (A•)

procedente do antioxidante, o qual é estável e não tem a capacidade de iniciar ou propagar as

reações oxidativas (ARAÚJO, 2011; NAJAFIAN; BABJI, 2012).

Os antioxidantes sinergísticos, são classificados de forma genérica como

removedores de oxigênio e complexantes. Eles atuam por diversos mecanismos, podendo

atuar na regeneração do radical fenoxil, doando um hidrogênio e, consequentemente,

regenerando o antioxidante primário. Dessa forma, possibilita que o antioxidante primário

seja utilizado em baixas concentrações se o sinergista é adicionado simultaneamente. O ácido

ascórbico e o palmitato de ascorbila atuam como sinergistas para antioxidantes primários

(ARAÚJO, 2011). Os removedores de oxigênio, como o ácido ascórbico, palmitato de

ascorbila, sulfito e eritorbatos, reagem com o oxigênio livre, removendo-o e,

consequentemente, tornando-os indisponíveis para atuarem como propagadores da auto-

oxidação. Os agentes complexantes imobilizam íons metálicos, principlamente o cobre e o

ferro, que catalisam a oxidação lipídica, aumentando significativamente a energia de ativação

das reações iniciais de auto-oxidação (ARAÚJO, 2011; BAILEY, 1996; RAMALHO;

JORGE, 2006).

Devido aos riscos potenciais dos antioxidantes sintéticos para a saúde, a busca de

antioxidantes naturais é crescente (CHALAMAIAH et al., 2012). Neste contexto, muitos

estudos comprovaram a atividade antioxidante de hidrolisados proteicos e peptídeos bioativos

obtidos de diversas fontes naturais, entre elas o pescado: bacalhau (FARVIN et al., 2014),

sardinha (GARCÍA-MORENO et al., 2014), atum (SAIDI et al., 2014), bijupirá (FONSECA,

2014), corvina (ZAVAREZE et al., 2014), castanha (CENTENARO, 2011), salmão (AHN;

KIM; JE, 2014) entre outros.

A atividade antioxidante dos peptídeos, depende das suas propriedades físico-

químicas, as quais são determinadas por sua massa molecular, sequência, estrutura, carga e

reatividade dos aminoácidos (DI BERNARDINI et al., 2011; NAJAFIAN; BABJI, 2012).

Além das propriedades do substrato de hidrólise, a escolha das condições de hidrólise

(enzima, proporção: enzima/substrato, temperatura e pH) e a extensão do GH influenciam na

capacidade antioxidante dos hidrolisados. Os hidrolisados com a maior GH, são preferidos a

fim de assegurar a presença de peptídeos pequenos, os quais tem sido relatados como potentes

antioxidantes (CHALAMAIAH et al., 2012; DI BERNARDINI et al., 2011; GARCÍA-

55

MORENO et al., 2014). Muitos peptídeos antioxidantes isolados de proteínas de pescado

possuem cerca de 2-16 resíduos de aminoácidos. A sequência hidrofóbica de aminoácidos

como histidina, prolina, metionina, cisteína, tirosina, triptofano e fenilalanina pode aumentar a

atividade antioxidante dos peptídeos (CHALAMAIAH et al., 2012). A presença de

aminoácidos hidrofóbicos na sequência peptídica faz com que os hidrolisados tenham a

capacidade de inibir a peroxidação lipídica, pois os mesmos tem maior solubilidade em

lipídios e são mais reativos com os ácidos graxos poli-insaturados. A valina e leucina na

posição N-terminal, bem como prolina, tirosina e histidina na sequência contribuem com a

capacidade antioxidante dos peptídeos (RAJAPAKSE et al., 2005).

Alemán et al. (2011a) verificaram em seus estudos com hidrolisado da gelatina de

pota (Dosidicus gigas), que a atividade antioxidante aumentou com o acréscimo no GH.

Entretanto, esse comportamento não foi observado para os diferentes métodos de avaliação de

atividade antioxidante testados. Khantaphant, Benjakul e Kishimura (2011) verificaram que

hidrolisados de lúcio marrom (Lutjanus vitta), apresentaram um acréscimo na atividade

antioxidante com o aumento do GH, dependendo do tipo de enzima utilizada e método para

avaliação da atividade antioxidante. Devido a isso, é interessante o estudo da atividade

antioxidante por diferentes métodos, tais como: da capacidade de redução do ferro (FRAP), da

captura do radical ABTS•+

, da capacidade de quelação de metais e do sequestro do radical

livre (DPPH).

2.6 FILMES POLIMÉRICOS

A partir da década de 80, com o advento da conscientização ambiental, os

aspectos negativos dos materiais poliméricos sintéticos começaram a ser percebidos. Assim,

características desejáveis durante o uso como a alta resistência e a não deterioração, foram

identificadas como inconvenientes no descarte na natureza, pois estes materiais podem levar

anos para serem totalmente destruídos causando problemas ambientais, devido ao acúmulo e

descarte indevido (FALGUERA et al., 2011; TONGNUANCHAN; BENJAKUL;

PRODPRAN, 2011). Como resultado, diversas pesquisas relacionadas ao uso de polímeros

naturais têm emergido como alternativa, devido à sua biodegradabilidade. Esses polímeros

têm sido estudados em relação às suas propriedades de formação de filmes destinados a

embalagem de alimentos (ROCHA et al., 2014; SALGADO et al., 2012, 2013). Segundo

56

Falguera et al. (2011), os filmes são utilizados para envolver os produtos, mas primeiramente

são formados separadamente como lâminas finas e após são utilizados como revestimento.

Em vista do impacto positivo sobre o ambiente, macromoléculas naturais tais

como os polissacarídeos (GIMÉNEZ et al., 2013a; MILKOVA; RADEVA, 2015; RHIM;

LEE; HONG, 2011a; SOUSA; GONÇALVES, 2015), proteínas (EL HALAL et al., 2015a;

LIMPAN et al., 2010; NÚÑEZ-FLORES et al., 2013; ROCHA et al., 2013, 2014) e lipídios

(VIDAWATIA et al., 2011) vêm sendo extensivamente estudados para o desenvolvimento de

filmes biodegradáveis. Além de macromoléculas (agente formador do filme), a elaboração dos

filmes envolve a utilização de solventes (água, etanol ou ácidos orgânicos), de plastificantes

(glicerol, sorbitol entre outros) e um agente ajustador de pH (hidróxido de sódio, ácido

clorídrico, ácido acético entre outros) no caso de filmes à base de proteínas, obtendo-se uma

dispersão filmogênica (FALGUERA et al., 2011).

Os filmes são formados por forças coesivas entre as moléculas de polímeros, ou

reticulação intramolecular das cadeias do polímero para formar uma matriz parcialmente

rígida, que permite imobilizar parte do solvente. Uma das técnicas utilizadas para esta

formação é denominada “casting”, um procedimento bastante difundido na formação de

filmes. Este processo consiste na solubilização da macromoléculas em solventes, seguida da

aplicação dessa solução filmogênica sobre um suporte e posterior evaporação do solvente

(KROCHTA; BALDWIN; NISPEROS-CARRIEDO, 1994). A Figura 9, apresenta um filme

elaborado pela técnica de casting.

Figura 9 -Filme elaborado pela técnica de casting

Fonte: Rocha e Prentice (2014)

O uso de filmes à base de polímeros naturais depende de vários fatores como o

custo, disponibilidade, atributos funcionais, propriedades mecânicas (resistência e

57

flexibilidade), qualidades ópticas (brilho e opacidade), propriedades de barreira

(permeabilidade ao vapor de água, O2 e CO2), resistência à água (solubilidade) e aceitação

sensorial. Estas características resultam de diversos parâmetros, tais como: características

físico-químicas, concentração da macromolécula e dos demais constituintes (solvente,

plastificante, agente antimicrobiano, antioxidante, entre outros), pH, condições de secagem e

condições ambientais (temperatura e umidade) (FALGUERA et al., 2011;VIEIRA et al.,

2011).

2.6.1 Filmes à base de polissacarídeos

Entre os diferentes polímeros usados na preparação de filmes, os polissacarídeos

se destacam, devido a sua relativa abundância e baixa toxicidade (FALGUERA et al., 2011;

MILKOVA; RADEVA, 2015). Eles são largamente utilizados na elaboração de filmes, como

apresenta a Tabela 1.

Tabela 1 - Diferentes polissacarídeos usados para a elaboração de filmes

Componente Referência

Ágar Sousa e Gonçalves (2015)

Ágar e amido de mandioca The et al. (2009)

Ágar e celulose Atef, Rezaei e Behrooz (2014)

Amido de banana García-Tejeda et al. (2013)

Amido e celulose de cevada El Halal et al. (2015b)

Carboximetilcelulose Siqueira, Salon e Mauret (2015)

Celulose Tibolla, Pelissari e Menegalli (2014)

Farinha de arroz e fibra de celulose Dias et al. (2011)

Goma xantana e glucomanana Jin et al. (2015)

Hidroxipropilmetilcelulose Bilbao-Sainz et al. (2010)

Pectina Zhuang et al. (2015)

Quitosana Arancibia et al. (2015b)

58

Em geral, os polissacarídeos formam filmes com boas propriedades mecânicas e

de barreira ao O2 e CO2, mas assim como as proteínas não oferecem barreira a umidade

devido a sua característica hidrofílica (MILKOVA; RADEVA, 2015). Os polissacarídeos se

apresentam na forma linear ou ramificada, sendo compostos pela repetição do mesmo ou mais

monossacarídeos. Estes podem apresentar carga neutra (ágar e metilcelulose), carga negativa

(alginato de sódio e pectina) ou carga positiva (quitosana), dependendo do grupo químico

ligado aos monossacarídeos. As características estruturais de um polissacarídeo, podem

modificar ou diferenciar as suas propriedades de formação do filme, uma vez que influencia

no número de ligações intermoleculares entre as cadeias de polímero. Além disso, a massa

molecular do polissacarídeo também desempenha um papel importante nas propriedades dos

filmes (LÓPEZ DE LACEY, 2013; RHIM; WANG; HONG, 2013). Os polímeros lineares, de

elevada massa molecular e não-iônicos formam filmes resistentes, o que foi verificado em

estudos com filmes à base de ágar e metilcelulose. Os polissacarídeos ramificados, com ou

sem carga aniônica formam filmes fracos (GIMÉNEZ et al., 2013a; LÓPEZ DE LACEY;

LÓPEZ-CABALLERO; MONTERO, 2014; RHIM; WANG; HONG, 2013).

2.6.1.1 Ágar

Os polissacarídeos provenientes de algas marinhas (PALM), tais como ágar,

carragena e alginato possuem excelentes propriedades para formação de filmes (RINAUDO,

2008). O ágar, também denominado ágar-ágar, é obtido a partir de duas algas vermelhas:

Gelidium sp. e Gracilaria sp. e é constituído por uma mistura heterogênea de duas classes de

polissacarídeos agarose: (fração gelificante) e agaropectina (fração não gelificante), a qual é

ligeiramente ramificada e sulfatada (RHIM; LEE; HONG, 2011b). O ágar de uso alimentar, é

composto em sua grande maioria pela agarose, pois a agaropectina é removida durante o

processamento. A agarose é um polímero linear, com massa molecular de 120 kDa e é

constituída por unidade repetitivas cuja a estrutura é β-1,3 D-galactose e α-1,4 3,6-anidro-L-

galactose (LÓPEZ DE LACEY; LÓPEZ-CABALLERO; MONTERO, 2014; RHIM; WANG;

HONG, 2013; SOUSA; GONÇALVES, 2015). O ágar é comumente utilizado como

espessante, clareador e na elaboração de meios de cultura. Entretanto, atualmente o mesmo

está sendo utilizado para a elaboração de filmes (GIMÉNEZ et al., 2013a; WANG et al.,

2015b).

59

Segundo Sousa e Gonçalves (2015) os filmes à base de PALM, possuem boa

resistência mecânica, propriedades moderadas de barreira ao O2 e CO2, comestíveis e

facilmente biodegradáveis, mas são hidrófilos e quebradiços. Além disso, são claros,

transparentes, fortes e sua permeabilidade ao vapor de água não possui diferença em

comparação com filmes de amido e celulose (THE et al., 2009). Devido ao seu custo de

produção, variação na qualidade ocasionada por fatores fisiológicos e ambientais que afetam

algumas algas, torna-as menos atraentes para as indústrias interessadas no desenvolvimento

de embalagens (RINAUDO, 2008).

O ágar possui a propriedade de formar uma matriz biologicamente inerte, a qual

facilita a difusão de diversos compostos ativos. Além disso, filmes baseados em ágar podem

ser facilmente selados pelo calor (THE et al., 2009). Devido a isso, muitos estudos foram

realizados utilizando o ágar como matriz para a elaboração de filmes com compostos ativos.

Giménez et al. (2013) elaboraram filmes à base de ágar, no qual adicionaram um extrato de

chá verde e avaliaram a suas atividades antimicrobianas e antioxidantes. Rhim, Wang e Hong

(2013), elaboraram filmes à base de ágar incorporados com nanopartículas de prata como

agente antimicrobiano.

2.6.2 Filmes bioativos

Segundo Gómez-Estaca et al. (2014) as embalagens ativas, são definidas como

um sistema que, deliberadamente, incorpora componentes que libertam ou absorvem

substâncias dos alimentos embalados ou do ambiente que envolve os mesmos, para manter ou

prolongar a vida útil dos alimentos embalados. Quando um agente antimicrobiano é

incorporado em uma embalagem ou filme, ele é liberado por difusão e permeação lenta do

mesmo para a superfície dos alimentos. Desta forma, controla a multiplicação de micro-

organismos e a deterioração durante o período da sua vida útil (SUPPAKUL et al., 2011a,

2011b).

O requisito necessário para o funcionamento da embalagem antimicrobiana é o

intenso contato com o alimento, o que restringe o número de compostos a serem utilizados

para sua elaboração, pois o contato não pode causar contaminação ou deixar resíduos no

alimento. As embalagens antimicrobianas podem ser divididas em dois grupos: no primeiro, o

agente antimicrobiano migra da embalagem para a superfície do produto. No segundo, os

60

agentes são efetivos contra a multiplicação microbiana superficial sem a necessidade de

migração para o produto (VERMEIREN; DEVLIEGHERE; DEBEVERE, 2002).

Deve-se considerar na seleção do agente antimicrobiano, seu mecanismo de

inibição, características físico-químicas, cinéticas de migração e de difusão do agente no

alimento, tipo, população e fisiologia do micro-organismo alvo, processo de fabricação do

material de embalagem, processabilidade do material de embalagem e aspectos relacionados à

legislação. Os agentes antimicrobianos podem ser compostos naturais ou sintéticos, os quais

podem ser incorporados aos mais diferentes tipos de materiais como o plástico, papel, filme,

fibras têxteis entre outros (OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2004). De maneira geral, certas

características da célula, podem sugerir possíveis locais de ação de um agente antimicrobiano.

A célula dos micro-organismos contém muitas enzimas responsáveis pelos processos

metabólicos; uma membrana semipermeável (membrana citoplasmática) que mantém a

integridade do conteúdo celular, controlando seletivamente o transporte de substâncias entre a

célula e seu meio, além de ser, o local de algumas reações enzimáticas. A parede celular

proporciona uma cobertura à bactéria, participando de certos processos fisiológicos. Uma

lesão em qualquer desses níveis pode iniciar alterações que levam a morte da célula (MANI-

LÓPEZ; GARCÍA; LÓPEZ-MALO, 2012; JAY, 2005).

2.6.2.1 Aplicação dos filmes bioativos

A busca do consumidor por alimentos sem conservantes sintéticos, de alta

qualidade e embalados por materiais de menor impacto ambiental, impulsionam estudos sobre

a aplicação de sistemas antimicrobianos em embalagens ativas, tal como os filmes

biodegradáveis (GÓMEZ-ESTACA et al., 2014; GIMÉNEZ et al., 2013a; LÓPEZ-DE-

DICASTILLO et al., 2012; MASTROMATTEO; CONTE; DEL NOBILE, 2010; SALGADO

et al., 2012, 2013). Os filmes e coberturas ativas, estão são sendo utilizados em carne e

produtos cárneos, pescados, frutos do mar, entre outros. Cada alimento tem seu próprio

mecanismo de degradação, que varia em função da sua composição e processamento.

Portanto, diversos processos podem ser observados no interior das embalagens, que vão

depender das características intrínsecas do alimento e da forma como ele interage com o

ambiente que o cerca (ARANCIBIA et al., 2015; FERREIRA, 2014; GIMÉNEZ et al., 2012;

GÓMEZ-ESTACA et al., 2010; ROCHA et al., 2014; SALGADO et al., 2013; TEIXEIRA et

61

al., 2014; ZINOVIADOU et al., 2009). A Figura 10, apresenta algumas aplicações dos filmes

bioativos.

Figura 10 - Aplicações de diferentes filmes bioativos

a) Filme de ágar incorporado com chá verde utilizado como revestimento de atum (LÓPEZ DE LACEY, 2013);

b) Filme proteico incorporado com hidrolisados nanoencapsulados utilizado como revestimento de filés de bagre

(ZAVAREZE, 2012)

Muitos estudos (GIMÉNEZ et al., 2012; GÓMEZ-ESTACA et al., 2010;

SALGADO et al., 2013; TEIXEIRA et al., 2014) relataram que os óleos essenciais

provenientes de plantas e temperos, tal como o óleo de cravo (Syzygium aromaticum),

possuem atividades antimicrobianas. Além disso, a maioria destes são Geralmente

Reconhecido como Seguro (GRAS) pela Food and Drug Administration, o que os torna

aditivos interessantes na indústrias de alimentos. Os óleos essenciais são ricos em compostos

biologicamente ativos, tais como os terpenos e os ácidos fenólicos (eugenol), e devido a isso

possuem essas propriedades bioativas. Os possíveis mecanismos da inibição dos micro-

organismos, incluem alterações na permeabilidade da membrana, provocando danos à

membrana proteica e citoplasmática, absorção de glicose e a interação com as enzimas das

bactérias como a ATPase (GÓMEZ-ESTACA et al., 2014; RUIZ-NAVAJAS et al., 2013).

Entretanto, sua utilização em alimentos é muitas vezes limitada devido ao seu forte sabor e

aroma, com a finalidade de minimizar esse problema os óleos essenciais podem ser

adicionadas em filmes poliméricos (RUIZ-NAVAJAS et al., 2013).

Salgado et al. (2013), adicionaram óleo essencial de cravo em filmes de proteínas

de girassol e utilizaram como embalagem ativa para a preservação empanados de sardinha,

onde foi verificado que os mesmos retardaram a multiplicação de mesófilos totais. Gómez-

Estaca et al. (2010) avaliaram o efeito de filmes elaborados à base de quitosana e gelatina

incorporados com óleo essencial de cravo sobre a conservação de filés de bacalhau (Gadus

morhua), onde verificaram uma redução na quantidade de bactérias Gram-negativas,

principalmente as enterobactérias.

(a) (b)

62

Zavareze (2012) elaborou e aplicou filmes proteicos incorporados com

hidrolisados nanoencapsulados em filés de bagre (Genidens barbus), onde verificou que os

mesmos, possivelmente devido a nanoencapsulação, não influenciaram no conteúdo de bases

voláteis totais e substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico. Entretanto, segundo Di

Bernardini et al., (2011) nos últimos anos, muitas pesquisas têm sido realizadas para a

obtenção de peptídeos bioativos a partir de hidrolisados de diversas fontes tais como ovos,

soro de leite, pescado entre outras, onde foi verificada a atividade antimicrobiana in vitro

frente à diferentes micro-organismos (ALEMÁN et al., 2011; DE CASTRO; SATO, 2014;

GÓMEZ-GUILLÉN et al, 2011; VAVRUSOVA et al., 2015). Devido a isto, é interessante o

estudo da incorporação dos mesmos em filme biodegradáveis e a posterior aplicação dos

mesmos como revestimentos.

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78

CAPÍTULO III – DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

APRESENTAÇÃO

As atividades experimentais da tese, foram primeiramente desenvolvidas no

Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA) da Escola de Química e Alimentos (EQA) da

Universidade Federal do Rio Grande (FURG). Os experimentos da avaliação das

bioatividades in vitro dos hidrolisados proteicos, foram desenvolvidos no Departamento de

Produtos do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos e Nutrição (CSIC-ICTAN) em

Madri, Espanha. Desta forma, o presente estudo foi dividido em quatro artigos científicos:

ARTIGO I: Propriedades funcionais, térmicas e físico-químicas de proteínas de

castanha (Umbrina canosai) recuperadas por solubilização/precipitação ou processo

de lavagem;

ARTIGO II: Atividade antioxidante e antimicrobiana apresentada por hidrolisados

proteicos obtidos de proteínas recuperadas do músculo da castanha (Umbrina

canosai);

ARTIGO III: Atividade anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase

IV e prolil endopeptidadse de hidrolisados proteicos da castanha (Umbrina canosai)

incorporados em filmes de ágar após digestão gastrointestinal simulada;

ARTIGO IV: Avaliação do uso de filmes de ágar incorporados com hidrolisados

proteicos da castanha (Umbrina canosai) e óleo essencial de cravo para o

prolongamento da vida útil de filés de linguado (Paralichthys orbignyanus).

ARTIGO I

PROPRIEDADES FUNCIONAIS, TÉRMICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DE

PROTEÍNAS DE CASTANHA (Umbrina canosai) RECUPERADAS POR

SOLUBILIZAÇÃO/PRECIPITAÇÃO OU PROCESSO DE LAVAGEM

82

RESUMO

O objetivo deste estudo, foi avaliar o efeito do método de recuperação nas propriedades

físico-químicas, estruturais, térmicas e funcionais de proteínas extraídas a partir do músculo

da castanha. Foram extraídas proteínas da castanha por dois métodos: extração

alcalina/precipitação isoelétrica e através de lavagens com água destilada e cloreto de sódio.

Os processos de extração alcalina/precipitação isoelétrica e das lavagens, produziram teores

significativamente diferentes (p < 0,05) de proteína de 92,1% (como isolado proteico) e

88,7% (como proteínas miofibrilares), respectivamente. Os aminoácidos polares

compreendem cerca de 61,5% e 59,8% da proteína miofibrilar e isolado, respectivamente. A

digestibilidade da proteína miofibrilar e isolado não diferiu significativamente (p > 0,05), e os

espectros de infravermelho mostraram bandas de proteínas semelhantes e típicas para cada

produto de recuperação. O isolado proteico apresentou uma luminosidade inferior (81,04) do

que a proteína miofibrilar (83,87), mas elevado valor de vermelhidão (2,55) e amarelo

(15,47). A entalpia total de desnaturação da proteína miofibrilar (1,47 J/g) foi maior do que a

do isolado proteico (0,33 J/g). A proteína miofibrilar mostrou estruturas mais compactas do

que o isolado proteico. Os valores de solubilidade e de capacidade de retenção de água (CRA)

do isolado proteico, foram superiores aos da proteína miofibrilar no mesmo valor de pH. O

estudo indicou que o processo de variação de pH, pode melhorar as propriedades funcionais

das proteínas da castanha em relação as proteínas miofibrilares. No entanto, os resultados

mostraram também, que algumas das características físico-químicas do isolado proteico foram

inferiores aos da proteína miofibrilar, sugerindo que os dois materiais podem ser usados para

obter diferentes produtos com alto valor agregado.

Palavras- chave: pescado, proteína, extração alcalina, lavagem, propriedades.

83

1 INTRODUÇÃO

A castanha (Umbrina canosai) é uma espécie de pescado amplamente disponível

no litoral sul do Brasil. No entanto, esta espécie é subutilizada e possui baixo valor comercial

(LEMPEK; MARTINS; PRENTICE, 2007). Atualmente, a exploração dos recursos naturais e

o aumento da poluição ambiental, criaram a necessidade da utilização de co-produtos e

espécies de baixo valor agregado de pescado para o desenvolvimento de produtos de alto

valor agregado. As proteínas musculares de pescado são nutritivas, de fácil digestão e

apresentam boa funcionalidade, tornando-os desejáveis para várias aplicações alimentares

(NOLSØE; UNDELAND, 2009). No entanto, o uso de proteínas de pescado como um

alimento ou ingrediente alimentar, tem sido limitado pela sua baixa estabilidade em

comparação com proteínas de mamíferos e de vegetais. Muitos autores estão utilizando

espécies subutilizadas, como a castanha, para obter isolados proteicos e proteínas

miofibrilares, que podem ser considerados produtos de alto valor agregado (EL HALAL et al.,

2015a; LIMPAN et al., 2010; NOLSØE; UNDELAND, 2009; ROCHA et al., 2014;

YARNPAKDEE et al., 2014; ZAVAREZE et al., 2014).

Os isolados proteicos têm apresentado boas propriedades funcionais para

aplicação em diferentes fórmulas alimentares (GEHRING et al., 2011; NOLSØE;

UNDELAND, 2009), e além disso eles contêm quantidades suficientes de todos os

aminoácidos essenciais para seres humanos adultos (FOH et al., 2012; MARMON;

UNDELAND, 2013). Segundo Tahergorabi et al. (2012), o isolado proteico obtido por

solubilização ácida e/ou alcalina tem mostrado um potencial significativo para a recuperação

de proteína do músculo de pescado. O processo de solubilização seguida de precipitação

isoelétrica, permite que a solubilidade em água das proteínas musculares seja seletiva e

induzida pelo pH, com separação simultânea de lipídios e a remoção de materiais não

destinados ao consumo humano, tais como ossos, escamas e pele através da centrifugação

(GEHRING et al., 2011; MARMON; UNDELAND, 2013; NOLSØE; UNDELAND, 2009).

Foh et al. (2012) em seus estudos, verificaram que os isolados proteicos são mais estáveis e

possuem elevada funcionalidade, quando comparados a proteína muscular não processada. Os

isolados proteicos têm sido amplamente utilizados como uma matéria-prima para elaboração

de filmes poliméricos, hidrolisados proteicos e como ingredientes funcionais entre outros

materiais (GEHRING et al., 2011; MATAK; TAHERGORABI; JACZYNSKI, 2015;

RAGHAVAN; KRISTINSSON, 2009a; ROCHA et al., 2014; TAHERGORABI et al., 2012).

84

Segundo Kristinsson e Liang (2006), a lavagem é um dos mais importantes passos

no processamento de surimi, uma vez que melhora a capacidade de formação de gel e

brancura, devido à remoção de uma quantidade considerável de gordura e proteínas

sarcoplasmáticas. De acordo com Nolsøe e Undeland (2009), esse processo envolve uma

sequência de lavagens com água fria e/ou soluções alcalinas diluídas. As proteínas

sarcoplasmáticas de pescado são um grande grupo de proteínas, as quais incluem algumas

enzimas, que são solúveis em água ou solução de baixa força iônica (GEHRING et al., 2011;

NOLSØE; UNDELAND, 2009). Durante o processo de lavagem, muitos compostos solúveis

em água são diluídos, e parte da gordura neutra é removida. No entanto, a perda de proteínas

sarcoplasmáticas e algumas proteínas miofibrilares na água de lavagem reduz o rendimento

total de proteína. Limpan et al. (2010) obtiveram proteína miofibrilar do pescado, com um

teor de proteína de 88,3%, que foi utilizado em soluções de formação de filmes. O objetivo

deste estudo, foi avaliar o efeito do método de recuperação proteica nas propriedades físico-

químicas, térmicas e funcionais das proteínas extraídas a partir do músculo da castanha.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 MATERIAL

2.1.1 Pescado

Os filés da castanha (U. canosai), foram fornecidos por uma indústria pesqueira

da cidade do Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil. A castanha foi capturada no litoral sul do

Rio Grande do Sul e em seguida transportada para a indústria processadora. Em seguida, foi

higienizada em água clorada (5 ppm) a 4 °C, descabeçada, eviscerada e fileteada. Os

músculos foram embalados em embalagens de polietileno e congelados a -18 °C na indústria

de processamento de pescado. Os músculos congelados foram transportados para o

Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA), da Universidade Federal do Rio Grande

(FURG), em caixas herméticas e armazenados a – 18°C até o momento do uso.

85

2.1.2 Reagentes

Os reagentes utilizados no presente estudo foram de grau analítico (P.A).

2.2 OBTENÇÃO DO ISOLADO PROTEICO

O isolado proteico de castanha (IPC), foi obtido através do método de variação de

pH, conforme descrito por Nolsøe e Undeland (2009), com modificações. A Figura 1

apresenta o fluxograma do processo de obtenção do IPC.

Figura 1 - Fluxograma do processo de obtenção do isolado proteico de castanha

Moagem

Proteínas insolúveis e

lipídios neutros Centrifugação I

Solubilização

Liofilização

Homogeneização

Centrifugação II

Isolado proteico

úmido

NaOH (1M)

Água destilada

HCl (1M) Precipitação

Sobrenadante

Água

Retido (> 42 mesh) Peneiramento

Músculo de pescado

Isolado proteico seco

86

Os músculos de castanha foram homogeneizados em água destilada, na proporção

1:9 (p/v) em reator de aço inoxidável, acoplado de banho ultratermostático (Quimis, Q212S,

Diadema, Brasil) a 4 °C sob agitação constante com agitador eixo-hélice (IKA, RW

20DZM.n, Alemanha) durante 1 min. Em seguida, foi realizada a solubilização em pH 11,2

(NaOH 1 M) durante 20 min a 4 °C sob agitação constante. Após, as amostras foram

centrifugadas a 9000 x g (Hanil, Supra 22K, Coréia do Sul) durante 20 min a 4 °C. Na

centrifugação, a amostra foi separada em três fases: fase superior (lipídios neutros) a qual foi

descartada, fase intermediária (proteínas solúveis) a qual foi submetida a precipitação

isoelétrica e fase inferior (proteínas insolúveis) a qual foi descartada. O pH das proteínas

solúveis, foi ajustado em pH 5,0 (HCl 1 M) durante 20 min a 4 °C sob agitação constante,

precipitando as proteínas. Após, as amostras foram centrifugadas a 9000 x g durante 20 min a

4 °C. O precipitado, isolado proteico, foi liofilizado em liofolizador (Liotop, L108, São

Carlos, Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h, fracionado em moinho de facas (Tecnal, TE-

633, Piracicaba, Brasil), peneirado em peneira de 42 mesh (Bertel, Caieiras, Brasil) e

armazenado a – 18 °C até o momento de uso.

2.3 OBTENÇÃO DAS PROTEÍNAS MIOFIBRILARES

As proteínas miofibrilares de castanha (PMC), foram obtidas através de

sucessivas lavagens em água destilada e solução salina segundo o método descrito por

Limpan et al. (2010), com modificações. A Figura 2, apresenta o fluxograma do processo de

obtenção das PMC. O músculo de castanha foi homogeneizado em água destilada a 4 °C, na

proporção 1:3 (p/v), a 13.000 rpm em agitador eixo-hélice (Fisatom, 712, São Paulo, Brasil)

durante 2 min, seguido por filtração em filtro de nylon. Então, foi homogeneizado em NaCl

(50 mM) a 4 °C, na proporção 1:5 (p/v), a 13.000 rpm em agitador eixo-hélice (Fisatom, 712,

São Paulo, Brasil) durante 5 min e filtrado em filtro de nylon. Esse processo foi realizado

duas vezes. Em seguida, a PMC úmida, foi liofilizada em liofolizador (Liotop, L108, São

Carlos, Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h, fracionada em moinho de facas (Tecnal, TE-

633, Piracicaba, Brasil), peneirada em peneira de 42 mesh (0,35 mm) (Bertel, Caieiras, Brasil)

e armazenada a - 18 °C até o momento do uso.

87

Figura 2 - Fluxograma do processo de obtenção das proteínas miofibrilares de castanha

2.4. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MATÉRIAS PRIMAS

2.4.1 Composição proximal

A composição proximal do músculo, IPC e PMC foi determinada em triplicata

segundo método descrito pela AOAC (2000), com n° de 992,15; 923,03; 960,39; e 925,30;

para determinação de proteína, cinzas, umidade e lipídios, respectivamente.

Pro

cess

o r

epet

ido

duas

vez

es

Homogeneização II

Liofilização

Homogeneização I

Proteína miofibrilar

úmida

Água destilada

Filtração II

Água

Retido (> 42 mesh)

Moagem

Músculo de pescado

Proteína miofibrilar

seca

Filtração I Lipídios e proteínas

sarcoplasmáticas

NaCl (50 mM)

Proteínas do tecido conectivo

Peneiramento

88

2.4.2 Digestibilidade

A digestibilidade in vitro do IPC e PMC, foi determinada em triplicata segundo

método descrito por Akeson e Stahman (1964), com modificações. Aproximadamente 1 g de

proteína foi homogeneizado em 10 mL de pepsina (3,0 mg/mL) dispersa em HCl (0,1 M). A

dispersão foi mantida a 37 °C durante 3 h sob agitação constante (90 rpm) em shaker (Cientec

CT-712RNT, Piracicaba, Brasil). Em seguida, foi neutralizada com a adição de NaOH (0,3

M) e 10 mL de pancreatina (4,0 mg/mL), em tampão fosfato (pH 8,0), foram adicionados.

Estes, foram mantidos a 37 °C durante 24 h a 130 rpm em shaker (Cientec CT-712RNT,

Piracicaba, Brasil). Foram adicionados 10 mL de ácido tricloroacético (30%, p/v) – TCA e

avolumados a 50 mL através da adição de TCA (5%, p/v). A dispersão foi centrifugada a

5000 x g (Biosystems, MPW 350/350-R, Brasil) durante 20 min a temperatura ambiente. O

sobrenadante foi filtrado em papel filtro Whatman n°1. O conteúdo de nitrogênio solúvel em

TCA no sobrenadante foi quantificado pelo método de micro-Kjeldahl (N x 6,25).

2.4.3 Composição aminoacídica

A determinação da composição de aminoácidos do IPC e da PMC, foi

determinada em triplicata segundo método proposto por Bidlingmeyer et al. (1984), na

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP de Ribeirão

Preto. As amostras foram previamente hidrolisadas com HCl 6 M, durante 22 horas a 110 ± 1

°C.

2.4.4 Eletroforese

A determinação do perfil eletroforético do IPC e da PMC, foi realizada segundo

método descrito por Laemmli (1970), com modificações, em gel de separação de

poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em uma concentração de 12%

(v/ v). Cada amostra (0,4% proteína; p/v) foi homogeneizada em água destilada e dispersa em

tampão Tris-HCl (0,5 M), contendo glicerol (20%) e dodecil sulfato de sódio – SDS (10%),

na proporção 1:1 (v/v). Desta dispersão, foi retirada uma alíquota de 1 mL e homogeneizada

em 100 µL de β-mercaptoetanol, os quais foram deixados em banho-maria a 100 °C durante 4

89

min. Após o arrefecimento, foram adicionados 3 gotas de azul de bromofenol na dispersão e

retirada uma alíquota de 20 µL da mesma e adicionados em cada poço. Aproximadamente 10

µL do padrão de massa molecular (10 kDa – 220 kDa; Sigma, Saint Louis, Estados Unidos)

foi adicionado em poço para comparação da massa molecular das amostras. Os géis foram

submetidos a uma corrente elétrica de 45 mA durante 3 h. Após, os géis foram corados com

uma solução corante contendo metanol 50% (v/v), ácido acético glacial 6,8% (v/v) e

Coomassie Brilliant Blue-R (1 mg/mL) durante 2 h sob agitação constante em shaker (Cientec

CT-712RNT, Piracicaba, Brasil). Os géis foram descorados em uma solução contendo ácido

acético glacial 7,5% (v/v) e metanol 5% (v/v), durante aproximadamente 24 h sob agitação

constante em shaker (Cientec CT-712RNT, Piracicaba, Brasil).

2.4.5 Cor

A cor do IPC e PMC foi determinada em triplicata em colorímetro (Minolta, CR-

400, Osaka, Japão) utilizando o sistema de escala de cor da Comissão Internacional de

Iluminação (CIEL*a*b*), segundo método descrito pela CIE Lab (CIE, 1986). Foram

determinadas as coordenadas desse sistema tridimensional: luminosidade (L*), que é

acromática e varia de 0 (preto) a 100 (branco); e as coordenadas a* e b* onde a*=coordenada

do verde-vermelho (-a*: verde, +a*: vermelho); e b*=coordenada azul-amarelo (-b*:azul,

+b*:amarelo).

2.4.6 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

A calorimetria diferencial de varredura, das amostras de IPC e PMC, foi

determinada segundo Meng e Ma (2001) em calorímetro diferencial de varredura (Shimadzu,

TA-60WS, Quioto, Japão) com modificações. Aproximadamente 2 mg das amostras foram

pesadas em cápsulas de alumínio hermético e em seguida foi adicionado 10 µL de tampão

fosfato salino (0,1 M, pH 7,0). As cápsulas foram hermeticamente seladas e a varredura foi

realizada com uma taxa de aquecimento de 10 °C/min em um intervalo de temperatura de 30 a

200 °C. A temperatura onde a desnaturação iniciou, foi denominada temperatura de início

(Tinício). A temperatura máxima de desnaturação foi denominada temperatura de pico (Tpico),

90

considerada a temperatura onde o fluxo de calor é máximo. A entalpia de desnaturação (ΔH)

foi calculada a partir da área do pico endotérmico.

2.4.7 Análise termogravimétrica (TGA)

A análise termogravimétrica do IPC e PMC, foi realizada segundo método

descrito por Kumar et al. (2014) em analisador termogravimétrico (Shimadzu, DTG 60,

Osaka, Japão), com adaptações. Amostras de 10 mg foram aquecidas a uma taxa de 10 °C/min

em um intervalo de temperatura de 30 a 600 °C sob atmosfera de nitrogênio a uma taxa de

fluxo de 50 mL/min.

2.4.8 Espectroscopia no infravermelho (FT-IR)

As análises de espectroscopia no infravermelho do IPC e PMC, foram realizadas

em espectrofotômetro (Shimadzu, IR Prestige – 21 FTIR, Alemanha) segundo Kummar et al.

(2014). As amostras foram homogeneizadas com brometo de potássio (KBr), na proporção

1:10 (p/p). Os espectros infravermelhos foram realizados na região espectral de 400 a 4000

cm-1

a temperatura ambiente.

2.4.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Estudos da microestrutura do IPC e da PMC, foram realizados no Centro de

Microscopia Eletrônica do Sul (CEME-Sul), da Universidade Federal do Rio Grande, em

microscópio eletrônico de varredura (Jeol, JSM - 6610LV, Tóquio, Japão) operando a 20 kV.

As amostras foram depositadas em suportes de alumínio (stubs) revestidos com uma fita

condutora de carbono. Em seguida, os mesmos foram recobertos com uma fina camada de

ouro em Spputering (Desk, Denton Vacuum, Estados Unidos) durante 120 s. A morfologia

das amostras foi observada em 1000 x de ampliação.

91

2.4.10 Propriedades funcionais

2.4.10.1 Solubilidade proteica

A solubilidade proteica do IPC e da PMC, foi determinada segundo método

descrito por Tadpitchayangkoon, Park e Yongsawatdigul (2010), com modificações, em

diferentes pH’s (3, 5, 7, 9 e 11). As amostras (0,5 g) foram dispersas em 2 mL de NaCl (0,1

M) e 48 mL de água destilada. O pH das amostras foi ajustado nos diferentes pH’s de estudo,

utilizando HCl ou NaOH (0,1 M ou 1 M). A dispersão foi mantida sob agitação constante em

agitador magnético (Quimis, 261-2, São Paulo, Brasil) durante 30 min a temperatura

ambiente, em seguida centrifugou-se em centrífuga (Biosystems, MPW-350R, Polônia) a

8667 x g durante 20 min a temperatura ambiente. O sobrenadante foi filtrado em papel filtro e

o filtrado utilizado para a quantificação proteica. A quantificação foi realizada segundo Lowry

et al. (1951) em espectrofotômetro (Biospectro, SP22, Paraná, Brasil) a 660 nm, usando

albumina bovina como padrão (0,04 – 0,42 mg/mL). A solubilidade proteica foi expressa

como porcentagem proteica no sobrenadante em relação ao conteúdo de proteína inicial.

2.4.10.2 Capacidade de retenção de água (CRA)

A CRA do IPC e PMC foi determinada segundo método descrito por Regenstein,

Gorimar e Sherbon (1979), com adaptações, em difrentes pH’s (3, 5, 7, 9 e 11). Dispersões

proteicas (1%, p/v) foram preparadas com 2 mL de NaCl (0,1 M), na qual foram adicionados

40 mL de solução tampão do pH correspondente. A dispersão foi homogeinizada durante 15

min em agitador magnético (Warmnest, HJ-3, Curitiba, Brasil) a temperatura ambiente. As

amostras foram centrifugadas (Biosystems, MPW-350R, Curitiba, Brasil) a 8667 x g durante

20 min a temperatura ambiente e filtradas em papel filtro. A CRA foi calculada segundo a

Equação 1:

CRA (g água/ g proteína) M

mP (1)

92

Onde CRA: capacidade de retenção de água; M: massa de água retida na amostra; mP: massa

de proteína que absorveu água.

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados de composição proximal, cor, digestibilidade, solubilidade,

capacidade de retenção de água, colorimetria diferencial de varredura e composição

aminoacídica foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas

pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. Os dados foram avaliados pelo programa

Statistica (versão 5.0, por StatSoft, Inc., Tulsa, Estados Unidos).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 COMPOSIÇÃO PROXIMAL

A Tabela 1, apresenta a composição proximal do músculo, IPC e da PMC. O

conteúdo de proteínas, lipídios e cinzas do músculo da castanha (b.u) foram inferiores ao

encontrado por Lempek (2005), o qual encontrou um teor de 18,28% para proteínas, 3,34%

para lipídios e 1,10% para cinzas. Entretanto, o conteúdo de umidade encontrado no presente

estudo foi superior ao encontrado por Lempek (2005), o qual obteve 77,33% de umidade.

Tabela 1 - Composição proximal do músculo, isolado proteico e proteína miofibrilar da

castanha

Dados expressos como valores médios (média ± desvio padrão, n=3). Letras minúsculas diferentes na mesma

linha, indicam diferenças significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p < 0,05; n=3).

Constituintes Músculo (b.u) IPC (b.u) PMC (b.u)

Proteína (%) 17,4c ± 0,5 92,1

a ± 0,0 88,7

b ± 0,8

Umidade (%) 79,3a ± 0,3 2,2

b ± 0,1 2,0

b ± 0,1

Lipídios (%) 2,7b ± 0,3 1,2

c ± 0,1 3,9

a ± 0,1

Cinzas (%) 0,9c ± 0,0 1,5

b ± 0,1 3,3

a ± 0,0

93

Segundo Koblitz (2008) o teor dos principais componentes do pescado, pode

variar com a espécie, o grau de maturação sexual e o estado nutritivo dos animais. Sendo que

as variações marcantes estão relacionadas com os teores de água e lipídios. O teor de umidade

do IPC (2,2%) e PMC (2,0%) não foi significativamente diferente (p > 0,05). Contudo, o

músculo apresentou um conteúdo superior de umidade em relação as demais amostras (p <

0,05). Neste estudo, o IPC apresentou um teor de proteína e de lipídios significativamente (p

< 0,05) superior e inferior ao encontrado para a PMC. O IPC obtido neste estudo mostrou um

teor de proteína superior ao encontrado por Rocha et al. (2013) em seus estudos com isolado

proteico de anchoita (Engraulis anchoita), o qual obteve um conteúdo proteico de 88,8%.

Marmon e Undeland (2013) elaboraram um isolado proteico de filés de arenque (Clupea

harengus), com um teor de proteínas de 86%, inferior à encontrada neste estudo. Limpan et al.

(2010), através do processo de sucessivas lavagens em NaCl e água obtiveram proteínas

miofibrilares, a partir de bigeye snapper (Priacanthus tayenus), com 88,3% de proteína

semelhante ao valor encontrado para PMC. García e Sobral (2005) obtiveram proteínas

miofibrilares a partir de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) liofilizada, com um teor de

proteína de 80%, um valor menor que o relatado neste estudo. De acordo com Nolsøe e

Undeland (2009), durante o processo de lavagem os compostos solúveis em água são diluídos

e/ou removidos, resultando na perda de proteínas sarcoplasmáticas e também algumas

proteínas miofibrilares, as quais são lixiviadas na água de lavagem, reduzindo o rendimento

da proteína total.

Tahergorabi et al. (2012) verificaram que os lipídios do pescado, também foram

removidos com maior eficiência das proteínas musculares, quando a solubilização em pH

alcalino foi realizada. Segundo Yarnpakdee et al. (2014), quando o processo de solubilização

alcalina é aplicado, as proteínas são mais susceptíveis a dissociação, principalmente devido à

repulsão intensificada. Como resultado, os lipídios podem ser liberados facilmente, resultando

em uma redução no conteúdo lipídico. Segundo Kristinsson et al. (2005), após solubilização

esses constiuintes, podem ser separados com base na diferença de densidade e de solubilidade

durante a etapa de centrifugação, o que foi verificado no presente estudo. O processo de

solubilização alcalina e as sucessivas lavagens, resultaram em uma redução no conteúdo

lipídico de 91% (b.s) de 70% (b.s) em relação ao teor lipídico do músculo. Kristinsson et al.

(2005) relataram que a solubilização alcalina do bagre (Ictalurus punctatus), contribuiu para a

redução superior do teor de lipídios (~ 88,6%), em comparação com o processo de surimi (~

58,3%). O mesmo comportamento foi verificado por Gehring et al. (2011), onde a

94

solubilização em pH alcalino resultou em maior redução dos lipídios presentes nas proteínas

recuperadas.

O teor em cinzas encontrado no IPC (1,5%) foi significativamente inferior (p <

0,05) ao encontrado para a PMC (3,3%). Este conteúdo pode ser verificado pela presença de

resíduos de cloreto de sódio utilizada na lavagem do músculo da castanha. Tokur et al. (2006),

verificaram um teor de cinzas de 1,80% em proteínas miofibrilares de carpa comum

(Cyprinus carpio L.), sendo superior ao encontrado no presente estudo. Rocha et al. (2013),

verificaram que o isolado proteico de anchoita apresentou um teor em cinzas de cerca de

1,0%. Tadpitchayangkoon e Yongsawatdigul (2009), em estudos realizados sobre o efeito dos

processos de lavagem e da extração por via alcalina sobre as características de gelificação das

proteínas musculares de panga (Hypophthalmus Pangasius), observaram uma redução no teor

de cinzas (0,86%) do isolado proteico quando comparado ao encontrado nas proteínas lavadas

com água (3,39%) ou lavada com solução alcalina (3,67%). A alta concentração de cinzas em

proteínas miofibrilares, pode ser explicada pelo acúmulo de NaCl ou de soluções alcalinas

durante o processo de lavagem.

3.2 DIGESTIBILIDADE PROTEICA

A Tabela 2 apresenta as digestibilidades proteicas das amostras IPC e PMC. O

IPC e o PMC não apresentaram digestibilidades significativamente diferentes (p > 0,05).

Entretanto, o processamento de alimentos pode aumentar ou diminuir a digestibilidade da

proteína, pois as alterações estruturais induzidas podem tornar a proteína mais ou menos

acessível às enzimas digestivas. Além disso, a oxidação das proteínas pode diminuir a

digestibilidade pela formação de ligações S-S, por exemplo (MARMON; UNDELAND,

2013). Segundo Contreras-Guzmán (1994), o músculo de pescado apresenta digestibilidade

em torno de 90 a 100%. No presente estudo, foi verificado no que o IPC e a PMC

apresentaram valores similares 98,0% e 97,9% de digestibilidade, respectivamente. As

alterações na digestibilidade da proteína, não foram observadas quando comparados os

processos de obtenção através dos métodos de variação de pH e de lavagem do músculo da

castanha. Marmon e Undeland (2013) também verificaram, que o isolado proteico obtido pela

variação de pH de arenque (Clupea harengus) manteve boa digestibilidade.

95

Tabela 2- Características físico-químicas e térmicas do isolado proteico e proteína miofibrilar

da castanha

Dados expressos como valores médios (média ± desvio padrão, n=3). Letras minúsculas diferentes na mesma

linha indicam diferenças significativas entre as amostras através do teste de Tukey (p < 0,05).

3.3 COR

As características de cor diferiram entre o IPC e PMC, como foi apresentada na

Tabela 2. O IPC apresentou a luminosidade (L*) de 81,04, a qual foi significativamente

inferior (p < 0,05) em relação ao PMC (83,87). Entretanto, o IPC apresentou valores

significativamente superiores (p < 0,05) de a* (2,55) e b* (15,47). O baixo valor de L*

encontrado para as proteínas recuperadas através da solubilização em pH alcalino, em relação

às obtidas pelo processo de sucessivas lavagens, ocorreu devido a maiores níveis de proteínas

desnaturadas e roteínas heme oxidadas recuperadas nesse processo, o que contribui para o

escurecimento da amostra (RAWDKUEN et al., 2009). A L* também está relacionada a maior

Características IPC PMC

*Digestibilidade (%) 98,0a ± 0,1 97,9

a ± 0,1

L* 81,04b ± 0,03 83,87

a ± 0,30

a* 2,55a ± 0,07 2,34

b ± 0,03

b* 15,47a ± 0,22 14,28

b± 0,16

DSC IPC PMC

Tinício1(°C) 49,14 51,96

Tpico1(°C) 53,42 53,51

Tfimt1 (°C) 54,99 59,43

ΔH1 (J/g) 0,32 0,40

Tiníciot2(°C) 71,92 68,76

Tpico2(°C) 72,19 72,71

Tfimt1 (°C) 76,53 76,84

ΔH2 (J/g) 0,01 1,47

ΔHtotal (J/g) 0,33 1,87

96

retenção de proteínas heme nativas no material final, como resultado o IPC apresentou maior

tendência a vermelhidão (a*) em relação ao PMC (p < 0,05). Foh et al. (2012) obtiveram um

isolado proteico de tilápia (Oreochromis niloticus), com um maior valor de L* (82,60)

comparado ao encontrado no presente estudo para o IPC. Estes autores verificaram que o

acréscimo do vermelho (a*), ocorreu devido às proteínas heme restantes na proteína

recuperada.

Neste estudo, PMC apresentou uma aparência mais branca, devido à remoção de

mioglobina durante a lavagem. Segundo Tadpitchayangkoon e Yongsawatdigul (2009), isto

ocorre porque a mioglobina e hemoglobina são removidos durante o processo de lavagem

devido as suas solubilidades nas soluções utilizadas. Kristinsson e Liang (2006) em seus

estudos, verificaram que a solubilização de músculo inteiro, em condições alcalinas ou ácidas,

acelerou a oxidação da mioglobina, resultando em uma coloração amarelada (b*). Isto foi

verificado por Chaijan et al. (2007), os quais relataram que as condições alcalinas e ácidas

aceleraram a auto-oxidação de mioglobina de sardinha (Sardinella gibbosa), resultando em

um aumento da cor.

3.4 PROPRIEDADES TÉRMICAS

Muitos estudos têm avaliado a desnaturação térmica de proteínas do músculo e

isolado proteico de pescado (ROCHA et al., 2013; YU et al., 2014). A Tabela 2 apresentou as

temperaturas de início (Tinício1) e máximo (Tpico1) para transições endotérmicas, bem como a

energia térmica (entalpia, ΔH) necessária para que a desnaturação das amostras do IPC e

PMC ocorresse. O IPC exibiu uma endoterma com Tpico1 de 53,42 °C, semelhante ao

encontrado para a PMC (53,51 °C), sendo essa faixa de temperatura característica da

desnaturação da miosina pertencente ao músculo de pescado. Medina-Vivanco et al. (2007)

relataram, em seus estudos com proteínas miofibrilares do músculo de tilápia (O. niloticus),

que as temperaturas de desnaturação da miosina e actina foram 54 e 76 ° C, respectivamente.

Segundo o estudo realizado por Bertram et al. (2006), sobre o efeito da temperatura sobre a

carne suína, durante a desnaturação ocorre principalmente à desnaturação da miosina (40 - 60

°C), da proteína sarcoplasmática e colágeno (60 - 70 °C) e a desnaturação da actina (80 °C). A

desnaturação térmica de proteínas dos alimentos requer uma absorção de calor (reação

endotérmica) para romper as ligações pontes de hidrogênio. Esta reação é detectada como um

pico endotérmico e a energia (entalpia, ΔH) necessária para que a reação ocorra é

97

representada pela área sob o pico (TASKAYA et al., 2009). Neste estudo, verificou-se que o

IPC e PMC apresentaram entalpias baixas de desnaturação de ΔH1: 0,32 J/g e ΔH1: 0,40 J/g,

respectivamente. Foh et al. (2012) apresentaram um termograma de DSC do isolado proteico

do músculo da tilápia (O. niloticus) solubilizado a pH 11, o qual exibiu uma única transição

endotérmica com uma entalpia total ΔHtotal, de 0,0206 J/g.

Taskaya et al. (2009) mostraram que as proteínas recuperadas a partir de carpa

prateada (Hypophthalmichthys molitrix) por solubilização/ precipitação isoelétrica, podem ter

sido submetidos a desnaturação induzida por ácido e base, o que contribui para a baixa

entalpia de desnaturação. Isto foi também foi observado por Yongswatdigul e Park (2004),

que em seus estudos com isolado proteico de peixe-vermelho (Sebastes flavidus), obtido a

partir por solubilização alcalina ou ácida, no qual a energia requerida para a desnaturação

térmica no DSC foi mínima. Entretanto, o músculo de peixe-vermelho moído exibiu

transições endotérmicas típicas. No entanto, Tahergorabi et al. (2012a) verificaram que a

desnaturação do isolado proteico de peito de frango obtido por solubilização alcalina a pH

11,5 apresentou uma entalpia de desnaturação de 2,0 J/g. As diferenças nas transições

endotérmicas encontradas com as do presente trabalho podem ocorrer devido às diferentes

condições de amostra utilizada. O IPC exibiu uma Tpico2 de 72,19 °C semelhante ao da PMC

(72,71 °C). Contudo, a PMC apresentou maior ΔH2 (1,47 J/g) e ΔHtotal (1,87 J/g) em relação

ao IPC (0,01 J/g e 0,33 J/g, respectivamente). Isto sugere que a PMC requer mais energia para

a desnaturação térmica, uma vez que o processo usado para obter ela não inclui um tratamento

ácido-alcalino severo. Segundo Rocha et al. (2013), as temperaturas para picos endotérmicos

tendem a variar em função das condições do tipo muscular, do pH e de aquecimento. Lee et

al. (2007) sugeriram que a entalpia diminui com o aumento do pH da solução, porque a

estrutura da proteína se desenrola em pH’s distantes do ponto isoelétrico durante o processo

de solubilização. Segundo Kristinsson e Hultin (2003), a miosina do pescado é caracterizada

por ser uma estrutura menos estável que sua homóloga em mamíferos, o que é indicado pela

sua menor resistência térmica e agregação.

3.5 COMPOSIÇÃO AMINOACÍDICA

O valor nutricional de um alimento depende do tipo e quantidade de aminoácidos

disponíveis no mesmo (TAHERGORABI et al., 2014). A Tabela 3 apresenta a composição

aminoacídica do IPC e da PMC. Os aminoácidos polares correspondem a cerca de 61,50% e

98

59,80% do total de aminoácidos na PMC e no IPC, respectivamente. Segundo Cuq et al.

(1995), a composição dos aminoácidos das proteínas determina o tipo e a quantidade de

interações entre as cadeias laterais, por exemplo.

Tabela 3 - Composição de aminoácidos (b.u) do isolado proteico e proteína

miofibrilar da castanha

Dados expressos como valores médios (média ± desvio padrão, n=3). AAE: aminoácido essencial; ANE:

aminoácido não-essencial; Letras minúscula diferente na mesma linha, indica diferença significativa (p < 0,05).

Estas interações são produzidos por aminoácidos, com grupos polares ionizáveis

(arginina - Arg, histidina - His, lisina - Lis, prolina - Pro, triptofano -Trp) e não-ionizáveis

(ácido aspártico - Asp, cisteína - Cis, ácido glutâmico - Glu, serina - Ser, treonina - Tre,

Aminoácido g aminoácido/ 100 g de IPC g aminoácido/ 100 g de PMC

Não essencial (ANE)

Alanina (Ala) 5,87b

± 0,06 6,18a ± 0,14

Arginina (Arg) 7,02a ± 0,01 6,78

b ± 0,13

Ácido aspártico (Asp) 10,9b ± 0,02 11,36

a ± 0,17

Cisteína (Cis) 0,27a ± 0,01 0,24

b ± 0,00

Ácido glutâmico (Glu) 16,47b ± 0,23 17,94

a ± 0,48

Glicina (Gli) 3,55b ± 0,06 3,87

a ± 0,08

Prolina (Pro) 3,17a ± 0,00 3,17

a ± 0,08

Serina (Ser) 3,97b ± 0,22 4,62

a ± 0,08

Tirosina (Tir) 4,41a ± 0,03 4,34

b ± 0,18

Essencial (AAE)

Histidina (His) 2,66a ± 0,01 2,35

b ± 0,04

Isoleucina (Iso) 4,94a ± 0,33 4,04

b ± 0,06

Leucina (Leu) 8,68a ± 0,09 8,51

a ± 0,14

Lisina (Lis) 9,04a ± 0,09 8,60

a ± 1,23

Metionina (Met) 4,29a ± 0,18 4,46

a ± 0,08

Fenilalanina (Fen) 4,17a ± 0,14 3,62

b ± 0,20

Treonina (Ter) 5,11b ± 0,06 5,29

a ± 0,08

Triptofano (Tri) nd nd

Valina (Val) 5,51a ± 0,22 4,65

b ± 0,15

Total de AAE 44,52a ± 0,19 41,52

b ± 0,27

Total de ANE 55,53 b

± 0,11 58,50 a ± 0,22

99

tirosina - Tir), que estão ligados a água através de pontes de hidrogênio. As interações

hidrofóbicas, podem ser formadas pela junção das cadeias laterais de aminoácidos com grupos

hidrofóbicos (alanina – Ala, valina - Val, leucina - Leu, isoleucina - Ile, metionina - Met,

Pro). Segundo Zhao et al. (2012), a solubilidade da proteína é geralmente associada com

equilíbrio hidrofilicidade/hidrofobicidade, que depende da composição dos aminoácidos.

Neste estudo, a PMC apresentou uma característica hidrófila, devido à quantidade de

aminoácidos polares presentes na amostra.

Segundo Tahergorabi et al. (2014), a qualidade nutricional da fonte de proteínas é

determinada pela presença de todos os nove aminoácidos essenciais (AAEs). Os isolados

proteicos contêm quantidades suficientes de todos os AAEs, para suprir a necessidade de

ingestão de indivíduos adultos (MARMON; UNDELAND, 2013). Pôde-se verificar, que o

IPC apresentou quantidades ligeiramente mais elevadas de todos os AAEs em relação a PMC.

Houve uma diferença maior entre o IPC e PMC, em termos de ANEs do que para os AAEs

essenciais.aDe acordo com Gómez-Guillén et al. (2011) o colágeno, o qual está presente no

tecido conectivo, é rico em Pro e Gli. A diminuição significativa (p < 0,05) da glicina no IPC,

é um forte indicador de que o colágeno foi eficazmente removido, durante o processo de

variação de pH, em relação ao procedimento de sucessivas lavagens utilizado para a obtenção

da PMC.

3.6 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)

A Figura 3 apresenta as microestruturas do IPC e da PMC. A superfície do IPC,

Figura 3a, exibiu uma estrutura fragmentada, com as partículas semelhantes a uma folha de

múltiplas camadas. Segundo Liu et al. (2010), esta morfologia pode resultar de amostras

obtidas em pH próximo do ponto isoelétrico (pI) da proteína, que resultaria em praticamente

nenhuma carga líquida sobre as moléculas. A falta de carga, pode fazer com que as moléculas

sejam agregadas randomicamente. A superfície da PMC, Figura 3b, apresentou-se compacta,

rugosa, dobrada e mais homogênea.

100

0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00Temp [C]

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

%TGA

Mass

a (

%)

Temperatura

(°C)

Figura 3 - Microscopia eletrônica de varredura do isolado proteico (a) e proteína miofibrilar

(b) da castanha

3.7 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA)

A Figura 4 apresenta os termogramas da TGA da degradação térmica do IPC e da

PMC. Foram observados dois estágios principais de perda de massa para as duas amostras

analisadas, sendo que a primeira fase de perda de massa para o IPC (5,2%) e PMC (4,1%) foi

observada de 53,4 °C para 68,4 °C e de 59,9 a 75 °C, respectivamente. Essa primeira fase de

perda de massa pode estar associada com a perda de água adsorvida nas amostras.

Figura 4 - Análise termogravimétrica (TGA) do isolado proteico (1) e da proteína

miofibrilar da castanha (2)

1

2

101

A segunda fase de perda de massa (52,4% e 61,9%) foi observada nas

temperaturas compreendidas entre 286,5 °C a 357 °C para o IPC e de 286,5 °C a 366,3 °C

para a PMC, respectivamente. Esta transição demonstra, que a proteína da PMC foi mais

degradada em comparação a proteína do IPC. Segundo Oujifard et al. (2013), a redução na

estabilidade térmica em temperaturas mais altas, pode ser promovida por alterações na

estrutura da proteína e ruptura das ligações intermoleculares de baixa energia, que mantêm a

conformação da proteína. De acordo com Oujifard et al. (2013) a perda de massa, nesta fase,

ocorre principalmente associada com a degradação da proteína associada ou de maior fração.

De acordo com os resultados de DSC, apresentados anteriormente, neste estudo, a PMC

requer mais energia para a desnaturação térmica, pois o processo utilizado para obtenção da

mesma não envolve um tratamento alcalino-ácido severo. No entanto, o IPC mostrou uma

perda de massa inferior ao encontrado para a PMC. Contudo, a composição proximal da PMC

e do IPC, a qual foi apresentada anteriormente na Tabela 1, indicou que a PMC possui teores

mais elevados de lipídios e de cinzas, o que pode explicar os resultados da análise

termogravimétrica.

3.8 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (FTIR)

A FTIR é uma técnica de espectroscopia vibracional, que pode ser aplicada a

amostras líquidas, semi-sólidas e sólidas para estudar as alterações estruturais da proteína e é,

particularmente, adequada para as proteínas desnaturadas ou de agregados (ZHAO et al.,

2012). De acordo com alguns autores (KONG; YU, 2007; KUMAR et al., 2014), as proteínas

são frequentemente referidas por possuírem certas frações de componentes estruturais (α-

hélices, β-sheet). A composição da estrutura secundária, fornece informação importante para

uma proteína de estrutura desconhecida. A Figura 5 apresenta a FTIR do IPC (5a) e da PMC

(5b).

De acordo com a Figura 5 os perfis observados, foram semelhantes para as

amostras estudadas. Os espectros apresentados revelaram bandas típicas para amostras

proteicas, a amida I (1600-1700 cm-1

) e a amida II (1600-1560 cm-1

), que surgem a partir de

vibrações específicas de alongamento e flexão do esqueleto da proteína. Segundo alguns

autores (BERTRAM et al., 2006; BÖCKER et al, 2008; OJAGH et al., 2011), as mudanças

espectrais na região de amida I, têm sido associados com alterações conformacionais das

proteínas miofibrilares, como resultado de aquecimento ou salting muscular. As mudanças na

102

banda amida I, são úteis para determinar as estruturas secundárias específicas dentro de

proteínas (OJAGH et al., 2011). No presente estudo, a banda de amida I do IPC (Fig. 5a)

apresentou a transmitância máxima do FTIR a 1675 cm-1

, a qual pode ser atribuída ao efeito

de desnaturação do pH de solubilização proteica, devido ao processo de isolamento. Contudo,

esta banda foi encontrada em valores inferiores de frequência no espectro da PMC (Fig. 5b)

de cerca em aproximadamente 1660 cm-1

.

Figura 5 - Espectros de absorção da região do infravermelho do isolado proteico (1) e

proteína miofibrilar da castanha (2)

Segundo Gerzhova et al. (2015) as bandas de amida I, localizadas

aproximadamente entre 1650 e 1658 cm-1

, são consideradas características de estruturas α-

helicoidais. As bandas amida II (N-H), foram localizadas em 1570 cm-1

(IPC) e a 1591 cm-1

(PMC), e as bandas de alongamento C-N (amida III) foram localizados em 1315 cm-1

e 1365

cm-1

, respectivamente. Os picos de transmitância de IPC e PMC em 1072 cm-1

e 1080 cm-1

,

respectivamente, são designados para o C-O, e a banda larga acima de 3000 cm-1

corresponde

a ligações O-H e N-H (ZHOU et al., 2014).

a b

103

3.9 ELETROFORESE

A Figura 6 apresenta a eletroforese em SDS-PAGE das amostras de IPC e PMC.

Entre as duas amostras proteicas, o IPC apresentou um maior número de bandas de proteína.

Segundo Matak et al. (2015), a miosina é a principal constituinte da proteína miofibrillar, o

mesmo foi verificado no presente estudo, onde a miosina apresentou bandas com maior

intensidade de cor e tamanho para as duas amostras estudadas. Para o IPC, foi observada uma

banda abaixo de 15 kDa, em aproximadamente 12 kDa, isto pode ocorrer porque o processo

de isolamento proteico, também exerce efeito sobre as proteínas sarcoplasmáticas, as quais

são solúveis em água e podem ser removidas durante a lavagem, no caso de PMC. Nas bandas

da PMC, a ausência de bandas entre 15 e 10 kDa sugere uma remoção efetiva das proteínas

sarcoplasmáticas durante o processo de sucessivas lavagens.

Figura 6 - Eletroforese em SDS-PAGE do isolado proteico (IPC), proteína miofibrilar da

castanha (PMC) e do padrão (P) de massa molecular

3.10 PROPRIEDADES FUNCIONAIS

3.10.1 Solubilidade proteica (S) e capacidade de retenção de água (CRA)

A solubilidade proteica é um pré-requisito para muitas propriedades funcionais,

incluindo a gelificação e emulsificação (KRISTINSSON et al., 2005). A Figura 7, apresenta a

S (7a) e a CRA (7b) do IPC e da PMC, respectivamente. As solubilidades mínimas, foram

50

10

15

20

30

40

60

70

PMC IPC P

o

kDa

220

90

104

observadas nos pH’s 5 e 7, ambas amostras estudadas. Entretanto, as solubilidades máximas,

foram observadas em pH 3 e 11. Contudo, a pH 11, o IPC apresentou uma solubilidade

superior (94%) em relação a PMC (70,1%) (p < 0,05).

Figura 7 - Solubilidade proteica (a) e capacidade de retenção de água (b) do isolado

proteico e da proteína miofibrilar da castanha

a

Dados expressos como valores médios (média ± desvio padrão, n=3). Letras minúsculas iguais em diferentes

colunas, indicam que não há diferenças significativas (p > 0,05).

Foh et al. (2012), verificaram que o isolado proteico do músculo de tilápia

(Oreochromis niloticus), apresentou uma solubilidade superior a 60%, em pH 3, com a

solubilidade mais elevada sendo alcançada utilizando solubilização alcalina (81,3%). Estes

autores verificaram que a solubilidade foi baixa entre os pH’s 4,5 e 5,5, porém mais elevada

em pH’s 2 e 3, e em pH’s 11 e 12. Segundo Kristinsson e Hultin (2003) os tratamentos ácidos

e alcalinos, são conhecidos por solubilizar as proteínas musculares, indicando que a

solubilidade elevada do IPC foi obtida, em relação a PMC proveniente do processo de

sucessivas lavagens, devido a essa característica. Segundo Kristinsson et al. (2005), a maior

solubilidade é verificada em pH extremos e pode ser atribuída ao aumento da carga positiva

ou negativa da proteína, conduzindo a repulsão eletrostática entre as mesmas, resultando em

maior interação proteína-água. Segundo Foh et al. (2012), a avaliação da solubilidade proteica

em diferentes pH’s, pode informar o comportamento dos isolados proteicos quando

incorporados em sistemas alimentares.

Segundo Kristinsson et al. (2005), a CRA está relacionada com as propriedades,

tais como a textura, a viscosidade e a aderência. O IPC e a PMC, apresentaram CRA mínimas

de 4,07 g de água/g de proteína e 4,17 g de água/g de proteína em pH 5 (Figura 7b),

respectivamente. Em pH 11, a CRA do IPC (15,80 g de água/g de proteína) foi

a b

(a) (b) (a) (b)

105

significativamente superior (p < 0,05), ao verificado para a PMC (9,80 g de água/g de

proteína) (p < 0,05). Segundo Liu et al (2010) em proteínas desnaturadas o -CO- e o –NH,

tornam-se centros de polarização positivos e negativos nas cadeias polipeptídicas,

respectivamente. Estes centros podem formar um sistema de água de múltiplas camadas, e as

ligações de hidrogênio entre proteínas, podem contribuir para o aprisionamento da água livre

pela estrutura. O presente estudo constatou, que a energia requerida para a desnaturação

térmica do IPC, a qual foi verificada na análise de DSC foi inferior em relação a PMC, como

apresentou a Tabela 2. A PMC apresentou maior ΔHtotal (1,87 J/g) em relação ao IPC (0,33

J/g). Estes dados sugerem, que a PMC requer mais energia para a desnaturação térmica, pois o

processo utilizado para a obtenção da mesma não inclui um tratamento alcalino-ácido severo.

Desta forma, a estrutura parcialmente desnaturada do IPC contribui para a CRA. De acordo

com alguns autores (LIU et al, 2010; TAHERGORABI et al., 2014) acima do ponto

isoelétrico, a miosina absorve um grande volume de água, devido a presença de diversos

grupos carregados e forças repulsivas. Em valores de pH’s próximos ao ponto isoelétrico, as

proteínas tendem a coagular, devido ao aumento das interações proteína-proteína. Entretanto,

a hidratação da proteína torna-se fraca gradualmente, devido às alterações nos estados de

hidratação dos aminoácidos carregados, diminuindo a sua interação com água e também a

CRA. Neste estudo, o mesmo comportamento foi verificado para a CRA em valores de pH

extremos, tais como 3 e 11. Contudo, o IPC apresentou a CRA superior a encontrada para a

PMC para o mesmo pH. Nolsøe e Undeland (2009) verificaram que as proteínas de espécies

aquáticas, recuperadas por solubilização/precipitação proteica, apresentaram hidrofobicidade

de superfície aumentada e grupos - SH reativos. Portanto, acredita-se que o desdobramento

induzido pelo pH, durante a solubilização/precipitação proteica, contribui para a

funcionalidade das proteínas recuperadas, tais como o aumento da CRA, a capacidade de

formação de gel e emulsificação.

4 CONCLUSÃO

As propriedades funcionais, térmicas e físico-químicas das proteínas miofibrilares

e isoladas da castanha foram avaliadas. Os resultados revelaram que o IPC apresentou maior

teor de proteínas, intensidade de coloração (vermelha, amarela), solubilidade e capacidade de

retenção de água e um menor teor de lipídios, luminosidade, aminoácidos polares e perda de

massa e baixa entalpia total de desnaturação em relação a PMC. Contudo, o IPC e a PMC não

106

apresentaram diferenças significativas na digestibilidade, e os espectros de infravermelho

mostraram bandas de proteínas semelhantes. A microscopia eletrônica de varredura, indicou

que a IPC apresentou estruturas multicamadas em relação à PMC. Esses resultados sugerem,

que essas mudanças podem ser, em grande parte, influenciadas pelo tratamento alcalino. A

solubilização/precipitação isoelétrica, recuperou proteínas com características fortemente

funcionais, em relação aquelas recuperadas pelo processo de sucessivas lavagens.


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110

ARTIGO II

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIMICROBIANA APRESENTADA POR

HIDROLISADOS PROTEICOS OBTIDOS DE PROTEÍNAS RECUPERADAS DO

MÚSCULO DA CASTANHA (Umbrina canosai)

111

RESUMO

O objetivo do presente estudo, foi a obtenção de hidrolisados a partir de isolado proteico

(IPC) e proteína miofibrilar (PMC) da castanha (Umbrina canosai), em diferentes graus de

hidrólise-GH (10 e 20%) utilizando as enzimas Alcalase e Protamex. Para tanto, os mesmos

foram caracterizados quanto a seu perfil de massa molecular (MM), composição aminoacídica

e propriedades antioxidantes in vitro, através de quatro métodos, e antimicrobiana frente a 26

microrganismos em diferentes concentrações (1,25; 2,50; 5,0 e 7,50 mg/mL). Em geral, o

acréscimo no GH, resultou em maior conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos e aromáticos,

além de uma diminuição da MM média. A enzima e a matéria-prima utilizada, influenciaram

no teor de aminoácidos e da MM média determinados. Além disso, em um mesmo GH e

enzima, a PMC apresentou menor MM média que o IPC. O hidrolisado de IPC com GH de

20% com a Alcalase, apresentou a maior capacidade de capturar o radical ABTS·+

(62,79 mg

de AEVC/g de amostra), quelação e redução do ferro (20,09 µmol FeSO4.7H2O/g amostra).

Entretanto, os tratamentos hidrolisados pela Protamex apresentaram maior sequestro do

radical livre DPPH•. Além disso, o GH e MM média influenciaram na atividade antioxidante.

De todos os micro-organismos avaliados, apenas 7 foram inibidos, sendo a maioria Gram-

positivos. Não foi verificada influência da concentração na inibição dos mesmos, sendo que

os tratamentos com maior potencial de inibição microbiana foram hidrolisados pela Alcalase.

Os hidrolisados proteicos obtidos, ofereceram uso potencial como antimicrobiano e

antioxidante.

Palavras-chave: pescado, hidrolisado, propriedades, grau de hidrólise, enzima.

112

1 INTRODUÇÃO

A oxidação lipídica e a multiplicação microbiana são as principais causas dos

processos de deterioração em alimentos, levando a perda da qualidade nutricional e a

formação de produtos potencialmente tóxicos. Além disso, a oxidação é conhecida por ser a

causa de muitas doenças humanas, tais como as desordens neurológicas, cardiovasculares,

hipertensão, câncer, diabetes, Alzheimer entre outras (CHALAMAIAH et al., 2012; GÓMEZ-

ESTACA et al., 2014; HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2014; NAJAFIAN; BABJI, 2012). A

multiplicação microbiana, também causa problemas associados a doenças transmitidas por

alimentos (DTA). Segundo a Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde

(SVS/MS), no Brasil entre os anos 2000 e 2014 foram registrados 1.948.144 de pessoas

expostas a surtos de DTA, tendo como os principais agentes etiológicos a Salmonella spp.,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli entre outros (BRASIL, 2014).

As espécies reativas de oxigênio (ERO) e os radicais livres são gerados no

decorrer das atividades fisiológicas normais, em especial durante a respiração celular em seres

humanos e outros organismos aeróbios. Essas espécies, possuem elétrons desemparelhados e

reagem com elétrons de moléculas vizinhas causando dano oxidativo e lesão nas células ou

tecidos (CHALAMAIAH et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012). A oxidação de óleos e

gorduras nos alimentos durante o processamento, transporte e armazenamento leva à

produção de produtos indesejáveis, que causam o ranço nos alimentos, bem como alteração na

coloração dos mesmos (GIRGIH et al., 2015; SARMADI; ISMAIL, 2010). O uso de

compostos antioxidantes pode remover radicais livres, impedindo ou retardando o processo de

oxidação dos componentes celulares, melhorando a estabilidade lipídica. Antioxidantes

sintéticos como o butil hidroxianisol (BHA) e o butil hidroxitolueno (BHT), são adicionados

aos produtos alimentares para retardar a oxidação de lipídios, embora a utilização desses

aditivos esteja sob regulamentação rigorosa devido a alguns efeitos tóxicos (SARMADI;

ISMAIL, 2010; UMAYAPARVATHI et al., 2014).

O controle de patógenos nos alimentos é um problema constante nas indústrias,

devido a isso diversos métodos de prevenção da multiplicação desses estão sendo utilizadas

em alimentos, incluindo o uso de agentes antimicrobianos sintéticos e naturais. Além disso,

devido ao uso extensivo de antibióticos, conservantes e a resistência de muitas bactérias, essas

tornaram-se amaeça a saúde dos indivíduos. A resistência bacteriana ocorre, principalmente,

pela mutação de um ou mais genes associados a eliminação das toxinas, tornando as bactérias

resistentes a agentes antimicrobianos convencionais (SILA et al., 2014).

113

Devido aos problemas relacionados aos antimicrobianos e antioxidantes

sintéticos, nos últimos anos foram realizados diversos estudos (ALEMÁN; GÓMEZ-

GUILLÉN; MONTERO, 2013; SILA et al., 2014a, 2014b) buscando compostos naturais, que

possuam essas propriedades bioativas, tais como os peptídeos bioativos provenientes de

diversas fontes entre elas, o pescado. Segundo Gómez-Guillén et al. (2011), as proteínas

possuem peptídeos biologicamente ativos, que são inativos dentro da sequência proteica, mas

podem ser liberados durante a digestão gastrointestinal, processamento dos alimentos e

processos como a hidrólise enzimática. A castanha (Umbrina canosai) é uma espécie de

pescado amplamente disponível no litoral sul do Brasil. Segundo Lempek, Martins e Prentice

(2007), essa espécie é subutilizada e possui baixo valor comercial. Entretanto, devido ao seu

conteúdo proteico, desperta o interesse pela obtenção de produtos com elevado valor agregado

como os hidrolisados proteicos. Em face disso, os objetivos do presente estudos foram: (i) a

obtenção de hidrolisados proteicos provenientes de proteínas recuperadas de castanha, pelo

método de variação do pH ou através de sucessivas lavagens, com diferentes graus de

hidrólise, utilizando as proteases comerciais Alcalase e Protamex e (ii) avaliar as atividades

antioxidante e antimicrobiana dos diferentes tratamentos.


2.1 MATERIAL

2.1.2 Matéria-prima

O isolado proteico de castanha (IPC) e a proteína miofibrilar de castanha (PMC),

foram obtidos no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio

Grande – FURG. O IPC foi elaborado através do método de variação de pH, segundo Nolsøe

e Undeland (2009), com modificações, como se apresentou na Figura 1 do Artigo I. O

músculo de castanha foi homogeneizado, em água destilada na proporção 1:9 (p/v). A

solubilização alcalina foi realizada em pH 11,2 (NaOH 1 M) durante 20 min a 4 °C sob

agitação constante. Após, as amostras foram centrifugadas a 9000 x g durante 20 min a 4 °C.

O pH das proteínas solúveis, foi ajustado em pH 5,0 (HCl 1 M) durante 20 min a 4 °C sob

agitação constante. Após, as amostras foram centrifugadas, a 9000 x g durante 20 min a 4 °C.

O precipitado, isolado proteico úmido, foi liofilizado em liofolizador (Liotop, L108, São

114



armazenado a – 18 °C até o momento de uso. O IPC foi analisado em triplicata, para avaliar a

sua composição proximal segundo método descrito pela AOAC (2000), o qual apresentou um

teor de 92,1% de proteína, 2,2% de umidade, 1,2% de lipídios, 1,5% de cinzas.

A PMC foi obtida através de sucessivas lavagens em água destilada e solução

salina, segundo método descrito por Limpan et al. (2010), com modificações, como se

apresentou na Figura 2 do Artigo I. O músculo de castanha foi homogeneizado em água

destilada na proporção 1:3 (p/v) a 4 °C, 13.000 rpm em agitador eixo-hélice (Fisatom, 712,

São Paulo, Brasil) durante 2 min, seguido por filtração em filtro de nylon. Então, foi

homogeneizado em NaCl (50 mM na proporção 1:5 (p/v) a 4 °C, 13.000 rpm em agitador

eixo-hélice (Fisatom, 712, São Paulo, Brasil), durante 5 min e filtrado em filtro de nylon. Esse

processo foi realizado duas vezes. Em seguida, a PMC úmida, foi liofilizada em liofolizador

(Liotop, L108, São Carlos, Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h, fracionada em moinho de

facas (Tecnal, TE-633, Piracicaba, Brasil), peneirada em malha de 42 mesh e armazenada a -

18 °C até o momento do uso. A PMC foi analisada em triplicata, para avaliar a sua

composição proximal segundo método descrito pela AOAC (2000), a qual apresentou um teor

de 88,7% de proteína, 2,0% de umidade, 3,9% de lipídios e 3,3% de cinzas.

2.2 ENZIMAS

As enzimas utilizadas, foram a Alcalase - 2,4 L (3.4.21.62); uma endopeptidase

bacteriana produzida a partir da fermentação submersa do Bacillus licheniformis, fornecida

pela Novozymes Latin America (Araucária – Paraná); e a Protamex (EC 3.4.21.62; EC

3.4.24.28) uma mistura de exo- e endopeptidases bacterianas, produzida a partir do Bacillus

sp., adquirida da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Estados Unidos). Os demais reagentes

utilizados, foram de grau analítico (P.A.).

2.3 OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTEICOS

As hidrólises enzimáticas do IPC ou da PMC, foram realizadas segundo método

descrito por Liu et al. (2014), Raghavan e Kristinsson (2009) e acompanhadas pelo método de

115

pH-stat, com modificações. A Figura 1, apresenta o fluxograma do processo de obtenção dos

hidrolisados proteicos provenientes da castanha.

Figura 1 - Fluxograma do processo de obtenção dos hidrolisados proteicos provenientes da

castanha (U. canosai)

Tanto o IPC como a PMC, foram homogeneizados em água destilada na

proporção de 2% (p/v; proteína/água destilada), em reator de vidro encamisado acoplado de

banho ultratermostático (Quimis, Q212S, Diadema, Brasil), sob agitação constante em

agitador (Marconi, Piracicaba, Brasil) a 300 rpm. As condições das dispersões proteicas,

foram ajustadas nos parâmetros ótimos para cada enzima: Alcalase (pH: 8 e temperatura 50

°C) e Protamex (pH:7 e temperatura 50 °C), durante 10 min. A hidrólise enzimática iniciou-se

através da adição da enzima na proporção de 30 U/g proteína, segundo a atividade específica

de cada enzima [13,3 U/mg de proteína (Alcalase) e 14 U/mg de proteína (Protamex)]

determinada pelo método descrito pela Sigma (2013), Anexo I, a qual utiliza caseína como

NaOH (1M) Homogeneização II

Enzima 30 U/g

IPC ou PMC

Homogeneização I

Hidrólise enzimática

Inativação térmica

Fração insolúvel

Liofilização Água

Hidrolisado proteico

Água destilada

Centrifugação

90 °C/10 min

116

substrato. O grau de hidrólise (GH) foi monitorado segundo a Equação 1 de Adler-Nissen

(1986):

Onde, B é o volume da base consumida durante a hidrólise, para manter o pH constante (mL);

NB é a normalidade corrigida da base; htot é o número de ligações peptidicas (moles equiv/kg)

para pescado este valor é 8,6 moles equiv/kg (ADLER-NISSEN, 1986); MP é a massa de

proteína (g, determinado em N x fator de Kjeldahl – 6,25); e α é o grau de dissociação, o qual

foi determinado segundo a Equação 2 de Adler-Nissen (1986):

Onde, pH é o pH ótimo de cada enzima utilizada para a hidrólise; pKa é a constante de

dissociação, a qual foi determinada de acordo com a temperatura utilizada para a hidrólise

enzimática segundo a Equação 3, de acordo com Steinhart e Beychok (1964 citado por

KRISTINSSON; RASCO, 2000).

Onde, T é a temperatura em Kelvin.

A hidrólise enzimática do IPC ou PMC, utilizando as enzimas Alcalase e

Protamex, foi conduzida até que o GH desejado fosse atingido (10 ou 20%). Esses GH foram

estudados, com base em estudos preliminares de algumas bioatividades apresentadas por

diferentes hidrolisados. As enzimas foram inativadas, pelo aquecimento da suspensão a 90 °C

durante 10 min. Os hidrolisados foram centrifugados a 9000 x g durante 20 min a 4 °C, para

separar as frações solúvel (hidrolisado) e insolúvel. A fração solúvel, foi seca em liofolizador

GH( ) B x NB

α x htot x 100 (1)

α 10

pH-pKa

1+ 10pH-pKa

(2)

pKa 7,8 (298-T)

(298 x T) x 2400 (3)

117

(Liotop, L108, São Carlos, Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h e armazenadas em frascos

de polietileno a -18 °C. Foram obtidas oito amostras de hidrolisados, elaboradas por

diferentes tratamentos: 1: hidrolisado de IPC com Alcalase com GH de 10% (HIPA1); 2:

hidrolisado de IPC com Alcalase com GH de 20% (HIPA2); 3: hidrolisado de PMC com

Alcalase com GH de 10% (HPMA1). 4: hidrolisado de PMC com Alcalase com GH de 20%

(HPMA2); 5: hidrolisado de IPC com Protamex com GH de 10% (HIPP1); 6. Hidrolisado de

IPC com Protamex com GH de 20% (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com Protamex com GH

de 10% (HPMP1) e 8: hidrolisado de PMC com Protamex com GH de 20% (HPMP2). As

cinéticas de hidrólise estão no Apêndice I.

2.4 COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS

A composição dos aminoácidos foi realizada em triplicata, segundo o método

descrito por Giménez et al. (2009b), com adaptações. As diferentes amostras dos hidrolisados

liofilizados, foram homogeneizadas em água destilada na concentração de 5mg/mL. Uma

alíquota de 20 µL de amostra foi seca e hidrolisada em tubos de vidro, selados a vácuo a 110

± 2 °C durante 24 h, na presença de HCl 6 M contendo 0,1% de fenol. Como padrão interno,

foi utilizada a Norleucina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Estados Unidos). Após a hidrólise, as

amostras foram secas a vácuo, homogeneizadas em solução tampão de aplicação e injetadas

em analisador de aminoácidos (Biochrom 20, Pharmacia, Barcelona, Espanha).

2.5 PERFIL DE MASSA MOLECULAR

O perfil de massa molecular (MM) média de cada amostra de hidrolisado, foi

obtido segundo o método descrito por Sila et al. (2015), por exclusão de tamanho em

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em cromatógrafo (SPE-MA10AVP,

Shimadzu, Kyoto, Japão). A coluna utilizada foi a Superdex para peptídeos (PC 3.2/30) (GE

Healthcare Bio Sciences, Barcelona, Espanha), com um fracionamento entre 7000 Da e 100

Da. O volume de injeção foi de 10 µL e o fluxo foi de 25 µL/min. Como fase móvel, foi

utilizada a acetonitrila (30%, v/v) contendo 0,01% de ácido trifluoroacético - TFA (v/v) e a

densidade ótica foi avaliada em 214 nm. Como padrões de massa molecular, foram utilizadas:

118

a albumina de soro bovino (ASB, 6700 Da), aprotinina (6512 Da), vitamina B12 (1340 Da),

hipuril-histidil-Ieucina (HHL, 429 Da) e glicina (75 Da).

2.6 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES BIOATIVAS DOS HIDROLISADOS

As propriedades bioativas dos hidrolisados, foram avaliadas no Instituto de

Ciência e Tecnologia de Alimentos e Nutrição – ICTAN/CSIC, em Madri, Espanha,

utilizando diferentes métodos analíticos descritos a seguir.



(2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)

A capacidade de captura do radical catiônico ABTS·+

pelos hidrolisados, foi

avaliada segundo método descrito por Re et al. (1999), com modificações. A solução estoque

do radical ABTS·+

, foi elaborada a partir de uma solução de ABTS (7 mM) em persulfato de

potássio (2,45 mM), mantida no escuro durante 16 h a temperatura ambiente. Uma alíquota da

solução estoque foi diluída em água destilada, até alcançar a absorbância de 0,70 ± 0,02 a 734

nm, sendo esta a solução de trabalho. Os hidrolisados foram diluídos em água destilada a uma

concentração de 20 mg/mL e após as amostras foram diluídas 10 vezes. Alíquotas de 20 µL

das amostras, foram homogeneizadas em 980 µL da solução de trabalho do radical ABTS·+

.

Em seguida, foram incubadas em banho-maria durante 10 min a 37 °C e após a redução na

absorbância a 734 nm foi avaliada em espectrofotômetro (Shimadzu, CPS-240, Kyoto, Japão).

Uma curva padrão de ácido ascórbico - vitamina C (0,02 – 0,2 mg/mL), a qual relaciona a

concentração de vitamina C com a redução de absorbância, foi realizada. A capacidade

antioxidante, foi expressa como atividade antioxidante equivalente à vitamina C – AEVC (mg

AEVC / g de amostra). As determinações foram realizadas em triplicata.

2.6.1.2 Capacidade de redução do ferro (FRAP)

A capacidade de reduzir o íon férrico (Fe3+

) dos hidrolisados foi determinada

segundo método descrito por Pulido, Bravo e Saura-Calixto (2000). O método FRAP está

baseado no acréscimo da absorbância a 595 nm, devido a formação de um complexo

119

tripiridiltriazina (TPTZ) – Fe (II), na presença de agente de redução a 37 °C. A solução de

trabalho, foi elaborada através da homogeneização de 25 mL de tampão acetato – pH 3,6 (300

mM), 2,5 mL da solução TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) 10 mM e 2,5 mL de FeCl3 (20

mM). A solução foi homogeneizada e armazenada a 37 °C durante 30 min. Os hidrolisados

foram diluídos em água destilada a uma concentração de 20 mg/mL. Alíquotas de 30 µL das

amostras foram homogeneizadas em 90 µL de água destilada e 900 µL da solução de trabalho.

A absorbância a 595 nm, foi mensurada em espectrofotômetro (Shimadzu, CPS-240, Kyoto,

Japan), após a incubação no escuro em banho-maria a 37 °C durante 30 min. Uma curva

padrão de FeSO4.7H2O (0,1 – 1 µM), a qual relaciona a concentração de FeSO4.7H2O (µM)

com a absorbância a 595 nm foi plotada. Os resultados foram expressos como equivalente de

FeSO4.7H2O (µM)/ g de amostra. As determinações foram realizadas em triplicata.

2.6.1.3 Capacidade de quelação dos metais

A capacidade de quelação do Fe2+

dos hidrolisados, foi avaliada segundo método

descrito por Chung et al. (2002) e Giménez et al. (2009a), com adaptações. Os hidrolisados

foram testados na concentração de 50, 25 e 5 mg/mL em água Milli-Q. Para a reação, foram

homogeneizados 800 µL das amostras, 10 µL de FeCl2 (2 mM) e 20 µL de ferrozina (5 mM) e

deixados em repouso a temperatura ambiente durante 10 min. Como controle, foi utilizado

800 µL de água Milli-Q, 10 µL de FeCl2 (2 mM) e 20 µL de ferrozina (5 mM). As

determinações foram realizadas em triplicata. A leitura da absorbância foi realizada em

espectrofotômetro (Shimadzu, CPS-240, Kyoto, Japan) a 562 nm. A capacidade de quelação

(%) foi calculada segundo a Equação 4:

Onde: Abscontrole é a absorbância dos reagentes; Absamostra é absorbância das amostras dos

hidrolisados.

Capacidade de quelação ( ) [1- (Absamostra

Abscontrole

)] x 100 (4)

120

2.6.1.4 Sequestro do radical livre DPPH• (2,2–Difenil–1–picrilhidrazila)

O sequestro do radical livre DPPH• (SRL) pelos hidrolisados, foi determinado

segundo método descrito por Yen e Hsieh (1995) e Memarpoor-Yazdi, Asoodeh e Chamani

(2012), com adaptações. Inicialmente, 200 µL de amostra de hidrolisado, previamente

homogeneizado em água destilada, foi homogeneizado em 600 µL de metanol (P.A) e 200 µL

de DPPH (0,15 mM em metanol) durante 2 min. A dispersão foi mantida no escuro durante 30

min a temperatura ambiente. A absorbância foi mensurada em triplicata a 517 nm, em

espectrofotômetro (Biospectro, SP-22, Brasil). Como controle, foi adicionado 200 µL de água

destilada, 600 µL de metanol e 200 µL de DPPH (0,15 mM). As amostras foram testadas a

uma concentração final no tubo de 10, 5 e 2,5 mg/mL. O SRL (%) foi calculado segundo a

Equação 5:

Onde: Abscontrole é a absorbância dos reagentes; Absamostra é absorbância das amostras dos

hidrolisados.


A atividade antimicrobiana foi realizada pelo teste de ágar difusão, segundo

método descrito por Gómez-Guillén et al. (2010), frente a 26 cepas de micro-organismos da

coleção do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos e Nutrição – ICTAN/CSIC, Madri,

Espanha. Os testes preliminares foram elaborados com a concentração de 5 mg/mL e as

Figuras da inibição estão expostas no Apêndice II. A Tabela 1 apresenta as cepas dos micro-

organismos e as condições de cultivos que foram utilizados. As cepas foram armazenadas a -

80 °C em caldo infusão de coração e cérebro - BHI (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) com

25% de glicerol (Panreac, Barcelona, Espanha) até à sua utilização.

SRL ( ) [(Abscontrole - Absamostra)

Abscontrole

] x 100 (5)

121

Tabela 1 - Cepas microbianas e condições de cultivo utilizados para avaliação da atividade

antimicrobiana dos diferentes hidrolisados proteicos

PDA: ágar batata dextrose; BHI: ágar Brain Heart Infusion; MRS: ágar Lactobacillus; *AN: anaerobiose; **

CO2: condições controladas de CO2.

Micro-organismos Certificado ID Meio de cultivo

Temperatura

de incubação

(°C)

Aeromonas hydrophila CECT 839T AH BHI 30

Aspergillus niger CECT 2088 AN PDA 30

Bacillus cereus CECT 148 BC PDA 37

Bifidobacterium bifidum DSMZ 20215 BB BHI *AN 37

Brochothrix thermosphacta CECT 847 BT BHI 20 - 25

Citrobacter freuduii CECT 401 CF BHI 37

Clostridium perfringes CECT 486 CP BHI *AN 37

Debaryomyces hanseii CECT 11364 GH BHI (3% NaCl) 20

Enterococcus faecium DSM 20477 EF BHI 37

Escherichia coli CECT 515 EC BHI 37

Lactobacillus acidophilus CECT 903 LA MRS ** CO2

Lactobacillus helveticus DSM 20075 LH BHI 37

Listeria innocua CECT 910 LI BHI 37

Listeria monocytogenes CECT 4032 LM BHI 37

Photobacterium

phosphoreum

CECT 4191 PP BHI (1% NaCl) 15

Pseudomonas fluorescens CECT 4898 PF BHI 30

Salmonella cholerasuis CECT 4300 SC BHI 37

Shewanella putrefaciens CECT 5346 T SP BHI 30

Shigella sonnei CECT 4887 SS BHI 37

Staphylococcus aureus CECT 240 SA BHI 37

Vibrio parahaemolyticus CECT 511 T VP BHI (3% NaCl) 37

Yersinia enterecolitica CECT 4315 YE BHI 37

Penicillium expansum DSMZ 62841 PE PDA 30

Colletotrichum

lindemuthianum

CECT 2119 CL PDA 25

Mucor rouxii CECT 2655 MR PDA 25

Fusarium oxysporum CECT 2869 FOX PDA 25

122

A avaliação da atividade antimicrobiana, foi realizada em placas de Petri

descartáveis contendo o ágar descrito para cada micro-organismo, Tabela 1, nas quais foram

inoculados 100 µL das suspensões microbianas (~ 106 UFC/mL) e espalhados com alça de

Drigalski estéril. Em seguida, foram adicionados 40 µL das diferentes amostras em diferentes

concentrações de 1,25; 2,5; 5,0 e 7,5 mg/mL, em discos estéreis de papel filtro (0,5 cm de

diâmetro). Como controles, foram utilizados a Polilisina e a Nisina (Nisaplin, DuPont,

Danisco), nas mesmas concentrações que as amostras dos hidrolisados. Estes discos foram

colocados no ágar inoculado, com auxílio de uma pinça estéril. As placas foram incubadas

durante 24 h, nas mesmas condições de temperatura e atmosfera descritas para o cultivo,

Tabela 1. Após a incubação, o diâmetro da zona de inibição (halo) foi mensurado em

quadruplicata pelo Software Corel Draw X6. As determinações foram realizadas em

quadruplicata e os resultados foram expressos em mm de inibição.


Os resultados da composição aminoacídica, das propriedades antimicrobianas e

antioxidantes, foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas

pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. Os dados foram avaliados pelo programa

Statistica (versão 5.0, por StatSoft, Inc., Tulsa, Estados Unidos).



As propriedades biológicas e nutricionais dos hidrolisados, resultam diretamente

da sua composição de aminoácidos e peptídeos, do perfil de massa molecular entre outros

(CHALAMAIAH et al., 2012; DI BERNARDINI et al., 2011; ROBERT et al., 2015). A

Tabela 2 apresenta a composição de aminoácidos das oito amostras de hidrolisados, obtidas

por diferentes tratamentos. Independentemente da matéria-prima (IPC ou PMC), do GH (10

ou 20%) ou da enzima (Alcalase e Protamex) utilizada, todas as amostras apresentaram como

aminoácidos presentes em maior quantidade o ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina,

leucina, arginina e alanina. Isto está de acordo com Khantaphant, Benjakul e Kishimura

(2011), que em seus estudos com hidrolisados proteicos de músculo de lúcio

123

Tabela 2 - Composição aminoacídica dos diferentes hidrolisados proteicos

Aminoácido Composição de aminoácidos (mg de aminoácidos/g de proteína)

1 2 3 4 5 6 7 8

Alanina (Ala) 59,40bcd

± 0,67 58,40cde

± 0,04 58,04de

± 1,14 57,18e ± 1,06 60,06

bc ± 0,36 62,31

a ± 0,35 60,93

ab ± 0,27 61,18

ab ± 0,06

Arginina (Arg) 60,85bc

± 0,08 61,01bc

± 0,46 62,06ab

± 1,25 63,28a ± 0,78 63,03

a ± 0,11 59,62

c ± 0,04 62,09

ab ± 0,08 57,83

d ± 0,13

Ác. Aspártico (Asp) 137,02a ± 1,10 136,93

a ± 0,38 131,28

d ± 1,11 132,61

cd ± 0,31 135,27

ab ± 0,70 136,73

a ± 0,60 133,70

bc ± 0,24 131,42

d ± 0,27

Cisteína (Cis) 4,40b ± 0,08 4,16

b ± 0,01 4,11

b ± 0,01 4,11

b ± 0,11 4,05

b ± 0,05 4,96

a ± 0,04 4,03

b ± 0,05 4,00

b ± 0,43

Ác. Glutâmico (Glu) 195,50b ± 1,91 188,60

c ± 1,37 196,16

b ± 2,37 190,66

c ± 1,48 200,50

a ± 0,22 196,19

b ± 0,33 201,20

a ± 0,43 198,25

ab ± 0,18

Glicina (Gli) 33,78b ± 0,61 35,87

a ± 0,28 32,62

c ± 0,64 33,40

bc ± 0,44 32,50

c ± 0,26 36,25

a ± 0,12 34,23

b ± 0,16 35,56

a ± 0,15

Histidina* (His) 24,81ab

± 1,38 24,66ab

± 0,14 24,69ab

± 0,47 24,91ab

± 0,53 23,28c ± 0,22 24,69

ab ± 0,10 23,00

b ± 0,03 26,39

a ± 1,32

Isoleucina* (Ile) 31,26a ± 0,33 31,00

a ± 0,09 31,46

a ± 1,24 31,14

a ± 0,57 29,21

b ± 0,32 26,24

c ± 0,09 28,76

b ± 0,10 25,42

c ± 0,11

Leucina* (Leu) 84,96a ± 0,13 83,96

ab ± 0,19 83,09

bc ± 1,03 82,35

cd ± 0,55 84,45

a ± 0,34 81,28

c ± 0,30 82,36

cd ± 0,13 78,84

e ± 0,13

Lisina* (Lis) 92,30c ± 7,23 96,07

bc ± 0,36 100,21

ab ± 1,35 98,58

abc ± 0,87 103,87

a ± 0,18 97,98

abc ± 0,05 101,41

ab ± 0,32 99,16

abc ± 0,40

Metionina*(Met) 39,78bc

± 0,31 41,68a ± 0,48 39,55

bc ± 0,57 40,34

b ± 0,28 37,80

d ± 0,31 39,33

c ± 0,21 39,14

c ± 0,03 39,49

bc ± 0,11

Fenilalanina*(Fen) 38,43c ± 1,27 38,67

c ± 0,01 38,42

c ± 0,70 39,71

bc ± 0,48 35,32

d ± 0,25 40,92

b ± 0,22 33,82

d ± 0,05 43,88

a ± 0,13

Prolina (Pro) 32,42cd

± 0,13 33,37bc

± 0,46 33,05bc

± 0,06 33,57b ± 0,58 31,11

e ± 0,06 31,71

de ± 0,45 34,88

a ± 0,46 32,95

bc ± 0,28

Serina (Ser) 46,00c ± 0,26 46,04

c ± 0,40 45,09

d ± 0,01 45,83

c ± 0,08 46,84

b ± 0,10 49,08

a ± 0,41 46,22

bc ± 0,30 49,72

a ± 0,02

Treonina (Tre) 45,85ab

± 0,08 45,38ab

± 0,62 46,01ab

± 1,31 46,50a ± 0,99 45,86

ab ± 0,40 44,54

b ± 0,15 45,86

ab ± 0,08 45,40

ab ± 0,01

Tirosina*(Tir) 36,30c ± 0,71 38,32

b ± 0,11 37,68

b ± 0,20 39,88

a ± 0,09 31,48

e ± 0,01 34,15

d ± 0,09 33,84

d ± 0,06 37,93

b ± 0,02

Valina*(Val) 37,00a ± 0,42 35,87

abc ± 0,02 36,47

ab ± 1,08 35,94

ab ± 0,32 35,39

bc ± 0,41 34,02

d ± 0,21 34,52

cd ± 0,01 32,58

e ± 0,46

AAH 363,91ab

± 1,50 365,44a ± 0,34 361,87

b ± 0,70 364,24

a ± 0,20 348,85

e ± 0,16 354,92

c ± 0,15 352,29

d ± 0,13 356,28

c ± 0,13

AAA 74,71cd

± 2,00 77,00c ± 0,11 76,10

cd ± 0,90 79,60

b ± 0,39 66,80

e ± 0,25 75,07

d ± 0,13 67,67

e ± 0,10 81,81

a ± 0,15

AACN 332,51abc

± ,01 325,53de

± 1,75 327,44cde

± 3,47 323,27e ± 1,79 335,77

a ± 0,47 332,92

ab ± 0,92 334,90

ab ± 0,19 329,67

bcd ±0,45

AACP 177,95c ± 5,93 181,74

bc ± 0,68 186,97

ab ± 2,13 186,76

ab ± 1,12 190,18

a ± 0,07 182,29

bc ± 0,09 186,50

ab ± 0,43 183,37

bc ± 0,80

*AAE 394,36 ab

± 4,98 390,23 ab

± 0,28 391,57 ab

± 2,78 392,86 ab

± 1,11 395,17 a ± 0,85 389,00

b ± 0,40 388,88

b ± 0,75 391,16

ab ± 0,92

1: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HIPA2); 3: Hidrolisado de PMC com

GH de 10% utilizando a Alcalase (HPMA1); 4: Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HPMA2); 5: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a

Protamex (HIPP1); 6: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Protamex (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Protamex (HPMP1); 8:

Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Protamex (HPMP2); AAH: aminoácidos hidrofóbicos (alanina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, prolina,

metionina e cisteína); AAA: aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina); AACP: aminoácidos carregados positivamente (arginina, histidina, lisina); AACN:

aminoácidos carregados negativamente (ácido aspártico, ácido glutâmico); *AAE: aminoácidos essenciais (fenilalanina, valina, treonina, isoleucina, metionina, histidina

leucina e lisina). Letras iguais na mesma linha indica que não há diferença significativa (p > 0,05).

124

marrom (Lutjanus vitta), verificaram que independente da enzima (Alcalase ou Flavourzyme)

utilizada no processo de hidrólise, os aminoácidos presentes em maior conteúdo foram ácido

glutâmico, ácido aspártico, lisina, alanina e leucina. Entretanto, segundo Chalamaiah et al.

(2012), muitos hidrolisados derivados de proteínas marinhas têm sido relatados por exibirem

variações na sua composição de aminoácidos, as quais dependem da matéria-prima, enzima e

condições de hidrólise. Esse comportamento foi verificado para os diferentes hidrolisados

obtidos nesse estudo.

A composição de aminoácidos é um aspecto importante a ser avaliado em

hidrolisados proteicos de pescado, pois o mesmo pode ser utilizado como uma potencial fonte

de proteína para formulações em dietas animais e humanas, com base em seu valor nutritivo e

elevado teor de aminoácidos essenciais (AAE) (FAO, 1999; SILVA et al., 2014). Segundo a

Food and Agriculture Organization – FAO (FAO, 1999) a quantidade de AAE recomendada

para os adultos é: 16 mg/gproteína de histidina, 13 mg/gproteína de valina, 17 mg/gproteína de

metionina, 13 mg/gproteína de isoleucina, 19 mg/gproteína de leucina, 19 mg/gproteína de

fenilalanina e 16 mg/gproteína de lisina, respectivamente. Todas as amostras de hidrolisados,

obtidas no presente estudo apresentaram um conteúdo desses aminoácidos superior ao

preconizado pela FAO. Eles poderiam ser fonte proteica suplementar, em uma dieta não

equilibrada.

Segundo alguns autores (LI et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012), os peptídeos

antimicrobianos possuem cerca de 50% de aminoácidos hidrofóbicos. Além disso, a presença

desses na sequência peptídica faz com que os hidrolisados tenham a capacidade de inibir a

peroxidação lipídica, pois possuem maior afinidade com as frações lipídicas das membranas

celulares e são mais reativos com os ácidos graxos poli-insaturados (RAJAPAKSE et al.,

2005). As amostras provenientes dos tratamentos 1 (HIPA1), 2 (HIPA2) e 4 (HPMA2),

apresentaram maior conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos (AAH) (p < 0,05). Foi verificado

para todas as amostras, com exceção da amostra 1 e 2, que o aumento de 10 para 20% no GH,

para as amostras hidrolisadas com as mesmas matérias-primas e enzimas, resultou em um

acréscimo no conteúdo de AAH (p < 0,05). Isso ocorre, pois a reação de hidrólise resulta na

exposição de grupos hidrofóbicos, os quais estavam protegidos na estrutura original da

proteína (PANYAM; KILARA, 1996). Segundo Panyam e Kilara (1996) as proteínas que

foram extensivamente hidrolisadas, podem apresentar sabor amargo devido à exposição e

acúmulo de cadeias laterais hidrofóbicas de aminoácidos de baixa massa molecular. A enzima

Alcalase, originou hidrolisados com um conteúdo significativamente superior (p < 0,05) de

AAH, em relação aos hidrolisados obtidos pelo uso da Protamex, com a mesma matéria-prima

125

e o mesmo GH. A Alcalase tem sido reportada como a enzima que possui afinidade em

hidrolisar resíduos de AAH (INTARASIRISAWAT et al., 2012; KLOMPONG et al., 2007).

Wiriyaphan, Chitsomboon e Yongsawadigul (2012) hidrolisaram subprodutos de surimi de

threadfin bream (Nemipterus furcosus) com diferentes enzimas: Alcalase, pepsina, tripsina e

Virgibacillus sp. SK33, onde verificaram que os hidrolisados obtidos a partir da Alcalase,

apresentaram maior conteúdo de AAH em relação aos hidrolisados obtidos pelas demais

enzimas. A Alcalase é uma endoprotease, que possui ampla especificidade em relação a

resíduos aromáticos (Fen e Tir), ácidos (Glu), sulfúricos (Met e Cis), alifáticos (Leu e Ala),

básicos (Lis) dentre outros (DOUCET et al., 2003; WIRIYAPHAN; CHITSOMBOON;

YONGSAWADIGUL, 2012).

A presença de aminoácidos aromáticos (AAA) aumentou significativamente (p <

0,05) com o acréscimo do GH de 10 a 20%, para as amostras obtidas com a mesma matéria-

prima e enzima. Entretanto, esse aumento foi pronunciado nas amostras hidrolisadas com a

Protamex onde as amostras 7 e 8, de PMC com GH de 10 e 20%, apresentaram um acréscimo

de 67,67 para 81,81 mg/gproteína. A presença de AAA (Tir, Tri e Fen) é importante para a

atividade antioxidante, por exemplo, pois pode estabilizar as ERO, através da transferência

direta de elétrons, mantendo a sua estabilidade através de estruturas de ressonância. Além

disso, a Tir e Tri contêm grupos fenólicos e indólicos, os quais podem servir como doadores

de hidrogênio (QIAN; JUNG; KIM, 2008; WIRIYAPHAN; CHITSOMBOON;

YONGSAWADIGUL, 2012). Piotrowicz e Mellado (2015) elaboraram hidrolisados proteicos

a partir de carne mecanicamente separada de anchoita (Engraulis anchoita), utilizando as

enzimas Alcalase e Protamex, com um GH de 78,6 e 59,3%, respectivamente. Os mesmos

apresentaram um conteúdo de AAA de 75,45 e 71,18 mg/gproteína, respectivamente. O

conteúdo de AAA do presente estudo foi superior ao encontrado por Piotrowicz e Mellado

(2015), apesar do GH superior que os mesmos obtiveram.

Segundo Saiga, Tanabe e Nishimura (2003) os aminoácidos ácidos (Asp e Glu),

básicos (His, Lis e Arg), com grupos carboxila e amino nas cadeias laterais, desempenham

uma função importante na quelação de íons metálicos. O teor de aminoácidos carregados

negativamente – AACN (Asp e Glu), presentes nos hidrolisados proteicos obtidos nesse

estudo, diminuíram significativamente (p < 0,05) com o incremento no GH, para as amostras

1 e 2, de hidrolisados de IPC com GH de 10 e 20% utilizando a Alcalase, e para as amostras 7

e 8, de hidrolisados de PMC com GH de 10 e 20% utilizando a Protamex. Entretanto, para

diferentes enzimas, mesma matéria-prima e GH, foi observado um acréscimo significativo (p

< 0,05) no conteúdo de AACN para as amostras 2 - 6, 3 - 7 e 4 - 8, respectivamente.

126

Piotrowicz e Mellado (2015) encontraram um conteúdo de 279,58 e 286,57 mg/gproteína de

AACN, nos hidrolisados proteicos de anchoita obtidos pelo uso da Alcalase e Protamex,

respectivamente. Esses resultados foram inferiores aos encontrados neste estudo,

independentemente do substrato, enzima ou GH utilizado.

Segundo Li et al. (2012), Najafian e Babji (2012) os hidrolisados proteicos com

atividade antimicrobiana, geralmente, possuem aminoácidos catiônicos em sua composição.

No presente estudo, não foi encontrada uma influência significativa (p > 0,05) no teor de

aminoácidos carregados positivamente (AACP), devido à variação do GH para os

hidrolisados obtidos utilizando a mesma matéria-prima e enzima (amostras 1 - 2 e 3 - 4).

Entretanto, foi verificada uma tendência ao acréscimo no conteúdo de AACP, com o

incremento de 10 para 20% no GH, para a amostra hidrolisada de IPC utilizando a Alcalase

como enzima. O comportamento inverso foi observado para a amostra hidrolisada de PMC,

utilizando a Protamex como enzima, onde ocorreu uma diminuição no conteúdo de AACP

com o acréscimo no GH.


A Figura 2 apresenta o perfil de massa molecular (MM) média, dos diferentes

hidrolisados proteicos. A variação na MM média dos hidrolisados, revelou uma diferença no

grau de quebra das proteínas dependendo da enzima, GH e matéria-prima utilizada. As

amostras hidrolisadas pela Protamex (5; 6; 7 e 8), apresentaram um conteúdo de peptídeos

com uma MM média de 1921 Da, 1350 Da, 1845 Da e 1233 Da, como pode ser verificado nas

Figuras 2e, 2f, 2g e 2h, respectivamente. Esses valores foram superiores aos encontrados para

as amostras hidrolisadas com a Alcalase, com o mesmo GH e matéria-prima, as quais

apresentaram uma MM média de 1285 Da, 1083 Da, 1245 Da e 1066 Da para as amostras 1;

2; 3 e 4, como pode ser verificado nas Figuras 2a, 2b, 2c e 2d, respectivamente. Esses

resultados indicam, que a Alcalase foi efetiva na quebra das proteínas em relação à Protamex.

Liu et al. (2014), obtiveram hidrolisados a partir de subprodutos de surimi de carpa prateada

(Hypophthalmichthys molitrix), em diferentes GH (10, 20 e 30%), utilizando a Alcalase e

Protamex como catalisadores, onde verificaram que a MM dos hidrolisados com o mesmo

GH, produzidos pela Alcalase foi inferior, sugerindo a maior afinidade dessa pelo substrato.

127

Figura 2 - Perfil de massa molecular média dos diferentes hidrolisados proteicos

1: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a

Alcalase (HIPA2); 3: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HPMA1); 4: Hidrolisado de PMC com GH

de 20% utilizando a Alcalase (HPMA2); 5: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Protamex (HIPP1); 6:

Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Protamex (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a

Protamex (HPMP1); 8: Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Protamex (HPMP2).

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

128

A Protamex é um mistura de exo- e endopeptidases, caracterizada como uma

mistura de diferentes tipos catalíticos de metalo protease, serina protease, protease aspártica e

carboximetilpeptidase (BENÍTEZ; IBARZ; PAGAN, 2008). Nas proteases aspárticas, ácido

glutâmico e metalo proteases, o ataque nucleófilo é mediado por uma molécula de água,

ativada por dois resíduos de ácido aspártico, um resíduo de ácido glutâmico e por um íon

metálico, respectivamente (RAWLINGS; BARRETT; BATEMAN, 2010; TEIXEIRAS,

2011). Contudo, a Alcalase por ser uma serino protease, possui um resíduo aminoácido de

serina no sítio ativo, que atua como nucleófilo, não necessitando de um íon metálico para a

ativação do ataque nucleófilo como a Protamex (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA,

2010).

As enzimas Alcalase e Protamex, tendem a possuir maior afinidade pelo substrato

PMC. A hidrólise da PMC (GH 10 e 20%, Alcalase), resultou em peptídeos com MM média

de 1245 Da e 1066 Da, sendo esses valores inferiores aos encontrados para a hidrólise do IPC

(GH 10 e 20%, Alcalase) que foram de 1285 Da e 1083 Da, respectivamente, sendo o mesmo

comportamento observado para a Protamex. Segundo Silva, Fonseca e Prentice (2014), o

processo de isolamento proteico, pode resultar em alterações na estrutura proteica,

dificultando a ação das enzimas. Além disso, a PMC possui em sua constituição um conteúdo

superior de aminoácidos como ácido glutâmico, ácido aspártico e serina, como foi verificado

na composição aminoacídica do Artigo 1, em relação ao IPC. Esses aminoácidos são

essenciais para a reação de hidrólise, quando se utilizam proteases aspárticas, ácido

glutâmico, metalo proteases e serino proteases, respectivamente. Desta forma, a PMC é um

substrato atraente para a quebra das proteínas por essas enzimas (RAWLINGS; BARRETT;

BATEMAN, 2010; TEIXEIRAS, 2011).

O perfil de MM média indicou uma dependência na extensão de quebra das

proteínas, com o GH utilizado. O acréscimo no GH resultou em peptídeos de menor MM

média, para todas as amostras analisadas. Raghavan e Kristinsson (2009) elaboraram

hidrolisados de isolado proteico de tilápia (Oreochromis niloticus), em diferentes GH (7,5 e

25%), nos quais verificaram que o incremento no GH, contribuiu para a presença de peptídeos

com baixa MM. Robert et al. (2015) hidrolisaram subprodutos (cabeça, víscera, pedaços) de

tilápia (O. niloticus), a 22,1% de GH e encontraram peptídeos com as seguintes frações: >

2000 Da, 500 – 2000 Da e < 500 Da. Segundo os mesmos, esse perfil de MM está em

conformidade com o baixo GH alcançado, que apresenta proteínas pouco hidrolisadas.

Segundo Panyam e Kilara (1996), as proteínas extensivamente hidrolisadas resultam em uma

diminuição da MM dos peptídeos obtidos. Os hidrolisados com o maior GH são preferidos, a

129

fim de assegurar a presença de peptídeos pequenos, os quais têm sido relatados como potentes

antioxidantes (CHALAMAIAH et al., 2012; DI BERNARDINI et al., 2011; GARCÍA-

MORENO et al., 2014). Além disso, peptídeos com MM abaixo de 10 kDa, são comumente

relatados como potentes antimicrobianos (LI et al., 2012; NAJAFIAN; BABJI, 2012;

NARAYANA; CHEN, 2015).



A atividade antioxidante não pode ser atribuída a um único mecanismo, pois no

processo oxidativo existem diferentes tipos de radicais livres e formas de atuação,

dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a atividade antioxidante possa

ser medida precisa e quantitativamente (ALVES et al., 2010). Assim, foram realizados

diferentes ensaios tais como FRAP, ABTS, DPPH e quelação de metais para avaliar a

atividade antioxidante.


O radical ABTS·+ é capturado pelos antioxidantes, através da doação de um átomo

de hidrogênio, onde o mesmo é mensurado através de uma reação colorimétrica. O radical

possui uma coloração azul/verde, com absorção máxima a 734 nm. Uma reação positiva,

muda a intensidade da coloração da reação para verde claro, a qual é detectada pela

diminuição na absorbância, tanto para compostos hidrófilos como lipofílicos (CHI et al.,

2015; RE et al., 1999). A Figura 3 apresenta a atividade antioxidante, avaliada pelo método de

captura do radical ABTS·+ dos hidrolisados proteicos provenientes de IPC ou PMC.

Os resultados apresentados, revelaram que os hidrolisados de IPC e PMC contêm

peptídeos potencialmente doadores de átomos de hidrogênio, os quais podem interagir com os

radicais livres, convertendo-os em produtos estáveis, pois as diferentes amostras apresentaram

atividade antioxidante. A captura do radical ABTS·+

de todos os hidrolisados proteicos,

aumentou significativamente (p < 0,05) com o acréscimo no GH de 10 para 20%,

independentemente da matéria-prima e enzima utilizada. Segundo Raghavan, Kristinsson e

130

Leeuwenburgh (2008) a proteína isolada de tilápia (O. niloticus) hidrolisada, por diferentes

proteases, apresentou um aumento acentuado na captura do radical ABTS·+

quando o GH

aumentou de 18 para 23%. Khantaphant, Benjakul e Kishimura (2011), estudaram a influência

de diferentes GH (20, 30 e 40%) de hidrolisados do músculo de lúcio marrom (L. vitta)

elaborados com Alcalase, Flavourzyme e protease do ceco pilórico, sobre as atividades anti-

hipertensiva e antioxidante. Eles verificaram que a capacidade de captura do radical ABTS·+

,

aumentou significativamente (p < 0,05) com o acréscimo no GH das amostras hidrolisadas

com Alcalase e protease do ceco pilórico.

Figura 3 - Captura do radical ABTS•+

pelos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com

diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex

1: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20%

utilizando a Alcalase (HIPA2); 3: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HPMA1); 4:

Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HPMA2); 5: Hidrolisado de IPC com GH de 10%

utilizando a Protamex (HIPP1); 6: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Protamex (HIPP2); 7:

Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Protamex (HPMP1); 8: Hidrolisado de PMC com GH de 20%

utilizando a Protamex (HPMP2); Letras diferentes, indicam que há diferença significativa (p < 0,05); (Média ±

desvio-padrão).

Segundo Raghavan, Kristinsson e Leeuwenburgh (2008), os peptídeos de menor

MM, ou seja, com grau de extensão de quebra de proteínas elevado (maior GH), possuem

maior capacidade de sequestrar ERO geradas por células mononucleares. Contudo, Senphan e

Benjakul (2014) verificaram em seus estudos com hidrolisados proteicos de pele de robalo

(Lates calcarifer), em diferentes GH (10, 20, 30 e 40%), que a capacidade de captura do

radical ABTS·+

aumentou com o incremento no GH até 30%, mas não foi observado esse

131

comportamento, variando o GH de 30 para 40%. A extensa hidrólise enzimática de proteínas,

resulta na diminuição da atividade antioxidante devido ao elevado conteúdo de aminoácidos

livres (CHALAMAIAH et al., 2012)

A amostra 2, proveniente do tratamento do hidrolisado de IPC com GH de 20%

com a Alcalase (HIPA2), apresentou a maior capacidade de captura do radical ABTS·+

, de

aproximadamente 62,79 mg de AEVC/g de amostra, em relação aos demais tratamentos

analisados (p < 0,05). Essa amostra, apresentou um perfil de MM média baixo (1083 Da;

Figura 2b) e um conteúdo acentuado de AAH de aproximadamente 365,44 mg/gproteína (Tabela

2). Giménez et al. (2009) avaliaram a capacidade de captura do ABTS·+

de hidrolisados de

gelatina de pota (D. gigas), utilizando a Alcalase a um GH de 50%, onde verificaram uma

capacidade de aproximadamente 34,50 mg de AEVC/g de amostra, inferior ao encontrado no

presente estudo. Muitos autores (ALEMÁN et al., 2011c; GIMÉNEZ et al., 2009;

NAJAFIAN; BABJI, 2015; SONG et al., 2015) têm relatado que os AAH (Ala, Val, Iso, Leu,

Tir, Fen, Pro, Met e Cis) presentes na sequência peptídica, fazem com que os hidrolisados

tenham a capacidade de inibir a peroxidação lipídica, pois possuem maior solubilidade em

lipídios e são mais reativos com os ácidos graxos poli-insaturados. Alemán et al. (2011c)

hidrolisaram gelatina de pele de atum (Thunnus spp.), halibute (Hypoglossus spp.) e pota (D.

gigas), utilizando como enzima a Alcalase em GH de 25,5; 18,8 e 30,9%, respectivamente.

Eles verificaram que a capacidade de captura do radical ABTS·+

foi de aproximadamente 17;

14 e 30 mg de AEVC/g de amostra, respectivamente, inferior ao encontrado no presente

estudo para qualquer amostra de hidrolisado.

Segundo Wiriyaphan, Chitsomboon e Yongsawadigul (2012) os aminoácidos Tri,

Tir e His contêm grupos indólicos, fenólicos e imidazólicos, os quais são potentes doadores

de hidrogênio. No presente estudo, foi verificado que a PMC apresentou hidrolisados com

maior capacidade de captura do radical ABTS·+

, do que os hidrolisados do IPC para as

amostra hidrolisadas com a Protamex, em um mesmo GH. Isto pode ter ocorrido, pois esses

hidrolisados apresentaram maior conteúdo de Tir (p < 0,05), o que contribui na atividade

antioxidante avaliada. O conteúdo de His nos hidrolisados de IPC, utilizando a enzima

Alcalase em diferentes GH, não apresentou diferença significativa (p > 0,05). Entretanto, o

conteúdo de Tir foi significativamente superior (p < 0,05) para os hidrolisados da Alcalase da

PMC. Os hidrolisados proteicos da Alcalase, apresentaram maior capacidade de captura o

radical ABTS·+

(p < 0,05) em relação aos hidrolisados da Protamex, com o mesmo GH e

matéria-prima. Esses dados podem ser resultantes do conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos

(Tabela 2), os quais foram significativamente superiores (p < 0,05) nas amostras hidrolisadas

132

pela Alcalase em relação às amostras hidrolisadas pela Protamex. Além disso, o perfil de MM

média apresentou um conteúdo de peptídeos de baixa MM para as amostras hidrolisadas pela

Alcalase, potencializando a atividade antioxidante dessas amostras.

3.3.1.2 Capacidade de redução do ferro (FRAP)

A capacidade de redução do ferro, de um dado composto, pode servir como um

indicador significativo do seu potencial de atividade antioxidante. Um agente redutor, doador

de elétrons, é capaz de doar um elétron para um radical livre. Como resultado, o radical é

neutralizado e as espécies reduzidas adquirem um próton da solução (WANG et al., 2008). O

método de FRAP é, geralmente, utilizado para medir a capacidade de um composto reduzir o

complexo Fe3+

- TPTZ para o complexo Fe2+

- TPTZ, o qual é monitorado a 595 nm

(GIMÉNEZ et al., 2009a; KHANTAPHANT; BENJAKUL; GHOMI, 2011; SENPHAN;

BENJAKUL, 2014). A Figura 4 apresenta a capacidade de redução do ferro (FRAP), obtida

pelos diferentes hidrolisados.

Figura 4 - Capacidade de redução do ferro (FRAP) dos hidrolisados proteicos de IPC ou

PMC, com diferentes GH, preparados com a Alcalase e a Protamex






utilizando a Protamex (HPMP2); Letras diferentes, indicam que há diferença significativa (p < 0,05); (Média ±

desvio-padrão).

133

Os hidrolisados proteicos, elaborados com a mesma matéria-prima e enzima,

aumentaram a FRAP com o acréscimo no GH (p < 0,05), como foi verificado na Figura 4.

Khantaphant, Benjakul e Kishimura (2011) verificaram que o acréscimo no GH de 20 para

40% dos hidrolisados do músculo de lúcio marrom (L. vitta), elaborados com Alcalase,

Flavourzyme e a protease do ceco pilórico, resultou em maior FRAP (p < 0,05). Esses

resultados, comprovam que a hidrólise está diretamente relacionada com o aumento no poder

redutor, especialmente quando a clivagem dos peptídeos aumenta como indicativo do

acréscimo no GH (KHANTAPHANT; BENJAKUL; KISHIMURA, 2011). Segundo

Wiriyaphan et al. (2015), os hidrolisados proteicos que contêm peptídeos pequenos,

contribuem com a elevada FRAP. Estes podem expor uma quantidade superior de cadeias

laterais, as quais possuem a capacidade de doar elétrons e tornar-se mais acessível pelo

complexo Fe3+

- TPTZ. Isto foi verificado no presente estudo, quando comparadas as

amostras preparadas com a mesma matéria-prima e enzima, porém com GH diferente.

A amostra 8, hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Protamex

(HPMP2), apresentou a maior a FRAP 20,75 µmol FeSO4.7H2O/g amostra (p < 0,05).

Contudo, a amostra 2, hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HIPA2),

apresentou uma FRAP de 20,09 µmol FeSO4.7H2O/g amostra, porém significativamente

diferente (p < 0,05). Esses resultados sugerem que essas amostras, apresentam em sua

constituição maior conteúdo de compostos capazes de doar elétrons. Giménez et al. (2009)

avaliaram a FRAP de hidrolisados de gelatina de pota (D. gigas), com um GH de 50% e

utilizando a Alcalase como enzima, onde verificaram uma capacidade de aproximadamente

16,50 µmol FeSO4.7H2O/g amostra, inferior ao encontrado no presente estudo. Muitos autores

(QIAN; JUNG; KIM, 2008; WIRIYAPHAN; CHITSOMBOON; YONGSAWADIGUL,

2012) relataram que o conteúdo de AAA (Tir, Tri e Fen), é importante para a atividade

antioxidante, pois pode estabilizar as ERO, através da transferência de elétrons, mantendo a

sua estabilidade através de estruturas de ressonância. A amostra 8, apresentou em sua

constituição, um conteúdo elevado de AAA (81,81 mg/gproteína). Além disso, o conteúdo de

Fen dessa amostra, foi significativamente superior (p < 0,05) aos demais hidrolisados.

Segundo Klompong et al. (2007) o maior poder redutor, indica que os hidrolisados podem

doar um elétron aos radicais livres, conduzindo à prevenção ou retardamento da propagação

da oxidação.

A amostra 2, como foi citado anteriormente, possui um conteúdo elevado de AAH

(365,44 mg/gproteína) e esses aminoácidos são conhecidos como potentes antioxidantes. A

amostra 8, não apresentou uma MM média baixa, quando comparada a amostra 2, sugerindo

134

que nesse caso o que contribuiu significativamente para a FRAP foi a composição

aminoacídica. No mesmo GH e matéria-prima, os hidrolisados preparados com a Alcalase,

apresentaram maior FRAP (p < 0,05), com exceção da amostra 8, a qual apresentou maior

FRAP em relação a amostra 4. Senphan e Benjakul (2014) verificaram em seus estudos, que a

Alcalase resultou em hidrolisados de pele de robalo (L. calcarifer) com maior FRAP, em

relação aos hidrolisados obtidos utilizando uma enzima obtida do hepatopâncreas de camarão.

3.3.1.3 Capacidade de quelação de metais

Os metais de transição tais como Fe2+

e Cu2+

, podem catalisar a formação de

ERO, tais como o radical hidroxila (∙OH) e o ânion superóxido (O2-). O Fe

2+ através da reação

de Fenton produz o radical∙OH, acelerando a reação em cadeia da peroxidação lipídica. Como

resultado ocorre a formação de compostos voláteis de oxidação, responsáveis pela formação

de odores desagradáveis, como a rancidez (FARVIN et al., 2014). A capacidade de quelar

Fe2+

, de um composto, pode servir como um indicador da potencial atividade antioxidante do

mesmo, uma vez que atua estabilizando a forma oxidada de íons metálicos, reduzindo o seu

potencial redox, retardando assim o processo de oxidação (SHI et al., 2014). A Figura 5,

apresenta a capacidade de quelação de metais dos diferentes hidrolisados.

A atividade quelante do Fe2+

apresentou uma dependência da concentração, pois

aumentou com a variação na concentração de 5 para 50 mg/mL (p < 0,05). Farvin et al.

(2014), verificaram o mesmo comportamento para os hidrolisados de bacalhau (Gadus

morhua). A amostra 2, apresentou a maior capacidade de quelação de Fe2+

(p < 0,05) de

aproximadamente 90,7; 81,0 e 64,1% para as concentrações de 50, 25 e 5 mg/mL,

respectivamente. Giménez et al. (2009a) verificaram que nas concentrações de 0,02; 0,1; 0,2;

2, 5 e 25 mg/mL, os hidrolisados de gelatina de pota (D. gigas) com 50% de GH apresentaram

uma capacidade de quelação de ferro de 7,2; 26,9; 80,9; 99,5; 99,2 e 100%, respectivamente.

Esses resultados, foram superiores aos encontrados no presente estudo. Samaranayaka e Li-

Chan (2008) relataram uma capacidade de quelação de Fe2+

entre, aproximadamente, 7 e 46%

para os hidrolisados derivados de músculo de pescada, obtidos por diferentes processos de

hidrólise, com uma concentração de 5 mg/mL. Neste estudo, para essa concentração houve

uma variação de 9,15 a 64,12%, respectivamente.

135

Figura 5 - Capacidade de quelação de metais dos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com







utilizando a Protamex (HPMP2); Letras maiúsculas iguais para o mesmo tratamento, indicam que não há

diferença significativa entre as concentrações (p > 0,05); Letras minúsculas iguais para a mesma concentração,

indicam que não há diferença significativa entre os tratamentos (p > 0,05); (Média ± desvio-padrão).

No presente estudo foi verificado que com o acréscimo no GH de 10 para 20%,

houve uma diminuição significativa (p < 0,05) na capacidade de quelação de Fe+2

, quando

comparada às amostras hidrolisadas pela Protamex, com a mesma concentração. Khantaphant,

Benjakul e Kishimura (2011), verificaram que a capacidade de quelação de Fe+2

diminuía

com o acréscimo no GH de 20 para 40%, utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme para

hidrolisar o músculo de lucio marrom (L. vitta). Segundo esses autores, uma cadeia de

peptídeos curta, pode resultar na perda da capacidade de formar o complexo com Fe2+

. No

presente estudo foi verificado que o aumento no GH de 10 para 20%, apresentou o

comportamento inverso para a amostra de IPC hidrolisada pela Alcalase. Esses resultados

indicam que uma hidrólise parcial das proteínas, faz com que a atividade quelante de ferro

aumente em comparação com a extensa hidrólise.

A presença de grupos carboxila e amino nas cadeias laterais de aminoácidos

ácidos (Glu e Asp) e básicos (Lis, His e Arg), faz com que algumas proteínas e peptídeos

consigam quelar íons metálicos (GIMÉNEZ et al., 2009b; SAIGA; TANABE; NISHIMURA,

2003). O Asp está em maior conteúdo (p < 0,05) em hidrolisados proteicos de IPC, para

136

ambas enzimas analisadas. Avaliando os resultados e o conteúdo desse aminoácido nas

amostras com potencial para quelação de Fe2+

, pôde-se sugerir que a atividade antioxidante

está fortemente vinculada ao mesmo. A His está presente em baixo conteúdo, em relação aos

demais aminoácidos, em todas as amostras de hidrolisados proteicos, independentemente de

matéria-prima, GH e enzima.

3.3.1.4 Sequestro do radical livre DPPH• (2,2–Difenil–1–picrilhidrazila)

O sequestro do radical livre DPPH•, possui absorbância máxima a 517 nm em

etanol e tem sido comumente usado em análises da atividade antioxidante, pois é um radical

livre estável (SUN et al., 2012). O ensaio de eliminação de radicais DPPH• baseia-se na

redução da solução etanólica de DPPH, na presença de um antioxidante doador de hidrogênio,

devido a formação de um não-radical DPPH-H pela reação. A cor da solução, após a reação

de redução, muda gradualmente de violeta para amarela (CHI et al., 2014; SUN et al., 2012).

A Figura 6 apresenta o sequestro do radical livre DPPH•, obtido pelos diferentes hidrolisados.

Os hidrolisados apresentaram um efeito dose-dependente, pois com o acréscimo

na concentração dos hidrolisados de 2,5 para 10,0 mg/mL houve um aumento significativo (p

< 0,05) no sequestro do radical livre DPPH•, para todas as amostras avaliadas. Esse

comportamento, também foi observado em diversos estudos (CHI et al., 2015; NASRI et al.,

2013; UMAYAPARVATHI et al., 2014). Os hidrolisados de PMC ou IPC pela enzima

Protamex, apresentaram uma diminuição no sequestro do radical livre DPPH• (p < 0,05), com

o acréscimo no GH de 10 para 20% nas diferentes concentrações avaliadas. Entretanto, para

as amostras hidrolisadas com a Alcalase esse comportamento não foi verificado, pois com o

aumento no GH ocorreu um acréscimo no sequestro do radical livre DPPH•. As amostras

hidrolisadas pela enzima Protamex, apresentaram maior capacidade de sequestro do radical

livre DPPH• (p < 0,05), em relação às amostras hidrolisadas pela Alcalase. Phanturat et al.

(2010), elaboraram hidrolisados proteicos de gelatina de pele de bigeye snapper (Priacanthus

macracanthus) com diferentes enzimas, Alcalase e Neutrase, em diferentes GH. Eles

verificaram que para a enzima Neutrase não houve um acréscimo significativo (p > 0,05) no

sequestro do radical livre DPPH•, com o acréscimo no GH de 5 para 10%, mas foi observado

em GH superior de 15%.

137

Figura 6 - Sequestro do radical livre (DPPH) dos hidrolisados proteicos de IPC ou PMC, com







utilizando a Protamex (HPMP2); (Média ± desvio-padrão). Letras maiúsculas iguais para o mesmo tratamento,

indicam que não há diferença significativa entre as concentrações (p > 0,05); Letras minúsculas iguais para a

mesma concentração, indicam que há diferença significativa entre os tratamentos (p > 0,05).

As amostras 5 e 7 (hidrolisados de IPC e PMC com GH de 10% utilizando a

Protamex), apresentaram a maior capacidade de sequestro do radical livre DPPH• (p < 0,05).

Essas amostras apresentaram um perfil de MM média de 1921 Da e 1845 Da, Figuras 2e e 2g,

superior ao verificado para as demais amostras. Wu, Chen e Shiau (2003) verificaram que

hidrolisados proteicos de cavala (Scomber austriasicus), com MM superior a 1400 Da,

apresentaram o maior sequestro do radical livre DPPH•. No presente estudo, as amostras dos

hidrolisados proteicos foram homogeneizadas em metanol para avaliação do sequestro do

radical livre DPPH•. Segundo Oliveira (2015) as proteínas, quando solubilizadas em solução

alcóolica, podem precipitar ou apresentar diferença de solubilidade. Esse fato pode ter

influenciado no sequestro do radical livre DPPH• pelas amostras obtidas nesse estudo.


Muitos métodos estão sendo utilizados para a avaliação da atividade

antimicrobiana de hidrolisados proteicos e/ou peptídeos. Entretanto, o método de disco

138

difusão em ágar é comumente aplicado para verificar o potencial antimicrobiano, onde o

aumento no halo da zona de inibição, resulta de uma amostra com potencial antimicrobiano

superior (DI BERNARDINI et al., 2011; JEMIL et al., 2014; NAJAFIAN; BABJI, 2012). As

Figuras 7 e 8, apresentam a atividade antimicrobiana dos diferentes hidrolisados avaliados.

Figura 7 - Atividade antimicrobiana frente à B. thermosphacta (a), L. innocua (b), L.

monocytogenes (c) e S. aureus (d) dos diferentes hidrolisados proteicos após 24 horas






utilizando a Protamex (HPMP2); P: Polilisina; N: Nisina; Letras minúsculas iguais para a mesma concentração,

indicam que não há diferença significativa entre as amostras (p > 0,05); (Média ± desvio-padrão).

(a) (b)

(c) (d)

139

(a) (b)

(c)

A avaliação da atividade antimicrobiana dos diferentes hidrolisados proteicos de

IPC ou PMC, com diferentes GH, obtidos pela Alcalase e Protamex, foi realizada frente à 26

micro-organismos. Entretanto, foi verificada a ação antimicrobiana dessas amostras em 7

micro-organismos testados, como apresentam as Figuras 7 e 8.

Figura 8 - Atividade antimicrobiana frente à A. hydrophila (a), Y. enterecolitica (b) e D.

hanseii (c) dos diferentes hidrolisados proteicos após 24 horas






utilizando a Protamex (HPMP2); P: Polilisina; N: Nisina; Letras minúsculas iguais para a mesma concentração,

indicam que não há diferença significativa entre as amostras (p > 0,05); (Média ± desvio-padrão).

A grande maioria dos micro-organismos inibidos, foram as bactérias Gram-

positivas (B. thermosphacta, L. innocua, L. monocytogenes e S. aureus), como apresentam as

Figuras 7a, 7b, 7c e 7d, seguidos pelas bactérias Gram-negativas (A. hydrophila e Y.

enterecolitica) e a levedura (D. hanseii), como apresentam as Figuras 8a, 8c e 8b. Os

140

hidrolisados testados, não apresentaram inibição frente a alguns micro-organismos probióticos

como Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus helviticus,

possibilitando o uso desses hidrolisados em alimentos que contenham os mesmos, sem

ocasionar problemas de viabilidade dos organismos probióticos. Além disso, os hidrolisados

testados não inibiram nenhum dos fungos avaliados, indicando que os mesmos não exercem

nenhum efeito fungiostático ou fungicida.

Jemil et al. (2014), verificaram que hidrolisados dos músculos fermentados de

sardinha (Sardinella aurita), caboz (Zosterizessor ophiocephalus), zebra blenny (Salaria

basilisca) e arraia (Dasyatis pastinaca) na concentração de 200 mg/mL, inibiram em sua

grande maioria micro-organismos Gram-positivos (S. aureus, Micrococcus luteus, Bacillus

cereus e Enterococcus faecalis) e apenas um micro-organismo Gram-negativo (Escherichia

coli). Estes resultados estão de acordo com diversos estudos, onde as bactérias Gram-

negativas foram mais resistentes em relação às bactérias Gram-positivas (SEDAGHATI et al.,

2016; SILA et al., 2014a). Os organismos Gram-negativos, possuem uma estrutura adicional

na parede celular, chamada de membrana externa, que age como uma barreira para limitar a

difusão de material prejudicial pra o interior da mesma. Essa membrana externa, contém

moléculas de lipopolissacarídios, fosfolipídios, lipoproteínas e proteínas que sustentam toda a

célula bacteriana (FORSYTHE, 2013; SEDAGHATI et al., 2016). Devido a isso, alguns

antimicrobianos são inativos frente a cepas Gram-negativas, pois não conseguem ultrapassar a

membrana externa destas bactérias, pois elas dificultam a difusão destes para o seu alvo no

interior celular, ao qual se constitui em um fator primordial para a ação de antibióticos,

sanitizantes, entre outros (BOMONO; SZABO, 2006).

Os micro-organismos B. thermosphacta, L. innocua e S. aureus foram inibidos

por todas as amostras de hidrolisados testadas, conforme observado na Figura 7a, 7b e 7d,

respectivamente. Entretanto, os micro-organismos L. monocytogenes, A. hydrophila, Y.

enterecolitica e D. hanseii foram inibidos, preferencialmente, pelas amostras de hidrolisados e

IPC e PMC, em diferentes GH utilizando a Alcalase como enzima. Segundo Mosquera et al.

(2014), as proteases utilizadas para a hidrólise podem determinar o tamanho e sequência dos

peptídeos resultantes, afetando as suas atividades. Os hidrolisados proteicos que foram

obtidos utilizando Alcalase, apresentaram uma baixa MM média de 1285 Da, 1083 Da, 1245

Da e 1066 Da para os tratamentos 1; 2; 3 e 4, conforme foi verificado na Figura 1, em relação

aos hidrolisados pela Protamex. Segundo Gómez-Guillén et al. (2010), as frações de menor

massa molecular possuem menos agregados, promovendo a melhor exposição dos

aminoácidos e suas cargas, facilitando a interação com as membranas bacterianas.

141

Além disso, os tratamentos 1, 2 e 4 dos hidrolisados proteicos apresentaram maior

conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos (AAH) (p < 0,05), conforme foi verificado na Tabela

2. A maioria dos peptídeos antimicrobianos, possuem cerca de 50% de resíduos hidrofóbicos,

alterando porções hidrofóbicas e catiônicas. A parte catiônica dos peptídeos, permite a ligação

à cabeça polar dos fosfolipídios da membrana, carregada negativamente, dos micro-

organismos, assim os mesmos são inseridos dentro da célula microbiana causando problemas

relativos a hidratação da célula e também a lise da mesma (HANCOCK; SCOTT, 2000;

HANCOCK; PATRZYKAT, 2002; KOBBI et al., 2015; NAJAFIAN; BABJI, 2012). A

membrana citoplasmática das células de mamíferos, ao contrário das de bactérias, apresenta,

na sua face externa, uma predominância de fosfolipídios com carga líquida neutra, o que

contribui para que a ação de diversos peptídeos antimicrobianos, seja seletiva apenas para a

membrana das bactérias (BROGDEN, 2005).

No presente estudo não foi verificada a tendência entre o acréscimo na inibição

dos micro-organismos com o aumento na concentração dos hidrolisados de 1,25 para 7,50

mg/mL, para a grande maioria das amostras testadas. Entretanto, para a A. hydrophila os

tratamentos 1, 2 e 3 apresentaram um acréscimo no halo de inibição com o aumento da

concentração de 1,25 para 7,50 mg/mL. Além disso, os micro-organismos L. innocua, L.

monocytogenes, D. hanseii e B. thermosphacta apresentaram a mesma tendência frente a

Polilisina e Nisina, respectivamente. O tratamento 1, hidrolisado de IPC com GH de 10%

utilizando a Alcalase (HIPA1), apresentou a maior inibição (p < 0,05) dos micro-organismos

D. hanseii (20,20 mm) e L. innocua (12,50 mm) na concentração de 7,5 mg/mL. A Nisina, na

mesma concentração, apresentou maior inibição (p < 0,05) do D. hanseii (28,20 mm). A

Polilisina e a Nisina na mesma concentração, apresentaram menor inibição (p < 0,05) da L.

innocua de 10,50 e 6,20 mm, respectivamente. Gómez-Guillén et al. (2010) elaboraram

hidrolisados da gelatina da pele de atum, onde verificaram que as frações de peptídeos com

MM de 10 kDa e 1 kDa na concentração de 2 mg/mL apresentaram um halo de inibição de

2,50 mm para a L. innocua. No presente estudo na concentração de 2,50 mg/mL , o tratamento

1 apresentou um halo de aproximadamente 6,60 mm, superior ao encontrado por esses

autores.

O tratamento 3, hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Alcalase

(HPMA1), apresentou maior inibição (p < 0,05) em relação as demais amostras testadas,

frente a L. monocytogenes (5,70 mm) na concentração de 7,5 mg/mL, a Polilisina e a Nisina,

na mesma concentração, apresentaram 7,30 e 5,50 mm, respectivamente. Mosquera (2014)

elaborou hidrolisado proteico de pota (D. gigas), utilizando a Alcalase como enzima, onde

142

verificou que a fração de MM de 1 a 3 kDa na concentração de 5mg/mL, apresentou um halo

de inibição de aproximadamente 2,50 mm, inferior ao encontrado nesse estudo, o qual na

concentração de 2,50 mg/mL apresentou um halo de inibição de 5,20 mm para o tratamento 3.

O tratamento 2, hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Alcalase

(HIPA2), na concentração de 7,50 mg/mL apresentou maior halo de inibição (p < 0,05) frente

a A. hydrophila e B. thermosphacta de 21,30 e 8,00 mm, respectivamente. Contudo, a

Polilisina e a Nisina, na mesma concentração, apresentaram menor e maior halo de inibição (p

< 0,05) de 5,80 e 30,10 mm para esses micro-organismos avaliados. Esse tratamento, também

apresentou maior inibição (p < 0,05) na concentração de 5,00 mg/mL, frente ao S. aureus e a

Y. enterecolitica, onde os halos de inibição foram de 14,50 e 6,20 mm, respectivamente. Além

disso, o controle Polilisina apresentou menor inibição de 7,90 e 5,90 mm para esses micro-

organimos, quando comparada ao tratamento 2.

Gómez-Guillén et al. (2010) elaboraram hidrolisados da gelatina da pele de atum,

onde verificaram que as frações de peptídeos com 10 kDa a 1 kDa na concentração de 2

mg/mL apresentaram um halo de inibição entre 2,50 e 5,00 mm e < 1 mm para a Y.

enterecolitica e A. hydrophila, respectivamente. Na concentração de 2,50 mg/mL, o

tratamento 2 não apresentou um halo de inibição para esses micro-organismos. Entretanto,

nessa concentração para o B. thermosphacta e o S. aureus, foi verificado um halo de 5,20 e

7,70 mm para o tratamento 2, superior aos halos de inibição de aproximadamente 2,50 mm

encontrados por Gómez-Guillén et al. (2010), para hidrolisados da gelatina da pele de atum,

na fração de peptídeos com MM inferior a 1 kDa na concentração de 2 mg/mL. A amostra 2,

como foi citado na Tabela 2 e na Figura 2, apresentou um conteúdo elevado de AAH (365,44

mg/gproteína) e peptídeos com menor MM média, que contribuem para a maior atividade

antimicrobiana concordando com alguns autores (GÓMEZ-GUILLÉN et al., 2010;

NAJAFIAN; BABJI, 2012). Esse tratamento, inibiu alguns micro-organismos que são

importantes patógenos alimentares, tais como a A. hydrophila, Y. enterecolitica e S. aureus,

devido a isso, a aplicação da mesma como agente antimicrobiano é interessante.

4 CONCLUSÃO

Os hidrolisados de isolado proteico e de proteína miofibrilar da castanha, em

diferentes graus de hidrólise, elaborados por distintas enzimas, apresentaram atividade

antioxidante e antimicrobiana. A matéria-prima, enzima e grau de hidrólise apresentaram

influência na determinação da atividade antioxidante. O tratamento dois, de hidrolisado de

143

isolado proteico de castanha, utilizando a Alcalase como enzima e no maior grau de hidrólise,

apresentou a maior atividade antioxidante, em três dos quatros métodos avaliados. Em relação

a atividade antimicrobiana, as amostras apresentaram capacidade de inibição frente aos micro-

organismos Gram-positivos. A protease utilizada apresentou grande influência na atividade

antimicrobiana, pois pôde-se verificar que as amostras hidrolisadas pela Alcalase exibiram

maiores halos de inibição, em relação às amostras hidrolisadas pela Protamex.







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150

ARTIGO III

ATIVIDADE ANTI-HIPERTENSIVA E INIBITÓRIA DAS ENZIMAS DIPEPTIDIL

PEPTIDASE IV E PROLIL ENDOPEPTIDASE DE HIDROLISADOS PROTEICOS

DA CASTANHA (Umbrina canosai), INCORPORADOS EM FILMES DE ÁGAR APÓS

DIGESTÃO GASTROINTESTINAL SIMULADA

151

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi avaliar as propriedades anti-hipertensiva, e inibitória das

enzimas dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) e prolil endopeptidase (PEP) dos diferentes

hidrolisados proteicos obtidos de proteínas recuperadas do músculo da castanha (Umbrina

canosai) antes e após a incorporação em filmes elaborados à base de ágar. A partir do isolado

proteico (IPC) e proteínas miofibrilares (PMC) da castanha, foram elaborados oito

hidrolisados em diferentes graus de hidrólise – GH (10 e 20%), utilizando as enzimas

Alcalase e Protamex. Os mesmos foram caracterizados quanto a seu perfil de massa molecular

(MM) média, composição aminoacídica, propriedades anti-hipertensiva, e inibitória das

enzimas DPP-IV e PEP. Em seguida, foram elaborados e caracterizados os filmes à base de

ágar incorporados com hidrolisados. Como resultado, foi verificado que o aumento no GH,

resultou em maior conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, aromáticos e uma diminuição da

MM. Entretanto, o mesmo efeito não foi verificado para os aminoácidos carregados

negativamente e positivamente. As amostras hidrolisadas pela Alcalase com maior GH e

menor MM média, apresentaram maior inibição da enzima DPP-IV. Entretanto, as maiores

atividades inibidoras da PEP e anti-hipertensiva, foram observadas para as amostras

hidrolisadas pela Protamex. Após a digestão do filme com a incorporação dos hidrolisados,

houve um decréscimo nas atividades estudadas. Os filmes incorporados com o hidrolisado

apresentaram maior solubilidade em água, elongação até a ruptura, umidade e hidrofilicidade

em relação aos filmes controle. Mesmo após a digestão dos filmes incorporados com o

hidrolisado, os mesmos apresentaram potencial para uso como filmes funcionais.

Palavras-chave: hidrolisados, filmes, funcionalidade, saúde, alternativa.

152

1 INTRODUÇÃO

A castanha (Umbrina canosai) é uma espécie de pescado amplamente distribuída

no litoral sul do Brasil. Segundo Lempek, Martins e Prentice (2007), essa espécie é

subutilizada e possui baixo valor comercial. Entretanto, devido ao seu elevado conteúdo

proteico, desperta o interesse para a obtenção de produtos com elevado valor agregado, tais

como os hidrolisados proteicos. Os hidrolisados proteicos de pescado e de espécies marinhas,

têm sido relatados como fonte de peptídeos biologicamente ativos com atividade

antimicrobiana, antioxidante, anti-hipertesiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV

e prolil endopeptidase, como indicativo de potenciais atividades antidiabética e inibidora de

desordens neuropatológicas (FARVIN et al., 2014; KHANTAPHANT; BENJAKUL;

KISHIMURA, 2011; NASRI et al., 2013; RAGHAVAN; KRISTINSSON, 2009b;

RAGHAVAN; KRISTINSSON; LEEUWENBURGH, 2008; SAIDI et al., 2014; SILA et al.,

2015). Os peptídeos bioativos, após demonstrarem resistência à digestão, podem ser utilizados

no desenvolvimento de alimentos funcionais para a prevenção de várias doenças (ALÉMAN,

2010).

A pressão arterial alta ou hipertensão é um problema mundial e um dos maiores

fatores de risco para doenças cardiovasculares, afetando cerca de 30% da população adulta na

maioria dos países (BALTI et al., 2013; NASRI et al., 2013). A enzima conversora da

angiostensina-I (ECA; EC 3.4.15.1), desempenha um papel importante na regulação da

pressão arterial, através da produção de um potente vasoconstritor, angiostensina-II, e a

degradação de um vasodilatador, a bradicinina (KHANTAPHANT; BENJAKUL;

KISHIMURA, 2011). A inibição da ECA é necessária para evitar a formação de agentes

vasoconstritores e, para potencializar a ação vasodilatadora da bradicinina (BALTI et al.,

2013). Entretanto, alguns inibidores sintéticos da ECA (captopril, lisinopril entre outros), que

têm sido utilizados no tratamento clínico da hipertensão, podem apresentar alguns efeitos

secundários indesejáveis em seres humanos, tais como tosse, dificuldade para respirar,

distúrbios no paladar, erupção cutânea, entre outros (CHEN et al., 2012; VYSSOULIS et al.,

2001).

O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) representa 90-95% dos casos diagnosticados de

diabetes no mundo, é caracterizado por gerar múltiplos efeitos patofisiológicos, incluindo

disfunção progressiva das células pancreáticas, resistência à insulina e aumento da produção

de glicose hepática (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2014). Os inibidores da enzima

dipeptidil peptidase - IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5), representam uma nova classe de agentes

153

antidiabéticos, que melhoram o controle glicêmico através do bloqueio da DPP-IV

(CUDENNEC et al., 2015; MCINTOSH et al., 2005; NONGONIERMA; FITZGERALD,

2013; SILA et al., 2015). Atualmente, inibidores sintéticos da DPP-IV estão sendo utilizados

para o controle de DM2 (NONGONIERMA et al., 2015).

Alguns estudos (LAFARGA; HAYES, 2014; SILA et al., 2015; WILSON;

HAYES; CARNEY, 2011) têm sugerido, que a prolil endopeptidase (PEP, EC 3.4.21.26)

pode ser relacionada com desordens neuropatológicas como a depressão, esquizofrenia,

Alzheimer, distúrbios da memória e do conhecimento. A PEP está envolvida no metabolismo

e na clivagem de pequenos neuropeptídeos como a ocitocina, neurotensina, angiostensina e

bradicinina. Em níveis anormais, faz com que os neuropeptídeos sejam alterados, afetando o

comportamento social, as emoções, a memória e o estresse do indivíduo (MOMENI et al.,

2005). Devido a isso, é importante estudos de inibidores da PEP, para melhorar a memória

através do bloqueio do metabolismo dos neuropeptídeos endógenos (TEZUKA et al., 1999).

Devido a isso, nos últimos anos muitos estudos com peptídeos inibidores da ECA, da DPP-IV

e da PEP estão sendo realizados como uma alternativa aos compostos sintéticos utilizados

para a inibição das mesmas (ALEMÁN; GÓMEZ-GUILLÉN; MONTERO, 2013;

LAFARGA; HAYES, 2014; LASSOUED et al., 2015; SILA et al., 2015; TEZUKA et al.,

1999).

Diversos estudos, têm mostrado a extensão das propriedades funcionais dos filmes

comestíveis através da adição de compostos bioativos (GIMÉNEZ et al., 2013a, 2013b). O

estudo da digestibilidade dos filmes, pode fornecer informações úteis para o uso desse tipo de

material na elaboração de alimentos funcionais (GIMÉNEZ et al., 2013b). Segundo Sousa e

Gonçalves (2015) os filmes à base de polissacarídeos de algas marinhas, como o ágar,

possuem boa resistência mecânica, propriedades moderadas de barreira ao O2 e CO2, são

comestíveis e facilmente biodegradáveis. Devido a isso, seria interessante a incorporação de

hidrolisados para avaliação desses para o desenvolvimento de filmes ativos e alimentos

funcionais. Em face disso, os objetivos do presente estudo foram: (i) a obtenção de

hidrolisados proteicos provenientes de proteínas recuperadas de castanha, pelo método de

solubilização/precipitação proteica ou através de sucessivas lavagens, com diferentes graus de

hidrólise, utilizando diferentes proteases comerciais (Alcalase e Protamex); (ii) avaliar a

propriedade anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas DPP-IV e PEP dos diferentes

hidrolisados; (iii) elaborar filmes à base de ágar com e sem a incorporação de hidrolisados e

avaliar suas propriedades e (iv) avaliar as propriedades anti-hipertensiva, e inibitória das

154

enzimas DPP-IV e PEP, após a digestão enzimática dos filmes de ágar incorporados com

hidrolisado.


2.1 MATERIAL


O isolado proteico de castanha (IPC) e a proteína miofibrilar de castanha (PMC),

foram obtidos no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio

Grande – FURG. O IPC foi elaborado através do método de variação de pH, segundo Nolsøe

e Undeland (2009), com modificações, como apresentado na Figura 1 do Artigo I. O músculo

de castanha foi homogeneizado, em água destilada, na proporção 1:9 (p/v). A solubilização

alcalina foi realizada em pH 11,2 (NaOH 1 M), durante 20 min a 4 °C sob agitação constante

em agitador eixo-hélice (IKA, RW 20DZM.n, Alemanha). Em seguida, as amostras foram

centrifugadas a 9000 x g em centrífuga refrigerada (Hanil, Supra 22K, Coréia do Sul) durante

20 min a 4 °C. O pH das proteínas solúveis foi ajustado em pH 5,0 (HCl 1 M), durante 20 min

a 4 °C sob agitação constante. As amostras foram centrifugadas, a 9000 x g durante 20 min a

4 °C. O precipitado, isolado proteico, foi liofilizado em liofolizador (Liotop, L108, São



armazenado a – 18 °C até o momento de uso. O IPC foi analisado em triplicata, para avaliar a

sua composição proximal segundo método descrito pela AOAC (2000), onde apresentou um

teor de 92,1% de proteína, 2,2% de umidade, 1,2% de lipídios e 1,5% de cinzas.

A PMC foi obtida através de sucessivas lavagens em água destilada e solução

salina, segundo método descrito por Limpan et al. (2010), com modificações, como

apresentou a Figura 2 do Artigo I. O músculo de castanha foi homogeneizado em água

destilada na proporção 1:3 (p/v) a 4 °C, 13.000 rpm em agitador eixo-hélice (Fisatom, 712,

São Paulo, Brasil) durante 2 min, seguido por filtração em filtro de nylon. Então, foi

homogeneizado em NaCl (50 mM na proporção 1:5 (p/v) a 4 °C e 13.000 rpm em agitador

eixo-hélice (Fisatom, 712, São Paulo, Brasil), durante 5 min e filtrado em filtro de nylon. Esse

processo foi realizado duas vezes. Em seguida, a PMC úmida foi liofilizada em liofolizador

155

(Liotop, L108, São Carlos, Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h, fracionada em moinho de

facas (Tecnal, TE-633, Piracicaba, Brasil), peneirada em peneira de 42 mesh (Bertel, Caieiras,

Brasil) e armazenada a – 18 °C até o momento do uso. A PMC foi analisada em triplicata para

avaliar a sua composição proximal, segundo método descrito pela AOAC (2000), e

apresentou um teor de 88,7% de proteína, 2,0% de umidade, 3,9% de lipídios e 3,3% de

cinzas.

2.2 ENZIMAS

As enzimas utilizadas foram a Alcalase - 2,4 L (EC 3.4.21.62); uma

endopeptidase bacteriana produzida a partir da fermentação submersa do Bacillus

licheniformis, fornecida pela Novozymes Latin America (Araucária – Paraná); e a Protamex

(EC 3.4.21.62; EC 3.4.24.28) uma mistura de exo- e endopeptidases bacterianas, produzida a

partir do Bacillus sp., adquirida da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Estados Unidos).

Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico (P.A.).

2.3 OBTENÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTEICOS

A hidrólise enzimática do IPC ou da PMC, foi realizada segundo método descrito

por Liu et al. (2014), Raghavan e Kristinsson (2009) e acompanhada pelo método de pH-stat,

com modificações. O IPC ou PMC foi homogeneizado em água destilada na proporção de 2%

(p/v; proteína/água destilada), em reator de vidro encamisado acoplado de banho

ultratermostático (Quimis, Q212S, Diadema, Brasil), sob agitação constante em agitador

(Marconi, Piracicaba, Brasil) a 300 rpm. As condições das dispersões proteicas, foram

ajustadas nos parâmetros ótimos de cada enzima: Alcalase (pH: 8 e temperatura de 50 °C) e

Protamex (pH:7 e temperatura de 50 °C) durante 10 min, respectivamente. A hidrólise

enzimática, iniciou através da adição da enzima na proporção de 30 U/g proteína, segundo a

atividade específica de cada enzima 13,3 U/mg de proteína para a Alcalase e 14 U/mg de

proteína para a Protamex, determinada pelo método descrito pela Sigma (2013), a qual utiliza

caseína como substrato. O grau de hidrólise (GH) foi monitorado segundo Adler-Nissen

(1986).

156

A hidrólise enzimática do IPC ou PMC, utilizando as enzimas Alcalase e

Protamex, foi conduzida até que o GH desejado fosse atingido (10 ou 20%). As enzimas

foram inativadas, pelo aquecimento da suspensão a 90 °C durante 10 min. Os hidrolisados

foram centrifugados a 9000 x g durante 20 min a 4 °C, para separar as frações solúvel

(hidrolisado) e insolúvel. A fração solúvel foi seca em liofolizador (Liotop, L108, São Carlos,

Brasil) a – 55 °C e 50 µHg durante 48 h, e armazenada em frascos de polietileno a -18 °C.

Foram obtidas oito amostras de hidrolisados provenientes de oito tratamentos distintos: 1:

hidrolisado de IPC com Alcalase com GH de 10% (HIPA1); 2: hidrolisado de IPC com

Alcalase com GH de 20% (HIPA2); 3: hidrolisado de PMC com Alcalase com GH de 10%

(HPMA1). 4: hidrolisado de PMC com Alcalase com GH de 20% (HPMA2); 5: hidrolisado

de IPC com Protamex com GH de 10% (HIPP1); 6. Hidrolisado de IPC com Protamex com

GH de 20% (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com Protamex com GH de 10% (HPMP1) e 8:

hidrolisado de PMC com Protamex com GH de 20% (HPMP2).


A composição dos aminoácidos do hidrolisado foi realizada em triplicata, segundo

método adaptado de Giménez et al. (2009b). As diferentes amostras dos hidrolisados

liofilizadas, foram homogeneizadas em água destilada na concentração de 5mg/mL. Uma

alíquota de 20 µL desse homogeneizado, foi seco e hidrolisado em tubos de vidro, selados a

vácuo a 110 ± 2°C, durante 24 h na presença de HCl 6M contendo 0,1% de fenol. Como

padrão interno foi utilizada a Norleucina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Após a

hidrólise, as amostras foram secas a vácuo, homogeneizadas em solução tampão de aplicação

e injetadas em analisador de aminoácidos (Biochrom 20, Pharmacia, Barcelona, Espanha).


O perfil de massa molecular (MM) média de cada amostra de hidrolisado, foi

obtido segundo método descrito por Sila et al. (2015), por exclusão de tamanho em

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em cromatógrafo (SPE-MA10AVP,

Shimadzu, Kyoto, Japão). A coluna utilizada foi a Superdex para peptídeos (PC 3.2/30) (GE

Healthcare Bio Sciences, Barcelona, Espanha), com um fracionamento entre 100 Da e 7000

157

Da. O volume de injeção foi de 10 µL e o fluxo foi de 25 µL/min. Como fase móvel, foi

utilizada a acetonitrila (30%, v/v), contendo 0,01% de ácido trifluoroacético - TFA (v/v) e a

densidade ótica foi avaliada em 214 nm. Como padrões de massa molecular, foram utilizadas:

a albumina de soro bovino (ASB, 6700 Da), aprotinina (6512 Da), vitamina B12 (1340 Da),

hipuril-histidil-Ieucina (HHL, 429 Da) e glicina (75 Da).


As propriedades bioativas dos hidrolisados, foram avaliadas nos laboratórios

Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos e Nutrição – ICTAN/CSIC, em Madri,

Espanha, utilizando diferentes métodos analíticos que estão descritos na continuação.

2.6.1 Atividade inibitória da dipeptidil peptidase-IV

A atividade de inibição da enzima dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) pelos

hidrolisados, foi determinada segundo método descrito por Tulipano et al. (2011), com

modificações. Os hidrolisados foram diluídos em tampão Tris-HCl (100 mM) em pH 8, a uma

concentração de 10 mg/mL. Em seguida, foram realizadas diferentes diluições em tampão

Tris-HCl (100 mM) em pH 8. Então, foram adicionados 10 µL de DPP – IV (0,01 mM),

previamente diluída em tampão Tris-HCl (100 mM, pH 8) e incubados a 37 °C durante 15

min. A reação iniciou através da adição de 100 µL de substrato cromogênico (H-Gli-Pro-

AMC • HBr), à concentração final de 25 µM. O ensaio foi realizado em placa de 96 poços, na

qual o volume final de cada poço foi de 300 µL. A concentração final por poço das amostras

de hidrolisados analisadas foram 0,17; 0,33; 0,83; 1,67 e 3,00 mg/mL, respectivamente. Como

controle foi utilizado o tampão Tris-HCl (100 mM) em pH 8 e como branco o ácido clorídrico

(40 mM). A variação da fluorescência a 355 nm/460 nm, foi monitorada em intervalos de 2

min durante 30 min em leitor de placas (Appliskan Multimode, Thermo Fisher Scientific,

Massachusetts, Estados Unidos). Os dados obtidos, foram plotados em função do tempo, e a

atividade inibitória dos hidrolisados, foi obtida através dos dados na ausência e presença de

amostra em diferentes concentrações. Uma regressão logarítmica foi utilizada para calcular o

valor do CI50, ou seja, a concentração (mg/mL) necessária de amostra para inibir 50% da

atividade da DPP – IV. As determinações foram realizadas em triplicata.

158

2.6.2 Atividade inibitória da prolil endopeptidase

A avaliação da atividade inibidora da prolil endopeptidase (PEP) foi determinada

segundo método descrito por Yoshimoto, Walter e Tsuru (1980), com modificações. Foram

homogeneizados em tampão de fosfato (0,1 M; pH 7,0; EDTA 1 mM), 10 µL de PEP (diluída

em tampão fosfato) e a amostra em diferentes concentrações. A reação iniciou, através da

adição de 100 µL de substrato cromogênico (H-Gly-Pro-AMC • HBr; 0,01 mM). O ensaio foi

realizado em uma placa de 96 poços, com um volume final de 300 µL em cada poço. A

concentração final em cada poço das amostras de hidrolisados analisadas foram 0,50; 0,83;

1,66; 3,00 e 4,33 mg/mL, respectivamente. Como controle foi utilizado o tampão de fosfato

(0,1 M; pH 7,0; EDTA 1 mM) e como branco o ácido clorídrico (40 mM). A variação da

fluorescência a 355/460 nm, foi monitorada em intervalos de 2 min durante 30 min em leitor

de placas (Appliskan Multimode, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Estados Unidos).

Os dados obtidos foram plotados em função do tempo, onde a atividade inibitória dos

hidrolisados foi obtida através dos dados na ausência e presença de amostra em diferentes

concentrações. Uma regressão logarítmica, foi utilizada para calcular o valor do CI50, ou seja,

a concentração necessária de amostra para inibir 50% da atividade da PEP. As determinações

foram realizadas em triplicata.

2.6.3 Atividade anti-hipertensiva

A capacidade das amostras de inibirem a enzima conversora de angiotensina

(ECA), foi determinada segundo Wu, Aluko e Muir (2006), com modificações. O volume

total da reação foi de 230 µL, composto por 50 µL de Hipuril-histidil-leucina (HHL) 5 mM,

160 µL de ECA (0,025 U/mL) e 20 µL das amostras diluídas em tampão fosfato de potássio

100 mM, contendo 300 mM de NaCl, pH 8,3, na concentração de 2 mg/mL. A solução foi

incubada a 37 °C em banho termostatizado (Grant Instruments Ltda, OSL 200, Cambridge,

Inglaterra), sob agitação constante de 160 rpm. A reação foi interrompida pela adição de 100

µL de HCl (0,1 M). O ácido hipúrico (HA) liberado, foi quantificado através de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (CLAE - FR) em cromatógrafo

(Shimadzu, SPE-MA10AVP, Kyoto, Japão), utilizando coluna C18 (Tracel Excel, tamanho

do poro 120 Å, ODS-A, tamanho da partícula de 5 µm, Teknokroma, Barcelona, Espanha).

Alíquotas de 50 µL amostras, foram injetadas em um fluxo de 0,8 mL/min usando

159

acetonitrila, em um gradiente de 20 para 60% em ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% durante

26 min. A formação de HA e HHL foi monitorado a 228 nm, nos tempos de retenção de 8,30

e 15,7 min, respectivamente. A capacidade das amostras na inibirem a ECA próximo a 100%,

indica que ocorreu total inibição.

2.7 ELABORAÇÃO DOS FILMES À BASE DE ÁGAR

Os filmes à base de ágar foram elaborados pela técnica de casting, segundo

método descrito por Giménez et al. (2013a), com adaptações. A solução filmogênica (SF), foi

preparada através da dispersão de 1,0 g de ágar em 100 mL de água destilada a 90 °C, durante

30 min sob agitação contínua em agitador magnético. Então, foi adicionado o glicerol como

plastificante, na concentração de 30% (g de glicerol/ 100 g de ágar) e homogeneizados

durante 20 min sob agitação contínua em agitador magnético. Em seguida, foi adicionado o

hidrolisado proteico - HP (0,5 g de HP/g de ágar) e homogeneizado durante 20 min sob

agitação contínua. Aproximadamente 0,0053 g/cm2 da SF, foi adicionada em placas de Petri

de acrílico com 12 x 12 cm2. Em seguida, os filmes foram secos em estufa com circulação de

ar a 37 °C durante 16 – 18 h. Os filmes foram acondicionados em dessecadores, contendo

brometo de sódio (NaBr) a 58% de umidade relativa (UR) durante 48 h a 22 °C. Como

amostra controle, foi utilizado o filme sem a adição de hidrolisado.

2.7.1 Caracterização dos filmes

2.7.1.1 Espessura

A espessura dos filmes foi determinada com micrômetro digital (MDC-25M,

Mitutoyo, Kanagawa, Japão). A espessura final, foi calculada pela média aritmética de dez

medidas aleatórias sobre a superfície do filme (GONTARD; GUILBERT; CUQ, 1992).

2.7.1.2 Propriedades mecânicas

A resistência à tração – RT (MPa) e a elongação até a ruptura – ER (%) dos

filmes, foram determinadas segundo método descrito pela American Society for Testing and

Materials – ASTM D882-91 (ASTM, 1996) em texturômetro TA.XTplus (Stable Micro

160

Systems, Inglaterra), com adaptações. As amostras foram cortadas em forma de retângulos

(100 x 20 mm) e fixadas em garras com separação inicial de 50 mm. A RT e a ER, foram

mensuradas em 9 tiras de filmes de onde se obtiveram três triplicatas.

2.7.1.3 Permeabilidade ao vapor de água

A permeabilidade ao vapor de água (PVA) foi determinada em triplicata, segundo

método descrito por Sobral et al. (2001). O filme foi selado, em uma célula com área de

permeação de 15,90 cm2, contendo sílica seca (0% UR). Em seguida, a célula foi

acondicionada em dessecadores contendo água destilada (100% UR) a 22 °C. As amostras

foram pesadas a cada hora durante 7 h e a PVA foi determinada segundo a Equação 1:

Onde W é o ganho de massa (g); X é a espessura do filme (mm); t é o tempo (h); A é a área

do filme exposto (cm2) e ΔP é a diferença da pressão parcial entre a atmosfera e a sílica (2642

Pa a 22 °C). Os resultados foram expressos como g mm/ h cm2 Pa.

2.7.1.4 Umidade

A umidade dos filmes foi determinada em triplicata segundo método descrito pela

American Society for Testing and Materials – ASTM D644-94 (ASTM, 1994), com

adaptações. Amostras de filmes com aproximadamente 0,5 g, foram pesadas em cápsulas de

alumínio, previamente taradas e acondicionadas em estufa a 105 °C durante 24 h. Após, as

amostras foram pesadas e a umidade foi determinada com base na perda de massa em relação

a massa inicial.

2.7.1.5 Ângulo de contato com a água (ACA)

O Ângulo de contato com a água (ACA), foi determinado segundo método

descrito por Rhim et al. (2013) com adaptações, em microcroscópio digital (Digital Blue

PVA (g mm/ h cm Pa.)

W x X

t x A x P (1)

161

moldel QX5), para avaliação das características de hidrofobicidade ou hidrofilicidade dos

filmes. Uma gota de água (4 - 6 µL) foi colocada sobre a superfície do filme com dimensões

de 1 x 0,5 cm2, utilizando uma microseringa na temperatura ambiente. O ACA foi calculado

através de medições (de 3 a 6), realizadas em diferentes áreas da superfície da gota de água

utilizando o software Surftens 3.0.

2.8 DIGESTÃO GASTROINTESTINAL ENZIMÁTICA SIMULADA DO FILME

A digestão gastorintestinal enzimática in vitro dos filmes foi realizada, segundo

método descrito por Laparra et al. (2003), com adaptações. Aproximadamente 5 g dos filmes,

foram pesados e adicionados em Erlenmeyer em triplicata. Então, foi adicionado 90 mL de

água cultura de células isotônicas (B. Braun Medical, S.A.) e a dispersão foi acidificada a pH

2 com a adição de HCl (0,1 M). Logo, foi adicionada pepsina à uma concentração de 0,2

mg/mL e o volume foi ajustado para 100 mL. Então, foram incubados em banho termostático

a 37 °C com agitação contínua durante 2 h. A reação foi interrompida, colocando as

dispersões em um banho de gelo e em seguida o pH da dispersão foi ajustado para 6,5 com a

adição de NaHCO3 (1 M). A pancreatina foi adicionada na concentração de 50 µg/mL em

solução de bile (300 µg/mL), em seguida a dispersão foi incubada a 37 °C em banho

termostático durante 2 h sob agitação contínua. A reação foi interrompida, pela adição da

dispersão em banho de gelo. O pH final da dispersão foi ajustado para 7,2 com a adição de

NaOH (0,5 M). A fração digerida foi obtida pela centrifugação a 15000 x g durante 30 min a

20 °C. Os sobrenadantes foram armazenados a – 20 °C até o momento do uso.

2.8.1 Caracterização dos filmes digeridos

2.8.1.1 Atividades anti-hipertensiva, inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV e prolil

endopeptidase

A determinação das atividades anti-hipertensiva, inibitória das enzimas dipeptidil

peptidase-IV (DPP-IV) e prolil endopeptidase (PEP), como indicativo das atividades

antidiabéticas e inibidora de desordens neuropatológicas, das digestões foi determinada pelo

mesmo método descrito para os hidrolisados proteicos. A IC50, à concentração necessária de

162

amostra para inibir 50% da atividade da DPP – IV e PEP, foi expressa em mg/mL. A

atividade anti-hipertensiva foi expressa como % de inibição da ECA.


Todos os resultados, com exceção do perfil de massa molecular média, foram

submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao

nível de 5% de significância. Os dados foram avaliados pelo programa Statistica (versão 5.0,

por StatSoft, Inc., Tulsa, Estados Unidos).



As propriedades anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV

e prolil endopeptidase têm sido relacionadas com a composição e a sequência de aminoácidos,

bem como o tamanho dos peptídeos que os compõem (ALEMÁN et al., 2011a; SILA et al.,

2015; WILSON; HAYES; CARNEY, 2011). A Tabela 1, apresenta a composição de

aminoácidos das amostras de hidrolisados de isolado proteico ou proteína miofibrilar da

castanha. Como pode ser verificado, os aminoácidos presentes em maior conteúdo, para todas

as amostras, foram o ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina, leucina, arginina e alanina.

Najafian e Babji (2015) hidrolisaram isolado proteico de panga (Pangasius sutchi) com

papaína, onde verificaram o mesmo comportamento, no qual os aminoácidos presentes em

maior conteúdo foram o ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina, leucina. Roslan et al. (2014),

verificaram que os aminoácidos presentes em hidrolisados proteicos de subprodutos de tilápia

(O. niloticus) em maior quantidade foram o ácido glutâmico, glicina, ácido aspártico e

alanina. Segundo Chalamaiah et al. (2012) muitos hidrolisados derivados de proteínas

marinhas, têm sido relatados por exibirem variações na sua composição de aminoácidos, as

quais dependem da matéria-prima, enzima e condições de hidrólise. A cisteína foi o

163

Tabela 1 - Composição aminoacídica dos diferentes hidrolisados proteicos

Aminoácido Composição de aminoácidos (mg de aminoácidos/g de proteína)

1 2 3 4 5 6 7 8

Alanina (Ala) 59,40bcd

± 0,67 58,40cde

± 0,04 58,04de

± 1,14 57,18e ± 1,06 60,06

bc ± 0,36 62,31

a ± 0,35 60,93

ab ± 0,27 61,18

ab ± 0,06

Arginina (Arg) 60,85bc

± 0,08 61,01bc

± 0,46 62,06ab

± 1,25 63,28a ± 0,78 63,03

a ± 0,11 59,62

c ± 0,04 62,09

ab ± 0,08 57,83

d ± 0,13

Ác. Aspártico (Asp) 137,02a ± 1,10 136,93

a ± 0,38 131,28

d ± 1,11 132,61

cd ± 0,31 135,27

ab ± 0,70 136,73

a ± 0,60 133,70

bc ± 0,24 131,42

d ± 0,27

Cisteína (Cis) 4,40b ± 0,08 4,16

b ± 0,01 4,11

b ± 0,01 4,11

b ± 0,11 4,05

b ± 0,05 4,96

a ± 0,04 4,03

b ± 0,05 4,00

b ± 0,43

Ác. Glutâmico (Glu) 195,50b ± 1,91 188,60

c ± 1,37 196,16

b ± 2,37 190,66

c ± 1,48 200,50

a ± 0,22 196,19

b ± 0,33 201,20

a ± 0,43 198,25

ab ± 0,18

Glicina (Gli) 33,78b ± 0,61 35,87

a ± 0,28 32,62

c ± 0,64 33,40

bc ± 0,44 32,50

c ± 0,26 36,25

a ± 0,12 34,23

b ± 0,16 35,56

a ± 0,15

Histidina* (His) 24,81ab

± 1,38 24,66ab

± 0,14 24,69ab

± 0,47 24,91ab

± 0,53 23,28c ± 0,22 24,69

ab ± 0,10 23,00

b ± 0,03 26,39

a ± 1,32

Isoleucina* (Ile) 31,26a ± 0,33 31,00

a ± 0,09 31,46

a ± 1,24 31,14

a ± 0,57 29,21

b ± 0,32 26,24

c ± 0,09 28,76

b ± 0,10 25,42

c ± 0,11

Leucina* (Leu) 84,96a ± 0,13 83,96

ab ± 0,19 83,09

bc ± 1,03 82,35

cd ± 0,55 84,45

a ± 0,34 81,28

c ± 0,30 82,36

cd ± 0,13 78,84

e ± 0,13

Lisina* (Lis) 92,30c ± 7,23 96,07

bc ± 0,36 100,21

ab ± 1,35 98,58

abc ± 0,87 103,87

a ± 0,18 97,98

abc ± 0,05 101,41

ab ± 0,32 99,16

abc ± 0,40

Metionina*(Met) 39,78bc

± 0,31 41,68a ± 0,48 39,55

bc ± 0,57 40,34

b ± 0,28 37,80

d ± 0,31 39,33

c ± 0,21 39,14

c ± 0,03 39,49

bc ± 0,11

Fenilalanina*(Fen) 38,43c ± 1,27 38,67

c ± 0,01 38,42

c ± 0,70 39,71

bc ± 0,48 35,32

d ± 0,25 40,92

b ± 0,22 33,82

d ± 0,05 43,88

a ± 0,13

Prolina (Pro) 32,42cd

± 0,13 33,37bc

± 0,46 33,05bc

± 0,06 33,57b ± 0,58 31,11

e ± 0,06 31,71

de ± 0,45 34,88

a ± 0,46 32,95

bc ± 0,28

Serina (Ser) 46,00c ± 0,26 46,04

c ± 0,40 45,09

d ± 0,01 45,83

c ± 0,08 46,84

b ± 0,10 49,08

a ± 0,41 46,22

bc ± 0,30 49,72

a ± 0,02

Treonina (Tre) 45,85ab

± 0,08 45,38ab

± 0,62 46,01ab

± 1,31 46,50a ± 0,99 45,86

ab ± 0,40 44,54

b ± 0,15 45,86

ab ± 0,08 45,40

ab ± 0,01

Tirosina*(Tir) 36,30c ± 0,71 38,32

b ± 0,11 37,68

b ± 0,20 39,88

a ± 0,09 31,48

e ± 0,01 34,15

d ± 0,09 33,84

d ± 0,06 37,93

b ± 0,02

Valina*(Val) 37,00a ± 0,42 35,87

abc ± 0,02 36,47

ab ± 1,08 35,94

ab ± 0,32 35,39

bc ± 0,41 34,02

d ± 0,21 34,52

cd ± 0,01 32,58

e ± 0,46

AAH 363,91ab

± 1,50 365,44a ± 0,34 361,87

b ± 0,70 364,24

a ± 0,20 348,85

e ± 0,16 354,92

c ± 0,15 352,29

d ± 0,13 356,28

c ± 0,13

AAA 74,71cd

± 2,00 77,00c ± 0,11 76,10

cd ± 0,90 79,60

b ± 0,39 66,80

e ± 0,25 75,07

d ± 0,13 67,67

e ± 0,10 81,81

a ± 0,15

AACN 332,51abc

± ,01 325,53de

± 1,75 327,44cde

± 3,47 323,27e ± 1,79 335,77

a ± 0,47 332,92

ab ± 0,92 334,90

ab ± 0,19 329,67

bcd ±0,45

AACP 177,95c ± 5,93 181,74

bc ± 0,68 186,97

ab ± 2,13 186,76

ab ± 1,12 190,18

a ± 0,07 182,29

bc ± 0,09 186,50

ab ± 0,43 183,37

bc ± 0,80

*AAE 394,36 ab

± 4,98 390,23 ab

± 0,28 391,57 ab

± 2,78 392,86 ab

± 1,11 395,17 a ± 0,85 389,00

b ± 0,40 388,88

b ± 0,75 391,16

ab ± 0,92

1: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HIPA2); 3: Hidrolisado de PMC com GH

de 10% utilizando a Alcalase (HPMA1); 4: Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Alcalase (HPMA2); 5: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a

Protamex (HIPP1); 6: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Protamex (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Protamex (HPMP1); 8:

Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Protamex (HPMP2); AAH: aminoácidos hidrofóbicos (alanina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, prolina,

metionina e cisteína); AAA: aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina); AACP: aminoácidos carregados positivamente (arginina, histidina, lisina); AACN:

aminoácidos carregados negativamente (ácido aspártico, ácido glutâmico); *AAE: aminoácidos essenciais (fenilalanina, valina, treonina, isoleucina, metionina, histidina

leucina e lisina). Letras iguais na mesma linha, indicam que não há diferença significativa (p > 0,05).

164

aminoácido presente em menor conteúdo, em todas as amostras de hidrolisados avaliadas,

onde seu conteúdo variou de 4,00 a 4,96 mg/gproteína. O baixo conteúdo de cisteína, foi

verificado em muitos trabalhos com hidrolisados proteicos de pescado (GIRGIH et al., 2013;

NAJAFIAN; BABJI, 2015; ROSLAN et al., 2014).

Segundo Chalamaiah et al. (2012) os hidrolisados proteicos provenientes de

proteínas de pescado, são uma boa fonte de aminoácidos essenciais (AEE). Segundo a Food

and Agriculture Organization – FAO (FAO, 1999), a quantidade de AAE recomendada para

os adultos é: 16 mg/gproteína de histidina, 13 mg/gproteína de valina, 17 mg/gproteína de metionina,

13 mg/gproteína de isoleucina, 19 mg/gproteína de leucina, 19 mg/gproteína de fenilalanina, 16

mg/gproteína de lisina, respectivamente. Todas as amostras de hidrolisados, obtidas no presente

estudo, apresentaram conteúdo desses aminoácidos superior ao preconizado pela FAO.

Os tratamentos 1 (HIPA1), 2 (HIPA2), 3 (HPMA1) e 4 (HPMA2), hidrolisados de

IPC ou PMC através do uso da Alcalase em GH 10 ou 20%, apresentam um teor de

aminoácidos hidrofóbicos (AAH) de 363,91; 365,44; 361,87 e 364,24 mg/gproteína,

respectivamente. Esses tratamentos apresentaram um conteúdo superior (p < 0,05) de AAH,

comparado com as amostras hidrolisadas pela Protamex, para a mesma matéria-prima e GH.

Segundo Intarasirisawat et al. (2012), a Alcalase tem sido reportada como a enzima que

possui afinidade em hidrolisar resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Khantaphant, Benjakul

e Kishimura (2011), verificaram que os hidrolisados do músculo de lúcio marrom (L. vitta),

hidrolisados pela Alcalase, apresentaram um conteúdo superior de AHH em relação aos

hidrolisados que utilizaram Flavourzyme como enzima. O aumento no GH de 10 para 20%,

para as amostras hidrolisadas com a mesma matéria-prima e enzima, resultou em um

acréscimo no conteúdo de AHH (p < 0,05), com exceção das amostras dos tratamentos 1 e 2.

O aumento na extensão da hidrólise resulta na exposição e acúmulo de cadeias laterais

hidrofóbicas de aminoácidos de baixa massa molecular (PANYAM; KILARA, 1996).

O conteúdo de aminoácidos aromáticos (AAA) aumentou significativamente (p <

0,05) com o acréscimo do GH de 10 a 20%, para as amostras obtidas com a mesma matéria-

prima e enzima. Além disso, pode-se verificar que a enzima Alcalase resultou em hidrolisados

com conteúdo significativamente superior (p < 0,05) de AAA, ao verificado para hidrolisados

da Protamex. A Alcalase tem ampla especificidade em hidrolisar a maioria das ligações

peptídicas, preferencialmente aquelas que possuem resíduos de aminoácidos aromáticos

(DOUCET et al., 2003). A presença de peptídeos com aminoácidos aromáticos no extremo C-

terminal, um resíduo carregado positivamente na posição intermediária e um aminoácido

hidrofóbico no extremo N-terminal, podem ser potenciais inibidores da ECA (WU; ALUKO;

165

NAKAI, 2006). No presente estudo foi verificado, que com o aumento no GH ocorreu uma

diminuição no conteúdo de aminoácidos carregados positivamente (AACP), para hidrolisados

pela Protamex com a mesma matéria-prima. Entretanto, foi verificado um acréscimo (p <

0,05) de 177,95 para 181,74 mg/gproteína com o aumento de 10 para 20% no GH, para a

amostra hidrolisada de IPC utilizando a Alcalase como enzima.

O acréscimo no GH de 10 para 20%, resultou em uma diminuição significativa (p

< 0,05) dos aminoácidos carregados negativamente - AACN, para todos os hidrolisados da

mesma matéria-prima e enzima. Além disso, pode-se observar um acréscimo significativo (p

< 0,05) no conteúdo de AACN para as amostras hidrolisadas pela Protamex, com a mesma

matéria-prima e GH avaliados. O conteúdo de AACN variou de 323,27 a 335,77 mg/gproteína,

para os diferentes tratamentos avaliados. Wiriyaphan et al. (2015), elaboraram hidrolisados

proteicos de surimi de subprodutos de threadfin bream (Nemipterus spp.), os quais

apresentaram um conteúdo de AACN de 222,4 mg/gproteína, inferior ao encontrado no presente

estudo.


A Figura 1, apresenta o perfil de massa molecular (MM) média dos diferentes

hidrolisados proteicos. As amostras hidrolisadas pela a Alcalase, apresentaram uma MM

média de 1285 Da, 1083 Da, 1245 Da e 1066 Da para os tratamentos 1; 2; 3 e 4,

respectivamente. Esses resultados foram inferiores, aos verificados para as amostras

hidrolisadas pela Protamex, comparando a mesma matéria-prima e GH. Este fato ocorre, pois

a Protamex posssui uma mistura de tipos catalícos de metalo proteases, serina proteases,

proteases aspárticas e carboximetilpeptidase (BENÍTEZ; IBARZ; PAGAN, 2008). Nas

proteases aspárticas e metalo proteases, o ataque nucleófilo é mediado por uma molécula de

água, ativada por dois resíduos de ácido aspártico, um resíduo de ácido glutâmico e por um

íon metálico, respectivamente. (RAWLINGS; BARRETT; BATEMAN, 2010; TEIXEIRAS,

2011). Contudo, a Alcalase possui um resíduo aminoácido de serina no sítio ativo, que atua

como nucleófilo, não necessitando de um íon metálico para a ativação do ataque nucleófilo

como a Protamex (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).

Sila et al. (2015) verificaram que a gelatina de pele de barbus (Barbus callensis),

hidrolisadas pela Alcalase ou Protamex a um GH de 14,17% e 10,38%, apresentaram uma

MM média de 1995 Da e 2325 Da, respectivamente. Esses resultados foram superiores aos

166

Figura 1 - Perfil de massa molecular média dos diferentes hidrolisados proteicos

1: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a

Alcalase (HIPA2); 3: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HPMA1); 4: Hidrolisado de PMC com

GH de 20% utilizando a Alcalase (HPMA2); 5: Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Protamex (HIPP1); 6:

Hidrolisado de IPC com GH de 20% utilizando a Protamex (HIPP2); 7: Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a

Protamex (HPMP1); 8: Hidrolisado de PMC com GH de 20% utilizando a Protamex (HPMP2).

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

167

verificados para hidrolisados de IPC ou PMC, utilizando a Alcalase a um GH de 10%

apresentaram 1285 Da e 1245 Da. As mesmas matérias-primas, no mesmo GH, hidrolisadas

pela Protamex apresentaram uma MM média de 1921 Da e 1845 Da.

O acréscimo no GH de 10 para 20%, em todas as amostras avaliadas, resultou em

peptídeos de menor MM média. Raghavan e Kristinsson (2009a), verificaram que o acréscimo

no GH de 7,5 para 25% nos hidrolisados de isolados proteicos de tilápia (Oreochromis

niloticus), também resultou em uma diminuição da MM. Liu et al. (2014) verificaram, em

seus estudos com hidrolisados de surimi de carpa prateada (Hypophthalmichthys molitrix)

com diferentes GH (10, 20 e 30%), utilizando Alcalase e Protamex, que a MM dos

hidrolisados diminuiu com o aumento no GH. Segundo Panyam e Kilara (1996) as proteínas

que são extensivamente hidrolisadas, apresentam uma diminuição da MM dos hidrolisados

obtidos.

A Alcalase e a Protamex, conforme verificado na Figura 1, apresentaram maior

afinidade pela PMC em relação ao IPC. Os hidrolisados de IPC apresentaram uma MM média

de 1285 Da e 1083 Da para hidrolisados de Alcalase com GH de 10 e 20%, superior ao

verificado para os hidrolisdos de PMC utilizando a mesma enzima e o mesmo GH,

respectivamente. O mesmo comportamento foi observado para os hidrolisados com a

Protamex. Segundo Silva, Fonseca e Prentice (2014), durante o processo de isolamento

proteico, podem ocorrer alterações na estrtura da proteína, dificultando a ação das enzimas, o

que resulta em amostras com menor GH e peptídeos de maior MM, conforme foi verificado

no presente estudo.


3.3.1 Atividade inibitória da dipeptidil peptidase-IV

Os inibidores da dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV), representam uma nova classe

de agentes antidiabéticos, os quais melhoram o controle glicêmico através do bloqueio de

DPP-IV, prolongando o efeito incretina in vivo (MCINTOSH et al., 2005). A Tabela 2

apresenta a determinação da concentração necessária de amostra para inibir 50% (CI50) da

atividade da DPP – IV.

Os hidrolisados da Protamex, com exceção do tratamento 8, não apresentaram

diferença significativa (p > 0,05) em relação à CI50. Os valores de CI50 da DPP-IV para essas

168

amostras, variaram de 0,50 a 0,68 mg/mL. Entretanto, para as amostras hidrolisadas com a

Alcalase, foi verificado que com o acréscimo no GH, houve uma diminuição significativa (p <

0,05) na CI50, para a amostra hidrolisada com a mesma matéria-prima, onde a CI50 variou de

0,36 a 0,52 mg/mL. Sila et al. (2015) verificaram hidrolisados da gelatina de pele de barbo

(Barbus callensis), utilizando a Alcalase ou a Protamex com um GH de 14,17 e 10,38%,

apresentaram uma CI50 da DPP-IV de 2,62 e 2,43 mg/mL. Li-Chan et al. (2012) verificaram

que os hidrolisados da gelatina da pele de salmão (Salmo salar), apresentaram uma CI50 de

1,35 mg/mL para amostras com MM abaixo de 1000 Da. Esses resultados foram superiores

aos determinados no presente estudo para qualquer amostra de hidrolisado.

Tabela 2 - Atividade inibitória da dipeptidil-peptidase-IV (DPP-IV), da prolil endopeptidase

(PEP) e da enzima conversora da angiostensina (ECA) dos diferentes hidrolisados proteicos

IPC: isolado proteico de castanha; PMC: proteínas miofibrilares; GH: grau de hidrólise; CI50: concentração

(mg/mL) necessária de amostra para inibir 50% da atividade da enzima; Um exemplo da determinação do CI50,

está apresentada no APÊNDICE III; Letras iguais na mesma coluna, indicam que não há diferença significativa

(p > 0,05).

Além disso, os hidrolisados da Alcalase apresentaram potente atividade inibitória

(p < 0,05) da DPP-IV em relação aos hidrolisados pela enzima Protamex, comparando a

mesma matéria-prima e GH utilizados. Conforme foi verificado na Figura 1, os hidrolisados

da Alcalase apresentam menor MM média, quando comparados aos hidrolisados da Protamex,

com a mesma matéria-prima e GH. Alguns autores (CUDENNEC et al., 2015; HSU et al.,

2013; LI-CHAN et al., 2012), relacionam a atividade inibidora da DPP-IV com o tamanho

dos peptídeos. Muito dos inibidores sintéticos são derivados de dipeptídeos e possuem baixa

massa molecular (DEACON; HOLST, 2006). Mosquera (2014) verificou que a fração

molecular < 3000 Da de hidrolisados de camarão (Penaeus notialis), apresentaram uma CI50

da DPP-IV de 0,46 mg/mL. Sila et al. (2015) não verificaram em seus estudos, a relação entre

Tratamento Matéria-prima Enzima GH

(%)

CI50 DPP-IV

(mg/mL)

CI50 PEP

(mg/mL)

ECA

(%)

1 IPC Alcalase 10 0,52b ± 0,01 0,99

b ± 0,01 61,81

d ± 1,65

2 IPC Alcalase 20 0,44d ± 0,00

1,26

a ± 0,03 74,36

c ± 4,82

3 PMC Alcalase 10 0,45cd

± 0,01 0,97b ± 0,08 72,84

c ± 2,91

4 PMC Alcalase 20 0,36e ± 0,03 1,33

a ± 0,04 77,27

bc ± 0,58

5 IPC Protamex 10 0,64a ± 0,01 0,77

c ± 0,01 84,65

ab ± 4,32

6 IPC Protamex 20 0,66a ± 0,03 1,10

b ± 0,07 86,44

a ± 1,64

7 PMC Protamex 10 0,68a ± 0,02 0,72

c ± 0,01 87,68

a ± 0,73

8 PMC Protamex 20 0,50bc

± 0,02 1,01b ± 0,05 84,62

ab ± 0,18

169

a inibição da DPP-IV e a massa molecular das amostras, sugerindo que é a sequência dos

peptídeos presentes nos hidrolisados, o principal responsável pela atividade inibitória. A

sequência dos peptídeos é um fator determinante, pois a DPP-IV possui especificidade por

substratos que possuem Ala ou Pro no extremo N-terminal da cadeia polipeptídica

(MCINTOSH et al., 2005; YAZBECK; HOWARTH; ABBOTT, 2009). Segundo a Tabela 1,

as amostras hidrolisadas com Alcalase apresentaram maior conteúdo de Pro e os hidrolisados

da Protamex maior conteúdo da Ala. Devido a isso, a atividade inibitória da DPP-IV do

presente estudo, pode ser atribuída a MM média dos diferentes hidrolisados proteicos.

3.3.2 Atividade inibitória da prolil endopeptidase

Estudos recentes (LAFARGA; HAYES, 2014; SILA et al., 2015; WILSON;

HAYES; CARNEY, 2011) indicam que a prolil endopeptidase (PEP), pode estar relacionada

com as doenças neuropatológicas. Devido a isso, estudos sobre inibidores da PEP oriundos de

diversas fontes estão sendo realizados (LAFARGA; HAYES, 2014; SILA et al., 2015;

TEZUKA et al., 1999). Os inibidores da PEP podem melhorar a memória, através do bloqueio

do metabolismo dos neuropeptídeos endógenos (TEZUKA et al., 1999). A concentração

necessária de amostra para inibir 50% (CI50) da PEP pode ser observada na Tabela 2.

As amostras hidrolisadas pela Protamex, apresentaram maior atividade inibitória

da PEP (p < 0,05), em relação às amostras hidrolisadas pela Alcalase. As amostras

hidrolisadas pela Protamex apresentaram maior MM média, segundo a Figura 1, em relação às

amostras hidrolisadas pela Alcalase, com a mesma matéria-prima e o mesmo GH. Além disso,

o acréscimo no GH de 10 para 20% resultou em um acréscimo significativo (p < 0,05) da CI50

para todas as amostras de hidrolisados avaliadas. Como foi verificado na Figura 1, as

amostras com maior GH, apresentaram menor MM média. Segundo Wilson, Hayes e Carney

(2011), a PEP cliva ligações peptídicas de proteínas com massa molecular relativamente

pequena. Esse fato, sugere que a atividade inibitória dos hidrolisados da Protamex não está

associada a MM. Segundo Sila et al. (2015), as diferenças na atividade inibitória podem ser

atribuídas a especificidade da enzima, a qual é um fator chave porque influencia as

características dos hidrolisados, a natureza e a composição dos peptídeos obtidos.

A maior atividade de inibição da PEP (CI50 = 0,72 mg/mL), foi obtida pela

amostra 7, da PMC hidrolisada pela Protamex com GH de 10%, e a menor atividade de

inibição da PEP (CI50 = 1,26 mg/mL) foi verificada para a amostra 2, do IPC hidrolisado pela

170

Alcalase com GH de 20%. Segundo Iwaniak e Minkiewicz (2008), a estrutura típica que

ocorre na maioria dos peptídeos inibidores da PEP, são de resíduos repetitivos da Pro. A

amostra 7, apresentou maior conteúdo de Pro (34,88 mg/gproteína) em relação às demais

amostras. Segundo Wilson, Hayes e Carney (2011) a PEP é uma serina protease, que cliva

ligações peptídicas no lado carboxila de resíduos da Pro, que contêm a sequência X-Pro-Y,

onde o X é um peptídeo ácido ou amino e Y pode ser uma amida, um peptídeo, um

aminoácido, uma amina aromática ou álcool. Entretanto, a amostra 5 apresentou uma CI50 de

0,77 mg/mL e seu conteúdo de Pro (31,11 mg/gproteína) foi significativamente inferior (p <

0,05) as demais amostras analisadas. A sequência da ligação peptídica pode ter influenciado

na inibição da PEP pelos hidrolisados.

Sila et al. (2015) verificaram que seus hidrolisados elaborados à base de gelatina

de pele de barbo (Barbus callensis), utilizando como enzimas a Esperase, Savinase, Alcalase,

Tripsina, Izyme G, Protamex, Neutrase e Peptidase com um GH de 9,29; 9,21; 14,17; 8,48;

5,74; 10,38; 9,45 e 7,43% apresentaram uma CI50 da PEP de 1,19; 1,95; 1,68; 0,91; 1,52;

1,78; 1,79 e 3,79 mg/mL, respectivamente. A gelatina de pele de barbo, apesar de possuir

elevado conteúdo de Pro, resultou em hidrolisados com CI50 elevada da PEP em relação aos

resultados obtidos no presente estudo. Além disso, foi verificado no estudo desses autores,

que o acréscimo no GH e a diminuição da MM não apresentaram relação com atividade

inibitória da PEP. Devido ao exposto, seria necessário o sequenciamento da amostra com a

maior capacidade de inibição da PEP, para verificar quais os aminoácidos presentes e a

sequência dos mesmos, para elucidar o efeito desses sobre a inibição da PEP.

3.3.3 Atividade anti-hipertensiva

Os peptídeos derivados de fontes marinhas, podem inibir a atividade da enzima

conversora de angiotensina (ECA), sendo eficazes na redução da pressão sanguínea

(ALEMÁN; GÓMEZ-GUILLÉN; MONTERO, 2013; KHANTAPHANT; BENJAKUL;

KISHIMURA, 2011; NASRI et al., 2013; WU et al., 2015). A inibição da ECA pode ser

observada na Tabela 2. As amostras hidrolisadas pela Protamex, apresentaram maior atividade

inibitória da ECA (p < 0,05), as quais variaram de 84,62 para 87,68%, em relação às amostras

hidrolisadas pela Alcalase, 61,81 para 77,27%, respectivamente. Nasri et al. (2013),

obtiveram uma inibição da ECA variando de 71,30 e 99,00%, a partir de 1,5 mg/mL de

hidrolisados do músculo de Goby (Zosterissessor ophiocephalus) pela tripsina e por enzimas

171

digestivas a um GH de 5,85 e 23,30%, respectivamente. Esses resultados obtidos, sugerem

que o tipo de enzima utilizada afetou significativamente (p < 0,05) a atividade inibitória da

ECA. Khantaphant, Benjakul e Kishimura (2011) verificaram que o tipo de enzima,

Flavourzyme e Cryotin, utilizadas para hidrolisar o músculo de lúcio marrom (Lutjanus vitta),

apresentou influência no capacidade de inibição da ECA. Alemán et al. (2011b) também

verificaram que a enzima utilizada para hidrolisar gelatina de pota (D. gigas), afetou a

atividade inibitória da ECA.

Segundo Pihlanto (2000) os aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Val, Iso, Leu, Tir,

Fen, Pro, Met e Cis) na posição C-terminal, são eficazes como inibidores da ECA devido à

maior interação entre eles e o sítio ativo da enzima. Segundo Wu, Aluko e Nakai (2006), a

presença de peptídeos com aminoácidos aromáticos no extremo C-terminal, um resíduo

carregado positivamente na posição intermediária e um aminoácido hidrofóbico no extremo

N-terminal, podem ser potenciais inibidores da ECA. No presente estudo, as amostras

hidrolisadas com a Protamex, apresentaram maior conteúdo de Ala em relação às amostras

hidrolisadas pela Alcalase. O tratamento 7, apresentou maior conteúdo de Pro (34,88

mg/gproteína) e um conteúdo elevado de Ala (60,93 mg/gproteína), apresentando uma inibição da

ECA (87,68%). Segundo Alemán et al. (2011b), os inibidores sintéticos comerciais (captopril

e enalapril), apresentam em sua estrutura um resíduo da Pro. Além disso, segundo FitzGerald,

Murray e Walshi (2004) a sequência Fen-Ala-Pro, é uma das mais favoráveis para ligar-se ao

centro catalítico da ECA. O sequenciamento da amostra, com potente inibição da ECA seria

importante, para verificação do tipo de aminoácidos presente nessa sequência e qual o seu

efeito na inibição da mesma.

O aumento no GH, resultou em uma tendência ao acréscimo na inibição da ECA,

com exceção da amostra 8. Raghavan e Kristinsson (2009), em seus estudos com hidrolisados

obtidos de isolado proteico de tilápia, observaram que com o aumento no GH de 7,5 para 25%

a inibição da ECA apresentou um acréscimo de 62 para 71% e de 66 para 77% para as

amostras hidrolisadas pela Cryotin e Flavourzyme, respectivamente. As amostras com GH de

20%, apresentaram uma MM média inferior ao encontrado para as amostras com GH de 10%,

como foi verificado na Figura 1. Os resultados do presente estudo sugerem que os peptídeos

de baixa MM são melhores inibidores da ECA, em relação aos peptídeos de elevada MM

média, comparando os hidrolisados obtidos com a mesma matéria-prima e enzima. As

sequências peptídicas de baixa massa molecular, possuem elevada propriedade de inibição da

ECA, pois massas moleculares elevadas dificultam o acesso do peptídeo ao sítio ativo da

enzima (ONDETTI; CUSHMAN, 1982).

172

3.4 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES

Dentre as amostras de hidrolisados proteicos o tratamento 2, o hidrolisado

proteico de IPC em um GH de 20% utilizando a Alcalase como enzima, foi o escolhido para a

incorporação em filmes à base de ágar, devido as suas potentes atividades antimicrobiana,

antioxidantes, conforme foi verificado no Artigo 2, e inibitória da DPP-IV, apesar dessa

amostra apresentar uma atividade anti-hipertensiva intermediária e uma baixa inibição da

prolil endopeptidase. A Figura 2 apresenta os filmes elaborados com e sem a incorporação do

hidrolisado.

Figura 2 – Filmes elaborados à base de ágar com e sem a incorporação do hidrolisado de

isolado proteico da castanha

Segundo The et al., (2009) os filmes elaborados à base de ágar são claros e

transparentes. Isto foi verificado no presente estudo, onde os filmes elaborados à base de ágar

com e sem a incorporação do hidrolisado do isolado proteico da castanha, apresentaram-se

homogêneos e transparentes.

3.4.1 Espessura e propriedades mecânicas

A espessura do filme é característica física importante, pois ao utilizá-lo como

embalagem deve se considerar o tipo, volume e peso do alimento a armazenado (PÉREZ-

GAGO; KROCHTA, 2001). As propriedades mecânicas, resistência à tração (RT) e

173

elongação até a ruptura (ER), são importantes, pois os materiais de embalagem devem ter a

resistência mecânica suficiente para manter a sua integridade durante o manuseio e

armazenamento (WIHODO; MORARU, 2013). A Tabela 3, apresenta as propriedades dos

filmes com e sem a incorporação do hidrolisado do isolado proteico da castanha.

Tabela 3 – Espessura, resistência à tração (RT), elongação até a ruptura (ER), permeabilidade

ao vapor de água (PVA), umidade e ângulo de contato da água (ACA) dos filmes com e sem a

incorporação do hidrolisado

Controle: filmes à base de ágar sem a incorporação do hidrolisado; Hidrolisado: filmes com a incorporação de

hidrolisado; Letras iguais na mesma linha, indicam que não há diferença significativa (p > 0,05); O plastificante

adicionado foi o glicerol, na proporção de 30% (30 g de glicerol/100 g de ágar).

A espessura dos filmes controle (0,043 mm) e peptídeos (0,043 mm) não

apresentou diferença signinificativa (p > 0,05). Este fato ocorre, devido à quantidade de

sólidos totais adicionados na placa ser a mesma. Segundo Pérez-Gago e Krochta a espessura

do filme, independentemente da técnica de elaboração, deve ser homogênea, pois pode

acarretar problemas de conservação e também mecânicos. Atef, Rezaei e Behrooz (2014),

elaboraram filmes com 1,5% de ágar e 33% de glicerol (g de glicerol/100 g de ágar), os quais

obtiveram uma espessura de 0,067 mm. Esse resultado foi superior ao verificado no presente

estudo, isto pode ter ocorrido devido ao conteúdo superior de sólidos totais adicionados na

placa de Petri. Segundo Rhim et al. (2006), em geral, a espessura dos filmes biopoliméricos é

dependente do teor de sólidos totais.

A resistência à tração (RT) e a elongação até a ruptura (ER) dos filmes controle

foi de 29,59 MPa e 23,23%, respectivamente. Segundo Sousa e Gonçalves (2015), os filmes

elaborados à base de polissacarídeos de algas marinhas, tal como o ágar, possuem boa

resistência mecânica, o que foi verificado no presente estudo. Giménez et al. (2013a)

elaboraram filmes com 1,5% de ágar (p/v) e 33% de glicerol (g glicerol/100 g de ágar), e

verificaram que a RT e a ER foram de 18,48 MPa e 62,35%, respectivamente. O conteúdo de

Propriedades Controle Hidrolisado

Espessura (mm) 0,043a ± 0,001 0,043

a ± 0,002

RT (MPa) 29,59a ± 2,94 19,44

b ± 1,97

ER (%) 23,23b

± 1,78 43,71a ± 1,20

PVA (x 10-8

)

(g mm/ h Pa cm2)

1,36b

± 0,09 3,50a ± 0,21

Umidade (%) 20,77b ± 0,45 29,60

a ± 0,39

ACA (°) 38,33ª ± 0,33 29,17b ± 0,44

174

plastificante glicerol adicionado por esses autores, foi superior ao incorporado no presente

estudo. O glicerol reduz a densidade das interações das macromoléculas, aumentando a

mobilidade das cadeias poliméricas e, consequentemente, tornando os filmes menos

resistentes e mais elongáveis. Shankar e Rhim (2015), elaboraram filmes com 2% de ágar

(p/v), 0,6% de glicerol (p/v) e obtiveram uma RT de 45,80 MPa e uma ER de 13,9%,

respectivamente. As propriedades mecânicas relatadas na literatura para filmes à base de ágar

são variáveis, atribuídas principalmente a diferentes conteúdos de polímero e plastificante

utilizados na elaboração dos filmes. Geralmente, quanto maior o teor de polímero na solução

filmogênica, maior a resistência dos filmes (GIMÉNEZ et al., 2013a).

Com a adição do hidrolisado, a RT e a ER dos filmes diminuiu e aumentou

significativamente (p < 0,05) para 19,44 MPa e 43,71%, respectivamente. Nuanmano,

Prodpran e Benjakul (2015) verificaram que filmes à base de proteína miofibrilar de tilápia,

adicionados de hidrolisados proteicos de gelatina de pele de tilápia, com um GH de 23%,

apresentaram um aumento significativo na ER de, aproximadamente, 39 para 77%, quando a

adição de hidrolisado aumentou de 30% (g hidrolisado/ 100 g de proteína) para 60% (g

hidrolisado/ 100 g de proteína). Giménez et al. (2009b) verificaram que os filmes à base de

gelatina de pele de pota (D. gigas), incorporados com hidrolisados proteicos, apresentaram

uma diminuição na resistência mecânica e um acréscimo na distensibilidade dos filmes, em

relação aos filmes sem a incorporação dos hidrolisados. Segundo Nuanmano, Prodpran e

Benjakul (2015) os peptídeos de cadeia curta, podem atuar como plastificantes em filmes

proteicos, reduzindo a interação entre os polímeros, aumentando o volume livre entre eles e

consequentemente a elongação. Dessa forma, a resistência à tração diminui, o que foi

verificado neste estudo.

3.4.2 Permeabilidade ao vapor de água e umidade

As embalagens de filmes poliméricos, devem ter propriedades de transferência de

massa adequadas para sua utilização. As perdas significativas da qualidade alimentar, podem

ocorrer devido a transferência de umidade, gases, aroma, sabor e cor para o ambiente

circundante (WIHODO; MORARU, 2013). A permeabilidade ao vapor de água (PVA), é

definida como a taxa de transmissão de vapor de água por unidade de área através do filme,

de espessura conhecida, induzida por um gradiente de pressão entre duas superfícies

específicas, que no presente estudo ocorreu entre a sílica e a água (ASTM, 1995). A Tabela 3,

175

apresenta a permeabilidade ao vapor dos filmes com e sem a incorporação de hidrolisado do

isolado proteico do castanha.

Os filmes controle apresentaram uma PVA e umidade de 1,36 x 10-8

g mm/ h Pa

cm2 e 20,77%, as quais foram significativamente (p < 0,05) inferiores aos valores encontrados

para os filmes com a incorporação do hidrolisado, os quais apresentaram 3,50 x 10-8

g mm/ h

Pa cm2 e 29,60%, respectivamente. Giménez et al. (2013a), elaboraram filmes com 1,5% de

ágar (p/v) e 33% de glicerol (g glicerol/100 g de ágar), os quais apresentaram uma PVA de

7,35 x 10-8

g mm/ h Pa cm2, superior ao encontrado no presente estudo para filmes controle e

com hidrolisado. O conteúdo de glicerol adicionado por esses autores foi superior ao

adicionado para os filmes controle. O glicerol é altamente hidrofílico, que devido a isso pode

atrair moléculas de água, formando um complexo hidrodinâmico água-plastificante,

aumentanto a absorção de água e a permeabilidade ao vapor de água através do filme

(NEMET; ŠOŠO; LAZIĆ, 2010). Segundo Sousa e Gonçalves (2015) os filmes à base de

polissacarídeos de algas marinhas, como o ágar são hidrófilos e quebradiços. Devido a isso,

torna-se necessarária a adição de glicerol para minimizar as interações ágar-ágar, resultando

em um filme flexível, porém mais permeável e solúvel.

A adição dos peptídeos resultou em um acréscimo significativo (p < 0,05) na PVA

dos filmes 3,50 x 10-8

g mm/ h Pa cm2. Giménez et al. (2009b) verificaram que os filmes à

base de gelatina de pele de pota (D. gigas), incorporados com hidrolisados proteicos

apresentaram um acréscimo significativo na PVA após adição de 5% (2,99 x 10-8

g mm/ h Pa

cm2) e 10% (3,30 x 10

-8 g mm/ h Pa cm

2) de hidrolisado proteico. Segundo Nuanmano,

Prodpran e Benjakul (2015) os filmes de proteína miofibrilar de tilapia (Oreochromis

niloticus), adicionados de hidrolisado proteico de gelatina de pele de tilápia em diferentes GH,

apresentaram um acréscimo na PVA, com o incremento no conteúdo de hidrolisado

incorporado no filme. Segundo esses autores, os hidrolisados com elevado GH possuem

peptídeos de baixa massa molecular, os quais podem transferir um número elevado de grupos

hidrófilos (-NH2, -COOH, -OH) à matriz do filme. Em consequência, os filmes absorvem

mais moléculas de água, aumentando a PVA dos filmes resultantes. O hidrolisado 2, de IPC

com GH de 20% utilizando a Alcalase (HIPA2), o qual foi incorporado no filme, possui em

sua constituição um número elevado de aminoácidos hidrófilos (Tabela 1), o que pode ter

contribuído para o acréscimo na PVA e na umidade dos filmes incorporados com o

hidrolisado.

176

3.4.3 Ângulo de contato com a água (ACA)

O ângulo de contato da água (ACA), é uma das propriedades de molhabilidade

básicas dos materiais de embalagem, indicando propriedades hidrófilas/hidrófobas do material

(RHIM et al., 2013). A Tabela 3, apresenta o ACA dos filmes com e sem a incorporação do

hidrolisado. O filme controle apresentou um ACA de 38,33 °, significativamente superior (p <

0,05) ao verificado para o filme com a incorporação do hidrolisado (29,17 °),

respectivamente. Atef, Rezaei e Behrooz (2014) elaboraram filmes à base de ágar com 1,5% e

33% de glicerol (g de glicerol/100 g de ágar), os quais apresentaram um ACA de 60,57 °,

superior ao verificado no presente estudo. Segundo Rhim e Hong (2007), geralmente, um

filme que apresenta uma ACA inferior a 65 °, é considerado como hidrófilo. No presente

estudo, os filmes elaborados apresentaram uma característica hidrófila. Entretanto, pode-se

afirmar que o filme adicionado de hidrolisado mostou maior tendência a molhabilidade que o

filme controle. Isto explica, a maior PVA e umidade apresentadas para os filmes com a

incorporação de hidrolisado em relação ao controle. Rhim et al. (2013), verificaram que os

filmes que apresentaram maior ACA, apresentaram menor PVA e elevada resistência à água.

3.5 CARACTERIZAÇÃO DO FILME DIGERIDO ATRAVÉS DE SIMULAÇÃO

GASTROINTESTINAL

3.5.1 Atividades anti-hipertensiva, e inibitória da dipeptidil peptidase-IV e da prolil

endopeptidase

Apesar dos filmes representarem uma pequena porção dos alimentos que

revestem, o estudo da sua digestibilidade pode fornecer informações úteis para o uso em

potencial deste tipo de material no desenvolvimento de alimentos funcionais (GIMÉNEZ et

al., 2013b). A Tabela 4 apresenta a inibição da ECA, DPP- IV e da PEP, do hidrolisado e após

a digestão do filme com a incorporação do hidrolisado.

Após a digestão gastrointestinal enzimática simulada dos filmes, foi observado

um acréscimo significativo (p < 0,05) na concentração (mg/mL) necessária de amostra para

inibir 50% da DPP-IV e da PEP, em relação aos resultados obtidos para o hidrolisado

proteico. Além disso, a inibição da ECA foi significativamente inferior (p < 0,05) ao resultado

obtido para o hidrolisado proteico sem digestão.

177

Tabela 4 - Atividade inibitória da dipeptidil-peptidase IV (DPP-IV), da prolil endopeptidase

(PEP) e da enzima conversora da angiostensina (ECA) do hidrolisado proteico de castanha e

dos filmes após a digestão enzimática

CI50: concentração (mg/mL) necessária de amostra para inibir 50% da atividade da enzima; Filme: filme digerido

com a incorporação de hidrolisado; Hidrolisado: amostra que não digerida; Letras iguais na mesma linha,

indicam que não há diferença significativa (p > 0,05).

Muitos efeitos da digestão gastrointestinal simulada têm sido relatados. Segundo

Alemán, Gómez-Guillén e Montero (2013), após a digestão da pepsina de hidrolisados de

colágeno de pele de pota (D. gigas), a massa molecular dos peptídeos permaneceram

inalterados. Entretanto, após a digestão da pancreatina houve um acréscimo no conteúdo de

peptídeos com massa molecular abaixo de 430 Da, resultando em um aumento na inibição da

ECA, comparado com as amostras não digeridas. Miguel et al. (2006) estudaram a inibição da

ECA após a digestão gastrointestinal de peptídeos da ovoalbumina, onde verificaram que a

atividade da ECA diminuiu cerca de cem vezes. No presente estudo, foi observada uma

diminuição na capacidade de inibição da ECA, em aproximadamente 3,3 vezes após a

digestão dos filmes, em relação a amostra de hidrolisado. A inibição da DPP-IV e da PEP,

também foram afetadas pelo processo de digestão gastrointestinal. Entretanto, Nongonierma e

Fitzgerald (2013), avaliaram a inibição da DPP-IV após a digestão gastrointestinal do isolado

proteico do soro de leite, onde verificaram o aumento na capacidade da inibição dessa enzima.

Estes resultados sugerem, que as atividades inibitória da DPP-IV, da PEP e da ECA dos

filmes incorporados do hidrolisado, foram afetadas após a digestão gastrointestinal simulada,

indicando que sequências menos ativas foram liberadas após a digestão. O processo de

digestão pode atuar sobre os hidrolisados, fazendo com que ocorra uma quebra e a formação

de novas sequências peptídicas, o que pode ter influenciado nos resultados obtidos.

4 CONCLUSÃO

Os hidrolisados proteicos preparados a partir do isolado proteico e da proteína

miofobrilar da castanha utilizando como enzimas a Alcalase e Protamex, em diferentes graus

de hidrólise, apresentaram atividade antidiabética, anti-hipertensiva e inibitória de doenças

Propriedade Filme Hidrolisado

CI50 DPP-IV (mg/mL) 1,24a ± 0,14 0,44

d ± 0,00

CI50 PEP (mg/mL) 2,83a ± 0,05 1,26

b ± 0,03

ECA (%) 22,61b ± 0,95 74,36

a ± 4,82

178

neuropatológicas devido à inibição das enzimas dipeptidil peptidase-IV, conversora da

angiostensina e da prolil endopeptidase, respectivamente. Os filmes elaborados a partir de

ágar, com e sem a incorporação do hidrolisado, apresentaram-se homogêneos e transparentes.

A adição do hidrolisado resultou em filmes mais permeáveis, úmidos, elongáveis e com

características hidrófilas, em relação aos filmes elaborados sem a adição dos mesmos. Após a

digestão do filme com a incorporação do hidrolisado, houve um decréscimo nas atividades

anti-hipertensiva, e inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV e prolil endopeptidase.

Portanto, os hidrolisados de proteínas recuperadas da castanha, podem servir como fonte de

peptídeos bioativos, os quais são uma alternativa aos inibidores sintéticos atualmente

utilizados. Além disso, os filmes adicionados de hidrolisado podem ser utilizados como uma

alternativa de alimentos funcionais, em relação aos filmes sem a adição dos mesmos.




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ARTIGO IV

AVALIAÇÃO DO USO DE FILMES DE ÁGAR INCORPORADOS COM

HIDROLISADOS PROTEICOS DA CASTANHA (Umbrina canosai) E ÓLEO

ESSENCIAL DE CRAVO PARA O PROLONGAMENTO DA VIDA ÚTIL DE FILÉS

DE LINGUADO (Paralichthys orbignyanus)

186

RESUMO

O pescado é altamente perecível durante o armazenamento sob refrigeração, devido a rápida

multiplicação dos micro-organismos naturalmente presentes no mesmo ou oriundos de

contaminação cruzada. Devido a isso, algumas estratégias, tal como o uso de filmes bioativos,

vêm sendo propostos com o objetivo de prolongar a vida útil do mesmo, inibindo ou

retardando a deterioração e a multiplicação de micro-organismos. O objetivo do presente

estudo, foi a elaboração, caracterização e aplicação de filmes à base de ágar incorporados de

hidrolisado ou óleo essencial de cravo (OEC), na conservação de filés de linguado

(Paralichthys orbignyanus) armazenados a 5 °C durante 15 dias. Para isso, foi obtido

hidrolisado de isolado proteico de castanha com grau de hidrólise de 20% utilizando a

Alcalase. Foram elaborados filmes: com a incorporação de hidrolisado ou OEC (0,5 g de

hidrolisado ou OEC/g de ágar), caracterizados quanto às propriedades físico-químicas,

mecânicas, de barreira e morfológicas. A conservação de filés de linguado, revestidos com

filmes incorporados com OEC ou hidrolisado, foi avaliada quanto as bases voláteis totais, pH,

perda de massa e análises microbiológicas. Os filmes incorporados de OEC ou hidrolisado

apresentaram maior permeabilidade ao vapor de água-PVA. Além disso, a incorporação de

hidrolisado resultou em filmes mais elongáveis, solúveis e amarelos. Os filmes incorporados

com OEC apresentaram bolhas em toda a superfície do filme o que contribuiu para o

acréscimo na PVA e uma redução nas propriedades mecânicas. Os filés revestidos com filmes

incorporados de OEC ou de hidrolisado, apresentaram a inibição para alguns micro-

organismos avaliados, mas as características físico-químicas dos filés revestidos com os

filmes controle e incorporados com os hidrolisado ficaram fora dos padrões estabelecidos.

Devido à elevada perda de massa das amostras, precisam ser realizadas maiores avaliações

para comprovar tal efeito em relação ao controle.

Palavras-chave: hidrolisados, filmes, polissacarídeo, propriedades, pescado, conservação.

187

1 INTRODUÇÃO

O linguado (Paralichthys orbignyanus) é distribuído desde o Rio de Janeiro

(Brasil) até a Patagônia (Argentina), no sudoeste do Atlântico, constituindo um importante

recurso pesqueiro devido ao seu elevado preço de mercado (BOLASINA, 2011; SAMPAIO;

BIANCHINI, 2002). O pescado é altamente perecível durante o armazenamento sob

refrigeração, devido a rápida multiplicação dos micro-organismos presentes no mesmo ou

oriundos de contaminação cruzada, o que pode resultar em problemas econômicos e/ou

relacionados com a saúde (GÓMEZ-ESTACA et al., 2010; LÓPEZ DE LACEY; LÓPEZ-

CABALLERO; MONTERO, 2014). Os principais micro-organismos responsáveis pela

deterioração do pescado são as bactérias Gram-negativas, em forma de bastonetes que

pertencem, entre outros, aos gêneros Pseudomonas, Moraxella, Vibrionaceae e Shewanella

(GRAM; HUSS, 2010). Devido a isso, algumas alternativas vêm sendo desenvolvidas com o

objetivo de prolongar a vida útil do pescado, inibindo ou retardando a deterioração e a

multiplicação de micro-organismos nos mesmos (LÓPEZ DE LACEY; LÓPEZ-

CABALLERO; MONTERO, 2014; OJAGH et al., 2011; SALGADO et al., 2013). Uma

dessas alternativas, é o uso de filmes ativos para o prolongamento da vida útil do pescado

(GÓMEZ-ESTACA et al., 2010; ITURRIAGA; OLABARRIETA; DE MARAÑÓN, 2012;

SALGADO et al., 2013; WU et al., 2014).

Os polissacarídeos formam filmes com boas propriedades mecânicas e de barreira

(MILKOVA; RADEVA, 2015). Segundo Sousa e Gonçalves (2015) os filmes à base de

polissacarídeos de algas marinhas, tais como o ágar, possuem boa resistência mecânica,

propriedades moderadas de barreira ao O2 e CO2, são comestíveis e facilmente

biodegradáveis. Além disso, o ágar possui a propriedade de formar uma matriz

biologicamente inerte, que facilita a difusão de diversos compostos bioativos para a superfície

dos alimentos (THE, et al., 2009). Alguns óleos essenciais são Geralmente Reconhecido como

Seguros (GRAS), pela Food and Drug Administration (FDA) e são considerados uma

alternativa aos aditivos sintéticos utilizados (SALGADO et al., 2013). Sabe-se que a atividade

antioxidante e antimicrobiana dos óleos essenciais está relacionada com a sua composição

química, principalmente os componentes fenólicos (ZIVANOVIC; CHI; DRAUGHON,

2005). A utilização de óleos essenciais em alimentos pode ser limitada, pois eles conferem

diferentes sabores e aromas daqueles naturais do alimento (GÓMEZ-ESTACA et al., 2010).

Os óleos essenciais, tal como o de cravo (Syzygium aromaticum), têm sido utilizados na

elaboração de filmes ativos para a conservação do pescado em diversos estudos (GÓMEZ-

188

ESTACA et al., 2010; SALGADO et al., 2013; WU et al., 2014), limitando dessa forma a

difusão de sabores e aromas indesejáveis para o alimento.

Muitos estudos têm relatado a atividade antimicrobiana de hidrolisados proteicos

de pescado (GARCÍA-MORENO et al., 2014; GIRGIH et al., 2013; HE et al., 2013; JEMIL

et al., 2014; SILA et al., 2014b). A castanha (Umbrina canosai) é um pescado disponível no

litoral sul do Brasil. Entretanto, é subutilizada e possui baixo valor comercial, mas devido ao

seu conteúdo proteico, desperta o interesse pela obtenção produtos com elevado valor

agregado, tais como os hidrolisados proteicos. Neste contexto, os objetivos do presente estudo

foram: (i) elaborar filmes de ágar incorporados com hidrolisado proteico de pescado ou óleo

essencial de cravo; (ii) avaliar o efeito da presença de hidrolisado e do óleo de cravo, sobre as

propriedades mecânicas, de barreira, térmicas e estruturais dos filmes obtidos e (iii)

determinar a eficácia dos filmes desenvolvidos na conservação de filés de linguado

armazenados sob refrigeração.


2.1 MATERIAL


O isolado proteico de castanha (IPC) foi processado no Laboratório de Tecnologia

de Alimentos, da Universidade Federal do Rio Grande – FURG. O IPC foi elaborado através

do método de variação de pH, segundo Nolsøe e Undeland (2009), com modificações. O

músculo de castanha foi homogeneizado, em água destilada na proporção 1:9 (p/v). A

solubilização alcalina, foi realizada em pH 11,2 (NaOH 1 M) durante 20 min a 4 °C sob

agitação constante em agitador eixo-hélice. Após, as amostras foram centrifugadas a 9000 x g

em centrífuga durante 20 min a 4 °C. O pH das proteínas solúveis foi ajustado em pH 5,0

(HCl 1 M), durante 20 min a 4 °C sob agitação constante. Em seguida, foram centrifugadas a

9000 x g durante 20 min a 4 °C. O precipitado, considerado como isolado proteico úmido, foi

liofilizado em liofilizador (Liotop L108, São Carlos, Brasil) à – 55 °C e 50 µHg durante 48 h,

fracionado em moinho de facas (Tecnal, TE-633, Piracicaba, Brasil), peneirado em peneira de

42 mesh (Bertel, Caieiras, Brasil) e armazenado a – 18 °C até o momento de uso. O IPC foi

analisado em triplicata, para avaliar a sua composição proximal segundo método descrito pela

189

AOAC (2000), o qual apresentou um teor de 92,1% de proteína, 2,2% de umidade, 1,2% de

lipídios, 1,5% de cinzas.

2.1.2 Enzima

A enzima utilizada foi a Alcalase - 2,4 L (3.4.21.62); uma endopeptidase

bacteriana, produzida a partir da fermentação submersa do Bacillus licheniformis, fornecida

pela Novozymes Latin America (Araucária – Paraná). A atividade específica da Alcalase de

13,3 U/mg de proteína, foi determinada pelo método descrito pela Sigma (2013), o qual utiliza

caseína como substrato.

2.2 OBTENÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO

A hidrólise enzimática do IPC, foi realizada segundo método descrito por Liu et

al. (2014), Raghavan e Kristinsson (2009) e acompanhados pelo método de pH-stat, para

determinação do grau de hidrólise, com modificações. O IPC foi homogeneizado em água

destilada na proporção de 2% (p/v; proteína/água destilada), em reator de vidro encamisado

acoplado de banho ultratermostático (Quimis, Q212S, Diadema, Brasil), sob agitação

constante em agitador eixo-hélice (Marconi, Piracicaba, Brasil) a 300 rpm. O pH e a

temperatura da dispersão proteica, foram ajustados para 8 e 50 °C durante 10 min,

respectivamente. A hidrólise enzimática iniciou, através da adição da enzima Alcalase na

proporção de 30 U/g proteína. O grau de hidrólise (GH), foi monitorado segundo Adler-

Nissen (1986). A hidrólise enzimática do IPC, foi conduzida até que o GH atingisse 20%. A

enzima foi inativada, pelo aquecimento da suspensão a 90 °C durante 10 min. O hidrolisado

foi centrifugado a 9000 x g, em centrífuga refrigerada (Hanil, Supra 22K, Coréia do Sul)

durante 20 min a 4 °C para separar as frações solúvel (hidrolisado) e insolúvel. A fração

solúvel, foi seca em liofilizador (Liotop, L108, São Carlos, Brasil) e armazenada em frasco de

polietileno a -18 °C até o momento do uso.

2.3 ELABORAÇÃO DOS FILMES

Os filmes à base de ágar, foram elaborados pela técnica de casting segundo

método descrito por Giménez et al. (2013) e Salgado et al. (2013), com adaptações. A solução

190

filmogênica (SF), foi preparada pela dispersão de 1,0 g de ágar em 100 mL de água destilada,

a 90 °C, durante 30 min sob agitação contínua em agitador magnético. Em seguida, foi

adicionado o glicerol como plastificante, na concentração de 30% (g de glicerol/ 100 g de

ágar) e homogeneizados durante 20 min sob agitação contínua em agitador magnético. O

hidrolisado proteico - HP (0,5 g de HP/g de ágar) ou o óleo essencial de cravo- OEC (0,5 g de

OEC/g de ágar) (Petite Marie, 010742PM, São Paulo), foi adicionado e homogeneizado

durante 20 min sob agitação contínua. Em seguida, 0,0053 g/cm2 da SF foi adicionada em

placas de Petri de acrílico (9 cm de diâmetro). Os filmes foram secos, em estufa com

circulação forçada de ar a 37 °C durante 16 – 18 h. Os filmes foram acondicionados em

dessecadores, contendo brometo de sódio (NaBr) a 58% de umidade relativa (UR) durante 48

h a 22 °C. Como controle foi utilizado o filme sem a adição de HP ou OEC.

2.3.1 Caracterização dos filmes

2.3.1.1 Espessura

A espessura dos filmes foi determinada com micrômetro digital (Insize, IP54, São

Paulo, Brasil, resolução 0,001 mm). A espessura foi determinada pela média aritmética de dez

medidas aleatórias sobre a superfície do filme (GONTARD; GUILBERT; CUQ, 1992).

2.3.1.2 Propriedades mecânicas

A resistência à tração – RT (MPa) e a elongação até a ruptura – ER (%) dos

filmes, foram determinadas segundo método descrito pela American Society for Testing and

Materials – ASTM D882-91 (ASTM, 1996), com adaptações, utilizando texturômetro

TA.XTplus (Stable Micro Systems, Inglaterra). As amostras foram cortadas em forma de

retângulos (80 x 25 mm) e fixadas em garras com separação inicial de 50 mm. A RT e a ER,

foram mensuradas em 9 tiras de filmes de onde se obtiveram três triplicatas.

2.3.1.3 Permeabilidade ao vapor de água

A permeabilidade ao vapor de água (PVA), foi determinada em triplicata segundo

método adaptado de Sobral et al. (2001). O filme foi selado em uma célula com área de

191

permeação de 15,90 cm2, contendo sílica seca (0% UR) e em seguida foi acondicionado em

dessecadores com água destilada (100% UR) a 22 °C. As amostras foram pesadas a cada hora

durante 7 h e a PVA foi determinada segundo a Equação 1:

Onde W é o ganho de massa (g), X é a espessura do filme (mm), t é o tempo (h), A é a área do

filme exposto (cm2), e ΔP é a diferença da pressão parcial entre a atmosfera e a sílica (2642

Pa a 22 °C). Os resultados foram expressos como g mm/ h cm2 Pa.

2.3.1.4 Solubilidade em água

A solubilidade em água foi determinada em triplicata, segundo método descrito

por Gontard, Guilbert e Cuq (1992), com adaptações. Os filmes foram cortados em quadrados

(2 x 2 cm2), secos em estufa a 105 °C durante 24 h, colocados em frascos de polietileno

contendo 15 mL de água destilada durante 24 h a 22 °C. Em seguida, procedeu-se a filtração

em papel filtro para recuperar o restante do filme não dissolvido, o qual foi seco a 105 °C

durante 24 h. A solubilidade em água foi calculada segundo a Equação 2:

Onde W0 é a massa inicial do filme expressa em massa seca (g) e Wf é a massa final do filme

não dissolvido. Os resultados foram expressos em %.

2.3.1.5 Cor, opacidade e transparência

A cor foi determinada em triplicata em colorímetro (Minolta, CR-400, Osaka,

Japão), utilizando o sistema de escala de cor da Comissão Internacional de Iluminação

(CIEL*a*b*), segundo método descrito pela CIE Lab (CIE, 1986). Como padrão branco foi

utilizada uma placa (L* = 97,75; a* = - 0,49 e b* = 1,94). Foram determinadas as coordenadas

PVA (g mm/ h cm Pa.)

W x X

t x A x P (1)

S( ) (W0- Wf

W0

) x 100 (2)

192

desse sistema tridimensional: luminosidade (L*), que é acromática e varia de 0 (preto) a 100

(branco); e as coordenadas a* e b* onde a*=coordenada do verde-vermelho (-a*: verde, +a*:

vermelho); e b*=coordenada azul-amarelo (-b*:azul, +b*:amarelo).

A opacidade (Y) foi determinada em triplicata em colorímetro (Minolta, CR-400,

Osaka, Japão), segundo método adaptado de Sobral (2000). A Y foi determinada segundo a

Equação 3.

Onde Yp é a opacidade do filme sobreposto sobre o padrão preto; Yb é a opacidade do filme

sobreposto sobre o padrão branco multiplicada por 100 e expressa em %.

A transparência foi avaliada em triplicata em espectrofotômetro (Bioespectro,

SP22, São Paulo) a 600 nm, segundo método descrito por Atef, Rezai e Behrooz (2014) e Han

e Floros (1997). A transparência dos filmes foi determinada segundo a Equação 4.

Onde Abs 600 é a absorbância mensurada a 600 nm; x é a espessura do filme em mm. Filmes

menos transparentes, apresentam valores de transparência mais elevados.

2.3.1.6 Microscopia eletrônica de varredura

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos filmes, foi realizada no Centro

de Microscopia Eletrônica do Sul (CEME-Sul), da Universidade Federal do Rio Grande, em

microscópio eletrônico de varredura (Jeol, JSM - 6610LV, Tóquio, Japão) operando a 10 kV.

As amostras foram depositadas em suportes de alumínio (stubs), revestidos com uma fita

condutora de carbono. Em seguida, os mesmos foram recobertos com uma camada de ouro

em Spputering (Desk, Denton Vacuum, Estados Unidos) durante 120 s. A morfologia das

amostras foi observada em 1000 x de ampliação.

Y ( ) (Yp

Yb

) x 100 (3)

Transpar ncia Abs 600

x (4)

193

2.4 USO DE FILMES BIOATIVOS NA CONSERVAÇÃO DO PESCADO

Os filés de linguado (P. orbignyanus) foram adquiridos no comércio local da

cidade do Rio Grande, sul do Brasil, e transferidos para o Laboratório de Tecnologia de

Alimentos – LTA da Universidade Federal do Rio Grande em caixas térmicas com gelo

picado. Os filés foram higienizados em água clorada (5 ppm) e armazenados a 4 °C durante 2

h antes da utilização. Os mesmos foram avaliados em triplicata, para determinação da sua

composição proximal, segundo método descrito pela AOAC (2000). Eles apresentaram um

teor de 80,4% de umidade, 18,5% de proteína, 1,4% de lipídios e 0,7% de cinzas. Os filés

foram cortados, em porções retangulares de aproximadamente 30 g (5 x 4 cm2). Estes foram

revestidos com os filmes dos diferentes tratamentos (controle - sem a incorporação de

compostos ativos e incorporados com o hidrolisado ou OEC). Em seguida, os mesmos foram

dispostos em bandejas de isopor e armazenados a 5 ± 1 °C durante 15 dias, conforme

apresenta a Figura 1.

Figura 1- Filés de linguado (P. orbignyanus) revestidos pelos filmes dos diferentes

tratamentos e armazenados a 5 ± 1 °C

Os filés foram avaliados periodicamente (zero, 3, 5, 7, 10 e 15 dias) quanto ao pH,

bases voláteis totais (N-BVT), perda de massa e análises microbiológicas. Para tanto, os

filmes foram removidos assepticamente das amostras de filé de linguado, com auxílio de

pinças estéreis, para as determinações anteriormente citadas.

194

2.4.1 pH

O pH foi determinado em triplicata, segundo método descrito por Gómez-Estaca

et al. (2010). Aproximadamente, 10 g de filé foram homogeneizados em água destilada na

proporção 1:2 (p/v). Após 5 min a temperatura ambiente, o pH foi determinado em pHmetro

(Qumis, Q400AS, Brasil).

2.4.2 Bases voláteis totais (N-BVT)

As bases voláteis totais (N-BVT) dos filés foram determinadas em triplicata,

segundo método descrito pela AOAC (1990), com modificações. Aproximadamente 25 g de

filé foi homogeneizado em ácido tricloroacético - TCA 7,5% (p/v), durante 1 min em

homogeneizador (Durabrand, HL-3022, China), filtrado à vácuo e avolumado para 50 mL

com TCA 7,5% (p/v). Uma alíquota de 10 mL foi transferida para um tubo de destilação de

micro-Kjeldahl, juntamente com 3 gotas de fenolftaleína 1% e em seguida foram submetidos

a destilação. O destilado foi recolhido em um Erlenmeyer, contendo 5 mL de ácido bórico

saturado (50 g/L), 4 gotas de indicador misto (30:20; bromocresol: vermelho de metila), e

titulado com ácido clorídrico (HCl 0,02 M). Os resultados foram expressos como mg de N-

BVT/ 100 g de amostra.

2.4.3 Perda de massa

A perda de massa foi determinada gravimetricamente em triplicata, segundo

método descrito por Ferreira (2014), onde foi relacionada a diferença entre a massa inicial da

amostra e a massa final da mesma, obtida para cada tempo de armazenamento. A perda de

massa foi expressa como g/100 g (%).

2.4.4 Análises microbiológicas

O efeito antimicrobiano dos diferentes revestimentos durante o armazenamento

foi avaliado em triplicata, segundo métodos descritos por Arancibia et al. (2015b) e Salgado

et al. (2013). Os filmes foram removidos assepticamente dos filés de linguado (P.

orbignyanus), foram pesados aproximadamente 10,0 ± 0,2 g e transferidos para sacos estéreis

195

de polietileno (Interscience, França) com 90 mL de água peptonada estéril 0,1% (p/v)

(Himedia, Índia) e homogeneizados durante 1 min em Stomacher (ITR, MR 1204, Esteio,

Brasil) à temperatura ambiente. Em seguida, foram preparadas diluições apropriadas para as

seguintes determinações bacteriológicas de: (i) mesófilos aeróbios totais em Ágar Padrão para

Contagem – PCA (Oxoid, Inglaterra), em profundidade, através da incubação a 30 °C durante

72 h; (ii) micro-organismos produtores de ácido sulfídrico (H2S), como colônias pretas, em

superfície, em Ágar Ferro (Microkit, Espanha) incubados a 15 °C durante 72 h; (iii)

Pseudomonas spp. em Ágar Isolamento de Pseudomonas (Difco, França), em superfície,

incubados a 25 °C durante 48 h; (iv) enterobactérias, em capa dupla de Ágar Bile Violeta

Vermelho Glicose – VRBG (Acumedia, Estados Unidos), incubados a 30 °C durante 48 h e

(v) bactérias ácido láticas, em capa dupla de Ágar Lactobacillus – MRS (Kasvi, Itália)

incubados a 30 °C durante 72 h. A contagem microbiológica foi expressa em log de unidades

formadoras de colônias por grama de amostra (Log UFC/g).


Todos os resultados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as

médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. Os dados foram

avaliados pelo programa Statistica (versão 5.0, por StatSoft, Inc., Tulsa, Estados Unidos).


3.1 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES

A Figura 2 apresenta os filmes elaborados com e sem a incorporação de OEC ou

hidrolisado. Os filmes controle (a) e com a incorporação de hidrolisado (b), apresentaram-se

transparentes e homogêneos. Entretanto, o filme incorporado com OEC (c) apresentou-se

opaco, heterogêneo com bolhas e exsudação do OEC em toda a superfície do filme, o que

pode afetar as propriedades mecânicas e de barreira do mesmo. Altiok, Altiok e Tihminlioglu

(2010), verificaram que a adição de óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris), em filmes

de quitosana, resultou no aumento da rugosidade dos filmes elaborados.

196

Figura 2 - Filmes controle (a), com a incorporação de hidrolisado (b) ou óleo essencial de

cravo (c)

Segundo Sánchez-González et al. (2009), os filmes de hidroxipropilmetilcelulose

incorporados com óleo essencial (OE) de chá verde, apresentaram descontinuidade, gotículas

lipídicas, ao longo de todo o filme. As gotículas tornaram-se numerosas, com o acréscimo na

concentração de óleo adicionada, devido a alta viscosidade da solução filmogênica.

3.1.1 Espessura e propriedades mecânicas

Os efeitos da incorporação do óleo essencial de cravo ou do hidrolisado sobre as

propriedades dos filmes são apresentados na Tabela 1. A espessura dos filmes controle (0,043

mm) e com a incorporação do hidrolisado (0,044 mm) não apresentou diferença significativa

(p > 0,05). Segundo Han e Krochta (1999) a espessura do filme, é influenciada pelo conteúdo

de sólidos da solução filmogênica da elaboração dos mesmos, a qual no presente estudo foi a

mesma para todos os filmes elaborados.

A adição de OEC, resultou em um acréscimo significativo (p < 0,05) na espessura

do filme (0,061 mm) em relação aos demais tratamentos. Este fato se deve, à formação de

bolhas e a exsudação do OEC, conforme foi verificado na Figura 2c. Estes resultados sugerem

que as cadeias de ágar não formam uma matriz compacta na presença de OEC. Atef, Rezaei e

Behrooz (2015) elaboraram filmes de ágar e nanopartículas de celulose incorporados de OE

de satureja (Satureja hortensis), onde verificaram um acréscimo na espessura dos filmes de

0,073 mm para 0,088 mm, com o acréscimo de 0 para 0,5% de OE no filme.

197

Tabela 1 – Propriedades dos filmes controle, incorporados com o hidrolisado ou

com o óleo essencial de cravo

Controle: filmes à base de ágar sem a incorporação de compostos ativos; Hidrolisado: filmes com a incorporação

de hidrolisado; OEC: filmes à base de ágar incorporados com óleo essencial de cravo; RT: resistência à tração;

ER: elongação até a ruptura, PVA: permeabilidade ao vapor de água; L*: luminosidade, varia de 0 (preto) a 100

(branco); a*:coordenada do verde-vermelho (-a*: verde, +a*: vermelho); b*: coordenada azul-amarelo (-b*:

azul, +b*:amarelo; Y: opacidade; Letras iguais na mesma linha, indicam que não há diferença significativa (p >

0,05).

A RT e a ER dos filmes controle foi de 27,46 MPa e 22,24%, respectivamente. A

incorporação dos compostos ativos resultou em uma diminuição significativa (p < 0,05) na

RT, de 19,89 e 10,16 MPa, para os filmes adicionados de hidrolisado ou OEC,

respectivamente. Atef, Rezaei e Behrooz (2015), verificaram que os filmes de ágar e

nanopartículas de celulose incorporados de OE de satureja (S. hortensis), apresentaram uma

diminuição na RT de 31,21 MPa (controle) para 28,26 MPa, com a adição de 0,5% de OE.

Muitos trabalhos têm relatado a redução na RT causada pela adição de diferentes OEs

(ALTIOK; ALTIOK; TIHMINLIOGLU, 2010; DO SOCORRO ROCHA BASTOS et al.,

2016; FERREIRA et al., 2013). Essa redução pode ocorrer, principalmente, pela substituição

da forte interação polímero-polímero pela fraca interação polímero-óleo na formação da rede

do filme (ATARÉS; CHIRALT, 2016).

Os filmes incorporados com o hidrolisado, apresentaram um acréscimo

significativo (p < 0,05) na ER (42,70%). Entretanto, o mesmo comportamento não foi

verificado para os filmes adicionados de OEC, os quais apresentaram uma ER de 3,93%.

Segundo Nuanmano, Prodpran e Benjakul (2015), os peptídeos de cadeia curta, podem atuar

como plastificantes em filmes proteicos, reduzindo a interação entre os polímeros

aumentando, o volume livre entre os mesmos, a elongação e diminuindo a resistência à tração,

Propriedades Filme controle Peptídeo OEC

Espessura (mm) 0,043b ± 0,001 0,044

b ± 0,002 0,061

a ± 0,012

RT (MPa) 27,46a ± 2,78 19,89

b ± 1,81 10,16

c ± 1,02

ER (%) 22,24b

± 3,55 42,70a ± 1,38 3,93

c ± 0,15

PVA (x 10-8

)

(g mm/ h Pa cm2)

1,40b

± 0,04 3,61a ± 0,11 3,37

a ± 0,16

Solubilidade (%) 21,95b ± 1,52 48,86

a ± 2,22 20,86

b ± 1,99

L* 96,03a ± 0,14 96,14

a ± 0,13 96,25

a ± 0,08

a* - 0,51b ± 0,00 - 0,61

a ± 0,02 - 0,54

b ± 0,01

b* 3,65b ± 0,09 4,21

a ± 0,16 3,70

b ± 0,15

Y (%) 10,23b ± 0,20 9,66

b ± 0,20 12,80

a ± 0,21

Transparência 1,57b ± 0,06 1,55

b ± 0,06 4,87

a ± 0,09

198

o que foi verificado neste estudo. Atef, Rezaei e Behrooz (2015), verificaram que com a

adição de 0,5% de OE de satureja (S. hortensis), apresentaram uma diminuição na ER

(28,26%), quando comparado ao filme controle (31,21%). O mesmo comportamento foi

observado por Altiok, Altiok e Tihminlioglu (2010), onde os filmes de quitosana

apresentaram uma diminuição na ER de 4,8 para 1,8% com a incorporação de 0 a 1,2% de OE

de tomilho (Thymus vulgaris). No presente estudo, foi verificado que a adição de OEC,

resultou numa estrutura heterogênea com bolhas e exsudação do OEC ao longo de toda a

superfície do filme, o que poderia ter contribuído para a baixa ER.

3.1.2 Permeabilidade ao vapor de água e solubilidade em água

A Tabela 1 apresenta a permeabilidade ao vapor de água (PVA) e a solubilidade,

dos filmes elaborados com e sem a incorporação de OEC ou hidrolisado. A adição dos

hidrolisado ou do OEC aumentou significativamente (p < 0,05) a PVA dos filmes, em

comparação ao filme controle. Giménez et al. (2009a), Nuanmano, Prodpran e Benjakul

(2015), verificaram que a adição de hidrolisados proteicos aumentou significativamente (p <

0,05) a PVA dos filmes avaliados. Segundo Cuq et al. (1997), o plastificante modifica a

organização molecular trimendimensional, diminuindo as forças atrativas intermoleculares o

que aumenta a mobilidade da cadeia e consequentemente a taxa de difusão e PVA, o que foi

verificado no presente estudo, onde a adição do hidrolisado resultou em um acréscimo na ER

e na PVA, devido ao efeito plastificante dos mesmos. Além disso, peptídeos de baixa massa

molecular, contêm um número elevado de grupos hidrófilos (-NH2, -COOH, -OH), e a adição

dos mesmos faz com que os filmes absorvam um conteúdo maior de moléculas de água

(NUANMANO; PRODPRAN; BENJAKUL, 2015). Muitos estudos (AHMAD et al., 2012;

ALTIOK; ALTIOK; TIHMINLIOGLU, 2010; ATEF; REZAEI; BEHROOZ, 2015;

GIMÉNEZ et al., 2012) têm relatado o acréscimo na PVA dos filmes, devido a incorporação

de diferentes OEs. Segundo Atarés et al. (2010), o impacto da adição do OE sobre a

microestrutura do filme, é um fator determinante para modificar as propriedades de barreira à

água. No presente estudo, foi possível verificar visivelmente a presença de bolhas na

superfície do filme, formando desta forma vias preferenciais para a difusão do vapor de água

resultando em um acréscimo na PVA.

A Tabela 1 apresentou o efeito da incorporação do hidrolisado ou do OEC nos

filmes sobre a solubilidade em água. O filme controle, apresentou uma solubilidade em água

199

significativamente (p < 0,05) inferior (21,95%) em comparação com o filme incorporado com

o hidrolisado (48,86%), porém não apresentou diferença significativa (p > 0,05) do filme

incorporado com OEC (20,86%). Giménez et al. (2013a), encontraram uma solubilidade em

água de 24,1%, para filmes elaborados com 1,5% de ágar (p/v), superior à verificada no

presente estudo. Este fato pode ocorrer, devido ao conteúdo superior de polímero utilizado na

elaboração do filme.

Giménez et al. (2009b) incorporaram hidrolisados proteicos de gelatina de pele de

pota (D. gigas), em filmes elaborados à base de gelatina, onde verificaram um acréscimo não

significativo (p > 0,05) na solubilidade de 91,59 para 95,71% com a adição de 2,5% de

hidrolisado proteico. Nuanmano, Prodpran e Benjakul (2015) sugeriram que o aumento na

solubilidade dos filmes adicionados de hidrolisados, pode ocorrer devido às fracas interações

entre os peptídeos de cadeia curta e a matriz polimérica. Wu et al. (2014), verificaram que os

filmes elaborados com blendas de quitosana e gelatina, incorporados com 0, 1, 2 e 3% de OE

de orégano, não apresentaram diminuição significativa (p > 0,05) na solubilidade em água dos

filmes. Atef, Rezaei e Behrooz (2015), também verificaram que a incorporação de 0 e 0,5%

de OE de satureja (S. hortensis) em filmes de ágar e nanopartículas de celulose, apresentaram

uma solubilidade significativamente igual (p > 0,05) de 29,68 e 29,67%. Entretanto, a adição

de OE pode resultar em uma diminuição da solubilidade em água dos filmes, devido à

propriedade hidrofóbica dos mesmos e uma boa interação entre a matriz polimérica do filme e

o OE (AHMAD et al., 2012; OJAGH et al., 2010). Contudo, devido à aparência do filme

incorporado com OEC, a qual apresentou uma superfície heterogênea, e as demais

propriedades avaliadas, pôde-se observar que não ocorreu uma forte interação entre o ágar e o

OEC adicionado. Desta forma, a adição do mesmo não influenciou na solubilidade do filme

obtido.

3.1.3 Cor, opacidade e transparência

A Tabela 1 apresenta a mudança nos parâmetros de cor (L*, a*, b*) e opacidade

(Y), dos filmes com e sem a incorporação de OEC ou hidrolisado. Os resultados obtidos

indicaram que a incorporação do hidrolisado e do OEC, não apresentaram diferença

significativa (p > 0,05) em relação ao parâmetro de luminosidade (L*), ou seja, todos os

filmes elaborados apresentaram tendência à coloração clara. O mesmo comportamento foi

observado em diversos estudos (ATEF; REZAEI; BEHROOZ, 2014; PIRES et al., 2013;

200

PRANOTO; SALOKHE; RAKSHIT, 2005). A adição do OEC não apresentou mudanças

significativas (p > 0,05), nos parâmetros a* e b* em relação ao filme controle. Atef, Rezaei e

Behrooz (2015), verificaram que o acréscimo na concentração de 0 para 0,5% de OE

adicionado no filme de ágar e nanopartículas de celulose, apresentou um acréscimo na

coloração amarela (b*+) dos filmes, de 5,00 para 7,68 com a adição de OE, o que não foi

verificado no presente estudo. Martucci et al. (2015), verificaram que os filmes de gelatina

adicionados de OE de orégano (Origanum vulgare L.), também não apresentaram um

acréscimo significativo nos parâmetros a* e b*.

Os filmes incorporados com o hidrolisado, apresentaram uma tendência

significativa (p < 0,05) a cor amarelada (b* = 4,21) e ao verde (a* = - 0,61), em relação aos

demais filmes avaliados. Nuanmano, Prodpran e Benjakul (2015), verificaram um acréscimo

no parâmetro b* com a adição de hidrolisados em filmes proteicos. Segundo esses autores, a

coloração amarela tem sido relatada devido a interação de proteínas, peptídeos e aminoácidos

com grupamentos aldeído, respectivamente.

A opacidade dos filmes controle e com a adição de hidrolisado, não apresentou

diferença significativa (p > 0,05). Os filmes incorporados com o OEC, apresentaram-se mais

opacos (Y = 12,80), o que também foi verificado visualmente (Figura 2c), em relação aos

demais filmes elaborados. Bastos et al. (2016), verificou que filmes de acetato de celulose,

incorporados OE de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) e manjericão (Ocimum gratissimum)

na concentração de 20% (v/p), aumentaram a opacidade dos filmes em relação ao filme sem

adição de OE. Segundo Pires et al. (2013), a incorporação de OE nos filmes, tem causado um

aumento na opacidade dos filmes. Além disso, a espessura elevada (0,061 mm) verificada no

presente estudo, pode ter contribuído para o acréscimo na opacidade dos filmes com OEC, em

relação aos demais elaborados. Os filmes elaborados com a incorporação de hidrolisado, não

apresentaram diferença significativa (p > 0,05) na transparência, quando comparados aos

filmes controle. Entretanto, a adição de OEC diminuiu significativamente (p < 0,05) a

transparência dos filmes (4,87). Teixeira et al. (2014), verificaram que filmes proteicos

incorporados com OEC, também apresentaram diminuição da transparência, quando

comparados aos filmes controle. Segundo Atarés e Chiralt (2016) a adição de OE, resulta em

uma diminuição da transmissão da luz, devido ao espalhamento da mesma na interface das

gotículas de óleo embebidas na matriz do filme.

201

3.1.4 Microscopia eletrônica de varredura

A Figura 3 apresenta a microscopia eletrônica de varredura (MEV), dos filmes

com e sem a incorporação de OEC ou hidrolisado. O filme controle (Figura 3a), apresentou a

formação de agregados, possivelmente entre o glicerol e o ágar, os quais derivam da presença

de grandes zonas de densidade de reticulação, que podem ter contribuído para a maior RT

observada para o filme. González, Strumia e Igarzabal (2011), também observaram o mesmo

comportamento observado para filmes de proteína de soja.

Figura 3 – Microscopia eletrônica de varredura dos filmes controle (a), com a incorporação

de hidrolisado (b) e óleo essencial de cravo (c)

O filme incorporado com hidrolisado (Figura 3b), apresentou uma superfície sem

rugosidade, porém com algumas regiões com pequenas partículas, que podem ser do

hidrolisado adicionado no filme, contribuindo para o aumento na PVA do mesmo. A Figura

3c, filme incorporado com OEC, apresenta bolhas e gotículas de óleo em sua superfície e, em

determinadas regiões, rugosidade. Essas regiões podem favorecer o acréscimo na PVA, que

foi verificado no presente estudo, pois formam vias preferenciais para a difusão do vapor de

(b)

(c)

(a)

202

água. Estes resultados sugerem que o OEC não é compatível com as moléculas de ágar,

originando uma estrutura descontínua. Esse efeito vem sendo observado em muitos estudos

(ALTIOK; ALTIOK; TIHMINLIOGLU, 2010; ATEF; REZAEI; BEHROOZ, 2014; WU et

al., 2014), com diferentes polímeros como, por exemplo, a gelatina, quitosana, ágar e celulose

adicionados de OE.

3.2 EFEITO DO USO DE FILMES BIOATIVOS NA CONSERVAÇÃO DO PESCADO

3.2.1 pH e bases voláteis totais (N-BVT)

A Figura 4 apresenta os valores de pH e das bases voláteis totais (N-BVT), dos

filés de linguado revestidos com os filmes incorporados com hidrolisado ou OEC,

armazenados a 5 °C. Os valores de pH e das N-BVT encontrados para amostras de filés de

linguado, embalados com diferentes tratamentos, foram de 6,64 e 8,35 mg de N-BVT/100 g

de amostra no tempo zero de armazenamento, como apresentam as Figuras 4a e 4b,

respectivamente. Segundo o regulamento oficial da Indústria de Sanitização e Inspeção de

Produtos de Origem Animal – RIISPOA (BRASIL, 2002), o limite máximo de pH para

pescado fresco é 6,5. Entretanto, após sofrer qualquer tipo de tratamento destinado a sua

conservação, evisceração e lavagem com água clorada, que alterem suas características

sensoriais essenciais o termo “pescado fresco” não pode ser aplicado. Segundo Ordóñez

(2005), no Rigor Mortis ocorre uma queda do pH muscular, cerca de 24 h após a captura,

dependendo do estresse do mesmo. Segundo Furlong (2000) e Koblitz (2014), o pH para o

pescado, após o Rigor Mortis, estará em torno de 6,2 a 6,6 o que foi verificado no presente

estudo.

No presente estudo, verificou-se uma queda significativa (p < 0,05) no pH, do

tempo zero para o 3° dia de armazenamento para a amostra controle. Entretanto, o mesmo

permaneceu inalterado para as amostras revestidas com filmes contendo hidrolisado ou com

OE. Durante o armazenamento a 5 °C, o pH da amostra revestida com o filme incorporado

com hidrolisado, aumentou significativamente (p < 0,05) para 7,05 até o 15° dia de

armazenamento. Entretanto, para a amostra resvestida com o filme controle e incorporado

com OEC, o aumento significativo (p < 0,05) para pH 7,11 e 6,76, foi observado até o 10° dia

de armazenamento, respectivamente.

203

Figura 4 – Comportamento do pH (a) e das bases voláteis totais (N-BVT) (b) dos filés de

linguado armazenados a 5 °C, revestidos com os filmes controle ou incorporados com

hidrolisado ou OEC

Os valores determinados para cada amostra foram média ± desvio padrão (n = 3). A análise estatística está no

Apêndice IV.

Gómez-Estaca et al. (2010), avaliaram filmes de gelatina-quitosana incorporados

com OEC, para a conservação de filés de bacalhau (Gadus morhua), onde verificaram o

acréscimo no pH para valor próximo a 7 no 11 ° dia de armazenamento a 2 °C. Esse valor foi

superior ao verificado no presente estudo, para a amostra revestida com filme incorporado

com OEC, mas inferior aos verificados para as amostras revestidas com o filme controle ou

incorporado com hidrolisado. Isto pôde ocorrer, devido à diferença na temperatura utilizada

(a)

(b)

204

para o armazenamento das amostras, que fez com que a multiplicação microbiana fosse

minimizada.

Segundo Seabra et al. (2011) e Salgado et al. (2013) o aumento no pH, pode ser

atribuído à formação de compostos alcalinos tais como amônia, devido à ação de micro-

organismos e enzimas endógenas, resultando em um acréscimo no conteúdo de N-BVT. No

presente estudo, foi verificado um aumento significativo (p < 0,05) no conteúdo de N-BVT de

8,35 para 33,97 mg de N-BVT/100 g de amostra para os filés revestidos com o filme controle,

após 15 dias de armazenamento. Entretanto, para as amostras revestidas com os filmes

incorporados com hidrolisado ou OEC, esse incremento significativo (p < 0,05) foi de 8,35

para 27,72 e 25,39 mg de N-BVT/100 g de amostra até o 10° dia de armazenamento,

respectivamente. Esse comportamento, foi semelhante ao verificado na determinação do pH

(Figura 4a). Ao final do tempo de armazenamento, as amostras revestidas seja com filme

controle, incorporados com hidrolisado ou OEC, apresentaram conteúdo de 33,97; 29,80 e

25,83 mg de N-BVT/100 g de amostra. Wu et al. (2014), avaliaram o efeito de filmes de

gelatina-quitosana incorporados com OE de orégano, sobre a conservação de filés de carpa-

capim (Hypophthalmichthys molitrix) durante armazenamento a 4 °C durante 12 dias, onde

verificaram que no 12 ° dia de armazenamento, o filme incorporado com OE de orégano

apresentou um conteúdo de N-BVT de 40 mg de N-BVT/100 g de amostra, superior ao

verificado no presente estudo. O aumento no conteúdo de N-BVT ao longo do

armazenamento, para diferentes amostras revestidas com filmes ou coberturas ativas, tem sido

verificado em muitos estudos (ARANCIBIA et al., 2015b; FERREIRA, 2014; GÓMEZ-

ESTACA et al., 2010; OJAGH et al., 2011; SALGADO et al., 2013). Os resultados sugerem,

que a amostra contendo OEC apresentou uma tendência à conservação dos filés de linguado,

pois segundo o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem

Animal - RIISPOA, o máximo aceitável de N-BVT para o pescado ser considerado fresco é

de 30 mg de N-BVT/100 g de amostra (BRASIL, 2002).

3.2.2 Perda de massa

A Figura 5, apresenta a perda de massa dos filés de linguado revestidos com os

filmes controle ou incorporados com hidrolisado ou OEC armazenados a 5 °C.

205

Figura 5 – Perda de massa dos filés de linguado embalados com os filmes controle ou

incorporados com hidrolisado ou OEC armazenados a 5 °C


Apêndice IV.

A perda de massa aumentou significativamente (p < 0,05), ao longo do tempo de

armazenamento para todas as amostras avaliadas. Ela foi significativamente superior (p <

0,05) para as amostras revestidas com os filmes incorporados com o hidrolisado ou OEC em

relação ao filme controle, que ao final do 15 ° dia de armazenamento apresentaram uma perda

de massa de 54,22 e 52,14%, respectivamente. Han et al. (2014), verificaram que filés de

carne bovina revestidos de filmes elaborados à base de polipropileno e álcool polivinílico

incorporados com diferentes OEs, não apresentaram uma perda de massa superior em relação

ao filme controle, ao longo do armazenamento, sugerindo que a perda de massa não

influenciou na avaliação microbiológica dos mesmos. Antoniewski et al. (2007) avaliaram a

perda de massa de carnes bovinas, suínas, de aves e de filés de salmão revestidos com filmes à

base de gelatina, onde verificaram que todas as amostras avaliadas apresentaram menor perda

de massa que o controle, quando adicionados de filmes de gelatina.

No presente estudo, verificou-se que os filmes incorporados com o OEC ou

hidrolisado, apresentaram maior PVA em relação ao filme controle, devido as características

estruturais e físico-químicas dos mesmos. Este fato, pode ter contribuído para maior perda de

massa dos filmes avaliados, contribuindo para diminuição da multiplicação microbiana,

possivelmente, devido a diminuição de água nos filés. Cardoso (2014), verificou que filmes à

base de quitosana e gelatina incorporados com OE, apresentaram uma perda de massa dos

206

filés de carne bovina revestidos, de aproximadamente 12% após 5 dias de armazenamento, a

qual foi associada à elevada PVA.

3.2.3 Análises microbiológicas

A Figura 6, apresenta a avaliação microbiológica dos filés de linguado revestidos

com os filmes controle, incorporados de hidrolisado ou OEC armazenados a 5 °C. A

contagem de enterobactérias, mesófilos aeróbios totais e micro-organismos produtores de

H2S, como colônias pretas possivelmente Shewanella putrefaciens, no tempo zero de

armazenamento foi entre 2 e 3 log UFC/g, Figuras 6b e 6e, respectivamente. A contagem

inicial de Pseudomonas spp. foi de 3,4 log UFC/g, Figura 6d. Salgado et al. (2013),

verificaram que a contagem inicial de enterobactérias, mesófilos aeróbios totais e micro-

organismos produtores de H2S e Pseudomonas spp. de filés de sardinha (Sardina pilchardus),

revestidos com filmes proteicos incorporados com diferentes OE, foi de 3,05; 4,56; < 2 e 4,29

log UFC/g, respectivamente.

Em geral a contagem dos micro-organismos, aumentou durante o armazenamento

(p < 0,05) em todos os tratamentos avaliados. Os filmes incorporados com OEC não

apresentaram acréscimo (p > 0,05) na contagem dos micro-organismos produtores de H2S,

Figura 6e, após o 10 ° dia de armazenamento. Além disso, esses filmes apresentaram maior

inibição (p < 0,05) dos mesófilos aeróbios totais (Figura 6b), bactérias ácido láticas (Figura

6c) e micro-organismos produtores de H2S (Figura 6e) de aproximadamente 1,5; 1,3 e 2,15

log UFC/g, em relação aos filés de linguado revestidos com o filme controle no 15° dia de

armazenamento, respectivamente. Essa inibição microbiana pode ser atribuída à natureza

hidrofóbica dos OEC e seus constituintes. Os principais componentes de OE são os

compostos fenólicos, tais como o carvacrol, eugenol e timol, que podem afetar o fosfolipídio

da membrana celular, aumentando a permeabilidade e a perda do citoplasma, ou interagir com

enzimas localizadas na parede da célula. Desta forma, ocorrem lesões que diminuem a

produção de ATP das células e o pH intracelular, levando a perda da viabilidade celular e até

mesmo a morte (SIKKEMA; DE BONT; POOLMAN, 1994; WU et al., 2014; ZIVANOVIC;

CHI; DRAUGHON, 2005).

207

Figura 6 – Contagem dos diferentes micro-organismos dos filés de linguados armazenados a

5 °C


Apêndice IV.

(a) (b)

(c) (d)

(e)

208

Gómez-Estaca et al. (2010), avaliaram o efeito de filmes de gelatina-quitosana

incorporados com OEC, sobre a conservação de filés de bacalhau (G. morhua) durante o

armazenamento a 2 °C, onde verificaram uma inibição total dos micro-organismos produtores

de H2S, após 3 dias de armazenamento, o que pode estar relacionado com a diminuição do pH

provocado pela filmes de gelatina-quitosana, o que aumentou a permeabilidade do OEC. Após

12 dias de armazenamento, os mesmos autores verificaram que a inibição das bactérias ácido

láticas, foi inferior a 2 log UFC/g, semelhante ao verificado no presente estudo.

O hidrolisado adicionado nestes filmes, possui em sua grande maioria

aminoácidos hidrofóbicos, como foi verificado nos Artigos II (página 125) e III (página 165),

possibilitando a ligação com a membrana celular dos micro-organismos (NAJAFIAN; BABJI,

2012; SEGURA-CAMPOS et al., 2013). Os filmes incorporados com hidrolisado,

apresentaram maior inibição (p < 0,05) dos micro-organismos produtores de H2S, das

bactérias ácido láticas e dos mesófilos aeróbios totais em relação aos demais micro-

organismos avaliados para esse tratamento. Em relação aos filés revestidos com o filme

controle, esses inibiram 0,94; 0,54 e 0,21 log UFC/g, respectivamente. Os filmes incorporados

com o hidrolisado, apresentaram menor inibição dos micro-organismos avaliados em relação

ao filme adicionado de OEC, sugerindo que o OEC possui um efeito antimicrobiano superior

ao verificado para o hidrolisado.

Em relação às Pseudomonas spp., não foi verificada uma diferença significativa (p

> 0,05) na inibição no 15 ° dia de armazenamento, para todas as amostras avaliadas. Em

relação às enterobactérias, os filés revestidos com os filmes incorporados com OEC e com o

hidrolisado, apresentaram uma contagem final de 7,85 e 8,03 log UFC/g, significativamente

superior (p < 0,05) ao filme controle (7,65 log UFC/g). Salgado et al. (2013), verificaram que

filés de sardinha (Sardina pilchardus), revestidos com filmes proteicos incorporados com

OEC, apresentaram uma contagem de 8,79 log UFC/g, ao final do tempo de armazenamento,

superior ao verificado neste estudo. Entretanto, a contagem inicial dos mesmos, foi superior

ao verificado para os filés de linguado deste trabalho.

Segundo Atef, Rezaei e Behrooz (2015), Sedaghati et al. (2016) e Wu et al. (2014)

as bactérias Gram-negativas, como as enterobactérias (Figura 6a) e as Pseudomonas spp.

(Figura 6d) são resistentes, pois possuem uma membrana exterior a parede celular,

relativamente impermeável, que limita a difusão de compostos hidrofóbicos, tais como o OEC

e hidrolisado proteico que contém aminoácidos hidrofóbicos, através do lipopolissacarídeo

que constitui a membrana externa da parede do peptideoglicano, que envolve a parede celular.

O acréscimo no conteúdo das N-BVT e do valor de pH dos diferentes tratamentos, coincide

209

com a contagem elevada dos mesófilos aeróbios totais, enterobactérias e Pseudomonas spp.

de aproximadamente 8 log UFC/g para os filés revestidos com os filmes incorporados com

peptídeos e o filme controle.

A adição de OEC e de hidrolisado nos filmes, não apresentou efetiva inibição dos

micro-organismos avaliados, comparados a outros estudos que adicionaram compostos ativos

nos filmes (GÓMEZ-ESTACA et al., 2010; HAN et al., 2014; WU et al., 2014). Contudo, os

filés revestidos com os filmes incorporados com OEC ou com o hidrolisado, apresentaram

maior perda de massa em relação ao controle, o que pode ter contribuído para os resultados

obtidos, devido a uma, possível, diminuição da atividade de água da amostra. Isto também

pode ter contribuído, para a inibição dos micro-organismos, tais como os produtores de H2S e

as bactérias ácido láticas pelo hidrolisado e também potencializado o efeito antimicrobiano do

OEC.

4 CONCLUSÃO

Os filmes elaborados a partir de ágar com a incorporação do hidrolisado

apresentaram-se homogêneos e transparentes. Entretanto, os filmes adicionados de óleo

essencial de cravo apresentaram descontinuidades ao longo de todo o filme, indicando falta de

afinidade do mesmo com a matriz polimérica utilizada. A incorporação do hidrolisado e do

óleo essencial de cravo, resultou em filmes mais permeáveis e menos resistentes, em relação

aos filmes controle. A adição do hidrolisado nos filmes, intensificou a cor amarelada dos

mesmos e aumentaram a solubilidade em água, porém manteve a transparência semelhante ao

filme controle. Entretanto, os filmes incorporados de óleo essencial de cravo, apresentaram

maior opacidade e menor transparência devido à formação de bolhas e gotículas de óleo, que

foram visivelmente observadas. Quando os filmes foram aplicados na conservação de filés de

linguado refrigerados, verificou-se que a adição de óleo essencial de cravo diminuiu a

formação de bases volatéis totais e o aumento do pH, em relação aos filmes controle e

incorporados com o hidrolisado. A incorporação seja do hidrolisado ou do óleo essencial de

cravo, diminuiu a multiplicação dos micro-organismos produtores de H2S, das bactérias ácido

láticas e dos mesófilos aeróbios totais, quando comparados ao filme controle. Entretanto, esse

efeito antimicrobiano pode ter sido influenciado pela perda de massa dos filés de linguado

revestidos com os mesmos, o que poderia ter alterado o conteúdo de água dificultando a

multiplicação destes.

210




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216

CAPÍTULO IV - CONCLUSÃO GERAL

217

Os isolados proteicos de castanha (U. canosai) obtidos por

solubilização/precipitação isoelétrica, recuperaram proteínas de castanha, que apresentaram

características fortemente funcionais em relação às proteínas miofibrilares, provenientes do

processo de sucessivas lavagens. Esse processo afetou a coloração e as propriedades térmicas

do mesmo. Contudo, o tipo de processo de recuperação proteica, não afetou a digestibilidade

proteica e os espectros de infravermelho. A microscopia eletrônica de varredura, indicou que

a proteína miofibrilar de castanha possui estruturas compactas, em relação ao isolado proteico

de castanha. Esses resultados sugerem, que essas mudanças são, em grande parte,

influenciadas pelo tratamento alcalino.

Os hidrolisados proteicos obtidos a partir de isolado proteico e de proteína

miofibrilar da castanha, em diferentes graus de hidrólise e enzimas, apresentaram atividades

antioxidante, antimicrobiana, anti-hipertensiva, inibitória das enzimas dipeptidil peptidase-IV

e prolil endopeptidase. A atividade antioxidante, encontrada apresentou forte dependência da

metodologia utilizada para avaliação da mesma. Além disso, a matéria-prima, enzima e grau

de hidrólise apresentaram influência na determinação da atividade antioxidante e

antidiabética. A amostra de hidrolisado de isolado proteico de castanha, obtida utilizando a

Alcalase como enzima e no maior grau de hidrólise, apresentou a maior atividade

antioxidante, em três dos quatros métodos avaliados.

Em relação à atividade antimicrobiana, as amostras apresentaram maior

capacidade de inibição frente aos micro-organismos Gram-positivos. Além disso, a protease

utilizada apresentou grande influência na atividade antimicrobiana, pois foi verificado que as

amostras hidrolisadas pela enzima Alcalase, exibiram maiores halos de inibição. As amostras

hidrolisadas pela enzima Protamex, apresentaram maior atividade anti-hipertensiva e

inibitória da enzima prolil endopeptidase. Após o ensaio da digestão gastrointestinal simulada

do filme com a incorporação do hidrolisado, houve um decréscimo nas atividades anti-

hipertensiva, inibitória da prolil endopeptidase e dipeptidil peptidase-IV, possivelmente pela

maior quebra da cadeira peptídica o que resultou, possivelmente, em peptídeos e sequências

desses que não favorecem essas atividades.

Os filmes elaborados a partir de ágar com e sem a incorporação do hidrolisado,

apresentaram-se homogêneos e transparentes. A adição do hidrolisado, resultou em filmes

mais permeáveis, úmidos, elongáveis e com características hidrófilas em relação aos filmes

elaborados sem a adição dos mesmos. A adição de óleo essencial de cravo, resultou em filmes

rugosos com descontinuidade ao longo de todo o filme, indicando falta de afinidade do

218

mesmo com a matriz polimérica utilizada, o que resultou em filmes opacos, permeáveis e

menos resistentes em relação ao filme sem a incorporação de óleo essencial de cravo.

Quando utilizado um filme incorporado com óleo essencial de cravo, como

revestimento de filés de linguado (Paralichthys orbignyanus) refrigerados, foi verificada a

diminuição de bases volatéis totais e a manutenção do pH, em relação aos filmes controle e

aos filmes incorporados com o hidrolisado. A incorporação do hidrolisado e do óleo essencial

de cravo, diminuiu a multiplicação dos micro-organismos produtores de H2S, das bactérias

ácido láticas e dos mesófilos aeróbios totais, em relação ao filme controle. Contudo, esse

efeito pode ter sido influenciado pela perda de massa dos filés de linguado revestidos com os

mesmos, que possivelmente alterou o conteúdo de água e ao final dificultou a multiplicação

dos mesmos.

219

CAPÍTULO V - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

220



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243

APÊNDICE I

Figura 1 - Cinética de hidrólise do isolado proteico e proteína miofibrilar de castanha pelas

enzimas Alcalase (a) e Protamex (b)

(a)

(b)

244

APÊNDICE II

Figura 2 - Teste preliminar da atividade antimicrobiana dos diferentes hidrolisados, na

concentração de 5 mg/mL frente a diferentes micro-organismos

a) Aeromonas hydrophila (AH), b) Brochothrix thermosphacta (BT), c) Debaryomyces hanseii (DH), d) Listeria

innocua (LI), e) Listeria monocytogenes (LM), f) Staphylococcus aureus (SA) e g)Yersinia enterecolitica (YE).

1:Hidrolisado de IPC com GH de 10% utilizando a Alcalase (HIPA1); 2: Hidrolisado de IPC com GH de 20%




Hidrolisado de PMC com GH de 10% utilizando a Protamex (HPMP1); 8: Hidrolisado de PMC com GH de

20% utilizando a Protamex (HPMP2).

245

y = 29,68x + 51,637 R² = 0,9373

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2

Inib

içã

o (

%)

ln

APÊNDICE III

Tabela 1- Fluorescência monitorada a 355 nm/460 nm em intervalos de 2 min durante 30 min

da inibição da prolil endopeptidase

Controle: o tampão de fosfato (0,1 M; pH 7,0; EDTA 1 mM) foi utilizado no lugar da amostra; Branco: ácido

clorídrico (40 mM).

Tabela 2- Fluorescência monitorada a 355 nm/460 nm do tratamento 3, em intervalos de 2

min durante 30 min da inibição da prolil endopeptidase

Concentração inicial: 10 µg/µL; Volume final do poço: 300 µL; Inibição (%) = [100- (Fluorescência da amostra

corrigida*100/Fluorescência média corrigida do controle)]; ln: ln (concentração de amostra final no poço).

Figura 1- Gráfico da inibição (%) versus o ln do tratamento 3

Equação para cálculo do CI50 (µg/µL ou mg/mL) CI 50 exp (50-b)/a

Onde: a: 29,68; b: 51,637

Tratamento Fluorescência Fluorescência média do

controle corrigida

Branco -357 -

Controle 24861 25219

Quantidade de

amostra adicionada

(µg/µL)

Concentração de

amostra final no

poço (µg/µL)

Fluorescência da

amostra

corrigida

Inibição (%) ln

15 0,50 19294 23,50 -0,69

25 0,83 12247 51,40 -0,18

50 1,66 6428 74,50 0,51

90 3,00 3705 85,30 1,09

130 4,33 2839 88,74 1,46

246

APÊNDICE IV

Tabela 1- Análise estatística da contagem das bactérias ácido láticas

Letras minúsculas iguais na mesma linha, indicam que não há diferença significativa (p > 0,05) ao longo do

tempo do armazenamento para o mesmo tratamento; Letras maiúsculas iguais na mesma coluna, indicam que

não há diferença significativa (p > 0,05) para os diferentes tratamentos no mesmo tempo de armazenamento.

Tabela 2 - Análise estatística da contagem das enterobactérias




Tabela 3 - Análise estatística da contagem das Pseudomonas spp.




Tratamento

Tempo de armazenamento (dias)

0 3 5 7 10 15

Controle dA cA cA cA bA aA

Hidrolisado dA cA cB cB bB aB

OEC dA cA cB cB bC aC

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle fA eA dA cA bA aC

Hidrolisado fA eAB dA cC bB aA

OEC fA eB dB cB bC aB

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle eA dB dA cB bA aC

Hidrolisado eA dA dB cA bB aB

OEC eA dC dC cC bC aA

247

Tabela 4 - Análise estatística da contagem de micro-organismos produtores de H2S




Tabela 5 - Análise estatística da contagem mesófilos aeróbios totais




Tabela 6 - Análise estatística da determinação das bases voláteis totais (N-BVT)

Letras minúscula iguais na mesma linha, indicam que não há diferença significativa (p > 0,05) ao longo do

tempo do armazenamento para o mesmo tratamento; Letras maiúscula iguais na mesma coluna, indicam que não

há diferença significativa (p > 0,05) para os diferentes tratamentos no mesmo tempo de armazenamento.

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle fA eB dA cA bA aA

Hidrolisado fA eA dB cA bA aA

OEC fA eC dB cB bB aA

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle eA dB dA cB bA aC

Hidrolisado eA dA dB cA bB aB

OEC eA dC dC cC bC aA

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle fA eAB dAB cA bA aA

Hidrolisado eA dA cA bA aB aB

OEC eA dB cB bB aB aC

248

Tabela 7 - Análise estatística da determinação de pH

Letras iguais na mesma linha indicam que não há diferença significativa (p > 0,05) ao longo do tempo do

armazenamento para o mesmo tratamento; Letras iguais na mesma coluna indicam que não há diferença

significativa (p > 0,05) para os diferentes tratamentos no mesmo tempo de armazenamento.

Tabela 8 – Análise estatística da determinação de perda de massa

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle Af Ae Bd Bc bBC Ba

Hidrolisado Af Ae Ad Ac Bb Aa

OEC Af Ae Ad Ac Ab Aa

Letras iguais na mesma linha indicam que não há diferença significativa (p > 0,05) ao longo do tempo do

armazenamento para o mesmo tratamento; Letras iguais na mesma coluna indicam que não há diferença

significativa (p > 0,05) para os diferentes tratamentos no mesmo tempo de armazenamento.

Tratamento


0 3 5 7 10 15

Controle dA eB cB bA aA aA

Hidrolisado dA dA cA cB bB aB

OEC dA dB cC bcC abC aC

249

ANEXO I

Universal Protease Activity Assay: Casein as a Substrate

A. Preparation of Reagents

Before beginning the assay, we need to make sure that the following reagents are

correctly prepared: A 50 mM Potassium Phosphate Buffer, pH 7.5. Prepare using 11.4 mg/ml

of potassium phospate dibasic, trihydrate in purified water and adjusting pH with 1M HCl.

This solution is placed at 37°C prior to use. A 0.65% weight/volume casein solution, prepared

by mixing 6.5 mg/ml of the 50 mM potassium phosphate buffer. The solution temperature is

gradually increased with gentle stirring to 80-85 °C for about 10 minutes until a homogenous

dispersion is achieved. It is very important not to boil the solution. The pH is then adjusted if

necessary with NaOH and HCl. A 110 mM Trichloroacetic acid solution, prepared by diluting

a 6.1N stock 1:55 with purified water. Trichloroacetic acid is a strong acid and should be

handled with care. The 0.5 M Folin & Ciolcaltea’s, or Folin’s Phenol Reagent, which is the

solution that will react with tyrosine to generate a measurable color change that will be

directly related to the activity of proteases. Folin’s Phenol Reagent is an acid and should be

handled with care.

The 500 mM Sodium Carbonate solution, prepared using 53 mg/ml of anyhydrous

sodium carbonate in purified water. An enzyme diluent solution, which consists of 10 mM

Sodium Acetate Buffer with 5mM Calcium, pH 7.5, at 37°C. This solution is what we use to

dissolve solid protease samples or dilute enzyme solutions. The 1.1 mM L-tyrosine Standard

stock solution. Prepared using 0.2 mg/ml L-tyrosine in purified water and heated gently until

the tyrosine dissolves. As with the casein, do not boil this solution. Allow the L-tyrosine

standard to cool to room temperature. This solution will be diluted further to make our

standard curve.

If necessary, a solid protease sample of predetermined activity, which is dissolved

using enzyme diluent to 0.1-0.2 units/ml. This solution serves as a positive control for the

quality control assay and as validation for the calculations we will perform to determine

enzyme activity.

250

B. Setting up the Protease Assay and Standard Curves

To begin this assay, find suitable vials that will hold about 15 mls. For each enzyme

that you will test, you will need 4 vials. One vial will be used as a blank, and three others will

be used to assay activity of three dilutions of the protease. Three dilutions are useful when

checking our final calculations against each other. To each set of four vials add 5mls of our

0.65% casein solution, and let them equilibrate in a water bath at 37°C for about 5 minutes.

Then, add varying volumes of enzyme solution you want to test to three of the test sample

vials, but not the blank. Mix them by swirling and incubate for 37°C for exactly ten minutes.

The protease activity and consequential liberation of tyrosine during this incubation time is

what will be measured and compared between our test samples.

After this 10 minute incubation, add the 5 mls of the TCA reagent to each tube to stop

the reaction. Then an appropriate volume of enzyme solution is added to each tube, even the

blank, so that the final volume of enzyme solution in each tube is 1 ml. This is done to

account for the absorbance value of the enzyme itself and ensure that the final volume in each

tube is equal. Now incubate the solutions at 37°C for 30 minutes. During this 30 minute

incubation, you may want to set up your tyrosine standard dilutions, which is done using 6

dram vials (dram vials can be substituted with polypropylene tubes) that can easily hold 8

mls. To the six vials the 1.1 mM tyrosine standard stock solutions is added with the following

volumes in mls: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. Don't add any tyrosine standard to the blank.

Lower standards may be needed for impure test samples with that will yield little color

change. Once the tyrosine standard solution has been added, add an appropriate volume of

purified water to each of the standards to bring the volume to 2 mls.

After the 30 minute incubation, filter each of the test solutions and the blank using a

0.45 um polyethersulfone syringe filter. Filtration is required to remove any insolubles from

the samples. The filtration 2 mls of the test samples and blank filtrate is then added to 4 dram

vials that can hold at least 8 mls. You can use the same type of vial in which the standards

were prepared. To all of the vials containing the standards and standard blank, 5mls of sodium

carbonate is added, and for best results, 1 ml of Folin’s reagent is added immediately

afterwards. Sodium carbonate is added to regulate any pH drop created by the addition of the

Folin’s reagent. Sodium carbonate is then added to our test samples and test blank. You’ll

notice that these solutions become cloudy after the addition of sodium carbonate. Then, the

Folin’s reagent is added, which will react primarily with free tyrosine. The dram vials are then

mixed by swirling and incubated at 37 ºC for 30 minutes.

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After this incubation, you should notice that the standards have a gradation of color

correlating with the amount of tyrosine added; the highest concentrations of tyrosine

appearing darkest. You can also notice appreciable color change in our test samples. 2mls of

these solutions are filtered using a 0.45 um polyethersulfone syringe filter into suitable

cuvettes. Now we performed the assay, we can proceed to the spectrophotometer to record our

absorbance values.

C. Measuring Absorbance and Calculating Enzyme Activity

The absorbance of our samples is measured by a spectrophotometer using a

wavelength of 660nm. The light path is set to 1cm. Record the absorbance values for the

standards, standard blank, the different test samples, and test blank. Once all of the data has

been collected, we are ready to create our standard curve. In order to generate the curve,

difference in absorbance between the standard and standard blank must be calculated. This is

the absorbance value attributable to the amount of tyrosine in the standard solutions. After

this simple calculation, we create our standard curve using a graphing program by plotting the

change in absorbance of our standards on the Y axis, versus the amount in micromoles for

each of our 5 standards on the X axis.

Once we have entered in our data points, generate a line of best fit and corresponding

slope equation.We then find the change in absorbance in our test samples by calculating the

difference between our test sample absorbance and the absorbance of our test blank. Inserting

the absorbance value for one of the test samples into the slope equation and solving will result

in the micromoles of tyrosine liberated during this particular proteolytic reaction.

Take the number of micromoles tyrosine equivalents released obtained from the slope

equation and multiply it by the total volume of the assay in mls, which in our case is 11mls.

Then, divide this value by three other quantities: the time of the assay, which we ran for 10

minutes, the volume of enzyme used in the assay, which was varied, - let's use 1ml - the

volume of milliliters used in colorimetric detection, which may differ based on your cuvette.

We used 2 mls. Micromoles of tyrosine divided by time in minutes gives us our measurement

of protease activity that we call units. We can cancel out the units for volume measurement in

the numerator and denominator, and are hence left with a measurment of enzyme activity in

terms of units/ml. In order to determine the activity in a solid protease sample diluted in

enzyme diluent we divide our activity in units/ml by the concentration of solid used in this

assay originally in mg/ml. Leaving us with activity in terms of units/mg.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE … · prolil endopeptidase de hidrolisados proteicos da castanha (Umbrina canosai) incorporados em filmes de ágar após digestão gastrointestinal