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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
RUBIA CRISTIANI CAMOCHENA
DESEMPENHO DE FOSFITOS DE POTÁSSIO NO MANEJO DE
MOFO BRANCO EM SOJA
TESE
PATO BRANCO
2015
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
RUBIA CRISTIANI CAMOCHENA
DESEMPENHO DE FOSFITOS DE POTÁSSIO NO MANEJO DE
MOFO BRANCO EM SOJA
TESE
PATO BRANCO
2015
RUBIA CRISTIANI CAMOCHENA
DESEMPENHO DE FOSFITOS DE POTÁSSIO NO MANEJO DE
MOFO BRANCO EM SOJA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia da UniversidadeTecnológica Federal do Paraná, Câmpus PatoBranco, como requisito parcial à obtenção do títulode “Doutor em Agronomia” - Área deConcentração: Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Idalmir dos SantosCo-Orientadora: Profª. Drª. Marisa de Cacia
Oliveira
PATO BRANCO
2015
Ministério da EducaçãoUniversidade Tecnológica Federal do Paraná
Câmpus Pato BrancoGerência de Ensino e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
TERMO DE APROVAÇÃO
Título da Tese n° XXX
DESEMPENHO DE FOSFITOS DE POTÁSSIO NO MANEJO DE
MOFO BRANCO EM SOJA
por
RUBIA CRISTIANI CAMOCHENA
Tese apresentada às 8 horas e 30 min. do dia 10 de dezembro de 2015 comorequisito parcial para obtenção do título de DOUTOR EM AGRONOMIA, Linha dePesquisa – Sustentabilidade de Agroecossistemas, Programa de Pós-Graduação emAgronomia (Área de Concentração: Produção vegetal) da Universidade TecnológicaFederal do Paraná, Câmpus Pato Branco. O candidato foi arguido pela BancaExaminadora composta pelos professores abaixo assinados. Após deliberação, aBanca Examinadora considerou o trabalho APROVADO.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Erlei Melo ReisOR Melhoramento de Sementes
Passo Fundo-RS
Profa. Drª. Rosangela DallemoleGiarettaUTFPR/PB
Profa. Drª. Marisa de Cacia OliveiraUTFPR/PB
Coorientadora
Prof. Dr. Idalmir dos SantosUTFPR/PBOrientador
Visto da Coordenação:
Prof. Dr. Giovani BeninCoordenador do PPGAG
- A minha família que soube entender a minha ausência nos muitos
momentos desde que ingressei no doutorado, até a conclusão dessa
tese;
- Ao meu querido namorado Claudio, pela ajuda e pelo apoio nos
momentos de angústia e ansiedade durante o período que me dediquei
ao doutorado;
- A todos os professores e alunos que participaram da pesquisa;
- A UTFPR por acreditar no meu profissionalismo,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
- Ao meu querido orientador Prof. Dr. Idalmir dos Santos, pela
dedicação, carinho, esperança, humildade, por ter me conduzido desde o mestrado
e por ter aceitado ser orientador novamente, e ter recebido meu trabalho de forma
profissional e com amizade;
- A minha querida coorientadora Profª. Drª. Marisa de Cacia Oliveira,
pela ajuda, dedicação e paciência, principalmente durante as análises laboratoriais e
pelo incentivo a tentar novamente, quando as metodologias não davam certo;
- Aos amigos e colegas Josicléa H. Arruda, Kelly Pazolini, Aquélis
Arminato, Marielle Marcondes, Driéli Reiner, Patrícia Piacentini, Felipe Deifeld, Alana
Chiarani, Andrei F. Kuhn, Alexandre Barbosa, e a todos que de alguma forma
contribuíram para a realização deste trabalho;
- Ao Prof. Jamhour pela disposição em auxiliar na formatação da tese;
- Em especial, agradeço a minha amiga Carla D. Leite e Danilo Sebim
por me apoiarem nos diversos trabalhos desenvolvidos no laboratório, à noite e em
finais de semana, para compôr esta tese;
- Também agradeço muitíssimo a Profª. Drª. Rosângela Dallemole-
Giaretta pela amizade e pela paciência e apoio durante grande parte de
desenvolvimento da pesquisa e elaboração da tese;
- Aos irmãos Pernlochner por ceder a área para realização dos
experimentos e por dar suporte nas atividades;
- A todos os professores da UTFPR, que participaram de toda minha
formação científica, agradeço de coração, e
- A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
Muito obrigada!
“Descobrir consiste em olhar para o que todo mundo está vendo e
pensar uma coisa diferente”. (Roger Von Oech)
RESUMO
CAMOCHENA, Rubia Cristiani. Desempenho de fosfitos de potássio no manejo demofo branco em soja. 81 f. Tese (Doutorado em Agronomia) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal), UniversidadeTecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2015.
A cultura da soja é importante no mercado brasileiro sendo um dos produtos maisexportados pelo país. Sua produtividade pode ser afetada pelas doenças, comomofo branco, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary, que, emcondições ambientais favoráveis, se desenvolve nas lavouras e impede a cultura deexpressar todo seu potencial produtivo. O fungo é cosmopolita e infecta mais de 400espécies de plantas. Essa doença é de difícil controle, e o uso de agroquímicos nãoé suficiente para evitar perdas significativas, e além disso, causam danos ambientaise possuem custos elevados. Métodos alternativos, a exemplo dos fertilizantesfoliares, à base de fosfito de potássio, também podem ser utilizados no manejodesta doença. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi comparar diferentes fosfitos depotássio no controle do mofo branco em soja, bem como a época de aplicação nacultura, a ação na indução de respostas de defesa das plantas e/ou sua influênciana qualidade das sementes. O efeito dos fosfitos sobre o patógeno foi avaliado, invitro, sobre a inibição micelial, a massa de micélio seca e germinação deescleródios. Em todos os testes foram utilizados os seguintes fosfitos: Fosfito A(P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha); Fosfito B (P2O5-40%; K2O-28% - 1 L/ha); Fosfito C(P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha), Fosfito D (P2O5-30%; K2O-20% - 2,4 L/ha). Nos testesde indução de resistência foram avaliadas a síntese de fitoalexinas, em cotilédonesde soja, e as enzimas FAL e POX, avaliadas em plântulas, em câmara decrescimento, pulverizadas com os fosfitos e o fungicida fluazinam. O experimento decampo foi conduzido no Município de Coronel Domingos Soares-PR, na safra2012/2013, em área com infestação natural com o fitopatógeno. Foi semeada acultivar de soja utilizada foi BMX Ativa, em sistema de semeadura direta, comespaçamento entre linhas de 0,5 m. O delineamento experimental foi em arranjofatorial 5 x 4 (tratamentos x épocas de aplicação). Foram utilizados os fosfitosdescritos acima e pulverização somente com água no tratamento testemunha. Ostratamentos foram aplicados em quatro estádios fenológicos da cultura: V4, V4+R1,R1 e R2, nas dosagens recomendadas pelo fabricante. Após a colheita foramavaliados componentes de rendimento e qualidade sanitária e fisiológica dassementes. Nenhum dos fosfitos testados afetou o crescimento micelial e agerminação dos escleródios, nem influenciou na síntese de fitoalexinas. Os fosfitosC e D se destacaram por aumentar a atividade da fenilalanina amonia-liase a partirde 48 horas após a inoculação. Esses mesmos produtos também induziram asíntese de peroxidases e o fosfito C foi o que manteve os níveis dessa enzimaelevados até 72 horas após a inoculação. No experimento de campo os fosfitos C eD se destacaram no controle do mofo branco. Não houve interação significativa dosfosfitos de potássio na qualidade fisiológica e sanitária das sementes.
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, Manejo alternativo, Indução de resistência
ABSTRACT
CAMOCHENA, Rubia Cristiani. Performance of potassium phosphite on white moldmanagement in soybeans. 81 f. Tese (Doutorado em Agronomia) – Programa dePós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal),Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2015.
Soybean plays an important role in the Brazilian agriculture being one of the productsmost exported by the country. Its yield may be affected by diseases such as whitemold, caused by the fungus Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary, which, underfavorable field conditions prevents the crop of expressing all its productive potential.The fungus is cosmopolitan and infects more than 400 species of plants. Thisdisease is difficult to control, and the use of chemicals has not been sufficient toavoid significant losses, thus, this products are expensive and may causeenvironmental damage. Alternative methods, such as foliar fertilizers based onpotassium phosphite, can also be used in the management of this disease. In thiscontext, this work aimed to study different sources of potassium phosphite and itseffects in the control of white mold in soybeans, as well as the time of application inculture, its action in inducing plants defense responses and/or its influence over theseeds quality. The effect of phosphites, over the pathogen, was evaluated in vitro, onmycelial inhibition, the mass of dry mycelium and germination of sclerotia. In all tests,the following phosphites were utilized: Phosphite A (P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha);Phosphite B (P2O5-40%; K2O-28% - 1 L/ha); Phosphite C (P2O5-40%; K2O-20% - 1L/ha) e Phosphite D (P2O5-30%; K2O-20% - 2,4 L/ha). At the induction of resistancetests were evaluated the synthesis of phytoalexin in soybean cotyledons and theenzymes FAL and POX evaluated in seedlings in growing chamber, sprayed withphosphites and the fungicide fluazinam. Field experiment was carried out at CoronelDomingos Soares-PR, in the 2012/2013 season, in an area with natural infestation ofthe pathogen. Soybean cultivar BMX Active was no-till seeded with 0,5m betweenrows. The experimental was laid out as a factorial 5 x 4 scheme (treatment xapplication time). Phosphites sources were used, as described above, and water wassprayed in the control treatment. Treatments were applied at four different growthstages: V4, V4 + R1, R1 and R2 at the rates recommended by the manufacturer.Soybean yield components and seeds and health and physiological quality wereevaluated after harvesting. None of the tested phosphites affected mycelial growthand sclerotia germination or influenced phytoalexin synthesis. Phosphites C and Dstood out due to an increasing in the phenylalanine ammonia-lyase activity 48 hoursafter its inoculation. These same products also induced the synthesis andperoxidases and phosphite C kept the levels of this enzyme elevated up to 72 hoursafter inoculation. At the field trials, phosphites C and D stood out in the control ofwhite mold. There was no significant interaction of potassium phosphite onphysiological and sanitary quality of the seeds.
Keywords: Sclerotinia sclerotiorum, alternative management, resistance induction.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 – A e B) Furador de rolhas utilizado para demarcação da área a ser raspada nos cotilédones de soja; C) Cotilédones de soja com a área seccionada raspada; D) Agitador com os erlenmayers contendo os cotilédones em agitação para extração da gliceolina; E) Filtragem para separar os cotilédones da solução de extração F) Espectrofotômetro. UTFPR, Pato Branco, 2013................................................................... 32
Figura 02 – A) Crescimento das plântulas de soja em copos plásticos; B) Inoculação de discos de micélio de Sclerotinia sclerotiorum na superfície adaxial das folhas de soja; C) Coleta de plântulas de soja e armazenamento em papelalumínio. UTFPR, Pato Branco, 2014................................................... 34
Figura 03 – A) Alíquota de material vegetal (plântulas sem raiz) de soja para maceração; B) Maceração de material vegetal de soja, em tampão de extração; C) Acondicionamento do extrato bruto de material vegetal de soja em tubos eppendorfs. UTFPR, Pato Branco, 2014....................... 34
Figura 04 – A) Demarcação de parcelas de cinco linhas. B) Espaçamento entre parcelas. Coronel Domingos Soares, safra 2012/13............................. 37
Figura 05 – A) Distribuição das sementes de soja no papel Germitest®; B) Acondicionamento de sementes de soja em caixas 'gerbóx' para teste de vigor; C) Distribuição das sementes de soja sobre linha traçada no terço superior da folha para análise de comprimento de raiz e parte aérea; D) Rolos contendo as sementes; E) Rolos dentro de sacos plásticos, com pequenos orifícios, para manter umidade e oxigenação, em acondicionamento em câmara germinadora. UTFPR, Pato Branco, 2013................................................................................................................39
Figura 06 – Experimento 1 e 2 in vitro, avaliação do efeito dos fosfitos de potássio sobre o crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, após sete dias de incubação em câmara de crescimento, com fotoperíodo de 12 horas a 24 °C. UTFPR, Pato Branco, 2014........................................................ 42
Figura 07 – Valores de absorbância (ABS) da síntese de gliceolina pela cultivar de soja BMX Ativa após ser submetida aos tratamentos com diferentes fosfitos de potássio. UTFPR, Pato Branco, 2013. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% deprobabilidade de erro. UTFPR, Pato Branco, 2013............................... 43
Figura 08 – Atividade específica de fenilalanina amônia-liase (FAL) em plantas de soja, cultivar Ativa, tratadas com diferentes fosfitos e inoculadas com Sclerotinia sclerotiorum, em câmara de crescimento. UTFPR, Pato Branco, 2014.......................................................................................... 45
Figura 09 – Atividade específica de peroxidase (POX) em plantas de soja “BMX Ativa”, no estadio vegetativo V2, eliciadas com fosfitos de potássio (fosfito A, B, C e D), fungicida fluazinam e inoculadas com o fungo Sclerotinia sclerotiorum. UTFPR, Pato Branco, 2014............................................. 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Efeito dos fosfitos de potássio sobre o diâmetro (cm), de colônias de Sclerotinia sclerotiorum após 13 dias de incubação, em meio de cultura BSA (Avaliações dos experimentos 1 e 2) e massa seca de micélio (MS) em gramas, média dos experimento 1 e 2...............................................41
Tabela 02 -- Incidência, em plantas (%), e controle de mofo branco em relação aos diferentes fosfitos de potássio utilizados, avaliados no estádio R4, da cultivar de soja BMX Ativa. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13.....................................................................................................52
Tabela 03 – Severidade do mofo branco (%) em relação aos fosfitos de potássio utilizados, avaliada nos estádios R5.1 e R5.5, da cultivar de soja BMX Ativa. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13..........................54
Tabela 04 – Número de plantas mortas em relação aos fosfitos de potássio utilizados, avaliados no estádio R7 da cultivar de soja BMX Ativa. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13..................................................54
Tabela 05 – Produtividade (kg/ha) de grãos de soja em resposta à aplicação de fosfitos de potássio. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13....56
Tabela 06 – Vagens por planta (n°) e sementes por planta (n°), de soja em resposta à aplicação de fosfitos de potássio. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/2013.....................................................................................…57
Tabela 07 – Massa de mil grãos (g) de soja em resposta à aplicação de fosfitos de potássio. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/2013.............…58
Tabela 08 – Germinação (%), vigor(%), comprimento da parte aérea e raiz (cm), massa seca de plântulas (g) e massa de mil grãos (g) das sementes colhidas no experimento de soja com aplicação de fosfitos de potássio, em Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13..............................59
Tabela 09 – Incidência (em sementes) (%) de Sclerotinia sclerotiorum na cultivar de soja “BMX Ativa”, detectada pelo teste Neon-modificado na safra 2012/2013. UTFPR, Pato Branco-PR.......................................................59
LISTA DE SIGLAS
CONAB Companhia Nacional de AbastecimentoEMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaIAPAR Instituto Agronômico do ParanáMAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoPR Unidade da Federação – Paraná
LISTA DE ABREVIATURAS
ABS AbsorbânciaBiol. Biologiacm centímetroEDTA Ácido etilenodiamino tetra-acéticoEnto. EntomologiaFAL Fenilalanina Amonia-Liaseg Gramaha Hectarekg quilogramaL LitroM Molarmg MiligramaN Normaln° Númeronm NanômetroO OestepH Potencial hidrogeniônicoPOX PeroxidasePVP Polivinilpirrolidonarpm Rotações por minutoS SulTris TrishidroximitelaminometanoµL Microlitro
µM Micromolar% Percentual
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................152 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................172.1 A CULTURA DA SOJA...........................................................................................172.2 MOFO BRANCO CAUSADO POR SCLEROTINIA SCLEROTIORUM................182.2.1 Detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja.............................222.3 ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA INDUÇÃO DA RESISTÊNCIA DE PLANTAS A PATÓGENOS..............................................................................................................242.4 USO DE FOSFITOS COMO INDUTORES DE RESISTÊNCIA............................272.5 EFEITO DE FERTILIZANTES FOLIARES NA QUALIDADE FÍSICA E FISIOLÓGICA DE SEMENTES...................................................................................283 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................303.1 TESTES IN VITRO................................................................................................303.1.1 Isolamento de Sclerotinia sclerotiorum de soja.................................................303.1.2 Avaliação de diferentes fosfitos de potássio sobre inibição micelial de Sclerotinia sclerotiorum...............................................................................................303.1.3 Avaliação da massa micelial seca de Sclerotinia sclerotiorum..........................313.1.4 Avaliação de fosfitos de potássio sobre a germinação de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum...............................................................................................313.2 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE COMPOSTOS DE DEFESA INDUZIDOS NAS PLANTAS PELOS FOSFITOS DE POTÁSSIO...........................................................323.2.1 Síntese de fitoalexinas.......................................................................................323.2.2 Avaliação da síntese de compostos induzidos pelos fosfitos de potássio.........343.2.3 Obtenção de extratos proteicos.........................................................................353.2.3.1 Peroxidase (POX, EC 1.11.1.7).......................................................................363.2.4 Fenilalanina amônia liase (FAL, EC 4.3.1.5)......................................................363.3 EXPERIMENTO DE CAMPO................................................................................363.3.1 Avaliação de diferentes fosfitos de potássio sobre o mofo branco em condiçõesde campo.....................................................................................................................373.3.2 Componentes do rendimento.............................................................................383.3.3 Teste de qualidade física e fisiológica das sementes........................................393.3.4 Teste da qualidade sanitária das sementes.......................................................413.4 ANÁLISE DOS DADOS.........................................................................................414 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................424.1 TESTES IN VITRO................................................................................................424.1.1 Avaliação da inibição micelial, massa de micélio e germinação de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum em resposta aos fosfitos..................................................424.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS....................................................................................434.2.1 Avaliação da síntese de fitoalexinas, peroxidases e fenilalanina amonia-liase.434.3 EXPERIMENTO DE CAMPO................................................................................524.3.1 Efeito de fosfitos de potássio na incidência e severidade de mofo branco, nos componentes de rendimento e na qualidade física, fisiológica e sanitária das sementes de soja........................................................................................................525 CONCLUSÕES........................................................................................................62CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................63REFERÊNCIAS...........................................................................................................64APÊNDICES................................................................................................................77ANEXOS......................................................................................................................79
14
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, a soja [Glycine max (L.) Merril] é a principal cultura agrícola,
sendo um dos produtos mais exportados pelo país. A cada ano aumenta a produção
desta oleaginosa, principalmente pela associação às tecnologias de ponta cada vez
mais utilizadas por grandes produtores como a utilização de variedades melhoradas
e com alto potencial produtivo.
Embora a área cultivada com soja esteja aumentando, alguns aspectos
básicos de manejo integrado de pragas e doenças acabam sendo deixados de lado,
aumentando, com isso, a ocorrência de patógenos nas lavouras. Em adição a isso, o
monocultivo e a falta de informação dos produtores faz com que problemas de
natureza sanitária, causem prejuízos na produtividade da soja. Um exemplo é o
mofo branco, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary (S.
sclerotiorum), que prejudica a produtividade da cultura em áreas infestadas.
O mofo branco destaca-se por reduzir o potencial produtivo da soja em
condições favoráveis ao seu desenvolvimento, umidade acima de 70% e
temperaturas abaixo de 20 °C, podendo causar danos, nas áreas de cultivo, de até
100% (JACCOUD FILHO et al., 2010).
O fungo S. sclerotiorum vem sendo estudado desde 1837 e destaca-se,
entre outros patógenos, por possuir algumas características específicas como ter
mais de 400 hospedeiros, entre mono e dicotiledôneas, alta capacidade de
sobreviver no solo, por meio de estruturas de resistência chamadas escleródios, por
períodos de 3 a 10 anos, apesar dos dados serem discordantes na literatura. Estas
estruturas germinam em condições de temperatura abaixo de 20 °C e umidade
relativa acima de 70%, disseminando o patógeno para outros locais. Estas
estruturas de repouso compõe uma característica marcante do fungo, pois a cada
ciclo da doença são produzidas novamente em plantas infectadas. O fungo também
pode ser disseminado através das sementes (como micélio dormente) a longas
distâncias, tornando o controle ou erradicação difícil, uma vez introduzido em áreas
de cultivo em que não estava presente.
Atualmente não existe uma medida de controle eficiente e
economicamente viável para a doença. Os fungicidas aplicados apresentam
dificuldade em atingir os sítios de infecção, e os que possuem ação protetora,
podem ser removidos pela chuva, pois em algumas safras as épocas de aplicação
15
dos produtos podem coincidir com períodos de alta precipitação pluvial. A rotação de
culturas, embora factível e viável, pode também ficar comprometida uma vez que o
fungo possui muitos hospedeiros, que são infectados devido à permanência das
estruturas de repouso remanescentes de cultivos anteriores.
Portanto, o manejo desta doença é uma tarefa complexa e medidas de
controle devem ser integradas num sistema flexível, que seja econômico e
compatível com o sistema de produção.
Devido a isso, vários estudos tem sido conduzidos visando a
associação de métodos para reduzir a intensidade do mofo branco em soja, e que
sejam economicamente viáveis, como uso de herbicidas, fungicidas e uso de adubos
foliares a base de fosfito de potássio.
Os fertilizantes foliares, além de proporcionarem incremento na
produtividade, vêm sendo testados no controle de doenças através da indução de
resistência da planta, ativando mecanismos de defesa, sem comprometer a
produtividade nem agredir o meio ambiente. Como exemplo pode-se citar os fosfitos
que estão apresentando resultados promissores quando utilizados para induzir
proteção contra alguns patógenos em frutíferas [Plasmopara viticola Berk. & M.A.
Curtis – videira (SÔNEGO, GARRIDO e CZERMAINSKI, 2003); Colletotrichum
gloesporioides (Penz) Sacc. – macieira (ARAUJO, VALDEBENITO-SANHUEZA e
STADNIK, 2010; DIANESE et al, 2007] e indução de resistência a doenças em
grandes culturas [influência na produção de peroxidases, proteínas e fenóis – milho;
Colletotrichum lindemuthianum Sacc. Magn. em Feijoeiro (GADAGA, 2009; ÁVILA,
2009; SILVA, 2013)].
Apesar dos fosfitos apresentarem potencial no manejo de algumas
doenças, ainda há poucos estudos sobre o assunto, principalmente, para controle
dese patógeno. Os estudos sobre a utilização de novos produtos para o controle de
mofo branco na soja, como fosfitos, podem contribuir para o aumento da
produtividade e rentabilidade da cultura.
Sendo assim, este estudo teve como objetivo comparar diferentes
fosfitos de potássio no controle do mofo branco da soja bem como época de
aplicação na cultura, sua ação na indução de respostas de defesa das plantas e/ou
sua influência na qualidade das sementes.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 A CULTURA DA SOJA
A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma leguminosa originária da China,
sendo considerada uma das culturas mais antigas do mundo. Ela atingiu o patamar
de produtividade atual devido a evolução, obtida pelos cruzamentos naturais entre
espécies selvagens e sendo com isso, melhorada e domesticada para cultivo.
Nos escritos chineses observa-se que esta cultura já era utilizada como
alimento 2838 anos a.C. (BONATO; BONATO, 1987), porém, seu cultivo data de
5.000 anos atrás. Foi levada ao mundo todo pelos viajantes ingleses e por
imigrantes da China e do Japão (EMBRAPA, 2003).
No Brasil, a cultura foi introduzida no ano de 1882, na Bahia, pelo
professor Gustavo D’Utra, inicialmente como planta forrageira, mas sem sucesso.
No ano de 1892, tiveram início alguns estudos no Instituto Agronômico de Campinas.
No entanto, resultados satisfatórios foram alcançados somente após o ano de 1908
quando alguns imigrantes japoneses trouxeram cultivares americanas (COSTA,
1996). Nas décadas seguintes, foi estudada em algumas instituições oficiais e
cultivada, em pequenas áreas, para a alimentação de famílias de imigrantes
japoneses, em São Paulo. Em 1914 também foi introduzida no Rio Grande do Sul
(MAGALHÃES, 1981). No Estado do Paraná iniciaram-se os cultivos de soja no ano
de 1954 (MIYASAKA; MEDINA, 1977) e, desde então, sua produção vem crescendo.
Segundo Costa (1996), os produtores brasileiros contribuíram ainda
mais para o desenvolvimento da cultura, utilizando áreas de trigo, que permaneciam
em pousio na estação quente, trazendo bom desempenho para ser cultivada em
sucessão com trigo.
Desde a chegada da soja ao Brasil, ela foi estudada e pesquisada, e
por não ser nativa, programas de melhoramento genético a transformaram em uma
cultura adaptada às condições climáticas e de solo, com altos rendimentos
(ALMEIDA; KIIHL, 1998; ALMEIDA et al., 1999).
Na safra de 2012/2013, o Brasil se destacou como o maior produtor de
soja, seguido pelos EUA, Argentina e China, com uma produção de 83,5; 82,1; 51,5
e 12,6 milhões de toneladas, respectivamente (DEAGRO - FIESP, 2013). A produção
17
da safra 2014/2015 ficou em torno de 96 milhões de toneladas, maior que a safra
anterior, devido ao aumento da área cultivada (CONAB, 2015).
O aumento da produção e de áreas cultivadas com soja, são resultados
especialmente, de preço elevado do grão, avanços tecnológicos, manejo e eficiência
dos produtores. É cultivada principalmente na região Sul e Centro Oeste do país, e
foi levada e adaptada às condições ambientais do cerrado, graças aos avanços das
tecnologias e pesquisas realizadas pela Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA) no desbravamento dessas regiões (MISSÃO, 2008;
MAPA, 2014).
Como o aumento das exportações, surge uma pressão de demanda
interna e necessidade de suprimento desta oleaginosa. Para isso, o aumento da
produtividade deve continuar. Isso ocorre devido aos investimentos e bons
resultados na cadeia produtiva, pois a leguminosa é utilizada para alimentação e
geração de energia, atraindo produtores e investidores de outras áreas, como
indústrias beneficiadoras de alimentos (MISSÃO, 2008).
Todo ano, aproximadamente 30 milhões de toneladas de soja são
convertidos em mais de 5 milhões de toneladas de óleo combustível e 23,5 milhões
de toneladas em rações, para produção de carne, ovos e leite. Além disso, estes
produtos, pela qualidade que possuem, são exportados a outros países, como União
Europeia, China e Japão (MAPA, 2014).
Embora a área de cultivo esteja aumentando, alguns aspectos básicos
de manejo integrado de pragas e doenças acabam sendo deixados de lado, e isso
acarreta em aumento da incidência de patógenos na cultura. Produtores e empresas
em busca de lucratividade, acabam utilizando o monocultivo dessa cultura, fazendo
com que ocorram problemas de natureza sanitária, como a ocorrência do mofo
branco, causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Essa doença é
uma das mais preocupantes da cultura, somada a ferrugem asiática (Phakopsora
pachyrhizi Sydow) (SEIXAS; SOARES, 2013).
2.2 MOFO BRANCO CAUSADO POR SCLEROTINIA SCLEROTIORUM
O fungo Sclerotinia sclerotiorum é o agente causador do mofo branco,
doença emergente, principalmente em regiões de clima ameno (abaixo de 20 °C),
18
como no Sul, Sudeste e áreas de maiores altitudes do Centro-Oeste e Nordeste, em
que as temperaturas, durante a noite, são mais baixas (CASSETARI NETO,
MACHADO e SILVA, 2010).
Esse fungo é habitante do solo, pertencente à Família Sclerotiniaceae,
da Ordem Helotiales, Filo Ascomycota e Reino Fungi (AGRIOS, 1997). Sua
sobrevivência ocorre através de micélio dormente em sementes e pela presença dos
escleródios no solo. A disseminação ocorre através de sementes infectadas,
ascósporos, trânsito de máquinas, implementos ou até mesmo pelo homem
(ALMEIDA et al., 2005; GORGEN et al., 2009).
É um patógeno polífago, e tem mais de 400 plantas como hospedeiras
(BOLAND; HALL, 1994). Uma vez introduzido em uma lavoura este fungo torna-se
de difícil controle, pois os escleródios são produzidos a cada ciclo da cultura,
mantendo-se presentes no solo, e sua degradação é difícil, principalmente pela
presença do pigmento melanina, e também, pela dificuldade dos fungicidas atingir os
sítios de infecção (ITO; PARISI, 2010). O mofo branco tem seu melhor
desenvolvimento nos locais com altitudes elevadas, geralmente, com mais de 800
m, e principalmente em regiões que possuam característica de clima com
temperaturas menores de 20 °C, na safra de verão, com e umidade relativa acima
de 70% (LEITE, 2005).
Para iniciar o processo infeccioso, os escleródios podem germinam
formando micélio (germinação miceliogênica), ou germinam formando apotécios
(germinação carpogênica). Quando os apotécios são formados, liberam ascósporos
que infectarão a parte aérea do hospedeiro (LEITE, 2005). Todavia, para que ocorra
a germinação dos escleródios, eles deverão estar localizados no solo numa
profundidade inferior a 5 cm e numa amplitude térmica de 4,4 a 30 °C (CLARKSON
et al., 2003; STEADMAN; BOLAND, 2005). Quando a germinação carpogênica
ocorre, inicia um crescimento de células que rompem a camada externa do
escleródio, formando ramificações em forma de tubo, chamados estipes. Estas
precisam de exposição à luz, principalmente ultravioleta, para se diferenciar em
apotécios (BOLTON, THOMMA e NELSON, 2006). Tal fato é importante, pois quando
a semente está infectada, apenas uma pode originar mais de um escleródio, e de
cada um, dependendo de seu tamanho, podem ser gerados vários apotécios (BEDI,
1963) contendo aproximadamente 2.000.000 de ascósporos cada um, que são
liberados no ambiente, durante 10 dias.
19
Os apotécios formam ascas em seu interior, e delas, são liberados os
esporos, sendo que o período de liberação pode variar entre 36 a 168 horas. A
incidência do sol ao meio dia causa aquecimento no solo, causando uma massa de
ar turbulenta que transporta os esporos para toda a lavoura. Quando a temperatura
for favorável, entre 5 e 10 °C, e alta umidade, ocorre a germinação dos ascósporos
(CLARKSON et al, 2003). Dessa forma, salienta-se que a doença ocorre em virtude
de excesso de chuvas aliadas com temperaturas amenas, abaixo de 20 °C
(AGRIOS, 1997; LEITE, 2005). O vento pode transportar os esporos a uma distância
de 50 a 100 m, infectando as plantas que estão dentro deste raio (STEADMAN,
1983).
Em condições de alta umidade, com duração de 16 e 24 horas já pode
ocorrer a colonização de tecidos sadios, após os tecidos florais já estarem
infectados, pois o micélio se desenvolve sobre um substrato formado por tecidos
mortos ou senescentes, e a temperatura ideal para isso situa-se entre 5 a 10 °C.
Todavia, se o clima estiver seco, o desenvolvimento da doença pode ser paralisado,
retornando somente quando voltar as condições umidade relativa acima de 70%
(HARIKRISHNAN; DEL RIO, 2006).
Os sintomas da doença em soja, geralmente, ocorrem no terço médio
inferior das plantas, presentes na haste principal, em folhas e vagens, causando
encharcamento, de coloração parda e consistência mole, com a produção de micélio
branco cotonoso e escleródios, que são as estruturas de repouso do fungo (LEITE,
2005; EMBRAPA, 2005). Do estádio da floração plena (R2) até iniciar a formação
das vagens (R3/R4) é o período de maior suscetibilidade da cultura ao
desenvolvimento da doença. O fungo é capaz de infectar qualquer parte a planta,
entretanto, a maior frequência das infecções ocorrem nas inflorescências e nas
axilas das folhas e ramos laterais, principalmente porque nesses locais tem pétalas
e restos de folhas senescentes (KIMATI et al, 2005).
Além das características de desenvolvimento da doença, outras
peculiaridades devem ser consideradas. Inicialmente, a disseminação do fungo S.
sclerotiorum teria sido considerada somente pelos escleródios. Mas, muitos
trabalhos já comprovaram que escleródios junto às sementes, ou as mesmas,
quando internamente infectadas pelo fungo, podem disseminá-lo a longas
distâncias, em áreas livres da doença (STEADMAM, 1983; VENTUROSO et al.,
2014), sendo consideradas uma fonte de inóculo. A disseminação de S. sclerotiorum
20
pela semente já foi comprovada desde 1998, através de micélio dormente (YANG,
WORKENEH e LUNDEEN, 1998).
A sanidade das sementes é cada vez mais importante para garantir a
qualidade de uma lavoura, uma vez que a presença de patógenos em seu interior na
forma de micélio dormente, pode refletir em efeitos diretos, como redução da
germinação, do vigor, de estande, do período de armazenamento e até do
rendimento (ITO; TANAKA, 1993; MACHADO, 2000). Portanto, a detecção do
patógeno S. sclerotiorum em sementes de soja é importante para o manejo desta
doença, de modo a evitar a disseminação do patógeno para áreas livres da doença
(BRUSTOLIN et al, 2012).
Dessa forma, cada vez mais torna-se importante que a semente seja
de boa qualidade sanitária, e vários métodos podem ser utilizados para detecção
deste patógeno, que podem variar na praticidade, economia e agilidade de
resultados (HENNING, 2005), contribuindo para diminuir a disseminação deste
patógeno para novas áreas (JACCOUD-FILHO et al., 2010).
Com toda a importância da cultura da soja, nos quesitos produtividade,
área cultivada e preço, torna-se necessária a busca por alternativas que
complementem um manejo integrado e proporcionem um melhor controle do mofo
branco.
Algumas formas de manejo têm sido utilizadas com bons resultados,
como rotação de culturas, cobertura morta do solo e aplicações de fungicidas. Como
não existem variedades resistentes a essa doença, alguns métodos de controle vêm
sendo estudados para auxiliar no manejo do mofo branco. A cobertura vegetal do
solo com braquiária, por exemplo, pode causar atraso na formação de apotécios, por
impedir a entrada de luz até os escleródios, formando um ambiente desfavorável à
sua germinação (VENTUROSO et al., 2013). Alguns testes com controle químico
também foram realizados (Meyer et al., 2011).Vários princípios ativos de fungicidas
foram testados e comparados para o controle do mofo branco. O resultado mostrou
redução da incidência de mofo branco e da produção de escleródios em relação à
testemunha.
Existe dificuldade para os fungicidas atingirem uma cobertura uniforme
da planta e nem sempre conseguem atingir o sítio de infecção, que se localiza
principalmente, no terço médio, onde o maior número de lesões ocorre, e muitas
vezes, quando são aplicados já houve a deposição dos ascósporos nesses locais
21
(MUELLER et al., 2004). Contudo, os trabalhos mostram que existe alguma
eficiência na utilização desses produtos, principalmente por proporcionar a redução
do inóculo para os cultivos subsequentes.
Outros estudos foram realizados com herbicidas visando a indução de
resistência das plantas ao mofo branco, como o de Dann, Diers e Hammerschmidt
(1999) que verificaram menor intensidade de S. sclerotiorum em parcelas de soja
que receberam pequenas doses de lactofen em relação à testemunha tratada
somente com água. Outros autores também encontraram efeitos de inibição de
crescimento micelial de isolados de S. sclerotiorum, usando clorimuron-etílico, e
diminuição da severidade de mofo branco em parcelas de soja utilizando herbicida
bentazon (GARCIA, JULIATTI, e BARBOSA, 2013; ARRUDA, 2014).
Os adubos foliares a base de fosfitos também vês ganhando
importância em estudos voltados à indução de resistência, Estudos realizados por
Arruda (2014) mostraram que eles tem potencial de controle do mofo branco por
induzirem respostas de defesa em soja.
Dessa forma, segundo as experiências descritas acima, é importante
ressaltar que qualquer medida de manejo, ou a associação delas, que vise reduzir o
inóculo no solo, retarde a germinação de escleródios, ou seja, que proporcione
redução da doença, é válida. Nesse sentido, um fator importante é que alguns
produtos têm a capacidade de ativar mecanismos de defesa das plantas contra
patógenos, podendo ser eles bióticos ou abióticos, como os adubos foliares a base
de fosfito de potássio.
2.2.1 Detecção de Sclerotinia sclerotiorum em sementes de soja
Sua disseminação a longas distâncias ocorre através de escleródios
entre as sementes e micélio dormente no interior das sementes (ITO; PARISI, 2010).
Para auxiliar no controle de qualidade das sementes Neergard (1977)
recomenda que vários testes de sanidade sejam realizados, pois cada um tem suas
peculiaridades na detecção do fungo e dessa forma, a confiabilidade nos resultados
seria maior. Vários métodos podem ser utilizados para detecção deste patógeno nas
sementes, que podem variar na praticidade, economia menor tempo de obtenção
dos resultados (HENNING, 2005).
22
O método que utiliza Rolo de Papel avalia 400 sementes (BRASIL,
2009), desinfestadas em hipoclorito de sódio a 1%, e as sementes permanecem em
câmara de incubação por 14 dias a 15 a 20 °C no escuro. Após, são avaliadas
sementes com micélio de S. sclerotiorum. Nesse teste pode haver superestimação
de incidência do fungo uma vez que micélios de sementes contaminadas podem
atingir sementes sadias.
O Blotter Test também está descrito no Manual de Análise Sanitária de
Sementes (BRASIL, 2009). São analisadas 400 sementes incubadas em caixas
gerbóx, incubadas por 14 dias em temperatura de 10 a 15 °C. As sementes são
analisadas individualmente com auxílio de lupas. As análises podem ser
prejudicadas pois, alguns fungos saprófitas que tem crescimento rápido, acabam
crescendo mais rapidamente do que S. sclerotiorum, prejudicando a detecção.
O método Neon-S modificado consiste no preparo do meio de cultura
batata+sacarose+ágar, com adição de 50 mg de azul de bromofenol, 50 mg de
cloranfenicol, 50 mg de 2,4-D. As sementes são depositadas e incubadas por sete
dias a 20 °C no escuro. Halos amarelos se formarão ao redor das sementes devido
à presença do fungo (NAPOLEÃO et al., 2006). As sementes contaminadas são
quantificadas em porcentagem de incidência.
Apesar de alguns trabalhos de quantificação de S. sclerotiorum em
sementes terem mostrado a presença deste patógeno como micélio dormente, ainda
são poucos realizados visando a possibilidade de transmissão deste patógeno via
semente. Por exemplo, Yang, Workeneh e Lundeen (1998), ao realizarem um estudo
para avaliar a formação de escleródios no solo, a partir de sementes infectadas,
concluíram que sementes infectadas internamente podem disseminar esclerotinia
para novas áreas, pois quando semeadas no solo, formam-se os escleródios.
Em outro estudo, Hartman, Kull e Huang (1998) fizeram um
levantamento da ocorrência de S. sclerotiorum em campos de soja, em Illinois,
quantificaram sua distribuição em lavouras e quantificaram o número de escleródios
e sementes infectadas, oriundas dessas áreas. Concluíram que sementes de soja,
vindas de lotes oriundos de campos contaminados pelo patógeno, estão
contaminadas pelo fungo internamente. Observaram que as sementes produziram
escleródios após sete dias de incubação. HOFFMAN et al. (1998) realizaram
trabalhos semelhantes mostrando a relação entre a incidência da doença nas
plantas, no campo, com a qualidade das sementes oriundas dessas plantas.
23
Constataram que quando aumentou a incidência da doença no campo, aumentou o
número de escleródios produzidos a partir das sementes no teste de germinação.
Venturoso et al. (2014), estudaram inoculações artificiais de sementes
de canola, cártamo, crambe, girassol e nabo forrageiro para avaliar sua
transmissibilidade ou influência na emergência das plântulas. Constataram que S.
sclerotiorum pode ser transmitido para as plântulas quando presente nas sementes,
sendo essas importantes fontes de inóculo.
Para avaliar a transmissão a partir de sementes nem sempre é fácil,
pois depende de fatores como a incidência, cuidados na hora da amostragem das
sementes, condições de armazenamento. Um exemplo desta dificuldade é retratado
numa avaliação de um lote contendo 10.400 sementes, realizada por Henning et al.
(2009) onde constataram a presença de oito sementes com S. sclerotiorum, sendo
uma incidência de 0,07%. Quando são realizadas análises de rotina, em laboratórios
de sementes, com 400 sementes, pode ocorrer uma subestimação da incidência
desse fungo nas sementes ou, pode nem ser detectado.
2.3 ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA INDUÇÃO DA RESISTÊNCIA DE PLANTAS A PATÓGENOS
As plantas podem ser resistentes a doenças causadas por
microrganismos presentes no ambiente, apesar de não possuírem sistema
imunológico (TAIZ; ZEIGER, 2004).
As interações que ocorrem entre hospedeiro-patógeno podem ser
entendidas como uma batalha entre eles, pela sobrevivência. Nesse confronto, de
um lado o patógeno utilizando seu arsenal enzimático como arma química para
atacar o hospedeiro em potencial, enquanto que este último, defendendo-se com
estruturas pré-existentes ou com respostas bioquímicas de defesa (PASCHOLATI,
STANGARLIN e SCHWAN-ESTRADA, 1998).
Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram múltiplos
mecanismos de defesa contra patógenos (TAIZ; ZEIGER, 2004). O sistema de
defesa das plantas é representado por estruturas como as ceras e cutículas, os
pêlos ou tricomas, adaptações em estômatos e fibras vasculares, e também as
substâncias químicas que são componentes das plantas, como os fenóis, alcaloides,
24
lactonas insaturadas, glicosídios fenólicos, inibidores protéicos e enzimas hidrolíticas
(PASCHOLATI; LEITE, 1995; SHEWRY; LUCAS, 1997; AGRIOS, 2005). Por outro
lado, também existem mecanismos de defesa que somente são desencadeados
quando a planta detecta o ataque do patógeno agressor, envolvendo a formação de
papilas, halos, lignificação, camada de cortiça, deposição de goma, além de
compostos como fitoalexinas, proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) e
espécies reativas de oxigênio (PASCHOLATI; LEITE, 1995; AGRIOS, 2005).
O termo indução de resistência pode designar uma proteção local,
apenas nos tecidos onde se aplicou o indutor ou, ainda, uma resistência sistêmica
que se manifesta em outros pontos mais distantes à aplicação do agente indutor
como uma reação de hipersensibilidade (MORAES, 1992). Nestes casos, além da
resposta hipersensitiva, que se caracteriza pelo rápido e localizado colapso do
tecido vegetal em volta do local da infecção, e síntese dos compostos já descritos,
há a indução de enzimas como as β-1,3-glucanase, quitinase e peroxidase e, ainda,
o desencadeamento da resistência sistêmica adquirida (RSA), que se caracteriza
pela indução da resistência em locais da planta distantes do local da infecção pelo
patógeno (ROMEIRO, 2000). A planta apresenta resistência durante semanas
mantendo a proteção contra certos patógenos (MORAES, 1992). Tais eventos e
reações podem determinar o sucesso da resistência da planta contra o ataque do
fitopatógeno, evitando, assim, o estabelecimento da doença (STINTZI et al., 1993).
A RSA está associada com acúmulo de proteínas (PRPs), induzidas na
planta como mecanismo de defesa, e é dependente de silicato, sendo que a planta
que recebeu indução pode apresentar alguns sintomas visuais, como necroses. Os
fatores que podem proporcionar esse tipo de resistência são eliciadores químicos ou
biológicos (MÉTRAUX, 2001). Todavia, para a resistência sistêmica induzida (RSI),
as PRPs não se acumulam e não se observam alterações visuais na planta, sendo
que a sinalização é mediada por jasmonatos e etileno e o eliciador, geralmente, é
um agente não-patogênico.
As fitoalexinas são alguns dos produtos do metabolismo secundário
que podem ser produzidos em resposta à invasão microbiana, considerados um dos
mecanismos de defesa das plantas, podendo reduzir ou evitar a atividade dos
patógenos (BAILEY, 1982; BRAGA, 2008). Em várias famílias de plantas já foram
descobertas mais de 300 fitoalexinas, que podem atuar sobre o patógeno
prejudicando a elongação do tubo germinativo e reduzindo o crescimento micelial
25
(LOPES, 1993; LABANCA, 2002). A soja possui a fitoalexina gliceolina, que é um
flavonóide (pterocarpanóide), de importância na interação planta-patógeno (BRAGA,
2008).
A levedura Saccharomyces cerevisae é muito utilizada como controle
comparativo em trabalhos onde são avaliadas atividades de fitoalexinas. A parede
celular desta levedura é composta por proteínas e polissacarídeos como quitina,
manoproteínas, β-1,3 glucanos, β-1,6 glucanos, e que em mínimas concentrações,
são capazes de ativar o sistema de defesa nas plantas, sendo que em soja,
desencadeiam a produção da fitoalexina gliceolina (CHEONG et al., 1991; LIPKE;
OVALLE, 1998).
Várias substâncias podem ser utilizadas como eliciadores de
fitoalexinas, como os fertilizantes a base de fosfito, que já apresentaram propriedade
de estimular a ação indutora destas substâncias para autodefesa da planta contra o
ataque de fungos (DERCKS; CREASY, 1989), além disso, possuem efeito fungicida
a alguns fitopatógenos, atuando diretamente sobre o mesmo (FENN; COFFEY,
1984).
Outro exemplo de compostos de defesa das plantas são as
peroxidases. São enzimas que fazem parte da composição das plantas, localizadas
no apoplasto e que estão envolvidas na proteção das células, reduzindo o peróxido
de hidrogênio (H2O2) a água (H2O) (TAIZ; ZEIGER, 2004). Várias reações são
catalisadas por estas enzimas, e associadas com a catalase e superóxido
dismutase, atuam na detoxificação das células acometidas por espécies reativas de
oxigênio, e ainda participam da biossíntese do etileno (PEIXOTO et al., 1999;
LABANCA, 2002) e estão envolvidas no processo de lignificação da parede celular
(CAVALCANTI et al, 2007). Sua atividade aumenta para conferir resistência às
doenças, formando lignina e auxiliando no metabolismo da parede celular (SIEGEL,
1993; VAN LOON; VAN STRIEN, 1999).
A enzima fenilalanina amonia-liase (FAL) também está relacionada com
o sistema de defesa das plantas contra fitopatógenos. Ela atua no passo inicial da
rota dos fenilpropanóides, transformando a fenilalanina em ácido trâns-cinâmico, que
é precursor de vários compostos, como fitoalexinas e lignina (NAKAZAWA et al.,
2001). Diversos fatores de estresse proporcionam aumento da atividade desta
enzima, como fatores ambientais e infecção por patógenos (NACZK; SHAHIDI,
2004).
26
2.4 USO DE FOSFITOS COMO INDUTORES DE RESISTÊNCIA
Os ativadores químicos de defesas de plantas, que também são
nomeados como indutores de SAR/ISR, começam, inclusive, a se constituírem uma
nova classe de defensivos, por terem um modo de atuação diferenciado dos
pesticidas, sendo que não exibem efeito direto sobre patógenos mas, estão
relacionados com a ativação de mecanismos de defesa das plantas tornando-as
mais resistentes (STICHER, MAUCH e METRAUX, 1997).
Os fosfitos (HPO32-) são sintetizados a partir do ácido fosforoso (H3PO3)
e descritos como não tóxicos às plantas, com boa translocação e podendo ser
absorvidos pelas folhas (GUEST; GRANT, 1991). São utilizados como fertilizantes
por possuírem alta solubilidade em água e solventes orgânicos, com 7% a mais de
fósforo (P) por molécula do que o fosfato, desta forma, são mais absorvidos pelas
raízes e folhas do que os fosfatos (RIBEIRO JUNIOR, 2006; BLUM 2008; BLUM;
DIANESE, 2010).
A primeira vez que as propriedades antifúngicas destes produtos foi
avaliada, ocorreu no ano de 1970, com a utilização do fosetil alumínio (Aliette®), da
Bayer CropScience, para o controle da requeima da batata [Phythophthora infestans
- (Mont.) de Bary]. Este produto inibiu o crescimento micelial, a esporulação e a
germinação de esporos deste patógeno (COHEN; COFFEY, 1986).
No fosetil alumínio estão presentes íons fosfonatos ligados ao alumínio,
e através de hidrólise, estes íons liberam fosfitos para a planta, sendo responsáveis
pela ação fungicida. Com o passar dos anos o tempo de patente do fosetil aluminio
acabou e muitas empresas passaram a formular produtos a base de fosfito, com
adição de sais de potássio, cálcio, zinco e cobre, e quando aplicados nas plantas,
liberam ânions fosfito, com potencial de controle de doenças (FENN; COFFEY, 1985;
ARAUJO et al., 2008; CARMONA; SAUTUA, 2011).
Os fosfitos têm a capacidade de ativar o metabolismo secundário das
plantas produzindo substâncias de autodefesa, como as fitoalexinas, protegendo-as
do ataque de patógenos (DERCKS & CREASY, 1989). Os mecanismos de ação que
podem estar associados ao controle de doenças com ação direta sobre o patógeno,
acelerando ou retardando seu desenvolvimento, indução de resistência com a
ativação do metabolismo secundário da planta e maior produção de lignina da
27
parede celular, o que dificulta a entrada do patógeno na planta (JACKSON et al,
2000; NOJOSA, 2003; RIBEIRO JUNIOR et al, 2006).
Além do mais, quando os fosfitos têm na sua composição o elemento
potássio (K), esse confere aumento de resistência estrutural da planta, impedindo ou
dificultando a penetração de patógenos, e, ainda, contribuindo para melhor utilização
da água e da taxa fotossintética (HOMHELD, 2005).
O fósforo, presente nos fosfitos, é fonte energética para a planta, na
forma de adenosina tri-fosfato (ATP). Plantas com deficiência deste nutriente têm a
taxa fotossintética mais baixa e, dessa maneira, ficam impedidas de expressar todo
seu potencial produtivo, sendo mais suscetíveis ao ataque de patógenos
(MARSCHNER, 1995).
Vários trabalhos foram realizados para estudar o controle de doenças
de soja com o uso de fosfitos (MENEGHETTI, 2009; SILVA et al., 2011) mas, não
para o controle de mofo branco. Mais recentemente, Pattis, em 2010, utilizou o
herbicida bentazon e o adubo foliar fosfito de potássio, em soja para manejo do mofo
branco e constatou a redução da severidade de mofo branco, sendo mais eficazes
que o fungicida fluazinam, de 69, 82 e 34 %, respectivamente. Arruda, no ano de
2014, também obteve redução de severidade de mofo branco utilizando os
herbicidas lactofen e bentazon, e um fosfito de potássio de 52, 60 e 54 %,
respectivamente.
2.5 EFEITO DE FERTILIZANTES FOLIARES NA QUALIDADE FÍSICA E FISIOLÓGICA DE SEMENTES
A adequada utilização de adubos corretivos e fertilizantes é um dos
mais importantes fatores para a produção de sementes de soja sadias e vigorosas, o
que refletirá em plântulas de melhor qualidade (GUERRA et al., 2006). A aplicação
de nutrientes, via foliar, não é uma técnica nova, e existem no mercado inúmeras
formulações à disposição (BORKET, SFREDO e MISSIO, 1987).
Esses produtos são comercializados como sais obtidos de reações de
potássio, cálcio, sódio e amônio com ácido fosforoso (H3PO3). Essas formulações
são recomendadas como fungicidas ou suplementos de fósforo, indicadas para
28
diversas culturas (MCDONALD, GRANT e PLAXTON, 2001, SCHRÖETTER et al.,
2006; MOOR et al., 2009).
Hajar et al. (2014), avaliaram o efeito de diferentes formulações de
fosfitos de potássio na produtividade do trigo, sendo que dos sete fosfitos utilizados,
três aumentaram a produtividade do trigo em 40,6, 36,1 e 33,2 %. Entretanto, Neves
e Blum (2014), estudando a influência da aplicação de fungicidas isolados ou em
associação com fosfito de potássio no controle da ferrugem asiática em soja, não
encontraram incremento na produtividade e massa de 1000 grãos quando foi
utilizado somente fosfito, em relação à testemunha.
Na literatura atual, também são escassos os estudos sobre ação dos
fosfitos na qualidade das sementes, principalmente de soja. Sendo assim, é
importante a busca por outros resultados neste quesito, já que a qualidade das
sementes é primordial para o arranque inicial do desenvolvimento de plantas
vigorosas e produtivas.
29
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 TESTES IN VITRO
3.1.1 Isolamento de Sclerotinia sclerotiorum de soja
Os isolados do fungo S. sclerotiorum foram obtidos a partir de
escleródios coletados em lavoura, no município de Coronel Domingos Soares, PR,
latitude: 26°18’00’’S e longitude 51°59’21’’ O, a 1110 m acima do nível do mar.
O clima local é do tipo Cfb (classificação de Köppen), temperado
propriamente dito, com temperatura média no mês mais frio abaixo de 18 °C
(mesotérmico), com verões frescos e temperatura média no mês mais quente abaixo
de 22 °C, sem estação seca definida (IAPAR, 2013). O tipo de solo é classificado
como Neossolo Litólico (EMBRAPA, 2006).
Os escleródios foram desinfestados com etanol a 70% por 30
segundos e, posteriormente, em hipoclorito de sódio a 2 % por 1 minuto. Após, os
escleródios foram enxaguados por três vezes com água destilada esterilizada e
deixados sobre papel filtro seco e esterilizado, para retirar o excesso de água. Todo
esse processo foi realizado em câmara asséptica. Em seguida, foram colocados em
placas de petri contendo meio de cultura batata-sacarose-ágar (BSA-140 g de batata
+ 10 g de sacarose + 14 g de ágar) e acondicionados em câmara de crescimento a
24 °C com 12 horas de fotoperíodo por 7 dias. Após, os respectivos isolados foram
repicados e armazenados.
3.1.2 Avaliação de diferentes fosfitos de potássio sobre inibição micelial de Sclerotinia sclerotiorum
Para o preparo das soluções utilizadas nos testes in vitro, as diferentes
formulações de fosfitos seguiram a dosagem recomendada pelos diferentes
fabricantes (dissolvidas em um volume de calda de 150 L/ha), todavia, para o teste
de inibição micelial foi preparado 150 mL de solução.
Desta forma, seguem as recomendações dos fabricantes: Fosfito A
(P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha); Fosfito B (P2O5-40%; K2O-28% - 1 L/ha); Fosfito C
30
(P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha), Fosfito D (P2O5-30%; K2O-20% - 2,4 L/ha). Cada
dosagem foi ajustada para o volume de calda (BSA) de 150 mL (Fosfito A, B e C: 1
mL/L; Fosfito D: 2,4 mL/L) os quais foram misturados ao meio de cultivo BSA
fundente, homogeneizados vertidos em placas de petri de 10 cm de diâmetro.
Quando o meio de cultura solidificou, discos de BSA, de 0,5 cm de
diâmetro, contendo o micélio de S. sclerotiorum, previamente crescido por sete dias
em BSA, foi colocado no centro de cada placa, compondo os respectivos
tratamentos. Como controle repicou-se o fungo em placas contendo somente o meio
de cultivo BSA. Em seguida as placas foram armazenadas em câmara de
crescimento a 24 °C com 12 horas de fotoperíodo por 13 dias. A avaliação do
diâmetro da colônia fúngica foi realizada quando o micélio de uma placa de petri, de
dez cm de diâmetro, no tratamento testemunha, atingiu a borda.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco
tratamentos e sete repetições por tratamento. Este estudo foi repetido duas vezes.
3.1.3 Avaliação da massa micelial seca de Sclerotinia sclerotiorum
Este teste foi realizado com os mesmos tratamentos descritos no item
3.1.2., porém com quatro repetições.
Após sete dias de incubação, cada placa de petri foi imersa em um
bécker com água e aquecido em forno micro-ondas por cinco minutos. Após
completa liquefação do meio de cultura, o líquido foi separado do micélio utilizando
um filtro. Em seguida, a massa micelial do fungo foi transferida separadamente, para
cadinhos de alumínio, de 25 mL, e colocados em estufa a 35 °C até massa
constante.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco
tratamentos.
3.1.4 Avaliação de fosfitos de potássio sobre a germinação de escleródios deSclerotinia sclerotiorum
31
Para a montagem deste teste foram utilizados os mesmos tratamentos
do ensaio descrito no item 3.1.2. A esterilização superficial dos escleródios do fungo
foi a mesma, conforme descrito no item 3.1.1.
Para cada tratamento foram utilizados 25 escleródios, com sete dias de
idade, os quais permaneceram imersos nos respectivos tratamentos, por cinco
segundos. No tratamento testemunha os escleródios permaneceram imersos
somente em água. Em seguida, foram transferidos cinco escleródios em cada placa
de petri contendo meio de cultura BSA. Em seguida as placas foram armazenadas
em câmara de crescimento a 24 °C com 12 horas de fotoperíodo. Após sete dias de
incubação foi avaliada a germinação dos escleródios. O experimento foi repetido
duas vezes.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco
repetições.
3.2 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE COMPOSTOS DE DEFESA INDUZIDOS NAS PLANTAS PELOS FOSFITOS DE POTÁSSIO
3.2.1 Síntese de fitoalexinas
Para realização deste teste foi utilizada a cultivar de soja BMX Ativa. A
semeadura da soja foi realizada em copos de plástico, de volume 200 mL, contendo
substrato comercial Plantmax®. Cada copo recebeu duas sementes de soja e
permaneceram por 15 dias em casa de vegetação com temperatura média de 24 °C,
recebendo irrigação manual. Após esse período os cotilédones foram destacados,
sendo então selecionados somente aqueles mais uniformes, sem danos visuais.
Após, estes foram transferidos para um bécker de 250 mL de capacidade contendo
uma solução de hipoclorito de sódio a 0,23% de cloro ativo, por 10 minutos. Em
seguida, os cotilédones foram lavados três vezes em água destilada esterilizada até
total retirada do odor de hipoclorito e transferidos para uma bandeja forrada com
papel toalha esterilizado para remoção do excesso de água. Todo o processo foi
realizado em câmara de fluxo laminar.
Em cada cotilédone foi demarcada uma área de aproximadamente 10
mm de diâmetro com 5 mm de espessura e raspada com uma lâmina de barbear
32
esterilizada, tipo gilete, (FIGURA 01-A, B e C). Em seguida, sobre as lesões
demarcadas de cada cotilédone foi depositada separadamente uma alíquota de 50
µL de cada tratamento: água destilada esterilizada (controle negativo), Fosfito A,
Fosfito B, Fosfito C, Fosfito D, respeitando-se as concentrações recomendadas
pelos fabricantes e solução de leveduras (controle positivo). Para o preparo da
suspensão de leveduras foi utilizada a marca comercial Saf-Instant® na
concentração de 1 g em 100 mL de água destilada a qual foi esterilizada em
autoclave a 120 °C, 1 atm, por 20 minutos. Após o resfriamento, o extrato foi
centrifugado, e o sobrenadante utilizado para determinação do conteúdo de
carboidratos totais através da metodologia descrita por Dubois et al. (1956). Uma
alíquota de 10,19 µg de equivalente de glucose foi depositada em cada cotilédone.
Os cotilédones (5 cotilédones por placa representando uma unidade
experimental) foram distribuídos em placas de petri de 10 cm de diâmetro,
esterilizadas, sobre dupla camada de papel filtro, umedecido com 5 mL de água
destilada esterilizada.
Figura 01 – A e B) Furador de rolhas utilizado para demarcação da área a ser raspada noscotilédones de soja; C) Cotilédones de soja com a área seccionada raspada; D) Agitadorcom os erlenmayers contendo os cotilédones em agitação para extração da gliceolina; E)Filtragem para separar os cotilédones da solução de extração F) Espectrofotômetro.UTFPR, Pato Branco, 2013.
Após, as placas compondo cada unidade experimental foram
colocadas em câmara de crescimento, por 20 horas a 26 °C, no escuro. Após este
33
período, os cotilédones que mantiveram as gotas com os respectivos tratamentos,
foram colocados em um erlenmeyer, e em seguida adicionou-se 1 mL de água
destilada esterilizada para cada cotilédone. Os recipientes com os cotilédones foram
mantidos sob agitação por 1 hora. Posteriormente, efetuou-se a filtragem em papel
de filtro Whatman n° 41 (FIGURA 01-D, E e F), e o filtrado analisado para produção
de gliceolinas, em espectrofotômetro (Shimadzu UV-1800) em comprimento de onda
de 285 nm (AYRES et al., 1976; ZIEGLER; PONTZEN, 1982).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco
repetições por tratamento.
3.2.2 Avaliação da síntese de compostos induzidos pelos fosfitos de potássio
Neste ensaio foi utilizada a cultivar de soja BMX Ativa. A semeadura da
soja foi realizada em copos de plástico, 200 mL de volume, contendo substrato
comercial autoclavado, da marca Plantmax®. Cada copo recebeu duas sementes de
soja, compondo a unidade experimental, permanecendo em câmara de crescimento
com temperatura de 24 °C (±2), com fotoperíodo de 12 horas (FIGURA 02-A).
Quando a soja estava no estádio vegetativo V2, as plantas receberam a
pulverização dos respectivos tratamentos: T1 (testemunha - somente com água); T2
(plantas apenas inoculadas com S. sclerotiorum); T3 (Fosfito A); T4 (Fosfito B); T5
(Fosfito C); T6 (Fosfito D) e T7 (fungicida fluazinam (500 g/L i.a) 1,5 L/ha). As doses
dos respectivos tratamentos seguiram as recomendações dos fabricantes. Para
cada tratamento foram utilizadas três repetições. Uma semana após a aplicação dos
tratamentos, um disco de 6 mm de diâmetro de meio de cultura contendo o patógeno
foi depositado na superfície adaxial do primeiro trifólio das plantas, fixando-os com
fita adesiva. (FIGURA 02-B). As plantas foram mantidas em câmara de crescimento
a 22 °C (±2 °C), com fotoperíodo de 12 horas e 80% de umidade relativa, por 96
horas. A primeira coleta de plantas para realização das análises bioquímicas ocorreu
no momento da inoculação, sendo denominada, tempo zero. As demais ocorreram
24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação. As plantas inteiras, exceto a rais, foram
cortadas imediatamente acima do solo, embaladas em papel alumínio e
acondicionadas em nitrogênio líquido (-196 °C) (FIGURA 02-C). Posteriormente, o
material vegetal foi armazenado em congelador a -45 °C até o momento das
34
análises bioquímicas. O experimento foi repetido duas vezes, sendo nomeado como
Experimento 1 e Experimento 2.
Para estas análises aplicou-se o delineamento inteiramente
casualizado com cinco repetições, em esquema fatorial 5 x 7 (tempos de coleta x
tratamentos).
Figura 02 – A) Crescimento das plântulas de soja em copos plásticos; B) Inoculação de discos demicélio de Sclerotinia sclerotiorum na superfície adaxial das folhas de soja; C) Coleta deplântulas de soja e armazenamento em papel alumínio. UTFPR, Pato Branco, 2014.
3.2.3 Obtenção de extratos proteicos
Para análise de proteínas cerca de 350 mg de material vegetal de
plântulas de soja, sem raiz, foram colocados em almofariz previamente resfriado a
4 °C, contendo 2 mL de tampão fosfato de potássio 0,2 M e pH 7,5 e macerados
com pistilo até a obtenção de um extrato líquido (FIGURA 03). Em seguida o extrato
foi centrifugado por 10 minutos a 5000 rpm a 4 °C e os sobrenadantes foram
utilizados para os ensaios de proteínas solúveis totais e peroxidases.
Figura 03 – A) Alíquota de material vegetal (plântulas sem raiz) de soja para maceração; B)Maceração de material vegetal de soja, em tampão de extração; C) Acondicionamento doextrato bruto de material vegetal de soja em tubos eppendorfs. UTFPR, Pato Branco,2014.
35
As proteínas totais foram quantificadas pelo método descrito por
Bradford (1976). Para obtenção da curva padrão foi utilizado soro de albumina
bovino e as leituras efetuadas em espectrofotômetro (Shimadzu UV-1800) a 595 nm.
3.2.3.1 Peroxidase (POX, EC 1.11.1.7)
A atividade da POX foi quantificada pelo método de Kar e Mishra
(1976), adicionando-se o extrato enzimático e o tampão de reação à cubeta, e as
leituras realizadas através do aumento da absorbância (420 nm), com leituras a
cada 20 segundos/minuto.
3.2.4 Fenilalanina amônia liase (FAL, EC 4.3.1.5)
Para análise da FAL foi utilizada metodologia de Hyodo, Kuroda e Yang
(1978). Para isso, foi pesado 0,5 g de material vegetal (plantas inteiras) de cada
tratamento. Em seguida, as amostras foram maceradas em cadinho com 3 mL de
tampão de extração (22,2 g de Tris, 0,37 g de EDTA, 85,5 g de sacarose, 10 g de
PVP, e o volume completado para 1 L; pH ajustado para 8 com ácido clorídrico 2,0
N). Após, o macerado de material vegetal foi centrifugado a 6000 g por 10 minutos a
4 °C, e o sobrenadante utilizado para análise enzimática.
Alíquotas de 400 µL de sobrenadante foram adicionadas a 800 µL do
tampão de extração em tubos de ensaio, os quais receberam 800 µL de fenilalanina
6 µM. Esta solução, após homogeneizada, foi incubada em banho a 40 °C por 1
hora. Após este período, a atividade enzimática foi paralisada colocando-se as
amostras no gelo. A atividade da PAL foi determinada pela quantificação do ácido
trâns-cinâmico, por meio de espectrofotometria a 290 nm. Uma unidade de atividade
representa a quantidade de enzima que converte 1 µM de fenilalanina em ácido
cinâmico em 1 hora a 40 °C. A atividade específica foi expressa em unidade de
absorbância/mg de proteína.
36
3.3 EXPERIMENTO DE CAMPO
3.3.1 Avaliação de diferentes fosfitos de potássio sobre o mofo branco em condiçõesde campo
Para a montagem desse experimento foram utilizados os mesmos
fosfitos de potássio A, B, C e D, descritos no ítem 3.1.2.
O ensaio foi conduzido no município de Coronel Domingos Soares, PR,
latitude: 26°18’00’’ S e longitude 51° 59’21’’ O, a 1110 m acima do nível do mar. O
clima local é do tipo Cfb (classificação de Köppen), temperado propriamente dito,
com temperatura média no mês mais frio abaixo de 18 °C (mesotérmico), com
verões frescos e temperatura média no mês mais quente abaixo de 22 °C, sem
estação seca definida (IAPAR, 2013). O tipo de solo é classificado como Neossolo
Litólico (EMBRAPA, 2006).
A semeadura da soja foi realizada no dia 9 de novembro de 2012, com
10,5 sementes por metro e espaçamento de 0,5 metros entre as linhas, pelo
proprietário da fazenda, em sistema de semeadura direta e as culturas antecedentes
foram soja no verão, e aveia no inverno. A cultivar de soja semeada foi a BMX Ativa,
com hábito de crescimento determinado e ciclo superprecoce. Os tratos culturais
seguiram o padrão do proprietário, com aplicações de fungicidas, inseticidas e
herbicidas (Apêndice A).
Os dados meteorológicos coletados durante o período de
desenvolvimento da cultura estão descritos nos Anexos A e B.
A área onde foi instalado o experimento tem histórico de ocorrência de
mofo branco há dez anos.
As unidades experimentais foram constituídas de parcelas medindo 5
m de comprimento, contendo cinco linhas, totalizando 12,5 m2 (FIGURA 04-A e B).
O delineamento experimental foi em esquema fatorial A x B (5
tratamentos x 4 épocas) com 3 repetições: aplicação foliar com diferentes
formulações de fosfitos – Fosfito A (P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha); Fosfito B (P2O5-
40%; K2O-28% - 1 L/ha); Fosfito C (P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha), Fosfito D (P2O5-
30%; K2O-20% - 2,4 L/ha) e testemunha (com pulverização somente de água). As
aplicações foram realizadas em quatro estádios fenológicos da cultura (V4; V4+R1;
R1 e R2).
37
Para as aplicações dos tratamentos descritos acima, foi utilizado um
pulverizador costal de pressão constante (CO2) e vazão de 150 L/ha.
Figura 04 – A) Demarcação de parcelas de cinco linhas. B) Espaçamento entre parcelas. CoronelDomingos Soares, safra 2012/13.
A avaliação da incidência de mofo branco foi realizada no estádio R4,
devido ao atraso no desenvolvimento do mofo branco, avaliando-se as tres linhas
centrais de cada parcela, desconsiderando as extremidades (1 m). As avaliações da
severidade foram realizadas nos estádios R5.1, R5.5 e o número de plantas mortas
no estádio R7. Para as avaliações da severidade foram coletadas 30 plantas
aleatoriamente (coletadas em zigue zague), das 3 linhas centrais, descartando-se as
extremidades das linhas (1 m). Foi sendo utilizada uma escala de pontos (GRAU;
RADKE, 1982) de acordo com a intensidade da doença: 0 = planta sem sintoma; 1 =
planta com sintoma apenas nos ramos laterais; 2 = planta com sintoma na haste
principal mas sem ocorrência de morte e 3 = planta morta.
Para avaliação da produtividade, realizou-se a colheita manual das três
linhas centrais, com três metros de comprimento, no estádio R8. Após a colheita as
plantas foram trilhadas em um batedor de cereais motorizado, e posteriormente, os
grãos levados ao laboratório para pesagem.
3.3.2 Componentes do rendimento
No laboratório de Sementes da UTFPR - Câmpus Pato Branco-PR, foi
determinado o peso de grãos/parcela. Para isto, as sementes de soja de cada
38
parcela foram pesadas e o teor de água corrigido para 13% e armazenadas em
câmara seca, com temperatura controlada em 15 °C. Os dados foram expressos em
kg/ha. A massa de mil grãos foi avaliada após a umidade das sementes ser
corrigida. Foram utilizadas 8 repetições de 100 sementes, contadas manualmente,
ao acaso. Em seguida, os grãos de cada repetição foram pesados e a massa de
1000 sementes calculada pela fórmula: Peso 1000 sem= (massa da amostra x 1000)
/ n°total de sementes (RAS, 2009). O resultado foi expresso em gramas (g).
Para a contagem do número de vagens, foram arrancadas 10 plantas
aleatoriamente, de cada unidade experimental, antes da colheita, e efetuada a
contagem média do número de vagens por planta e número de sementes por
vagem. Posteriormente realizou-se a média das 10 plantas.
3.3.3 Teste de qualidade física e fisiológica das sementes
As determinações foram feitas nos Laboratórios de Análise de
Sementes e de Fitopatologia da UTFPR - Câmpus Pato Branco-PR. As sementes de
soja utilizadas para os testes foram as mesmas colhidas no ensaio descrito no item
3.3.1, conduzido no município de Coronel Domingos Soares.
Na análise da germinação foi utilizada quatro repetições de 100
sementes, distribuídas sobre duas folhas de papel (Germitest®) e cobertas com uma
terceira, previamente umedecidas com 2,5 vezes a massa do papel em volume de
água. Os rolos contendo as sementes de soja foram colocados em sacos plásticos,
com pequenos orifícios para manter a umidade e oxigenação, e acondicionados em
germinadores a 25 °C por 8 dias, quando foram contadas as plântulas normais,
segundo as Regras de Análise de Sementes (RAS, 2009) (FIGURA 05-A, D e E).
O vigor das sementes foi quantificado pelo teste de envelhecimento
acelerado, realizado com 42 g de sementes de soja distribuídas em camada
uniforme, sobre tela, em caixas de polietileno tipo gerbox, com dimensões de 11 x 11
x 3,5 cm. Depois de fechadas, as caixas foram acondicionadas em câmara de
crescimento, à 41 ºC por 48 horas (KRYZANOWSKI, FRANÇA NETO e HENNING,
1991) (FIGURA 05-B). Após este período foi instalado o teste de germinação,
utilizando quatro repetições de 50 sementes, conforme os procedimentos descritos
39
nas RAS (1999) (FIGURA 05-D e E). No quinto dia de incubação, fez-se a contagem
do número de plântulas normais, conforme RAS (2009).
Para análise do comprimento de plântulas foram utilizadas quatro
repetições de 20 sementes, com adaptações dos procedimentos descritos por
Nakagawa (1999). Primeiramente foi traçada uma linha no terço superior do papel
(Germitest®), no sentido longitudinal. Os papéis foram umedecidos com 2,5 vezes a
massa do papel em volume de água. As sementes foram distribuídas sobre a linha
deixando a micrópila voltada para a parte inferior do papel (FIGURA 05-C). Os rolos
contendo as sementes de soja foram colocados em sacos plásticos (FIGURA 05-D e
E) e acondicionados em germinadores a 25 °C por sete dias, quando foram medidos
os comprimentos de parte aérea e comprimento de raiz das plântulas normais
emergidas (raiz primária e hipocótilo) utilizando-se uma folha milimetrada. Os
resultados foram expressos em centímetros (cm).
A massa seca foi determinada após as avaliações de comprimento de
plântulas, removendo-se os cotilédones e, em seguida, acondicionadas em sacos de
papel, identificadas e mantidas em estufa com temperatura de 80 °C por 24 horas
(NAKAGAWA, 1999). A determinação da massa seca (g) foi efetuada em balança
eletrônica de precisão.
Figura 05 – A) Distribuição das sementes de soja no papel Germitest®; B) Acondicionamento desementes de soja em caixas 'gerbóx' para teste de vigor; C) Distribuição das sementesde soja sobre linha traçada no terço superior da folha para análise de comprimento deraiz e parte aérea; D) Rolos contendo as sementes; E) Rolos dentro de sacos plásticos,com pequenos orifícios, para manter umidade e oxigenação, em acondicionamento emcâmara germinadora. UTFPR, Pato Branco, 2013.
40
3.3.4 Teste da qualidade sanitária das sementes
Esse teste foi realizado nos laboratórios de Sementes e Fitopatologia
da UTFPR - Câmpus Pato Branco-PR.
Para a detecção de Sclerotinia sclerotiorum nas sementes de soja foi
utilizado o teste de Neon-S modificado (NAPOLEÃO et al., 2006). Para 1 L de meio
de cultura batata-sacarose-ágar (BSA) foram utilizados 50 mg de azul de
bromofenol, 50 mg de cloranfenicol e 50 mg de ácido livre 2,4-D. Posteriormente, o
meio de cultivo foi autoclavado por 20 minutos a 1 atm (120 °C), e vertido em placas
de petri de 10 cm de diâmetro. Dezesseis sementes foram acondicionadas em cada
placa, totalizando 400 sementes. Em seguida, foram incubadas a 20 °C, no escuro,
por um período de 5 a 8 dias, com observações diárias da formação de halo amarelo
no meio de cultura, embaixo das sementes.
O resultado foi expresso em incidência de Sclerotinia sclerotiorum
presente nas sementes.
3.4 ANÁLISE DOS DADOS
Os dados dos experimentos descritos nos ítens 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4.
3.2.1, 3.2.3.1, 3.2.4, 3.3, 3.3.1, 3.3.2 e 3.3.3, foram submetidos à análise de
variância e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade de erro
utilizando o programa ASSISTAT 7.7 (SILVA; AZEVEDO, 2009).
41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 TESTES IN VITRO
4.1.1 Avaliação da inibição micelial, massa de micélio e germinação de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum em resposta aos fosfitos
Nenhum dos fosfitos testados inibiu crescimento micelial do fungo S.
sclerotiorum (TABELA 01) e a germinação dos escleródios, que foi de 100%, em
ambos os experimentos.
Vários trabalhos já comprovaram a ação dos fosfitos na inibição de
crescimento micelial de outros patógenos, como Colletotrichum lindemuthianum
Sacc. & Magn. (CAIXETA, VIEIRA e CANEDO, 2012), Sclerotium rolfsii Sacc. em
feijoeiro (PACHECO, 2012), Alternaria tomatophila Simmons (CATÃO, 2011),
Rhizopus stolonifer Ehrenb., Botritys cinerea Pers. e Colletotrichum gloesporioides
(Penz.) Sacc. (ROMA, 2013) e produção de conídios de Fusarium oxysporum
Schlecht. f.sp. Phaseoli Kendrick; Snyder (CAIXETA, VIEIRA e CANEDO, 2012). No
entanto, nesse estudo comprovou-se que não houve ação antifúngica, in vitro, dos
fosfitos contra S. sclerotiorum (FIGURA 06).
Tabela 01 – Efeito dos fosfitos de potássio sobre o diâmetro (cm), de colônias de Sclerotiniasclerotiorum após 13 dias de incubação, em meio de cultura BSA (Avaliações dosexperimentos 1 e 2) e massa seca de micélio (MS) em gramas, média dos experimento1 e 2.
Experimento 1 Experimento 2 Média
Tratamentos Diâmetro Diâmetro MS
Testemunha 8,0ns 8,0ns 0,104ab*
Fosfito A 8,0 8,0 0,093ab
Fosfito B 8,0 7,9 0,071bc
Fosfito C 7,4 8,0 0,046c
Fosfito D 7,0 8,0 0,126a
CV% 10,0 10.8 25,1ns Não significativo (p>0,05).*Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste de médias de Tukey ao nivel de 5% de probabilidade de erro.
42
Provavelmente os componentes minerais presentes nos fosfitos,
quando adicionados nos meios de cultivos foram metabolizados pelo fungo para o
crescimento micelial, como o fósforo e potássio, não proporcionando dessa forma,
efeito fungitóxico ou fungistático. No entanto, a eficiência da utilização de nutrientes
oriundos dos fosfitos B e C pelo fungo foi baixa, visto que houve uma redução da
massa micelial (FIGURA 06). A baixa eficiência na utilização dos nutrientes poderá
afetar o desenvolvimento dos escleródios do fungo, pois para que ocorra o
desenvolvimento dessas estruturas é importante que os meios de cultura ofereçam
alguns nutrientes importantes como fósforo e potássio, bem como fontes de carbono
ricas em açúcares e ácidos orgânicos (TERAO et al., 2001; GARCIA, JULIATTI e
CASSEMIRO, 2012).
Figura 06 – Experimento 1 e 2 in vitro, avaliação do efeito dos fosfitos de potássio sobre ocrescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, após sete dias de incubação em câmarade crescimento, com fotoperíodo de 12 horas a 24 °C. UTFPR, Pato Branco, 2014.
4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.2.1 Avaliação da síntese de fitoalexinas, peroxidases e fenilalanina amonia-liase
43
Os cotilédones de soja “BMX Ativa”, tratados com os diferentes fosfitos
não apresentaram aumento da síntese de gliceolinas, em relação ao controle
positivo, com extrato de leveduras (FIGURA 07), além de não terem diferido
significativamente do tratamento testemunha (adição apenas de água). Dessa forma,
os fosfitos não podem ser considerados eliciadores de fitoalexinas em soja, nas
condições deste experimento.
Figura 07 – Valores de absorbância (ABS) da síntese de gliceolina pela cultivar de soja BMX Ativaapós ser submetida aos tratamentos com diferentes fosfitos de potássio. UTFPR, PatoBranco, 2013. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste deTukey ao nível de 5% de probabilidade de erro. UTFPR, Pato Branco, 2013.
Tais resultados estão de acordo com os dados obtidos por Arruda
(2014) que, ao avaliar o potencial eliciador de fosfitos, herbicidas e fungicida, em
soja, “BMX Ativa”, para controle de S. sclerotiorum concluiu que os dois fosfitos
testados (30% P2O5, 20% K2O e 26% P2O5, 19% K2O) não apresentaram efeito como
eliciadores da síntese de gliceolinas em soja.
Possivelmente esse comportamento tenha ocorrido devido às doses
dos fosfitos terem sido altas para ativação da síntese de gliceolinas, uma vez que
indutores eficientes são ativos em doses muito baixas. Outro fator a ser considerado
é o genótipo da planta, que numa interação específica pode influenciar na
quantidade e no tipo de fitoalexinas produzidas, e também, a expressão das
44
mesmas pode não ocorrer, dependendo do indutor utilizado (BRAGA, 2008; DANIEL;
PURKAYASTHA, 1996).
Além disso, pode ser que os componentes fósforo e potássio presentes
nos fosfitos não se ligaram a um receptor específico na membrana plasmática, ou no
interior da célula vegetal e, desta forma, não atuaram na sinalização para produção
de fitoalexinas. Isso é salientado por Labanca (2002) e Bertozzi e Kiessling (2001),
que um eliciador quando liga-se a um receptor específico na membrana plasmática,
desencadeia a produção dos compostos de defesa, apesar de o mesmo eliciador
poder se ligar a mais de um receptor.
Mesmo não ativando a síntese de fitoalexinas, houve um aumento da
atividade da FAL 48 horas após a inoculação (9 dias após a pulverização), nos
tratamentos com os fosfitos C e D, não havendo diferença significativa entre eles,
(Figura 08 - Experimentos 1 e 2). Após esse período a atividade diminuiu, para
esses mesmos produtos, mantendo-se na média dos demais. Este comportamento
foi observado em ambos os experimentos realizados, indicando que tais compostos
têm envolvimento na ativação desta importante enzima.
O aumento da atividade da FAL nos primeiros períodos após
inoculação, corroboram com um estudo realizado em outro patossistema, para
avaliar óleos essenciais de capim-limão (Cymbopogon flexuosus Stapf.), assa-peixe
(Vernonia polyanthes Less.) e fosfito de potássio no controle de antracnose do
feijoeiro, em plantas desafiadas ou não com o fungo Colletotrichum lindemuthianum
Sacc. & Magn., (inoculadas 7 dias após aplicação dos produtos). Foi constatado
aumento na atividade da FAL, em plantas pulverizadas com fosfitos (8 e 10 dias
após pulverização), em relação às plantas pulverizadas com óleos. Todavia, aos 13
dias após a pulverização com fosfito de potássio, a produção de FAL foi menor
comparada às plantas que receberam óleos, indicando que a maior produção no
primeiro momento após a inoculação causou gasto de energia pela planta (SILVA,
2013).
45
Figura 08 – Atividade específica de fenilalanina amônia-liase (FAL) em plantas de soja, cultivar Ativa,tratadas com diferentes fosfitos e inoculadas com Sclerotinia sclerotiorum, em câmara decrescimento. UTFPR, Pato Branco, 2014.
A FAL é uma enzima muito importante no metabolismo secundário.
Participa das primeiras reações enzimáticas de transformação da L-fenilalanina em
ácido trâns-cinâmico, sendo este o primeiro composto a ser produzido na rota dos
fenilpropanóides, que, posteriormente à síntese de ácido salicílico, origina uma
molécula envolvida na sinalização no processo de desenvolvimento da SAR, lignina
e de possíveis fitoalexinas (RITTER; SCHULZ, 2004). Sua maior atividade ocorre
46
entre 24 e 48 horas após a eliciação, mesmo que sua indução seja por fatores como
luminosidade ou ferimentos (SALTVEIT, 2000; CHEN, SHIN e LIU, 2002).
A SAR é uma distinta via de transdução de sinais que pode
desencadear uma resistência duradoura, e é ativada após a inoculação com
patógenos ou através da aplicação de indutores químicos. Ela pode expressar vários
genes e destes, alguns podem estar associados ao metabolismo de compostos
fenólicos (RYALS et al., 1996).
Os incrementos na atividade da FAL são proporcionados, também, por
injúrias nos tecidos, que causam aumento na produção de etileno e,
consequentemente, esse processo influencia na produção de compostos fenólicos,
lignina e fitoalexinas (GEBALLE; GALSTON, 1983).
O aumento da atividade da FAL, nas plantas tratadas com os fosfitos C
e D, no início do processo infeccioso por S. sclerotiorum, sugere que esses produtos
têm potencial de aumentar a atividade dessa enzima.
O sistema de defesa antioxidante em plantas compreende compostos
diversos e principalmente, enzimas, como a superóxido-dismutase (SOD), catalases
(CAT), as peroxidases (POX), entre outras. A função principal deste sistema é a
manutenção de espécies reativas de oxigênio, formadas nos diversos processos
fisiológicos, em níveis baixíssimos, evitando, assim, injúrias causadas pela
superprodução destes radicais livres (SHARMA; DUBEY, 2007). Em condições de
estresse, as plantas tendem a aumentar a produção de ERO's e,
consequentemente, seu sistema de defesa também será induzido, o que é visto com
os resultados obtidos com a POX.
Quando foi avaliada a enzima POX, observaram-se alterações no
primeiro período de avaliação, 24 horas após a inoculação com S. sclerotiorum. A
atividade da POX aumentou nesse período em relação ao tempo zero (momento da
inoculação), para todos os tratamentos (FIGURA 09-Experimentos 1 e 2). Após este
período alguns tratamentos mantiveram ou diminuíram a atividade e outros,
aumentaram, como os fosfitos C e D.
Com relação aos tratamentos utilizados, foram observados maiores
incrementos na atividade da POX proporcionados pelos fosfitos C e D a partir de 24
horas após a inoculação (FIGURA 09 - Experimento 1). Entretanto, para 72 e 96
horas após a inoculação, o fosfito C destacou-se dos demais, considerando a
consistência dos resultados dos dois experimentos.
47
Para o tratamento apenas com inoculação do fungo, e sem aplicação
de nenhum produto, houve um pequeno incremento na atividade da POX a partir de
24 horas após a inoculação, Experimento 1 (FIGURA 09). Isso mostra que a planta
ativou o sistema de defesa, com a explosão oxidativa durante a interação com o
fungo e, posteriormente, desencadeou a síntese de peroxidase para detoxificação
celular. Todavia, quando a atividade da peroxidase é comparada com aquela de
plantas que receberam a pulverização com os fosfitos C e D, principalmente, a
atividade da enzima é maior nesse período e ainda aumenta em 72 e 96 horas após
a inoculação.
Ribeiro Junior et al. (2006), testando fosfito de potássio na indução de
resistência de cacaueiro a Verticillium dahliae Kleb., observaram que houve um
pequeno acréscimo na atividade da peroxidase, somente 13 dias após a
pulverização (1,25 mL/L de fosfito de potássio (27% de P2O5 e 27% de K2O), seguida
por inoculação com este fungo, e consideraram esse acréscimo não significativo.
Xue, Charest e Jabaji-Hare (1998), testando indução sistêmica de peroxidases, β 1-3
glucanase e quitinase, em resistência de feijão a espécies de Rhizoctonia,
observaram que a atividade da peroxidase aumentou até duas vezes mais em
mudas que haviam sido protegidas/inoculadas anteriormente com um isolado
avirulento do fungo.
No presente trabalho o comportamento foi semelhante, pois a maior
atividade dessa enzima ocorreu em plantas protegidas pelas aplicações dos fosfitos,
e, posteriormente, inoculadas com S. sclerotiorum, em relação àquelas somente
desafiadas com esse fungo. Esse comportamento demonstra que a planta pode ter
ativado as respostas iniciais de defesa, como a ativação das peroxidases, para que
reagissem com as espécies reativas de oxigênio (ERO's) e diminuíssem seu efeito
deletério nas células da planta.
Em outro estudo, Ogoshi (2011), analisando fosfito de potássio no
controle de Colletotrichum gloesporioides (Penz.) Sacc., isolado de plantas de
cafeeiro, observou que apenas a pulverização de fosfito de potássio (10 mL/L 25%
de P2O5 e 35% de K2O) proporcionou incremento da atividade da POX com o pico de
atividade um dia após a aplicação, e um pequeno aumento também, 13 dias após a
pulverização, e que a associação desse produto com a inoculação do fungo, não
induziu aumento na atividade dessa enzima.
48
Figura 09 – Atividade específica de peroxidase (POX) em plantas de soja “BMX Ativa”, no estadiovegetativo V2, eliciadas com fosfitos de potássio (fosfito A, B, C e D), fungicida fluaziname inoculadas com o fungo Sclerotinia sclerotiorum. UTFPR, Pato Branco, 2014.
Silva (2013), analisando óleos essenciais de capim-limão, assa-peixe e
fosfito de potássio no controle de antracnose do feijoeiro, encontrou incremento
significante na atividade da POX em plantas inoculadas, 7 dias após a pulverização
dos tratamentos, sendo que a atividade dessa enzima foi maior aos 8 e 13 dias após
a pulverização, diferindo da testemunha. Em plantas que não foram desafiadas pelo
49
fungo Colletotrichum lindemuthianum Sacc. & Magn., apenas o fosfito de potássio se
destacou dos demais tratamentos para produção de POX, aos 8 dias após a
pulverização.
No patossistema feijão caupi e Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid.
(MP), foi estudada a dinâmica das enzimas FAL e POX, em sementes tratadas com
o indutor benzotiadiazole (ASM), indutor + MP, água + MP e somente água. As
sementes ficaram imersas no indutor por 24 horas e logo após a semeadura, foram
aplicados os tratamentos e as coletas iniciadas. Os autores observaram que a maior
atividade da POX ocorreu a partir das 72 e 84 horas para os tratamentos ASM+MP e
ASM, respectivamente. Eles associaram este comportamento com interações
incompatíveis entre patógeno e hospedeiro (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2006).
Os primeiros produtos formados como respostas de defesa por
eliciadores bióticos são as espécies ativas de oxigênio, em duas fases: a fase I que
corresponde a primeira resposta ao ataque de um patógeno, muito rápida, podendo
ser de minutos; e a fase II, onde ocorre uma explosão mais prolongada de ERO's,
que provocará a morte localizada de células, pela reação de hipersensibilidade, e
possui envolvimento direto com a resistência das plantas ao agente patogênico
(DANGL, DIETRICH e THOMAS, 2000).
A enzima POX também está envolvida no processo de geração de
ERO's, localizada no apoplasto, ligada aos polímeros da parede celular das plantas
(APEL; HIRT, 2004), catalisa várias reações de diversos compostos, e a partir de
uma molécula de H2O2, forma moléculas de superóxido e também está relacionada
com a síntese de lignina e etileno (CHEN; SCHOPFER, 1999; TAIZ; ZEIGER, 2004).
Do et al. (2003), estudando a expressão de genes ligados a
peroxidase, produção de EAO's e resposta da peroxidase durante a reação de
hipersensibilidade, utilizando estirpes virulentas e avirulentas de Xanthomonas
campestris Pammel em pimentão, observaram que na interação incompatível
(estirpe avirulenta), houve pico de atividade dessa enzima 18 horas após a
inoculação, sendo três vezes maior que na interação compatível (estirpe virulenta).
Entretanto, quando foi avaliada 30 horas após a inoculação, na interação compatível
a atividade foi duas vezes maior e não houve alterações significativas da enzima em
tecidos não inoculados. Quando relacionaram as duas interações observaram que a
primeira explosão oxidativa ocorreu 2 horas após a inoculação, depois houve uma
segunda explosão 24 horas após a inoculação, na interação incompatível, que foi 6
50
vezes maior que na compatível, sendo que nesta, os níveis se mantiveram
constantes entre 18 e 30 horas após a inoculação.
No Experimento 2 pode-se observar o mesmo comportamento para os
Fosfitos C e D (FIGURA 09), com pico de atividade da POX 96 horas após a
inoculação. Dessa forma, sugere-se que há ação eliciadora dos fosfitos C e D.
O tratamento contendo fungicida fluazinam proporcionou leve aumento
na atividade da POX a partir de 24 horas após a inoculação, mas, manteve o nível
abaixo dos fosfitos C e D. Por se tratar de um produto de ação direta sobre o fungo,
comprovado por Arruda (2014) e Zancan et al. (2012), provavelmente o aumento da
atividade enzimática pode ser resultado da presença de S. sclerotiorum, mais do que
do produto propriamente dito.
Diante disso, pode-se considerar que as aplicações de fosfitos,
principalmente o fosfito C, potencializaram a antecipação da atividade da POX para
iniciar o processo de defesa da planta ao ataque do patógeno, em um primeiro
momento. Posteriormente, 72 e 96 horas após a inoculação, seu nível se manteve
elevado comprovando as respostas das plantas na defesa contra o agente agressor.
Esse comportamento é semelhante às reações incompatíveis entre o patógeno e a
planta. A incompatibilidade ocorre quando o hospedeiro possui genes de resistência
que reconhecem genes de avirulência do patógeno, e dessa forma, a doença não
ocorre (RESENDE, SALGADO e CHAVES, 2003).
Quando a atividade da POX sofre mudanças, geralmente elas são
correlacionadas com resistência ou suscetibilidade de plantas a patógenos. Por
serem enzimas oxidativas, removem hidrogênio dos álcoois hidroxicinâmicos para
formar lignina, que junto com outros compostos serve como barreira física à invasão
de patógenos (CAVALCANTI, BRUNELLI e STANGARLIN, 2005). Por outro lado, a
quebra do H2O2 pela POX, molécula altamente tóxica aos microrganismos, pode
significar maior suscetibilidade em função desta atividade.
Avaliando conjuntamente as atividades da POX e FAL, conhecendo-se
seus mecanismos e rotas de formação, possivelmente os fosfitos C e D ativaram a
rota dos fenilpropanoides para, posteriormente, sintetizar lignina e compostos
fenólicos. A polimerização final de compostos fenólicos para formação de lignina
depende da atividade da POX (PUNJA, 2004), o que demonstra sua relação direta
com a atividade da FAL. Dessa forma, os fosfitos podem ser considerados uma
alternativa de manejo para o mofo branco em soja e, principalmente por
51
apresentarem menores riscos à saúde e ao meio ambiente em relação aos
fungicidas atualmente recomendados para o manejo desta doença.
4.3 EXPERIMENTO DE CAMPO
4.3.1 Efeito de fosfitos de potássio na incidência e severidade de mofo branco, noscomponentes de rendimento e na qualidade física, fisiológica e sanitária dassementes de soja
Na avaliação da incidência em plantas houve interação significativa
entre os fosfitos utilizados e as épocas de aplicação (TABELA 02). Quando os
fosfitos foram aplicados no estádio V4, não diferiram entre si, mas, proporcionaram
diminuição de incidência da doença em plantas em relação ao tratamento
testemunha. Contudo, quando foram realizadas duas aplicações, estádio V4+R1, o
fosfito B apresentou o melhor controle, em relação a testemunha, não diferindo dos
fosfitos C e A (TABELA 02).
No estádio R1, o fosfito C apresentou maior interferência no
desenvolvimento da doença, diminuindo a incidência da doença, em relação a
testemunha, não diferindo dos fosfitos B e D. Entretanto, quando foi realizada uma
aplicação em estádio R2, não houve diferença entre os fosfitos testados em relação
ao tratamento testemunha (TABELA 02).
Ao relacionar a eficiência de cada produto, nas diferentes épocas de
aplicação, pode ser observado que o fosfito B, com uma aplicação apenas, no
estádio R1 mostrou menor controle da incidência. Para os demais fosfitos, não
houve diferença na incidência com relação às épocas e número de aplicação.
A avaliação de incidência do mofo branco na soja foi realizada no
estádio R4 devido ao atraso no desenvolvimento da doença. Esse fato ocorreu
devido à baixa precipitação pluvial que ocorreu desde a semeadura (Anexo A). Após
este período, houve um aumento na precipitação e a temperatura se manteve com
médias de 20 °C, até o final das avaliações. A partir do estádio R2, as condições
ambientais e a arquitetura das plantas proporcionaram ambiente favorável ao
desenvolvimento da doença, pois, a parte superior das plantas se encontrava mais
densa devido à maior quantidade de folhas e hastes propiciando um microclima
52
ótimo, que segundo CUNHA, 2010; LEITE, 2005, quando a umidade relativa próxima
de 70% e temperaturas médias em torno de 20 °C, são condições ideais para a
germinação dos escleródios presentes no solo.
Tabela 02 -- Incidência, em plantas (%), e controle de mofo branco em relação aos diferentes fosfitosde potássio utilizados, avaliados no estádio R4, da cultivar de soja BMX Ativa. CoronelDomingos Soares-PR, na safra 2012/13.
Incidência
Tratamentos
Épocas de aplicação
V4%
ControleV4+R1
%Controle
R1%
ControleR2
%Controle
Água 43,3aA - 36,0aAB - 30,4abB - 26,4aB -
Fosfito A 20,6bA 79 28,5abA 71 32,2aA 68 29,0aA 71
Fosfito B 25,1bAB 75 17,2bB 83 30,0abA 70 22,2aAB 78
Fosfito C 23,3bA 77 25,0abA 75 19,0bA 81 26,0aA 74
Fosfito D 32,0abA 68 32,0aA 68 25,5abA 75 26,0aA 74
Média geral 27,4
CV% 19,6
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e maiúscula na horizontal, não diferem estatisticamente entre si, ao nivel de 5% pelo teste de médias de Tukey.
O mofo branco tem um período de maior ocorrência que inicia no estádio de pleno
florescimento até inicio da formação de vagens e enchimento de grãos, em soja,
sendo que o principal tipo de infecção é via esporos que se depositam nas axilas de
folhas e ramos laterais (VIEIRA, 1994; ALMEIDA, KIIL e ABDELNOORR, 1997).
Nas duas avaliações de severidade houve interação significativa entre
épocas de aplicação e produtos utilizados (TABELA 03). Na avaliação de severidade,
estádio R5.1, observou-se que não houve diferença entre os produtos testados
quando aplicados no estádio V4. Todavia, quando foram realizadas duas aplicações
(V4+R1), os fosfitos B e C mostraram melhor eficiência, diminuindo a severidade de
mofo branco, não diferindo entre si. Quando as aplicações foram realizadas no
estádio R1, os melhores controles foram obtidos pelos Fosfitos C e D por reduzirem
a severidade da doença em 49% e 59%, respectivamente. Esses resultados se
repetiram quando esses produtos foram aplicados no estádio vegetativo R2,
reduzindo a severidade em 51% e 63%, respectivamente.
Quando analisou-se cada produto isolado nas diferentes épocas de
aplicação, o fosfito A não proporcionou controle diferenciado da severidade, nas
quatro épocas de aplicação. O Fosfito B proporcionou melhor controle da severidade
53
com duas aplicações, quando este foi aplicado nos estádios vegetativos (V4+R1).
Por outro lado, o fosfito C controlou efetivamente a doença com duas aplicações (V4
+ R1) e nas aplicações em épocas distintas (R1 ou R2), diminuindo a severidade. O
fosfito D apresentou-se mais eficaz na diminuição da severidade do mofo branco
quando aplicado em R1 e R2.
Para a segunda avaliação da severidade, realizada no estádio R5.5,
todos os fosfitos utilizados apresentaram influência no desenvolvimento da doença,
quando aplicados no estádio V4, em relação ao tratamento testemunha
(TABELA 03). Os fosfitos B e C, quando aplicados em duas épocas (V4+R1),
reduziram a severidade do mofo branco, com controle de 62% e 73%,
respectivamente. Nas aplicações em R1 os fosfitos C e D controlaram mais
efetivamente a doença, 51 e 53%, respectivamente, não diferindo do fosfito B, 29%.
Quando as aplicações foram realizadas somente no estádio R2, todos os
tratamentos eficiência para diminuir a severidade da doença em relação à
testemunha, sendo que o fosfito D teve eficiência superior aos demais, com 65% de
controle da severidade.
Tabela 03 – Severidade do mofo branco (%) em relação aos fosfitos de potássio utilizados, avaliadanos estádios R5.1 e R5.5, da cultivar de soja BMX Ativa. Coronel Domingos Soares-PR,na safra 2012/13.
Severidade
Tratamentos
Épocas de aplicação
ESTADIO R5.1 ESTADIO R5.5
V4 V4+R1 R1 R2 V4 V4+R1 R1 R2
Água 14,0aA 16,2aA 14,3aA 13,6aA 19,7aAB 18,3aAB 16,7aB 22,5aA
Fosfito A 10,6aA 12,5aA 13,6aA 12,6aA 11,8bA 14,3aA 13,5aA 15,0bA
Fosfito B 14,0aA 2,2bB 10,4abA 13,6aA 14,7abA 6,8bB 11,8abAB 15,2bA
Fosfito C 11,0aA 3,7bB 7,3bcAB 6,6bB 11,3bA 4,8bB 8,1bAB 10,0bcA
Fosfito D 12,5aA 13,6aA 5,8cB 5,0bB 13,5bA 14,4aA 7,7bB 7,7cB
Média geral 10,6 12,9
CV% 16,5 17,7
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na vertical e maiúsculas na horizontal, não diferemestatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade de erro.
Ao serem analisadas as épocas de aplicação sobre a eficiência do
controle do mofo branco, para cada produto isolado, observou-se que o fosfito A
apresentou o mesmo comportamento da primeira avaliação. Os fosfitos B e C
reduziram a severidade da doença com duas aplicações, quando aplicados em duas
54
épocas (V4+R1) e com uma aplicação apenas, no estádio R1. Já, o fosfito D
proporcionou melhor controle da doença com apenas uma aplicação nos estádios
R1 ou R2.
Pela análise química expressa no rótulo dos fosfitos utilizados, [Fosfito
A (P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha); Fosfito B (P2O5-40%; K2O-28% - 1 L/ha); Fosfito C
(P2O5-40%; K2O-20% - 1 L/ha), Fosfito D (P2O5-30%; K2O-20% - 2,4 L/ha)], sabe-se
que os fosfitos A e C tem a mesma proporção de fósforo e potássio. Com isso,
esperava-se que estes produtos apresentassem o mesmo comportamento no
controle do mofo branco (TABELA 03). Tal resultado possivelmente não ocorreu
devido aos ingredientes ativos utilizados na composição destes produtos serem de
origem diferente e também não se conhece a sua qualidade.
A menor porcentagem de plantas mortas foi observada nos
tratamentos que proporcionaram melhor controle de severidade (TABELA 04).
Quando as aplicações foram efetuadas no estádio V4 os fosfitos reduziram a
quantidade de plantas mortas em relação à testemunha, mas não diferiram entre si.
Para duas épocas de aplicação, V4 + R1, os fosfitos B, C e D proporcionaram menor
número de plantas mortas. Nos estádios de aplicação R1 e R2, os fosfitos C e D se
destacaram diminuindo a severidade da doença, não diferindo entre si e
proporcionando menor quantidade de plantas mortas.
Tabela 04 – Número de plantas mortas em relação aos fosfitos de potássio utilizados, avaliados noestádio R7 da cultivar de soja BMX Ativa. Coronel Domingos Soares-PR, na safra2012/13.
TratamentosÉpocas de aplicação
V4 V4+R1 R1 R2
Água 14,3aA 13,7aA 15,0aA 14,0aA
Fosfito A 9,0bA 11,7aA 9,0bcA 11,7aA
Fosfito B 9,0bA 8,7bcA 11,7abA 11,7aA
Fosfito C 10,0bA 8,0bcAB 4,3dB 4,3bB
Fosfito D 6,3bA 5,0cA 6,7cdA 7,0bA
Média geral 9,5
CV% 17,8
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na vertical e maiúsculas na horizontal, não diferemestatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nivel de 5% de probabilidade de erro.
Um fato importante é que, apesar destes agroquímicos não terem
efeitos sobre crescimento micelial nem inibição da germinação de escleródios, pelas
análises bioquímicas pôde-se observar que estão agindo como indutores do sistema
55
de defesa das plantas pelos incrementos proporcionados nas enzimas FAL e POX,
sendo que os fosfitos C e D foram responsáveis pelos maiores aumentos.
A fenilalanina é um aminoácido pertencente aos compostos fenólicos,
que são derivados da via do chiquimato, que representa os primeiros estágios da
síntese de compostos aromáticos. A FAL é a enzima que faz a desaminação da
fenilalanina para formação de compostos fenólicos, entre os quais está a lignina (LO;
NICHOLSON, 2008), que é resistente à degradação microbiana. Os compostos
fenólicos tem um papel importante restringindo a penetração do patógeno na parede
celular retardando o aumento das lesões (RIDE, 1983).
O aumento da atividade da POX está intimamente relacionado com a
explosão oxidativa ou produção de espécies reativas de oxigênio (ERO's), que é a
primeira resposta da planta ao ataque de um patógeno. As ERO's se originam
durante o contato do patógeno com a planta, em maior quantidade, e também, nos
momentos posteriores da patogênese, e quando acumuladas, são tóxicas à célula.
Contudo, as plantas possuem mecanismos para anular essa toxicidade, que são as
moléculas antioxidantes como a POX (YOSHIMURA et al., 2000). Assim, um
aumento na atividade da POX está relacionado a alterações no metabolismo
secundário das plantas para síntese de substâncias de defesa da planta, contra o
agente agressor.
Quando se faz a interpretação desses dados de laboratório com os de
campo, percebe-se que existe uma relação positiva entre o aumento da atividade
dessas enzimas com o melhor controle do mofo branco no campo, se destacando os
fosfitos C e D.
Tais resultados contribuíram para mostrar que os fosfitos
proporcionaram uma diminuição da doença em relação à testemunha, e podem ser
utilizados como um método viável de manejo e ambientalmente correto. Também,
podem ser associados a outros métodos para diminuição de perdas ocasionadas por
S. sclerotiorum. Eles proporcionaram diminuição da doença, semelhante ou melhor
até do que quando são utilizados fungicidas, como nos trabalhos de Arruda (2014),
que constatou um controle de 16,6% utilizando o fungicida fluazinam e no trabalho
de Meyer (2011), utilizando fluazinam, tiofanato metílico e carbendazin, encontrou
81, 29 e 19% de controle de mofo branco, respectivamente.
Não houve interação significativa entre os fosfitos utilizados e as
épocas de aplicação em relação à produtividade da soja, número de vagens por
56
planta, número de sementes por planta e massa de mil grãos (TABELAS 05, 06 e
07).
Seria oportuno pensar que nos tratamentos onde morreram mais
plantas em decorrência da doença, a produtividade seria inferior. Todavia, as
variações na população das plantas de soja nem sempre afetam a produtividade,
pois, a cultura se adapta aos espaços remanescentes com modificações
morfológicas compensando a produtividade. A menor densidade de plantas na linha
pode proporcionas maior disponibilidade de fotoassimilados para o crescimento de
ramos laterais, onde estão as gemas reprodutivas (MAUAD et al., 2010) o que pode
compensar no rendimento de grãos. Isso é verdadeiro pois, esses autores também
concluíram que com o maior número de plantas por metro linear houve redução do
número de vagens por planta.
Tabela 05 – Produtividade (kg/ha) de grãos de soja em resposta à aplicação de fosfitos de potássio.Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/13.
TratamentosÉpocas de aplicação
V4 V4+R1 R1 R2
Água 3.540ns 2.900 3.180 3.600
Fosfito A 3.000 3.180 3.480 3.440
Fosfito B 3.240 3.440 3.410 2.900
Fosfito C 2.700 3.180 3.520 3.420
Fosfito D 3.240 2.850 3.240 3.350
CV % 10,7ns Não significativo (p>0,05).
Resultados semelhantes também foram obtidos por Tourino, Resende e
Salvador (2002), ao estudar espaçamento e densidade de semeadura e sua
influência nos componentes de rendimento de soja. Observaram que com a menor
densidade de plantas por metro (10 plantas/m) e menor espaçamento entre linhas
(45 cm) houve aumento na produtividade. Salientam que quanto menor a densidade
de plantas, menor a competição entre elas por nutrientes e, assim, também, há
maior emissão de ramificações, maior produtividade e maior número de vagens por
planta, uma vez que as plantas se adaptam aos espaços disponíveis fazendo essa
compensação.
57
Tabela 06 – Vagens por planta (n°) e sementes por planta (n°), de soja em resposta à aplicação defosfitos de potássio. Coronel Domingos Soares-PR, na safra 2012/2013.
Tratamentos
Épocas de aplicação
Vagens/planta Sementes/planta
V4 V4+R1 R1 R2 V4 V4+R1 R1 R2
Água 64ns 51 51 49 172ns 136 133 130
Fosfito A 51 54 59 61 138 145 156 161
Fosfito B 51 62 58 57 138 167 154 153
Fosfito C 55 59 61 63 147 160 165 166
Fosfito D 52 59 58 58 140 158 155 157
Média geral 57,0 152,0
CV % 16,1 15,7ns Não significativo (p>0,05).
Por outro lado, quando o fosfito de potássio foi utilizado em outro
patossistema, para controle da ferrugem asiática da soja, não teve efeito significativo
na produtividade e massa de 1000 grãos, em relação à testemunha (NEVES; BLUM,
2014) e salientam ainda que, apesar da ferrugem ter progredido de forma mais lenta,
nas folhas infectadas a área foliar fotossinteticamente ativa foi prejudicada. Isso fez
diminuir a taxa fotossintética e consequentemente, ocorreu redução do número de
vagens por planta prejudicando o enchimento de grãos.
Apesar dos fosfitos não proporcionarem incremento nos componentes
de rendimento da soja, deve-se ressaltar sua importância na redução da incidência e
da severidade do mofo branco. Dessa forma, o uso contínuo desses produtos pode
promover a redução do inóculo nas lavouras e como o mofo branco é uma doença
monocíclica, efeitos epidemiológicos benéficos ocorrerão.
Devido à ausência de cultivares resistentes a esse patógeno, o uso de
fosfitos pode ser adotado para minimizar os danos causados pela doença. Também
é mais uma alternativa de manejo que pode ser associada a outros métodos, como
rotação de culturas, cobertura morta e controle químico com fungicidas.
Quando foi avaliado o efeito dos diferentes fosfitos na massa de mil
grãos, não foi encontrado incremento significativo (TABELA 07).
Silva et al. (2011) realizaram uma pesquisa com aplicações de
diferentes doses de fosfito (750 e 1500 g – P2O5 (30%) e P2O5 + 20% K2O) para
controle do míldio, ferrugem, e verificaram seu efeito sobre os componentes de
rendimento em soja, observando que no primeiro cultivo a maior dose de fosfito
58
(1.500 g/ha) proporcionou maior rendimento em relação às plantas não tratadas.
Entretanto, no segundo cultivo, não encontraram interação de nenhuma das doses
utilizadas para peso de sementes.
Tabela 07 – Massa de mil grãos (g) de soja em resposta à aplicação de fosfitos de potássio. CoronelDomingos Soares-PR, na safra 2012/2013.
TratamentosÉpocas de aplicação
V4 V4+R1 R1 R2
Água 128,0ns 138,0 144,3 142,3
Fosfito A 143,0 142,3 143,0 143,0
Fosfito B 148,3 145,3 142,3 148,0
Fosfito C 142,0 144,0 140,0 145,0
Fosfito D 145,6 145,0 141,3 141,0
Média geral 142,5
CV % 5,8ns Não significativo (p>0,05).
Os fosfitos de potássio testados neste estudo não apresentaram efeito
significativo (P<0,05) na germinação, vigor, comprimento da parte aérea,
comprimento de raiz, massa seca de plântulas e massa de mil grãos quando
comparados à testemunha, bem como, não houve influência entre as épocas de sua
aplicação (TABELA 08).
Todas as amostras de soja apresentaram, em média, uma germinação
e vigor de 87,37%, e 75,7%, respectivamente, e o comprimento de parte aérea de
10,4 cm, comprimento de raiz de 14,1 cm e massa seca de plântulas de 0,04 g. A
porcentagem de germinação está dentro dos padrões exigidos pelo MAPA, que deve
ser no mínimo de 80% para sementes certificadas, S1 e S2 (BRASIL, 2009).
59
Tabela 08 – Germinação (%), vigor(%), comprimento da parte aérea e raiz (cm), massa seca deplântulas (g) e massa de mil grãos (g) das sementes colhidas no experimento de sojacom aplicação de fosfitos de potássio, em Coronel Domingos Soares-PR, na safra2012/13.
Épocas de aplicaçãoGerminação (%)
Tratamentos V4 V4+R1 R1 R2Testemunha 88,3ns 88,6 93,1 92,0Fosfito A 88,5 88,0 84,5 85,0Fosfito B 82,0 92,5 83,3 82,1Fosfito C 94,0 84,0 86,0 86,0Fosfito D 87,0 87,6 88,4 86,7Média geral 87,37CV % 5,8
Vigor (%)Testemunha 75,0ns 71,0 83,3 69,0Fosfito A 70,0 74,0 77,5 64,0Fosfito B 77,3 86,0 73,3 73,0Fosfito C 83,0 74,7 78,1 72,0Fosfito D 75,5 79,5 80,0 80,0Média geral 75,7CV % 12,8
Comprimento de parte aérea (cm)Testemunha 9,7ns 11,0 10,8 11,3Fosfito A 11,0 11,0 11,0 10,2Fosfito B 11,0 9,6 11,1 10,2Fosfito C 11,0 9,7 11,0 10,3Fosfito D 11,0 10,6 9,8 9,7Média geral 10,4CV % 8,6
Comprimento de raiz (cm)Testemunha 14,19ns 14,1 14,93 14,2Fosfito A 14,5 13,7 13,92 14,2Fosfito B 13,6 14,3 14,43 15,0Fosfito C 14,2 14,0 15,1 13,0Fosfito D 14,2 14,8 13,1 14,0Média geral 14,1CV % 6,3
Massa plântula seca (g)Testemunha 0,03ns 0,03 0,03 0,03Fosfito A 0,03 0,03 0,03 0,03Fosfito B 0,04 0,03 0,04 0,04Fosfito C 0,04 0,03 0,03 0,15Fosfito D 0,04 0,04 0,03 0,03Média geral 0,04CV % 12,0ns Não significativo (p>0,05).
Na avaliação de incidência de S. sclerotiorum em sementes oriundas
de plantas tratadas com fosfitos, não foram observadas diferenças significativas
entre os produtos utilizados nem entre épocas de aplicação (TABELA 09).
Alguns trabalhos demonstram que a incidência de S. sclerotiorum em
sementes de soja, geralmente, não ultrapassa 2%, sendo considerada uma
incidência baixa (PERES, 1996). Todavia, a análise sanitária das sementes é de
grande importância, pois sabe-se que vários patógenos de importância econômica
60
são transmitidos pela semente, e os métodos de amostragem e análise também
devem ser precisos para quantificá-los de maneira mais precisa.
Tabela 09 – Incidência (em sementes) (%) de Sclerotinia sclerotiorum na cultivar de soja “BMXAtiva”, detectada pelo teste Neon-modificado na safra 2012/2013. UTFPR, Pato Branco-PR.
TratamentosÉpocas de aplicação
V4 V4+R1 R1 R2
Água 0,17ns 2,33 0,16 0,87
Fosfito A 0,83 0,16 1,86 2,76
Fosfito B 0,50 1,90 0,33 0
Fosfito C 0,50 0,33 0,16 0
Fosfito D 0,33 0,16 0,16 0,50
Média geral 0,7
CV % 21,8ns Não significativo (p>0,05).
No caso de S. sclerotiorum, sua transmissibilidade pela semente é
muito preocupante, uma vez que dela pode ser originado mais de um escleródio, e
deste, vários apotécios que, segundo Steadman (1983), podem liberar, no período
de 10 dias, 2.000.000 ascósporos. Muitas vezes, a semente contaminada distribui o
fungo em diferentes locais da lavoura, onde vão se desenvolver novos focos de uma
doença, tanto em áreas livres, quanto podem aumentar o inóculo de áreas
infestadas (GOULART, 1997).
Outro fato relevante para infestação de novas áreas ocorre quando os
agricultores produzem suas próprias sementes. Acabam adquirindo sementes de
outros agricultores, essas, sem um controle de qualidade fitossanitária, podem estar
infectadas e levar o fungo para locais ainda isentos da doença.
Dessa forma, a conscientização dos agricultores quanto a utilização
dos fosfitos como eliciadores de respostas de defesa das plantas contra o mofo
branco, contribuirá para a redução do inóculo de S. sclerotiorum.
61
5 CONCLUSÕES
Todos os fosfitos de potássio testados mostram eficiência na redução
da incidência e severidade do mofo branco em soja, principalmente quando
aplicados nos estádios V4+R1, R1 e R2, nas condições do experimento
Há diferença na eficiência, com destaque para os fosfitos C e D.
O mecanismo de ação dos fosfitos de potássio, nesse patossistema,
parece ser a indução da resistência através da ativação das enzimas FAL e POX.
Os fosfitos de potássio não apresentam efeito na qualidade fisiológica e
sanitária das sementes de soja.
62
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os fosfitos vêm demonstrando importância no manejo de doenças, pois
além da atuação como possíveis eliciadores de respostas de defesa nas plantas,
são menos tóxicos ao meio ambiente que os fungicidas.
Sua utilização associada a fungicidas e herbicidas para indução de
resistência, pode potencializar a ação desses e até poderá contribuir para
diminuição do número de aplicações e com isso minimizar a agressão ao meio
ambiente. Outro fator importante é que além do mofo branco, outras doenças
poderão ter seu desenvolvimento reduzido pela associação desses produtos.
Esse trabalho vai contribuir embasando novos estudos com outras
culturas atacadas por S. sclerotiorum, como por exemplo, o feijão. Os fosfitos
poderão ser utilizados como mais uma alternativa de manejo nesse patossistema.
Além da associação dos fosfitos com manejo químico, podem ser
associados a outras práticas como a rotação de culturas, pois, foi observado, em
outra área, na mesma propriedade onde foi instalado o experimento, que onde havia
sido cultivado milho na safra anterior, ocorreu atraso e baixa incidência de mofo
branco.
Porém, novos estudos devem ser conduzidos para avaliar o efeito dos
fosfitos na ativação de outras enzimas relacionadas com respostas de defesa contra
patógenos, nesse patossistema. A análise química desses produtos também é outro
fator importante a ser considerado, pois a composição química poderá explicar
melhor as diferenças de comportamento entre produtos com a mesma concentração
de fósforo e potássio.
Outro ponto importante a ser estudado seria aplicação de fosfitos em
áreas com diferentes densidades de semeadura e arquitetura de plantas, bem como
seu efeito em diferentes variedades de soja.
63
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75
ÍNDICE DE APÊNDICES E ANEXOS
APÊNDICE A – Tratos culturais realizados na cultivar de soja BMX Ativa, em CoronelDomingos Soares, safra 2012/2013. Paraná........................................ 77
APÊNDICE B – A) Análise do percentual de germinação das plântulas, 7 dias após aincubação; B) Plântulas anormais; C) Plântulas normais; D) Avaliação de comprimento de raiz e parte aérea de plântulas. UTFPR, Pato Branco – PR.......................................................................................................... 77
ANEXO A - Dados de pluviosidade e temperatura média, coletados na estação meteorológica de Palmas-PR, disponibilizados pelo IAPAR (2013), referentes aos meses de novembro e dezembro de 2012, janeiro, fevereiro, março e abril de 2013............................................................ 79
ANEXO B: Dados de pluviosidade e temperatura média, coletados na estação meteorológica de Palmas-PR, disponibilizados pelo IAPAR (2014), referentes aos meses de novembro e dezembro de 2013, janeiro, fevereiro, março e abril de 2014............................................................ 79
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APÊNDICES
77
APÊNDICE A – Tratos culturais realizados na cultivar de soja BMX Ativa, em CoronelDomingos Soares, safra 2012/2013. Paraná.
05/12/2012 19/12/2012 11/01/2013 01/02/2013
Roundup Transbord:2L/ha
Roundup Ready: 1,6L/ha
Priori: 0,25 L/ha Derosal 500: 0,7 L/ha
COMO Platinum: 100mL/ha
Nomolt: 120 mL/ha Alterne: 0,5 L/haAprouch Prima: 0,3
L/ha
Classic: 30 g/ha Bendazol: 0,6 L/ha Bendazol: 0,6 L/ha Nomolt: 120 mL/ha
Engeo Pleno: 80mL/ha
---- Dipel: 400 mL/ha ----
---- ---- Math: 150 mL/ha ----
APÊNDICE B – A) Análise do percentual de germinação das plântulas, 7 dias após aincubação; B) Plântulas anormais; C) Plântulas normais; D) Avaliação decomprimento de raiz e parte aérea de plântulas. UTFPR, Pato Branco – PR.
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ANEXOS
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ANEXO A - Dados de pluviosidade e temperatura média, coletados na estaçãometeorológica de Palmas-PR, disponibilizados pelo IAPAR (2013), referentes aosmeses de novembro e dezembro de 2012, janeiro, fevereiro, março e abril de 2013.
ANEXO B: Dados de pluviosidade e temperatura média, coletados na estaçãometeorológica de Palmas-PR, disponibilizados pelo IAPAR (2014), referentes aosmeses de novembro e dezembro de 2013, janeiro, fevereiro, março e abril de 2014.
