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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS CARDIOVASCULARES
Renata de Azevedo Macedo
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM AMIDO RESISTENTE SOBRE A EXPRESSÃO DO RECEPTOR
ARIL HIDROCARBONETO EM PACIENTES EM HEMODIÁLISE
Niterói/RJ 2018
ii
Renata de Azevedo Macedo
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM AMIDO RESISTENTE SOBRE A EXPRESSÃO DO RECEPTOR ARIL HIDROCARBONETO
EM PACIENTES EM HEMODIÁLISE
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Cardiovasculares da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Cardiovasculares. Área de concentração: Ciências Biomédicas.
Orientadora: Profª. Drª. Denise Mafra
Niterói/RJ 2018
iii
Elaborada pela Bibliotecária Thaíssa Matias – CRB7: 5764.
M141
Macedo, Renata de Azevedo
Efeito da suplementação com amido resistente
sobre a expressão do receptor aril
hidrocarboneto em pacientes em hemodiálise /
Renata de Azevedo Macedo, 2018.
77f.
Orientadora: Denise Mafra.
Dissertação (Mestrado em Ciências
Cardiovasculares)– Universidade Federal
Fluminense, Faculdade de Medicina, 2018.
DOI: http://dx.doi.org/10.22409/PPGCCV.2018.m.14385778779
1. Diálise renal. 2. Prebióticos. 3. Fibras na
dieta. 4. Inflamação. I. Titulo.
CDD 616.6106
iv
Renata de Azevedo Macedo
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM AMIDO RESISTENTE SOBRE A EXPRESSÃO DO RECEPTOR ARIL HIDROCARBONETO
EM PACIENTES EM HEMODIÁLISE
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Cardiovasculares da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Cardiovasculares. Área de concentração: Ciências Biomédicas.
Niterói, 03 de dezembro de 2018.
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Natália Alvarenga Borges Universidade Federal Fluminense
Profª. Drª. Ludmila FMF Cardozo Universidade Federal Fluminense
Prof. Dr. José Carlos Carraro Eduardo Universidade Federal Fluminense
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sempre se fazer presente em minha vida, por me dá forças para lutar pelos meus objetivos, e não me deixar abater pelos obstáculos que surgem em meu caminho.
Aos meus pais, pelo amor, carinho, orientações e conselhos. Por investirem em meus estudos e me darem a oportunidade de chegar em uma pós-graduação pública, algo de que me orgulho, principalmente por ser em um país no qual a educação e área de pesquisa são tão desvalorizadas.
À todas as nutricionistas envolvidas no projeto do amido resistente, Marta Esgalhado, Julie Ann Camp, Mariana Zogby e Maria Clara Testa que se dedicaram para concluir este projeto.
Um agradecimento especial para Marta Esgalhado que sempre me ajudou desde os trabalhos das disciplinas até a elaboração do projeto.
À técnica do laboratório de técnica e dietética Claudinha por sempre me ajudar na elaboração dos biscoitos.
À Bruna Regis e Jessyca Bryto por transformarem momentos turbulentos em motivos para dá risada, por sempre me ouvirem e por todo incentivo. Além de serem essenciais na conclusão das minhas análises.
À toda equipe das Clínicas RenalCor, os médicos, os enfermeiros, os técnicos, as recepcionistas e, especialmente a nutricionista Najla Farage por nos receber com tanta educação e possibilitar a execução do nosso projeto.
A todos os pacientes que participaram do nosso estudo. Fico feliz em ter feito parte de um projeto que visa melhorar a qualidade de vida dessas pessoas que passam por um momento tão delicado.
Às professoras Ludmila Cardoso, Natália Borges e Milena Barcza por me ajudarem nas análises e por me passarem seus conhecimentos.
À minha orientadora Denise Mafra, agradeço por ter permitido que eu participasse do seu grupo de pesquisa, o qual veio a acrescentar a minha bagagem acadêmica. Obrigada pela oportunidade e por me proporcionar o desenvolvimento deste trabalho.
À Ingredion por gentilmente disponibilizar o prebiótico amido resistente (HI- MAIZE® 260).
Ao programa de Pós-graduação em Ciências Cardiovasculares, por me conceder a oportunidade para realização do mestrado.
Às agências de fomento: Capes, CNPq e Faperj por possibilitarem a execução do nosso projeto.
vi
RESUMO
Macedo, Renata. Efeito da suplementação com amido resistente sobre a expressão do receptor aril hidrocarboneto de pacientes em hemodiálise. 2018. Dissertação (Mestrado em Ciências Cardiovasculares) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2018.
Introdução: O desequilíbrio da microbiota intestinal presente na Doença Renal Crônica (DRC) promove a produção de toxinas urêmicas, como o ácido indol-3- acético (AIA), que se liga ao receptor aril hidrocarboneto (RAH), fator de transcrição envolvido na expressão de citocinas inflamatórias, possilvelmente por
meio da ativação do fator nuclear kappa B (NF-B). Portanto, o RAH pode servir como mediador na inflamação em pacientes com DRC. Estratégias como a suplementação com prebióticos pode ser abordagem não farmacológica promissora para restaurar o equilíbrio da microbiota intestinal, minimizando os efeitos deletérios. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação com amido resistente (AR), um tipo de prebiótico, sobre os níveis plasmáticos do
AIA e a expressão do mRNA de RAH e mRNA de NF-B em pacientes em hemodiálise (HD). Método: Ensaio clínico randomizado, duplo-cego, controlado por placebo no qual foram selecionados 43 pacientes estáveis em HD alocados nos grupos AR ou placebo. Os pacientes receberam, alternadamente, biscoitos e sachês contendo 16 g/dia de AR (Hi-Maize 260®) ou amido de mandioca durante 4 semanas. Amostras de sangue em pré-diálise em jejum foram coletadas e os níveis plasmáticos de AIA medidos por cromatografia líquida de alta eficiência. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas e processadas para
análises de expressão de mRNA do RAH e do NF-B por PCR em tempo real (rt- PCR). Parâmetros antropométricos, bioquímicos e ingestão alimentar também foram avaliados. Resultados: Trinta e um pacientes completaram o estudo, 15 (47% homens; 56,1 ± 7,5 anos; 50,0 ± 36,6 meses de HD; Kt/V de 1,3 ± 0,2) no grupo AR e 16 (69% homens, 53,6 ± 11,5 anos, tempo 44,3 ± 26,4 meses de HD; Kt/V de 1,4 ± 0,3) no grupo placebo. Apesar de não ter ocorrido alterações significativas nos níveis plasmáticos de AIA [2329,5 (1112- 3451) ug/L a 1667 (1191-2934) ug/L, p= 0,16], tampouco na expressão de mRNA do RAH (1,08 ± 0,5 a 1,12 ± 0,45, p = 0,84) após a suplementação com AR, foi observada correlação positiva (r=0,48; p= 0,03) entre o AIA e o RAH no baseline. Também não houve
alteração no mRNA do NF-B (1,35 ± 0,81 a 0,97 ± 0,37, p=0,06) após a suplementação com AR. Conclusão: Embora a suplementação de AR não tenha influenciado os níveis plasmáticos de AIA ou a expressão do RAH, a associação positiva entre eles reforça possível interação entre eles.
Palavras chave: Prebiótico, fibra alimentar, receptor aril hidrocarboneto, toxinas urêmicas, inflamação, hemodiálise.
vii
ABSTRACT
Macedo, Renata. Effect of resistant starch supplementation on aryl
hydrocarbon receptor expression in hemodialysis patients. 2018. Dissertação
(Mestrado em Ciências Cardiovasculares) - Faculdade de Medicina, Universidade
Federal Fluminense, Niterói, 2018.
Background: Gut microbiota imbalance promotes uremics toxins production in
Chronic Kidney Disease (CKD), such as indole-3-acetic acid (IAA), that binds to the
aryl hydrocarbon receptor (AhR), a ligand-transcription factor involved in the
expression of inflammatory cytokines, possibly through activation of nuclear factor
kappa B (NF-B). Therefore, AhR can serve as a mediator in inflammation in CKD
patients. Strategies like prebiotic supplementation may be promising non-
pharmacological approach to restore gut microbiota balance, minimizing
deleterious effects. This study aimed to evaluate prebiotic resistant starch (RS)
supplementation effects on IAA plasma levels and AhR mRNA expression in
hemodialysis (HD) patients. Method: This randomized, double-blind, placebo-
controlled trial evaluated forty-three stable HD patients allocated in RS or placebo
groups. Patients received, alternately cookies and sachet containing 16 g/day RS
(Hi-Maize 260®) or manioc flour during four weeks. Fasting pre-dialysis blood
samples were collected and plasma IAA levels measured by high performance
liquid chromatography. Peripheral blood mononuclear cells were isolated and
processed for AhR and NF-κB mRNA expression analyses by quantitative real-
time PCR (rt-PCR). Anthropometric and biochemical parameters as well as food
intake were also evaluated. Results: Thirty-one patients completed the study, 15
(47% men; 56,1 ± 7,5 age; 50,0 ± 36,6 months of HD; Kt/V de 1,3 ± 0,2) in RS group
and 16 (69% men, 53,6 ± 11,5 age, 44,3 ± 26,4 months of HD; Kt/V de 1,4 ± 0,3) in
placebo group. Although there was no significant alteration in plasma IAA levels
from (2329.5 (1112-3451) ug/L to 1667 (1191-2934) ug/L, p= 0.16), neither in AhR
mRNA expression from (1.08 ± 0.5 to 1.12 ± 0.45, p= 0.84), after RS
supplementation, a positive correlation (r= 0.48; p= 0.03) was observed between
them at the baseline. No change in mRNA NF-B (1.35 ± to 0.97 ± 0.37, p= 0.06)
was observed after RS supplementation. Conclusion: Even though RS
supplementation did not influence IAA or AhR expression, their positive association
reinforces a possible interaction between them.
Key words: Prebiotic, dietary fiber, aryl hydrocarbon receptor, uremic toxins, inflammation, hemodialysis.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Produção das toxinas urêmicas IS e AIA .................................................. 10
Possível mecanismo de ativação do RAH por toxinas urêmicas derivadas do metabolismo do triptofano ..................................................... 13
NF-B e resposta inflamatória ................................................................... 17
Delineamento do estudo ............................................................................ 25
Elaboração dos biscoitos e porcionamento da suplementação em sachês ....................................................................................................... 27
Biscoitos com AR para suplementação ..................................................... 28
Sachês com AR e placebo......................................................................... 28
Similaridade entre os biscoitos de AR e placebo ....................................... 28
Fluxograma do estudo ............................................................................... 35
Correlação entre os níveis plasmáticos de AIA e expressão de RAH nos pacientes com DRC em HD ....................................................................... 43
ix
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Critérios para Doença Renal Crônica..................................... 2
3
29
30
31
32
27
36
37
38
41
42
Quadro 2. Classificação da Doença Renal Crônica ...............................
Quadro 3. Classificação do estado nutricional segundo o Índice de Massa Corporal (IMC)............................................................
Quadro 4. Classificação do estado nutricional segundo a área muscular do braço corrigida (AMBc)......................................................
Quadro 5. Fórmulas para o cálculo da densidade corporal (DC)............
Quadro 6.
Valores de referência para a classificação do percentual de gordura corporal.....................................................................
Tabela 1. Tabela nutricional do biscoito AR e placebo após o cozimento................................................................................
Tabela 2. Características gerais dos pacientes com DRC em HD incluídos nos grupos AR e placebo..........................................
Tabela 3.
Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre a ingestão calórica de macronutrientes e fibras dos pacientes com DRC em HD incluídos no estudo......................................................
Tabela 4. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre os parâmetros antropométricos dos pacientes com DRC em HD incluídos no estudo..................................................................
Tabela 5. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre os parâmetros bioquímicos nos pacientes com DRC em HD..........................................................................................
Tabela 6. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre a expressão do RAH e NF-κB e os valores plasmáticos do AIA nos pacientes com DRC em HD....................................................
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1O2
%GC AND
AGCC AR AIA
AIDS AMBc AP-1 ARNT BHLH BSA CB CC
COX-2 CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1
DC DCB
DCSE DCSI DCT DCV DP
DRC ELISA ERNs EROs FAV H2O2
HAS HD
HSP-90 IDG IL-10 IL-6 IL-8 IL-9 IC
IMC INF IS
KDIGO LPS
MAPK MLG
NADPH
Oxigênio singleto Percentual de Gordura Corporal Ácido Desoxirribonucleico Ácidos graxos de cadeia curta Amido resistente Ácido Indol-3-Acético Acquired immunodeficiency syndrome Área Muscular do Braço Corrigida Activator Protein-1 (proteína ativadora-1) Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Basic helix looping helix Bovine serum albimune Circunferência do Braço Circunferência da Cintura Cycloxygenase-2 Cytochrome P450, family 1, member A1 Cytochrome P450, family 1, member A2 Cytochrome P450, family 1, member B1 Densidade Corporal Dobra Cutânea Bicipital Dobra Cutânea Subescapular Dobra Cutânea Supra-Ilíaca Dobra Cutânea Tricipital Doença Cardiovascular Desvio Padrão Doença Renal Crônica Enzyme Linked Immunosrbent Assay (ensaio imunoenzimático) Espécies Reativas de Nitrogênio Espécies Reativas de Oxigênio Fístula Arteriovenosa Peróxido de hidrogênio Hipertensão Arterial Sistêmica Hemodiálise heat-shock protein 90 Indoxil-β-D glucuronideo Interleucina-10 Interleucina-6 Interleucina-8 Interleucina-9 Índice de Conicidade Índice de massa corporal Interferon Indoxil Sulfato Kidney disease improving guidelines outcomes Lipopolissacarídeos Proteína quinase ativadas por mitógenos Massa Livre de Gordura Fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida
xi
NFB
NKF NO
TAO OH-
ONOO P23 PAS
NRF2
PBMC
PCR PCS RAH SOD SPSS TFG
TNF-α TCDD
VCAM-1 VCAM-2
WB XAP-2 XRE
Nuclear Factor (fator nuclear) kappa-B National Kidney Foundation Óxido nítrico Transportador de anions orgânicos Radical hidroxila NAD(P)H:Quinona Oxidoredutase 1 Co-chaperona p23 Per-Arnt-Sim Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2) Peripheral Blood Mononuclear Cells (células mononucleares do sangue periférico) Proteína C-Reativa p-Cresil Sulfato Receptor aril hidrocarboneto Superóxido Dismutase Statistical Package for Social Sciences Taxa de Filtração Glomerular 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina Tumor Necrosis Factor-alfa(fator de necrose tumoral-alfa) Vascular Cell Adhesion Molecule-1(molécula de adesão vascular-1) Vascular Cell Adhesion Molecule-2(molécula de adesão vascular-2) Western Blot Proteína associada-X 2 Elementos sensíveis a xenobióticos
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................... vi
ABSTRACT .............................................................................................................. vii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vi
LISTA DE QUADRADOS E TABELAS ..................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... x
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 2
2.1. Doença renal crônica (DRC) ............................................................................ 2
2.2. Hemodiálise ..................................................................................................... 4
2.3. Doença Renal Crônica e Doenças Cardiovasculares ...................................... 5
2.4. Microbiota intestinal na DRC ........................................................................... 6
2.5. Toxinas urêmicas ............................................................................................. 9
2.6. Receptor Aril Hidrocarboneto (RAH) .............................................................. 12
2.7. Inflamação e estresse oxidativo na DRC ....................................................... 14
2.8. Fibras alimentares e DRC .............................................................................. 18
2.9. Amido resistente (AR) e sua ação prebiótica ................................................. 19
3 OBJETIVO ............................................................................................................. 23
3.1. Objetivo geral ................................................................................................ 23
3.2. Objetivo específico ........................................................................................ 24
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 24
4.1. Casuística ...................................................................................................... 24
4.2. Critérios de inclusão ...................................................................................... 24
4.3. Critérios de exclusão ..................................................................................... 24
4.4. Aspectos éticos .............................................................................................. 25
4.5. Delineamento do estudo ................................................................................ 26
4.6. Suplementação .............................................................................................. 28
4.7. Avaliação da ingestão alimentar .................................................................... 28
4.8. Avaliação nutricional ...................................................................................... 28
4.9. Análises bioquimicas ..................................................................................... 32
4.10. Determinação dos níveis plasmáticos do ácido indol acético (AIA) ............. 33
4.11. Determinação dos fatores de transcrição RAH e NF-κB .............................. 33
4.12. Análises estatísticas .................................................................................... 34
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 35
5.1. Caracteristicas gerais .................................................................................... 36
5.2. Avaliação da ingestão alimentar .................................................................... 37
5.3. Avaliação antropométrica .............................................................................. 38
5.4. Parâmetros bioquímicos de rotina, níveis plasmáticos de AIA e expressão do
RNAm do RAH e NF-κB ........................................................................................ 39
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 44
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 47
8 REFERENCIAS ..................................................................................................... 48
9 ANEXOS ................................................................................................................ 60
9.1. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina
UFF/HUAP ............................................................................................................ 60
9.2. Termo de consentimento livre e esclarecido .................................................. 61
9.3. Artigo original a ser submetido: “Resistant starch supplementation effects on
plasma indole 3-acetic acid and mRNA aryl hydrocarbon receptor expression in
hemodialysis patients: Randomized, double blind and controlled trial” ................. 63
9.4. Artigo piloto publicado: “Could resistant starch supplementation improve
inflammatory and oxidative stress biomarkers and uremic toxins levels in
hemodialysis patients? A randomized controlled trial” .......................................... 64
9.5. Artigo original publicado: “A possible link between polyunsaturated fatty acids
and uremic toxins from the gut microbiota in hemodialysis patients: A hypothesis”
............................................................................................................................. 65
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
O receptor aril hidrocarboneto (RAH) foi inicialmente identificado como fator de
transcrição relacionado ao metabolismo de xenobióticos, tendo como principal ligante
ativador as dioxinas (Poland et al., 1976). Desde então foi extensamente estudado
como mediador das respostas celulares contra substâncias tóxicas ambientais. No
entanto, as últimas descobertas mostram que além das dioxinas, outros ligantes
endógenos são capazes de ativá-lo, associando, deste modo, o RAH a diversas vias
bioquímicas/fisiológicas necessárias para manter a homeostase em diferentes tecidos
e tipos de células animais e de humanos (Pohjanvirta et al., 2012; Mulero-Navarro e
Fernandez-Salguero, 2016; Bock et al., 2017; Nebert et al., 2017).
Dentre estes ligantes, encontram-se as toxinas urêmicas, como o ácido indol-
3-acético (AIA), as quais são produzidas a partir do metabolismo de aminoácidos,
principalmente o triptofano, pelas bactérias intestinais (Dou et al. 2015).
Tais toxinas urêmicas encontram-se elevadas em pacientes com doença renal
crônica (DRC), principalmente dentre os que estão em diálise. Em um organismo
saudável, as toxinas urêmicas são facilmente excretadas pelos rins, contudo na DRC
sua depuração encontra-se prejudicada, e os tratamentos dialíticos não são capazes
de filtrá-las por completo devido a forte ligação das mesmas com a albumina sérica
(Deltombe et al., 2015).
As toxinas urêmicas têm sido associadas à inflamação e ao estresse oxidativo
(EO), fatores de risco que levam à progressão da DRC (Mafra et al., 2014) e a maior
incidência de doenças cardiovasculares (DCV) (Lekawanvijit et al. 2015; Hsu et al.,
2017), principal causa de óbito dentre os pacientes com DRC (Dou et al., 2015).
Estudos sugerem que a suplementação de fibras alimentares com função
prebiótica podem exercer possível efeito modulador da microbiota intestinal na
redução da produção de toxinas urêmicas em pacientes com DRC, e assim reduzir a
inflamação e o EO (Koppe et al., 2013; Salmean et al., 2015). Neste contexto, o amido
resistente (AR), uma fibra alimentar com função prebiótica, vem emergindo como
estratégia nutricional (Sirich et al., 2014; Vaziri et al., 2014; Kieffer et al., 2016;
Khosroshahi et al., 2018).
Levando em consideração as novas evidências sobre o RAH e a importância
de compreender o impacto da sua ativação em pacientes com DRC, o objetivo desse
2
estudo foi investigar o efeito da suplementação com AR na via AIA-RAH a qual vem
sendo associada à indução da inflamação e dos riscos cardiovasculares na DRC.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Doença Renal Crônica (DRC)
A DRC consiste em um processo fisiopatológico de múltiplas etiologias que
levam à perda progressiva e irreversível das funções renais. A sua incidência tem
aumentado a nível mundial, em parte pelo envelhecimento da população, mas também
pela crescente prevalência das condições de hipertensão arterial (HAS) e diabetes
melittus (DM), consideradas as principais causas etiológicas da DRC (NKF- KDIGO,
2013; Hill et al., 2016).
O Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K/DOQI) da National Kidney
Foundation (NKF) definiu a DRC como anormalidades na estrutura e/ou na função
renal por um período igual ou superior a 3 meses (K/DOQI, 2002). Tais anormalidades
as quais o K/DOQI estabelece como critério para o diagnóstico da DRC se encontram
no Quadro 1.
Quadro 1. Critérios para a Doença Renal Crônica
Critérios para a Doença Renal Crônica
(Pelo menos um dos fatores abaixo por mais de 3 meses)
Marcadores de
lesão renal
Albuminúria
Anormalidades no sedimento urinário
Distúrbios eletrolíticos e outros devido a lesões tubulares
Anormalidades detectadas por exame histológico
Anormalidades estruturais detectadas por exame de imagem
História de transplante renal
Redução da TFG TFG < 60 ml/min/1,73m2
TFG, taxa de filtração glomerular. Fonte: Adaptado de NKF-KDIGO, 2013.
3
A progressão da DRC é dividida em 5 estágios com base na TFG e nos níveis
de albuminúria (Quadro 2) (K/DIGO, 2012). Até o quarto estágio da DRC o paciente
geralmente encontra-se em tratamento conservador (fase pré-dialítica), no qual o rim
apresenta funções alteradas. Normalmente, somente no quinto estágio há
necessidade do início de terapia renal substitutiva por meio da HD ou da diálise
peritoneal, sendo a primeira em maior frequência (NKF-KDIGO, 2013).
Quadro 2. Classificação da Doença Renal Crônica
Fonte: K/digo, 2012.
De acordo com o Censo de Diálise - Sociedade Brasileira de Nefrologia de
2016, o número total estimado de pacientes em diálise no país em 1 de julho de 2016
foi de 122.825. Este número representa aumento de 31,5 mil pacientes nos últimos 5
anos (91.314 em 2011). Metade desses pacientes encontrava-se na região Sudeste.
A taxa de prevalência global aumentou em relação a 2015 (544/por milhões da
população), com tendência a permanente crescimento anual. Dentre as terapias de
substituição renal a HD foi a mais instituída (92,1%) (SBN, 2016).
4
2.2. Hemodiálise
Na HD, a transferência de solutos ocorre entre o sangue e a solução de diálise
através de uma membrana semipermeável artificial (filtro de hemodiálise ou capilar)
por três mecanismos: a difusão, que é o fluxo de soluto de acordo com o gradiente de
concentração, sendo transferida a massa de um local de maior concentração para um
de menor concentração (depende do peso molecular e características da membrana);
a ultrafiltração é a remoção de líquidos através de um gradiente de pressão
hidrostática; e a convecção é a perda de solutos durante a ultrafiltração, quando ocorre
o arraste de solutos na mesma direção do fluxo de líquidos através da membrana
(Canziani et al., 2005; Gonçalves et al., 2013).
Tradicionalmente, é normatizado que o procedimento hemodialítico tenha a
duração de 4 horas, sendo 3 vezes na semana (Canziani et al., 2005). No Brasil, a
Agência Nacional de Vigilância à Saúde (ANVISA) determina por meio de suas RDCs
(n° 154 de 2004 e n° 11 de 2014) os critérios mínimos para o funcionamento dos
serviços públicos e privados de diálise.
Nos últimos anos, os avanços tecnológicos possibilitaram a melhor sobrevida
dos pacientes em HD. Contudo, até o momento a terapia renal substitutiva não
conseguiu realizar por completo a função renal. Fatores como, biocompatibilidade de
membranas, contaminação do dialisado por endotoxinas, impurezas na água de
diálise, infeção do acesso venoso, acidose metabólica contribuem para agravar o
estado pró-oxidante e pró-infamatório desses pacientes (Cheung et al., 2010; Libetta
et al., 2011; Akchurin e Kaskel, 2015), corroborando deste modo para o aumento das
taxas de hospitalização e mortalidade por DCV (Fouque et al., 2008; Riella et al., 2008;
Zanetti et al., 2011).
5
2.3. Doença Renal Crônica e Doenças Cardiovasculares
O risco de evento/mortalidade cardiovascular em pacientes com DRC em
tratamento dialítico é significativamente maior em comparação pacientes sem DRC,
mesmo na presença de fatores de risco (Schiffrin et al., 2007). Isso porque além dos
fatores de risco tradicionais (obesidade, hipertensão, diabetes, dislipidemia, etc.) e as
situações típicas da doença renal (hipervolemia, anemia, alterações no metabolismo
cálcio-fósforo, etc.), pacientes em HD também apresentam alta prevalência dos
chamados fatores de risco emergentes, tais como homocisteína, lipoproteína (a), EO
e inflamação (Bayés et al., 2006; Stenvinkel et al., 2010).
Os eventos cardiovasculares observados na DRC incluem: doença
coronariana, insuficiência cardíaca congestiva, fibrilação atrial, morte cardíaca súbita,
doença cerebrovascular, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica
(Singh et al., 2014).
Evidências corroboram que o aumento da inflamação é independentemente
associado a desfechos cardiovasculares em pacientes com doença renal. De fato,
altos níveis de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina 6 (IL-6) e proteína C
reativa (PCR) predizem mortalidade cardiovascular em pacientes em HD (Yeun et al.,
2000; Wanne et al., 2002), bem como em pacientes nos estágios 3 e 4 da DRC (Herzig
et al., 2001; Menon et al., 2005).
A PCR, juntamente com a IL-6 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), são
marcadores mais específicos de vulnerabilidade de placa e risco de eventos
cardiovasculares, com dados sugerindo seu papel direto na aterogênese ao promover
adesão de monócitos às células endoteliais, levando à proliferação e migração de
células da musculatura lisa vascular (Wang et al., 2011). As citocinas pró-inflamatórias
também podem promover remodelação cardíaca e hipertrofia, bem como estimular a
apoptose em cardiomiócitos (Wollert et al., 2001).
O aumento dos monócitos CD16 + também contribuem com a aterogênese, e
são independentemente associados com eventos cardiovasculares em pacientes em
diálise (Rogacev et al., 2011). Além disso, inflamação crônica pode promover a
calcificação vascular, via interação com vários marcadores do metabolismo mineral
6
(Carrero et al., 2009).
Recentemente, tem sido sugerido que o desequilíbrio da microbiota intestinal,
verificado em pacientes com DRC, pode ser considerado um novo fator de risco
cardiovascular. O desbalanço da comunidade de bactérias que vivem no intestino
pode levar a perda da integridade da barreira intestinal que, por sua vez, torna-se mais
permeável permitindo a translocação de macromoléculas, bactérias e seus
metabólitos para o sistema circulatório, contribuindo para o quadro de EO e inflamação
(Vaziri et al., 2012; Wong et al., 2014; Ramezani et al., 2014; Mafra et al., 2015).
2.4. Microbiota intestinal na DRC
A microbiota intestinal consiste em uma comunidade de microorganismos
altamente diversificada que vive no intestino humano estabelecendo relação
comensal, simbiótica ou patogênica com o hospedeiro (Lozupone et al., 2012). A partir
do nascimento, a composição da microbiota intestinal começa a ser formada, sendo
diferente entre os indivíduos, em resposta à genética, tipo de parto, alimentação ao
nascer, hábitos alimentares, idade e estilo de vida (Icaza-Chávez, 2013; Tsabouri et
al., 2013; Parks et al., 2013; Power et al., 2014; Schippa e Conte, 2014).
Composta por aproximadamente 10 bilhões de bactérias de diferentes filos, a
microbiota intestinal é a maior do corpo humano (Savage et at., 1997). Recentemente,
a mesma chamou atenção como papel central no desenvolvimento de muitas doenças
crônicas, incluindo DRC (Ramezani et al., 2016).
Em um organismo saudável, a microbiota intestinal realiza diversas atividades,
como o aproveitamento de energia, geração de componentes absorvíveis, produção
de vitaminas e outros nutrientes essenciais. Além disso, regula a imunidade inata e
adquirida, protegendo o hospedeiro contra a invasão de patógenos e tendo papel
relevante na regulação da inflamação crônica através da sua contribuição para a
manutenção da integridade da barreira do epitélio intestinal (Ramezani et al., 2016).
Tais bactérias também atuam na conversão de componentes da dieta, gerando
uma grande variedade de metabólitos que podem ter efeitos benéficos ou maléficos à
saúde. A disbiose instala-se a partir do desequilíbrio da microbiota intestinal,
especificamente entre espécies de bactérias pertencentes a dois filos dominantes
7
(Bacteroidetes e Firmicutes), que pode ser ocasionado por vários gatilhos
(sedentarismo, ingestão de álcool, alimentos e bebidas com aditivos, estresse, uso de
antibióticos, genética, entre outros), inclusive a uremia presente na DRC (Casén et al.,
2015). A disbiose pode promover uma cascata de anormalidades metabólicas,
incluindo infeções, desordens imunológicas, resistência à ação da insulina, EO e
inflamação (Cani et al., 2008 Manco, 2009; Manco et al., 2010; Schippa e Conte 2014).
Vaziri et al., (2013) indentificaram em seu estudo com pacientes em HD, um
aumento nas espécies gran negativas dos gêneros de Enterobacteriaceae e
Pseudomonadaceae (filo Proteobacteria), Bacteroidaceae e Clostridiaceae e
diminuição nas espécies de Lactobacillaceae, Prevotellaceae e Bifidobacteriaceae, e
associaram tais alterações com a inflamação local e sistêmica.
Posteriormente, Wong et al. (2014) demonstraram por meio de sequenciamento
genético que famílias bacterianas contendo enzimas produtoras de urease, uricase,
triptofanase e p-cresol eram mais abundantes dentre os pacientes em HD. Sendo as
famílias bacterianas possuindo fosfotransbutirilase e butirato quinase menos
abundantes em pacientes com doença renal terminal quando comparado ao grupo
saudável.
A elevada concentração de ureia nos fluidos corporais e seu influxo para o trato
gastrointestinal pode favorecer o crescimento de bactérias produtoras de urease,
enzima que atua na conversão de ureia em amônia e hidróxido de amônio (Ramezani
et al., 2016), além uricase e enzimas formadoras de indols e p-cresol. Estes provocam
ruptura dos constituintes proteicos (claudina-1 e ocludina) do complexo de junção
“tight junctions” interpostos entre as células epiteliais e o lúmem, interferindo desta
forma, na permeabilidade intestinal (Bellavia et al., 2013). Concomitante, ao aumento
de tais bactérias, há depleção das bactérias que produzem ácidos graxos de cadeia
curta (AGCC) (Lau et al., 2018).
O aumento na permeabilidade torna o epitélio intestinal menos seletivo, o que
leva a translocação paracelular de endotoxinas, microorganismos nocivos e seus
componentes, tais como o lipopolissacarídeos (LPS), e outros produtos residuais do
lúmen para a circulação sistêmica, contribuindo deste modo para a inflamação (Cani
et al., 2008; Manco, 2009; Manco et al., 2010; Harris et al., 2012; Bellavia et al., 2013).
Outro fator associado à DRC e que contribui para o comprometimento estrutural
8
do epitélio intestinal e para alterações na microbiota é a baixa ingestão de fibras, por
consequência da restrição de alimentos fontes de potássio (para prevenir
hipercalemia), incluindo frutas e vegetais que são fontes comuns de fibras alimentares,
as quais são fermentadas pelas bactérias intestinais e dão origem aos AGCC,
substâncias de suma importância para saúde intestinal (Haenen et al., 2013; Umu et
al., 2015; Lange et al., 2015, Lau et al., 2015).
Deste modo, o desequilíbrio da microbiota intestinal favorece a produção de
substâncias pró-inflamatórias, incluindo toxinas urêmicas: indoxil sulfato (IS), ácido
indol-3-acético (AIA), p-cresil sulfato (PCS), ácido hipúrico, ácido kinurênico, 3-carboxi-
4- metil-5-propil-2-furanpropanóico, N-óxido trimetilamina (Poveda et al., 2014; Wong
et al., 2014), ácidos biliares desconjugados, ácido desoxicólico e ácido litocólico
(Ridlon et al., 2006).
Considerando o papel da disbiose intestinal na promoção da inflamação
sistêmica, sua presença pode contribuir para o desenvolvimento e progressão da DRC
e de seus principais fatores de risco (diabetes e hipertensão). A interação entre a
disbiose intestinal e a DRC é bidirecional, uma vez que ao promover a inflamação
intestinal crônica a disbiose infuencia na doença renal, e a DRC modificando o meio
bioquímico e biofísico do intestino, através do aumento de substâncias nocivas tais
como as toxinas urêmicas, desequilibra a microbiota intestinal, criando assim um ciclo
vicioso (Vaziri et al., 2016).
A microbiota intestinal é capaz de promover a conversão de componentes
dietéticos levando à formação de grande variedade de metabólitos que podem ter
efeitos benéficos ou adversos à saúde humana (Blaut & Clavel, 2007). Na DRC, em
decorrência da uremia, há aumento na síntese dessas toxinas urêmicas supracitadas,
como o AIA, por meio da fermentação de aminoácidos da dieta.
9
2.5. Toxinas urêmicas
De acordo com o European Uremic Toxin Work Group (EUTox), as toxinas
urêmicas são classificadas em três grupos principais de acordo com o seu padrão de
remoção por diálise (Vanholder et al., 2001; 2003). Distinguem-se entre: pequenos
compostos solúveis em água (Vanholder et al., 2001), compostos ligados às proteínas
(Wikoff et al., 2011) e as chamadas moléculas intermediárias, que são na maioria
pequenos peptídeos (Vanholder et al., 2016). Há também a classificação referente ao
seu local de síntese, o que difere as que são produzidas no intestino e as que são
produzidas em outros órgãos (Meijers et al., 2014).
Estilo de vida alterado, padrão alimentar inadequado, diminuição da ingestão
de fibras, e complicações patológicas (por exemplo, a síndrome urêmica presente na
DRC) levam à disbiose intestinal e à produção excessiva de toxinas urêmicas, como
IS, AIA, PCS a partir da metabolização de aminoácidos provenientes da dieta (Mafra
et al., 2014; Ramezani et al., 2016).
Dentre estes, encontra-se o triptofano, aminoácido essencial, presente em
alimentos de origem animal como carnes, leite e ovos, sendo de suma importância na
síntese de várias proteínas corporais (Keszthelyi et al., 2009). Em um ambiente de
disbiose, o triptofano, ao escapar do processo digestivo e absortivo alcança o intestino
grosso e é metabolizado a indol por meio da ação da enzima triptofanase expressa em
bactérias intestinais, como Escherichia coli e Clostridium sporogenes (Zhu et al, 2011;
Ramezani et al., 2016).
Após serem absorvidos para a corrente sanguínea, os indóis alcançam o tecido
hepático onde são hidroxilados por Citocromo P450 2E1 (CYP2E1) para formar
indoxilo, seguido por sulfatação por sulfotransferases sendo convertidos a IS (Niwa et
al., 2010; Ramezani et al., 2016). Diferente do IS, o AIA é sintetizada no intestino por
meio do metabolismo de triptofano pelas bactérias Clostridium sporogenes,
Clostridium bartlettii e Escherichia coli ou no tecido através da via triptamina (Zhu et
al, 2011; Ramezani et al., 2016) (Figura 1).
10
Figura 1. Produção das toxinas urêmicas IS e AIA.
A forte ligação dessas toxinas urêmicas à albumina sérica dificulta a completa
eliminação das mesmas por meio da diálise (peritoneal ou hemodiálise) (Sakai et al.,
1995; Fujii et al., 2009; Basile et al., 2010; Meyer et al., 2012), e seus níveis
aumentados estão associados à deterioração da função renal, complicações da DRC,
bem como doenças cardiovasculares e mortalidade nestes pacientes (Watanabe et
al., 2013; Lin et al., 2015).
A última revisão considerando grande variedade de toxinas urêmicas ligadas a
proteínas foi publicado há quase 10 anos (Jourde et al., 2009). Depois disso, as
pesquisas foram restritas a toxinas específicas como IS e o PCS (Leong et al., 2016;
Gryp et al., 2017), que de fato, apresentam correlação negativa com a função renal e,
seus efeitos foram confirmados por número crescente de estudos (Lin et al., 2011;
Huang, et al., 2012).
O AIA recebeu menos atenção do que o IS, mas essa tendência mudou
especialmente nos últimos anos. O AIA está associado às DCVs por indução de
mecanismos pró-inflamatórios (Wu et al., 2011; Dou et al., 2015) e produção de fatores
11
teciduais pró-coagulante (Gondouin et al., 2013).
Após ser captado por transportadores de ânions orgânicos (TAO), o AIA induz
lesão tubular proximal por estimular a produção de radicais livres celulares (Motojima
et al., 2002) afetando a viabilidade celular (Edamatsu et al., 2014) e acelerando a
progressão da DRC (Satoh et al., 2003). Além disso, AIA está ligado a diversos efeitos
metabólicos, como a inibição da captação de digoxina (Tsujimoto et al., 2008) e
glucuronidação renal (Mutsaers et al., 2013).
Em um estudo, o AIA não teve efeito pró-oxidante (Oliveira et al., 2007), mas
este composto pode precisar ser oxidado para se tornar biologicamente ativo, como
sugerido por Dalmazzo et al., 2011, que mostraram o efeito citotóxico do AIA oxidado.
Em estudo experimental, Satoh et al. (2003) demonstraram que tratamento com AIA
induziu esclerose glomerular e fibrose intersticial em ratos.
Além disso, em ensaio observacional, o AIA foi associado ao aumento da
mortalidade e eventos cardiovasculares de pacientes com DRC com níveis de AIA
>3.73 µM quando comparados com pacientes com menores níveis (IAA<3.73 µM).
Para confirmar tal associação, foi observado por meio de cultura de células que o AIA
induziu o EO por aumentar a síntese de EROs, e a inflamação via RAH/ p38MAPK/NF-
κB, aumentando citocinas inflamatórias, moléculas endoteliais e ativando a COX-2
(Dou et al., 2015).
Vários mecanismos foram propostos para explicar a ação prejudicial das
toxinas urêmicas. Dentre eles, estudos identificaram que tais toxinas entram na célula
alvo por meio de transportadores específicos, como TAO (Deguchi et al., 2004;
Deguchi et al., 2005; Miyamoto et al., 2011) e então, exercem sua toxicidade por meio
da ativação do NADPH celular oxidase via RAH ocasionando aumento da produção
de EROs que, por sua vez, desencadeia a produção de citocinas inflamatórias (TNF-
α, IL-6 e TGF-β1) e induz a expressão de miostatina e atrogina-1, que estão envolvidas
na perda muscular (Enoki et al, 2016).
Recentemente, o AIA e outros metabólitos de triptofano mostraram ser potentes
agonistas endógenos para o RAH (Chowdhury et al., 2009; Schroeder et al., 2010). A
ativação do RAH parece desempenhar papel central na ação de várias toxinas
urêmicas (Sallee et al, 2014).
12
2.6. Receptor Aril Hidrocarboneto (RAH)
O RAH é um fator de transcrição alocado no subgrupo hélice-loop-hélice básico
da família de fatores de transcrição Per-Arnt-Sim (bHLH/PAS), uma classe de
proteínas que são consideradas sensores ambientais, amplamente expresso a nível
central e sistêmico (Bersten et al, 2013).
A ativação do RAH foi inicialmente conhecida por mediar a expressão dos
genes do metabolismo da Fase I e da Fase II pertencentes a família do P450 (incluindo
CYP1A1/2, CYP1B1, UGT1A1/6 e sulfotransferase), necessários para a detoxificação
de xenobióticos. A princípio acreditava-se que os ligantes do RAH de alta afinidade
deveriam conter duas ou mais estruturas de anel cíclico ou aromático para serem
funcionais, tais como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, hidrocarbonetos
aromáticos alogenados (por exemplo, 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD),
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e bifenilos policlorados coplanares (PCBs)
(Denison et al., 2003; Bock et al., 2013).
Uma meta-análise destacou associação consistente entre exposição a TCDD e
aumento do risco de mortalidade cardiovascular, especialmente de doenças
isquêmicas (Humblet et al., 2008). A ativação de RAH por TCDD leva à promoção de
lesões ateroscleróticas e regulação positiva da expressão de MCP-1 em macrófagos
(Wu et al., 2011). Além disso, a exposição a PCBs co-planares apresentam risco
aumentado de infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico
(Humblet et al., 2008).
Posteriormente, estudos indicaram que o RAH é capaz de regular funções
homeostáticas por meio de ligantes endógenos, agonistas ou antagonistas com
diferentes potenciais de ativação do receptor, incluindo: a bilirrubina; moléculas
derivadas do ácido araquidônico; metabólitos heme; compostos dietéticos como indol-
3-carbinol e flavonoides (ex.: resveratrol, quercetina) (Nguyen & Bradfield, 2008), e
metabólitos do triptofano (Heath-Pagliuso et al.,1998; Rannug et al.,1987,1995;
Wincentet et al., 2012).
O RAH está localizado no citoplasma celular, no estado inativo, complexado a
proteínas estabilizadoras, incluindo duas proteínas heat-shock 90 (HSP-90), uma co-
chaperona p23 (P23) e uma proteína associada-X 2 (XAP2) (Beischlag et al., 2008).
13
Após a ligação com um de seus agonistas, o RAH sofre mudança conformacional e
transloca-se para o núcleo, onde suas proteínas estabilizadoras se dissociam do
complexo, para que este se ligue ao aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT),
também conhecido como hipóxia indutível fator 1β (HIF1β) (Swanson e Bradfield,
1993; Swanson, Chan e Bradfield, 1995; Nebert e Dalton, 2006), através do seu
domínio Per-Arnt-Sim (PAS), formando o dímero RAH-ARNT. Este liga-se ao
elemento responsivo à dioxina (DRE ou elemento de resposta xenobiótica) nas
regiões promotoras de genes alvo (Patel et al., 2009) (Figura 2).
Figura 2. Possível mecanismo de ativação do RAH por toxinas urêmicas derivadas do metabolismo do
triptofano. Fonte: Brito et al., 2017.
14
O RAH pode regular um conjunto diverso de genes envolvidos em função
imune, proliferação e sinalização inflamatória (Kraemer et al., 1996; Ikuta et al., 2006;
Patel et al., 2006), desenvolvimento vascular hepático (Harstad et al., 2006),
diferenciação de células T em células Th17 (Veldhoen et al., 2008), processo
reprodutivo (ovulação e folicogênese) e desenvolvimento de órgãos na vida fetal
(Jiang et al., 2010).
A ativação do NF-B, bem como do RAH pode ocorrer mediante a ligantes
endógenos, e dentre eles, as toxinas urêmicas formadas pela microbiota intestinal vêm
se destacando no cenário da DRC. Schroeder et al. (2010) foram os primeiros
pesquisadores que mostraram que o indol presente em toxinas é ligante em potencial
do RAH, exercendo toxicidade por esta via.
Particularmente, o acúmulo de toxinas urêmicas indólicas nestes pacientes
pode ser estímulo persistente para ativação de RAH (Sallee et al., 2014), bem como
para o NF-B (Stockler et al., 2015) sendo atribuído a este receptor possível papel na
inflamação e EO e consequentemente sobre o sistema cardiovascular nos pacientes
com DRC (Gondouin et al., 2013; Sallee et al., 2014). No entanto, os mecanismos
exatos pelos quais níveis mais elevados destes solutos contribuem para a DCV e
mortalidade, ainda não foram elucidados.
2.7. Infamação e estresse oxidativo na DRC
A inflamação desempenha papel central na patogênese da DRC diretamente
ao infligir lesão renal e indiretamente ao promover o desenvolvimento e progressão
dos distúrbios que a causam, incluindo diabetes, hipertensão e proteinúria (Pashkow,
2011; Sundaram et al., 2014; Modaresi et al., 2015; Machowska et al., 2016).
Múltiplos fatores contribuem para a inflamação crônica em pacientes com DRC.
Com o declínio da função renal, há aumento de citocinas pró-inflamatórias na
circulação sanguínea destes pacientes devido à deficiência da depuração das
mesmas pelos rins debilitados (Carrero et al., 2009; Rosengren et al., 2013). O
ambiente urêmico promove EO, o qual é altamente pró-inflamatório. Influências
15
epigenéticas, resultantes da interação entre antecedentes genéticos, dieta, estilo de
vida e meio ambiente também contribuem para aumento da inflamação (Akchurin et
al., 2015).
Eventos infecciosos e trombóticos fornecem estímulos inflamatórios adicionais,
particularmente em pacientes em diálise, incluindo infecções do local de acesso,
fístulas intravenosas trombosadas e enxertos (Nassar et al., 2013). A qualidade
microbiológica do dialisato e impurezas na diálise, incluindo a água, também pode
colaborar com a inflamação (Santoro et al., 2014).
As citocinas inflamatórias são proteínas de baixo peso molecular produzidas
por diferentes células do sistema imune e atuam como mensageiros (Bilate et al.,
2007; Vianna et al., 2011). Dentre os marcadores circulantes comumente avaliados
como indicadores de inflamação encontra-se as interleucinas (ILs) (IL-1, a IL-1b; a IL-
6, TNF-α, dentre outras), interferons e fatores estimuladores de colônias (Pecoits-Filho
et al., 2003; Vilaysane et al., 2010; Dinarello et al., 2011; Anders et al., 2011). A PCR
também é um marcador inflamatório produzido por estímulos de citocinas, tais como
a IL-6 (Ramos et al., 2009; Gomes et al., 2010; Colombo et al., 2012).
O desenvolvimento de inflamação na DRC começa bem antes da necessidade
de diálise, e níveis elevados de biomarcadores inflamatórios, como a IL-6 e PCR
sugerem que a DRC e a diálise podem ser vistas como processos inflamatórios de
baixo grau (Shlipak et al., 2003; Oberg et al., 2004). Enquanto a liberação aguda de
citocinas pró-inflamatórias podem ter efeitos benéficos, a inflamação persistente de
baixo grau tem sido reconhecida como importante contribuinte para o risco de
mortalidade, eventos cardiovasculares, progressão e outras complicações na DRC
(Akchurin et al., 2015).
O EO por sua vez, pode ser definido como perturbação da função celular e
molecular causada pelo desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs), espécies reativas de nitrogênio (ERNs) e a capacidade antioxidante
natural das células (Small et al., 2012). Em condições normais, a produção de
espécies reativas ativa muitas vias benéficas de sinalização que mantêm a
homeostase, mas o excesso de produção das mesmas é altamente prejudicial. EROs
e ERNs são constantemente produzidas em organismos aeróbios como subprodutos
16
do metabolismo de oxigênio e, incluem radicais livres como o ânion superóxido, o
radical hidroxila, o oxigênio singleto, o peróxido de hidrogênio, e também o
peroxinitrito, proveniente do óxido nítrico (Jung e Kwak, 2010; Powers et al., 2011).
O aumento do EO na DRC, similarmente a outros estados pró-oxidantes, é
caracterizado pela geração excessiva de compostos oxidantes devido à ativação
positiva de vias enzimáticas incluindo a nicotinamida adenina dinucleotídeo, fosfato
oxidase, lipoxigenase, xantina oxidase, óxido nítrico sintase desacoplado e a cadeia
respiratória mitocondrial (Locatelli et al., 2003; Small et al., 2012).
A redução dos mecanismos de defesa antioxidantes, tanto os enzimáticos
quanto os não enzimáticos, amplifica ainda mais esse estado de aumento do EO na
DRC. À ativação defeituosa do fator de transcrição factor nuclear factor-erythroid 2-
related factor 2 (Nrf2), que é o principal regulador de cerca de 250 genes codificando
enzimas antioxidantes e citoprotetivas e proteínas contribui para a capacidade
antioxidante prejudicada na DRC (Jiang et al., 2010; Kim e Vaziri, 2010; Aminzadeh
et al., 2013; Vaziri et al., 2014).
A superóxido dismutase, a catalase e a glutationa peroxidase têm sido
tradicionalmente consideradas como os principais mediadores da via de proteção
antioxidante enzimática (Yilmaz et al., 2006). Além disso, outra família de enzimas, as
paraoxonases (PON), que compartilham propriedades distintas, tem recebido cada
vez mais atenção devido ao seu potencial antioxidante (Furlong et al., 2016).
Pacientes com DRC exibem comprometimento da respiração mitocondrial,
indicativa de metabolismo aeróbico desregulado e aumento do EO (Granata et al.,
2009). O dano mitocondrial progressivo resulta em perda de eficiência da cadeia de
transporte de elétrons, aumento na geração de EROs e redução na produção de ATP,
molécula essencial para geração de energia (via metabolismo aeróbico e fosforilação
oxidativa) necessária para reabsorção tubular.
O excesso desses radicais livres leva à oxidação de macromoléculas como
ácido desoxirribonucleico (DNA), proteínas e lipídeos (Vaziri et al., 2004; Himmelfarb,
2009), observada em diversas doenças como diabetes mellitus, HAS e insuficiência
cardíaca congestiva (Appendino et al., 2011). A DRC por si só é fonte de radicais
livres, tendo em vista que as toxinas urêmicas induzem à oxidação de lipídeos e
17
Citoplasma
Células de crescimento, diferenciação e proliferação
NF-β
VCAM-1, ICAM-1 e e-selectina Núcleo
TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6 e IL-12 NF-β
EROs
proteínas, levando à superprodução de radicais livres (Stepniewska et al., 2005; Ruiz
et al., 2013). O EO contribui para a senescência renal e a apoptose celular, fibrose
renal e diminuição da regeneração das células renais (Locatelli et al., 2003).
O NF-кB é um fator de transcrição redox que regula a transcrição de ampla
gama de genes, incluindo aqueles associados à inflamação como citocinas pró-
inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1b, IL-2, IL-6, IL-12, moléculas de adesão
leucocitária (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) (Antunes et al., 2009; Kim et al., 2010).
Este fator de transcrição encontra-se no citoplasma ligado às proteínas
inibitórias (IB) (Salminen et al., 2008; Gloire et al., 2009). Em resposta a estímulos,
incluindo: citocinas, mitógenos, fatores de crescimento de RNA de cadeia dupla,
produtos finais de glicação, toxinas urêmicas, LPS, produtos e várias formas virais ou
bacterianas de estresse celular, EO, as proteínas IB são rapidamente fosforilada pela
IB quinase em resíduos específicos de serina, seguida de ubiquitinação, e finalmente
degradadas pelo 26S proteassoma. Este processo resulta na dissociação do NF-B e
translocação para o núcleo, ativando genes-alvo, envolvidos com inflamação,
imunidade, apoptose, proliferação e diferenciação celular (Salminen et al., 2008). Tal
mecanismo é representado na Figura 3.
Figura 3: NF-B e resposta inflamatória. Fonte: Adaptado de Pedruzzi et al., 2012.
As EROs são capazes de ativar de forma exacerbada diversos fatores de
transcrição, destacando-se o NF-B, que por sua vez, promove a síntese de citocinas
pró-inflamatórias, potencializando desta forma a cascata inflamatória. Vale ressaltar
que a produção dessas citocinas provoca o EO através do aumento da produção de
EROs e ERNs, formando-se, deste modo, um ciclo vicioso entre o EO e a
superprodução de citocinas pró-inflamatórias (VaziriI et al., 2004; Aminzadeh et al.,
18
2013).
O NF-B tem sido associado às mais variadas doenças, incluindo a DRC. A
gravidade da lesão glomerular e tubulointersticial e, a perda da função renal estão
diretamente relacionadas à quantidade de células inflamatórias presentes no
interstício (Noronha et al., 2002). Experimentos com animais demonstraram que o NF-
B tem importante papel patogênico nos eventos celulares relacionados a progressão
da DRC (Donadelli et al., 2000, Tamada et al., 2006).
Deste modo, tratamentos antiinflamatórios capazes de inibir/modular a ativação
de NF-B são necessários para minimizar os efeitos negativos que tal via pode
ocasionar em pacientes com DRC (Soares et al. 2004; Kim et al., 2010; Kim e Vaziri,
2010).
2.8. Fibras alimentares e DRC
A fibra dietética foi definida como "a parte comestível de plantas ou carboidratos
análogos que resistem à digestão e absorção no intestino delgado humano, com
fermentação completa ou parcial no intestino grosso", e é dividida em três categorias:
insolúvel, solúvel e AR (Codex Alimentarius, 2010; OMS, 2010). A subdivisão é devido
a diferenças na estrutura química, física e suas propriedades funcionais (Sizer et al.,
2008).
As recomendações atuais para a ingestão de fibras alimentares na dieta variam
de acordo com a idade, sexo e consumo de energia, com a recomendação de ingestão
adequada de cerca de 14 g de fibra por 1000 kcal (Instituto de Medicina. Ingestão de
referência dietética: energia, carboidratos, fibras, gorduras, ácidos graxos, colesterol,
proteínas e aminoácidos, 2005), ou 25-30 g/dia para a população saudável de acordo
com a ADA. No entanto, os dados de NHANES III, demonstraram que a ingestão
média de fibra alimentar na população de DRC é de cerca de 15,4 g/dia,
(Krishnamurthy et al., 2012), ou seja, quantidade muito menor do que a ingestão
recomendada de fibra para a população saudável que é de 25 a 30g/dia segundo IOM,
2005.
O consumo adequado de fibras alimentares por pacientes com DRC é de
grande importância tendo em vista os benefícios que promovem na redução da
19
inflamação, acidose metabólica e complicações endócrinas, através da modulação da
microbiota intestinal, fatores associados à progressão da DRC e aumento da
mortalidade nesses indivíduos (Meijers et al., 2010; Vaziri et al., 2014; Sirich et al.,
2014; Salmean et al., 2015; Keiffer et al., 2016).
2.9. Amido resistente (AR) e sua ação prebiótica
O termo "amido resistente" foi utilizado pela primeira vez em 1982 por Englyst
et al., caracterizando "uma pequena fração de amido que é resistente à hidrólise de
de amilase in vitro". Mais de uma década depois, o mesmo autor confirmou que esse
mesmo tipo de amido também era resistente à hidrólise in vivo usando indivíduos
saudáveis (Englyst et al., 1996).
Atualmente, AR é definido como a soma de amido e seus produtos de
degradação, o qual resiste a digestão pela amilase pancreática humana no intestino
delgado, atinge o cólon e é usado como substrato para fermentação bacteriana. O AR
comporta-se fisiologicamente semelhante a fibra solúvel (Topping et al., 2003; Moraes
et al, 2016). O AR foi classificado em cinco subtipos:
- Tipo I: Encontrado no endosperma de cereais, grãos ou sementes. Enredada em
uma matriz não digerível composta por material de proteína e parede celular. Essa
estrutura física dificulta a digestibilidade de AR. Alimentos como pães (feitos com
grãos inteiros ou acrescidos de grãos) e macarrão (feito com trigo duro por extrusão)
contém este tipo AR.
- Tipo II: grânulos de amido não gelatinizados. Eles são encontrados em alimentos
como amido de batata cru, amido de banana verde, amido de gingko e amido de milho
com alta concentração de amilose, que exibe o polimorfo tipo B ou C e são altamente
resistentes à hidrólise enzimática. No entanto, após o cozimento, o amido é
gelatinizado, e parte de seu conteúdo se torna digerível.
- Tipo III: Presente em alimentos submetidos ao processo de retrogradação, em que
foram rapidamente resfriados após o cozimento. Neste processo, a rápida mudança
de temperatura causa modificação da estrutura linear de amilose para formar
estruturas de dupla hélice. Depois de passar pelo processo de retrogradação, as
20
moléculas de amilose não se dissociam depois de cozinhar devido à sua alta
temperatura de gelatinização.
- Tipo IV: Formado por modificações químicas com a adição de éter, éster, octenil
succinil ou grupos acilo, tornando impossível a hidrolise pela amilase, e desta forma,
sendo fermentável por microorganismos.
- Tipo V: decorre da interação entre amido e outros componentes, tais como lipídios,
amilose e cadeias longas e ramificadas de amilopectina a partir de complexos
helicoidais com ácidos graxos e álcoois gordurosos após interagir com os lipídios
(Keenan et al., 2015).
O AR exerce funções de prebiótico (Keenan et al., 2015). O termo prebiótico foi
definido pela primeira vez em 1995 por Gibson e Roberfroid como um "ingrediente
alimentar não digerível que afeta beneficamente o hospedeiro estimulando
seletivamente o crescimento e/ou atividade de um ou um número limitado de bactérias
no cólon, melhorando desta forma a saúde do hospedeiro".
Ao longo do tempo, esta definição foi refinada e, atualmente, o prebiótico é
considerado um substrato seletivamente fermentado que permite modificações
específicas na composição e/ou atividade da microbiota gastrointestinal e assim
confere efeitos benéficos sobre o hospedeiro " (Gibson et al., 2010).
O AR é fermentado no intestino grosso por bactérias simbióticas (Firmicutes,
Bacteroidetes e Actinobacterium), as quais possuem atividade enzimática capaz de
clivar as ligações α 1,4 e α 1,6 do AR resultando como produtos desta fermentação os
AGCC (Wang et al., 2014), além de, gases (metano, hidrogênio, dióxido de carbono),
ácidos orgânicos (lactato, succinato e fumarato) e álcoois (metanol e etanol). Os
AGCC promovem a redução do pH do intestino, que permite a modulação da
microbiota intestinal (Martinez et al., 2010; Tachon et al., 2013; Haenen et al., 2013;
Umu et al., 2015; Lange et al., 2015), aumento da massa fecal, bem como os efeitos
da melhora da sensibilidade à insulina (Bodinham et al., 2014; Maki et al., 2015),
redução do perfil lipídico (Nichenametla et al., 2014; Dodevska et al., 2016) e
adiposidade (Bodinham et al., 2014; Higgins, 2014; Dodevska et al., 2016).
Os mecanismos de ação dos prebióticos no intestino são complexos e, várias
21
hipóteses têm sido propostas tal como a sua ação na modulação na composição da
microbiota do cólon; estimulação do crescimento bifidobactérias; melhoria da glicemia
e resistência à insulina pela secreção de glucagon-like peptide-1; melhoria
dislipidemia; redução da fome e aumento da sensação de saciedade pelo aumento da
secreção de peptídeo YY; redução dos níveis de LPS na corrente sanguínea; redução
da digestão de macronutrientes, retardando o esvaziamento gástrico e/ou o tempo de
trânsito intestinal; efeitos imunomoduladores; redução da produção de toxinas
urêmicas e atenuação do EO e inflamação (Meijers et al., 2010; Gibson et al., 2010;
Koppe et al., 2013; Ramezani et al., 2014; Mafra et al., 2014; Vaziri et al., 2014; Sirich
et al., 2014; Salmean et al., 2015; Barczynska et al., 2015; Valcheva e Dieleman, 2016;
Kieffer et al., 2016; Esgalhado et al., 2016).
De acordo com a literatura, são necessários 20 g/dia de AR para obter
benefícios para a saúde (Topping et al., 2001). No entanto, em uma pesquisa
conduzida por Murphy et al. (2008) foi demonstrado que a ingestão usual de AR é de
aproximadamente 4,9 g/dia nos EUA e de 3,2 a 5,7 g/dia na Europa (Murphy et al.,
2008).
Os efeitos mais comuns do AR incluem o aumento da massa fecal, menor pH
colônico, redução da glicemia, e melhora na saúde intestinal (Keenan et al., 2015).
A maioria dos estudos envolvendo suplementação de prebióticos em pacientes
com DRC observou redução nos níveis plasmáticos de toxinas urêmicas,
particularmente de p-CS, que é preditora independente de DCV nestes pacientes
(Meijers et al. 2010; Koppe et al., 2013; Salmean et al., 2015).
Estudos recentes demonstraram que a suplementação com AR é capaz de
contribuir para o equilíbrio da microbiota intestinal, e deste modo, melhorar a
integridade da mucosa intestinal e reduzir a endotoxemia, atenuando deste modo a
inflamação sistêmica na DRC (Sirich et al., 2014; Vaziri et al., 2014; Kieffer et al.,2016).
A suplementação de AR (590 g/kg de HI-MAIZE durante 3 semanas), em ratos
nefrectomizados, demonstrou eficácia na redução da progressão da doença e
atenuação da fibrose, inflamação e EO por ativação da expressão de NRF2 e redução
de NF-кB (Vaziri et al., 2014). Recentemente, outros pesquisadores revelaram
melhora no desequilíbrio da microbiota intestinal bem como na restauração da ruptura
22
da barreira epitelial intestinal com suplementação de AR em ratos nefrectomizados
(Kieffer et al.,2016).
Embora os estudos sugiram possível efeito modulador da microbiota intestinal
em pacientes renais por redução da produção de toxinas urêmicas e com isso menor
ativação de cascata inflamatória. Nenhum estudo até o momento avaliou o impacto da
suplementação com prebióticos, especificamente AR, na expressão do RAH e níveis
de AIA.
23
3. OBJETIVO
3.1. Objetivo geral
Avaliar os efeitos da suplementação oral com AR sobre a expressão do RAH
em pacientes com DRC em HD.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar antes e após 4 semanas de suplementação com AR e placebo:
- Níveis totais da toxina urêmica AIA
- Expressão mRNA do marcador inflamatório NF-кB
- Parâmetros bioquímicos de rotina;
- Estado nutricional;
- Ingestão alimentar;
- Possíveis correlações entre os parâmetros supramencionados.
24
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Casuística
Trata-se de um estudo longitudinal do tipo ensaio clínico randomizado, duplo-
cego e controlado por placebo. Foram selecionados 43 pacientes com DRC em
programa dialítico regular nas Clínicas Renalcor em Nova Iguaçu/RJ e Rio
Comprido/RJ. Sendo este estudo parte de um grande projeto intitulado “Efeito da
suplementação com amido resistente no perfil da microbiota intestinal e de
marcadores cardiovasculares em pacientes com doença renal crônica”.
Todos os pacientes foram previamente informados sobre a coleta e uso de
material biológico. Os dados demográficos e clínicos foram obtidos através da análise
de prontuários e entrevistas com os pacientes no momento da coleta de sangue.
4.2. Critérios de inclusão
Foram incluídos no estudo pacientes do sexo masculino e feminino com DRC
em tratamento de HD (há mais de 6 meses), com idade entre 30 e 75 anos e que
possuíssem fístula arteriovenosa (FAV) como acesso vascular.
4.3. Critérios de exclusão
Não foram incluídos: gestantes, pacientes com doenças auto-imunes,
infecciosas, neoplásicas e AIDS; pacientes com cateter para o acesso hemodialítico;
pacientes em uso de drogas catabolizantes, suplementos vitamínicos antioxidantes,
pré, pró ou simbióticos e de antibióticos nos últimos 3 meses antes do início deste
estudo. Pacientes que praticavam exercício físico também foram excluídos.
4.4. Aspectos éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal Fluminense - Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF)
recebendo como número 1.334.263 (Anexo 1) e está registrado no Clinical Trials
service of the US National Institutes of Health com o número NCT02706808. Os
pacientes foram informados sobre a pesquisa e assinaram o termo de consentimento
livre e esclarecido (Anexo 2).
25
4.5. Delineamento do estudo
Após a seleção dos pacientes, estes foram alocados no grupo AR ou no grupo
placebo por meio de randomização manual simples, realizada por um indivíduo não
envolvido diretamente na pesquisa. Tal subdivisão não foi revelada aos pesquisadores
antes das análises dos dados. Os pacientes envolvidos no estudo também não foram
informados em qual grupo estavam alocados.
Durante 4 semanas os pacientes foram suplementados diariamente com AR ou
placebo sob a forma intercalada de biscoito (1 pacote/dia) e pó (1 sachê/dia) (Figura
4). Cada pacote de biscoito continha 9 unidades e foi entregue por um funcionário da
clínica durante a sessão da HD para o consumo dos pacientes no local. Os sachês (4
pacotes/semana) foram entregues a cada primeiro dia da semana de sessão de diálise
(2f ou 3f), com recomendação do seu consumo nos dias sem diálise. Os pacientes
foram orientados a misturar o pó com a refeição ou diluir em suco, água, leite ou
iogurte.
Figura 4. Delineamento do estudo.
26
Coleta de sangue (para as análises bioquímicas, AIA, RAH e NF-κB),
antropometria e recordatório alimentar foram realizados antes e após o período de
suplementação.
Durante o período de intervenção, todos os pacientes foram acompanhados,
através de contato telefônico semanal, por uma nutricionista envolvida na pesquisa
para certificar a adesão ao estudo e registrar possíveis sintomas ou dificuldades.
Os pacientes recebiam orientação dietética hipossódica e prescrição de 1,2g a
1,4g de proteína/kg/dia e 30 a 35kcal/kg/dia, como recomendado para pacientes em
HD, de acordo com suas necessidades. O acompanhamento dietético foi realizado
pela nutricionista da clínica e direcionado de acordo com os exames bioquímicos dos
pacientes podendo ser prescrita dieta hipocalêmica e hipofosfatêmica, conforme os
resultados bioquímicos.
4.6. Suplementação
O AR utilizado em nossa intervenção foi o amido de milho HI-MAIZE® 260
produzido pela Ingredion a partir da variedade de milho híbrido com alto teor de
amilose. Este é um AR não modificado quimicamente do tipo II de alta quantidade de
amilose na sua constituição (60% amilose e 40% amilopectina). Geralmente o amido
de milho comum tem na sua constituição apenas 20% de amilose e 80% amilopectina.
Após vários testes, concluímos que a quantidade máxima de HI-MAIZE® para
a confecção de uma porção de biscoitos (9 unidades de aproximadamente 10 g cada)
palatáveis e não quebradiços era de 48 g/dia que contêm cerca de 30 g de AR. No
entanto, após o seu cozimento a quantidade de AR reduziu para cerca de 16 g, devido
à gelatinização de parte do amido; a porção de AR presente foi analisada pelo método
AOAC usando o kit K-RSTAR (Megazyme®, Wicklow, Ireland). Foi oferecida a mesma
quantidade de AR/dia em pó no sachê, 26 g de HI-MAIZE® contêm cerca de 16 g de
AR.
O placebo consistiu em polvilho doce e foi utilizada a mesma quantidade, cerca
de 20 g/dia, para a confecção de uma porção de biscoitos e para colocar em um sachê.
Pacotes de biscoito e sachês com pó, AR e placebo, continham
aproximadamente as mesmas calorias (Tabela 1).
27
Tabela 1. Tabela nutricional dos biscoitos (porção de 100 g) AR e placebo após cozimento.
Margarina Ovo Coco Açúcar Sal HI-MAIZE® TOTAL Polvilho TOTAL
Quantidade (g) 15,3 15,4 16,8 15,3 0,3 47,7 - 20,0 -
Proteína 0,0 1,9 0,2 0,0 0,0 0,2 2,3 0,0 2,1
Hidratos de
Carbono
0,0
0,3
3,4
15,3
0,0
8,1
27,0
16,0
35,0
Lipídeos 12,0 1,3 10,1 0,0 0,0 0,2 23,7 0,0 23,4
Fibra (AR) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 15,8 15,8 0,0 0,0
Kcal 108,0 20,9 105,0 51,2 0,0 63,0 348,1 64,0 349,1
O biscoito e pó de AR ou de placebo foram elaborados (Figura 5) no Laboratório
de Nutrição e Dietética da Faculdade de Nutrição - UFF, eram idênticos em cor,
aspecto, tamanho e forma, e foram acondicionados em embalagens plásticas
idênticas (Figuras 6 e 7).
Figura 5. Elaboração dos biscoitos e porcionamento da suplementação em sachês.
Mistura dos ingredientes Modelagem dos
biscoitos Forno: 8min/180°C Embalagem
28
Placebo AR
Figura 6. Biscoitos com AR para a suplementação Figura 7. Sachês com AR e placebo
Figura 8. Similaridade entre os biscoitos de AR e placebo.
4.7. Avaliação da ingestão alimentar
A ingestão energética diária, de macronutrientes e de fibra foi estimada a partir
do recordatório alimentar de 24 horas, realizado por uma nutricionista da equipe
durante a sessão de diálise, contemplando dois dias de semana (um dia de diálise e
um dia sem diálise) e um dia de final de semana. A média da ingestão foi calculada
utilizando o software de avaliação dietética Nutwin® (UNIFESP).
4.8. Avaliação nutricional
A avaliação do estado nutricional foi realizada por dados antropométricos, através
da avaliação do peso corporal seco, estatura, circunferência do braço (CB),
circunferência da cintura (CC) e dobras cutâneas tricipital (DCT), biciptal (DCB),
29
subescapular (DCSE) e supra-ilíaca (DCSI). A avaliação antropométrica foi realizada
após a sessão de diálise para minimizar erros decorrentes de estado de hiper-
hidratação.
Baseado nessas medidas, foram calculados: índice de massa corporal (IMC),
índice de conicidade (IC), área muscular do braço corrigida (AMBc), percentual de
gordura corporal (%GC) e massa livre de gordura (MLG).
A aferição do peso corporal foi realizada com auxílio de balança calibrada, da
marca FILIZOLA, com capacidade máxima de 150 kg e subdivisões a cada 100 g. O
indivíduo foi posicionado de pé, no centro da base da balança, descalço e com roupas
leves. A estatura foi obtida com o auxílio de estadiômetro acoplado à balança, referida
anteriormente, ficando o indivíduo descalço, com os calcanhares juntos, costas retas
e braços estendidos no prolongamento do corpo.
O estado nutricional foi avaliado segundo o índice de massa corporal (IMC),
obtido pela razão entre o peso e o quadrado da estatura, e sua classificação seguiu o
proposto pela Organização Mundial de Saúde (Quadro 3) (OMS, 2000).
Quadro 3. Classificação do estado nutricional segundo o índice de massa corporal
(IMC).
Classificação IMC (Kg/m2)
Magreza ≤ 18,4
Eutrofia 18,5 - 24,9
Sobrepeso 25 - 29,9
Obesidade ≥ 30
Fonte: OMS, 2000.
Para aferição da circunferência do braço, o braço sem FAV foi flexionado em
direção ao tórax, formando um ângulo de 90º. Em seguida, foi localizado o ponto
médio entre o acrômio e o olécrano e, o paciente permaneceu com o braço estendido
ao longo do corpo, com a palma da mão voltada para a coxa. O braço foi então
contornado com uma fita métrica não extensível graduada em centímetros no ponto
marcado, de forma ajustada, evitando compressão da pele ou folga (Lohman et al.,
1991). A aferição foi realizada em duplicata utilizando-se a média das medidas nas
análises.
30
Para melhor avaliar a reserva de tecido muscular, devido a correção da área
óssea, foi calculada a área muscular do braço corrigida (AMBc) de acordo com a
seguinte fórmula: AMBc= [CB (cm) – (π x DCT (cm)]² / 4π – n, sendo n = 6,5 para
mulheres e n = 10 para homens.
A classificação do estado nutricional segundo a AMBc foi baseada nos valores
de referência estabelecidos por Frisancho (1981), de acordo com o Quadro 4.
Quadro 4. Classificação do estado nutricional segundo a área muscular do braço
corrigida (AMBc).
Desnutrição Grave Desnutrição Leve/Moderada Normal
AMBc Percentil < 5 Percentil entre 5 e 15 Percentil > 15
Fonte: Frisancho, 1981.
Foi utilizado o adipômetro Lange Skinfold Caliper de precisão de 1 mm
(Cambridge Scientific Industries Inc.) para avaliação das dobras cutâneas. Para
aferição da DCT, o local da medida foi o mesmo onde foi aferida a CB, o tecido adiposo
foi separado levemente e aplicado o adipômetro. Para a aferição da DCB, o local da
medida foi marcado 1 cm acima do marcado para aferição da DCT, no lado anterior
do braço, com a palma da mão do paciente voltada para fora. Para a aferição da
DCSE, foi marcado o local abaixo do ângulo inferior da escápula. A pele foi levantada
obliquamente 1 cm abaixo do ângulo inferior da escápula, estando o paciente com os
braços e ombros relaxados. E finalmente para a aferição da DCSI, o local de medida
foi marcado na linha média axilar logo acima da crista ilíaca. A pele foi levantada
obliquamente seguindo a linha de clivagem natural da pele (Lohman et al., 1991). Para
aferição do valor de cada prega foi calculada a média de três leituras.
Para avaliar a reserva adiposa, foi calculado o Percentual de Gordura Corporal
(%GC). Nesta técnica, a composição corporal é estimada utilizando-se a somatória de
quatro pregas cutâneas: biciptal, triciptal, subescapular e supra-ilíaca. Após a aferição
das pregas, seu somatório segue o proposto na equação de Durnin e Womersely
(Kamimura et al., 2005) para o cálculo da Densidade Corporal (DC):
DC = (A – B) x log Σ 4 pregas
As fórmulas para o cálculo da DC, já com os coeficientes A e B, elaborados de
acordo com idade e gênero, estão apresentados no Quadro 5.
31
Quadro 5. Fórmulas para o cálculo da densidade corporal (DC).
Idade (anos) Homens Mulheres
17 – 19 DC = 1,1620 - 0,0630 x (log Σ) DC = 1,1549 – 0,0678 x (log Σ)
20 – 29 DC = 1,1631 - 0,0632 x (log Σ) DC = 1,1599 – 0,0717 x (log Σ)
30 - 39 DC = 1,1422 - 0,0544 x (log Σ) DC = 1,1423 – 0,0632 x (log Σ)
40 – 49 DC = 1,1620 - 0,0700 x (log Σ) DC = 1,1333 – 0,0612 x (log Σ)
≥ 50 DC = 1,1715 - 0,0779 x (log Σ) DC = 1,1339 – 0,0645 x (log Σ)
Fonte: Durnin & Womersley, 1974.
A partir dos valores de DC, a porcentagem de gordura corporal total foi
determinada utilizando a fórmula de Siri (1961) (Kamimura et al., 2005):
Gordura Corporal (%) = 4,95/DC – 4,5 x 100.
Os valores de referência para classificação do %GC foram estabelecidos por
Lohman et al. (1991), conforme exposto no Quadro 6.
Quadro 6. Valores de referência para classificação do percentual de gordura
corporal.
Parâmetros Homens Mulheres
Risco de distúrbios associados à desnutrição ≤ 5 ≤ 8
Abaixo da média 6 a 14 9 a 22
Média 15 23
Acima da Média 16 a 24 24 a 31
Risco de doenças associadas à obesidade ≥ 25 ≥ 32
Fonte: Lohman et al., 1991.
A MLG foi calculada subtraindo-se a massa correspondente à percentagem de
gordura do peso corporal total.
Para analisar o perfil de distribuição de gordura corporal foi aferida a
circunferência da cintura. Para isso o paciente manteve-se em pé e, com auxílio de
uma fita métrica não extensível graduada em centímetros, o paciente foi circundado
na linha natural da cintura, no ponto médio entre a última costela e a crista ilíaca. A
leitura foi feita em apneia após uma expiração (Lohman et al., 1991). Os valores
32
obtidos foram comparados com os valores limítrofes associados ao risco de
desenvolvimento de complicações relacionadas à obesidade. Para homens este risco
encontra-se aumentado quando os valores de CC são maiores que 102 cm e, para
mulheres, quando maiores que 88 cm (NCEP, 2001).
Adicionalmente o IC foi calculado a partir das medidas de peso corporal,
estatura e CC segundo a equação de Valdez (1991). Este índice foi baseado na ideia
de que indivíduos que acumulam gordura em volta da região central do tronco têm a
forma do corpo parecida com um duplo cone, ou seja, dois cones com uma base
comum dispostos um sobre o outro, enquanto aquelas com menor quantidade de
gordura na região central teriam a aparência de um cilindro (Figura 9). Foi considerado
o ponto de corte de 1,25 para homens e 1,18 para mulheres, como discriminador de
risco coronariano elevado (Pitanga e Lessa, 2004).
4.9. Análises bioquímicas
Amostras de sangue foram obtidas no período da manhã, após jejum de 12
horas, antes do início procedimento dialítico e imediatamente após punção da FAV. O
sangue foi coletado em tubos Vacutainer® contendo ou não EDTA como
anticoagulante (1 mg/mL). As alíquotas de sangue total foram divididas: A) para
obtenção do plasma e, B) para isolamento das células mononucleares do sangue
periférico (PBMCs). Para obtenção do plasma, o sangue foi centrifugado a 3500 rpm
por 10 minutos, a 4ºC e depois armazenado a -80ºC até análises posteriores. A
determinação dos parâmetros bioquímicos de rotina: cálcio, sódio, potássio, fósforo,
glicose e perfil lipídico foram analisados através de aparelho de automação BioClin®
com kits comerciais da BioClin®. Os valores considerados como referência foram
baseados no Clinical Practice Guidelines for Nutrition in Chronic Renal Failure (NKF-
KDOQI, 2000) e Clinical Practice Guidelines and Clinical Practice
Recommendationsfor Anemia in Chronic Kidney Disease (NKF - KDOQI, 2006). Os
níveis de albumina e o hematócrito foram coletados do prontuário. Os níveis de
albumina < 3,8 mg/dL foram considerados baixos (Fouque et al., 2008).
33
4.10. Determinação dos níveis plasmáticos do Ácido indol-3 acético (AIA)
A avaliação dos níveis plasmáticos da toxina urêmica AIA foi realizada por
Cromatografia Liquida de Fase Reversa (High-performance liquid chromatography
HPLC) utilizando um dispositivo Waters Alliance 2695 (Waters, Zellik, Bélgica)
conectado a detector de fluorescência Waters 2475. A separação foi realizada à
temperatura ambiente em coluna de fase reversa Ultrasphere ODS (150 3 4,6 mm,
tamanho de partícula 5-lm; Beckman Instruments, Fullerton, CA) e com uma coluna
de guarda Ultrasphere ODS (45 3 4,6 mm, 5-lm de partícula; Beckman Instruments).
A separação cromatográfica consistiu de gradiente linear de metanol e tampão de
formiato de amônio (50 mM, pH 3,0) de 35 a 70% de metanol em 15 min a uma taxa
de fluxo de 1 mL/min. O detector de fluorescência foi fixado em kex 265 nm/290 nm
kem. Análise dos dados foi feita utilizando software Empoder 2 (Waters).
Para determinar as concentrações totais plasmáticas do AIA, as amostras
foram diluídas com água e aquecidas a 95°C durante 30 min. Depois, foram resfriadas
(10 min em gelo) e filtradas (Centrifree filter - Millipore, Billerica, MA). O ultrafiltrado
(60uL) foi injetado na coluna. Espectros de emissão de fluorescência e excitação
foram registrados a partir de soluções-padrão e de amostras urêmicas e não urêmicas,
permitindo selecionar os comprimentos de onda ideais e excluir interferências. A curva
de calibração foi construída com soluções-padrão das toxinas. As áreas de pico foram
representadas graficamente em função das concentrações e todas as concentrações
foram expressas como miligramas por litro.
4.11. Determinação dos fatores de transcrição RAH e NF-B
Para o isolamento das PBMCs, a mistura de sangue total com solução salina
de Hanks (10 ml:10 ml) foi transferida lentamente para um tubo falcon com solução
histopaque (15 ml) e centrifugado a 1750 rpm por 30 min a 18C.A nuvem de células
em suspensão formada foi transferida para um novo tubo falcon, adicionado 5 ml de
solução salina e em seguida centrifugado a 1700 rpm por 5 min a 18ºC. O
sobrenadante foi descartado e o “pellet” nuclear lavado com 1 ml de solução salina e
34
centrifugado novamente (nas condições anteriores). Em seguida uma parte do
material foi ressuspendido em 1 ml do meio de congelamento RecoveryTM - Cell
Culture Freezing Médium (Gibco®, Life Techonologies) para dar seguimento à análise
de rt-PCR. O lisado nuclear foi estocado a -80C, até análise posterior.
Para análise do rt- PCR, as células PBMCs foram isoladas do sangue e o RNA
foi extraído com sistema de isolamento total de RNA SV (PROMEGA). O cDNA foi
sintetizado com kit de transcrição de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems®).
Foi utilizado ensaio de expressão de gene TaqMan (Applied Biosystems®) para
detecção de mRNA de RAH (Hs00169233_m1), NF-B (Hs00765730_m1) e do gene
de controle GAPDH (Hs02758991_g1).
A amplificação do PCR foi realizada com o sistema de detecção de
sequenciamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems®) e padrões de condições de
ciclo. A expressão dosníveis de RAH e NF-B foi normalizada em função do GAPDH
e o nível de expressão foi calculado utilizando o Detection Delta Limit Cycle (ΔΔCT).
4.12. Análise estatística
Os resultados obtidos foram expressos em média ± Desvio-Padrão (DP) ou
mediana (intervalo interquartílico) de acordo com a distribuição dos dados, segundo
teste de Kolmogorov-Smirnov, ou em percentual conforme adequado. Foi utilizado
Teste-t de Student ou Mann-Whitney para avaliar as diferenças entre as médias;
coeficiente de correlação de Pearson ou Spearman para avaliar a correlação entre as
variáveis. O efeito da suplementação (∆) de cada variável foi definido como o sujeito
da diferença após a suplementação. Os testes foram fixados com valores de confiança
de 95% (p < 0,05), sendo considerados significativos. As análises estatísticas foram
realizadas utilizando o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) (23).
35
5. RESULTADOS
Dos 43 pacientes selecionados para o estudo, 31 completaram as 4 semanas
de suplementação correspondente; 15 no grupo AR (47% homens, idade média de
56,1 ± 7,5 anos, tempo médio de tratamento em HD de 50,0 ± 36,6 meses e Kt/v de
1,3 ± 0,2) e 16 no grupo Placebo (69% homens, idade média de 53,6 ± 11,5 anos,
tempo médio de tratamento em HD de 44,3 ± 26,4 meses e Kt/v de 1,4 ± 0,3). O
fluxograma de estudo está representado na Figura 9.
Figura 9. Fluxograma do estudo.
36
5.1. Características gerais
A nefroesclerose hipertensiva configurou-se como a principal causa etiológica
da DRC nos 31 pacientes analisados deste estudo (83%), seguida pela nefropatia
diabética (11%, 2 pacientes encontravam-se no grupo placebo e 1 no grupo AR),
glomerulonefrite crônica (3%) e pielonefrite (3%).
A Tabela 2 apresenta as características gerais dos pacientes incluídos em
ambos os grupos estudados.
Tabela 2. Características gerais dos pacientes com DRC em HD incluídos nos grupos
AR e placebo.
Variável Total Grupo AR
(n=15) Grupo placebo
(n=16) p-valor
Idade (anos) 54,8 ± 9,7 56,1 ± 7,5 53,6 ± 11,5 0,48
Gênero (H/M) 18 /13 7 / 8 11 / 5 0,07
Tempo de HD (meses) 47,1 ± 31,3 50,0 ± 36,6 44,3 ± 26,4 0,62
Kt/V 1,4 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,4 ± 0,3 0,44
HD, hemodiálise; Kt/V, cálculo da dose de diálise. Valores expressos em média ± DP e valor absoluto.
Com relação aos medicamentos utilizados, todos os pacientes faziam uso de
eritropoetina recombinante humana e utilizavam quelantes de fósforo, sendo
carbonato de cálcio e/ou Sevelamer. As drogas anti-hipertensivas usadas pelos
pacientes (81%) incluíam inibidores da enzima conversora de angiotensina II (IECA),
β-bloqueadores, antagonistas dos canais de cálcio e antiadrenérgico de ação central.
O cinacalcet estava sendo utilizado por 23% dos pacientes devido ao hipertireoidismo
grave, 54% dos pacientes usavam sulfato ferroso e ácido fólico por apresentarem
anemia e, 38% fazia uso de calcitriol. A medicação não foi alterada durante o período
de suplementação e foi semelhante entre os grupos.
5.2. Avaliação da ingestão alimentar
Os valores correspondentes à ingestão diária de energia, macronutrientes e
fibras no momento basal foram semelhantes entre os pacientes de ambos os grupos.
Os pacientes relataram baixo consumo de alimentos ricos em fibras (como vegetais e
frutas), peixes e fontes de gordura poliinsaturada e alta ingestão de carboidratos
simples e gorduras saturadas, quer no início quer no final do estudo, não mostrando
alterações significativas nos hábitos alimentares após o período de suplementação
(Tabela 3). No entanto, ambas as suplementações forneceram aumento da ingestão
de energia e de macronutrientes, como era esperado. O aumento calórico (10% grupo
AR e 12% grupo placebo) e de lípidos (16% grupo AR e 20% grupo placebo) foi
significativo (p=0,001) em ambos os grupos. Apesar do aumento calórico conseguido
com a suplementação, a maioria dos pacientes apresenta valores ainda aquém das
recomendações diárias para a manutenção de peso para indivíduos em HD (30 a 35
kcal/kg). No que diz respeito aos valores de proteína, mais de metade dos pacientes
em cada grupo alcançaram 1,2 a 1,4 g/kg/dia, após suplementação. Além disso, no
grupo AR a ingestão de fibra aumentou 85%, de 18,6 ± 7,1 g/dia para 34,4 ± 7,9 g/dia,
p=0,001. Após suplementação todos os pacientes grupo AR alcançaram as
recomendações diárias de fibra (25 a 30 g/dia), segundo a American Dietetic
Association.
Tabela 3. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre a ingestão calórica de
macronutrientes e fibras dos pacientes com DRC em HD.
Grupo AR (n=15)
Grupo placebo (n=16)
Variáveis p-valor p-valor
Antes Depois Antes Depois
Energia (kcal/dia) 1474.7 ± 408.5 1620.4 ± 421.3 0.0004 1481.7 ± 303.2 1654.4 ± 286.7 0.01
Energia (kcal/kg/dia) 22.02 ± 9.9 24.28 ± 10.2 0.001 21.04 ± 7.1 22.55 ± 5.6 0.09
Proteína (g/day) 76.4 ± 21.9 78.1 ± 19.3 0.68 65.6 ± 19.2 67.8 ± 18.2 0.57
Proteína (g/kg/dia) 1.05 ± 0.3 1.09 ± 0.3 0.41 0.9 ± 0.2 0.9 ± 0.2 0.91
Carboidrato (g/dia) 209.3 ± 69.9 219.81 ± 72.9 0.14 233.7 ± 62.0 246.6 ± 60.0 0.11
Lipídio (g/dia) 36.4 ± 13.6 42.2 ± 16.7 0.0002 35.4 ± 9.6 42.7 ± 12.8 0.001
Fibra (g/dia) 18.6 ± 7.1 34.4 ± 7.9 0.0001 18.8 ± 8.4 19.4 ± 8.3 0.18
Valores expressos em média ± DP. 37
38
5.3. Avaliação antropométrica
Dentre os pacientes que completaram ambas suplementações: 48,4% eram
eutróficos, 22,6% tinham sobrepeso e 29,0% estavam obesos, segundo o IMC.
Nenhum paciente apresentou magreza. Segundo o % GC, apenas 1 paciente do
gênero masculino apresentou valores correspondentes à normalidade, 19,3 %
estavam acima da média (6 homens) e a maioria (77,4%) apresentava risco de
doenças associadas à obesidade (11 homens e 13 mulheres). Em relação à
distribuição de gordura corporal, os valores médios de CC encontrados estavam acima
dos limites para adiposidade abdominal preconizados. A respeito da reserva muscular
nenhum paciente estudado apresentou algum grau de depleção muscular.
Os dados antropométricos dos pacientes estudados encontram-se na Tabela
4. Não se verificou alterações significativas dos parâmetros antropométricos
estudados entre os grupos no baseline nem em cada grupo após o período de
suplementação.
De acordo com a análise feita por gênero, homens apresentaram valores
significativamente superiores de MLG (55,0 ± 7,6 vs 43,4 ± 8,9, p ˃0,01) e mulheres
de %GC (37,4 ± 3,7 vs 27,3 ± 7,0, p=0,01) como já esperado; esta diferença manteve-
se após o período de suplementação.
Tabela 4. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre os parâmetros
antropométricos dos pacientes com DRC em HD incluídos no estudo.
Variável
Grupo AR (n=15)
Pré Pós
p-valor
Grupo placebo (n=16)
Pré Pós
p-valor
IMC (kg/m2) 26,2 ± 5,0 26,1 ± 4,7 0,43 26,6 ± 5,3 26,6 ± 5,4 1,00
IC 1,3 ± 0,1 1,3 ± 0,1 0,69 1,3 ± 0,1 1,3 ± 0,1 1,00
GC (%) 33,9 ± 4,6 33,6 ± 4,9 0,53 29,1 ± 9,3 29,9 ± 8,8 0,08
MLG (kg) 47,8 ± 11,2 47,3 ± 10,4 0,19 53,2 ± 8,2 52,6 ± 8,7 0,08
AMBc (cm2) 41,6 ± 10,2 40,2 ± 9,7 0,12 44,4 ± 8,1 43,7 ± 7,2 0,67
IMC, índice de massa corporal; IC, índice de conicidade; GC, gordura corporal; MLG, massa livre de gordura; AMBc, área muscular do braço corrigida. Valores expressos em média ± DP.
39
5.4 Parâmetros Bioquímicos de Rotina, nível plasmático de AIA e
expressão do mRNA do RAH e do NF-B
Os parâmetros bioquímicos de rotina no momento inicial e após 4 semanas de
suplementação com AR ou placebo podem ser visualizados na Tabela 5. Não se
verificou alterações significativas após 4 semanas de suplementação com AR.
Após a suplementação com AR ou placebo não foram observadas alterações
nos valores na expressão do RAH e NF-B, assim como nos valores plasmáticos do
AIA nos pacientes com DRC em HD (Tabela 6).
Foi observada correlação positiva entre os valores de mRNA de RAH e os níveis
AIA nos valores de base dos pacientes incluídos no estudo, demonstrando uma
possível correlação positiva entre o AIA e o RAH. Após a suplementação com AR
houve uma tendência na redução do mRNA do NF-B (p-valor=0,06) como
demonstrado na Figura 10.
Tabela 5. Efeitos da suplementação (AR e placebo) sobre os parâmetros bioquímicos dos pacientes com DRC em HD.
Variável Grupo AR (n=15)
p-valor Grupo Placebo (n=16)
p-valor Valores de
Pré Pós Pré Pós Referência
Ca (mg/dL) 9,5 ± 0,9 9,4 ±1,4 ,52 9,1 ± 0,9 9,1 ± 1,0 ,94 8,5 – 10
P (mg/dL) 5,3 ± 1,7 5,0 ± 1,9 ,33 5,0 ± 0,9 4,4 ± 1,0 ,08 3,5 – 5,5
K (mg/dL) 5,0 ± 1,7 4,7 ± 1,4 ,37 5,5 ± 1,8 5,5 ± 1,7 ,75 3,5 – 5,5
Ureia-pré (mg/dL) 148,1 ± 35,8 145,0 ± 32,3 ,61 152,5 ± 24,3 151,1 ± 31,9 ,74 15 – 40
Ureia-pós (mg/dL) 48,2 ± 12,7 45,9 ± 12,2 ,50 47,4 ± 11,6 46,4 ± 11,3 ,73 15 – 40
Cr (mg/dL) 8,4 ± 2,3 8,5 ± 2,8 ,52 8,1 ± 2,3 7,9 ± 2,4 ,67 > 10,0
Ht (%) 33,1 ± 5,1 34,7 ± 4,9 ,25 34,1 ± 5,0 32,8 ± 7,2 ,33 -
Hb (g/dL) 10,8 ± 1,7 11,2 ± 1,7 ,29 11,2 ± 1,5 10,8 ± 2,3 ,42 11-13
Glicose (mg/dL) 109,0 ± 54,2 108,0 ± 52,9 ,87 105,1 ± 56,8 118,9 ± 66,4 ,25 < 99
Colesterol (mg/dL) 142,1 ± 40,5 146,7 ± 30,1 ,59 147,0 ± 26,7 146,1 ± 36,8 ,92 < 190
Albumina (mg/dL) 3,9 ± 0,3 3,8 ± 0,5 ,40 3,7 ± 0,3 3,6 ± 0,5 ,34 > 3,8
Ca:,cálcio, P, fósforo, K, potássio; Na, sódio, Cr, creatinina; Ht, hematócrito Hb, hemoglobina.
Os dados foram apresentados como média ± DP.
40
Tabela 6. Efeitos da suplementação (AR e placebo) na expressão de RAH e NF-B e valores plasmáticos do AIA nos pacientes com
DRC em HD.
Grupo AR (n=15)
Grupo Placebo (n=16)
Parâmetros p-valor dos Δ
Pré Pós p-valor Δ Pré Pós p-valor Δ
Expressão RAH
1,08 ± 0,49
1,12 ± 0,45
0,84
0,3 (-0,4; 0,45)
1,12 ± 0,52
0,95 ± 0,48
0,29
-0,13 (-0,69; 0,31)
0,19
Expressão
NF-B 1,35 ± 0,81 0,97 ± 0,37 0,06 -0,2 (-0,6; 0,19) 1,0 ± 0,54 1,16 ± 0,64 0,49 0,04 (-0,61; 0,61) 0,18
AIA (ug/L) 2132 ± 1167 1917 ± 956 0,16 6,6 (-427; 226) 2004 ± 1035 1840 ± 908 0,59 -194 (-1254; 520) 0,89
RAH, receptor aril hidrocarboneto; NF-B, fator nuclear kappa-B, AIA: Ácido Indol-3-Acético. Os dados foram apresentados como média ± DP ou mediana
perrcentil 25 – 75).
41
42
Figura 10: Correlação entre os níveis plasmáticos de AIA e expressão de RAH nos pacientes com DRC em HD.
43
6. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo revelaram que não houve redução
significativa dos níveis plasmáticos de toxina urêmica AIA e da expressão do mRNA
do RAH e NF-B em pacientes em hemodiálise após a suplementação com AR.
Contudo, foi observada uma correlação positiva entre os valores do baseline do AIA e
do RAH, fato que corrobora com a literatura, possivelmente, maiores concentrações
de toxinas urêmicas, especificamente AIA, induzem maior a ativação do RAH. Esses
dados vão ao encontro dos achados de um estudo do nosso grupo (Brito et al, 2018),
o qual foi o pioneiro e único até o momento a avaliar a expressão do RAH e sua
associação com os níveis de toxinas urêmicas IS e AIA.
O presente ensaio clínico foi o primeiro a avaliar o efeito de um prebiótico,
especificamente AR, sob a concentração da toxina urêmica AIA e sua possível
ativação do RAH, o qual foi identificado como um dos principais receptores de toxinas
urêmicas, sugerido como uma das vias de ativação inflamatória na DRC (Sallee et al.,
2014).
Para nosso conhecimento, apenas um estudo examinou os efeitos da
suplementação de fibra solúvel fermentativa no estado inflamatório de pacientes em
HD (Xie et al., 2015), e apenas três estudos avaliaram os efeitos da suplementação
de AR em pacientes em HD (Sirich et al., 2014; Khosroshahi et al., 2018; Esgalhado
et al., 2018).
Khosroshahi et al. (2018) observaram uma redução significativa nos níveis
séricos de TNF-α, IL-6 e malondialdeído (P <0,05) após a suplementação com AR,
sendo que tais marcadores permaneceram inalterados no grupo placebo. Em relação
às concentrações séricas de IL-1b, PCR ultrassensível e atividade antioxidante total,
não houve alterações significativas nos dois grupos após a intervenção com biscoitos
contendo 20 g/dia AR durante as primeiras quatro semanas e 25 g/dia nas quatro
semanas posteriores.
Nosso estudo piloto (Esgalhado et al., 2018) observou redução nos níveis
plasmáticos de IL-6 e (TBARS), bem como nos níveis de IS após quatro semanas de
suplementação de 16g de AR. Além disso, uma correlação positiva entre IS e IL-6 foi
observada. Achados semelhantes, redução nos níveis de toxinas urêmicas e, portanto,
44
inflamação e marcadores de estresse oxidativo, foram demonstrados previamente em
estudos com ratos com DRC alimentados com AR (Vaziri et al., 2014; Kiefer et al.,
2016).
Estudos anteriores já avaliaram os níveis de toxinas urêmicas e seu papel na
patogênese da DRC e eventos cardiovasculares, que são a principal causa de morte
entre pacientes renais. Dentre essas toxinas, o IS é o principal precursor das doenças
cardiovasculares, estando associado à mortalidade geral e cardiovascular em
pacientes com DRC em estágio 2 a 5 (Barreto et al., 2009), e com mortalidade por
todas as causas em pacientes em HD (Melamed et al., 2013).
O AIA não tem sido objeto de pesquisas nos últimos anos, porém esse cenário
mudou e muitos pesquisadores vêm explorando os efeitos dessa toxina sobre a DRC
(Satoh et al., 2003; Oliveira et al., 2007, Tsukimoto e cols. 2008; Mutsaers et al., 2018).
Em um ensaio observacional, o AIA foi associado a um aumento na mortalidade e
eventos cardiovasculares em pacientes com DRC com níveis de AIA > 3.73 μM
quando comparados com pacientes com níveis mais baixos (AIA <3.73 μM). Para
confirmar tal associação, foi observado pela cultura de células que o AIA induziu
estresse oxidativo aumentando a síntese de EROs e inflamação via RAH / p38MAPK
/ NF-B, aumentando citocinas inflamatórias e ativando ciclo-oxigenase-2 (COX2) (Dou
et al., 2015).
Embora não tenha ocorrido redução significativa dos níveis de AIA em nosso
estudo, Sirich (2014) relatou que após a intervenção com 15g de amido de milho rico
em amilose (Hi-maize 260) via sachê por 6 semanas reduziu significativamente o nível
plasmático de IS quando comparados com o grupo controle. Vale ressaltar que,
apesar de nosso estudo ter um tempo de intervenção mais curto (4 semanas), a
quantidade de AR administrada por dia foi maior (16g).
Nesse contexto, a redução da concentração de toxinas urêmicas na DRC pelo
restabelecimento da microbiota intestinal com suplementação prebiótica surge como
estratégias não farmacológicas para diminuir a ativação da cascata inflamatória via
ativação do RAH (Meijers et al., 2010; Vaziri et al 2014; Sirich et al., 2014; Salmean et
al., 2015; Keiffer et al., 2016).
Os mecanismos de ação dos prebióticos, especificamente AR, no intestino
humano são complexos e várias hipóteses têm sido propostas para explicar seus
45
efeitos benéficos sobre a saúde intestinal e sistêmica de pacientes em HD. O AR é
fermentado no intestino grosso por bactérias simbióticas (Firmicutes, Bacteroidetes e
Actinobacterium) que têm atividade enzimática capaz de clivar as ligações α 1,4 e α
1,6 do AR, resultando em AGCC, gases (metano, hidrogênio, dióxido de carbono),
ácidos orgânicos (lactato, succinato e fumarato) e álcoois (metanol e etanol). Vaziri et
al 2013, relataram que após a suplementação com HAM-RS2 houve aumento na
população de bactérias simbióticas, incluindo Bifidobacterium e Faecalibacterium
prausnitzii, que possuem potencial antiinflamatório.
Os AGCCs promovem a redução do pH intestinal, modulando assim a
microbiota intestinal e reduzindo a uremia (Martinez et al., 2010, Tachon et al., 2013,
Haenen et al., 2013, Umu et al., 2015). Além disso, os AGCCs são substratos
energéticos para os linfócitos T reguladores (Smith, 2013), aumentando, assim, a
imunidade e, para os colonócitos, e restaurando, a integridade da barreira mucosa
(Wong et al., 2006). Uma vez que esta barreira esteja íntegra, ela se torna mais
seletiva e não permite a passagem de macromoléculas, substâncias tóxicas (por
exemplo, toxinas urêmicas), bactérias e LPS para circulação sistêmica, reduzindo
assim a inflamação presente em pacientes renais (Wonget et al., 2006). Entre outros
efeitos do AR está a melhora da sensibilidade à insulina (Bodinham et al., 2014; Maki
et al., 2015), redução do perfil lipídico (Nichenametla et al., 2014; Dodevska et al.,
2016) e adiposidade (Bodinham et al., 2014; Higgins et al., 2014; Dodevska et al.,
2016). O aumento da massa fecal é acompanhado por melhora na constipação, o que
contribui para menor exposição do conteúdo do lúmen à barreira mucosa.
Embora esses estudos sugiram um possível efeito modulador da microbiota
intestinal em pacientes com DRC, reduzindo a produção de toxinas urêmicas e, com
essa menor ativação de cascata inflamatória e EO, a ação prebiótica nesses pacientes
ainda é incerta. De fato, este é o primeiro estudo sobre o impacto da suplementação
prebiótica com AR na expressão do RAH.
Como limitações deste estudo, podemos apontar o número de pacientes
analisados, a falta da análise de algum marcador de disbiose (e.:LPL), de EO (ex.:
malondialdeído) e de alguma citocina inflamatória (ex.: IL-6) para fechar o ciclo de
ativação do AIA-RAH-NF-B.
46
7. CONCLUSÃO
A partir dos resultados deste estudo, podemos concluir que a suplementação
diária de 16 g de AR (HI-MAIZE® 260 da Ingredion) durante 4 semanas em pacientes
com DRC em HD: não alterou os valores bioquímicos, antropométricos e de ingestão
alimentar; não foi suficiente para reduzir a expressão do mRNA do RAH e do NF-κB;
também não foram observados menores níveis plasmáticos da toxina urêmica AIA
após a suplementação com AR.
Contudo, foi observada correlação positiva entre os valores de mRNA de RAH
e os níveis AIA nos valores de base dos pacientes incluídos no estudo, demonstrando
possível associação positiva entre o AIA e o RAH, na qual maiores níveis plasmáticos
de AIA poderiam estar envolvidos com o aumento da expressão do RAH.
Deste modo, são necessários mais estudos com prebióticos, inclusive AR, para
que se possa avaliar se a ingestão dos mesmos é capaz de reduzir a produção de
toxinas urêmicas pelas bactérias intestinas, e se esta redução estaria associada a
menor expressão do RAH, contribuindo para menor ativação do NF-κB, reduzindo
assim a inflamação crônica presente nos pacientes com DRC em hemodiálise.
47
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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59
9. ANEXOS
9.1. Aprovação do comitê de ética em pesquisa da Faculdade de Medicina
- UFF/HUAP
60
9.2. Termo de consentimento livre e esclarecido
Projeto: Efeitos da suplementação com amido resistente no perfil da microbiota intestinal e de marcadores cardiovasculares em pacientes com doença renal crônica
Pesquisador Responsável: Denise Mafra.
Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: Universidade Federal Fluminense. Nome do voluntário: Idade: R.G.:
Estas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo, que tem como objetivo verificar como está o seu intestino e o nível de algumas substâncias produzidas pelas bactérias do seu intestino, que podem causar inflamação e doenças no coração. Avaliaremos também, seus hábitos alimentares e seu estado nutricional. Além disso, iremos distribuir os pacientes voluntários através de sorteio em dois grupos, denominado “grupo A" e "grupo B". Se você for sorteado para Grupo A, vai receber biscoitos e pós A que deverá comer todos os dias durante as primeiras 4 semanas. Após esse período o senhor (a) ficará 4 semanas sem receber os biscoitos e pós e, depois receberá por mais 4 semanas os biscoitos B. Se você for sorteado para o grupo B nas primeiras 4 semanas, você fará parte do grupo A na segunda vez que receber os biscoitos e pós. Os profissionais envolvidos diretamente no estudo e os pacientes não poderão tomar conhecimento qual tipo de biscoito foi fornecido na primeira e segunda vez.
Todos os medicamentos utilizados regularmente pelo senhor(a) serão mantidos.
As pesquisadoras envolvidas farão o preenchimento do formulário em que constará uma sequência de perguntas sobre o seu consumo de alimentos nas últimas 24horas. Isso é muito importante para conhecermos seus hábitos alimentares. Para a avaliação do estado nutricional serão coletadas medidas do seu corpo, como peso corporal, estatura, circunferência da cintura, circunferência do braço e quatro dobras cutâneas (bíceps, tríceps, subescapular e supra ilíaca).
Uma amostra de seu sangue será coletada para realizarmos análise desses compostos presentes no seu sangue em 4 momentos (antes e após 4 semanas com os biscoitos e pós A e antes e após 4 semanas dos biscoitos e pós B). Esta coleta de sangue será um procedimento comum já realizado mensalmente por profissionais treinados e que não acarretará nenhum desconforto. As células que serão extraídas do seu sangue, serão armazenadas em freezer -80oC e utilizadas para avaliação de fatores que medem inflamação e estresse oxidativo. Além disso, será solicitado ao senhor(a) uma amostra de fezes nos mesmos momentos das coletas de sangue, pois queremos saber se a ingestão de fibras alterou o tipo de bactérias presentes no seu intestino.
Você tem a liberdade de querer não participar desta pesquisa ou, no caso de aceitação, retirar seu consentimento a qualquer momento, sem nenhum prejuízo à continuidade de seu tratamento.
A avaliação do seu prontuário médico e dos resultados dos exames somente será realizada pelos pesquisadores envolvidos na pesquisa e médicos responsáveis pelo
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seu tratamento. Estes dados, os resultados e o sangue coletado, serão de uso exclusivo desta pesquisa.
Não há despesas pessoais para o participante em qualquer etapa do estudo. Todos os dados coletados assim como os resultados desta pesquisa serão publicados e divulgados no meio científico sem qualquer identificação pessoal. Além disso, somente a equipe de pesquisadores envolvida e o médico responsável pelo seu tratamento terão conhecimento sobre os resultados dos exames e de sua avaliação nutricional.
Com este estudo teremos a oportunidade de investigar se a doença renal crônica causa alguma mudança no intestino e se isso faz com que ele produza substâncias tóxicas e saber se o uso de um tipo de fibra é capaz de melhorar o nível dessas substâncias, diminuindo a chance do paciente renal de desenvolver outras doenças.
A qualquer momento você terá acesso aos resultados parciais da pesquisa, bem como a qualquer dado referente ao resultado dos exames, com a profissional Denise Mafra, telefone: 985683003 ou email: [email protected], ou tambem você pode entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da UFF no endereço: Rua Marquês do Paraná 303, 4° andar, prédio anexo ao HUAP, tel: 21 2629-9189.
. Esse documento será assinado em 2 (duas) vias por ambas as partes, uma pelo
pesquisador responsável e outra por você. Eu, , acredito ter sido
suficientemente informado a respeito das informações sobre o estudo citado, que li ou que foram lidas para mim.
Eu discuti com a pesquisadora Denise Mafra sobre a minha decisão em participar deste estudo. Ficaram claros os propósitos do estudo, os procedimentos realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas, e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízos ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido ou no meu atendimento nesta instituição.
Data: / / . Assinatura do Paciente
Data: / / .
Assinatura do Pesquisador
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9.3. Artigo original a ser submetido: “Resistant starch supplementation effects on plasma indole 3-acetic acid and mRNA aryl hydrocarbon receptor expression in hemodialysis patients: Randomized, double blind and controlled trial”
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9.4. Artigo piloto publicado: “Could resistant starch supplementation improve inflammatory and oxidative stress biomarkers and uremic toxins levels in hemodialysis patients? A randomized controlled trial”
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9.5. Artigo original publicado: “A possible link between polyunsaturated fatty acids and uremic toxins from the gut microbiota in hemodialysis patients: A hypothesis
![O uso da biomassa para energia - Conselho Regional de Química · [Fração de Energia Renovável no Consumo Final de Energia Global] RENEWABLES 21 -A biomassa hoje representa 26,4%](https://img.document.onl/doc/110x75/5be3cbfe09d3f281048c40c5/o-uso-da-biomassa-para-energia-conselho-regional-de-qui-fracao-de-energia.jpg)
