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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA
Utilização de Membranas de Poli (L-ácido láctico) em Regeneração Tecidual Guiada para
Periodontia
Autor: Lucas Alves Moura Orientadora: Eliana Ap. Rezende Duek
63/2007
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS
Utilização de Membranas de Poli (L-ácido láctico) em Regeneração Tecidual Guiada para
Periodontia Autor: Lucas Alves Moura Orientadora: Eliana Ap. Rezende Duek Curso: Engenharia Mecânica Área de concentração: Engenharia de Materiais e Processos de Fabricação
Dissertação de mestrado acadêmico apresentada à comissão de Pós Graduação da Faculdade de Engenharia Mecânica, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica.
Campinas, 2007 SP – Brasil
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA - BAE - UNICAMP
M865u
Moura, Lucas Alves Utilização de membranas de poli (L-ácido láctico) em regeneração tecidual guiada para periodontia / Lucas Alves Moura. --Campinas, SP: [s.n.], 2007. Orientador: Eliana Aparecida de Rezende Duek Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica. 1. Biomateriais. 2. Polímeros na medicina. 3. Ossos - Regeneração. 4. Periodontia. I. Duek, Eliana Aparecida de Rezende. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III. Título.
Título em Inglês: Use of poly (L-lactic acid) membranes in guided tissue
regeneration for periodontology Palavras-chave em Inglês: Biomaterial, Poly (L-lactic acid), Guided tissue
regeneration, Periodontal Área de concentração: Materiais e Processos de Fabricação Titulação: Mestre em Engenharia Mecânica Banca examinadora: Célia Marina de Alvarenga Freire e Arnaldo Rodrigues dos
Santos Junior Data da defesa: 10/07/2007 Programa de Pós-Graduação: Engenharia Mecânica
iv
Dedicatória:
Dedico este trabalho a:
Os meus amados pais, Antonio Carlos e Regina Moura, que me forneceram conhecimento,
condições e incentivo nesta empreitada longe de casa;
A minha irmã Carolina que sempre torceu por mim;
A minha querida Vanessa, que me motivou em todos os momentos.
v
AGRADECIMENTOS
Este trabalho não poderia ter sido terminado sem a ajuda de certas pessoas a quem presto
minha homenagem:
A Deus por me proteger e iluminar;
À Profª Draª Eliana Duek, minha orientadora, que me ajudou e inspirou em todos os
momentos desta pesquisa;
Às minhas amigas do laboratório de Campinas que me ensinaram e ajudaram tanto,
Márcia Tomaz e Grazielle Baraúna;
Aos meus Amigos do laboratório de Sorocaba: Denis Bastiton, que me auxiliou nas
cirurgias dos animais, Carolina Lucchesi, que realizou os testes de DSC de minhas amostras e à
Kátia Fernanda;
A Claudinete e ao José Luís que me ajudaram nos MEVs e no ensaio mecânico;
À família da Vanessa que tanto me apoiou nestes anos aqui em Campinas.
Meu muito obrigado; Lucas Alves Moura.
vi
Aprender é a única coisa de que a mente nunca
se cansa, nunca tem medo e nunca se
arrepende.
Leonardo da Vinci
vii
RESUMO
MOURA, Lucas Alves, Utilização de membranas de Poli (L-ácido láctico) em regeneração tecidual guiada para Periodontia, Campinas,: Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, 2007. 67p. Dissertação (Mestrado).
A regeneração tecidual guiada (RTG) é uma técnica utilizada na Periodontia para permitir a
neoformação de um novo aparato de inserção periodontal do dente (osso alveolar, ligamento
periodontal e cemento). Na Periodontia, a utilização de polímeros biorreabsorvíveis vem
ganhando confiabilidade e importância devido a não necessidade de uma segunda intervenção
cirúrgica para remover a membrana, porém poucas membranas atendem a todos os critérios da
RTG, que são biocompatibilidade, exclusão celular, manutenção do espaço a ser regenerado,
integração à atividade tecidual, facilidade de utilização e atividade biológica. Um polímero
biorreabsorvível muito estudado é o poli (L-ácido láctico) (PLLA), porém ele é polímero
semicristalino muito rígido e com longo período de degradação, contudo ao se adicionar em sua
composição um plastificante, o tri-etil-citrato, a membrana resultante seria mais flexível,
microporosa e teria seu tempo de degradação reduzido. Esta pesquisa avaliou, através de estudo
in vivo, a resposta inflamatória e a manutenção de um espaço vital para a regeneração óssea sob
membranas de PLLA/tri-etil-citrato, em três diferentes proporções polímero/plastificante,
implantadas na calota craniana de coelhos, analisando, assim, a capacidade destas membranas em
se adaptar aos critérios da RTG periodontal. Paralelamente ao estudo in vivo, foram realizados
estudos da degradação in vitro, com ensaios mecânicos de tração, de microscopia eletrônica de
varredura e de calorimetria diferencial de varredura (DSC). Notou-se que as membranas de
concentração PLLA/tri-etil-citrato de 85/15 apresentaram características mais adequadas para a
RTG periodontal tanto no estudo in vivo quanto no in vitro.
Palavras-chave:
- Biomaterial, Poli (L-ácido láctico), Regeneração Tecidual Guiada, Periodontia
viii
Abstract
MOURA, Lucas Alves, Use of Poly (L-lactic acid) Membranes in Guided Tissue Regeneration
for Periodontology, Campinas,: Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual
de Campinas, 2007. 67p. Dissertação (Mestrado)
Guided tissue regeneration (GTR) is a technique used in the periodontal practice to allow
the neoformation of a new apparatus of teeth periodontal attachment (alveolar bone, periodontal
ligament and cementum). In Periodontology, the use of bioresorbable polymers is gaining
trustworthiness and importance due the non required second surgical intervention to remove the
membrane, however few membranes fit in all GTR criteria, which are biocompatibility, cellular
exclusion, space maintainer, integration to tissue activity, easy usage and biological activity. A
bioresorbable polymer very studied is poly(L-lactic acid) (PLLA), however it is a very rigid
semicrystalline polymer and with a long degradation period, but by adding in its composition a
plasticizer, the tri-ethyl-citrate, the resultant membrane would be more flexible, microporous and
would have its degradation time reduced. This research evaluated, through in vivo study, the
inflammatory response and the maintenance of a vital space for bone regeneration under
PLLA/tri-ethyl-citrate membranes, in three different polymer/plasticizer proportions, implanted
in rabbits calvarial bone, analyzing, thus, the capacity of these membranes in adapting to the
criteria of periodontal GTR. Simultaneously to this study, it had been carried out studies of in
vitro degradation, with mechanical testing, scanning electronic microscopy and differential
scanning calorimetry (DSC). It was observed, that the highest concentration membranes
PLLA/tri-ethyl-citrate (85/15) showed themselves more adequate characteristics for the
periodontal GTR on in vivo study as well on in vitro.
Keyword:
- Biomaterial; Poly(L-lactic acid); guided tissue regeneration; Periodontal.
ix
Índice
Lista de figuras ............................................................................................................. XI
Lista de tabelas ............................................................................................................ XII
Nomenclatura .............................................................................................................. XIII
Introdução ...................................................................................................................... 1
Revisão bibliográfica .................................................................................................... 3
2.1 Polímeros biorreabsorvíveis .................................................................................................... 4
2.2. O periodonto .......................................................................................................................... 10
2.3. Regeneração tecidual guiada (RTG) na periodontia ......................................................... 14
Materiais e métodos .................................................................................................... 19
3.1. Preparo e caracterização das membranas de PLLA .......................................................... 19 3.1.1. Caracterização das amostras ............................................................................................. 20
3.2. Estudo da degradação hidrolítica ........................................................................................ 20 3.2.1 Análises e ensaios de caracterização das amostras ........................................................... 20
3.3. Animais ................................................................................................................................... 22
3.4. Procedimento cirúrgico ......................................................................................................... 22
3.5. Processamento do material ................................................................................................... 24
3.6. Preparação das lâminas ........................................................................................................ 25 3.6.1. Análise histológica ........................................................................................................... 26
x
3.6.2. Parâmetros qualitativos .................................................................................................... 26 3.6.3. Parâmetros quantitativos .................................................................................................. 26
Resultados e Discussão ............................................................................................. 27
4.1 Estudo in vitro ......................................................................................................................... 27 4.1.1 Avaliação macroscópica .................................................................................................... 27 4.1.2 Avaliação por microscopia eletrônica de varredura .......................................................... 28 4.1.3 Ensaio mecânico de tração ................................................................................................ 32 4.1.4 Calorimetria diferencial de varredura (DSC) .................................................................... 37
4.2 Estudo in vivo .......................................................................................................................... 44 4.2.1 Avaliação macroscópica .................................................................................................... 44 4.2.2 Avaliação microscópica .................................................................................................... 45
Conclusões .................................................................................................................. 59
Sugestões para Próximos Trabalhos ........................................................................ 60
Referências Bibliográficas .......................................................................................... 61
xi
Lista de Figuras Figura 1. Fórmula estrutural dos poli α-hidróxi ácidos. ................................................................... 5 Figura 2. Esquema da polimerização do anel diéster cíclico. .......................................................... 6 Figura 3. Esquema simplificado da degradação do Poli (ácido láctico). ......................................... 8 Figura 4. Hidrólise da ligação éster. ................................................................................................. 8 Figura 5. Destruição do osso alveolar. ........................................................................................... 12 Figura 6. Simulação de como age a membrana de RTG. ............................................................... 15 Figura 7. (A) Agitação magnética da mistura PLLA, tri-etil-citrato e dicloro-metano; (B) cuba de vidro saturada por solvente. ........................................................................................................... 20 Figura 8. Equipamento Material Testing Systems (MTS) modelo 810 .......................................... 21 Figura 9. Seqüência cirúrgica na calvária de coelhos. ................................................................... 24 Figura 10. Membranas de PLLA/Tri-etil-citrato degradadas ......................................................... 28 Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da superfície de membranas de PLLA/tri-etil-citrato. ............................................................................................................................................. 29 Figura 12. Micrografias eletrônicas de varredura da fratura de membranas de PLLA/tri-etil-citrato. ............................................................................................................................................. 30 Figura 13. Fotomicrografias eletrônicas de varredura das membranas de PLLA/tri-etil-citrato ... 31 Figura 14 Curvas de Tensão x Deformação. .................................................................................. 33 Figura 15. Curvas de Tensão x Deformação .................................................................................. 34 Figura 16. Termogramas a partir de DSC. ..................................................................................... 37 Figura 17 Termogramas a partir de DSC ....................................................................................... 38 Figura 18. Termogramas a partir de DSC ...................................................................................... 38 Figura 19. Observação macroscópica das calotas cranianas de coelho. ......................................... 45 Figura 20. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15 ..................................... 46 Figura 21. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 80/10 ..................................... 47 Figura 22. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 ....................................... 48 Figura 23. Fotomicrografa do defeito controle. ............................................................................. 49 Figura 24. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15. ...................................... 50 Figura 25. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10. ...................................... 51 Figura 26. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 ......................................... 52 Figura 27. Fotomicrografa do defeito controle .............................................................................. 53 Figura 28. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 ....................................... 55 Figura 29. Fotomicrografia do defeito controle. ............................................................................ 55 Figura 30 Fotomicrografia do defeito contendo membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 ............. 56
xii
Lista de Tabelas Tabela 1. Ensaio mecânico de tração para as amostras em função do tempo de degradação. ....... 36 Tabela 2. Dados do primeiro aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15. .......... 42 Tabela 3. Dados do segundo aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15. ........... 43 Tabela 4. Avaliação da regeneração óssea nos grupos de estudo. ................................................. 57
xiii
Nomenclatura Tg – Temperatura de transição vítrea (ºC) Tc – Temperatura de cristalização (ºC) Tm – Temperatura de fusão (ºC) Mw – Massa molar ponderal média (Daltons) ΔHM – Entalpia de fusão experimental (J/g) ΔHC – Entalpia de cristalização experimental (J/g) ΔH – Variação de entalpia (J/g) GC – Grau de cristanilidade (%) Letras gregas χ - Grau de Cristanilidade (%) Abreviações ASTM – American Society of Testing Materials CO2 – Dióxido de carbono (gás carbono) Da – Daltons DMC – Diclorometano DSC – Calorimetria diferencial de varredura H2O – Água KV – Quilovolts MEV – Microscopia eletrônica de varredura MO – Microscopia óptica MPa – Megapascal N – Newton PBS – Solução tampão fosfato salina PDLA – poli(D-ácido láctico) PLA – poli(ácido láctico) PLLA – Poli(L-ácido láctico) PDLLA – Poli(L-DL-ácido láctico) PGA – poli (ácido glicólico) PTFE-e – Poli-tetrafluoretileno expandido RTG – Regeneração tecidual guiada
1
Capítulo 1
Introdução
A regeneração periodontal é definida como regeneração dos tecidos de suporte do dente,
incluindo osso alveolar, ligamento periodontal e cemento. A regeneração tecidual guiada (RTG) é
uma técnica que envolve a utilização de membranas, para permitir a repopulação do defeito
periodontal por células desejáveis, resultando no chamado novo aparato de inserção (Warrengton,
2004). As células que podem repovoar a superfície radicular após uma cirurgia de retalho são as
células oriundas do epitélio gengival, do osso alveolar e do ligamento periodontal.
A procura por materiais apropriados para aplicações no periodonto levou pesquisadores a
desenvolverem e testar novos materiais que não necessitassem de uma segunda intervenção
cirúrgica. Com isso, iniciaram-se estudos de uma família de polímeros muito atrativa e
promissora, os α-hidróxi ácidos, pois além de biorreabsorvíveis, eles também são biocompatíveis,
podendo ser utilizados em diversas aplicações na área médica. Implantes de polímeros
biorreabsorvíveis são utilizados em diversas aplicações, como suporte para cultura de células,
órgãos e peles artificiais, suturas cirúrgicas, liberação controlada de drogas e reparos ortopédicos
(Davis & Vacanti, 1996; Furukawa, 2000).
O PLA está presente em várias formas estéreo-isométricas e a mais importante sendo o poli
(L-ácido-láctico) (PLLA). Este polímero é metabolizado em ácido láctico e excretado no ciclo de
Krebs. Dados seus graus de biocompatibilidade e degradação, o PLLA é bem tolerado pelo
organismo, podendo ser utilizado não apenas como uma barreira ou substituinte físico, mas
também favorecendo a regeneração óssea e tecidual (Lolito et al., 2002).
2
Estas substâncias são biocompatíveis e quando implantadas no organismo são degradadas
primeiramente por hidrólise e finalmente pelo metabolismo do ciclo de Krebs, liberando CO2 e
água (Cordewerner et al., 1995; Pezzin & Duek, 2002), além de apresentar ótimas características
físicas, alta resistência mecânica quanto à compressão e tração, comportamento termoplástico e
disponibilidade de fonte renovável (Gajaria, 1996).
Para que se possam utilizar esses materiais para implantes em seres humanos, é necessária,
primeiramente, uma avaliação precisa do dispositivo, a fim de satisfazer uma série de exigências
para suas aplicações como, por exemplo, apresentar biocompatibilidade, não provocando um
processo inflamatório agudo ou crônico em tecidos adjacentes (Ambrosio et al., 2003; Rhee,
2004).
A possibilidade de controlar a flexibilidade e o tempo de degradação de membranas para a
RTG periodontal é uma das principais vantagens da membrana de PLLA em relação às demais
comercialmente utilizadas. O principal problema relacionado com o uso das membranas
comerciais é que a precoce reabsorção das mesmas, associada com a falta de rigidez de sua
estrutura pode ocasionar o colapso das membranas para o interior dos defeitos ósseos,
interferindo, deste modo, no processo regenerativo.
Baseado nessas informações e nos resultados obtidos pelo grupo em estudos com
membranas de PLLA com plastificante, no qual se obteve um controle do tamanho dos poros e do
tempo de degradação das membranas em função da concentração de plastificante (Scapin et al.,
2003), observou-se que o material resultante desse estudo tem apresentado propriedades
adequadas para aplicação em RTG periodontal.
O propósito deste trabalho foi avaliar as características de membranas de PLLA com
plastificante (tri-etil-citrato), em diferentes proporções in vitro e in vivo, através de estudos em
calvária de coelhos.
3
Capítulo 2
Revisão Bibliográfica
O avanço tecnológico e científico na área da saúde se deu graças ao desenvolvimento de
novas técnicas e materiais que melhor atenderam determinadas funções. Como por exemplo, o
desenvolvimento de próteses ortopédicas/odontológicas a partir do titânio, materiais para
reconstrução crânio-maxilofacial à base de biocerâmicas e a reconstrução de tecidos moles a
partir do emprego de biomateriais poliméricos biorreabsorvíveis (Donos et al., 2005).
2.1 Biomateriais
Um material biocompatível pode ser definido como aquele que uma vez implantado no
organismo, não provocará uma resposta tecidual exacerbada, tal como uma diferenciação
desapropriada dos tecidos circunjacentes ao implante (Schaldach, 2000).
Os requisitos médicos para considerar um material como biomaterial são restritos, pois o
material a ser implantado, enquanto restaura a função comprometida, deve também garantir que
não haja, a longo ou médio prazo, qualquer distúrbio no organismo do paciente (Schaldach,
2000).
Alguns fatores devem ser levados em consideração para a escolha e utilização do
biomaterial como o limite de tolerância que o tecido apresenta no que se refere à remoção dos
produtos de degradação, visto que se este for excedido, poderão ocorrer respostas inflamatórias
indesejáveis no tecido, diminuição do tempo de vida útil do dispositivo, reabsorção óssea ou
4
mesmo necrose do tecido. Os biomateriais mais empregados atualmente são os metálicos,
cerâmicos e poliméricos (Pistner et al., 1993).
Os dispositivos metálicos apresentam uma grande dureza e resistência quando
confrontados às características dos tecidos humanos, são comumente utilizados como dispositivos
para fixação interna de fraturas. As vantagens destes implantes são basicamente: um curto
período de recuperação e a exata reposição do osso faturado. Entretanto há inúmeras
desvantagens como possível estresse do osso e relativa osteoporose, devido a ausência de
funcionamento e transmissão de cargas pelo local do implante; reações alérgicas contra diferentes
componentes do metal (Steinhauser, 1968; Bradley et al., 1979) problemas de corrosão (Cohen &
Wulf, 1972) sensibilização térmica (Weiler et al., 1996) e em caso de dispositivos temporários,
existe, muitas vezes, a necessidade de uma segunda cirurgia para a remoção do implante.
Estes problemas praticamente deixam de existir quando se trata de implantes poliméricos
biorreabsorvíveis, que vem a ser implantes que cumprem somente uma função temporária no
organismo, uma vez que assim que o tecido ou órgão se regeneram eles degradam por ação dos
fluidos orgânicos.
2.1 Polímeros biorreabsorvíveis
O critério para seleção de um polímero para uso com biomaterial envolve dois fatores: as
propriedades mecânicas e o tempo de degradação em função das necessidades de aplicação
(Middleton & Tipton, 2000). Um polímero ideal para uso com biomaterial biorreabsorvível deve
apresentar as seguintes características: não provocar respostas inflamatórias acima do normal no
tecido implantado; ser metabolizado pelo organismo após ter cumprido sua função; ser
processado em um produto final de forma fácil e ser facilmente esterilizável.
Polímeros sintéticos bioabsorvíveis normalmente mimetizam moléculas naturais, como
proteínas e celulose, pois esses polímeros contem ligações hidrolisáveis ao longo de sua cadeia
susceptíveis a biodegradação por microorganismos ou enzimas hidrolíticas.
Embora muitos grupos de polímeros venham sendo estudados por suas propriedades
biodegradacionais, a família dos α-hidróxi ácidos são os mais estudados e com melhores
resultados tanto fisiológicos quanto mecânicos.
5
Dentre os poli α-hidróxi ácidos, o poli (ácido láctico) (PLA) e o poli (ácido glicólico)
(PGA) são os mais utilizados. O campo de aplicação destes polímeros é vasto como implantes
(Kulkarni et al., 1996); materiais de sutura (Cutright et al., 1971); próteses, materiais de
reparação ortopédica (Rozema et al., 1991); pinos intramedulares (Manninen et al., 1992); na área
odontológica (Zislis et al., 1989) e em liberação controlada de fármacos (Domb et al., 1994).
Estes polímeros biorreabsorvíveis, brevemente, irão substituir implantes metálicos, devido suas
várias vantagens sobre estes: não criam pontos de estresse; não há a necessidade de sua remoção
após a cirurgia; e não apresentam corrosão metálica (Chen et al., 2003).
Os poli α-hidróxi ácidos possuem a capacidade de degradar em meio aos fluidos
corpóreos devido às cisões hidrolíticas de suas ligações ésteres (Dittrich, 1971). A fórmula
estrutural dos poli α-hidróxi ácidos é exibida abaixo na Figura 1.
Figura 1. Fórmula estrutural dos poli α-hidróxi ácidos. PLA quando R=CH3 e PGA quando R=H. No caso do poli (ácido láctico) a quiralidade de carbono α permite a síntese de dois
enantiômeros, o poli (D-ácido láctico) (PDLA) e o poli (L-ácido láctico) (PLLA).
Segundo Dittrich (1971), esses materiais têm diferentes propriedades, como, por exemplo,
suas velocidades de degradação, pois o grupo metila é responsável por dois efeitos na cinética de
biodegradação: o aumento da hidrofilicidade, e o impedimento estérico na reação de hidrólise. A
cinética hidrolítica do PDLA tem sido verificada mais rápida do que em seu análogo, o PLLA
(Gilding, 1981).
O poli (L-ácido láctico) (PLLA) é um polímero semicristalino com ponto de fusão em
torno de 180ºC e uma cristanilidade por volta de 70%, tornando sua degradação mais lenta em
relação aos demais poli (lactides). Esses polímeros podem ser sintetizados a partir da abertura do
anel de diésteres cíclicos na presença de catalisadores (Figura 2) (An et al., 2000). As
O
H R
O
O
R H
O
O
H R
O
O
H R
O
O
6
propriedades mecânicas apresentadas por este polímero são muito boas, já que apresentam uma
boa resistência à tração e um alto módulo de Young (Vert et al., 1994).
Figura 2. Esquema da polimerização do anel diéster cíclico para obtenção do poli α-hidróxi ácido.
Algumas técnicas possibilitam analisar as características do processo de degradação
desses polímeros. Com a calorimetria diferencial de varredura (DSC), obtém-se a cristanilidade e
a temperatura de transição vítrea do polímero (Göpferich et al., 2000); com a microscopia
eletrônica de varredura (MEV), obtém-se a morfologia externa do polímero e do tecido ao redor
do implante. Através da microscopia óptica (MO), podem-se observar as células envolvidas na
reação ao implante. Os ensaios mecânicos de tração possibilitam avaliar o comportamento
mecânico do implante (Jones, 1999; Shalaby, 1998).
De acordo com Vert et al.. (1994) pode-se definir biodegradação como o processo de
perda de massa, ou degradação das cadeias macromoleculares sem a eliminação dos produtos e
subprodutos pelo organismo. Bioabsorção é o conceito associado aos materiais que são
dissolvidos, sem clivagem da cadeia polimérica, em fluidos corpóreos. Por último, polímeros
biorreabsorvíveis são aqueles que quando implantados sofrem primeiramente quebra de suas
cadeias e posteriormente eliminação de seus subprodutos por vias metabólicas do corpo.
A degradação do polímero é um fator importante, pois determina o tipo e a intensidade da
resposta biológica ao implante, já que a ocorrência de partículas poli, oligo e monoméricas
liberadas durante a degradação do polímero in vivo está diretamente correlacionada com uma
mudança no tipo e intensidade da resposta inflamatória. Isso pode ser causado por produtos
tóxicos provenientes da degradação ou pela mudança na rugosidade superficial e forma do
implante durante a liberação de fragmentos. Além disso, a própria fagocitose dos fragmentos atua
como um importante fator na modificação da resposta inflamatória. A fagocitose modifica o
processo funcional do macrófago, que é o pivô na resposta inflamatória no tecido e na reação de
7
corpo estranho. As células gigantes observadas nesta fase são formadas pela fusão de
macrófagos. A fagocitose de fragmentos também pode causar a morte celular e a liberação do
conteúdo destas células mortas pode causar uma reação inflamatória aguda. (Hyon, 1985; Lam et
al., 1995).
O processo de degradação hidrolítica pode ser caracterizado pela redução da massa molar,
perda de tensão e perda de massa, simultaneamente. Primeiro, a água infiltra pelo polímero e
ataca suas cadeias poliméricas causando sua cisão por hidrólise. Isso ocorre in vivo, havendo ou
não atividade enzimática. Essa degradação ocorre mesmo com a umidade do ar, se o polímero
não for armazenado em condições adequadas (Li et al., 1990; Pistner et al., 1993).
Perdas de tensão e de massa vão ocorrendo gradativamente, mas não linearmente, sendo
maior no início do processo enquanto ocorre uma invasão de macrófagos e células gigantes que
dão início a fagocitose das partículas degradadas. Finalmente, os macrófagos e células gigantes
desaparecem, restando possivelmente um remanescente de cápsula fibrosa. A região onde existia
o implante fica preenchida temporariamente por tecido conjuntivo (Mikos et al., 1998).
Silva et al. (2002), observaram a presença de células gigantes a partir do sétimo dia de
implante. Estas células são originadas a partir da fusão de diversos macrófagos, em um processo
induzido por citocinas tais como interleucina 4 e interferon-gama. Estas células agem geralmente
em reações contra corpos estranhos no organismo, e apresentam um grande número de
mitocôndrias, o que pode estar associado com a degradação do PLLA via ciclo de Krebs.
Com a quebra das cadeias há a formação de partículas menores que poderão ser fagocitadas
por macrófagos, a digestão celular é realizada seguindo os caminhos normais estabelecidos pela
célula através de suas atividades usuais e os produtos oxidados finais são de semelhantes aos
presentes no organismo, tais como água e dióxido de carbono, excretados pelos rins e pelos
pulmões (Ali et al., 1993).
Segundo Bostman (1991), há uma excelente biocompatibilidade dos poliésteres, pois os
produtos da biodegradação metabólica do poli (ácido láctico) (CO2 e H2O) são reabsorvidos pelo
organismo. Neste caso, a degradação metabólica do PLA segue o processo de oxidação do ácido
láctico, que por sua vez é convertido em ácido pirúvico. Na presença da acetil-coenzima A,
ocorrerá liberação de CO2 e consequentemente a decomposição em citrato. Este citrato será então
incorporado no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, que no final eliminará novamente CO2 e H2O,
conforme o esquema mostrado na Figura 3.
8
Figura 3. Esquema simplificado da degradação do Poli (ácido láctico).
O mecanismo de degradação do PLA tem sido avaliado nos últimos anos e demonstrou ser
heterogêneo. A presença de terminais ácidos catalisa a reação de degradação. Inicialmente, o
processo é homogêneo, gerando oligômeros solúveis em água em toda a extensão do material. Os
produtos presentes na superfície da matriz são difundidos para o meio, entretanto, a baixa taxa de
difusão dos produtos da reação no interior do material gera um acúmulo de ácidos, fazendo com
que estruturas densas tenham uma erosão inicial na superfície, mas apresentando uma degradação
mais acentuada no centro. É o chamado efeito autocatalítico dos poli α-hidróxi ácidos. A
degradação pode prosseguir por um processo biologicamente ativo (por enzimas dos fluidos
orgânicos) ou pela simples clivagem hidrolítica passiva (Li, 1999). A Figura 4 exemplifica a
cisão hidrolítica.
Figura 4. Hidrólise da ligação éster originando terminal carbóxi e hidróxi na cadeia polimérica.
9
A autocatálise foi avaliada inicialmente por Li et al. (1990) estudado copolímeros amorfos
de PDLLA. Segundo os autores, após 12 semanas de degradação in vitro em tampão fosfato, o
interior do material desaparece. Resultados semelhantes também foram obtidos em estudos in
vivo.
Pineda et al. (1996), implantaram membranas de PLA com poros de vários tamanhos em 15
coelhos para cobrir um largo defeito ósseo de 10 mm criado propositadamente. Radiografias pós-
implante revelaram um hematoma na região do defeito que foi desaparecendo à medida que a
formação de um novo tecido ósseo foi ocorrendo, independentemente do tipo de membrana
utilizada. O autor concluiu que a função primária das membranas usadas para cobrir defeitos
ósseos é a de preservar componentes osteogênicos presentes no espaço sob a membrana e garantir
o crescimento das células na cavidade medular.
A taxa de absorção de um polímero bioabsorvível é influenciada por vários fatores, como
grupos químicos da cadeia, estrutura, cristanilidade e o método de processamento do implante. O
local do implante contribui com a taxa de metabolismo e quanto maior a circulação, maior será
essa taxa (Athanasiou et al., 2000).
Lam et al. (1995), avaliaram a influência da morfologia de superfície e hidrofilicidade de
membranas absorvíveis (PLLA, porosas e densas) e não absorvíveis Poli-tetrafluoretileno (PTFE)
(Teflon) e PTFE expandido em relação à resposta inflamatória após implantá-las sob a derme de
ratos. Foi constatado, através de medidas do ângulo de contato, que o PLLA é mais hidrofílico
que o PTFE. Muitos estudos têm estabelecido que a adesão e a expansão celular sejam
favorecidas em substratos hidrofílicos. Van der Valk et al. (1983), estudaram a interação de
fibroblastos em superfícies poliméricas, tentando fornecer uma relação entre energia superficial
livre e o espalhamento dos mesmos.
Propriedades como tipo de grupamento químico, relação entre
hidrofilicidade/hidrofobicidade, anisotropia físico-química e contractilidade do substrato têm sido
propostas como fatores que influenciam o comportamento de uma cultura de células. Lydon et al.
(1985), apresentaram uma revisão sobre as relações entre as propriedades físico-químicas de um
substrato e o comportamento celular, para uma série de polímeros sintéticos.
Vert et al. (1984), afirmaram que o grau de cristanilidade determina a taxa de absorção de
água pelo polímero, o que consequentemente irá influenciar na velocidade de degradação do
material.
10
A membrana produzida apenas com PLLA é densa, sem poros e rígida, por isso faz-se
necessária a utilização de plastificante na composição das membranas. A inclusão de um
plastificante nas cadeias de polímeros diminui a interação entre eles, mas aumenta a flexibilidade,
porosidade e reduz o tempo de degradação do material (Scapin et al., 2003; Chen et al., 2003).
Luciano (1997) observou que o plastificante causa uma variação significativa nas propriedades
físicas e na interação biológica do implante. Sugeriu, ainda, que pequenas mudanças na
concentração do plastificante possibilitariam obterem-se membranas com melhores condições de
interação tecido-implante.
Ao adicionar tri-etil-citrato, como plastificante, às membranas obtidas por dissolução em
solvente, constatou-se uma resposta biológica bem aceitável, com muito pouca inflamação inicial
e uma rápida invasão celular em membranas com plastificante implantadas no subcutâneo de
ratos. Ele observou que ao adicionar o plastificante, a membrana, antes densa, tornava-se
totalmente porosa e tinha sua velocidade de degradação aumentada, o que favoreceu, muito, a
invasão pelas células dos tecidos adjacentes. O autor sugeriu que controlando a quantidade do
plastificante e a velocidade de evaporação do solvente poderia se controlar a porosidade do
polímero e a velocidade de degradação, além das propriedades mecânicas dos implantes
(Luciano, 1997). O plastificante atua nas cadeias poliméricas, diminuindo a interação entre as
cadeias, favorecendo a flexibilidade da membrana. Como conseqüência, há a diminuição no valor
da temperatura de transição vítrea (Duek, 1996).
Scapin et al. (2003) comprovou por meio de estudo in vivo que a adição do tri-etil-citrato,
como plastificante nas membranas, não provocou processos inflamatórios graves, tampouco
formação de tecido neoplásico.
A reação aos implantes pode ser estudada tanto in vitro quanto in vivo. A grande
desvantagem de se estudar os efeitos in vitro é o fato de analisar-se o processo isoladamente sem
a interação com sistemas fisiológicos do tecido hospedeiro, muito relevantes.
2.2. O periodonto
Os dentes são suportados pelo periodonto. O periodonto é um sistema de tecidos
conjuntivos, protegidos por epitélio, que prende os dentes aos ossos mandibular e maxilar e
proporciona um aparato continuamente adaptável para a mastigação. Há quatro tecidos
11
componentes de periodonto: a lâmina própria da gengiva, o ligamento periodontal, o cemento, e o
osso alveolar. A lâmina própria da gengiva é protegida por epitélio pavimentoso estratificado
queratinizado na sua superfície mastigatória e por epitélio não-queratinizado nas suas superfícies
sulcular e juncional (Melcher, 1976).
A doença periodontal refere-se a um grupo de problemas que emergem do sulco gengival.
Ela geralmente é dividida em dois grupos: Gengivite - que causa lesões aos tecidos periodontais
de proteção; e Periodontite - que afeta o osso alveolar e os tecidos conjuntivos que suportam os
dentes. A primeira é uma inflamação gengival normalmente crônica, mas pode assumir fases
agudas. A segunda, por sua vez, é caracterizada pela inflamação gengival, com bolsas profundas
(superiores a 3 mm), aumento na mobilidade dentária, culminando com a perda do elemento
dentário (Simon, 2003) (Figura 5).
A doença periodontal é provocada por microorganismos presentes na placa bacteriana e
seus produtos, que causam injúrias inflamatórias. Ocorre uma grande proliferação bacteriana e
uma persistente resposta imunológica a estas infecções crônicas, as quais assumem um
importante papel, não apenas na destruição dos tecidos periodontais, mas também em outras
partes do corpo (Matthews, 2000; Durocher, 2003).
O processo se inicia com o ataque de bactérias. Mesmo em bocas saudáveis, o sulco
gengival é habitado por uma variedade de bactérias, porém estas são inofensivas. A doença
periodontal se desenvolve geralmente devido a dois eventos na cavidade oral: um aumento na
quantidade e um desequilíbrio no balanço dos tipos bacterianos, ou seja, um aumento na
quantidade de microorganismos nocivos. Estes microorganismos aumentam em massa e
espessura até formarem um biofilme e posteriormente a placa (Simon, 2003).
Quando a placa é mantida na região periodontal, ela se transforma em cálculo. Este material
tem a consistência sólida e se adere tenazmente à superfície dentária, sendo assim, muito mais
difícil a sua remoção (Gibbons & Van Houte, 1980).
12
Figura 5. Destruição do osso alveolar, causando perda de inserção dentária.
Segundo Izadi (2002), o acúmulo e o metabolismo de bactérias na cavidade oral são
considerados como a causa primária da periodontite, mais de quatrocentas espécies já foram
isoladas e caracterizadas na placa dental. O acúmulo de bactérias nos dentes induz uma resposta
inflamatória reversível no tecido gengival, mas para o local inflamado progredir a uma destruição
tecidual permanente, a área tem de ser colonizada por alguns microorganismos potencialmente
patogênicos.
Certas espécies subgengivais, na maioria bactérias Gram-negativas, têm sido relacionadas à
etiologia das doenças periodontais destrutivas: Actinobacillus actinomycetemcomittans,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia e Bacterioides sp. Estas espécies podem liberar
produtos tóxicos na placa dental tal como endotoxinas (Mergenhagen et al., 1961), nucleotídeos
de parede celular, ácidos orgânicos, aminas, e leucotoxinas (Socransky et al., 1998). Estes
produtos ativam seqüências de eventos imunológicos que têm um impacto na iniciação e
progressão da doença periodontal.
Em síntese, pode-se dizer que os processos inflamatórios e imunológicos nos tecidos
periodontais são uma resposta, não simplesmente a uma espécie microbiana, mas à várias
espécies e a seus produtos, agindo sobre um longo período de tempo (Izadi, 2002).
Sabe-se que frente à lesões, o tecido gengival tem uma ótima capacidade de se regenerar,
porém o mesmo não ocorre quando a injúria atinge o aparato de sustentação periodontal –
13
ligamento periodontal e osso alveolar. Desta forma, ocorre a destruição das fibras do ligamento
periodontal assim como do osso alveolar ligado a estas (Carranza & Newman, 1996).
Há diversas terapias para o tratamento da doença periodontal. A primeira é a remoção
mecânica e química do acúmulo bacteriano da superfície corono-radicular dos dentes, com o
auxílio de instrumentos raspadores. Este tratamento é eficaz nos casos mais simples e iniciais da
doença. Conforme a doença progride, as alternativas de tratamento tornam-se mais complexas,
por exemplo, quando há perdas ósseas em virtude de grande acúmulo de cálculo sobre os dentes,
faz-se necessário empregar técnicas cirúrgicas a retalho, as quais expõem a raiz dos dentes
facilitando sua descontaminação (Lindhe et al., 1999).
Entretanto, após a cirurgia periodontal a retalho, durante a cicatrização, ocorre uma rápida
migração de células epiteliais para a superfície radicular, formando uma junção epitelial longa.
Esta nova junção epitelial é capaz de bloquear parcialmente a invasão de microorganismos para
dentro do sulco, porém não restabelece uma nova inserção dente-osso alveolar (Needleman et al.,
2005). A RTG pode oferecer benefícios para esse tipo de cirurgia, como um aumento no nível de
inserção gengival clínico, possibilidade de fechamento de defeitos periodontais (Cury et al.,
2003).
Por estas razões, em casos em que há extensa perda óssea, culminando em mobilidade
dental moderada, apenas a remoção dos depósitos de cálculo não sanará a doença. Foi a partir
desta situação que Melcher (1976) propôs os princípios da regeneração tecidual guiada na
periodontia.
A exclusão eficaz de células epiteliais ocorre quando um perfeito selamento é estabelecido
entre a membrana e os bordos ósseos do defeito ou da raiz do dente. Se não, as células epiteliais
podem migrar com a abertura da interface membrana-osso e comprometer o resultado clínico.
Igualmente importante, a superfície da membrana voltada para o defeito deve permitir a formação
do coágulo sangüíneo que irá maturar e possibilitar a diferenciação das células que regenerarão o
periodonto (Takeishi et al., 2001).
14
2.3. Regeneração tecidual guiada (RTG) na periodontia
A técnica de RTG tem como princípio biológico a exclusão celular seletiva e pressupõe a
utilização de uma barreira física interposta entre o retalho periodontal e a superfície radicular já
tratada. Com o objetivo de defletir ou excluir o tecido conjuntivo, além de desviar a proliferação
epitelial da superfície radicular, criando um espaço protegido que poderá ser repovoado por
células originárias do ligamento periodontal e do periósteo remanescentes, condunzindo assim a
regeneração do periodonto (Gottlow et al., 1986).
Laurell et al. (2006) investigaram a estrutura dos tecidos periodontais formados após a
terapia de regeneração tecidual guiada (RTG) em bolsas (defeitos) intra-ósseos em macacos. Eles
observaram que a dimensão e a composição do novo ligamento periodontal se reestabilizavam
completamente após seis meses da cirurgia. Quando comparados os ligamentos periodontais
regenerados e intactos a proporção de fibroblastos, vasos sanguíneos e fibras colágenas era
similar aos ligamentos periodontais intactos.
Varios fatores devem ser levados em consideração quando se utiliza membranas. Dentre
eles estão os relacionados ao paciente, ao procedimento e período de cura, e os relacionados ao
defeito (Kornman & Robertson, 2000). Dentre os relacionados ao paciente, a importância do
controle do biofilme bacteriano e da recolonização após a cirurgia é primordial. Mesmo
avaliando-se criteriosamente o tipo de defeito e executando-se um controle adequado de placa,
um fato indesejável, porém relativamete frequente com o uso da RTG, é a exposição das
membranas atualmente comercializadas. Sugere-se que a exposição prematura permita a
colonização bacteriana, o que pode levar a um comprometimento do resultado da terapia (Selvig
et al., 1992; Chen et al., 1997).
As membranas para RTG têm o objetivo de proporcionar a regeneração dos tecidos
periodontais através do bloqueio físico à migração das células epiteliais para a região a ser
regenerada (Figura 6). Desta forma, a concepção de uma membrana cuja topografia superficial
fosse capaz de repelir células epiteliais, de um lado, e guiar ou estimular o crescimento de células
ósseas do outro, seria o modelo de membrana ideal. O desenvolvimento de tal membrana para a
RTG periodontal poderia ser benéfica na aceleração da cicatrização e regeneração óssea, levando
a resultados clínicos mais previsíveis (Owen et al., 2005).
15
Figura 6. Simulação de como age a membrana de RTG após a cirurgia, fornecendo espaço para a regeneração do tecido do ligamento periodontal, do cemento e osso alveolar.
As membranas não-reabsorvíveis apresentam uma maior capacidade de manter o espaço
destinado à regeneração porém, o seu uso requer um segundo ato cirúrgico para sua remoção e
usualmente ocorrem exposições das membranas, devido à reações de corpo estranho. Tal fato
leva a um maior desconforto ao paciente e a possibilidade de perturbar o tecido neoformado sob a
membrana. Por outro lado as membranas reabsorvíveis não necessitam de um segundo
procedimento cirúrgico e apresentam poucas complicações (Sanz & Giovannoli, 2000).
A utilização de outros materiais que substituam as membranas para RTG não-reabsorvíveis
de PTFE-e tem sido bastante estudada. Como pode-se citar o emprego de membranas à base de
quitosana, um polímero natural, que foram implantadas em defeitos críticos em calvária de ratos.
Estas membranas apresentaram boa atividade defletora de células epiteliais, porém as membranas
de quitosana pura, não mantiveram suas características mecânicas, apenas as membranas
reforçadas com estrutura de titânio mantiveram suas características por seis semanas após a
cirurgia (Kuo et al., 2005).
Eickholz et al. (2006), em um estudo de longo prazo, observaram que, após 10 anos, não há
diferenças entre os tratamentos de RTG com membranas reabsorvíveis e não-reabsorvíveis.
Principalmente no que diz respeito ao ganho de inserção clínica horizontal.
Em um estudo comparativo de cinco tipos de membranas para RTG, Takata et al. (2001)
analisaram a biocompatibilidade e afinidade celular de membranas de diferentes composições.
16
Foi observado que as membranas biorreabsorvíveis de PLA (Epi-Guide) e de copolímero
PLA/PGA (Resolute) apresentaram maior afinidade por fibroblastos após seis dias de teste.
Inicialmente, as membranas servem como protetoras do coágulo sanguíneo que se forma
em meio ao defeito, sendo este importante uma vez que atua como matriz, onde os osteoblastos
se depositarão e promoverão a neoformação óssea e a proliferação de fibroblastos e
cementoblastos (Spiekermann, 1995). Para que seja possível a regeneração dos tecidos
periodontais, é necessário que exista uma barreira que impeça a migração do tecido epitelial para
a região de defeito preservando componentes osteogênicos presentes no espaço sob a membrana e
garantir o crescimento das células na região de defeito (Pineda et al., 1996).
Diversos estudos em humanos e em animais demonstraram que algumas membranas podem
ser aplicadas com sucesso para facilitar a regeneração periodontal em lesões mandibulares de
furca classe II e em defeitos intra-ósseos. Assim, começaram estudos utilizando barreiras de poli-
tetrafluoretileno expandido (PTFE-e), que era uma membrana não-reabsorvível e foram obtidos
ótimos resultados quanto ao ganho de nova inserção periodontal. Em contrapartida, a necessidade
de uma nova intervenção cirúrgica para a remoção da membrana inviabilizava, em parte, o uso da
mesma por requerer um novo período cirúrgico, assim como cicatricial, além de aumentar custos
e riscos para o paciente (Gottlow et al., 1986, Caffesse et al., 1990, Becker & Becker, 1993,
Cortellini et al., 1993, Becker et al., 1996, Mattson et al., 1999, Eickholz et al., 2000).
Para as membranas usadas em RTG, é de suma importância um cuidado quanto à sua
espessura que possui cerca de 0,2 mm no estado seco e 0,4 no estado úmido. Ela tem que ser
semipermeável com tamanho de poros de (0,004 μm) pequenos suficientes para impedir a
penetração das células epiteliais, e permitir a passagem de nutrientes, pois isto é essencial para
uma neoformação óssea (Wang et al., 1995).
Foi realizado um estudo abrangente e detalhado in vitro e in vivo analisando a degradação
de membranas porosas e não porosas de poli (L-ácido lático) (PLLA) que poderiam ser utilizadas
tanto em RTG quanto em suporte para cultura de células. Foram analisadas as mudanças na
massa molecular, na polidispersividade, na temperatura de fusão, na energia de fusão, na
resistência à tração, no módulo de elasticidade, na massa e na área superficial das membranas sob
degradação. Estes autores constataram que as membranas porosas apresentam os maiores valores
de massa molecular e temperatura de fusão e degradam mais rapidamente em relação às
membranas não porosas (Lam et al., 1994).
17
Sculean et al. (2007) realizaram um estudo controlado avaliando tratamentos de defeitos
periodontais intra-ósseos com uma associação de osso mineral natural e membranas de RTG,
somente o tratamento de RTG e tratamento somente com osso natural. Foi observado que após
cinco anos, o tratamento somente com membrana e o com membrana e osso natural resultaram
em um ganho significativo no nível de inserção clínica dos dentes tratados, enquanto que no
tratamento somente com osso natural não houve tal resultado positivo.
Stavropoulos et al. (2004) compararam membranas de copolímero PLA/PGA com
membranas de colágeno. Observaram que nos sítios operados com membranas de colágeno, estas
degradaram muito rapidamente permitindo, assim a proliferação de células epiteliais para a região
do defeito, o que retardou o processo de regeneração periodontal. Já nos defeitos com membranas
de PLA/PGA, houve a regeneração, mas em ambos os casos estas membranas necessitaram o
preenchimento dos defeitos com osso liofilizado a fim de manter o espaço para a regeneração dos
tecidos.
A resposta fisiológica ao implante varia em função de sua forma, do tempo de implante, do
material implantado e do local do implante (maior ou menor fluxo de fluidos). Geralmente o
corpo tende inicialmente a encapsular com uma fina camada de tecido fibroso e tem inicio a
degradação do material. Esse encapsulamento vem acompanhado de uma leve reação
inflamatória, não muito maior do que a causada por uma incisão. Se essa reação for muito
intensa, pode causar a necessidade da retirada do implante (Pennings, 2000).
Foi listada uma série de exigências que uma membrana para RTG necessita apresentar para
que ela seja eficiente. Em resumo, ela precisa apresentar biocompatibilidade, exclusão celular,
manutenção do espaço, integração à atividade tecidual, facilidade de utilização e atividade
biológica. A falha de um dispositivo em um ou em mais destes critérios pode ser a razão para o
desempenho insatisfatório na regeneração de defeitos periodontais (Tatakis & Trombelli, 2000).
Poucas membranas atualmente têm incorporado todos estes critérios.
Outras técnicas já foram desenvolvidas para substituir ou dispensar a utilização de
membranas na RTG. Dentre elas, a utilização de osso particulado autógeno ou alógeno para
preencher o defeito periodontal e o emprego de matriz derivada do esmalte. Entretanto, nenhuma
destas técnicas promove uma real regeneração dos tecidos periodontais, pois não são capazes de
efetuar um bloqueio adequado para a proliferação do tecido gengival para o defeito, portanto a
18
RTG só terá sucesso com a utilização de barreiras que impeçam a invasão de células epiteliais
(Donos et al., 2004; Donos et al., 2005).
O conhecimento da tensão máxima que a membrana pode apresentar sem comprometer sua
estrutura e sua utilidade é muito importante durante a síntese de membranas de polímeros
biorreabsorvíveis. Quando a membrana é fixada em um tecido do organismo hospedeiro, o
polímero começa a degradar e suas propriedades mecânicas são afetadas (Trombelli et al., 2005).
Desta forma a adição de plastificante à composição de membranas de PLLA tornaria a
membrana resultante porosa, com menor tempo de degradação sem afetar suas propriedades
mecânicas. O que pode torná-las ideais para a RTG periodontal (Luciano et al., 2003).
19
Capítulo 3
Materiais e Métodos
3.1. Preparo e caracterização das membranas de PLLA
Para o preparo das membranas foi utilizado poli(L-ácido láctico) (PLLA) granulado
(PURAC) com massa molecular ponderal média (Mw) em torno de 100.000 Da (segundo
informações do fabricante).
As membranas foram sintetizadas em três diferentes concentrações de polímero e de
plastificante, a fim de se obter diferentes graus de maleabilidade e de porosidade, assim como
para alterar o tempo de degradação das membranas.
As membranas serão sintetizadas nas seguintes proporções:
• PLLA a 95% com 5% de plastificante;
• PLLA a 90% com 10% de plastificante;
• PLLA a 85% com 15% de plastificante.
A seqüência de preparo foi padronizada para todas as amostras de membranas. As
quantidades de PLLA, de solvente (DMC) (Diclorometano, Merck) e de plastificante (tri-etil-
citrato de sódio, Aldrich) necessárias para a obtenção das membranas nas proporções acima
descritas, foram misturadas e submetidas à agitação magnética por duas horas. Após a agitação, a
solução obtida foi colocada em um molde de vidro e posta dentro de uma cuba de vidro com
ambiente saturado pelo solvente, por vinte e quatro horas, para obtenção da membrana (Figura
7).
20
Figura 7. (A) Agitação magnética da mistura PLLA, tri-etil-citrato e dicloro-metano; (B) cuba de vidro saturada por solvente.
3.1.1. Caracterização das amostras
As amostras foram secas em estufa à vácuo por 24 horas e caracterizadas através das
técnicas citadas abaixo antes e após sua degradação in vitro.
3.2. Estudo da degradação hidrolítica
As amostras foram colocadas em tubos de ensaios com tampa rosqueada, previamente
esterilizados com álcool 70%, contendo solução tampão fosfato (PBS) pH 7,4 a 37 ± 1°C, sendo
retiradas após 2, 4, 8, 16 e 18 semanas, lavadas com água, secas à vácuo.
3.2.1 Análises e ensaios de caracterização das amostras
Primeiramente foi feita a avaliação macroscópica da degradação das membranas para se
obter uma primeira opinião sobre diferenças de degradação conforme o tempo de imersão entre
as diferentes proporções PLLA/tri-etil-citrato.
Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV. Testes realizados em Jeol 300. Pequenas
amostras das membranas foram separadas e mantidas em dessecador à vácuo de acordo com os
períodos de remoção da degradação in vitro. Teve como objetivo investigar a superfície e
superfície de fratura dos dispositivos. As amostras foram introduzidas em nitrogênio líquido para
21
induzir a fratura dos materiais. As membranas foram fixadas em suporte adequado com o auxílio
de cola condutora – cola de prata – e metalizadas com outro a fim de torná-las eletro-condutoras.
A tensão utilizada foi de 10KV.
Ensaio mecânico de tração para determinar a máxima resistência das membranas, módulo
de elasticidade e a taxa de alongamento das membranas em função do tempo de degradação. As
membranas de PLLA/tri-etil-citrato com distância entre as garras de 60 mm de, 15 mm de largura
e 0,25 mm de espessura foram submetidas aos ensaios de tração em uma máquina universal de
ensaios, MTS (Material Testing Systems), modelo 810 (Figura 8), utilizando célula de carga de
200N e velocidade de 50 mm.min-1 seguindo norma ASTM D882-02. Cada amostra foi
submetida a quatro ensaios nas mesmas condições de umidade (50%) e temperatura (22ºC).
Figura 8. Equipamento Material Testing Systems (MTS) modelo 810, utilizado para a realização dos ensaios mecânicos de tração.
22
Calorimetria Diferencial de Varredura – DSC. Foi utilizado para se avaliar variações de
cristalinidade através da entalpia de fusão, temperatura de fusão e temperatura de transição vítrea.
Estes testes foram realizados utilizando uma porção de 10mg extraídos das membranas de PLLA
degradadas in vitro, elas foram colocadas em recipiente especial, lacradas e mantidas em
dessecador à vácuo até o momento do ensaio. Duas curvas para cada tipo de membrana foram
necessárias para se obter o valor da Tg (temperatura de transição vítrea), que raramente é
detectável no primeiro aquecimento. Na primeira, a temperatura foi de 0ºC a 200ºC. A segunda
foi de -50ºC a 250ºC. A taxa de aquecimento foi de 20ºC/min.
As curvas obtidas foram analisadas no programa NETZSCH TA ANALYSIS STA 409C
V3.3 que acompanha o equipamento. Os valores de Tg e Tf (temperatura de fusão) %Xc (grau de
cristanilidade - GC) foram coletados e especificados em gráficos. As curvas também foram
sobrepostas a fim de comparação.
3.3. Animais
Neste trabalho foram utilizados coelhos Nova Zelândia de ambos os sexos, com idade
aproximada de três meses e pesando de 2,5 a 3,0 Kg. Esses animais foram obtidos do Biotério da
Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, no Centro de Ciências Médicas e Biológicas de
Sorocaba (PUC-SP/CCMB). Eles permaneceram presos individualmente recebendo ração
comercial e água “ad libitum” e, mantidos em regime de claro-escuro correspondente a 12 horas e
temperatura controlada de cerca de 23 ºC ± 2 ºC.
3.4. Procedimento cirúrgico
Foram utilizados doze (12) coelhos divididos em quatro (04) grupos, equivalentes aos
diferentes tempos de implante das membranas: quinze (15), trinta (30), sessenta (60) e noventa
(90) dias, sendo utilizados três (03) coelhos para cada tempo. Foram implantadas nestes animais
membranas de PLLA com plastificante em diferentes proporções: 95/5 de PLLA/plastificante;
90/10 de PLLA/plastificante e 85/15 de PLLA/plastificante. As membranas apresentando 8 mm
de diâmetro foram esterilizadas por imersão em álcool 70º por uma hora e lavadas em solução
tampão fosfato pH 7,4 a 37 ± 1 °C, por 1 hora antes da cirurgia.
23
Os coelhos foram pesados e submetidos à anestesia geral administrada via intramuscular
com uma solução de Ketamina 10% (40 mg/Kg) mais Cloridrato de Xylazina 2% (5 mg/Kg) por
peso corporal.
Após a anestesia, foi realizada a tricotomia da parte dorsal do crânio do coelho. Uma
incisão de aproximadamente 30 mm foi feita no escalpe do animal, seguindo o trajeto da sutura
sagital. A musculatura e o periósteo são descolados e rebatidos, expondo os ossos parietais.
Quatro defeitos ósseos bilaterais foram preparados, com o auxílio de uma broca trefina com 8
mm de diâmetro, montada em motor odontológico de baixa rotação elétrico (Beltec), sob
irrigação constante com solução fisiológica estéril a fim de evitar superaquecimento das bordas
do defeito. Três defeitos receberam as membranas em suas diferentes proporções
polímero/plastificante e um defeito não foi preenchido para controle. A implantação das
membranas obedeceu ao seguinte padrão:
Defeito 1 – localizado no lado anterior direito e preenchido com a membrana 95/5% de
PLLA/plastificante;
Defeito 2 – localizado no lado anterior esquerdo e preenchido com a membrana 90/10% de
PLLA/plastificante;
Defeito 3 – localizado no lado posterior direito e preenchido com a membrana PLLA
85%/15% de plastificante;
Defeito 4 – localizado no lado posterior esquerdo e não preenchido, servindo como
controle.
A pele foi reposicionada e suturada em dois planos, seguida de anti-sepsia com solução de
iodo-polvedine na região do ferimento (Figura 9).
Finalizado os períodos de 15, 30, 60 e 90 dias pós-cirúrgicos, os animais foram sacrificados
por aprofundamento de anestesia com solução de Hidrato de Cloral 10% na dose 400mg/Kg,
seguida por deslocamento cervical. Uma vez sacrificado, a calvária de cada animal foi removida
com o auxílio de uma serra cirúrgica. As amostras dissecadas foram analisadas
macroscopicamente e as observações registradas e fotografadas. Em seguida, a calvária contendo
o segmento de cada membrana implantada e a região controle foram fixados em paraformoldeido
4%, para análise histológica.
24
Figura 9. Seqüência cirúrgica na calvária de coelhos: (A) preparo dos defeitos ósseos com broca
trefina de 8 mm de diâmetro; (B) remoção de parte do osso parietal; (C) exposição da calvária de
coelho mostrando os quatro defeitos bilaterais nos ossos parietais para a colocação das
membranas; e (D) membranas já colocadas nos defeitos criados.
3.5. Processamento do material
Primeiramente o material foi submetido à descalcificação em solução de ácido nítrico a 5%.
Em seguida, os segmentos contendo os defeitos foram separados e os defeitos cortados na região
transversal mediana obtendo duas amostras com uma área central e duas periféricas. As amostras
foram preparadas para análise histológica de acordo com as técnicas utilizadas para Microscopia
de Luz, utilizando-se parafina como meio de inclusão.
O processamento consistiu inicialmente na fixação do material em líquido de
paraformoldeído a 4%, por um período de 24 horas à temperatura ambiente. Após a fixação do
material, foram realizados os seguintes procedimentos:
25
1. Desidratação: etanol a 70% (1h), etanol a 80% (2 tempos de 30 min.), etanol a 95% (2
tempos de 30 min.) e etanol a 100% (3 tempos de 30 min.);
2. Diafanização: etanol a 100% + xilol (na proporção de 1:1 durante 30 min.) e xilol puro
(durante 60 min.);
3. Embebição: xilol + parafina (na proporção 1:1 durante 30 min. dentro da estufa) e
parafina pura (2 tempos de 60 min.);
4. Inclusão: após o processamento o material será incluído em fôrma com parafina. Após
gelados e, devidamente identificados, os blocos foram aparados para tirar o excesso de
parafina.
3.6. Preparação das lâminas
Os preparados foram seccionados com navalhas descartáveis em micrótomo Leica RM
2245 a uma espessura de 4 μm. Para tanto, os blocos de parafina foram colocados no congelador
durante 30 minutos. A seguir os blocos foram colocados um a um no micrótomo e desbastados
até que toda a superfície tenha sido atingida. As fitas obtidas foram colocadas no banho
histológico, e pescados os cortes com o auxílio de lâminas. Então, as lâminas devidamente
identificadas foram colocadas em um suporte de madeira para secar. As lâminas com o material
histológico foram levadas para a estufa a 60ºC, onde permanecerão durante 15 minutos para que
o excesso de parafina seja eliminado. Finalizando, as lâminas foram coradas usando a técnica
Tricômico de Masson:
1. Desparafinizar e hidratar os cortes;
2. Corar com Hematoxilina de Ehrlich por 5 a 15 minutos;
3. Lavar em água de torneira por 10 minutos;
4. Corar com Fucsina Ácida por 1 a 5 minutos;
5. Lavar várias vezes em água destilada;
6. Oxidar pelo Ácido Fosfomolíbdico a 1% por 8 minutos;
7. Escorrer bem e corar pela Azul de Anilina por 5 minutos;
8. Lavar rapidamente em água destilada;
9. Desidratar, diafanizar e montar em Entelan.
26
3.6.1. Análise histológica
As lâminas foram analisadas em um microscópio óptico (marca NIKON – E800). Através
da analise histológica foram avaliados os seguintes parâmetros:
3.6.2. Parâmetros qualitativos
1. Regeneração óssea;
2. Respostas inflamatórias e coagulatórias;
3. Biocompatibilidade e capacidade de sustentar a adesão e crescimento celular;
4. Propriedades mecânicas condizentes com o tecido a ser reconstruído;
5. Velocidade de degradação compatível com o crescimento do tecido para qual serve o
suporte.
3.6.3. Parâmetros quantitativos
Após exame microscópico convencional, a avaliação da resposta cicatricial do osso foi feita
obedecendo ao critério preconizado por Donos et al. (2004), no qual se divide a amostra em três
grupos:
Grupo 1 – não fechamento – no qual permaneceu aberto o defeito ósseo, com apenas uma
cicatrização óssea marginal ao defeito;
Grupo 2 – fechamento parcial – onde houve a formação de novo osso além da cicatrização
óssea marginal ao defeito, sem continuidade óssea;
Grupo 3 – fechamento total – defeitos que apresentaram continuidade óssea completa entre
as margens.
Para cada período avaliado foram empregados estes critérios, e após, estes dados foram
cruzados entre si, a fim de determinar qual proporção polímero/plastificante se adequará melhor a
determinado período de cicatrização. Teste exato de Fischer foi aplicado para análise estatística,
valores de p < 0.05 foram considerados como nível de significância.
27
Capítulo 4
Resultados e Discussão
4.1 Estudo in vitro
4.1.1 Avaliação macroscópica
Dentre as três proporções polímero/plastificante (95/5; 90/10 e 85/15) pôde-se notar pouca
degradação das membranas de 95/5 e 90/10, porém as membranas com maior concentração de
plastificante (85/15) tiveram uma maior degradação visível macroscopicamente, conforme
aumentava o período de imersão em tampão fosfato (PBS).
Foi possível observar através da análise macroscópica que a partir da 16ª semana de
degradação in vitro, ocorreram mudanças na estrutura das membranas e na 18ª semana as
membranas, principalmente de proporção PLLA/tri-etil-citrato 85/15 se encontravam muito
quebradiças apresentando uma coloração esbranquiçada, dificultando, assim, a execução do
ensaio mecânico de tração (Figura 10).
28
Figura 10. Membranas de PLLA/Tri-etil-citrato degradadas nos tempos de 2, 4, 8, 16 e 18
semanas.
4.1.2 Avaliação por microscopia eletrônica de varredura
Através de MEV, nota-se que as membranas com maior concentração de plastificante são
mais globulares e porosas, já as com menor concentração, tendem a ser mais densas.
A partir da análise das fotomicrografias eletrônicas de varredura, podemos comparar a
degradação das membranas de PLLA/tri-etil-citrato nos períodos inicial e após 18 semanas, sendo
que as membranas de concentração 85/15 foram as que apresentaram maior taxa de degradação.
Observou-se, também, que a degradação das membranas se dá a partir do centro para a porção
externa das membranas, acontecimento descrito primeiramente por Li et al. (1999), como
autocatálise devido ao acúmulo de ácidos fazendo com que a estrutura da membrana tenha uma
erosão inicial na superfície, mas apresentando uma degradação mais acentuada no centro (Figura
29
11 e 12). A morfologia das membranas, particularmente os tamanhos dos poros e sua distribuição
são muito importantes para a adesão celular, tornando o material bioativo (Luciano et al., 2003).
Figura 11. Micrografias eletrônicas de varredura da superfície de membranas de PLLA/tri-etil-citrato obtidas no tempo 0 (coluna à esquerda) e após 18 semanas (coluna à direita) de degradação in vitro. Membranas PLLA/tri-etil-citrato 95/5 (A e B), 90/10 (C e D) e 85/15 (E e F). Nota-se a degradação mais acentuada na membrana de proporção 85/15 (E e F).
30
Figura 12. Micrografias eletrônicas de varredura da fratura de membranas de PLLA/tri-etil-citrato obtidas no tempo 0 (coluna à esquerda) e após 18 semanas (coluna à direita) de degradação in vitro. Membranas PLLA/tri-etil-citrato 95/5 (A e B), 90/10 (C e D) e 85/15 (E e F). Nota-se a degradação mais acentuada na membrana de proporção 85/15 (E e F).
31
Figura 13. Fotomicrografias eletrônicas de varredura das membranas de PLLA/tri-etil-citrato após 18 semanas de degradação in vitro, em aumentos de 500x (A, C e E) e 2000x (B, D e F). (A e B) representam a membrana 95/5, (C e D) representam a membrana 90/10 e (E e F) representam a membrana 85/15.
32
De acordo com os resultados obtidos, a adição do plastificante tri-etil-citrato à
composição das membranas de PLLA resultou em alterações significativas para a produção de
membranas para RTG com diferentes tempos de degradação, pois o plastificante confere às
membranas uma porosidade que permite a difusão de nutrientes para a região do defeito sem
permitir a sua invasão por células epiteliais, além de fornecer uma maior maleabilidade aos
dispositivos sem o comprometimento de sua biocompatibilidade (Nakamura et al., 2000).
Entretanto esta alteração na composição da membrana, só se torna perceptível
morfologicamente a partir das membranas de composição PLLA/tri-etil-citrato 90/10 e 85/15.
Sendo que a degradação é mais evidente após 18 semanas nas membranas 85/15 provavelmente
pela maior quantidade de poros, o que facilita a difusão de aquosa por entre sua estrutura (Figura
13) (Barbanti et al., 2004).
4.1.3 Ensaio mecânico de tração
As amostras 95/5, 90/10 e 85/15 foram submetidas ao ensaio de tração, segundo a norma
ASTM D882-02. A Figura 14 mostra o comportamento das curvas tensão x deformação para as
amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante.
Verifica-se nitidamente que a adição do plastificante está diretamente ligada ao
alongamento apresentado pelas amostras, ou seja, como era esperado, quanto maior a
concentração de plastificante, maior o alongamento.
33
0 1 2 3 4 5 60
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
85/15 T0 90/10 T0 95/05 T0
Tens
ão (M
Pa)
Deformação (%)
Figura 14 Curvas de Tensão x Deformação para as amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante.
A Tabela 1 refere-se aos dados obtidos das análises do PLLA em função do tempo de
degradação em tampão fosfato (PBS). Os resultados analisados foram obtidos até o tempo de 18
semanas.
Verifica-se que o módulo de elasticidade diminui e o alongamento aumenta em função da
composição de plastificante. Entretanto, se avaliarmos a variação desses parâmetros em função
do tempo de degradação, verifica-se que o módulo aumenta à medida que o processo de
degradação ocorre, enquanto o alongamento diminui. No entanto, o aumento do módulo na
amostra 85/15 é mais acentuado comparado às amostras 90/10 e 95/5. Esse comportamento pode
ser verificado através da Figura 15, que mostra as curvas obtidas para esse ensaio.
34
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tens
ão (M
Pa)
Deformação (%)
85/15 T5 90/10 T5 95/05 T5
Figura 15. Curvas de Tensão x Deformação para as amostras de PLLA com diferentes concentrações de plastificante, após 18 semanas de degradação. O aumento dos valores do módulo e a diminuição no alongamento em função do processo
de degradação podem estar relacionados à variação do grau de cristalinidade à medida que a
degradação ocorre, como verificado nas análises de DSC. Dessa forma, à medida que o material
degrada novos arranjos cristalinos são formados, aumentando a resistência e diminuindo o
alongamento. Esse efeito é mais acentuado nas amostras 85/15, devido a maior composição do
plastificante.
No entanto, acredita-se que existe um efeito competitivo entre a ação do plastificante,
levando a uma degradação mais rápida devido aos poros, permitindo uma maior difusão dos
fluidos e por isso, variações nas propriedades mecânicas mais acentuadas para as amostras 85/15,
embora as análises de DSC mostrassem que nessa amostra a variação do grau de cristalinidade foi
menor comparada com as outras amostras.
A comparação entre dados de estudos de degradação in vitro publicados na literatura
torna-se difícil, devido a inúmeras diferenças entre os estudos. Esses fatores que podem alterar os
resultados incluem a composição do material de estudo, processamento, armazenamento da
amostra e tipos de testes mecânicos (Moser et al., 2005).
35
De qualquer forma, os resultados do estudo in vitro apresentados têm o objetivo de servir
somente como um simples modelo do comportamento do estudo in vivo dos implantes
biorreabsorvíveis, tendo em vista que quando implantados esses dispositivos podem estar em
contato com vários tecidos que podem afetar as características de degradação dos implantes.
Moser et al. (2005), exemplifica as situações que dificultam a predição exata do estudo in
vitro para a situação in vivo, dizendo que no caso do dispositivo polimérico in vitro a exposição à
solução tampão de PBS é muito grande, enquanto na situação in vivo os implantes podem estar
expostos a um volume muito menor de fluídos. Além disso, a carga a que o implante estará
sujeito, durante o período de recuperação óssea, pode variar, dependendo do local do implante,
tendo essa carga, às vezes, uma magnitude maior do que a suportada pelo dispositivo.
Nesse contexto, as menores variações entre um estudo in vitro e um in vivo serão
encontradas quando se sabe previamente que o implante estará numa região onde a exposição a
carga é baixa, como no caso de certas aplicações craniofaciais, assim como relatado por Moser et
al. (2005).
Um dos copolímeros estudados por Mainil-Varlet et al. (1997), quanto a degradação in
vitro e in vivo, foi o poli(L-co-DL ácido lático), na relação 95:5 , sendo constatado uma boa
correlação entre esses estudos quando os critérios considerados foram variações na resistência
mecânica e massa molar.
36
Tabela 1. Dados de modulo de elasticidade (MPa), tensão no escoamento (MPa), tensão na ruptura (MPa), alongamento no escoamento (%) e alongamento na ruptura (%), obtidos pelo ensaio mecânico de tração para as amostras em função do tempo de degradação.
Tempo (semanas)
Módulo de elasticidade (MPa)
Tensão máxima (MPa)
Tensão na ruptura (MPa) Alongamento na ruptura (%)
0 1393,51 (+/- 327,16) 19,44 (+/- 0,93) 20,26 (+/- 1,84) 2,11 (+/- 0,72) 2 2387,6 (+/- 359,21) 40,21 (+/- 0,74) 36 (+/- 7,21) 2,04 (+/- 0,12)
95/5 4 2799,75 (+/- 328,86) 49,79 (+/- 1,46) 48,42 (+/- 0,26) 1,98 (+/- 0,72) 8 2502,47 (+/- 314,3) 19,15 (+/- 8,52) 24,4 (+/- 6,43) 1,04 (+/- 0,11) 16 2234,24 (+/- 460,6) 13,43 (+/- 0,34) 17,12 (+/- 2,61) 0,78 (+/- 0,13) 18 2543,73 (+/- 670,24) 43,75 (+/- 0,49) 27,61 (+/- 17,94) 1,03 (+/- 0,51) 0 873,48 (+/- 159,19) 20,22 (+/- 3,27) 21,49 (+/- 1,64) 4,65 (+/- 0,46) 2 1122,4 (+/- 123,6) 13,24 (+/- 0,93) 12,54 (+/- 3,81) 1,17 (+/- 0,51)
90/10 4 1462,56 (+/- 316,7) 23,66 (+/- 3,46) 21,07 (+/- 6,1) 1,42 (+/- 0,33) 8 1743,32 (+/- 406,8) 14,19 (+/- 3,79) 11,03 (+/- 2,06) 0,64 (+/- 0,13) 16 2867,92 (+/- 469,54) 41,24 (+/- 6,16) 43,03 (+/- 5,44) 2,26 (+/- 0,73) 18 2669,54 (+/- 239,3) 34,49 (+/- 1,91) 34,52 (+/- 2,16) 1,41 (+/- 0,32) 0 491,82 (+/- 32,81) 11,76 (+/- 0,89) 11,64 (+/- 0,89) 6,95 (+/- 1,8) 2 1952,22 (+/- 236,61) 10,73 (+/- 1,43) 9,6 (+/- 1,28) 0,5 (+/- 0,82)
85/15 4 1903,04 (+/- 538,56) 7,74 (+/- 0,52) 7,39 (+/- 0,57) 0,48 (+/- 0,14) 8 2467,12 (+/- 242,89) 32,20 (+/- 8,69) 31,02 (+/- 9,12) 1,79 (+/- 0,17) 16 1951,02 (+/- 213,57) 11,04 (+/- 8,84) 17,93 (+/- 7,91) 0,96 (+/- 0,24) 18 2455,77 (+/- 654,42) 12,49 (+/- 0,42) 10,08 (+/- 0,56) 0,43 (+/- 0,11)
37
4.1.4 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
A Calorimetria Diferencial de Varredura é uma técnica útil para a quantificação de
propriedades térmicas dos materiais. Usualmente, a técnica permite acompanhar transições
associadas aos processos exotérmicos e endotérmicos, como a entalpia de fusão, cristalização e
vaporização, como também a temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de cristalização
(Tc) e temperatura de fusão (Tm). Aplicadas aos polímeros, a técnica pode também determinar o
grau de cristalinidade do material, influência de aditivos, reações de polimerização e degradação
oxidativa ou térmica (Lucas et al., 2001).
Os termogramas obtidos para as amostras de PLLA com adição de 5, 10 e 15% de
plastificante, cujas composições foram denominadas 95/5, 90/10 e 85/15 são mostrados nas
Figuras 16, 17 e 18, respectivamente, para o segundo aquecimento, em função do tempo de
degradação em solução tampão fosfato, pH 7,4. Os termogramas de todas as amostras nas
diferentes composições são característicos de um polímero semicristalino, mostrando picos de
fusão, temperatura de transição vítrea e pico de cristalização, sendo que o pico de cristalização
aparece somente no segundo aquecimento, em função das condições de resfriamento das
amostras.
-15
-10
-5
0
5
Hea
t Flo
w (m
W)
0 50 100 150 200 250
Temperature (°C)
––––––– 95-5 0 semana––––––– 95-5 4 semanas––––––– 95-5 8 semanas––––––– 95-5 16 semanas––––––– 95-5 18 semanas
Exo Up Universal V2.5H TA Instruments
Figura 16. Termogramas a partir de DSC, segundo aquecimento, para as amostras 95/5 em função do tempo de degradação.
38
-15
-10
-5
0
5H
eat F
low
(mW
)
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Temperature (°C)
––––––– 90-10 0 semana––––––– 90-10 4 semanas––––––– 90-10 8 semanas––––––– 90-10 16 semanas––––––– 90-10 18 semanas
Exo Up Universal V2.5H TA Instruments
Figura 17 Termogramas a partir de DSC, segundo aquecimento, para as amostras 90/10 em função do tempo de degradação.
-15
-10
-5
0
5
Hea
t Flo
w (m
W)
0 50 100 150 200 250
Temperature (°C)
––––––– 85-15 0 semana––––––– 85-15 4 semanas––––––– 85-15 8 semanas––––––– 85-15 16 semanas––––––– 85-15 18 semanas
Exo Up Universal V2.5H TA Instruments
Figura 18. Termogramas a partir de DSC, segundo aquecimento, para as amostras 85/15 em função do tempo de degradação.
39
A Tabela 2 mostra os valores de temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de
fusão (Tf) para as amostras no primeiro aquecimento, em função do tempo de degradação.
Avaliando-se os dados antes da degradação, verifica-se valores de Tg de 56oC e Tm de 175 oC e
que os mesmos não variam independente da composição das amostras e do tempo de degradação,
no entanto, se compararmos com o trabalho de Ceroni-Filho (2004) para as análises de DSC para
o mesmo PLLA puro, verifica-se um decréscimo no valor Tg, encontrado em (65oC).
Nas membranas em estudo, temos que considerar que o plastificante age dando maior
mobilidade às cadeias poliméricas e diminui a Tg. A ação do plastificante diminuindo a interação
entre as cadeias pode explicar a diminuição dos valores de Tg quando comparados ao polímero
puro.
O pico de cristalização presente somente no resfriamento das amostras de PLLA (Tabela
2), sugere que a taxa de resfriamento do material (10oC/min), após o primeiro aquecimento, foi
rápida o suficiente para permitir a lenta nucleação e conseqüente formação de cristais do material.
A cristalinidade é um parâmetro responsável pela baixa taxa de hidrólise do poli(L-ácido láctico),
que tem como conseqüência rápida perda de suas propriedades mecânicas. Além disso, em
aplicações biomédicas, principalmente em ortopedia, a perda das propriedades mecânicas é um
fator importante, tendo em vista que os dispositivos devem exercer suas funções até a formação
do novo osso. É interessante que os dispositivos apresentem valores de cristalinidade mais baixos
do que os apresentados pelo PLLA, para que a taxa de degradação seja mais elevada, diminuindo
assim a permanência de fragmentos do material no local do implante o que poderia causar riscos
de reações de corpos estranhos em longo prazo.
Outro dado obtido pela técnica de DSC é a variação da entalpia das amostras, podendo ser
relacionada com a entalpia do polímero, supondo-o 100% cristalino, fornecendo uma
porcentagem de grau de cristalinidade do material. Os dados das Tabelas 2 e 3 indicam amostras
semicristalinas, sem diferenças de cristalinidade entre as mesmas.
A partir da entalpia de fusão experimental, da entalpia de cristalização experimental e a
temperatura de fusão do PLLA, considerando o polímero 100% cristalino (93.7 J/g) ) (Pistner et
al., 1993), foi possível obter o grau de cristalinidade (χ %) do PLLA nas diferentes composições
do plastificante. Onde ΔHm é a entalpia de fusão experimental [J/g], ΔHc é a entalpia de
cristalização experimental [J/g] e ΔHmo é a entalpia de fusão considerando o polímero 100%
cristalino, 93.7 J/g.
40
Sabe-se que a degradação das amostras de polímeros biorreabsorvíveis é uma função do
seu grau de cristalinidade, pois esta determina a taxa de absorção de água pelo polímero, que
conseqüentemente irá influenciar na cinética de hidrólise do material (Duek et al., 1999). Existem
vários trabalhos na literatura tratando da degradação de polímeros biorreabsorvíveis, mostrando o
aumento do grau de cristalinidade em função do tempo de degradação. Isso é válido tanto para
estudos in vitro quanto para estudos in vivo. No caso da utilização das amostras como suporte
para a cultura de células, o fator cristalinidade também é fundamental, pois a medida que o
material polimérico degrada, permite a invasão celular com conseqüente formação do tecido
(Khor et al., 2002). Essas características poderão ser otimizadas variando-se a taxa de degradação
do suporte polimérico, dependendo do tipo de célula cultivada.
Valores do grau de cristalinidade a partir da entalpia de fusão indicam um aumento do
grau de cristalinidade para as amostras de composições 95/5 e 90/10, sendo que para as
membranas 85/15, essa variação não é observada, (Tabela 3). O aumento do grau de
cristalinidade em função do tempo de degradação foi observado para o mesmo PLLA puro por
Ceroni-Filho (2004). No entanto, os valores de grau de cristalinidade encontrados para o PLLA
puro foram de 40%, antes da degradação, mantendo-se praticamente constantes após 20 semanas
de degradação. No caso em estudo, o fato da amostra 85/15 manter o grau de cristalinidade
constante em função da degradação pode estar relacionado ao efeito da alta concentração de
plastificante, mantendo as cadeias separadas, não permitindo a cristalização, considerando o
tempo de 18 semanas.
Existe uma controvérsia na literatura para explicar o aumento do grau de cristalinidade
com o aumento do tempo de degradação. A maioria dos autores afirma que ocorre um rearranjo
das cadeias menores geradas pelo próprio processo de degradação e como conseqüência, há a
formação de novos cristais, enquanto outros acreditam que à medida que a parte amorfa do
polímero degrada, permanece uma maior porcentagem de fase cristalina.
O processo de degradação de poliésteres, como é o caso do poli(ácido-láctico), é devido à
hidrólise das ligações ésteres, à qual ocorre nas regiões amorfas do polímero. Isto pode explicar o
aumento da cristalinidade também observado por esses autores (Li et al., 1990; Leenslag et al.,
1987).
41
O processo de degradação é mais complexo do que relacionar partes amorfas e cristalinas.
Grizzia et al. (1995), usando diferentes placas de PDLA amorfo observaram que o processo de
degradação é heterogêneo e que é mais rápido no centro do que na superfície, quando em contato
com o meio aquoso. Assim, o autor resume esse processo nos seguintes passos: inicialmente a
amostra é homogênea, em contato com o meio aquoso inicia-se a hidrólise e consequentemente
clivagem das ligações ésteres, confirmado pela diminuição da massa molar. No início do
processo é provável que a degradação ocorra na superfície devido ao gradiente de absorção de
água, mas pode se dissolver mais facilmente no meio comparado com os localizados no centro. A
concentração de grupos finais carbonila aumenta no centro e passa a catalisar o processo.
Esse comportamento auto-catalítico mostra-se ser geral para o processo de degradação nos
poliésteres alifáticos. Entretanto, esse processo é dependente da estrutura química e
configuracional das cadeias poliméricas, além da morfologia dos dispositivos (Li et al., 1990).
Lam et al. (1994), confirmaram essa hipótese ao mostrarem que membranas não porosas
de PLLA degradam mais rapidamente do que membranas porosas, pois no caso das membranas
não porosas o efeito auto-catalítico é favorecido enquanto que para as porosas ocorre a facilidade
na dissolução dos produtos.
No caso das membranas de PLLA em estudo, conforme pôde ser visualizado através de
MEV, distinguem-se duas morfologias: as membranas com menor percentual de plastificante em
sua composição (95/5 e 90/10) exibem uma morfologia mais densa e as membranas contendo
maior concentração de plastificante (85/15) apresentam uma morfologia porosa e globular.
42
Tabela 2. Dados de temperatura de fusão (Tf) e temperatura de transição vítrea (Tg) obtidos a partir do primeiro aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15.
Amostras
Tempo
(semanas)
Tf
(°C)
Tg
(°C)
0 175 56
4 175 55
95/5 8 176 55
16 176 57
18 176 55
0 174 58
4 174 58
90/10 8 175 56
16 175 56
18 176 54
0 176 53
4 175 56
85/15 8 175 58
16 175 57
18 176 53
43
Tabela 3. Dados temperatura de transição vítrea (Tg), temperatura de cristalização (Tc), entalpia de cristalização (∆Hc), temperatura de fusão (Tf), entalpia de fusão (∆Hf) e grau de cristalinidade (χ ) obtidos a partir do segundo aquecimento do DSC para as amostras 95/5, 90/10 e 85/15.
Tempo
(semanas)
Tg
(°C)
Tc
(°C) ∆Hc(J/g)
Tf
(°C) ∆Hf (J/g)
χ (%)
95-5
0 47 99 31 175 48 18
4 47 96 32 173 55 24
8 48 97 32 175 55 24
16 48 95 29 175 54 27
18 50 98 30 175 55 27
90-10
0 47 99 33 174 46 18
4 50 96 33 172 50 18
8 54 97 34 170 58 26
16 48 93 28 173 64 38
18 45 96 27 174 57 32
85-15
0 52 99 34 172 60 28
4 53 97 34 168 52 19
8 52 98 36 172 54 19
16 47 96 32 173 59 29
18 50 96 34 170 54 21
Comparando-se nossos resultados com o trabalho de Lam et. al. (1994), era de se esperar
que as membranas com plastificante apresentassem um maior aumento no grau de cristalinidade
em função do tempo de degradação, resultado oposto ao encontrado. Esses resultados nos levam
a concluir que o plastificante exerce um efeito mais acentuado no processo de degradação do que
o efeito devido à diferença morfológica entre as membranas, ou seja, o efeito da mobilidade das
cadeias prevalece sob a morfologia.
44
O aumento da cristalinidade é verificado mesmo para as membranas amorfas. Estudos
realizados com copolímeros PLA37.5/PGA25, completamente amorfos mostraram através de
análise de DSC que o copolímero apresenta uma Tg na faixa de 50-55 °C. Após 12 semanas em
tampão fosfato, além da Tg, apresentam um pico de fusão na faixa de 95-100 °C, indicando a
formação de regiões cristalinas confirmados por análises de Raio-X. Tg também pode diminuir
devido ao efeito plastificante da água. No caso do copolímero, é influenciada pela composição;
quanto maior a porcentagem de ácido glicólico em relação ao ácido láctico mais rápido é o
processo de degradação (Li et al., 1990).
Entretanto devemos lembrar que no caso das membranas porosas obtidas através da
adição de plastificante, a ação do mesmo diminuindo a Tg e dando maior mobilidade à cadeia é
muito mais marcante do que esse processo, e sua degradação acaba sendo muito mais rápida,
como observamos nos resultados dos ensaios de tração Essa estrutura porosa e a estrutura densa
das outras membranas podem ser visualizadas através das micrografias realizadas através de
MEV.
4.2 Estudo in vivo
4.2.1 Avaliação macroscópica
Os animais suportaram bem a anestesia e o procedimento cirúrgico sem registro de
ocorrências no período operatório. Durante o acompanhamento pós-operatório dos implantes não
foram observados sinais de complicações pós-cirúrgicas imediatas ou tardias. Tampouco foram
observados sinais clínicos de rejeição às membranas durante o período pós-operatório. Uma
premissa da adequada biocompatibilidade das membranas de PLLA/tri-etil-citrato.
Não houve sinais de rejeição às membranas e de infecção em qualquer defeito. Os defeitos
controle estavam frágeis e flexíveis quando tocados e eram revestidos por uma fina camada
fibrosa. Os defeitos tratados com a membrana de PLLA/tri-etil-citrato estavam cobertos por
tecido fibroso e mais rígidos e resistentes ao toque, mas nenhuma diferença pôde ser estabelecida
entre as diferentes membranas.
Macroscopicamente, foi possível observar a regeneração parcial do defeito ósseo a partir do
15º dia (2ª semana) através da análise do corte da calota craniana dos espécimes sacrificados, não
houve reação inflamatória exacerbada local, constatando a biocompatibilidade das membranas de
45
PLLA/tri-etil-citrato. Esta formação parcial óssea em curto período comprova que a membrana de
PLLA/tri-etil-citrato manteve um espaço ideal para a neoformação óssea evitando assim a
proliferação de células epiteliais para a região do defeito (Figura 19).
Figura 19. Observação macroscópica das calotas cranianas de coelho dissecadas, após 15 dias da cirurgia. (A) aspecto do material depois de retirada a pele; (B) visualização dos quatro defeitos: (1) PLLA/tri-etil-citrato 95/5; (2) controle; (3) PLLA/tri-etil-citrato 85/15 e (4) PLLA/tri-etil-citrato 90/10; e em (C) visualização de tecido da (*) dura-máter extravasado no defeito controle.
4.2.2 Avaliação microscópica
Tempo: 15 dias
Não houve diferenças significativas aos 15 dias entre as membranas de PLLA/tri-etil-
citrato. Verificaram-se a presença de uma cápsula de tecido conjuntivo ao redor do polímero,
com presença das células do tipo fibroblasto, além de fibras colágenas. Não houve processo
inflamatório expressivo ao redor do material implantado. A membrana serviu como uma barreira
46
impedindo a invasão do tecido mole adjacente. Notou-se o inicio da regeneração óssea a partir
das bordas do defeito. Vasos sanguíneos estavam presentes. A degradação das membranas de
PLLA/tri-etil-citrato não foi perceptível nesse intervalo de tempo (Figuras 20, 21 e 22).
O defeito controle foi invadido e preenchido por uma camada espessa de tecido
conjuntivo fibroso. Não houve regeneração óssea significativa (Figura 23).
Figura 20. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15 exibindo a formação de uma cápsula fibrosa (C) ao redor da membrana (M), aos 15 dias pós-implante. Tricômico de Masson 100x
C
M
C
47
Figura 21. Fotomicrografia da membrana de PLLA/tri-etil-citrato 80/10 exibindo a formação de uma cápsula fibrosa (C) ao redor da membrana (M), aos 15 dias pós-implante. Tricômico de Masson 100x
M
C
48
Figura 22. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 (M) exibindo o início do processo de neoformação óssea com a migração de vasos sanguíneos (VS), aos 15 dias pós-implante. Tricômico de Masson 100x.
M
VS
49
Figura 23. Fotomicrografa do defeito controle, nota-se a invasão da área por tecido conjuntivo fibroso, aos 15 dias pós-implante. Tricômico de Masson 200x.
Tempo: 30 dias
Houve continuidade no processo de regeneração óssea a partir das bordas. A regeneração
óssea ocorreu abaixo da membrana e acima houve a permanência de tecido mole. Em alguns
casos houve uma continuidade de novo tecido ósseo formado (fechamento total), entretanto com
uma camada delgada de osso neo-formado e em outros um fechamento parcial do defeito.
Verificou-se a presença de uma delgada cápsula de tecido conjuntivo ao redor do espaço do
polímero e a presença de muitos vasos sanguíneos. Diferenças na velocidade de degradação das
diferentes membranas de PLLA/tri-etil-citrato não foi perceptível, mas o espaço quando
comparado com o menor tempo foi aparentemente menor. O defeito controle continuava
abundante em células fibrosas como o verificado ao 15º dia (Figuras 24, 25 e 26).
A região de defeito controle, mesmo com a invasão do tecido conjuntivo apresentou
ligeiras neoformações ósseas isoladas (Figura 27).
50
Outra importante observação foi a capacidade de as membranas manterem o espaço
necessário para que a regeneração ocorresse óssea sob elas. Outras membranas disponíveis para
RTG necessitam serem combinadas com enxertos ósseos, autógenos ou alógenos para suportar ou
estabilizar as membranas evitando assim o seu colapso para a região do defeito (Stavropoulos et
al., 2004).
Figura 24. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15 com regeneração óssea significativa nas bordas do defeito (→) aos 30 dias. Localização da membrana (M) e tecido conjuntivo fibroso (C). Tricômico de Masson, 20x.
M
C
51
Figura 25. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 mostrando uma adequada regeneração óssea abaixo da membrana (M) aos 30 dias. Cápsula fibrosa fina (C); osso neoformado (O), osteoblastos (→) e osteócitos (►). Tricômico de Masson, 200x.
C
O
52
Figura 26. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 mostrando uma adequada regeneração óssea abaixo da membrana (M) aos 30 dias. Cápsula fibrosa fina (C); grande quantidade de vasos sanguíneos (VS); osso neoformado (O). Tricômico de Masson, 200x
M
VS
O
53
Figura 27. Fotomicrografa do defeito controle nota-se a invasão da área por tecido conjuntivo fibroso, aos 30 dias pós-implante, com formações ósseas isoladas (O). Tricômico de Masson 20x
Tempo: 60 dias
Nota-se o processo de ossificação adiantado. Espessamento da camada de osso da periferia
para o centro do defeito, a presença de trabéculas ósseas maiores, maior número de osteócitos.
Foi verificado o fechamento total nos defeitos com as membranas. A cápsula fibrosa apresentou-
se quase ausente. A região referente à membrana de PLLA/tri-etil-citrato de 85/15 estava bem
menor quando comparado aos referentes às membranas 95/5 e 90/10 (Figura 28).
No defeito controle houve pouca regeneração óssea a partir das bordas, não perfazendo uma
camada continua de osso. Apresentando muito tecido conjuntivo fibroso no local do defeito
(Figura 29).
O
54
Tais resultados comprovam a eficiência das membranas de PLLA/tri-etil-citrato em se
adaptar as condições corpóreas causando o mínimo de irritação e sendo bem aceitas pelo
organismo (Scapin et al., 2003).
Takata et al. (2001) confirmaram essa observação, ao constatarem que as membranas a base
de PLA influenciavam a proliferação e diferenciação de células provenientes do ligamento
periodontal mais do que outras membranas já utilizadas em RTG.
T
VS
VS
55
Figura 28. Fotomicrografia de membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 aos 60 dias mostrando novo osso formado no centro do defeito. Vasos sanguíneos (VS) e tecido conjuntivo (T) necessário para a formação de novo osso. Tricômico de Masson, 100x.
Figura 29. Fotomicrografia do defeito controle mostrando a regeneração óssea restrita à borda do defeito (→) aos 60 dias. Espaço do defeito invadido e preenchido por tecido conjuntivo (T) e vasos sanguíneos (*). Tricômico de Masson, 200x.
Tempo: 90 dias
Regeneração óssea completa para os defeitos com as membranas de PLLA/tri-etil-citrato.
Presença de tecido ósseo secundário ou pelo menos mais organizado. A degradação das
membranas de PLLA/tri-etil-citrato 95/5 e 90/10 não apresentam diferenças significativas,
T
*
*
56
entretanto a membrana de PLLA/tri-etil-citrato 85/15 apresentou uma maior velocidade de
degradação evidenciada pelo menor sitio. O defeito controle apresentou fechamento parcial do
defeito e com grande quantidade de fibras colágenas melhores organizadas quando comparadas
com o menor tempo (Figura 27).
Figura 30 Fotomicrografia do defeito contendo membrana de PLLA/tri-etil-citrato 90/10 aos 90 dias mostrando o fechamento total do defeito. Presença de uma fina camada de tecido conjuntivo (cabeça de seta) abaixo do local de implante e canais de Havers (→). Tricômico de Masson, 100x.
Os resultados in vivo confirmaram os estudos in vitro, nos quais as membranas com
menores concentrações de plastificante (95/5 e 90/10) degradaram menos quando comparadas à
membrana com maior concentração de tri-etil-citrato (85/15) (Silva et al., 2002; Luciano et al.,
57
2003). Quanto à capacidade das membranas de PLLA/tri-etil-citrato em isolar o defeito ante a
proliferação de células epiteliais e simultaneamente manter um espaço vital para a neoformação e
reorganização óssea, todas as membranas demonstraram resultados satisfatórios (Owen et al.,
2005).
As membranas do grupo 85/15 foram as que melhor se adaptaram aos requisitos de uma
membrana para RTG periodontal, visto que elas permitiram a regeneração óssea sob elas e
degradaram no período desejado de 90 dias (Kim et al., 2006; Knesser et al., 2006).
Os resultados da classificação histológica da regeneração óssea nos quatro grupos em
função dos quatro diferentes períodos de implantação estão expostos na Tabela 4, na qual
podemos observar que nos grupos teste houve formação total de osso e no controle apenas parcial
até 90 dias pós-cirurgia de acordo com o critério de classificação de Donos et al. (2004).
Tabela 4. Avaliação da regeneração óssea nos grupos de estudo (membranas PLLA/tri-etil-
citrato em concentrações 95/5, 90/10 e 85/15) e no grupo controle em função do tempo de estudo.
Classificação da Regeneração Óssea PLLA/tri-etil-
citrato (%) N Não Fechamento
Fechamento Parcial
Fechamento Total
95/5 15 dias 3 3 0 0 30 dias 3 0 3 0 60 dias 3 0 1 2 90 dias 3 0 0 3
90/10 15 dias 3 3 0 0 30 dias 3 0 3 0 60 dias 3 0 1 2 90 dias 3 0 0 3
85/15 15 dias 3 3 0 0 30 dias 3 0 3 0 60 dias 3 0 0 3 90 dias 3 0 0 3
Controle 15 dias 3 3 0 0 30 dias 3 3 0 0 60 dias 3 2 1 0 90 dias 3 1 2 0
.
58
59
Capítulo 5
Conclusões
Concluímos que as membranas de PLLA/tri-etil-citrato podem ser utilizadas para RTG
periodontal.
Todos os defeitos ósseos nas calvárias de coelhos contendo membranas tiveram fechamento
completo após 90 dias. Sendo que as membranas com concentração de 85/15 PLLA/plastificante
apresentaram melhor desempenho no experimento in vivo, pois permitiram o fechamento
completo com 60 dias de implantação e foram reabsorvidas quase que completamente após 90
dias.
Os resultados das análises da degradação in vitro, também apontaram a membrana
PLLA/tri-etil-citrato 85/15 como a mais adequada para a RTG periodontal, pois demonstraram
melhor taxa de degradação em função do período de simulação de implante, a partir de sua
avaliação macroscópica, por microscopia eletrônica de varredura, ensaio mecânico de tração e
calorimetria diferencial de varredura.
60
Capítulo 6
Sugestões para Próximos Trabalhos
Substâncias farmacêuticas, como antibióticos, antiinflamatórios ou fatores de crescimento
poderiam ser adicionados à composição das membranas de PLLA/tri-etil-citrato a fim de acelerar
o processo regenerativo.
Emprego das membranas na técnica de RTG periodontal propriamente dita.
61
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