Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no melhoramento

genético e proteção de cultivos

Prof. Dr. Felipe dos Santos Maraschin

Laboratório de Fisiologia Vegetal – Instituto Biociências UFRGS

Porto Alegre, RS

Plasmídeos vegetais

• Sistema de expressão transiente de amplo espectro – Simples administração

– Não transgênico

– Sem necessidade de cultura in vitro ou agentes de seleção

– Superexpressão constitutiva ou induzível, estável e duradoura

– Não herdável e não transmissível

TYLCV

• Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)

• Geminivirus (ssDNA circular)

• Patógeno de diversas culturas pelo mundo

• Transmitido por Bemisia tabaci “whitefly”

Ciclo de um Geminivirus

TYLCV

• Genoma circular ssDNA 6 ORFs

• Região intergênica (IR) contém elementos para replicação pelo hospedeiro e funciona como um promotor bidirecional

• Proteínas do hospedeiro geram novas cópias dsDNA

• A proteína C1 é essencial para a produção de novos genomas ssDNA por replicação “rolling circle”

• A proteína V1 codifica o capsídeo (CP) e é essencial para transmissibilidade

• As proteínas V2, C2, C3 e C4 estão envolvidas na mobilidade viral, aparição de sintomas e na severidade da doença

• Em suma, cinco ORFs não estão envolvidas na replicação e expressão do vírus

Modificação do vírus

• As proteínas do capsídeo viral V1, V2 estão envolvidas no movimento do vírus dentro da planta

• TYLCV inoculados mecanicamente não causam infecção

• Um isolado israelense (GenBank X15656) é capaz de causar infecção com inoculação mecânica

• Remoção de 20 aa (60nt) N-terminais da proteína V1 (CP) tornou o vírus incapaz de gerar sintomas. Entretanto esta versão que é capaz de multiplicar-se e espalhar-se nos tecidos vegetais foi denominada IL-60

• TYLCV é funcional somente com pequenos insertos

O sistema de expressão • Uma célula expressando V1,V2 replica autonomamente dsDNA contendo a

IR.

• Um plasmídeo contendo IR é capaz de se auto-propagar em células vegetais como um plasmídeo

• ssDNA não é produzido e capsídeos virais não podem ser produzidos

• O vetor pode ser propagado em E coli

• O gene de interesse é colocado em um plasmídeo “satélite” que possui a região IR como promotor (p-IR).

• A administração plasmídeo helper p1470 “ativa” a propagação do plasmídeo satélite

helper

Satélite (expressão)

Ciclo do plasmídeo vegetal

X

X

X

X Outras células

Expressão de genes exógenos

• Inicialmente a expressão é limitada ao floema, e após alguns dias passa a espalhar-se para outros tecidos.

DNA

Silenciamento gênico

• Expressão de dsRNA formando hairpin para silenciamento do gênico.

• Expressão do operon prnABCD de Pseudomonas fluorescens em tomate.

• Formação de um único mRNA policistrônico e acúmulos do composto funcional pyrrolnitrina.

• O acúmulo de pyrrolnitrina confere resistência à infecção por R. solani.

Vantagens do sistema

• Facilidade: miniprep de 2 plasmídeos administrados mecanicamente na planta hospedeira. Somente uma clonagem é necessária

• Altos níveis de expressão: comparáveis a CaMV::35S

• Universalidade de hospedeiros

• Estratégia não transgênica e com reduzidos riscos de biossegurança. USDA – Non GMO!!!

• Limitação de fluxo gênico

• Aplicação em espécies de difícil transformação

• Expressão de operons sem a necessidade de transformação plastidial, rotas metabólicas co-expressas

Resultados preliminares - UFRGS

Tabaco Arroz Eucalipto

Macieira Videira

Projetos em colaboração

• Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves, RS

• Resistência à sarna da maçã (Apple scab)

MSc.Roberta Cusin

Sarna da maçã

• Causada pelo ascomiceto Venturia inaequalis

• Predominante em clima úmido temperado

• Causa perdas de até 100% nos pomares

• Quatro aplicações de fungicidas mais tratos culturais perfazem 20% do custo de produção

• Fuji, Gala e Golden delicious são muito sucetíveis.

Variedades resistentes à sarna

• Vários acessos de germoplasma de Malus são resistentes à sarna

• A resistência já foi mapeada e um gene, Vf2 oriundo de Malus floribunda, foi demonstrado como o responsável pelo fenótipo resistente

• A introgressão genética nas variedades cultivadas pode levar décadas (até 20 anos)

Mecanismo de resistência

• Interação gene-a-gene

• Proteínas R reconhecem efetores do patógeno (Avr genes)

• Reconhecimento por uma proteína LRR identificada como Vf2

Viabilizar a introgressão imediata do gene de resistência nas variedades suscetíveis Fuji e Gala

• Clonagem do gene Vf2 de Malus floribunda

• Tratamento plantas Fuji e Gala com o gene de resistência

• Genotipagem

• Análise da expressão

• Testes de patogenicidade

Resultados

Amostragens

15 e 30 dias – detecção DNA plamidial

240 dias – análise expressão gênica

Abril 2015

Expressão do gene de resistência nas plantas tratadas

Macierias Gala e Fuji resistentes à sarna

Modulação da expressão de gênica para obtenção de uvas apirênicas

• Jaiana Malabarba – Doutoranda PPGBCM-UFRGS

Orientação Giancarlo Pasquali e Luis Fernando Revers

Fator de transcrição MADS

• Presente em um QTL para apirenia em videira

• MADS Box, gene candidato

Modulação da expressão gênica

• Superexpressão: Variedades apirênicas

• Silenciamento:Variedades com sementes

Resultados

• A superexpressão restaurou parcialmente a formação de sementes em variedades apirênicas

100-200 fold increase!

Resultados

• O silenciamento por RNAi suprimiu a produção de sementes em variedades com sementes

Agradecimentos

• Roberta Cusin

• Jonata Ribeiro

• Jaiana Malabarba

• Vitor Falavigna

• Luis Fernando Revers, Embrapa

• Sílvio André Meirelles Alves, Embrapa

• Diogo Porto, Embrapa

• Márcia Margis, UFRGS

• Rogério Margis, UFRGS

Felipe dos Santos Maraschin

felipe.maraschin@ufrgs.br

MUITO OBRIGADO!