UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG ESCOLA DE ... menoncin... · PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS PURIFICAÇÃO DE LIPASES PRODUZIDAS POR FUNGO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE

ALIMENTOS

PURIFICAÇÃO DE LIPASES PRODUZIDAS POR FUNGO UTILIZANDO SISTEMA

AQUOSO BIFÁSICO E SEPARAÇÃO POR MEMBRANA

Silvana Menoncin

Profa. Dra. Susana Juliano Kalil

Orientadora

Profo. Dr. Marco Di Luccio

Co-orientador

RIO GRANDE, RS

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇĂO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DOS

ALIMENTOS

PURIFICAÇÃO DE LIPASES PRODUZIDAS POR FUNGO UTILIZANDO SISTEMA

AQUOSO BIFÁSICO E SEPARAÇÃO POR MEMBRANA

Silvana Menoncin

Profa. Dra. Susana Juliano Kalil

Orientadora

Profo. Dr. Marco Di Luccio

Co-orientador

RIO GRANDE, RS

2011

Tese apresentada como parte dos

requisitos necessários para obtenção do

título de Doutor em Engenharia e Ciência

de Alimentos

ii

“Quanto maior a dificuldade tanto maior o mérito em superá-la”

(Henry Ward Beecher)

iii

Dedico esta conquista a

todos que acreditaram que era

possível, pelo apoio e incentivo.

iv

AGRADECIMENTOS

No trajeto percorrido, muitos obstáculos foram encontrados, e muitas pessoas foram

colocadas neste caminho que me ajudaram de varias maneiras a alcançar esta

conquista e a quem agradeço.

A Deus, força maior a qual nos momentos difíceis recorri em busca de paz, coragem e

proteção para seguir o caminho.

A meus pais Selvino e Ivete e meus irmãos Silvete e Carlos pelo amor, carinho,

incentivo e apoio durante todos estes anos, e por acreditarem que era possível sim.

Ao Eluzardo, meu companheiro que junto comigo superou a distância e saudade

durante todos estes anos, e principalmente pela paciência e compreensão nos

momentos em que não podia estar contigo.

Aos demais familiares, que sempre me apoiaram em busca desta conquista.

A meus orientadores Susana e Marco por todos os ensinamentos, mas principalmente

pela amizade, confiança, apoio e compreensão em todas as vezes que em suas salas

fui em busca de uma palavra de incentivo. Obrigado por acreditarem em mim.

Às minhas amigas especiais Marceli e Simone, por toda ajuda que me deram, estando

sempre dispostas a me auxiliar nos experimentos e principalmente pelos ombros

amigos sempre me escutando quando as coisas não estavam muito bem, e que nos

momentos de alegria estavam lá para rir comigo. Obrigada, a amizade e carinho que

tenho por vocês irá comigo para onde eu for.

À Daniela, Renata, Adriana e André os quais, em um momento da realização deste

trabalho, estavam lá para me ajudar.

Aos demais colegas e amigos do laboratório de Biotecnologia e da Central de

Materiais da URI – Campus de Erechim e também do laboratório de Microbiologia e

Bioseparações da FURG – Rio Grande, pela amizade, ajuda e experiências

compartilhadas.

Aos professores da Engenharia de Alimentos da URI - Erechim e da FURG – Rio

Grande, por toda ajuda e ensinamentos.

Ao PROCAD/CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro.

Enfim a todas as pessoas que contribuíram com ensinamento, apoio e amizade,

tornando possível a conclusão deste trabalho.

v

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .................................................................................................. IV

LISTA DE TABELAS ................................................................................................... IX

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. XII

RESUMO ................................................................................................................... XIII

ABSTRACT .............................................................................................................. XIV

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 3

2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 3

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 3

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................... 4

3.1 ASPECTOS GERAIS E APLICAÇÕES DE LIPASES ....................................................... 4

3.2 PRODUÇÃO DE LIPASES POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ............................ 9

3.3 PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS ................................................................................... 14

3.3.1 Purificação de enzimas por Sistema Aquoso Bifásico ................................. 15

3.3.2 Purificação de enzimas por ultrafiltração ..................................................... 21

3.4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 26

4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 27

4.1 MICRO-ORGANISMO ............................................................................................. 27

4.2 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO ..................................................................... 27

4.3 PREPARO DAS AMOSTRAS ................................................................................... 28

4.4 MASSA MOLAR DO POLIETILENOGLICOL (PEG) ..................................................... 28

4.5 DETERMINAÇÃO DA CURVA BINODAL .................................................................... 29

4.6 PREPARAÇÃO DO SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO ...................................................... 29

4.7 SCREENING DE DIFERENTES CONDIÇÕES DE PEG/FOSFATO DE POTÁSSIO NO SISTEMA

AQUOSO BIFÁSICO PARA A PURIFICAÇÃO DA LIPASE .................................................... 30

4.8 ESTRATÉGIA PARA A MAXIMIZAÇÃO DA PURIFICAÇÃO POR SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO

................................................................................................................................ 30

4.9 ULTRAFILTRAÇÃO ................................................................................................ 31

vi

4.10 EFEITO DA FORÇA IÔNICA NA ULTRAFILTRAÇÃO.................................................... 32

4.11 COMBINAÇÃO DO SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO E ULTRAFILTRAÇÃO PARA A

PURIFICAÇÃO DA LIPASE............................................................................................ 32

4.13 FATOR DE PURIFICAÇÃO (FP)............................................................................. 33

4.14 RECUPERAÇÃO DA LIPASE (RP) .......................................................................... 33

4.15 COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (KPART) ..................................................................... 33

4.16 RAZÃO DE VOLUMES DO SISTEMA (VR) ............................................................... 34

4.17 RETENÇÃO DA ULTRAFILTRAÇÃO (%R) ............................................................... 34

4.18 MEDIDA DA ATIVIDADE DE HIDRÓLISE ................................................................. 34

4.19 MEDIDA DA ATIVIDADE DE TRANSESTERIFICAÇÃO ................................................ 35

4.20 QUANTIFICAÇÃO DE POLIETILENOGLICOL ............................................................ 36

4.21 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA TOTAL ................................................................. 36

4.22 DETERMINAÇÃO DO PH ...................................................................................... 36

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 37

5.1 SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMO ................................................ 37

5.2 SCREENING DE DIFERENTES SISTEMAS PEG/FOSFATO DE POTÁSSIO PARA A

PURIFICAÇÃO DA LIPASE ............................................................................................ 37

5.2.1. Avaliação da influência de diferentes massas molares do PEG em pH 6,0 37



5.2 ESTRATÉGIA PARA A MAXIMIZAÇÃO DA PURIFICAÇÃO POR SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO

................................................................................................................................ 49

5.3 ULTRAFILTRAÇÃO ................................................................................................ 56

5.4 EFEITO DA FORÇA IÔNICA NA ULTRAFILTRAÇÃO...................................................... 58

5.5 COMBINAÇÃO DO SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO E SEPARAÇÃO POR MEMBRANA PARA A

PURIFICAÇÃO DA LIPASE ............................................................................................ 61

6 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 65

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ...................................................... 66

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 67

9 APÊNDICE .............................................................................................................. 83

APÊNDICE I – CURVAS BINODAIS PARA PEG 8000 E 10000 DA EM PH 6, 7 E 8 .......... 83

vii

APÊNDICE II - TABELAS COMPLETAS COM OS VALORES OBTIDOS NA ULTRAFILTRAÇÃO DO

EXTRATO BRUTO, COM A ADIÇÃO DE NACL ULTRAFILTRADO EM MEMBRANA DE 30 E 60

KDA E COMBINAÇÃO DO SAB/UF ULTRAFILTRADO NA MEMBRANA DE 30 KDA. ............... 86

APÊNDICE III – ARTIGO SCREENING DO MICRO-ORGANISMO UTILIZADO NO ESTUDO .... 90

viii

ix

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – PRINCIPAIS APLICAÇÕES DE LIPASES EM DIFERENTES

SEGMENTOS 8

TABELA 2 - SUBSTRATOS NATURAIS E MICRO-ORGANISMOS ENVOLVIDOS NA

FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO PARA PRODUÇÃO DE LIPASES 12

TABELA 3 - SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS UTILIZADOS PARA A

PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS 19

TABELA 4 - APLICAÇÃO DAS DIFERENTES MEMBRANAS NA SEPARAÇÃO DE

VÁRIOS COMPOSTOS 24

TABELA 5 - VARIÁVEIS E NÍVEIS ESTUDADOS NO PLANEJAMENTO PARA

MAXIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PURIFICAÇÃO 31

TABELA 6 – RESULTADOS OBTIDOS COM SISTEMAS BASEADOS EM PEG 1500

PH 6 38

TABELA 7 - RESULTADOS OBTIDOS COM SISTEMAS BASEADOS EM PEG 4000

PH 6 38


PH 6 38


PH 6 39


PH 6 39


PH 7,0 41


PH 7,0 41


PH 7,0 42


PH 7,0 42

TABELA 15- RESULTADOS OBTIDOS COM SISTEMAS BASEADOS EM PEG 10000

PH 7,0 43


PH 8,0 44


PH 8,0 44

x


PH 8,0 45


PH 8,0 45


PH 8,0 46

TABELA 21-RECUPERAÇÃO E FATOR DE PURIFICAÇÃO PEG 1500, 4000, 6000,

8000 E 10000 PH 8,0 47

TABELA 22 - MATRIZ DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL REALIZADO PARA

PURIFICAÇÃO DA LIPASE (VALORES CODIFICADOS E REAIS COM AS

RESPOSTAS RECUPERAÇÃO, FATOR DE PURIFICAÇÃO, RAZÃO DOS

VOLUMES E COEFICIENTE DE PARTIÇÃO) 50

TABELA 23 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA O FATOR DE PURIFICAÇÃO DO

EXTRATO ENZIMÁTICO BRUTO OBTIDO POR PENICILLIUM CRUSTOSUM 51

TABELA 24 - FATOR DE PURIFICAÇÃO, RECUPERAÇÃO, RAZÃO DE VOLUMES E

COEFICIENTE DE PARTIÇÃO PARA MENORES CONCENTRAÇÕES DE PEG E

FOSFATO DE POTÁSSIO E CONCENTRAÇÕES DE 0, 1,2 E 4,8% DE NACL 54

TABELA 25 - FATOR DE PURIFICAÇÃO, RECUPERAÇÃO, RAZÃO ENTRE

VOLUMES E COEFICIENTE DE PARTIÇÃO, ATIVIDADE DE HIDRÓLISE E DE

TRANSESTERIFICAÇÃO NA FASE DE TOPO, NOS MELHORES PONTOS DA

MAXIMIZAÇÃO DA PURIFICAÇÃO 56

TABELA 26 – RESULTADOS DA ATIVIDADE HIDRÓLISE, PROTEÍNA E ATIVIDADE

ESPECÍFICA OBTIDOS NA ULTRAFILTRAÇÃO DO EXTRATO ENZIMÁTICO

BRUTO EM MEMBRANA DE 30 KDA E 60KDA 57

TABELA 27 - RESULTADOS DA ULTRAFILTRAÇÃO DO EXTRATO ENZIMÁTICO

BRUTO 57


ESPECÍFICA OBTIDOS NA ULTRAFILTRAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E NOS

ENSAIOS COM ACRÉSCIMO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE NACL

EM MEMBRANA DE 30 KDA 59


ESPECÍFICA OBTIDOS NA ULTRAFILTRAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E NOS

ENSAIOS COM ACRÉSCIMO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE NACL

EM MEMBRANA DE 60 KDA 59

xi

TABELA 30 - EFEITO DA FORÇA IÔNICA SOBRE A ULTRAFILTRAÇÃO DO

EXTRATO ENZIMÁTICO, COM A ADIÇÃO DE DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE NACL, UTILIZANDO MEMBRANA DE 30 KDA 60

TABELA 31 - EFEITO DA FORÇA IÔNICA SOBRE A ULTRAFILTRAÇÃO DO

EXTRATO ENZIMÁTICO,COM ADIÇÃO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES

DE NACL, UTILIZANDO MEMBRANA DE 60 KDA 60

TABELA 32 – RESULTADOS DA ATIVIDADE DE HIDRÓLISE, PROTEÍNA E

ATIVIDADE ESPECÍFICA OBTIDOS NA COMBINAÇÃO DOS SISTEMAS DE

PURIFICAÇÃO EM MEMBRANA DE 30 KDA 62

TABELA 33- COMBINAÇÃO DO SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO E SEPARAÇÃO POR

MEMBRANA PARA A PURIFICAÇÃO DA LIPASE COM MEMBRANA DE 30 KDA

62

TABELA 34 - PURIFICAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE LIPASE USANDO SISTEMA

AQUOSO BIFÁSICO JUNTAMENTE COM ULTRAFILTRAÇÃO EM RELAÇÃO À

CAPACIDADE DE SÍNTESE DE ÉSTERES 63

TABELA 35 – RESULTADOS DA QUANTIFICAÇÃO DE PEG NAS AMOSTRAS DE

RETIDO E FILTRADO PARA OS PONTOS ESTUDADOS NA COMBINAÇÃO DO

SAB/UF 64

xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - DIAGRAMA DE FASE DE UM SAB FORMADO POR UM POLÍMERO E

UM SAL, EXPRESSO EM COORDENADAS RETANGULARES 17

FIGURA 2 - BÉQUERES UTILIZADOS PARAA FES. 28

FIGURA 3 - ESQUEMA DA PURIFICAÇÃO DA LIPASE PELO SISTEMA AQUOSO

BIFÁSICO 30

FIGURA 4 - MODELO DO SISTEMA DE UF 32

FIGURA 5 – FOTOMICROGRAFIA DO MICROCULTIVO DO FUNGO PENICILLIUM37

FIGURA 6 - SUPERFÍCIE DE RESPOSTA E CURVA DE CONTORNO PARA FATOR

DE PURIFICAÇÃO EM RELAÇÃO À CONCENTRAÇÃO DE PEG E FOSFATO

DE POTÁSSIO, OBTIDA NA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE

PURIFICAÇÃO DA LIPASE PRODUZIDA POR FES 51


DE PURIFICAÇÃO EM RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO DE NACL E PEG OBTIDA

NA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PURIFICAÇÃO DA LIPASE

PRODUZIDA POR FES 52


DE PURIFICAÇÃO EM RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO DE NACL E FOSFATO DE

POTÁSSIO OBTIDA NA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE PURIFICAÇÃO DA

LIPASE PRODUZIDA POR FES 52

FIGURA 9 - CURVA BINODAL PEG 6000 PH 8. PONTOS ESTUDADOS NO

PLANEJAMENTO EXPERIMENTOS PARA A MAXIMIZAÇÃO DA PURIFICAÇÃO

PELO SISTEMA AQUOSO BIFÁSICO. 53

FIGURA 10 - CURVA BINODAL PEG 6000 PH 8. QUADRADOS: PONTOS

ESTUDADOS NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTOS. ESTRELAS: PONTOS

ESTUDADOS NA SEGUNDA ETAPA DA MAXIMIZAÇÃO DA PURIFICAÇÃO. 55

xiii

RESUMO

A purificação de proteínas consiste em um dos desafios da área de Bioprocessos. O

grau de pureza requerido para enzimas está diretamente relacionado com a aplicação

na qual estas serão empregadas. Os sistemas aquosos bifásicos (SAB) e o processo

de separação por membranas (UF) vêm sendo amplamente estudados na purificação

de diversas proteínas, por apresentarem algumas vantagens sobre os processos

cromatográficos, como facilidade de escalonamento e baixo custo. No entanto, a

purificação de lipases por SAB ainda é pouco reportada. Neste sentido, o foco deste

trabalho foi avaliar a utilização da melhor combinação do SAB formado por

polietilenoglicol (PEG) e tampão fosfato de potássio e a combinação com o processo

de separação por membrana, na purificação de lipase de Penicillium crustosum

produzida por fermentação em estado sólido. O SAB se apresentou como uma técnica

potencial para a separação e purificação da lipase obtendo-se fator de purificação 5,8

no sistema composto de 20% PEG 6000, 7,0% fosfato de potássio pH 8. A técnica do

planejamento experimental foi utilizada como uma estratégia para a maximização da

purificação, no qual foram avaliadas as concentrações de polietilenoglicol (PEG),

fosfato de potássio e NaCl em sistemas compostos por PEG 6000 fosfato de potássio

pH 8. O sistema 20% PEG 6000, 5,8% fosfato de potássio pH 8 com acréscimo de

4,8% de NaCl apresentou recuperação da atividade de hidrólise de 53,8% e o maior

fator de purificação 10,5. O sistema composto de 20% PEG 6000, 5,8% de fosfato de

potássio sem o acréscimo de NaCl foi o que apresentou maior atividade de

transesterificação e fator de purificação, 8,5 U/mg e 28,3 vezes, respectivamente.

Membranas comerciais com massa molecular de corte de 30 e 60 kDa foram testadas.

Com acréscimo de 0,09 mol/L de NaCl o fator de purificação aumentou de 0,8 para 1,4

vezes. Quando combinou-se o sistema aquoso bifásico e separação por membrana, o

fator de purificação em termos de atividade de hidrólise diminuiu, mas com relação à

de atividade de transesterificação aumentou, alcançando valores em torno de 39

vezes para os sistemas compostos de 11,6% PEG 6000, 10% fosfato de potássio e

1,2% NaCl e 38,3 para o sistema formado por 16% PEG 6000, 8% fosfato de potássio

e 4,8% NaCl.

Palavras-chave: lipase, purificação, membranas, sistema aquoso bifásico,

ultrafiltração.

xiv

ABSTRACT

The purification of proteins is one of the challenges in the area of Bioprocesses. The

purity degree required for enzymes is directly related to the application in which they

are employed. Aqueous two-phase systems (ATPS) and membrane separation

process have been investigated in the purification of several proteins, which present

some advantages over the chromatographic processes, such as easy scale-up and low

cost. However, the purification of lipases by ATPS has been little reported. In this

sense, the focus of this study was to evaluate the use of the best combination of the

ATPS consisting of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate buffer and the

combination with membrane separation process for the lipases purification from

Penicillium crustosum produced by solid state fermentation. The ATPS is a potential

technique for the separation and purification of such lipases, resulting in a purification

factor 5.8 using the system composed of 20% PEG 6000, 7.0% potassium phosphate,

pH 8. The technique of experimental design was used as a strategy for maximizing the

purification, in which we assessed the concentrations of polyethylene glycol (PEG),

potassium phosphate and sodium chloride in systems composed of PEG 6000 at pH 8.

The system 20% PEG 6000, 5.8% potassium phosphate at pH 8, and 4.8% NaCl

showed a recovery of the activity (hydrolysis) of 53.8% and yielded the highest

purification factor 10.5, based on hydrolytic activity. The system made up of 20% PEG

6000, 5.8% potassium phosphate without the addition of NaCl showed highest activity

of transesterification and purification factor, 8.5 U/mg and 28,3, respectively.

Commercial membranes with molecular weight cutoff of 30 and 60 kDa were tested.

That addition of 0.09 mol/L NaCl to the enzymatic extract in the feed increased the

purification factor from 0.8 to 1.4. When the processes of ATPS and UF were

combined, the purification factor in terms of hydrolytic activity decreased, but increased

in terms of transesterification activity, reaching values around 39 for PF in the systems

composed of 11.6% PEG 6000 10% potassium phosphate and 38,3 in the systems

composed of 1.2% NaCl and 16% PEG 6000, 8% potassium phosphate and 4.8%

NaCl.

Key words: lipase, purification, membranes, aqueous two-phase system, ultrafiltration.

1

1 INTRODUÇÃO

A produção de enzimas é um campo em crescimento na Biotecnologia

(GONZÁLES-VINIEGRA, et al., 2003). As lipases são enzimas que catalisam a quebra

de gorduras e óleos liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e

glicerol, podendo catalisar também reações de esterificação, transesterificação e

interesterificação em solventes orgânicos. Estas enzimas possuem alto potencial

biotecnológico devido à sua habilidade de catálise e são encontradas em tecidos

animais, vegetais e também são produzidas por micro-organismos (bactérias, fungos e

leveduras) (VILLENEUVE et al., 2000).

As lipases podem catalisar reações de hidrólise de triacilglicerois a ácidos

graxos, mono e diacilglicerois e glicerois, na interface óleo-água da reação. Esta

enzima possui também habilidade de catalisar reações em meios orgânicos,

favorecida pelos baixos conteúdos de água presentes nas reações (RUIZ et al., 2008;

CHOWDARY e PRAPULLA, 2002). As lipases com atividade de síntese encontram

aplicação na produção de agentes aromatizantes e flavorizantes, na transesterificação

de óleos para produção de ésteres (biodiesel) (IBRAHIM, 2008; FERNANDES et al.,

2007; SHARMA et al., 2001), fármacos, etc. Assim, as lipases somam um importante

grupo, devido ao significativo volume de vendas, devido à versatilidade de aplicações,

especial atrativo para aplicações industriais (CONTESINI e CARVALHO, 2006;

JAERGER e REETZ, 1998).

Uma alternativa na produção de enzimas microbianas é o processo de

fermentação em estado sólido (FES), o qual se baseia no multiplicação dos micro-

organismos em substratos sem a presença de água livre. Uma das vantagens da FES

está na utilização de resíduos agroindustriais como suporte e substrato para o

desenvolvimento dos micro-organismos, o que tem atraído grande interesse na

utilização deste tipo de fermentação para a produção de enzimas, incluindo as lipases

(TREICHEL et al., 2010; VARGAS et al., 2008; KEMPKA et al., 2008; WOLSKI et al.,

2008; PINHEIRO et al., 2008; SILVA et al., 2005)

A purificação de produtos biotecnológicos, como as enzimas, constitui uma

etapa complexa do processo, podendo contribuir com uma parcela significativa do

custo final da enzima, devido às várias características dos meios e das biomoléculas

de interesse. Uma alternativa para o primeiro passo da purificação é a utilização de

2

Sistemas Aquosos Bifásicos (SAB). Estes são formados por soluções aquosas de

polímeros e sais ou dois polímeros diferentes (SANTOS et al., 2007), que dependendo

da composição podem dar origem a duas fases.

Neste processo de purificação, a partição depende principalmente das

propriedades físico-químicas das proteínas, tais como ponto isoelétrico, superfície de

hidrofobicidade, e outras variáveis do meio como massa molar do polímero, pH, o tipo

e a concentração do sal adicionado. Conhecendo e controlando estes fatores é

possível separar e recuperar uma proteína (TUBIO et al., 2004).

Outra tecnologia de grande interesse na separação de proteínas se baseia nos

processos de separação com membrana (PSM). Esta tem se desenvolvido bastante

nas últimas décadas e suas aplicações têm se expandido em vários setores

industriais. Os PSM são considerados como alternativa mais econômica e que podem

ser ajustados para se conseguir alta produtividade com razoável grau de pureza. Entre

os PSM, o processo de ultrafiltração é o que mais tem sido testado para a purificação

de proteínas (SAXENA et al., 2009).

Embora a ultrafiltração (UF) tenha sido extensivamente investigada e a

concentração de macromoléculas seja rotina comum em biotecnologia, a purificação

ou fracionamento de proteínas por UF, no entanto, ainda é um desafio e necessita de

maior esforço de pesquisa, para se obter membranas mais seletivas e otimizar os

parâmetros físico-químicos relacionados à interação entre proteínas, que afetam

diretamente o fluxo e a seletividade (SAXENA et al., 2009).

A maior parte dos estudos publicados em bioseparações trata de misturas

proteicas conhecidas e se baseia em resultados empíricos, dificultando a sua

extrapolação para outros sistemas. Nas aplicações reais ou industriais, as soluções de

proteínas a serem separadas são muito mais complexas, como no caso da produção

de enzimas por fermentação submersa ou em estado sólido, sendo então necessário

realizar a avaliação detalhada de cada sistema.

Neste contexto, a aplicação de sistema aquoso bifásico e ultrafiltração para a

recuperação de lipases com atividade de hidrólise e de síntese, produzidas por

fermentação em estado sólido apresenta um grande potencial de investigação

científica e tecnológica, justificando o presente trabalho.

3

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar a utilização de estratégias de purificação de uma lipase fúngica

produzida por fermentação em estado sólido (FES) utilizando sistema aquoso bifásico

(SAB) e processo de ultrafiltração (UF).

2.2 Objetivos Específicos

• Seleção e identificação do micro-organismo produtor de lipase

• Seleção das melhores condições com relação à massa molar de PEG e pH,

para a purificação da lipase por sistema aquoso bifásico;

• Maximização da purificação da lipase por sistema aquoso bifásico, avaliando a

concentração de PEG, de fosfato de potássio e cloreto de sódio, através da

técnica de planejamento experimental e análise de superfície de resposta;

• Estudo da concentração e purificação de lipase utilizando ultrafiltração;

• Definição das melhores condições da combinação do sistema aquoso bifásico

e ultrafiltração para a purificação da lipase.

4

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capitulo será apresentado uma revisão de literatura sobre lipases

incluindo definição, aplicações, fontes e propriedades, considerações gerais sobre

fermentação em estado sólido, e o estudo da purificação de enzimas por diferentes

métodos.

3.1 Aspectos Gerais e Aplicações de Lipases

As enzimas são biocatalisadores com propriedades que as tornam altamente

requisitadas. Além de serem ativas e versáteis, elas catalisam uma série de

transformações de modo seletivo, rápido e em condições brandas de reação, o que as

difere dos catalisadores não enzimáticos. Além disso, toda enzima catalisa as

transformações moleculares sem ocorrência de reações paralelas, comuns em

sínteses químicas, devido à sua especificidade (DZIEZAK, 1991; PATEL, 2002;

PIZARRO e PARK, 2003).

Enzimas são catalisadores biológicos de natureza protéica, que participam nas

reações químicas que ocorrem em células. As enzimas atuam acelerando uma reação

termodinamicamente possível, sem alterar a constante de equilíbrio e a energia livre

de reação. Uma das diferenças básicas entre enzimas e catalisadores químicos

sintéticos é a capacidade daquelas em catalisar reações sob condições suaves, em

soluções aquosas, a temperatura e pressão normais, reduzindo a possibilidade de

alteração de compostos sensíveis ao calor, bem como reduzindo as necessidades

energéticas e os efeitos de corrosão do processo (LEHNINGER, 1996).

Lipases, triacilglicerol éster hidrolases (EC3.1.1.3), são enzimas largamente

distribuídas na natureza, que catalisam a hidrólise de óleos e gorduras liberando

ácidos graxos livres, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol (BEISSON et al.,

2000). Podem catalisar também reações de esterificação, transesterificação e

interesterificação em solventes orgânicos (VILLENEUVE et al., 2000).

Estas enzimas podem ser obtidas de um grande número de bactérias, fungos,

plantas e animais, possuindo propriedades variáveis de acordo com sua procedência

(SAXENA et al., 2003). As lipases provenientes de micro-organismos constituem um

grupo de valiosas enzimas de aplicação biotecnológica, devido às diferentes reações

que são capazes de catalisar, ao fato de na maioria das vezes não requererem co-

5

fatores, atuação em uma ampla faixa de pH, e também devido à sua régio e enâncio

seletividade, o que as torna particularmente atrativas para a indústria de química fina e

farmacêutica. Estas enzimas podem ser aplicadas ainda em um grande número de

processos, tais como aqueles para obtenção de detergentes, alimentos, indústria de

couro, celulose e papel (FREIRE e CASTILHO, 2000; PANDEY et al.,1999; GANDHI et

al., 1997).

Além da classificação de acordo com o mecanismo de ação, as enzimas são

usualmente classificadas quanto a suas fontes produtoras, e este é o método mais

empregado para fins de aplicação industrial, que são animal, vegetal e microbiana. As

fontes animal e vegetal encarecem os procedimentos de obtenção de preparados e

isolados enzimáticos. Já os micro-organismos, pela sua distribuição na natureza, são

as fontes mais versáteis e fáceis de manuseio em laboratório, e consequente

produção industrial de enzimas específicas. Os micro-organismos produzem uma

enorme variedade de enzimas potencialmente úteis, muitas das quais são excretadas

ao exterior das células. Além disso, são capazes de desenvolver-se fácil e

rapidamente em seu meio de cultivo e a tecnologia a respeito, em grande escala, se

encontra bem estabelecida (GACESA e HUBBLE, 1990).

Entre as vantagens que o seu uso apresenta sobre os processos

convencionais estão a alta eficiência em condições de baixa temperatura e pressão

atmosférica, redução da poluição ambiental, os produtos originados de reações

enzimáticas são considerados “naturais” pela legislação da maioria dos países e o alto

grau de seletividade, ao contrário dos catalisadores convencionais, gerando menos

produtos secundários (XU, 2000).

A formação de um complexo, enzima-substrato (ES), é a primeira etapa na

catálise enzimática. Os substratos são ligados a uma região específica, chamada de

centro ativo, ou sítio ativo, contendo os radicais de aminoácidos que participam

diretamente na formação e quebra de ligações. Esses radicais são chamados

grupamentos catalíticos (JOÃO JR, 1999).

As lipases são usadas como versáteis biocatalisadores na química orgânica

moderna especialmente na modificação de gorduras e outros lipídios via hidrólise,

esterificação e interesterificação, na obtenção de ácidos graxos específicos ou

glicerídeos de óleos vegetais, sendo já utilizadas com sucesso como catalisador para

a síntese de ésteres, que são produzidos a partir de ácidos graxos de cadeia curta,

com muitas aplicações industriais, incluindo agentes aromatizantes e ácidos graxos de

6

cadeia longa usados para enriquecer óleo diesel (KUMAR et al., 2005; BRADOO et al.,

1999).

O processo de transesterificação, também chamado de alcoólise, consiste no

deslocamento do álcool e de um éster em um processo similar à hidrólise, exceto pelo

emprego de um álcool ao invés da água. Alguns álcoois são empregados de modo

satisfatório na reação, dentre estes pode-se citar, o metanol, etanol, propanol e o

butanol, sendo que o mais amplamente utilizado é o metanol devido ao baixo custo e

às vantagens físicas e químicas deste reagente (FUKUDA et al., 2001).O surgimento

da transesterificação é datado de 1846, quando Rochieder descreveu a produção de

glicerol pela etanólise de óleo de mamona. Desde aquele momento, o processo de

alcoólise tem sido largamente estudado (DEMIRBAS, 2003).

A transesterificação de óleos vegetais ou gorduras animais, também

denominada de alcoólise, pode ser conduzida por uma variedade de rotas

tecnológicas, em que diferentes tipos de catalisadores podem ser empregados

(RAMOS et al., 2003). De acordo com SRIVASTAVA e PRASAD (2000), a

transesterificação consiste na reação de triglicerídeo (TG) com álcool, resultando na

produção de 3 mol de ésteres e 1 mol de glicerol (GL).

Na indústria têxtil as lipases são usadas na remoção de lubrificantes e

promovem uma melhor absorção de tinta no tecido. Fibras sintéticas modificadas

enzimaticamente são utilizadas para a produção de tapetes, dando a eles maior

resistência ao estiramento, enrugamento, abrasão e ao tratamento com produtos

químicos (HASAN et al., 2006).

O campo de aplicação comercial mais importante para as lipases hidrolíticas é

a sua adição aos detergentes, geralmente em combinação com outras enzimas

(proteases e celulases), sendo responsáveis pela remoção de manchas de gorduras

tais como baton, fritura, manteiga, azeite, molhos e manchas em colarinhos e punhos

(CASTRO et al., 2004).

As lipases são utilizadas também para modificar o sabor dos alimentos, além

de atuarem no processo de fermentação de salames e vinhos. Enzimas lipolíticas são

frequentemente usadas para conferir flavors diferente em queijos durante sua

produção (HASAN et al., 2006).

A aplicação de lipases tem sido também preconizada na degradação biológica

de carga lipolítica de efluentes industriais gerados em frigoríficos, abatedouros,

laticínios e indústrias de alimentos em geral (GANDHI, 1997; PANDEY et al., 1999). O

uso de lipases em tratamento de efluentes fornece várias vantagens potenciais, entre

7

as quais se destaca a simplicidade e facilidade no controle do processo; a não

necessidade de aclimatação de biomassa; ausência de efeitos de choque por carga de

poluentes; possibilidade de aplicação em processos com baixa ou alta concentração

de poluentes; operação em ampla faixa de pH, temperatura e salinidade (KARAM et

al., 1997).

Lipases são capazes de catalisar a hidrólise de ésteres, atuando sobre ésteres

insolúveis em água como os triglicerídeos (FREIRE et al., 1997), sob condições

microaquosas, a partir de álcool e ácido carboxílico. Uma combinação destes dois

processos básicos em sequências lógicas pode resultar em reações de

interesterificação (acidólise, alcoólise ou transesterificação a depender dos reagentes

de partida) (CASTRO et al., 2004).

A atividade hidrolítica de lipases é significativamente aumentada pela presença

de uma interface óleo-água, um fenômeno chamado ativação interfacial. Em meio não-

aquoso esta reação é invertida devido a um domínio hidrofóbico que cobre o local

ativo da lipase (SUN et al., 2008).

Sua plena utilização está diretamente relacionada à redução dos custos dos

processos de produção e purificação, na busca de novas cepas produtoras e no

melhoramento genético destas cepas, a fim de que produzam maiores quantidades

destas enzimas em tempos menores, com características desejáveis (MARTINS,

2001).

Por catalisarem diversos tipos de processos, as lipases apresentam um amplo

campo de aplicações. A Tabela 1 sintetiza as principais aplicações das lipases em

diferentes tipos de indústrias de acordo com VILLENEUVE et al., (2000) considerando

a hidrólise e a esterificação.

8

Tabela 1 – Principais aplicações de lipases em diferentes segmentos

Indústria Aplicações Produtos

Hidrólise

Alimentos Hidrólise da gordura do leite

Desenvolvimento de “Flavour” lácteos

Química Hidrólise de óleos e gorduras

Biorremediação

Tratamento efluente

Análise de ácidos graxos de TGC

Ácidos graxos, mono diglicerídeos;

Redução sólidos

Química (detergentes) Remoção de manchas de gorduras

Detergentes (roupas e superfícies)

Médica Análise de triglicérides do sangue

Kits de diagnóstico

Farmacêutica, agroquímica Hidrólise estéreo-específica

Resolução de misturas racêmicas

Esterificação

Química (química fina) Síntese de ésteres Compostos quirais intermediários; Ésteres e emulsificantes; “Flavour”

Alimentos, Química, Farmacêutica

Transesterificação (óleos naturais)

Óleos e gorduras: análagos de manteiga de cacau, Biodiesel

Têxtil Síntese de poliésteres Poliésteres biodegradáveis,

Alimentos Síntese de ésteres Aromas para alimentos e bebidas

Os micro-organismos produtores de lipases são encontrados nos mais diversos

habitats como resíduos agroindustriais, alimentos em decomposição, sementes

oleaginosas, depósitos de carvão e até mesmo em solos contaminados. Esses podem

ser bactérias, bolores e leveduras. Os métodos para a detecção de atividades

lipásicas em micro-organismos geralmente envolvem o screening em placas de ágar

utilizando tributirina ou compostos cromogênicos como substratos; ou ainda o cultivo

em meio sólido com o surfactante Tween 80, em que zonas opacas em torno das

colônias indicam organismos produtores de lipases (SHARMA et al., 2001). No

entanto, alguns destes substratos podem não ser totalmente adequados para

9

detecção de lipases verdadeiras, tornando-se de extrema importância a verificação da

especificidade da análise de hidrólise por lipases e esterases (KOUKER e JAEGER,

1987).

Entre os fungos, o gênero Penicillium se destaca por abranger muitos

produtores: P. expansum (STOCKLEIN et al., 1993 e DAI et al., 2005), P. citrinum

(MIRANDA et al., 1999), P. chrysogenum (MANUEL et al., 2000), P. aurantiogriseum

(LIMAA et al., 2004), P. verrucosum (PINHEIRO et al., 2008 e MENONCIN et al.,

2010). A maioria das espécies é saprófita e geralmente encontrada no solo, vegetais

em decomposição, sementes e grãos (JESUS et al., 1999). Estes fungos apresentam

como características principais: colônia radialmente sulcada, velutinosa, micélio

branco, conidiogênese moderada de cor verde-acizentada.

Lipases provenientes de distintas fontes microbianas normalmente apresentam

uma ampla faixa de propriedades dependentes da fonte produtora, relacionada ainda

com a especificidade posicional, especificidade ao substrato, termoestabilidade, pH

ótimo entre outros. A temperatura de estabilidade é uma das mais relevantes

características para aplicação industrial dos biocatalisadores, assim os micro-

organismos adaptados, por exemplo, a baixas temperaturas, apresentam potencial

produtivo de lipases psicrófilas. Lipases psicrófilas normalmente possuem grande

flexibilidade de sua estrutura, o que permite sua aplicação em sistemas com baixo

conteúdo de água, diferente comportamento pode ser apresentado pelas enzimas

mesófilas ou termófilas, devido suas propriedades catalíticas (JOSEPH et al., 2008).

3.2 Produção de Lipases por Fermentação em Estado Sólido

Entre as técnicas para o desenvolvimento de vários bioprocessos e produtos,

destaca-se a fermentação em estado sólido (FES) (Tabela 2). A técnica da

fermentação em estado sólido (FES) envolve o crescimento e o metabolismo dos

micro-organismos em sólidos úmidos sem a presença de água livre (MAHADIK et al.,

2002). No entanto, o conteúdo de água necessário para o crescimento encontra-se

absorvido na matriz porosa do substrato, o que favorece a transferência de oxigênio

no meio, pois o micro-organismo permanece em contato direto com uma corrente de

ar (RAGHAVARO et al., 2003).

A maior atenção creditada à FES se deve ao fato de que os rendimentos de

bioprodutos como enzimas, compostos aromáticos, corantes e outros compostos de

10

interesse em alimentos são maiores quando comparados com os rendimentos obtidos

por Fermentação Submersa (FS). As principais vantagens do emprego de FES são:

altas produtividades, melhor circulação de oxigênio, utilização de resíduos

agroindustriais, menores custos na etapa de recuperação e purificação dos

metabólitos obtidos, baixo consumo energético, o crescimento dos micro-organismos é

muito semelhante ao encontrado no seu habitat natural, entre outros (COUTO e

SANROMÁN, 2005). Para que a produção de enzimas seja maximizada é de

fundamental importância levar em consideração o meio fermentativo, este devendo

proporcionar nutrientes necessários a produção da cepa e produção de metábolitos,

além de suprir a energia utilizada para biossíntese de manutenção da célula (SMITS et

al., 1996).

O meio deve ser composto basicamente por fonte de carbono, fonte de

nitrogênio (seja ela orgânica ou inorgânica), sais orgânicos, vitaminas e indutores,

quando necessários para a produção de lipase, visto que existem lipases indutíveis e

constitutivas (ALONSO, 2001). Segundo DALMAU et al., 2000 a presença de

substratos lipídicos (e seus metabólitos, como ácidos graxos) pode estimular a

produção de lipases.

As condições de crescimento da FES aproximam-se do habitat natural de

fungos filamentosos, o que facilita o crescimento deste no substrato sólido e a

produção de grandes quantidades de enzimas. Os resíduos gerados nos processos

agroindustriais podem ser usados como substrato para o crescimento celular. A

matéria orgânica presente neste material é usada como fonte de energia para o

crescimento e o carbono para a síntese de biomassa celular e dos produtos do

metabolismo microbiano (SILVA et al., 2005).

A seleção de um substrato para o processo de FES depende de vários fatores

principalmente relacionados com o custo e disponibilidade. No processo de FES, o

substrato sólido fornece não só os nutrientes à cultura microbiana que se multiplica

nele, mas também serve como suporte para as células. Os substratos que possuem

todos os nutrientes necessários para a reprodução dos micro-organismos devem ser

considerados como substratos ideais. Porém, alguns dos nutrientes podem estar

disponíveis em concentrações menores que as necessárias. Neste caso é necessário

suplementar o meio. Também se pode fazer um pré-tratamento (química ou

mecanicamente) em alguns substratos antes de seu uso na FES, tornando-os mais

facilmente acessíveis para o crescimento do micro-organismo (PANDEY et al., 2000).

11

Geralmente, partículas pequenas de substrato resultam em área superficial

grande para o crescimento microbiano sendo considerado como um fator desejável.

Porém, partículas de substrato muito pequenas podem resultar em aglomeração de

substrato podendo interferir no processo respiratório microbiano e assim resultando

um baixo crescimento. Ao mesmo tempo, partículas maiores resultam eficiência no

processo respiratório (devido a espaços entre partículas), mas geram superfície

limitada para o crescimento microbiano. Assim, torna-se necessário chegar a um

balanço em relação ao tamanho de partícula para o processo em particular (PANDEY

et al., 2000).

Pesquisas para seleção de um substrato adequado têm sido centralizadas

principalmente em culturas tropicais e resíduos de agroindústrias. Estes incluem

culturas como mandioca, soja, batata-doce, batata, sorgo doce, resíduos da cultura

como farelo de trigo, palha de trigo e arroz, casca de soja, milho e arroz, bagaço de

cana-de-açúcar, resíduos de mandioca, da indústria de processamento de café como

polpa, casca, resíduo da indústria do processamento de frutas como polpa ou bagaço

de maçã e uva, resíduos do processamento de maçã e cenoura, resíduos de banana,

torta de coco, amendoim, etc. (PANDEY et al., 2000).

A seleção de um substrato apropriado para a fermentação é um fator crítico

(ELLAIAH et al., 2004). Vários são os substratos utilizados, sendo alguns exemplos

citados na Tabela 2.

A FES apresenta outras características como (SATO e SUDO, 1999; PALMA et

al., 2000; BIANCHI et al., 2001; GERVAIS e MOILN, 2003):

• Redução da umidade do meio é provocada pelo calor gerado durante o

processo de crescimento e metabolismo do micro-organismo devido à elevação

da temperatura;

• O cultivo é geralmente estacionário, devido à dificuldade de agitação do meio.

A agitação pode causar danos às células em alguns casos;

• Podem-se adicionar nutrientes suplementares ao substrato sólido;

• Volume do meio reacional é reduzido, implicando em um menor investimento

capital em biorreatores;

• Altos rendimentos quanto à formação de metabólitos e simplicidade nas etapas

de purificação, pois os produtos estão concentrados nos líquidos da extração;

12

• Os esporos dos micro-organismos podem ser utilizados diretamente na

inoculação, evitando etapas prévias como pré-cultivo que envolve grandes

volumes de meio e tanques para seu desenvolvimento.

Tabela 2 - Substratos naturais e micro-organismos envolvidos na fermentação em

estado sólido para produção de lipases

Substrato Micro-organismo Referência

Torta de babaçu e farelo de mamona

Penicillium verrucosum and Penicillium brevicompactum

SILVA et al., (2011)

Farelo de soja P. verrucosum MENONCIN et.al,(2010)

Farelo de soja Penicillium sp. RIGO et al., (2010 c)

Farelo de soja Penicillium sp. GRIEBELER et al.,(2009)

Farelo de soja Penicillium sp. WOLSKI et al.,(2009)

Farelo de soja P. verrucosum KEMPKA et al.,(2008)

Farelo de soja P.simplicissimum VARGAS et al.,(2008)

Torta de babaçu P.simplicissimum GUTARRA et al.,(2007)

Torta de babaçu P. simplicissimum GUTARRA et al.,(2005)

Torta de babaçu P. simplicissimum CAVALCANTE et al.,(2005)

Torta de soja P. simplicissimum DI LUCCIO et al.,(2002)

Torta de babaçu P. restrictum PALMA et al.,(2000)

Farelo de trigo A.niger NCI1207 MAHADIK et al.,(2002)

Farelo de trigo A.niger MTCC2594 MALA et al.(2007)

Torta de amêndoas R. oligosporus UI-HAQ et al.,(2002)

Bagaço de cana R. homothallicus RODRIGUES et al.,(2006)

Bagaço de cana R. homothallicus DIAZ et al.,(2006)

Casca de arroz C.gloesporioides COLEN et al.,(2006)

Farelo de trigo Y. lipolytica DOMINGUES et al.,(2003)

A FES apresenta ainda superior produtividade e facilidade de recuperação do

produto, porém, a fermentação geralmente é lenta em função da barreira à

transferência de massa gerada. Os processos metabólicos são influenciados pela

mudança de temperatura, de pH, de substrato, umidade, do fornecimento de ar, da

concentração de inóculo, etc., sendo que estes fatores variam extensamente de

espécie para espécie (ELLAIAH et al., 2004).

Outro problema encontrado em FES está na difícil remoção do calor produzido

devido à atividade metabólica microbiana. Isto ocorre devido à dificuldade de

homogeneização do meio reacional, além dos problemas difusionais característicos de

13

processos envolvendo meios sólidos. Assim, o acúmulo de calor no decorrer da

fermentação pode ocasionar a desnaturação dos produtos formados, sendo que o

controle do aquecimento está relacionado com a capacidade de aeração do sistema

(PANDEY e SOCCOL, 2001; SATO e SUDO, 1999; PALMA et al., 2000; GERMANO,

2000; BIANCHI et al., 2001; VON MEIEN e MITCHELL, 2002; MITCHELL et al., 2003).

Em relação ao pH, em geral, a produção máxima de lipase por fungos ocorre

quando o pH atinge valores entre 7,0 e 8,0. No final da fermentação, isto é, após o

esgotamento da fonte de carbono, o pH continua subindo para a faixa alcalina,

provavelmente devido à proteólise que origina aminoácidos que são desaminados,

liberando amônia para o meio fermentativo. Neste estágio, a enzima produzida é

rapidamente desnaturada por proteólise ou pH adverso (CASTILHO et al., 2000).

Em um processo industrial, a temperatura utilizada na fermentação é o fator

limitante da altura do leito. Nos estágios iniciais do processo de fermentação, a

temperatura e a concentração do oxigênio são iguais em todo leito. No entanto, com o

decorrer do processo, surgem problemas na difusão de oxigênio e transferência de

calor, por compactação e encolhimento do leito. O calor e gases gerados nas

biorreações tendem a se acumular no meio, formando gradientes. Este problema é

bastante complexo e pode afetar o controle de dois parâmetros fundamentais como a

temperatura e o conteúdo de água no meio sólido, que por sua vez podem levar a

mudanças nas condições operacionais, prejudicando o andamento do processo

(SANGSURASK e MITCHELL, 1998; RAGHAVARAO et al., 2003; ROBINSON e

NIGAN, 2003; VARGAS, 2008).

O desenvolvimento de equipamentos que proporcionem uma boa transferência

de calor é um fato importante e, em geral, em escala industrial utiliza-se o fermentador

com tambor rotativo, eficiente neste aspecto (CHEN et al., 2005; RAGHAVARAO et al.,

2003).

Há uma importante relação entre a taxa de oxigênio distribuído e o espaço

entre as partículas de substrato. Assim, o aumento da porosidade do leito através do

uso de menor ou um maior número de partículas do substrato é uma forma de facilitar

os processos de transferência durante a fermentação em estado sólido. Outro fator de

extrema importância é a formação do micélio aéreo do fungo no leito do suporte, pois

este possui relação direta com a velocidade de formação da enzima (RAHARDJO et

al., 2005).

14

3.3 Purificação de Enzimas

A purificação de produtos biotecnológicos é fundamental na obtenção de

enzimas com alto grau de pureza, o que é essencial para sua aplicação industrial.

Após a fermentação, a enzima encontra-se no meio contendo uma série de outros

compostos que não são de interesse (MALDONADO, 2006).

É importante enfatizar que o conceito de grau de pureza aceitável varia de

acordo com a aplicabilidade da proteína isolada. A eficácia e a economia do processo

de purificação frequentemente determinam o destino do produto no mercado. Por

exemplo, enzimas utilizadas em detergentes, em síntese orgânica, na indústria têxtil,

de couro, polpa e papel, e alimentos, usualmente não requerem elevados graus de

pureza. Por outro lado, proteínas terapêuticas requerem alto nível de pureza

(MONDAL et al., 2006).

O uso potencial de enzimas para vários propósitos industriais não só estimulou

interesse na redução do custo de produção, como também para protocolos eficientes e

de fácil purificação (BRADOO, et al. 1999). A maioria das aplicações comerciais não

requer preparações de lipase homogêneas; porém, certo grau de pureza possibilita

uso mais eficiente. Além disso, a purificação de enzimas permite a determinação da

sequência primária de aminoácidos e da estrutura tridimensional (SAXENA, et al.

2003).

O principal passo no design de qualquer processo de fermentação é o

desenvolvimento de um método eficiente para o isolamento e purificação do produto

desejado. O processo de downstream deve assegurar que o produto desejado esteja

separado de outras combinações indesejáveis. Além disso, produtos como proteínas,

enzimas, ácidos nucléicos, organelas celulares, antibióticos, etc. requerem que suas

atividades biológicas sejam preservadas no processo de purificação. Muitas

biomoléculas apresentam limites de tolerância estreitos ao pH, temperatura, pressão

osmótica, superfície de contato, etc. Uma das principais etapas é a seleção de uma

técnica de extração e isolamento específica e compatível ao produto (KULA et al.,

1982).

15

3.3.1 Purificação de enzimas por Sistema Aquoso Bifásico

As técnicas convencionais de separação como a precipitação, cristalização e

centrifugação podem não apresentar boa seletividade na separação. Já as separações

de alta resolução como eletroforese, eletrodiálise, operações de afinidade e

cromatografia apresentam seletividades muito altas, o que permite a obtenção de

proteínas altamente purificadas, motivo pelo qual são técnicas bastante empregadas

em laboratórios de pesquisa. No entanto, estas técnicas possuem alto custo de

instalação, manutenção e operação devido à complexa instrumentação requerida,

apresentam difícil scale up e baixos rendimentos, o que torna seu emprego limitado

para produções em larga escala. (FEINS e SIRKAR, 2007; HUANG et al., 2009;

IBÁÑEZ et al., 2007; YUNOS e FIELD, 2008).

Novas tecnologias surgem como alternativas aos processos convencionais

como os processos com membranas, sistemas aquosos bifásicos e imunopurificação.

As indústrias hoje procuram estratégias de purificação mais vantajosas

economicamente, rápidas, com elevados rendimentos e passíveis de ampliação de

escala (SAXENA et al., 2003).

Dentre os processos de separação pode-se destacar a extração líquido-líquido

com Sistemas Aquoso Bifásico (SAB). Nestes a purificação é resultado de uma

partição diferenciada da molécula-alvo e impurezas entre as duas fases líquidas.

Sistemas de duas fases aquosas são formados pela mistura de determinados

polímeros, polieletrólitos, ou ainda, polímeros em combinação com solutos de baixa

massa molar, em uma mesma solução. O elevado teor de água, 75 a 80% em massa,

garante a manutenção das propriedades biológicas das proteínas (PESSOA e

KILIKIAN, 2005).

Em geral, as pesquisas em SAB podem ser divididas em duas áreas. A

elucidação de mecanismos moleculares para o entendimento da partição do soluto no

SAB é o principal foco da maior área de pesquisa e geralmente envolve o uso de

sistemas modelo para estabelecer as regras que poderão predizer o procedimento

desse soluto, enquanto a outra tem como alvo a implementação prática da técnica no

desenvolvimento de processos (RITO-PALOMARES, 2004).

Apesar da simplicidade aparente destes, a partição de combinações nestes

sistemas é muito complexa devido aos vários fatores envolvidos. Na realidade, a

interação de uma combinação com cada uma das fases, inclui pontes de hidrogênio e

16

interações hidrofóbicas. Porém, a complexidade destes sistemas é maior porque estes

fatores não são completamente independentes um do outro (MARCOS et al., 2002).

Acima das concentrações críticas destes componentes, ocorre a separação

espontânea de fases, cuja composição dependerá das interações intermoleculares –

expressas em termos da energia livre – entre os constituintes formadores do sistema

(XU et al., 2003; SILVA e LOH, 2006).

Os SAB resultam da incompatibilidade de dois polímeros em soluções, embora

a variedade de SAB seja grande, os mais aplicados à extração liquido-liquido são os

constituídos de polietilenoglicol (PEG)/dextrana e polietilenoglicol (PEG)/sal (fosfato,

sulfato, citrato). A incompatibilidade ocorre em função da concentração desses

compostos, quando comparados com sistemas tradicionais compostos com solventes

orgânicos. Os sistemas PEG/Sal têm sido usados para extração de enzimas em larga

escala por apresentarem baixo custo, elevada seletividade das proteínas, tempo de

separação de fases, possibilidade de esterilização, atoxicidade e faixa de aplicação.

Outra vantagem dos SAB é a possibilidade de reciclagem dos seus componentes

(ZUNIGA et al., 2003).

A partição depende principalmente das propriedades físico-químicas das

proteínas, tais como ponto isoelétrico, superfície de hidrofobicidade, massa molar, e

outras variáveis do meio como massa molar do polímero, pH, o tipo de sal adicionado

e sua concentração. Conhecendo e controlando estes fatores é possível separar e

recuperar seletivamente uma proteína (TUBIO et al., 2004). Diversas vantagens deste

sistema são relatadas, incluindo baixo custo, boa reprodutibilidade, fácil

escalonamento e reciclagem das fases (CAVALCANTI et al., 2006). Atualmente, os

SAB são aplicados mais eficientemente em etapas iniciais dos processos de

purificação, mas em alguns casos raros podem até mesmo substituir os clássicos

sistemas cromatográficos (SILVA e LOH, 2006).

As composições dos sistemas de duas fases são representadas por diagramas

triangulares ou retangulares que expressam a concentração dos componentes do

sistema (polímeros, sais e solventes) (LIMA, 2002). A Figura 1 exemplifica um

diagrama de fases.

17

Fonte: SILVA et al., 2006.

Figura 1 - Diagrama de fase de um SAB formado por um polímero e um sal, expresso

em coordenadas retangulares

Neste diagrama encontramos várias informações, por exemplo, podemos

verificar em quais composições globais o sistema é monofásico ou bifásico, sendo

estas duas regiões demarcadas por uma linha denominada binodal. Também são

representadas as linhas de amarração, que são as retas que ligam pontos no

diagrama que representam a composição das duas fases em equilíbrio. Qualquer

conjunto de pontos que pertençam à região bifásica e que estejam sobre a mesma

linha de amarração fornecerá fases superiores que possuirão propriedades

termodinâmicas intensivas iguais (densidade, volume molar, entalpia molar),

entretanto, sendo distintas as suas variáveis termodinâmicas extensivas (massa,

volume, etc.). Aplica-se o mesmo raciocínio para as fases inferiores formadas a partir

de composições globais localizadas sobre uma mesma linha de amarração (SILVA e

LOH, 2006).

Em geral, a distribuição de proteínas entre as duas fases aquosas dos SAB é

caracterizada por um parâmetro denominado coeficiente de partição, Kpart

adimensional e é dado pela equação 1:

fundo

topo

partC

CK = (Equação 1)

18

em que CTopo é a concentração do soluto na fase de topo (g/L) e CFundo a

concentração do soluto na fase de fundo (g/L) (PESSOA e KILIKIAN, 2005).

O valor de Kpart é frequentemente utilizado para avaliação da extensão das

separações nos sistemas de duas fases aquosas. Coeficientes de partição

significativamente distintos para a molécula de interesse e para as demais moléculas

indicam a ocorrência de purificação. Este depende de uma série de fatores como

massa molecular do polímero, presença de eletrólitos, temperatura, tamanho de

proteína e concentração das substâncias formadoras do sistema (SILVA, 2000).

Ainda que o valor de Kpart da molécula-alvo seja elevado, assim como a razão

entre valores de Kpart (molécula-alvo e contaminantes), a viabilidade da aplicação da

extração em SAB requer rendimentos elevados da molécula desejada em uma dada

fase do sistema (KILIKIAN e PESSOA, 2005). Duas proteínas podem ser separadas

de uma mistura inicial mediante a sua partição em ambas as fases com valores

diferentes de Kpart. Quanto maior ou menor que 1 for o coeficiente de partição, mais o

componente tenderá a se concentrar na fase superior ou na fase inferior,

respectivamente (CHUMPITAZ, 2002).

O Kpart é uma variável que mede a eficiência do processo de separação da

substância de interesse, pois mostra a sua distribuição nas duas fases aquosas. Pode

ser calculado tanto para a substância de interesse como para os contaminantes ou

proteínas totais presentes na amostra, podendo-se comparar esses valores. O que se

deseja é que os dois coeficientes tenham uma ordem de grandeza bem distinta entre

si. Como os sistemas em duas fases aquosas são aplicados aos processos de

separação em biotecnologia, geralmente as substâncias de interesse são produtos

biotecnológicos, principalmente proteínas e enzimas, às quais normalmente o Kpart

está associado (MINAMI, 1997).

Devido à alta demanda por métodos de extração e purificação de biomoléculas

(proteínas, enzimas, células, etc) que sejam eficientes e economicamente viáveis

torna-se necessário a determinação de combinações de compostos para formação das

fases que venham a reduzir seu custo, bem como uma maior compreensão dos

fatores que determinam sua formação e a partição de solutos específicos.

Na Tabela 3 são apresentados alguns sistemas utilizados para a purificação de

enzimas por SAB encontrados na literatura.

19

Tabela 3 - Sistemas Aquosos Bifásicos utilizados para a purificação de enzimas

Autor/Ano Enzima Componentes do SAB

MINAMI et al. (1998) Glucoamilase de Aspergillus

awamori PEG/fosfato de potássio

BRADOO et al. (1999) Lipase de Bacillus

stearothermophilus SB-1 PEG/fostato

MAYETHOFF et al. (2004)

Xilose redutase de Cândida mogii PEG/fosfato

CAVALCANTI et al. (2006)

Α-toxina de Clostridium

perfringens tipo A PEG/fosfato

BEZERRA et al. (2006) Amilase de Bacillus subtilis PEG/fosfato

SANTOS et al. (2007) Lipase de Trichosporon ssp PEG/sais de fosfato

PORTO et al. (2008) Proteases de Clostridium

perfringens

PEG/citrato de sódio

MARCOS et al. (2002) Penicilina acilase de Escherichia

coli PEG/citrato de sódio

A temperatura é um fator importante na separação de proteínas. O efeito desta

é diferente para cada sistema, dependendo do tipo de polímeros utilizados

(SARAVANAN et al., 2008). Relatos indicam que com o aumento da temperatura

aumenta a estrutura do PEG, que se torna mais alongada e, consequentemente,

diminui sua afinidade com a proteína, diminuindo assim o coeficiente de partição e

consequentemente o rendimento também diminui (NUCCI et al., 2001). Um aumento

na temperatura causará um aumento na concentração do polímero na fase superior e

uma diminuição na fase inferior (MISHIMA et al.,1995).

A afinidade da proteína está relacionada com a área superficial hidrofóbica da

proteína exposta ao solvente e massa molecular dos polímeros (NUCCI et al., 2001).

Segundo o autor são necessárias menores concentrações de soluções para a

formação de fases com PEG de maior massa molecular, sendo que o pH não

apresenta efeito significativo no deslocamento das curvas binodais e consequente

formação das fases.

As lipases têm sido purificadas por diferentes processos que envolvem o uso

de um ou mais métodos como: precipitação, filtração em gel, cromatografia de troca

iônica, cromatografia por afinidade, micelas reversas, separação por membrana,

imunopurificação e sistemas bifásicos (SAXENA et al., 2003).

Na extração pelo sistema aquoso bifásico ao particionar a proteína específica

para uma fase e contaminantes da proteína para outra em condições apropriadas, isto

20

resulta na extração, purificação e concentração do bioproduto alvo (NANDINI e

RASTOGI, 2009). Devido a essa complexidade, os estudos de purificação em SAB

são na sua maioria empíricos. As melhores condições são geralmente atingidas pela

variação sistemática de vários fatores tais como massa molecular do polímero,

concentração de sal e pH (MARCOS et al., 2002).

A escolha do sal utilizado tem impacto direto na separação, concentração e

purificação, devido à sua influência na formação do sistema reacional (NANDINI e

RASTOGI, 2009). Sistemas formados com fosfato de potássio são considerados mais

adequados para C-ficocianina (ANTELO et al., 2010), lipase (BRADOO et al, 1999;

GULATI et al., 2000)

Entre os trabalhos que relatam a purificação de lipases por sistema aquosos

bifásico podemos citar NANDINI e RASTOGI (2009) utilizando PEG 6000, fosfato de

sódio pH 9,0 para a purificação de lipase de Aspergillus niger produzido por

fermentação em estado sólido utilizando farelo de arroz como substrato, encontrando

fator de purificação de 2,25. Este aumentou para 3,59 quando se utilizou extração em

multi-estágios. BASSANI et al. (2010) purificou lipase de Candida rugosa utilizando

SAB formado por PEG 2000 e tampão fosfato de potássio e obteve fator de purificação

de 2,3 vezes. Os mesmos autores (BASSANI et al., 2007) obtiveram fator de

purificação de 3,4 vezes na purificação de lipase de pâncreas de porco utilizando PEG

2000, tampão fosfato de potássio e acrescentando 3% de NaCl ao sistema.

Duas lipases de Bacillus stearothermophilus SB-1 foram purificadas por

BRADOO et al., (1999) o qual obteve fator de purificação de 5,27 vezes para a lipase

ácida em pH 4,0 e fator de purificação de 15,2 vezes para lipase neutra em pH 6,0

ambas na fase de fundo. Lipase de Aspergillus terreus foi purificada por GULATI et al.

(2000) utilizando PEG 6000 e solução tampão fosfato em duas etapas obtendo fator

de purificação de 12 vezes.

Sistema aquoso bifásico formado por PEG 8000 e fosfato de potássio e sódio

foi utilizado por CAVALCANTI et al. (2006) para a purificação de α-toxina produzida

por Clostridium perfringens obtendo fator de purificação de 4,6 vezes. Para a

purificação de glucoamilase MINAMI et al. (1998) utilizaram a purificação por sistema

aquoso bifásico em duas etapas primeiramente utilizando PEG 4000 e então PEG

1500 com tampão fosfato de potássio obtendo aumento na purificação de 3 vezes.

MAYERHOFF et al. (2004) purificou xilose redutase de Candida mogii em sistema

aquoso bifásico composto de PEG 1000 e tampão fosfato potássio e sódio pH 6,5 com

acréscimo de NaCl e obteve fator de purificação de 1,89 vezes.

21

Outro sistema com potencial de aplicação devido à fácil separação e

recuperação da enzima, porém pouco explorado é a purificação por sistema aquoso

bifásico formado por álcool-sal. OOI et al. (2009) estudaram diferentes sistemas

álcool-sal para a purificação de lipase de Burkholderia pseudomallei obtendo para

sistema formado por 16% de 2-propanol, 16% de fosfato de potássio e 4,5% de NaCl

um rendimento de 99% e fator de purificação de 13,5, por se tratar de uma lipase

tolerante a solventes, a atividade enzimática não foi afetada.

3.3.2 Purificação de enzimas por ultrafiltração

De maneira geral uma membrana pode ser definida como uma barreira que

separa e restringe, total ou parcialmente, o transporte de uma ou de várias espécies

químicas presentes nas fases (PESSOA e KILIKIAN, 2005). As moléculas de

solventes e solutos de menor tamanho que os poros permeiam através dos poros da

membrana, enquanto outras moléculas ou partículas de tamanho maior são retidas

(RODRIGUES et al., 2003).

Dentre as vantagens apresentadas pela separação por membranas as

principais são o baixo consumo energético, não requer aditivos químicos, utilização de

sistemas compactos e de fácil escalonamento, e ainda apresenta a possibilidade de

emprego em sistemas contínuos, podendo ser combinado com outros processos de

separação (MERÇON et al., 2000).

A tecnologia de membranas tem se desenvolvido bastante nas últimas décadas

e suas aplicações têm se expandido em vários setores industriais: químico,

petroquímico, mineral e metalúrgico, farmacêutico, alimentício, tratamento de águas

residuárias etc. A separação por membrana compete com métodos físicos de

separação, como a adsorção seletiva, absorção, extração por solventes, destilação,

cristalização e outras técnicas (MOURA et al., 2007).

Os processos da tecnologia de membrana mais utilizados na separação de

bioprodutos são a osmose inversa (OI), ultrafiltração (UF), microfiltração (MF) e diálise

(D). As vantagens envolvem a facilidade no escalonamento dos equipamentos,

elevada estabilidade, o processo ocorre em temperaturas moderadas, o estresse

químico e físico pode ser minimizado, além de permitir que a concentração e a

purificação possam ser obtidas em uma única etapa (SAKSENA e ZYDNEY, 1994). Os

principais atrativos para estes processos são o baixo consumo de energia, a redução

22

no número de etapas em um processamento, a maior eficiência na separação e a

maior qualidade do produto final (PETRUS, 1997).

De um modo geral, as membranas podem ser classificadas em duas

categorias: densas e porosas. Tanto as membranas densas quanto as porosas podem

ser isotrópicas ou anisotrópicas, ou seja, podem ou não apresentar as mesmas

características morfológicas ao longo de sua espessura. As membranas anisotrópicas

se caracterizam por uma região superior muito fina, mais fechada (com poros ou não)

chamada de “pele”, suportada em uma estrutura porosa. Quando ambas as regiões

são constituídas por um único material, a membrana é do tipo anisotrópica integral.

Caso materiais diferentes sejam empregados, a membrana será anisotrópica

composta (MULDER, 2000).

As membranas sintéticas comerciais, em sua grande maioria, são preparadas a

partir de materiais poliméricos com características químicas e físicas variadas. Alguns

dos principais materiais poliméricos utilizados no preparo de membranas são: acetato

de celulose, polisulfona, polietersulfona, poliacrilonitrila, polieteramida e policarbonato

(HABERT, 2006).

De um modo geral, as propriedades mais desejáveis para as membranas são a

permeabilidade, seletividade, resistência mecânica, estabilidade térmica e resistência

química. Em alguns casos, a escolha do material que compõe a membrana afeta os

fluxos e rejeição, devido à adsorção de solutos presentes na alimentação, como por

exemplo, proteínas que podem ser adsorvidas em membranas preparadas com

materiais hidrofóbicos (MULDER, 2000).

SAXENA et al. (2009) relata que polietersulfona (PES) tem-se tornado um

material padrão entre os fabricantes de membranas por ser um material viável e

disponível em quantidades ilimitadas. A PES é empregada em aplicações biológicas

como permeação seletiva, recuperação e purificação de proteínas, isolamento de

proteínas de soja, tendo uma vasta aplicação na indústria alimentícia.

Além de suas aplicações em separação e purificação de produtos, os

processos de separação por membranas também vem sendo adotados com o objetivo

de melhorar a eficiência dos processos bioquímicos, seja pela esterilização continua

do meio de cultura e do ar de alimentação, seja pela remoção contínua dos produtos.

A grande vantagem dessa nova concepção é que a reação e a separação ocorrem

simultaneamente e, se possível em um mesmo equipamento. Além disso, as células

ou os biocatalisadores são mantidos no sistema, o que pode ser conseguido com o

23

uso de uma membrana capaz de retê-los ou pela imobilização destes na estrutura da

membrana (CHARCOSSERT, 2006).

Os processos de ultrafiltração e microfiltração são geralmente usados para

recuperação de macromoléculas e para retenção de coloides suspensos e partículas

integrando os processos de upstream e downstream. Um grande campo de aplicações

para ultrafiltração e microfiltração é reportado como a concentração de proteínas,

clarificação de suspensão de células, esterilização de líquidos pela remoção de vírus e

bactérias (CHARCOSSET, 2006).

Muitos processos comerciais de separação com membrana envolvem a

filtração de soluções biológicas que contêm proteínas, peptídeos, aminoácidos, sais e

outras combinações de ácidos orgânicos, açúcares, vitaminas. Pode-se citar como

exemplos a concentração de proteínas de soro na produção de uma variedade de

produtos de laticínios, clarificação de vinhos ou a purificação de soluções em

biotecnologia (DARNON et al., 2003).

A utilização de processos com membranas é vista como uma alternativa na

purificação de proteinas pois pode-se obter uma elevada purificação e produtividade

ao mesmo tempo (ZULKALI et al., 2005). A estrutura das membranas (como, por

exemplo, o tamanho do poro e a distribuição do tamanho do poro) e a natureza física e

química desta podem afetar diretamente a separação (Tabela 4) (SAXENA, 2009).

Os processos de ultrafiltração são os processos com membranas mais

amplamente utilizados quando se deseja purificar e fracionar soluções contendo

macromoléculas. Como os poros das membranas de ultrafiltração são menores que os

das membranas de microfiltração, é necessária uma maior força motriz (diferença de

pressão) para se obter os fluxos de permeados elevados o suficiente para que o

processo possa ser utilizado industrialmente (OLIVEIRA, 2000). A filtração

convencional (dead–end) é usada na separação de partículas suspensas imiscíveis

maiores que 10 µm. Estes processos utilizam o modo de operação frontal, ou seja, o

fluido escoa perpendicularmente ao filtro. No caso de uma solução sendo processada

em modo frontal, materiais em suspensão são retidos, acumulando-se na superfície do

filtro. Trata-se de um processo essencialmente transiente, uma vez que a

concentração de sólidos próximos ao filtro aumenta com o tempo. Isto gera um

problema: à medida que o processo evolui, os sólidos retidos formam uma camada

espessa ou “torta”, tornando o processo bastante lento (DZIEZAK, 1990).

Além da operação clássica frontal, os processos com membrana podem ser

operados em escoamento tangencial. A filtração tangencial ocorre tangencialmente à

24

membrana e, neste processo, é mantida a mistura fluida circulando paralelamente a

esta superfície permeável e sujeita a diferenças de pressão transmembrana. Neste

caso, os processos de transferência são extremamente complexos, requerendo um

conhecimento, em particular, das características físicas e químicas da solução de

alimentação, da vazão, do regime de escoamento e de propriedades da membrana

permeável e camada de polarização (QUEIROS, 2004).

Tabela 4 - Aplicação das diferentes membranas na separação de vários compostos

Compostos Massa molar

(Da)

Tamanho

(nm)

Compostos retidos

OR UF MF D

Leveduras e Fungos 103 – 104 X

Bactérias 300 – 104 - X X

Colóides 100 – 103 X X X

Vírus 30 – 300 X X X

Proteínas 104 - 106 2 – 10 X X

Polissacarídeos 104 - 106 2 – 10 X X

Enzimas 104 - 106 2 – 5 - X X

Antibióticos 300 – 103 0,6 – 1,2 - -

Açucares simples 200 – 400 0,8 – 1,0 X

Ácidos orgânicos 100 – 500 0,4 – 0,8 X

Ácidos inorgânicos 10 – 100 0,2 – 0,4 X

Fonte: Zuniga, 2003. OR = Osmose Reversa. UF = Ultrafiltração. MF = Microfiltração. D = Diálise.

Durante uma separação real em processos movidos pela pressão, o

desempenho da membrana pode variar expressivamente com o tempo, sendo que

frequentemente se observa um decréscimo do fluxo com o tempo (HABERT et al.,

2006).

O declínio do fluxo pode ser causado por diversos fatores, como o fenômeno

da polarização de concentração, adsorção de solutos, formação da camada gel e

entupimento dos poros. Todos esses fatores induzem a resistências adicionais ao

transporte através da membrana. A extensão desse fenômeno é fortemente

dependente do tipo de processo com membrana e da solução de alimentação

empregada. A escolha do material é baseada em muitos casos na prevenção do

fouling e na facilidade de limpeza da membrana durante o uso (MULDER, 2000).

O fouling se caracteriza por fenômenos que envolvem adsorção ou interação

dos solutos da corrente de alimentação com a membrana, resultando na diminuição do

fluxo. Os fenômenos envolvidos no fouling são irreversíveis e não são dependentes do

25

tempo. O fouling pode ser influenciado por três fatores principais, ou pela interação

entre eles: as propriedades do material constituinte da membrana, as propriedades do

soluto e os parâmetros operacionais (BASSETTI et al., 2003; JAMES et al., 2003;

CHERYAN, 1998). Estes problemas se agravam na ultrafiltração, devido aos altos

fluxos e baixos coeficientes de transferência de massa (MULDER, 2000).

A polarização de concentração leva à formação de uma camada mais

concentrada em soluto próxima à superfície da membrana. Quando se processam

soluções de proteínas, a concentração na superfície da membrana pode atingir valores

que levam à formação de um gel protéico, que por sua vez, pode atuar como uma

membrana secundária (GAO et al., 2001; E-COLLEN e LENCKI, 1999).

A formação da camada gel ocorre quando a concentração de partículas junto à

superfície filtrante atinge um determinado valor, não variando mais. Ocorre então uma

precipitação de macromoléculas sobre a membrana, formando a camada gel. Esta

camada perturba o funcionamento hidrodinâmico do sistema pelo aparecimento de

uma resistência suplementar e de novas características de permeação (JULIANO,

2000).

Alguns estudos sugerem que é possível controlar o desempenho do

fracionamento de proteínas através de membranas, ajustando-se o pH e a força iônica

do meio (IBÁÑEZ et al., 2007, CHARCOSSET, 2006; ZULKALI et al., 2005; VAN REIS

et al., 1997), que vão afetar as interações soluto-soluto e soluto-membrana. Outros

trabalhos mostram o potencial da utilização de membranas carregadas (SAXENA e

SHAHI, 2007; MEHTA e ZYDNEY, 2006), além da adição de outras proteínas ao meio

como forma de aumentar a seletividade da separação (FILIPE e GHOSH, 2005;

KANANI et al., 2004).

Estudos referenciam o uso de membranas de ultrafiltração em sistema capilar

para purificação de lipase de Pseudomonas fluorescens, de poliacrilonitrila (PAN) e

polisulfona (OS) (SAXENA et al., 2003). A purificação de lipase de Pseudomonas

fluorescens segundo MAKHOUM et al. (1995) pode ser realizada por três etapas,

iniciando com a ultrafiltração, a precipitação com sulfato de amônio e finalmente com a

cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

A ultrafiltração foi empregada na etapa inicial da purificação da lipase de

Clostridium tetanomorphum (PETERSEN e DANIEL, 2006), de Pseudomonas

fluorescens HU380 (KOJIMA e SHIMIZU, 2003), bem como a de Bacillus sp. RSJ-1

aumentando o fator de purificação de 1,0 para 4,2 quando comparado ao caldo bruto

(SHARMA et al., 2002).

26

A lipase extracelular de Yarrowia lipolytica foi submetida à centrifugação e

clarificação por microfiltração (0,2 µm), seguida de concentração por ultrafiltração

(10 kDa). A integridade da enzima foi mantida durante o procedimento de

recuperação. Desta forma, a maior vantagem da aplicação deste processo foi a

redução no volume de trabalho, contribuindo para a purificação parcial da enzima.

(FINKERS et al., 2006).

3.4. Considerações Finais

A purificação de proteínas consiste em um dos desafios da área de

bioprocessos. O grau de pureza requerido para enzimas está diretamente relacionado

com a aplicação na qual estas serão empregadas. Os Sistemas Aquosos Bifásicos

(SAB) vêm sendo amplamente estudados na purificação de diversas proteínas, assim

como o processo de separação por membranas.

Com isso faz-se necessário o estudo mais detalhado a fim de determinar as

variáveis e seus importantes efeitos nesses sistemas para obtenção de altos valores

para o fator de purificação da enzima, sem prejuízo do rendimento que favoreçam

suas possíveis utilizações nos processos industriais e de síntese.

27

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Micro-organismo

O micro-organismo, fungo 74, utilizado neste estudo foi selecionado a partir do

trabalho de screening desenvolvido pelo grupo durante a realização do doutorado

(RIGO et al., 2010 b) por apresentar atividade hidrolítica e capacidade de síntese de

ésteres (Apêndice III).

Este micro-organismo foi isolado previamente a partir de amostras de requeijão

deteriorado (GRIEBELER et al., 2009) e identificado o gênero por técnica de

microcultivo..

Para o desenvolvimento desta técnica cortou-se quadrados de ágar (PDA) de

aproximadamente 5 mm2 os quais foram transportados com alça de platina para cima

das lâminas, suportadas pelo bastão em “U” que estava dentro da placa de Petri.

Posteriormente, inoculou-se o fungo em PDA, já isolado, que foi coberto com a

lamínula. Adicionou-se 5 mL de água estéril na placa que foi incubada em estufa a 25

°C por 6 dias. Após o crescimento, as faces da lâmina e lamínula em contato com os

fungos foram montadas separadamente complementando com outra lâmina e outra

lamínula, utilizando lactofenol azul de algodão como corante. Retirou-se o ar existente

na lâmina, através de fricção, e, posteriormente lacrou-se com esmalte incolor

(RIBEIRO e SOARES, 1998). O fungo foi então identificado pela observação

microscópica, seguindo a chave de identificação de gêneros de BARNETT e HUNTER

(1986).

A propagação de esporos foi realizada em meio Ágar Dextrose Batata (BDA)

por um período de 7 dias a 27 ºC (VARGAS et al., 2008). Os esporos foram recolhidos

adicionando-se 10 mL de solução Tween 80 0,1% (v/v) e cacos de porcelana estéreis

ao Erlenmeyer. A concentração de esporos da suspensão resultante foi padronizada

para se obter a concentração desejada no meio de cultivo.

4.2 Fermentação em Estado Sólido

O substrato utilizado em todos os experimentos de fermentação em meio sólido

foi constituído de farelo de soja. A fermentação foi realizada em béqueres de

28

polipropileno de 500 mL, contendo 10 g de farelo (Tyler 9-16) (base seca), tampados

com manta acrílica. A umidade do meio foi corrigida para 55%. Os béqueres foram

autoclavados (121 ºC, 30 min), resfriados e inoculados com a suspensão de esporos

previamente diluída de forma a se obter 4 x 108 esporos/g de farelo seco (PINHEIRO,

et al., 2008). Os béqueres foram incubados a 27 ºC por 48 h. Figura 2 apresenta os

béqueres utilizados para a fermentação em estado sólido.

Figura 2 - Béqueres utilizados para a FES.

4.3 Preparo das Amostras

Após a fermentação, as amostras foram maceradas e a enzima extraída com

45 mL de tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0, incubando-as a 37 ºC, 150 rpm por

30 min. Após a filtração em filtro de nylon, o sobrenadante foi utilizado para os ensaios

de purificação, dosagens de atividade hidrolítica e de transesterificação e do teor de

proteína total (VARGAS et al., 2008).

4.4 Massa Molar do Polietilenoglicol (PEG)

Para o processo de purificação da lipase no sistema PEG/fosfato potássio

foram selecionadas massa molares de polietilenoglicol 1500, 4000, 6000, 8000 e

10000 Da, com base nos trabalhos de MINAMI (1997) e BRANDOO et al. (1999).

29

4.5 Determinação da Curva Binodal

As curvas binodais para os SAB foram determinadas segundo metodologia

descrita por MINAMI (1997), para os sistemas compostos de fosfato de potássio e

PEG de massas molares de 8000 e 10000 Daltons em pH 6, 7 e 8. Estas estão

dispostas no Apêndice I. Para os SAB formados com PEG de massas molares 1500,

4000 e 6000 em pH 6, 7 e 8 utilizaram-se as curvas binodias publicadas por MINAMI

(1997).

4.6 Preparação do Sistema Aquoso Bifásico

O sistema aquoso bifásico formado por PEG/fosfato de potássio foi preparado

em tubos de centrífuga graduados através de pesagem de quantidades apropriadas de

PEG, tampão fosfato de potássio (30% e 40% m/m KH2PO4/K2HPO4) em pH de acordo

com os valores a serem estudados e água deionizada, de acordo com os limites de

concentração de PEG e fosfato de potássio definidos com base no diagrama de fases

determinado para cada massa molar do polímero (MINAMI, 1997). O conteúdo destes

tubos foi homogeneizado mecanicamente em vórtex para completa dissolução do

polímero, e o sistema foi mantido em banho de gelo. Após a formação de duas fases,

adicionou-se 8 g do extrato enzimático, com pH ajustado ao do sistema, para

completar a massa total de 40 g em todos os sistemas, levando-se imediatamente à

agitação em vórtex para a homogeneização final. O sistema foi centrifugado a 4 ºC

durante 10 minutos a 4700 x g (ANTELO et al., 2010) e mantido em repouso em banho

de gelo a fim de atingir o equilíbrio das fases.

As fases de topo e de fundo foram separadas tomando-se o cuidado de não

perturbar o equilíbrio, sendo então medidos os volumes de cada fase (ANTELO et al.,

2010). Foi retirada uma alíquota de cada fase para a determinação da atividade

enzimática e quantidade de proteína total. Um ensaio controle foi realizado sem a

adição da enzima para verificar se havia interferência dos componentes do sistema

nas dosagens analíticas. A Figura 3 mostra o esquema da purificação da lipase pelo

sistema aquoso bifásico (ANTELO, 2007).

30

Fonte: Antelo, 2007

Figura 3 - Esquema da Purificação da lipase pelo Sistema Aquoso Bifásico

4.7 Screening de diferentes condições de PEG/fosfato de potássio no Sistema

Aquoso Bifásico para a purificação da lipase

Para a realização dos ensaios de purificação nas diferentes massas molares de

PEG (1500, 4000, 6000, 8000 e 10000) e valores de pH (6,0, 7,0 e 8,0) foram

selecionados pontos na região bifásica das curvas binodais em diferentes

concentrações do polímero e de fosfato de potássio. Os ensaios foram realizados em

triplicata com realização de análises também em triplicatas. Análise de variância

seguindo Teste de Tukey, foi aplicado para determinar a melhor condição em cada um

dos sistemas. Como respostas foram obtidos o fator de purificação, recuperação da

lipase, coeficiente de partição (Kpart), razão de volumes do sistema e atividade da

enzima, conforme definições a partir do item 4.13.

4.8 Estratégia para a maximização da purificação por Sistema Aquoso Bifásico

O estudo do efeito do percentual do polietilenoglicol, do fosfato de potássio e

do cloreto de sódio sobre o fator de purificação e a recuperação de lipase foi estudado

através de um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 para verificação

dos efeitos principais e as interações entre as variáveis, com triplicata do ponto central

para PEG de massa molar 6000 e fosfato de potássio pH 8,0.

A Tabela 5 apresenta os valores dos níveis codificados usados no

planejamento para a maximização da purificação da lipase.

31

Tabela 5 - Variáveis e níveis estudados no planejamento para maximização das

condições de purificação

Variáveis/Níveis % PEG % de fosfato de potássio

% NaCl

-1,68 13,3 6,6 0

-1 16 8 1,2

0 20 10 3

1 24 12 4,8

1,68 26,7 13,4 6

4.9 Ultrafiltração

Para a realização dos ensaios de ultrafiltração foi utilizada uma unidade de

bancada tipo “dead-end”, confeccionada em polipropileno e acrílico, de volume útil de

200 mL, agitada por barra magnética suspensa a 5 mm da superfície da membrana,

posicionada centralmente na célula, a fim de minimizar a polarização de concentração

na superfície da membrana. A célula foi pressurizada com nitrogênio gasoso,

controlado por um regulador de pressão e monitorado por um indicador de pressão

conectado a uma das entradas da célula.

Todos os ensaios experimentais foram realizados utilizando 1,5 bar e 5°C para

evitar a perda da atividade enzimática, utilizando membrana de polisulfona de 47 mm

com massa molecular de corte de 30 kDa e 60 kDa (Osmonics,1114893 e 1156432,

respectivamente).

Foram analisadas a atividade de hidrólise e proteína total das amostras da

alimentação, retido e permeado, conforme descrito nos itens 4.17 e 4.20. Os volumes

de cada fração também foram registrados para o cálculo de balanço de massa. Um

diagrama esquemático da célula é apresentado na Figura 4.

32

Figura 4 - Modelo do sistema de UF

4.10 Efeito da força iônica na ultrafiltração

O efeito da interação soluto-soluto e soluto-membrana foi avaliado por meio da

modificação da força iônica do extrato enzimático. Esta modificação foi realizada por

meio da adição de NaCl ao extrato enzimático bruto em diferentes concentrações:

0,02 mol/L, 0,04 mol/L, 0,09 mol/L e 0,2 mol/L ( BRADOO et al. (1999)).

4.11 Combinação do Sistema Aquoso Bifásico e Ultrafiltração para a Purificação

da Lipase

Após preparo do sistema aquoso bifásicos nas condições de 20% PEG, 5,8%

fosfato de potássio e 0% de NaCl, 11,6% PEG, 10% fosfato de potássio e 1,2% de

NaCl e 16% de PEG, 8% fosfato de potássio e 4,8% NaCl de acordo com resultados

obtidos na etapa de maximização da purificação, 40 mL da fase de topo foram

submetidas a ultrafiltração, utilizando membrana de polisulfona de 47 mm com massa

molar de corte de 30 kDa, em 1,5 bar e 5 °C.

Foram analisadas as atividades de hidrólise, de transesterificação e proteína

total conforme descrito nos itens 4.17, 4.18 e 4.20 das amostras da alimentação, retido

e permeado. Os volumes de cada fração também foram registrados para os de

balanços de massa.

N2

Alimenta ção N2

Alimenta ção

Permeado

Retido

33

4.13 Fator de Purificação (FP)

O fator de purificação FP obtido para a enzima foi calculado pela Equação 2.

(Equação 2)

Onde:

Aesp. purificada é a atividade específica da lipase purificada (U/mg de proteina).

Aesp. bruta é a atividade específica de lipase bruta (U/mg de proteina).

4.14 Recuperação da lipase (RP)

A recuperação da lipase RP (%) foi calculada pela Equação 3.

(Equação 3)

Onde:

A1 é a atividade enzimática da lipase na fração considerada (U/mL);

Aextrato inicial é a atividade enzimática lipase no extrato inicial (U/mL);

V1 é o volume da fração considerada em mL;

Vinicial é o volume inicial do extrato adicionado em mL;

4.15 Coeficiente de Partição (Kpart)

O coeficiente de partição Kpart para a purificação de lipase por sistema aquoso

bifásico foi calculado pela Equação 4 (PESSOA e KILIKIAN, 2005).

(Equação 4)

Onde:

AF topo é a atividade enzimática de lipase na fase de topo, em U/mL, após o

processo de purificação;

AF fundo é a atividade enzimática de lipase na fase de fundo, em U/mL, após o

processo de purificação.

fundoF

topoF

A

AKpart =

brutoesp

purificadoesp

A

AFP

.

.=

( )[ ]

[ ]100

*

*% 11 ∗=

inicialinicialextrato VA

VARP

34

4.16 Razão de Volumes do Sistema (Vr)

A razão de volume Vr do sistema foi determinada pela Equação 5 (OLIVEIRA

et al., 2004).

(Equação 5)

Onde:

Vtopo é o volume da fase de topo, em mL, após o processo de purificação;

Vfundo é o volume da fase de fundo, em mL, após o processo de purificação.

4.17 Retenção da Ultrafiltração (%R)

A retenção da membrana de ultrafiltração foi calculada em termos de proteína e

de atividade utilizando a Equação 6.

Onde:

Cp é a concentração do componente no permeado

Ca é a concentração do componente na alimentação.

4.18 Medida da Atividade de Hidrólise

A atividade de hidrólise foi determinada por método espectrofotométrico a partir

da reação de hidrólise do p-nitrofenil laurato catalisada pela lipase com a formação do

produto cromóforo p-nitrofenol. A reação foi iniciada pela adição de 50 µL de solução

enzimática a 0,25 mL do substrato p-nitrofenil laurato 25 mmol/L em acetonitrila:

DMSO (1:1) e 2,2 mL de tampão fosfato de sódio 25 mmol/L pH 7, a 30 ºC. A reação

foi acompanhada em espectrofotômetro em modo cinética em 410 nm por 1 min. Uma

unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar

1,0 µmol de p-nitrofenol por minuto nas condições de ensaio (GODOY et al.,2009) . A

atividade de hidrólise foi calculada conforme equação 7

fundo

topo

V

VVr =

−= 100*1%

Ca

CpR (Equação 6)

35

(Equação 7)

Onde:

A é a atividade de hidrólise da amostra (U/mL)

Ca é o coeficiente da curva cinética da amostra (Abs/s)

Cb é o coeficiente da curva cinética para o branco (Abs/s)

It é a interseção da reta de calibração (Absorbância x concentração p-nitro

fenol)

Ic é a inclinação da reta padrão (Absorbância x concentração p-nitro fenol)

4.19 Medida da Atividade de Transesterificação

A atividade de transesterificação foi determinada a partir da reação do p-

nitrofenil laurato com etanol catalisada pela lipase com formação dos produtos laurato

de etila e p-nitro fenol. A reação foi iniciada pela adição de 1900 µL de solução

contendo 36 mmol/L de p-nitrofenil laurato em acetonitrila:DMSO (1:1), 100 µL de

etanol e 0,01 g de enzima liofilizada a temperatura ambiente (25 ºC), em cubeta de

vidro, sob agitação. A concentração de p-nitrofenol liberada foi determinada por

espectrofotômetro e modo cinética em 410 nm por 120 segundos. Uma unidade

internacional (UI) foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1,0

µmol de p-nitrofenol por minuto nas condições do ensaio. A atividade de

transesterificação foi calculada conforme equação 8.

(Equação 8)

Onde:

A é a atividade de transesterificação da amostra (U/g)

Ca é o coeficiente da curva cinética da amostra (µmol/mL)

Cb é o coeficiente da curva cinética para o branco (µmol/mL)

It é a interseção da reta de calibração (Abs x concentração p-nitro fenol)

Ic é a inclinação da reta de calibração(Abs x concentração p-nitro fenol)

V é o volume total de reação (mL)

M é a massa de enzima (g)

50*)60*)((

)/(Ic

ItCbCamLUA

−−=

M

V

Ic

ItCbCagUA *60*

))(()/(

−−=

36

4.20 Quantificação de Polietilenoglicol

A quantificação de polietilenoglicol foi realizada por gravimetria. Nas amostras

obtidas após combinação do sistema aquoso bifásico e separação de membrana, as

frações do retido e do filtrado primeiramente foram secas em estufa a 105ºC até

massa constante, (aproximadamente 24 h). Após este período, as amostras foram

submetidas à calcinação em mufla a 500 ºC por 8 h. A massa de compostos voláteis

representa a massa de PEG e enzima. A quantidade de enzima foi estimada pela

quantidade de proteína total e por diferença foi estimado o teor de PEG (modificado de

CUNHA e AZNAR, 2009).

4.21 Determinação de Proteína Total

A determinação de proteínas foi feita utilizando o método de Bradford (1976),

com albumina de soro bovino (Sigma A3294) como padrão, e pelo método

fluorimétrico utilizando um kit comercial da Invitrogen® (Quanti-it). A amostra (10 µL)

era adicionada a uma alíquota de 190 µL do reagente com posterior leitura em

fluorímetro digital (Qbit Fluorometer) utilizado conforme as determinações do

fabricante.

4.22 Determinação do pH

O determinação do pH foi realizada segundo normas da AOAC (1995).

37

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Seleção e identificação de micro-organismo

Primeiramente o micro-organismo escolhido, fungo 74F (Apêndice III), foi

identificado através de observação microscópica. Na Figura 5 pode-se observar que o

fungo em estudo pertence ao gênero Penicillium. Apresenta como características

principais: colônia radialmente sulcada, velutinosa, micélio branco, conidiogênese

moderada de cor verde-acizentada.

Posteriormente, amostras do fungo foram enviadas para o Laboratório de

Biologia Molecular/CENA-USP para identificação da espécie onde concluiu-se tratar-

se de um Penicillium crustosum (RIGO, et al., 2010 a).

Figura 5 – Fotomicrografia do microcultivo do fungo Penicillium

5.2 Screening de diferentes sistemas PEG/fosfato de potássio para a purificação

da lipase

Para este estudo foram testados PEG de diferentes massas moleculares (1500,

4000, 6000. 8000 e 10000) em pH 6,0; 7,0 e 8,0. Foram escolhidos pontos aleatórios

na região bifásica baseados na curva binodal de cada sistema.

5.2.1. Avaliação da influência de diferentes massas molares do PEG em pH 6,0

Os resultados obtidos para o PEG 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000 Daltons em

pH 6,0 estão apresentados nas Tabelas 6 a 10.

38

Tabela 6 – Resultados obtidos com sistemas baseados em PEG 1500 pH 6

Ensaios %PEG %fosfato de potássio

Fase FP RP (%) Vr Kpart

1 34 8 Topo 0,7b±0,2 42,3b±1,4 9,4 ∞

2 24 12 Topo 1,0b±0,1 70,9a±1,3 4,4 ∞

3 16 14 Topo 0,9b±0,1 72,4a±0,9 5,0 8,5

4 18 16 Topo 1,5a±0,1 41,5b±1,2 2,1 ∞

Letras iguais indicam que não há diferença significativa ao nível de 5% de significância entre as médias dos ensaios para a Recuperação e Fator de Purificação

Tabela 7 - Resultados obtidos com sistemas baseados em PEG 4000 pH 6

Ensaios %PEG % fosfato

de potássio


1 34 8 Topo 0,9d±0,1 33,9d±1,0 6,5 ∞

2 24 8 Topo 1,4b,c±0,1 50,1b±1,1 9,2 ∞

3 20 12 Topo 1,3b±0,1 41,3c±2,7 2,3 ∞

4 18 10 Topo 1,5a±0,1 53,9a±1,8 9,5 ∞

5 14 16 Topo 1,4b,c±0,1 37,2c,d±0,8 1,2 ∞



Ensaios %PEG % fosfato de potássio


1 32 6 Topo 1,3a±0,1 20,4c±1,2 16,1 ∞

2 30 8 Topo 0,4c±0,1 25,3b±1,7 5,7 ∞

3 20 10 Topo 1,1b±0,1 35,7a±1,4 3,9 ∞


39


Ensaios %PEG % fosfato de potássio


1 30 8 Topo 1,9a±0,2 50,1a±1,9 5,3 ∞

2 22 8 Topo 1,3b±0,2 31,0b±1,3 10,0 ∞

3 22 12 Topo 1,6a±0,1 33,8b±1,8 2,6 ∞

4 18 16 Topo 0,2c±0,1 10,6c±1,3 1,3 ∞



Ensaio %PEG % fosfato de potássio


1 30 8 Topo 0,4c±0,1 28,0b±1,9 7,2 0,3

2 24 12 Topo 0,9a±0,1 52,7a±1,6 3,5 1,3

3 18 10 Topo 0,6b±0,1 18,4c±1,8 4,4 ∞

4 18 16 Topo 0,5c±0,1 8,3e±0,6 1,3 ∞

5 15 14 Topo 0,3c±0,1 8,2e±1,2 1,3 ∞

6 30 8 Fundo 1,2a±0,1 12,3d±0,8 7,2 0,3


De acordo com os valores apresentados na purificação por sistema aquoso

bifásico em pH 6,0, os ensaios que conduziram aos maiores resultados em relação ao

fator de purificação (FP) foram obtidos utilizando 30% PEG 8000 e 8% fosfato de

potássio, e 22% PEG 8000 e 12% fosfato de potássio ambos na fase de topo obtendo

FP de 1,9 e 1,6 vezes, e recuperação de 50,1% e 33,8%, respectivamente (Tabela 9).

Nestas condições os valores de FP são considerados estatisticamente iguais pelo

Teste de Tukey.

As maiores recuperações (RP) foram encontradas nos ensaios com 16% PEG

1500 e 14% fosfato de potássio e 24% PEG 1500 e 12% fosfato de potássio, 72,4% e

40

70,9%, respectivamente (Tabela 6), as quais são consideradas estatisticamente iguais,

porém estes ensaios não conduziram à purificação da enzima (FP < 1).

Podemos verificar que a partição da enzima foi diferente nas diferentes massas

molares de PEG, pois esta se concentrou na maioria das vezes na fase rica em PEG,

(fase de topo) quando o SAB era formado com PEG de menor massa molar e se

deslocou para a fase rica em fosfato (fase de fundo) quando o SAB era formado com

PEG de maior massa molar (10000).

Observa-se que a massa molar do PEG influencia significativamente a partição,

pois com menores valores de massa molar de PEG a partição aumenta. Este

comportamento é justificado pela teoria de exclusão de volume, pois quanto maior a

massa molar do polímero menor será o espaço ou volume livre na solução e é neste

espaço para onde as moléculas se particionam. Então, em grandes massas molares, o

volume excluído aumenta e consequentemente diminui a partição das biomoléculas

para a fase rica em polímero (PORTO, 2004).

Na Tabela 10 observa-se que nos ensaios 1, 2 e 6 (30% PEG 10000, 8%

fosfato de potássio, 24% PEG 10000, 12% fosfato de potássio e 30% PEG 10000 , 8%

fosfato de potássio, respectivamente) obteve-se os menores valor de Kpart. Este fato se

deve provavelmente a estar trabalhando com o polímero de maior massa molar, aliado

a maior concentração do mesmo, na faixa de 24 e 30%. Este baixo valor do coeficiente

de partição representa a migração da proteína de interesse para a fase de fundo. No

ensaio 6 se observa que apesar da pequena recuperação (12,3%) ocorreu purificação

da enzima (FP igual a 1,2), com a mesma se localizando no fundo.


Os resultados obtidos para o PEG 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000 Daltons em

pH 7,0 estão apresentados nas Tabelas 11 a 15.

41

Tabela 11 - Resultados obtidos com sistemas baseados em PEG 1500 pH 7,0

Ensaios %PEG %Fosfato de

potássio


1 38 5 Topo 0,6c,d±0,1 19,5c,d±3,2 10,3 ∞

2 30 9 Topo 0,4d,e ±0,1 14,9d,e±3,8 3,0 ∞

3 20 9 Topo 1,3b±0,1 53,6a,b±4,9 3,0 4,6

4 20 13 Topo 1,7a±0,2 59,4a±5,3 1,5 ∞

5 23 14 Topo 1,3b±0,1 46,7b±2,3 1,3 ∞

6 11 16 Topo 0,4c,e±0,1 18,8c,e±2,8 0,6 ∞

7 8 18 Topo 0,7c±0,1 25,1c±1,0 0,4 ∞



Ensaios %PEG %Fosfato de potássio


1 27 5 Topo 0,8c,d±0,1 21,4b,c±2,3 8,5 ∞

2 36 5 Topo 0,5d±0,1 14,4d±2,1 7,8 ∞

3 16 10 Topo 1,1b,c±0,2 20,2c±1,0 1,2 ∞

4 25 10 Topo 1,4b±0,3 29,0a±0,9 1,8 ∞

5 4 15 Topo 2,1a±0,2 26,4a,b±2,8 0,2 ∞

6 12 15 Topo 1,6a,b±0,2 27,6a±1,7 0,6 ∞

Letras iguais indicam que não há diferença significativa ao nível de 5% de significância entre as médias dos ensaios para a Recuperação e Fator de Purificação.

42




1 15 10 Topo 1,9a,b±0,1 24,7b±1,8 1,2 ∞

2 8 18 Topo 2,4a±0,1 31,3a±3,1 0,3 ∞

3 12 18 Topo 1,4c±0,1 20,0b,d±1,8 0,5 ∞

4 6 23 Topo 1,4b,c±0,4 33,2a±1,9 0,2 ∞

5 11 23 Topo 1,3c±0,2 21,2b,c±0,9 0,4 ∞

6 5 28 Topo 0,9c±0,1 16,3c,d±0,6 0,1 ∞





1 19 7,5 Topo 2,7a±0,2 23,1a,b±2,1 2,0 ∞

2 25 7,5 Topo 1,2c±0,1 21,1a,c±0,4 2,5 ∞

3 13 16 Topo 1,6b±0,3 14,6c,d±1,7 0,5 2,1

4 20 16 Topo 0,4d±0,1 23,9a±2,4 0,9 3,5

5 8 25 Topo 1,2c±0,1 17,9a,d±1,8 0,2 3,4

6 14 25 Topo 0,2d±0,1 4,2e±1,1 0,4 1,0

7 5 28 Topo 1,0c±0,1 16,4b,c,d±2,4 0,1 4,5


43

Tabela 15- Resultados obtidos com sistemas baseados em PEG 10000 pH 7,0



1 17 10 Topo 1,2b±0,1 27,4a±2,5 1,2 ∞

2 25 10 Topo 1,6a±0,2 25,8a±0,7 1,6 ∞

3 11 17 Topo 1,7a±0,1 26,7a±3,3 0,4 8,2

4 19 17 Topo 0,7c±0,2 8,1b±1,3 0,7 1,8

5 15 25 Topo 0,4c±0,1 4,0b±1,4 0,4 0,4


Os melhores resultados encontrados na purificação por sistema aquoso

bifásico em pH 7,0 foram aqueles obtidos nos ensaios utilizando 19% PEG 8000 e

7,5% fosfato de potássio, 8% PEG 6000 e 18% fosfato de potássio, 4% PEG 4000 e

15% fosfato de potássio e 15% PEG 6000 e 10% fosfato de potássio obtendo fatores

de purificação de 2,7, 2,6, 2,1 e 1,9 vezes e recuperações de 23,1%, 31,3%, 26,4%,

24,7%, respectivamente.

Assim como ocorreu para o pH 6,0, as maiores recuperações foram

encontradas quando se utilizou PEG 1500, nos ensaios com 20% de PEG e 13%

fosfato de potássio e 20% PEG e 9% de fosfato de potássio, 59,4% e 53,6%, e fator de

purificação da enzima de FP 1,7 e 1,3 respectivamente.

Observa-se que maiores fatores de purificação foram encontrados em baixos

valores de Vr para o PEG 4000 e 6000. Este fato se deve também à questão da

redução do volume de topo e migração das proteínas contaminantes para a fase de

fundo em função da menor solubilidade na fase de topo. Isto, porém não ocorreu para

o PEG de massa molar maior (8000), pois esta leva a uma exclusão maior, que não

permite uma redução do volume tão acentuada, sem comprometer a manutenção da

enzima alvo na fase de topo.


Os resultados obtidos para o PEG 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000 Daltons no

pH 8,0 são apresentados nas Tabelas 16 a 20.

44


Ensaios %PEG % Fosfato de potássio


1 35 5 Topo 1,3c±0,2 48,4d±1,8 9,3 ∞

2 30 9 Topo 1,3c ±0,1 44,2d±2,5 2,7 ∞

3 20 9 Topo 1,1c±0,1 46,8d±3,3 2,5 ∞

4 23 13 Topo 3,7a±0,1 61,6b±2,2 1,3 6,6

5 11 14 Topo 1,7b±0,1 70,3a±2,7 0,6 ∞

6 16 16 Topo 1,1c±0,1 43,7d±1,5 0,8 ∞

7 8 17 Topo 1,8b±0,1 59,7c±0,9 0,4 ∞





1 36 4 Topo 1,2b±0,2 34,7b±2,6 7,8 ∞

2 25 8 Topo 0,7c±0,1 21,5c±1,5 2,7 ∞

3 16 8 Topo 2,2a±0,1 50,6a±3,5 2,7 ∞

4 20 12 Topo 1,0b±0,1 35,8b±3,8 1,6 ∞

5 8 13 Topo 0,9b±0,1 38,6b±1,0 0,5 ∞


45




1 35 4 Topo 0,9c±0,1 47,0b,c±3,1 7,5 2,1

2 30 7 Topo 2,4b±0,4 65,7a±3,9 4,3 ∞

3 20 7 Topo 5,9a±0,1 25,4d±2,1 0,4 1,7

4 10 10 Topo 2,1b±0,1 57,1b±3,5 1,0 16,4

5 10 13 Topo 1,9b±0,2 42,8c±4,5 0,5 ∞





1 35 5 Topo 1,5b,c±0,2 67,6a±1,1 8,6 ∞

2 20 10 Topo 2,1a±0,3 55,5c±2,6 1,4 ∞

3 25 15 Topo 2,2a±0,1 61,2b±1,1 1,2 ∞

4 15 15 Topo 1,7a,c±0,3 31,7d±0,7 0,6 ∞

5 20 20 Topo 0,6d±0,1 15,3e±0,6 0,6 ∞

6 10 20 Topo 1,8a,b±0,3 27,7d±2,3 0,3 ∞


46




1 35 5 Topo 1,1d,e±0,1 42,3b±0,6 1,9 ∞

2 32 12 Topo 1,0d,f±0,1 48,8a±0,5 5,6 3,5

3 25 10 Topo 2,2b±0,2 47,3a±2,7 1,7 ∞

4 25 17 Topo 1,2e,f±0,1 20,5c±1,3 1,2 ∞

5 15 16 Topo 2,8a±0,1 51,7a±0,1 1,7 4,8

6 17 27 Topo 1,7c±0,1 13,3d±1,2 0,4 2,4

7 8 27 Topo 0,7d±0,1 5,8e±0,6 0,2 2,2


O sistema aquoso bifásico formado em pH 8,0 que conduziu à melhor condição

em termos de fator de purificação (FP) foi aquele formado por 20% PEG 6000 e 7% de

fosfato, obtendo um incremento de 5,9 vezes na atividade específica. Segundo

SHARMA et al., (2001) o efeito do pH está relacionado à estabilidade da enzima e à

carga líquida da proteína, mostrando que algumas lipases podem apresentar maior

estabilidade em pH alcalino.

A carga líquida dos resíduos de aminoácidos da superfície determina as

propriedades superficiais da proteína e pode ser alterada pela mudança de pH. As

interações entre a proteína e as fases do SAB contribuem para a partição destas. A

fase de topo de um sistema composto por PEG e sais de fosfato, tem uma carga

positiva e a fase de fundo apresenta carga negativa (GAUTAM e SIMON, 2006). A

lipase apresentou uma melhor partição com o aumento do pH o que levou à maior

retirada de contaminantes, provavelmente pela maior carga positiva de outras

proteínas, sendo particionadas para a fase de fundo, propiciando maior purificação do

composto alvo.

Todos estes processos que ocorrem com a proteína modificam sua interação

com os componentes do sistema bifásico, alterando seu comportamento de partição.

O pH, indiretamente, pode afetar a partição de uma proteína e modificar a composição

das fases dos SABs, seja a posição da linha binodal, seja o comprimento da linha de

amarração (SILVA et al., 2006).

47

Outros fatores como concentração, massa molar e tipo de polímero formador

das fases influenciam decisivamente o comportamento de extração das biomoléculas.

Geralmente o aumento da massa molar de um polímero acaba diminuindo a tendência

de partição da proteína para a mesma fase, devido a efeitos entrópicos (SILVA et al.,

2006). Segundo ROJAS et al., (2004) o comportamento de partição da proteína

depende da sua hidrofobicidade, sendo que conforme o comprimento da cadeia de

PEG aumenta (massa molar de PEG maior), menor será a quantidade de grupos

hidroxil para a mesma concentração do polímero, sendo a fase de topo, rica em PEG,

mais hidrofóbica que a fase mais rica em sal.

Na Tabela 21 são apresentados os resultados com os maiores valores do fator

de purificação, obtidos em pH 8,0, bem como a comparação dos resultados por

análise de variância e teste de Tukey.

Tabela 21-Recuperação e Fator de Purificação PEG 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000

pH 8,0

Ensaios MM %PEG %Fosf. de Potássio

FP RP (%)

1 23 13 3,7b±0,1 61,6b,g±2,2

2 1500 8 17 1,8c,e±0,1 59,7b,g±0,9

3 11 14 1,7c,f±0,1 70,3a±2,7

4 20 12 1,0d±0,1 35,6c±1,0

5 4000 16 8 2,3e,g±0,1 50,6d,i±3,5

6 36 4 1,2f,g±0,2 34,7c,e±2,6

7 20 7 5,8a±0,1 25,4f±2,1

8 6000 30 7 2,4g,h,i±0,4 65,7a,g,h±3,9

9 10 10 2,1c,e,h±0,1 57,1b,d,i±3,5

10 10 20 1,8c,e±0,3 27,7e,f±2,3

11 8000 25 15 2,2c,e,g±0,1 61,2b,h±1,1

12 20 10 2,1c,e,g±0,3 55,5b,d±2,6

13 15 16 2,8i±0,1 51,7d,i±0,1

14 10000 25 10 2,2c,e,g±0,2 47,3i±2,7

15 17 22 1,7c,f±0,1 13,3j±1,3

Letras iguais indicam que não há diferença significativa e letras distintas há diferença significativa ao nível de 5% de significância entre as médias dos ensaios para a Recuperação e Fator de Purificação

Pelos resultados apresentados, observa-se que houve diferença significativa

(P<0,05) no fator de purificação quando se variou a composição do SAB, utilizando

48

PEG 6000 Da. Alguns autores relatam que existe uma massa molecular do polímero

que maximiza o fator de purificação. O aumento na massa molecular do PEG levaria

ao aumento da hidrofobicidade do polímero, que poderia interagir mais com a lipase.

Por outro lado, o aumento da massa molar do PEG também diminui o volume livre da

solução, levando à maior partição das biomoléculas para a fase de fundo (NANDINI e

RASTOGI, 2009).

De acordo com PICÓ et al., 2007 PEG de baixa massa molecular, pode

interagir fortemente com as proteínas o que pode levar a maior partição da enzima

para a fase de PEG, fato este evidenciado pelos melhores resultados do estudo terem

sido obtidos em PEG 6000 conforme mostrado na tabela 21.

O maior fator de purificação alcançado no presente trabalho, igual a 5,9, foi

maior do que os reportados na literatura sobre purificação de lipases por SAB

compostos apenas por PEG e fosfato de potássio em um única etapa de processo,

como o encontrado por NANDINI e RASTOGI (2009) utilizando PEG de massa

molecular 6000 Da, fosfato de sódio pH 9,0 que foi de 2,2 o qual aumentou para 3,6

quando utilizou extração em multi-estágios. BASSANI et al. (2010) purificou lipase de

Candida rugosa utilizando SAB formado por PEG de massa molecular 2000 Da e

tampão fosfato de potássio e obteve fator de purificação de 2,3 vezes. Os valores da

recuperação de atividade na fase de topo variaram entre 13 e 70%, sendo difícil

estabelecer uma relação entre esse parâmetro e as condições de operação.

Valores de pH perto da neutralidade, tornam o sistema biocompatível. O pH

pode afetar a separação, seja alterando a carga do soluto ou alterando a proporção

dos componentes presentes. Em pH mais elevados, a proteína é mais carregada

negativamente do que em pH baixo e, portanto, o coeficiente de partição aumenta com

o aumento do pH, que pode ser causado pelas interações eletrostáticas entre as

proteínas e o PEG. O aumento no valor do coeficiente de partição pode ser devido a

interações hidrofóbicas e efeito de carga líquida, que é uma função da concentração

do polímero e pH da solução (SARAVANAN et al., 2008). Portanto, coeficientes de

partição altos ou tendendo ao infinito indicam a partição da proteína para a fase de

topo.

Na situação ideal, a enzima e os compostos contaminantes devem se

concentrar em diferentes fases, sendo que a otimização pode ser alcançada pela

variação da razão entre os volumes das fases. Neste caso, teoricamente, o fator de

purificação aumenta e consequentemente diminui o rendimento com a diminuição da

razão entre os volumes das fases (MARCOS et al., 2002).

49

5.2 Estratégia para a maximização da purificação por sistema aquoso bifásico

Nesta etapa, avaliou-se o efeito da concentração de PEG 6000, fosfato de

potássio pH 8 e NaCl no fator de purificação, recuperação, coeficiente de partição e

razão entre volumes, na purificação de lipase produzida por fermentação em estado

sólido. Foi utilizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 23 para

verificação dos efeitos principais e as interações entre as variáveis. A importância do

uso da técnica de planejamento experimental e análise de superfície de resposta

deve-se ao fato da possibilidade de analisar os efeitos sinérgicos ou antagônicos entre

as variáveis, que só podem ser verificadas pela determinação dos efeitos de interação

entre estas por um planejamento fatorial (KALIL et al., 2000; RODRIGUES, et al.,

2005). A Tabela 22 apresenta a matriz do planejamento com os valores reais,

codificados e as respostas para o fator de purificação, recuperação, coeficiente de

partição e razão do volumes.

A matriz do planejamento experimental foi determinada com base na melhor

condição encontrada na etapa de seleção da melhor massa molecular de PEG e pH

do tampão fosfato de potássio. Porém, não foi possível colocar a condição com maior

fator de purificação, 5,9 (PEG 20%, fosfato de potássio 7%) como ponto central do

planejamento, pois alguns pontos do planejamento ficariam na região monofásica,

sendo, portanto necessário o deslocamento da concentração de fosfato do ponto

central para 10% garantindo desta maneira que todos os pontos estudados no

planejamento ficassem dentro de região bifásica.

O acréscimo de NaCl no sistema aquoso bifásico foi baseado nos relatos de

que este reduz a atividade de água na fase de fundo e assim exclui as proteínas

hidrofóbicas (LAHORE et al.,1995).

50

Tabela 22 - Matriz do planejamento experimental realizado para purificação da lipase

(valores codificados e reais com as respostas recuperação, fator de

purificação, razão dos volumes e coeficiente de partição)

Ensaio % PEG %Fosfato de potássio

%NaCl FP %Recup. Vr Kpart

1 -1(16) -1(8) -1(1,2) 5,2 47,2 1,3 ∞

2 1(24) -1(8) -1(1,2) 1,9 28,8 2,0 ∞

3 -1(16) 1(12) -1(1,2) 1,9 28,5 0,9 ∞

4 1(24) 1(12) -1(1,2) 2,5 31,3 1,5 ∞

5 -1(16) -1(8) 1(4,8) 10,2 36,5 2,3 ∞

6 1(24) -1(8) 1(4,8) 1,8 17,7 3,9 ∞

7 -1(16) 1(12) 1(4,8) 3,1 30,7 1,0 ∞

8 1(24) 1(12) 1(4,8) 3,1 24,2 1,7 ∞

9 0(20) 0(10) -1,68(0) 2,1 44,8 1,4 ∞

10 0(20) 0(10) 1,68(6) 2,6 37,2 1,7 ∞

11 0(20) -1,68(6,6) 0(3) 2,8 29,8 1,6 ∞

12 0(20) 1,68(13,4) 0(3) 1,7 25,8 1,0 ∞

13 -1,68(13,3) 0(10) 0(3) 3,8 31,1 0,8 ∞

14 1,68(26,7) 0(10) 0(3) 1,7 20,7 1,9 ∞

15 0(20) 0(10) 0(3) 1,8 28,4 1,3 ∞

16 0(20) 0(10) 0(3) 1,8 24,4 1,3 ∞

17 0(20) 0(10) 0(3) 1,9 24,8 1,4 ∞

Os resultados apresentados na Tabela 22 foram tratados estatisticamente e um

modelo empírico foi obtido para o fator de purificação (Equação 9). O modelo

codificado maximizado para a purificação da enzima em função da concentração de

PEG, tampão e NaCl foi validado pela análise de variância apresentada na Tabela 24.

Verifica-se que o coeficiente de correlação obtido (0,86) e o valor de F (F calculado

maior que o F tabelado) validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a

construção das superfícies de resposta e curvas de contorno apresentadas nas

Figuras 6, 7 e 8. Na Figura 9 encontra-se a curva binodal e os pontos estudados para

a maximização da purificação pelo sistema aquoso bifásico.

TNaClPEGNaClPEGTNaClTPEGFP 39,069,052,157,074,007,195,2 −−++−−=

(Equação 9)

51

Tabela 23 - Análise de variância para o fator de purificação do extrato enzimático bruto

obtido por Penicillium crustosum

Fonte de Variação

Soma Quadrática

Graus de Liberdade

Média Quadrática

Fcalculado

Regressão 51,1 6 8,5 4,8

Resíduo 17,7 10 1,8

Falta de Ajuste 17,7 8

Erro Puro 0,02 2

Total 68,7 16

Coeficiente de correlação: R=0,86, F0,95;6;10 =3,2

Figura 6 - Superfície de resposta e curva de contorno para fator de purificação em

relação à concentração de PEG e fosfato de potássio, obtida na otimização das

condições de purificação da lipase produzida por FES

52


relação concentração de NaCl e PEG obtida na otimização das condições de

purificação da lipase produzida por FES


relação concentração de NaCl e fosfato de potássio obtida na otimização das

condições de purificação da lipase produzida por FES

53

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

Con

centr

ação d

e P

EG

%

Concentração de Fosfato %

Figura 9 - Curva binodal PEG 6000 pH 8. Pontos estudados no planejamento

experimentos para a maximização da purificação pelo sistema aquoso bifásico.

Os resultados obtidos para recuperação apresentados na Tabela 22 foram

tratados estatisticamente e observou-se que as variáveis estudadas não apresentaram

efeito significativo sobre a recuperação da enzima.

Observa-se pelas Figuras 6, 7 e 8 que diminuindo as concentrações de PEG e

fosfato de potássio e aumentando a concentração de NaCl há uma tendência a

aumentar o fator de purificação. Com base nos resultados optou-se por diminuir as

concentrações de PEG e fosfato de potássio e fixar os valores de NaCl em 0, 1,2 e

4,8%. Os resultados estão apresentados na Tabela 24 e Figura 10. Os ensaios 7, 8, 9

referem-se às melhores condições de PEG e fosfato de potássio obtidos na primeira

etapa de maximização da purificação, com variação de 0, 1,2 e 4,8 % de NaCl.

54

Tabela 24 - Fator de purificação, recuperação, razão de volumes e coeficiente de

partição para menores concentrações de PEG e fosfato de potássio e

concentrações de 0, 1,2 e 4,8% de NaCl

Ensaio %PEG %Fosfato de

potássio

%NaCl FP Recup.% Vr Kpart

1 20 5,8 0 3,6d,e±0,4 85,9a±2,0 3,7 ∞

2 11,6 10 0 4,5c,d±0,4 81,5a±0,5 0,8 ∞

3 20 5,8 1,2 5,5b,c±0,5 54,2c±2,0 2,3 ∞

4 11,6 10 1,2 6,5b±0,7 55,4c±1,8 0,6 ∞

5 20 5,8 4,8 10,2a±0,4 53,8c±0,6 2,2 ∞

6 11,6 10 4,8 10,0a±0,4 25,8e±2,1 0,6 ∞

7 16 8 0 4,5c,e±0,1 66,7b±2,6 1,4 ∞

8 16 8 1,2 5,8b±0,3 39,4d±2,1 1,2 ∞

9 16 8 4,8 10,4a±0,2 50,2c±3,1 1,4 ∞

Pelos resultados apresentados na Tabela 24 observa-se que as maiores

recuperações foram encontradas nos ensaios 1, 2, quando não houve o acréscimo de

NaCl. Já os maiores fatores de purificação foram encontrados nos ensaios 5,6 e 9 nos

quais foram acrescentados 4,8%, porém nestes houve a precipitação do NaCl. Nas

mesmas concentrações de PEG e fosfato de potássio destes ensaios, porém com

menor concentração de NaCl (1,2%), obteve-se FP menores, porém não houve

precipitação de NaCl e as recuperações foram na ordem de 40 a 55%. Os resultados

confirmam que aumentando a concentração de NaCl ocorreu um aumento no fator de

purificação e uma diminuição na recuperação. BASSANI et al. (2007) obtiveram fator

de purificação de 3,4 vezes na purificação de lipase de pâncreas de porco utilizando

PEG 2000, tampão fosfato de potássio e acrescentando 3% de NaCl ao sistema.

Na Figura 10 encontra-se a curva binodal e os pontos estudados na segunda

etapa da maximização da purificação pelo sistema aquoso bifásico.

55

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

Conce

ntr

açã

o d

e P

EG

%

Concentração de Fosfato %

Figura 10 - Curva binodal PEG 6000 pH 8. Quadrados: pontos estudados no

planejamento experimentos. Estrelas: pontos estudados na segunda etapa da

maximização da purificação.

Com base nos resultados apresentados na Tabela 24, foi determinada a

atividade de transesterificação para os três melhores pontos, sendo que o ensaio 1

refere-se à condição que apresentou maior recuperação, o ensaio 2 refere-se ao ponto

que apresentou boa recuperação e FP representativo com a menor concentração de

PEG e o ensaio 3 refere-se à condição de maior fator de purificação. Os resultados

estão apresentados na Tabela 25.

A determinação da atividade de transesterificação se deu pelo fato de que

durante a medida de atividade de esterificação foi observado a ocorrência de

interferência do PEG o que nos remetia a resultados errados.

56

Tabela 25 - Fator de purificação, recuperação, razão entre volumes e coeficiente de

partição, atividade de hidrólise e de transesterificação na fase de topo, nos

melhores pontos da maximização da purificação

Ensaio 1 2 3

PEG% 20 11,6 16

Fosfato de potássio% 5,8 10 8

NaCl% 0 1,2 4,8

Ativ.hidrólise (U/mg) 6,7±0,7 12,9±1,4 16,2±0,3

FP1 3,6±0,8 6,5±0,7 10,4±0,3

Recup.% 85,9±10,4 55,4±1,8 50,2±4,9

Vr 3,7 0,6 1,4

Kpart ∞ ∞ ∞

Ativ. Trans.(U/mg) 8,5±0,7 7,1±0,6 4,1±0,6

FP2 28,3±0,7 23,7±0,6 13,7±0,6

Nota: FP1: fator de purificação com base na atividade de hidrólise. FP2: fator de purificação com base na

atividade de transesterificação.

Observa-se que os fatores de purificação com base na atividade de

transesterificação foram maiores que os obtidos para atividade de hidrólise. É

interessante notar que o ensaio que apresentou maior atividade de hidrólise foi o que

apresentou menor atividade de transesterificação. O mesmo comportamento se

observa em relação ao fator de purificação e sugere a ocorrência de duas lipases no

extrato obtido da fermentação em estado sólido.

5.3 Ultrafiltração

Os ensaios de ultrafiltração para o extrato bruto foram realizados em uma

unidade de bancada tipo “dead-end”, utilizando pressão de 1,5 bar e temperatura de 5

°C para evitar a perda da atividade enzimática, com membranas de polisulfona de

47 mm com massa molecular de corte de 30 kDa e 60 kDa.

Após os ensaios foram analisadas a atividade hidrólise e proteína total das

amostras da alimentação, retido e permeado, no extrato bruto, sendo os resultados

apresentados na Tabela 26. Os resultados de atividade e teor de proteína mostram

que a lipase é retida em ambas as membranas, pois os valores de atividade no retido

são bem maiores que os obtidos no permeado.

57

Tabela 26 – Resultados da atividade hidrólise, proteína e atividade específica obtidos

na ultrafiltração do extrato enzimático bruto em membrana de 30 kDa e

60kDa

30 kDa 60 kDa

Alimentação 3,3 3,0

Atividade (U/mL) Retido 10,0 6,1

Permeado 0,1 0,3


Proteína (mg/mL) Retido 2,8 1,8

Permeado 0,1 0,1


Ativ. Específica (U/mg) Retido 3,5 3,2

Permeado 0,1 0,4

Com base nos resultados de atividade, proteína e volume de todas as frações

envolvidas na ultrafiltração do extrato bruto foi possível calcular os parâmetros de

desempenho do processo de concentração e fracionamento do extrato enzimático

obtido por FES, os quais são apresentados na Tabela 27. No Apêndice II encontra-se

a tabela completa dos resultados obtidos no processo de concentração e

fracionamento da enzima.

Tabela 27 - Resultados da ultrafiltração do extrato enzimático bruto

Parâmetro 30 kDa 60 kDa

Recuperação Total da Enzima % 71,1 51,0

Recuperação da Enzima no Retido % 71,0 50,2

Recuperação da Enzima no Permeado % 0,01 0,8

Fator de Purificação Baseado no Retido 0,8 0,6

Fator de Purificação Baseado no Permeado 0,01 0,01

Retenção da Atividade % 99,9 98,9

Retenção da Proteína % 86,7 86,3

Recuperação da Proteína no Retido % 89,9 77,2

Recuperação da Proteína no Permeado % 10,0 9,8

Recuperação da Proteína Total % 99,9 87,0

Os resultados de recuperação da atividade enzimática e de proteína foram

sempre inferiores a 100 %, sugerindo que ocorre perda de proteínas na membrana,

possivelmente devido à formação da camada de gel na superfície desta (GHOSH e

58

CUI, 2000). Como a recuperação de atividade é menor que a recuperação de proteína,

pode-se inferir que também ocorre inativação enzimática durante o processo.

A retenção da atividade e de proteína total foi alta (> 90% e >86%) para as

duas membranas utilizadas, indicando que a enzima e as demais proteínas

contaminantes possuem alta massa molecular ou que o extrato seja formado por

agregados de proteínas. Além disso, a camada de incrustação na superfície da

membrana também pode atuar como uma membrana dinâmica, aumentando a

retenção. Como resultado da maior retenção, os fatores de purificação (FP) do

permeado foram baixos, enquanto o FP calculado para o retido na membrana de

30 kDa e 60 kDa, foram de 0,8 e 0,6 respectivamente. Uma vez que a retenção de

proteína foi menor que a retenção de atividade, poderia se esperar encontrar um FP

maior que unidade. No entanto, isso não ocorreu, o que pode ser atribuído à

desativação da enzima durante a permeação.

5.4 Efeito da força iônica na ultrafiltração

O efeito da força iônica no desempenho do sistema foi avaliado pela adição de

diferentes concentrações de NaCl no extrato bruto, antes deste ser submetido à

ultrafiltração em membrana de 30 kDa e 60 kDa. O acréscimo de NaCl diminuiu a

atividade do permeado, devido provavelmente à precipitação da proteína na superfície

da membrana, hipótese que é reforçada pela diminuição da recuperação total de

proteína nas duas membranas (Tabelas 28 e 29).

Foram analisadas a atividade de hidrólise e proteína total das amostras da

alimentação, retido e permeado, no extrato bruto e nos ensaios com acréscimo de

diferentes concentrações de NaCl, ultrafiltrados em membrana de 30 kDa e 60 kDa,

sendo os resultados apresentados nas Tabelas 28 e 29, respectivamente.

59


na ultrafiltração do extrato bruto e nos ensaios com acréscimo de

diferentes concentrações de NaCl em membrana de 30 kDa

Concentração de NaCl (mol/L)

0 0,02 0,04 0,09 0,2

Alimentação 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3

Atividade (U/mL) Retido 10 8,8 8,2 9,6 7,1

Permeado 0,01 0,3 0,01 0,02 0,03

Alimentação 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

Proteina (mg/mL) Retido 2,8 1,6 1,9 1,5 1,3

Permeado 0,01 0,04 0,1 0,1 0,03

Alimentação 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4

Ativ. Específica (U/mg) Retido 3,5 5,4 4,2 6,3 5,3

Permeado 0,1 0,9 0,1 0,3 0,9


na ultrafiltração do extrato bruto e nos ensaios com acréscimo de

diferentes concentrações de NaCl em membrana de 60 kDa


0 0,02 0,04 0,09 0,2

Alimentação 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Atividade (U/mL) Retido 6,1 6,6 5,8 6,5 6,7

Permeado 0,03 0,05 0,01 0,01 0,1

Alimentação 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Proteina (mg/mL) Retido 1,8 1,9 1,4 1,5 1,6

Permeado 0,1 0,1 0,1 0,1 0,04

Alimentação 4,9 4,9 4,9 4,9 4,9

Ativ. Específica (U/mg) Retido 3,2 3,4 4,2 4,4 4,2

Permeado 0,4 0,3 0,02 0,1 2,6

Com base nos resultados de atividade e proteína do extrato bruto foi possível

calcular os valores da concentração e fracionamento do extrato enzimático bruto e

com a adição de diferentes concentrações de NaCl, utilizando a membrana de 30 kDa

e 60 kDa, os quais são apresentado nas Tabelas 30 e 31, respectivamente. No

Apêndice II encontra-se a tabela completa dos resultados obtidos.

60

Tabela 30 - Efeito da força iônica sobre a ultrafiltração do extrato enzimático, com a

adição de diferentes concentrações de NaCl, utilizando membrana de 30

kDa


Parâmetros 0 0,02 0,04 0,09 0,2

Recuperação Total da Enzima % 71,1 62,9 59,7 73,2 56,8

Recuperação da Enzima no Retido % 70,9 62,2 59,6 72,8 55,8

Recuperação da Enzima no Permeado % 0,1 0,8 0,1 0,4 0,6

Fator de Purificação Baseado no Retido 0,8 1,2 0,9 1,4 1,2

Fator de Purif. Baseado no Permeado 0,01 0,2 0,02 0,1 0,2

Retenção da Atividade % 99,8 95,9 99,8 99,5 99,1

Retenção da Proteína % 86,7 94,9 89,5 92,5 95,9

Recuperação da Proteína no Retido % 89,8 50,5 63,0 50,9 45,7

Recuperação da Proteína no Permeado % 9,9 3,8 7,8 5,4 3,0

Recuperação da Proteína Total % 99,8 54,3 70,8 56,3 48,7

Tabela 31 - Efeito da força iônica sobre a ultrafiltração do extrato enzimático,com


kDa


Parâmetros 0 0,02 0,04 0,09 0,2





Fator de Purificação Baseado no Permeado 0,1 0,1 0,01 0,02 0,5






Na Tabela 30 observa-se que a adição de NaCl causou aumento no fator de

purificação quando foi utilizada a membrana de 30 kDa, alcançou-se um fator de

purificação de 1,4 na fração retida pela membrana, mostrando que a adição de sal

pode potencializar o fracionamento de enzimas por UF. Nesse caso, a mudança da

61

força iônica do meio pode ser benéfica ao processo, pois muda a conformação das

proteínas, possibilitando ainda a separação de agregados proteicos.

É interessante notar que a recuperação total da proteína diminui com a adição

de NaCl. Esse comportamento sugere que a adição de sal esteja aumentando a

precipitação de proteínas na superfície da membrana, hipótese que é reforçada pelo

aumento da retenção de proteína e de atividade observada. Ainda, a pouca diferença

de retenção entre membranas com cortes distintos, sugere que a membrana dinâmica

formada pela camada de proteínas depositada na superfície da membrana esteja

desempenhando um papel importante no processo.

Alguns autores alegam que em misturas de proteínas, interações de soluto não

dependem apenas da magnitude da carga superficial, mas também da espessura da

dupla camada elétrica. Nesse caso, a adição de NaCl reduziria a espessura da dupla

camada elétrica reduzindo, portanto, a atração eletrostática de algumas proteínas,

diminuindo seu tamanho e aumentando a permeabilidade das membranas (BRECHT

et al., 2008; LIN et al., 2008). No presente trabalho isso não foi observado, indicando

que o efeito do NaCl diminuiu a permeabilidade das proteínas pela membrana,

aumentando a retenção, pelos prováveis motivos expostos anteriormente.

Quando se utilizou a membrana de 60 kDa (Tabela 31), obteve-se menores

fatores de purificação. Ainda, o material da membrana pode ter um papel relevante na

permeação, facilitando ou prejudicando a passagem das enzimas, em função das

interações entre a enzima e a superfície da membrana.

Cabe ainda ressaltar que os resultados de atividade também podem sofrer

influência da presença ou ausência de inibidores. No processo de UF, inibidores da

enzima podem ser removidos, levando a aumentos na atividade da enzima em relação

à atividade inicial.

5.5 Combinação do Sistema Aquoso Bifásico e Separação por Membrana para a

purificação da lipase

A combinação das técnicas de purificação, sistema aquoso bifásico e

separação por membranas foi avaliada, e os resultados obtidos estão apresentados

nas Tabelas 32 e 33. O ponto 1 representa o sistema aquoso bifásico formado por

20% PEG, 5,8% fosfato de potássio e 0% de NaCl. O ponto 2 representa o sistema

aquoso bifásico formado por 11,6% PEG, 10% fosfato de potássio e 1,2% de NaCl e o

ponto 3 representa o sistema aquoso bifásico formado por 16% de PEG, 8% fosfato de

62

potássio e 4,8% de NaCl, as quais foram submetidas à ultrafiltração em membrana de

30 kDa.

Tabela 32 – Resultados da atividade de hidrólise, proteína e atividade específica

obtidos na combinação dos sistemas de purificação em membrana de 30

kDa

Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3

Alimentação 0,5 0,7 0,9

Atividade (U/mL) Retido 0,3 0,5 0,3

Permeado 0 0 0


Proteína (mg/mL) Retido 0,1 0,05 0,05

Permeado 0,04 0,03 0


Ativ. Específica (U/mg) Retido 4,8 8,9 7,1

Permeado 0 0 0

O ponto 1 representa o sistema aquoso bifásico formado por 20% PEG, 5,8% fosfato de potássio e 0% de NaCl. O ponto 2 representa o sistema aquoso bifásico formado por 11,6% PEG, 10% fosfato de potássio e 1,2% de NaCl e o ponto 3 representa o sistema aquoso bifásico formado por 16% de PEG, 8% fosfato de potássio e 4,8% de NaCl,

Tabela 33- Combinação do sistema aquoso bifásico e separação por membrana para

a purificação da lipase com membrana de 30 kDa

Resultados / Concentrações Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3

Recuperação Total da Enzima % 21,5 37,5 19,5

Recuperação da Enzima no Retido % 21,5 37,5 19,5

Recuperação da Enzima no Permeado % 0 0 0

Fator de Purificação Baseado no Retido 0,4 0,5 0,3

Fator de Purificação Baseado no Permeado 0 0 0

Retenção da Atividade % 100 100 100

Retenção da Proteína % 11,6 27,0 12,5

Recuperação da Proteína no Retido % 54,6 80,8 76,6

Recuperação da Proteína no Permeado % 53,0 25,5 30,6

Recuperação da Proteína Total % 107,6 106,3 107,2

Nas Tabelas 32 e 33 observa-se que quando foi feito a combinação do sistema

aquoso bifásico e ultrafiltração ocorreu retenção total da enzima no retido, pois a

atividade do permeado é zero. Observa-se também perda na recuperação da enzima

do retido o que caracteriza perda por deposição na membrana ou ainda desnaturação.

63

No Apêndice II encontra-se tabela completa dos resultados obtidos na combinação

dos sistemas de purificação SAB/UF.

Na Tabela 34 estão apresentados os resultados obtidos para a atividade de

síntese de ésteres do extrato enzimático submetido à purificação por sistema aquoso

bifásico seguido de ultrafiltração.

Tabela 34 - Purificação e recuperação de lipase usando sistema aquoso bifásico

juntamente com ultrafiltração em relação à capacidade de síntese de

ésteres

Frações Atv. (U/mL) Prot.

(mg/g)

Atv. Esp. (U/mg) FP

Ext. Bruto 5,5 16,9 0,3 1

SAB P1 8,6 1,0 8,5 28,3

SAB P2 6,4 0,9 7,1 23,7

SAB P3 3,7 0,9 4,1 13,7

UF(R-P1) 8,6 0,9 9,0 30,0

UF(R-P2) 10,9 0,9 11,7 39,0

UF(R-P3) 10,9 0,9 11,5 38,3

Nota: SAB P1 representa a fase de topo do sistema aquoso bifásico formado por 20% PEG, 5,8% fosfato de potássio e 0% de NaCl. SAB P2 representa a fase de topo do sistema aquoso bifásico formado por 11,6% PEG, 10% fosfato de potássio e 1,2% de NaCl e o SAB P3 representa a fase de topo do sistema aquoso bifásico formado por 16% de PEG, 8% fosfato de potássio e 4,8% de NaCl, as quais foram submetidas à ultrafiltração em membrana de 30 kDa. UF (R-P1) representa o retido da SAB P1 após ultrafiltração, UF (R-P2) representa o retido da SAB P2 após ultrafiltração e UF (R-P3) representa o retido da SAB P3 após ultrafiltração.

Pelos resultados observa-se que a combinação dos métodos em relação à

atividade de síntese proporcionou o aumento do fator de purificação principalmente

para os pontos 2 (11,6% PEG, 10% fosfato de potássio e 1,2% de NaCl ) e 3 (16% de

PEG, 8% fosfato de potássio e 4,8% de NaCl) que passaram de 23,7 e 13,7 para 39,0

e 38,3, respectivamente, levando à conclusão de que se tem um pool de lipases no

extrato enzimático estudado.

Segundo TANUJA et al. (2000), que obteve rendimento total de 78%,

concentração de 12 vezes e fator de purificação de 3,3 vezes para a purificação de

amiloglocosidase, a vantagem da associação entre o sistema aquoso bifásico e a

ultrafiltração é que se reduz consideravelmente o volume de meio que será

processados por UF. SRINIVAS et al. (2002) em seu estudo de purificação de

peroxidase utilizando sistema aquoso bifásico combinado com ultrafiltração encontrou

64

resultados semelhantes a TANUJA et al. (2000), com recuperação total da enzima de

76%, fator de purificação de 5,9 vezes e aumento na atividade de 9,7 vezes.

Após os ensaios de SAB combinados com ultrafiltração foi quantificada a

concentração de PEG nas amostras de retido e filtrado de cada ponto estudado. Os

resultados estão apresentados na Tabela 35.

Tabela 35 – Resultados da quantificação de PEG nas amostras de retido e filtrado

para os pontos estudados na combinação do SAB/UF

Retido (%) Filtrado (%)

Ponto 1 10,6 34,6

Ponto 2 9,8 37,4

Ponto 3 10,0 37,2

Na Tabela 37 observa-se que após a combinação do SAB/UF a maior

concentração de PEG foi para o permeado, conforme o esperado, pois a massa molar

de PEG e bem menor que a massa molar de corte da membrana. No entanto, uma

quantidade de PEG permaneceu no retido. A permanência do PEG no retido pode ser

explicado devido à afinidade existente entre o PEG e a proteína. Outra hipótese seria

a retenção de PEG sobre a superfície da membrana.

65

6 CONCLUSÃO

O SAB é uma técnica potencial para a separação e purificação da lipase. O

sistema 20% PEG 6000, 7,0% de fosfato de potássio pH 8 maior fator de purificação

5,9, recuperação de 25,4%, Vr de 0,40 e Kpart de 1,71 evidenciando a maior afinidade

da enzima pela fase de topo.

A técnica do planejamento experimental foi utilizada como uma estratégia para

a maximização da purificação, no qual foram avaliadas as concentrações de

polietilenoglicol (PEG), fosfato de potássio e NaCl em sistemas compostos por PEG

6000 pH 8. O acréscimo de NaCl no sistema aquoso bifásico foi baseado nos relatos

de que este favorece a transferência das proteínas para a fase superior (rica em PEG)

do sistema de duas fases. O sistema 20% PEG 6000, 5,8% fosfato de potássio pH 8,0

e com acréscimo de 4,8% de NaCl apresentou recuperação 53,8% e o maior fator de

purificação, igual a 10,2.

O sistema composto de 20% PEG, 5,8% de fosfato de potássio e sem a adição

de NaCl, apresentou maior atividade de transesterificação e fator de purificação, 8,5

U/mg e 28,3 vezes, respectivamente. Pode-se observar também que os fatores de

purificação com base na atividade de transesterificação foram maiores que os obtidos

para atividade de hidrólise. É interessante notar que o ensaio que apresentou maior

atividade de hidrólise foi o que apresentou menor atividade de transesterificação. O

mesmo comportamento se observa em relação ao fator de purificação e sugere a

ocorrência de um pool de enzimas no extrato obtido da fermentação em estado sólido.

O desempenho da ultrafiltração foi avaliado por sistema de escoamento

transversal. Membranas comerciais com massa molecular de corte de 30 a 60 kDa

foram testadas. Os resultados mostraram que um fator de purificação de 0,8 vezes e

com acréscimo de 0,09 mol/L de NaCl o fator de purificação aumentou para 1,4 vezes.

Quando combinado SAB/UF o fator de purificação em termos de atividade de

hidrólise diminuiu, mais em termos de atividade de transesterificação aumentou,

alcançando valores em torno de 39,0 vezes para os sistemas compostos de 11,6%

PEG 6000, 10% de fosfato de potássio e 1,2% de NaCl e 38,3 para o sistema

formado16% de PEG 6000, 8% de fosfato de potássio e 4,8% de NaCl. Após a UF da

fase de topo do SAB, conseguiu-se remover parte do PEG, que foi para o permeado,

mais uma quantidade de PEG permaneceu no retido, o que pode ser explicado devido

afinidade existente entre o PEG e a proteína.

66

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

• Investigação da purificação de lipases por outros sistemas aquosos bifásicos,

incluindo a etapa precipitação.

• Avaliação de membranas de outros fabricantes e de diferentes materiais.

• Avaliação de outras estratégias de separação da enzima e do PEG.

• Caracterização das enzimas obtidas após purificação.

• Eletroforese.

• Custos.

• “GRAS” do micro-organismo

67

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83

9 APÊNDICE

APÊNDICE I – Curvas Binodais para PEG 8000 e 10000 Da em pH 6, 7 e 8

Curva Binodal PEG 8000 pH 6,0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25 30

% Fosfato de Potássio

% P

EG

Figura 1: Curva Binodal para o PEG 8000 e fosfato de potássio 30% (p/p), pH 6.


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25 30 35 40


%P

EG


84


05

101520253035404550

0 5 10 15 20 25 30 35 40


%P

EG



0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15 20 25 30

%Fosfato de Potássio

%P

EG


85


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25 30 35 40

%Fosfato de Potássio

%P

EG



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25 30 35 40


%P

EG


86

APÊNDICE II - Tabelas completas com os valores obtidos na ultrafiltração do

extrato bruto, com a adição de NaCl ultrafiltrado em membrana de 30 e 60 kDa e

combinação do SAB/UF ultrafiltrado na membrana de 30 kDa.

Tabela 1 - Resultados da ultrafiltração do extrato enzimático bruto.

Parâmetro 30 kDa 60 kDa

Perda Volumétrica (mL) 0,6 1,6

Recuperação Total da Enzima % 71,1 51,0

Recuperação da Enzima no Retido % 71,0 50,2

Recuperação da Enzima no Permeado % 0,01 0,8

Fator de Purificação Baseado no Retido 0,8 0,6

Fator de Purificação Baseado no Permeado 0,01 0,01

Retenção da Atividade % 99,9 98,9

Retenção da Proteína % 86,7 86,3

Fator de Concentração Volumétrico 4,3 4,0

Fator de Concentração da At Enzimática 3,0 2,0

Fator de Concentração da Ptn Total 3,8 3,1

Recuperação da Proteína no Retido % 89,9 77,2

Recuperação da Proteína no Permeado % 10,0 9,8

Recuperação da Proteína Total % 99,9 87,0

87

Tabela 2 - Efeito da força iônica sobre a ultrafiltração do extrato enzimático,com a


kDa.


Parâmetros 0 0,02 0,04 0,09 0,2

Perda Volumétrica (mL) 0,6 0,7 0,4 1,0 0,8





Fator de Purif. Baseado no Permeado 0,01 0,2 0,02 0,1 0,2



Fator de Concentração Volumétrico 4,3 4,3 4,2 4,0 3,9

Fator de Concentração da At Enzimática 3,0 2,7 2,5 2,9 2,2

Fator de Concentração da Ptn Total 3,8 2,2 2,6 2,0 1,8




88

Tabela 3 - Efeito da força iônica sobre a ultrafiltração do extrato enzimático,com adição

de diferentes concentrações de NaCl, utilizando membrana de 60 kDa.


Parâmetros 0 0,02 0,04 0,09 0,2

Perda Volumétrica (mL) 1,6 1,2 1,6 1,6 2,6





Fator de Purificação Baseado no Permeado 0,1 0,1 0,01 0,02 0,5



Fator de Concentração Volumétrico 4,0 4,4 4,7 4,7 4,4

Fator de Concentração da At Enzimática 2,0 2,2 1,9 2,1 2,2

Fator de Concentração da Ptn Total 3,1 3,2 2,3 2,4 2,6




89

Tabela 4 - Combinação do sistema aquoso bifásico e separação por membrana para a

purificação da lipase com membrana de 30 kDa.

Resultados / Concentrações Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3

Perda Volumétrica (mL) 2,0 3,0 4,0

Recuperação Total da Enzima % 39,7 37,5 20,3

Recuperação da Enzima no Retido % 39,7 37,5 20,3

Recuperação da Enzima no Permeado % 0 0 0

Fator de Purificação Baseado no Retido 0,4 0,5 0,3

Fator de Purificação Baseado no Permeado 0 0 0

Retenção da Atividade % 100 100 100

Retenção da Proteína % 7,0 27,0 6,3

Fator de Concentração Volumétrico 1,7 1,7 1,9

Fator de Concentração da At Enzimática 0,7 0,6 0,4

Fator de Concentração da Ptn Total 1,7 1,4 1,5

Recuperação da Proteína no Retido % 96,3 80,8 78,6

Recuperação da Proteína no Permeado % 34,8 25,5 35,2

Recuperação da Proteína Total % 131,2 106,3 113,9

90

APÊNDICE III – Artigo screening do micro-organismo utilizado no estudo

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