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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
HÁLLISON DO NASCIMENTO SILVA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE ATEMOIA (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.) EM
ROEDORES
PETROLINA-PE
2016
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HÁLLISON DO NASCIMENTO SILVA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE ATEMOIA (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.) EM
ROEDORES
Dissertação apresentada à
Universidade Federal do Vale do São
Francisco - UNIVASF, como parte das
exigências do Programa de Pós-
graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais, na linha
de pesquisa: Fisiologia e
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida
PETROLINA-PE
2016
3
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF. Bibliotecário: Fabio Oliveira Lima - CRB-4/2092.
Silva, Hállison do Nascimento.
S586a Avaliação do potencial antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Annona cherimola Mill. X Annona squamosa L.) em roedores/ Hállison do Nascimento Silva. - - Petrolina-PE, 2016. XVII ; 122 f. : il. ; 29cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) – Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida. 1. Atemoia. 2. Antinociceptiva. 3. Anti-inflamatória. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 615.53
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HÁLLISON DO NASCIMENTO SILVA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE ATEMOIA (Annona cherimola
Mill. x Annona squamosa L.) EM ROEDORES
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF,
como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, para obtenção do título de Mestre
em Recursos Naturais, na linha de pesquisa em
Fisiologia e Farmacologia.
APROVADO em: 18 de Março de 2016.
_________________________________________________
Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida - UNIVASF
(Orientador)
_________________________________________________
Prof. Dra.: Márcia Bento Moreira - UNIVASF
(Examinador Externo)
_________________________________________________
Prof. Dr. Raimundo Campos Palheta Júnior - UNIVASF
(Examinador Interno)
5
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar sou muito grato a Deus pelo dom da sabedoria e
entendimento e por tudo que Ele tem feito na minha vida. Ao meu orientador, Prof.
Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, um grande cientista, amigo e pai nas
horas exatas, ao qual é merecedor dos frutos que vem colhendo. Não poderia deixar
de agradecer por ter acreditado em mim, e contribuído para o meu crescimento em
meio às dificuldades. Obrigado por ter me aceito como seu orientando. Sou muito
grato à Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), por
contribuírem para o desenvolvimento da pesquisa científica.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela bolsa de mestrado.
Além disso, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais
do Semiárido, e a todos os docentes que contribuíram no decorrer da minha
formação enquanto mestre.
Ao meu pai, José Adelson Cordeiro da Silva, por me ajudar no que estava ao
seu alcance e à minha querida mãe, Vera Lúcia do Nascimento Silva, pelas orações,
amor, carinho e por sempre estar ao meu lado me dando palavras de força.
Às minhas queridas irmãs, Vilma do Nascimento Maciel e Andreza Carvalho
do Nascimento, por sempre estarem ao meu lado, me ajudando em oração e
transmitindo o maior sentimento puro o “AMOR”; aos meus queridos sobrinhos,
Rebeca Maciel, Mary Anny, Otávio Miguel e Alice Carvalho, Amo Vocês! E também
aos meus cunhados Jailson Carvalho e Noemário Araújo, obrigado pela força e
orações. Aos Técnicos: Ana Paula (Lab. Bioquímica), Amanda Leal (Lab.
Imunologia), Amanda (Lab. de Química Orgânica) e ao pessoal do biotério
Leonardo, Helenildo, Fabiana, por toda atenção e compreensão.
Meu muito obrigado a todos do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas
Medicinais, (NEPLAME), e especialmente aos meus colegas de laboratório, Tâmara
Coimbra, Roxana Andrade, Leandra Araújo, Fernanda Granja, Sarah Raquel,
Raimundo Júnior Gonçalves, Juliane Cabral, Suzana Rabelo, Milla Gabriela, Camila
e aos estudantes do curso de Medicina Lucas Remígio e Vitor Gabriel, e Samara
Paiva do curso de enfermagem. Diante disso, portanto, agradeço a todos que me
ajudaram de forma direta ou indireta por mais uma grande conquista.
6
A todos os servidores da Biblioteca da UNIVASF, em especial Lis Maria,
Leonardo Vieira, Daniele Moreno, Tayline Fonseca, Patrícia Albuquerque e Viviane
Araújo, por toda atenção.
Aos meus eternos professores, Mestres e Doutores: Ladjane Albuquerque,
Alecsandra Lucena, Nayale Lucinda, Lidiane Barbosa, Samira Almeida, Raquel
Bezerra, Vanessa Juvino, Wesla Albuquerque, Marília Cruz, Fabrício Andrade,
Paulo Rogério, Marcelo Paiva e Renato Cabral, pela grande força e ensinamento!
A todos os meus “amigos/irmãos”. Agradeço a Deus pela vida de cada um.
.
Muito obrigado a todos e Deus abençoe grandemente!
Vela a pena ser Fiel!
7
"Nem olhos viram, nem ouvidos ouviram, nem jamais penetrou em
coração humano o que Deus tem preparado para aqueles que o amam."
(1 Coríntios 2:9)
8
RESUMO
Para esse estudo, foi selecionado atemoia (Annona cherimola Mill. x Annona
squamosa L.) (Annonaceae), um híbrido interespecífico, no qual faz parte da família
Annonaceae conhecida por sua ampla atividade biológica. O presente trabalho
avaliou o efeito antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico bruto (Acs-
EtOH – 25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) das folhas de atemoia, em camundongos,
utilizando diferentes modelos experimentais, bem como avaliar a toxicidade aguda
na administração de uma dose única de Acs-EtOH 2.000 mg/kg (v.o.) em ratos. Para
avaliação da atividade antinociceptiva, foram realizados os seguintes ensaios: teste
de contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina e teste da
placa quente. Para avaliar o efeito anti-inflamatório, foram realizados dois modelos:
peritonite e teste de bolsa de ar, ambos induzidos por carragenina. O estudo
toxicológico foi conduzido durante 14 dias (avaliando o consumo de ração, água e
peso corporal), não ocorreu morte e nenhuma alteração significativa em nenhum dos
grupos tratados, sugerindo uma baixa toxicidade do extrato. Ao final do estudo, os
animais foram eutanasiados para análise macroscópica e peso dos órgãos. Os
resultados obtidos através da avaliação antinociceptiva, Acs-EtOH demonstrou efeito
antinociceptivo em todos os testes. Em relação à avaliação da atividade anti-
inflamatória, Acs-EtOH obteve resultados em todos os testes. Conclui-se que a
atemoia possuem atividades antinociceptiva e anti-inflamatória, corroborando com
uso na medicina popular. Além disso, o estudo de toxicidade demonstrou um perfil
de segurança no uso do extrato, contribuindo assim, para o desenvolvimento de
pesquisas farmacológicas e toxicológicas com a espécie.
Palavras-chaves: Antinociceptivos, Anti-inflamatórios, Toxicidade aguda.
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ABSTRACT
For this study, it was selected atemoia (Annona cherimoya Mill. X Annona squamosa
L.) (Annonaceae), an interspecific hybrid, and used in folk medicine for the combat
inflammation in general. The aim of this study was to evaluate the antinociceptive
and anti-inflammatory effect of ethanol extract (Acs-EtOH - 25, 50 and 100 mg / kg,
p.o.) of atemoia leaves in mice using different experimental models and to assess the
acute administration of a single dose of Acs-EtOH 2000 mg / kg (p.o.). To evaluate
the antinociceptive activity, the following tests were performed: test of writhing
induced by acetic acid, formalin test and the hot plate test. To evaluate the anti-
inflammatory effect were performed in two models: peritonitis air bag test, both
induced by carrageenan. The toxicology study was conducted for 14 days (assessing
the feed intake, water and body weight), there was no death and no significant
change in any of the treatment groups, suggesting a lower toxicity of the extract. At
the end of the study, animals were euthanized for macroscopic examination and
organ weights. The results obtained by evaluation of the antinociceptive, Acs-EtOH
exhibited analgesic effect in all tests. Regarding the evaluation of anti-inflammatory
activity, Acs-EtOH obtained results in all tests. In conclusion, the atemoia sheets
have antinociceptive and anti-inflammatory, corroborating with use in folk medicine.
Moreover, the toxicity study demonstrated a safety profile in use of the extract,
thereby contributing to the further development of pharmacological and toxicological
research on the species.
Keywords: antinociceptive, anti-inflammatory, acute toxicity.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de distribuição da família Annonaceae no mundo..... ..................... 25
Figura 2. Frutos de diferentes espécies de Annona. ............................................... 27
Figura 3. Ilustração do fruto de Annona squamosa L. x Annona cherimola Mill.
atemoia .................................................................................................................... 30
Figura 4. Imagens do híbrido atemoia. .................................................................... 31
Figura 5. Tipos de neurônios primários sensoriais que são responsáveis pelo sinal
nociceptivo das extremidades ao SNC. ................................................................... 34
Figura 6. Via ascendente da nocicepção da primeira conexão. Transmissão do
impulso nociceptivo para as lâminas do corno dorsal, através das fibras aferentes
primárias. ................................................................................................................. 36
Figura 7. Processo de liberação de mediadores por diferentes estímulos como
carragenina (Cg) ou antígenos (Ag). ....................................................................... 39
Figura 8. Mapa conceitual resumido dos mediadores derivados de fosfolipídios e
suas ações, com os locais de ação de agentes anti-inflamatórios. ......................... 40
Figura 9. Esquematização de uma resposta inflamatória. ...................................... 42
Figura 10. Exsicata de atemoia (Annona cherimola Mill x Annona squamosa L). ... 44
Figura 11. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia. ................. 46
Figura 12. Dados do consumo de ração dos animais tratados com extrato etanólico
bruto de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% grupo controle
negativo (n= 5 por grupo). ....................................................................................... 54
Figura 13. Dados do consumo de água dos animais tratados com extrato etanólico
bruto de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% grupo controle
negativo (n= 5 por grupo). ....................................................................................... 55
11
Figura 14. Dados de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto das
folhas de atemoia (2.000 mg/kg v.o.) durante 14 dias...............................................56
Figura 15. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de atemoia, indometacina
e morfina no teste de contorções induzidas por ácido acético em camundongos.....58
Figura 16. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de atemoia, indometacina
e morfina na primeira e segunda fase do teste da formalina.....................................59
Figura 17. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de atemoia e morfina no
teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração.......... 60
Figura 18. Efeito sobre a coordenação motora do extrato etanólico bruto de atemoia
e diazepam no teste do rota-rod em camundongos. ................................................. 61
Figura 19. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia e
da dexametasona sobre a migração leucocitária na cavidade peritoneal após
administração de carragenina em camundongos.......................................................62
Figura 20. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia e
da dexametasona sobre a migração leucocitária na bolsa de ar após a administração
de carragenina em camundongos..............................................................................62
12
TABELA
Tabela 1. Peso dos órgãos de roedores tratados com extrato etanólico bruto das
folhas de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o.). ........................................................ 57
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aα Fibras do tipo A-alfa
Aβ Fibras do tipo A-beta
Aδ Fibras do Tipo A-delta
AA Ácido araquidônico
AINES Anti-inflamatórios não esteroidais
ANOVA Análise de variância
Ag Antígeno
Acs-EtOH Extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Annona cherimola
Mill. x Annona. squamosa L.).
BK Bradicinina
Cg Carragenina
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
COX Enzima ciclooxigenase
E.P.M Erro padrão da média
EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético
GLU Glutamato
HVASF Herbário Vale do São Francisco
i.p. Intraperitoneal
IL Interleucina
LTA Leucotrienos
LTB4 Leucotrieno – B4
MORF Morfina
NO Óxido nítrico
14
OMS Organização Mundial da Saúde
PAF Fator de Ativação Plaquetário
PG Prostaglandina
PGE2 Prostaglandina E2
PGF2α Prostaglandina F2α
PLA 2 Fosfolipase A2
cPLA 2 Fosfolipases citoplasmáticas A2
S.F Solução Fisiológica
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
SP Substância P
TXs Tromboxanos
TNF Fator de necrose tumoral
TNF-α Fator de necrose tumoral-α
UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco
v.o. Via oral
s.c. Subcutâneo
15
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 18
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 20
2.1. Objetivo geral .................................................................................................... 21
2.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 21
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................ 22
3.1. Plantas medicinais ............................................................................................. 23
3.2. Considerações sobre a família Annonaceae ...................................................... 24
3.3. Atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de espécie do gênero Annona ..... 27
3.4. Considerações sobre o híbrido de atemoia ....................................................... 29
3.5. Considerações sobre dor e Nocicepção ............................................................ 32
3.5.1. Transmissão da dor e nocicepção .............................................................. 34
3.6. Inflamação ......................................................................................................... 37
4. PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................................... 43
4.1. Coleta do material botânico ............................................................................... 44
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Annona cherimola
Mill. X Annona squamosa L.) .................................................................................... 45
4.3. Animais .............................................................................................................. 46
4.4. Estudo da toxicidade aguda .............................................................................. 46
4.4.1. Análise comportamental ................................................................................. 47
4.5. TESTES DE ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA ................................................. 47
4.5.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético .................. 47
4.5.2. Teste da formalina ...................................................................................... 48
4.5.3. Teste da placa quente ................................................................................ 49
4.6. TESTE DE COORDENAÇÃO MOTORA........................................................ .... 49
4.6.1. Teste da barra giratória (rota-rod) ................................................................ 49
4.7. TESTES DE ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ............................................. 49
4.7.1. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal (Peritonite) ....................... 49
4.7.2. Modelo de inflamação na bolsa de ar ......................................................... 50
16
4.8. Análise estatística .............................................................................................. 51
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 53
5.1. Toxicidade aguda de atemoia ............................................................................ 53
5.2. Consumo de ração e água ................................................................................. 53
5.3. Variação do peso corporal ................................................................................. 56
5.4. Análise macroscópica e peso dos órgãos ........................................................ 56
5.5. Atividade antinociceptiva do extrato de atemoia ................................................ 57
5.5.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético .................. 57
5.5.2. Teste da formalina ..................................................................................... 58
5.5.3. Teste da placa quente ............................................................................... 60
5.6. Teste da barra giratória (rota-rod) ...................................................................... 60
5.7. Atividade anti-inflamatória do extrato de atemoia.......................... .................... 61
5.7.1. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal (peritonite) ........................ 61
5.7.2. Modelo de inflamação na bolsa de ar ......................................................... 62
5.8. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 63
6. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 69
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 71
APÊNDICE ................................................................................................................... 86
ANEXOS ....................................................................................................................... 121
17
1- INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
A natureza, em geral, é responsável pela produção da maior parte das
substâncias orgânicas conhecidas. O reino vegetal tem contribuido para o
fornecimento de substâncias úteis para o tratamento de doenças que afetam os
seres humanos (MONTANARI, 2001). Dentre estas, relacionado aos efeitos anti-inflamatórios
e antinociceptivos.
As plantas medicinais são utilizadas na medicina popular em muitos países
para o tratamento de várias condições dolorosas e inflamatórias. No entanto, para
muitas das plantas em uso, seus princípios ativos e sua eficácia são desconhecidos.
Com isso, estudos experimentais têm por objetivo demonstrar as possíveis
propriedades farmacológicas encontradas nestas plantas e identificar os princípios
ativos responsáveis por essa atividade (SOUSA et al., 2002). Os produtos naturais
em geral, e em particular as plantas medicinais, são uma importante fonte de novas
substâncias químicas com potencial de aplicabilidade terapêutica. Considerando-se
que os mais importantes protótipos analgésicos (ex: ácido salicílico e morfina) foram
derivados originalmente do reino vegetal, o estudo de plantas medicinais tem se
tornado uma estratégia útil na pesquisa por novas drogas analgésicas
(ELISABETSKY et al., 1995).
No Brasil foram registrados 29 gêneros, compreendendo cerca de 392
espécies (MAAS, et al., 2015). Atemoia (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa
L.) é um híbrido interespecífico entre a cherimola (A. cherimola Mill.) e a pinha ou
fruta-do-conde (A. squamosa L.) (OLIVEIRA et al., 2010). O nordeste brasileiro é
uma região com uma rica diversidade de plantas, cujo principal bioma, a Caatinga, é
rico em biodiversidade, possuindo uma vegetação adaptada ao clima semiárido, com
espécies endêmicas, na qual já foram registradas mais de 1.500 espécies em sua
flora.
Apesar da polinização ocorrer entre espécies naturalmente, o híbrido
atemoia foi resultado de um cruzamento intencional, com a finalidade de se obter um
fruto de boa qualidade, e que fosse mais adaptável ao clima tropical. Esse fruto é de
cultivo recente no Nordeste, tendo sido implantado pela primeira vez na região, nos
projetos de irrigação do Vale do São Francisco no ano de 1997, na cidade de
Petrolina-PE. Ademais, é visto que existem espécies no gênero Annona, como a
Annona diversifolia (CARBALLO et al., 2010) e Annona squamosa (CHAVAN et al.,
18
19
2010) que possuem atividades comprovadas com potencial antinociceptivo e anti-
inflamatório. Já no ponto de vista fitoquímico, muitas classes de metabólitos
secundários foram encontradas na família Annonaceae, onde os dados
quimiotaxonômicos caracterizam a presença de alcaloides, terpenoides e
flavonoides (SILVA et al., 2009). Além disso, o desenvolvimento de pesquisa na área
de recursos naturais dessa região vem corroborando para o conhecimento de
espécies da família Annonaceae, bem como na investigação de novas espécies com
ação farmacológica, para o tratamento da algia e inflamação.
Diante disso, portanto, foi realizado um levantamento bibliográfico nos
principais bancos de dados sobre possíveis atividades farmacológicas de atemoia,
observou que não foram encontrados registros de pesquisas farmacológicas com
esse híbrido, considerando-se um estudo pioneiro na procura e constatação da
atividade antinociceptiva e anti-inflamatória das folhas de atemoia.
20
2- OBJETIVOS
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Investigar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato etanólico
das folhas de atemoia em roedores.
2.2. Objetivos Específicos
- Avaliar o perfil de segurança do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia,
através do estudo de toxicidade aguda;
- Avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das
folhas de atemoia;
- Verificar a função motora após administração do extrato etanólico bruto das folhas
de atemoia;
22
3- FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
23
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. PLANTAS MEDICINAIS
A biodiversidade, de um modo geral, é a responsável pela produção de
grande parte das substâncias orgânicas conhecidas e em pesquisa, sendo que, o
reino vegetal tem a maior parcela da diversidade química conhecida e registrada na
literatura. Os produtos naturais de quaisquer origens podem atuar como fonte de
novos padrões moleculares úteis para as possíveis ações farmacológicas (VIEGAS-
JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO, 2006). A busca pelo uso dessas plantas tem
crescido consideravelmente na segunda metade do século XX pela população
(ALBUQUERQUE et al., 2007).
Para que uma planta seja considerada medicinal, a mesma deve prevenir
aliviar, curar ou modificar um processo fisiopatológico ou, ainda, serem utilizadas
com fins terapêuticos por possuírem, em um u mais órgãos substâncias para que
sejam precursores de fármacos semi-sintéticos. Sendo assim, segundo dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS), 65-80% da população mundial que mora em
países em desenvolvimento utilizam essencialmente plantas medicinais para o
tratamento inicial de doenças, devido à baixa condição socioeconômica e a
dificuldade de acesso à medicina moderna (AKERELE, 1993).
É importante destacar que as plantas medicinais, além do seu uso pela
população com finalidades terapêuticas, têm contribuído ao longo dos anos para a
formulação de diversos fármacos, até hoje sendo utilizados na clínica (CECHINEL-
FILHO, YUNES, 1998); como a morfina e a codeína, encontradas a partir da
Papaver somniferum com potencial analgésico e que pode provocar alterações no
humor dos seres humanos por atuar, principalmente, nos receptores opioides μ
(HUANG; KUTCHAN, 2000).
Grande quantidade dos princípios ativos de importância farmacológica
identificadas nos extratos vegetais, de modo geral, é de origem de uma grande
variedade de metabólitos secundários que são produzidos para modular seus
próprios metabolismos, possuem uma composição complexa que pode servir para
alvos terapêuticos de patologias humanas. Enquanto os medicamentos demonstram,
em sua quase totalidade, um exclusivo princípio ativo que é responsável pelo seu
potencial farmacológico, os extratos vegetais são compostos por misturas
multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente ativas e inativas, que,
24
diversas vezes, atuam em alvos farmacológicos distintos (FERREIRA; PINTO,
2010).
A iniciativa pela busca de plantas medicinais pela população, impulsionou os
pesquisadores e a indústria farmacêutica a se aperfeiçoarem mais nas pesquisas
por novos fármacos (SOUSA et al., 2008), já que as espécies vegetais concebem
uma fonte crescente e importante de novos medicamentos para o plano terapêutico
de diferentes condições. Vale destacar que a grande diversidade química que essas
plantas proporcionam, torna-as uma das principais fontes para a realização do
isolamento de possíveis compostos orgânicos bioativos (ADEBIYI et al., 2012).
O Brasil é o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta,
não podendo abdicar de sua capacidade para os produtos naturais (PINTO et al.,
2002). Apresentando cinco biomas, dentre eles destacamos a Caatinga, que envolve
70% da região Nordeste e partes do norte do estado de Minas Gerais, além de
corresponder a 13% do território desse país (SANTOS; JUNIOR; PRATA, 2012).
A grande quantidade de plantas localizadas nesse bioma é conhecida e
usada como medicinais pela população, e algumas delas são utilizadas para a
fabricação comercial de fitoterápicos, como por exemplo, Erythrina velutina e
Amburana cearensis (ALBUQUERQUE et al., 2007).
3.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE A FAMÍLIA ANNONACEAE
A família Annonaceae abrange um grande número de gêneros e espécies,
onde a maioria é de origem das regiões tropicais, com cerca de 2.500 espécies
difundidas em quase 135 gêneros (CHATROU et al., 2004)(Figura 1). Além disso,
são plantas de adaptação ao clima tropical (PINHEIRO et al., 2009), demonstrando
espécies de diversos tamanhos e variada classificação topográfica (MAAS et al.,
2012).
Dentre as mais de 32 mil espécies de angiospermas registradas no Brasil,
aproximadamente 386 são anonáceas, que se encontram distribuídas em grande
escala pelo território brasileiro (NAZARO, 2013), sendo que a maioria, é distribuída
na região da Amazônia com cerca de 259 espécies, onde 158 são endêmicas
(LOBÃO et al., 2012). Três gêneros conhecidos, como: Annona, Rollinia e Duguetia,
produzem frutos para consumo, sendo o gênero Annona o de maior importância
25
para a economia, podendo encontrar várias espécies, como Annona squamosa e
Annona muricata, Annona cherimola, Annona dioica (MOSCA et al., 2006).
Figura 1. Mapa de distribuição da família Annonaceae no mundo.
Fonte: Tropicos.org.
Diversas espécies, como as dos gêneros Annona, Rollinia e Duguetia, são
irrigadas em função de terem frutos comestíveis e saborosos, tais como: graviola
(Annona muricata), pinha, fruta-do-conde ou ata (Annona squamosa), biribá (Rollinia
mucosa), pindaíba (Duguetia lanceolata) e cherimóia (Annona cherimola) (PAULINO
NETO; OLIVEIRA, 2006). Muitas frutas são consumidas "in natura" e/ou utilizadas
como sucos, sorvetes e sobremesas (LORENZI; MATOS, 2002).
A catalogação da família Annonaceae foi no ano de 1789 por Jussieu
(HUTCHINSON, 1974). Esta família é constituída por árvores, arbustos, subarbustos
e lianas, com casca caracterizada fibrosa e sua madeira com grandes raios
(GALASTRI, 2008). A maioria dos frutos são considerados comestíveis, e é um tipo
de sincarpo formado pela união de numerosos carpelos sobre um receptáculo
carnoso. Os carpelos são bem divididos, principalmente na parte superior do fruto,
sua polpa é caracterizada branca, adocicada, saborosa e ligeiramente com um
aspecto ácido (FERREIRA et al., 2002).
As espécies dos gêneros Annona, Rollinia, Duguetia, Uvaria e Asimina, que
apresentam frutas de interesses comerciais, por possuírem frutos comestíveis e
26
agradáveis (NOGUEIRA et al., 2005). Além disso, muitas espécies da família
Annonaceae possuem indicações populares para importância econômica, e têm sido
pesquisadas quanto às suas atividades farmacológicas e constituintes químicos. Um
exemplo é a espécie Goniothalamus velutinus, onde a decocção das raízes é
utilizada para dores de cabeça e casos de intoxicação exógena, e suas folhas são
usadas para elaboração de repelente de mosquitos.
As plantas da família Annonaceae são utilizadas na medicina popular, como
as folhas e cascas de Anaxagorea dolichocarpa, empregadas como chás para
amenizar as dores de cabeça (MAAS et al., 1984); as folhas de Annona squamosa,
popularmente chamada de pinha, araticum, anona, ata, fruta-do-conde ou língua-de-
tucano, que são aproveitadas no tratamento de furúnculos, aftas e úlceras (SOUZA
et al., 2012); a utilização do chá das folhas de Duguetia furfuracea, identificada como
araticum-do-campo, marolinho ou ata brava, que é indicado para o tratamento de
dismenorreia (FARIAS et al., 2013).
Avaliando o perfil fitoquímico, a família Annonaceae se destaca pela presença
de vários tipos de metabólidos secundários. Na busca por dados
quimiotaxonômicos, foi caracterizado que esta família apresenta flavonoides,
alcaloides e terpenoides, principalmente diterpenos (SILVA et al., 2009). Ahmad e
colaboradores (2010) demonstraram em estudo recente a identificação de três
metabólitos secundários de relevância: uma esteril-lactona, a goniotalamina, e dois
flavonoides, naringenina e pinocembrina.
Os estudos desenvolvidos sobre atividade biológica e fitoquímica das
anonáceas estão sendo intensificados por identificarem a presença das
acetogeninas, uma classe de compostos com uma ampla atividade biológica
(MATSUMOTO et al., 2010), tais como imunossupressora, antiparasitária, citotóxica,
pesticida e antimicrobiana (LIMA et al., 2010).
Algumas espécies do gênero Annona no Brasil são muito apreciadas, como
Annona crassiflora ("araticum") (Figura 2a), Annona squamosa ("fruta do conde")
(Figura 2b) e Annona muricata ("graviola") (Figura 2c) (DUTRA et al., 2012). A
graviola (A. muricata) é a espécie mais consumida no meio da industrialização, como
na produção de polpa para várias finalidades, e seu plantio é de grande escala
comercial, principalmente na região do Nordeste brasileiro (DUTRA et al., 2012).
27
Figura 2 - Frutos de diferentes espécies de Annona: (a) Annona crassiflora, (b)
Annona squamosa e (c) Annona muricata.
(Fonte: (a) MERCADANTE, 2009; (b) BRADLEY, 2011 e (c) AGUILAR, 2005)
A região Nordeste apresenta a maior parte do cultivo das principais
anonáceas no Brasil (pinha e graviola), logo em seguida a região Sudeste. Destaca-
se o estado da Bahia com 39%, seguida por São Paulo 30% e Minas Gerais
(WATANABE et al., 2014).
Annona muricata, sua folha é utilizada para combater a diarréia e espasmos
musculares, já o uso do seu chá é utilizado para emagrecer e como medicação para
combater alguns tipos de neoplasias (BARATA et al., 2009).
Annona spinescens, conhecida como araticum-do-rio ou araticum-do-
alagadiço, utilizada no tratamento de úlceras (MAAS et al., 1984). Algumas espécies
deste gênero presentam substâncias bioativas, tendo diversas atividades, entre elas,
destaca-se sua citotoxicidade contra muitas linhagens de células tumorais,
antioxidante, atividades antimicrobiana, anti-plaquetária e ação antiparasitária
(Trypanosoma cruzi e Leishmania sp.). Tais atividades são atribuídas parcialmente à
presença de metabólitos secundários como terpenos, alcaloides e acetogeninas
(COSTA et al., 2011).
3.3. ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE ESPÉCIES DO
GÊNERO ANNONA.
No decorrer da história o homem tem usado diversas maneiras de tratamento
para o alívio da dor, entre elas, o uso das ervas medicinais devido ao seu extenso
uso popular (ALMEIDA et al., 2001). Observa-se que os mais potentes e eficazes
28
fármacos analgésicos são obtidos de plantas, como exemplo da salicinina extraída
de Salix alba e a morfina da Papaver somniferum (VEIGA-JUNIOR et al., 2005).
Existem algumas espécies do gênero Annona que possuem atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória, como a Annona squamosa L., onde é realizada a
obtenção do extrato das folhas e utilizado para o tratamento da dor no baço e
reumatismo (CHAVAN et al., 2010). Na busca dos constituintes químicos se
observou em estudos fitoquímicos, alterações entre os metabólitos secundários
presentes na decocção de folhas frescas e no extrato das folhas secas. Na
decocção é possível identificar compostos lactônicos, fenólicos, cumarinas, açúcares
redutores e aminoácidos, já no extrato foram encontrados alcaloides, flavonoides,
quinonas, compostos fenólicos, cumarinas, compostos lactônicos, antocianidinas,
aminoácidos, e açúcares redutores, porém, não foi obtido resultados de atividade
analgésica e anti-inflamatória. Os dados obtidos com a decocção das folhas frescas
aceitam validar o saber popular e gerar base científica para seu uso na medicina
popular (AMADOR et al., 2006).
Nesse contexto, Annona squamosa L. é popularmente conhecida como fruta-
do-conde, ata ou pinha. De origem das terras da América Central, foi introduzida no
Brasil pelo Conde de Miranda, o que define o nome “fruta-do-conde”. No Brasil ela é
muito cultivada, tendo um bom desenvolvimento em regiões de clima quente
(KAVATI, 1992). A polpa do fruto é adocicada, com um sabor agradável e um bom
aroma (MANICA, 1997). A pinheira é um tipo de anonácea encontrada em diversas
regiões do ecossistema brasileiro, desenvolve-se melhor em ambientes com baixa e
alta precipitação de chuvas (ROCHA et al., 2002).
Annona diversifolia Saff., é conhecida no México como "Ilama" e "Ilama
zapote", onde seus frutos são servidos como alimento, já as suas folhas são
utilizadas como agente anticonvulsivante e analgésico, bem como anti-inflamatório
na medicina tradicional mexicana. Alguns estudos reforçam a utilização das folhas
de A. diversifolia no plano terapêutico da dor e da inflamação, notando-se que seus
dados demonstraram potencial de produzir total antinocicepção no uso do modelo de
dor visceral, e redução parcialmente significativa da nocicepção artrítica
(CARBALLO et al., 2010). Diante disso, as análises apontaram a presença de
flavonoides e a participação da palmitona no seu potencial antinociceptivo.
Annona muricata L., conhecida popularmente como graviola, é encontrada
principalmente na América do Sul, América Central, incluindo algumas regiões do
29
Brasil, como: Norte, Nordeste e Sudeste. Suas folhas são usadas tradicionalmente
para dores de cabeça, diabetes, hipertensão, insônia, cistite, problemas no fígado e
também como anti-inflamatório. Entre os compostos químicos identificados nessa
espécie, destacam-se os alcaloides e os óleos essenciais, pois são os mais
utilizados na pesquisa científica.
Annona glabra, conhecida popularmente no Brasil como araticum-bravo e
araticum-do-brejo, demonstram uma grande quantidade de constituintes químicos,
como acetogeninas, alcaloides e diterpenos em extratos obtidos das cascas, caules,
folhas e frutos. Ademais, uma pesquisa demonstra que o extrato de A. glabra inibe a
migração de células de defesa, como os granulócitos, de acordo com o aumento das
doses utilizadas, apontando um potencial anti-inflamatório (SIEBRA et al., 2009).
Annona coriacea Mart., conhecida popularmente como araticum, é encontrada
em algumas regiões do Brasil, como: Sudeste, Norte e Nordeste, principalmente no
estado do Ceará. Suas folhas são utilizadas pela população por via oral, como:
estomáquica, carminativa, anti-reumática e anti-helmíntica. Além disso, o uso do
extrato etanólico das folhas dessa espécie é utilizado para o tratamento de
estomatite, nevralgias e cefaleias, pois apresentou propriedades com atividades
antinociceptiva e anti-inflamatória, através do desenvolvimento de modelos pré-
clínicos de contorções abdominais, formalina, placa quente, edema de pata e
pleurisia induzida pela carragenina, um polissacarídeo extraído de algas (SOUSA et
al., 2007).
Annona senegalensis, suas raízes e folhas são vendidas comercialmente na
Nigéria para tratamento da dor, câncer e artrite. Nesse contexto, observa-se que o
extrato metanólico da raiz tem propriedades antinociceptiva e anti-inflamatória
comprovada através de modelos de nocicepção e inflamação, justificando o seu uso
tradicional nesse país para o tratamento de reumatismo e outras doenças
relacionadas à dor (ADZU et al., 2003).
3.4. CONSIDERAÇÕES SOBRE O HÍBRIDO ATEMOIA
A atemoia trata-se de um híbrido interespecífico (OLIVEIRA et al., 2010).
(Figura 3) resultando do cruzamento entre uma espécie originária de clima tropical
de altitude A. cherimola Mill.(cherimóia) e outra de clima seco, A. squamosa L.(fruta
do conde ou ata) (PEREIRA, 2011).
30
Figura 3 - Ilustração do fruto Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.
(Fonte: Disponível em http://www.nacozinhabrasil.com/2009/07/atemoia.html).
Sabe-se que apesar do cruzamento ocorrer naturalmente entre espécies, o
cruzamento da atemoia foi intencional, com a finalidade de se ter um fruto de
qualidade como a cherimoia, e que tivesse a capacidade de se adaptar melhor ao
clima tropical (SCALOPPI-JUNIOR; MARTINS, 2003). Devido à atemoia ser um
híbrido e não uma espécie, não é correto referir-se a esta como Annona atemoia
(SANEWSKI, 1991).
A primeira realização do cruzamento artificial da atemoia ocorreu na Flórida -
USA, em 1908, já no Brasil há relatos de que, em 1950, o Instituto Agronômico de
Campinas foi quem realizou a primeira introdução deste híbrido no estado de São
Paulo, com a produção de Núcleo de Produção de Mudas em São Bento do Sapucaí
(TOKUNAGA, 2000).
A atemoia foi introduzida no Nordeste, pela primeira vez na região dos
projetos de irrigação do Vale do São Francisco na cidade de Petrolina-Pe no ano de
1997. Na classificação taxonômica das espécies, o híbrido atemoia pertence ao
gênero Annona, Subfamília: Annonoideae, Família: Annonaceae; Ordem:
Magnoliales; Classe: Dicotyledoneae; Divisão: Angiospermae e Reino: Vegetal
(MANICA, 1997) (Figura 4).
Cherimóia Ata Annona cherimola Mill. Annona squamosa L.
31
Figura 4 - Imagens do híbrido atemoia: (a) árvore, (b) flor, (c) folhas e (d) frutos.
(Fonte: Autoria própria)
Dentre os gêneros da família Annonaceae já estudados, o gênero Annona
tem se destacado por apresentar diversos tipos de alcaloides, como o
benzilisoquinolínico reticulina, anonaina, os aporfínicos asimilobina e o oxoaporfínico
liriodenina. Pesquisas recentes descreveram o isolamento de asimilobina, reticulina
e liriodenina em algumas espécies desse gênero, como em Annona pickelii (Diels)
H. Rainer, Annona foetida Mart., Annona sericea Dunal, e Annona salzmannii A.
DC., todas de origem brasileira (DUTRA et al., 2012).
Os alcaloides identificados foram encontrados em cascas e folhas de A.
crassiflora das Guianas (HOCQUEMILLER et al., 1982). O isolamento da
asimilobina, anonaina, reticulina e liriodenina, tem sido considerado indicadores
quimiotaxonômicos deste gênero para várias espécies de Annona (CRUZ et al.,
2011).
Na triagem fitoquímica de atemoia em estudos anteriores detectou a
presença de flavonoides, taninos, lignanas, mono e diterpenos em todos os extratos.
Ainda revelou, resultado positivo para presença de outros constituintes como
alcaloides, derivados antracênicos, naftoquinonas, triterpenos e esteroides
(RABELO et al., 2014). Além disso, outro estudo demonstra que foi identificado o
isolamento e a caracterização química de sete alcaloides, tais como: Asimilobina,
Pronuciferina, Lanuginosina, liriodenina, Lysicamina, Anonaina e Stepharina através
dos métodos espectrométricos (RABELO, et al., 2015).
(c)
32
3.5. CONSIDERAÇÕES SOBRE DOR E NOCICEPÇÃO
O significado da palavra “dor” no dicionário da língua portuguesa é de origem
do latim: dolore, que quer dizer sofrimento; na língua inglesa “pain” e do grego:
poiné, pena (FEIN, 2011). A definição da palavra dor é adequada exclusivamente
para seres humanos, devido à sua maneira de apresentação, ocorrendo não só o
envolvimento sensorial nociceptivo, mas também a parte emocional, integrando aos
quadros dolorosos (COUTAUX et al., 2005).
A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) descreve a dor como
uma experiência sensorial e emocional desagradável, relacionada com algum dano
tissular (WILDER-SMITH, 2007). O termo nocicepção vem do latim nocese, refere-se
ao processo sensorial desencadeado, é classificada como um componente
fisiológico da dor e correspondem aos processos de transdução, transmissão e
modulação dos estímulos dolorosos. Quando iniciado o estímulo nociceptivo, várias
alterações neuroendócrinas acontecem, ocasionando um estado de
hiperexcitabilidade do Sistema Nervoso Central (SNC) e Sistema Nervoso Periférico
(SNP).
A dor é uma consequência fisiopatológica deletéria de várias morbidades,
mas em grande parte das vezes age como um papel protetor, representando, um
dos principais sintomas para a hipótese do diagnóstico de diversas patologias
(OLIVEIRA et al., 2009). A Agência Americana de Pesquisa e Qualidade em Saúde
Pública e a Sociedade Americana de Dor apresentam como sendo o quinto sinal
vital, sendo avaliado indispensavelmente junto aos demais sinais vitais: pulso,
respiração, temperatura e pressão arterial (SOUSA, 2002).
A percepção do estímulo à dor sofre diversas influências das variáveis
biológicas, tais como: variações no SNC e nos circuitos da algia (PALMEIRA;
ASHMAWI; PASSO. 2011). Por ser considerada uma sensação complexa, há várias
classificações que podem definir os processos dolorosos em diversas etapas, de
acordo com a duração, intensidade e natureza do estímulo, entre outros aspectos.
Em relação às classificações da dor, a mais importante é que se divide em
dor aguda e crônica. A aguda é uma resposta fisiológica normal a uma ação nociva
(CARR.; GOUDAS, 1999), considerada de curta duração (menor que três meses), e
geralmente é presente apenas no período da lesão tissular, sendo representada por
uma ação fisiológica natural do organismo humano (MERSKEY, 1994). A dor crônica
33
é aquela que possui um tempo de duração maior que três meses, e está relacionada
a algum processo patológico crônico, e que causa desconforto doloroso por meses
ou anos (ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004).
Uma grande diferença entre a dor aguda e crônica é além da duração, a
incapacidade que o sistema nervoso tem em restabelecer a sua atividade neuronal
para um nível de homeostasia normal (VALE, 2000). O termo nocicepção está
relacionado ao estímulo doloroso propriamente dito, sem nenhuma relação aos
componentes emocionais, ou seja, ocorrendo a participação das vias
neuroanatômicas, assim como os receptores específicos que detectam o estímulo
lesivo e os mecanismos neurológicos envolvidos. Sendo assim, os nociceptores são
terminações nervosas livres que respondem aos estímulos nociceptivos,
identificados, quando ocorre uma lesão nos tecidos, desencadeados por uma ação
mecânica, térmica ou química (MILLAN, 2002).
Nesse contexto, se observa que alguns nociceptores são mais sensíveis a um
estímulo específico, já outros são sensíveis a diversos tipos de estímulos. Estas
estruturas de nocicepção são descritas em quatro classes: silenciosos, mecânicos,
polimodais e térmicos. Os nociceptores silenciosos são ativados na presença de
mediadores inflamatórios, estímulos químicos, respondendo a estímulos térmicos e
mecânicos somente depois de serem ativados; os nociceptores mecânicos
respondem a uma pressão, onde essa pressão pode ser intensa ou não; os
nociceptores polimodais respondem aos estímulos nocivos mecânicos, térmicos e/ou
químicos, e os térmicos respondem temperaturas, maiores que 46 °C ou menores
que 5 °C, possuindo fibras A mielinizadas. Em conjunto, os nociceptores de fibra Aδ
e β são considerados nociceptores mecanotérmicos. (FEIN, 2011).
A diferença entre dor e nocicepção, é que a dor é mais que uma sensação, é
uma vivência, podendo ter influência de componentes sensoriais pessoais,
emocionais e/ou ambientais. Dessa forma, como os animais não têm a capacidade
de expressar verbalmente os componentes subjetivos relacionados à dor (exceto
mamíferos e aves), não se pode avaliar dor, e sim nocicepção. Portanto, os termos
como analgesia e dor são atribuídos para estudos envolvendo seres humanos,
enquanto que antinocicepção e nocicepção já são mais encontrados nos estudos
pré-clínicos, com o uso de animais (KANDEL et al., 2003).
34
3.5.1. TRANSMISSÃO DA DOR E NOCICEPÇÃO
O conhecimento da fisiopatologia da dor é um importante instrumento para
ser entendido como ocorrem os mecanismos dos processos dolorosos, de origem
patológica ou fisiológica (SALIBA; HUBER; PENTER, 2011). Na dor perceptível, os
neurônios aferentes com fibras intensamente mielinizadas (10 µm) participam da
transmissão da sensação dolorosa, e apresentam uma velocidade de condução de
30-100 m/s, e são conhecidas como fibras Aβ. No entanto, grande parte dos
nociceptores está inclusa em pequenas fibras de diâmetro entre (0,4 - 1,2 μm) e de
médio diâmetro (2-6 μm), constituindo respectivamente as fibras não mielinizadas
(fibras C), e as pouco mielinizadas (fibras Aδ) (JULIUS; BASBAUM, 2001). (Figura 5)
Figura 5 - Tipos de neurônios primários sensoriais que são responsáveis pelo sinal
nociceptivo das extremidades ao SNC.
Fonte: Adaptado de Julius & Basbaum, 2001.
As fibras sensoriais nociceptivas primárias realizam sinapses com neurônios
secundários na região do corno dorsal da medula espinhal e na substância cinzenta.
Os neurônios presentes no corno dorsal mostram seus axônios e transmitem dados
nociceptivos para os centros encefálicos, contendo a formação reticular, hipotálamo
e tálamo que são responsáveis pela transmissão de sinais para o córtex através de
neurônios terciários (ALMEIDA et al., 2004).
35
Além disso, podem-se compreender três mecanismos básicos da dor: a
tradução, caracterizada pela ação ativa dos nociceptores; a transmissão, onde
envolve um conjunto de vias sensitivas e favorece o impulso nervoso para o SNC
comprometidos com a identificação da dor; e por último, a modulação, que ocorre
através do mecanismo de supressão da dor e que é ocasionado pelas vias
descendentes de nocicepção (FERNANDES; GOMES, 2011).
Após a sensação da dor nas partes superiores do encéfalo, é ativado um
sistema de antinocicepção por meio de vias inibitórias descendentes do organismo,
que vão influenciar no processo de transmissão do impulso nociceptivo dos
neurônios aferentes para o SNC. Este processo representa um processo de
restauração da homeostase (RIEDEL; NEECK, 2001).
Diversos mediadores químicos presentes na região lesionada podem
estimular os nociceptores e, portanto, estimular a dor. São diversos os mediadores
inflamatórios envolvidos, destacando-se a histamina (vasodilatador) e a bradicinina –
BK – (Figura 6). As BK atuam com receptores associados à proteína G, estimulando
uma diversidade de efeitos pró-inflamatórios, como o edema e vasodilatação
(MAYER, 2006).
A BK também estimula a ação enzimática da fosfolipase A2 que está ligada à
membrana, que provocará uma reação de desesterificação, ocasionando a formação
do ácido araquidônico e a biossíntese da prostaglandinas - PGE2 e prostaciclinas,
PGI2 - pela atuação da ciclooxigenase (COX) na via. Ademais, as PGE apresentam
um potente efeito vasodilatador e mediadores na dor inflamatória (WIENECKE,
2008).
Diante disso, além da liberação da BK e PGI ocorre o estímulo de diversos
mediadores químicos, como: serotonina, citocinas, eicosanoides e histamina, que
agem sobre os seus receptores, favorecendo a alteração do limiar nociceptivo
dessas fibras (CURY et al., 2011). A transmissão do impulso nociceptivo da medula
espinhal para o tálamo e para o córtex são por cinco vias ascendentes: os tratos
espinotalâmico, espinomesencefálico, espinoreticular, espinohipotalâmico,
cervicotalâmico (PINTO, 2000).
36
Figura 6 - Via ascendente da nocicepção da primeira conexão. Transmissão do
impulso nociceptivo para as lâminas do corno dorsal, através das fibras aferentes
primárias.
Fonte: Adaptado de NESTLER et al., 2001.
O funcionamento do corno dorsal da medula espinhal é responsável pela
transmissão da dor. Os nociceptores envolvidos chegam de forma muito organizada
ao corno da medula espinhal, através das fibras mielinizadas Aδ finalizando
principalmente nas lâminas I e V e as fibras C, e as não mielinizadas, na lâmina II.
Nestas regiões, são sinalizados os interneurônios de segunda ordem e os neurônios
de projeção na medula espinhal, alguns só são ativados quando ocorre um estímulo
nocivo e outros respondem a excitações de alta ou baixa intensidade (limiar amplo e
dinâmico). Durante a realização das conexões sinápticas envolvendo as fibras
aferentes primárias e os neurônios do corno dorsal, ocorrem à participação de
neurotransmissores como a substância P (SP) e o glutamato (GLU), sendo
responsáveis por produzir respectivamente os potenciais pós-sinápticos excitatórios
lentos e rápidos (MILLAN, 1999).
A SP está em grandes concentrações nas terminações aferentes da medula
espinhal, agindo como um intermediário da primeira sinapse da transferência
dolorosa (VELÁZQUEZ et al., 1997). Essa ação é aceita por ocorrer a sua interação
com receptores NK1 e NK2 das taquicininas (ZHANG et al., 2009). A ocorrência da
sua infusão intratecal leva os animais ao comportamento de sacudir, lamber ou
morder o membro lesionado ou administrado, ocasionando a nocicepção, e
37
indicando papel excitatório na via nociceptiva (BJÖRKMAN, 1995). Já o GLU é
considerado um aminoácido estimulatório, que pode ser localizado em quantidades
apreciáveis na medula espinhal. É produzido e liberado pelas fibras nociceptivas
primárias aferentes mielinizadas e não-mielinizadas (HEADLEY; GRILLNER, 1990).
Em diversas sinapses o glutamato e a SP são liberados juntos, porém,
aproximadamente 75% dos processos de transmissão excitatória no SNC são
desenvolvidos pela ação do glutamato (MAI, 2007).
3.6. INFLAMAÇÃO
O processo inflamatório é conhecido desde o período da antiguidade
(aproximadamente 3.000 a.C.), sendo encontrado suas características clínicas
escritas em papiros egípcios (ROBBINS et al., 2001). Seus princípios fundamentais
foram registrados pela primeira vez por Aulus Cornelius Celsus (30 a 50 a.C.), na
Roma Antiga, onde relatou os quatro sinais cardinais da inflamação: edema, rubor,
calor e dor. Além disso, a estes sinais o pesquisador Galeno (138 a 201 d.C.),
acrescentou um quinto sinal: a perda de função. Logo em seguida, com a ajuda do
microscópio o cientista Virchow pode descrever os processos fisiológicos das
células, para analisar os principais fenômenos vasculares e Metchnikoff descreveu o
processo da fagocitose (DA SILVA et al., 2003).
A inflamação é uma reação complexa que envolve componentes moleculares
e celulares. É considerada uma resposta inespecífica a um dano específico. Os
agentes responsáveis pelas agressões podem ser de origem física, química ou
biológica (ZHOU et al., 2007). Este evento pode ser visto como uma ação de defesa
do organismo, corroborando para que ocorram os processos de reparação, como a
cicatrização e a regeneração dos tecidos afetados (TIZARD, 2002).
A resposta inflamatória é um processo que consiste na liberação de
mediadores químicos e recrutamento de leucócitos que são ativados no sítio da
inflamação. Além disso, a resposta inflamatória é decorrente da liberação de
mediadores inflamatórios endógenos, como as citocinas, bradicinina e interleucinas
IL. Nesse contexto, a deposição e ativação contínua de leucócitos em uma região
são consideradas um processo de inflamatório crônico, ocasionando uma disfunção
(HANADA; YOSHIMURA, 2002).
38
Os principais elementos para o aparecimento do processo inflamatório são:
vasodilatação; aumento da permeabilidade vascular; ativação e adesão celular; e
coagulação (SAYERS, 2002). O processo da resposta inflamatória é classificado em
duas fases. A primeira fase é conhecida por fase aguda, caracterizada pela
presença de eventos vasculares, sendo observados a ocorrência da vasodilatação
local e o aumento da permeabilidade vascular; já a fase tardia é aquela que ocorre a
migração celular, com presença de leucócitos, células fagocitárias e o surgimento da
fase proliferativa crônica, na qual acontece a decomposição tecidual e o
aparecimento de fibrose (tecido avascular), podendo originar a dor através da
ativação e sensibilização dos receptores nociceptivos (LEES et al., 2004).
O processo inflamatório está relacionado à ação de vários mediadores
químicos, podendo ser de origem tissular, como o fator de ativação plaquetária
(PAF), as aminas vasoativas, eicosanoides, radicais livres superóxidos, citocinas,
óxido nítrico (NO) e neuropeptídios (RANG et al., 2007). Esses mediadores da
inflamação, portanto, são substâncias sintetizadas e liberadas, intermitente ou
sequencialmente, no local da lesão. Os mediadores estão sempre envolvidos na
gênese, manutenção dos eventos da reação inflamatória e se vinculam a receptores
específicos das células-alvos ocasionando a possível liberação de outros
mediadores (ZHOU et al., 2007).
Além disso, existem as citocinas liberadas no momento da lesão, e também o
fator de necrose tumoral (TNFα) que estimula a liberação de outras citocinas,
destacando-se a interleucina 8 (IL-8) e a interleucina 1-beta (IL-1β). A IL-8 atua no
processo de liberação local de aminas simpatomiméticas, enquanto a IL-1β causa a
ativação da enzima cicloxigenase (COX) responsável pela produção de
prostaglandinas - PGs, prostaciclinas - PIs e tromboxanos – TXs (VERRI et al.,
2006) (Figura 7).
39
Figura 7 - Processo de liberação de mediadores por diferentes estímulos como carragenina (Cg) ou antígenos (Ag).
(Adaptado de VERRI et al., 2006).
Vale salientar que o TNF-α e a IL-1 dividem diversas propriedades biológicas.
Ambos são produzidos por células de defesa, como os macrófagos ativados e a IL-1
por vários outros tipos celulares e seus efeitos podem ser no local da infecção ou
sistematicamente, estimulando as células alvo a produzirem e liberar inúmeros
mediadores que participaram do processo da resposta inflamatória. Além disso,
estimula a hematopoiese, proporcionando o crescimento e diferenciação das células
de defesa, como: linfócito B e exposição de antígenos aos linfócitos T (BALKWILL et
al., 2001).
A produção exagerada de TNFα e IL-1β, pode induz a um quadro de
leucocitose devido um aumento da produção na medula óssea de células pós-
mitóticas, porém, em alguns quadros infecciosos o sistema imune encontra-se
sobrecarregado ocorrendo uma leucopenia, um exemplo é a febre tifoide (ROBBINS
et al., 2001).
Ademais, em decorrência de uma variedade de estímulos, o ácido
araquidônico (AA) é sintetizado na membrana a partir da ação das fosfolipases
liberadas - sPLA2 - ou citoplasmáticas - cPLA2 -, já as fosfolipases C podem estar
relacionadas a estas funções, mas, em menor grau (RAO et al., 2008). O AA livre
pode ser metabolizado, e formar vários mediadores lipídicos conhecidos no geral
como eicosanoides através da via das lipoxigenases e ciclooxigenases (RANG et al.,
2007) (Figura 8).
IL-8 IL-1β/ IL-6
40
Figura 8 - Mapa conceitual resumido dos mediadores derivados de fosfolipídios e suas ações, com os locais de ação de agentes anti-inflamatórios.
Fonte: (RANG et al., 2007).
Diante disso, se observa que tem a participação da via da ciclooxigenase que
é formada por duas enzimas: COX-1, responsável pela formação basal de
protaglandinas – PGs – responsáveis pela manutenção da função homeostática, já a
(COX-2) é fundamental na síntese de PGs que é induzida por estímulos
inflamatórios e em alguns tecidos, como o cardíaco e o renal que presentam da
COX-2 relacionado fortemente com os efeitos adversos gerados pelos AINES
seletivos (RAO et al., 2008).
Da atuação destas enzimas, é visto que ocorre também a síntese de
tromboxanos. Ademais, a via das lipooxigenases está incluída a produção de
leucotrienos. O LTB4 é o principal tipo de leucotrienos, pois ocorre o seu
envolvimento no processo inflamatório. Exerce uma forte atividade quimiotática
(quimiotaxia) para os leucócitos, monócitos e eosinófilos desencadeando a migração
destas células para o local lesionado (COUTINHO et al., 2009).
Ácido Araquidônico
41
Os AINES são formados por uma importante classe de fármacos com a
finalidade terapêutica que vem sendo desenvolvida pela pesquisa científica.
Após o século 17 na Alemanha a companhia Kolbe iniciou a pesquisa sobre o
composto ativo da salicina, extraído das cascas do tronco do salgueiro (Salix alba,
Salicaceae) na Europa. Sendo assim, com o desenvolvimento da pesquisa foi
iniciado a produção do ácido salicílico no ano de 1860. O ácido acetilsalicílico foi
introduzido no mercado pela indústria Bayer em 1893, motivado pelo químico
alemão Felix Hoffman. Então pode-se afirmar que a Aspirina® é o AINE mais antigo
da história farmacêutica (RAO et al., 2008).
No grupo dos fármacos AINES, incluem uma variedade de agentes e em
geral, atuam na inibição da ação da COX e no processo de produção de
tromboxanos, leucotrienos e prostaglandinas (CARVALHO, 2004; RANG et al.,
2007). Vale salientar, que os AINES tradicionais agem de forma não-seletiva inibindo
ambas as isoformas da clooxigenase, destacando-se a Aspirina® e a indometacina.
Os AINES inibem ambas as enzimas e estimulam o aparecimento de efeitos
adversos, como: alterações renais, sangramento gastrintestinal e nos mecanismos
de homeostase, decorrente da inibição da ação da prostaglandina E2 sintetase.
Diante dessas alterações, decorrentes da inibição da enzima COX-1, foram
desenvolvidos pesquisas com o intuito de desenvolver inibidores mais seletivos, o
que propôs no surgimento de drogas com ação mais seletivas para COX-2
(SCHOLICH & GEISSLINGER, 2006).
Ao ser descoberto os inibidores seletivos para COX-2, foram identificados
vários efeitos adversos renais e cardiovasculares, e em altas doses, efeitos
gastrointestinais (úlceras pépticas). Estudos demonstram que os inibidores seletivos
para COX-2 podem desfazer o equilíbrio natural entre tromboxano A2 prótrombótico
e prostaciclina anti-trobótica favorecendo o aumento do seu potencial e um possível
evento trombótico cardiovascular (SOLOMON et al., 2004).
42
Figura 9 - Esquematização de uma resposta inflamatória.
Fonte: (Gilroy; Lawrence, 2008)
Esses por sua vez, são responsáveis pelos eventos vasculares, permitindo
assim a vasodilatação, a estase vascular e o aumento da permeabilidade capilar;
garantindo ainda a migração de leucócitos da circulação para o tecido inflamado e
coordenando as múltiplas respostas de defesa local. Alguns desses mediadores
apresentam a capacidade de estimular neurônios sensoriais locais, contribuindo
para o surgimento da nocicepção (ROTH et al., 2009).
Por isso, existem situações em que a resposta inflamatória se torna mais
intensa, ocasionando sérios danos aos tecidos e/ou órgãos. Sendo necessário um
melhor tratamento para o possível processo inflamatório ou doloroso, através de
extratos desenvolvidos em pesquisas científicas que visam proporcionar uma melhor
qualidade de vida para população susceptível a possíveis patologias. Diante disso,
portanto, a grande parte dos AINES disponíveis no comércio possuem efeitos
indesejáveis, sendo assim é de suma importância a pesquisa por novas moléculas,
com um melhor perfil de segurança na formulação de novos medicamentos anti-
inflamatórios.
43
4- PARTE EXPERIMENTAL
44
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO
As folhas de atemoia foram coletadas no mês de abril de 2014, no Perímetro
Irrigado Senador Nilo Coelho, Núcleo IV, em Petrolina-PE (Coordenadas: 9°20‟30,4”
S e 40°40‟42,1” W), Pernambuco, Brasil. A identidade botânica da planta foi
confirmada pelo professor José Alves de Siqueira Filho e uma exsicata (16310)
(Figura 10) encontra-se depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da
Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF).
Figura 10 - Exsicata da atemoia (Annona cherimola Mill x Annona squamosa L).
Fonte: Herbário da UNIVASF - HVASF
A autenticidade da espécie foi feita por comparação com a exsicata 16310,
depositada no HVASF.
45
4.2. OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE
ATEMOIA (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.)
As folhas foram submetidas à secagem em estufa com circulação de ar à
temperatura de 45 ºC durante três dias. Após a secagem e completa estabilização
(eliminação de água, inativação de enzimas, etc.) as folhas foram pulverizadas em
moinho, obtendo-se um material vegetal seco e pulverizado (575,2 g). Este material
seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva com etanol em um
percolador. Foram realizadas seis extrações com intervalos de 72 horas entre cada
extração. A solução foi tratada com Na2SO4 (sulfato de sódio anidro P.A.) filtrada e
concentrada no evaporador rotatório a uma temperatura de 50 ºC sob vácuo. Após
evaporação do solvente em rota-evaporador, obteve-se o extrato etanólico bruto de
atemoia - Acs- EtOH-. A partir de 575,2 g do pó seco das folhas foram obtidos 214 g
do extrato etanólico bruto (37,20% de rendimento em relação ao peso seco da
planta) (Figura 11).
Figura 11 - Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia.
(Fonte: Autoria própria)
46
4.3. ANIMAIS
Para realização dos testes farmacológicos foram utilizados 238
camundongos, machos, albinos, (25-35 gramas), e 20 ratos albinos Wistar (Rattus
novergicus) pesando 200-250 g (10 machos e 10 fêmeas) todos provenientes do
Biotério Setorial da UNIVASF. Os animais foram aleatoriamente colocados em
gaiolas adequadas de polipropileno forradas com serragem e mantidos a uma
temperatura constante de 22 ± 2 °C num ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas às
06:00 h e apagadas às 18:00 h) com livre acesso à ração e água. Os animais foram
privados de ração 12 horas antes dos experimentos ou de acordo com o protocolo
exigido e 48 horas antes do experimento foram transferidos do Biotério para o
Laboratório de Fisiologia para adaptação. Durante o período, os animais foram
manipulados apenas para limpeza das caixas. Todos os procedimentos foram
conduzidos de acordo com os princípios éticos na experimentação animal, sendo
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade
Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF sob o número 0003/110414.
4.4. ESTUDO DA TOXICIDADE AGUDA
O estudo da toxicidade aguda de Acs-EtOH, foi procedido em ratos albinos
wistar por gavagem. Para tanto, foram constituídos quatro grupos 5 animais (5
machos e 5 fêmeas) (n=20) que receberam o extrato na dose única de 2.000 mg/kg
por v.o., preconizada pelas normas da ANVISA/2013 (ANVISA, 2013) e o grupo
controle recebeu veículo salina (S.F. 0,9 %) v.o.. Após a administração e durante os
14 dias, os animais foram observados quanto à presença de sinais de toxicidade e
morte. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno durante os 14 dias
para avaliar a presença de morte e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais
como: peso corporal, consumo de ração e água foram avaliados diariamente,
durante todo o estudo.
47
4.4.1 ANÁLISE COMPORTAMENTAL
A análise comportamental foi realizada avaliado alguns parâmetros
específicos (ptose palpebral, contorções abdominais, convulsões, tremores, paralisia
das patas dianteiras, sedação, ambulação aumentada, resposta ao toque diminuída,
agressividade e analgesia), após a administração de Acs-EtOH. No primeiro dia, tais
parâmetros foram avaliados nos tempos de 0,5; 1, 2, 3 e 4 h após administração do
extrato. Nos demais dias, a avaliação comportamental foi feita diariamente até o
último dia da toxicidade aguda seguindo metodologia descrita por Almeida et al.
(1999) (ANEXO B).
4.5. TESTES DE ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
4.5.1. TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO
ACÉTICO
Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Collier et al.
(1968) com modificações. Os camundongos foram separados em 6 grupos de 6
animais (n=36). Os animais foram tratados com Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg), e
com veículo (salina) administrados por via oral (v.o.) 1 hora antes do agente
nociceptivo. A nocicepção foi induzida por ácido acético 0,9 % via intraperitoneal
(i.p.) em um volume de 0,1 mL/10 g.
Já o AAS (200 mg/kg) e a morfina (10 mg/kg) foram usados como drogas
padrão, sendo administradas por i.p. 30 minutos antes do agente indutor da dor.
Após a injeção do ácido acético, (uma resposta que induz a contração da parede
abdominal, rotatividade pélvica, seguida de extensão dos membros posteriores), foi
registrado o número de contorções abdominais produzidas pelo animal durante o
intervalo de 5 - 15 min após administração do ácido (QUEIROZ et al., 2010).
48
4.5.2. TESTE DA FORMALINA
O método usado foi similar ao descrito por Hunskaar & Hole (1987). Os
camundongos foram separados em 6 grupos de 6 animais (n=36). A solução de
formalina (2,5% em salina 0,9%) foi administrada por via subplantar na pata
posterior direita, em um volume de 20 μL/pata (SANTOS et al., 2010). Os
camundongos foram observados em uma câmara com um espelho montado em três
lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em segundos) gasto lambendo e
mordendo a pata injetada foi medido como um indicador de dor.
Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira fase, dor
neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda fase, dor
inflamatória). Os animais receberam veículo (salina, v.o.), Acs-EtOH (25, 50 e 100
mg/kg, v.o.), AAS (200 mg/kg, i.p.) e morfina (10 mg/kg, i.p.), administrados 30
minutos antes da injeção de formalina (n= 6 por grupo).
4.5.3. TESTE DA PLACA QUENTE
Os camundongos foram divididos em 5 grupos de 6 animais (n=30). Esses
foram pré-selecionados no aparelho de placa quente (Insight, Brasil), na temperatura
de 55 ± 0,5 °C. Animais que apresentaram um tempo de reação (definido como
latência para levantar ou lamber as patas) maior que dez segundos foram excluídos.
Os camundongos selecionados foram pré-tratados com veículo (salina – v.o.), Acs-
EtOH (25, 50, 100 mg/kg, v.o.), e morfina (10 mg/kg, i.p.).
Cada animal foi colocado sobre a placa quente mantida a 55 ºC e a latência
foi medida em 30, 60, 90 e 120 min após a administração do veículo, extrato ou
morfina (ALMEIDA et al., 2011). Um tempo de corte de 20 segundos foi escolhido
para indicar completa analgesia e para proteger de dando tecidual. O tempo de
latência foi medido para cada animal.
49
4.6. TESTE DE COORDENAÇÃO MOTORA
4.6.1. TESTE DA BARRA GIRATÓRIA (ROTA-ROD)
O método utilizado nesse teste foi proposto por Dunham e Miya (1957). O
aparelho do rota-rod (Insight, Brasil) é constituído de uma barra, subdividida em
quatro compartimentos. Nesse teste o animal é colocado sobre uma barra giratória
com velocidade (7 RPM) constante por 180 s verificando a capacidade do animal em
se equilibrar sobre ela. Esse teste permite avaliar se os tratamentos promovem
incoordenação motora nos animais por sedação e/ou relaxamento muscular (LAPA
et al, 2003).
O parâmetro avaliado no rota-rod é o tempo em que o animal permanece
sobre a barra giratória, pois, quanto mais intenso for o efeito depressor, menor será
o tempo em que o animal consegue se equilibrar sobre a barra. Os animais foram
pré-selecionados antes do teste (24 horas) escolhendo aqueles que permanecerem
na barra por 60 segundos em pelo menos uma das três tentativas (ALMEIDA, 2006).
Cinco grupos de seis animais (n=30) receberam veículo (salina), diazepam
(2,5 mg/kg) e Acs-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg em relação ao peso dos
animais. O extrato foi administrado por (v.o.) assim como a droga de referência 30
minutos antes da observação.
Após a administração, os animais foram colocados individualmente na barra
giratória (sentido contrário ao movimento da barra) e registrados os tempos de
permanência dos animais na barra (SANTOS-JUNIOR et al., 2005). Os animais
foram em seguida observados em diferentes intervalos de tempo (30, 60 e 120
minutos) após os pré-tratamentos.
4.7. TESTES DE ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
4.7.1. MIGRAÇÃO DE LEUCÓCITOS NA CAVIDADE PERITONEAL
Os camundongos foram divididos em 6 grupos de 6 animais cada (n=30). A
migração leucocitária foi induzida por injeção de carragenina (1%, i.p., 0,25 mL)
(ANDRADE et al., 2012) na cavidade intraperitoneal 1 hora depois da administração
de Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e veículo (salina). Para a Dexametasona (2
50
mg/kg, i.p.) (BASTOS et al., 2007). A migração de leucócitos foi avaliada 4 horas
após o estímulo, sendo os animais eutanasiados e as células coletadas da cavidade
peritoneal 3 mL de solução salina contendo 1 mM de EDTA. Imediatamente, uma
breve massagem foi realizada, e em seguida coletado o fluido peritoneal, que foi
centrifugado (3.000 rpm por 5 min) em temperatura ambiente. O sobrenadante foi
descartado e 300 µL de EDTA adicionados ao precipitado, do qual foi retirada uma
alíquota de 10 µL. Foi adicionado 200 µL de solução de Turk à alíquota, e o total de
células foram contadas em uma câmara de Neubauer, em um microscópio óptico.
Os resultados foram expressos como números de leucócitos/mL (neutrófilos) (MELO
et al., 2011). A droga de referência dexametasona (2 mg/kg, i.p.) foi utilizada para o
controle positivo.
4.7.2. MODELO DE INFLAMAÇÃO NA BOLSA DE AR
O modelo de inflamação na bolsa de ar foi realizado de acordo com Garcia
Ramallo et al. (2002), porém, com algumas adaptações. Os camundongos foram
separados em 6 grupos de 6 animais (n=36). No dia 0, os animais foram separados
por grupo e receberam uma injeção subcutânea de 10 mL de ar estéril no dorso. No
dia 3, uma nova injeção de 5 mL de ar estéril dentro da bolsa pré-formada foi
realizada. No sétimo dia, os animais foram tratados, com: veículo (S.F 0,9%, v.o.),
Dexametasona (2 mg/kg, s.c.), Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) uma hora antes
da injeção de 0,25 mL de uma suspensão 0,1% de Cg no interior da cavidade). Após
quatro horas do estímulo inflamatório, os animais foram eutanasiados e a bolsa foi
lavada com 2 mL de PBS heparinizado (10 UI/mL). Com o auxílio de uma pipeta a
secreção foi coletada, através de uma incisão na bolsa na região dorsal, e em
seguida passada por um processo de centrifugação.
Além disso, uma porção do lavado foi diluído na solução de Türk (1:20) e
submetido à contagem. O número de células totais no lavado foi determinado
através de contagem com ajuda da câmara de Neubauer (sob microscopia óptica).
51
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todos os resultados foram apresentados como a média ± E.P.M (erro padrão
da média) e a significância estatística entre os grupos foram calculadas pela
aplicação de uma análise de variância (ANOVA one-way), seguido pelos pós testes
de Tukey e teste T student conforme exigido pelo protocolo foram considerados
significativos as diferenças com (*p < 0,05). A análise foi realizada usando o
programa GraphPad Prism por 5.0 (Graph PadPrism Software Inc., San Diego, CA,
EUA).
Para calcular os percentuais de inibição na análise dos dados, foi utilizada a
fórmula:
C = Média aritimética do grupo controle negativo.
E = Média aritimética do grupo tratado.
C – E x 100 = % C
52
5- RESULTADOS/ DISCUSSÃO
53
5. RESULTADOS
5.1. TOXICIDADE AGUDA DE ATEMOIA
A administração do Acs-EtOH de atemoia na dose única de 2.000 mg/kg, por
via oral não ocasionou óbitos, indicando uma baixa toxicidade do extrato bruto. Em
relação ao peso corporal, consumo de água e ração monitorados diariamente, não
apresentaram diferenças estatísticas quando comparados com o grupo controle.
Durante os dias do teste de toxicidade aguda não ocorreram alterações
comportamentais e fisiológicas, nem sinais de toxicidade conforme o protocolo de
Almeida (1999).
5.2. CONSUMO DE RAÇÃO E ÁGUA
O consumo de ração e água pelos camundongos tratados com Acs-EtOH não
sofreu alterações significativas. A quantidade de ração consumida no final do
experimento pelas fêmeas foi de 81,36 ± 3,36 g e os machos 92,93 ± 0,88 g para o
grupo controle, e de 79,21 ± 5,38 g e 92,64 ± 1,02 g para o grupo tratado com a
dose de 2.000 mg/kg (Figura 18). A quantidade de água consumida no final do
experimento pelas fêmeas foi de 130,7 ± 3,05 mL e os machos 144,6 ± 1,69 mL para
o grupo controle, e a do grupo de fêmeas e machos tratados com a dose de 2.000
mg/kg foi de 136,6 ± 2,54 mL e 144,6 ± 2,12 mL (Figura 12).
54
Figura 12 - Dados do consumo de ração dos animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% grupo controle negativo (n= 5 por grupo) durante 14 dias. (F= Fêmeas / M= Machos)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
50
100
150
Controle F
Acs-EtOH F
Fêmeas
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de r
ação
(g
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1480
85
90
95
100
Controle M
Acs-EtOH M
Machos
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de r
ação
(g
)
55
Figura 13 - Dados do consumo de água dos animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% grupo controle negativo (n= 5 por grupo) durante 14 dias.(F= Fêmeas / M= Machos)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
100
120
140
160
180Controle F
Acs-EtOH F
Fêmeas
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de á
gu
a (
mL
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14110
120
130
140
150
160
Controle M
Acs-EtOH M
Machos
Tempo (dias)
Co
nsu
mo
de á
gu
a (
mL
)
56
5.3. VARIAÇÃO DO PESO CORPORAL
Não ocorreram mudanças significativas relacionadas ao peso corporal dos
ratos do grupo tratado com o extrato na dose de 2.000 mg/kg, (v.o.) e o grupo
controle a partir do dia 1 ao dia 14. No final do experimento a média do grupo
controle foi de 283,7 ± 1,16 g, enquanto que a do grupo tratado com a dose foi de
268,8 ± 2,22 g.
A variação do peso corporal ao longo do experimento pode ser vista na Figura
14, abaixo.
Figura 14 - Peso dos animais tratados com Acs-EtOH 2.000 mg/kg e salina (dose
única) durante 14 dias.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14220
240
260
280
300
320
Controle
Acs- EtOH
Tempo (dias)
Peso
co
rpo
ral
do
s a
nim
ais
(g
)
5.4. ANÁLISE MACROSCÓPICA E PESO DOS ÓRGÃOS
Na análise macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Acs-
EtOH 2.000 mg/kg, apresentou o pulmão e fígado com aspecto hemorrágico e nos
demais, não ocorreram alterações. Diferenças estatísticas nos pesos dos órgãos
quando comparados com o grupo controle não foram encontradas. (Tabela 1).
57
Tabela 1. Peso dos órgãos dos animais tratados com extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 2.000 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% no controle negativo) (n= 5 por grupo) durante 14 dias.
Parâmetros Grupos
Controle Acs-EtOH 2.000 mg/kg
Coração (g)
Pulmão (g)
Fígado (g)
Estômago (g)
Rim (g)
Baço (g)
Pâncreas (g)
0,96 ± 0,05
1,77 ± 0,11
10,78 ± 0,78
1,55 ± 0,06
1,41 ± 0,10
0,73 ± 0,02
0,85 ± 0,08
1,02 ± 0,06
1,62 ± 0,12
11,41 ± 0,83
1,41 ± 0,06
1,39 ± 0,08
0,68 ± 0,03
0,80 ± 0,13
Valores são expressos em média ± E.P.M. Teste t de Student *p< 0,05.
5.5. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO EXTRATO DE ATEMOIA
5.5.1. TESTE DAS CONTORÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR ÁCIDO
ACÉTICO
Os resultados na figura 15 demonstram que o Acs-EtOH nas doses 25, 50 e
100 mg/kg (v.o.) inibiu as contorções induzidas por ácido acético quando comparado
com grupo controle (***p<0,001). As porcentagens de inibição foram de 42,14; 48,88
e 63,48%, respectivamente. Ácido acetilsalicílico (AAS) e morfina apresentaram
91,23 e 100%, respectivamente, de redução de contorções quando comparados com
o controle.
58
Figura 15 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), AAS (200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste de contorções abdominais. Valores são expressos em média ± E.P.M, n = 6. (***p < 0,001) significativamente diferente do grupo controle (ANOVA one-way seguido pelo teste de Tukey).
Controle 25 50 100 AAS Morfina
0
10
20
30
40
Acs-EtOH (mg/kg)
******
*********
******
Nº
de c
on
torç
ões
5.5.2. TESTE DA FORMALINA
O tratamento com Acs-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) produziu
uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas
as fases (*p<0,05) (Figura 16). Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) reduziu em
56,71; 64,35 e 50,09%, respectivamente, o tempo de lambida da pata na primeira
fase, bem como em 47,58; 77,79% e 73,41, respectivamente, na segunda fase do
teste da formalina. A droga de referência a AAS (200 mg/kg, i.p.) teve mais ação na
segunda fase do teste, enquanto que a morfina inibe ambas as fases do estímulo da
dor (*p<0,05).
Houve diferença significativa na estatística na primeira fase (*p<0,05), entre
as doses de 25 e 100 mg/kg, tendo em vista que a dose de 50 mg/kg apresentou um
melhor efeito antinociceptivo. Além disso, na segunda fase apresentou maior
diferença estatística (*p<0,05) nas doses de 50 e 100 mg/kg do Acs-EtOH quando
comparadas a primeira fase, tendo em vista que estas doses apresentaram uma
possível atividade anti-inflamatória na segunda fase.
59
Figura 16 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), AAS (200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste da formalina. Valores são expressos em média ± E.P.M, n = 6. (*** p< 0,001, ** p<0,01) significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
1ª Fase
Controle 25 50 100 AAS Morfina0
20
40
60
80
100
Asc- EtOH (mg/Kg)
**
***
**
******T
em
po
de l
am
bid
a (
s)
2ª Fase
Controle 25 50 100 AAS Morfina0
50
100
150
200
Asc- EtOH (mg/Kg)
***
*** ******
***
Tem
po
de l
am
bid
a (
s)
60
5.5.3. TESTE DA PLACA QUENTE
No teste da placa quente, os animais tratados com morfina (10 mg/kg, i.p.)
demonstraram um aumento evidente no tempo de latência em 30, 60, 90 e 120 min
(*p<0,05). Já os grupos tratados com Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.)
mostraram um aumento na latência no tempo de 60 e 90 minutos, sendo observado
também que ocorreu um amento do tempo de latência em todos os tempos quando
comparado ao grupo controle (Figura 17).
Figura 17 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos em média ± E.P.M., n = 6. (*p< 0,05) significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).
30 60 90 1200
5
10
15
20
Controle
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
* ***
***
*
*****
***
*
***
Tempo (min)
Latê
ncia
(s)
5.6. TESTE DA BARRA GIRATÓRIA (ROTA-ROD)
O parâmetro analisado foi o tempo em que o animal permanecia na barra
giratória, durante 180 s, a uma velocidade constante, em três intervalos (0,5; 1 e 2
horas) após a administração de Acs-EtOH nas doses determinadas (25, 50 e 100
mg/kg, v.o). Os resultados mostram que não houve nenhuma alteração no
parâmetro analisado, logo, não ocorreu comprometimento da coordenação motora e
musculatura esquelética (Figura 18).
61
Figura 18 - Efeito do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH) e diazepam no teste rota-rod. Valores são expressos como média ± E.P.M.; n = 6. (*p<0,05) significantemente diferente do grupo controle; (ANOVA one-way seguido do teste de Tukey).
0
50
100
150
200
Controle
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Diazepam 2,5 mg/kg
0,5h 1 h 2 h
* **
***
Tem
po
so
bre
a b
arr
a g
irató
ria (
s)
5.7. ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO DE ATEMOIA
5.7.1. MIGRAÇÃO DE LEUCÓCITOS NA CAVIDADE PERITONEAL - PERITONITE
O Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) foi administrado 1 h antes da injeção
de carragenina (1%, i.p., 0,25 mL) com a hipótese de inibir a migração de leucócitos
quando comparado ao grupo controle (Figura. 19). A droga de referência
dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução significante na migração
de leucócitos. O efeito inibitório da Acs-EtOH na migração de leucócitos para a
cavidade peritoneal foi de 35,40 %; 46,20 % e 63,85 % nas doses de 25 , 50 e 100
mg/kg, enquanto o efeito inibidor da dexametasona foi 89,55%.
62
Figura 19 - Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-
EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), e dexametasona (2 mg/kg) no ensaio migração de leucócitos induzido por carragenina na cavidade peritoneal de camundongos. Valores são expressos em média ± E.P.M., n = 6. (* p< 0,05, *** p< 0,001) significativamente diferente do grupo controle (ANOVA one-way, seguido pelo teste de Tukey).
Controle 25 50 100 Dexa
0
10
20
30
40
Asc-EtOH (mg/kg)
*
***
***
***Leu
có
cit
os x
10
6 /
mL
5.7.2. TESTE DE BOLSA DE AR
O teste de bolsa de ar demonstra que os leucócitos têm papel eficaz na
defesa contra organismos estranhos, e também em processos relacionados com a
resposta inflamatória, devido à viabilidade das células e/ou tecidos lesionados. O
efeito inibitório Acs-EtOH na migração de leucócitos para a bolsa de ar foi de 56,17;
62,04 e 73,16 % nas doses de 25 , 50 e 100 mg/kg, enquanto o efeito inibidor da
dexametasona foi 88,15% (Figura 20).
Figura 20 - Efeito do extrato etanólico bruto das folhas de Atemoia (Acs-EtOH) e
dexametasona (2 mg/kg) na migração de leucócitos na bolsa de ar induzida por carragenina em camundongos. Os valores são média ± E.P.M.; n = 6 (*** p< 0,001), significativamente quando comparado ao grupo controle; (ANOVA one-way seguida do teste de Tukey).
0
10
20
30
40
******
***
***
Controle 25 50 100 Dexa
Acs-EtOH (mg/kg)
Leu
có
cit
os x
10
6 /
mL
63
5.8. DISCUSSÃO
De forma inédita na literatura, os dados reportados nesse estudo demonstram
que o extrato etanólico bruto das folhas de atemoia, apresenta um perfil de resposta
antinociceptiva e anti-inflamatória frente a distintos testes que utilizam estímulos
dolorosos, térmicos e químicos.
Esse padrão de atividade possivelmente está relacionado com a variedade
de constituintes químicos que já foram identificados na análise fitoquímica do extrato
em estudos anteriores, geralmente atribuídas à presença de metabólitos
secundários como alcaloides, acetogeninas e terpenos (COSTA et al., 2011).
Embora seja diverso o uso de plantas medicinais para a profilaxia de várias
patologias, poucos estudos científicos exploram a toxicidade e segurança da
utilização desses recursos terapêuticos (JOTHY et al., 2011).
Para a segurança dos medicamentos e dos produtos vegetais no uso
humano, é necessário o desenvolvimento de estudos experimentais para prever a
toxicidade e fornecer diretrizes para a seleção de uma dose segura. A maior
concordância geral de toxicidade em animais, com o ser humano, são alterações
hematológicas, gastrointestinais e cardiovasculares (OLSON et al., 2000).
Diante disso, o presente estudo mostra que o extrato etanólico bruto das
folhas de atemoia administrado por via oral na dose de 2.000 mg/kg dose única e
avaliado por 14 dias, não provocou sinais de toxicidade e morte nos animais,
demonstrando uma baixa toxicidade do extrato. Além disso, foi avaliado se ocorreu
alteração no peso corporal, uma vez que as alterações no peso corporal têm sido
utilizadas como um indicador de efeitos adversos de fármacos e produtos químicos
(RAZA et al., 2002, TEO et al., 2002). Todos os dias foi realizada a verificação do
peso corporal, não ocorrendo diferença estatística quando comparado com o grupo
controle. Além disso, não ocorreram alterações significativas no consumo de água e
ração nos grupos tratados quando comparados ao controle. Na toxicidade de dose
única são observados os possíveis efeitos comportamentais, tais como: ambulação
aumentada, agressividade, tremores, resposta ao toque diminuída, ptose palpebral,
resposta ao toque diminuída e sedação, como possíveis sinais de toxicidade
(ALMEIDA, 2006); não sendo identificados nos grupos estudados.
Na análise macroscópica dos órgãos dissecados, foi observado que apenas
um animal tratado com Acs-EtOH, apresentou o pulmão e fígado com aspecto
64
hemorrágico (petéquias), fato que possivelmente não foi referente à dose
administrada, devido a não incidência na avaliação dos demais animais. Não houve
diferença significativa nos pesos dos órgãos quando comparada ao controle. Sendo
assim, o estudo de toxicidade aguda indica baixa toxicidade do extrato Acs-EtOH,
porém, é necessário o aperfeiçoamento de estudos posteriores com diferentes
metodologias, para determinar um melhor perfil de segurança desse extrato.
Para avaliar a atividade antinociceptiva do extrato, foi realizado o teste de
contorções abdominais induzidas por ácido acético, que tem sido utilizado como um
modelo clássico para avaliar o possível potencial antinociceptivo de novos agentes
analgésicos (MOHAMAD et al., 2010). Desta forma, esse ensaio configura-se como
um modelo não seletivo para avaliação do efeito antinociceptivo de substâncias,
extratos vegetais ou outros possíveis produtos de origem natural, sendo necessário
o desenvolvimento de outros testes que confirmem o potencial antinociceptivo.
O extrato etanólico (Acs-EtOH) reduziu significativamente o número de
contorções abdominais provocadas pela aplicação do ácido acético na região
intraperitoneal. Portanto, quando os animais foram previamente tratados com 25, 50
e 100 mg/kg de Acs-EtOH, o número de contorções foi reduzido de maneira
significante. Desta maneira pode-se sugerir que Acs-EtOH nas doses supracitadas
provavelmente apresentam agentes antinociceptivos neste ensaio experimental. A
administração intraperitoneal de uma solução de ácido acético induzirá à liberação
e/ou produção de vários mediadores envolvidos no processo de resposta
inflamatória aguda e de neurotransmissão álgica, conhecidos por: substância P,
prostaglandinas (em especial, PGI2), bradicinina, citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-
6, IL-8 ou TNF-α), entre outros. Esses neurotransmissores acabam estimulando de
forma direta os neurônios sensitivos e os nociceptores periféricos, possibilitando
assim a transmissão do potencial de ação de uma célula para outra, caracterizando
a sensação de dor (LE BARS et al., 2001).
Como critério para melhor análise do possível efeito analgésico, foi realizado
o teste da formalina, que é um método de avaliação utilizado para mensurar a
efetividade comportamental de agentes antinociceptivos (RANDOLPH; PETERS,
1997). A importância desse método em relação aos outros é a maior possibilidade
de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo,
permitindo avaliar agentes antinociceptivos com diferentes mecanismos de ação (LE
BARS et al., 2001).
65
As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico
composto de uma fase inicial aguda (primeira fase – neurogênica) que dura alguns
minutos e reflete o componente de nocicepção, sendo produzida principalmente pelo
uso de analgésicos opioides, e por um período mais prolongado (segunda fase-
inflamatória), que pode durar até cerca de uma hora. O período entre as fases é
denominado intervalo de quiescência (MARTINS et al., 2006). As substâncias que
atuam eminentemente por mecanismos centrais, como os analgésicos opioides,
reduzem a nocicepção em ambas as fases. Por outro lado, substâncias que atuam
por mecanismos periféricos, como os anti-inflamatórios não esteroides – AINES-,
reduzem, em geral, a nocicepção durante a segunda fase do teste. Diante disso,
Acs-EtOH foi capaz de diminuir a nocicepção em ambas as fases no teste da
formalina, embora esse efeito tenha sido mais proeminente na segunda fase do
teste, sugerindo assim, uma possível atividade anti-inflamatória.
Consequentemente, com a finalidade de comprovar o envolvimento de
mecanismos centrais no efeito antinociceptivo de Acs-EtOH, foi realizado o teste da
placa quente. Assim, analisando os resultados apresentados na Figura 25, foi
observado que Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) aumenta o tempo de latência
dos animais sobre a placa metálica previamente aquecida em determinados
períodos de tempo, fornecendo evidências de ação central, uma vez que esse
padrão de resposta trata-se de um reflexo predominantemente espinal, sendo
considerado, portanto, um modelo de avaliação da ação central de drogas
analgésicas (NEMIROVSKY et al., 2001). Este teste associa a estimulação térmica
com a neurotransmissão central, em que o calor fornecido desencadeia a ativação
dos nociceptores (fibras Aδ e C) pela condução do impulso ao longo do corpo dorsal
da medula espinhal e, posteriormente, aos centros corticais (PINHEIRO et al., 2011).
Os testes que avaliam a atividade antinociceptiva do extrato envolve resposta
ao sistema locomotor, e possivelmente pode provocar um relaxamento da
musculatura ou sedação, ocasionando consequentemente uma incoordenação
motora, interferindo com a resposta sem serem necessariamente analgésicas, e os
testes permitem ainda uma interação dos resultados obtidos que avaliam a atividade
antinociceptiva (LAPA et al., 2003). Nesse contexto, para avaliar se ocorreu
comprometimento na coordenação motora dos animais, foi testado no equipamento
rota-rod (barra giratória), onde os resultados revelam que os animais tratados com
Acs-EtOH nas respectivas doses (25, 50 e 100 mg/kg) não apresentaram alteração
66
quando comparados ao grupo controle. Diante disso, é visto que estudos já
desenvolvidos com a espécie da família Annonaceae, Annona vepretorum Mart.
revelaram que o extrato não apresentou enfeito ansiolítico no sistema locomotor dos
animais tratados (DINIZ et al., 2013). Neste teste o animal é colocado sobre uma
barra giratória a uma velocidade padrão (7 rpm), onde será medido um possível
efeito adverso ocasionado por efeito de drogas (ALMEIDA, 2006). Vale salientar,
que esse teste tem um fator de importância, pois o animal ao receber um extrato
bruto de uma planta, ele estará recebendo diversas substâncias, que poderá induzir
efeitos adversos, como exemplo, diminuição da atividade motora do animal
(CARLINI; MENDES, 2011).
No processo de avaliação do potencial antinociceptivo, foram realizados os
testes de contorções abdominais e formalina, onde possivelmente envolvem
mecanismos anti-inflamatórios (COSTA-SOUZA, 2010). Diante disso, com a
finalidade de avaliar a possibilidade do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia
possuir atividade anti-inflamatória, foram realizados os respectivos testes: peritonite
e bolsa de ar, ambos induzidos por carragenina.
Através do reconhecimento da importância do papel das células de defesa no
organismo, tanto nos processos inflamatórios agudos quanto nos crônicos, muita
prudência tem sido imposta aos testes que avaliam os modelos de inflamação
aguda, pois permite uma quantificação estimativa da migração desses leucócitos
(neutrófilos), por meio do processo de diapedese estimulada por ação dos
mediadores químicos envolvidos no processo inflamatório. Os dois modelos de
inflamação usando animais, envolvendo a cavidade peritoneal (peritonite) e a região
dorsal (bolsa de ar), ambos permitem que ocorra um processo de migração
leucocitária que é quantitativamente analisado após um processo inflamatório
agudo, induzido por diferentes agentes exógenos (irritantes) administrados nas
cavidades. Além disso, ocorre o extravasamento plasmático de mediadores
inflamatórios no local lesionado (SEDGWICK E., LEES, 1986).
O teste de peritonite é realizado pela administração da carragenina na
cavidade intraperitoneal após 1 hora da dose do tratamento (Acs-EtOH), induzindo
um processo inflamatório agudo. Já o teste de bolsa de ar é desenvolvido pela
ocorrência de injeções subcutânea na região dorsal do animal (camundongo) de ar
estéril. Vale salientar, que depois de seis dias após a primeira injeção de ar (10 mL)
o tecido que reveste a bolsa de ar demonstra uma similaridade ao tecido de
67
revestimento sinovial. Sendo assim, pode-se concluir que esse modelo esquematiza
o mesmo processo inflamatório que ocorre na cavidade sinovial (EDWARDS et al.,
1981).
Nesse contexto, se observou que o uso de Acs-EtOH foi capaz de inibir
significamente a migração leucocitária nos modelos de inflamação induzidos pela
Cg, e possivelmente a inibição dos mecanismos da síntese de mediadores
inflamatórios.
68
6- CONCLUSÕES
69
6. CONCLUSÕES
Diante dos resultados alcançados no presente estudo, pode-se concluir que o
extrato etanólico bruto das folhas de atemoia demonstrou efeitos antinociceptivo e
anti-inflamatório. Acs-EtOH apresentou potencial antinociceptivo envolvendo
mecanismos centrais, que possivelmente está relacionado aos receptores opióides.
Além disso, apresentou atividade anti-inflamatória, ocorrendo a redução da migração
leucocitária ocasionada pela administração de Acs-EtOH comprovando a atividade
anti-inflamatória. Sendo assim, este efeito pode também estar envolvido com
mecanismos que inibem a síntese ou liberação de mediadores pró-inflamatórios.
Os estudos apresentaram efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório
relevantes, porém, não se sabe ainda qual o mecanismo de ação (vias) do efeito
antinociceptivo envolvido, se é central e/ou periférico. Estudos posteriores serão
realizados a fim de identificar o possível mecanismo de ação envolvido nos testes
realizados.
Em relação ao perfil de segurança de Acs-EtOH, se observou que não foi
capaz de provocar mortes nos animais submetidos ao ensaio de toxicidade aguda
preconizado pela ANVISA/2013. Dessa forma, este híbrido pode ser considerado de
baixa toxicidade, o que respalda a continuação de estudos farmacológicos e
toxicológicos com diferentes metodologias, com intuito de determinar um melhor
perfil de segurança do extrato.
Diante disso, portanto, todos os resultados apresentados nesse trabalho são
inéditos para o híbrido em estudo, contribuindo para estudos farmacológicos e
toxicológicos de espécies do bioma Caatinga, em especial a família Annonaceae.
Ademais, é de suma importância essa pesquisa, pois fortalece o perfil farmacológico
desse híbrido estudado, contribuindo de forma relevante para o avanço da pesquisa
científica em recursos naturais no mundo.
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REFERÊNCIAS
71
REFERÊNCIAS
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85
APÊNDICE
APÊNDICE A – Artigo I
86
Artigo I: PROSPECÇÃO CIENTÍFICA DE ESPÉCIES DO GÊNERO ANNONA
(ANNONACEAE) COM ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-
INFLAMATÓRIA.
87
Resumo
A família Annonaceae possui cerca de 135 gêneros e 2.500 espécies distribuídas
entre as áreas tropicais dos continentes americano, africano e asiático. Ela destaca-
se por haver um grande número de espécies de importância para os diversos
setores industriais. Algumas espécies possuem atividade antinociceptiva e anti-
inflamatória, dentre elas, Annona squamosa L. (pinha). O objetivo deste trabalho foi
realizar uma prospecção científica de espécies do gênero Annona, identificando
quais espécies possuem atividade antinociceptiva e anti-inflamatória, e a quantidade
de artigos publicados que apresentem as respectivas ações farmacológicas. Essa
prospecção científica foi desenvolvida através da busca nos bancos de dados
Pubmed, Science Direct, Scopus, Scielo e Lilacs realizada no mês de janeiro de
2015. Foram encontrados 75 artigos, analisados e identificados conforme os
88
respectivos critérios de inclusão do estudo, totalizando no final 12 artigos. Os
resultados demonstram que ainda são poucos os estudos relacionados no
meiocientífico sobre as possíveis atividades antinociceptiva e anti-inflamatória de
espécies desse gênero.
Palavras-chave: Annona; Annonaceae; antinociceptivo; anti-inflamatório.
Abstract
The Annonaceae family has about 135 genera and 2,500 species distributed in
tropical areas of the Americas, Africa and Asia. It stands out for having a large
number of species of importance to the various industrial sectors. Some species
have antinociceptive and anti-inflammatory activities, among them, Annona
squamosa L. The objective of this study was to conduct a scientific survey of the
Annona genus, identifying which species have antinociceptive and anti-inflammatory
activity, and the amount of published papers with these pharmacological actions.
This scientific survey was developed by searching the data banks Pubmed, Science
Direct, Scopus, SciELO and Lilacs held in January 2015. It were found 75 articles,
analyzed and identified as their inclusion criteria of the study, totaling at the end 12
articles. The results showed that there are few studies related in scientific circles
about the possible antinociceptive and anti-inflammatory species of this genus.
Key-words: Annona; Annonaceae; antinociceptive; anti-inflammatory.
Introdução
A biodiversidade, de um modo geral, é a responsável pela produção de
grande parte das substâncias orgânicas conhecidas e em pesquisa, sendo que, o
reino vegetal tem a maior parcela da diversidade química conhecida e registrada na
literatura. Os produtos naturais de quaisquer origens podem atuar como fonte de
novos padrões moleculares úteis para as possíveis ações farmacológicas (VIEGAS-
JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).
Ao longo da história o homem tem utilizado diversas formas de tratamento
para o alívio da dor, entre elas, as ervas medicinais merecem destaque devido ao
seu amplo uso popular (ALMEIDA et al., 2001). O interesse popular na busca de
89
plantas medicinais tem crescido consideravelmente na segunda metade do século
XX (ALBUQUERQUE et al., 2007).
A família Annonaceae foi catalogada em 1789 por Jussieu (HUTCHINSON,
1974), e estas plantas geralmente estão distribuídas entre as áreas tropicais dos
continentes americano, africano e asiático. Essa família compreende um grande
número de gêneros e espécies, cuja maioria é nativa das regiões tropicais, com
cerca de 2.500 espécies distribuídas em aproximadamente 135 gêneros (CHATROU
et al., 2012). No Brasil foram registrados 29 gêneros, compreendendo cerca de 392
espécies (MAAS, et al., 2015). A maioria das espécies dessa família são frutíferas e
encontradas com frequência em regiões de clima subtropical e tropical (CHATROU
et al., 2012). A grande parte dos princípios ativos de importância farmacológica
encontrada nos extratos vegetais, de modo geral, é oriunda de uma variedade de
metabólitos secundários que possuem uma constituição complexa, alcançando alvos
terapêuticos nas doenças humanas e que são produzidos para modular seus
próprios metabolismos (FERREIRA; PINTO, 2010). A família Annonaceae,
cientificamente, destaca-se por haver um grande número de espécies de
importância para os diversos setores industriais. O valor econômico dessas espécies
está relacionado principalmente às propriedades nutricionais dos frutos que são
consumidos in natura, mas também são amplamente utilizados em produtos
processados ou semi-processados, especialmente na preparação de sucos,
sorvetes e sobremesas (LAGE, 2011; DINIZ et al., 2013).
A espécie Annona muricata L., vulgarmente conhecida como graviola, é
encontrada na América Central e América do Sul, incluindo as regiões Norte,
Nordeste e Sudeste do Brasil, sendo uma fruta bastante consumida nestas regiões e
de grande valor econômico. Entre os constituintes químicos encontrados nessa
espécie, os alcaloides e os óleos essenciais se destacam (SOUSA et al.,2010).
Muitas espécies desse gênero possuem atividade farmacológica, tais como atividade
antinociceptiva (ALMEIDA et al., 2012) e antioxidante (LIMA et al., 2010), e também
atividade sobre o sistema nervoso central em roedores (DINIZ et al., 2013).
Tradicionalmente, as folhas são usadas para dores de cabeça, insônia, cistite,
problemas de fígado, diabetes, hipertensão e como anti-inflamatório. Além disso,
tem atividade antimicrobiana (COSTA et al., 2013), antitumoral (LIMA et al.,2012),
antinociceptiva, anti-inflamatória (SIEBRA et al., 2009), ansiolítica e sedativa (DINIZ
et al., 2013), o que desperta o interesse de grupos de pesquisa nacionais e
90
internacionais, além do setor industrial farmacêutico. Algumas espécies do gênero
Annona possuem atividade antinociceptiva e/ou antiinflamatória, dentre elas, Annona
diversifolia, Annona muricata e Annona squamosa, cujas folhas são usadas para o
tratamento de reumatismo, dor no baço, dores de cabeça, insônia, cistite, problemas
de fígado, diabetes, hipertensão e anti-inflamatório. O extrato obtido com éter de
petróleo bruto e o óxido de cariofileno isolado do extrato da casca exibiram
atividades analgésica e anti-inflamatória significativa (CHAVAN et al., 2010).
Nesse contexto, o objetivo principal desse trabalho foi realizar uma
prospecção científica de espécies do gênero Annona, no sentido de identificar quais
espécies possuem atividade antinociceptiva e anti-inflamatória, bem como analisar a
quantidade de artigos publicados relacionados às respectivas ações farmacológicas.
2. Metodologia
Trata-se de uma prospecção científica desenvolvida pela busca nos bancos
de dados Pubmed, Science Direct, Scopus, Scielo e Lilacs acerca de publicações
sobre espécies do gênero Annona e suas atividades antinociceptiva e anti-
inflamatória. A pesquisa foi realizada durante o mês de janeiro de 2015. A escolha
dos descritores foi adequada para a realização de uma pesquisa ampla, utilizando-
se como palavras chaves: Annona, “antinociceptive” e “anti-inflammatory”, sozinhos
ou combinados, sendo considerados válidos os documentos que apresentassem
esses termos no título e/ou resumo que versavam sobre as atividades
farmacológicas.
Foram excluídos os trabalhos que descreviam a estrutura química dos
compostos sem a análise farmacológica. Já para o critério de inclusão, foram
selecionados os trabalhos que realizaram a avaliação das atividades farmacológicas
selecionadas (anti-inflamatória e antinociceptiva) usando camundongos e/ou ratos
nos experimentos, avaliando os possíveis mecanismos de ação.
Os artigos repetidos foram excluídos durante a pesquisa. Um fluxograma que
ilustra o andamento da seleção dos artigos em cada fase é mostrado abaixo (Figura
1).
91
Figura 1 – Fluxograma abordando as etapas de seleção dos artigos em cada base
de dados.
3. Resultados e Discussão
A prospecção científica foi utilizada como um meio sistemático de analisar os
respectivos artigos encontrados, que estão relacionados à presença das atividades
antinociceptiva e antiinflamatóriade espécies do gênero da Annona.
Nesse contexto, na busca dos artigos nas bases de dados foram encontrados
sem filtro, 75 artigos no âmbito geral, abordando as palavras chaves (Annona AND
antinociceptive, Annona AND anti-inflammatory). Pode-se observar na Figura 2 a
distribuição das publicações referentes às palavras chaves nas cinco bases de
dados.
92
Figura 2 - Total de artigos publicados por banco de dados envolvendo atividade anti-
inflamatória e antinociceptiva do gênero Annona.
A pesquisa foi direcionada no intuito de explorar melhorar as informações que
essas bases pudessem fornecer a respeito das espécies do gênero Annona com
possível atividade antinociceptiva e anti-inflamatória no banco de dados científicos.
Dos artigos selecionados nas bases demonstradas acima, foi observado que
espécies do gênero Annona apresentaram efeito anti-inflamatório mais documentado
que o efeito antinociceptivo, isso pode ser devido à falta de realização de testes
experimentais antinociceptivos das espécies em questão, ou mesmo alguns efeitos
não significativos nessa variável.
A análise dos artigos foi realizada de acordo com os critérios de inclusão e
exclusão do estudo. Diante disso, ao final dos 75 artigos foram selecionados 12
(Figura 3), os quais foram considerados pertinentes para o desenvolvimento da
prospecção científica. A base de dados Scopus forneceu o maior número de artigos
publicados envolvendo espécies do gênero Annona com atividade antinociceptiva
e/ou anti-inflamatória, e as bases que tiveram menor número de publicações foram a
Scielo e Lilacs, em relação aos demais publicados na mesma área da pesquisa
farmacológica.
93
Figura 3 - Total de artigos selecionados após a análise dos respectivos critérios de inclusão e exclusão do estudo do gênero Annona.
Na figura acima, observa-se a distribuição da amostra final dos 12 artigos
selecionados para o estudo, onde a maior quantidade foi encontrada no Scopus com
50% (n=6) dos artigos selecionados, em seguida com o Pubmed e Science Direct
ambos com 16,66% (n=2) e por último, o Scielo e Lilacs 8,34% (n=1), sendo as
principais bases com artigos publicados nessa temática.
Nota-se que durante todos os estudos relacionados à atividade
antinociceptiva e antiinflamatória foram identificadas apenas 12 publicações nas
quais foram desenvolvidos testes específicos para avaliação da atividade
farmacológica, tais como: placa quente, edema de pata, bolsa de ar induzidos pela
carragenina (polissacarídeo extraído de algas marrons), contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético, peritonite induzida por carragenina, edema de orelha
induzido pelo óleo de Croton e teste da formalina.
Na Figura 4, observa-se que a espécie mais citada foi Annona muricata L.,
popularmente conhecida como graviola, com 41,66%, Annona squamosa (pinha)
com 33,33%, confirmando seu potencial antinociceptivo e anti-inflamatório. Vale
destacar também o efeito da graviola sobre o sistema nervoso central, com ação
ansiolítica, por exemplo (OVIEDO, et al., 2009).
94
Figura 4 - Total de publicações com espécies do gênero Annona com potencial
antinociceptivo e anti-inflamatório.
Isso demonstra que ainda é mínima a exploração das demais espécies que
fazem parte desse gênero, tornando-se desconhecidas para a ciência. Com isso,
percebe-se na análise da figura 5 abaixo, a distribuição dos artigos por ano, que o
desenvolvimento da pesquisa com essas espécies ainda é recente. Além disso, em
consideração às espécies até agora estudadas do gênero Annona, é observado que
o número de artigos publicados ainda é pouco expressivo, mostrando que ainda há
muito a que ser estudado, uma vez que essas espécies apresentam diversos
metabólitos secundários com variados efeitos fisiológicos promissores.
95
Figura 5 - Total de artigos publicados com espécies do gênero Annona com
atividade antinociceptiva e anti-inflamatória por ano de publicação.
3. Conclusão
Diante disso, esta prospecção é de interesse especial para os respectivos
grupos científicos que desenvolvem pesquisa com espécies do gênero Annona, pois
mostra de fato, que o estado da arte em pesquisas envolvendo essa temática é
pouco estudado. Apenas seis espécies de Annona foram instrumento de estudo para
investigação da possível atividade antinociceptiva e antiinflamatória, nesse
levantamento nos respectivos bancos de dados científicos. Os principais
mecanismos de ação envolvem a participação de receptores opioides e
envolvimento de canais de potássio sensíveis ao ATP.
Os resultados demonstram que ainda são poucos os estudos relacionados no
meio científico sobre as possíveis atividades antinociceptiva e anti-inflamatória
desse gênero. No campo da pesquisa científica, apesar de haver um número mínimo
de artigos publicados, ainda há caminhos, como o desenvolvimento de possíveis
mecanismos de ação, testes para descoberta de novos metabólitos, até mesmo a
exploração de novas espécies nas linhas de pesquisa. Portanto, esse trabalho
mostra que a pesquisa com o gênero Annona é importante, uma vez que resultados
prévios da literatura mostram diversos efeitos em modelos animais.
96
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Aprovado: 27/07/2015
98
APÊNDICE B – Artigo II
Artigo II:
ANTINOCICEPTIVE AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITIES OF
ETHANOLIC EXTRACT FROM ATEMOYA
99
Antinociceptive and anti-inflammatory activities of ethanolic extract from
Atemoya
Hállison do Nascimento Silva¹*, Tâmara Coimbra Diniz¹, Fernanda Granja da Silva Oliveira1, Roxana
Braga de Andrade Teles¹, Raimundo Gonçalves de Oliveira Júnior¹, Jackson Roberto Guedes da S Almeida
1*
*Correspondence: [email protected]; [email protected] 1.Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of
San Francisco Valley, 56.304-205 Petrolina, Pernambuco, Brazil. Full list of author information is available at the end of the article
Abstract Background: Atemoya is a plant from the family of Annonaceae, and an interspecific hybrid (Annona cherimola Mill x Annona squamosa L.). It is a tree from a region in diversity of plants, the caatinga, one of the main brazilian biomes. In this research, was investigated the effects of ethanol extract of Atemoya (Acs-EtOH) in relief of pain and inflammation in models rodents. Methods: The evaluation of the antinociceptive activity was performed by writhing test induced by acetic acid, formalin test, hot plate test, while the anti-inflammatory profile was evaluated by testing air bag and carrageenan-induced peritonitis and to assess the locomotor system was used rota-rod test. Results: Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.) significantly reduced the number of writhes with significant (p <0.001) and decreased (***p <0.001) paw licking time in both phases of the formalin test. In the hot plate test, the latency was significant, reducing painful stimulus. Since the anti-inflammatory models, Acs-EtOH inhibited significantly (***p <0.001) the migration of leukocytes to the air pouch tests and peritonitis. Thus, confirmed by microscopy using a Neubauer chamber, thereby showing, significant inhibition of migration of leukocytes in the groups treated with different doses of the extract Conclusion: Acs-EtOH has antinociceptive activity and anti- inflammatory significant, but it is not yet known mechanisms of action that are involved. More studies are being conducted to identify the possible mechanism of action of the extract involved in the tests. This hybrid is a great potential for drug discovery. Keywords: Anti-inflammatory, Anti-nociceptive, Atemoya.
Background
The nature, in general, is responsible for producing the majority of the known
organic substances. Plant kingdom has mostly contributed to the supply of useful
substances to treat diseases that affect humans [1]. Medicinal plants are used in folk
medicine in many countries to treat various painful and inflammatory conditions;
however, for many plants in use, effectiveness and active compounds are unknown.
Aiming to solve this challenge, several experimental studies are demonstrating the
pharmacological properties of these plants and identifying the active principles
responsible for the activities [2].
The natural products in general and in particular medicinal plants are an
important source of new chemical substances with potential therapeutic applicability.
Considering that the most important painkillers prototypes (salicylic acid and
morphine) were derived originally from the plant kingdom, the study of medicinal
plants has become a useful strategy in the search for new antinociceptive drugs [3].
100
The Brazilian Northeast is a region with a great plant diversity. One of the main
biomes, the Caatinga, has an adapted vegetation to semi-arid climate, with a wide
variety of endemic species, with over 1.500 species recorded in its flora.
The Annonaceae family comprises a large number of genera and species,
most of which are native to the tropical regions, with about 2500 species in about 135
genera [4]. In Brazil, there are recorded 29 genera, comprising about 392 species [5].
Atemoya (Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.) is an interspecific hybrid
between cherimoya (A. cherimola Mill.) and pinecone or fruit-the-count (A. squamosa
L.) [6]. Although pollination occurs between species naturally, the hybrid atemoya
was the result of an intentional crossing, in order to obtain a fruit with a good quality
and more adaptable to tropical climate.
This specie is a recent fruit crop in the Northeast and was first deployed in
the region in 1997, specifically in the irrigation projects of the San Francisco Valley.
Studies have shown that the Annona species have several pharmacological
properties including antinociceptive [7,8] and anti-inflammatory activity [9]. From the
phytochemical perspective, many secondary metabolites classes were found in the
Annonaceae Family. Chemotaxonomic data characterize this family for the presence
of alkaloids, terpenoids and flavonoids, mainly the diterpenes [10].
Studies on the biological activity of this plant are still necessary in Brazil.
Therefore, this article aims to investigate the antinociceptive and anti- inflammatory
activity of the ethanol extract of Atemoya leaves (Annona cherimola Mill. x Annona
squamosa L.) in rodents.
Methods
Plant material
The leaves of atemoya were collected in the city of Petrolina (Coordinates: 9
° 23'19 " S and 40 ° 29'3 " W), state of Pernambuco, Brazil, in May 2014 and was
identified by a botanist from Centro de Referência para Recuperação de Áreas
Degradadas da Caatinga (CRAD). A voucher specimen (16310) was deposited in the
Herbarium Vale do São Francisco (HVASF) from Federal University of San Francisco
Valley.
101
Preparation of the plant extract
The leaves of Atemoya were dried in an oven at 45 ° C for three days. The
leaves dried and powdered (575.2 g) was macerated with ethanol (EtOH) 95 % at
room temperature for 6 days. The Acs-EtOH solution was concentrated under
vacuum yielding 214 g (10:50 % w/w from dried plant materials) of crude ethanol
extract of Atemoya (Acs-EtOH).
Animals
Swiss albino mice of both sex weighing 25-30 g were used, randomly housed
in appropriate cages maintained at 22 ± 2 °C, with a light and dark cycles of 12 /12 h
and free access to water and food. Experimental protocols and procedures was
approved by the Federal University of San Francisco Valley Animal Care and Use
Committee, by number 0003/110414.
Antinociceptive Activity
Acetic acid-induced abdominal writhing assay in mice
The mice were divided into six groups, with six animals each. Nociception was
induced by intraperitoneally (i.p.) using dose defined in study design administration of
0.1 mL acetic acid (1%). The animals were treated with the Acs-EtOH (25, 50 and
100 mg/kg, p.o.) [11] and received saline (negative control) 1 h before to inoculation
of the nociceptive agent. Indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg i.p.)
were used as reference drugs (i.p.) for positive control 30 minutes before the
administration of the pathogenic agent. The animals were observed individually and
the number of writhes was counted for 20 min, starting 5 min after injection of acetic
acid [12]. The number of abdominal writhings inhibition was calculated using the
following formula:
Percentage of Inhibition (%) = Mean No. of writhes (Control) - Mean No. of writhes (Test) x 100 Mean No. of writhes (Control)
The significant reduction in number of writhes of treated groups was compared
to the control and the groups treated with the reference drug.
102
Formalin-induced nociception assay in mice
Formalin-induced nociception was developed according to a previously
described procedure [13], with some adaptations. Formalin solution was introduced
(2.5% in sterile 0.9% salt) in the subplantar paw region, injected into the right rear
paw of mice [14]. The mice were observed in the cages with a mirror and the amount
of time (seconds) spent licking or/and biting the injected paw, measured as a pain
indicator.
Responses were measured for 5 min after formalin injection (first stage,
neurogenic) and 15-30 min after the injection of formalin (second phase,
inflammatory) [15]. Treatments with saline (p.o.), Asc-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg,
p.o.), indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg, i.p.) was injected 1 hour
before formalin injection (n = 6 per group).
Hot-plate latency assay in mice
The six groups were divided, with six mice each. Mice were pre-selected on
the hot plate apparatus (Insight, Brazil) one day before at 45 ± 0.5 °C. Animals
showing a reaction time (defined as the latency for licking the hind feet or jumping)
greater than 20 s were discarded. Selected mice were pre-treated with saline (p.o.),
Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or morphine (10 mg/kg, i.p.). Each animal
was placed on the heated surface of the plate maintained at 45 °C and the latency to
a discomfort reaction (jumping or licking of the paws) was recorded at 30, 60, 90 and
120 min after the administration of the saline, extract and morphine [16]. A cut-off
time of 20 s was chosen to indicate complete analgesia and to avoid tissue injury.
The latency time for each animal was recorded.
Leukocyte migration to the peritoneal cavity
The six groups were divided, with six mice each. The leukocyte migration
was induced by injection of carrageenan (1 %, i.p., 0.25 ml) [17] in the peritoneal
region, 1 h after administration of Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), and saline
(p.o.) 30 minutes after injection of dexamethasone (2 mg/kg, i.p.) [18].
103
The leukocyte migration was evaluated 4 h after exogenous stimulus. Then,
euthanasia was carried out and 3 mL of saline containing 1 mM EDTA was injected
at perinoteal cavity. A brief massage was done for further fluid collection, which was
centrifuged (3000 rpm for 5 min) at a room temperature. The supernatant was
disposed and saline was added to the precipitate. Then an aliquot of 10 μl from this
suspension was dissolved in 200 μl of Turk solution and the total cells were counted
in a Neubauer chamber, using an optic microscopy. All the results were submitted to
statistical analysis and were expressed as the number of leukocytes/ml [19].
Air pouch assay
The air pouch assay was performed according to a method described
previously [20], but with some adjustments. On day 0, the animals were separated by
groups and received a subcutaneous injection of 15 mL of sterile air on the dorsal
region of mice. On day 3, a new injection of 5 mL of sterile air into the preformed bag
was carried out. On day 7, the animals were divided in groups: saline solution (0.9%
saline p.o.), Dexamethasone (0.5 mg / kg, s.c.), Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg / kg,
p.o.). One hour after treatment, 0.25 mL of a 0.1% solution of carrageenan in saline
was injected into the cavity, except the vehicle group, which received an injection of
0.25 mL of saline. Then, after four hours after the inflammatory stimulus, the animals
were euthanized and the pocket was washed with 2 mL heparinized PBS (10 IU/mL).
With the aid of a pipette exudate was collected via an incision in the dorsal pouch,
then, the total count of the number of leukocyte cells in the air pouch was carried out.
A portion of fluid was diluted in a Türk solution (1:20) and subjected to counting. All
counts were performed in a Neubauer chamber, with an optical microscopy.
Rota rod assay
To discard possible nonspecific effects of the Acs-EtOH in the motor
coordination or the muscular relaxation the mice had been tested in the rota-rod. The
animals had been trained on of the device one day before the experiment. On the
day of the experiment, the mice had been dealt with Acs-EtOH (25, 50 and 100
mg/kg, p.o.), diazepam (5 mg/kg, i.p.) and saline solution 0.9%, p.o., after 60 min had
104
been placed in the route-rod and registered the time of motor performance (s) of
each animal using a chronometer.
Statistical analysis
All the results were presented as the mean ± S.E.M (Standard Error Mean)
and the statistical significance was determined using one-way ANOVA, followed by t-
test and was carried out to compare the results of control and test drug groups. The
differences are considered to be significant if *p<0.05, **p< 0.01 and ***P<0.001
most significant. The analysis was performed using by GraphPad Prism 5.0 program
(Graph Pad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA).
Results
Acetic acid-induced abdominal writhing assay in mice
The results from this evaluation (Figure 1) can demonstrate that
pretreatment with ethanol extract of the leaves of atemóia (Acs-EtOH ) (25, 50 and
100 mg /kg, orally p.o.) was able to inhibit acetic acid-induced writhings compared
with the control group (***p <0.001). The inhibition percentage of the doses of Acs-
EtOH was 42.14 %, 48.88 % and 63.48 %, respectively. Indomethacin and morphine
reduced 91.23 % and 100 % of the writhes compared to the control, respectively.
There was no statistical difference between the doses of Acs-EtOH when compared
to each other.
0
10
20
30
40
******
***
******
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Indomethacin 20 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Nu
mb
er
of
wri
thin
g (
s)
Fig. 1. Abdominal writhing inhibition by crude ethanol extract of Atemoya. Data are expressed as mean ± S.E.M. of six mice. ***p<0.001 indicates significant difference when compared with control group by using (one-way ANOVA) followed Tukey Test (n = 6, per group).
105
Formalin-induced nociception assay in mice
The Figure 2 shows that the treatment with Acs-EtOH at doses of 25, 50 and
100 mg / kg (p.o.) produced significant antinociceptive effect compared to the control
group in both phases (***p <0.001). Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg / kg, p.o.) reduced
by 56.71%, 64.35% and 50.09 %, respectively, the time of paw licking in first phase,
as well as 47.58%, 73.41% and 77.79 %, in the second phase of formalin test.
Indomethacin, the reference drug, demonstrated more activity in the second test
phase, while morphine inhibited both phases of the pain stimulus (***p <0.001).
Morphine significantly inhibited pain (100%) over the control, both at early and late
phases (Figure 2).
First phase
0
20
40
60
80
100
**
***
**
******
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Indomethacin 20 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Lic
kin
g t
ime (
s)
Second phase
0
50
100
150
200
***
*** ***
***
***
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Indomethacin 20 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Lic
kin
g t
ime (
s)
Fig. 2. Effect of ethanolic extract of Atemoya (Acs-EtOH) of the formalin test on neurogenic phase 0-5 min (First phase) after formalin injection; and the second inflammatory pain phase 15-30 min (Second phase) . Data are mean ± S.E.M. of six mice. **p < 0.01, ***p < 0.001, significantly different from control group by using (one-way ANOVA) followed Tukey Test (n = 6, per group).
106
Hot-Plate Latency Assay in Mice In this evaluation, animals treated with morphine (10 mg / kg, i.p.) had an
evident increase in the latency time 30, 60, 90 and 120 min (*** p <0.001). For the
groups treated with Acs-EtOH doses (25, 50 and 100 mg / kg, p.o.), no effect was
shown in the first 30 minutes. However, an increase in latency time was found in 60
and 90 min and a reduction in was evident in 120 min. The morphine proved to be a
potent analgesic, increasing the latency time within the time evolution (Figure 3).
30 60 90 1200
5
10
15
20
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
* ***
***
*
*****
***
*
******
Time (min)
Late
ncy t
ime (
s)
Fig. 3. Effect of ethanolic extract of Atemoya (Acs-EtOH) on hot plate assay in mice. Values are mean ± S.E.M.; * p<0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, significantly different from control; (one-way ANOVA) followed Tukey test (n = 6, per group).
The migration of leukocytes into the peritoneal cavity
The Acs-EtOH showed an inhibitory effect on leukocytes migration (Figure 4)
(35.40%, 46.20% and 63.85% at 25, 50 and 100 mg/kg, respectively, ***p<0.001).
The results obtained with the control group support the effect of Acs-EtOH since the
vehicle presented no activity, and the control drug dexamethasone inhibited (89.55%,
***p<0.001) the carrageenan-induced leukocyte migration to the peritoneal cavity.
107
0
10
20
30
40
***
***
***
***
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg
Dexamethasone 2 mg/kg
Leu
co
cyte
s x
10
6 / m
l
Fig. 4. Effect of ethanolic extract of Atemoya (Acs-EtOH) and dexamethasone on leukocytes migration into the peritoneal cavity induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; ***p < 0.001,
significantly different from control; (one-way ANOVA) followed Tukey test (n = 6, per group).
Air pouch assay
Air pouch assay demonstrates that the neutrophils have effective role in the
defense against foreign bodies, and also in processes related to inflammatory
response, due to the viability of injured cells and/or tissues. The inhibitory effect of
Acs-EtOH on leukocytes migration into the air pouch was 56.17%, 62.04% and 73.16
% at doses of 25, 50 and 100 mg/kg, while inhibitory effect of dexamethasone was
88.15%.
Air pouch
0
10
20
30
40
******
***
***
Control
Acs-EtOH 25 mg/kg
Acs-EtOH 50 mg/kg
Acs-EtOH 100 mg/kg
Dexamethasone 2 mg/kg
Leu
co
cyte
s x
10
6 / m
l
Fig. 5. Effect of ethanolic extract of Atemoya (Acs-EtOH) and dexamethasone on leukocytes migration into the air pouch induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; ***p < 0.001, significantly different from control; (one-way ANOVA) followed Tukey test (n = 6, per group).
108
Effect of Extracts in Locomotive Assay
Rota rod assay
The rota-rod assay was performed to determine if the extract Acs-EtOH (25,
50 and 100 mg/kg p.o.) compromises the motor system in rats treated sharply when
placed on the rotating rod. Mice treated showed no significant change in the
performance of the device.
Fig. 6. Effect of ethanolic extract of (Asc-EtOH) and diazepam in rota-rod assay in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p< 0.05, **p<0.01, ***p<0.001, significantly different from control; (one-way ANOVA) followed Tukey test (n = 6, per group).
Discussion
The aim of this study was to investigate the antinociceptive and anti-
inflammatory effects of ethanol extract from the leaves of Atemoya (Annona
cherimoya Mill. X Annona squamosa L.) (Acs-EtOH), using different models with
painful, chemical and thermal stimuli.
These activities can possibly be associated with the chemical constituents
already identified in the plant, such as alkaloids, terpenes and acetogenins [21].
Additionally, previous phytochemical screenings of atemoya detected the presence of
flavonoids, tannins, lignans, mono and diterpenes (leaves and stems). Also showed
positive results for the presence of other components such as alkaloids, anthracene
derivatives, naphthoquinones, triterpenes and steroids [22]. Due to the expansion of
cultivation atemóia and its growing consumption in key Brazilian markets, it is
109
necessary to investigate the chemical composition of the plant. In phytochemical
study previously carried out in the São Francisco Valley, show the isolation and
chemical characterization of seven alkaloids, such as: Asimilobine (C17H17NO2),
Pronuciferine (C19H21NO3), Lanuginosine (C18H11NO4), Liriodenine (C17H9NO3),
Lysicamine (C18H13NO3), Anonaine (C17H15NO2) Stepharine (C18H19NO3) by
spectrometric methods [23].
The antinociceptive activity of Acs-EtOH in this study was investigated using
the abdominal writhing, formalin and hot plate tests in mice. The writhing model
induced by acetic acid in mice is commonly considered as classical peripheral
inflammatory pain animal model for evaluation of antinociceptive or anti-inflammatory
drugs [24]. The peripheral analgesic is due to the liberation of several inflammatory
mediators such as bradykinin, substance P, prostaglandins, cyclo-oxygenases and
lipoxygenases, as well as some cytokines such as IL-1 β, TNF- α and IL-8 [25, 26].
The Acs-EtOH significantly reduced the number of writhing caused by the application
of acetic acid in the intraperitoneal region. The results in Figure 1 demonstrate that
the control group showed 29.67 ± 3.25 writhings 10 minutes after application of acetic
acid. Thus, when animals were pretreated with 25, 50 and 100 mg/kg Acs-EtOH, the
number of writhings was reduced in a statistically significant manner (17.17 ± 1.88,
15.17 ± 0.74 and 10.83 ± 0.87). The Acs-EtOH reduced significantly the number of
writhings at all doses compared to control groups. Therefore, this study
demonstrated the significant antinociceptive activity of this plant.
The test of writhing induced by acetic acid has been used as a classic model
for the possible antinociceptive potential of new agents [27]. This assay is
characterized as a nonselective model to evaluate the analgesic effect of
substances, plant extracts or other products of natural origin, but another tests are
necessary to confirm the antinociceptive potential.
So, for better analysis of the analgesic effect, the formalin test was carried
out, aiming to measure the behavioral effectiveness of antinociceptive agents [28].
The administration of subcutaneous formalin injection in rats induces a biphasic
nociceptive response [29]. The first phase corresponds to neurogenic pain and is
caused by the direct effect of formalin in sensory C- fibers. The second phase (or
inflammatory phase) is related with the inflammatory response development,
releasing the nociceptive mediators in peripheral tissue and functional changes in the
dorsal medulla body [30]. The Acs-EtOH significantly inhibited both phases of the
110
formalin-induced pain, indicating that the extract has an antinociceptive effect in both
phases, reducing the pain response during the second phase. In order to confirm the
involvement of central mechanisms in the antinociceptive effect of Acs-EtOH, the hot
plate assay was carried out. Analyzing the results shown in Figure 3, the animals
treated with Acs-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.) spent more time on the heated
metal plate, evidencing possible centrally acting. This pattern of response is related
to a spinal reflex and it is considered, thus, a centrally acting analgesic evaluation
model [31].
In this study, Acs-EtOH significantly decreased leukocyte migration. This
effect probably occurs by the inhibition mechanisms of the cyclooxygenase pathway,
inhibiting the synthesis of mediators that act in the inflammatory process, whose
involvement in cell migration is well established. The inflammation induced by
carrageenan involves the migration of defense cells, plasma exudation, and
production of mediators such as NO, PGE2, interleukin (IL-1β, IL–6, IL-8, and tumor
necrosis factor (TNF–α) [32, 33]. These mediators are capable of migrating
leukocytes such as neutrophils, in different experimental tests. Figure 4 shows that
Acs-EtOH inhibited significantly the leukocyte migration induced by carrageenan, and
the inhibition of mediators involved in cell migration may be associated with this
activity.
To further confirm the effect of Acs-EtOH on the migration of leukocytes, the
experiment was conducted in an animal model of carrageenan induced air pouch
polysaccharide, which is a well-known model to induce migration of leukocytes,
infiltrated into the bag contrived. When neutrophils stimulated release reactive
oxygen species and a variety of protein granules, there is an increase in the
migration process. The influx of neutrophils in inflammation active regions regulates
the inflammatory process in various pathogenic stimuli [34]. Acs-EtOH inhibition of
migration of leukocytes and plasma loss observed in air pouch model is an important
parameter of inflammation. These findings contributed to explain the use of the
ethanol extract of atemoya leaves in folk medicine for the treatment of inflammatory
and infectious diseases. These results suggest that the studied extract contains
bioactive anti-inflammatory compounds in a dose dependent manner. These
mediators are able to recruit leukocytes such as neutrophils in several experimental
models in figures 4 and 5.
111
Several studies have shown that the use of drugs which produces CNS
depression or non-specific muscle relaxing effect can reduce the coordination
response, may invalidate the possible results of the behavioral tests [35]. Thus, the
results demonstrated mice treated with Acs-EtOH had no change in performance of
the rotar-rod device.
Conclusion
Considering the results of this study, the ethanolic extract obtained from the
leaves of atemoya (Annona cherimoya Mill. x Annona squamosa L.) showed
significant antinociceptive and anti-inflammatory effects, which may also be involved
in the mechanisms that inhibit the synthesis or release of pro-inflammatory
mediators. Additional studies are being conducted by our group to clarify the
mechanisms involved in these actions.
Atemoya can be characterized as an important plant used in folk medicine in
the Northeast region of Brazil, and further studies are necessary to evaluate the its
toxicity. All data presented in this work are unprecedented for the species under
study, and the results demonstrate the importance of new pharmacological studies of
other species of the genus of Annona in the Caatinga biome. Therefore, the
results support the use of the species in folk medicine, encouraging the research for
new bioactive extracts, as well as the development of natural products obtained in
Brazilian biomes, with the purpose of clinical application.
Acknowledgements
CAPES - Cordenação of Higher Education Personnel Training. The CNPq and the
Federal University of São Francisco Valley - UNIASF
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115
- COMPORVANTE DE SUBMISSÃO: Journal On Web Indian Journal of Medical Research
116
APÊNDICE C – Resumo
Atividade antinociceptiva do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia
(Annona cherimola Mill. x Annona squamosa L.) em camundongos
Silva, H.N.1, Macêdo, L.A.R.O1, Diniz, T. C.1 , Gomes, L. M. A.1, Pereira, N. R. S.1, Rabêlo,
S.V.1, Almeida, J.R.G.S.1
1NEPLAME, Universidade Federal do Vale do São Francisco.
Introdução: A atemoia é um híbrido interespecífico entre a cherimola (A. cherimola Mill.) e a pinha ou fruta-do-conde (A. squamosa L.). É uma planta de cultivo recente no Nordeste, inserida em 1997 pela primeira vez na região, no município de Petrolina-PE. A família Annonaceae compreende um grande número de gêneros e espécies, cuja maioria é nativa das regiões tropicais, com cerca de 2.500 espécies em aproximadamente 135 gêneros. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto das folhas de atemoia (Acs-EtOH) em camundongos. Parte Experimental: Foram utilizados grupos de camundongos (n=6), Swiss, machos, pesando entre 30 e 40 gramas, todos provenientes do Biotério da UNIVASF. A atividade antinociceptiva de Asc-EtOH folhas (25, 50 e 100 mg/kg v.o) foi avaliada através do teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e teste da formalina. AAS (150 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) por via intraperitoneal (i.p), foram utilizadas como drogas padrão. Os grupos controle receberam solução salina. A análise dos dados foi feita no programa GraphPad Prism®. Todos os procedimentos foram realizados após a aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIVASF, protocolo 0003/110414. Resultados e Discussão: O tratamento com as doses de Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) foi capaz de inibir significativamente o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético quando comparados com grupo controle (***p < 0,001). As porcentagens de inibição foram de 41,59, 48,87 e 65,18%, respectivamente. O AAS reduziu as contorções abdominais em 92,68% e a morfina em 100% quando comparados com o grupo controle. No teste da formalina o tempo de lambida da pata diminuiu na primeira e na segunda fase após a administração de Asc-EtOH, sendo as melhores respostas obtidas na segunda fase na dose de 100 mg/kg (76,33% de inibição). Conclusão: Os resultados obtidos mostram que a administração via oral de Acs-EtOH apresentou efeito antinociceptivo. Outros estudos ainda são necessários para caracterizar o mecanismo de ação preciso do extrato. Agradecimentos: UNIVASF Apoio Financeiro: CNPq/CAPES/FACEPE
117
APÊNDICE D – Resumo
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANÁLISE MOTORA NO USO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE ATEMOIA (ANNONA CHERIMOLA MILL. X ANNONA SQUAMOSA L.) EM CAMUNDONGOS
HÁLLISON DO NASCIMENTO SILVA
1; TÂMARA COIMBRA DINIZ
1; ROXANA BRAGA ANDRADE
TELES1; JULIANE CABRAL SILVA
1; SARAH RAQUEL GOMES LIMA SARAIVA
1; PAULO VICTOR
AMORIM MARQUES2
; RAIMUNDO GONÇALVES OLIVEIRA JUNIOR1
;JACKSON ROBERTO GUEDES SILVA ALMEIDA
1
1 NEPLAME, Universidade Federal do Vale do São Francisco - UNIVASF.
2 Acadêmico do curso de Medicina, UNIVASF – Petrolina-Pe - Brasil.
Introdução: A família Annonaceae compreende um grande número de gêneros e
espécies, cuja maioria é nativa das regiões tropicais, com cerca de 2.500 espécies
em aproximadamente 135 gêneros. A atemoia é um híbrido entre a (A. cherimola
Mill. x A. squamosa L.). Objetivo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti-
inflamatório e a ação sobre a coordenação motora do extrato etanólico das folhas de
atemoia. Métodos: Grupos de camundongos (n=6), Swiss, machos, entre 30 e 40 g.
A atividade anti-inflamatória de Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) foi avaliada
através dos testes de peritonite e bolsa de ar, induzido pela carragenina (Cg) (1%,
i.p.,0.25 mL). Dexametasona (2 mg/kg, i.p.), foi utilizada como droga padrão. O
controle recebeu S.F 0,9%. O teste rota-rod, foi utilizado para avaliar a coordenação
motora nos intervalos (30, 60 e 120 min.), nas mesmas doses do Acs-EtOH, e o
diazepam (2,5 mg/kg) como controle positivo. Os dados foram analisados no
GraphPad Prism®. Os testes foram realizados após a aprovação pela Comissão de
Ética no Uso de Animais da UNIVASF, protocolo 0003/110414. Resultados: O
tratamento com as doses de Acs-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) foi capaz de inibir
significativamente o número de migração de mediadores inflamatórios, induzida
pela Cg 1% no teste de peritonite (19,98±1,31; 16,64±0,77 e 11,18±0,63); e no teste
bolsa de ar, (13,88±0,55; 12,03±0,33 e 8,50±0,37), apresentando diferenças
estatísticas (p<0.05), quando comparadas ao grupo controle. No rota-rod, as doses
de 25, 50 e 100 mg/kg do Acs-EtOH v.o., não alteraram a coordenação motora dos
animais na barra giratória nos tempos de 30, 60 e 120 minutos. Conclusões: Os
resultados mostram que a administração via oral de Acs-EtOH apresentou efeito
anti-inflamatório e não alterou a coordenação motora dos animais.
Palavras-chave: Atemoia; anti-inflamatória; peritonite; bolsa de ar; rota-rod. Apoio Financeiro: CNPq/CAPES.
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APÊNDICE E – Certificado
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APÊNDICE F – Certificado
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ANEXOS
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ANEXO A – Aprovação do comitê de ética
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ANEXO B – Tabela de triagem comportamental
Triagem Farmacológica (Modelo retirado de Almeida et al., 1999)
