UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ Marcelle Figueiredo Vilaçatcconline.utp.br/wp-content/uploads/2013/02/QUALIDADE... · microrganismos presentes no leite ordenhado e refrigerado para

UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ

Marcelle Figueiredo Vilaça

QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO LEITE ENTREGUE PARA

PROCESSAMENTO INDUSTRIAL

CURITIBA

2012




Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de

Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade

Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Médica Veterinária

Orientadora: Profa. Dra. Anderlise Borsoi

CURITIBA

2012

TERMO DE APROVAÇÃO




Esta monografia foi julgada e aprovada para obtenção do título de Bacharel no Curso de Bacharelado

em Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.

Curitiba, 19 de Junho 2012

Bacharelado em Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.

Orientador: Prof. Dra Anderlise Borsoi

UTP

Prof. Dr. Welington Hartmann

UTP

Prof. Dr. José Mauricio França

UTP

AGRADECIMENTOS

À Deus por estar presente me ajudando e dando força para seguir em frente

não apenas no decorrer de todo curso mas sim ao longo da minha vida.

À minha mãe Ana Lúcia por todo amor, esforço e dedicação, pessoa que sigo

como exemplo de mulher guerreira.

À minha tia Luzia que sempre esteve presente não apenas nos meus estudos.

À minha querida vó Olívia pelo o carinho e cuidado no decorrer da minha vida.

A minha irmã Michelle que do seu jeito sempre me deu apoio.

À minha amiga peludinha Meg pela inspiração e lembrança diária do porque

da escolha desta profissão.

À todos meus familiares que torceram e acreditaram na conclusão desta

etapa.

À minha orientadora Prof. Dra. Anderlise Borsoi por sua dedicação, paciência

e ensinamentos dados no desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus colegas de curso e professores pelos ensinamentos

compartilhados no decorrer desta etapa.

Aos funcionários do Laboratório de microbiologia da UTP e da Leiteria da

Fazenda Pé da Serra - UTP pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Deocy França pela oportunidade de estagiar no laboratório de

microbiologia de alimentos da UFPR

Obrigada a todos que direta ou indiretamente participaram desta etapa,

me fizeram crescer, tanto pessoalmente como profissionalmente

RESUMO

As condições higiênicas do local de obtenção do leite podem favorecer a presença e multiplicação de microrganismos patogênicos, podendo potencialmente contaminar o processamento.Visando avaliar a qualidade do leite entregue para processamento industrial esse trabalho pesquisou a contaminação por bactérias mesófilas, coliformes totais, Escherichia coli, Estafilococos aureus e Salmonella. O estudo foi conduzido com 16 amostras em duplicata de leite cru obtidas na Fazenda Pé da Serra-UTP e analisadas no laboratório de Microbiologia da UTP. Todas as amostras estavam dentro das normas quanto a ausência de Salmonella e dentro do padrão para contagem em placa de mesofilos segundo a IN 62 que é de 6,0 x 105 UFC/mL. Somente as amostras 3 da manhã e 3 da noite foram negativas para a presença de coliformes fecais. A amostra 3 da manhã apresentou contagem de Stahpylococcus aureus estatisticamente superior as demais amostras. Palavras-chave: leite cru, qualidade, Salmonella , Estafilococos aureus, Escherichia coli

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO _________________________________________________ 6

2 OBJETIVOS ___________________________________________________ 7

3 ORIENTAÇÃO E LOCAIS DE ESTÁGIO _____________________________ 8

4 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES ___________________________________ 9

5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA _______________________________________12

5.1 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS ____________________12

5.2 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E PESQUISA DE COLIFORMES

FECAIS __________________________________________________________ 12

5.3 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS _______________________________ 13

5.4 PESQUISA DE Salmonella _______________________________________ 16

5.5 COLORAÇÃO DE GRAM ________________________________________ 17

6 MATERIAIS E MÉTODOS _______________________________________ 20

7 RESULTADOS ________________________________________________ 28

8 CONCLUSÕES ________________________________________________ 30

REFERÊNCIAS ____________________________________________________ 31

1 INTRODUÇÃO

O leite é um alimento de extrema importância nutricional, é constituído de:

água, proteínas de alta qualidade, vitaminas, antioxidantes, gordura, lactose, cálcio e

outros minerais. (LANNA, 2000) Devido a sua grande quantidade de nutrientes,

possuir pH com valores variáveis entre 6,6 a 6,8 e sua temperatura no momento da

ordenha ser de aproximadamente 37ºC, o leite se apresenta como um meio

favorável ao crescimento bacteriano (OHI et al., 2010), tornando assim

imprescindível sua análise microbiológica.

Segundo pesquisas realizadas pela FAO (2010a) o Brasil é o quinto maior

produtor mundial de leite com um total de 31,7 milhões de toneladas, sendo o

segundo maior produtor das Américas ficando atrás apenas dos Estados Unidos que

produziu 87milhões de toneladas de leite. Do total do leite produzido no Brasil,

apenas 21 milhões de toneladas são de leite inspecionado (IBGE, 2010b). A

produtividade anual por animal em 2010 foi de 1.340 litros (FAO, 2010b) e o número

de vacas ordenhadas no ano de 2010 foram aproximadamente 23 milhões (IBGE,

2010a).

A maior parte da produção de leite do Brasil concentra-se nas regiões

Sudeste e Sul. Entre os estados, Minas Gerais lidera a produção nacional, com

27,3%, ficando em segundo lugar o Rio Grande do Sul com 11,8% da produção e o

Paraná em terceiro lugar com 11,7% (IBGE, 2010c).

Atualmente a IN (Instrução Normativa) 51 (Brasil, 2002) e a IN 62 (Brasil,

2011), ambas do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA),

regularizam o padrão de qualidade do leite cru refrigerado, incluindo o padrão

microbiológico. Segundo a IN 51 o leite deve possuir na Contagem Padrão em

Placas o valor máximo de 5,0 x105 UFC/mL enquanto que na IN 62 o valor máximo é

de 6,0 x 105 UFC/mL, com redução gradativa a partir de 2014 para no máx. 3,0 x

105 UFC/mL e em 2016 de no máx. 1,0 x 105 UFC/mL para os produtores individuais

das regiões Sul, Sudeste e Centro Oeste.

2 OBJETIVOS

O objetivo do presente trabalho de conclusão de curso foi analisar

microrganismos presentes no leite ordenhado e refrigerado para entrega a caminhão

coleta através das análises de contagem de microrganismos mesófilos, contagem de

coliformes totais, contagem de Staphylococcus, pesquisa de coliformes fecais e

pesquisa de Salmonella. Avaliar os resultados obtidos durante as analises e

compara-los com a legislação vigente.

3 ORIENTAÇÃO E LOCAIS DE ESTÁGIO

O Estagio Curricular Obrigatório para a obtenção do título de Medico

Veterinário foi realizado no mês de abril no laboratório de microbiologia de alimentos

da Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizado na Fazenda Experimental

do Canguiri, Rua Ivone Pimentel nº 1000, Bairro Canguiri, Pinhais, CEP 83300 - 000;

Neste local foi orientado pelo Dr.Deocy França, professor de tecnologia de alimentos

na UFPR. Durante o mês de maio, as atividades foram realizadas no laboratório de

microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná (UTP) utilizado para atividades

praticas nos cursos da universidade, Rua Sydnei a Rangel Santos 238, Santo Inacio,

CEP 82.010 - 330; orientado pela professora Dra.Anderlise Borsoi, responsável

pelas disciplinas de Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal e Doença de

Aves e Suínos. A carga horária total desenvolvida no estágio foi de 360h.

4 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES

As atividades realizadas foram preparação de materiais e meio de cultura

para as análises microbiológicas, esterilização de materiais limpos e contaminados,

preparo e diluições de amostras, análises microbiológicas (mesófilos, psicrotróficos,

coliformes totais, estafilococos, coliformes fecais e Salmonella), leitura e contagem

em placa e expressão de resultados.

FIGURA 01 – PREPARO DO AGAR PCA: ERLENMEYER COM SOLUÇAO DE AGUA E ÁGAR,

SOB APARELHO DE AGITAÇAO MAGNETICA E AQUECIMENTO.

FONTE: o próprio autor.

FIGURA 02 – AGAR EMB ( À ESQUERDA, CONTEÚDO ESCURO ) E AGAR PCA ( À DIREITA,

CONTEÚDO CLARO) PRONTOS PARA SEREM AUTOCLAVADOS


FIGURA 03 – MEIOS DE CULTURA EM AUTOCLAVE


FIGURA 04 – SECAGEM DO MEIO XLD NAS PLACAS DE PETRI, EM FLUXO LAMINAR.


FIGURA 05 – CALDO EC DISTRIBUÍDO EM TUBOS DE ENSAIO ANTES DA AUTOCLAVAGEM.


5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

5.1 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS

Este grupo de bactérias tem grande importância por incluir a maioria dos

contaminantes do leite, tanto deteriorantes como patógenos, podem ser

caracterizados por se desenvolverem entre temperaturas de 20 a 45ºC, com a

temperatura ótima de crescimento entre 30 e 40ºC (LORENZETTI, 2006).

Sua presença em grande número indica matéria-prima excessivamente

contaminada, limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas, higiene insuficiente

na produção e condições inapropriadas de tempo e temperatura durante a produção

ou conservação dos alimentos (CARDOSO et al. , 2000).

A refrigeração do leite a 4°C tem como principal objetivo controlar a

multiplicação destes microrganismos (LORENZETTI, 2006).

O meio de cultura mais utilizado na metodologia convencional é o Agar

Padrão para Contagem (PCA). Esta contagem detecta o número de bactérias

aeróbias ou facultativas mesófilas, presentes em forma vegetativa e esporulada

(OLIVEIRA, 2005).

5.2 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E PESQUISA DE COLIFORMES

FECAIS

O grupo de coliformes totais é constituído por enterobactérias como

Enterobacter sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp., Escherichia sp. entre outras. Estes

quatro gêneros mais frequentes são encontrados nas fezes do homem, animais de

sangue quente, na natureza e em certos vegetais (SILVA JR, 1995). Os coliformes

incluem todos os bacilos gram-negativos, aeróbios e anaeróbios facultativos,que não

formam esporos e são capazes de a 32-35°C em 48 horas fermentar a lactose,

produzir ácido, gás e degradar proteínas (OHI et al., 2010; TRONCO, 2010).

Os coliformes fecais ou coliformes termotolerantes pertencem ao grupo de

bactérias coliformes, porém utilizam a lactose a 44,5ºC no meio de cultura EC (Caldo

Escherichia coli) com produção de gás. O mais importante microrganismo deste

grupo é a Escherichia coli, bactéria exclusiva do intestino de animais de sangue

quente. A E. coli é indicadora de condições sanitárias, sua presença evidencia

práticas de higiene inferiores ao padrões requeridos, indica se houve contaminação

fecal. Os principais sintomas da intoxicação por E. coli são diarréia podendo

conter sangue, vômito, febre, cólica, mal estar e calafrios (SILVA JR, 1995).

Os coliformes do leite têm origem de utensílios mal desinfetados, tais como

baldes, tarros, tanques e máquinas de ordenha, podendo haver contaminação de

esterco e pêlos do animal que caem durante a ordenha (TRONCO, 2010). Além de

serem indicadores de higiene de produção, também podem produzir uma série de

enzimas que comprometem a qualidade dos derivados a que o leite cru é destinado

(NERO, 2005). Estas bactérias podem ser controladas pelo método de alta

temperatura em curto tempo (pasteurização) (OHI et al., 2010).

No Agar EMB (Eosin Methylene Blue Agar) as colônias de coliformes fecais

características (Figura 06) apresentam de 2 a 3 mm de diâmetro, com brilho

metálico esverdeado (TRONCO, 2010).

FIGURA 06 – ESCHERICHIA COLI ATCC 51823 EM AGAR EMB


5.3 CONTAGEM DE ESTAFILOCOCOS

Os estafilococos estão presentes na pele e mucosas de mamíferos, portanto

seres humanos e outros animais podem veicular este microrganismo para o leite e

seus derivados, visto que vários fatores como uso de ordenha manual, falhas na

higiene dos animais e equipamentos, bem como ausência de programas de controle

de mastite, ainda ocorrem em muitos rebanhos (SANTOS, 2008). O Staphylococcus

aureus (S. aureus) é um dos principais agentes etiológico da mastite bovina,

contaminando o leite na sua obtenção (SANTANA et al., 2006).

S. aureus é um coco Gram positivo, anaeróbico facultativo, não móvel,

catalase e coagulase positiva, não esporulados. As células são esféricas podendo

ocorrer sozinhas, pareadas, ou apresentam formações semelhantes a cachos de

uva (CHAPAVAL et al., 2009).

O método de referência para enumeração de S. aureus é a contagem em

placas contendo ágar Baird-Parker (BP), que permite o isolamento e a enumeração

de microorganismos injuriados sem a etapa de enriquecimento não seletivo,

apresentando como desvantagem, o fato de não ser totalmente seletivo. Por tal

razão, a detecção de S. aureus em amostras de leite cru e derivados, que estejam

muito contaminadas por microrganismos competidores, é limitada neste meio

(SANTOS, 2008).

As características de crescimento das colônias típicas no BP (Figura 07) são

negras, brilhantes, delimitadas e com dois halos, sendo associada estas

características a capacidade do microrganismo em produzir a enzima coagulase

(SANTANA et al., 2006). Para confirmação das colônias típicas de S. aureus pode-

se fazer os testes bioquímicos da Catalase e o da Coagulase.

FIGURA 07 - PLACA DE PETRI COM COLÔNIAS TÍPICAS DE S. AUREUS.

FONTE: PVL, disponível em: < http://www.pvl.pt/pt/produto/38_46+184/baird-parker-agar-base-

bk055/>

O Teste da Catalase consiste em emulsionar uma alçada de uma colônia

típica de S.aureus em uma gota de água oxigenada (peróxido de hidrogênio) em

uma lâmina de vidro e observar a ocorrência de borbulhamento imediato (teste

positivo) ou não (teste negativo) (Figura 08). O S. aureus possuí a enzima catalase

que degrada peróxido de hidrogênio e o transforma em água e oxigênio (CHAPAVAL

et al., 2009).

FIGURA 08 – TESTE NEGATIVO (2) E TESTE POSITIVO (5) PARA CATALASE


O Teste da Coagulase consiste em colocar uma gota de salina em uma

lâmina e emulsionar uma colônia isolada a ser testada em seguida colocar uma gota

de plasma de coelho e homogeneizar com um palito de madeira, observar se há

aglutinação em alguns segundos. Quando ocorre a coagulação considera-se teste

positivo, a coagulase está presente no S. aureus e induz a coagulação do sangue,

convertendo o fibrinogênio do plasma em fibrina (ANVISA, 2004).

Algumas cepas de S. aureus, geralmente cepas coagulase positiva, estão

aptas à produzir enterotoxinas estafilocócicas (CHAPAVA, 2009), são estas

liberadas no alimento durante seu desenvolvimento e não o microrganismo em si o

agente causador da intoxicação alimentar (SANTOS, 2008). Os principais

sintomas da intoxicação estafilocócica são náuseas , vômito, cãibras

abdominais e diarréia (SANTANA et al., 2006).

Quanto à resistência térmica, são microrganismos termolábeis, sendo

inativados em temperaturas superiores a 60 ºC por três minutos (SANTOS, 2008), as

enterotoxinas estafilocócicas não são inativadas pelo processo de pasteurização e

permanecem no leite pasteurizado tornando-se um risco à saúde humana

(BORGES, 2008).

5.4 PESQUISA DE Salmonella

O gênero Salmonella é composto por bacilos gram-negativos, não produtores

de esporos, pertencentes à família das Enterobacteriaceae. As bactérias desse

gênero são anaeróbias facultativas, móveis (com poucas exceções), tem a

capacidade de reduzir nitratos a nitritos, fermentam glicose e geralmente não

fermentam lactose ou o fazem lentamente (GUERRA, 2010).

É um importante patógeno que utiliza como reservatório o trato

gastrointestinal do homem e de animais (SILVEIRA et al., 2011), causando

enfermidades, como diarreia em bezerros, e produz altas taxas de morbidade e

letalidade nos animais portadores. Pode ser o agente causal de mastite bovina

subclínica (GENEROSO, 2011).

Em humanos a enfermidade causada pela bactéria chama-se salmonelose e

seus principais sinais clínicos são infecção intestinal com disenteria, podendo

apresentar febre, vômito, mal estar, calafrios, hipotensão, septicemia, choque

endotoxico e morte (SILVA JR, 1995). O sorotipo de maior importância causador de

infecções alimentares é S. enteritidis, sendo a causa predominante de salmonelose

em diversos países (SHINOHARA et al., 2008).

É uma zoonose de grande preocupação da indústria de alimentos por ser

frequentemente isolada de produtos de origem animal tendo importância para

garantia da segurança alimentar (SILVEIRA et al., 2011). A salmonela é

termossensível podendo ser destruída pela pasteurização tornando o leite

pasteurizado um alimento seguro neste quesito (TOLEDO, 2003).

As colônias típicas de Salmonella em Agar Xilose Lisina Desoxicolato

(XLD) são vermelhas com o centro preto devido à produção de H2S (Figura 10) e em

Agar verde brilhante (AVB) são esbranquiçadas com halos vermelhos (Figura 09)

(BD, 2011).

FIGURA 09 – S. ENTERITIDIS ATCC 13076 EM AGAR VERDE BRILHANTE (AVB)


FIGURA 10 - S. ENTERITIDIS ATCC 13076 EM AGAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD)


5.5 COLORAÇÃO DE GRAM

A coloração de Gram é o método bacterioscópico mais importante e mais

utilizado atualmente na bacteriologia, sua finalidade é a classificação de

microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e

arranjo celular. As bactérias são classificadas basicamente em dois grandes grupos:

Gram-positivas (Figura 11) e Gram-negativas (Figura 12), corando-se de roxo e de

rosa respectivamente (FREITAS,2007).

FIGURA 11 - COLORAÇÃO DE GRAM-POSITIVO - STAPHYLOCOCCUS AUREUS

FONTE: KRIAT, 2007, disponível em: <http://www.geniebio.ac-aix-

marseille.fr/biospip/spip.php?article252&id_document=837#documents_portfolio>

FIGURA 12 - COLORAÇÃO DE GRAM-NEGATIVO - SALMONELLA

FONTE: KRIAT, 2007, disponível em: <http://www.geniebio.ac-aix-

marseille.fr/biospip/spip.php?article252&id_document=831>

Este método de coloração de bactérias foi desenvolvido pelo médico

dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, consiste no tratamento

sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal

violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina. Essa técnica permite a separação de

amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas baseando-se na

composição da parede bacteriana, permitindo determinar a morfologia e o tamanho

das bactérias analisadas (PERAZZOLO, 2006).

Segundo estudo realizado por Freitas (2007) o melhor protocolo da técnica

para coloração de Gram é a sequência a seguir: cristal violeta por 1 min , lavagem

com água, lugol por 1 min, lavagem com água , álcool-acetona gotejar até que não

desprenda mais a cor violeta do esfregaço, lavagem com água e fucsina 30 s.

6 MATERIAIS E MÉTODOS

Durante quatro semanas do mês de maio de 2012, realizou-se coletas de leite

para analise microbiológica na Fazenda Pé da Serra, localizada em São José dos

Pinhais. Semanalmente coletou-se 4 amostras de leite refrigerado da ordenha da

noite e 4 amostras de leite também refrigerado da ordenha da manhã. Ao final do

mês totalizou-se 32 de amostras para trabalho (16 coletas em duplicata).

Amostras com volumes de 200 mL foram coletadas em frascos de vidros

esterilizados e armazenados em caixa isotérmica com gelo até a chegada ao

laboratório no mesmo dia para processamento .

Todas as análises foram realizadas previamente para a aferição do método

com as seguintes bactérias controles: Escherichia coli ATCC 51823; Staphylococcus

aureus ATCC 6538; Salmonella Enteritidis ATCC 13076 (Figura 13).

FIGURA 13 – BANCADA ORGANIZADA PARA INÍCIO DAS ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS


Contagem de microrganismos mesófilos

A partir do leite in natura foram realizadas diluições decimais em água

peptonada a 0,1% (AP, OXOID) até a diluição 10-5 (Figura 14), sendo o leite in

natura a amostra 100. Alíquotas de 1mL de cada uma das diluições foi transferido

para placas de Petri (Figura 15) e semeados em profundidade com Agar de

contagem padrão em placas (PCA, Himedia) (Figura 16), incubado a 35°C por 48h.

A leitura das placas (Figura 17) e contagem (Figura 18) foi realizada selecionando-

se placas que continham entre 25 e 250 colônias.

FIGURA 14 – DILUIÇÕES DECIMAIS DE LEITE EM AP (10º A 10-5

), DA ESQUERDA PARA A

DIREITA.


FIGURA 15 – 1 ML DO TUBO 10º TRANSFERIDO PARA PLACA DE PETRI


FIGURA 16 - SEMEADURA EM PROFUNDIDADE COM PCA


No cálculo das contagens, o resultado final foi expresso em UFC/ mL

(unidade formadora de colônias por mililitro), levando-se em conta a diluição

empregada, da seguinte modo: R = a x 10b UFC/g ou mL (sendo: R = resultado; a =

os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9; b = expoente de 0 a

10) e realizando média entre os resultados.

FIGURA 17 - PLACAS DE AGAR PCA DAS DILUIÇÕES 10º A 10-5

, APÓS INCUBAÇÃO, PRONTAS

PARA LEITURA E CONTAGEM DE COLÔNIAS.

FONTE: o próprio autor

FIGURA18 - PLACA COM MARCAÇÃO PARA CONTAGEM DAS COLÔNIAS EM AGAR PCA

FONTE: o próprio autor

Contagem de coliformes totais

A contagem de coliformes totais foi realizada a partir das diluições citadas e o

meio utilizado para a contagem foi o Agar EMB (Himedia) incubados a 35°C por 48h,

com mesma metodologia para expressão de resultados. (Figura 19)

FIGURA 19 - SEMEADURA EM PROFUNDIDADE COM AGAR EMB


Pesquisa de coliformes fecais

A partir do crescimento em ágar EMB (Himedia), foram selecionadas 3

colônias de cada amostra processada, e inoculadas em caldo EC (Himedia) com

tubos de Duram. Incubou-se a 45°C por 48h. Foram considerados positivos os tubos

com presença de gás (Figura 20).

FIGURA 20 - TUBOS DE ENSAIO COM TUDOS DE DURAN NO INTERIOR E CALDO EC. LEITURA

DE TESTE POSITIVO ( À ESQUERDA) E TESTE NEGATIVO (À DIREITA). NOTAR PRESENÇA DE

BOLHA DE GÁS DENTRO DO TUBO DE DURAN (SETA)


Contagem de estafilococos

Alíquotas de 0,1 mL (Figura 21) a partir das diluições iniciais foram semeadas

com alça de Drigalsky (Figura 22) em Agar Baird Parker (BP, BD Difco).

FIGURA 21 – 0,1 ML DA DILUIÇÃO 10º TRANSFERIDO PARA PLACA DE PETRI COM AGAR

BAIRD PARKER


FIGURA 22 – SEMEADURA EM SUPERFÍCIE COM ALÇA DE DRIGALSKY DESCARTAVEL EM

AGAR BAIRD PARKER


Após incubadas por 24/48h a 35°C (Figura 23), foi realizada a contagem das

colônias típicas (negras com halo translúcido) e atípicas. A confirmação das colônias

típicas foi realizada através de aglutinação em látex (Staphclin Latex, Laborclin)

(Figura 24).

Figura 23 – PLACAS DE PETRI EM ESTUFA PARA INCUBAÇAO.


FIGURA 24 – AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX (STAPHCLIN LATEX, LABORCLIN) 1. TESTE POSITIVO

2. TESTE NEGATIVO


Pesquisa de Salmonella

O pré enriquecimento foi realizado através das diluições 10 -1 de cada amostra

incubadas em estufa a 37°C por 24 horas após este período foi realizado o

enriquecimento seletivo em caldo Rappaport Vassiliadis Medium (RV, Himedia)

inoculando 100 µL de cada amostra já pré enriquecida nos tubos permanecendo em

estufa a 42°C por 24h. No terceiro dia foi realizado o plaqueamento em superfície

com alça bacteriológica em Agar Verde Brilhante (BD) e XLD (Himedia) (Figura 25)

incubadas por 24h a 37°C após este período foi realizada a leitura das placas.

FIGURA 25 – ESTANTE COM TUBOS DE ENSAIO CONTENDO CALDO RV APÓS INCUBAÇÃO E

AGARES PARA PLAQUEAMENTO AVB E XLD, PLACAS DISPOSTAS A FRENTE DA ESTANTE

(ESQUERDA PARA DIREITA).


7 RESULTADOS

Abaixo na Tabela 01 são mostrados os resultados das contagens de

microrganismos mesófilos, coliformes totais e estafilococos; e presença de

coliformes fecais nas amostras de leite analisadas. Os dados da tabela 01 referem-

se as análises das coletas semanais, contando com número de 8 amostras, sendo

04 para cada turno (M) manhã e (N) noite.

TABELA 01 - RESULTADOS DAS CONTAGENS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS,

MICRORGANISMOS MESÓFILOS, COLIFORMES TOTAIS E PRESENÇA DE COLIFORMES

FECAIS DURANTE AS QUATRO SEMANAS DE AMOSTRAGEM DO LEITE RESFRIADO

ORDENHADO A TARDE E NAS MANHAS, COLETADOS DO TANQUE RESFRIADOR.

Semanas Número

amostral

Médias de contagens UFC/mL Coliformes Fecais

SA MES CT

1M 4 5,5 x103bc

1,9 x 105 1,3 x 10

4 NR

1N 4 1,0 x103bc

4,5 x 105a

1,4 x 103 NR

2M 4 1,3 x103b

6,4 x 104ab

6,0 x 103a

Positivo

2N 4 1,4 x104c

4,7 x 105a

3,3 x 103b

Positivo

3M 4 4,9 x104a

1,3 x 105 5,4 x 10

3 Negativo

3N 4 3,8 x104 7,5 x 10

4ab 6,0 x 10

3 Negativo

4M 4 1,0 x104bc

1,7 x 105 3,9 x 10

3 Positivo

4N 4 1,3 x104bc

5,7 x 104ab

2,5 x 104 Positivo

Valor p 0,001 0,02 0,02 Positivo

SA: Staphylococcus aureus; MES: microrganismos mesófilos; CT: coliformes totais; M: manhã;

N: noite; p: nível de significância estatística; NR: não realizado.

As análises estatísticas dos dados foi realizada com o programa BioStat,

2009 (AnalystSoft . Inc. USA), analise ANOVA, em análise de um fator, completo

com variável de grupo. Nivel de confiança 95%.

Quanto a pesquisa de Salmonella, as amostras resultaram em ausência em

100% das analises.

A respeito das análises microbiológicas realizadas no presente trabalho,

conforme a legislação IN 62 o limite para mesófilos é de 6,0 x 105 UFC/mL, e todos

estavam dentro do limite.

Foram agrupadas as 16 amostras coletadas no turno da noite e as 16

amostras coletadas no turno da manhã em dois grupos e realizada as analises

estatísticas para os microrganismos pesquisados. Não houve diferença estatística

entre as diferentes contagens para os dois turnos de coleta, sendo elevada a

variância entre as médias.

8 CONCLUSÕES

1- Todas as amostras estiveram dentro do padrão da legislação para

contagem em placa de mesófilos.

2- As amostras 1N e 2N apresentaram maiores números de mesófilos frente

as demais amostras.

3- Todas as amostras estavam dentro das normas quanto a ausência de

Salmonella.

4- A amostra da semana 3 coleta da manhã (3M) apresentou contagem de

Stahpylococcus aureus estatisticamente superior as demais amostras.

5- A amostra 2M obteve maior numero de coliformes totais e positividade para

presença de coliformes fecais.

6- Somente as amostras 3M e 3N foram negativas para a presença de

coliformes fecais.

REFERÊNCIAS

ANVISA, Manual de detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica.

Mód. V , 2004. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/

manuais/microbiologia/mod_5_2004.pdf> Acesso em: 31 maio 2012.

BD. Brilliant Green Agar. 2011. Instruções de utilização. Disponível em: <

http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9059> Acesso em: 30 maio 2012.

BD. Ágar de desoxicolato-lisina-xilose. 2011. Instruções de utilização. Disponível em:

< http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9086 > Acesso em: 30 maio 2012.

BORGES, M. F. Perfil de contaminação por Staphylococcus e suas enterotoxinas e

monitorização das condições de higiene em uma linha de produção de queijo de

coalho. Ciência Rural, Santa Maria, v.38, n.5,p. 1431-1438, 2008. Disponível em:

<http://www.scielo.br/pdf/cr/v38n5/a37v38n5.pdf> Acesso em: 25 maio 2012.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa

no. 051, de 18 de setembro de 2002. Diário Oficial da União, Brasília, 20 set. 2002.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa

no. 062, de 29 de dezembro de 2011. Diário Oficial da União, Brasília, 29 dez. 2011.

CARDOSO, A.L.S.P. et al. Pesquisa de Salmonella spp., Coliformes Totais,

Coliformes Fecais e Mesófilos em carcaças e produtos derivados de frango. Revista

Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 67, n.1, 2000. Disponível em:

<http://www.biologico.sp.gov.br/docs/arq/V67_1/pesquisa_salmonella.htm > Acesso

em: 30 maio 2012.

CHAPAVAL, L. et al. Cultura, Crescimento e Identificação de Bactérias do Gênero

Staphylococcus aureus em Leite de Cabra. Circular Técnica Embrapa, Sobral, CE,

41, p. 1 - 5, 2009. Disponível em: < http://www.cnpc.embrapa.br/admin/

pdf/005135001245.ct41.pdf > Acesso em: 25 maio 2012.

FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations.Principais países

produtores de leite no mundo. 2010a. Disponível em: <http://www.cnpgl.embrapa.br/

nova/informacoes/estatisticas/producao/tabela0212.php> Acesso em: 22 maio 2012.

FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations. Produção de leite

nos países da América, 2010b. Disponível em: <http://www.cnpgl.embrapa.br/nova/

informacoes/estatisticas/producao/tabela0214.php> Acesso em: 22 maio 2012.

FREITAS, V. R.; PICOLI S. U. A Coloração de Gram e as Variações na sua

Execução. Newslab - A revista do laboratório moderno, São Paulo, ed.82, p. 124-

128, 2007 Disponível em: <http://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art0

2.pdf>. Acesso em: 17 maio 2012.

GENEROSO, D; LANGONI, H. Avaliação da presença de Salmonella sp na criação

de bovinos de leite. Veterinária e Zootecnia, Botucatu, v.18, n.4, p.661-667.

Disponível em: < http://www.fmvz.unesp.br/rvz/index.php/rvz/article/view/139/159

> Acesso em: 28 maio 2012.

GUERRA, P. R. Controle de Salmonella Enteritidis em aves, através do uso de

bacterinas comerciais - Revisão de literatura. 26 p. Trabalho de conclusão em

Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

2010 Disponível em: < http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/38787/

000791976.pdf?sequence=1> Acesso em: 28 maio 2012.

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - Pesquisa da Pecuária

Nacional. Produção de leite, vacas ordenhadas e produtividade animal no Brasil,

2010a Disponível em: <http://www.cnpgl.embrapa.br/nova/informacoes/estatisticas/

producao/tabela0230.php> Acesso em: 22 maio 2012.

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - Pesquisa Trimestral do Leite.

Leite inspecionado no Brasil, 2010b. Disponível em: <http://www.cnpgl.embrapa.br/

nova/informacoes/estatisticas/producao/tabela0231.php> Acesso em: 22 maio 2012.

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - Pesquisa da Pecuária

Municipal. Ranking da Produção de Leite por Estado, 2010c. Disponível em:

<http://www.cnpgl.embrapa.br/nova/informacoes/estatisticas/producao/tabela0240.ph

p> Acesso em: 22 maio 2012.

KRIAT, M. Bactéries au microscope optique. Coloration au Gram (Pascal Fraperie),

2007 Disponível em: < http://www.geniebio.ac-aix- marseille.fr/biospip/

spip.php?article252&id_document=831#documents_portfolio> e <http://www.

geniebio.ac-aix-marseille.fr/biospip/spip.php?article252&id_document=837#

documents_portfolio> Acesso em: 01 jun. 2012.

LANNA, D. P. D.; MEDEIROS, S. R. Manipulação da composição do leite e do

metabolismo de nutrientes usando isômeros do ácido linolêico conjugado (ALC). . In:

SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE QUALIDADE DO LEITE, 2, 2002, Curitiba.

Anais. Curitiba, 2000. p. 78 - 84

LORENZETTI, D. K. Influência do tempo e da temperatura no desenvolvimento de

microrganismos psicrotróficos no leite cru de dois estados da região Sul. 62 p.

Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal do

Paraná , Curitiba, 2006. Disponível em: <

http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/handle/1884/4115/DAYANE%20KARINA

%20LORENZETTI.pdf;jsessionid=5504459E2FFD5FDA635AC228EA5F7994?seque

nce=1> Acesso em: 31 maio 2012.

NERO, L. A. Listeria monocytogenes e Salmonella spp. em leite cru produzido em

quatro regiões leiteiras no Brasil: ocorrência e fatores que interferem na sua

detecção. 141 p. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo , Faculdade de

Ciências Farmacêuticas, São Paulo, 2005. Disponível em:

<http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9131/tde-09052005-174614/pt-br.php>

Acesso em: 28 maio 2012.

OHI, M. et al. Princípios básicos para produção de leite bovino. Curitiba, Imprensa

da UFPR, 2010.

OLIVEIRA, R. P. S. Condições microbiológicas e avaliação da pasteurização em

amostras de leite comercializadas no município de Piracicaba-SP. 97p. Dissertação

(Mestrado em Ciências) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, São Paulo,

2005. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11141/tde-

18072005-164621/pt-br.php > Acesso em: 31 maio 2012.

PERAZZOLO, L. M. Coloração de Gram: princípios e características. Santa Catarina:

Disciplina de Biologia Celular da UFSC. 7 f. Notas de aula, 2006. Disponível em:

<http://www.liaaq.ufsc.br/aulas/Gram%20complemento.PDF> Acesso em: 17 maio

2012.

SANTANA, E. H. W. et al. Estafilococos: morfologia das colônias, produção de

coagulase e enterotoxina a, em amostras isoladas de leite cru refrigerado. Semina:

Ciências Agrárias, Londrina, v. 27, n. 4, p. 639-646, 2006. Disponível em:

<http://www.uel.br/revistas/uel/index.php/semagrarias/article/view/2522/2165>

Acesso em: 25 maio 2012.

SANTOS, A. K. R. Comparação entre os meios de cultura Baird-Parker, Bairdparker

– RPF e Petrifilmtm Staph Express na detecção de Staphylococcus coagulase

positivo em leite cru naturalmente contaminado e em leite esterilizado inoculado com

culturas específicas. 53 p. Dissertação de Mestrado em Ciência Animal - Escola de

Veterinária da UFMG, Belo Horizonte, 2008 Disponível em: <http://www.

bibliotecadigital.ufmg.br/dspace/bitstream/1843/SSLA-7USP6M /1/disserta__ o_

andr_ia_santos.pdf> Acesso em: 25 maio 2012.

SHINOHARA, N. K. S. et al. Salmonella spp., importante agente patogênico

veiculado em alimentos. Ciência & Saúde Coletiva, Rio de janeiro, v.13, n.4, p. 1675-

1683, 2008. Disponível em: < http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_

arttext&pid =S1413-81232008000500031> Acesso em: 28 maio 2012.

SILVA JR, E. A. Manual de controle higiênico - sanitários em serviços de

alimentação. 6. ed. São Paulo: Livraria Varela, 1995.

SILVEIRA, D. et al. Comportamento de Salmonella sorotipo Typhimurium em doce

de leite pastoso. In: XX CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTIFICA, 20, 2011,

Pelotas. Anais. Pelotas: UFPEL , 2011. Disponível em: < http://www.ufpel.edu.br/

cic/2011/anais/pdf/CA/CA_01249.pdf> Acesso em: 28 maio 2012.

TOLEDO, P. S. Descrição do comportamento da capa de Salmonella enteritidis pt4

frente ao tratamento térmico a 60,0ºC por três minutos e meio, em ovo integral

pasteurizado desidratado reconstituído. 95 p. Dissertação (Mestrado em Medicina

Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de

São Paulo, Toledo,2003. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/

disponiveis/10/ 10134/tde-14052004-083711/pt-br.php > Acesso em: 28 maio 2012.

TRONCO, V. M. Manual para inspeção da qualidade do leite. 4. ed. Santa Maria:

Editora UFSM, 2010.

PVL. Disponível em: < http://www.pvl.pt/pt/produto/38_46+184/baird-parker-agar-

base-bk055/> Acesso em: 29 maio 2012.

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