UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE

BRUNA RACHEL DE BRITTO PEÇANHA

SÍNTESE DE POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR

E SUA APLICAÇÃO NA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

NITERÓI

2012

BRUNA RACHEL DE BRITTO PEÇANHA

SÍNTESE DE POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR

E SUA APLICAÇÃO NA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Pesquisa e Monitoramento de Produtos para a saúde.

Orientadoras: Profa. Dra. ESTELA MARIS FREITAS MURI

Profa. Dra. ELIANI SPINELLI

Niterói

2012

BRUNA RACHEL DE BRITTO PEÇANHA

SÍNTESE DE POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR

E SUA APLICAÇÃO NA TÉCNICA DE EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Pesquisa e Monitoramento de Produtos para a saúde.

Aprovada em 28 de maio de 2012.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Estela Maris Freitas Muri – OrientadoraUFF

Profa. Dra. Eliani Spinelli – OrientadoraUFF

Profa. Dra. Mônica Costa PadilhaUFRJ

Prof. Dr. Leandro Medeiros MottaUEZO

Profa. Dra. Luiza Rosaria Sousa Dias (Revisora e Suplente)UFF

Niterói2012

Dedico este trabalho à minha família,

meus pais,

meu esposo e meus filhos,

pois são a motivação que

necessito para seguir adiante.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me permitir mais essa conquista, tão valiosa para mim;

Às Profas. Estela e Eliani, por me aceitarem como aluna deste

projeto desafiador e pela confiança depositada em minha pessoa do

início ao fim;

Ao meu esposo Elton, sempre companheiro nos momentos difíceis,

além do suporte técnico na parte manuscrita do trabalho;

À Coordenação do PPG-CAPS, nas pessoas da Profa. Kátia e sua

secretária Adelina, pelo apoio acadêmico e disponibilidade em

atender aos alunos sempre que solicitadas;

Às Profas. Luiza Rosaria e Maria Abadia do LQMed pelo auxílio no

laboratório, sempre nos ajudando e orientando quando preciso;

À Profa. Monique Brito pela realização dos estudos de modelagem

molecular;

Às minhas amigas de mestrado e laboratório (LQMed), Bruna, Ieda,

Raquel, Simone Oliveira, Simone Pontes, Suellen e Talita pelos

momentos de descontração, carinho e solidariedade, além da troca

de preciosas idéias;

À Cássia, do Toxfree, e seu esposo Álvaro pelo apoio e ajuda com

os espectros de FTIR, de grande valia para este trabalho;

Ao prof. Venício Veiga do Instituto de Microbiologia da UFRJ por

ceder o microscópio eletrônico de transmissão para a realização das

imagens dos polímeros;

A todos que contribuíram para a realização deste trabalho.

EPÍGRAFE

“Quando você pensa que sabe todas as respostas,

vem a vida e muda todas as perguntas.”

Luís Fernando Veríssimo

RESUMO

Polímeros de impressão molecular (MIPs) foram sintetizados e aplicados como adsorventes na técnica de extração em fase sólida (EFS). O método de polimerização por precipitação foi utilizado para a síntese dos polímeros, devido à simplicidade de preparo, altos rendimentos e obtenção de partículas mais uniformes, devido a não trituração do polímero. O MIP foi sintetizado com ácido metacrílico (MAA) como monômero funcional, trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) e dimetacrilato de etilenoglicol (EDMA) como agentes de reticulação e o cloridrato de amilorida (AMI) foi escolhido como molécula-molde. Diferentes proporções de MAA, TRIM, EDMA, volume e tipo de solvente foram utilizadas para ajuste das condições ideais de síntese. Os MIP foram avaliados quanto à capacidade de adsorção comparando-se a polímeros sintetizados na ausência da molécula-molde (NIP, polímeros não impressos). O solvente de elevada polaridade empregado na síntese (THF:MeOH:H2O) permitiu o emprego da técnica para moléculas polares como AMI. O controle no volume de solvente permitiu a obtenção de partículas maiores, de modo que a EFS foi realizada em condições usuais, o que confere um potencial para aplicação dessa técnica de polimerização na preparação de adsorventes para EFS. O polímero que apresentou maior capacidade adsortiva no ensaio realizado em tampão citrato-acetato pH 6,5 foi o MIP/NIP 12 (AMI:MAA:TRIM 1:8:10), com uma taxa média de adsorção de 83 e 88% para NIP e MIP, respectivamente. A adsorção foi elevada devido a interação iônica entre MAA e AMI promovida pelo controle de pH, porém foi não específica. O polímero MIP/NIP 12 foi aplicado como adsorvente na EFS, onde a recuperação de AMI foi avaliada nos resíduos de carregamento e eluição com solventes. O carregamento com tampão citrato-acetato pH 6,5 foi o ideal, favorecendo a interação iônica do polímero com o analito. A eluição total de AMI do cartucho somente ocorre após lavagem com o solvente na presença de ácido, que protona os grupos carboxila do polímero, rompendo assim a interação iônica com o analito.

Palavras-chave: Polímeros de impressão molecular (MIP). Extração em fase sólida (EFS). Polimerização por precipitação. Cloridrato de Amilorida.

ABSTRACT

Molecularly imprinted polymers (MIPs) were synthesized and applied as adsorbents in solid-phase extraction technique (SPE). The polymers have been synthesized by precipitation polymerization method because of its simplicity, high yields and good control of final size and shape of particles. MIP was synthesized using methacrylic acid (MAA) as functional monomer, trimethylolpropane trimethacrylate (TRIM) and ethyleneglycol dimethacrylate (EDMA) as cross-linker and amiloride hydrochloride (AMI) was chosen as template. Different ratios of MAA, TRIM and EDMA, volume and type of solvent were used to adjust the optimal synthesis conditions. The MIP were tested for adsorption capacity compared to the polymers synthesized in the absence of template molecule (NIP, non-imprinted polymers). The polar solvent mixture used (THF:MeOH:H2O) allowed the synthesis of MIP of polar molecules as AMI. The solvent volume control afforded the larger particles so the SPE was performed in the usual conditions, giving a potential application for this polymerization technique in the preparation of adsorbents for SPE. The polymers with higher adsorption capacity at the test performed in citrate-acetate buffer pH 6,5 was MIP/NIP 12 (AMI:MAA:TRIM 1:8:10) with adsorption rate of 83 and 88% for NIP and MIP, respectively. The recognition of MIP was due to ionic interaction between MAA and AMI promoted by pH control, but was not specific. The polymer MIP/NIP 12 was used as a solid-phase extraction sorbent and the recoveries of AMI was evaluated using different loading and elution conditions. The loading with buffer citrate-acetate pH 6,5 was optimal, due to ionic interaction of the polymer with the analyte. Total elution of AMI bound to the polymers only occurs after washing with a acid-containing solvent, because of protonation of the carboxyl groups of the polymer and disrupting the ionic interaction with the analyte.

Keywords: Molecularly imprinted polymers (MIPs); solid-phase extraction technique (SPE); precipitation polymerization method; amiloride hydrochloride.

LISTA DE SIGLAS

1-MA 1-metiladenosinaABDV Azo-bis-dimetilvaleronitrilaACN AcetonitrilaAIBN 2,2’-azo-bisisobutironitrilaALC Agente de ligação cruzada ou reticulaçãoAMI Cloridrato de amiloridaATE AtenololBPA Bisfenol ACG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massasCLAE Cromatografia Liquida de Alta EficiênciaCLAE-EM Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria

de massas CLAE-EM/EM

Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas em série

DBP DibutilftalatoDIP DipiridamolEDMA Dimetacrilato de etilenoglicolEFS Extração em fase sólidaFDA Food and Drug AdministrationFTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de FourierFUR FurosemidaHCT HidroclorotiazidaIR Iniciador radicalarISE Ionização por eletronsprayIUPAC Acrônimo de Internacional Union of Pure and Applied Chemistry

(Uniâo Internacional de Química Pura e Aplicada)MAA Ácido metacrílicoMeOH MetanolMET Microscopia Eletrônica de TransmissãoMF Monômero funcionalMIP Polímero de impressão molecularMISPE Extração em fase sólida com impressão molecularMM Molécula moldeNIP Polímero não impressoPB Peróxido de benzoílaPMC Perfluoro metilciclohexanoPRO PropranololPVC Policloreto de vinilaRMN Ressonância magnética nuclearSTX SaxitoxinaTHF TetrahidrofuranoTRIM Trimetacrilato de trimetilolpropanoultra-CLAE Cromatografia Líquida de Ultra-Alta EficiênciaUV UltravioletaVP 4-vinilpiridina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO, f. 15

2 OBJETIVOS, f. 19

2.1 OBJETIVO GERAL, f. 17

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, f. 17

3 REVISÃO DA LITERATURA, f. 18

3.1 POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR (MIP), f. 18

3.1.1 Síntese e variáveis experimentais, f. 18

3.1.2 Técnicas de polimerização, f. 24

3.1.3 Extração em fase sólida com impressão molecular (MISPE), f. 29

3.2 ESCOLHA DA MOLÉCULA MOLDE, f. 34

3.2.1 Estudos de modelagem molecular, f. 36

3.2.2 Propriedades físico-químicas do cloridrato de amilorida, f. 39

3.2.3 Métodos para determinação de cloridrato de amilorida, f. 41

4 MATERIAIS E MÉTODOS, f.

4.1 EQUIPAMENTOS, f. 45

4.2 REAGENTES, f. 47

4.3 PROCEDIMENTOS, f. 47

4.3.1 Síntese dos MIPs e NIPs em cloridrato de amilorida, f. 47

4.3.2 Caracterização química por Espectroscopia no Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR), f. 49

4.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) dos polímeros MIP/NIP 12, f.

49

4.3.4 Preparo da solução tampão citrato-acetato pH 6,5, f. 49

4.3.5 Preparo da solução estoque de AMI a 1 mg/mL, f. 50

4.3.6 Espectro de varredura de AMI em HCl 0,1N e tampão citrato-acetato pH 6,5, f.

50

4.3.7 Preparo da curva de calibração em solução tampão citrato-acetato pH 6,5, f.

50

4.3.8 Ensaio de adsorção variando a quantidade de polímero, f. 50

4.3.9 Ensaio de adsorção de AMI em MIP/NIP 7, 8, 10 e 11 variando a

concentração de AMI, f. 51

4.3.10 Ensaio de adsorção de AMI em MIP/NIP 10 e 12 variando a concentração de

AMI, f. 51

4.3.11 Ensaio de adsorção de AMI nos polímeros em THF: MeOH: água (5:4:1), f. 52

4.3.12 Confecção dos cartuchos para a EFS, f. 52

4.3.13 Procedimento da técnica de MISPE com solução de AMI, f. 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO, f. 54

5.1 SÍNTESE DOS MIPs E NIPs, f. 54

5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS POLÍMEROS OBTIDOS, f. 60

5.2.1 Caracterização química por Espectroscopia no Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR), f. 60

5.2.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão de MIP/NIP 12, f. 63

5.3 ENSAIOS DE ADSORÇÃO, f. 64

5.3.1 Ensaio de adsorção de cloridrato de amilorida em solução tampão pH 6,5, f.

64

5.3.2 Ensaio de adsorção dos polímeros em THF:MeOH:água (5:4:1), f. 72

5.4 EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM MIP (MISPE), f. 73

6 CONCLUSÕES, f. 76

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, f. 78

8 ANEXOS, f. 84

8.1 ESPECTROS DE FTIR DOS MONÔMEROS, f. 85

8.2 ESPECTROS DE FTIR DOS POLÍMEROS, f. 86

8.3 TABELAS COM RESULTADOS DOS ENSAIOS DE ADSORÇÃO, f. 91

8.3.1 Curva de calibração em tampão citrato-acetato pH 6,5, f. 91

8.3.2 Ensaios de adsorção com os polímeros, f. 92

8.3.3 Ensaios de adsorção variando a concentração, f. 94

8.3.4 Análise estatística com os resultados dos ensaios de adsorção (Teste t), f.

100

8.4 TABELAS COM RESULTADOS DA EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM

MIP (MISPE), f. 101

8.5 CERTIFICADO DE ANÁLISE DO FABRICANTE DE CLORIDRATO DE

AMILORIDA, f. 102

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema da síntese de MIP, f. 19

Figura 2. Estruturas dos principais monômeros funcionais, f. 21

Figura 3. Estruturas dos principais agentes de ligação cruzada, f. 21

Figura 4. Fases da reação de polimerização em cadeia via radicais livres, f. 22

Figura 5. Estruturas dos principais iniciadores radicalares, f. 23

Figura 6. Principais técnicas de síntese de MIP, f. 25

Figura 7. Número de publicações científicas sobre MIP usados como sistemas de liberação de fármacos nos últimos anos, f. 29

Figura 8. Técnica de Extração em Fase Sólida, f. 30

Figura 9. Compostos candidatos a molécula molde para a STX, f. 37

Figura 10. Modificações na estrutura da amilorida sugeridas na modelagem molecular, f. 38

Figura 11. Estrutura da amilorida, f. 40

Figura 12. Esquema da síntese de MIP de AMI com EDMA e MAA, f. 60

Figura 13. Espectros de FTIR de MIP e NIP 7 (EDMA), f. 61

Figura 14. Espectros de FTIR de MIP e NIP 11 (TRIM), f. 62

Figura 15. Espectro de FTIR de AMI, f. 63

Figura 16. Imagens de MET dos polímeros NIP e MIP, f. 64

Figura 17. Espectro de varredura de cloridrato de amilorida, f. 65

Figura 18. Curva de calibração AMI em tampão citrato-acetato pH 6,5, f. 65

Figura 19. Gráficos de adsorção de acordo com a massa de polímero, f. 66

Figura 20. Curvas de adsorção de MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12, f. 68

Figura 21. Curvas de adsorção de MIP/NIP 10 e 12 de acordo com a concentração, f. 69

Figura 22. Interação iônica de amilorida com o ácido metacrílico no pH 6,5, f. 71

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Compostos selecionados para os estudos de modelagem, f. 36

Tabela 2. Quantidades dos reagentes na síntese dos MIPs e NIPs de cloridrato de amilorida, f. 48

Tabela 3. Rendimentos das reações de síntese dos MIPs e NIPs, f. 55

Tabela 4. Aspecto dos polímeros obtidos, f. 56

Tabela 5. Taxas médias de adsorção (%) dos polímeros, f. 70

Tabela 6. Recuperação de AMI (%) obtida pela técnica de MISPE, f. 74

1 INTRODUÇÃO

Os polímeros de impressão molecular (Molecularly Imprinted Polymers - MIP)

consistem em matrizes macromoleculares sintéticas, obtidas com base em métodos

de moldagem molecular e que são capazes de reconhecer seletivamente moléculas

biológicas, como fármacos e proteínas. A especificidade na detecção de substâncias

é comparável à dos anticorpos monoclonais utilizados em técnicas imunológicas

(SOUSA; BARBOSA, 2009).

Para sintetizar o MIP, uma molécula molde é colocada para interagir com as

moléculas de um monômero. A molécula molde pode ser o próprio analito ou um

composto com estrutura semelhante ao mesmo. O monômero, denominado

funcional, deve possuir grupos que possibilitem a interação com a molécula molde,

sendo que esta pode ser de natureza covalente ou não covalente. Adiciona-se ao

meio, um segundo monômero (estrutural) capaz de promover ligações cruzadas

entre os monômeros primários, a fim de formar uma matriz polimérica rígida. A

reação de polimerização é do tipo em cadeia e começa após a adição de um

iniciador radicalar, espécie química capaz de liberar radicais livres para iniciar a

reação. Por fim, a molécula molde é removida da matriz polimérica por meio de

solvente ou clivagem química (no caso de ligação covalente). Assim, espera-se que

o polímero resultante contenha microcavidades com tamanhos uniformes capazes

de reter seletivamente a molécula molde em uma amostra complexa, eliminando

também possíveis interferentes (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

Além do caráter seletivo, os MIPs demonstram vantagens em relação aos

adsorventes de natureza biológica quanto à estabilidade química, capacidade de

adsorção e reprodutibilidade no preparo do polímero, além de menor custo,

16

preparação rápida, resistência térmica e melhores condições de estocagem

(TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a e b).

O emprego de MIP como material adsorvente na técnica de extração em fase

sólida (EFS) vem adquirindo destaque, pois oferece alto grau de seletividade quando

comparados com outros materiais, como a sílica modificada (C18) e resinas de troca

iônica e, ao mesmo tempo, por serem mais estáveis que os adsorventes de origem

biológica (imunosorventes). A EFS consiste na percolação da amostra no material

adsorvente disposto em cartuchos, onde a espécie de interesse fica retida. Quando

o material adsorvente é um MIP, a técnica recebe a designação de Molecular

Imprinting Solid-Phase Extraction (MISPE) (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA,

2005a).

A técnica de EFS promove a eliminação dos principais interferentes presentes

na matriz, principalmente de natureza biológica, possibilitando assim a obtenção de

um resíduo mais limpo. Com o uso de um pequeno volume de solvente para eluir o

analito do cartucho promove-se a sua concentração. Além da economia com

reagentes e solventes, o tempo gasto com extração e purificação é menor. A EFS é

usualmente empregada para o preparo de amostras de urina visando a análise

toxicológica (COSTA, 2008).

A técnica de extração em fase sólida representa uma estratégia interessante

para a extração de substâncias, em particular as de elevada polaridade, em matrizes

de natureza altamente hidrofílica como as biológicas. Na análise de substâncias

polares em urina, por exemplo, a extração líquido-líquido é a técnica mais utilizada,

e geralmente fornece rendimentos baixos devido a solubilidade destas na fase

aquosa. Além das propriedades da EFS, a MISPE acrescenta um aumento na

seletividade na extração do analito de interesse frente a outros compostos presentes

na amostra, devido ao efeito de impressão molecular, além de reduzir os efeitos dos

interferentes da matriz da amostra (BLOMGREN, et al., 2002).

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral do projeto consiste na síntese de Polímeros de Impressão

Molecular (MIPs) para serem utilizados como adsorventes na técnica de extração

em fase sólida.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1 Escolha da molécula molde a ser usada na síntese dos Polímeros de

Impressão Molecular (MIPs);

2.2.2 Síntese dos MIPs com a molécula molde escolhida no item 2.2.1 e seus

polímeros não impressos (NIP) correspondentes;

2.2.3 Caracterização dos polímeros obtidos (MIPs e NIPs);

2.2.4 Ensaio de adsorção do analito escolhido nos MIPs e NIPs sintetizados e

avaliação da capacidade adsortiva dos mesmos;

2.2.5 Confecção do cartucho para a EFS com os polímeros de maior capacidade

adsortiva (MISPE);

2.2.6 Procedimento da técnica de MISPE com solução padrão para determinação

da recuperação do analito em MIP e NIP.

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR (MIP)

3.1.1 Síntese e variáveis experimentais

A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros dotados

de sítios específicos de reconhecimento, moldados a partir de uma molécula molde

(MM), sendo esta o próprio analito ou um composto de estrutura semelhante.

Nesses polímeros, rotineiramente denominados de Polímeros de Impressão

Molecular (Molecularly Imprinted Polymers, MIP), a etapa de síntese ocorre após a

formação de um complexo entre o monômero funcional (MF) e a MM. Assim, as

terminações ligantes dos MF são posicionadas em pontos complementares àqueles

provenientes da MM, permitindo a formação de ligações. Após a adição de um

agente de ligação cruzada (“cross-linker”) e um reagente iniciador, a reação de

polimerização tem início e o MIP é formado (Figura 1), ocorrendo a formação de

uma matriz polimérica rígida (FIGUEIREDO; DIAS; ARRUDA, 2008; CORMACK;

ELORZA, 2004).

Em seguida, após a extração da molécula molde (também referida como

molécula chave, molécula alvo, molécula impressa, analito ou template, do inglês),

realizada por meio de um solvente adequado, são formadas cavidades

complementares a este molde em tamanho, forma e presença de grupos funcionais

(TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a; TAMAYO; TURIEL; MARTÍN-

ESTEBAN, 2005). Tais cavidades constituem os sítios específicos de ligação que

agem no reconhecimento deste composto e/ou de substâncias com estrutura

semelhante a ele. Por causa desta capacidade, os MIPs podem ser conhecidos

como anticorpos plásticos, já que os mesmos podem atuar como biomiméticos,

19

mimetizando o mecanismo de ação de enzimas ou a interação fármaco-receptor

(YAN; RAMSTRÖM, 2005).

Figura 1. Esquema da síntese de MIP

Fonte: TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a

O primeiro MIP foi sintetizado em 1972, quando Wulf e Sarhan descreveram a

síntese de um polímero com sítios seletivos para a separação enantiomérica de

racematos de açúcares (WULF; SARHAN, 1972). Desde então, estes materiais têm

recebido grande atenção por causa das vantagens, em relação aos materiais

biológicos, que atuam no mecanismo de reconhecimento molecular. A facilidade de

síntese, o baixo custo dos reagentes empregados, a estabilidade química, física e

térmica do material por longos períodos de tempo, a capacidade de ser estocado

sem perder sua especificidade e a possibilidade de reutilização do polímero, após a

limpeza do mesmo, são algumas dessas vantagens (MAIER et al., 2004; MAHONY

et al., 2005).

Em contrapartida, os materiais imunosorventes possuem algumas

desvantagens como o elevado custo, a variação de sua estabilidade, a fragilidade

química, física e térmica dos mesmos, a necessidade de condições especiais de

armazenagem, a dificuldade de obtenção de biomoléculas e instabilidade quando

20

estes são empregados em condições diferentes daquelas presentes em seu

ambiente nativo (MAIER et al., 2004; TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005b).

Desta forma, os MIPs têm sido empregados como substitutos de biomoléculas que

atuam no processo de reconhecimento molecular (MAIER et al., 2004; BAGGIANI et

al., 2001). Entretanto, os Polímeros de Impressão Molecular apresentam algumas

desvantagens como a baixa capacidade catalítica e a natureza polidispersa dos

sítios de reconhecimento, embora isto não seja sempre uma limitação na prática.

Dependendo de como o MIP é sintetizado, a quebra e trituração do material torna o

processo laborioso e pode haver a dificuldade de remoção da molécula molde em

alguns casos (MAHONY et al., 2005).

Em todos os processos de moldagem molecular, a MM assume uma

importância fundamental, já que é responsável pela definição da organização

espacial dos grupos funcionais dos MF. Os MF são responsáveis pelas interações

que se estabelecem nos locais de reconhecimento. É muito importante assegurar a

complementaridade da funcionalidade da MM com a do MF (por exemplo, um

doador de prótons com um aceptor de prótons), de modo a maximizar a formação

dos complexos e, assim, o processo de moldagem molecular do polímero (SOUZA;

BARBOSA, 2009).

Entre os MF mais empregados para o preparo dos MIPs (Figura 2), está o

ácido metacrílico (MAA, 1). No entanto, deve-se salientar que a escolha deste é feita

de acordo com a natureza do analito. A maioria deles possuem a capacidade de

fazer ligações de hidrogênio e interação iônica com o analito. Os analitos que

possuem grupos básicos, por exemplo, interagem mais facilmente com monômeros

que contenham grupos ácidos, como o MAA e monômeros com caráter básico,

como o 4-vinilpiridina (4-VP, 2), interagem preferencialmente com analitos ácidos. A

acrilamida (3) faz interações com o analito somente através de ligações de

hidrogênio (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

O agente de ligação cruzada ou reticulação (ALC) usado na obtenção de um

MIP desempenha três funções principais: controle da morfologia da matriz polimérica

(polímero do tipo gel, polímero macroporoso ou pó microgel), estabilização dos

locais de ligação com capacidade de reconhecimento molecular e estabilização

mecânica da matriz polimérica. Da mesma forma que ocorre a interação entre a MM

e o MF, o ALC deve ter grupos que possam interagir de maneira estável com o MF

para a formação da matriz polimérica.

21

(1) (2) (3)

Figura 2. Estruturas dos principais monômeros funcionais,

MAA (1), 4-VP (2) e acrilamida (3)

As estruturas dos principais ALC utilizados na síntese de MIPs constam na

Figura 3. O dimetacrilato de etilenoglicol (EDMA, 4) tem sido o agente de ligação

cruzada mais utilizado, pois promove a formação de polímeros térmica e

mecanicamente estáveis e com rápida transferência de massa. O trimetacrilato de

trimetilolpropano (TRIM, 5) também é bastante utilizado, devido a produzir MIP com

elevada seletividade e com maior capacidade de carregamento (SOUZA;

BARBOSA, 2009; KAREUHANON et AL., 2009).

(4) (5)

Figura 3. Estruturas dos principais agentes de ligação cruzada,

EDMA (4) e TRIM (5)

A reação de polimerização para a formação do MIP é do tipo radicalar, em

cadeia, podendo ser classificada como polimerização em cadeia. Neste tipo de

polimerização, os monômeros (MF e ALC) devem possuir em sua estrutura duplas

ligações. Durante a reação, há a abertura de uma dupla ligação pela ação de um

22

iniciador que, no caso da síntese de MIP, é um composto capaz de produzir radicais

livres, denominado iniciador radicalar. As fases da reação de polimerização por

adição são a iniciação, a propagação e o término (Figura 4). O início da formação

da cadeia polimérica então se dá início a partir do rompimento da dupla ligação de

um monômero pela ação de um radical livre formado por cisão homolítica do

iniciador, produzindo um novo radical (CANEVAROLO Jr., 2006).

Iniciação

R1OOR1 → 2 R1OO·

R2 – HC=CH – R3→ R2– HC – CH – R3·

2 R1OO· + R2– HC – CH – R3 · → R1OO – R3– HC – CH – R2·Propagação

R1OO – R3– HC – CH – R2· + R2– HC – CH – R3 · → R4·Término

R4· + R5· → R4 – R5 (combinação)

R4· + R5· → R4 + R5 (desproporcionamento)

R4· + R5 → R4 + R5· (transferência de cadeia)

R4· + S → R4 + S· (transferência para o solvente)

Figura 4. Fases da reação de polimerização em cadeia via radicais livres

A fase de propagação é a reação deste radical com outra ligação dupla de

outra molécula de monômero, e assim sucessivamente, produzindo macrorradicais.

O término da formação das cadeias poliméricas pode ocorrer através da combinação

de dois macrorradicais em crescimento, por desproporcionamento, onde dois

macrorradicais se rearranjam e param o crescimento das duas cadeias, por

transferência de cadeia (uma cadeia em crescimento transfere o radical para uma

cadeia terminada, fazendo esta crescer novamente e terminando a primeira) ou

transferência para o solvente, onde o radical da cadeia em crescimento é transferido

para o solvente (CANEVAROLO Jr., 2006).

23

A função do iniciador radicalar (IR) é liberar radicais livres para possibilitar o

início e a manutenção da reação de polimerização. Contudo, para o início da reação,

é necessário algum estímulo físico como o aumento da temperatura ou a incidência

de radiação UV. Esse estímulo é determinante na escolha do IR, pois os outros

reagentes da síntese (MM, MF, ALC) podem ser termo ou fotossensíveis. As

estruturas dos principais IRs utilizados em impressão molecular estão na Figura 5.

O IR 2,2’-azo-bisisobutironitrila (AIBN, 6) é o mais empregado na síntese dos MIPs,

mas outros também podem ser utilizados, como azo-bis-dimetilvaleronitrila (ABDV,

7) e peróxido de benzoíla (PB, 8) (FIGUEIREDO; DIAS; ARRUDA, 2008;

CORMACK; ELORZA, 2004; KAREUHANON et al., 2009).

(6) (7) (8)

Figura 5. Estruturas dos principais iniciadores radicalares,

AIBN (6), ABDV (7) e PB (8)

O solvente na síntese do MIP deve ser cuidadosamente escolhido de acordo

com a natureza da molécula molde e dos reagentes. Além de dissolver os reagentes

da síntese, este não deve interferir na formação do complexo MM-MF, o que pode

resultar na formação de sítios de ligação pouco seletivos e em pequeno número. A

maioria dos MIPs é sintetizada em solventes de polaridade mais baixa, apróticos e

de baixa constante dielétrica, como por exemplo, clorofórmio e tolueno (MATSUI et

al., 1995; HAGINAKA et al., 1999). Entretanto, alguns MIPs já foram sintetizados

com sucesso em solventes polares como metanol (CAI; GUPTA, 2004) e acetonitrila

(THEODORIDIS; MANESIOTIS, 2002), além de misturas de solventes como THF,

metanol e água visando a aplicação do MIP em análises de amostras aquosas,

como alimentos e fluidos biológicos (KAREUHANON et al., 2009).

Existem vários processos de moldagem molecular, permitindo gerar locais

com elevada capacidade e especificidade de reconhecimento molecular, que se

24

distinguem pela natureza da ligação estabelecida com a MM, quer durante o

processo de síntese do polímero, quer na fase de recaptação da MM. A moldagem

covalente se caracteriza pelas ligações covalentes que se formam entre MM e MF,

com estequiometria definida, mas com cinética menos favorável na recaptação do

analito. Essas ligações podem ser reversíveis ou irreversíveis, o que implica para

este último em condições mais drásticas para remoção do template sem

recuperação deste em sua forma original, além da recaptação do mesmo ser

estericamente desfavorável. Na moldagem não covalente, as interações podem ser

através de ligações de hidrogênio ou de natureza iônica, além de interações

hidrofóbicas e dipolo-dipolo (WHITCOMBE; VULFSON, 2001). Neste processo, a

MM pode ser facilmente extraída do polímero e reciclada, o que é particularmente

interessante pela sua simplicidade, permitindo a obtenção de MIP que apresentam

uma afinidade elevada para o seu alvo e uma ampla aplicabilidade. (SOUSA;

BARBOSA, 2009).

A técnica de impressão molecular envolve a preparação em paralelo ao MIP

de um polímero não impresso (NIP), ou polímero controle, ou seja, o MIP sintetizado

sem a presença da molécula molde. A formação das cavidades complementares em

MIP pela interação com o analito pode ser verificada pela maior retenção deste no

polímero impresso, comparado ao NIP, em determinadas condições de análise que

devem ser otimizadas para cada composto. Em NIP, ocorre a formação de sítios não

seletivos, de forma aleatória, desprovidos de cavidades complementares ao volume

e posição de grupos que podem interagir com o analito, promovendo alguma

retenção do mesmo.

3.1.2 Técnicas de polimerização

Diferentes usos e potenciais aplicações dos MIPs exigem diferentes

propriedades dos polímeros. Alguns fatores tais como especificidade, capacidade ou

o meio em que se encontra a amostra e o analito requerem características

particulares nos MIPs. Em resposta a essa demanda, diferentes métodos para

produzir polímeros impressos foram desenvolvidos. As técnicas mais empregadas

para o preparo de MIP são a polimerização em massa, por suspensão, por

precipitação, polimerização por expansão em multietapas (“multi-step swelling”) e

por emulsão (Figura 6). Cada um desses procedimentos envolve o controle de

25

diferentes parâmetros durante a síntese e produz polímeros com propriedades

diferentes (PÉREZ-MORAL; MAYES, 2004).

Figura 6. Principais técnicas de síntese de MIP: (A) Massa (B) Suspensão

(C) Precipitação (D) Expansão em multietapas e (E) Emulsão (“Core-shell emulsion”)

Fonte: Adaptado de PÉREZ-MORAL; MAYES, 2004

Os MIPs são preparados convencionalmente pelo método de polimerização

em massa (ou bulk, do inglês), onde a reação é realizada em sistema homogêneo.

Esta reação é conduzida em frascos selados contendo monômero, molécula molde,

solvente, agente de ligação cruzada e iniciador radicalar. A reação ocorre na

ausência de oxigênio sob fluxo de N2 ou argônio e induzida com aquecimento e/ou

radiação UV. O oxigênio deve ser eliminado do meio reacional, pois retarda a reação

de polimerização radicalar. Por fim, o sólido polimérico resultante é moído,

peneirado e submetido a uma lavagem com solvente para extração do analito,

visando seu uso posterior. As partículas obtidas por este processo possuem forma

irregular, com o tamanho variando entre 20 e 50 µm. Uma outra desvantagem é que

uma grande parte do polímero produzido (cerca de 50%) perde suas propriedades

analíticas, uma vez que durante a trituração, alguns sítios seletivos formados são

parcialmente destruídos, diminuindo a capacidade seletiva de retenção do polímero.

Também pode ocorrer a formação de áreas de heterogeneidade na matriz

polimérica, resultante da falta de controle do processo durante a polimerização,

26

particularmente quando a iniciação da polimerização é feita por UV. Os MIPs obtidos

pelo método de polimerização em massa são mais indicados para técnicas de

extração como a EFS (partículas da ordem de micrômeros), ao passo que seu uso

como fase estacionária em CLAE é pouco indicado, devido à heterogeneidade das

partículas (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a; PÉREZ-MORAL; MAYES,

2004).

A polimerização por suspensão tem como objetivo a obtenção de

microesferas com maior homogeneidade de tamanho. A reação polimérica ocorre

dentro das gotas do monômero dispersas num solvente imiscível, geralmente água.

Os reagentes da síntese (MF, MM, ALC e IR) são dissolvidos em solvente orgânico

e, em seguida, adicionados na fase dispersiva (polar), sendo a fase apolar voltada

para o interior da micela, normalmente estabilizada pelo emprego de um tensoativo,

geralmente o álcool polivinílico ou polímeros à base de sais orgânicos

(FIGUEIREDO; DIAS; ARRUDA, 2008). A reação de polimerização ocorre após o

aquecimento do meio reacional sob agitação. O polímero obtido no formato de

esferas é facilmente separado da fase aquosa. Apesar da uniformidade do tamanho

das partículas ser uma vantagem, algumas moléculas de água se dissolvem na

mistura polimérica interferindo na interação analito-monômero, principalmente

quando esta se dá por ligação de hidrogênio. Além disso, quando monômeros e

analitos possuem elevada solubilidade em água, pode ocorrer partição destes

constituintes da fase orgânica para o meio aquoso, resultando num polímero com

baixo reconhecimento molecular. A polimerização por suspensão é mais adequada

para analitos e monômeros que interagem preferencialmente por interações

hidrofóbicas e iônicas (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

A fim de solucionar a limitação constatada no método de polimerização por

suspensão em meio aquoso, foi desenvolvida uma reação de polimerização em

suspensão empregando o agente dispersante perfluorocarbono (perfluoro

metilciclohexano - PMC). Este agente é imiscível em muitos compostos orgânicos e,

consequentemente, permite a formação de uma fase inerte apropriada para a

polimerização. Além das vantagens em relação ao método de polimerização por

suspensão em meio aquoso no que tange à influência da água, no método com o

emprego de PMC é possível também controlar o tamanho das partículas poliméricas

(de 5 a 50 μm) alterando a massa do dispersante (TARLEY; SOTOMAYOR;

KUBOTA, 2005a).

27

O método de preparo de MIP por meio de polimerização por precipitação é

análogo ao método de polimerização em massa, porém, volumes superiores de

solventes são empregados. Enquanto que, no método convencional normalmente

são utilizados volumes de 10 mL, no método por precipitação são usados cerca de 5

vezes mais. Neste método não é necessário usar nenhum tipo de estabilizante para

evitar a coagulação das gotas de monômero. A formação de partículas poliméricas

ocorre devido ao crescimento da cadeia polimérica ao longo da reação, o que torna

o polímero cada vez menos solúvel no meio. Além disso, a precipitação também

ocorre em face da formação de ligações cruzadas no polímero, tornando-o também

pouco solúvel no solvente reacional. Devido a estes fatores, a formação de

microesferas na forma de um precipitado é assegurada sem a necessidade de se

empregar agentes estabilizantes. A polimerização por precipitação também produz

partículas com tamanhos pequenos e uniformes (diâmetro entre 0,3 – 10 μm) com

maior rendimento da reação (85%). A síntese dos MIPs por polimerização por

precipitação é induzida por luz ou aquecimento na ausência de oxigênio, quando

ambos, monômero e analito são dissolvidos no solvente, seguido da adição do

reagente de ligação cruzada e iniciador radicalar. Neste método as micropartículas

são obtidas por meio de centrifugação. O método de polimerização por precipitação

produz partículas com diâmetros reduzidos e essa característica torna-se uma

desvantagem quando tais polímeros são utilizados como fases estacionárias em

CLAE, dada a elevada pressão resultante dentro da coluna cromatográfica

(TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

O método de polimerização por expansão em multietapas é o mais trabalhoso

e envolve basicamente o emprego de partículas poliméricas com diâmetro bem

definido (geralmente poliestireno com diâmetro de 1 μm). Diferente de outros

métodos, as partículas poliméricas atuam como solventes porogênicos, permitindo a

produção de polímeros com tamanhos e poros maiores. Primeiramente, uma

microemulsão de partículas de poliestireno é preparada em água contendo o

tensoativo dodecil sulfato de sódio e o solvente dibutilftalato. O sistema é agitado até

eliminar a microemulsão. Em seguida, a expansão das partículas de poliestireno é

efetuada após adição de uma microemulsão preparada a partir do iniciador radicalar,

solvente porogênico e álcool polivinílico como agente estabilizante. Após um

determinado tempo de agitação, o analito junto com o monômero funcional e o

reagente de ligação cruzada dispersos em água, além de álcool polivinílico, são

28

adicionados ao meio. O sistema é novamente agitado, caracterizando a segunda

etapa de expansão das partículas de poliestireno. Por fim, a reação de

polimerização do MIP é iniciada sob agitação e induzida por aquecimento sob

atmosfera inerte. As partículas monodispersas do MIP são posteriormente

separadas do sobrenadante e submetidas a uma lavagem com solvente para

extração do analito, e se apresentam com diâmetro entre 2 – 50 μm (TARLEY;

SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

O método de polimerização por emulsão envolve a formação de um núcleo

polimérico, primeiramente, em fase aquosa contendo os monômeros e iniciador,

adicionada de tensoativos e com controle de temperatura e agitação. As partículas

obtidas são filtradas e colocadas para reagir em nova fase aquosa com tensoativo,

monômeros, iniciador e o analito. As partículas de MIP vão se formando ao redor do

núcleo, em forma de concha (daí a denominação “core-shell”). As partículas obtidas

por este método são monodispersas e podem ser produzidas em um intervalo de

tamanho coloidal de 0,05 – 2 μm (PÉREZ-MORAL; MAYES, 2004).

A aplicação da tecnologia de impressão molecular é muito ampla, onde

existem estudos na área da química analítica em métodos de extração (extração e

microextração em fase sólida), separação (como adsorventes em cromatografia

líquida) e no desenvolvimento de sensores químicos, na área da química sintética

(como catalisadores), na indústria de alimentos (para remoção de cafeína e

colesterol de amostras) e na biotecnologia, como material de suporte para

crescimento de células e para purificação de proteínas (WHITCOMBE; VULFSON,

2001). Mais recentemente, os MIP têm sido estudados para serem utilizados como

uma ferramenta para o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos

(“DDS – drug delivery systems”), aumentando o número de publicações nas últimos

anos, como pode ser visto na Figura 7.

A aplicabilidade dos MIPs em diferentes segmentos da química analítica faz

com que a adoção dos procedimentos de preparo seja dependente das

características intrínsecas das técnicas. Significa, portanto, que o preparo de um

MIP visando seu uso em técnicas de separação é diferente daquele onde o MIP vai

ser utilizado na modificação de eletrodos ou sensores químicos (TARLEY;

SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005b).

29

Figura 7. Número de publicações científicas sobre MIPs

usados como sistemas de liberação de fármacos nos últimos anos.

Fonte: FIGUEIREDO; DIAS; ARRUDA, 2008

3.1.3 Extração em fase sólida com impressão molecular (MISPE)

O emprego dos MIPs como materiais adsorventes em EFS vem adquirindo

destaque, pois oferecem alto grau de seletividade quando comparado com outros

adsorventes, como a sílica modificada (C18) e resinas de troca iônica e, ao mesmo

tempo, por serem mais estáveis que os imunosorventes. Um procedimento de EFS

consiste na percolação da amostra no material sorvente disposto em cartuchos,

onde a espécie de interesse fica retida seletivamente quando do uso do MIP. Em

seguida, ao se empregar amostras complexas, faz-se necessário efetuar uma etapa

de limpeza com um solvente adequado, no intuito de extrair as espécies

interferentes ligadas ao polímero por interações não específicas. Nesta etapa, a

espécie de interesse não deve ser coeluída. As interações não específicas formadas

durante a síntese, responsáveis pela retenção das espécies interferentes no MIP são

originadas devido ao excesso de monômeros no meio reacional. Sendo assim, na

extração em fase sólida normalmente é realizada uma etapa de limpeza também

conhecida como etapa de lavagem, a fim de extrair os interferentes retidos nos sítios

não específicos. A etapa final é efetuada mediante a eluição do analito na ausência

dos interferentes. Nestes procedimentos, as etapas de limpeza e de pré-

concentração são executadas simultaneamente, o que confere também aos MIPs

30

características de materiais pré-concentradores, como visto na Figura 8 (TARLEY;

SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a; PEREIRA, 2008).

Figura 8. Técnica de extração em fase sólida. Em (1), a amostra é adicionada ao cartucho

contendo o MIP e o analito se liga seletivamente ao polímero (2). Em (3) ocorre a eluição dos

componentes da matriz e posterior eluição do analito com solvente apropriado.

Fonte: ANDERSSON, L.I., 2000

A análise de microcistina-LR através de MISPE foi descrita por Chianella et al.

(2003). O uso da técnica permitiu a concentração da amostra em até 1000 vezes,

facilitando a quantificação em água potável, onde os níveis da toxina são muito

baixos. O MIP pode tanto ser utilizado em EFS quanto como sensor químico.

Theodoridis e Manesiotis (2002) desenvolveram a síntese de um MIP para

análise de cafeína por polimerização em massa utilizando como monômeros EDMA

e MAA, e AIBN como iniciador em acetonitrila como solvente. Diferentes protocolos

de lavagem e eluição foram desenvolvidos para otimizar a extração de cafeína das

amostras. O MIP sintetizado foi aplicado em cartuchos e utilizado na técnica de

extração em fase sólida. Observou-se que houve boa retenção da cafeína no

cartucho contendo o MIP na etapa de lavagem, com recuperação média de 23%, ao

contrário do cartucho com o NIP (polímero não impresso), onde a retenção não foi

tão eficiente, com recuperação em torno de 76%. O protocolo de extração otimizado

foi utilizado para extração direta da cafeína em bebidas e plasma humano fortificado

com cafeína, com recuperação em torno de 83% nos dois casos.

Theodoridis et al. (2003), utilizaram a técnica do “dummy template” para a

síntese de um MIP seletivo para a escopolamina. Essa técnica envolve a utilização,

como molécula molde, de um análogo estrutural ao analito de interesse, sendo a

31

hiosciamina a molécula selecionada. O MIP foi sintetizado pela técnica de

polimerização em massa, utilizando EDMA, MAA e AIBN em tolueno. Estudos

visando a otimização da EFS para a extração da escopolamina foram realizados, até

se observar que na etapa de lavagem o analito é mais retido em MIP do que em NIP

e o contrário na eluição, onde deve haver maior recuperação em MIP. O MIP

apresentou seletividade para a extração da escopolamina em amostras biológicas,

como urina e soro bovino e humano, entretanto com uma recuperação de 46 a 59%

nas amostras de urina e de até 79% nas amostras de soro.

Scorrano, Longo e Vasapollo (2010) elaboraram a síntese de um MIP para

análise de 1-metiladenosina (1-MA) por polimerização em massa (EDMA, MAA,

AIBN) em acetonitrila:água (4:1) para aplicação na técnica de EFS, superando

dificuldades relacionadas à impressão molecular de substâncias polares, devido a

não solubilidade em solventes orgânicos. A seletividade do MIP foi avaliada

observando-se a recuperação de compostos análogos à 1-MA, como adenosina e

citidina, demonstrando que o MIP foi altamente seletivo para 1-MA. A recuperação

na extração de 1-MA foi de 95% para o MIP, 50% para o cartucho C18 e apenas 36%

para o NIP, mostrando que a retenção foi seletiva. O protocolo de extração adotado

foi eficaz na extração de 1-MA de amostras de urina humana fortificadas,

concentrando a amostra e eliminando interferentes da matriz.

Blomgren e colaboradores (2002) desenvolveram um método para a extração

de clembuterol a partir de amostras de urina bovina usando um polímero de

impressão molecular (MIP). A quantificação de clenbuterol na urina foi realizada

utilizando CLAE com detecção por UV. O MIP foi produzido usando brombuterol

como molécula molde (dummy template) e a seletividade do MIP, para clembuterol,

foi testada contra um polímero não-impresso (NIP). As condições da extração foram

otimizadas de modo a se obter uma maior retenção do analito em MIP do que em

NIP, conseguida na lavagem com acetonitrila-ácido acético (98:2). A retenção de

clembuterol em MIP foi seletiva e melhor avaliada em amostras de urina diluída,

devido a menor força iônica da matriz. Os resultados das análises em CLAE

mostraram que a extração de clembuterol utilizando MIP foi linear no intervalo de 0,5

– 100 ng mL-1, com recuperação absoluta de 75% nesta faixa de concentração.

Um estudo foi desenvolvido para a determinação de cloridrato de tramadol em

fluidos biológicos, utilizando a técnica de MISPE para a limpeza da amostra e

quantificação do analito por CLAE com detecção por UV. Os polímeros impressos

32

(MIPs) foram preparados por polimerização em massa utilizando ácido metacrílico

(MAA) como monômero funcional, dimetacrilato de etilenoglicol como agente de

reticulação e clorofórmio como solvente porogênico. O MIP sintetizado foi usado

como adsorvente em EFS para a extração de cloridrato de tramadol a partir de

plasma e urina humanos. Parâmetros que podem afetar a seletividade do MIP em

relação ao NIP e a eficiência de extração, como a quantidade de MAA, o solvente de

síntese e o pH foram avaliados. A seletividade do MIP foi verificada através da

avaliação da retenção de várias substâncias com estruturas moleculares similares

ao tramadol no MIP, como difenidramina, morfina e dextrometofano. O limite de

quantificação para o cloridrato de tramadol em amostras de urina foi de 3,5 µg L-1 e

de 8,5 µg L-1 para amostras de plasma. As recuperações para amostras de plasma

e urina foram maiores do que 91%.

Gholivand e colaboradores (2010) sintetizaram alguns MIPs para extração em

fase sólida e determinação de furosemida em plasma humano. Uma abordagem

computacional foi utilizada para a prever a melhor interação do analito com o

monômero funcional (MF), com base na comparação da energia de ligação dos

complexos formados entre o analito e os MFs. Alguns MFs foram escolhidos para a

síntese dentre os que apresentaram maior energia de ligação com a furosemida. A

acrilamida foi o MF que produziu o MIP com maior capacidade adsortiva e

seletividade em relação ao NIP, sendo selecionado para a aplicação em EFS. Os

MIPs foram sintetizados por polimerização em massa, com EDMA como agente de

reticulação e acetona como solvente. Os solventes utilizados na EFS foram

otimizados quanto à recuperação da furosemida, nas etapas de carregamento,

lavagem e eluição do analito. A furosemida foi quantificada por CLAE-UV, com

linearidade na faixa de concentração de 0,075 – 3,5 µg mL-1 e limite de quantificação

no plasma de 0,043 µg mL-1.

Embora a maioria dos trabalhos de síntese de MIP sejam por polimerização

em massa, existem muitas abordagens que utilizam a técnica por precipitação,

visando a obtenção de partículas mais uniformes e com maior rendimento de sítios

de reconhecimento, pois a etapa de trituração é abolida.

Kareuhanon e colaboradores (2009) desenvolveram um método de

determinação de nevirapina por MISPE em plasma humano. A síntese do MIP foi

feita pela técnica de polimerização por precipitação, utilizando ácido metacrílico

como MF, trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) como agente de ligação

33

cruzada, peróxido de benzoíla como iniciador e como solvente uma mistura de

Tetrahidrofurano:metanol:água (THF:MeOH:água 5:4:1). Foram sintetizados 4

polímeros, cada um com uma molécula molde análoga à nevirapina (nicotinamida,

benzamida e benzofenona), além do próprio analito como molde. O MIP com maior

adsorção para a nevirapina foi o sintetizado em nicotinamida, confirmando estudos

de energia de ligação realizados por modelagem molecular pelos autores. A

seletividade entre MIP e NIP foi avaliada em ensaio de adsorção, onde houve uma

maior adsorção em MIP somente em concentrações acima de 0,5 mM e na etapa de

lavagem do cartucho de EFS. Os cartuchos (MIP e NIP) foram carregados com

nevirapina e lavados com 10 alíquotas de 1 mL de acetonitrila. A recuperação de

nevirapina se mostrou elevada no processo de lavagem em MIP (92%) após a quinta

alíquota de lavagem (maior retenção), enquanto em NIP a recuperação foi de 79%

na primeira lavagem. No cromatograma obtido após a extração por MISPE,

observou-se a eliminação de interferentes.

Zhang et al. (2006) utilizaram a técnica de MISPE para análise de Bisfenol A

(BPA), um composto usado na produção de plásticos policarbonatados e resinas

epóxi e considerado um perturbador endócrino. As amostras eram de origem

biológica e ambiental, podendo conter traços de BPA, o que levou à necessidade de

concentração da amostra. Os polímeros foram preparados por polimerização por

precipitação e usados como adsorventes para extração direta de BPA a partir de

diferentes amostras biológicas e ambientais (soro, urina de porco, água da torneira e

camarão). Os monômeros usados foram 4-vinilpiridina (MF) e TRIM (ALC) e o

iniciador foi o AIBN, dissolvidos em uma mistura de acetonitrila e tolueno (ACN:

Tolueno 3:7 v/v). Os MIPs sintetizados variaram somente na quantidade de molde

adicionado ou ausência do mesmo, no caso do NIP. O polímero que apresentou a

maior seletividade e capacidade de adsorção foi o que continha maior concentração

de BPA (8 mmol) na síntese, sendo este utilizado como adsorvente na EFS. O

protocolo de extração foi otimizado e as condições ótimas para condicionamento,

carregamento, lavagem e eluição foram obtidas. Na etapa de lavagem com

acetonitrila, o MIP foi capaz de reter o analito com maior intensidade do que o NIP,

com recuperação de 99 e 33% de BPA, respectivamente. As análises foram

realizadas em um intervalo de concentração de 2 – 20 mM. As recuperações de BPA

para as amostras utilizando MISPE foram 65,8, 82,3, 76,0 e 75,97% para soro

humano fortificado, urina de porco, água da torneira e camarão, respectivamente.

34

Comparado com o cartucho C18, a técnica de MISPE permitiu uma melhor linha de

base, maior eficiência na separação cromatográfica e maior recuperação do analito.

Outros autores sintetizaram MIPs para aplicação em EFS por precipitação,

como Cacho et al. (2003) para extração de triazinas (herbicidas) em amostras de

vegetais. O MIP foi sintetizado em tolueno, com ácido metacrílico e EDMA como

monômeros, AIBN como iniciador e propazina como molécula molde. O

procedimento de MISPE foi otimizado e aplicado à extração das triazinas em batata,

ervilha e amostras de extratos de milho, permitindo a limpeza da amostra. No

entanto, alguns interferentes da matriz, fortemente ligados à matriz polimérica de

forma não específica, dificultaram a quantificação de algumas triazinas. Assim, o

polímero não impresso (NIP) foi utilizado para a remoção destes interferentes, antes

da percolação da amostra em MIP, sendo estes quase completamente removidos,

permitindo a determinação das triazinas em níveis de concentração abaixo do limite

máximo estabelecido para estes resíduos, tornando o procedimento desenvolvido

adequado para o monitoramento desses analitos em amostras de vegetais.

3.2 ESCOLHA DA MOLÉCULA MOLDE

O projeto originou-se inicialmente da necessidade de desenvolver um teste

diagnóstico para intoxicação por neurotoxinas produzidas por microorganismos

aquáticos (cianobactérias), aplicável tanto a análise de água quanto a análise de

material biológico. Apesar de alguns acidentes já bem documentados (AZEVEDO et

al., 2002), este tipo de intoxicação ainda é subnotificada no Brasil por falta de um

teste diagnóstico rápido e simples, que possa substituir os atuais ensaios biológicos

e as análises por CLAE-EM (HUMPAGE; MAGALHAES; FROSCIO, 2010). As cinco

neurotoxinas de maior incidência foram selecionadas e o projeto original visava a

construção de um cartucho de extração em fase sólida composto de polímeros de

impressão molecular que adsorvessem as neurotoxinas. Este cartucho poderia ser

aplicado na triagem de águas de consumo ou de material biológico. A análise

dessas neurotoxinas é dificultada pela natureza química destes compostos,

alcaloides extremamente solúveis em água. A extração seletiva permitiria o emprego

de uma técnica analítica menos seletiva para a quantificação, como a CLAE

convencional para a análise dos resíduos. Essa técnica é mais disponível nos

35

laboratórios do que a CLAE-EM, que seria utilizada, então, como técnica de

confirmação.

Para este trabalho, uma neurotoxina foi selecionada para os primeiros

estudos, a saxitoxina. A saxitoxina (STX) é um composto de elevada polaridade,

produzido pelas cianobactérias. O padrão analítico não é fabricado no Brasil, sendo

de alto custo de aquisição. A viabilidade dessa pesquisa veio da possibilidade de

trabalharmos com padrões secundários, produzidos em berçários de cianobactérias

aqui no Rio de Janeiro. O extrato bruto rico em saxitoxinas utilizado nos primeiros

testes foi fornecido pelo Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias

da Universidade Federal do Rio de Janeiro (LECT – IBCCF – UFRJ). No entanto, a

concentração da toxina neste extrato era muito baixa (86 µg/mL) e não foi possível

obter quantidade suficiente para os testes de síntese, ainda que suficientes para a

parte analítica.

A alternativa foi a busca na literatura de moléculas semelhantes, para serem

utilizadas como molécula molde na síntese dos polímeros de impressão molecular,

no lugar da toxina, mais conhecido na literatura de síntese de MIPs por “dummy

template” (KAREUHANON et al., 2009). Para tal foi necessário um levantamento

bibliográfico e um estudo de modelagem molecular para seleção de possíveis

moléculas candidatas, que possuíssem volume molecular igual ou ligeiramente

maior que a toxina e que possuíssem pontos de ancoragem, ou seja, grupos

funcionais doadores e aceptores de ligação de hidrogênio, por exemplo,

espacialmente dispostos ou próximos como na toxina.

Para a realização dos estudos de modelagem molecular, contamos com o

apoio do Grupo de Modelagem Molecular e Estudos ADMETox in silico, grupo

de pesquisa coordenado pela Profa. Dra. Monique Brito, da Faculdade de Farmácia

da UFF, onde essa etapa do estudo foi desenvolvida.

Primeiramente, foi feita uma busca na literatura de compostos com possíveis

características em comum com a saxitoxina, além de busca na base de dados do

SciFinder. Para a seleção dos compostos, selecionaram-se alguns grupos que

contivessem particularidades comuns à saxitoxina, como alcaloides de origem

natural, toxinas, agrotóxicos, agonistas/antagonistas do canal de sódio e

aminoácidos precursores da biossíntese da STX. Alguns parâmetros foram

observados nesses compostos como peso molecular, número de grupos doadores e

aceptores de ligação de hidrogênio (importantes para a interação com o monômero

36

funcional no polímero) e posição destes grupos, além da estrutura em 3D e

facilidade de obtenção.

Os compostos selecionados na busca foram encaminhados para o laboratório

da Profa. Monique, onde foram realizados os estudos de modelagem molecular com

metodologia particular deste e selecionados alguns compostos para a síntese dos

MIPs.

3.2.1 Estudos de modelagem molecular

Foram encontrados na literatura ao todo 40 compostos candidatos

promissores à molécula molde para a STX. Destes, somente 7 foram selecionados

para os estudos de modelagem molecular: Fisostigmina, Colchicina, Papaverina,

Amilorida, Escopolamina, Praziquantel e um glicopiranosil sintético a base de

asparagina e N-acetilglicosamina (Tabela 1).

Tabela 1. Compostos selecionados para os estudos de modelagem

Composto Peso Molecular Grupos doadores de ligação hidrogênio

Grupos aceptores de ligação hidrogênio

Saxitoxina* 287,28 6 10

Fisostigmina 261,32 1 5

Colchicina 385,41 1 6

Papaverina 339,39 5 0

Amilorida 229,63 4 3

Escopolamina 303,35 1 5

Praziquantel 312,41 0 4

Glicopiranosilamina 335,31 7 9

* Colocada na tabela somente para fins comparativos

Os parâmetros calculados através do estudo de modelagem foram o volume

molecular, a área e as distâncias entre os grupos aceptores/doadores de ligação de

idrogênio presentes nas extremidades da molécula. Os resultados obtidos estão na

Figura 9.

37

Figura 9. Compostos candidatos a molécula molde para a STX

As moléculas escolhidas através do estudo de modelagem molecular para a

síntese do MIP como molécula molde para análise de saxitoxina e seus análogos,

foram a colchicina e papaverina , dois alcaloides de origem natural e a amilorida,

um bloqueador de canal de sódio epitelial presente nos túbulos distais renais. Os 3

compostos foram escolhidos principalmente pelo volume molecular, posição dos

38

grupos aceptores e doadores de ligação de hidrogênio e estrutura em 3D

aparentemente semelhante à STX.

Não se obteve resultado satisfatório na síntese de MIPs com a colchicina e

papaverina. A polimerização não ocorreu, provavelmente devido a presença de

grupos metoxi (-OCH3) que funcionaram como inibidores da polimerização,

consumindo o iniciador peróxido de benzoíla, reagente que inicia a reação via

produção de radicais livres. Houve a formação de subprodutos, confirmado através

de cromatografia em camada fina.

A amilorida possui um grupo guanidina também presente na STX. Entretanto,

sugeriu-se que seria necessária uma modificação estrutural na posição 6 do anel

pirazínico ocupado pelo átomo de Cl, para aumentar o volume molecular. Através da

modelagem, foi possível visualizar que o grupo ideal a ser adicionado seria oriundo

de uma substituição nucleofílica do Cl por um derivado ciclohexil ou fenil com a

hidroxila (OH) em posição orto em relação ao grupo nucleófilo, que poderia ser um

grupo amino ou um sal sódico de enxofre (R-NaS), como pode ser visto na Figura

10.

Figura 10. Modificações na estrutura da amilorida sugeridas na modelagem molecular

Escolhemos para fazer a substituição nucleofílica do átomo de Cl da amilorida

o composto p-aminofenol. Contudo, a amilorida é comercializada na forma de sal de

cloridrato, o que impede a solubilidade do composto em solventes orgânicos. Para

solucionar esta questão, partiu-se para a tentativa de extração líquido-líquido do

cloridrato de amilorida para se obter a substância na forma de base livre,

aumentando sua solubilidade em solventes orgânicos. Isto facilitaria tanto a reação

39

de substituição nucleofílica quanto a de síntese do MIP. Entretanto, não obteve-se

sucesso na extração da amilorida como base livre.

Assim, tentou-se conduzir a reação de substituição nucleofílica do átomo de

Cl da amilorida pelo nucleófilo p-aminofenol com o cloridrato de amilorida, segundo

a literatura (TANDON; MAURYA, 2009), utilizando água como solvente e

temperatura da reação a 50ºC, porém sem sucesso. Outras tentativas utilizando

etanol, isopropanol e dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente foram feitas, mas

ocorreu a degradação do p-aminofenol. A reação à temperatura ambiente e sob

nitrogênio também não ocorreu.

Um tempo maior seria necessário para o desenvolvimento desta etapa de

síntese, que demonstrou ser mais complexa do que originalmente pensado. Então, a

alternativa foi trabalhar com o cloridrato de amilorida sem modificações estruturais.

Na ausência da saxitoxina, a solução encontrada foi utilizar o próprio fármaco para

os ensaios analíticos afim de comprovar a seletividade dos polímeros sintetizados.

Sendo assim, a síntese dos MIPs foi realizada utilizando o cloridrato de

amilorida como molécula molde e o mesmo analito foi utilizado para os ensaios de

adsorção e extração em fase sólida utilizando os polímeros sintetizados.

3.2.2 Propriedades físico-químicas do cloridrato de amilorida

O cloridrato de amilorida (AMI) é um sal obtido a partir de uma base

moderadamente forte, a amilorida (9, Figura 11). A amilorida possui nomenclatura

IUPAC 3,5-diamino-6-cloro-N-(diaminometileno)-2-pirazinocarboxamida, e consiste

em um anel pirazínico substituído por um grupo acilguanidina na posição 2, dois

grupos amino nas posições 3 e 5 e um átomo de Cl na posição 6. O sal

normalmente apresenta-se cristalino na forma de monocloridrato di-hidratado, de

coloração amarelo-esverdeada e inodoro. A fórmula molecular do composto é

C6H8ClN7O.HCl.2H2O e o peso molecular correspondente é 302,12 (BENOS, 1982;

THAKRAL; MADAN, 2008; MAZZO, 1986).

O grupo guanidínico possui importante papel na molécula de amilorida, pois é

neste grupo que ocorre a protonação, com ressonância da carga entre os

nitrogênios guanidínicos, fazendo com que a amilorida seja considerada uma base

fraca. Todos os hidrogênios da amilorida são intercambiáveis em solução aquosa

(BENOS, 1982).

40

Figura 11. Estrutura da amilorida (9)

A amilorida possui um valor de pKa em torno de 8,70 a 25°C, confirmado

tanto experimentalmente por titulacão aquosa quanto estimado através de cálculos

teóricos como a afinidade por prótons na fase gasosa, a entalpia de solução e

cálculos semiempíricos (BOCK; SCHLEGEL; SMITH, 1981; MAZZO, 1986).

Jozwiakowski e colaboradores (1993) relataram que o cloridrato de amilorida

pode cristalizar na forma de sal di-hidratado, disponível em duas formas polimórficas

A e B, sendo que estas podem ser desidratadas obtendo-se a forma cristalina

anidra. A forma anidra rapidamente se reidrata retornando ao polimorfo A di-

hidratado após exposição à umidade relativa do ambiente. Os polimorfos di-

hidratados A e B tem pontos de fusão, espectros de FTIR e solubilidades

semelhantes. Contudo, a técnica de difração do raio-X pode diferenciá-los e a

quantificação pode ser estimada em amostras com a mistura dos dois polimorfos,

sendo o polimorfo A mais fisicamente estável.

O ponto de fusão do cloridrato de amilorida (AMI) anidro é 293,5°C e da forma

di-hidratada é 288°C, com decomposição. A forma hidratada do sal de AMI pode ser

convertida na forma anidra pela secagem a 100°C a pressão reduzida. O cloridrato

de amilorida é praticamente insolúvel em acetona, clorofórmio, éter etílico e acetato

de etila, livremente solúvel em dimetilsulfóxido, ligeiramente solúvel em isopropanol,

etanol (1,96 mg mL-1) e água, além de moderadamente solúvel em metanol. A

limitada solubilidade de AMI em água é típica de uma base orgânica e aumenta com

a diminuição de pH. Enquanto em pH 4,8 a solubilidade é 5,2 mg mL-1, em pH 10,0

ela reduz para 0,3 mg mL-1 (MAZZO, 1986).

Um estudo de estabilidade de AMI em soluções aquosas foi realizado por Li,

Moore e Tattam (1999). A fotodegradação de AMI foi avaliada em solução aquosa

deaerada a 30 °C na faixa de pH entre 4,5 e 11 através de espectrofotometria e

CLAE em fase reversa. A forma neutra do fármaco presente na solução alcalina se

41

degrada aproximadamente 3 vezes mais rápido do que a forma catiônica. O

processo de fotorreação inicial envolve decloração de AMI e o mecanismo de

fotólise parece envolver a formação de um cátion radicalar que facilita a decloração.

Observou-se que a atividade de fotossensibilização de AMI predominantemente

ocorre na presença de substratos de oxigênio singlete e não por um mecanismo de

formação de radicais livres. No entanto, AMI é um fraco fotossensibilizador, tendo

atividade somente sob condições de radiação intensa, em relação a outros

diuréticos, tais como furosemida e hidroclorotiazida, sob as mesmas condições

experimentais.

O espectro de varredura no ultravioleta de AMI obtido em solução de ácido

clorídrico 0,1 N apresenta máximos de absorção em 212, 285 e 363 nm, sendo que

este último representa seu λmáx. A molécula emite fluorescência a 420 nm, o que

possibilita a sua determinação por técnicas que utilizam este tipo de detecção

(MAZZO, 1986; USP, 1989).

3.2.3 Métodos para determinação de cloridrato de amilorida

Diversos métodos têm sido relatados para determinação de AMI em fluidos

biológicos como urina e plasma e em formulações farmacêuticas, incluindo

espectrofotometria, CLAE, quimioluminescência, polarografia com pulso diferencial,

métodos potenciométricos, entre outros. Embora a determinação por alguns

métodos como CLAE seja altamente sensível, estes requerem a eliminação

preliminar de interferentes e pré-concentração do analito no caso de amostras

biológicas, por extração líquido-líquido, técnica que envolve a utilização de grandes

volumes de solventes orgânicos. Isto acarreta desvantagens como baixa

recuperação do analito, pois os procedimentos de extração se baseiam em reações

de equilíbrio, e aumento do tempo de análise (MIRMOMTAZ; ENSAFI;

SOLEIMANIAN-ZAD, 2009).

Em preparações farmacêuticas, as amostras contendo AMI geralmente não

necessitam de tratamento prévio, pois os excipientes não interferem nas análises

devido a serem insolúveis e assim podem ser eliminados por um processo de

filtração simples (ZECEVIC et al., 2000). No caso de matrizes complexas como

plasma e urina, utilizam-se técnicas preliminares de preparação das amostras para

eliminação de interferentes, como a extração em fase sólida e a extração líquido-

42

líquido previamente à análise por CLAE (FORREST et al., 1988; BI; COOPER;

CÔTÉ, 1992).

A quantificação de AMI por métodos espectrofotométricos são realizados

somente para formulações farmacêuticas, pois apresentam elevado limite de

quantificação e maior sensibilidade aos interferentes (TORAL et al., 2002; ABDEL-

HAY, 2008). Em um estudo de comparação entre os métodos espectrofotométricos

no UV e CLAE em fase reversa com detecção no UV, Kartal e Erk (1999)

observaram uma boa precisão, exatidão e recuperação para ambos os métodos.

Entretanto, o método cromatográfico é mais versátil e mais seletivo para a

determinação de AMI na presença de produtos de degradação e pode ser aplicado a

uma variedade de matrizes.

Halvatzis et al. (1994) relataram um método automatizado de determinação

de AMI por quimioluminescência baseado na oxidação com N-bromosuccinimida em

solução alcalina. O método foi capaz de analisar o composto em formulações

farmacêuticas em uma faixa de 0,5 a 15 µg mL-1 com limite de detecção de 0,16 µg

mL-1, erro relativo de 1,7% e com recuperação média de 95,5% entre as amostras

comerciais analisadas.

Um método simples e rápido para análise de AMI foi desenvolvido utilizando

um sistema de injeção de fluxo monocanal com transdução fluorimétrica, para

amostras de soro humano e formulações farmacêuticas. O AMI era retido

transitoriamente em uma coluna de troca catiônica de gel Sephadex SP-C25

colocada na área de detecção dentro da célula. A determinação de AMI foi realizada

sem nenhuma reação de derivatização, medindo diretamente a fluorescência

intrínseca do analito, com limite de detecção de 0,92 e 0,33 mg L-1 para volumes de

injeção de 100 e 600 µL, respectivamente. As recuperações de AMI em amostras de

soro fortificadas e em formulações foram de 96,3 a 105% e 98 a 100,6%,

respectivamente (DOMINGUEZ-VIDAL; ORTEGA-BARRALES; MOLINA-DIAZ,

2002).

Martín et al. (1999) utilizaram o método de polarografia de pulso diferencial

para a quantificação simultânea de AMI e HCTZ em formulações farmacêuticas. Os

resultados obtidos foram de acordo com o conteúdo declarado pelos fabricantes dos

comprimidos contendo AMI e HCTZ analisados, sendo estes comparados com a

quanficação por CLAE. Não houve diferença significativa entre os dois métodos

utilizados para quantificação e a diferença entre as duas marcas analisadas foi

43

menor do que 15%, aceito pela legislação. O desvio padrão relativo calculado foi de

0,5 a 3,4% (n=6) entre as amostras quantificadas em dias diferentes.

Ensafi e Allafchian (2008) desenvolveram um novo sensor potenciométrico a

base de membrana de Policloreto de vinila (PVC) para determinação seletiva de AMI

em comprimidos e urina. O método é baseado na formação de um par iônico entre a

amilorida e tetrafenilftalato de sódio como material eletroativo e dibutilftalato (DBP)

como íon exclusor. O eletrodo indicador (amilorida) foi montado com uma solução

interna de AMI e na ponta colocado uma membrana composta do par iônico AMI-

tetrafenilftalato de sódio além de DBP e PVC. Um eletrodo de calomelano foi usado

como referência. O sensor de membrana apresentou resposta satisfatória e rápida

para a amilorida em um intervalo de concentração de 1,0 × 10-2 a 1,0 × 10-6 mol L-1

com um limite de detecção de 9,9 × 10-7 mol L-1 e exibiu alta seletividade para

amilorida frente a um grande número de compostos relacionados. Os mesmos

autores também desenvolveram um outro eletrodo semelhante feito de membrana

polimérica, mas utilizando ds-DNA de esperma de salmão-amilorida como par iônico

e nitrofeniloctiléter como um íon exclusor para quantificação de amilorida em

formulações, plasma e urina (ALLAFCHIAN; ENSAFI, 2010).

Em outro método potenciométrico desenvolvido para quantificação de AMI em

comprimidos e urina, um eletrodo de grafite foi usado como suporte para imobilizar a

membrana de ds-DNA-amilorida. A técnica de voltametria por pulso diferencial foi

usada para determinar a mudança da intensidade do sinal de oxidação das bases

guanina e adenina antes e depois da interação com a amilorida. A diminuição na

intensidade do sinal se mostrou proporcional para uma faixa de concentração de

amilorida de 0,75 a 240 µM, com um limite de detecção de 0,5 µM, com resultados

satisfatórios (MIRMOMTAZ; ENSAFI; SOLEIMANIAN-ZAD, 2009).

A determinação simultânea de AMI e atenolol (ATE), propranolol (PRO) e

dipiridamol (DIP) por espectrometria de fluorescência foi desenvolvida por Pulgarín,

Molina e López (1998), em amostras farmacêuticas comerciais. Para aumentar a

seletividade do método um espectrômetro de fluorescência com ângulo variável

sincronizado foi utilizado, de modo que o espectro foi obtido pela varredura de

comprimentos de onda de excitação e emissão a diferentes velocidades, sendo a

diferença entre eles não constante. A combinação da espectrometria de varredura

sincronizada com técnicas derivativas aumentou a sensibilidade do método em

comparação ao espectro convencional, devido a amplitude do sinal ser inversamente

44

proporcional à largura da banda do espectro original. O método foi adequado para a

determinação dos analitos em uma faixa de concentração na ordem de ng mL-1, com

limites de detecção de 5,2, 1,9, 2,1 e 0,1 ng mL-1 para ATE, PRO, AMI e DIP,

respectivamente.

Um método para a estimativa simultânea de AMI e HCTZ em plasma humano

por CLAE-EM/EM em fase reversa foi validado utilizando triantereno e

hidroclorotiazida13C,d2 como padrão interno. Os analitos e padrões internos foram

extraídos do plasma através de extração em fase sólida simples. O limite de

quantificação do método foi de 0,1 e 5 ng mL-1 e a recuperação média foi de 41,1 e

81,5% para amilorida e hidroclorotiazida, respectivamente. O coeficiente de variação

do ensaio foi de menos de 11,2% e 5,2% e a precisão foi de 89,0 – 98,1 e 96,6 –

102,9% para AMI e HCTZ, respectivamente. Os autores concluíram que o método

pode ser aplicado a estudos farmacocinéticos envolvendo os dois fármacos

(JANGID; TALE; VAIDYA, 2011).

Um grupo de pesquisadores recentemente utilizou o método fluorimétrico para

determinação de AMI e furosemida (FUR) em formulações farmacêuticas

(PERALTA; FERNÁNDEZ; MASI, 2010) e em urina (PERALTA; FERNÁNDEZ;

MASI, 2011). Nos dois casos, as amostras foram tratadas em uma membrana de

nylon composta de poliamida de 0,45 µm antes da análise, devido a determinação

direta convencional promover a sobreposição do espectro de fluorescência dos dois

analitos e no caso da urina, também devido à fluorescência de alguns componentes

da matriz. A solução de AMI foi alcalinizada a pH 11 para possibilitar a retenção do

composto na membrana de poliamida (não polar), sendo que a FUR está

predominantemente na forma carregada em pH acima de 5 e não fica retida na

membrana, separando os dois diuréticos. A AMI foi determinada diretamente na

membrana frente a um branco de matriz, ou seja, a urina sem os diuréticos foi

filtrada na membrana e verificou-se que não havia fluorescência. A FUR foi

determinada na solução aquosa, após o pH ser ajustado para 2,7, onde a urina não

fluoresce. O limite de detecção para amostras de urina foi de 0,11 ng mL-1 para AMI

e de 0,35 ng mL-1 para FUR, mostrando a sensibilidade do método, que apresentou

uma recuperação variando de 91,5 a 109,5%.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 EQUIPAMENTOS

A síntese dos MIP e NIP foi conduzida no Laboratório de Química Medicinal

(LQMed) da Faculdade de Farmácia da UFF, sob orientação da profa. Estela Muri.

As moléculas molde e o peróxido de benzoíla usados para a síntese foram

pesados em balança analítica de precisão Bioprecisa JA3003N (Brasil) e o

aquecimento e agitação da reação foram realizados em agitador magnético com

aquecimento Ika RH Basic 2S1 (Alemanha). Os polímeros foram secos à

temperatura ambiente e o solvente residual foi evaporado com auxílio de uma

bomba de alto vácuo Edwards RV3 (Inglaterra) até peso constante.

A tamização dos polímeros, o ensaio de adsorção e a extração em fase sólida

(EFS) foram conduzidos no Laboratório de Toxicologia Analítica (ToxFree) da

Faculdade de Farmácia da UFF, sob orientação da profa. Eliani Spinelli.

Os polímeros foram tamizados em peneiras para análise granulométrica

Granutest (São Paulo, Brasil) de 25 a 62 µm. Foram desprezadas as partículas com

menos de 25 µm e com mais de 62 µm.

Os polímeros e o AMI foram cuidadosamente pesados em balança analítica

de precisão Shimadzu AUW220D (Japão) para a condução dos ensaios de adsorção

e para preparação dos cartuchos de EFS.

Os microtubos, da Eppendorf (Alemanha) utilizados nos ensaios de adsorção

dos polímeros foram colocados em agitação utilizando o homogeneizador de tubos

Phoenix AP 22 (São Paulo, Brasil).

Após o ensaio de adsorção, os microtubos foram centrifugados em uma

centrífuga para microtubos Minispin®, da Eppendorf (Alemanha).

46

Os reagentes para o preparo da solução tampão citrato-acetato pH 6,5 (0,12M

e 0,66 M) utilizada nos ensaios de adsorção foram pesados em balança Gehaka

BG400 (São Paulo, Brasil) e o ajuste do pH foi feito em medidor de pH Tekna T-

1000 (Brasil).

A água ultra-pura foi obtida através de um sistema de purificação de água

Simplicity UV, da Millipore (França).

As soluções de cloridrato de amilorida (AMI), molécula molde escolhida para

os ensaios de adsorção e para a EFS, foram preparadas em água ultra-pura,

solubilizando o sal (cloridrato) com auxílio de um banho ultrassônico, Unique

Ultracleaner 1600A (São Paulo, Brasil). As alíquotas das soluções utilizadas foram

pipetadas com o auxílio de micropipetas monocanal de volume variável P100,

P1000, P5000, Research Plus® da Eppendorf (Alemanha) e P200 da Labnet (EUA).

A EFS foi conduzida em uma câmara de vácuo Supelco VisiprepTM (EUA) com

capacidade para 12 cartuchos acoplado a uma fonte de vácuo. Os polímeros foram

empacotados em cartuchos de polipropileno vazios de 3 mL para EFS, Supelco

(EUA), entre dois “frits” (Supelco, EUA) de polipropileno com porosidade de 20 µm.

Os “frits” foram colocados no cartucho por um dispositivo de inserção de “frits”, da

Supelco (EUA). Os polímeros foram pesados diretamente nos cartuchos.

As leituras das absorbâncias das soluções de AMI obtidas nos ensaios de

adsorção e EFS foram realizadas em espectrofotômetro UV-Visível, Bel Photonics

Spectrophotometer SP 2000 UV (Itália).

Após a EFS, a evaporação do solvente extrator foi feita a 50ºC sob fluxo de

nitrogênio, em um termoreator para tubos (Dry Block), da Marconi (Brasil) provido de

linha de distribuição de nitrogênio.

Os polímeros foram visualizados em microscópio eletrônico de transmissão

FEI Morgagni 268D (EUA), gentilmente cedido pelo Laboratório de Microscopia do

prof. Venício Veiga no Instituto de Microbiologia da UFRJ.

As análises de caracterização dos polímeros por Espectrofotometria no

Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) foram realizadas no Instituto de

Química da UFF, utilizando o equipamento Varian 660-IR FT-IR Spectrometer

(Alemanha) com aplicação direta da amostra.

47

4.2 REAGENTES

Na síntese de MIP e NIP foram utilizados os monômetros ácido metacrílico

(MAA, 99%), dimetacrilato de etilenoglicol (EDMA, 98%) e trimetacrilato de

trimetilolpropano (TRIM, grau técnico) provenientes da Sigma Aldrich (Alemanha). O

peróxido de benzoíla P.S. utilizado foi o da Vetec (Brasil). Os monômeros foram

utilizados sem purificação prévia.

O cloridrato de amilorida (AMI) utilizado na síntese e demais ensaios foi

adquirido na DEG Importação de Produtos Químicos Ltda. (Brasil), com certificado

de análise do fabricante cumprindo as especificações das Farmacopéias Britânica e

Européia (Anexo 8.5).

Os solventes orgânicos usados foram tetrahidrofurano (grau espectroscópico

HPLC/UV), acetonitrila (grau espectroscópico HPLC/UV) e ácido acético glacial

ACS, todos obtidos da Tedia (EUA). O metanol (grau espectroscópico HPLC/UV),

ácido trifluoroacético P.S. e ácido clorídrico P.A. utilizados foram provenientes da

Vetec (Brasil).

Os reagentes usados para fazer a solução tampão citrato-acetato foram

hidróxido de sódio P.A. Vetec (Brasil), ácido cítrico anidro ACS Spectrum (EUA) e

acetato de sódio tri-hidratado USP Sigma Aldrich (Alemanha).

4.3 PROCEDIMENTOS

4.3.1 Síntese dos MIPs e NIPs em cloridrato de amilorida

Os reagentes e solventes foram adicionados nas quantidades listadas na

Tabela 2. Em um balão de fundo redondo bitubulado de 100 mL conectado a um

condensador de refluxo, foi colocado o solvente e, no caso dos MIPs, adicionou-se o

cloridrato de amilorida (AMI). Após a solubilização do composto, dissolveu-se o

ácido metacrílico (MAA) deixando em agitação por 10 min. Posteriormente foram

adicionados o agente de reticulação (EDMA ou TRIM) e o peróxido de benzoíla (PB)

72% (iniciador radicalar). Após a adição dos reagentes, o balão foi fechado com

septo de borracha, a atmosfera dentro do balão foi saturada com gás nitrogênio e a

solução foi borbulhada com o mesmo gás por 10 minutos através de uma cânula de

inox. O balão então foi colocado em banho de óleo, deixando a reação a 60°C por

48

24h. Os NIPs foram sintetizados com o mesmo procedimento, entretanto sem a

adição de AMI.

Tabela 2. Quantidades dos reagentes na síntese dos MIPs e NIPs de cloridrato de amilorida

MIP/NIPAMI

(mmol)*2

MAA

(mmol)

Agente de

Reticulação

(mmol)

PB*4

(mmol)Solvente

1* 0,25 1 1 (TRIM) 0,125 15 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

2 0,25 1 2 (TRIM) 0,125 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

3 0,25 1 3 (EDMA) 0,31 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

4 0,25 1 2 (TRIM) 0,125 20 mL THF:MeOH (4:1)

5 0,25 1 3 (EDMA) 0,31 20 mL THF:MeOH (4:1)

6 0,25 1 2 (TRIM) 0,125 30 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

7*3 0,25 1 5 (EDMA) 0,60 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

8 0,25 2 5 (EDMA) 0,60 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

9 0,25 1,5 5 (EDMA) 0,51 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

10 0,25 2 10 (EDMA) 0,97 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

11 0,25 1 2,5 (TRIM) 0,30 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

12 0,25 2 2,5 (TRIM) 0,34 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

13 0,25 2 1,25 (TRIM) 0,21 20 mL THF:MeOH:água (5:4:1)

* proporção usada segundo Kareuhanon et al. (2009).

*2 ausente em NIP

*3 proporção geral encontrada na literatura

*4 ajustado de acordo com a quantidade de monômero e observações das reações de polimerização

O final da reação foi verificado através da formação de um precipitado branco

leitoso, confirmando a precipitação do polímero. O polímero precipitado foi

transferido com auxílio de metanol para um cartucho de celulose para extrator

soxhlet de 33 x 80 mm, sendo este colocado em um conjunto extrator soxhlet de 250

mL completo (balão de fundo chato, extrator soxhlet e condensador de bolas). O

excesso de reagentes e molécula molde foi extraído por lavagem no extrator soxhlet

com metanol:ácido acético 9:1 (v/v) por algumas horas. O polímero então foi lavado

com metanol ainda no soxhlet para retirar o ácido e, após a lavagem, o cartucho foi

deixado para secagem em temperatura ambiente para eliminação do excesso de

solvente. O polímero foi então transferido para um balão de fundo redondo e

colocado em bomba de alto vácuo até peso constante.

49

Após secos, os polímeros foram macerados levemente em gral e pistilo para

dispersão dos grânulos. Os polímeros MIPs e NIPs preparados foram peneirados em

tamizes de 0,025 a 0,062 mm para a obtenção de partículas entre 25 e 60 µm para o

ensaio de adsorção e EFS.

Após tamizados, os polímeros foram caracterizados quimicamente através de

Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), de acordo

com o item 4.3.2 e morfologicamente por Microscopia Eletrônica de Transmissão

(MET), de acordo com o item 4.3.3 (somente para os polímeros MIP/NIP 12).

4.3.2 Caracterização química por Espectroscopia no Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR)

Os polímeros MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12, os monômeros MAA, EDMA e

TRIM, além do cloridrato de amilorida foram enviados para o laboratório de

Espectrofotometria em Infravermelho no Instituto de Química da UFF, Campus

Valonguinho. Os espectros foram feitos com aplicação direta da amostra no

equipamento.

4.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) dos polímeros MIP/NIP 12

Os polímeros foram suspensos em água ultra-pura na concentração de 1 mg

mL-1 e diluídos em água na concentração de 1:10 em microtubos. As amostras foram

levadas para o Laboratório de Microscopia do prof. Venício Veiga na UFRJ, onde

foram depositadas em um suporte de cobre para visualização direta das amostras

por MET.

4.3.4 Preparo da solução tampão citrato-acetato pH 6,5 para os ensaios de

adsorção e EFS

A solução tampão citrato-acetato pH 6,5 foi preparada pesando-se 23 g de

ácido cítrico anidro (0,12M), 45 g de acetato de sódio tri-hidratado (0,66 M) e 10 g de

hidróxido de sódio. Os sais foram dissolvidos em água ultra-pura, completando-se o

volume a 1000 mL em balão volumétrico. O pH foi ajustado a 6,5 com solução de

NaOH a 70% (p/V) em medidor de pH de bancada.

50

4.3.5 Preparo da solução estoque de AMI a 1 mg/mL

A solução estoque foi preparada pesando-se exatamente cerca de 10 mg de

AMI em balão volumétrico de 10 mL. O sal foi solubilizado em água ultra-pura com

auxílio de banho ultrassônico e a solução foi avolumada. A cada dia de experimento

foi preparada uma nova solução estoque e a partir desta foram retiradas alíquotas

para diluição e obtenção das demais concentrações utilizadas nos ensaios.

4.3.6 Espectro de varredura de AMI em HCl 0,1N e tampão citrato-acetato pH 6,5

O espectro de varredura da solução de AMI foi obtido no espectrofotômetro

UV-Visível na faixa de comprimento de onda entre 260 e 390 nm, utilizando solução

de AMI na concentração de 9 µg mL-1 diluída em tampão citrato-acetato. Os λmáx

foram comparados aos obtidos no espectro de varredura feito em HCl 0,1N na

mesma faixa de comprimento de onda e mesma concentração. O HCl 0,1N é o

solvente preconizado pela Farmacopéia americana USP XXII (1989) para análise de

cloridrato de amilorida.

4.3.7 Preparo da curva de calibração em solução tampão citrato-acetato pH 6,5

A curva de calibração para o ensaio de adsorção foi feita a partir da solução

estoque de AMI a 1 mg/mL em água ultra-pura. As diluições foram preparadas em

triplicata, avolumando-se com tampão citrato-acetato pH 6,5, de forma a obter a

curva em uma faixa de concentração de 0,1 a 20 µg/mL. As leituras das

absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm (λmáx).

4.3.8 Ensaio de adsorção variando a quantidade de polímero

Para a realização deste ensaio, foram escolhidos os polímeros MIPs/NIPs 10,

11 e 12 pela maior quantidade de material obtido. Pesou-se 7,5, 15 e 30 mg em

duplicata de cada MIP e NIP em microtubos de 2,0 mL. Adicionou-se 1,5 mL de

solução de cloridrato de amilorida em tampão citrato-acetato pH 6,5 a 9 µg mL-1 em

cada tubo, preparadas a partir da solução estoque a 1 mg/mL. Os tubos foram

colocados no agitador de tubos por inversão por 16 horas e centrifugados a 10000

51

rpm por 10 min. O sobrenadante foi recolhido e levado para leitura em

espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm. Solução-controle, sem polímero, foi submetida

às mesmas condições do ensaio.

4.3.9 Ensaio de adsorção de AMI em MIP/NIP 7, 8, 10 e 11 variando a

concentração de AMI

O ensaio de adsorção de cloridrato de amilorida nos polímeros em solução de

tampão citrato-acetato pH 6,5 foi conduzido seguindo a metodologia adaptada de

Kareuhanon et al. (2009) e Chen, Chen e Lin (2001).

Para a realização deste ensaio, foram escolhidos os polímeros MIPs/NIPs 7,

8, 10 e 11, . Pesou-se, em triplicata, 7,5 mg de cada MIP e NIP em microtubos para

centrífuga de 2,0 mL. Uma alíquota de 1,5 mL de solução de cloridrato de amilorida

em tampão citrato-acetato pH 6,5 nas concentrações de 3, 6, 9, 12 e 15 µg mL-1 foi

adicionada em cada tubo. As soluções foram diluídas e preparadas a partir da

solução estoque a 1 mg/mL. Os tubos foram colocados no agitador de tubos por

inversão por 16 horas e centrifugados a 10000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi

recolhido e levado para leitura em espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm. Soluções-

controle, sem polímero, em cada concentração foram submetidas às mesmas

condições do ensaio.

4.3.10 Ensaio de adsorção de AMI em MIP/NIP 10 e 12 variando a concentração de

AMI

Pesou-se 7,5 mg em duplicata de cada MIP e NIP em microtubos para

centrífuga de 2,0 mL. Adicionou-se 1,5 mL de soluções de cloridrato de amilorida em

tampão citrato-acetato pH 6,5 na faixa de concentração de 6 a 75 µg mL-1 para

MIP/NIP 10 e de 6 a 60 µg mL-1 para MIP/NIP 12 em cada tubo, preparadas a partir

da solução estoque a 1 mg/mL. Os tubos foram colocados no agitador de tubos por

inversão por 16 horas e centrifugados a 10000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi

recolhido e levado para leitura em espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm. Soluções-

controle, sem polímero, em cada concentração foram submetidas às mesmas

condições do ensaio.

52

4.3.11 Ensaio de adsorção de AMI nos polímeros em THF: MeOH: água (5:4:1)

Neste ensaio foram testados os polímeros MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12.

Pesou-se 7,5 mg em duplicata de cada MIP e NIP em microtubos de 2,0 mL.

Adicionou-se 1,5 mL de solução de cloridrato de amilorida em THF: MeOH: água

(5:4:1) a 9 µg mL-1 em cada tubo, preparadas a partir da solução estoque a 1 mg/mL.

Os tubos foram colocados no agitador de tubos por inversão por 16 horas e

centrifugados a 10000 rpm por 10 min. Uma alíquota de 1 mL do sobrenadante foi

recolhida em tubos de vidro e o solvente foi evaporado em um termoreator Dry Block

a 70°C sob nitrogênio. Os resíduos foram solubilizados em 1 mL de tampão citrato-

acetato e levados para leitura em espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm. Solução-

controle, sem polímero, foi submetida às mesmas condições do ensaio.

4.3.12 Confecção dos cartuchos para a EFS

O polímero escolhido para a confecção dos cartuchos de EFS foi MIP/NIP 12.

Em um cartucho de polipropileno vazio, com capacidade de 3 mL, foi colocado um

“frit” de 20 µm. Foram pesados 20 mg de MIP/NIP 12 dentro do cartucho e colocou-

se outro “frit” de modo a acondicionar os polímeros entre os “frits”. Os cartuchos

foram cobertos com papel alumínio e guardados à temperatura ambiente até o

momento dos ensaios de extração em fase sólida com impressão molecular

(MISPE).

4.3.13 Procedimento da técnica de MISPE com solução de AMI

Os cartuchos preparados foram colocados em uma câmara de vácuo com

entradas para os cartuchos de EFS, com capacidade para 12 cartuchos. Os

cartuchos foram condicionados aplicando-se 1 mL de metanol, seguido por 1 mL de

água e 1 mL de tampão citrato-acetato, segundo metodologia de Blomgren et al.

(2002).

O ensaio de recuperação do MISPE foi realizado em duplicata para MIP e

NIP. Cada cartucho, após condicionamento, foi carregado com 2 mL de solução de

cloridrato de amilorida a 10 µg mL-1 (20 µg) diluída em tampão citrato-acetato pH 6,5

a partir da solução estoque a 1 mg/mL, aplicando-se o vácuo mínimo necessário

53

para o gotejamento de 1 – 2 gotas por segundo. O eluato foi recolhido para leitura no

espectrofotômetro a fim de avaliar a retenção nessa velocidade de eluição, típica

das aplicações de EFS.

A seguir, em cada cartucho de MIP e NIP, foram aplicados 2 mL de cada

solvente ou mistura solvente testada quanto à capacidade de recuperar a amilorida

retida. Foram testados os seguintes solventes e misturas: metanol, metanol:ácido

trifluoroacético (TFA) a 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4% e 5% e metanol:ácido acético a 1%.

Esses solventes foram recolhidos em tubos de vidro e evaporados a 50°C sob

nitrogênio. Os resíduos foram diluídos em 2 mL de tampão citrato-acetato pH 6,5 e

levados para leitura em espectrofotômetro UV-Vis a 363 nm. Uma solução-controle

de amilorida a 10 µg mL-1 foi analisada no espectrofotômetro.

Para avaliação do efeito de um solvente aprótico na técnica de MISPE, foi

feito um teste com eluição em acetonitrila (ACN) e acetonitrila:ácido acético a 1% e

2%. Para isso, os cartuchos (duplicata para MIP e NIP) foram condicionados com 1

mL de metanol:TFA a 2%, 1 mL de água ultra-pura e 1 mL de acetonitrila. O

cartucho foi então carregado com 1 mL de solução de AMI a 20 µg mL-1 (20 µg)

preparada diluindo-se uma alíquota da solução estoque a 1 mg/mL em água ultra-

pura com ACN. A seguir foram aplicados 2 mL do solvente de eluição,

acetonitrila:ácido acético a 1%. Esses solventes foram recolhidos em tubos de vidro

e evaporados a 50°C sob nitrogênio. Os resíduos foram diluídos em 2 mL de tampão

citrato-acetato pH 6,5 e levados para leitura em espectrofotômetro, junto com a

solução-controle de amilorida a 20 µg mL-1.

Para cada ensaio de EFS foi utilizado um novo cartucho. Os cartuchos não

foram reutilizados após os ensaios, sendo descartados após os mesmos, conforme

recomendado por Blomgren et al. (2002).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 SÍNTESE DOS MIPs E NIPs

As sínteses dos MIPs e NIPs de cloridrato de amilorida (AMI) foram

conduzidas variando-se a proporção de reagentes (monômero funcional, agente de

reticulação e iniciador) e o volume e tipo de solvente, para ajuste das condições

ideais de polimerização. Estes ajustes foram importantes para a obtenção de

polímeros com características satisfatórias para a EFS. A quantidade de iniciador

radicalar, peróxido de benzoíla, também foi ajustado a cada reação de modo a obter

uma polimerização eficiente, observada pela formação do precipitado branco leitoso

característico do polímero.

Foram obtidos 25 polímeros, sendo 13 MIPs (de 1 a 13) e 12 NIPs (de 2 a

13). Os primeiros polímeros obtidos (MIPs/NIPs 1 a 6) foram considerados

polímeros teste para ajuste da síntese, não sendo utilizados nos testes de adsorção

e EFS. Os MIPs e NIPs numerados de 1 a 3 e de 6 a 13 foram sintetizados em

THF:MeOH:água (5:4:1), enquanto os MIPs e NIPs 4 e 5 o foram em THF:MeOH

(4:1). A mistura de solventes THF:MeOH (4:1) também foi testada para avaliar qual

o efeito da remoção da água na síntese dos polímeros. O MIP 1 e os MIPs/NIPs 2,

6, 11, 12 e 13 contém TRIM como agente de reticulação e os MIPs/NIPs 3, 7, 8, 9 e

10 contém EDMA. Os rendimentos das reações de síntese dos polímeros foram

calculados com base na massa inicial de monômeros e final de polímero obtida, de

acordo com a Tabela 3. O cálculo do rendimento foi feito antes da tamização dos

polímeros. Para polímeros de adição, assumindo-se conversão total, o peso de

polímero formado é igual ao peso de monômero adicionado (CANEVAROLO Jr.,

2006).

55

Tabela 3. Rendimentos das reações de síntese dos MIPs e NIPs

MIP/NIP Proporção de

reagentes*

Volume de

Solvente*3

Massa inicial de

monômeros (g)

Massa final de

polímero (g)

Rendimento

(%)

MIP 1 1:4:4 (TRIM) 15 mL 15 mL (a) 0,427 0,081 19

MIP 2 1:4:8 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,765 0,874 114

NIP 2 0:4:8 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,765 1,009 131

MIP 3 1:4:12 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 0,854 0,871 102

NIP 3 0:4:12 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 0,854 1,173 137

MIP 4 1:4:8 (TRIM) 20 mL 20 mL (b) 1,532 gelificou -

NIP 4 0:4:8 (TRIM) 20 mL 20 mL (b) 1,532 gelificou -

MIP 5 1:4:12 (EDMA) 20 mL 20 mL (b) 1,708 gelificou -

NIP 5 1:4:12 (EDMA) 20 mL 20 mL (b) 1,708 gelificou -

MIP 6 1:4:8 (TRIM) 30 mL 20 mL (a) 1,532 1,662 108

NIP 6 0:4:8 (TRIM) 30 mL 30 mL (a) 1,532 1,501 98

MIP 7 1:4:20 (EDMA) 20 mL 30 mL (a) 1,349 1,258 93

NIP 7 0:4:20 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 1,349 1,711 127

MIP 8 1:8:20 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 1,436 0,845*2 59*2

NIP 8 0:8:20 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 1,436 1,901 132

MIP 9 1:6:20 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 1,390 1,121 81

NIP 9 0:6:20 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 1,390 1,825 131

MIP 10 1:8:40 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 2,700 3,357 124

NIP 10 0:8:40 (EDMA) 20 mL 20 mL (a) 2,700 3,346 124

MIP 11 1:4:10 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,935 0,970 104

NIP 11 0:4:10 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,935 0,900 96

MIP 12 1:8:10 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 1,023 1,199 117

NIP 12 0:8:10 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 1,023 1,317 129

MIP 13 1:8:5 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,599 0,672 112

NIP 13 0:8:5 (TRIM) 20 mL 20 mL (a) 0,599 0,681 114

* molécula molde: monômero funcional: agente de reticulação (TRIM ou EDMA)

*2 Um pouco de polímero foi perdido no manuseio antes da pesagem

*3 (a) THF:MeOH:água (5:4:1) (b) THF:MeOH (4:1)

O MIP 1 (1:4:4) foi sintetizado segundo as proporções e condições descritas

em Kareuhanon et al. (2009), entretanto obteve-se baixo rendimento (19%),

alterando-se a proporção para (1:4:8), dando origem a MIP/NIP 2, com rendimento

satisfatório. Os MIP/NIP 3 foram sintetizados com EDMA no lugar de TRIM e

proporção de (1:4:12), também com elevados rendimentos. Os rendimentos acima

de 100% podem ser devidos a presença de moléculas de água aderidas ao polímero

e ainda pelas altas quantidades de agente de reticulação utilizada na síntese.

56

Os aspectos dos polímeros obtidos estão descritos na Tabela 4. A troca pela

mistura de solventes para THF:MeOH (4:1) foi com intuito de remover a água do

sistema, sendo obtidos os polímeros MIP/NIP 4 e 5. Os polímeros obtidos não

apresentaram aspecto satisfatório para aplicação em EFS, pois formou-se um

polímero em estado de gel. O processo de gelificação do polímero provavelmente foi

devido à solubilização do polímero nessa mistura de solventes. O polímero sólido

em contato com o solvente tende a inchar através da difusão das moléculas do

solvente para dentro da massa polimérica, formando um gel inchado

(CANEVAROLO Jr., 2006). Após o processo de secagem, estes polímeros

resultaram em partículas muito heterogêneas. Nos polímeros com EDMA (MIP/NIP

5), o processo de gelificação foi mais expressivo, devido à maior massa de

monômeros na reação e o polímero seco apresentou aspecto mais endurecido e de

aparência acrílica. A mistura de solventes então não foi mais utilizada ao longo do

estudo, e portanto o rendimento desses polímeros não consta na Tabela 3.

Tabela 4. Aspecto dos polímeros obtidos

MIP/NIPProporção

AMI*:MAA:ALCSolvente*3 Aspecto do polímero

MIP NIP

1* 1:4:4 (TRIM) 15 mL (a) Baixo rendimento -

2 1:4:8 (TRIM) 20 mL (a) Bom rendimento Bom rendimento

3 1:4:12 (EDMA) 20 mL (a) Bom rendimento Bom rendimento

4 1:4:8 (TRIM) 20 mL (b) gelificação gelificação

5 1:4:12 (EDMA) 20 mL (b) gelificação gelificação

6 1:4:8 (TRIM) 30 mL (a) Partículas < 25 µm Partículas < 25 µm

7 1:4:20 (EDMA) 20 mL (a) Homogêneas (32 – 62 µm) Homogêneas (32 – 62 µm)

8 1:8:20 (EDMA) 20 mL (a) Homogêneas (32 – 62 µm) Homogêneas (32 – 62 µm)

9 1:6:20 (EDMA) 20 mL (a) Heterogêneas Heterogêneas

10 1:8:40 (EDMA) 20 mL (a) Polímero rígido Polímero rígido

11 1:4:10 (TRIM) 20 mL (a) Homogêneas (25 – 62 µm) Homogêneas (25 – 62 µm)

12 1:8:10 (TRIM) 20 mL (a) Homogêneas (25 – 62 µm) Homogêneas (25 – 62 µm)

13 1:8:5 (TRIM) 20 mL (a) Heterogêneas Heterogêneas

* proporção usada segundo Kareuhanon et al. (2009)

*2 ausente em NIP

*3 (a) THF:MeOH:água (5:4:1) (b) THF:MeOH (4:1)

57

Para avaliarmos a possibilidade de produzir uma quantidade maior de

polímeros a cada síntese, MIP/NIP 6 foi sintetizado, onde todos os reagentes foram

dobrados, mantendo-se a proporção (1:4:8) usada em MIP/NIP 2. No entanto, o

volume do solvente foi aumentado para 30 mL, a fim de se verificar este efeito no

polímero final. Observou-se na tamização que o tamanho das partículas no polímero

6 foi menor que 25 µm, como melhor explicado mais adiante, não sendo adequado

para EFS, então vimos que o volume ideal era 20 mL.

Com o volume de solvente ajustado para 20 mL e quantidade fixa de 0,25

mmol de AMI, deu-se início a bateria de síntese dos polímeros numerados de 7 a 13

para avaliar outras modificações, e observar como elas afetariam o rendimento e as

características dos polímeros. Em geral, a proporção de reagentes descrita na

literatura para MIPs sintetizados em EDMA foi de (1:4:20), de acordo com Tamayo et

al. (2007), sendo a proporção usada para MIP/NIP 7. Os polímeros 8 e 9 variaram

somente na proporção de MAA, enquanto que o polímero 10 variou na proporção de

EDMA, comparando com 7. Em relação aos polímeros sintetizados com TRIM 11, 12

e 13, foi usada uma quantidade menor deste em relação ao EDMA, devido a sua

maior capacidade de reticulação. Os polímeros foram sintetizados tendo como base

a proporção usada para o polímero 2 (1:4:8), aumentando um pouco a quantidade

de TRIM chegando a proporção de (1:4:10) para o polímero 11. A partir daí, variou-

se a quantidade de MAA em 12 (1:8:10) e de TRIM em 13 (1:8:5).

Em todas as proporções testadas nos polímeros de 7 a 13 houve

polimerização com bons rendimentos. Os polímeros 9 (1:6:20 EDMA) e 13 (1:8:5

TRIM) apresentaram partículas com aspecto muito heterogêneo, não sendo

adequados para a aplicação como adsorventes em EFS. Os demais polímeros (7, 8,

10, 11 e 12) apresentaram partículas homogêneas para aplicação no cartucho de

EFS, além de bom rendimento. O polímero 10 apresentou maior rigidez,

necessitando de trituração, pois o volume de solvente foi baixo em relação à elevada

quantidade de monômeros (1:8:40), assemelhando-se ao processo de polimerização

em massa, o que não era o proposto para o nosso estudo (precipitação). Mesmo

assim, o polímero foi utilizado para os testes de adsorção seguintes. Os polímeros

sintetizados em EDMA 7 e 8 apresentaram partículas com grumos de aspecto mais

rígido do que os polímeros sintetizados com TRIM, mas não precisaram ser

triturados. As partículas de polímeros sintetizados em TRIM 11 e 12 apresentaram

58

grumos mais soltos e facilmente pulverizáveis, não havendo a necessidade de

trituração e também foram somente tamizados.

A tamização dos polímeros foi necessária para uniformizar as partículas e

avaliar seu tamanho para a aplicação na EFS. O tamanho ideal para EFS situa-se

entre 30 - 60 µm. Partículas menores aumentam a resistência do sistema à

passagem do solvente e exigem a aplicação de muita pressão, como sabemos que

ocorre na cromatografia em fase líquida, onde a fase sólida apresenta partículas de

5 µm. Como a porosidade dos “frits” utilizados nos cartuchos de EFS é de 20 µm, os

polímeros foram peneirados em tamizes de 0,025 a 0,062 mm excluindo-se as

partículas menores ou maiores. O que observou-se visualmente na tamização foi

que as partículas dos polímeros feitos com TRIM apresentaram menor tamanho que

as partículas dos polímeros feitos com EDMA, devido a muitas partículas terem

passado na peneira de 0,032 mm. Isto pode ser devido à menor quantidade deste

agente de reticulação (de 12 a 40 mmol), em comparação ao TRIM (de 4 a 10 mmol)

nos polímeros sintetizados.

Em MIP/NIP 6, onde alterou-se somente o volume de solvente em relação a

MIP/NIP 2 (de 20 para 30 mL), as partículas apresentaram tamanho menor que 25

µm, sendo este inadequado para a aplicação do polímero em EFS. O que pode

explicar este efeito é que um maior volume de solvente reduziu o tamanho da

partícula de polímero formada, pois há maior dificuldade de encontro dos

monômeros com a cadeia polimérica em crescimento. O tamanho de partícula

encontrado na literatura (0,3 a 10 µm) para a técnica de polimerização por

precipitação também utilizada em nosso estudo, pode ser devida a este efeito do

volume do solvente (PÉREZ-MORAL; MAYES, 2004). Manipulando então a

quantidade de solvente, obtivemos partículas maiores para a aplicação dos

polímeros em EFS, sem a necessidade de trituração do polímero final.

A técnica mais utilizada na literatura para síntese de MIPs consiste na

polimerização em massa, principalmente quando aplicada à EFS. No entanto,

existem abordagens que utilizam a técnica por precipitação para aplicação dos

polímeros em EFS (KAREUHANON et al., 2009; ZHANG et al., 2006; CACHO et al.,

2003). A técnica por precipitação foi usada neste trabalho visando a obtenção de

partículas de tamanho mais uniforme, com maior rendimento de sítios de

reconhecimento e assim polímeros com maior capacidade adsortiva, pois a etapa de

trituração é abolida. Mohajeri e colaboradores (2011) observaram que a

59

polimerização por precipitação possibilitou maior reconhecimento e adsorção de

clozapina do que a técnica de polimerização em massa.

O EDMA é o agente de reticulação mais utilizado para a síntese de MIPs,

contudo o uso de TRIM também tem sido investigado, e resultados semelhantes ou

até melhores tem sido obtidos comparados a MIPs sintetizados com EDMA. O TRIM

pode conferir ao MIP formado maior capacidade de adsorção e maior seletividade ao

polímero formado (TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a). Neste trabalho, foi

feita a síntese de polímeros tanto com EDMA quanto com TRIM para melhor

avaliarmos as características do polímero final quanto à adsorção e aplicabilidade

para EFS.

O MAA foi escolhido para ser o monômero funcional para a síntese dos MIPs

de cloridrato de amilorida (AMI), porque possui grupos aceptores (a carbonila do

grupo carboxila, COOH) e doadores (hidroxila) de ligação de hidrogênio capazes de

interagir com a molécula molde, que possui também grupos aceptores (carbonila do

grupo acilguanidina) e doadores (grupos amino) de ligação de hidrogênio (TARLEY;

SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a). Além disso, possui a capacidade de fazer

ligações de natureza iônica devido à presença de grupos ionizáveis (COOH), pois é

um ácido fraco (pKa = 4,7), possibilitando a interação com a AMI que se apresenta

na forma de cátion. A Figura 12 ilustra a interação iônica entre AMI e MAA em uma

síntese de MIP com EDMA ou TRIM como agente de reticulação.

A mistura de solventes de elevada polaridade THF:MeOH:H2O (5:4:1), permite

a síntese dos MIPs para moléculas polares, como descrito por Kareuhanon et al.

(2009). Alguns autores demonstraram o uso de outros solventes polares, como a

acetonitrila, na síntese de MIP por precipitação, a fim de conferir ao polímero maior

capacidade de reconhecimento pela molécula molde, quando aplicados para análise

em sistemas hidrofílicos (YE; CORMACK; MOSBACH, 1999; WANG et al., 2003).

Como o cloridrato de amilorida não foi solúvel em acetonitrila e na mistura

THF:MeOH:H2O (5:4:1) apresentou boa solubilidade, esta foi empregada no

presente estudo.

60

Figura 12. Esquema da síntese de MIP de AMI com EDMA e MAA

Adaptado de BENOS, 1982 e BALAMURUGAN, K.;

PRAKASAM, T.; GOKULAKRISHNAN, 2012

5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS POLÍMEROS OBTIDOS

5.2.1 Caracterização química por Espectroscopia no Infravermelho com

Transformada de Fourier (FTIR)

Os espectros de todos os monômeros utilizados na síntese (MAA, TRIM e

EDMA) constam nos Anexos 8.1. Os monômeros ou agentes de reticulação EDMA

e TRIM possuem os mesmos grupamentos químicos e assim, as mesmas bandas

características de monômeros acrílicos, derivados esterificados do ácido acrílico. O

MAA é um ácido também derivado do ácido acrílico. As bandas características de

EDMA e TRIM (ésteres) que podem ser visualizadas com maior evidência estão na

região de 1700 cm-1, banda correspondente ao estiramento de C=O do grupo éster e

a 1150 cm-1, banda correspondente a deformação axial de C-O de éster. Para o

monômero MAA (ácido carboxílico), observa-se uma banda característica de

deformação angular de O-H de ácido carboxílico a 940 cm -1. Também pode ser

observada para o MAA, a banda na região de 1700 cm-1, correspondente ao

61

estiramento de C=O referente a carboxila (COOH), além da banda característica de

deformação axial de C-O de ácido carboxílico de 1200 a 1300 cm-1. Ainda em MAA,

pode-se observar a presença de uma banda larga na região de 2900 cm-1,

característica de deformação axial de O-H de ácido carboxílico, não muito intensa

devido a formação de ligações de hidrogênio intermoleculares. Para o EDMA e

TRIM, nesta mesma região, podem ser vistas bandas de deformação axial de C-H.

Pode-se também observar um sinal em 1670 – 1640 cm-1 proveniente do

estiramento de grupos vinila C=C, presentes em todos os monômeros.

Os espectros das amostras de polímeros MIP/NIP 7, 8, 10, 11 e 12

sintetizados constam no Anexos 8.2.

Nas Figuras 13 (MIP/NIP 7) e 14 (MIP/NIP 11) podemos comparar os

espectros de FTIR de MIP e NIP com os dois agentes de reticulação utilizados no

estudo, sendo o 7 com EDMA e o 11 com o TRIM. Os espectros de FTIR dos

polímeros MIP e NIP em TRIM e EDMA são praticamente idênticos, pois possuem

os mesmos grupamentos químicos. Como a metodologia de síntese de MIP e NIP é

a mesma, os polímeros finais obtidos são os mesmos, exceto o MIP que é

sintetizado na presença de AMI, sendo esta eliminada pela lavagem do polímero.

Assim, a semelhança dos espectros de NIP e MIP demonstra que o fármaco foi

realmente eliminado na fase de lavagem de MIP.

600110016002100260031003600

95,0

95,5

96,0

96,5

97,0

97,5

98,0

98,5

mip7

nip7

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itânc

ia (

T%

)

Figura 13. Espectros de FTIR de MIP e NIP 7 (EDMA)

62

600110016002100260031003600

88

90

92

94

96

98

MIP 11

NIP 11

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itânc

ia (

%)

Figura 14. Espectros de FTIR de MIP e NIP 11 (TRIM)

As bandas características dos monômeros utilizados na síntese e que podem

ser visualizadas nos polímeros MIP e NIP são as de EDMA, TRIM e MAA na região

de 1700 cm-1, correspondente ao estiramento de C=O do grupo éster e carboxila do

ácido, de 1150 cm-1 correspondente a deformação axial de C-O de éster e de 1200 a

1300 cm-1 característica de deformação axial de C-O de ácido carboxílico.

Pode-se também observar a ausência do sinal em 1670 – 1640 cm-1

proveniente do estiramento de grupos vinila dos monômeros, que desaparecem nos

polímeros devido a quebra das ligações C=C no processo de polimerização, dando

origem à ligações simples.

Entretanto, não puderam ser observadas com muita evidência bandas na

região de 2900 cm-1 características de estiramento de O-H de ácido carboxílico e C-

H em nenhum dos polímeros sintetizados, predominando assim bandas

características do grupo éster presentes em EDMA e TRIM. Isto pode ser devido a

formação de ligações de hidrogênio intermoleculares que ocorrem entre as cadeias

de polímeros, diminuindo a intensidade das bandas de estiramento de O-H. Além

disso, os monômeros de reticulação EDMA e TRIM estão em excesso em relação ao

monômero funcional MAA, predominando assim as bandas de características de

ésteres.

63

A formação de polímeros porosos altamente reticulados não é uma ciência

inteiramente preditiva e os materiais resultantes são difíceis de caracterizar

completamente, mesmo por ressonância magnética nuclear no estado sólido (RMN)

e espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)

(WHITCOMBE; VULFSON, 2001), assim como através de técnicas de análise

térmica como calorimetria diferencial de varredura (ESFANDYARI-MANESH et al.,

2011).

Não foram observadas bandas características de AMI nos polímeros

sintetizados, principalmente na região de 3250 e 3150 cm-1, como pode ser visto na

Figura 15, correspondente ao estiramento de N-H presente no analito (MAZZO,

1986). Isto confirma a eficiência na lavagem de MIP pela extração no Soxhlet,

eliminando AMI do polímero final.

600110016002100260031003600

80

85

90

95

100

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itânc

ia (

%)

Figura 15. Espectro de FTIR de AMI

5.2.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão de MIP/NIP 12

As imagens obtidas por MET mostram que os polímeros se apresentam na

forma de aglomerados de partículas (Figura 16), similar ao encontrado por alguns

autores (KAREUHANON, et al., 2009; ZHANG et al., 2006). Os polímeros MIP e NIP

possuem morfologia e características de superfície semelhantes sendo muito difícil

64

diferenciá-los, mesmo através por técnicas de porosimetria, que avaliam o tamanho

dos poros formados no polímero, e de determinação da área de superfície (YE;

CORMACK; MOSBACH, 1999).

Figura 16. Imagens de MET dos polímeros NIP (esq.) e MIP (dir.)

Na teoria, a presença da molécula molde, seja qualquer composto, poderia

promover o aumento do tamanho dos poros e da área de superfície dos polímeros,

promovendo diferenças em relação ao polímero não impresso. Diversos trabalhos

descritos na literatura (KAREUHANON, et al., 2009; ZHANG et al., 2006; YE;

CORMACK; MOSBACH, 1999) avaliam estes parâmetros tanto em MIP como em

NIP, mas os autores não chegam a um consenso sobre qual o efeito do analito na

morfologia do polímero impresso em relação ao não impresso.

5.3 ENSAIOS DE ADSORÇÃO

5.3.1 Ensaio de adsorção de cloridrato de amilorida em solução tampão pH 6,5

Os espectros de varredura de cloridrato de amilorida podem ser vistos na

Figura 17. Eles foram obtidos no espectrofotômetro UV-Vis em tampão citrato-

acetato pH 6,5 e HCl 0,1N na faixa de comprimento de onda entre 260 e 390 nm,

utilizando solução de AMI a 9 µg mL-1.

65

260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 4000

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Tampão acetato/citrato

HCl 0,1 N

Comprimento de onda (nm)

Abs

Figura 17. Espectro de varredura de cloridrato de amilorida

Os λmáx obtidos em tampão citrato-acetato foram em 285 e 363 nm e idênticos

aos do espectro de varredura feito em HCl 0,1N, solvente preconizado pela

Farmacopéia americana USP XXII (1989) para análise de cloridrato de amilorida.

Sendo assim, as leituras das soluções de AMI em tampão citrato-acetato foram

realizadas a 363 nm.

Para a dosagem por espectrofotometria, a curva de calibração do cloridrato

de amilorida em tampão citrato-acetato pH 6,5 (Figura 18) foi construída na faixa de

concentração de de 0,1 a 20 µg mL-1.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

f(x) = 0,063x + 0,018R² = 0,995

Concentração (µg/mL)

Ab

s

Figura 18. Curva de calibração AMI em tampão citrato-acetato pH 6,5

66

Os resultados das absorbâncias obtidas de acordo com as concentrações

para a plotagem da curva estão tabelados no Anexo 8.3, item 8.3.1. A curva

apresentou excelente linearidade (R=0,995), como pode ser observado pelo cálculo

da equação da reta presente no gráfico. Os cálculos para o ensaio de adsorção em

tampão foram feitos determinando a concentração livre de AMI no sobrenadante de

acordo com a curva de calibração.

Para determinar a quantidade ideal de polímero a ser utilizada nos ensaios de

adsorção, foram feitos testes variando a quantidade de polímero, na concentração a

9 µg mL-1, em duplicata. Os polímeros testados nesta primeira fase foram MIPs/NIPs

10, 11 e 12, devido a serem os polímeros obtidos com maior rendimento. A

concentração de AMI ligada (adsorvida) no polímero foi calculada subtraindo-se a

concentração inicial pela concentração final de AMI. A partir da concentração livre,

calculou-se a massa de AMI em µg e plotou-se o gráfico de massa de AMI em µg

por mg de polímero. Os resultados das absorbâncias obtidas para os polímeros e os

cálculos da massa de AMI adsorvida em µg constam no Anexo 8.3, item 8.3.2.

Como pode ser observado na Figura 19, a massa de polímero não influenciou

significativamente na massa de AMI adsorvida, por isso se adotou a massa de 7,5

mg para os ensaios de adsorção. Os polímeros MIP/NIP 12 adsorveram maior

massa de AMI do que 10 e 11, além de apresentar resultados mais homogêneos na

adsorção.

7,5 15 300

5

10

15

NIP 10

MIP 10

Massa de po límero (mg)

AM

I a

dso

rvid

a (

µg

)

7,5 15 300

5

10

15

NIP 11

MIP 11

Massa de po límero (mg)

AM

I a

dso

rvid

a (

µg

)

7,5 15 300

5

10

15

NIP 12

MIP 12

Massa de po límero (mg)

AM

I a

dso

rvid

a (

µg

)

Figura 19. Gráficos de adsorção de acordo com a massa de polímero

67

Os polímeros selecionados para os ensaios de adsorção foram os polímeros

MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12, devido a estes apresentarem características mais

satisfatórias para o emprego como adsorventes em EFS.

Definida a quantidade de polímero (7,5 mg), a avaliação da adsorção foi feita

em triplicata na faixa de concentração de AMI de 3 a 15 µg mL -1, segundo a curva de

calibração feita para cloridrato de amilorida em tampão citrato-acetato. A partir da

concentração livre calculada pela curva de calibração, calculou-se a massa de AMI

adsorvida (µg) e plotou-se o gráfico da curva de adsorção Concentração de AMI (µg

mL-1) X Q, onde Q é a quantidade de AMI adsorvida em µg por mg de polímero. Os

resultados das absorbâncias obtidas nos ensaios de adsorção para os polímeros

variando a concentração e os cálculos de Q constam no Anexo 8.3, item 8.3.3.

As curvas de adsorção para os polímeros MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12 na

faixa de concentração de 3 a 15 µg mL-1 são apresentadas na Figura 20. Os valores

de Q máximos (Qmax) obtidos para os polímeros, respectivamente, foram para

MIP/NIP 7, 2,20 e 2,16 µg mg-1; MIP/NIP 8, 2,16 e 2,08 µg mg-1; MIP/NIP 10, 2,37 e

1,90 µg mg-1; MIP/NIP 11, 2,39 e 2,48 µg mg-1 e MIP/NIP 12, 2,52 e 2,77 µg mg-1. Os

polímeros que apresentaram maior capacidade adsortiva para MIP foram os

MIP/NIP 10 (1:8:40 EDMA), 11 (1:4:10 TRIM) e 12 (1:8:10 TRIM), sendo o último

com maior valor de Q. Os dados para MIP/NIP 12 a 3 µg mL-1 não foram realizados e

por isso não constam na curva de adsorção para estes polímeros.

Os resultados dos ensaios de adsorção dos polímeros MIP/NIP 7, 8, 10 e 11

foram submetidos a cálculos estatísticos para avaliação da diferença entre as

médias de Q entre MIP e NIP nas concentrações de 6 a 15 µg mL -1, sendo que para

3 µg mL-1, o cálculo não foi feito devido a grande variabilidade de resultados nesta

concentração. Os cálculos para MIP/NIP 12 não foram feitos pois estes se

apresentavam em duplicata. A princípio foi aplicado o teste F para verificar se as

variâncias entre as amostras de MIP e NIP eram diferentes (resultados não

mostrados). Observou-se que as amostras não eram significativamente diferentes,

para a maioria das concentrações. O teste t de Student foi então aplicado para

comparação entre as médias de Q em MIP e NIP para amostras independentes e

com variâncias iguais, no modo bicaudal ao nível de significância de 5% (α).

As tabelas com os resultados do teste t estatístico aplicado e os respectivos

p-value de MIP e NIP para cada concentração constam no Anexo 8.3, item 8.3.4.

68

3 6 9 12 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

NIP 7

MIP 7

Concentração µg/mL

Q (

µg

/mg

)

3 6 9 12 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

NIP 8

MIP 8

Concentração µg/mL

Q (

µg

/mg

)

3 6 9 12 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

NIP 10

MIP 10

Concentração (µg/mL)

Q (

µg

/mg

)

3 6 9 12 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

NIP 11

MIP 11

Concentração (µg/mL)

Q (

µg

/mg

)

6 9 12 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

NIP 12 MIP 12

Concentração (µg/mL)

Q (

µg

/mg

)

Figura 20. Curvas de adsorção de MIPs/NIPs 7, 8, 10, 11 e 12

A hipótese nula (H0) foi aceita em todos os casos, ou seja, as médias de MIP

e NIP são iguais, pois os p-value calculados foram menores que α (0,05) e os

valores de t observados (calculados) foram menores que o tabelado (t=2,776).

Conclui-se assim que os polímeros MIP não apresentaram diferenças significativas

de adsorção comparados aos seus NIP correspondentes na faixa de concentração

de 6 a 15 µg mL-1.

O ensaio de adsorção de MIP/NIP 10 e MIP/NIP 12 foi conduzido de forma a

se avaliar o grau de saturação dos polímeros, ou seja, o máximo de AMI que os

69

polímeros seriam capazes de adsorver. Para isso, os valores de Q foram calculados

para uma faixa de concentração mais ampla que a dos polímeros anteriores,

variando de 6 a 75 µg mL-1 para MIP/NIP 10 e de 6 a 60 µg mL-1 para MIP/NIP 12.

Nos gráficos de adsorção apresentados na Figura 21, pode-se observar os valores

para MIP/NIP 10, onde o Qmax obtido foi de 11,35 (NIP) e 11,45 µg mg-1 (MIP) na

concentração de 75 µg mL-1. Para MIP/NIP 12, o Qmax obtido foi de 10,63 e 10,45 µg

mg-1 na concentração de 60 µg mL-1.

Figura 21. Curvas de adsorção de MIP/NIP 10 e 12 de acordo com a concentração

Observou-se nesses polímeros, que Q aumenta proporcionalmente com o

aumento da concentração, não alcançando a saturação, entretanto também não se

observou diferença entre os MIPs e seus respectivos NIPs. Acima das

concentrações testadas, o cloridrato de amilorida não era completamente

solubilizado, inviabilizando o ensaio em concentrações superiores a 75 µg mL-1.

As taxas médias de adsorção (%) foram calculadas pela razão entre a

quantidade adsorvida e a quantidade inicial de AMI. Os valores encontrados estão

na Tabela 5. A ordem crescente de capacidade média de adsorção foi MIP/NIP 10 <

11 < 8 < 7 < 12. Entre os polímeros com maior capacidade de adsorção, as

proporções usadas na síntese de MIP/NIP 7 (1:4:20 EDMA) foram as ideais para o

agente de reticulação EDMA, confirmando a descrita pela literatura. Quanto ao

MIP/NIP 12 (1:8:10 TRIM), o aumento na capacidade adsortiva pode ter sido devida

não somente à proporção de reagentes, maior do que nos dois estudos localizados

durante a revisão bibliográfica, mas também pela proporção maior de partículas na

faixa de 25 – 32 µm, o que aumenta a superfície de contato. Também não foi

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

NIP 10

MIP 10

Concentração (µg/mL)

Q (

µg

/mg

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

NIP 12

MIP 12

Concentração (µg/mL)

Q (

µg

/mg

)

70

observada diferença aparentemente significativa entre o MIP e seu NIP

correspondente com as proporções testadas quanto às taxas médias de adsorção.

Como o polímero 12 apresentou a maior capacidade média de adsorção, ele foi

escolhido para a confecção do cartucho para EFS e testes de recuperação de AMI.

Vale lembrar que os ensaios de adsorção mantém o fármaco em contato com o

polímero por 16 horas. A passagem pelo cartucho de EFS dura, no máximo, 5

minutos.

Tabela 5. Taxas médias de adsorção (%) dos polímeros

Polímeros Taxas médias de adsorção (%)

MIP 7 76,71

NIP 7 69,53

MIP 8 69,40

NIP 8 70,49

MIP 10 62,31

NIP 10 57,89

MIP 11 64,92

NIP 11 66,28

MIP 12 83,85

NIP 12 88,26

A interação iônica que ocorre entre o cloridrato de amilorida (AMI) e o ácido

metacrílico (MAA) no tampão citrato-acetato pH 6,5 está representada na Figura 22.

Os polímeros possuem ancorados em sua estrutura grupamentos ácidos,

provenientes do MAA (pKa 4,7), livres para interação com a AMI, que possui um pKa

de 8,7. Como o ensaio de adsorção foi feito em tampão citrato-acetato pH 6,5, neste

pH o MAA está carregado negativamente (COO-) e a AMI está na forma de cátion

pois o grupo guanidínico se apresenta com carga positiva, o que favorece a

interação iônica com o polímero e possibilita a adsorção.

Os polímeros sintetizados apresentaram uma boa adsorção, variando de 63 a

88%, o que confirma a interação iônica de AMI com os polímeros, contudo esta não

foi seletiva. A interação não específica dos MIPs com AMI foi possível devido aos

grupos de MAA presentes também no polímero não impresso. A interação do analito

muito polar com o ácido metacrílico pode ter sido prejudicada pela competição com

o solvente de elevada polaridade (THF:MeOH:água) no momento da síntese, que

contém solventes polares como água e metanol em sua composição. O AMI

71

possivelmente interagiu através de ligação de hidrogênio com esses solventes,

explicando a falta de seletividade.

Figura 22. Interação iônica de amilorida com o ácido metacrílico no pH 6,5

Pérez-Moral e Mayes (2004) observaram uma mesma situação de ausência

de seletividade entre MIP e NIP na adsorção de propranolol em uma solução

tamponada a pH 4,6 em MIP sintetizado por precipitação em tolueno. Neste estudo,

os autores fizeram a síntese de MIPs para o propranolol utilizando técnicas de

polimerização diferentes como em massa, por precipitação e por suspensão e

compararam a adsorção do analito no solvente de síntese (tolueno) e em tampão pH

4,6. A falta de seletividade não foi observada neste estudo em outras técnicas de

polimerização como em massa e suspensão para o mesmo analito, somente pela

técnica de precipitação. No caso do propranolol sintetizado por precipitação,

conseguiu-se observar uma diferença na seletividade de MIP em relação a NIP de

50%, no teste de adsorção do analito em tolueno. Como o MIP foi sintetizado em

tolueno, o ambiente se mostrou favorável à interação analito-polímero, assim como

ocorreu na síntese.

Outros autores como Baggiani et al. (2001) e Masqué et al. (2000) utilizaram

solventes polares como acetonitrila e metanol:água 3:1 para a síntese de MIPs

seletivos por polimerização em massa, para análise de herbicidas à base de

derivados de ácidos clorofenoxiacéticos e de p-nitrofenol, respectivamente. Os

autores verificaram a seletividade entre MIP e o polímero não impresso (NIP)

através de análise cromatográfica, utilizando os polímeros como recheio da coluna.

Os fatores de retenção obtidos foram maiores para MIP do que para NIP para os

analitos testados, comprovando a seletividade do polímero e o efeito de impressão

72

molecular. Na polimerização em massa, técnicas usadas por estes autores, o

volume de solvente é muito menor. Isto pode diminuir a interferência que o solvente

empregado na síntese pode ter sobre o analito de interesse, pois os monômeros

estão em excesso em relação ao solvente.

5.3.2 Ensaio de adsorção dos polímeros em THF:MeOH:água (5:4:1)

Para verificarmos se os polímeros sintetizados teriam adsorção no solvente

utilizado na síntese, THF:MeOH:água (5:4:1), foi feito um estudo de adsorção neste

solvente. Os resultados do ensaio de adsorção dos polímeros em THF:MeOH:água

(5:4:1) não foram de acordo com o esperado e descrito na literatura (PÉREZ-

MORAL; MAYES, 2004), pois houve praticamente nenhuma adsorção neste solvente

(resultados não mostrados, absorbâncias semelhantes às soluções controles sem

polímero). O esperado seria uma interação significativa entre MIP e AMI neste

solvente através de ligações de hidrogênio, pois este foi o solvente usado para a

síntese e teoricamente reproduziu-se este ambiente favorável à interação polímero-

AMI. O que poderia explicar este resultado, é que foi utilizado um solvente prótico

que também é capaz de interagir com AMI por ligações de hidrogênio, competindo

com o polímero e dificultando a formação das cavidades seletivas nos MIPs.

Entretanto, a dificuldade na escolha do solvente foi devida a não solubilização de

AMI em solventes orgânicos apróticos, como THF, e inclusive em solventes de

constante dielétrica elevada como a acetonitrila.

Solventes polares apróticos, tais como acetonitrila e THF poderiam ser mais

apropriados para a síntese de MIPs para AMI, mas o sal é praticamente insolúvel

nesses solventes. Spizzirri e Peppas (2005) sintetizaram MIPs para reconhecimento

de colesterol utilizando como solventes porogênicos THF, misturas de THF e DMSO

e THF/água. Neste estudo, os autores observaram que a adição de DMSO

aumentou a capacidade de reconhecimento do polímero impresso para o colesterol,

provavelmente devido a este ser um solvente polar e aprótico, não competindo com

o polímero pela formação das ligações deste com o analito. Assim, podemos sugerir

para uma futura continuação de nosso estudo, a utilização da mistura de solventes

composta por dimetilsulfóxido (DMSO) e THF, ambos solventes apróticos e polares,

sendo uma alternativa para a síntese de MIP para AMI, pois o analito é solúvel em

DMSO.

73

A temperatura da reação (60ºC) também pode influenciar na interação

analito-monômero se esta ocorrer por ligação de hidrogênio. Esta temperatura foi

necessária para a quebra da ligação O-O e consequente liberação dos radicais livres

do peróxido de benzoíla, iniciador usado na síntese dos polímeros, para que este

pudesse dar início à polimerização. Recomenda-se efetuar a polimerização em

baixas temperaturas e, nestas circunstâncias, os iniciadores radicalares ativos

fotoquimicamente por ação de energia UV são os mais indicados, como AIBN.

(TARLEY; SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005a).

5.4 EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM MIP (MISPE)

Os cartuchos de EFS foram preenchidos utilizando os polímeros MIP/NIP 12

como adsorvente conforme item 4.3.12, pois a princípio, estes apresentaram maior

capacidade adsortiva nos ensaios de adsorção realizados anteriormente. Os

resultados obtidos nos ensaios de MISPE por espectrofotometria no UV estão

tabelados e constam no Anexo 8.4. Para esses ensaios foi utilizada solução de AMI

a 10 µg mL-1, preparada em tampão citrato-acetato pH 6,5. Uma alíquota foi

colocada (carregada) no cartucho condicionado e, após aplicado o vácuo, o resíduo

em tampão foi recolhido e feita a leitura da absorbância, conforme o item 4.3.13. A

capacidade de retenção foi avaliada pela dosagem de AMI na solução antes

(controle) e após sua passagem pelo cartucho previamente condicionado. Como no

resíduo de carregamento em tampão a absorbância foi próxima de zero, pudemos

concluir que os polímeros foram capazes de reter quase que totalmente o analito.

Na fase de remoção do fármaco adsorvido no cartucho (ou eluição) vários

solventes foram testados, conforme listado na Tabela 6, onde constam os totais de

recuperação calculados (%). Da mesma forma, o solvente foi eluído no cartucho

carregado com AMI sob vácuo e os resíduos recolhidos, evaporados sob N2 e

diluídos em tampão citrato-acetato pH 6,5 para leitura no UV a 363 nm.

A eluição com metanol puro não foi capaz de retirar quantidades significativas

de AMI dos polímeros, obtendo-se uma recuperação de 5,6% para MIP e 9,5% para

NIP. A interação iônica entre o analito e o polímero possui maior força e prevaleceu

em relação à interação entre AMI e metanol por ligação de hidrogênio. Este solvente

poderia ser então usado em uma etapa de lavagem na técnica de MISPE, após o

74

carregamento com tampão, para eliminação de interferentes em uma amostra

contendo AMI, sem que este seja eluído do cartucho.

A eluição total de AMI somente ocorre após lavagem com o solvente na

presença de ácido, que protona o ânion carboxilato de MAA do polímero, rompendo

assim a interação iônica com o analito. Na eluição de AMI com a mistura

metanol:ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, obteve-se uma recuperação superior a

80% e em TFA a 1% e 2%, a eluição foi total, assim como em metanol:ácido acético

a 1%.

Tabela 6. Recuperação de AMI (%) obtida pela técnica de MISPE

Solvente MIP NIP

Tampão citrato-acetato pH 6,5 0 0

Metanol 5,6 9,5

TFA 0,1% em metanol 89,6 83,3

TFA 1% em metanol >100 >100

TFA 2% em metanol >100 >100

Ácido acético 1% em metanol >100 >100

Para avaliarmos qual a influência de um solvente aprótico na técnica de

MISPE, a acetonitrila foi o solvente escolhido como solvente de carregamento e

eluição. O cartucho, após condicionado conforme o item 4.3.14, foi carregado com

solução preparada em acetonitrila (ACN). Como o AMI não é solúvel diretamente em

ACN, uma solução a 20 µg mL-1 foi preparada diluindo-se uma alíquota da solução

estoque a 1 mg/mL em água ultra-pura com ACN. Após a passagem pelo cartucho,

a solução de acetonitrila foi recolhida, o solvente foi evaporado a 50ºC sob fluxo de

nitrogênio e os resíduos diluídos em tampão citrato-acetato pH 6,5 e quantificados

através das leituras das absorbâncias.

A concentração de AMI que não foi retida correspondeu a cerca de 55% no

NIP e 61% no MIP. Para remover a amilorida do cartucho foi empregada a solução

de ácido acético 1% em ACN, com remoção total do conteúdo adsorvido. Neste

experimento pudemos evidenciar que a interação iônica, ainda que menos

favorecida pela ausência de controle de pH promovido pelo tampão a pH 6,5, foi

75

ainda responsável pela adsorção do fármaco no polímero. Isto ocorreu devido ao

analito estar na forma de cátion mesmo na presença de ACN, devido ao seu elevado

pKa (8,7). O MAA (pKa = 4,7) neste caso está parcialmente carregado, devido ao

condicionamento feito anteriormente em água e por ser um ácido fraco, o que fez

com que a retenção no polímero diminuísse, mas ainda ocorresse a interação de

natureza eletrostática.

6 CONCLUSÕES

Polímeros de impressão molecular foram sintetizados para funcionarem como

adsorventes e aplicados à técnica de extração em fase sólida com impressão

molecular (MISPE), através da confecção de um cartucho contendo os polímeros.

Os MIPs sintetizados foram avaliados quanto à capacidade de adsorção

comparando-se com polímeros sintetizados na ausência da molécula molde (NIP,

polímeros não-impressos). A molécula molde escolhida para a síntese dos MIPs foi

o cloridrato de amilorida (AMI). O polímero com maior capacidade adsortiva,

MIP/NIP 12 foi utilizado na confecção do cartucho e aplicado à extração em fase

sólida como adsorvente, onde observou-se a recuperação de AMI após a eluição no

cartucho.

Vários fatores estão envolvidos na síntese de polímeros de impressão

molecular. A técnica de polimerização, o solvente empregado na síntese e as

proporções dos reagentes de síntese podem modificar as características do

polímero formado e sua capacidade adsortiva. A escolha dos monômeros funcionais

e do agente de reticulação também deve ser avaliada cuidadosamente para cada

analito. Estes fatores devem ser bem estudados para cada molécula molde,

avaliando-se quais são as condições ideais de síntese, considerando também a

aplicação a que se destina o MIP sintetizado.

A polimerização por precipitação é uma técnica de polimerização simples e de

baixo custo que pode, com o adequado controle das condições operacionais,

fornecer partículas de tamanho apropriado para a aplicação na extração em fase

sólida. Esta técnica possibilitou a obtenção de partículas de tamanho adequado para

a extração de AMI por EFS neste estudo.

Na técnica de impressão molecular utilizada neste estudo, as interações

analito-polímero são de natureza não covalente (iônica e por ligação de hidrogênio),

77

e a elevada polaridade de moléculas como o cloridrato de amilorida torna difícil a

escolha de um solvente ideal para a síntese de MIP, sem que este interfira nas

interações com o polímero. Solventes apróticos podem ser mais adequados para a

síntese de MIPs por não possuírem grupos doadores de ligação de hidrogênio,

aumentando as chances de interação entre a molécula molde e o polímero. No

presente estudo, os solventes e condições experimentais testadas não foram

capazes de gerar polímeros com capacidade adsortiva diferenciada entre MIP e NIP,

apesar do polímero ter apresentado um alto grau de adsorção para AMI. Para este

analito, é necessário que a pesquisa continue com a avaliação de outros solventes,

sugerindo em particular a mistura de THF e DMSO.

A técnica de extração em fase sólida com impressão molecular (MISPE) é

uma técnica promissora na área analitica. Ela possibilita a pré-concentração do

analito com o aumento da seletividade, o que pode ser observado amplamente na

literatura, desde que otimizadas as condições de síntese e de EFS para cada

analito.

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8 ANEXOS

8.1 ESPECTROS DE FTIR DOS MONÔMEROS

60011001600210026003100360020

40

60

80

100

120

Ácido metacrílico

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

6001100160021002600310036000

20

40

60

80

100

120

EDMA

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

6001100160021002600310036000

20

40

60

80

100

120

TRIM

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

8.2 ESPECTROS DE FTIR DOS POLÍMEROS

60011001600210026003100360095

95,5

96

96,5

97

97,5

98

98,5

NIP 7

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360095

95,5

96

96,5

97

97,5

98

MIP 7

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360089

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

NIP 8

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360096

96,5

97

97,5

98

MIP 8

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360086

88

90

92

94

96

98

NIP 10

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360095

95,5

96

96,5

97

97,5

98

98,5

MIP 10

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360088

90

92

94

96

98

100

NIP 11

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360084

86

88

90

92

94

96

98

100

MIP 11

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360090

91

92

93

94

95

96

97

98

99

NIP 12

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

60011001600210026003100360096,6

96,8

97

97,2

97,4

97,6

97,8

98

MIP 12

Comprimento de onda (cm-1)

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

8.3 TABELAS COM RESULTADOS DOS ENSAIOS DE ADSORÇÃO

8.3.1 Curva de calibração em tampão citrato-acetato pH 6,5

Abs médias Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

0,1 0,012 0,013 0,0032 24,110,1 0,011

0,1 0,0170,3 0,034 0,030 0,0038 12,76

0,3 0,028

0,3 0,0270,5 0,039 0,041 0,0059 14,18

0,5 0,0370,5 0,048

1 0,076 0,075 0,0023 3,09

1 0,0721 0,076

3 0,209 0,209 0,0006 0,283 0,209

3 0,2086 0,398 0,402 0,0047 1,18

6 0,4

6 0,4079 0,606 0,602 0,0047 0,78

9 0,6049 0,597

12 0,799 0,794 0,0044 0,55

12 0,79112 0,792

15 0,992 0,973 0,0186 1,9115 0,955

15 0,97120 1,147 1,220 - -

20 1,292

Concentração (µg mL-1)

8.3.2 Ensaios de adsorção variando a quantidade de polímero

NIP 10

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,266 4,02 7,487,5 9 0,205 3,03 8,9515 9 0,193 2,84 9,24

15 9 0,221 3,29 8,5630 9 0,151 2,16 10,26

30 9 0,108 1,47 11,30

Controle 0,475 7,39P=25,05 mg (bv 25 mL)

AMI adsorvida (µg)

MIP 10

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,238 3,56 8,157,5 9 0,344 5,27 5,59

15 9 0,27 4,08 7,3815 9 0,241 3,61 8,08

30 9 0,279 4,23 7,1630 9 0,31 4,73 6,41

AMI adsorvida (µg)

NIP 11

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,161 2,32 10,02

7,5 9 0,214 3,18 8,73

15 9 0,203 3,00 9,00

15 9 0,145 2,06 10,40

30 9 0,158 2,27 10,09

30 9 0,168 2,44 9,85

Controle 0,510 7,95

P= 10,05 mg (bv 10 mL)

AMI adsorvida (µg)

MIP 11

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,309 4,71 6,447,5 9 0,216 3,21 8,6915 9 0,246 3,69 7,9615 9 0,224 3,34 8,4930 9 0,297 4,52 6,7330 9 0,241 3,61 8,08

AMI adsorvida (µg)

NIP 12

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,127 1,77 10,847,5 9 0,076 0,95 12,07

15 9 0,081 1,03 11,9515 9 0,143 2,03 10,4530 9 0,127 1,77 10,8430 9 0,062 0,73 12,41

AMI adsorvida (µg)

MIP 12

massa (mg) Conc. Inicial Abs Conc. Livre

7,5 9 0,096 1,27 11,597,5 9 0,177 2,58 9,63

15 9 0,093 1,23 11,6615 9 0,092 1,21 11,6930 9 0,105 1,42 11,37

30 9 0,116 1,60 11,10

AMI adsorvida (µg)

8.3.3 Ensaios de adsorção variando a concentração

MIP/NIP 7 (3 a 15 µg/mL)

NIP 7

Abs Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,095 1,26 2,61 0,35 0,28 - -3 0,137 1,94 1,60 0,213 0,215 3,19 0,01 0,00

6 0,105 1,42 6,87 0,92 0,94 0,03 3,016 0,103 1,39 6,92 0,926 0,089 1,16 7,26 0,979 0,125 1,74 10,89 1,45 1,26 0,19 15,099 0,243 3,65 8,03 1,079 0,184 2,69 9,46 1,2612 0,19 2,79 13,81 1,84 1,92 0,12 6,2312 0,123 1,71 15,44 2,0612 0,184 2,69 13,96 1,8615 0,327 5,00 15,00 2,00 2,16 0,15 6,99

15 0,234 3,50 17,25 2,3015 0,271 4,10 16,35 2,18

Conc. Inicial (µg/mL) Conc. Livre (µg/mL) Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

*µg de amilorida/mg polímero

MIP 7

Abs Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,073 0,90 3,15 0,42 0,40 0,02 4,13

3 0,08 1,02 2,98 0,40

3 0,083 1,06 2,90 0,39

6 0,086 1,11 7,33 0,98 0,96 0,08 8,27

6 0,071 0,87 7,69 1,036 0,119 1,65 6,53 0,87

9 0,093 1,23 11,66 1,55 1,49 0,05 3,52

9 0,123 1,71 10,94 1,46

9 0,119 1,65 11,03 1,47

12 0,201 2,97 13,55 1,81 1,92 0,10 5,0112 0,148 2,11 14,83 1,98

12 0,151 2,16 14,76 1,97

15 0,414 6,40 12,90 1,72 2,20 0,42 19,02

15 0,182 2,66 18,51 2,47

15 0,197 2,90 18,15 2,42

Conc. Inicial (µg/mL) Conc. Livre (µg/mL) Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

*µg de amilorida/mg polímero

NIP 7

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) médias

3,29 2,03 61,70 51,37

3,29 1,35 41,03

3,29 0,10

5,66 4,24 74,91 76,62

5,66 4,27 75,44

5,66 4,50 79,518,85 7,11 80,34 69,60

8,85 5,20 58,87

8,85 6,16 69,60

11,37 8,58 75,46 78,92

11,37 9,66 84,96

11,37 8,68 76,34

14,55 9,55 65,64 71,13

14,55 11,05 75,95

14,55 10,45 71,82

69,53

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP 7

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) médias

3,29 2,39 72,5463 70,833,29 2,27 69,1146

3,29 2,23 67,6439

5,66 4,55 80,3374 78,635,66 4,79 84,6119

5,66 4,01 70,93358,85 7,62 86,1491 82,75

8,85 7,14 80,68168,85 7,20 81,4106

11,37 8,40 73,8985 78,77

11,37 9,26 81,416911,37 9,21 80,9913

14,55 8,15 55,9916 72,5814,55 11,89 81,7093

14,55 11,65 80,0466

76,71* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP/NIP 8 (3 a 15 µg/mL)

MIP 8

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,113 1,55 2,18 0,29 0,27 - -

3 0,124 1,73 1,91 0,25

3 0,066 0,79 3,31 -

6 0,134 1,89 6,17 0,82 0,83 0,16 18,65

6 0,178 2,60 5,10 0,68

6 0,082 1,05 7,43 0,99

9 0,181 2,65 9,53 1,27 1,27 0,19 14,619 0,239 3,58 8,13 1,08

9 0,124 1,73 10,91 1,45

12 0,256 3,85 12,22 1,63 1,62 0,30 18,58

12 0,355 5,45 9,82 1,31

12 0,169 2,45 14,32 1,91

15 0,205 3,03 17,95 2,39 2,16 0,39 18,03

15 0,417 6,45 12,82 1,7115 0,211 3,13 17,81 2,37

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

NIP 8

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) medias

3,87 1,47 37,98 58,40

3,87 2,43 63,05

3,87 2,87 74,16

6,05 4,49 74,05 74,10

6,05 4,44 73,39

6,05 4,53 74,88

9,35 5,64 60,43 72,83

9,35 7,17 76,79

9,35 7,59 81,28

12,35 9,30 75,38 77,14

12,35 9,06 73,36

12,35 10,20 82,67

15,32 10,43 68,15 69,95

15,32 9,63 62,86

15,32 12,08 78,85

70,49

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL) MIP 8Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) medias

3,87 2,32 59,99 64,993,87 2,14 55,413,87 3,08 79,586,05 4,16 68,81 69,526,05 3,45 57,086,05 5,00 82,679,35 6,70 71,71 71,659,35 5,77 61,709,35 7,62 81,5412,35 8,50 68,79 68,2612,35 6,90 55,8612,35 9,90 80,1515,32 12,29 80,21 72,5615,32 8,87 57,8915,32 12,19 79,58

69,40* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

NIP 8

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,166 2,40 0,90 0,12 0,22 - -

3 0,106 1,44 2,35 0,31

3 0,079 1,00 0,01 -

6 0,114 1,56 6,65 0,89 0,89 0,01 1,09

6 0,117 1,61 6,58 0,88

6 0,111 1,52 6,73 0,90

9 0,247 3,71 7,94 1,06 1,29 0,21 15,92

9 0,152 2,18 10,23 1,36

9 0,126 1,76 10,86 1,45

12 0,206 3,05 13,43 1,79 1,83 0,12 6,58

12 0,221 3,29 13,06 1,74

12 0,15 2,15 14,78 1,97

15 0,32 4,89 15,17 2,02 2,08 0,25 12,02

15 0,37 5,69 13,96 1,86

15 0,218 3,24 17,64 2,35

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP/NIP 10 (3 a 15 µg/mL)

NIP 10

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3

33 0,144 2,05 1,43 0,19 0,19

6 0,147 2,10 5,85 0,78 0,86 0,09 11,046 0,09 1,18 7,23 0,96

6 0,131 1,84 6,24 0,839 0,23 3,44 8,35 1,11 1,31 0,17 13,18

9 0,129 1,81 10,79 1,449 0,149 2,13 10,31 1,37

12 0,175 2,55 14,18 1,89 1,74 0,13 7,58

12 0,251 3,77 12,34 1,6512 0,239 3,58 12,63 1,68

15 0,221 3,29 17,56 2,34 1,90 0,43 22,4615 0,486 7,56 11,15 1,49

15 0,363 5,58 14,13 1,88*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP 10

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,191 2,81 0,29 - 0,313

3 0,107 1,45 2,32 0,31

6 0,183 2,68 4,98 0,66 0,76 0,09 12,316 0,15 2,15 5,78 0,77

6 0,125 1,74 6,39 0,85

9 0,27 4,08 7,38 0,98 1,04 0,10 10,079 0,274 4,15 7,28 0,97

9 0,216 3,21 8,69 1,16

12 0,174 2,53 14,20 1,89 1,90 0,03 1,3612 0,165 2,39 14,42 1,92

12 0,181 2,65 14,03 1,87

15 0,216 3,21 17,69 2,36 2,37 0,01 0,59

15 0,209 3,10 17,85 2,3815 0,208 3,08 17,88 2,38

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

NIP 10

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) média

2,58

2,58

2,58 0,53 20,61 20,61

5,56 3,46 62,29 69,35

5,56 4,38 78,82

5,56 3,72 66,93

8,16 4,72 57,90 69,89

8,16 6,35 77,86

8,16 6,03 73,91

10,74 8,19 76,27 69,26

10,74 6,97 64,86

10,74 7,16 66,66

13,82 10,53 76,19 60,36

13,82 6,26 45,26

13,82 8,24 59,62

57,89

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP 10

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) média

2,582,582,58 1,13 43,74 43,745,56 2,88 51,84 60,645,56 3,41 61,425,56 3,82 68,678,16 4,08 49,99 53,298,16 4,01 49,208,16 4,95 60,6710,74 8,21 76,42 76,5210,74 8,35 77,7710,74 8,09 75,3713,82 10,61 76,78 77,3613,82 10,72 77,5913,82 10,74 77,71 62,31

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP/NIP 10 (6 a 75 µg/mL)

NIP 10

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio

6 0,206 3,05 4,43 0,59 0,69

6 0,147 2,10 5,85 0,7815 0,248 3,73 16,91 2,25 2,2015 0,284 4,31 16,04 2,14

30 0,415 6,42 35,37 4,72 4,6730 0,445 6,90 34,65 4,62

75 1,16 18,44 84,85 11,31 11,35

75 1,14 18,11 85,33 11,38

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP 10

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio

6 0,183 2,68 4,98 0,66 0,776 0,115 1,58 6,63 0,8815 0,231 3,45 17,32 2,31 2,3615 0,198 2,92 18,12 2,4230 0,377 5,81 36,29 4,84 4,9130 0,335 5,13 37,31 4,9775 1,042 16,53 87,70 11,69 11,7175 1,03 16,34 87,99 11,73

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP/NIP 11 (3 a 15 µg/mL)

NIP11

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,145 2,06 1,40 0,19 0,23 - -

3 0,221

3 0,117 1,61 2,08 0,28

6 0,145 2,06 5,90 0,79 0,80 0,01 1,63

6 0,142 2,02 5,98 0,80

6 0,137 1,94 6,10 0,81

9 0,24 3,60 8,10 1,08 1,24 0,15 11,82

9 0,179 2,61 9,58 1,28

9 0,151 2,16 10,26 1,37

12 0,175 2,55 14,18 1,89 1,89 0,08 4,18

12 0,198 2,92 13,62 1,82

12 0,149 2,13 14,81 1,97

15 0,189 2,77 18,34 2,45 2,48 0,04 1,56

15 0,178 2,60 18,60 2,48

15 0,165 2,39 18,92 2,52

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP11

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio Desvio padrão Coeficiente de variação (%)

3 0,172 2,50 0,75 0,10 0,22 - -

3 0,196 2,89 - -

3 0,1 1,34 2,49 0,33

6 0,109 1,48 6,77 0,90 0,82 0,11 13,01

6 0,123 1,71 6,44 0,86

6 0,172 2,50 5,25 0,70

9 0,203 3,00 9,00 1,20 1,28 0,07 5,30

9 0,164 2,37 9,94 1,33

9 0,17 2,47 9,80 1,31

12 0,223 3,32 13,02 1,74 1,78 0,07 3,76

12 0,216 3,21 13,19 1,76

12 0,184 2,69 13,96 1,86

15 0,224 3,34 17,49 2,33 2,39 0,06 2,36

15 0,189 2,77 18,34 2,45

15 0,207 3,06 17,90 2,39

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

NIP 11

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) média

2,9 0,84 28,97 36,722,92,9 1,29 44,485,81 3,75 64,54 65,46

5,81 3,79 65,235,81 3,87 66,618,77 5,17 58,95 68,198,77 6,16 70,24

8,77 6,61 75,3711,4 8,85 77,63 77,7811,4 8,48 74,3911,4 9,27 81,3215,44 12,67 82,06 83,25

15,44 12,84 83,1615,44 13,05 84,52

66,28

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP 11

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) media

2,9 0,4 13,79 33,79

2,9

2,9 1,56 53,79

5,81 4,33 74,53 67,36

5,81 4,1 70,57

5,81 3,31 56,97

8,77 5,77 65,79 70,20

8,77 6,4 72,98

8,77 6,3 71,84

11,4 8,08 70,88 73,04

11,4 8,19 71,84

11,4 8,71 76,40

15,44 12,1 78,37 80,20

15,44 12,67 82,06

15,44 12,38 80,18

64,92

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

MIP/NIP 12 (6 a 60 µg/mL)

NIP 12

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio

6 0,063 0,74 7,89 1,05 1,066 0,056 0,63 8,06 1,0712 0,074 0,92 16,62 2,22 2,2112 0,077 0,97 16,55 2,2115 0,091 1,19 20,71 2,76 2,7715 0,086 1,11 20,83 2,78

22,5 0,145 2,06 30,65 4,09 3,9822,5 0,209 3,10 29,10 3,8830 0,244 3,66 39,51 5,27 5,3630 0,185 2,71 40,94 5,46

37,5 0,314 4,79 49,06 6,54 6,6237,5 0,268 4,05 50,18 6,6945 0,349 5,35 59,47 7,93 7,9245 0,355 5,45 59,32 7,91

52,5 0,462 7,18 67,98 9,06 9,1352,5 0,423 6,55 68,93 9,1960 0,447 6,94 79,60 10,61 10,6360 0,435 6,74 79,89 10,65

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP 12

Conc. Inicial (µg/mL) Abs Conc. Livre (µg/mL) Q médio

6 0,132 1,85 6,22 0,83 0,85

6 0,116 1,60 6,60 0,88

12 0,14 1,98 15,02 2,00 2,00

12 0,145 2,06 14,90 1,99

15 0,169 2,45 18,82 2,51 2,52

15 0,163 2,35 18,97 2,53

22,5 0,184 2,69 29,71 3,96 3,82

22,5 0,274 4,15 27,53 3,67

30 0,244 3,66 39,51 5,27 5,2730 0,241 3,61 39,58 5,28

37,5 0,293 4,45 49,57 6,61 6,63

37,5 0,278 4,21 49,94 6,66

45 0,374 5,76 58,86 7,85 7,88

45 0,357 5,48 59,27 7,90

52,5 0,418 6,47 69,05 9,21 9,17

52,5 0,442 6,85 68,47 9,13

60 0,491 7,65 78,53 10,47 10,45

60 0,505 7,87 78,19 10,43

*µg de amilorida/mg polímero

Amilorida adsorvida (µg) Q* (µg/mg)

MIP 12

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) médias

5,92 4,06 68,66 68,66

5,92 4,32 73,02

11,63 9,65 82,94 82,94

11,63 9,56 82,25

14,11 11,66 82,63 82,63

14,11 11,76 83,31

21,17 18,48 87,28 87,28

21,17 17,02 80,42

26,77 23,11 86,32 86,32

26,77 23,16 86,50

34,77 30,32 87,20 87,20

34,77 30,56 87,89

42,26 36,50 86,37 86,37

42,26 36,78 87,02

49,1 42,63 86,83 86,83

49,1 42,25 86,04

56,45 48,80 86,46 86,46

56,45 48,58 86,06

83,85

* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)NIP 12

Conc. Inicial (µg/mL)* taxa adsorção (%) médias

5,92 5,18 87,47 87,475,92 5,29 89,37

11,63 10,71 92,09 92,0911,63 10,66 91,6814,11 12,92 91,54 91,54

14,11 13,00 92,1121,17 19,11 90,25 90,25

21,17 18,07 85,3726,77 23,11 86,32 86,3226,77 24,06 89,88

34,77 29,98 86,22 86,2234,77 30,72 88,3642,26 36,91 87,33 87,33

42,26 36,81 87,1049,1 41,92 85,38 85,38

49,1 42,55 86,6656,45 49,51 87,71 87,7156,45 49,71 88,06

88,26* valores obtidos dos controles

Conc. Adsorvida (µg/mL)

8.3.4 Análise estatística com os resultados dos ensaios de adsorção (Teste t)

Teste t de Student para amostras independentes com variancias iguais

n1 = n2 = 3graus lib. = 4 H0 = médias iguais

H1 = médias diferentest tab = 2,776

MIP/NIP 7 MIP/NIP 8 MIP/NIP 10 MIP/NIP 11

6 µg/mLmédia MIP 0,96 0,83 0,76 0,82média NIP 0,94 0,89 0,86 0,8dp MIP 0,08 0,16 0,09 0,11dp NIP 0,03 0,01 0,09 0,01t calculado 0,049 0,668 1,361 0,314P-value 0,666 0,57 0,277 0,746Decisão Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0

9 µg/mLmédia MIP 1,49 1,27 1,04 1,28média NIP 1,26 1,29 1,31 1,24dp MIP 0,05 0,19 0,1 0,07dp NIP 0,19 0,21 0,17 0,15t calculado 2,027 0,122 2,371 0,418P-value 0,110 0,900 0,081 0,723Decisão Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0

12 µg/mLmédia MIP 1,92 1,62 1,9 1,78média NIP 1,92 1,83 1,74 1,89dp MIP 0,1 0,3 0,03 0,07dp NIP 0,12 0,12 0,13 0,08t calculado 0 1,128 2,077 1,79P-value 0,973 0,310 0,115 0,144Decisão Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0

15 µg/mLmédia MIP 2,2 2,16 2,37 2,39média NIP 2,16 2,08 1,9 2,48dp MIP 0,42 0,39 0,01 0,06dp NIP 0,15 0,25 0,43 0,04t calculado 0,155 0,297 1,893 2,162P-value 0,878 0,780 0,130 0,075Decisão Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0 Aceita-se H0

α = 0,05Decisão: t calc < t tab e p-value > α = Aceita-se H0

8.4 TABELAS COM RESULTADOS DA EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM OS

POLÍMEROS (MISPE)

NIP 12

Fração Abs Massa final (µg) Recuperação (%) médias

19,94 0,635 9,97

Carregamento (2 mL) 0,004 -0,21 0 0 0

tampão citrato-acetato pH 6,5 0 -0,27 0 0 0

0 -0,27 0 0 0

0,006 -0,18 0 0 0Lavagem* (2 mL)

Metanol 0,076 0,95 1,9 9,5 9,5

Eluição* (2 mL)Metanol:TFA 1% 0,686 10,79 21,58 108,2 >100

Metanol:TFA 1% 0,73 11,50 23 115,4 >100

Metanol:TFA 2% 0,779 12,29 24,58 123,3 >100

19,06 0,608 9,53

Carregamento (2 mL) 0 0 0 0 0

tampão citrato-acetato pH 6,5

Eluição* (2 mL)

Metanol:TFA 0,1% 0,451 7,00 14 73,5 83,3Metanol:TFA 0,1% 0,567 8,87 17,74 93,1

Metanol:HAc 1% 0,63 9,89 19,78 103,8 >100

* etapas realizadas em cada replicata do cartucho (separadamente) após o carregamento

Fração Abs Massa final (µg) Recuperação (%) médias

15,27 0,964 15,27

Lavagem* (1 mL)

ACN 0,548 8,56 8,56 56,1 54,8

ACN 0,523 8,16 8,16 53,4

Eluição* (2 mL)

ACN: HAc 1% 0,235 3,52 7,04 46,1 50,4

ACN: HAc 1% 0,276 4,18 8,36 54,8

ACN: HAc 2% 0,008 -0,15 0 0 0

ACN: HAc 2% 0,004 -0,21 0 0 0Total recuperação (%) 105,2

* etapas realizadas na mesma replicata do cartucho após o carregamento

massa inicial (µg) Conc. final (µg/mL)

Amostra (10 µg/mL) 2 mL

Amostra (10 µg/mL) 2 mL

massa inicial (µg) Conc. final (µg/mL)

Amostra (20 µg/mL) 1 mL

MIP 12

Fração Abs Massa final (µg) Recuperação (%) médias

19,94 0,635 9,97

Carregamento (2 mL) 0,003 -0,23 0 0 0

tampão citrato-acetato pH 6,5 0,014 -0,05 0 0 0

0,006 -0,18 0 0 0

0 -0,27 0 0 0

Lavagem (2 mL)

Metanol 0,052 0,56 1,12 5,6 5,6

Eluição (2 mL)

Metanol:TFA 1% 0,714 11,24 22,48 112,7 >100

Metanol:TFA 1% 0,751 11,84 23,68 118,8

Metanol:TFA 2% 0,782 12,34 24,68 123,8 >100

Metanol:TFA 2% 0,756 11,92 23,84 119,6

19,06 0,608 9,53

Carregamento (2 mL) 0 0,00 0 0 0

tampão citrato-acetato pH 6,5

Eluição (2 mL)

Metanol:TFA 0,1% 0,579 9,06 18,12 95,1 89,6

Metanol:TFA 0,1% 0,514 8,02 16,04 84,2

Metanol:HAc 1% 0,656 10,31 20,62 108,2 >100

Metanol:HAc 1% 0,621 9,74 19,48 102,2

* etapas realizadas em cada replicata do cartucho (separadamente) após o carregamento

Fração Abs Massa final (µg) Recuperação (%) médias

15,27 0,964 15,27

Lavagem (1 mL)

ACN 0,422 6,53 6,53 42,8 61,5

ACN 0,778 12,27 12,27 80,4

Eluição (2 mL)

ACN: HAc 1% 0,195 2,87 5,74 37,6 35,6

ACN: HAc 1% 0,176 2,56 5,12 33,5

ACN: HAc 2% 0,013 -0,06 0 0 0

ACN: HAc 2% 0,008 -0,15 0 0

Total recuperação (%) 97,1

* etapas realizadas na mesma replicata do cartucho após o carregamento

massa inicial (µg) Conc. final (µg/mL)

Amostra (10 µg/mL) 2 mL

Amostra (10 µg/mL) 2 mL

massa inicial (µg) Conc. final (µg/mL)

Amostra (20 µg/mL) 1 mL