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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
Bethânia Alves de Avelar
DETECÇÃO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMÁTICAS (INTERFERON
GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL, INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA
10) EM LEUCÓCITOS HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUÍDO
DE Euphorbia tirucalli
Diamantina
2010
Bethânia Alves de Avelar
DETECÇÃO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMÁTICAS
(INTERFERON GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL,
INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA 10) EM LEUCÓCITOS
HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUÍDO DE
Euphorbia tirucalli
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas. Área de concentração: Farmacologia de produtos naturais e plantas medicinais. Orientador: Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo - UFVJM Coorientador: Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes - UFMG
Diamantina
2010
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo cuidado;
Ao meu pai Américo e minha mãe Lúcia, pelo exemplo de perseverança, amizade, apoio e
dedicação;
Ao meu irmão Américo, pelo companheirismo;
Aos meus tios, Lucimar, Lucinéia, Lucilene, Estanislau e Luciano, pela bondade, incentivo e
prontidão em ajudar;
Ao Professor Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo, pelo auxílio na formação
acadêmica, pela amizade e o exemplo de Pesquisador;
À Professora Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes, pela disposição em coorientar;
Ao Professor Dr. Herton Helder Rocha Pires (Tim), pelo incentivo e confiança desde a
iniciação científica;
À equipe do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas da UFVJM pelos conselhos e
apoio;
Ao Dr. Olindo Martins Filho, pelas contribuições ao trabalho;
Aos funcionários da Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, pelo comprometimento;
À equipe do laboratório de Imunologia da UFVJM, pelo incentivo e apoio, e trabalho em
equipe;
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
“Uma paixão forte por qualquer objeto
assegurará o sucesso, porque o desejo
pelo objetivo mostrará os meios.”
William Hazlitt
RESUMO
O uso de plantas da família Euphorbiaceae, principalmente do gênero Euphorbia, tem sido
popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenças de natureza
infecciosa, tumoral e inflamatória. Entre as espécies desse gênero, a Euphorbia tirucalli é
uma planta de uso difundido no Brasil e em algumas regiões, tal como a do Vale do
Jequitinhonha. Há indícios de que o látex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e
antiviral, porém, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nessa ação. É provável que o
mecanismo de ação para tais atividades envolva a ativação de leucócitos e a produção de
citocinas para o direcionamento de uma resposta antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso,
o presente trabalho avaliou a produção de citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas
populações e subpopulações leucócitárias do sangue periférico estimulados com o látex bruto
da referida planta. Para tal, leucócitos do sangue periférico de vinte indivíduos hígidos foram
incubados por 4 horas com o látex bruto de E. tirucalli diluído em Dimetilsulfoxido (DMSO)
e constituiu o grupo látex (Lt). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO, utilizando-
se o mesmo período de incubação, constituíram as culturas controle não estimuladas (CC) e
controle de solvente (DMSO), respectivamente. Após o período de incubação, as células
foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para receptores de superfície celular
CD4, CD8 e CD14, bem como para as citocinas intracitoplasmáticas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-
10. A aquisição e análise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os resultados
demonstraram um aumento significativo (p < 0,05) no percentual de linfócitos T e sua
subpopulação T CD4 positivos para as citocinas do tipo 1, TNF-α e IFN-γ. Essas citocinas são
responsáveis por ativar o sistema imune para respostas imunoprotetoras frente às infecções
virais e processos tumorais. Já os neutrófilos e linfócitos T CD8, nas culturas estimuladas com
o látex da planta, apresentaram um perfil misto de produção de citocinas do tipo 1 e 2. Esses
resultados evidenciaram uma resposta do tipo 1 predominante, in vitro, e uma provável
ativação de mecanismos moduladores, mediados por linfócitos T CD8 e neutrófilos. Este
estudo sugere que a utilização popular da planta em infecções virais e processos tumorais
pode ter algum fundamento, tendo em vista a produção preferencial de citocinas do tipo 1 em
células estratégicas da resposta imune celular, fundamental no combate às patologias
mencionadas. No entanto, os estudos in vitro aqui realizados não são suficientes para garantir
que a utilização da planta no contexto in vivo possa, de fato, apresentar tais propriedades.
Assim, estudos adicionais, incluindo outros ensaios in vitro, bem como ensaios pré-clínicos,
são fundamentais para o avanço das pesquisas envolvendo a utilização de E. tirucalli para fins
terapêuticos.
Palavras-chave: Euphorbia tirucalli, imunomodulação, planta medicinal, pro-
inflamatória.
ABSTRACT
The use of plants in the family Euphorbiaceae, especially of the genus Euphorbia, has been
popularly circulated for the treatment of a variety of infectious, tumoral and inflammatory
illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is a the plant with widespread
use in Brasil and in some regions, such as the Vale do Jequitinhonha. There is evidence that
the latex of E. tirucalli has antiviral and antitumor activity, but little is known about the
mechanisms involved in this action. It is likely that the mechanism of action for such
activities involves leukocyte activation and cytokine production for directing an effective
antitumor and antiviral response. Thus, the present study evaluated the production of
cytokines TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-10 in the populations and subpopulations in peripheral
blood leukocytes stimulated with crude latex of this plant. For such, peripheral blood
leukocytes of twenty healthy subjects were incubated for 4 hours with crude latex of E.
tirucalli diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) and was the latex group (Lt). Cell cultures
incubated with saline and DMSO, using the same incubation period, represent the control
cultures that were not stimulated (CC) and solvent control (DMSO), respectively. After the
incubation period, cells were stained with monoclonal antibodies specific to cell surface
receptors CD4, CD8 and CD14, as well as for TNF-α intracytoplasmic cytokines, IFN-γ, IL-4
and IL-10. The acquisition and analysis were performed by flow cytometry. The results
showed a significant increase (p <0.05) in the percentage of T lymphocytes and their
subpopulation T CD4 positive for type 1 cytokines, TNF-α and IFN-γ. These cytokines are
responsible for activating the immune system to immunoprotective responses against viral
infections and tumor processes. However the neutrophils and T CD8 lymphocytes, in cultures
stimulated with the latex of the plant, showed a mixed profile of cytokine production of type 1
and 2.These results showed a response of the type 1 predominant, in vitro, and a probable
activation of modulatory mechanisms mediated by T CD8 lymphocytes and neutrophils.This
study suggests that the popular use of plant in viral infections and tumor processes may have
some foundation, in order to preferential production of type 1cytokines in strategic cells of
the cellular immune response, that is essential in combating the diseases mentioned. However,
in vitro studies conducted here are not sufficient to ensure that the use of the plant in vivo
context may, in fact, possesses such properties.
Thus, further studies including other in vitro tests and preclinical trials are fundamental to the
advancement of research involving the use of E. tirucalli for therapeutic purposes.
Keywords: Euphorbia tirucalli, Immunomodulation, Medicinal plant, Pro-inflammatory.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Etapas do desenvolvimento de um novo fármaco .............................. 2
Figura 2- Imagens da E. tirucalli ....................................................................... 9
Figura 3- Principais funções atribuídas à citocina INF-γ ................................... 14
Figura 4- Principais funções atribuídas à citocina TNF-α ................................. 14
Figura 5- Coleta do látex .................................................................................... 20
Figura 6- Estratégia de análise por citometria de fluxo ..................................... 24
Figura 7- Percentual de células viáveis em leucócitos mononucleares circulantes
do sangue periférico de indivíduos hígidos nos tempos 24 horas, 48 horas
e 72 horas e estimulados com deve ficar salina, DMSO, e Látex de E.
tirucalli nas concentrações de deve ficar 5%, 10%, 20% e 30%
................................................................................
26
Figura 8- Análise do percentual médio de neutrófilos-IFN-γ+ e neutrófilos-TNF-
α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.............................................................................................................
27
Figura 9- Análise do percentual médio de neutrófilos-IL-4+ e neutrófilos-IL-10+ de
culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.............................................................................................................
28
Figura 10- Análise do percentual médio de monócitos-TNF-α+ de culturas de
leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ....................................
29
Figura 11- Análise do percentual médio de monócitos-IL-4+ e monócitos-IL-10+ de
culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.............................................................................................................
30
Figura 12- Análise do percentual médio de linfócitos-IFN-γ+ e linfócitos-TNF-α+ de
culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.............................................................................................................
31
Figura 13- Análise do percentual médio de linfócitos-IL-4+ e linfócitos-IL-10+ de
culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ............
32
Figura 14- Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IFN-γ+ e linfócitosT
CD8-TNF-α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.................................................................................
33
Figura 15- Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IL-4+ e linfócitosT
CD8-IL-10+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.................................................................................
34
Figura 16- Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IFN-γ+ e linfócitosT
CD4-TNF-α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.................................................................................
35
Figura 17- Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IL-4+ e linfócitosT
CD4-IL-10+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt
.................................................................................
36
Figura 18- Resumo dos resultados obtidos na expressão de citocinas nas populações e
subpopulações estudadas, quando estimulados com o látex bruto de E.
tirucalli diluído á 10% em DMSO ..........................
37
Figura 19- Vias envolvidas na transcrição gênica para síntese de citocinas pró-
inflamatórias .......................................................................................
42
LISTA DE TABELAS
1 - Espécies do gênero Euphorbia com atividade citotóxica/ antitumoral ........... 6
2 - Posição sistemática da Euphorbia tirucalli ..................................................... 9
3 - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de
populações leucocitárias e marcação de citocinas ......................................
23
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................
1
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................... 2
2.1 O estudo de plantas medicinais ............................................................. 2
2.2 A família Euphorbiaceae ...................................................................... 4
2.3 O gênero Euphorbia .............................................................................. 4
2.3.1 Estudos das atividades biológicas de plantas do gênero Euphorbia ..... 5
2.3.1.1 Atividade antitumoral ........................................................................... 5
2.3.1.2 Atividade antimicrobiana ...................................................................... 6
2.3.1.3 Ação antiviral ........................................................................................ 7
2.3.1.4 Ações que interferem em processos alérgicos e inflamatórios ............. 7
2.3.1.5 Atividade antiinflamatória .................................................................... 7
2.3.1.6 Modulação das Proteínas associadas à múltipla resistência à drogas ... 8
2.4 Euphorbia tirucalli ............................................................................... 8
2.4.1 Constituintes químicos do látex de E. tirucalli ..................................... 10
2.4.2 Toxicologia associada à E. tirucalli ...................................................... 10
2.4.3 Atividades atribuídas ao látex de E. tirucalli ........................................ 11
2.5 Sistema imune contra infecções virais .................................................. 12
2.6 Sistema imune no combate à células tumorais ..................................... 15
2.7 Resposta imune do tipo 1 e do tipo 2 .................................................... 16
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................ 17
4 OBJETIVO......................................................................................... 18
4.1 Objetivo geral ....................................................................................... 18
4.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 18
5 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................... 19
5.1 População estudada ............................................................................... 19
5.2 Amostras de sangue .............................................................................. 19
5.3 Certificação botânica ............................................................................ 19
5.4 Coleta das amostras de látex de Euphorbia tirucalli ............................ 19
5.5 Triagem da citotoxicidade in vitro do látex bruto de E. tirucalli à leucócitos
mononucleares do sangue periférico ...................................
20
5.6 Análise de citocinas intracitolasmáticas por citometria de fluxo ......... 21
5.7 Estratégia de Análise ............................................................................ 23
5.8 Análise Estatística ................................................................................. 24
6 RESULTADOS ................................................................................ 26
6.1 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico
humano in vitro após estimulação com o látex bruto de Euphorbia tirucalli
..................................................................................................
26
6.2 Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico
estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................
27
6.2.1 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em neutrófilos do sangue
periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................
27
6.2.2 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos do sangue
periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................
29
6.2.3 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos e subpopulações
linfocitárias T CD8 e T CD4 do sangue periférico estimulados com látex
bruto de E. tirucalli ..........................................
31
7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS .......................................... 38
8 CONCLUSÃO ................................................................................. 44
REFERÊNCIAS ...............................................................................
45
ANEXO ................................................................................ 54
1 INTRODUÇÃO
As plantas da família Euphorbiaceae são amplamente utilizadas na cultura tradicional
popular para fins terapêuticos. Algumas espécies identificadas contêm compostos bioativos
que conferem a essas plantas potencial para o tratamento de doenças (PUSZTAI et al., 2007;
LAGE et al., 2009). Alguns desses compostos demonstraram ter atividade sobre o
comportamento funcional de leucócitos do sangue periférico. Porém, embora seja possível
sugerir que extratos de plantas do gênero Euphorbia interfiram na funcionalidade de
populações e subpopulações leucocitárias, os mecanismos moleculares envolvidos nesses
processos ainda não estão bem elucidados (BANI et al., 2007).
Estudos prévios têm mostrado que as plantas do gênero Euphorbia apresentam a
capacidade de alterar alguns parâmetros celulares e moleculares do sistema imunológico.
Amirghofran e colaboradores (2008) demonstraram um aumento da citocina mitogênica
Interleucina-2 (IL-2) no sobrenadante de culturas de leucócitos do sangue humano
estimuladas com extrato metanólico de Euphorbia cheiradenia. Essa capacidade de alterar a
produção de citocinas também foi demonstrada em estudos que avaliaram a capacidade
antialérgica de Euphorbia hirta L.. Segundo Singh e colaboradores (2006), o extrato da planta
foi capaz de aumentar a produção de Interferon-gamma (IFN-γ) e diminuir a produção de IL-
4, e regular negativamente a resposta imune humoral, prevenindo os efeitos indesejáveis da
resposta alérgica. As citocinas são fatores solúveis que, uma vez liberadas no meio
extracelular, promovem a ativação de vários componentes do sistema imune tais como a
produção de anticorpos e citotoxicidade. Nenhum estudo até então verificou o perfil de
produção de citocinas nas populações específicas de leucócitos estimulados com o látex bruto
de Euphorbia tirucalli numa análise celular individualizada.
Tendo em vista a utilização popular de E. tirucalli no tratamento de algumas doenças
que necessitam da participação efetiva do sistema imunológico, tais como tumores e infecções
virais, o presente estudo avaliou o perfil de produção de citocinas do tipo 1 (pró-
inflamatórias: IFN-γ e Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α)) e do tipo 2 (IL-4 e IL-10) em
populações e subpopulações leucocitárias do sangue periférico humano, submetidos à
estimulação rápida (4 horas) com o látex bruto de E. tirucalli.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O estudo de plantas medicinais
O conhecimento tradicional sobre as propriedades curativas de plantas medicinais
contribui para a formulação de fármacos e auxilia as práticas terapêuticas (SCHMIDT et al.,
2008). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial fazem
uso de plantas medicinais na atenção primária à saúde (OMS, 2002). No entanto, muitas
dessas plantas ainda não foram estudadas, nem o seu uso foi padronizado. Isto impede o uso
racional e seguro de muitas destas plantas medicinais.
Uma vez que o uso popular das plantas medicinais fornece evidências de algumas
atividades biológicas, a investigação científica através de modelos experimentais adequados
torna-se necessária em todas as etapas envolvidas na formulação de um novo fármaco. Por
meio do desenvolvimento dessas etapas experimentais é possível validar o uso tradicional de
algumas plantas, bem como indicar os parâmetros que permitam a sistematização do uso
(HEINRICH e GIBBONS, 2001).
O relato de experiências bem sucedidas do uso de plantas no tratamento e cura de doenças
pela população instiga a pesquisa científica na formulação de fármacos, contribuindo para a
fase de descoberta. Esta fase envolve triagens experimentais na pesquisa básica. Na FIG. 1
estão apresentadas as fases de desenvolvimento de um novo fármaco (CHIN e FERREIRA,
1999).
Pesquisa básica
•Triagem e
Descoberta
Pesquisa Pré-
clínica
•Modelos
animais,
ensaios in
vitro
Pesquisa Clínica
•Fase I
•Fase II
•Fase III
Pesquisa pós-
comercializaçãp
•Farmacovigi-
lância (Fase IV)
FIGURA 1- Etapas do desenvolvimento de um novo fármaco
Muitos compostos bioativos foram descobertos e isolados a partir de fontes naturais e
são hoje utilizados nas formulações alopáticas (ITOKAWA et al., 2008). Dos medicamentos
utilizados na clínica médica, 25% têm sua origem nas plantas (PHILLIPSON et al., 2007).
Embora a descoberta de muitas moléculas com propriedades curativas tenha se originado de
investigações com produtos naturais de origem vegetal, a produção em larga escala de muitos
desses fármacos requer processos de obtenção de princípios ativos além de modelagem
molecular e síntese química.
Como exemplo disso, o uso popular dos extratos da Catharanthus roseus, conhecida
como Pervinca ou Vinca rósea, no tratamento da Diabetes mellitus, levou a investigação de
suas ações terapêuticas. Ensaios em modelos animais demonstraram que os extratos causavam
a granulocitopenia e a supressão da medula óssea, bloqueando células em mitose (HANSEN
& NISSEN, 1972). Esses extratos produziram quatro alcalóides diméricos ativos conhecidos
como alcalóides da vinca: a vimblastina, a vincristina, a vinleurosina e a vinrosidina. Os
alcalóides purificados causaram regressão da leucemia linfocítica aguda em camundongos. A
vimblastina e a vincristina são agentes clínicos importantes no tratamento de leucemias,
linfomas e do câncer testicular (NOBLE et al., 2009).
O Brasil, um país tropical, possui uma biodiversidade em sua flora com plantas
nativas e exóticas adaptadas que lhe conferem um grande potencial para desenvolvimento de
fitoterápicos e outros fármacos a partir de insumos vegetais. As culturas tradicionais
brasileiras utilizam com frequência as plantas medicinais com propriedades curativas, e esse
conhecimento é transmitido ao longo de gerações. Na atualidade, o Sistema Único de Saúde
brasileiro (SUS) busca o fortalecimento do uso dos fitoterápicos na atenção básica da saúde
(Brasil, 2006).
Considerando o uso de plantas medicinais e a fitoterapia como práticas terapêuticas
complementares à saúde, em 2006, o governo federal brasileiro aprovou junto ao ministério
da saúde a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) que visa propor
formas alternativas à terapêutica e incentivar o desenvolvimento comunitário, a solidariedade
e a participação social na saúde. Uma das diretrizes dessa política é incentivar grupos de
pesquisa com atuação voltada para a farmacologia de plantas medicinais, principalmente no
enfrentamento das principais necessidades epidemiológicas identificadas no país.
2.2 A família Euphorbiaceae
A família compreende plantas com cerca de 300 gêneros e 6000 espécies, distribuídas
predominantemente em regiões tropicais. No Brasil, ocorrem cerca de 70 gêneros e 1000
espécies, o que a torna uma família comum na formação da flora brasileira e uma das mais
complexas do ponto de vista taxonômico (SOUZA e LORENZI, 2008). Em geral, as espécies
apresentam látex cáustico que, quando em contato direto com mucosas, principalmente dos
olhos, pode causar lesões graves (SHLAMOVITZ et al., 2009).
Algumas plantas da família Euphorbiaceae têm importância econômica como a
mamona, espécie africana Ricinus communis L, cujas sementes são utilizadas na produção do
óleo de rícino e de biodiesel, e a seringueira da Amazônia, Hevea brasiliensis, importante na
produção de borracha e extensamente cultivada na Malásia e Indonésia (SOUZA e LORENZI,
2008).
Espécies dessa família são conhecidas também pelo seu potencial terapêutico.
Destacam-se o quebra-pedras, designação comum a várias espécies do gênero Phyllantthus
reconhecidas, popularmente, por suas propriedades diuréticas, sendo utilizadas na eliminação
de litíases renais (BAGALKOTKAR et al., 2006; KARUA et al., 2009). As plantas do gênero
Euphorbia apresentam diversas atividades terapêuticas, e entre tais atividades destacam-se as
atividades antivirais e antitumorais.
2.3 O gênero Euphorbia
O gênero Euphorbia é o maior gênero da família Euphorbiaceae (SHLAMOVITZ et
al., 2009). As Euphorbias são encontradas nos continentes africano, asiático e na América do
Sul. Como possuem uma predileção por regiões áridas, não são comuns em lugares de clima
frio (RAVIKANTH et al., 2003). Algumas espécies do gênero são encontradas como ervas
daninhas, em jardins, ou como elementos decorativos, em casas.
Uma vez que possuem vários compostos bioativos em suas constituições, tais como
alcalóides, flavonóides, taninos e terpenos (PUSTZTAI et al., 2007; ZHANG et al., 2008;
WANG et al., 2006), as plantas do gênero Euphorbia são tradicionalmente utilizadas pela
cultura popular como plantas medicinais. Como exemplos, a espécie E. hirta é utilizada em
doenças respiratórias (SINGH et al., 2006), e a E. tirucalli é comumente utilizada no
tratamento de doenças virais (BENTACUR-GALVIS et al., 2002). Muitos estudos têm sido
conduzidos no sentido de comprovar as atividades de plantas do gênero Euphorbia e validar
seu uso.
2.3.1 Estudos das atividades biológicas de plantas do gênero Euphorbia
2.3.1.1 Atividade antitumoral
Muitas espécies do gênero Euphorbia têm demonstrado atividade citotóxica a diversas
linhagens tumorais. A TAB. 1 apresenta algumas dessas espécies. O extrato metanólico de E.
cheradenia pulverizado e diluído em Dimetilsulfóxido (DMSO) foi capaz de induzir a
apoptose de células leucêmicas das linhagens K562 e Jurkat (AMIRGHOFRAN et al., 2006).
A apoptose foi analisada por meio de testes de viabilidade celular e por fragmentação do
DNA.
O Putranjivain, um tanino extraído de E. jolkini inibiu a proliferação do
adenocarcinoma de mama humano da linhagem MCF-7, bloqueando a divisão celular,
mantendo as células estacionárias nas fases G0 ou G1 do ciclo celular (KUO et al., 2006).
Uma fração de E. peplus induziu apoptose em células de melanoma humano, linhagens Me
4405 e Me 1007 (GILLESPIE et al., 2004). Essa apoptose foi observada por ativação das vias
mitocondrial e caspase dependente. Um diterpeno extraído de E. fischeriana demostrou ser
um inibidor da via NF-КB (Fator Nuclear Kappa-B) (YAN et al., 2008). O fator de
transcrição NF-КB apresenta, entre outras funções, a ativação de genes necessários para o
processo de angiogênese, necessário para a sobrevida e metástase do tumor. Assim, com a
inibição dessa via, possivelmente o tumor não terá progressão.
Para a avaliação da ação antimutagênica do látex de E. tirucalli, foi utilizado um
modelo do sistema metionina no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. O tratamento com o
látex de E. tirucalli diminuiu a taxa de mutação (REZENDE et al., 2004). A ação
antimutagênica do látex é positiva porque minimiza o surgimento espontâneo de células
tumorais.
O extrato de E. tirucalli diluído em salina exibiu uma atividade mielomoduladora e
inibiu crescimento tumoral em animais com células de tumor ascítico. O tratamento com
extrato de E. tirucalli também aumentou a sobrevida dos ratos (VALADARES et al., 2006).
O aumento da mielopoiese pode ser um possível mecanismo para a atividade antitumoral da
planta, uma vez que aumenta a produção de granulócitos, bem como sua atividade funcional
importante na imunovigilância.
TABELA 1
Espécies de Euphorbias com atividade citotóxica/ antitumoral.
Espécie Linhagem tumoral e/ou tipo
de tumor*
Referência
E. peplus Me 4405 e Me 1007 (GILLESPIE et al., 2004)
E. jolkini MCF-7 (KUO et al., 2006)
E. fischeriana U937, Jurkat, CoLo205, HGc,
MCF-7, A549, H460, HepG2
(YAN et al., 2008; Wang et al.,
2006)
E. cheiradenia Jurkat, K562 (AMIRGHOFRAN et al., 2006)
E. tirucalli Ehrlich ascite (VALADARES et al., 2006)
E. helioscopia HL-60 (TAO et al., 2008)
E. salicifolia L5178, L5178Y (HOHMANN et al., 2002)
E. serrulata L5178, L5178Y (HOHMANN et al., 2002)
E. poisonii A-498, MCF-7, PACA-2, A-
549, PC-3
(FATOPE et al., 1996)
* Me 4405 e Me 1007: Linhagem de células de melanoma humano/ MCF-7: Linhagem celular
de adenocarcinoma mamário humano/ U937: Linhagem celular leucêmica monocítica
humana/ Jurkat: Linhagem celular leucêmica de células T humana/ CoLo20: Linhagem
celular de câncer coloretal humano/ HGc: Linhagem celular de carcinoma gástrico humano/
A549: Linhagem celular de adenocarcinoma alveolar humano/ H460: Linhagem celular de
câncer pulmonar humano/ HepG2: Linhagem celular de hepatocarcinoma humano/ K562:
Linhagem celular leucêmica eritroblástica humana/ HL-60: Linhagem celular leucêmica
eritroblástica humana/ L5118, L5118Y: Linhagens de células leucêmicas linfoblásticas
murinas/ A-498: Linhagem de células de carcinoma renal humano/ PACA-2: Linhagem
celular de tumor pancreático humano/ PC-3: Linhagem celular de câncer de próstata humano.
2.3.1.2 Atividade antimicrobiana
O extrato etanólico das partes aéreas de E. hirta exibiu atividade antimicrobiana
contra Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa pelo método de difusão
(SUDHAKAR et al., 2006) . Já a mistura complexa de quatro glicocerebrosídeos extraídos de
E. peplis tiveram atividade antifúngica contra Candida spp. E. Cryptococcus neoformans
(CATENI et al., 2003). Utilizando o método de difusão, pesquisadores observaram que o
extrato aquoso das partes frescas de E. tirucalli teve ação antimicrobiana contra Erwinia
carotovora pv carotovoea, Xanthomonas campestris pv campestris, e Pseudomonas
solanacearum (LIRIO et al., 1998).
2.3.1.3 Ação antiviral
As euphorbias E. cotinifolia e E. tirucalli exibiram ação antiherpética (BENTACUR-
GALVIS et al., 2002), em que a eficiência desses extratos diluídos em água/metanol foi sete
vezes superior ao fármaco Aciclovir tratado no grupo controle, usualmente utilizado no
tratamento de herpes simples. O extrato etanólico de E. thimifolia também apresentou
atividade antiherpética por inativar o vírus Herpes simplex 2 e diminuir sua infectividade
(YANG et al., 2005). Já diterpenoides isolados de E. paralias demonstraram moderada
atividade contra a replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) em culturas
celulares (ABDELGALEIL et al., 2001).
2.3.1.4 Ações que interferem em processos alérgicos e inflamatórios
Euphorbia hirta tem a capacidade de evitar reações alérgicas do tipo tardias
(hipersensibilidade do tipo 4). Isso foi observado em modelo animal de ratos sensibilizados
com ovalbumina em que o tratamento com E. hirta atenuou a liberação de (IL-4) e aumentou
a secreção de INF-γ (SINGH et al., 2006). Isso demonstra que constituintes químicos de E.
hirta favorece uma resposta imune do tipo celular em detrimento da resposta imune humoral.
Além disso, ésteres extraídos de E. tirucalli exibiram efeito inflamatório em orelha de
ratos, e essa inflamação foi caracterizada por uma irritação e aumento do rubor, que é um
sinal clássico da inflamação (KINGHORN et al., 1979). De forma semelhante, dierpenos
isolados de E. peplus tiveram um efeito inflamatório em orelha de ratos, caracterizado pelo
rubor (HOHMANN et al., 1999).
2.3.1.5 Atividade anti-inflamatória
Já a fração biopolimérica de polissacarídeos presentes no látex de E. tirucalli inibiu a
inflamação provocada pela artrite em modelo animal. Os sinais para essa ação anti-
inflamatória foram: redução da permeabilidade vascular e migração leucocitária, supressão
dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ e suas citocinas intracitoplasmáticas pró-inflamatórias INF-γ
e IL-2 (BANI et al., 2007). De forma semelhante, uma fração do extrato de E. royleana
também exibiu ação anti-inflamatória em modelo animal, caracterizada pela redução do
edema e da migração leucocitária (BANI et al., 2000). O tratamento com extrato etanólico de
E. hirta em modelo animal de anafilaxia, uma reação inflamatória exacerbada ocasionada pela
liberação de mediadores inflamatórios, dentre os quais se destaca a histamina liberada por
mastócitos e basófilos, foi capaz de diminuir a gravidade da reação, reduzindo o edema e os
níveis plasmáticos das citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e o TNF-α (YOUSSOUF et al.,
2007). Já a aplicação tópica de tirucallol, um triterpeno isolado do látex de E. láctea, diminuiu
o edema e inibiu a expressão da enzima óxido nítrico sintetase (iNOS), de forma semelhante à
dexametasona, um potente anti-inflamatório (FERNANDEZ-ARCHE et al., 2010).
2.3.1.6 Modulação das Proteínas associadas à múltipla resistência a drogas (MDR)
Produtos de algumas plantas do gênero Euphorbia parecem ter a capacidade de
modular a expressão dos MDRs, proteínas que diminuem a concentração intracelular de
fármacos antibióticos e quimioterápicos, e assim promovem um prejuízo à eficácia terapêutica
(HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2010). O tratamento com compostos isolados de E.
lagascae e E. tuckeyana reduziu a expressão dos genes que comandam a síntese de MDRs,
porém, os mecanismos para essa modulação ainda não foram descritos. Dessa forma, tais
plantas poderiam ser úteis no campo quimioterápico de diversas doenças, uma vez que
proporcionariam a manutenção dos fármacos no interior das células (WESOLOWSKA et al.,
2007).
2.4 Euphorbia tirucalli
A planta, também conhecida como árvore-lápis, aveloz, mata-verruga e cega-olho, tem
como sinonímia botânica o nome Euphorbia rhipsaloides Lem. A planta é originária da
África e foi trazida para os países tropicais, incluindo o Brasil, onde é encontrada no estado
do Amazonas, em Minas Gerais, na região Nordeste e também na costa do Estado de São
Paulo (CORREIA, 1984). A TAB. 2 estabelece a posição sistemática da E. tirucalli.
TABELA 2
Posição sistemática da Euphorbia tirucalli
A Euphorbia tirucalli é um arbusto, semilenhoso, medindo em torno de 4 metros de
altura, lactescente, com inúmeros ramos verdes, suculentos, cilíndricos, com poucas folhas e
flores pequenas e raras (FIG. 2). O arbusto é bem adaptado em solos pobres e secos e é
frenquetemente encontrado em regiões de clima quente e solo arenoso. No Brasil, o látex da
planta é utilizado na cultura popular como agente laxante, para controle de parasitoses
intestinais, para tratar asma, verrugas e câncer (BENTACUR-GALVIS et al., 2002).
A B
FIGURA 2 - Imagens da E. tirucalli. (A) Planta inteira (B) Detalhamento dos ramos
Reino Plantae
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Subclasse Magnoliidae
Ordem Malpighiales
Família Euphorbiaceae
Gênero Euphorbia
Espécie Euphorbia tirucalli
2.4.1 Constituintes químicos do látex de E. tirucalli
O látex bruto de E. tirucalli contém em torno de 53,8 a 79,9% de água e seus
principais constituintes químicos são: 12-0-22-octadieno-4-deoxiforbol-13-acetato, ácido
metil elágico; β-sitosterol; ácido cítrico; eufol; euforona, glicose; hentriacontanol; isoeuforal;
ácido málico; sapogenina; ácido succínico; taraxasterol; e tirucalol (FURTENBERGER et al.,
1986). Achados posteriores caracterizaram quatro terpenos (KHAN et al., 1987) extraídos do
látex e do caule da planta, um triterpeno pentaciclico euphorcinol (KHAN et al., 1989), bem
como um novo diterpeno macrocíclico (KHAN et al., 1990). Esses constituintes químicos são
biologicamente ativos. Outros ésteres de phorbol sabidamente têm ação em processos
biológicos como a inflamação e a modulação da expressão de citocinas (BISHAYI et al.,
2002; KERR et al., 1987; SIERAKOWSKI et al., 1988; SMITH et al., 1998). Alguns
terpenos têm também a ação biológica estudada na indução da apoptose de células tumorais,
bem como na modulação da expressão das MDRs (ABDELGALEI et al, 2001; DUARTE et
al., 2009).
2.4.2 Toxicologia associada à E. tirucalli
E. tirucalli é uma fonte de acidentes tóxicos. Devido à natureza cáustica do látex, uma
vez ingerido em grandes quantidades, pode causar irritação gastrintestinal. Além disso, uma
vez em contato com a pele ou mucosas, o látex pode provocar lesões do tipo eritematosas com
processo inflamatório associado. Há relatos na literatura de lesões oculares provocadas pela E.
tirucalli em que é comum a ceratoconjutivite com irritação inicial e posterior perda da
acuidade visual (HSUEH et al, 2004; SHLAMOVITZ et al., 2009).
Estudos com ratas grávidas demonstraram que o tratamento por via oral com extrato
de E. tirucalli, diluído em salina, durante 15 dias, não alterou parâmetros como a sobrevida,
sinais clínicos, e o peso dos animais e seus órgãos internos. O tratamento nem mesmo afetou a
implantação e desenvolvimento do embrião (SILVA et al., 2007). Tais resultados
demonstraram que, nas concentrações testadas, o látex da planta não exibiu toxicidade aos
embriões.
Avaliando a atividade antiherpética in vitro de E. tirucalli, foi observado que o extrato
inibiu o crescimento viral e seu ciclo lítico na concentração de 100mg/mL diluído em
água/metanol sem apresentar toxicidade às células não infectadas. Esse resultado demonstrou
um bom índice terapêutico do extrato, uma vez que a dose que exibiu atividade antiviral foi
muito inferior à menor dose tóxica da ordem de 1000 mg/mL (BENTACUR-GALVIS et al.,
2002)
2.4.3 Atividades atribuídas ao látex de E. tirucalli
O látex de E. tirucalli apresenta diversas atividades biológicas já estudadas e relatadas
na literatura, como atividades moluscicida e larvicida, que conferem à planta potencial
controle vetorial de doenças endêmicas de países tropicais (JURBERG et al., 1985;
RAHUMA et al., 2008; RAMOS et al., 2009; YADAV et al., 2002). Os autores sugerem que
o controle vetorial com utilização do extrato seria menos agressivo ao ambiente do que as
substâncias utilizadas para o controle atualmente. As ações com futuras aplicações
terapêuticas incluem a atividade antimicrobiana (LIRIO et al., 1998), antiviral (BENTACUR-
GALVIS et al., 2002), pró-inflamatória (KINGHORN et al., 1979) e anti-inflamatória (BANI
et al., 2007), conforme relatado no texto.
De acordo com os trabalhos relatados até então, é possível verificar que, embora a E.
tirucalli seja utilizada em diversos modelos experimentais que possam comprovar a sua
utilidade terapêutica contra doenças de natureza infecciosa, inflamatória ou tumoral, os
mecanismos moleculares envolvidos em tais processos ainda não foram devidamente
esclarecidos. As investigações realizadas limitam-se, na maioria das vezes, à apresentação
descritiva dos resultados obtidos com produtos da planta em comparação a controles
experimentais. Pouco se sabe em que vias metabólicas os princípios ativos da planta poderiam
estar atuando. Por isso, alguns questionamentos poderiam ser levantados: será que os
componentes bioativos da planta estariam atuando diretamente nos processos relacionados à
perpetuação dos agentes infecciosos? Será que tais substâncias também poderiam atuar em
mecanismos que levam à regressão ou controle de tumores? Ou será que tais princípios ativos
poderiam atuar de maneira indireta, alterando os elementos da resposta imunológica e
proporcionando assim uma resposta eficiente contra agentes infecciosos e células tumorais?
Tendo em vista que o presente trabalho pretende demonstrar se os princípios ativos do látex
bruto de E. tirucalli alteram alguns parâmetros imunológicos, faz-se necessário realizar uma
breve exposição das bases celulares e moleculares relacionadas ao estabelecimento de uma
resposta imune durante as infecções virais e durante os processos tumorais.
2.5 Sistema imune contra infecções virais
Os vírus são organismos intracelulares obrigatórios, que se replicam dentro das
células. Os mecanismos da imunidade inata contra os vírus envolvem basicamente a inibição
da replicação viral pelas células infectadas e a morte das células infectadas pelas células
Natural Killer (NK). As células NK lisam as células infectadas e são importantes no início e
no decorrer da infecção (BIRON et al., 1999; BIRON & BROSSAY, 2001;). Já a resposta da
imunidade adquirida aos vírus é mediada principalmente pelos linfócitos T CD8, também
conhecidos como linfócito T citotóxicos. As células infectadas por vírus são especificamente
reconhecidas por linfócitos T citotóxicos que, após se tornarem ativados, lisam diretamente as
células infectadas por meio da liberação dos seus grânulos (ZHOU, 2010). O mecanismo de
lise envolve ativação de enzimas conhecidas como caspases, que culminam com a clivagem
do DNA viral e também da célula hospedeira.
O efeito dos linfócitos T é dependente das interações com as células alvos que
desencadeiam respostas antígenos específicas (CHAVEZ-GALAN et al., 2009). Essa
interação ocorre entre o receptor de célula T e o Complexo Principal de Histocompatibilidade
(MHC) da célula alvo. O MHC é composto por proteínas de membrana cujos domínios
extracelulares formam uma fenda na qual se liga o fragmento de peptídeo, que será
reconhecido pelo receptor do linfócito T. As moléculas de MHC de classe I recrutam
peptídeos derivados de proteínas sintetizadas no citosol celular (GOULDER & WATKINS,
2008). Dessa forma, em infecções intracelulares, como infecções virais, o MHC de classe I é
capaz de expor os peptídeos virais aos linfócitos T citotóxicos na superfície celular (DEL-
VAL & LOPEZ, 2002). Para que os peptídeos se liguem à fenda do MHC I no citosol da
célula, as proteínas precisam ser degradadas em um complexo enzimático conhecido como
proteossoma. Existe também a apresentação cruzada de antígeno, quando partículas virais
podem ser endocitadas e, ainda assim, se unirem às vesículas contendo o MHC I (SNYDER
et al., 2010). O linfócito T citotóxico reconhece os peptídeos vírais nas células-alvo
associados às moléculas de MHC I, desencadeando a morte da célula infectada. Já a molécula
de MHC II se liga a peptídeos derivados de vesículas intracelulares, e assim expõe peptídeos
de patógenos que foram endocitados por células fagocíticas, que são os macrófagos, as células
dendríticas e os linfócitos B (BANGHAM et al., 2009). O MHC II apresenta os antígenos aos
linfócitos T CD4 (Th), também conhecidos como linfócitos T auxiliares. Clones Th1 são
efetivos em potencializar respostas protetoras contra as infecções virais, por liberarem
citocinas que farão predominar uma resposta pró-inflamatória caracterizada por ser uma
resposta imune celular.
As citocinas do tipo 1 são importantes nesses processos de ativação da resposta imune
ao combate aos patógenos intracelulares, bem como no reconhecimento de moléculas
consideradas “estranhas” no interior de células. O IFN-γ favorece o aumento da apresentação
de antígeno, uma vez que induz uma modificação no proteossoma que permite o aumento da
produção de peptídeos antigênicos. Células tratadas com a IFN-γ aumentam a transcrição de
cadeias do MHC I (SELIGER et al., 2008). Os linfócitos T CD4 realizam suas funções
efetoras por meio da liberação de citocinas. O IFN- γ liberados por linfócitos Th1 ativam
macrófagos e ativam células Natural Killer (NK) (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001). A
FIG. 3 apresenta as principais funções atribuídas à citocina IFN- γ. O TNF-α é também um
mediador importante da resposta imune celular, sendo os macrófagos sua principal fonte
celular (YAMAUCHI & NIITSU, 1997). Além disso, o TNF-α favorece o recrutamento de
leucócitos para o sítio da infecção, por estimular o endotélio a expressar moléculas de adesão
e também por estimular os macrófagos e células endoteliais a secretarem quimiocinas,
importantes no recrutamento tecidual de leucócitos (APOSTOLAKI et al., 2010; WAJANT,
2009). Os receptores de TNF-α pertencem a uma família que ativa proteínas intracelulares
associadas que induzem apoptose celular (SCREATON & XU, 2000). As principais funções
do TNF-α estão ilustradas na FIG. 4.
NK
TNF-α
NO
Granzimas e Perforinas
Ativação de células NK
Ativação de Macrófagos
Aumento da expressão de moléculas de MHC
Th1 Diferenciação de linfócitos Th em Th1
FIGURA 3 - Principais funções atribuídas à citocina IFN- γ.
TNF-α
Aumento da expressão de moléculas de adesão do endotélio
Aumento da permeabilidade do endotélio
Apoptose via estimulação de receptores
FIGURA 4 - Principais funções atribuídas à citocina TNF-α.
2.6 Sistema imune no combate a células tumorais
Os tumores desencadeiam respostas imunes específicas que inibem a sua existência ou
suprimem seu crescimento. Os mecanismos para controle e combate de células tumorais são
conhecidos como imunovigilância. Os tumores expressam antígenos que podem desencadear
uma resposta do sistema imune (WHITESIDE et al., 2010). Em alguns casos, proteínas que
são expressas somente em fases embrionárias são expressas por células tumorais. Tais
proteínas ao serem apresentadas, via MHC I, aos linfócitos T citotóxicos não tolerantes a
esses autoantígenos respondem a eles como se fossem moléculas estranhas ou não próprias
(BEATTY & VONDERHEIDE, 2008). Há casos em que proteínas próprias são expressas e
apresentadas em quantidades excessivas e levam ao que chamamos de quebra da tolerâncias
dos linfócitos T e, então, desencadeiam uma resposta citotóxica. Porém, as células tumorais
apresentam mecanismos de escape do sistema imune, tais como a inibição direta de células T
e a perda da expressão de antígenos que desencadeiam o escape dos tumores ao sistema imune
(GARCIA-LORA et al., 2003).
O principal mecanismo da imunidade contra células tumorais é a morte destas células
pelos linfócitos citotóxicos (BENCHETRIT et al., 2003; JAGER et al., 2001). Os linfócitos
T CD4, conhecidos como Linfócitos T auxiliares, fornecem por meio da produção de
citocinas específicas, tais como IFN-γ e TNF-α, um microambiente de citocinas que favorece
o recrutamento celular e até mesmo o aumento da expressão do MHC I nas células tumorais.
Os linfócitos T auxiliares (Th) também podem propiciar a morte de células tumorais por meio
da secreção de TNF-α, e sua ação direta sobre tais células (HOLOCH E GRIFFITH, 2009). O
TNF-α secretado em grandes quantidades provoca alterações sistêmicas como a queda de
glicose e a trombose vascular (CHEN et al., 2009; ZHANG et. al, 2009). As citocinas do
tipo 2, como IL-4 e IL-10 que antagonizam o TNF-α, são importantes por fornecerem um
equilíbrio da resposta imune, de forma que a resposta do tipo 1 seja predominante, porém não
exacerbada (FIORENTINO et al., 1991; HOLUB et al., 2009).
As células NK são potencialmente ativadas pelo IFN-γ e podem destruir células
tumorais que possuam a expressão reduzida de moléculas de MHC I ou que estejam
opsonizadas por anticorpos tumor-específicos (PEGRAM et al., 2010). Estudos mostraram
que animais que tinham a expressão de IFN-γ deficiente ou não apresentavam o receptor para
a citocina não respondiam ao tratamento antitumoral quimioterápico (GHIRINGHELLI et al.,
2009), indicando a necessidade da citocina para o êxito do tratamento antitumoral.
2.7 Resposta Imune do tipo 1 e do tipo 2
Uma resposta imune do tipo 1, também conhecida como resposta celular, é
caracterizada principalmente pela diferenciação de linfócitos T helper (Th0) em linfócitos
Th1 (ZINFANG et al., 2010). Esses linfócitos produzem citocinas conhecidas como citocinas
do tipo 1, das quais podem ser citadas o IFN-γ, TNF-α e IL-1. O IFN- γ é a citocina que
caracteriza uma célula Th1, e por consequência a resposta do tipo 1 (ELYAMAN et al.,
2009). Além de linfócitos Th, outros leucócitos também contribuem para o predomínio da
resposta imune do tipo 1 com a produção de citocinas que irão compor o microambiente. A
produção e liberação de citocinas do tipo 1 leva à imunidade mediada por células, com
ativação de macrófagos, linfócitos T citotóxicos e à produção de anticorpos
predominantemente do isotipo IgG pelos linfócitos B. Esses anticorpos são opsonizantes,
favorecendo a resposta citotóxica (DUFFIELD et al., 2003). Esta resposta é necessária para
combate efetivo de patógenos intracelulares.
Citocinas do tipo 2, como IL-4, IL-5 e IL-10, que podem ser liberadas por linfócitos
Th2 e outros leucócitos, são inibidoras da resposta do tipo 1, e úteis no controle da resposta
citotóxica (MCCOY et al., 2010). Porém, uma resposta predominantemente do tipo 2 será um
resposta humoral, em que anticorpos produzidos por células B desencadeiam a destruição de
patógenos extracelulares (GARSIDE et al., 1998). E o direcionamento de uma resposta Th2,
em infecções intracelulares, pode constituir um mecanismo de escape de patógenos como
bactérias intracelulares e vírus (WIGGINTON et al.,2001).
3 JUSTIFICATIVA
A Euphorbia tirucalli é uma planta abundante no Vale do Jequitinhonha e amplamente
conhecida na região como uma planta com propriedades anti-helmínticas, cicatrizante e anti-
inflamatória. A planta também tem seu uso popular difundido para fins terapêuticos contra
infecções virais e doenças tumorais, além do uso no tratamento local de verrugas. De fato,
algumas dessas propriedades têm sido estudadas por diversos pesquisadores, no entanto,
pouco se sabe se as ações desempenhadas pelos princípios ativos da planta agem de maneira
direta sobre os mecanismos envolvidos nos processos patológicos, anteriormente citados, ou
se tais princípios ativos poderiam alterar a resposta imune do hospedeiro frente ao estímulo,
seja ele de natureza infecciosa ou tumoral.
Tendo em vista os altos níveis de compostos bioativos presentes nas plantas do gênero
Euphorbia, é provável que algumas espécies possam realmente apresentar atividades
biológicas capazes de promover uma melhora clínica em algumas situações patológicas
(LAGE et al, 2009; PUSZTAI et al, 2007). Considerando a importância da produção de
citocinas no desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra os processos patológicos
associados à infecção, a tumores e a processos inflamatórios, é possível que muitas das
funções terapêuticas atribuídas às Euphorbiáceaes possam ser consequência da ação dos
princípios ativos das plantas sobre o sistema imune, e não somente derivar de uma ação direta
dos mesmos elementos causadores de tais patologias.
Como as ações do sistema imune no combate às infecções virais e nos processos de
eliminação de tumores possuem mecanismos semelhantes, tais como a citotoxicidade
antígeno-dependente e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), características
de uma resposta imune do tipo celular (tipo 1), o presente trabalho buscou avaliar a ação in
vitro do látex bruto de E. tirucalli na produção de citocinas em populações e subpopulações
específicas de leucócitos do sangue periférico.
4 OBJETIVO
4.1 Objetivo geral
Analisar o perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico
de indivíduos estimulados in vitro com o látex bruto de Euphorbia tirucalli.
4.2 Objetivos específicos
- Construir uma curva dose-resposta da viabilidade das células monucleares do sangue
periférico estimuladas pelo látex bruto de E. tirucalli diluído em DMSO nas concentrações de
5, 10, 20 e 30% in vitro nos tempos de incubação de 24, 48 e 72 horas.
- Analisar o perfil das citocinas intracitoplasmáticas IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 in
vitro nas populações de neutrófilos, monócitos, linfócitos e nas subpopulações de linfócitos T
CD4+ e T CD8+ do sangue periférico de indivíduos estimulados com o látex bruto de
Euphorbia tirucalli 10% diluído em DMSO.
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1. População estudada
Para o estudo funcional dos leucócitos circulantes, foram coletadas amostras de sangue
venoso de 20 indivíduos voluntários com idade variando de 21 a 56 anos (37 ± 12), sendo 6
mulheres e 14 homens. Os voluntários foram submetidos à triagem na clínica hematológica
Romeu Ibrahim de Carvalho, tendo sorologia negativa para hepatite B e C, HIV, sífilis,
doença de Chagas e HTLV e estando, assim, aptos à doação de sangue. As culturas celulares e
as análises fenotípicas foram realizadas no laboratório de Imunologia da UFVJM e no
Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoramento do Centro de Pesquisa René
Rachou – FIOCRUZ. Todos os indivíduos incluídos neste estudo assinaram o termo de
consentimento aprovado pelo Comitê de Ética da UFVJM, sob registro permanente 002/09.
5.2 Amostras de sangue
A amostra biológica constituiu-se de 8 a 15 mL de sangue total, utilizando-se a
heparina como anticoagulante. Após a coleta, num prazo máximo de 24 horas, foram feitas as
culturas celulares e posteriores análises da produção de citocinas intracitoplasmáticas em
populações e subpopulações de leucócitos periféricos, por citometria de fluxo.
5.3 Certificação botânica Euphorbia tirucalli
A identificação botânica do exemplar utilizado nos experimentos foi realizada por
botânicos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM por meio
de estudos anatômicos. O material testemunho foi depositado no herbário da referida
instituição número de registro 1897.
5.4 Coleta das amostras de látex de Euphorbia tirucalli
O látex de Euphorbia tirucalli foi coletado por meio de pipeta automática com
ponteira descartável, após incisão na base do ramo da planta adulta, com altura mínima de 2
metros. O material foi coletado pela manhã, entre 8 e 9 horas, e diluído imediatamente em
DMSO, nas concentrações de 5, 10, 20 e 30% v/v. Nessas concentrações, foi possível obter
boa diluição em DMSO, além de baixa toxicidade em leucócitos mononucleares nas primeiras
24 horas. A qualidade da solução foi determinada pela ausência de coágulos e pela sua
homogeneidade.
FIGURA 5 - Coleta do látex de E. tirucalli
5.5 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in
vitro com o látex bruto de E. tirucalli
Tendo em vista o conhecimento prévio sobre a toxicidade do látex de E. tirucalli, foi
realizado um teste de viabilidade celular a fim de indicar a concentração ideal a ser utilizada
nos ensaios de análise das citocinas intracitoplasmáticas, sem prejuízo às células em cultura.
Para a realização desse teste, foram coletados 15mL de sangue venoso de três indivíduos
jovens, aptos à doação. O sangue foi centrifugado utilizando-se um gradiente de concentração
de Ficoll-Paque (Pharmacia, Upsalla - Sweeden), na proporção de 2/1, por 20 minutos a 600g.
Posteriormente, retirou-se o anel de leucócitos mononucleares que foram depositados em
tubos cônicos de 50mL. O volume do tubo foi completado para 40 mL de salina tamponada -
PBS (PBS 0,015 M pH 7,4) e a solução foi então centrifugada novamente. Essa etapa de
lavagem foi repetida. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado, mantendo-se um
volume de 1mL, seguido de ressuspensão das células. 10µL dessa suspensão celular foram
incubados por cinco minutos com 190µL de azul de tripam a 0,4% em PBS. Para ajustar a
concentração da suspensão celular para 1 x 107 células/mL, foi feita a contagem das células
viáveis utilizando-se Câmara de Neubauer. 50µL da suspensão celular, totalizando 500000
células/poço, foram incubados com 1925µL de RPMI completo e 25µL das soluções estoque
de látex diluídas em DMSO, em diferentes concentrações, sendo elas: Látex a 5% (Lt 5%),
Látex a 10% (Lt 10%), Látex a 20% (Lt 20%) e Látex a 30% (Lt 30%). Como o volume em
cada poço foi 2mL nas culturas chamadas de Lt 5%, Lt 10%, Lt 20% e Lt30%, o látex de E.
tirucalli estaria na concentração final, em cada poço, de 0,0625%, 0,125%, 0,25% e 0,5%
respectivamente. Culturas celulares estimuladas com salina e DMSO foram realizadas e
constituíram os grupos controle (CC) e controle do solvente (DMSO, respectivamente. As
culturas foram realizadas em triplicata, utilizando placas de 24 poços, sendo cada replicata
reservada para a análise dos tempos 24, 48 e 72 horas de incubação. Ao fim da incubação, as
células foram colocadas em tubos de fundo redondo de 5mL e lavadas com 2mL de PBS.
10µL das suspensões celulares foram incubados com 190µL de azul de tripam por 5 minutos.
Foi feita, então, a contagem das células viáveis e inviáveis utilizando-se Câmara de Neubauer.
A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis não coradas no
universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).
5.6 Análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo
A detecção de citocinas intracelulares por citometria de fluxo é um método rápido,
fácil e semiquantitativo, que permite a detecção de citocinas em uma única célula, sendo um
instrumento muito útil para o estudo da contribuição de células imunocompetentes na
produção de citocinas em populações celulares heterogêneas, bem como para o estudo do
padrão de citocinas em populações celulares homogêneas (FOSTER et al., 2007).
Para avaliação do potencial de produção de citocinas em diferentes populações
celulares, foi utilizado o seguinte protocolo: alíquotas de 500µL de sangue total foram
adicionadas a 500µL de RPMI-1640, em quatro tubos distintos. O tubos utilizados nas
culturas eram de fundo em U e de polipropileno. O primeiro tubo correspondeu à cultura
controle não estimulada (CC). Ao segundo tubo foram adicionados 25µL de Dimetilsulfoxido,
correspondendo ao grupo controle do solvente (DMSO). Ao terceiro tubo foram adicionados
25µL de látex da Euphorbia tirucalli diluído a 10% v/v em DMSO (Lt). Como o volume final
no tubo corresponde a 1mL, a concentração do extrato no tubo foi de 0,25% v/v. Essa
concentração foi escolhida tendo em vista resultados prévios que demonstraram ser essa a
concentração ótima para uso experimental. Em todos os tubos foram adicionados 10µL de
Brefeldina-A a 1mg/mL, para interromper o processo de transporte de proteínas, mantendo-as
no citosol celular. As culturas celulares foram então incubadas por 4 horas, em estufa úmida a
37oC, contendo 5% CO2. Após esse tempo, as amostras foram lavadas com 6mL de PBS-W
(PBS 0,015 M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica) e centrifugadas a 600g
por 10 minutos a 18oC. Um volume de 1mL das culturas CC, DMSO e Lt foi adicionado a 4
tubos contendo 5µL de anticorpos monoclonais específicos para os receptores celulares CD4,
CD8, CD14 para a análise de linfócitos T auxiliares (Th), linfócitos T citotóxicos e
monócitos, respectivamente. As amostras foram incubadas por 30 minutos, à temperatura
ambiente, ao abrigo da luz. Após incubação, as culturas foram submetidas à lise por adição de
4,5ml de solução de lise eritrocitária (Optilyse-B, Immunotec-USA) e incubadas por 10
minutos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Em seguida, as amostras foram
centrifugadas a 600g por 10 minutos a 18oC, o sobrenadante aspirado e as células
ressuspendidas em 4ml de PBS-W, e o volume completado até 12ml com PBS-P (PBS 0,015
M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina). Após incubação
por 10 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a suspensão de células foi
novamente centrifugada. O sobrenadante foi aspirado e as células ressuspendidas em 3ml de
PBS-W. Fez-se nova centrifugação, aspiração do sobrenadante e ressuspensão celular em
250µl de PBS-W. Após a homogeneização da suspensão celular, o volume de cada tubo foi
distribuído em quatro novos tubos contendo 20µl de anticorpos anti-IFN-γ, anti-TNF-α, anti-
IL-4 e anti-IL-10 (diluídos 1/20 em PBS-P), seguido de incubação por 30 minutos, à
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Terminada a incubação, as células foram
ressuspensas em 3 ml de PBS-P e centrifugadas. O sobrenadante foi desprezado e o pellet
ressuspensas em PBS-W. Após essa etapa foram adicionados aos tubos 2ml de PBS-W
seguido de centrifugação a 400g por 10 minutos a 18oC. Após o descarte do sobrenadante, as
células foram ressusas em 300µl de solução fixadora “FACS fix solution”(10 g/L
paraformaldeído, 1% de cacodilato sódico, 6,65 g/L cloreto de sódio e 0,01% de azida
sódica). As amostras foram avaliadas quanto aos parâmetros fenotípicos celulares e produção
de citocinas, por citometria de fluxo (FACScan – Becton-Dickinson USA), procedendo-se a
aquisição de 30.000 eventos por tubo utilizando o programa Cell-Quest para o estoque dos
dados. Os anticorpos utilizados para a identificação das populações leucocitárias, bem como
para a marcação das citocinas por citometria de fluxo e suas especificidades estão listados na
TAB. 3.
TABELA 3
Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações
leucocitárias e marcação de citocinas.
Anticorpos monoclonais Especificidade
Anti-CD4 humano marcado com PerCP1 Subpopulação de Linfócitos T
Anti-CD8 humano marcado com PerCP Subpopulação de Linfócitos T
Anti-CD14 humano marcado com PerCP População de monócitos
Anti-INF-γ humano marcado com PE2 Interferon gamma
Anti TNF-α humano marcado com PE Fator de necrose tumoral alfa
Anti IL-4 humano marcado com PE Interleucina 4
Anti IL-10 humano marcado com PE Interleucina 10
Anticorpos monoclonais (Becton-Dickinson, USA). 1PerCP: Proteína Clorofila Peridina
2PE: Ficoeritrina
5.7 Estratégia de análise
As populações leucocitárias de interesse foram selecionadas mediante a análise de
gráficos de distribuição pontual em função do tamanho e granulosidade (FSC x SSC),
conforme FIG. 6A e 6C . Para a análise das populações de monócitos e as subpopulações de
linfócitos T CD4 e T CD8 foram utilizados anticorpos anti-CD14, anti-CD4 e anti-CD8,
respectivamente, todos marcados com PerCP (FL3). Uma vez que a população de neutrófilos
é negativa para o marcador anti-CD14, essa população foi selecionada com base no perfil de
tamanho e granulosidade, bem como na negatividade para a marcação com anti-CD14.Após a
seleção das células de interesse, por meio de gráficos de tamanho versus granulosidade, foi
realizada a análise das citocinas intracitoplasmáticas em gráficos de distribuição pontual de
fluorescência 3 (FL3) versus fluorescência 2 (FL2), tanto nas culturas controle quanto nas
culturas estimuladas com látex de E. tirucalli, conforme exemplificado nas figuras 6B e 6D,
respectivamente. Os dados primários obtidos em cada quadrante dos gráficos de dispersão
FL3 x FL2 corresponderam aos valores percentuais, tendo como referência a população
selecionada nos gráficos de dispersão SSC x FSC (FIG. 6B e 6D).
CD4-PerCP
CD4-PerCP
TNF-
alp
ha-
PE
Gra
nu
losi
dad
e-S
SCG
ran
ulo
sid
ade
-SSC
Tamanho - FSC
TNF-
alp
ha-
PE
Tamanho - FSC
A B
C D
1 3
5440
15 13
4527
FIGURA 6 - Estratégia de análise por citometria de fluxo. Sequência de procedimentos
utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por citometria de fluxo.
Gráfico de distribuição pontual FSC x SSC são utilizados para a seleção das populações
desejadas nas culturas do grupo controle CC (A) e grupo Lt (C). Em seguida são utilizados
gráficos de distribuição pontual FL3 x FL2 para avaliar a expressão de citocinas nas
populações e subpopulações específicas (B) CC, (D) Lt.
5.5 Análise estatística
Para verificar a diferença entre os grupos, utilizou-se a análise de variância, seguida
pelo teste de múltipla comparação de média de Tukey. A tabulação e análise dos dados foi
realizada utilizando-se o Software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego,
CA, USA). Adotou-se como nível de significância um p < 0,05.
6 RESULTADOS
6.1 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico humano in
vitro após estimulação com látex bruto de Euphorbia tirucalli
A FIG. 7 representa a análise de viabilidade em valores percentuais dos leucócitos
mononucleares incubados com o látex de E. tirucalli diluído em DMSO nas concentrações de
5, 10, 20 e 30%, nos tempos 24 (A), 48 (B) e 72 horas (C). Os dados obtidos revelaram que o
tratamento com o látex de E. tirucalli, na concentração de 5%, não alterou o percentual de
células viáveis e inviáveis em nenhum dos tempos avaliados, quando comparados aos grupos
CC e DMSO. O látex nas concentrações 10 e 20% reduziu a viabilidade celular a partir das 48
horas de incubação. Já o extrato da planta na concentração de 30% apresentou citotoxicidade
desde as primeiras 24 horas. Esses dados evidenciam que a citotoxicidade aumenta em função
do tempo de exposição ao látex nas concentrações acima de 5%. De acordo com os dados
apresentados, o látex bruto da planta parece não interferir nos processos citotóxicos na
concentração de 5% em todos os tempos avaliados e nas concentrações de 10 e 20% em
tempos inferiores a 24 horas, porém, são necessários outros estudos para a confirmação da
toxicidade do extrato, uma vez que o ensaio com o azul de tripam avalia apenas a perda da
seletividade da membrana celular, um evento tardio da célula em processo de morte.
50
100 a
aaa
aaa
50
100
Via
bili
da
de %
CC DMSO Lt 5% Lt 10% Lt 20% Lt 30%
50
100
A
B
C
FIGURA 7 - Percentual de células viáveis em leucócitos mononucleares circulantes do sangue
periférico de indivíduos hígidos nos tempos 24 horas (A), 48 horas (B) e 72 horas (C) e
estimulados com salina (grupo controle) , DMSO e Látex de E. tirucalli nas concentrações
de 5 , 10 , 20 e 30% . A contagem das células foi feita com auxílio da câmara de
neubauer, segundo o protocolo de viabilidade celular descrito no material e métodos. Os
resultados foram expressos com a dispersão dos dados e o valor médio da viabilidade nos
diferentes grupos. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle.
Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
0
0.15
0.3
0.45
0.6
0
0.25
0.5
0.75
1
% N
eu
tró
filo
s+ C
ito
cin
a +
/Ne
utr
ófi
los
+
a, b
a, b
A B
6.2 Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico
estimulados com látex bruto de E. tirucalli
6.2.1 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em neutrófilos do sangue periférico
estimulados com látex bruto de E. tirucalli
O percentual de neutrófilos positivos para as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10
está apresentado nas figuras 8 e 9. De acordo com os resultados, o percentual de neutrófilos-
IFN-γ+ (FIG. 8A) e neutrófilos-TNF-α+ (FIG. 8B) das culturas celulares do grupo Lt
apresentou um aumento significativo em relação aos grupos CC e DMSO (IFN-γ: Lt: 0,25 ±
0,25, CC 0,05 ± 0,02, DMSO: 0,45 ± 0,03 e TNF-α: Lt: 0,50 ± 0,29, CC: 0,2 ± 0,11, DMSO:
0,15 ± 0,08).
FIGURA 8 - Análise do percentual médio de neutrófilos-IFN-γ+ (A) e neutrófilos-TNF-α+
(B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população
celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas
intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE,
segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e métodos. Os resultados
foram expressos como percentual médio de células positivas para as citocinas mais os valores
de desvio padrão. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b
= em relação ao grupo DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IFN-γ TNF-α
0
3
6
9
12
0
0.1
0.2
0.3
0.4
% N
eu
tró
filo
s+ C
ito
cin
a +
/Ne
utr
ófi
los
+ a, b
A B
A análise das citocinas do tipo 2 revelou que o grupo Lt apresentou um aumento no
percentual de neutrófilos-IL-4+ quando comparado aos grupos CC e DMSO (Lt: 7,18 ± 3,02,
CC 2,26 ± 1,17, 3,60 ± 1,77) (FIG. 9A). Nenhuma diferença foi observada nos valores
percentuais de neutrófilos-IL-10+ entre os grupos avaliados (FIG. 9B).
.
FIGURA 9 - Análise do percentual médio de neutrófilos-IL-4+ (A) e neutrófilos-IL-10+ (B)
de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular
foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas
intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE,
segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e métodos. Os resultados
foram expressos como percentual médio de células positivas para as citocinas mais os valores
de desvio padrão. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b
= em relação ao grupo DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IL-4
IL-4 IL-10
6.2.2 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos do sangue periférico
estimulados com látex bruto de E. tirucalli
Nas FIG. 10 e 11 estão expressos os valores percentuais médios de monócitos
positivos para a expressão das citocinas estudadas. De acordo com os resultados, os grupos
analisados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas para os monócitos
positivos, tanto para as citocinas do tipo 1 (TNF- α), quanto para as citocinas do tipo 2 (IL-4 e
IL-10), respectivamente.
0
15
30
45
60
% M
on
ócito
s+ C
ito
cin
a +
/Mo
nó
cito
s+
A
FIGURA 10 - Análise do percentual médio de monócitos-TNF-α+ (A) de culturas de
leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular foi
identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e marcação com anticorpo
anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos
anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no
material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de células
positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença estatisticamente
significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo DMSO. Método
estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
TNF-α
0
3
6
9
12
0
3
6
9
12
% M
on
ócito
s+ C
ito
cin
a +
/Mo
nó
cito
s+
A B
FIGURA 11 - Análise do percentual médio de monócitos-IL-4+ (A) e monócitos-IL-10+ (B)
de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular
foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e marcação com anticorpo
anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos
anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no
material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de células
positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença estatisticamente
significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo DMSO. Método
estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IL-4 IL-10
6.2.3 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos e subpopulações linfocitárias
T CD8+ e T CD4+ do sangue periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli
A FIG. 12 apresenta os valores percentuais de linfócitos positivos para as citocinas do
tipo 1 INF-γ (A), TNF-α (B). A expressão de linfócitos positivos para INF-γ TNF-α quando
estimulados com o látex de E. tirucall foram cerca de 11 e 16 vezes maiores comparados ao
grupo controle CC (INF-γ: Lt: 5,17 ± 2,09, CC: 0,44 ± 0,31, DMSO: 0,33 ± 0,27 e TNF: Lt:
8,60 ± 3,75, CC: 0,51 ±0,31, DMSO: 0,38 ± 0,28), mostrando uma polarização da expressão
de citocinas do tipo 1 na população linfocitária.
0
2
4
6
8
0
4
8
12
16
% L
info
cito
sT
ota
is+ C
ito
cin
a +
/Lin
focito
sTo
tais
+
a, b
a, b
A B
FIGURA 12 - Análise do percentual médio de linfócitos-IFN-γ+ (A) e linfócitos-TNF-α+ (B)
de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular
foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas
intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE,
segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e métodos. Os resultados
foram expressos como percentual médio de células positivas para as citocinas mais os valores
de desvio padrão. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b
= em relação ao grupo DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IFN-γ TNF-α
Os resultados apresentados na FIG. 13 expressam os valores percentuais de linfócitos
positivos para as citocinas IL-4 (A) e IL-10 (B). A análise entre os grupos revelou que o látex
da planta não foi um estímulo para o aumento da expressão de citocinas do tipo 2.
0
0.7
1.4
2.1
2.8
0
1
2
3
4
% L
info
cito
sT
ota
is+ C
ito
cin
a +
/Lin
focito
sTo
tais
+
a
A B
FIGURA 13 - Análise do percentual médio de linfócitos-IL-4+ (A) e linfócitos-IL-10+ (B) de
culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular foi
identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas
intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE,
segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e métodos. Os resultados
foram expressos como percentual médio de células positivas para as citocinas mais os valores
de desvio padrão. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b
= em relação ao grupo DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IL-4 IL-10
Nas FIG. 14 e 15 observamos que a subpopulação de linfócito T CD8+ quando
estimulados com o látex de E. tirucalli, apresentou um perfil misto na expressão de citocinas,
dado que os valores de linfócitos TCD8+ positivos para as citocinas avaliadas, INF-γ, TNF-α,
IL-4 e IL-10, foi superior aos grupos CC e DMSO, respectivamente. Foram estes os valores
de média e desvio para os respectivos grupos: INF-γ: CC: 0,76 ± 0,77, DMSO: 070 ± 0,64, Lt:
17,57 ± 15,29; TNF-α: CC: 1,24 ± 1,62, DMSO: 0,82 ± 0,67, Lt: 18,86 ± 19,18; IL-4: CC:
1,03 ± 0,96, DMSO: 1,25 ± 0,82, Lt: 4,52 ± 4,93; e IL-10: CC: 1,97 ± 1,92, DMSO: 2,67 ±
2,09, Lt: 7,83 ± 9,88.
0
10
20
30
40
% L
info
cito
sT
CD
8+ C
ito
cin
a+ /L
info
cito
sT
CD
8+ a, b
0
12.5
25
37.5
50
a, b
A B
FIGURA 14 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IFN-γ+ (A) e linfócitosT
CD8-TNF-α+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A
população celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e
marcação com anti-CD8 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se
anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem
descrito no material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de
células positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença
estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo
DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IFN-γ TNF-α
0
3
6
9
12
% L
info
cito
sT
CD
8+ C
ito
cin
a+ /L
info
cito
sT
CD
8+
0
6
12
18
24
a, ba, b
A B
FIGURA 15 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IL-4+ (A) e linfócitosT CD8-
IL-10+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A
população celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e
marcação com anti-CD8 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se
anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem
descrito no material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de
células positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença
estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo
DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IL-4 IL-10
A FIG. 16 mostra o resultado dos valores percentuais de linfócitos T CD4-INF-γ+ (A)
e T CD4-TNF-α+ (B). A análise dos dados indicou que quando estimulados com o látex da
planta estudada, o percentual de linfócitos T CD4-INF-γ+ T CD4-TNF-α+ teve um aumento,
sendo este cerca de 8,5 e 11 vezes superior respectivamente (INF-γ: Lt: 3,23 ± 1,33, CC: 0,37
± 0,43, DMSO: 0,29 ± 0,29 e TNF-α: Lt: 13,68 ± 4,77, CC: 1,23 ± 3,19, DMSO: 0,33 ± 0,26).
0
1.5
3
4.5
6
0
4
8
12
16
% L
info
cito
sT
CD
4+ C
ito
cin
a +
/Lin
focito
sT
CD
4+
a, b
a, bA B
FIGURA 16 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IFN-γ+ (A) e linfócitosT
CD4-TNF-α+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A
população celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e
marcação com anti-CD4 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se
anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem
descrito no material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de
células positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença
estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo
DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IFN-γ TNF-α
Já a FIG. 17 mostra o resultado dos valores percentuais de linfócitos T CD4- IL-4+
(A) e T CD4-IL-10+ (B). Nenhuma diferença significativa foi observada no percentual de
linfócitos T CD4 positivos para as citocinas do tipo 2 avaliadas, demonstrando que, assim
como os linfócitos totais, os linfócitos T CD4+
contribuem para a polarização da resposta
imune para um perfil celular, conhecido também como pró-inflamatório.
0
1.5
3
4.5
6
% L
info
cito
sT
CD
4+ C
ito
cin
a +
/Lin
focito
sT
CD
4+
0
0.7
1.4
2.1
2.8A B
FIGURA 17 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IL-4+ (A) e linfócitosT CD4-
IL-10+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A
população celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e
marcação com anti-CD4 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se
anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem
descrito no material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de
células positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença
estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo
DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.
IL-4 IL-10
A figura abaixo (FIG. 18) sintetiza os resultados. Os dados apresentados
demonstraram que o estímulo do látex bruto de E. tirucalli induziu o aumento do percentual
positivo para as citocinas do tipo 1, INF-γ, TNF-α, nas populações de neutrófilos e linfócitos,
bem como nas subpopulações de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Já os monócitos neste estudo
não responderam ao estimulo do látex da planta com o aumento da expressão de citocinas em
nenhum dos perfis. O látex de E. tirucalli também foi um estímulo para o aumento do
percentual de neutrófilos IL-4+ e também linfócitos TCD8-IL-4+
e TCD8-IL-10+.
T CD8+
T CD4+
Monócitos
Neutrófilos
Linfócitos
FIGURA 18 - Resumo dos resultados obtidos na expressão de citocinas nas populações e
subpopulações estudadas, quando estimulados com o látex bruto de E. tirucalli diluído a 10%
em DMSO.
7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Embora diversas funções biológicas de E. tirucalli tenham sido mencionadas em
diversos trabalhos da literatura científica, é também sabido que o látex bruto da planta possui
propriedades cáusticas que podem promover lesões graves quando em contato direto com
tecidos humanos (SHLAMOVITZ et al., 2009). Diante disso, ao iniciarmos o presente estudo,
fez-se necessário saber qual seria a concentração ótima a ser utilizada nos experimentos com
culturas de leucócitos humanos. Além de determinar a concentração ideal, foi preciso
verificar se o tempo de exposição ao látex poderia interferir na viabilidade dos leucócitos
submetidos a tais culturas celulares. Para tanto, leucócitos do sangue periférico de indivíduos
foram submetidos a culturas celulares na presença de diferentes concentrações do látex, bem
como a diferentes tempos de incubação (Figura 6).
A análise dos dados do teste de viabilidade com o azul de tripam revelou que as
concentrações do látex a 5, 10 e 20% diluído em DMSO, correspondendo a 0,0625%, 0,125%
e 0,25% no volume final das culturas celulares, não foram tóxicas aos leucócitos
mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos) nas primeiras 24 horas. Uma vez
que o tempo de incubação com o látex no protocolo de análise do perfil de citocinas
intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico foi de 4 horas, as concentrações de
5,10 e 20% em DMSO poderiam ser utilizadas, uma vez que não alteraram de forma
significativa a viabilidade dos leucócitos avaliados. Além da análise quantitativa aqui
apresentada, foi possível também acompanhar, qualitativamente, os parâmetros de tamanho e
granulosidade das células, em gráficos de dispersão (FSC x SSC), no momento da aquisição
de dados pela citometria de fluxo. A escolha da concentração do látex diluído a 10% em
DMSO, neste ensaio correspondendo a 0,25% no volume final da cultura, para a realização
das culturas celulares baseou-se em estudos preliminares realizados no laboratório, onde tal
concentração mostrou-se como a concentração mínima ótima, capaz de levar a ativação e
produção de citocinas intracitoplasmáticas demonstradas no presente estudo.
As plantas da família Euphorbiacea têm sido relatadas como plantas medicinais com
atividade antiviral e antitumoral (AMIRGHOFRAN et al., 2006; KUO et al., 2006; YANG et
al., 2005; LAGE et al., 2009). No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos nesses
processos ainda não estão bem elucidados. A análise das citocinas intracitoplasmáticas em
leucócitos do sangue periférico revelou um aumento estatisticamente significativo no
percentual de neutrófilos e linfócitos positivos para as citocinas do tipo1 quando estimulados
pelo látex bruto de E. tirucalli (FIG. 8 e 12). Esse resultado condiz com algumas propriedades
biológicas atribuídas a essa planta. A respeito das atividades antitumoral e antiviral atribuídas
a algumas espécies da família Euphorbiaceae, estudos sugerem que os princípios ativos
envolvidos em tais processos podem atuar diretamente sobre o ciclo de replicação de alguns
vírus e nos mecanismos moleculares envolvidos na manutenção de tumores (YANG et al.,
2005; BETANCUR-GALVIS et al., 2002; TAO et al., 2008). No entanto, há relatos na
literatura que sugerem que tais princípios ativos poderiam também interferir na resposta
imunológica e, dessa forma, favorecer a eliminação viral e tumoral por meio de uma ação
indireta desses princípios sobre o sistema imune (DIAS-BARUFFI et al., 2000;
AMIRGHOFRAN et al., 2008).
De acordo com os dados obtidos em nosso estudo, as populações específicas de
leucócitos humanos do sangue periférico comportam-se de maneira diferenciada quando
submetidas à estimulação com o látex bruto de E. tirucalli. Os linfócitos T apresentaram um
perfil de produção de citocinas predominantemente do tipo 1, demonstrado pelo aumento no
percentual de células positivas para as citocinas IFN-γ e TNF-α (pró-inflamatórias) quando
estimulados com o látex da planta. O aumento de linfócitos T produtores de citocinas do tipo
1 poderia favorecer elementos da resposta imune responsáveis pela cicatrização, fagocitose e
aumento da citotoxicidade mediada por linfócitos T CD8 citotóxicos e células Natural Killer,
importantes nas respostas antiviral e antitumoral, como descrito anteriormente,bem como por
Sasaki e colaboradores (2010). Essa capacidade de estimular a resposta imune do tipo 1,
conhecida como resposta celular, também foi demonstrada por Kinghom e colaboradores
(1979) quandoestudos utilizando ésteres de forbol extraídos de E. tirucalli exacerbaram o
processo inflamatório em orelhas de ratos.
Na análise das subpopulações de linfócitos T, observamos que os linfócitos T CD4+ e
T CD8+ apresentaram o mesmo perfil de produção de citocinas do tipo 1. Os linfócitos T
CD4+, conhecidos como linfócitos T helper, são responsáveis por conduzir a resposta imune
celular (tipo 1) ou humoral (tipo 2). A condução predominante de uma ou outra resposta
depende do perfil de citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4 e pela predominância dessas
citocinas no microambiente do foco da lesão (ZINFANG et al., 2010).
A indução de citocinas do tipo 1 com o objetivo de modular a resposta imune
utilizando plantas do gênero Euphorbia foi descrita por Singh (2006). No estudo, o
tratamento com extrato etanólico de Euphorbia hirta em animais com reação alérgica
promoveu um aumento de IFN-γ e atenuação da resposta humoral. O IFN-γ tem a capacidade
de ativar macrófagos, células Natural Killer e linfócitos T CD8 e induzir a apresentação de
antígenos por meio do aumento da expressão do complexo maior de histocompatibilidade do
tipo I - MHC-I. Essa citocina também apresenta a capacidade de induzir a produção de
subclasses de anticorpos tipo IgG2 e IgG3 (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001; SNAPPER &
PAUL, 1987; DUFFIELD et al., 2003), uma característica marcante em infecções virais. A
ativação desses processos torna o IFN-γ imprescindível na resposta antiviral e antitumoral. Os
animais com tumor induzido por linhagens celulares EL4 ou EG7, e Knockout para o rIFN-γ,
ou deficientes na produção de IFN-γ não respondiam ao tratamento quimioterápico ao
contrário dos animais do grupo controle que apresentavam a produção normal de tal citocina e
do seu receptor (GHIRINGHELLI et al., 2009). Esse estudo aponta a importância do IFN-γ
para uma resposta quimioterápica efetiva.
Tendo em vista que as respostas antitumoral e antiviral são dependentes da ativação da
resposta imune celular, é provável que a produção de IFN-γ em linfócitos T helper, induzida
pelo látex de E. tirucalli, possa favorecer a apresentação de antígenos e assim contribuir para
a eliminação de células tumorais, ou infectadas por vírus, por meio da ação antígeno
específica de linfócitos T CD8. Os trabalhos realizados por Valadares (2006) evidenciam uma
ação antitumoral de E. tirucalli. Nesse estudo, o extrato da massa seca de Euphorbia tirucalli,
diluída em salina, foi capaz de prolongar a sobrevida de animais com tumor ascítico, além de
restabelecer a hematopoiese a valores normais e recuperar a esplenomegalia. No entanto, esse
trabalho não avaliou a participação de citocinas ou outro parâmetro imunológico como
mediador dessa resposta.
A ação antitumoral de plantas do gênero Euphorbia foi também demonstrada na
modulação da expressão de proteínas associadas à múltipla resistência a drogas (MDR). Os
MDR diminuem a concentração intracelular de quimioterápicos promovendo a resistência do
tumor e de células infectadas (HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2009). Dessa forma, a
redução da expressão de MDRs é um forte auxílio à quimioterapia por permitirem a ação
terapêutica efetiva dos fármacos. As citocinas foram descritas como moléculas importantes
nessa regulação negativa de MDRs (STEIN e WALTHER, 1998). As citocinas IL-1 e TNF-α,
por exemplo, reduzem a expressão do gene mdr1 (STEIN et al., 1996). Tendo em vista os
resultados deste trabalho, é possível que os princípios ativos encontrados nas plantas do
gênero Euphorbia modulem a expressão de MDRs através do aumento na produção de TNF-
α.
O linfócito T CD8+ induz apoptose de células alvo por meio da liberação das
proteínas, tais como perforina, granzimas e granulisina contidas em grânulos. Os linfócitos T
CD8+ também são fontes secretoras de citocinas, que podem potencializar a resposta imune
(JAGER et al., 2001). Como observado em nossos resultados, os linfócitos T CD8+
estimulados com látex bruto de E. tirucalli apresentaram um aumento na produção das
citocinas do tipo 1 (FIG. 14) o que favorece suas funções efetoras, principalmente a
citotoxicidade. Outra citocina fundamental na resposta imune celular é o TNF-α. Essa
citocina é capaz de ativar macrófagos, induzindo a produção de óxido nítrico (NO) e induzir a
expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento celular
(WAJANT et al., 2009; APOSTOLAKI et al., 2010). O TNF-α também pode ser uma
molécula efetora na apoptose de células tumorais, bem como em células infectadas, por meio
da ligação aos receptores que possuem domínios de morte que sinalizaram os eventos
apoptóticos (SCREATON e XU, 2000).
O aumento percentual de linfócitos TCD4+TNF+ e TCD8+TNF+ reforçam a hipótese
de que os princípios ativos de E. tirucalli conduzem a resposta predominantemente do tipo 1.
Alguns estudos realizados evidenciaram a participação de princípios ativos encontrados em
plantas do gênero Euphorbia sobre diversos processos biológicos mediados por TNF-α. Foi
demonstrado que a fração ativa do extrato de Euphorbia peplus induziu apoptose em células
de melanoma por vias dependentes da ligação do TNF em receptores que se ligam aos
domínios de morte (GILLESPIE et al., 2004). Já a lectina Euphorbin, extraída do latex de
Euphorbia milii, induziu a migração de neutrófilos em ratos (DIAS-BARUFFI et al., 2000).
Embora a produção de citocinas não tenha sido avaliada no referido estudo, muito
provavelmente houve a participação dessas moléculas nesse recrutamento celular.
Tendo em vista que a E. tirucalli possui, dentre outras substâncias, ésteres de forbol
em sua constituição, sendo esses capazes de ativar a proteína quinase C, as possíveis vias para
a produção de citocinas pró-inflamatórias envolveriam os fatores de transcrição NF-kB, Elk e
a junção de Jun e Fos, conhecido como AP1(DUMONT et al., 1998). Além dessas, a via
JAK/STAT também tem uma importância na produção de citocinas do tipo 1. A figura 19
sintetiza as possíveis vias de sinalização para a transcrição das citocinas pró-inflamatórias.
Uma perspectiva futura seria a análise das vias de sinalização e dos fatores de transcrição
envolvidos nesse aumento da expressão de citocinas frente à estimulação com o látex bruto de
E. tirucalli. No entanto, faz-se necessário realizar tal investigação utilizando substâncias
isoladas ou frações ricas em determinados compostos bioativos.
RNAm citocinaspró-inflamatórias
FIGURA 19 - vias envolvidas na transcrição de RNAm para síntese de citocinas pro-
inflamatórias
Os neutrófilos apresentaram um aumento de IL-4, concomitantemente com o aumento
das citocinas IFN-γ e TNF-α (TAB. 2). No fígado tem sido descrita a importância dos
neutrófilos em moderar a resposta inflamatória dos monócitos em condições de infecção
bacteriana sistêmica (HOLUB et al., 2009). A importância da IL-10 em inibir e modular a
ativação de células da inflamação também já foi descrita (FIORENTINO et al., 1991). O
aumento expressivo da IL-4 pelos neutrófilos, assim como o aumento de IL-10 e IL-4 em
linfócitos TCD8+ se encaixa no contexto da moderação da resposta inflamatória estimulada
pelo látex de E. tirucalli, de forma que a resposta seja predominantemente inflamatória,
porém moderada. Tais mecanismos de controle fazem parte da fisiologia da resposta imune e
são necessários para evitar uma resposta inflamatória exacerbada e prejudicial ao organismo.
Os monócitos demonstraram não contribuir para o aumento de citocinas em nenhum dos dois
perfis e portanto, parecem não serem alvos para a ação do látex de E. tirucalli na produção de
citocinas.
É possível que a ação antitumoral e antiviral observada pelos extratos de E. tirucalli
seja mediada pelo sistema imune. Estudos pré-clínicos realizados já demonstraram que, além
de baixa toxicidade em ratos (SILVA et al., 2007), o extrato de E. tirucalli apresentou um
bom índice terapêutico para ação antiviral (BETANCUR-GALVIS et al., 2002), sugerindo-o
como uma perspectiva para futuros ensaios clínicos.
8 CONCLUSÃO
Este estudo permitiu identificar, seletivamente, as populações celulares nas quais o
látex bruto de E. tirucalli diluído em DMSO atuou promovendo o aumento da síntese de
citocinas. O estímulo com látex bruto da planta Euphorbia tirucalli sobre leucócitos do
sangue periférico, submetidos à cultura rápida, in vitro, induziu um perfil de resposta imune
predominantemente do tipo 1 por meio do aumento percentual de linfócitos T positivos para
as citocinas IFN-γ e TNF-α, principalmente em linfócitos T-CD4, Esse padrão de resposta
imune, conhecido como resposta imune celular poderia ter aplicações futuras no campo da
imunoterapia de tumores e infecções por patógenos intracelulares, uma vez que tais citocinas
são importantes mediadores em tais processos.
Estudos adicionais, utilizando-se substâncias isoladas, preferencialmente, são
necessários para elucidar em que nível metabólico os princípios ativos estariam atuando para
proporcionar os resultados aqui apresentados. Além disso, investigações in vivo, utilizando
modelos de desenvolvimento tumoral, associados ao tratamento com a planta, serão essenciais
para avaliar se a produção de citocinas observadas no contexto in vitro, poderia, no contexto
in vivo, provocar alguma alteração em processos carcinogênicos.
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ANEXO
Anexo A – Artigo científico
The crude latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) modulates the
cytokine response of leukocytes, especially CD4+ T lymphocytes.
1 Bethânia A Avelar,
1 Felipe JN Lélis,
2 Renato S Avelar,
1 Mathias Weber,
3 Elaine M. Souza-
Fagundes, 2 Olindo A Martins-Filho,
3 Miriam TP Lopes,
1 Gustavo EA Brito-Melo
*,1
1 Immunology laboratory – Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM),
2
Biomarkers laboratory – René Rachou Institute/Oswaldo Cruz Foundation (CPqRR/FIOCRUZ), 3
Biological Sciences Institute – Federal University of Minas Gerais (UFMG)
RESUMO: “O latex bruto de Euphorbia tirucalli L (Euphorbiaceae) modula a produção de
citocinas por leucócitos, principalmente em linfócitos T CD4+”.
O uso de plantas da família Euphorbiaceae, principalmente do gênero Euphorbia, tem sido
popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenças de natureza infecciosa,
tumoral e inflamatória. Entre as espécies desse gênero, a Euphorbia tirucalli é uma planta de uso
difundido em algumas regiões brasileiras, tal como o Vale do Jequitinhonha. Há indícios de que o
látex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e antiviral, porém, pouco se sabe sobre os
mecanismos envolvidos nessa ação. É provável que o mecanismo de ação para tais atividades
envolva a ativação de leucócitos e a produção de citocinas para o direcionamento de uma resposta
antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso, o presente trabalho avaliou a produção das citocinas
TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas populações e subpopulações leucócitárias do sangue periférico
estimulado com o látex bruto da referida planta. Para tal, leucócitos do sangue periférico de vinte
indivíduos saudáveis foram incubados por 4 horas com o látex bruto de E. tirucalli diluído em
dimetilsulfoxido (DMSO). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO constituíram as
culturas controle e controle de solvente, respectivamente. Após o período de incubação, as células
foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para receptores de superfície celular CD4,
CD8 e CD14, conjugados com FITC, bem como para as citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10,
conjugados com PE. A aquisição e análise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os
resultados demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no T CD4+ positivos para as citocinas
TNF-α e IFN-γ. Já os neutrófilos e linfócitos T CD8+ apresentaram um perfil misto de produção de
citocinas, caracterizado por aumento na frequência de células positivas para IFN-γ, TNF-α e IL-10.
Os resultados evidenciam uma resposta predominante do tipo 1. Diante dos achados é possível
sugerir que a ação atribuída a Euphorbia pelo uso popular possa estar relacionado a seu efeito sobre
a produção preferencial das citocinas TNF-α e IFN-γ. Contudo é preciso investigar se o efeito in
vitro de E. tirucali sobre a produção de citocinas está relacionado com sua potencial ação in vivo.
Unitermos: Euphorbia tirucalli, planta medicinal, citocinas tipo 1.
ABSTRACT: The plants of the Euphorbiaceae family, especially those of the genus Euphorbia, are
frequently used by Brazilian folk communities to treat a wide variety of infectious, tumoral and
inflammatory illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is widely used in
some Brazilian regions, such as the Jequitinhonha River Valley. There is evidence that the latex
produced by E. tirucalli has antiviral and antitumor activities, but little is known about the
mechanisms involved in these actions. It is likely that the mechanism for such activities involves
leukocyte activation and cytokine production. Here we aimed to evaluate the production of type 1
(TNF-α and IFN-γ) and type 2 (IL-4 and IL-10) cytokines by circulating leukocyte subsets
submitted to brief stimulation with the crude latex of E. tirucalli. Peripheral blood leukocytes of 20
healthy subjects were submitted to three conditions: i) four-hour incubation with crude E. tirucalli
latex diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) (EUP group), ii) four-hour incubation in the presence of
DMSO alone as the solvent control group (DMSO group) and iii) and four-hour incubation in the
presence of saline as the saline control group (CC group). After the incubation period, the cells were
stained with FITC-conjugated monoclonal antibodies specific to the cell surface receptors CD4,
CD8 and CD14 and PE-conjugated monoclonal antibodies specific to the cytokines TNF-α, IFN-γ,
IL-4 and IL-10. The acquisition and analysis of data were performed by flow cytometry. The results
showed a significant increase (p<0.05) in the percentage of CD4+ T lymphocytes positive for the
type 1 cytokines TNF-α and IFN-γ. Neutrophils and CD8+ T lymphocytes showed a mixed profile
of cytokine production, characterized by an increase in the percentage of cells positive for IFN-γ,
TNF-α and IL-10. The data indicate a predominant type 1 cytokine response. The findings
presented suggest that the effect popularly attributed to Euphorbia usage may be attributed to its
effect on the production of TNF-α and IFN-γ. However, the relationship between the in vitro and in
vivo effects of Euphorbia needs to be investigated.
Keywords: Euphorbia tirucalli, medicinal plant, type 1 cytokines.
*E-mail: [email protected]; Tel. +55 38 3532 1235 Fax: +55 38 3532 6000
INTRODUCTION
Plants from the Euphorbiaceae family, mainly from the Euphorbia genus, have been
used by some Brazilian folk communities for the treatment of injuries, infectious
illnesses, tumors and inflammatory diseases (Zhang et al., 2008; Yang et al., 2005;
Uzair et al., 2009; Amirghofran et al., 2006; Fernandez-Arche et al., 2010). Regarding
the high concentrations of terpenoid compounds in specific plants within this family, it
is probable that some species have medicinal properties that can be exploited for
therapeutic purposes (Pusztai et al., 2007; Lage et al., 2009).
Euphorbia tirucalli is commonly used in popular medicine in the Jequitinhonha River
Valley, one of the poorest regions of Minas Gerais, for therapeutic purposes to treat
illness and tumors (Valadares et al., 2006; Betancur-Galvis et al., 2002; Lage et al.,
2009). The in vivo antitumor effect of E. tirucalli has been demonstrated (Valadares et
al., 2006), although the mechanisms responsible for such an effect have not been
investigated.
Cytokines are important mediators in the development of efficient and adequate
immunological responses against pathogens and pathological processes. Studies have
shown that plants from the Euphorbia genus can alter the molecular and cellular
parameters of the immune system (Amirghofran et al., 2008; Singh et al., 2006),
suggesting that the therapeutic actions attributed to E. tirucalli could be the
consequence of immune response changes evoked by the plant and not its direct action
on the elements that promote the disease. In the present study, we investigated the in
vitro effect of the crude latex of E. tirucalli on the production of the type 1 cytokines
IFN-γ and TNF-α and the type 2 cytokines IL-4 and IL-10 by human leukocyte
populations.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) latex was collected from a specimen on the
campus of the Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM),
located at MGT-367 road, Km-583, N° 5000, Diamantina, Minas Gerais state, Brazil,
(18°12.152’S, 43°34.667’W, 1.345 m alt) in January. The plant was identified by
Fabiane Nepomuceno Costa. The collected samples were deposited in the UFVJM
herbarium under the registration number 1897. E. tirucalli latex was collected in the
morning by incision at the base of a branch. The latex was diluted immediately in
dimethylsulfoxide (DMSO) at 10% v/v. The quality of the solution was determined by
homogeneity and the absence of precipitates.
Specific monoclonal antibodies used in flow cytometry analysis
The specific monoclonal antibodies (MoAbs) used were purchased from Pharmingen
(San Diego, CA, USA), including anti-human IgG1-fluorescein isothiocyanate (FITC)
clone 679·1Mc7, anti-human IgG2a-phycoerythrin (PE) clone U7·27, anti-human CD4-
FITC clone 13B8·2, anti-human CD8-FITC clone B9·11, and anti-human CD14-FITC
(clone M0P9). The PE-labeled (PE) anti-human cytokine MoAbs included anti-TNF-α
(clone MOAB11), anti-IFN-γ (clone B27), anti-IL-4 (clone MP4–25D2) and anti-IL-10
(clone JES3–9D7).
Biological samples and short-term whole-blood culture
Leukocytes were obtained from the blood of 20 volunteers capable of blood donation
with negative serology for relevant blood-borne pathogens, including HIV, hepatitis C
virus, hepatitis B virus, syphilis and Chagas disease. Volunteers using corticosteroids or
other immunosuppressive drugs were not considered for blood donation. Informed
written consent was obtained from all participants. The study was approved by the
Ethical Committee at the UFVJM, Diamantina, Minas Gerais, Brazil (protocol 02/009).
Blood samples were collected in vacuum tubes containing sodium heparin (Vacutainer;
Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), and 500-µl aliquots were dispensed into
individual 17 x 100mm polypropylene tubes (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose,
CA, USA). Samples were incubated for 4 h at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere
in the presence of 500 µl of RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) and Brefeldin
A (BFA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) at a final concentration of 10
µg/ml. The stimulation with crude E. tirucalli latex was performed by the addition of 25
µl of 10% crude E. tirucalli latex diluted in DMSO (EUP group) to the cultures. A
solvent control, i.e., cells treated on with DMSO (25 µL), was performed in parallel
(DMSO group). After solvent or latex treatment, the cultures were treated with 2 mM
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Sigma Chemical Co. and incubated at room
temperature for 15 min.
Flow cytometric immunostaining for surface markers and intracellular cytokines
Samples were washed with 6 mL of phosphate-buffered saline (PBS) (0.015 M)
containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% sodium azide (Sigma). Cells
were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min) and then resuspended in
PBS/BSA/sodium azide. Aliquots (200 L) were distributed into two 12 x 75-mm
polystyrene tubes (Falcon 2052), and cells were individually stained with MoAbs
directed against CD4, CD8 and CD14 for 30 min at room temperature in the dark.
Stained samples were treated with 2 mL of FACS lysing solution (Becton Dickinson,
San Jose, CA) by gentle vortexing. After re-incubation for an additional 10 min, the
samples were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min), and the supernatant was
discarded. The pellet was dissolved in 2 ml FACS permeabilizing solution, which
contains PBS/BSA/sodium azide and 0.5% saponin (Sigma), and was incubated in the
dark for 10 min at room temperature. After incubation, the samples were washed twice
in PBS/BSA/sodium azide. Then 20 L of PE-labeled anti-cytokine MoAb was added to
cells (20 L) in a 96-well U-bottom microplate (Thomas 9383-A90) for 30 min at room
temperature. Cells were subsequently washed with 150 L of FACS permeabilizing
solution followed by 200 l of FACS buffer. Samples were then fixed in 200 mL of
FACS fixing solution containing 10 g/l paraformaldehyde, 10.2 g/l sodium cacodylate
and 6.63 g/l sodium chloride (Sigma) at pH 7.2. The samples were stored at 4°C in the
dark and analyzed by flow cytometry within 24 h.
Flow cytometry
A total of 30,000 events were acquired using a FACScan flow cytometer (Becton
Dickinson) correctly set up to measure forward (FSC) and side (SSC) light scattering
and FITC (FL-1) and PE (FL-2) fluorescence. CellQuestTM
software was used for data
acquisition and analysis. Identification of the lymphocyte subsets was performed by the
dual-color immunophenotyping method using specific FITC-labeled anti-surface
MoAbs and PE-labeled anti-cytokine MoAbs (BRITO-MELO et al., 2006).
Initially, a lymphocyte scatter gate was set up, using FSC versus SSC dot plots,
followed by the identification of cytokine-positive cells using FL-1/FITC-anti-cell
marker versus FL-2/PE-anti-cytokine dot plots. All results were expressed as the
percentage of cytokine-positive cells for the different gated leukocyte subpopulations
analyzed in this study, selected as described above. The numbers of subjects displayed
in the figures may differ due to methodological restrictions, including insufficient
numbers of cells and autofluorescence interference in the flow cytometry data.
Statistical analysis
Statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA) followed by
Tukey’s multiple comparison test using the GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.,
San Diego, CA, USA). Difference were considered statistically significant when
P<0.05.
RESULTS AND DISCUSSION
Plants from the Euphorbiaceae family have been reportedly used as medicinal plants
because of their antiviral and antitumor proprieties (Kuo et al., 2006; Yan et al., 2008;
Amirghofran, 2006; Yang et al., 2005; Lage et al., 2009). However, the biological
pathways involved in these processes have not been identified.
In this study, we demonstrated that the expression profiles of human peripheral blood
leukocytes changed after they were stimulated with crude E. tirucalli latex. As
demonstrated in Table 1, lymphocytes predominantly expressed type 1 cytokines, and
the IFN-γ and TNF-α expression levels in this cell population were 11 and 8 times
higher than those of the control group, respectively. Studies have shown that phorbol
esters obtained from E. tirucalli have an inflammatory effect in rat ears (Kinghorn,
1979). The CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets similarly presented increased
expression of TNF-α and IFN-γ (FIGURES 1 and 2). CD4+ T lymphocytes are key cells
involved in antiviral and antitumor immune responses. This cell population secretes
cytokines that improve the recognition and cell-mediated elimination of virus-infected
cells and tumor cells (Sasaki et al., 2010).
The increase of type 1 cytokines mediated by plants of the Euphorbia genus was
recently described. Singh et al. (2006) demonstrated that treatment with an ethanolic
extract of E. hirta in allergic rats promoted an increase in the level of IFN-γ and
decreased the severity of the allergic reactions. IFN-γ is an important type 1 cytokine
because of its roles in macrophage and killer cell activation, in antigen presentation and
cytotoxicity mediated by CD8+ T cells. Additionally, IFN-γ induces IgG1 and IgG3
production by B cells. Together, these immunological elements are able to efficiently
eliminate and destroy infected and tumor cells (Levy & Garcia-Sastre, 2001; Duffield,
2003; Snapper & Paul, 1987).
Euphorbia tirucalli extract diluted in saline was able to increase the survival of animals
with ascitic tumors. Additionally, the hematopoiesis and spleen size of these animals
returned to normal after treatment with the plant extract. However, the study conducted
neither a cytokine analysis nor a detailed evaluation of the molecular mechanisms
involved in the process (Valadares et al., 2006). In another study, the author suggested
that treatment with plants from the Euphorbia genus changes the expression of multi-
drug resistance (MDR) factors. These factors down-regulate the intracellular
concentrations of drugs used in chemotherapy to improve tumoral resistance (Hohmann
et al., 2002; Lage et al., 2009). It seems that some antitumor mechanisms are cytokine
dependent, primarily on IFN-γ (Stein et al., 1998). Ghiringhelli (2009) demonstrated
that animals injected with EL4 or EG7 tumor cells and deficient in IFN-γ production
could not be effectively treated with chemotherapy, whereas the wild-type control group
responded to treatment.
The increased percentages of CD4+TNF+ and CD8+TNF+ T cells support our
hypothesis that bioactive compounds from E. tirucalli improve the type 1 immune
response (FIGURES 1 AND 2). TNF-α is a cytokine that activates improved
phagocytosis mediated by macrophages and that increases the expression of adhesion
molecules on endothelial cells (Wajant, 2009; Apostolaki et al., 2010). Moreover, TNF-
α may also be an effector molecule for the apoptosis of tumor or infected cells by
binding to death domains that signal apoptotic events (Screaton & Xu, 2000).
Previous studies have demonstrated that plants from the Euphorbia genus have
biological activities that could be mediated by TNF-α. A lectin extracted from
Euphorbia milii latex induced leukocyte migration (Dias-Baruffi et al., 2000), and an
active fraction of a Euphorbia peplus extract induced apoptosis in melanoma cells via
TNF family receptor-dependent pathways (Gillespie et al., 2004).
Neutrophils presented an increase in IL-4, IFN-γ and TNF-α expression (TABLE 1).
The increase of IL-4 expression by neutrophils, along with the increase of type 2
cytokine expression by CD8+ T lymphocytes, could modulate inflammatory responses.
Type 2 cytokines inhibit the activation of inflammatory cells (Fiorentino et al., 1999).
Monocytes did not contribute to the increase in cytokine production in either of the two
profiles (TABLE 1).
Crude E. tirucalli latex extract is potentially useful in antitumor and antiviral
treatments. Pre-clinical studies indicate that the plant has low toxicity in mice (Silva et
al., 2007) and a good therapeutic index for antiviral activity (Betancur-Galvis et al.,
2002). Our data suggest that the antitumor protection provided by E. tirucalli extract
observed by Valadares et al., (2006) may be mediated by type 1 cytokine (TNF-α and
INF-γ) expression in neutrophils and lymphocytes, mainly CD4+ T lymphocytes.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Prof. Dr. Etel Vieira for contributing to the writing of this
manuscript.
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FIGURE
FIGURE 1. Percentages of CD4+ T lymphocytes positive for TNF-α, INF-γ, IL-4 and
IL-10. CC – control group, DMSO – solvent control group, EUP – E. tirucalli latex-
stimulated group.
p < 0,05 p < 0,05
FIGURE 2. Percentages of CD8+ T lymphocytes positive for TNF-α, INF-γ, IL-4 and
IL-10. CC – control group, DMSO – solvent control group, EUP – E. tirucalli latex-
stimulated group.
Table 1: Percentages of neutrophils and monocytes and lymphocytes positive for TNF-
α, INF-γ, IL-4 and IL-10. CC DMSO EUP
Neutrophils TNF- + 0.05 ± 0.02 0.05 ± 0.03 0.24 ± 0.28a,b
IFN- + 0.16 ± 0.05 0.15 ± 0.08 0.50 ± 0.29a,b
IL-4+ 2.26 ± 1.18 3.60 ± 1.77 7.18 ± 3.02a,b
IL-10+ 0.17 ± 0.16 0.11 ± 0.12 0.17 ± 0.11
Monocytes TNF- + 28.75 ± 20.20 24.29 ± 18,42 16.56 ± 14.60
IL-4 + 4.27 ± 2.40 4.26 ± 2.42 6.38 ± 3.22
IL-10+ 4.16 ± 2.83 4.25 ± 3.55 5.18 ± 3.48
Lymphocytes TNF- + 1.05 ± 2.39 0.38± 0.28 8.59± 3.75a,b
IFN- + 0.45± 0.31 0.33±0.27 5.16± 2.08a,b
IL-4+ 0.56± 0.27 1.19± 0.91a 1.05± 0.73
IL-10+ 1.72± 1.79 1.80± 1.53 1.17± 0.61
Data are presented as the mean ± SD for n= 20. CC – control group, DMSO – solvent
control group, EUP – E. tirucalli latex-stimulated group.
Statistically significant differences are denoted by “a” for comparison with the CC
group and by “b” for comparison with the DMSO group.
p < 0,05 p < 0,05