94
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA ADRIANO SILVIO DOS SANTOS EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS MUSCULARES C2C12 SUBMETIDAS À LESÃO POR MIOTOXINAS BTHTX - I E BTHTX - II ISOLADAS DO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu SÃO PAULO - SP 2015

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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

ADRIANO SILVIO DOS SANTOS

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS MUSCULARES

C2C12 SUBMETIDAS À LESÃO POR MIOTOXINAS BTHTX - I E BTHTX - II

ISOLADAS DO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu

SÃO PAULO - SP 2015

II

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

ADRIANO SILVIO DOS SANTOS

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS MUSCULARES

C2C12 SUBMETIDAS À LESÃO POR MIOTOXINAS BTHTX - I E BTHTX - II

ISOLADAS DO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu

DISSERTAÇÃO APRESENTADA À

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO,

PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

MESTRE EM MEDICINA.

PÓS-GRADUANDO: ADRIANO S. SANTOS

ORIENTADORA: DRA. STELLA REGINA ZAMUNER

SÃO PAULO - SP

2015

III

FICHA CATALOGRÁFICA

Santos, Adriano Silvio dos.

Efeito do laser de baixa potência sobre células musculares C2C12

submetidas à lesão por miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do

veneno da serpente Bothrops jararacussu. / Adriano Silvio dos Santos.

2015.

94 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE,

São Paulo, 2015.

Orientador (a): Profa. Dra. Stella Regina Zamuner.

1. Células musculares. 2. Fosfolipase A2. 3. Laser. 4. Mionecrose.

I. Zamuner, Stella Regina. II. Titulo

CDU 616

IV

V

“Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes.”

(Isaac Newton).

“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que

ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur

Schopenhauer)

VI

DEDICATÓRIA

Dedico este estudo aos meus pais e minha família que sempre me apoiaram e me incentivaram para a realização

deste trabalho.

VII

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela força e coragem que precisei

para percorrer esta caminhada.

Aos meus amados pais Maria Cleonice Ramos da Silva Santos e

Joaquim Pereira dos Santos (in memórian) e toda a minha família que

sempre estiveram ao meu lado, me apoiaram com palavras de

incentivo e acreditaram no meu crescimento.

Ao meu namorado Jhonny, pela paciência, compreensão, carinho e por

toda a ajuda durante este tempo.

À minha orientadora Profª Drª Stella Zamuner que acreditou no meu

trabalho, me acolheu com muito carinho e respeito, sendo sempre

paciente dedicada e disposta a me ensinar cada vez mais, se tornando

um exemplo de profissional.

À aluna de iniciação científica Aline, agradeço pela amizade, carinho

e disponibilidade em ajudar para concretização deste trabalho.

VIII

A meu professor de graduação Joelmir Lucena Veiga, que participou

do meu crescimento acadêmico.

A todos meus colegas de laboratório em especial Adilson, Gabriela,

Lucas, Regiane, Mozânia, Otávio, Fábio, Zé, Marcelo, que sempre

estiveram ao meu lado.

À técnica de laboratório Ângela, que sempre esteve disposta a me

ouvir nas horas difíceis, à Luciana e Samara que somaram para a

concretização desse trabalho.

À Profª Silvia Zamuner que esteve sempre disposta a colaborar para a

realização deste trabalho e ao Prof° Sthepen Hyslop pela doação das

toxinas e Prof° Ernesto Belizário pela doação das células C2C12.

Aos professores do Programa de Mestrado em Medicina.

À PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos.

IX

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelo suporte financeiro Processo: 2013/23757-0

X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição dos acidentes ofídicos Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.

........................................................................................................................... 4

Figura 2: Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil. ............................................... 4

Figura 3: Serpente Bothrops jararacussu .......................................................... 6

Figura 4: Irradiação das culturas de células .................................................... 18

Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência.. .................................................. 22

Figura 6: Curva dose resposta – Efeito da Bothropstoxina I sobre a viabilidade

das células C2C12 ........................................................................................... 27

Figura 7: Curva dose resposta – Efeito da Bothropstoxina I sobre a integridade

das células C2C12 ........................................................................................... 29

Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com Bothropstoxina I.................................................. 31

Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com Bothropstoxina I.................................................. 33

Figura 10: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com Bothropstoxina II................................................. 35

Figura 11: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com Bothropstoxina II................................................. 37

XI

Figura 12: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima

lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por

Bothropstoxina I .................................................................................. .............38

Figura 13: Efeito do Laser de baixa potência 830 nm na liberação da enzima

lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por

Bothropstoxina I ............................................................................................... 41

Figura 14: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima

lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por

Bothropstoxina II .............................................................................................. 43

Figura 15: Efeito do Laser de baixa potência 685 nm na liberação da enzima

lactato desidrogenase LDH de células C2C12 submetida a lesão por

Bothropstoxina II .............................................................................................. 45

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Grupos experimentais e aplicabilidade.. ........................................... 17

Tabela 2: Parâmetros do Laser 685 nm.. ......................................................... 20

Tabela 3: Parâmetros do Laser 830 nm.. ......................................................... 21

XII

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AsGa – Arseneto de Gálio

ATP – Adenosina trifosfato

BthTX - I – Bothropstoxina I

BthTX - II – Bothropstoxina II

DMEM – Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA – Ácido desoxirribonucleico

InGaAlP – Índio Gálio Alumínio Fósforo

J/cm2 – Joules por centímetro ao quadrado

LBP – Laser de baixa potência

mL – mililitros

MTT - (Brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol – 2il 2,5- difenil tetrazol)

nm – nanômetros

PBS – NaCl 140mM; KCL 2,5mM; Na2HPO4 8mM; KH2PO 1,4mM; pH 7,4

FLA2 – Fosfolipases A2

rpm – Rotações por minuto

SFB – Soro fetal bovino

XIII

TLBP – Terapia Laser de Baixa Potência

VBj – Veneno da serpente B. jararacussu

µL – microlitros

λ – Comprimento de onda

Índice

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 2

1.1 Serpentes da fauna brasileira ........................................................................ 2

1.2 Epidemiologia ................................................................................................. 3

1.3 Bothrops jararacussu ..................................................................................... 5

1.4 Considerações gerais sobre fosfolipase A2 (FLA2) ........................................ 6

1.5 Soroterapia ..................................................................................................... 9

1.6 Terapia com laser de baixa potência............................................................ 10

1.7 Laser e ofidismo ........................................................................................... 11

1.8 Laser e cultura de células ............................................................................ 11

2 OBJETIVO ......................................................................................................... 14

2.1 Geral ............................................................................................................ 14

2.2 Específicos ................................................................................................... 14

3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 16

3.1 Miotoxinas .................................................................................................... 16

3.2 Células C2C12 musculares .......................................................................... 16

3.3 Cultivo Celular .............................................................................................. 16

3.4 Condições de tratamento ............................................................................. 17

3.5 Preparação de monocamadas de células musculares para ensaios com as toxinas ................................................................................................................... 18

3.6 Ensaio para a avaliação da viabilidade da monocamada de células musculares ............................................................................................................ 18

3.7 Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células musculares ............................................................................................................ 19

3.8 Irradiação laser de baixa intensidade ........................................................... 20

3.9 Análise do LBP sobre a integridade da monocamada de células musculares após incubação com a BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu. ........................................................................................................... 21

3.10 Análise do LBP sobre a citotoxicidade induzida pela BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de B. jararacussu em células musculares. ............................. 22

3.10.1 Ensaio da viabilidade celular MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol – 2il 2,5- difenil tetrazol). ............................................................................................ 22

3.11 Ensaio da atividade enzimática da lactato desidrogenase (LDH) ............. 22

3.12 Análise Estatística ..................................................................................... 23

4 RESULTADOS ................................................................................................... 25

4.1 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a viabilidade das células C2C12.................................................................................................................... 25

4.2 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a integridade das células C2C12.................................................................................................................... 27

4.3 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I. .............................................................................. 29

4.4 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células .......... 31

C2C12 após incubação com BthTX - I. .................................................................. 31

4.5 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II. ............................................................................. 33

4.6 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - II. ............................................................................. 35

4.7 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I. ......... 37

4.8 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - I. ......... 39

4.9 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II.............................................................. 41

4.10 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da LDH de células C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II............................................................. 43

5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 46

6 CONCLUSÕES .................................................................................................. 51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 53

8. APÊNDICE ......................................................................................................... 69

RESUMO

O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX – I e BthTX – II na dose 75 μg/mL e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/mL para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes.

Palavras chave: células musculares, fosfolipase A2, laser, mionecrose, miotoxina.

ABSTRACT

Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX – I (75 μg / mL) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX – I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/mL was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes.

Keys Word: laser muscle cells, phospholipase A2, myonecrosis, myotoxin.

1

Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem, ainda, um

problema de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo e fazem parte da lista de

doenças negligenciadas, da Organização Mundial de Saúde (OMS) (GUITIÉRREZ et

al., 2010; WHO WORLD, HEALTH ORGANIZATION, 2013). De acordo com a OMS

(2010), ocorreram cerca de 421.000 acidentes ofídicos no mundo, com número de

mortes/ano entre 30.000 e 40.000. No entanto, o número de indivíduos com

sequelas permanentes, decorrentes desses acidentes, foi mais elevado que o

número de mortes (GRACIANO et al., 2013). Esses acidentes acontecem,

geralmente, com trabalhadores rurais, em locais de difícil acesso e frequentemente

distantes de centros de saúde capacitados a realizar o atendimento necessário. A

demora no atendimento resulta em agravamento do quadro, que pode levar à

amputação do membro afetado e, consequentemente, à incapacitação do indivíduo

(KASTURIRATNE et al., 2008; WARREL, 2010; STONE et al., 2013).

1.1 Serpentes da fauna brasileira

As serpentes pertencem à classe Reptilia, Ordem Squamata e Subordem

Ophidia. Estão distribuídas em 23 famílias, 511 gêneros e 3.378 espécies. No Brasil,

temos representantes de 9 famílias, 72 gêneros e 321 espécies, ou seja, cerca de

10% do total das espécies (FRANCO, 2009). Dentre as espécies encontradas no

Brasil destacam-se, pela importância médica, as pertencentes às famílias: Elapidae

que tem como único gênero desta família no Brasil o Micrurus, cujas espécies são

conhecidas como corais; a família Viperidae que engloba a subfamília Crotalinae

(pitvipers), que agrupa os gêneros Lachesis, Crotalus, Bothriopsis, Bothrocophias e

Bothrops (MELGAREJO, 2009). No gênero Crotalus as espécies são conhecidas

popularmente por cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia,

maracá e outras denominações populares; gênero Lachesis (surucucu, surucucu-

pico-de-jaca, surucutinga, malha-de-fogo) e gênero Bothrops, Bothriopsis e

Bothrocophias (jararaca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira, jararaca-do-rabo-

3

branco, malha-de-sapo, patrona, surucucurana, comboia, caiçara, e outras

denominações), sendo que esse gênero compreende cerca de 30 espécies,

distribuídas por todo o território nacional (Ministério da Saúde, 2001).

1.2 Epidemiologia

O número exato de mortes e a incidência por picadas de serpentes, ao redor

do mundo, são desconhecidos. Dados da literatura demonstram que as serpentes

responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos, na América Latina,

pertencem a família Viperidae e aos gêneros Bothrops, Bothriopsis, Bothrocophias e

Rhinocerophis, assim denominados de acordo com a proposta taxonômica de

FENWICK et al., (2009). No Brasil, aproximadamente 90% dos acidentes ofídicos

são provocados por serpentes desses gêneros (fig. 1), sendo também consideradas

as mais agressivas (BARREIRA, 1993). Os acidentes causados pelas serpentes do

gênero Bothrops não apresentam alta letalidade (0,31%), porém devido à alta

incidência, são consideradas de grande importância epidemiológica no país (Manual

de diagnóstico e tratamentos de acidentes por animais peçonhentos, 1999) (fig. 2). A

epidemiologia dos acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas do sexo masculino

(70%), atingidos, sobretudo, nos membros inferiores. Estes acidentes, em geral,

estão relacionados a fatores climáticos e aumento da atividade humana no campo

(Ministério da Saúde, 2001).

4

Figura 1: Fonte: Manual de Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais Peçonhetos –

Ministério da Saúde Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) Outubro/2001.

Figura 2 – Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.

5

Os efeitos causados pelo envenenamento das serpentes do complexo

Bothrops, ao serem injetados no organismo das vítimas, induzem um quadro

fisiopatológico comum, que podem ser classificados clinicamente de acordo com a

presença de manifestações sistêmicas e locais. As manifestações sistêmicas são

caracterizadas por náuseas, vômitos, sudorese, hemorragia, hipotensão arterial,

insuficiência renal e ocasionamalmente choque, além de manifestações locais como

dor, edema de instalação precoce e caráter progressivo, equimoses, hemorragia,

hipóxia, podendo ser acompanhada por necrose tecidual (DOIN-SILVA et al., 2009;

MILANI JUNIOR et al., 1997; CARNEIRO et al., 2002; LU et al., 2005; YAMASHITA

et al., 2011).

A mionecrose local é uma consequência comum nos envenenamentos

causados pelas serpentes do complexo Bothrops. A literatura indica que a

mionecrose é causada por uma família de proteínas denominadas miotoxinas,

componentes dos venenos botrópicos, as quais possuem características de

fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a membrana da célula muscular,

por se ligarem e alterarem a membrana plasmática (GUTIÉRREZ et al., 1984).

Essas miotoxinas induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alterações

morfológicas são observadas a partir de 15 minutos de sua injeção (GUTIÉRREZ, J.

M., LOMONTE, B. 1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequência da

isquemia causada por obstrução dos vasos da microcirculação e de artérias

intramusculares (GUTIÉRREZ et al., 1984).

1.3 Bothrops jararacussu

A Bothrops jararacussu (fig. 3) é uma serpente de grande porte, podendo

atingir até 2,20 m de comprimento. Diferencia-se das jararacas comuns pelo porte

padrão de desenho em seu corpo e por possuir uma cabeça negra, Há um

acentuado dimorfismo sexual entre fêmeas e machos, sendo que as fêmeas são

marcadamente amarelas e pretas, enquanto que os machos são marrons e pretos,

além de serem menores e mais delgados. Estas serpentes apresentam hábito

noturno ou crepuscular. Geralmente são encontradas em florestas tropicais, bancos

de rios e pântanos (MILANI JUNIOR et al., 1997).

6

Figura 3: Bothrops jararacussu

Fonte: http:// http://www.biogalapagos.com.br/

As serpentes Bothrops jararacussu causam 0,8 a 10% dos acidentes ofídicos

registrados no Brasil (MILANI JUNIOR et al., 1997). Os estudos experimentais

mostram que esse veneno causa necrose muscular seguido de alterações

vasculares e trombose. Além disso, a recuperação da fibra muscular se dá de forma

deficiente, resultando em sequela (SANCHEZ et al., 1992). Ainda, o

envenenamento causado por esta serpente tem grande mortalidade quando

comparada com outras serpentes do mesmo gênero (HOMSI-BRANDERBURGO et

al., 1988), sendo que o grande nível de letalidade atribuída aos 25% de miotoxinas e

fosfolipase A2 encontradas neste veneno (GUTIÉRREZ, LOMONTE, 1995).

1.4 Considerações gerais sobre fosfolipase A2 (FLA2)

As FLA2 pertencem a uma superfamília de enzimas lipolíticas, que possuem

baixo peso molecular (13-18 KDa), e catalisam a ligação sn-2 de fosfolipídeos de

membrana celulares, gerando ácidos graxos livres, tais como o ácido araquidônico

(AA), o ácido oleico (AO) e lisofosfolipídeos, como o liso-PAF (DENNIS, 1994;

VALENTIN; LAMBEAU, 2000). Esta reação, de modo geral, depende de Ca++, para

ativação do sítio catalítico. As fosfolipases secretadas (FLA2s) são enzimas

abundantes na natureza e estão presentes tanto em fluidos e tecidos de mamíferos

7

quanto em venenos de serpentes, abelhas e vespas (MURAKAMI; KUDO, 2002). As

FLA2s de mamíferos desempenham importantes funções em vários processos

biológicos, como a remodelagem de membranas biológicas e a síntese de segundos

mensageiros lipídicos, que exercem importantes ações biológicas e participam da

transdução de sinais intracelulares. Em condições patológicas, estas enzimas

contribuem para o processo mionecrótico (VALENTIN; LAMBEAU, 2000,

MURAKAMI et al., 2011). Venenos viperídicos e crotalídicos contém FLA2s com a

habilidade de causar rápida necrose das fibras do músculo esquelético (FLA2s

miotóxicas) (HARRIS; CULLEN, 1990). Em adição ao seu papel catalítico primário,

as PLA2s dos venenos de serpentes mostram ainda outros importantes efeitos

toxicos/farmacológicos, incluindo mionecrose, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e

hemolítico, hemorrágico, hipotensivo, anticoagulante, inibição da agregação

plaquetária e indução da atividade edematogênica (HARRIS; CULLEN, 1990;

GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1997; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000). Algumas destas

atividades são correlacionadas com a atividade enzimática, mas outras são

completamente independentes (KINI, R. M.; EVANS, H. J., 1989; SOARES, A. M.;

GIGLIO, J. R. 2004a). Devido à capacidade dessas FLA2 promoverem a liberação do

ácido araquidônico, que é o substrato para a biossíntese de vários mediadores

lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e leucotrienos, muito interesse se tem

demonstrado, no estudo dessa família de enzimas, pois, os derivados do ácido

araquidônico e o fator ativador de plaquetas (PAF), além de mediadores de

fenômenos fisiológicos estão envolvidos em vários processos inflamatórios

(FLAMAND et al., 2006; REID, 2005).

Em venenos de serpentes do complexo Bothrops, as ações preponderantes

das PLA2s estão relacionados às atividades miotóxicas (GUTIÉRREZ, J.M.; E.

CERDAS, 1984). É interessante notar que as miotoxinas isoladas de venenos

botrópicos, à semelhança da grande maioria das PLA2 de venenos, apresentam uma

grande homologia sequencial e estrutural entre si. Essa característica, no entanto,

não é suficiente para determinar atividades catalíticas e biológicas semelhantes.

Assim, um importante grupo de FLA2 miotóxicas, contendo aspartato na

posição 49 (Asp 49), apresenta alta atividade catalítica, como as miotoxinas de

Bothrops atrox, Bothrops godmani e a MT-III de Bothrops asper. No entanto, outras

FLA2 homólogas, com baixa ou nenhuma atividade catalítica, mantêm potente

8

atividade miotóxica. Como exemplo, cita-se a MT-II do veneno de Bothrops asper, a

BthTX - I de Bothrops jararacussu, a PrTX-I de Bothrops pirajai, a MjTX-I da

Bothrops moojeni e a BnSP-7 da Bothrops neuwiedi pauloensis, que contêm uma

molécula de lisina na posição 49 (Lys 49) (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988;

para revisão vide GUTIÉRREZ, J. M., LOMONTE, B. 1995; CANDURI et al., 1998;

SOARES et al., 2000a; 2000b). A substituição do resíduo Asp por Lys, na posição

49, afeta drasticamente a capacidade de ligação destas proteínas ao íon cálcio,

cofator essencial para a estabilização do intermediário tetraédrico, no mecanismo

catalítico (VAN DEN BERGH et al., 1988; SCOTT et al., 1990). A despeito da baixa

atividade enzimática, as FLA2-Lys 49 homólogas mantêm a habilidade de lesar

membranas biológicas e sintéticas por um mecanismo pouco conhecido e

independente de cálcio (GUTIÉRREZ et al., 1989).

Foram purificadas, do veneno de B. jararacussu, as miotoxinas BthTX - I e

BthTX - II (HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). A BthTX - I é uma PLA2 Lys49,

uma proteína dimérica miotóxica, e pode ser considerada um modelo molecular que

apresenta desafios, porque possui miotoxicidade elevada e, no entanto, apresenta

pouca ou nenhuma atividade FLA2 (GUTIÉRREZ; OWNBY, 2003). Danifica a

membrana através de um mecanismo cálcio-independente, capaz de induzir uma

severa mionecrose (FLETCHER et al., 1996; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995;

HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). Além da mionecrose, a BthTX - I causa

diversos efeitos farmacológicos que incluem o edema, degranulação do mastócito, o

bloqueio irreversível da contração do músculo (in vitro), interrupção de lipossoma e

citotoxidade em células endoteliais (ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; HOMSI-

BRANDEBURGO et al., 1988; LANDUCCI et al., 1998).

A BthTX - II é uma Asp49 com estrutura homóloga ao da Lys49.

Segundo CORRÊA et al., (2008), a BthTX - II tem ação de uma Asp49

(desempenhando sua atividade catalítica) e de uma Lys49 (sendo miotóxica e

citotóxica) e ainda, mostra efeitos edematogênico e hemolítico (GUTIÉRREZ et al.,

1991; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). Foi demonstrado também que a BthTX

- II induz agregação plaquetária (GUTIÉRREZ et al., 1991).

9

1.5 Soroterapia

A soroterapia é, ainda, o único método de eficácia comprovada no tratamento

dos acidentados por picadas de serpentes venenosas, desde que administrada em

tempo, dose e via adequados (RUCAVANO; LOMONTE, 1996). Porém, apesar da

eficácia da neutralização dos efeitos sistêmicos, este tratamento contribui pouco

para a melhoria do quadro local, resultando em aparecimento de sequelas graves e

perda tecidual. Neste sentido, a efetividade da soroterapia em prevenir o dano

tecidual local é limitada, pela rápida ação das miotoxinas comparada com a

distribuição lenta de anticorpos (RUCAVANO; LOMONTE, 1996). A patogênese da

mionecrose é complexa e envolve as ações combinadas de uma variedade de

componentes, tais como miotoxinas e metaloproteinases (QUEIROZ; PETTA 1984;

SANCHEZ et al., 1992; HOMSI et al., 1988; CINTRA et al., 1993; RODRIGUES et

al., 2004; VAN DEN BERGH et al., 1988). A administração de antivenenos (AV) que

consistem em moléculas inteiras de IgG (~150 kDa), ou fragmentos fab F(ab’)2

(LALOO; THEAKSTON, 2003; THEAKSTON; GUTIÉRREZ et al., 2009.), constitui o

tratamento específico para picada de serpente

Os estudos experimentais têm sugerido que existe uma significante, embora

parcial, neutralização da hemorragia, edema e mionecrose apenas quando o AV é

administrado rapidamente após o envenenamento (CAMEY et al., 2002). Neste

sentido, CAMEY et al., 2002, estudaram o efeito farmacológico do veneno de cinco

espécies botrópicas brasileiras em relação à sua letalidade, atividade hemorrágica,

necrosante, proteolítica da fosfolipase, coagulante e fibrinolítica. Os resultados

indicaram que o antiveneno foi efetivo na neutralização sistêmica da atividade tóxica

de todos os venenos testados. Porém, os efeitos locais não são neutralizados pelo

uso de antiveneno e os mecanismos envolvidos nesta falta de proteção, até o

momento, não foram esclarecidos.

Várias substâncias alternativas têm sido pesquisadas com a finalidade de

diminuir a miotoxicidade de venenos botrópicos (MELO et al., 1993; MELO; OWNBY,

1999; MELO; KURTZ, 1988), em razão da baixa eficácia da soroterapia contra a

manifestação miotóxica no local da picada. Entretanto, qualquer que seja a

abordagem terapêutica até hoje disponível, esta tem se mostrado ineficaz na

neutralização dos efeitos locais produzidos pelo veneno botrópico, os quais são de

10

evolução rápida e intensa. Por esses motivos a procura por abordagens alternativas

às usualmente empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em

medidas extremamente relevantes para neutralização e/ou diminuição dos efeitos

degenerativos, bem como a aceleração do processo regenerativo. Portanto, avanços

no tratamento desta patologia localizada devem ser alcançados para elucidar os

componentes de veneno envolvidos em sua gênese e a base molecular do seu

mecanismo de ação. Pelo exposto acima, no Brasil, tem sido crescente o interesse

em investigar terapias coadjuvantes à soroterapia já existente. Uma possibilidade

que poderá ser empregada é a laserterapia.

1.6 Terapia com laser de baixa potência

A palavra laser é uma sigla que corresponde “Light Amplification by

Stimulated Emission of Radiation, a qual significa “Amplificação da Luz por Emissão

Estimulada por Radiação”. A ação do laser consiste na absorção da luz pelos

tecidos, resultando em modificações no metabolismo celular. Quando o laser é

aplicado nos tecidos, a luz é absorvida por fotorreceptores localizados nas células,

sendo capaz de modular as reações bioquímicas específicas dentro da célula e

estimular uma série de reações em cadeia na mitocondria, resultando em síntese de

ATP (RENNÓ et al., 2011; STEIN et al., 2005; NAKANO et al., 2009).

A laserterapia tem sido muito utilizada nas últimas décadas, inclusive nas

áreas médicas e paramédicas, iniciando a ação ou a estimulação bioquímica,

fisiológica ou atividade proliferativa das células e tecidos. Assim, a aplicação do

laser de baixa potência (LBP) tem como finalidade restabelecer o equilíbrio biológico

celular melhorando as condições de vitalidade tecidual (DORTBUDAK, 2000).

A irradiação do LBP estimula a proliferação de células satélites musculares, a

angiogênese e a expressão de fatores de crescimento, desempenhando, assim, uma

função importante na regeneração muscular (PETRI et al., 2010).

11

1.7 Laser e ofidismo

Existem alguns estudos sobre o LBP na avaliação do efeito local causado por

veneno ofídico. DOURADO et al., 2003, demonstraram que o LBP aplicado no

músculo gastrocnêmio de camundongos, após injeção do veneno de B. Moojeni,

diminuiu consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de

desfazer a integridade da membrana plasmática. Estudos realizados por nosso

grupo demonstram que o tratamento com o LBP e Light emmition Diode (LED)

aplicados 30 min e 3 h após a injeção em pata de camundongos de veneno de B.

jararacussu e por duas miotoxinas isolada deste veneno foram efetivos na redução

do edema, influxo leucocitáio, hemorragia e hiperalgesia (GUIMARÃES-SOUZA et

al., 2011; BARBOSA et al., 2010). Em outros estudos in vivo, demonstrou-se a

eficácia do laser na resposta inflamatória (BARBOSA et al., 2009) e mionecrose

(DOIN-SILVA et al., 2009) local, induzida por venenos botrópicos. Ainda, estudos do

nosso grupo demonstraram uma diminuição na mionecrose local em pata de

camundongos induzida pelo veneno de B. jararacussu e duas miotoxinas isoladas

deste veneno a BthTX - I e BthTX - II, sugerindo que o uso do LBP seja uma

abordagem terapêutica local eficaz em casos de envenenamento botrópico

(BARBOSA et al., 2010; ALGHAMDI et al.; 2012). No entanto, não existem estudos

adicionais na literatura mostrando o efeito do LBP em células isoladas após lesão

com venenos botrópicos, bem como o mecanismo de ação do LBP na redução dos

efeitos locais.

1.8 Laser e cultura de células

A literatura demonstra que o LBP em cultura de células causa um aumento no

número de células, síntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em células-

tronco e em outras linhagens celulares (PETRI et al., 2010).

A aplicação do LBP Arseneto de Gálio Alumínio em osteoblastos cultivados

em disco de titânio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e dose de 3 J/cm2 ,

demonstrou estimular a diferenciação osteoblástica (EDUARDO et al., 2007). O uso

desta técnica terapêutica demonstrou ser também eficaz no crescimento de células

12

epiteliais de rim de macaco cultivado em situação de carência nutricional (2% de

SFB), quando aplicadas irradiações repetidas de LBP (HAWKINS; ABRAHAMSE,

2006).

No entanto, determinar parâmetros como comprimento de onda, densidade de

energia, potência e tempo de aplicação do laser é importante para se obter uma

resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins & Abrahamse (2006), relataram

que a aplicação do LBP utilizando baixas densidade de energia, como dose única de

5,0 J/cm2 ou duas exposições de 2,5 J/cm2 apresentou um efeito estimulante na

resposta celular de fibroblastos “feridos”, resultando no aumento de migração

celular, viabilidade e proliferação celular e atividade de ATP.

Apesar do efeito do LBP ser estudado em vários tipos celulares e em várias

patologias, não existem estudos na literatura mostrando o efeito do laser de baixa

potência em células isoladas após lesão com venenos botrópicos. Dados do nosso

laboratório mostraram que o LBP é capaz de proteger a membrana de células

musculares C2C12 após incubação com o veneno bruto de B. jararacussu (dados

enviados a publicação). Assim sendo, este estudo pretende avaliar a ação do LBP

sobre células C2C12 após incubação com as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II,

isoladas do veneno de B. jararacussu.

13

Objetivo

14

2 OBJETIVO

2.1 Geral

Analisar as ações do LBP 685 nm e 830 nm sobre células musculares C2C12

submetidas à lesão pelas miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno de

Bothrops jararacussu.

2.2 Específicos

Através de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiação LBP 685

nm e 830 nm sobre células musculares C2C12, após lesão com as miotoxinas BthTX

- I e BthTX - II, quanto:

I à viabilidade das células

II à integridade das monocamadas

III aos marcadores de lesão celular (LDH)

15

MATERIAL E MÉTODOS

16

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Miotoxinas

Foram utilizadas as miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno da

serpente Bothrops jararacussu, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Sthepen Hyslop,

do Departamento de Farmacologia, FCM, UNICAMP, Campinas-SP. As miotoxinas

foram mantidas a - 20oC até o momento de sua utilização.

3.2 Células C2C12 musculares

As células, provenientes da linhagem de mioblastos C2C12, foram

gentilmente doadas pelo professor José Ernesto Belizário, do Instituto de Ciências

Biomédicas - USP/SP. As células foram cultivadas no meio de cultura de Eagle

modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) contendo 10% de

soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 1% de solução antibiótica-

antimicótica (Cultilab).

3.3 Cultivo Celular

Os mioblastos foram mantidos em estufa (HEPA class 3110, Thermo Electron

Corporation, Marietta, OH, EUA) a 37°C, numa atmosfera úmida contendo 5% de

CO2. O monitoramento do crescimento celular foi realizado a cada 24 horas,

utilizando-se microscópio invertido de fase (Eclipse TE 2000U, Nikon, Melville, NY,

EUA). O subcultivo foi realizado quando a monocamada celular se torna

subconfluente para a perpetuação da linhagem celular, sempre em fluxo laminar

(Linha 400, Pachane, Piracicaba, SP, Brasil). Para tanto, o sobrenadante foi

removido, as células lavadas 1X com tampão PBS (NaCl 140mM; KCl 2,5mM;

Na2HPO4 8mM; KH2PO4 1,4mM; pH 7,4) e tratadas com solução de tripsina 0,25%

durante 3 minutos a 37°C. Após a incubação, foi realizada nova lavagem com meio,

centrifugação a 1200 rpm a 20°C por 5 minutos (Centrífuga Excelsa 4-280R, Fanem,

17

São Paulo, SP, Brasil) e posteriormente a ressuspensão em 1mL de meio DMEM. A

viabilidade das células foi avaliada por contagem com corante vital azul de Trypan

(0,4%) e foram utilizadas nos ensaios as culturas com viabilidade maior que 95%.

3.4 Condições de tratamento

Os experimentos foram realizados em um ambiente com obscuridade parcial

para não sofrer interferência da luz externa. A cultura de células musculares C2C12

foi dividida em dez grupos, conforme tabela abaixo:

Tabela 01- Grupos experimentais e aplicabilidade

NOME GRUPOS CELULARES TRATAMENTO

Grupo 1 Controle Células + meio de cultura DMEM

Grupo 2 Células + LBP Células + 685nm

Grupo 3 Células + LBP Células + 830nm

Grupo 4 Veneno Células + Veneno VBj

Grupo 5 Toxina Células + BthTX – I

Grupo 6 Toxina Células + BthTX - II

Grupo 7

Grupo 8

Células + BthTX – I

+ Laser

Células + BthTX - I

+ Laser

Células + BthTX - I - tratadas com

laser 685nm

Células + BthTX - I - tratadas com

laser 830nm

Grupo 9

Grupo 10

Células + BthTX – II

+ Laser

Células + BthTX - II

+ Laser

Células + BthTX – II - tratadas com

laser 685nm

Células + BthTX - II - tratadas com

laser 830nm

A cultura foi irradiada imediatamente após a adição das toxinas e foi

aplicada, em cada poço, de forma pontual inferior, de modo a atingir a monocamada

de células musculares, conforme a figura 4:

18

Figura 4: Irradiação das culturas de células

3.5 Preparação de monocamadas de células musculares para ensaios com

as toxinas

A partir das culturas celulares obtidas como descrito no item 3.3, foram feitas

as diluições necessárias para a semeadura das células em placas de 96 poços ou

lamínulas de vidro. Assim, 1x104 células/poço foram semeadas em placas de 96

poços e colocadas em estufa numa atmosfera úmida contendo 5% de CO2, a 37ºC,

por 24 horas. Após esse período as células foram incubadas com BthTX – I e

BthTX - II, diluídas em meio DMEM, nas concentrações de 10, 25, 50 ou 75 μg/mL,

ou meio de cultura (controle negativo) ou veneno de B. jararacussu na concentração

de 25 μg/mL (controle positivo) e incubadas por 15, 30 e 60 minutos.

3.6 Ensaio para a avaliação da viabilidade da monocamada de células

musculares

O ensaio de viabilidade celular foi realizado pelo método MTT. Após cada

período de incubação, como descrito no item 3.4 o sobrenadante das culturas foi

19

removido e as células foram lavadas 1X com 100 μL de PBS. Em seguida,

adicionado 50 μl de MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol – 2il 2,5- difenil tetrazol) e

incubadas por 3 horas a 37ºC. Terminado o tempo de incubação foi adicionado 100

μL de isopropanol para ressuspender e solubilizar o precipitado. Por fim, foi

realizada a leitura da absorbância a 620 nm com auxílio de um leitor de Elisa (2020,

Anthos, Eugendorf, Áustria).

3.7 Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células

musculares

Após cada período de incubação, como descrito no item 3.4, os

sobrenadantes das culturas foram removidos e as células foram lavadas 1X com 100

μL PBS. Em seguida, foram adicionados 40 μL de cristal violeta (0,5%) em ácido

acético (30%) por poço. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e

colocadas para secar. A seguir, 100 μL de metanol absoluto (MERCK) foram

adicionados em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) realizada em leitor

de ELISA a 620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de

diminuição da D.O, observada na monocamada submetida à ação do veneno em

estudo, em relação à monocamada controle.

20

3.8 Irradiação laser de baixa intensidade

Foi utilizado o Laser da marca DMC® modelo Thera Lase, com os seguintes

parametros:

Tabela 2: Parametros do Laser da marca DMC® modelo Thera Lase

Aparelho Laser DMC

® modelo Thera

Lase

Comprimento de onda 685 nm

Densidade de energia 4 .0 J/cm2

Energia total 1.3 J

Potência 35 mW

Densidade de potência 1.4 W/cm²

Área irradiada 0,3 cm²

Área do feixe com espaçador 0,28 cm2

Modo de aplicação Pontual

Tempo de aplicação 35 s

Tabela 3: Parametros do Laser da marca DMC® modelo Thera Lase

Aparelho Laser DMC

® modelo Thera

Lase

Comprimento de onda 830 nm

Densidade de energia 4 .0 J/cm2

Energia total 1.3 J

Potência 100 mW

Densidade de potência 0.33 W/cm²

Área irradiada 0.3 cm²

Área do feixe com espaçador 0,28 cm2

Modo de aplicação Pontual

Tempo de aplicação 13 s

21

Figura 5: Aparelho Laser da marca DMC® modelo Thera Lase

3.9 Análise do LBP sobre a integridade da monocamada de células

musculares após incubação com a BthTX - I e BthTX - II isoladas do

veneno de B. jararacussu.

As células C2C12 foram plaqueadas 1x104 células por poço em placas de 96

poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células

receberam as toxinas na concentração de 75 μg/mL, ou meio de cultura (controle) e

imediatamente foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas

por 15, 30 e 60 minutos e o ensaio para a avaliação da integridade da monocamada

foi realizado conforme descrito no item 3.6.

22

3.10 Análise do LBP sobre a citotoxicidade induzida pela BthTX - I e BthTX - II

isoladas do veneno de B. jararacussu em células musculares.

3.10.1 Ensaio da viabilidade celular MTT (brometo de 3, 4,5-dimetiltiazol – 2il 2,5- difenil tetrazol).

A viabilidade das células musculares C2C12 foi avaliada pelo método MTT.

Esse método mede a viabilidade celular com base no dano induzido nas

mitocôndrias. O princípio do método é a avaliação da atividade de desidrogenases

mitocondriais, quantificadas pela redução do MTT (um sal de coloração amarela

solúvel em água) a formazan (cristais de coloração púrpura, insolúveis em água). As

células C2C12 foram plaqueadas 1x104 célula/poço em placas de 96 poços e

incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células

receberam as toxinas na concentração de 75 μg/mL, ou meio de cultura (controle

negativo) ou veneno de B. jararacussu na concentração de 25 μg/mL (controle

positivo) e imediatamente foram irradiadas com laser, em seguida as células foram

incubadas por 15, 30 e 60 minutos. A seguir, o ensaio da atividade mitocondrial foi

realizado conforme descrito no item 3.5.

3.11 Ensaio da atividade enzimática da lactato desidrogenase (LDH)

A atividade enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi

considerada como parâmetro da lesão celular. As células C2C12 foram plaqueadas

1x104 célula/poço em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão

celular. Após esse período as células receberam as miotoxinas, serão incubadas por

15, 30 e 60 minutos. Em seguida os sobrenadantes das culturas de cada grupo

foram removidos e armazenados em freezer – 80ºC, a dosagem de LDH foi

realizada por meio do kit LDH Liquiform (Labtest, Minas Gerais,Brasil), usando

método cinético, espectrofotômetro 340 nm a 37ºC. Cada amostra foi analisada em

triplicata, e três experimentos independentes serão realizados. Os resultados foram

23

expressos pelo decréscimo da D.O., resultante da oxidação do NADH, na presença

de piruvato, em relação ao tempo zero.

3.12 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média e

analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student ou Análise de Variância

(ANOVA), complementado por testes de significância apropriados. Em todos os

cálculos foram fixado o nível crítico menor que 0,05. Todas as amostras foram feitas

em triplicatas e três experimentos independentes foram realizados.

24

RESULTADOS

25

4 RESULTADOS

4.1 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a viabilidade das células

C2C12.

A viabilidade celular foi avaliada nos tempos de 15, 30 e 60 minutos após a

incubação das células C12C12 com a toxina, em diferentes concentrações (10, 25,

50 e 75 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Os resultados demonstraram a

diminuição estatisticamente significativa na viabilidade celular nas concentrações 25,

50 e 75 µg/mL em todos os tempos analisados, quando comparado com o grupo

controle, esse efeito foi mais pronunciado na concentração de 50 e 75 µg/mL, nos

períodos de 30 e 60 min, após a incubação com o veneno (Fig. 6).

No tempo de 60 minutos não houve alteração na viabilidade das células

quando incubadas com a toxina na concentração de 25 µg/mL. A concentração de

10 µg/mL não apresentou efeito sobre a viabilidade celular (Fig. 6). Com base

nesses resultados, a dose de 75 µg/mL foi a dose de escolha avaliar os efeito do

LBP no presente trabalho.

26

Control 10 25 50 750

20

40

60

80

100

120

BthTx I (g/ml)

15 min

*

*#

*

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

A

Control 10 25 50 750

20

40

60

80

100

120

*

* *

BthTx I (g/ml)

30 min

()

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

B

Control 10 25 50 750

20

40

60

80

100

120

**

BthTx I (g/ml)

60 min

()

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

C

Figura 6: Efeito da BthTX - I na viabilidade de células musculares C2C12. Células musculares

C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão

celular. Após este período, a BthTX - I foi adicionada e foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos.

A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de

três experimentos independentes, ANOVA de Tukey; * p<0,05 comparado ao controle, #

p<0,05

comparado as concentrações 10, 25 e 50 µg/mL ; () p<0,05 comparado as concentrações 10 e 25

µg/mL.

27

4.2 Curva dose resposta - Efeito da BthTX - I sobre a integridade das

células C2C12

A capacidade da toxina em afetar a integridade das monocamadas das

células musculares C2C12 em cultura foi avaliada pelo descolamento das

monocamadas, após sua incubação com a toxina, por 15, 30 e 60 minutos, em

diferentes concentrações (10, 25, 50 e 75 µg/mL) em comparação às monocamadas

contendo apenas meio de cultura (controle). Nas concentrações e tempos

analisados, a BthTX - I não foi capaz de causar descolamentos da integridade das

monocamadas de forma estatisticamente significante (Fig. 7).

28

Controle 10 25 50 750.00

0.05

0.10

0.15

15 min

BthTX I (g/ml)

Desco

lam

en

to C

elu

lar

(DO

)A

Controle 10 25 50 750.00

0.05

0.10

0.15

30 min

BthTX I (g/ml)

Desco

lam

en

to C

elu

lar

( D

O )

B

Controle 10 25 50 750.00

0.05

0.10

0.15

60 min

BthTX I (g/ml)

Desco

lam

en

to C

elu

lar

( D

O )

C

Figura 7: Efeito da BthTX - I no descolamento de células muscular C2C12. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada e foram incubadas em concentrações de 10, 25, 50 e 75 µg/mL durante 15, 30 e 60 minutos ou meio sozinho (controle). O descolamento celular foi determinado pelo ensaio de cristal violeta.

29

4.3 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células C2C12 após incubação com BthTX - I.

Para a avaliação do efeito de LBP 685 nm na viabilidade das monocamadas

de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente

após a adição da toxina. O veneno bruto de B. jararacussu na concentração de 25

µg/mL foi utilizado como controle positivo. Nossos resultados demonstraram um

aumento da viabilidade em células C2C12 irradiadas com o laser nos tempos de 15

e 30 min. Quando as células foram incubadas com a miotoxina e irradiadas,

demonstraram um aumento de 31%, 57% e 60% na viabilidade celular, no tempo de

15, 30 e 60 minutos, respectivamente, após a aplicação do LBP, com o comprimento

de onda de 685 nm (fig. 8).

30

0

50

100

150

15 min

BthTX I (75g/ml)

Vbjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

*

*

* *

# $

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

A

0

50

100

150

30 min

BthTX I (75g/ml)

Vbjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

*

**

# $

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

B

0

50

100

150

60 min

BthTX I (75g/ml)

Vbjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

* *

* # $

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

C

Figura 8: Efeito do LBP 685 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação

com BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas

durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada (75 µg/mL) e as

células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de

energia (4J/cm2) em comprimentos de onda de 685 nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e

60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média

± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; * p <0,05 vs controle; # p <0,05 vs

Vjbs; $ p <0,05 vs BthTX I.

31

4.4 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com BthTX - I.

Para a avaliação do efeito de LBP 830 nm na viabilidade das monocamadas de

células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente após a

adição da toxina. Nossos resultados demonstraram um aumento de 27%, 49% e

60% na viabilidade celular no tempo de 15, 30 e 60 minutos respectivamente após a

aplicação do LBP, com comprimento de onda de 830 nm (fig. 9).

32

0

50

100

150

15 min

BthTX I (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

***

#$

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

A

0

50

100

150

30 min

BthTX I (75 g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

#$

**

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

B

0

50

100

150

60 min

BthTX I (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

#$

* *

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

C

Figura 9: Efeito do LBP 830 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação

com BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas

durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - I foi adicionada (75 ug/mL) e as

células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de

energia (4J / cm2) em comprimentos de onda de 830 nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e

60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média

± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; #

p<0,05 vs VBjs;

$p<0,05 vs BthTX - I.

33

4.5 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com BthTX - II.

Para a avaliação do efeito de LBP 685 nm na viabilidade das monocamadas

de células incubadas com a BthTX - II, o mesmo foi aplicado diretamente nas células

C2C12, imediatamente após a adição da toxina. Nossos resultados demonstraram

um aumento de 23% e 22 % na viabilidade celular no período de 15 e 60 minutos

após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de 685 nm. O mesmo efeito

não foi observado no tempo de 30 min (fig. 10). Ainda, observamos um aumento da

viabilidade celular das células irradiadas com o laser e incubadas com o meio de

cultura em 27% e 50% respectivamente, nos tempos de 15 e 30 min (fig. 10).

34

0

50

100

150

15 min

BthTX II (75 g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

*

*

#

# $

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

A

0

50

100

150

30 min

BthTX II (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

*

*

*

##

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

B

0

50

100

150

60 min

BthTX II (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

*

* #

#

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

C

Figura 10: Efeito do LBP 685 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação

com a BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas

durante 24 horas para a adesão celular. Após este período BthTX - II foi adicionada (75 µg/mL) e as

células foram imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de

energia (4J/cm2) em comprimentos de onda de 685nm, logo após foram incubadas durante 15, 30 e

60 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média

± SEM de três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; #p<0,05 vs VBjs;

$p<0,05 vs BthTX - II.

35

4.6 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na viabilidade de células

C2C12 após incubação com BthTX - II.

Para a avaliação do efeito de LBP 830 nm na viabilidade das monocamadas

de células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células C2C12, imediatamente

após a adição da toxina. Nossos resultados demonstraram um aumento de 11% e

35% na viabilidade celular no período de 15 e 60 minutos após a aplicação do LBP,

com comprimento de onda de 830 nm. O mesmo efeito não foi observado no tempo

de 30 min (fig. 11).

36

0

50

100

150

15 min

BthTX II (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

*

* ## $

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

A

0

50

100

150

30 min

BthTX II (75g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

*

* * ##

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

B

0

50

100

150

60 min

BthTX II (75 g/ml)

VBjs

25g/ml

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

*

*

#

$#

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

C

Figura 11: Efeito do LBP 830 nm na viabilidade de células musculares C2C12 após incubação

com BthTX - II.

Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante 24 horas

para a adesão celular. Após este período BthTX - II foi adicionada (75 ug/mL) e as células foram

imediatamente irradiados com laser de baixa intensidade utilizando densidade de energia (4J/cm2)

em comprimentos de onda de 830, logo após foram incubadas durante 15, 30 e 60 minutos. A

viabilidade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± SEM de

três experiências independentes, ANOVA de Tukey; *p<0,05 vs controle; #p<0,05 vs VBjs;

$p<0,05 vs

BthTX - II.

37

4.7 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação da enzima

Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por

BthTX - I.

A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e

tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da

enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que

receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante,

na concentração e tempos analisados (fig. 12).

38

0.00

0.25

0.50

15 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)A

0.00

0.25

0.50

30 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

B

0.00

0.25

0.50

60 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

C

Figura 12: Efeito do laser de baixa potência (LBP) 685 nm na liberação de LDH de células C2C12

submetidas à lesão por BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e

incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de

(75 µg/mL) ou somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no

comprimento de 685 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a

liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa

a média ± EPM de três experimentos independentes.

39

4.8 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da enzima

Lactato Desidrogenase (LDH) de células C2C12 submetidas à lesão por

BthTX - I.

A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e

tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da

enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que

receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante,

na concentração e tempos analisados (fig. 13).

40

0.00

0.25

0.50

15 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)A

0.00

0.25

0.50

30 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

B

0.00

0.25

0.50

60 min

BthTX I (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

830 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

C

Figura 13: Efeito do laser de baixa potência 830 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas

a lesão por BthTX - I. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por

24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/mL) ou

somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de

830 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato

Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de

três experimentos independentes.

41

4.9 Efeito do Laser de Baixa Potência 685 nm na liberação de LDH de células

C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II.

A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e

tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da

enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que

receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante,

na concentração e tempos analisados (fig. 14).

42

0.00

0.25

0.50

15 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)A

0.00

0.25

0.50

30 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

B

0.00

0.25

0.50

60 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

685 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

C

Figura 14: Efeito do laser de baixa potência 685 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas

a lesão por BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por

24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/mL) ou

somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de

685 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato

Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de

três experimentos independentes.

43

4.10 Efeito do Laser de Baixa Potência 830 nm na liberação da LDH de células

C2C12 submetidas à lesão por BthTX - II.

A perda da integridade da membrana após incubação com a toxina e

tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da

enzima citoplasmática LDH. Nossos resultados mostram que as células que

receberam a toxina não apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante,

na concentração e tempos analisados (fig. 15).

44

0.00

0.25

0.50

15 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)A

0.00

0.25

0.50

30 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

B

0.00

0.25

0.50

60 min

BthTX II (75g/ml)

Laser

830 nm

Cél.

685 nm

Controle

LD

H (

D.O

.)

C

Figura 15: Efeito do laser de baixa potência 830 nm na liberação de LDH de células C2C12 submetidas

à lesão por BthTX - II. Células musculares C2C12 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por

24 horas para adesão celular. Após esse período a toxina foi adicionada na concentração de (75 µg/mL) ou

somente meio de cultura (controle) as células foram imediatamente irradiadas com LBP no comprimento de

830 nm e foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato

Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. Cada valor representa a média ± EPM de

três experimentos independentes.

45

Discussão

46

5 DISCUSSÃO

Acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem, ainda, um

problema de saúde pública em regiões tropicais do mundo (GUTIERRES et al.,

2010; RAHMAN et al., 2010; WHO WORLD, HEALTH ORGANIZATION, 2013). A

reação local ao envenenamento por serpentes do gênero Bothrops é caracterizada

por uma resposta inflamatória grave, com formação de edema, sendo a mionecrose

local o mais acentuado dano observado em acidentes por picada de serpentes

(Ministério da Saúde 2001; BARRAVIERA, 1993; Ministério da Saúde 1999; DOIN-

SILVA et al.; MILANI JUNIOR et al.; 1997; CARNEIRO et al., 2012).

A mionecrose local é uma consequência comum nos envenenamentos

causados por serpentes do gênero Bothrops. Segundo dados da literatura, a

mionecrose é causada por miotóxinas com características de fosfolipase A2 (FLA2)

(GUTIÉRREZ et al., 1984; BRENES et al., 1987). As fosfolipases são largamente

presentes nos venenos de serpentes. Estas enzimas tem habilidade de causar

rápida necrose das fibras do músculo esquelético, sendo, portanto, classificadas

como FLA2 miotóxica (HARRIS; CULLEN, 1990). A soroterapia é o tratamento que

se mostra mais eficaz em neutralizar os efeitos sistêmicos causados pelo

envenenamento bothrópico, porem esse se mostra ineficaz em reverter os danos

locais (ROSENFELD, 1971; ZAMUNER et al., 2004). Neste sentido, a laserterapia de

baixa potência tem se mostrado eficaz na redução dos efeitos locais induzidos por

serpentes botrópicas (DOIN-SILVA et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2011;

BARBOSA et al., 2009, 2011; NADUR-ANDRADE et al., 2014). Assim, o presente

trabalho visou avaliar os efeitos de miotoxinas isoladas do veneno de B. jararacussu

em células musculares, e no melhor entendimento da aplicabilidade do laser de

baixa potência nessas células após lesão por miotoxinas botrópicas. Para a

obtenção dos resultados demonstrados nesse estudo, foram utilizados mioblastos de

linhagem C2C12, para avaliar os efeitos de miotoxinas isoladas em célula muscular.

A utilização de músculos esqueléticos mioblastos/miotubos como alvos para o

veneno bruto de serpente, bem como suas substâncias isoladas como

metaloproteinase e miotoxinas tem sido sugerida como uma alternativa viável no

modelo in vitro para estudar mecanismos miotóxicos, uma vez que se correlaciona

com miotoxicidade in vivo (LOMONTE et al., 1999).

47

Neste trabalhou, investigou-se a capacidade da BthTX - I em alterar a

viabilidade celular. Inicialmente, a viabilidade celular, na presença da miotoxina, foi

avaliada pela atividade metabólica mitocondrial, que consiste na capacidade das

células C2C12 em reduzir o composto formazan, produto cromogênico. Apenas

células vivas, viáveis, são capazes de reduzir o MTT em formazan por

desidrogenases mitocondriais, sendo a produção de formazan diretamente

proporcional a viabilidade celular. Os resultados obtidos mostraram que a BthTX - I,

foi capaz de diminuir a viabilidade das células musculares, este efeito foi dose-

dependente, sendo a concentração de 75 µg/mL que causou uma diminuição da

viabilidade em torno de 50%, em todos os períodos de tempo analisados. Estes

resultados estão de acordo com literatura que mostra a capacidade citotóxica do

veneno bruto e de miotoxinas isoladas de venenos botrópicos sobre cultura de

mioblastos de linhagem C2C12 (LOMONTE, et al., 1999; ANDRIÃO-ESCARSO et

al., 2000; SILVA et al., 2012; HAMZA et al., 2010). Da mesma maneira, a BthTX - II

causou uma diminuição da viabilidade nas células C2C12 na concentração de 75

µg/mL, no entanto, a redução da viabilidade ficou em torno de 25%, para todos os

tempos estudados. Dos Santos et al. (2011) demonstraram uma diminuição da

viabilidade de células C2C12 com a BthTX - II em torno de 50% em células C2C12,

no entanto, o método utilizado para avaliar a citotoxicidade foi a dosagem de lactato

desidrogenase.

Adicionalmente, investigamos a capacidade da BthTX - I em afetar o

descolamento celular, para termos uma melhor compreensão da ação da miotoxina

sobre a integridade da célula muscular. Os resultados demonstraram que a BthTX - I

não afetou o descolamento das células C2C12 em nenhuma das concentrações ou

tempo estudado. Esse resultado era esperado, uma vez que a literatura demonstra

que os principais componentes do veneno responsáveis pelo descolamento das

células de seu substrato são as metaloproteinases (BRENES et al., 2010).

A terapia com o LBP é uma alternativa eficaz para o tratamento dos efeitos

locais causados por serpentes botrópicas devido a sua capacidade de diminuir a

inflamação, hemorragia e mionecrose após envenenamento botrópico experimental,

in vivo, tanto com veneno bruto quanto com miotoxinas isoladas (DOURADO et al.,

2003; BARBOSA et al., 2009; NADUR-ANDRADE et al., 2012; 2014). No entanto, os

48

mecanismos envolvidos na proteção local pela irradiação laser contra a ação local

do veneno botrópico ainda não são compreendidos.

Neste estudo, investigamos a capacidade da terapia LBP em proteger as

células musculares contra ação de miotoxinas isoladas do veneno da serpente B.

jararacussu. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada pelo veneno foi

avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm2 em dois comprimentos

de onda, vermelho no comprimento de onda 685 nm e infravermelho no

comprimento 830 nm, após a adição das miotoxinas nas células musculares C2C12.

Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a concentração usada de 4

J/cm2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo método MTT, em células musculares

em todos os períodos de tempo analisados após a adição das miotoxinas. Em apoio

a este resultado, há relatos sobre a habilidade do laser em estimular processos

celulares em vários tipos celulares, humanas e animais, in vitro (para revisão ver

PEOPLOW et al., 2010). No entanto, não esta claro o mecanismo pelo qual o laser

protege a célula muscular da ação das miotoxinas, esse efeito pode ser resultante

tanto de uma parcial ou mesmo total proteção da célula, ou por estimulação da

proliferação de células sobreviventes.

Quando analisamos a efetividade do laser vermelho em comparação com o

laser infravermelho, observamos que o laser vermelho se mostrou mais efetivo, em

comparação com o laser infravermelho. Essa diferença encontrada entre o laser

vermelho e o infravermelho pode estar relacionada com a penetração da luz no

tecido (EL SAYED et al., 1990; TACON et al., 2011) uma vez que já foi demonstrado

que o laser vermelho penetra mais no tecido que o laser infravermelho. Além disso,

é descrito na literatura que a luz laser que emite no espectro vermelho visível

estimula a cadeia respiratória em células sob estresse, levando a alterações no

transporte de elétrons pela mitocôndria, como a formação de ATP (KARU, 1989;

OLSON et al., 1981; MOORE et al., 2005). Então, além do aumento da síntese de

ATP, há uma sinalização para o núcleo para estimular a produção de enzimas

antioxidantes, proteínas que estabilizam a função celular e proliferação (POLO et al.,

1999). Além disso, observamos um aumento da viabilidade celular em células que

somente foram irradiadas com o laser vermelho, o que não aconteceu com as

células irradias com o laser infravermelho. É possível que no nosso modelo

49

experimental o laser vermelho tenha produzido mais ATP e com isso tenha sido

mais efetivo, a hipótese que vamos esclarecer em estudo futuro.

Para melhor entender a capacidade do laser em proteger a célula muscular

contra a ação das miotoxinas, investigamos a capacidade das miotoxinas em afetar

a viabilidade celular, pela liberação da lactato desidrogenase (LDH) uma enzima

intracelular que após rompimento da membrana celular é liberada, podendo ser

dosada no sobrenadante de cultura celular. A LDH converte piruvato a lactato,

gerando NAD, que é importante para sustentação do fluxo glicolítico. A LDH

converte o piruvato, que é o produto final da glicólise em lactato na ausência ou em

pequenas quantidades de oxigênio, realiza também reação reversa via glicolítica

anaeróbica no fígado. Na presença de grandes concentrações de lactato, a enzima

exibe inibição por “feedback” e a taxa de lactato a piruvato é reduzida. Em nosso

modelo experimental, não encontramos diferença na liberação de LDH em nenhum

dos tempos analisados por nenhuma das miotoxinas estudadas. Nossos resultados

mostraram contrários aos mostrados por outros autores que demonstram que as

miotoxinas de B. apser e B. jararacussu aumentam a liberação de LDH em

diferentes tempos e concentrações quando comparados com esse estudo.

(ANGULO et al. 2005; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000; LOMONTE et al., 1999).

Esses achados sugerem que novas concentrações e tempos devem ser avaliados

para o melhor entendimento dos possíveis mecanismos de ação das toxinas.

É possível considerar que a fototerapia com laser de baixa potência utilizando

parâmetros específicos descritos neste estudo foi capaz de compensar os efeitos

citotóxicos causados pelas miotoxinas. É bastante provável que dois ou mais

mecanismos de ação da fototerapia tenha ocorrido simultaneamente nas culturas

irradiadas e foram responsáveis pela resposta biológica observada. O aumento da

atividade celular por aumento do metabolismo (atividade mitocondrial) decorrente da

irradiação laser, com as duas miotoxinas estudadas, pode ser considerado como um

efeito benéfico da terapia. A partir dos parâmetros utilizados neste trabalho, que

demonstraram eficácia na compensação da citotoxicidade das miotoxinas, podemos

sugerir que o laser de baixa potência seja uma ferramenta eficaz com efeitos

importantes na diminuição dos efeitos locais causados por envenenamento

botrópico.

50

Conclusões

51

6 CONCLUSÕES

Os dados do presente estudo permitiu concluir que:

√ As miotoxinas BthTX - I e BthTX - II isoladas do veneno da serpente B.

jararacussu apresentam efeito miotóxico de maneira dose-dependente, nos períodos

analisados, para a linhagem celular utilizada nesse estudo.

√ O laser de baixa potência 685 nm e 830 nm foi capaz de proteger a célula

muscular contra a ação da miotoxinas BthTX - I e BthTX - II, pelo método de MTT,

mas não pelo método de liberação de LDH.

52

Referências Bibliográficas

53

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALGHAMDI, K.M.; KUMAR, A.; MOUSSA, N.A. Low-level laser therapy: a useful

technique for enhancing the proliferation of various cultured cells. Lasers Med Sci.

27(1):237-49, 2012.

ANDRIÃO-ESCARSO, S. H. et al. Myotoxic phospholipases A2 in Bothrops snake venoms: effect of chemical modifications on the enzyrmatic and pharmacologic properties of bothropstoxin from Bothrops jararcussu. Biochemie, v. 82, p. 755-763, 2000.

ANGULO, Y.; GUTIÉRREZ, J.M.; SOARES, A.M.; CHO, W.; LOMONTE, B. Myotoxic

and cytolytic activities of dimeric Lys49 phospholipase A2 homologues are reduced,

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