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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS
PARA SAÚDE
Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de
géis de papaína destinados ao tratamento de feridas
DANIELE YURI MIURA
Niterói
2012
ii
DANIELE YURI MIURA
Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de
géis de papaína destinados ao tratamento de feridas
Niterói
2012
Dissertação apresentada à Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense para obtenção do título de
Mestre no Programa de Pós-Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro
Miura, Daniele Yuri
Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas/Daniele Yuri Miura; orientadora: Débora Omena Futuro. – Niterói, 2012.
101f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2012. 1. Papaína. 2. Terapêutica. 3. Cicatrização de feridas. 4. Estabilidade de medicamento. I. Futuro, Débora Omena II. Título. CDD 615.1901
M685
iii
DANIELE YURI MIURA
Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao
tratamento de feridas
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como
requisito para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde.
Aprovada em ____ / ____ / 2012.
Orientadora
Professora Dr.ª Débora Omena Futuro
Universidade Federal Fluminense
Banca Examinadora
Professora Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão
Universidade Federal Fluminense
Professora Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)
Membros Suplentes
Professora Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo
Universidade Federal Fluminense
Professora Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas
Universidade Federal do Rio de Janeiro
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Luiz e Hitomi, pelo apoio incondicional e exemplo de vida.
Às minhas irmãs, Tatiana e Camila, pelo carinho e momentos de alegria.
Ao meu marido, Claudio, pelo amor, companheirismo, incentivo e paciência.
v
AGRADECIMENTOS
À Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro, minha orientadora, pela oportunidade, confiança e
ensinamentos. Minha gratidão por termos feito esta caminhada juntas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde e seus
docentes, meu muito obrigada.
À Prof.ª Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo, pelo conhecimento, entusiasmo e prestatividade;
obrigada pela imprescindível ajuda durante todo o projeto. Às alunas do LABIOTEC, por
serem sempre atenciosas quando necessitei de auxílio.
Ao Prof. Dr. Joel Maurício Corrêa da Rosa, pela valiosa contribuição nos estudos de
superfície de resposta, parte essencial deste trabalho. Muito obrigada por nos auxiliar nessas
análises.
À Dr.ª Valéria Gonçalves Costa, por compartilhar seus conhecimentos e colocar-se disponível
sempre que preciso. Muito obrigada por todo o suporte, atenção e gentileza, mesmo com todas
as adversidades. Ao seu aluno Ricardo, agradeço pela contribuição nos ensaios de reologia
realizados.
À Prof.ª Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão e à Prof.ª Dr.ª Samanta Cardozo Mourão, obrigada
por acompanharem este trabalho desde o princípio, por contribuírem com incentivos e
opiniões, e pelos materiais cedidos.
À Prof.ª Dr.ª Selma Rodrigues de Castilho, à Prof.ª Dr.ª Beatriz Guitton Renaud Baptista de
Oliveira, à aluna de mestrado Andrea Pinto Leite e aos demais integrantes do Grupo de
Pesquisa em Feridas, Biomateriais e Pesquisa Clínica, pelo apoio intelectual e incrível troca
de experiências, que foram essenciais para determinar os rumos deste trabalho.
vi
À Farmácia Universitária da Universidade Federal Fluminense por, além de ser parte
essencial da minha formação profissional e objeto do meu carinho, contribuir com o
empréstimo de matérias-primas e vidrarias para este projeto. Aos farmacêuticos Eliana de
Vares Cação e Nilo Jorge Picolli e ao Prof. Ronaldo Ferreira da Silva, meu muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Wilson da Costa Santos, pela aquisição dos filtros para o fluorímetro, parte
essencial para o desenvolvimento da metodologia analítica deste trabalho. Muito obrigada.
Ao Prof. Déo Anselmo Pinheiro, por gentilmente ceder o Laboratório de Cosméticos para
produção das formulações analisadas neste projeto.
À Prof.ª Dr.ª Lenise Arneiro Teixeira e ao Prof. Dr. Geraldo Renato de Paula, do Laboratório
de Controle Microbiológico, pela disponibilidade na utilização de seus equipamentos.
Às alunas de estágio e iniciação científica, Carina Menegussi Dalvi, Hingred Bosch e Luiza
Mattos, pela ajuda e empenho em diversas etapas deste trabalho.
À CAPES, pela bolsa de estudos concedida.
À FAPERJ, pelo apoio financeiro.
Aos meus amigos, Luciana e João Márcio. Obrigada pelo incentivo e por tornarem tudo mais
divertido.
vii
“Digo o que penso, com esperança. Penso no que faço, com fé. Faço o que devo fazer, com
amor. Eu me esforço para ser cada dia melhor, pois bondade também se aprende.
Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar,
desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o
decidir."
Cora Coralina
viii
RESUMO
MIURA, D.Y. Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de
papaína destinados ao tratamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-
Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal Fluminense, 2012.
A papaína é uma enzima proteolítica, extraída do látex da espécie Carica papaya
Linne. Ela é utilizada no tratamento tópico de feridas como agente desbridante, podendo ser
aplicada em concentrações de 2 a 10%, dependendo da fase do processo de cicatrização.
Porém, sua baixa estabilidade é um fator limitante para aplicação em formulações.
O presente estudo analisou a influência dos adjuvantes técnicos EDTA dissódico,
cloridrato de cisteína e propilenoglicol no aumento da atividade proteolítica de géis de
Carbopol® 940 contendo papaína a 2 e a 4% (p/p). No estudo de formulação dos géis, as
formulações foram definidas por um desenho fatorial 33 e o efeito dos adjuvantes foi avaliado
através de um estudo de superfície de resposta. Para cada concentração de papaína, foram
selecionadas duas formulações para o estudo de estabilidade acelerada: a formulação com
melhor resultado de atividade proteolítica e aquela sem adição de adjuvantes. O estudo de
estabilidade acelerada foi realizado por sessenta dias a 5ºC ± 2ºC, 26ºC ± 2ºC e 45ºC ± 2ºC.
As quatro formulações apresentaram grande perda de atividade enzimática durante o tempo
do estudo, mesmo aquelas armazenadas a 5ºC ± 2ºC. Contudo, o armazenamento em
temperaturas mais altas intensificou a perda de atividade. Para os géis de papaína a 2%, o uso
de adjuvantes não foi eficiente na manutenção da atividade proteolítica. Já para os géis de
papaína a 4%, houve um intenso aumento na atividade com o uso de adjuvantes, porém este
efeito não foi mantido durante o tempo. Apesar destes resultados, o estudo indicou a
possibilidade de aprimoramento das formulações de gel de papaína com o uso de adjuvantes
técnicos, podendo gerar uma melhora no desempenho da atividade proteolítica dos produtos.
Palavras-chave: papaína, estabilidade, gel, estudo de formulação.
ix
ABSTRACT
MIURA, D.Y. Pharmacotechnical development and stability study of papain gels for
wounds treatment. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense,
2012.
Papain is a proteolytic enzyme extracted from latex of Carica papaya Linne. It is used
in the topical wounds treatment as a debriding agent and can be applied at concentrations of
2-10%, depending on the phase of the healing process. However, its low stability is a limiting
factor for use in formulations.
The present study examined the influence of technical adjuvants disodium EDTA,
cysteine hydrochloride and propylene glycol on increasing of proteolytic activity of
Carbopol® 940 gels containing 2 and 4% (w/w) of papain. In the gels preformulation study,
the formulations were defined by a 33 factorial design and the effect of adjuvants was
evaluated using a response surface study. For each concentration of papain, two formulations
were selected for the accelerated stability study: a formulation with best result of proteolytic
activity and that without adjuvants. The accelerated stability study was carried out for sixty
days at 5°C ± 2°C, 26ºC ± 2°C and 45ºC ± 2°C. The four formulations showed a large loss of
enzyme activity during the time of the study, even those stored at 5°C ± 2°C. However,
storage at higher temperatures increased the loss of activity. For gels with 2% papain, the use
of adjuvants was not efficient in maintaining the proteolytic activity. As for the gels with 4%
papain, there was an intense increase in activity with the use of adjuvants, but this effect was
not maintained over time. Despite these results, the study indicated the possibility of
improvement of papain gel formulations with the use of technical adjuvants, wich can provide
a better performance of the proteolytic activity of the products.
Keywords: papain, stability, gel, formulation study.
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físicas da papaína. .............................................................................. 12
Tabela 2. Classificação dos géis segundo a natureza da fase coloidal. ................................... 22
Tabela 3. Classificação dos géis segundo o número de fases. ................................................. 22
Tabela 4. Classificação dos géis segundo a natureza da fase líquida. ..................................... 22
Tabela 5. Formulação do gel base de Carbopol® 940. ............................................................. 29
Tabela 6. Formulações de géis de papaína a 2 e a 4% preparadas para seleção do gel base
mais adequado. .................................................................................................................. 30
Tabela 7. Volumes utilizados das soluções das amostras e do padrão no teste de recuperação.
........................................................................................................................................... 34
Tabela 8. Formulações avaliadas no teste de especificidade. .................................................. 35
Tabela 9. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 2%. ............... 37
Tabela 10. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 4%. ............. 38
Tabela 11. Codificação das variáveis para o estudo de superfície de resposta, utilizando
pacote RMS do programa R. ............................................................................................. 39
Tabela 12. Composição das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, selecionadas para o
estudo de estabilidade acelerada. ...................................................................................... 40
Tabela 13. Parâmetros de avaliação das características sensoriais das formulações. .............. 42
Tabela 14. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão
secundário 30.000 UI/mg. ................................................................................................. 46
Tabela 15. Resultados obtidos da avaliação da precisão intra-corrida para soluções de papaína
padrão 0,450; 1,500; e 3,750 UI/mL. ................................................................................ 48
Tabela 16. Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras de gel de
Carbopol® 940. .................................................................................................................. 49
Tabela 17. Resultados experimentais da análise da interferência de diversos excipientes na
determinação da atividade da papaína em gel de Carbopol® 940. .................................... 50
Tabela 18. Resultados obtidos para o cálculo dos limites de detecção e quantificação da
papaína pelo método de microplacas. ............................................................................... 52
xi
Tabela 19. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína
2%...................................................................................................................................... 54
Tabela 20. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína
4%...................................................................................................................................... 60
Tabela 21. Resultados do teste de steepest ascent from ridge do gel de papaína a 4%. .......... 64
Tabela 22. Composição das formulações de gel de papaína selecionadas para o estudo de
estabilidade acelerada. ....................................................................................................... 65
Tabela 23. Avaliação das características sensoriais das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e
P4-28 no tempo zero. ........................................................................................................ 65
Tabela 24. Valores de pH das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ..... 67
Tabela 25. Resultados da análise de viscosidade aparente das formulações P2-01, P2-20, P4-
01 e P4-28 no tempo zero. ................................................................................................. 68
Tabela 26. Valores referentes à viscosidade aparente (no ponto de máximo gradiente de
cisalhamento) e tixotropia para as formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28. ................ 72
Tabela 27. Valores da atividade proteolítica das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no
tempo zero. ........................................................................................................................ 73
Tabela 28. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-01 em 60 dias............ 74
Tabela 29. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-20 em 60 dias............ 75
Tabela 30. Avaliação das características sensoriais da formulação P4-01 em 60 dias............ 77
Tabela 31. Avaliação das características sensoriais da formulação P4-28 em 60 dias............ 77
Tabela 32. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-01. ................ 80
Tabela 33. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-20. ................ 80
Tabela 34. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P4-01. ................ 81
Tabela 35. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P4-28. ................ 81
Tabela 36. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................................................... 85
Tabela 37. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-20 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................................................... 85
xii
Tabela 38. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-01 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................................................... 87
Tabela 39. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-28 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................................................... 87
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal
estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007). .............. 13
Figura 2. Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra. ........................ 32
Figura 3. Curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg. ....................................................... 46
Figura 4. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 1,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). .................................. 50
Figura 5. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 2,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). .................................. 51
Figura 6. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 3,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). .................................. 51
Figura 7. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 4,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). .................................. 52
Figura 8. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol. ................................................................................................................. 58
Figura 9. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol. ................................................................................................................. 59
Figura 10. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol. ................................................................................................................. 62
Figura 11. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol. ................................................................................................................. 63
Figura 12. Fotografias das formulações no tempo zero de análise - (a) P2-01; (b) P2-20; (c)
P4-01; (d) P4-28. ............................................................................................................... 67
Figura 13. Gráfico de viscosidade aparente x velocidade das formulações P2-01, P2-20, P4-
01 e P4-28 no tempo zero. ................................................................................................. 69
xiv
Figura 14. Reograma da formulação P2-01 no tempo zero de análise. ................................... 70
Figura 15. Reograma da formulação P2-20 no tempo zero de análise. ................................... 71
Figura 16. Reograma da formulação P4-01 no tempo zero de análise. ................................... 71
Figura 17. Reograma da formulação P4-28 no tempo zero de análise. ................................... 72
Figura 18. Fotografias das formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, entre os 7º e
60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC),
temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). .............................................. 76
Figura 19. Fotografias das formulações de gel de papaína a 4%, P4-01 e P4-28, entre os 7º e
60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC),
temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). .............................................. 79
Figura 20. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-01, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................... 82
Figura 21. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-20, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................... 83
Figura 22. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P4-01, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................... 84
Figura 23. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P4-28, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................... 84
Figura 24. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ....................................................... 86
Figura 25. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-20 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ....................................................... 86
Figura 26. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-01 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ....................................................... 89
Figura 27. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-28 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ....................................................... 89
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AA Adesivo acrílico
a.C. Antes de Cristo
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
app Tm Temperatura de desnaturação térmica aparente
Asn Asparagina
CCD Composite Central Design
CMD Concentração média determinada
CME Concentração média experimental
Cp Centipoise
CT Concentração teórica
CV Coeficiente de variação
Cys Cisteína
λmax Comprimento de onda de absorbância máxima
Da Dalton
d.C. Depois de Cristo
DCC Delineamento Composto Central
DMSO Dimetilsulfóxido
DP Desvio padrão
DPa Desvio padrão da interseção com o eixo y das 3 curvas de
calibração
DSC Calorimetria exploratória diferencial
DX Dextrana
EDTA Etilenodiaminotetracetato
FO First order
g Grama
GLU Glutaraldeído
His Histidina
HUAP Hospital Universitário Antônio Pedro
I Incolor
IC Inclinação da curva de calibração
INT Instituto Nacional de Tecnologia
LAMAP Laboratório de Processamento e Caracterização de Materiais
Poliméricos
xvi
LBNB Látex de borracha natural bicentrifugado
LD Limite de detecção estimado
LQ Limite de quantificação estimado
µL Microlitro
µm Micrometro
mg Miligrama
mL Mililitro
mPa.s Milipascal segundo
N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalnil-L-arginina 4-
metilcumarina-7-amido
nm Nanômetro
Pa Pascal
p/p Peso por peso
p/v Peso por volume
PEG Polietilenoglicol
psi Medida de pressão em libra por polegada quadrada
q.s. Quantidade suficiente
q.s.p. Quantidade suficiente para
R Coeficiente de correlação
R2 Coeficiente de correlação linear
rpm Rotações por minuto
s Segundo
SB Dispersão de silicone bicomponente
SM Dispersão de silicone monocomponente
SO Second order
TPP Tripolifosfato
TWI Two-way interactions
UI Unidade Internacional
UR Umidade relativa do ar
ŷ Valor estimado
xvii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3
aa 2.1 Pele
3
AA 2.1.1 Feridas
4
aa 2.1.1.1 Processo de cicatrização
5
2.1.1.2 Tratamento de feridas
7
2.2 Papaína
10
2.2.1 Características físicas da papaína
12
2.2.2 Estrutura molecular da papaína
12
2.2.3 A papaína no tratamento de feridas
13
2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no
tratamento de feridas
16
2.2.5 Estabilização da papaína
18
2.3 Géis
21
2.3.1 Carbômero (Carbopol®)
23
2.4 Reologia
24
2.4.1 Comportamento reológico de géis de Carbopol®
26
3. OBJETIVOS
27
3.1 Objetivo geral
27
3.2 Objetivos específicos
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS
28
4.1 Materiais
28
4.1.1 Matérias-primas e Reagentes
28
4.1.2 Equipamentos
28
4.2 Métodos
29
4.2.1 Preparação do gel de Carbopol® 940 para incorporação da
papaína
29
4.2.2 Preparação dos géis de papaína a 2 e 4% para seleção do
gel base mais adequado
30
4.2.3 Determinação da atividade proteolítica da papaína
31
4.2.3.1 Validação da metodologia
33
aa 4.2.3.1.1 Curva de calibração
33
4.2.3.1.2 Precisão
33
4.2.3.1.3 Exatidão
34
4.2.3.1.4 Especificidade
35
4.2.3.1.5 Limites de detecção e quantificação
36
4.2.4 Estudo de formulação
36
xviii
4.2.4.1 Estudo de superfície de resposta
39
4.2.5 Estudo de estabilidade acelerada
40
4.2.5.1 Preparo das amostras
40
4.2.5.2 Condições do estudo
41
4.2.5.3 Características avaliadas
41
4.2.6 Análise estatística
43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
45
5.1. Seleção do gel base de Carbopol®
940 para incorporação da
papaína
45
5.2 Validação da metodologia de determinação da atividade
proteolítica da papaína
46
5.2.1 Curva de calibração
46
5.2.2 Precisão
47
5.2.3 Exatidão
48
5.2.4 Especificidade
49
5.2.5 Limites de detecção e quantificação
52
5.3 Estudo de formulação
53
5.3.1 Gel de papaína a 2%
54
5.3.2 Gel de papaína a 4%
60
5.4 Estudo de estabilidade acelerada
64
5.4.1 Caracterização dos géis de papaína no tempo zero do
estudo de estabilidade acelerada
65
5.4.1.1 Características sensoriais
65
5.4.1.2 pH
67
5.4.1.3 Viscosidade aparente
68
5.4.1.4 Comportamento reológico
70
5.4.1.5 Atividade proteolítica
73
5.4.2 Avaliação das características sensoriais durante 60 dias de
armazenamento dos géis
74
5.4.3 Avaliação dos valores de pH durante 60 dias de
armazenamento dos géis
80
5.4.4 Avaliação da viscosidade aparente durante 60 dias de
armazenamento dos géis
81
5.4.5 Avaliação da atividade proteolítica durante 60 dias de
armazenamento dos géis
85
6. CONCLUSÕES
92
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
93
1
1. INTRODUÇÃO
Ferida pode ser descrita como qualquer tipo de alteração na integridade anatômica da
pele, resultante de trauma físico, químico, mecânico ou causado por afecção clínica. Ainda
nos dias atuais, as feridas representam um problema de saúde para o ser humano, com
repercussões físicas e psicoemocionais e diminuição na qualidade de vida e no convívio
social.
O tratamento de feridas é complexo, envolvendo aspectos sistêmicos e locais. A
terapia tópica é um fator essencial para o tratamento de feridas e envolve os processos de
limpeza, desbridamento e cobertura. O desbridamento consiste na remoção de tecidos
necrosados ou exudatos purulentos presentes no leito da ferida, que interferem no processo de
cicatrização. Pode ser realizado por técnicas mecânicas e/ou químicas. O desbridamento
mecânico apresenta as desvantagens de ser uma técnica cansativa, muito delicada,
normalmente traumática e causadora de sofrimento ao paciente. A opção pelo desbridamento
com enzimas proteolíticas apresenta-se vantajosa, com remoção rápida e seletiva, não-
traumática, sem causar prejuízos ao paciente.
Amplamente utilizada na prática clínica como agente desbridante, a enzima papaína,
oriunda do látex da espécie Carica papaya, apresenta também características
bactericida/bacteriostática, anti-inflamatória e bioestimulante. Outras vantagens do seu uso
são o baixo custo e a ausência de efeitos colaterais. A papaína pode ser utilizada em todas as
fases do processo cicatricial, sendo indicadas diversas concentrações dependendo do grau de
cicatrização da ferida: preparações a 2% para feridas com tecido de granulação, produtos com
4% a 6% de papaína em feridas que apresentem exsudato purulento, e formulações onde a
papaína encontre-se a 8 e a 10% quando a ferida apresentar tecido necrótico.
No Brasil, as preparações com papaína são provenientes da farmácia magistral e só
recentemente foram contempladas pelo Formulário Nacional, na forma farmacêutica em gel.
Não existem produtos industrializados a base de papaína para uso tópico em nosso país e não
foram encontrados registros de estudos de estabilidade de produtos nas concentrações
preconizadas pelo Formulário Nacional. Por tratar-se de uma enzima, a papaína apresenta
baixa estabilidade, tornando necessário que sejam feitos estudos mais aprofundados para
2
determinação de veículos compatíveis, adjuvantes técnicos necessários, condições de
armazenamento e estabilidade físico-química dessas formulações.
Deste modo, foi elaborado o presente trabalho, visando contribuir para um melhor
entendimento a respeito da estabilidade dos géis de papaína a 2 e a 4% (p/p), produtos
amplamente utilizados no tratamento de feridas.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Pele
A pele é considerada o maior e mais complexo órgão do corpo humano, representando
aproximadamente 15% do peso corporal, tendo a função de revesti-lo e delimitá-lo, além de
estar constantemente relacionada com atividades biológicas e bioquímicas (CAMARGO,
2006; HAX, 2009; DÂNGELO e FATTINI, 1998). Ela contém, pelo menos, cinco diferentes
tipos de células que contribuem para sua organização estrutural e demais tipos celulares,
provenientes dos sistemas circulatório e imunológico (HADGRAFT, 2004; MENON, 2002;
QUEIROZ, 2008). É composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme (CAMARGO,
2006; DÂNGELO e FATTINI, 1998).
A epiderme é a camada mais externa, composta por três diferentes linhagens de
células: queratinócitos, melanócitos e células de Langerhans. Ela é organizada em camadas e,
conforme as mais superficiais são eliminadas, as camadas mais profundas são restauradas por
divisão celular. Suas camadas são denominadas: germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e
córnea. A camada germinativa é a mais profunda, faz limite com a derme, e a camada córnea
é a mais superficial (BLANES, 2004). A camada córnea é constituída por células escamosas,
queratinizadas, impermeáveis, e proporciona proteção contra traumas físicos e químicos
(BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; SAMPAIO, CASTRO e RIVITTI, 1989). As diversas
camadas de queratinócitos, unidos uns aos outros, fornecem barreira às lesões, à
contaminação e à luz. A epiderme também evita a desidratação dos tecidos subjacentes, retém
fluidos e nutrientes dentro da pele e produz melanina, responsável pela cor da pele e proteção
dos tecidos subjacentes dos efeitos nocivos da luz ultravioleta (BLANES, 2004; CAMARGO,
2006; HAX, 2009).
A derme é uma espessa camada de tecidos conjuntivos fibrinosos de colágeno e
elastina, onde se apoia a epiderme e faz a união à hipoderme (BLANES, 2004; JUNQUEIRA
e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008). Nela, encontram-se os anexos da pele, vasos
sanguíneos, vasos linfáticos e nervos (HAX, 2009). Pode ser dividida em camada papilar,
mais externa, e camada reticular, mais interna (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004;
QUEIROZ, 2008). A derme contém diversos tipos de células, incluindo fibroblastos e
4
fibrócitos, macrófagos, mastócitos e leucócitos sanguíneos, particularmente neutrófilos,
eosinófilos, linfócitos e monócitos (BLANES, 2004).
A hipoderme, ou camada subcutânea, é rica em fibras e adipócitos. Atua como reserva
energética, isolante térmico e protege contra choques mecânicos (CAMARGO, 2006; HAX,
2009). Ela é formada por tecido conjuntivo frouxo e une de maneira pouco firme a derme aos
órgãos subjacentes (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008).
2.1.1 Feridas
Ferida pode ser denominada como uma interrupção da continuidade de um tecido
corpóreo, em maior ou em menor extensão, causada por qualquer tipo de trauma físico,
químico, mecânico ou desencadeada por uma afecção clínica (BLANES, 2004; CESARETTI,
1998).
As feridas podem ser classificadas em função de sua etiologia (aguda ou crônica); do
mecanismo da lesão (amputação, incisa, contusa, escoriação, lacerante ou puntiforme); do
grau de contaminação (limpa, limpa-contaminada, contaminada ou infectada); e do grau de
perda de tecido (feridas de espessura ou densidade parcial, ou feridas de espessura ou
densidade total) (PEREIRA, 2006).
Dentre as principais patologias relacionadas ao surgimento de feridas, está o diabetes.
Portadores dessa doença devem ser avaliados constantemente, já que o nível de glicemia está
fortemente relacionado a complicações vasculares, como a neuropatia periférica e a doença
vascular periférica. Complicações como essas estão associadas a lesões tissulares e
amputações de membros inferiores (MACIEL, 2008).
As neuropatias motora, sensitiva e autonômica aumentam os riscos do surgimento de
ulcerações, pois diminuem os mecanismos de proteção ao trauma, através da diminuição da
sensibilidade, diminuição da sudorese, modificação na regulação do fluxo sanguíneo e
deformidade nos pés (MACIEL, 2008).
Uma das complicações frequentes em pacientes com anemia falciforme é a úlcera de
membros inferiores. Elas ocorrem em 8 a 10% dos pacientes homozigotos. As ulcerações
formadas são dolorosas e podem ser únicas ou múltiplas. Acometem áreas com pouco tecido
subcutâneo e pele fina, como a região maleolar interna ou externa e tibial anterior. O
5
aparecimento pode ser espontâneo ou gerado por pequenos traumas. Não existe forma de
prevenção, a recorrência é frequente, a cicatrização é lenta e respondem pior ao tratamento
que úlceras de outras etiologias (PALADINO, 2007).
A insuficiência venosa crônica é a principal etiologia das úlceras venosas. Tais lesões
contribuem com cerca de 70% a 90% dos casos de úlceras de pernas e geram impacto
psicológico, dor, diminuição da qualidade de vida e altos custos ao sistema de saúde, pois os
pacientes costumam permanecer com a ferida por vários anos (BORGES, 2005; MACIEL,
2008).
Como consequência das doenças crônicas, as limitações físicas e a imobilidade são
importantes fatores de risco para as úlceras por pressão (MACIEL, 2008; THOMAS, 2006).
Elas são consideradas como indicadores da qualidade do cuidado com o paciente. Essa lesão é
definida como uma área localizada de dano da pele e tecido subjacente, causado por pressão,
cisalhamento, fricção ou a combinação destes fatores (CANNON e CANNON, 2004;
MACIEL, 2008). Essas lesões podem atingir qualquer área de proeminência óssea corporal,
porém as mais vulneráveis são as regiões sacra, calcânea e trocantérica (MACIEL, 2008;
REDDY et al., 2008; THOMAS, 2006). As úlceras por pressão ocorrem com frequência em
pacientes hospitalizados, com prevalência entre 3% e 12%, segundo dados americanos que
contabilizaram úlceras a partir do estágio II, lesão que envolve a epiderme e/ou a derme
(MACIEL, 2008). Consequentemente, elas constituem importante problema para pacientes e
instituições de saúde, pois, aumentam o risco de infecção, dificultam a recuperação,
prolongam a internação, geram custo elevado e contribuem para o aumento da taxa de
mortalidade (CANNON e CANNON, 2004; MACIEL, 2008; REDDY et al., 2008;
THOMAS, 2006).
2.1.1.1 Processo de cicatrização
A cicatrização de feridas é um processo dinâmico, contínuo e complexo, composto por
diversas fases sobrepostas (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; CESARETTI, 1998;
DECLAIR, 2002; HAX, 2009). Ela depende de vários fatores, locais e gerais, como:
localização anatômica, tipo de pele, raça, técnica cirúrgica utilizada (CAMARGO, 2006). São
utilizadas diferentes classificações didáticas para entendimento deste processo.
6
Morfologicamente, identificam-se três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e de
maturação (BLANES, 2004; CESARETTI, 1998; HAX, 2009).
A fase inflamatória é uma reação local não específica à lesão do tecido e/ou invasão
bacteriana (HAX, 2009). Ocorre vasoconstrição por 5 a 10 minutos imediatamente após a
lesão, propiciando o fechamento dos vasos danificados. Em seguida, há o aumento da
permeabilidade vascular, com a retração das células endoteliais, permitindo a passagem dos
elementos sanguíneos para a ferida; plasma, eritrócitos e leucócitos (diapedese) (BLANES,
2004). A vasodilatação com extravasamento de elementos para o exterior do vaso forma um
exsudato, que se manifesta clinicamente por inchaço, calor, rubor e dor; a intensidade
depende do tipo e do grau de agressão sofrida pela pele (BLANES, 2004; HAX, 2009). Estas
alterações correspondem à resposta vascular e são acompanhadas por uma resposta celular. Os
neutrófilos realizam a digestão de bactérias e tecidos desvitalizados, e os monócitos
transformam-se em macrófagos, auxiliando na fagocitose de bactérias e restos celulares
(SCHULTZ et al., 2003). Ocorre a liberação de mediadores celulares, que estimulam a
elaboração de substâncias responsáveis pelo fenômeno inflamatório (histamina, serotonina,
bradicinina, prostaglandinas e tromboxanos, linfocinas e interleucinas 1 e 2). Há também a
liberação do fator de crescimento pelas células epidérmicas e plaquetas (BLANES, 2004).
Na fase proliferativa, ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do epitélio. A
reparação do tecido conjuntivo compreende a formação de tecido de granulação, com
proliferação endotelial e de fibroblastos, que surgem por volta do segundo e terceiro dia após
a lesão. Ocorre a transformação do fibrinogênio do exsudato inflamatório em fibrina, que
forma uma rede. Nesta rede de fibrina, há a deposição dos fibroblastos, que passam a
multiplicar-se e a secretar os componentes protéicos do tecido cicatricial (BLANES, 2004).
Observa-se também uma intensa proliferação vascular (BLANES, 2004; SCHULTZ et al.,
2003). Este tecido constituído por fibroblastos, substâncias produzidas por eles e vasos
sanguíneos é chamado de tecido de granulação, que apresenta aspecto granuloso e
avermelhado. Presente no tecido de granulação, o miofibroblasto é uma célula que confere
capacidade contrátil, reduzindo a área da lesão e facilitando a epitelização. Próximo ao 15º
dia, com o fim da atividade mitótica dos fibroblastos, eles passam a secretar as proteínas
presentes no tecido de granulação, produzindo os componentes da substância fundamental
(formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos) e colágeno (BLANES, 2004). Os
fibroblastos são células consideradas adaptativas, realizando função reguladora do equilíbrio
7
de colágeno, devido à sua dupla função de síntese e reabsorção do mesmo (HAX, 2009;
SIMÕES et al., 1985). Outro fenômeno importante desta fase, a formação do epitélio faz-se
pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme
por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente. Nos casos de feridas com perda
total da derme, a epitelização ocorre apenas das margens da mesma, pois não há anexos
cutâneos remanescentes (BLANES, 2004; HAX, 2009).
Na fase de maturação, observam-se dois eventos importantes: deposição, agrupamento
e remodelação do colágeno, e regressão endotelial. Ocorre o direcionamento das fibras de
colágeno, através das colagenases e outras proteases produzidas por macrófagos e células
epidérmicas (BLANES, 2004; SCHULTZ et al., 2003). A remodelação do colágeno tem
início na formação do tecido de granulação e permanece por meses após a reepitelização. Há a
diminuição de todos os elementos celulares e dos elementos do tecido conjuntivo, além da
redução progressiva de vasos neoformados (BLANES, 2004). A cicatriz se torna menos
espessa, mais plana, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (BLANES, 2004;
HAX, 2009; SCHULTZ et al., 2003).
2.1.1.2. Tratamento de feridas
O tratamento de feridas é uma prática observada desde os primórdios da humanidade,
sendo adaptado durante os séculos para apresentar melhores resultados. Foram descritas na
Alexandria, por volta de 3.000 a.C., feridas infectadas como aquelas com bordas
avermelhadas e que apresentavam calor. Para o tratamento, recomendava-se aplicação de
folhas de salgueiro, pão mofado ou levedo de cerveja. Os egípcios introduziram o uso de
minerais, como cobre e mercúrio, além do mel para o tratamento de feridas (GOMES e
CARVALHO, 2002).
Hipócrates (460 - 377 a.C.) sugeriu que as feridas deveriam ser tratadas com unguento
para promover supuração, remoção de tecido necrótico e redução de inflamação, buscando
eliminar o humor que estava em excesso no organismo. No início da era cristã, Cornelius
Celsus (53 a.C. - 7 d.C.) foi o primeiro a descrever os quatro sinais da inflamação e
diferenciou as condutas de tratamento de feridas, classificando soluções para uso tópico em:
adstringentes, cáusticos, erosivos e hemostáticos. Claudius Galeno (129 - 200 d.C.), líder da
escola médica de Alexandria, realizava a supuração de feridas com aplicação de unguentos e
8
utilizava substâncias promotoras da cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL,
2008).
No século XIV, o uso de armas de fogo nas guerras europeias gerou um novo tipo de
ferida, mais difícil de curar. Ambroise Paré, cirurgião francês (1510-1590), reformulou o
tratamento desse tipo de feridas. Ele substituiu o óleo fervente, que até então vinha sendo
utilizado, por pomada à base de terebentina, óleo de rosa e gema de ovo (BLANES, 2004;
GOMES e CARVALHO, 2002).
Entre o final do século XIX e o início do século XX, o tratamento de feridas baseava-
se em agentes tópicos com ação antimicrobiana e proteção com coberturas secas. O uso do
álcool e de antissépticos metálicos tornou-se mais comum. Entre os anos de 1920 e 1940,
foram introduzidas ao tratamento pomadas contendo enzimas, com o objetivo de realizar o
desbridamento químico das feridas. A partir de 1950, surgiram os primeiros estudos sobre a
eficácia da cicatrização de feridas em ambiente úmido. A partir de então, surgiu um novo
interesse no desenvolvimento de coberturas interativas, que promoviam um melhor ambiente
para a cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL, 2008).
Atualmente, apesar dos avanços tecnológicos e da maior disponibilidade de recursos,
ainda existem controvérsias a respeito da melhor terapia tópica para o tratamento de feridas. É
vivenciada pelos profissionais a dificuldade em decidir qual o melhor tratamento e qual o
produto mais eficaz, e associar os estudos desenvolvidos sobre o tratamento de feridas à
prática clínica (PEREIRA, 2006). O processo que tem sido adotado para auxiliar na escolha
do tratamento de feridas é a prática baseada em evidências, onde se valoriza a decisão com
base em evidências clínicas, originada de pesquisas sistemáticas. Nessa situação, pesquisa e
prática clínica estão associadas em um processo sistemático e contínuo de auto-aprendizado e
auto-avaliação. Tratamentos que não são baseados em evidências científicas não atingem
resultados desejados, submetendo o paciente a intervenções ineficazes (MACIEL, 2008;
PEREIRA, 2006).
Diversos fatores locais e sistêmicos estão envolvidos na cicatrização de feridas, como
doenças crônicas e infecciosas; questões socioeconômicas e psicológicas; traumas e cirurgias;
a necessidade de continuidade da utilização do curativo; avaliação do custo-benefício. A
escolha do tratamento deve ser adequada à natureza, à localização e ao tamanho da ferida.
Portanto, é essencial que o acompanhamento do paciente seja feito por uma equipe
9
multidisciplinar, para o controle dos fatores que interferem no processo cicatricial (FRANCO
e GONÇALVES, 2008; MACIEL, 2008).
Um fator importante é o nutricional, já que a cicatrização é um processo complexo,
que envolve fenômenos químicos, produção de colágeno e gasto de energia, proteínas,
vitaminas e minerais. Fatores psicológicos e sociais também podem influenciar no processo
de cicatrização, sendo importante reduzir situações estressantes e melhorar a qualidade de
vida do paciente (MACIEL, 2008).
A terapia tópica de feridas é baseada em estudos científicos sobre a fisiologia de
reparação tecidual. É preciso favorecer as condições locais através da terapia tópica para
viabilizar o processo fisiológico. Pode-se definir terapia tópica como o conjunto de condutas
que visam à cura precoce das feridas, compreendendo limpeza, desbridamento e cobertura
(BLANES, 2004; GOMES e CARVALHO, 2002).
A limpeza da ferida deve ser realizada com uso de técnica e fluido que minimize
trauma mecânico e químico. Entre os princípios da terapia tópica, um dos primeiros e mais
importantes componentes a serem considerados é a remoção não somente da necrose como
também de corpos estranhos do leito da ferida. O uso de antissépticos em feridas tem efeito
nocivo, pois, além da citotoxidade, contribuindo para o retardo da cicatrização, não é o
mecanismo mais eficiente para reduzir a contagem bacteriana nas lesões. Em feridas crônicas,
como úlceras de membros inferiores e por pressão, há colonização bacteriana, mas essa não
retarda o processo de cicatrização. Entretanto, a presença de tecido necrótico favorece a
infecção (BLANES, 2004; YAMADA, 1999).
O desbridamento consiste na remoção de tecidos necrosados aderidos ou de corpos
estranhos do leito da ferida, usando técnicas mecânicas e/ou químicas. Existem diversos
métodos de desbridamento, cujas indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens
devem ser conhecidas para a escolha mais adequada às necessidades do paciente. Dentre os
métodos de desbridamento estão os desbridamento autolítico, desbridamento enzimático ou
químico, desbridamento mecânico e desbridamento cirúrgico/instrumental (BLANES, 2004;
YAMADA, 1999).
O procedimento de oclusão das feridas com coberturas visam manter as células viáveis
e permitir que elas liberem fatores de crescimento, estimulando sua proliferação. Algumas
características para a escolha da cobertura mais apropriada são: manter umidade na interface
10
ferida/cobertura, remover o excesso de exsudato, permitir a troca gasosa, promover
isolamento térmico, proporcionar proteção contra infecção, ser isento de partículas e
contaminantes e permitir a remoção sem causar traumas. Além dessas, devem apresentar
disponibilidade, flexibilidade, facilidade de manuseio e custo-eficácia. Os efeitos benéficos do
meio úmido incluem a prevenção de desidratação do tecido e morte celular; a angiogênese
acelerada; o desbridamento autolítico, pois eles retêm as enzimas e água que ajudam na
fibrinólise; e a redução da dor, atribuída à proteção das terminações nervosas que o meio
úmido fornece contra o ressecamento e a exposição. As coberturas podem ser classificadas
como primária, que são aquelas que permanecem em contato direto com a lesão, e secundária,
sendo aquelas que ficam sobre a cobertura primária, podendo ser gazes, chumaços, entre
outros. Para a escolha da cobertura mais apropriada é imprescindível conhecer as principais
categorias de produtos disponíveis, adequados à realidade de trabalho, assim como sua forma
de ação, indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens (BLANES, 2004; DEALEY,
1996; PEREIRA, 2006).
O mercado mundial disponibiliza mais de 2.000 produtos para o tratamento de feridas,
tornando a escolha da cobertura correta uma tarefa difícil e desafiadora. Alguns exemplos de
coberturas utilizadas ultimamente são: filme de poliuretano, hidrocolóide, hidrogel, papaína,
carvão ativado e alginatos (BLANES, 2004; PEREIRA, 2006).
2.2 Papaína
A papaína é uma enzima de origem vegetal, encontrada nas folhas e nos frutos da
Carica papaya Linne. Ela é isolada a partir do látex do fruto verde dessa espécie
(CAPUCHO, 2007). A enzima é amplamente utilizada na indústria alimentícia, em
estabilização de cerveja e amaciamento de carnes (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e
ISLAM, 1998; PAQUES e MACEDO, 2006). Na indústria farmacêutica, pode ser encontrada
em medicamentos para uso interno, para tratamento de problemas digestivos, e para uso
externo, destinados ao tratamento de lesões cutâneas (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e
ISLAM, 1998; FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006). Na produção de
cosméticos, é utilizada em preparações para clareamento da pele, esfoliantes e agentes
depilatórios. Também é empregada na remoção de proteínas das superfícies de lentes de
contato (TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). A papaína também tem
11
aplicações na indústria têxtil, na produção de seda, em curtumes, no tratamento de efluentes
industriais e domésticos, na indústria de borracha, entre outras (ESPÍN e ISLAM, 1998;
FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006).
O látex da Carica papaya L. é um fluído de aparência leitosa, com comportamento
tixotrópico. Ele possui aproximadamente 15% de matéria seca, das quais 40% correspondem
a enzimas, principalmente cisteínas endopeptidases, que constituem mais de 80% da fração
total de enzimas (AZARKAN et al, 2003; CAPUCHO, 2007). A papaína consiste em uma
mistura de enzimas proteolíticas, papaína e quimopapaína, essencialmente. Essas enzimas são
capazes de hidrolisar polipeptídeos, amidas e ésteres, principalmente nas ligações envolvendo
aminoácidos básicos, leucina ou glicina, produzindo peptídeos de baixo peso molecular
(PINTO, 2005).
Além da papaína, são encontradas outras endopeptidases no látex da Carica papaya
L., como as quimopapaínas A e B, a endopeptidase papaia III, a endopeptidase papaia IV e,
acredita-se que, uma outra denominada endopeptidase Ω. Essas endopeptidases são um risco
para a própria planta; porém, elas estão presentes no látex como pró-formas inativas, que são
ativadas após a liberação do látex pela planta (CAPUCHO, 2007).
Dentre essas endopeptidases, a papaína é a que se encontra em menor quantidade
(aproximadamente 8%); contudo, é a mais facilmente purificada (CAPUCHO, 2007). Foi
isolada em forma cristalina a partir do látex fresco pela primeira vez em 1937, sendo o
processo aprimorado por Balls e Lineweaver (1939).
12
2.2.1 Características físicas da papaína
Algumas características físicas da papaína estão descritas na Tabela 1.
Tabela 1. Propriedades físicas da papaína.
Propriedades físicas Características
Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor
forte e característico, similar ao enxofre.
Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol.
Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio.
Massa molecular 23.406 Da
Ponto isoelétrico pH 8,75
λmax 278 nm
Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC
Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 - 7,0
Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 - 6,2
Fontes: FERREIRA et al., 2008; GLAZER e SMITH, 1961; KILARA, SHAHANI e WAGNER, 1977; MERCK
INDEX, 1996; MITCHEL, CHAIKEN e SMITH, 1970; SANCHEZ NETO et al., 1993; TRAVERSA,
MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007.
2.2.2 Estrutura molecular da papaína
A papaína é classificada como uma cisteína protease da família C1, pertencente à
classe das enzimas proteolíticas (DARDENNE et al., 2003). Sua estrutura está representada
na Figura 1. Ela consiste em uma única cadeia polipeptídica com 212 resíduos de aminoácidos
(TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Possui um grupo nucleofílico
tiol essencial, do resíduo Cys-25, e um imidazol do resíduo His-159. A cadeia lateral do
resíduo Asn-175 é um importante sítio de ligação das cisteínas proteases. Esses três resíduos,
Cys-25, His-159 e Asn-175, formam a tríade catalítica da papaína (SANKALIA et al., 2006).
A papaína hidrolisa ligações peptídicas de aminoácidos hidrofóbicos na posição P2 e,
preferencialmente, aminoácidos básico na posição P1 (PINTO et al., 2007).
13
Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal
estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007).
O grupo tiol do aminoácido cisteína (Cys-25) é fundamental para sua atividade
enzimática (FERREIRA et al., 2005; HOMAEI et al., 2010; SILVA, 2003). Esse radical deve
permanecer na sua forma reduzida, porém é facilmente oxidado a dissulfetos em soluções
aquosas ou em contato com substâncias compostas por iodo, oxigênio e ferro (FERREIRA et
al., 2005). Uma vez oxidado esse radical, a enzima perde sua atividade proteolítica. Para
manter o radical no estado reduzido, pode-se adicionar outro tiol como cisteína, glutationa,
mercaptoetanol, 2,3-dimercaptopropanol ou tioglicolato (SANKALIA et al., 2006; SMITH,
KIMMEL e BROWN, 1953). A papaína pode ser parcialmente ou completamente inativada
quando armazenada a temperatura ambiente por um mês (PINTO at al., 2007). Devido a essas
características, recomenda-se que o armazenamento da papaína obedeça a condições
específicas como abrigo de luz, umidade e calor (FERREIRA et al., 2005; SANCHEZ NETO
et al., 1993).
2.2.3 A papaína no tratamento de feridas
A utilização da papaína no tratamento de feridas tem sido amplamente estudada
quanto à sua ação e ao estabelecimento de protocolos para o tratamento de diversos tipos de
lesões. Ela se destaca como uma ótima alternativa para esses tipos de tratamento devido ao
seu baixo custo e ausência de efeitos colaterais (FERREIRA et al., 2005; HAX, 2009; SILVA,
2003).
14
A papaína promove desbridamento químico, ativa o processo de regeneração tecidual
e encurta o período de cicatrização, além de possuir ação bactericida, bacteriostática e anti-
inflamatória (FERREIRA et al., 2005; FERREIRA et al., 2008). Foi uma das primeiras
substâncias utilizadas no desbridamento (PIEPER e CALIRI, 2003). Ela também é capaz de
hidrolisar as ligações peptídicas do colágeno e da queratina na camada córnea da pele
(LOPES et al., 2008; TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Além de
facilitar a cicatrização, ela promove o alinhamento das fibras de colágeno, resultando em um
crescimento mais uniforme do tecido e, consequentemente, em uma cicatriz mais plana, mais
próxima à estrutura original da pele (CAPUCHO, 2007; MONETTA, 1990; SANCHEZ
NETO et al., 1993).
O uso da papaína é consagrado na literatura internacional desde a década de 50
(FERREIRA et al., 2005). No Brasil, a primeira publicação científica dos resultados da
utilização da papaína no tratamento de feridas foi feita por Monetta (1987), usando
inicialmente o fruto in natura e, posteriormente, a solução da papaína em pó.
Monetta (1987) realizou um estudo com 15 pacientes com lesões abertas, num total de
23 lesões. Foi preparada a solução de papaína através da diluição de uma colher de café rasa
da enzima em 50 mL de água destilada. A aplicação foi feita após limpeza mecânica por
cobertura da lesão com gaze embebida na solução de papaína e, em áreas de tecidos
necrosados, foi feita cobertura com fina camada de papaína em pó. No estudo, foi utilizada
também a polpa do mamão verde. A limpeza foi feita com soro fisiológico, seguida de
aplicação da polpa na lesão e cobertura secundária de gaze seca. Somente no primeiro
paciente foi utilizado o mamão. No 5º dia, observou-se aumento de secreção sero-purulenta,
amolecimento do tecido necrosado, afrouxamento dos bordos com pequeno aumento do
tamanho da lesão e diminuição do alo de hiperemia ao redor da lesão. Dos 15 pacientes
acompanhados, 3 foram submetidos a enxerto de pele na fase de aparecimento do tecido de
granulação; 2 tiveram óbito, 1 caso suspenso no 13º dia devido à queixa de dor e 5 pacientes
receberam alta hospitalar com lesões já em fase de cicatrização. Cinco pacientes queixaram-se
de ardor moderado que diminuiu gradativamente, durando no máximo 20 minutos até cessar
totalmente. Não foram observadas reações alérgicas.
Em 1953, Guzman e Guzman realizaram uma experimentação in vitro das marcas de
papaína disponíveis no mercado, encontrando uma grande variação na atividade proteolítica.
Eles também aplicaram soluções de papaína em pacientes com úlceras, incluindo 12 pacientes
15
com queimaduras de segundo e terceiro graus majoritariamente infectadas. As soluções de
papaína (2-5%) foram aplicadas em curativos com gaze cirúrgica úmida ou a própria enzima
em pó foi colocada sobre a superfície úmida da ferida. Os curativos foram trocados a cada 24
horas, sendo a papaína reaplicada quando necessário. Dez dos 12 pacientes queimados
apresentaram bom desbridamento entre 24-48 horas.
Em 1995, foi publicado um estudo onde foi avaliada a ação da papaína em infecção de
vísceras e feridas abdominais abertas. Foram utilizadas soluções de papaína a 1, 2 e 4%. A
troca dos curativos era feita três vezes ao dia. Em todos os casos, após 72 horas, observou-se
diminuição acentuada da secreção e início de formação de tecido de granulação. A
cicatrização de todas as feridas ocorreu em tempo médio de 30 dias (FERREIRA et al., 2005;
PEREIRA e BACHION, 2005).
Foi relatado por Starley e colaboradores (1999) o uso tópico de uma pasta preparada
com polpa de mamão em queimaduras infectadas em pacientes pediátricos. O tratamento das
feridas durante algumas semanas tornam-nas suficientemente limpas para um enxerto. O
estudo mostrou a possibilidade do uso de enzimas na remoção de escaras, sem a necessidade
de intervenções cirúrgicas, diminuindo o tempo de internação do paciente. Um fator limitante
para o desbridamento enzimático é a sepse, sendo que o mamão contém carpaina e agliconas,
que possuem um amplo espectro de atividade antimicrobiana.
Um estudo descritivo e retrospectivo foi feito por Monetta (1998), onde a solução de
papaína foi utilizada para tratamento de úlceras diabéticas, venosas e de pressão, em
concentrações de 2% para lesões com tecidos viáveis e 10% em tecidos inviáveis. A média de
idade dos pacientes foi de 62 anos, com predominância de mulheres (58,5%). Observou-se
redução gradativa do tecido de necrose após o 14º dia até o 28º dia e, a partir do 7º dia, a
granulação e epitelização aumentaram nos três grupos de pacientes.
A ação proteolítica da papaína é observada somente em tecidos inviáveis, não
agredindo os tecidos sadios ao redor da lesão. Este fato deve-se à enzima α1-antitripsina, uma
antiprotease plasmática presente somente nas células sadias, que impede a ação proteolítica da
papaína (BLANES, 2004; FERREIRA et al., 2005).
O uso da papaína é indicado para todas as fases do processo de cicatrização, em
feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Normalmente,
são utilizadas as concentrações de 2% (p/p), para feridas com tecido de granulação; 4% a 6%
16
(p/p), em feridas com exsudato purulento; e 8 a 10% (p/p), para tecido necrótico (FERREIRA
et al., 2005; HAX, 2009; PIEPER e CALIRI, 2003).
2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no tratamento de feridas
No tratamento de feridas, a papaína é utilizada em diversas formas farmacêuticas,
como solução aquosa, pó, gel e creme (FERREIRA et al., 2005).
No estudo realizado por Ferreira e colaboradores (2005), no período de 1987 a 2000,
foi relatado exclusivamente o uso da papaína em solução, diluída em água destilada ou soro
fisiológico 0,9%, com recomendação unânime de aplicação imediatamente após o preparo. De
Paola e colaboradores (1999) avaliaram a estabilidade de solução de papaína 2% (p/v), diluída
em água destilada. A solução foi armazenada em geladeira a 5ºC e em temperatura ambiente
(22ºC), mostrando uma perda de 50% da atividade quando em temperatura ambiente no
período de 8 a 10 horas de armazenamento. Quando armazenada em geladeira, após 52 horas,
a atividade enzimática permaneceu em torno de 60% da inicial.
Um fator importante no uso da papaína em pó e em solução é a segurança na
manipulação e aplicação, tanto do profissional quanto do paciente. Além da sua alta atividade
proteolítica, se inalada, pode causar doenças respiratórias como asma, pneumonia e enfisema.
É necessário ressaltar a necessidade da utilização de equipamentos de proteção individual,
como máscaras com filtros contra pós e óculos, além de ventilação adequada (FERREIRA et
al., 2005).
Foi desenvolvido e padronizado por Velasco (1993) um gel de papaína 0,4% (p/v) para
uso diário em pacientes com ferimentos, abscessos e úlceras, inclusive as úlceras por pressão.
Foram avaliadas quatro formulações de gel de papaína 0,4%, com temperaturas de
armazenamento de 5, 22 e 37ºC, durante cerca de dois meses. Em temperatura de 5ºC,
observou-se perda de 30% da atividade proteolítica; houve perda de 50% para a temperatura
de 22ºC; enquanto que, para a temperatura de 37ºC, ocorreu variação de 30 a 60% de redução
da atividade no período estudado.
A utilização da forma em gel se mostra vantajosa, já que mantém o ambiente da ferida
úmido, condição primordial para o processo de cicatrização. O gel também se distribui
facilmente, não excedendo os limites da lesão, além de apresentar fácil remoção pela lavagem
da ferida com água destilado ou soro fisiológico, sem deixar resíduos. A formulação da
17
papaína em gel apresenta a concentração como fator limitante, pois ela pode interferir na
viscosidade do veículo. Entretanto, não foi encontrada na literatura a concentração máxima de
papaína em gel que assegure a manutenção das características da formulação (FERREIRA et
al., 2005).
Em 2003, Traversa avaliou a estabilidade de formulações de papaína 0,8% (p/p) em
gel de Carbopol® 940 e em creme à base da cera emulsificante não-iônica Polawax
®. As
temperaturas de armazenamento utilizadas foram 4, 25 e 40ºC. Foram avaliados os seguintes
parâmetros: características sensoriais (cor, odor e uniformidade), valores de pH e viscosidade.
As maiores variações foram observadas nas formulações armazenadas a 40ºC, com alteração
de odor para as duas formulações na primeira semana, e de cor para a formulação a base de
Polawax® no 32º dia. Para a emulsão de Polawax
®, ocorreram também alterações de
viscosidade em todas as temperaturas, com variação de 48% em 40ºC.
Capucho (2007) estudou a estabilidade e a eficácia in vitro de formulações de papaína
1% em géis de Carbopol® 940, Natrosol
® 250 HHR e Pluronic
® F127. Os géis mostraram-se
estáveis quando armazenados a 4ºC por 6 meses. Entretanto, o acondicionamento em
temperaturas de 30ºC/70% UR e 40ºC/70% UR resultou em uma rápida redução da atividade
proteolítica em função do tempo de armazenamento. A avaliação in vitro das formulações foi
feita em gel de poliacrilamida, adicionado de gelatina como substrato, durante 6 horas a 37ºC.
O gel de papaína em Carbopol® 940 apresentou resultado mais eficaz para esta análise,
mesmo quando comparado com a solução extemporânea de papaína 1% em água. Foi
concluído, então, que este foi o polímero mais adequado para veicular a papaína.
Novas formas farmacêuticas têm sido estudadas para a aplicação da papaína, com
aumento de sua estabilidade. Ruas e colaboradores (2006) desenvolveram uma matriz
polimérica para obtenção de um adesivo de uso tópico com ação cicatrizante. Foram
analisadas duas dispersões de silicone: monocomponente (MED 6605) e bicomponente (MED
6640), sendo que a segunda alterou a atividade da enzima. A formulação de papaína 0,69%
(p/p) em dispersão em silicone monocomponente apresentou um melhor perfil de liberação.
Posteriormente, Zulli (2007) realizou a incorporação da papaína em diversas matrizes
poliméricas com o objetivo de obter um sistema de liberação controlada da enzima. Foram
utilizados os polímeros: látex de borracha natural bicentrifugado (LBNB), adesivo acrílico
(AA), dispersão de silicone monocomponente (SM) e dispersão de silicone bicomponente
(SB). As membranas de LBNB e de AA foram descartadas por apresentarem citotoxicidade.
18
Então, as membranas de silicone incorporadas com a papaína a 2%, foram submetidas ao
ensaio de liberação com células de difusão de Franz. Nos resultados, foi encontrada liberação
constante da papaína nas 12 horas iniciais do experimento.
No Brasil, as preparações de uso tópico com papaína são exclusivamente provenientes
da farmácia magistral. Somente recentemente foram inclusas no Formulário Nacional da
Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2011) as fórmulas de géis de papaína 2% a 10%, com
recomendação de armazenamento sob refrigeração. Por não apresentar forma industrializada,
não se encontram registros de estudos de estabilidade dessas formulações. Foi recomendado
por Sankalia e colaboradores (2006) que formulações farmacêuticas contendo papaína e
outras enzimas digestivas sejam armazenadas a 2 - 8ºC ou 8 - 25ºC, desde que, sob a condição
escolhida, mantenha-se um tempo de prateleira de um ano. Esses fatores são preocupantes,
pois se torna impossível assegurar a eficácia e a segurança do medicamento durante o tempo
de tratamento.
2.2.5 Estabilização da papaína
As enzimas têm sido muito utilizadas em cosméticos e medicamentos nos últimos
anos, além de serem estudadas como uma nova opção terapêutica com menos efeitos tóxicos.
Apesar desse potencial das enzimas, sua fragilidade apresenta-se como um problema. A
maioria das enzimas não é estável e, em temperatura ambiente, perdem sua atividade
biológica em aproximadamente um mês. Essa característica afeta a aplicação das mesmas em
produtos farmacêuticos (SIM et al., 2000; VARCA et al., 2007).
As aplicações da papaína são restritas devido à sua limitada estabilidade. Sim e
colaboradores (2000) avaliaram a conjugação da papaína com um biopolímero solúvel
produzido pelo fungo Schizophyllum commune, a SC-glucana, para aplicações cosméticas.
Foram realizadas também conjugações com a dextrana (DX) e o polietilenoglicol (PEG). Foi
observada uma melhora significativa na estabilidade da enzima conjugada com a SC-glucana,
sendo que 95% da atividade inicial manteve-se após um mês de armazenamento a 45ºC,
enquanto a conjugação com PEG e DX apresentaram atividade de 27% e 45%,
respectivamente. O complexo papaína/SC-glucana foi incorporado em uma loção base
cosmética na concentração de 1%, apresentando taxa de recuperação da atividade maior que
19
70%. A atividade enzimática na loção foi mantida por três meses de armazenamento a 45ºC;
pelo contrário, a papaína nativa em loção foi inativada rapidamente.
Pinto (2005) estudou o efeito da incorporação de polietilenoglicol à papaína. A
modificação da enzima foi realizada com polietilenoglicol modificado com peso molecular
médio de 5000, utilizando concentração de papaína a 5% (p/v). Foram avaliadas emulsões
acrescidas de papaína livre ou modificada, nas concentrações de 0,8% (p/p) e 22,06% (p/v),
respectivamente. As formulações foram armazenadas em temperatura de 5, 22 e 40ºC durante
90 dias. Foi observada uma mudança no perfil de liberação e na atividade da papaína
modificada, em relação à livre. A temperatura mais adequada para armazenamento das
formulações com papaína não modificada foi de 5ºC, enquanto para as com papaína
modificada foi de 22ºC. Os resultados confirmaram um aumento na estabilidade da papaína
modificada e o potencial para aplicação em formulações de uso tópico.
Outro estudo, realizado por Varca e colaboradores (2007), propôs a formação de
complexos de papaína com ciclodextrinas. As ciclodextrinas são amplamente utilizadas em
formulações farmacêuticas devido à sua habilidade de formar complexos com outras
moléculas, aumentando a estabilidade e a biodisponibilidade dos fármacos. A análise térmica
dos complexos de papaína/hidroxipropil-β-ciclodextrina e papaína/β-ciclodextrina mostrou
mudanças nos eventos endotérmicos e nos perfis citotóxicos, sendo que o último apresentou
maior eficiência na mudança das características da enzima.
A adição de compostos polihidroxilados em soluções enzimáticas mostrou aumento na
estabilidade das enzimas, provavelmente, pela interação dessas substâncias com a água do
sistema. Assim, diminuem-se as interações da proteína com a água, já que as substâncias
polihidroxiladas são preferencialmente hidratadas, e aumentam-se as interações hidrofóbicas
da estrutura protéica. O resultado é uma maior resistência à desnaturação térmica da estrutura
da proteína e da estabilidade da enzima (KILINÇ, ONAL e TELEFONCU, 2001).
Satish, Kumar e Prakash (2007) realizaram um estudo do efeito de vários co-solventes,
como sorbitol, sacarose, xilose e glicerol, na papaína. Foram utilizadas medidas de atividade,
espectroscopia de fluorescência e calorimetria exploratória diferencial (DSC). Nos estudos de
desnaturação térmica da papaína com diversas concentrações dos co-solventes, observou-se
mudança na temperatura de desnaturação térmica aparente (app Tm), sugerindo aumento da
estabilidade térmica da papaína na presença desses co-solventes. A estabilização máxima foi
20
observada com o sorbitol na concentração de 30%, quando a temperatura de transição térmica
aumentou em relação ao controle. Os resultados sugeriram um considerável aumento da
estabilidade da papaína na presença de todos os co-solventes estudados, como resultado da
hidratação preferencial.
Uma formulação em spray foi desenvolvida por Jáuregui e colaboradores. (2009) para
cicatrização de feridas, contendo papaína 0,1% (p/v) imobilizada em gel de pectina 6% (p/v).
Ela apresentou maior estabilidade quando comparada a solução aquosa de papaína 0,1% em
temperaturas de 4 e 75ºC. A meia-vida da formulação papaína-pectina, a 4ºC, é de 15 dias,
comparada a 1,36 dias da solução. Quando sob pressão de 50 psi de ar ou gás nitrogênio, a
meia-vida do produto é estendida para 30 dias.
Foram desenvolvidas por Vasconcellos, Goulart e Beppu (2011) micropartículas de
quitosana contendo papaína para aplicação em formulações de liberação controlada. As
micropartículas de quitosana são amplamente utilizadas para liberação de fármacos, podendo
ser adaptadas para tratamentos específicos em alvos diferentes. Entretanto, a papaína pode
despolimerizar a quitosana, por isso a quitosana precisa estar em uma forma reticulada. As
micropartículas de quitosana foram reticuladas com glutaradeído (GLU) ou tripolifosfato
(TPP) e submetidas à sorção da papaína por 12 horas em solução de papaína 1% (p/v). Depois
de liofilizadas, as micropartículas foram submetidas aos testes de estabilidade e de liberação
in vitro. Elas foram estáveis por 7 dias, mantendo a atividade enzimática constante durante o
período do estudo, em temperatura de 37ºC. A taxa de liberação das micropartículas de
quitosana–GLU e quitosana–TPP em tampão fosfato (pH 7,4) mostrou-se similar, com perfil
ligeiramente crescente, indicando liberação constante da papaína durante as primeiras 25
horas. Os autores destacam as micropartículas de quitosana–GLU e quitosana–TPP como
fortes candidatas à aplicação em formas de liberação controlada da papaína, com preferência
para o uso do tripolifosfato, devido à sua menor toxicidade em relação ao glutaraldeído.
A papaína costuma ser utilizada como princípio ativo único. Porém, nos Estados
Unidos, encontram-se produtos de papaína associada à uréia e à clorofila. Esse produto é
comercializado com o nome de Panafil®. Além dele, há também a Accuzyme
®, produto com
papaína e uréia, e o produto italiano NouriFusion®, associação da papaína com as vitaminas
A, C e E. A função da uréia nesse tipo de formulação é facilitar a ação proteolítica da papaína,
alterando as estruturas tridimensionais das proteínas por romper suas ligações hidrogênio, e
expondo os sítios ativos da papaína por ação solvente. Ela também age na redução das pontes
21
dissulfeto das proteínas e expõe os resíduos de cisteína, que são os mais susceptíveis à ação da
papaína. Essa associação apresenta ação duas vezes mais efetiva na digestão de proteínas,
comparada à papaína isolada (CAPUCHO, 2007; FALANGA, 2002).
2.3 Géis
Os géis são formas farmacêuticas semi-sólidas, constituídas da suspensão de pequenas
partículas inorgânicas ou de grandes moléculas orgânicas interpenetradas por um líquido. São
destinados geralmente para uso externo, com indicação para administração de ativos em peles
mistas, oleosas e acnéicas, podendo também ter aplicação intranasal, intravaginal, retal, oral e
parenteral (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; CORRÊA et al., 2005; FERREIRA,
2008).
Os géis são considerados dispersões coloidais, pois contém partículas em dimensão
coloidal. Usualmente, diz-se que uma substância é coloidal quando suas partículas têm entre
1nm e 0,5µm (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000).
De modo geral, os géis têm ação epidérmica, pois apresentam baixo poder de
penetração na pele. Assim, são mais adequados para tratamentos superficiais dos tecidos.
Entretanto, já são descritos na literatura inúmeros exemplos de formulações em gel
empregadas como veículos para permeação cutânea, os chamados géis transdérmicos
(FERREIRA, 2008). Alguns exemplos de agentes utilizados para aumentar a permeação
cutânea são: tensoativos, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, dimetilformamida,
álcool, acetona, propilenoglicol e polietilenoglicol (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR.,
2000).
Géis podem ser classificados pelos seguintes critérios: natureza da fase coloidal;
número de fases; e natureza da fase líquida. As classificações são apresentadas nas Tabela 2 a
Tabela 4.
22
Tabela 2. Classificação dos géis segundo a natureza da fase coloidal.
Tipo de gel Descrição Exemplos
Inorgânico Geralmente bifásico Gel de hidróxido de alumínio
Gel de bentonita
Orgânico Geralmente
monofásico
Gel de goma adraganta
Gel de carbômeros (Carbopol®)
FONTE: FERREIRA, 2008.
Tabela 3. Classificação dos géis segundo o número de fases.
Tipo de gel Descrição Exemplos
Monofásico Uma fase Gel de alginato de sódio
Gel de carbômeros (Carbopol®)
Bifásico Duas fases Gel de hidróxido de alumínio
Gel de bentonita
FONTE: FERREIRA, 2008.
Tabela 4. Classificação dos géis segundo a natureza da fase líquida.
Tipo de gel Descrição Exemplos
Hidrogel Substâncias hidrofílicas Gel de carbômeros (Carbopol)
Gel de metilcelulose
Oleogel Substâncias lipofílicas Gel de parafina líquida
Gel de polietilenoglicol
FONTE: FERREIRA, 2008.
Os géis hidrofílicos (hidrogéis) são mais utilizados, sendo relativamente pequena a
quantidade de preparações em oleogel (PRISTA et al., 2006). Os hidrogéis têm sido muito
usados em produtos cosméticos e como base dermatológica, pois apresentam fácil
espalhamento, não são gordurosos e podem veicular princípios ativos hidrossolúveis e
lipossomas (CORRÊA et al., 2005).
23
O gel é composto por agente gelificante, veículo e conservantes, podendo também
haver a presença de outros adjuvantes técnicos, como os umectantes. Os agentes gelificantes
são utilizados nas preparações farmacêuticas e cosméticas por conferirem aumento de
viscosidade. Essa elevação de viscosidade deve-se ao seu elevado grau de solvatação e
hidratação e à capacidade de reter moléculas dos líquidos nas suas cadeias macromoleculares
(FERREIRA, 2008).
Geralmente, são utilizados polímeros como substância formadora do gel, ou agente
gelificante. Dependendo das características do polímero, os géis podem apresentar natureza
iônica ou não-iônica. Os géis aniônicos são pH dependentes, apresentando-se mais estáveis
em pH neutro ou próximo do neutro. Já os géis de caráter não-iônico possuem estabilidade em
ampla faixa de pH, tornando possível a veiculação de substâncias ácidas (CORRÊA et al.,
2005).
Os agentes gelificantes podem ser divididos em três classes: derivados da celulose
(carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose);
polímeros não-celulósicos naturais ou semi-sintéticos (goma xantana, goma adraganta,
alginatos, pectina, ágar, ácido algínico); e polímeros derivados do ácido acrílico (Carbopol®
;
Aristoflex® AVC; Pemulen
®) (AULTON, 2005; FERREIRA, 2008; LOPES, LOBO e
COSTA, 2005; QUEIROZ, 2008).
2.3.1 Carbômero (Carbopol®)
As resinas de carbômero (carbômer ou Carbopol®) são os agentes gelificantes mais
utilizados e apresentam ampla aplicação nas áreas farmacêutica e dermocosmética. Existem
diversos tipos de Carbopol®, que devem ser escolhidos corretamente de acordo com a
característica desejada. Os géis de Carbopol® apresentam vantagens como: alta viscosidade
em baixas concentrações; amplo intervalo de viscosidade e comportamento de fluxo
característico; compatibilidade com muitos princípios ativos; propriedades bioadesivas; boa
estabilidade térmica; características sensoriais excelentes; e boa aceitação pelo paciente
(FERREIRA, 2008; ISLAM et al., 2004).
Eles são constituídos de polímeros de ácido acrílico de alto peso molecular com
ligação cruzada. Os géis de Carbopol® são preparados a partir da dispersão do polímero em
água, onde ele pode aumentar em até mil vezes do volume original. Para desenvolver o
24
completo potencial de viscosidade destes polímeros deve-se adicionar uma base orgânica ou
inorgânica, como a trietanolamina de alta pureza ou o hidróxido de sódio, à dispersão aquosa
do polímero (BONACUCINA, MARTELLI e PALMIERI, 2004; CORRÊA et al., 2005;
FERREIRA, 2008; QUEIROZ, 2008).
Os carbômeros são utilizados usualmente nas concentrações de 0,5 a 2,0%, podendo
variar de acordo com o tipo do carbômero. São incompatíveis com resorcinol, fenol,
polímeros catiônicos, ácidos fortes e altas concentrações de eletrólitos. Alcança-se a máxima
viscosidade na faixa de pH entre 6,0 e 11,0 (FERREIRA, 2008).
2.4 Reologia
O termo reologia, de origem do grego rheo (fluxo) e logos (ciência), foi criado por
Bingham e Crawford, e passou a ser adotado a partir de 1929. Ela pode ser definida como o
estudo das propriedades de fluxo e deformação da matéria (AULTON, 2005; CORRÊA et al.,
2005).
Na reologia, os materiais podem ser classificados como Newtonianos ou não-
Newtonianos, de acordo com suas características de fluxo. O fluxo Newtoniano é
caracterizado pela viscosidade constante, independente da velocidade de cisalhamento
aplicada; enquanto no fluxo não-Newtoniano, a viscosidade é alterada com o aumento da
velocidade de cisalhamento (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000).
Materiais compostos por partículas assimétricas, como é o caso da maioria dos
produtos farmacêuticos e cosméticos, apresentam fluxo não-Newtoniano. Dentre eles,
incluem-se as soluções coloidais, as emulsões, as suspensões líquidas e as pomadas (ANSEL,
POPOVICH e ALLEN JR., 2000; CORRÊA et al., 2005).
Os materiais de fluxo não-Newtoniano podem ser classificados em três tipos gerais:
plásticos, pseudoplásticos e dilatantes.
Materiais plásticos são também chamados de corpos de Bingham, em homenagem a
quem realizou grande parte dos primeiros estudos com esses materiais. O fluxo plástico não
tem início até que um determinado valor de tensão de cisalhamento tenha sido ultrapassado; a
tensões menores, o material se comporta como um sólido, ou seja, apresenta comportamento
elástico. O fluxo plástico é característico de pomadas e suspensões concentradas,
25
particularmente se a fase contínua for de alta viscosidade ou se a fase dispersa estiver
floculada (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005; FERREIRA, 2008).
O fluxo do material pseudoplástico inicia-se tão logo a tensão de cisalhamento é
aplicada. Conforme se aumenta a tensão de cisalhamento, a velocidade de cisalhamento
também aumenta. Apresentam este tipo de fluxo os hidrocolóides naturais ou quimicamente
modificados, os polímeros sintéticos e emulsões. Acredita-se que moléculas longas, de
elevada massa molecular, se embaracem quando estão em solução, com imobilização do
solvente entre elas. Então, sob influência da tensão, essas moléculas tendem a desembaraçar-
se e alinhar-se longitudinalmente entre si, deslizando umas sobre as outras. Desse modo,
oferecem menor resistência ao fluxo e, aliado à liberação do solvente, contribui para a
diminuição da viscosidade (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005;
FERREIRA, 2008).
Uma característica dos fluidos pseudoplásticos é a chamada tixotropia. Este termo
significa “mudar pelo toque” e é utilizado para descrever qualquer material que exiba um
decréscimo reversível na sua viscosidade aparente dependente do tempo, em condição
isotérmica. Em geral, sistemas tixotrópicos são formados por partículas assimétricas ou
macromoléculas, que são capazes de interagir por várias ligações secundárias, resultando em
uma frouxa estrutura tridimensional. Com aplicação do cisalhamento, essas ligações são
rompidas e o material flui de modo mais alinhado, o que diminui a sua viscosidade. Com a
retirada do cisalhamento, ocorre a reestruturação do material, que se expressa em aumento de
viscosidade. Praticamente todas as pomadas, géis, emulsões e suspensões apresentam
propriedade tixotrópica com mais ou menos evidência. (AULTON, 2005; FERREIRA, 2008).
O comportamento tixotrópico favorece a estabilidade do produto, com aumento do
tempo de prateleira, pois apresentam viscosidade constante durante o armazenamento,
dificultando a separação dos componentes da formulação. Outra vantagem das formulações de
uso tópico com comportamento tixotrópico é a capacidade de deformação durante a aplicação,
facilitando o espalhamento, seguida da recuperação da viscosidade quando se encerra a
aplicação, evitando que o produto escorra. Entretanto, não são desejáveis valores elevados de
tixotropia, pois a recuperação da estrutura do produto é lenta e pode causar um escorrimento
pela pele, nem valores baixos de tixotropia, já que podem dificultar a espalhabilidade do
produto, resultando em uma distribuição não uniforme (CORRÊA et al., 2005, GASPAR e
MAIA CAMPOS, 2003).
26
O fluxo dilatante é oposto ao fluxo pseudoplástico, observando-se um aumento de
viscosidade com o aumento da velocidade de cisalhamento. Eles apresentam aumento de
volume e espessamento quando submetidos ao cisalhamento. O efeito é reversível e, com a
remoção da tensão de cisalhamento, ocorre o restabelecimento da natureza fluida. É um
comportamento menos comum que os fluxos plástico e pseudoplástico, mas pode ser exibidos
por sistemas com alta porcentagem (aproximadamente 50%) de partículas pequenas,
defloculadas (ANSEL, POPOVICH E ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005).
2.4.1 Comportamento reológico de géis de Carbopol®
As características reológicas são propriedades importantes, que devem ser
consideradas nos processos de fabricação, estocagem e aplicação de um produto. É necessário
que se conheça as velocidades de deformação das operações às quais esse produto estará
sujeito, como, por exemplo, no processo de mistura de substâncias, no envase em recipientes
e retirada de determinada embalagem (CORRÊA et al., 2005; FERREIRA, 2008).
As formas farmacêuticas semi-sólidas, em sua maioria, são destinadas ao uso externo.
Elas apresentam propriedade de adesão à superfície de aplicação durante certo período de
tempo antes de serem removidas. Esse comportamento permite que os semi-sólidos
mantenham a forma e adiram como um filme, até que uma força externa os façam deformar e
fluir. É desejável que produtos para uso externo espalhem facilmente, sem muito esforço, mas
não devem ser tão fluidos que escorram pela superfície da pele. É comum que esse tipo de
formulação apresente comportamento pseudoplástico (AULTON, 2005; CORRÊA et al.,
2005; FERREIRA, 2008; SOUTO et al., 2004).
O comportamento reológico de géis de Carbopol vem sendo amplamente estudado, em
relação à mudança de pH, temperatura, concentração e densidade. Este tipo de análise é
importante por estar diretamente relacionada às propriedades físicas, às características de
adesão, ao tempo de permanência na área de aplicação e à difusão e liberação do princípio
ativo pela microestrutura do gel. Os parâmetros citados e suas alterações podem influenciar na
aceitação do produto pelo consumidor (CORRÊA et al., 2005; ISLAM et al., 2004; KIM et
al., 2003).
27
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Desenvolver formulações de gel de papaína em concentrações de 2 e 4% e realizar o
estudo de estabilidade dos produtos selecionados.
3.2 Objetivos específicos
Estabelecer uma metodologia analítica para a determinação da atividade proteolítica
da papaína a 2 e a 4% em gel.
Desenvolver formulação de gel de Carbopol® 940 compatível com a papaína nas
concentrações de 2 e 4%.
Estudar a aplicação de adjuvantes técnicos para a manutenção da atividade proteolítica
da papaína em gel.
Estudar a estabilidade dos géis de papaína a 2 e 4 % que apresentem as melhores
resultados para a atividade proteolítica.
28
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias-primas e Reagentes
Ácido acético glacial – Reagen.
Água ultrapura Milli-Q®.
Carbopol® 940 – Viafarma.
Cloridrato de L-cisteína anidro – Viafarma.
Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-
CBZ-PHE-ARG-7-MCA), grau de pureza analítico – Sigma-Aldrich.
Dimetilsulfóxido (DMSO) – Sigma-Aldrich.
Etilenodiaminotetracetato (EDTA) dissódico – Farmos.
Fosfato de sódio dibásico anidro – Farmos.
Hidróxido de sódio pastilhas – Vetec.
Metilparabeno – Farmos.
Papaína 30.000 UI/mg, substância química de referência – Merck.
Papaína 6.000 UI/mg – Viafarma.
Propilenoglicol – Viafarma.
4.1.2 Equipamentos
Balança analítica – Gehaka AG 200.
Batedeira planetária – Skymsen BPS-05.
Leitor de fluorescência em microplacas – FLUOstar OPTIMA.
pHmetro – Schott Handylab 1.
29
Reômetro de disco oscilatório – Haake Mars, tipo cone-placa, acoplado ao cone
C35/2º TI (35 mm e 2 graus de inclinação).
Viscosímetro – Visco Basic Plus, Fungilab S.A., acoplado à haste R7.
4.2 Métodos
4.2.1 Preparação do gel de Carbopol® 940 para incorporação da papaína
Foram preparadas oito formulações de gel de Carbopol® 940, com variação na
concentração do polímero, nos valores de 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 e 2,0 %. A fórmula
do gel base é apresentada na Tabela 5.
Tabela 5. Formulação do gel base de Carbopol® 940.
Componentes Concentração (% p/p)
Carbopol® 940 0,60 – 2,00
Metilparabeno 0,10
Solução de NaOH 10% (p/v) q.s. pH 6,00
Água destilada q.s.p. 100,00
Em bécher de plástico, colocou-se aproximadamente 70% da água destilada. Foi
adicionado o metilparabeno e agitou-se. O Carbopol foi disperso na mistura anterior e deixado
em repouso por 24 horas. Após este período, a mistura foi agitada com espátula e adicionou-
se solução de hidróxido de sódio 10% até atingir pH 6,0. Acrescentou-se o volume restante de
água destilada e agitou-se até completa homogeneização. Em determinadas etapas do estudo
foi necessária a produção de géis de Carbopol em maiores quantidades, requerendo a
utilização de batedeira planetária para sua preparação.
30
4.2.2 Preparação dos géis de papaína a 2 e 4% para seleção do gel base mais adequado
A cada formulação de gel de Carbopol®, foi adicionada a papaína nas concentrações
de 2 e 4%, conforme descrito na Tabela 6, com finalidade de seleção do gel mais apropriado.
A todas as formulações, foram também acrescentados os adjuvantes técnicos EDTA
dissódico, cloridrato de cisteína anidro e propilenoglicol nas concentrações máximas
utilizadas no estudo, 0,08; 0,32; e 10%, respectivamente, para papaína 2%; e 0,16; 0,64 e
10%, respectivamente, para papaína 4%, com objetivo de estabelecer um limite mínimo de
Carbopol® que mantenha adequada a viscosidade do produto.
Cada formulação foi submetida à avaliação de alteração de viscosidade, através de
comparação visual com o gel base e entre as próprias.
Tabela 6. Formulações de géis de papaína a 2 e a 4% preparadas para seleção do gel base
mais adequado.
Concentração de Carbopol
® 940 (% p/p)
0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Concentração
de papaína
(% p/p)
2 P2C0,6 P2C0,8 P2C1,0 P2C1,2 P2C1,4 P2C1,6 P2C1,8 P2C2,0
4 P4C0,6 P4C0,8 P4C1,0 P4C1,2 P4C1,4 P4C1,6 P4C1,8 P4C2,0
As formulações que apresentaram menor perda de viscosidade foram submetidas à
avaliação de quatro voluntários da equipe de Enfermagem do Ambulatório de Feridas do
Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) para seleção da mais adequada à aplicação
clínica. O ensaio foi aprovado pelo Comitê de Ética, estando inserido no projeto
"Implementação e Avaliação de Ações Visando a Otimização da Assistência Farmacêutica",
coordenado pela Profª. Drª. Selma Rodrigues de Castilho, da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense (UFF) e financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Os géis foram dispensados em bisnagas de polietileno brancas, contendo 100 g cada.
As formulações foram aplicadas na região dorsal das mãos e avaliadas quanto à consistência e
31
à espalhabilidade. A formulação mais adequada é aquela que apresenta fácil aplicação e
remoção, porém não pode ser tão fluida que ultrapasse os limites da ferida.
4.2.3 Determinação da atividade proteolítica da papaína
A metodologia selecionada para realizar a medida da atividade proteolítica da papaína
baseia-se na espectrofluorimetria por método de microplacas, descrita por Pinto (2005).
Para esta técnica utiliza-se um substrato sintético, o cloridrato de carbobenzoxi-L-
fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA), para
quantificação da atividade da papaína. O método permite a determinação mesmo quando a
papaína está incorporada em formulações. A hidrólise do substrato, catalisada pela papaína,
libera um produto fluorescente, a 4-metilcumarina-7-amido, que é detectável em baixas
concentrações.
O experimento foi realizado no aparelho FLUOstar OPTIMA, um leitor de
fluorescência em microplacas, na Central Analítica do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal
Fluminense. Foram utilizados os filtros de excitação e emissão de 360 e 460 nm,
respectivamente. O ensaio enzimático foi realizado em microplaca de 96 poços
As soluções utilizadas foram:
1) Solução tampão de fosfato-cisteína
Pesaram-se 3,55 g de fosfato de sódio dibásico anidro e dissolveu-se em 400 mL de
água Milli-Q em balão volumétrico de 500 mL. Adicionou-se 7,00 g de EDTA dissódico e
2,74 g de cloridrato de cisteína anidro, completou-se o volume com água Milli-Q e agitou-se
até completa dissolução. O pH foi ajustado para 6,0 (± 0,1) com solução de hidróxido de
sódio 10%.
2) Solução do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA
Pesaram-se exatamente 25 mg do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA e solubilizou-
se em 37,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) em frasco de vidro âmbar. Transferiu-se uma
alíquota de 400 µL da solução anterior para um balão volumétrico de 25 mL. Completou-se o
volume com solução tampão de fosfato-cisteína e agitou-se até completa homogeneização.
32
3) Solução de ácido acético 30%
Transferiu-se 30 mL de ácido acético glacial para balão volumétrico de 100 mL,
completou-se o volume com água purificada e agitou-se até completa homogeneização.
Em cada poço da microplaca, foram adicionados: 55 µL da solução tampão, 125 µL da
solução do substrato, 20 µL de papaína (amostra ou padrão) ou formulação contendo ou não
papaína e 40 µL de solução de ácido acético 30% para interromper a reação.
Durante todo o preparo da microplaca, todas as soluções e a placa foram mantidas em
banho de gelo. Posteriormente, a placa foi colocada em incubação a 40ºC no próprio aparelho
por 45 minutos. A reação foi interrompida com solução de ácido acético 30% de 15 em 15
minutos, iniciando no tempo zero e terminando em 45 minutos. O experimento foi realizado
em triplicata.
O esquema da microplaca está representado na Figura 2. Os poços em cor cinza
representam a análise de uma amostra: as quatro linhas são referentes ao tempo de reação (0,
15, 30 e 45 minutos) e as três colunas, às repetições (triplicata).
Figura 2. Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra.
Foi construída uma curva com a média dos valores de fluorescência em função do
tempo de reação, onde se obteve a velocidade da reação (aumento de fluorescência por
33
minuto). Deste modo, foi feita a relação da velocidade do aumento de fluorescência em
função da concentração de papaína.
4.2.3.1 Validação da metodologia
4.2.3.1.1 Curva de calibração
Pesaram-se exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg e
transferiu-se para balão volumétrico de 250 mL. Completou-se volume com solução tampão
(item 4.2.3) e agitou-se até completa homogeneização.
Foram transferidas alíquotas de 180, 300, 600, 1200 e 1500 µL da solução anterior
para balões volumétricos de 100 mL. Adicionou-se solução tampão até completar volume e
homogeneizou-se.
As soluções foram analisadas segundo procedimento descrito no item 4.2.3. As
concentrações finais de papaína nos poços da microplaca são: 0,45; 0,75; 1,50; 3,00 e 3,75
UI/mL, respectivamente.
4.2.3.1.2 Precisão
Foi avaliada a precisão intra-corrida (repetibilidade) do ensaio, onde foi verificada a
concordância entre os resultados em um curto período de tempo, com o mesmo analista e
mesma instrumentação. Foram utilizadas soluções padrão de papaína 30.000 UI/mg nas
concentrações de 0,45; 1,50 e 3,75 UI/mL nos poços. Realizaram-se 10 determinações de cada
amostra no mesmo dia e calculou-se o coeficiente de variação pra elas, segundo a Equação 1.
Equação 1:
CV (%) = DP x 100
CMD
Onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD é a concentração
média determinada.
34
4.2.3.1.3 Exatidão
Segundo a Resolução nº 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
(BRASIL, 2003), a exatidão pode ser calculada como porcentagem de recuperação de uma
quantidade conhecida do analito adicionado à amostra.
Para este teste, foram preparadas as seguintes soluções:
1) Solução de papaína padrão 30.000 UI/mg
Foram pesadas exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg.
Transferiu-se para balão volumétrico de 250 mL e dissolveu-se em solução tampão, descrita
no item 4.2.3.
2) Solução da amostra
Foram pesadas quantidades de amostras equivalentes a 25 mg de papaína 6.000
UI/mg. As amostras utilizadas foram: papaína 2% em gel de Carbopol 1,4%, e papaína 4% em
gel de Carbopol 1,8%, sem adição de adjuvantes. Essas amostras foram dissolvidas em
solução tampão (item 4.2.3) em balão volumétrico de 250 mL.
Foram transferidas quantidades destas soluções para balões volumétricos de 25 mL,
conforme descrito na Tabela 7, e completou-se o volume com a mesma solução tampão. As
amostras foram, então, submetidas à análise descrita no item 4.2.3.
Tabela 7. Volumes utilizados das soluções das amostras e do padrão no teste de recuperação.
Balão
volumétrico
(25 mL)
Volume adicionado (µL)
Solução 1
(padrão)
Solução 2
(amostra)
1 150 -
2 150 75
3 - 75
35
A exatidão pode ser determinada através da Equação 2, descrita a seguir.
Equação 2:
Exatidão = CME x 100
CT
Onde, CME é a concentração média experimental e CT é a concentração teórica.
4.2.3.1.4 Especificidade
O teste de especificidade tem como objetivo avaliar se o método tem capacidade de
medir exatamente o composto na presença de outras substâncias (BRASIL, 2003). Com isso,
foi analisada a interferência dos excipientes da formulação na determinação da atividade da
papaína.
Foram avaliadas as formulações de gel de Carbopol 1,4 e 1,8%, e as mesmas
acrescidas dos adjuvantes técnicos nas maiores concentrações utilizadas no estudo, conforme
descrito na Tabela 8.
Tabela 8. Formulações avaliadas no teste de especificidade.
Componentes Concentração (% p/p)
1 2 3 4
EDTA dissódico - 0,08 - 0,16
Cloridrato de cisteína - 0,32 - 0,64
Propilenoglicol - 10 - 10
Gel de Carbopol 1,4% 100 q.s.p. 100 - -
Gel de Carbopol 1,8% - - 100 q.s.p. 100
Foram pesados exatamente 3,125 g de cada formulação em bécher de 20 mL. Diluiu-
se com aproximadamente 10 mL solução tampão (descrita no item 4.2.3), transferiu-se para
balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com solução tampão. Foram
36
transferidos 1000 µL dessa solução para balão volumétrico de 25 mL e completou-se o
volume com a solução tampão citada anteriormente. Dessa segunda solução, foram
transferidos 300 µL para balão volumétrico de 25 mL e completou-se o volume com a mesma
solução. Posteriormente, as amostras foram submetidas ao procedimento descrito no item
4.2.3.
4.2.3.1.5 Limites de detecção e quantificação
Foram feitas três curvas de calibração com soluções de papaína padrão secundário
30.000 UI/mg nas concentrações de 0,075; 0,225; 0,750; 1,500; 3,000 e 3,750 UI/mL em cada
poço. Foi seguido o procedimento conforme item 4.2.3.
Os limites foram calculados através da inclinação e da média da interseção de y das
curvas, utilizando as Equação 3 e Equação 4.
Equação 3:
LD = DPa x 3
IC
Onde, LD é o limite de detecção estimado, DPa é o desvio padrão da interseção com o
eixo y das 3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração.
Equação 4:
LQ = DPa x 10
IC
Onde, LQ é o limite de quantificação estimado, DPa é o desvio padrão da interseção
com o eixo y das 3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração.
4.2.4 Estudo de formulação
Foram preparadas 27 formulações para cada concentração de papaína, 2 e 4%, com
variações nas concentrações dos adjuvantes técnicos selecionados: EDTA dissódico,
37
cloridrato de cisteína e propilenoglicol. O planejamento do experimento foi realizado por um
desenho fatorial 33. As formulações estudadas estão apresentadas nas Tabela 9 e Tabela 10.
Tabela 9. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 2%.
Formulações
Componentes (% p/p)
Papaína
6.000 UI/mg
EDTA
dissódico
Cloridrato
de cisteína Propilenoglicol
Gel Carbopol®
940 1,4%
(q.s.p.)
P2-01 2,00 - - - 100,00
P2-02 2,00 - - 5,00 100,00
P2-03 2,00 - - 10,00 100,00
P2-04 2,00 - 0,16 - 100,00
P2-05 2,00 - 0,16 5,00 100,00
P2-06 2,00 - 0,16 10,00 100,00
P2-07 2,00 - 0,32 - 100,00
P2-08 2,00 - 0,32 5,00 100,00
P2-09 2,00 - 0,32 10,00 100,00
P2-10 2,00 0,04 - - 100,00
P2-11 2,00 0,04 - 5,00 100,00
P2-12 2,00 0,04 - 10,00 100,00
P2-13 2,00 0,04 0,16 - 100,00
P2-14 2,00 0,04 0,16 5,00 100,00
P2-15 2,00 0,04 0,16 10,00 100,00
P2-16 2,00 0,04 0,32 - 100,00
P2-17 2,00 0,04 0,32 5,00 100,00
P2-18 2,00 0,04 0,32 10,00 100,00
P2-19 2,00 0,08 - - 100,00
P2-20 2,00 0,08 - 5,00 100,00
P2-21 2,00 0,08 - 10,00 100,00
P2-22 2,00 0,08 0,16 - 100,00
P2-23 2,00 0,08 0,16 5,00 100,00
P2-24 2,00 0,08 0,16 10,00 100,00
P2-25 2,00 0,08 0,32 - 100,00
P2-26 2,00 0,08 0,32 5,00 100,00
P2-27 2,00 0,08 0,32 10,00 100,00
38
Tabela 10. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 4%.
Formulações
Componentes (% p/p)
Papaína
6.000 UI/mg
EDTA
dissódico
Cloridrato
de cisteína Propilenoglicol
Gel de
Carbopol® 940
1,8% (q.s.p.)
P4-01 4,00 - - - 100,00
P4-02 4,00 - - 5,00 100,00
P4-03 4,00 - - 10,00 100,00
P4-04 4,00 - 0,32 - 100,00
P4-05 4,00 - 0,32 5,00 100,00
P4-06 4,00 - 0,32 10,00 100,00
P4-07 4,00 - 0,64 - 100,00
P4-08 4,00 - 0,64 5,00 100,00
P4-09 4,00 - 0,64 10,00 100,00
P4-10 4,00 0,08 - - 100,00
P4-11 4,00 0,08 - 5,00 100,00
P4-12 4,00 0,08 - 10,00 100,00
P4-13 4,00 0,08 0,32 - 100,00
P4-14 4,00 0,08 0,32 5,00 100,00
P4-15 4,00 0,08 0,32 10,00 100,00
P4-16 4,00 0,08 0,64 - 100,00
P4-17 4,00 0,08 0,64 5,00 100,00
P4-18 4,00 0,08 0,64 10,00 100,00
P4-19 4,00 0,16 - - 100,00
P4-20 4,00 0,16 - 5,00 100,00
P4-21 4,00 0,16 - 10,00 100,00
P4-22 4,00 0,16 0,32 - 100,00
P4-23 4,00 0,16 0,32 5,00 100,00
P4-24 4,00 0,16 0,32 10,00 100,00
P4-25 4,00 0,16 0,64 - 100,00
P4-26 4,00 0,16 0,64 5,00 100,00
P4-27 4,00 0,16 0,64 10,00 100,00
Foram pesados os componentes sólidos (papaína, EDTA dissódico e cloridrato de
cisteína) e transferiu-se para gral de porcelana. Triturou-se e, quando presente na formulação,
adicionou-se o propilenoglicol. O gel de Carbopol (descrito na Tabela 5) foi adicionado aos
poucos, sob mistura com pistilo de porcelana, até completa homogeneização. Quando
necessário, foi feito o ajuste para valor de pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio 10%.
39
Preparou-se 30 g de cada formulação, que foram armazenadas em frascos plásticos
transparentes envoltos em papel alumínio, por 48 horas em temperatura de 5ºC ± 2ºC.
Posteriormente, as formulações foram submetidas ao teste de determinação da atividade
proteolítica da papaína, descrito no item 4.2.3, com objetivo de selecionar aquelas com
melhores resultados de atividade.
4.2.4.1 Estudo de superfície de resposta
A análise estatística dos resultados do estudo de formulação dos géis de papaína a 2 e
4% foi realizada no programa R (versão 2.14), utilizando o pacote RMS. Este pacote é usado
para o estudo de superfície de resposta, que é uma metodologia onde se visa explorar
condições de operação ótimas através de métodos experimentais (LENTH, 2009). Neste caso,
a análise foi realizada para a procura da melhor combinação de adjuvantes técnicos que
favoreça a atividade proteolítica da papaína em gel.
As variáveis foram codificadas utilizando a função “coded.data” do pacote RMS.
Tratando-se de um experimento de Composite Central Design (CCD) ou Delineamento
Composto Central (DCC), a codificação das variáveis foi feita conforme descrito na Tabela
11.
Tabela 11. Codificação das variáveis para o estudo de superfície de resposta, utilizando
pacote RMS do programa R.
Variável Codificação Exemplo
Propilenoglicol
x1 -1 0%
x2 0 5%
x3 1 10%
Legenda: x1 - variável no menor nível / x2 - variável no
nível médio / x3 - variável no maior nível.
O estudo avaliou a influência de cada adjuvante técnico na atividade proteolítica da
papaína em gel e a interação entre eles. Para ajuste dos modelos, foram utilizadas as funções
40
FO (first order), SO (second order) e TWI (two-way interactions). Foram obtidos gráficos das
curvas de contorno e das superfícies de resposta para a análise de variáveis dois a dois.
Após esta avaliação, foi selecionada uma formulação, aquela mais favorável à
atividade proteolítica, para cada concentração de papaína para o estudo de estabilidade
acelerada. Para o gel de papaína 2%, a formulação selecionada foi a P2-20. Já para o gel de
papaína 4%, foi proposta a formulação P4-28, através dos resultados do estudo de steepest
ascent from ridge ou “caminho mais íngreme até o valor máximo”, cuja composição está
apresentada na Tabela 12 (item 4.2.5).
4.2.5 Estudo de estabilidade acelerada
As formulações selecionadas de acordo com o descrito no item 4.2.4.1, P2-20 e P4-28,
foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerada. Com objetivo de comparar o efeito dos
adjuvantes técnicos utilizados, também foram submetidas ao estudo as formulações P2-01 e
P4-01, contendo apenas papaína e gel de Carbopol.
Tabela 12. Composição das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, selecionadas para o
estudo de estabilidade acelerada.
Componentes Concentração (% p/p)
P2-01 P2-20 P4-01 P4-28
Papaína 6.000 UI/mg 2,00 2,00 4,00 4,00
EDTA dissódico - 0,08 - 0,12
Cloridrato de cisteína - - - 0,05
Propilenoglicol - 5,00 - 3,58
Gel de Carbopol 1,8% q.s.p. 100 q.s.p. 100 q.s.p. 100 q.s.p. 100
4.2.5.1 Preparo das amostras
Foram pesados os componentes sólidos (papaína, EDTA dissódico e cloridrato de
cisteína) e transferidos para gral de porcelana para trituração. Adicionou-se o propilenoglicol,
quando presente na formulação. O gel de Carbopol foi adicionado aos poucos, sob mistura em
41
batedeira planetária, até completa homogeneização. Foi feito o ajuste para valor de pH igual a
6,0 com solução de hidróxido de sódio 10%, quando necessário. O gel foi fracionado em
porções de 100 g e acondicionado em bisnagas de polietileno brancas com 120 g de
capacidade.
4.2.5.2 Condições do estudo
As análises foram iniciadas após 48 horas do preparo, tempo necessário para
estabilização da formulação (CAPUCHO, 2007). Durante este tempo, as bisnagas foram
mantidas em refrigeração a 5ºC ± 2ºC, com objetivo de preservar as características da
papaína.
Após este prazo, as amostras foram acondicionadas em três diferentes temperaturas:
geladeira (5ºC ± 2ºC), ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC) (BRASIL, 2004;
BRASIL, 2005). As análises foram realizadas no tempo zero e nos 7, 15, 30 e 60º dias.
4.2.5.3 Características avaliadas
As formulações foram avaliadas quanto às características sensoriais (aspecto, cor e
odor), pH, viscosidade aparente, comportamento reológico e atividade proteolítica.
a) Características sensoriais
As características sensoriais (aspecto, cor e odor) foram avaliadas pelo mesmo
operador, de acordo com os parâmetros baseado nos descritos por Pinto (2005). Os
parâmetros utilizados estão na Tabela 13.
42
Tabela 13. Parâmetros de avaliação das características sensoriais das formulações.
Aspecto
Ho Homogêneo
He Heterogêneo, com presença de precipitados
Cor
I Incolor
LA Levemente amarelado
A Amarelado
A+ Cor amarela +
A++ Cor amarela ++
A+++ Cor amarela +++
A++++ Cor amarela ++++
A+++++ Cor amarela +++++
Odor
C Característico da papaína
LM Levemente modificado, indicando degradação da
papaína
M Modificado, caracterizando degradação da papaína
b) pH
A medida do pH foi realizada por potenciometria em pHmetro Schott Handylab 1. As
amostras foram retiradas do acondicionamento e analisadas após alcançarem a temperatura
ambiente.
c) Viscosidade aparente
A medida da viscosidade aparente foi realizada com o Viscosímetro Visco Basic Plus,
Fungilab S.A. Foi utilizado viscosímetro acoplado à haste R7. Cada amostra foi submetida à
avaliação da viscosidade aparente durante um intervalo de velocidade de 0,6 a 100 rpm,
realizada em triplicata. As análises foram realizadas em temperatura ambiente. As amostras
43
foram retiradas previamente das condições de armazenamento e deixadas em repouso até
alcançarem a temperatura desejada. Com os dados obtidos, foram feitos gráficos de
viscosidade (mPa.s) por velocidade (rpm).
d) Comportamento reológico
As formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 foram submetidas à caracterização do
comportamento reológico no tempo inicial do estudo de estabilidade acelerada. Foi utilizado
reômetro de disco oscilatório Haake Mars, tipo cone-placa, acoplado ao cone C35/2º TI (35
mm e 2 graus de inclinação). Esta analise foi realizada no Laboratório de Processamento e
Caracterização de Materiais Poliméricos (LAMAP), no Instituto Nacional de Tecnologia
(INT), sob a supervisão da Dr.ª Valéria Gonçalves Costa.
Os parâmetros de análise foram definidos através do software RheoWin 3. As análises
foram feitas a 25ºC, com tamanho da fenda (distância entre o cone e a placa) de 0,105 mm. O
tempo de análise foi definido em 120 segundos para a curva ascendente e 120 segundos para a
curva descendente, com leituras de 4 em 4 segundos, em um total de 60 leituras. A taxa de
cisalhamento foi estabelecida de 0 a 125 rpm (CORRÊA et al., 2005). As análises foram feitas
em triplicata.
Foram obtidas as curvas de fluxo (reogramas), a viscosidade aparente e a tixotropia
das formulações.
e) Atividade proteolítica
As amostras foram preparadas e analisadas de acordo com o descrito no item 4.2.3.1.4.
Foram preparadas três amostras para cada formulação avaliada, para cada temperatura de
armazenamento. A avaliação da atividade enzimática em microplaca foi realizada em
triplicata, conforme o esquema demonstrado na Figura 2.
4.2.6 Análise estatística
Os resultados foram avaliados quanto à estatística descritiva (média, desvio padrão,
erro padrão), através do programa Microsoft Office Excel 2007, e foram tratados através do
44
programa GraphPad InStat 3.00, sendo empregada a ANOVA de uma via, seguida pelo teste
de Student-Newman-Keuls para comparação entre os grupos de dados, adotando-se
significância de 5% (p<0.05).
45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Seleção do gel base de Carbopol® 940 para incorporação da papaína
O estudo da concentração de Carbopol® 940 necessária para a preparação dos géis de
papaína iniciou-se pela preparação de amostras nas duas concentrações de papaína, 2 e 4%,
com concentrações fixas de EDTA dissódico, cisteina e propilenoglicol, em géis onde a
concentração do agente gelificante encontrava-se entre 0,6 a 2,0% de Carbopol®. A papaína e
os adjuvantes foram adicionados a géis base previamente preparados. Observou-se que a
adição destes componentes resultava na perda da consistência do gel, podendo ocasionar sua
completa desorganização quando as preparações apresentavam concentrações menores de
1,0% de Carbopol®
940. As preparações que apresentavam aparência satisfatória foram
aquelas que possuíam 1,2 a 1,6% de Carbopol® 940 para a concentração de 2% de papaína e
1,8 a 2,0% de Carbopol® 940 para géis com 4% de papaína.
A consistência de um gel destinado a aplicação em feridas precisa atender às
expectativas dos profissionais que os administram durante a execução dos curativos diários
em pacientes com lesões. Considera-se necessário, portanto, a opinião de profissionais de
enfermagem que estivessem acostumados à prática destes procedimentos. Foi promovida uma
reunião com professores e profissionais de enfermagem do Ambulatório de Feridas do HUAP
para a eleição da formulação que apresentava a melhor consistência. Por consenso do grupo
de profissionais a melhor preparação deveria ser de fácil aplicação e remoção, mas que não
deve ser tão fluida que escorresse dos limites da ferida durante o período de ação do gel. A
consistência selecionada seria aquela que apresentava a viscosidade mínima para aceitação na
prática clínica.
As formulações P2C1,2; P2C1,4; P2C1,6; P4C1,8 e P4C2,0 foram encaminhadas para
a avaliação por parte da equipe de Enfermagem. A escolha dos enfermeiros do Ambulatório
de Feridas do HUAP, após análise sensorial, foi pelas formulações P2C1,4 e P4C1,8. Deste
modo, os estudos seguintes foram realizados com gel de Carbopol® 1,4% para papaína a 2%,
e gel de Carbopol® 1,8% para papaína a 4%.
46
5.2 Validação da metodologia de determinação da atividade proteolítica da papaína
5.2.1 Curva de calibração
Os resultados obtidos na curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg são
apresentados na Tabela 14 e na Figura 3.
Tabela 14. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão
secundário 30.000 UI/mg.
Concentração
(UI/mL)
Velocidade*
(unidades de fluorescência/minuto)
0,450 105,86 (±27,41)
0,750 201,80 (±27,56)
1,500 388,68 (±41,32)
3,000 978,31 (±64,08)
3,750 1259,30 (±55,79)
*Média de três determinações.
Figura 3. Curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg.
47
A partir da curva de calibração, foi obtida a Equação 5.
Equação 5:
y = 352,21x – 78,895 R2 = 0,9952
Onde, y é a velocidade do aumento de fluorescência por minuto, x é a concentração de
papaína em UI por mL e R2 é o coeficiente de correlação linear.
Segundo a Resolução nº 899 da ANVISA (BRASIL, 2003), linearidade é “a
capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são
diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado”. A análise dos dados mostra aumento proporcional entre a velocidade da reação
e a concentração de papaína padrão utilizada. O coeficiente de correlação linear (R2) igual a
0,9952 corresponde ao valor de coeficiente de correlação (R) igual a 0,9976, atendendo o
critério mínimo para aceitação de valor de R ≥ 0,99.
5.2.2 Precisão
Na Tabela 15, são apresentados os resultados da precisão intra-corrida obtidos da
análise das soluções de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg.
Pode-se considerar a precisão do método adequada, pois os valores dos coeficientes de
variação são menores do que 5%, valor máximo aceitável segundo a Resolução nº 899, da
ANVISA (BRASIL, 2003).
48
Tabela 15. Resultados obtidos da avaliação da precisão intra-corrida para
soluções de papaína padrão 0,450; 1,500; e 3,750 UI/mL.
Determinação
Concentração da solução padrão (UI/mL)
0,450 1,500 3,750
Concentração obtida (UI/mL)
1 0,5246 1,3275 3,7994
2 0,5238 1,3394 3,7852
3 0,5267 1,3415 3,7747
4 0,5263 1,3452 3,7665
5 0,5276 1,3697 3,7747
6 0,5272 1,3710 3,7705
7 0,5267 1,3727 3,7719
8 0,5269 1,3718 3,7725
9 0,5244 1,3744 3,7770
10 0,5228 1,3736 3,7725
Média 0,5257 1,3587 3,7765
DP* 0,0016 0,0171 0,0089
CV** (%) 0,30 1,26 0,24
*Desvio padrão **Coeficiente de variação
5.2.3 Exatidão
Os resultados obtidos no teste de recuperação das amostras de gel de papaína a 2 e a
4% estão na Tabela 16.
49
Tabela 16. Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras de gel de
Carbopol® 940.
Amostra
Quantidade de
padrão adicionado
(UI/mL)
Quantidade de
padrão recuperado
(UI/mL)
Exatidão
(%)
Papaína 2% em gel de
Carbopol 1,4% 1,5 1,4564 97,09
Papaína 4% em gel de
Carbopol 1,8% 1,5 1,4608 97,39
O método mostrou excelente taxa de recuperação da papaína em gel de Carbopol®
940, para ambas as concentrações estudadas. O resultado é semelhante ao obtido por Pinto
(2005), que obteve 96,7% de recuperação da papaína 0,8% em gel com este método,
mostrando que a exatidão do teste mantém-se mesmo para concentrações de papaína mais
altas.
A metodologia empregada no presente trabalho demonstra uma enorme vantagem em
relação à descrita por Capucho (2007), que utiliza o método espectrofotométrico e tem a
caseína como substrato. No trabalho citado, foram obtidos resultados com soluções de
papaína padrão, com recuperação média de 113 e 115%, para exatidão intra e interensaio,
respectivamente. Porém, quando o método espectrofotométrico foi aplicado à formulação de
papaína 1% em gel de Carbopol® 940, a taxa de recuperação da foi de apenas 8,96%.
5.2.4 Especificidade
Os resultados da avaliação da interferência dos excipientes na determinação da
atividade proteolítica da papaína estão na Tabela 17.
50
Tabela 17. Resultados experimentais da análise da interferência
de diversos excipientes na determinação da atividade da papaína
em gel de Carbopol® 940.
Unidades de fluorescência
Tempo de reação
(minutos)
Formulação
1 2 3 4
0 1165,33 1073,33 1247,33 1251,00
15 1059,33 1407,00 1514,00 1567,67
30 968,33 1065,67 1159,67 1385,67
45 1163,67 1272,00 1428,33 1244,33
A partir desses valores, foram feitos gráficos de unidades de fluorescência x tempo de
reação, onde verificou-se a não existência de linearidade nas reações analisadas, como
demonstrado abaixo (Figura 4 a Figura 7).
Figura 4. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 1,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).
51
Figura 5. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 2,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).
Figura 6. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 3,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).
52
Figura 7. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 4,
apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).
5.2.5 Limites de detecção e quantificação
Os resultados da análise dos limites de detecção e quantificação estão apresentados na
Tabela 18.
Tabela 18. Resultados obtidos para o cálculo dos limites de detecção e
quantificação da papaína pelo método de microplacas.
Curvas Interseção com o eixo y Inclinação da curva
(coeficiente angular)
1 -33,210 348,29
2 -48,472 362,01
3 -27,618 328,82
Média --- 346,37
Desvio padrão 10,7942 ---
53
Utilizando a Equação 3 e a Equação 4 (item 4.2.3.1.5), foram calculados os limites de
detecção e quantificação, com resultados de 0,094 e 0,312 UI/mL, respectivamente.
Esses valores demonstram que o método é bastante sensível, principalmente em
comparação com resultados do método espectrofluorimétrico utilizando a caseína como
substrato, que apresenta limite de detecção igual a 3420 UI/mL e limite de quantificação igual
a 10380 UI/mL (PINTO, 2005).
5.3 Estudo de formulação
O estabelecimento da composição dos géis analisados no estudo de formulação foi
baseado na formulação proposta por Capucho (2007), que avaliou o gel de papaína em
Carbopol® 940 constituído por: papaína - 1,00%; cloridrato de cisteína - 0,16%; solução de
EDTA 1% (p/v) - 4,00%; propilenoglicol - 5,00%; Nipaguard®
- 0,80%; Carbopol®
940 -
0,60%; solução de hidróxido de sódio 10% q.s. pH 6,5; e água destilada q.s.p. 100,00.
Foram utilizadas concentrações proporcionais dos adjuvantes técnicos em relação às
de papaína, estabelecendo assim o limite máximo de concentração do adjuvante utilizado no
desenho fatorial. A exceção foi o propilenoglicol que, por tratar-se de um líquido, seu uso em
altas concentrações afetaria extremamente a viscosidade do produto final. Assim, foram
utilizadas as mesmas concentrações de propilenoglicol tanto para os géis de papaína 2%
quanto os 4% (0, 5 e 10%).
A escolha do uso de EDTA dissódico e de cloridrato de cisteína justifica-se pelo
estudo anterior realizado por Capucho (2007) e pelas informações encontradas na literatura
sobre seu efeito na ativação e na proteção do sítio ativo da papaína (ARNON, 1970;
KIMMEL e SMITH, 1953; PINTO, 2005; SMITH, KIMMEL e BROWN, 1953). A escolha
do propilenoglicol, entretanto, é justificada pelas evidências encontradas em relatos
científicos de que substâncias polihidroxiladas aumentam a estabilidade da papaína (KILINÇ,
ONAL e TELEFONCU, 2001; SATISH, KUMAR e PRAKASH, 2007). O propilenoglicol é
comumente aplicado em formulações de géis hidrofílicos pelo seu efeito umectante e
escolheu-se estudar o seu efeito sobre atividade proteolítica.
54
5.3.1 Gel de papaína a 2%
Os resultados de atividade proteolítica dos géis submetidos ao estudo de formulação
para a papaína a 2% estão na Tabela 19. Foi realizada uma análise inicial dos resultados,
utilizando como parâmetro de comparação a formulação P2-01, preparação com papaína a 2%
que não possuía qualquer adjuvante técnico.
Tabela 19. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel
de papaína 2%.
Formulação
Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p) Atividade
proteolítica
(UI/mg)* EDTA dissódico
Cloridrato de
cisteína Propilenoglicol
P2-01 0 0 0 243,70
P2-02 0 0 5 238,71
P2-03 0 0 10 203,75
P2-04 0 0,16 0 230,26
P2-05 0 0,16 5 226,70
P2-06 0 0,16 10 246,66
P2-07 0 0,32 0 216,06
P2-08 0 0,32 5 218,42
P2-09 0 0,32 10 226,53
P2-10 0,04 0 0 211,35
P2-11 0,04 0 5 244,80
P2-12 0,04 0 10 222,67
P2-13 0,04 0,16 0 249,82
P2-14 0,04 0,16 5 234,38
P2-15 0,04 0,16 10 234,46
P2-16 0,04 0,32 0 224,59
P2-17 0,04 0,32 5 214,81
P2-18 0,04 0,32 10 212,97
P2-19 0,08 0 0 244,65
P2-20 0,08 0 5 233,15
P2-21 0,08 0 10 264,86
P2-22 0,08 0,16 0 217,65
P2-23 0,08 0,16 5 202,70
P2-24 0,08 0,16 10 210,13
P2-25 0,08 0,32 0 210,31
P2-26 0,08 0,32 5 225,90
P2-27 0,08 0,32 10 223,20
*Média de três determinações.
55
À primeira vista, observou-se a diminuição da atividade proteolítica em formulações
onde o único adjuvante técnico é o propilenoglicol. Este fenômeno é percebido nas
formulações P2-02 e P2-03, onde a atividade reduz quando comparado a P2-01, sendo que a
redução vista na última é altamente significativa (p<0,001).
Verificou-se também efeito negativo na atividade proteolítica para o cloridrato de
cisteína, podendo ser proporcional à concentração (P2-04 e P2-07). Foi possível conferir este
efeito na análise das formulações P2-13 e P2-16, um conjunto que varia na concentração de
cisteína, mas mantém fixos os outros parâmetros. Neste caso, houve uma diminuição
significativa da atividade enzimática (p<0,01).
Em relação ao uso do EDTA dissódico, porém, não foi possível observar um padrão de
comportamento; na menor concentração estudada (P2-10), notou-se uma queda na atividade
proteolítica (p<0,001), enquanto para a concentração mais alta (P2-19), verificou-se apenas
uma manutenção da atividade em relação à formulação P2-01 (p>0,05). Entretanto, quando
foi avaliado o conjunto de formulações P2-13 e P2-22, que diferem entre si pela concentração
de EDTA e mantém fixos os outros parâmetros, observou-se uma queda da atividade
proteolítica (p<0,001) relacionada ao aumento deste adjuvante.
Para melhor interpretação dos dados, os resultados foram submetidos a um tratamento
estatístico no programa R, com auxílio do pacote RMS. As formulações foram planejadas por
um desenho fatorial 33 e os resultados foram submetidos ao estudo de superfície de resposta.
O experimento planejado pode ser classificado como um Composite Central Design
(CCD) ou Delineamento Composto Central (DCC). O DCC é um dos mais populares
delineamentos para o estudo de superfície de resposta e é considerado ótimo. Ele apresenta
características interessantes na busca do ponto ótimo (aquele onde se encontra a melhor
resposta), como a necessidade de um número menor de tratamentos em relação aos fatoriais
completos e a capacidade de ser realizado sequencialmente, caminhando no sentido de
otimização do sistema, através da técnica de steepest ascent from ridge ou “caminho mais
íngreme até o valor máximo”. Esta técnica consiste em encontrar a região que contém o ótimo
e comparar o delineamento nesta área, de forma a chegar à combinação ótima, que maximize
os resultados do sistema (LENTH, 2009; MATEUS, BARBIN e CONAGIN, 2001; WANG,
2006).
56
Para verificar corretamente a influência de cada variável, é necessário que elas sejam
codificadas. Este é um fator imprescindível em um estudo de superfície de resposta, pois pode
alterar os resultados da análise de steepest ascent from ridge. É necessário utilizar um método
de codificação que faça com que todas as variáveis codificadas do experimento oscilem
dentro de uma mesma escala, para proporcionar a cada uma delas a mesma potência na
determinação do steepest ascent from ridge; ou seja, se os fatores não estiverem na mesma
escala, o resultado de steepest ascent from ridge obtido do ajuste do modelo dos valores
brutos será diferente daquele dos valores codificados. Os valores codificados podem,
posteriormente, ser decodificados e relacionados aos valores iniciais (LENTH, 2009).
No DCC, há um ponto central com a mesma distância para os outros pontos de análise;
por exemplo, as concentrações de propilenoglicol utilizadas (0, 5 e 10%), onde 5% é o ponto
central, que se distancia das concentrações extremas na mesma proporção. Deste modo, foi
utilizada a codificação de -1, 0, 1 para as variáveis, como se observa nos eixos “x” dos
gráficos das curvas de contorno e de superfície de resposta, apresentados nas Figura 8, 9, 10 e
Figura 11.
A análise das variáveis foi realizada em combinação dois a dois (EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína, EDTA dissódico x propilenoglicol e cloridrato de cisteína x
propilenoglicol), onde foi possível verificar a interferência de cada adjuvante técnico e de
suas combinações na atividade proteolítica da papaína.
Nas formulações de gel de papaína a 2%, o parâmetro que apresentou maior
significância foi o cloridrato de cisteína. A presença dele influencia efetivamente a atividade
proteolítica do gel, produzindo um efeito negativo sobre ela. Não foram detectadas interações
significativas entre os adjuvantes técnicos.
Os resultados foram ajustados por uma função de 1ª ordem (FO), apresentando relação
linear. A função de 2ª ordem (SO) e as interações (TWI) não apresentaram significância, com
coeficiente de correlação (R2) igual a 0,2079. Isto significa que apenas 20,79% dos casos
poderiam ser explicados pelo modelo que inclui SO e TWI, o que o torna não aplicável.
As curvas de contorno pra o modelo do gel de papaína 2% são apresentadas na Figura
8.
A primeira curva de contorno (EDTA dissódico x cloridrato de cisteína – Figura 8a)
mostra que a atividade proteolítica do gel aumenta com o aumento do EDTA dissódico e a
57
diminuição do cloridrato de cisteína, com uma contribuição muito maior da cisteína para o
resultado.
Na segunda curva (EDTA dissódico x propilenoglicol – Figura 8b), verificamos a
ausência de interação entre os adjuvantes; ao fixar a concentração de um deles, pouca
alteração na atividade se observa.
Com a terceira curva (cloridrato de cisteína x propilenoglicol – Figura 8c), é possível
confirmar a influência majoritária da cisteína na atividade do gel, onde sua diminuição
favorece-a. Quanto ao propilenoglicol, pode-se novamente verificar a ausência de sua
influência no resultado.
Na Figura 9, são apresentados os gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína
a 2%. Novamente, é possível observar a grande contribuição da presença de cisteína para a
queda da atividade proteolítica (Figura 9a e c). No entanto, o aumento da concentração de
EDTA mostra uma melhora na atividade do gel (Figura 9a e b), enquanto os resultados do
propilenoglicol reforçam sua ausência de efeito (Figura 9b e c).
Não foi possível definir um ponto ótimo, onde a combinação dos adjuvantes indicasse
uma atividade proteolítica máxima, devido à característica do modelo de atender a uma
função de 1ª ordem. Para realização do teste de steepest ascent from ridge, é necessário que o
modelo proposto obedeça a uma função de 2ª ordem.
Deste modo, analisando os resultados anteriormente apresentados, foi determinada a
formulação P2-20 como escolha para o estudo de estabilidade acelerada. Esta formulação foi
selecionada por apresentar a concentração máxima de EDTA dissódico utilizada no estudo e a
ausência de cloridrato de cisteína, que demonstraram ter efeitos positivo e negativo,
respectivamente, sobre a atividade proteolítica da papaína em gel na concentração de 2%.
Como o propilenoglicol não apresentou influência na atividade, foi selecionada a
concentração de 5%, quantidade usual para sua função de agente umectante em géis
(BRASIL, 2011; FERREIRA, 2008).
É essencial ressaltar, entretanto, que a influência de cada adjuvante técnico foi
avaliada somente 48 horas após o preparo dos géis. Deste modo, os resultados indicam a
natureza da influência de cada um deles no momento inicial do estudo, com pouco tempo de
preparo, e não como se comportarão ao longo de um período maior.
58
Figura 8. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol.
59
Figura 9. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol.
60
5.3.2 Gel de papaína a 4%
Os resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína a
4% são mostrados na Tabela 20. Assim como no estudo de formulação dos géis de papaína
2%, foi feita uma análise simples, através da comparação dos valores de atividade obtidos, em
relação à formulação P4-01, que não apresenta adição de adjuvante técnico.
Tabela 20. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel
de papaína 4%.
Formulação
Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p) Atividade proteolítica
(UI/mg)* EDTA
dissódico
Cloridrato de
cisteína Propilenoglicol
P4-01 0 0 0 358,00
P4-02 0 0 5 344,02
P4-03 0 0 10 298,35
P4-04 0 0,32 0 279,46
P4-05 0 0,32 5 299,37
P4-06 0 0,32 10 322,57
P4-07 0 0,64 0 262,17
P4-08 0 0,64 5 260,71
P4-09 0 0,64 10 273,35
P4-10 0,08 0 0 347,23
P4-11 0,08 0 5 323,20
P4-12 0,08 0 10 309,53
P4-13 0,08 0,32 0 319,54
P4-14 0,08 0,32 5 279,71
P4-15 0,08 0,32 10 270,88
P4-16 0,08 0,64 0 260,07
P4-17 0,08 0,64 5 271,23
P4-18 0,08 0,64 10 223,73
P4-19 0,16 0 0 423,38
P4-20 0,16 0 5 377,91
P4-21 0,16 0 10 403,81
P4-22 0,16 0,32 0 333,25
P4-23 0,16 0,32 5 280,86
P4-24 0,16 0,32 10 247,09
P4-25 0,16 0,64 0 287,88
P4-26 0,16 0,64 5 250,67
P4-27 0,16 0,64 10 277,84
*Média de três determinações.
61
Em relação ao propilenoglicol, avaliando as formulações P4-02 e P4-03, foi possível
observar o mesmo comportamento relatado para os géis de papaína a 2%, havendo maior
diminuição da atividade proteolítica com a maior concentração do adjuvante (p<0,01).
A presença do cloridrato de cisteína mostrou efeito negativo, assim como para as
formulações de papaína a 2%. Foi observada a diminuição da atividade nas formulações
avaliadas P4-04 (p<0,001) e P4-07 (p<0,001), porém esta não foi proporcional à concentração
da cisteína, com redução de 21,94 e 26,77%, respectivamente. A tendência pode ser verificada
também quando avaliamos dois conjuntos P4-13 e P4-16 (p<0,05), e P4-22 e P4-25 (p<0,05),
que variam na concentração de cisteína e mantém fixos os outros valores. Nota-se que ocorre
diminuição na atividade com o aumento do adjuvante, tanto entre eles, quanto em relação à
formulação P4-01.
A análise das curvas de contorno e das superfícies de resposta do gel de papaína a 4%
(Figura 10 e Figura 11) demonstra um aumento da atividade proteolítica com o aumento da
concentração de EDTA (Figura 10a e b; e Figura 11a e b) e com a diminuição da
concentração de cisteína (Figura 10a e c; e Figura 11a e c), conforme também foi observado
para o gel de papaína a 2%. Neste caso, o propilenoglicol apresentou efeito na atividade,
principalmente pela sua interação com o EDTA dissódico, que podemos observar nas Figura
10b e Figura 11b. Essa interação se mostra mais efetiva em concentrações altas de EDTA e
concentrações baixas de propilenoglicol. Já em relação à cisteína, observa-se que a influência
do propilenoglicol é insignificante.
62
Figura 10. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol.
63
Figura 11. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 4% - (a) EDTA dissódico x
cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x
propilenoglicol.
64
Como o ajuste do modelo para os géis de papaína 4% foi feito através de uma função
de 2ª ordem, tornou-se possível aplicar o teste de steepest ascent from ridge. Os resultados
encontram-se na Tabela 21.
Tabela 21. Resultados do teste de steepest ascent from ridge do gel de papaína a 4%.
Distância
Valores codificados Valores decodificados
ŷ x1 x2 x3
EDTA
dissódico*
Cloridrato de
cisteína* Propilenoglicol*
1 0,00 0,000 0,000 0,000 0,08000 0,32000 5,000 274,260
2 0,50 0,181 -0,444 -0,141 0,09488 0,17792 4,295 304,056
3 1,00 0,463 -0,840 -0,283 0,11704 0,05120 3,585 346,046
Legenda: x1 - EDTA dissódico / x2 - cloridrato de cisteína / x3 - propilenoglicol / ŷ - valor estimado da atividade
proteolítica da papaína em gel (UI/mg). * Resultados expressos em % (p/p).
Deste modo, com indicação estimada de um ponto ótimo de resposta, foi proposta a
formulação P4-28 para o estudo de estabilidade acelerada, contendo os adjuvantes técnicos
nas seguintes concentrações: EDTA dissódico 0,12%; cloridrato de cisteína 0,05%; e
propilenoglicol 3,58%.
5.4 Estudo de estabilidade acelerada
Foram selecionadas quatro formulações para o estudo de estabilidade acelerada: P2-
01, P2-20, P4-01 e P4-28 (Tabela 22). As amostras foram submetidas ao estudo de
estabilidade acelerada de 60 (sessenta) dias, sob as condições descritas no item 4.2.5.2. Os
resultados das avaliações realizadas estão descritos a seguir.
65
Tabela 22. Composição das formulações de gel de papaína selecionadas para o
estudo de estabilidade acelerada.
Formulação
Concentração de
papaína (% p/p)
Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p)
EDTA
dissódico
Cloridrato de
cisteína Propilenoglicol
P2-01 2 0,00 0,00 0,00
P2-20 2 0,08 0,00 5,00
P4-01 4 0,00 0,00 0,00
P4-28 4 0,12 0,05 3,58
5.4.1 Caracterização dos géis de papaína no tempo zero do estudo de estabilidade
acelerada
As formulações foram preparadas e acondicionadas em geladeira (5ºC ± 2ºC) por 48
horas, tempo necessário para estabilização da formulação, descrito por Capucho (2007). Após
este prazo, foram realizadas as análises no chamado tempo zero.
5.4.1.1 Características sensoriais
As formulações foram avaliadas em seu aspecto, cor e odor. Os resultados são
apresentados na Tabela 23. Todas as formulações apresentaram aspecto heterogêneo, ausência
de cor e odor característico da papaína.
Tabela 23. Avaliação das características sensoriais das
formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.
Característica Formulação
P2-01 P2-20 P4-01 P4-28
Aspecto He He He He
Cor I I I I
Odor C C C C
Legenda: He – heterogêneo / I – incolor / C – característico.
66
O aspecto heterogêneo dos géis desenvolvidos (Figura 12), caracterizado pela presença
de precipitados brancos, deve-se à papaína. Segundo Arnon (1970), a papaína apresenta
solubilidade em água igual a 10 mg/mL. A quantidade da enzima utilizada nas formulações é
superior a esta concentração, tornando sua solubilidade no meio apenas parcial. Foi descrito
por Pinto (2005), durante sua avaliação de estabilidade, um gel de papaína homogêneo e
transparente; esta formulação, porém, utilizava uma concentração de apenas 0,8% de papaína,
quantidade que atende à solubilidade citada anteriormente. Já Capucho (2007), na avaliação
prévia de suas formulações de géis de papaína com diferentes polímeros, descreve géis
opacos, levemente amarelados. Nos seus estudos, foi utilizada papaína a 1%, concentração
levemente acima da solubilidade da enzima, considerando o conteúdo total de água na
formulação. Ela realizou um estudo de uniformidade de conteúdo através da análise de dez
alíquotas de 1,0 g da formulação, obtendo coeficiente de variação igual a 4,96% e,
confirmando assim, a homogeneidade do princípio ativo no produto.
Avaliando isso, a formulação de papaína na forma farmacêutica gel apresenta uma
limitação de concentração, uma vez que um gel de característica heterogênea pode acarretar
em instabilidade da formulação e falta de precisão na dose administrada. Os géis de papaína,
entretanto, são amplamente utilizados para o tratamento de feridas (FERREIRA, 2005),
estando inclusive descritos no Formulário Nacional da Farmacopéia Brasileira em
concentrações de papaína que variam de 2 a 10%, alcançando valores muito superiores aos
utilizados neste estudo e, portanto, com maior tendência à separação de fases. Deste modo,
apesar da característica heterogênea descrita, optou-se por continuar os experimentos com as
formulações selecionadas.
67
Figura 12. Fotografias das formulações no tempo zero de análise - (a) P2-01; (b) P2-20; (c)
P4-01; (d) P4-28.
5.4.1.2 pH
A avaliação do pH das quatro formulações está na Tabela 24. Observa-se uma queda
dos valores de pH quando a concentração de papaína aumenta (formulações P4-01 e P4-28),
considerando seu pH levemente ácido. Também é possível notar um valor inferior para a
formulação P4-28, devido ao fato de ser a única que possui o cloridrato de cisteína na sua
composição; o cloridrato de cisteína anidro utilizado no estudo apresenta pH entre 1,5 e 2,0,
de acordo com o laudo do fabricante.
Tabela 24. Valores de pH das formulações P2-01, P2-
20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.
Formulação Valor de pH
P2-01 6,44
P2-20 6,48
P4-01 6,21
P4-28 6,10
68
5.4.1.3 Viscosidade aparente
As quatro formulações foram analisadas quanto às suas viscosidades aparentes, em
intervalo de velocidade de 0,6 a 100 rpm utilizando um viscosímetro tipo Brookfield. Os
resultados estão na Tabela 25 e na Figura 13. Para efeito de comparação, foram selecionados
os valores de viscosidade na velocidade de 100 rpm, pois estes apresentaram um percentual de
torque do aparelho mais próximo a 50%, o que possibilita uma melhor precisão na medida.
Tabela 25. Resultados da análise de viscosidade aparente das
formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.
Velocidade
(rpm)
Formulação
P2-01 P2-20 P4-01 P4-28
Viscosidade (mPa.s)*
0,6 815.673 (±127.148) 1.371.952 (±93.368) 1.899.618 (±185.360) 1.395.425 (±166.446)
1 658.683 (±81.728) 935.426 (±61.396) 1.276.980 (±61.395) 1.011.623 (±59.527)
1,5 521.756 (±53.286) 669.623 (±41.869) 902.013 (±41.687) 716.728 (±40.729)
2 431.130 (±38.681) 528.693 (±33.881) 703.522 (±32.513) 558.118 (±31.908)
2,5 365.745 (±29.037) 437.123 (±24.894) 577.945 (±27.738) 460.882 (±28.178)
3 319.793 (±23.098) 373.713 (±21.717) 495.577 (±23.054) 394.351 (±22.014)
4 257.565 (±15.333) 294.060 (±17.162) 389.912 (±18.056) 307.531 (±16.348)
5 216.127 (±10.462) 242.069 (±15.661) 322.688 (±15.538) 253.222 (±13.928)
6 187.666 (±8.805) 209.272 (±12.647) 276.683 (±14.002) 215.827 (±12.569)
10 125.202 (±6.427) 138.068 (±8.068) 182.313 (±9.836) 141.194 (±8.979)
12 108.638 (±5.269) 118.542 (±7.515) 156.983 (±8.677) 121.792 (±8.193)
20 73.186 (±3.346) 79.781 (±3.390) 104.289 (±6.385) 80.812 (±5.763)
30 53.297 (±2.295) 58.073 (±2.141) 75.847 (±4.954) 58.315 (±4.494)
50 36.214 (±1.973) 39.247 (±1.415) 50.829 (±3.829) 39.072 (±3.249)
60 31.315 (±2.013) 34.239 (±1.193) 44.717 (±2.627) 33.777 (±2.713)
100 21.559 (±1.460) 23.395 (±877) 30.341 (±1.924) 23.226 (±1.946)
*Média de três determinações.
69
Dentre os géis de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, não foi possível observar diferença
significativa (p>0,05) entre os valores de viscosidade. Já nos géis de papaína 4%, P4-01 e P4-
28, a segunda formulação apresentou uma viscosidade significativamente inferior (p<0,01),
que pode ser justificada pela presença do cloridrato de cisteína. Como relatado no item
5.4.1.2, a cisteína apresenta pH extremamente ácido, o que influencia diretamente na
formação da estrutura polimérica do gel. Segundo Ferreira (2008), o máximo de viscosidade e
transparência nos géis de Carbopol é alcançado em pH igual a 7,0; porém, aceitáveis
viscosidade e transparência iniciam em pH 4,5 a 5,0 e estendem-se até pH 11,0. Isto ocorre
devido à mudança estrutural dos polímeros de Carbopol frente ao uso de alcalinizante, que
ocorre pela neutralização dos seus grupos carboxilas, levando a uma distensão das moléculas.
Apesar de também apresentar propilenoglicol em sua composição, que levaria a um aumento
da viscosidade, o efeito negativo da cisteína sobre ela predominou, resultando em valores
comparáveis aos dos géis de papaína a 2%, que apresentam cerca de 20% a menos de
polímero.
Figura 13. Gráfico de viscosidade aparente x velocidade das formulações P2-01,
P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.
70
Como visto na Figura 13, todos os géis apresentaram comportamento pseudoplástico,
onde a viscosidade aparente diminui gradualmente, à medida que aumenta a velocidade de
cisalhamento. Portanto, eles atendem ao comportamento mais comum e desejável para uma
formulação semi-sólida de uso externo, necessário para que o produto espalhe facilmente
sobre a pele, porém não escorra (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON,
2005).
5.4.1.4 Comportamento reológico
Foram obtidos os reogramas das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, que se
encontram na Figura 14 a Figura 17. Os resultados de viscosidade aparente e tixotropia estão
demonstrados na Tabela 26.
Pode-se observar nos reogramas das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 que não
existe uma relação linear entre a tensão de cisalhamento e a taxa de cisalhamento,
caracterizando as mesmas como fluidos não-newtoniano. Nota-se também, confirmando os
resultados mostrados no item 5.4.1.3, o comportamento pseudoplástico de todas as
formulações.
Figura 14. Reograma da formulação P2-01 no tempo zero de análise.
71
Figura 15. Reograma da formulação P2-20 no tempo zero de análise.
Figura 16. Reograma da formulação P4-01 no tempo zero de análise.
72
Figura 17. Reograma da formulação P4-28 no tempo zero de análise.
Tabela 26. Valores referentes à viscosidade aparente (no ponto de máximo gradiente de
cisalhamento) e tixotropia para as formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28.
Formulação Viscosidade
aparente* (Pa.s)
Tixotropia*
(Pa/s)
P2-01 2,11 (±0,04) 1205,53 (±497,91)
P2-20 2,18 (±0,02) 3088,33 (±698,62)
P4-01 2,56 (±0,02) 8282,00 (±580,53)
P4-28 2,37 (±0,03) 3687,67 (±341,53)
*Média de três determinações.
Os reogramas mostram ainda que todas as formulações analisadas apresentam
tixotropia, que é característica de fluidos pseudoplásticos (FERREIRA, 2008; GASPAR e
MAIA CAMPOS, 2003). Segundo BORGHETTI e KNORST (2006), a tixotropia pode ser
caracterizada quando, em ciclos de velocidades de cisalhamento crescentes-decrescentes, o
braço descendente da curva é deslocado para posição inferior. Ela indica o desmonte da
estrutura tridimensional do sistema, tornando o produto mais fluido quando submetido à
pressão externa.
Através da análise dos reogramas, observamos que o referente à formulação P4-01
apresenta maior tixotropia, enquanto o da formulação P2-01 apresenta a menor. A constatação
73
visual confirma-se pelos valores na Tabela 26. A formulação P4-01 possui a maior
viscosidade aparente, o que resulta em um retorno mais lento à sua estrutura original,
conforme se diminui o cisalhamento. O oposto ocorre para a formulação P2-01, que tem a
menor viscosidade aparente, que recupera sua estrutura mais rapidamente.
Os resultados da viscosidade aparente das formulações foram semelhantes aos
apresentados no item 5.4.1.3, com exceção da formulação P4-01, que mostrou valor menor
que na análise anterior; diferença esta causada, provavelmente, pelo tipo de aparelho utilizado
em cada estudo.
5.4.1.5 Atividade proteolítica
Os valores da atividade proteolítica inicial das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-
28 estão representados na Tabela 27.
Tabela 27. Valores da atividade proteolítica das formulações
P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.
Formulação Atividade proteolítica
(UI/mg)*
P2-01 240,72 (±1,35)
P2-20 243,66 (±2,80)
P4-01 334,72 (±2,87)
P4-28 453,00 (±22,86)
*Média de três determinações.
As formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, não apresentaram diferença
significativa entre si quanto à atividade proteolítica (p>0,05). Os resultados também foram
semelhantes aos obtidos no estudo de formulação (item 5.3.1). Neste caso, o uso de
adjuvantes técnicos não mostrou ser vantajoso em relação à formulação somente com o
princípio ativo, considerando apenas a análise no tempo zero de estudo.
Em relação aos géis de papaína a 4%, observa-se uma diferença significativa entre os
valores de atividade obtidos (p<0,001). Com a proposta da formulação P4-28, proveniente do
74
estudo de superfície de resposta (item 5.3.2), foi possível intensificar a atividade proteolítica
do gel em, aproximadamente, 135% em relação à formulação sem adição de adjuvantes
técnicos (P4-01). O resultado, inclusive, superou a expectativa criada pela análise de “steepest
ascent from ridge”, que indicou um resultado estimado da atividade proteolítica para a
formulação proposta igual a 346,046 UI/mg. Foi demonstrada, então, a eficiência do uso dos
adjuvantes técnicos no aumento da atividade proteolítica do gel de papaína a 4%, quando
considerado o tempo inicial de análise.
A comparação entre os géis de papaína a 2 e a 4% sem acréscimo de adjuvantes (P2-
01 e P4-01) nos mostra que a atividade proteolítica não aumenta proporcionalmente em
relação à concentração da papaína 6.000 UI/mg na formulação.
5.4.2 Avaliação das características sensoriais durante 60 dias de armazenamento dos
géis
Os resultados da avaliação das características sensoriais das formulações estudadas
estão representados na Tabela 28 a Tabela 31.
Tabela 28. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-01 em 60 dias.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
Aspecto He He He He He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho
Cor I I I I I I LA LA LA LA LA A A
Odor C C C C LM C LM LM LM C LM LM LM
Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / C –
característico / LM – levemente modificado.
75
Tabela 29. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-20 em 60 dias.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
Aspecto He He He He He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho
Cor I I I I I I LA LA LA LA LA A A
Odor C C C C LM C LM LM LM C LM LM M
Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / C –
característico / LM – levemente modificado.
Os géis de papaína a 2%, quando acondicionados a 5ºC ± 2ºC, apresentaram alteração
somente no odor após 60 dias de armazenamento. Os géis acondicionados a 26ºC ± 2ºC
sofreram alterações a partir do 15º dia de armazenamento, com modificações na cor e no odor.
Já naqueles acondicionados a 45ºC ± 2ºC, foram observadas alterações desde o 7º dia de
armazenamento na cor, e do 15º dia no odor. O comportamento entre eles foi semelhante,
exceto por uma alteração de odor mais intensificada na formulação P2-20 no 60º dia, quando
acondicionada a 45ºC ± 2ºC.
Foi observado que os géis acondicionados em temperaturas mais altas, 26ºC ± 2ºC e
45ºC ± 2ºC, apresentaram aspecto homogêneo, com ausência dos precipitados brancos
notados naqueles armazenados em geladeira (5ºC ± 2ºC). Sugere-se que, com o aumento da
temperatura, aumenta-se a solubilidade da papaína no meio, possibilitando sua total dispersão
no gel.
O aspecto dos géis P2-01 e P2-20 podem ser visualizados na Figura 18.
76
Figura 18. Fotografias das formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, entre
os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ±
2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC).
77
Tabela 30. Avaliação das características sensoriais da formulação P4-01 em 60 dias.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
Aspecto He He He He He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho
Cor I I I LA A A A A+ A+ A+ A+ A++ A+++
Odor C C C LM LM LM LM LM M LM LM LM M
Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / A+ –
cor amarela + / A++ – cor amarela ++ / A+++ – cor amarela +++ / C – característico / LM – levemente
modificado / M - modificado.
Tabela 31. Avaliação das características sensoriais da formulação P4-28 em 60 dias.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
Aspecto He He He He He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho
Cor I I I LA A A+ A++ A++ A++ A+++ A+++ A++++ A+++++
Odor C C LM LM LM LM LM M M LM M M M
Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / A+ –
cor amarela + / A++ – cor amarela ++ / A+++ – cor amarela +++ / A++++ – cor amarela ++++ / A+++++ – cor
amarela +++++ / C – característico / LM – levemente modificado / M - modificado.
Para os géis de papaína a 4%, observou-se o início das alterações nas características
sensoriais em prazo inferior aos géis de papaína a 2%. Mesmo com acondicionamento a 5ºC ±
2ºC, a formulação P4-28 apresentou alteração no odor no 15º dia de armazenamento,
enquanto a P4-01 teve alterações na cor e no odor no 30º dia. As evidentes alterações no odor
dos géis P4-28 podem estar relacionadas à presença do cloridrato de cisteína, que possui um
cheiro característico forte, semelhante ao enxofre.
Ambas as formulações, quando acondicionadas em temperatura ambiente e estufa
(26ºC ± 2ºC e 45ºC ± 2ºC, respectivamente), mostraram alterações na cor e no odor desde o 7º
dia de armazenamento, sendo as das acondicionadas em estufa mais intensas.
78
Em comparação com a formulação P4-01, as modificações ocorridas na formulação
P4-28 foram mais intensas em todas as temperaturas de acondicionamento, tanto para o
parâmetro cor quanto odor. A intensa modificação da coloração pode ser constatada na Figura
19. Este fato pode ser atribuído à presença do cloridrato de cisteína, utilizado também pela sua
função antioxidante na formulação. A cisteína é um antioxidante que atua por mecanismo
preventivo, ou seja, interfere na iniciação da reação radicalar em cadeia (BERNARDI, 2007;
CARDOSO, 1996; FERREIRA, 2008). Em presença de ar ou em solução aquosa alcalina ou
neutra, ela sofre processo de oxidação, convertendo-se em cistina (MENDES, 2008). O pH
dos géis, próximo ao neutro, além da presença de ar no interior das bisnagas pode ter
influenciado no processo de oxidação da cisteína. Deve-se também considerar o fator
temperatura, que potencializou as alterações sensoriais das formulações, principalmente
daquela contendo cisteína. Portanto, mesmo sofrendo maiores alterações na cor e no odor e
indicando maiores percentuais de perda de atividade (ver item 5.4.5), os géis P4-28
apresentaram valores superiores de atividade proteolítica em relação aos géis P4-01.
Assim como para os géis de papaína a 2%, quando armazenados a 26ºC ± 2ºC e 45ºC
± 2ºC, nas formulações P4-01 e P4-28 foi verificada ausência de precipitados brancos, que
estão presentes nos géis armazenados em geladeira. Apesar da maior concentração do
princípio ativo em relação a P2-01 e P2-20, provavelmente o aumento de temperatura foi
suficiente para aumentar a solubilidade da papaína e fornecer géis homogêneos.
79
Figura 19. Fotografias das formulações de gel de papaína a 4%, P4-01 e P4-28, entre
os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ±
2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC).
80
5.4.3 Avaliação dos valores de pH durante 60 dias de armazenamento dos géis
Os valores de pH das formulações, nas diferentes condições de armazenamento, estão
apresentados na Tabela 32 a Tabela 35.
Não foram verificadas grandes variações nos valores de pH das formulações avaliadas.
Os maiores percentuais de variação foram observados para os géis de papaína a 2%, P2-01 e
P2-20, quando acondicionados em estufa (45ºC ± 2ºC), após 60 dias de armazenamento, com
valores de 4,35 e 5,25%, respectivamente.
Tanto para os géis de papaína a 2% quanto para os géis a 4%, foram notadas maiores
variações de pH nas formulações sem adição de adjuvantes técnicos. A formulação que
apresentou menor variação durante os 60 dias, em todas as temperaturas de
acondicionamento, foi a P4-28; esta também foi a única formulação que apresentou aumento
dos valores de pH, provavelmente devido à degradação do cloridrato de cisteína.
Tabela 32. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-01.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
pH 6,44 6,27 6,25 6,28 6,18 6,24 6,30 6,32 6,20 6,27 6,32 6,30 6,16
% variação - 2,64 2,95 2,48 4,04 3,11 2,17 1,86 3,73 2,64 1,86 2,17 4,35
Tabela 33. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-20.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
pH 6,48 6,36 6,35 6,38 6,36 6,38 6,34 6,39 6,35 6,40 6,35 6,36 6,14
% variação - 1,85 2,01 1,54 1,85 1,54 2,16 1,39 2,01 1,23 2,01 1,85 5,25
81
Tabela 34. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P4-01.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
pH 6,21 6,11 6,12 6,13 6,09 6,11 6,11 6,12 6,09 6,10 6,11 6,11 6,08
% variação - 1,61 1,45 1,29 1,93 1,61 1,61 1,45 1,93 1,77 1,61 1,61 2,09
Tabela 35. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P4-28.
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)
Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)
0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60
pH 6,10 6,15 6,14 6,14 6,19 6,13 6,15 6,15 6,22 6,12 6,12 6,13 6,12
% variação - 0,82 0,66 0,66 1,48 0,49 0,82 0,82 1,97 0,33 0,33 0,49 0,33
5.4.4 Avaliação da viscosidade aparente durante 60 dias de armazenamento dos géis
Como descrito no item 5.4.1.3, foram selecionados os valores de viscosidade aparente na
velocidade de 100 rpm para realizar a avaliação dos resultados. Esses resultados estão
expostos na Figura 20 a Figura 23.
As formulações de gel de papaína a 2% não mostraram muita variação de viscosidade
aparente durante os 60 dias de estudo, nas condições determinadas. Inicialmente, verifica-se
que não há diferença significativa (p>0,05) entre os valores de viscosidade aparente das
formulações P2-01 e P2-20.
Observa-se uma alteração significativa da P2-01 somente no 7º dia de análise, quando
houve o aumento dos valores de viscosidade dos géis armazenados em temperatura ambiente
(26ºC ± 2ºC) (p<0,001) e em estufa (45ºC ± 2ºC) (p<0,001). Esta alteração, porém, foi
pontual e não foi notado nenhum padrão de relação com o tempo e a temperatura. Um
82
comportamento semelhante é observado para a formulação P2-20, onde há pequena oscilação
dos valores de viscosidade, porém sem relação com o tempo e a temperatura.
Corrêa e colaboradores (2005), em estudo com géis de Carbopol® 940 a 0,5 e 1,0%,
armazenados a 25 e 40ºC durante 28 dias, relataram que a temperatura e o tempo de
armazenamento não influenciam na viscosidade aparente dos géis. Em resultados obtidos por
Pinto (2005) no estudo de estabilidade de papaína 0,8% em gel de Carbopol ® 940 0,6%,
houve pouca variação nos dados de viscosidade aparente durante 90 dias de armazenamento
em geladeira (5ºC ± 1ºC), com valores entre 6300 a 7100 Cp, sem relação específica com o
tempo.
Realizando a comparação das viscosidades aparentes dos géis P2-01 e P2-20
armazenados em estufa (45ºC ± 2ºC), no 60º dia, com a viscosidade aparente inicial de cada,
verifica-se uma maior manutenção do resultado relativo à segunda formulação, com 8,00 e
1,14% de variação, respectivamente. Este fato pode ser atribuído à presença do
propilenoglicol no gel P2-20. O propilenoglicol mostrou não interferir diretamente na
atividade proteolítica da papaína, porém atua como agente umectante na formulação. Com
esta ação, ele é responsável pela retenção da água no produto, garantindo a conservação da
sua viscosidade e, consequentemente, uma boa estabilidade física para o mesmo (CORRÊA et
al., 2005).
Figura 20. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-01, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
83
Figura 21. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-20, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
Para as formulações de gel de papaína a 4%, nota-se, entre elas, uma diferença
significativa dos valores de viscosidade aparente somente para os géis armazenados em
geladeira (5ºC ± 2ºC) no tempo zero (p<0,01) e no 7º dia (p<0,05). A formulação P4-01
apresenta valores superiores de viscosidade, com manutenção do valor inicial (p>0,05) até o
7º dia de armazenamento em geladeira. Enquanto isso, a P4-28 se aproxima da viscosidade
dos géis de papaína 2%. Como foi explicado no item 5.4.1.3, este fato pode estar relacionado
à presença do cloridrato de cisteína, que apresenta pH extremamente ácido, diminuindo a
viscosidade do gel.
Assim como nos géis de papaína a 2%, comparando-se as viscosidades aparentes dos
géis P4-01 e P4-28 armazenados em estufa (45ºC ± 2ºC), no 60º dia, com a viscosidade
aparente inicial de cada, há maior manutenção da viscosidade da formulação composta por
propilenoglicol. Neste caso, observam-se variações mais distintas, iguais a 18,18% para P4-
01, e 5,64% para P4-28.
.
84
Figura 22. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P4-01, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
Figura 23. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P4-28, na velocidade de 100 rpm,
durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
85
5.4.5 Avaliação da atividade proteolítica durante 60 dias de armazenamento dos géis
Os resultados obtidos no teste de atividade proteolítica da papaína são apresentados a
seguir (Tabela 36 a Tabela 39 e Figura 24 a Figura 27).
Tabela 36. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento.
Dia
Atividade proteolítica (UI/mg)*
Condição de armazenamento
Geladeira
(5ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Ambiente
(26ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Estufa
(45ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
0 240,72 (±1,35)
7 260,81 (±4,58) 108,34 228,32 (±21,22) 94,85 216,70 (±2,93) 90,02
15 257,19 (±2,86) 106,84 229,04 (±5,39) 95,15 205,21 (±2,18) 85,25
30 212,65 (±3,02) 88,34 206,41 (±6,53) 85,74 197,09 (±1,78) 81,87
60 209,78 (±5,42) 87,15 205,33 (±3,12) 85,30 195,24 (±1,82) 81,11
*Média de três determinações.
Tabela 37. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-20 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento.
Dia
Atividade proteolítica (UI/mg)*
Condição de armazenamento
Geladeira
(5ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Ambiente
(26ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Estufa
(45ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
0 243,66 (±2,80)
7 233,48 (±13,62) 95,82 227,35 (±4,04) 93,31 205,01 (±6,14) 84,14
15 232,07 (±5,44) 95,24 227,98 (±20,86) 93,57 205,25 (±5,22) 84,23
30 221,80 (±7,89) 91,03 207,58 (±6,17) 85,19 204,02 (±5,06) 83,73
60 209,66 (±5,30) 86,05 206,93 (±1,39) 84,93 203,07 (±4,40) 83,34
*Média de três determinações.
Na análise dos géis de papaína a 2%, verifica-se que, durante o estudo de estabilidade
acelerada, a formulação proposta para melhorar a atividade proteolítica da papaína não se
mostrou vantajosa. Como visto no item 5.4.1.5, no tempo inicial do estudo, os géis P2-01 e
86
P2-20 não apresentaram diferença significativa (p>0,05) quanto à atividade proteolítica. Este
comportamento foi alterado somente para os géis armazenados em geladeira, nos 7º e 15º
dias, quando a formulação P2-01 apresentou aumento significativo (p<0,001 e p<0,01,
respectivamente) da atividade em relação à P2-20.
Figura 24. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
Figura 25. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-20 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
87
Tanto para a formulação P2-01, quanto para a P2-20, verifica-se maior perda de
atividade proteolítica conforme aumenta-se a temperatura de armazenamento. Este fato já era
esperado, já que com o aumento da temperatura, se favorece a degradação da papaína. Em
estudo realizado por Capucho (2007), foram armazenadas amostras de papaína de dois
fornecedores distintos, em temperaturas de 4ºC, 30ºC (70% UR) e 40ºC (70% UR) durante 30
dias. Após este tempo, as matérias-primas acondicionadas a 4ºC não apresentaram perda de
atividade, enquanto aquelas armazenadas em temperaturas superiores tiveram redução de
23,06 até 61,54% da atividade.
Tabela 38. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-01 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento.
Dia
Atividade proteolítica (UI/mg)*
Condição de armazenamento
Geladeira
(5ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Ambiente
(26ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Estufa
(45ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
0 334,72 (±2,87)
7 363,82 (±17,43) 108,69 269,48 (±7,00) 80,51 212,82 (±8,47) 63,58
15 312,24 (±15,31) 93,28 234,72 (±12,60) 70,13 211,65 (±9,48) 63,23
30 263,63 (±3,16) 78,76 232,76 (±1,55) 69,54 208,50 (±5,54) 62,29
60 237,23 (±27,44) 70,87 229,47 (±16,90) 68,55 205,27 (±21,69) 61,32
*Média de três determinações.
Tabela 39. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-28 durante 60 dias, em
diferentes temperaturas de armazenamento.
Dia
Atividade proteolítica (UI/mg)*
Condição de armazenamento
Geladeira (5ºC
± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Ambiente
(26ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
Estufa
(45ºC ± 2ºC)
% da
atividade
inicial
0 453,00 (±22,86)
7 302,37 (±7,29) 66,75 300,34 (±10,67) 66,30 271,25 (±12,55) 59,88
15 317,03 (±3,25) 69,98 281,25 (±10,33) 62,09 264,98 (±0,63) 58,50
30 270,97 (±0,86) 59,82 270,74 (±16,70) 59,77 254,12 (±12,16) 56,10
60 264,55 (±12,84) 58,40 263,38 (±7,65) 58,14 239,61 (±5,27) 52,89
*Média de três determinações.
88
Ao contrário do ocorrido com o gel de papaína a 2% proposto (P2-20), a formulação
P4-28 mostrou-se eficiente em melhorar a atividade proteolítica do gel, como observamos no
tempo inicial de análise (item 5.4.1.5). Contudo, durante o tempo do estudo de estabilidade
acelerada, não houve manutenção desse benefício. Mesmo o gel armazenado em geladeira
(5ºC ± 2ºC) apresentou uma perda de 33,25% da atividade inicial ainda no 7º dia. Após os 60
dias de estudo, observou-se perda de quase 50% da atividade no gel acondicionado em estufa
(45ºC ± 2ºC).
Apesar do grande percentual de perda, a formulação P4-28 ainda apresentou valores
absolutos de atividade proteolítica maiores que os obtidos na formulação sem adjuvantes
técnicos, P4-01, principalmente para aqueles armazenados em maiores temperaturas. Para as
formulações acondicionadas em temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e em estufa (45ºC ± 2ºC),
os valores superiores de atividade dos géis P4-28 foram observados até o 30º dia (p<0,05 e
p<0,01, respectivamente). A exceção foram os géis armazenados em geladeira, no 7º dia de
análise, quando a formulação P4-01 apresentou um valor significativamente maior (p<0,001).
Assim como no gel de papaína a 2% sem adjuvantes (P2-01), foi observado no gel P4-01 um
aumento da atividade proteolítica no 7º dia, para a amostra armazenada em geladeira (5ºC ±
2ºC). Este acréscimo foi suficiente para superar a atividade do gel P4-28, porém este fato foi
pontual e não se repetiu para os outros dias.
Do mesmo modo que nos géis de papaína a 2%, verificou-se a influência da
temperatura na manutenção da atividade proteolítica dos géis, onde o aumento da temperatura
resultou em maior perda de atividade. Esta relação ficou mais evidente na formulação P4-01,
onde os valores da atividade enzimática dos géis acondicionados em geladeira foram
significativamente maiores do que aqueles armazenados em estufa, até o 60º dia do estudo
(p<0,05).
Para a formulação P4-28, exceto no 15º dia de análise (p<0,01), nota-se ausência de
diferença significativa (p>0,05) entre os valores de atividade dos géis armazenados em
geladeira (5ºC ± 2ºC) e em temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC). A comparação entre os géis
armazenados em geladeira e em estufa (45ºC ± 2ºC) demonstra que, a partir do 30º dia de
armazenamento, não existe diferença significativa (p>0,05) entre os valores de atividade
proteolítica. Esta evidência pode estar relacionada ao uso do EDTA dissódico e do cloridrato
de cisteína que, segundo Ferreira (2008), atuam como antioxidantes sinergistas e, desta ação,
houve a diminuição do efeito da temperatura na degradação da papaína.
89
Figura 26. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-01 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
Figura 27. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P4-28 durante 60
dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.
Em estudos prévios (CAPUCHO, 2007; PINTO, 2005; VELASCO, 1993), foi visto
que os géis de papaína sofrem ação do tempo e da temperatura, resultando em perda da
atividade proteolítica.
90
Capucho (2007) avaliou a estabilidade da papaína em géis de Pluronic® F127 e
Carbopol® 940, armazenados a 4, 30 e 40ºC durante oito meses. Ela concluiu que as
formulações armazenadas a 4ºC foram estáveis por 6 meses, sendo que o gel de Carbopol®
940 proporcionou maior estabilidade que o Pluronic® F127; as formulações armazenadas a 30
e 40ºC mostraram perda considerável e suas análises foram interrompidas no 4º mês. Durante
o período do estudo, a atividade proteolítica do gel de papaína em Carbopol® 940 decaiu em
um intervalo de 450 a 350 UI/grama de formulação. Esta pequena redução, contudo, pode
estar relacionada não à estabilidade da formulação, e sim à baixa capacidade de recuperação
do método analítico utilizado.
No estudo de estabilidade realizado por Pinto (2005), com gel de papaína 0,8% em
Carbopol® 940, verificou-se uma redução significativa da atividade proteolítica da formulação
armazenada somente em geladeira (5ºC ± 1ºC), durante 90 dias. No 7º dia, havia 90,30% da
atividade inicial; nos 15º e 30º dias, 82,72%; no 60º dia, 67,07%; e no 90º dia, 70,09%. Seus
resultados mostram perda superior aos encontrados para as formulações P2-01, P2-20 e P4-
01. Neste caso, pode-se supor que o uso do cloridrato de cisteína a 0,16% tenha afetado o
resultado; como foi observado nos estudos de superfície de resposta (itens 5.3.1 e 5.3.2), a
cisteína influencia negativamente a atividade proteolítica da papaína.
É importante ressaltar que, em todos os estudos anteriores, a máxima concentração de
papaína avaliada em formulações foi de 1%, sendo mais usual a 0,8% (CAPUCHO, 2007;
JÁUREGUI et al., 2009; PINTO, 2005; RUAS et al., 2006; SIM et al., 2000; TRAVERSA,
2003; VELASCO, 1993). A exceção foi o experimento feito por Zulli (2007), com matrizes
poliméricas incorporadas com papaína a 2%; entretanto, não foi realizado um estudo de
estabilidade dessas membranas. Em baixas concentrações, a enzima tem aplicação para uso
cosmético, e não como um medicamento para o tratamento de feridas.
Recentemente, foram inclusas as fórmulas de gel de papaína 2% a 10% ao Formulário
Nacional da Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2011). Elas são compostas por papaína (2 a 10
g) e gel de carbômer (q.s.p. 100 g), com ajuste para valor de pH igual a 5. Ressalta-se o
cuidado com a conservação da papaína, com informação de inativação da mesma por agentes
oxidantes como ferro, oxigênio e iodo. Recomenda-se acondicionamento sob refrigeração, em
embalagem plástica perfeitamente fechada. As indicações são para úlceras por pressão,
diabética, venosa, arterial e queimaduras. A finalidade das fórmulas é para uso externo, com
91
aplicação sobre a lesão, seguida de oclusão, e troca do curativo após um dia com lavagem
com soro fisiológico.
Entretanto, o Formulário Nacional não faz nenhuma referência quanto à estabilidade
desses produtos (BRASIL, 2011). As formulações P2-01 e P4-01 reproduzem aquelas
recomendadas pelo Formulário Nacional, com exceção da presença de propilenoglicol; o gel
de carbômer descrito no Formulário possui propilenoglicol a 5% em sua composição. Porém,
como foi observado durante o presente estudo, a presença deste adjuvante técnico não
influencia a atividade proteolítica da papaína; ele tem papel importante apenas na manutenção
da viscosidade do produto.
Quando são avaliados os resultados do estudo de estabilidade dos géis de papaína a
2%, constata-se que a formulação P2-20, proposta para otimização da atividade proteolítica,
não apresentou o resultado esperado. Em comparação com o gel P2-01, este obteve melhor
desempenho durante os 60 dias de análise, mostrando que a adição dos adjuvantes técnicos é
dispensável neste caso. Para os géis de papaína a 2%, portanto, a comparação com as
formulações avaliadas mostra que a fórmula proposta pelo Formulário Nacional apresenta-se
como a melhor opção.
Já para os géis de papaína a 4%, com a formulação P4-28 proposta, observou-se uma
intensa melhora em relação àquela sem adição dos adjuvantes técnicos (P4-01). Este aumento
da atividade proteolítica, entretanto, não foi mantido durante o estudo de estabilidade, com
queda acentuada logo no 7º dia de análise. Apesar da queda significativa, o gel P4-28 ainda
apresentou melhores resultados em relação ao P4-01. Neste caso, comparando-se os
resultados dos géis analisados, o uso dos adjuvantes mostrou que a fórmula descrita no
Formulário Nacional pode ser aprimorada, gerando um melhor desempenho quanto à
atividade proteolítica da papaína.
92
6. CONCLUSÕES
O método de determinação da atividade proteolítica da papaína através da medida da
fluorescência em microplacas, utilizando o cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-
arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA) como substrato, é aplicável a
formulações em gel de Carbopol® 940 contendo papaína nas concentrações de 2 e 4%.
Com os estudos de formulação, verificou-se a necessidade de adequação da
concentração de Carbopol® 940 de acordo com as concentrações de papaína e dos adjuvantes
técnicos, para que o produto apresente uma viscosidade adequada para o uso.
Na análise pontual após 48 horas de preparo dos géis de papaína a 2 e a 4%,
considerando as concentrações utilizadas de cada adjuvante técnico, o EDTA dissódico
apresentou influência positiva na atividade proteolítica da enzima, enquanto o cloridrato de
cisteína teve influência negativa. O propilenoglicol não interferiu nos resultados.
Durante os 60 dias de análise, as quatro formulações avaliadas no estudo de
estabilidade acelerada apresentaram boa estabilidade física, com manutenção dos valores de
viscosidade aparente e pH, porém observou-se considerável perda dos valores de atividade
proteolítica, mesmo para aqueles armazenados a 5ºC ± 2ºC.
O uso do adjuvante técnico, EDTA dissódico não demonstrou eficiência na
manutenção da atividade proteolítica da papaína em concentração igual a 2% veiculada em
gel de Carbopol® 940, nas condições avaliadas no estudo de estabilidade acelerada.
Para o gel de papaína a 4%, utilizando os adjuvantes nas concentrações ideais
apontadas pelo estudo de superfície de resposta, houve um aumento considerável na atividade
proteolítica inicial, porém não ocorreu a manutenção esta atividade ao longo do tempo do
estudo de estabilidade acelerada.
Os géis de papaína a 2 e a 4% devem ser armazenados em baixa temperatura (5ºC ±
2ºC) na tentativa de reduzir a perda da atividade enzimática dos produtos.
93
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANSEL, H.C.; POPOVICH, N.G.; ALLEN JR., L.V. Farmacotécnica: Formas
Farmacêuticas & Sistemas de Liberação de Fármacos. 6ª ed. São Paulo: Editorial Premier,
2000.
ARNON, R. Papain. Methods in Enzymology, v. 19, p. 226-244, 1970.
AULTON, M.E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
AZARKAN, M.; MOUSSAOUI, A.E.; WUYTSWINKEL, D.V; DEHON, G. LOOZE, Y.
Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya. Journal of
Chromatography B, v. 790, p. 229-238, 2003.
BALLS, A.K.; LINEWEAVER,H. Isolation and properties of crystalline papain. Journal of
Biological Chemistry, v. 130, p.669-686, 1939.
BERNARDI, A.P.M. Análise química, avaliação da atividade antioxidante e obtenção de
culturas in vitro de espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul. Tese (Doutorado).
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007.
BONACUCINA, G.; MARTELLI, S.; PALMIERI, G.F. Rheological, mucoadhesive and
release properties of Carbopol gels in hydrophilic cosolvents. International Journal of
Pharmaceutics, v. 282, p. 115–130, 2004.
BLANES, L. Tratamento de feridas. Baptista-Silva JCC, editor. Cirurgia vascular: guia
ilustrado. São Paulo, 2004. Disponível em: http://www.bapbaptista.com
BORGES, E.L. Tratamento tópico de úlcera venosa: proposta de uma diretriz baseada em
evidências. Tese (Doutorado). Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, 2005.
BORGHETTI, G.S.; KNORST, M.T. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade física de
loções O/A contendo filtros solares. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 4,
p. 531-537, out./dez., 2006.
94
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº
899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos.
Diário Oficial da União, Brasília, DF, 02 de junho de 2003.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de
Estabilidade de Produtos Cosméticos, v. 1: 11-22, Brasília, 2004.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº 1,
de 29 de julho de 2005. Guia para a Realização de Estudos de Estabilidade. Diário Oficial da
União, Brasília, DF, 01 de agosto de 2005.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Formulário
Nacional da Farmacopéia Brasileira, 2ª ed., Brasília, 2011.
CAMARGO, S.M.P.L.O. Estudo combinado do ultra-som pulsado de baixa intensidade e da
papaína na cicatrização de úlcera por pressão no atendimento domiciliar. Dissertação
(Mestrado). Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, Universidade de
São Paulo, 2006.
CANNON, B.C.; CANNON, J.P. Management of pressure ulcers. American Journal of
Healthy-System Pharmacy, v. 61, p. 1895-1905, 2004.
CAPUCHO, H.C. Desenvolvimento de formulações tópicas contendo papaína para o
tratamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, 2007.
CARDOSO, S.L. Fotofísica de carotenóides e o papel antioxidante de β-caroteno. Química
Nova, v. 20, n. 5, p. 535-540, 1997.
CESARETTI, I.U.R. Processo fisiológico de cicatrização da ferida. Pelle Sana, v. 2, p. 10-12,
1998.
CHAMBERS, L.; BROWN, A.; PRITCHARD, D.I.; SREEDHARAN, S.;
BROCKLEHURST, K.; KALSHEKER, N.A. Enzymatically active papain preferentially
induces an allergic response in mice. Biochemical and Biophysical Research
Communications, v. 253, p. 837–840, 1998.
CORRÊA, N.M.; CAMARGO JÚNIOR, F.B.; IGNÁCIO, R.F.; LEONARDI, G.R. Avaliação
do comportamento reológico de diferentes géis hidrofílicos. Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas, v. 41, n. 1, p. 73-78, jan./mar., 2005.
95
DÂNGELO, J.G.; FATINNI, C.A. Anatomia humana sistêmica e segmentar. 2ª ed. Rio de
Janeiro: Atheneu, 1988.
DARDENNE, L.E.; WERNECK, A.S.; OLIVERA NETO, M.; BISCH, P.M. Electrostatic
properties in the catalytic site of papain: a possible regulatory mechanism for the reactivity of
the ion pair. PROTEINS: Structure, Function, and Genetics, v. 52, p. 236–253, 2003.
DE PAOLA, M.V.R.V.; RODRIGUES, L.B., DAZZI, C., YAMAMOTO, J.K., KANEKO,
T.M. Avaliação da estabilidade da solução de papaína 2% p/v pelo método da coagulação do
leite. Farmácia & Química, v. 32, n. 4, p. 8-13, 1999.
DEALEY, C. Cuidando de feridas: um guia para enfermeiras. São Paulo: Atheneu; 1996.
p.1-21.
DECLAIR, V. Tratamento de úlceras crônicas de difícil cicatrização com ácido linoléico.
Jornal Brasileiro de Medicina, v. 82, p. 36-41, 2002.
ESPÍN, N.; ISLAM, N.M. Stabilization of papain from papaya peels. Food Science and
Technology International, v.4, p. 179-187, 1998.
FALANGA, V. Wound bed preparation and the role of enzymes: a case for multiple actions
of therapeutic agents. Wounds - A Compendium of Clinical Research and Practice, v. 14, n. 2,
p. 47-57, 2002.
FERREIRA, A. M.; OLIVEIRA, K.A; VIEIRA, L.C.; ROL, J.L. Revisão de estudos clínicos
de enfermagem: Utilização de papaína para o tratamento de feridas. Revista Enfermagem
UERJ, v. 13, p. 382-389, 2005.
FERREIRA, A.M.; WATANABE, E.; NASCIMENTO, A.P.; ANDRADE, D.; ITO, I.Y.
Atividade antibacteriana in vitro de géis com diferentes concentrações de papaína. Revista
Eletrônica de Enfermagem, v. 10, n. 4, p. 1035-1040, 2008.
FERREIRA, A.O. Guia Prático de Farmácia Magistral - Volume 1. 3ª ed. São Paulo:
Pharmabooks, 2008.
FRANCO, D.; GONÇALVES, L.F. Feridas cutâneas: a escolha do curativo adequado. Revista
do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, v. 35, n. 3, p. 203-206, 2008.
GASPAR, L.R.; MAIA CAMPOS, P.M.B.G. Rheological behavior and the SPF of
sunscreens. International Journal of Pharmaceutics, v. 250, p. 35-44, 2003.
96
GLAZER, A.N.; SMITH, E.L. Phenolic hydroxyl ionization in papain. The Journal of
Biological Chemistry, v. 286, n. 11, 1961.
GOMES, F.S.L.; CARVALHO, D.V. Tratamento de ferida: Revisão da literatura. Revista
Mineira de Enfermagem, v. 6, n. 1/2, p. 67-72, 2002.
GUZMAN, E.V., GUZMAN, M.G. The enzymatic debridement of suppurations, necrotic
lesions and burns with papain. Journal of the International College of Surgeons, v. 20, p. 695-
702, 1953.
HADGRAFT, J. Skin deep. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v.
58, n. 2, p. 291-299, 2004.
HAX, G. Comparando os efeitos da utilização da papaína e AGE em lesões cutâneas: estudo
experimental. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica e
Ciências da Saúde, PUC-RS, 2009.
HOMAEI, A.A.; SAJEDI, R.H.; SARIRI, R.; SEYFZADEH, S.; STEVANATO, R. Cysteine
enhances activity and stability of immobilized papain. Amino Acids, v. 38, p. 937-942, 2010.
ISLAM, M.T.; RODRÍGUEZ-HORNEDO, N.; CIOTTI, S.; ACKERMANN, C. Rheological
characterization of topical carbomer gels neutralized to different pH. Pharmaceutical
Research, v. 21, n. 7, 2004.
JÁUREGUI, K.M.G.; CABRERA, J.C.C; CENICEROS, E.P.S; HERNÁNDEZ, J.L.M.;
ILYINA, A. A new formulated stable papain-pectin aerosol spray for skin wound healing.
Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 14, p.450-456, 2009.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 10ª ed. Rio de Janeiro: Editora
Guanabara Koogan, p. 359-370, 2004.
KILARA, A.; SHAHANI, K.M.; WAGNER, F.W. Preparation and properties of immobilized
papain and lipase. Biotechnology and Bioengineering, v. 19, n. 11, p. 1703-1714, 1977.
KILINÇ, A.; ONAL,, S.; TELEFONCU, A. Stabilization of papain by modification with
chitosan. Turkish Journal of Chemistry 26, p. 311-316, 2001.
KIM, J.Y.; SONG, J.Y.; LEE, E.J.; ARK, S.K. Rheological properties and microstructures of
Carbopol gel network system. Colloid and Polymer Science, v. 281, p. 614–623, 2003.
97
KIMMEL, J.R.; SMITH, E.L. Crystalline papain. I. Preparation, specificity, and activation.
Journal of Biological Chemistry, v. 207, p. 515-530, 1954.
LENTH, R.V. Response-surface methods in R, using rsm. Journal of Statistical Software, v.
32, n. 7, p. 1-17, 2009.
LOPES, C.M.; LOBO, J.M.S.; COSTA, P. Formas farmacêuticas de liberação modificada:
polímeros hidrifílicos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 41, n. 2, p. 143-154,
2005.
LOPES, P.S.; RUAS, G.W.; BABY, A.R.; PINTO, C.A.S.O.; WATANABE, I.; VELASCO,
M.V.R.; KANENKO, T.M. In vitro safety assessment of papain on human skin: a qualitative
Light and Transmission Electron Microscopy (TEM) study. Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas, v. 44, n. 1, p. 151-156, jan./mar., 2008.
MACIEL, E.A.F. Prevalência de feridas em pacientes internados em um hospital filantrópico
de grande porte de Belo Horizonte. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação da
Escola de Enfermagem, Universidade Federal de Minas Gerais, 2008.
MATEUS, N.B.; BARBIN, D.; CONAGIN, A. Viabilidade de uso do delineamento composto
central. Acta Scientiarum, v. 23, n. 6, p. 1537-1546, 2001.
MENDES, P.A.P. Estudo do Teor de Alicina em Alho. Dissertação (Mestrado). Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Química, Escola Superior de Tecnologia e de Gestão de
Bragança, 2008.
MENON, G.K. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced Drug
Delivery Reviews, v. 54, n. 1, p. S3-S17, 2002.
MERCK index. 12ª ed. Whitehouse Station, Merck Research Laboratories, Division of Merck
& Co., 1996, 1741p.
MITCHEL, R.E.J.; CHAIKEN, I.M.; SMITH E.L. The complete amino acid sequence of
papain. Additions and corrections. Journal of Biological Chemistry, v. 245, p. 3485-3492,
1970.
MONETTA L. Uso da papaína nos curativos feitos pela enfermagem. Revista Brasileira de
Enfermagem, v. 40, n. 1, p. 66-73, 1987.
98
MONETTA, L. A importância da atuação científica do enfermeiro na execução dos curativos
feitos com papaína. Revista Paulista de Enfermagem, v. 9, n. 3, p. 83-87, 1990.
MONETTA L. Análise evolutiva do processo de cicatrização em úlceras diabéticas, de
pressão e venosas com uso de papaína. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação
da Escola de Enfermagem, Universidade de São Paulo, 1998.
PALADINO, S.F. Úlcera de membros inferiores na anemia falciforme. Revista Brasileira de
Hematologia e Hemoterapia, v. 29, n. 3, p. 288-290, 2007.
PAQUES, F.W.; MACEDO, G.A. Lipases de látex vegetais: propriedades e aplicações
industriais. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 93-99, 2006.
PEREIRA, A.L. Revisão sistemática da literatura sobre produtos usados no tratamento de
feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-graduação da Faculdade de Enfermagem,
Universidade Federal de Goiás, 2006.
PEREIRA, A.L.; BACHION, M.M. Tratamento de feridas: análise da produção científica
publicada na Revista Brasileira de Enfermagem de 1970-2003. Revista Brasileira de
Enfermagem, v. 58, n. 2, p. 208-213, 2005.
PIEPER, B.; CALIRI, M.H.L. Nontraditional wound care: a review of the evidence for the
use of sugar, papaya/papain, and fatty acids. Journal of Wound, Ostomy and Continence
Nursing, v. 30, n. 4, p. 175-183, 2003.
PINTO, C.A.S.O. Estudo comparativo da estabilidade de formulações cosméticas contendo
papaína livre e modificada. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em
Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo,
2005.
PINTO, C.A.S.O.; GREEN, D.; BABY, A.R.; RUAS, G.W.; KANEKO, T.M.; MARANA,
S.R.; VELASCO, M.V.R. Determination of papain activity in topical dosage forms: single
laboratory validation assay. Latin American Journal of Pharmacy, v. 26, n. 5, p. 771-775,
2007.
PRISTA, L.N.; ALVES, A.C.; MORGADO, R.; LOBO, J.S. Tecnologia Farmacêutica. II
Volume. 5ª ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2006.
99
QUEIROZ, M.B.R. Desenvolvimento e estudo da estabilidade de gel com extrato de
Matricaria recutita (L.) e avaliação da atividade anti-inflamatória tópica comparada com o
gel de diclofenaco sódico. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, 2008.
REDDY, M.; GILL, S.S.; KALKAR, S.R.; WU, W.; ANDERSON, P.J.; ROCHON, P.A.
Treatment of pressure ulcers: a systematic review. Journal of the American Medical
Association, v. 300, n. 22, p. 2647-2662, 2008.
RUAS, G. W. ; PINTO, C. A. S. O. ; LOPES, P. S.; VELASCO, M. V. R.; KANEKO, T. M.
Desenvolvimento de sistema de liberação de papaína para uso tópico. In: 14º Simpósio
Internacional de Iniciação Científica da USP, Ribeirão Preto, 2006.
SAMPAIO, S.A.P.; CASTRO, R.M.; RIVITTI, E.A. Anatomia e fisiologia da pele. In:
______. Dermatologia Básica. 3ª ed. Porto Alegre: Artes Médicas, p. 1-21, 1999.
SANCHEZ NETO, R.; BARONE, B.; TEVES, D.C.; SIMÕES, M.J.; NOVO, N.F.;
JULIANO, Y. Aspectos morfológicos e morfométricos da reparação tecidual de feridas
cutâneas de ratos com e sem tratamento com solução de papaína a 2%. Acta Cirurgica
Brasileira, v. 8, n. 1, p. 18-23, 1993.
SANKALIA, M.G.; MASHRU, R.C.; SANKALIA, J.M.; SUTARIYA, V.B. Physicochemical
characterization of papain entrapped in ionotropically cross-linked kappa-carrageenan gel
beads for stability improvement using Doehlert shell design. Journal of Pharmaceutical
Sciences, v. 95, n. 9, p. 1994-2012, 2006.
SATISH, H.A.; KUMAR, P.R.; PRAKASH, V. Mechanism of solvent induced thermal
stabilization of papain. International Journal of Biological Macromolecules, v. 41, p.383–
390, 2007.
SCHULTZ, G.S.; SIBBALD, R.G.; FALANGA, V.; AYELLO, E.A.; DOWSETT, C.;
HARDING, K.; ROMANELLI, M.; STACEY, M.C.; TEOT, L.; VANSCHEIDT, W. Wound
bed preparation: a systematic approach to wound management. Wound Repair and
Regeneration, v. 11, n. 2, supplement, 2003.
SILVA, L.M. Efeitos benéfico da papaína no processo terapêutico de lesões de pele. In:
JORGE S.A., DANTAS S.R.P.E. Abordagem multiprofissional no tratamento de feridas. São
Paulo: Atheneu, p.123-131, 2003.
SIM, Y.C.; LEE, S.G.; LEE, D.C.; KANG, B.Y.; PARK, K.M.; LEE, J.Y.; KIM, M.S.;
CHANG, I.S.; RHEE, J.S. Stabilization of papain and lysozyme for application to cosmetic
products. Biotechnology Letters, v. 22, p. 137–140, 2000.
100
SIMÕES, M.J.; UZUNIAN, A.; MORA, O.A.; SASSO, W.S. Aspectos ultra-estruturais do
processo de reparação da pele de ratos albinos. Revista Paulista de Medicina, v. 103, p. 123-
126, 1985.
SMITH, E.L.; KIMMEL, J.R.; BROWN, D.M. Crystalline papain. II. Physical studies; the
mercury complex. Journal of Biological Chemistry, v. 207, p. 533-549, 1954.
SOUTO, E.B.; WISSING, S.A.; BARBOSA, C.M.; MÜLLER, R.H. Evaluation of the
physical stability of SLN and NLC before and after incorporation into hydrogel formulations.
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 58, p. 83-90, 2004.
STARLEY, I.F.; MOHAMMED, P.; SCHNEIDER, G.; BICKLER, S.W. The treatment of
paediatric burns using topical papaya. Burns, v. 25, p. 636-639, 1999.
THOMAS, D.R. Prevention and treatment of pressure ulcers. Journal of the American
Medical Directors Association, v.7, n. 1, p. 46-59, 2006.
TRAVERSA, E. Desenvolvimento de formulações cosméticas contendo papaína e avaliação
da sua eficácia depilatória sobre o folículo piloso. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-
Graduação em Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade de São Paulo, 2003.
TRAVERSA, E.; MACHADO-SANTELLI, G.M.; VELASCO, M.V.R. Histological
evaluation of hair follicle due to papain’s depilatory effect. International Journal of
Pharmaceutics, v. 335, p. 163-166, 2007.
WANG, L. Recommendations for design parameters for central composite designs with
restricted randomization. Tese (Doutorado em Estatística). Virginia Polytechnic Institute and
State University, Estado Unidos da América, 2006.
VARCA, G.H.C.; ANDRÉO-FILHO, N.; FRACETO, L.F.; KANEKO, T.M.; FERRAZ,
H.G.; ESTEVES, N.M.; ISSA, M.G.; MATHOR, M.B.; LOPES, P.S. Thermal
characterization and cytotoxicity of complexes formed by papain and cyclodextrin. Journal of
Biological Physics, v. 33, p. 463–475, 2007.
VASCONCELLOS, F.C.; GOULART, G.A.S.; BEPPU, M.M. Production and
characterization of chitosan microparticles containing papain for controlled release
applications. Powder Technology, v. 205, p. 65-70, 2011.
101
VELASCO, M.V.R. Desenvolvimento e padronização de gel contendo papaína para uso
tópico. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Fármacos e Medicamentos,
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 1993.
YAMADA, B.F.A. Terapia tópica de feridas: limpeza e desbridamento. Revista da Escola de
Enfermagem da USP, v. 33, p. 133-140, 1999.
ZULLI, G. Desenvolvimento de uma matriz polimérica para incorporação e liberação
controlada de papaína. Dissertação (Mestrado). Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares, Universidade de São Paulo, 2007.