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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR
VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO
RÁPIDO DUAL PATH PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO
DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA
FORTALEZA-CEARÁ 2011
2
EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR
VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH
PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientadora: Profa. Dra.: Claudia Maria Leal Bevilaqua
FORTALEZA-CEARÁ 2011
3
Q3v Queiroz Júnior, Eudson Maia de
Validação do teste imunocromatográfico rápido Dual Path Platform para o diagnóstico da leishmaníase visceral canina / Eudson Maia de Queiroz Júnior. — Fortaleza, 2011.
77 p. ; il. Orientadora: Profª. Drª. Claudia Maria Leal Beviláqua. Co-orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Souza Nunes
Pinheiro. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências
Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
1. Diagnóstico. 2. Cães. 3. Leishmaníase visceral. 4. Sorologia. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 616.9364
4
EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR
VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH
PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: ____/_____/_____
Banca Examinadora
_________________________________ Claudia Maria Leal Bevilaqua
Orientadora – UECE
_________________________________ Fernanda Cristina Macedo Rondon
Examinadora – UECE
_________________________________ Sthenia Santos Albano Amóra
Examinadora-UFERSA
5
Aos meus pais, Eudson e Lêda.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente a Deus, pela família maravilhosa que escolheu pra mim,
que sempre será um símbolo de união e cooperação;
Aos meus pais Eudson Maia de Queiroz e Lucileide (Lêda) Xavier de Lima
Queiroz, agradeço pelo amor incondicional, pela credibilidade, pelo exemplo de caráter
e principalmente por me mostrarem que todas as pessoas são iguais perante o Criador,
devendo ser tratadas como tal. Agradeço pelo esforço para garantir que seus filhos
tivessem uma boa educação e pelo exemplo de matrimônio;
Aos meus irmãos, Érika Régia de Lima Queiroz e Edson Maia de Queiroz Neto,
por estarem sempre presentes, seja nas alegrias ou na tristeza; agradeço-lhes pela
confiança e por acreditarem em meu potencial, sempre me incentivando a lutar pelos
meus sonhos;
À Neudete de Sousa Oliveira (Dedê), por todos esses anos de dedicação à
família, sempre disposta a fazer nossos caprichos; você é uma segunda mãe para mim e
para meus irmãos.
Ao meu primo Vanderilo Rodrigues de Oliveira Júnior (In Memorian), por ter
me recebido em sua casa, por toda ajuda nos primeiros passos dessa caminhada.
Obrigado pelos momentos alegres que você nos proporcionou, saudades!!;
À minha noiva, Thamires Soares Guerreiro, pelo carinho, compreensão e amor
dedicado; minha baixinha, você é muito importante para mim! Você é uma das razões
da minha luta;
À Maria Lúcia de Lima Xavier (tia e madrinha), pelo apoio e ajuda fundamental
nos primeiros anos da minha vinda para Fortaleza;
À Vera Lúcia de Lima Xavier (tia), pelo apoio, pela disposição e o interesse no
meu crescimento;
À amiga Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, pela amizade incondicional
que faz eu me sentir mais seguro e confiante; obrigado pela credibilidade e
principalmente pela sinceridade prestada;
Às amigas e colegas de laboratório Ana Caroline Moura Rodrigues, Juliana
Ribeiro e Rafaele Almeida e ao amigo João Batista e Silva Júnior (Jota), pela
participação e cooperação neste trabalho durante as coletas no CCZ e UHV-FAVET;
À toda a equipe da UHV-FAVET pelo apoio nas coletas, em especial aos
colegas médicos veterinários: Dra. Érika, Dr. Reginaldo e Dr. Marcio.
7
À professora Dra. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro por ter aceito ser minha
co-orientadora e por toda atenção dispensada durante minhas dúvidas e na elaboração
do artigo científico;
À minha orientadora Professora Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua, pela
oportunidade dada há seis anos quando dei os primeiros passos na iniciação científica.
Pelos ensinamentos, orientação e principalmente pelo exemplo a qual almejo seguir;
Ao Dr. Alexander Amaral Medeiros, Dra. Evanisa Alves Ventura e toda a
equipe do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Fortaleza, por todo apoio para que
esse trabalho de concretizasse;
À Dra. Fernanda Cristina Macedo Rondon, por toda a atenção dispensada e pela
disposição em ajudar. Mesmo naqueles dias mais tumultuados ela sempre arranja um
tempinho para as nossas dúvidas e sugestões. Sou muito grato a você, muito obrigado
pela confiança, paciência e por ser essa amiga que você é;
À Professora Dra. Sthenia Santos Albano Amóra pela confiança em propor que
eu realizasse esse trabalho e pela ajuda durante todo o decurso do mestrado, sempre
muito atenciosa e disposta a ajudar;
À Dra. Ana Lourdes por sempre compartilhar seu tempo com conselhos, gestos
de amizade e ensinamentos;
Às doutorandas Lorena Mayana Beserra de Oliveira, Iara Térsia Freitas Macedo,
pela solidariedade e ensinamentos compartilhados e por toda atenção dispensada no
decorrer desse período.
A CAPES que proveu apoio financeiro, sob a forma de bolsa de estudos, durante
a minha passagem pelo mestrado.
8
RESUMO
A leishmaníase visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no mundo e o cão é
o seu principal reservatório. Na atualidade, a LV tem se expandido para muitos centros
urbanos do Brasil, como conseqüência principalmente de falhas nas medidas de controle
direcionadas ao reservatório doméstico, que se traduzem nos tipos de diagnósticos
utilizados e na demora dos seus resultados. Um novo método de diagnóstico rápido,
Dual Path Platform (DPP®) baseado na imunocromatografia, está sendo testado. Assim,
o principal objetivo desse estudo foi contribuir para o controle da leishmaníase visceral
canina (LVC), através da validação do teste rápido DPP® para detecção de anticorpos
anti-Leishmania chagasi. O teste imunocromatográfico rápido (DPP – Bio-
Manguinhos®) e o ensaio imunoenzimático (EIE® – Bio-Manguinhos®) foram validados
usando o teste de imunofluorescência indireta (IFI® – Bio-Manguinhos®) como padrão-
ouro. Foram examinamos 103 cães divididos em três grupos com diferentes sinais
característicos de leishmaníase visceral: assintomáticos (n = 35), oligossintomáticos (n
= 31) e sintomáticos (n= 37). Amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica dos
cães obtendo-se soro utilizado no IFI® e EIE®, enquanto que foi coletada uma gota de
sangue da ponta da orelha de cada cão para a realização do DPP®. A análise dos dados
foi realizada sobre o total das amostras e sobre os grupos dos diferentes sinais clínicos,
usando uma tabela de contingência 2 x 2 e analisados pelo GraphPad PRISMTM 5.0. O
DPP® sobre o total das amostras, independente de sinais, mostrou sensibilidade de
56,1% e especificidade de 100% quando comparado ao IFI®. Quando o DPP® foi usado
no diagnóstico de cães assintomáticos a sensibilidade foi de 12% e a especificidade de
100%. Examinando cães oligossintomáticos, a sensibilidade foi de 52,4% e
especificidade de 100%. Para cães sintomáticos, a sensibilidade e a especificidade do
DPP® foram de 88,9% e 100%, respectivamente. O teste de EIE® sobre o total das
amostras, independente dos sinais, mostrou sensibilidade de 50% e especificidade de
100%. Quando EIE® foi usado no diagnóstico de cães assintomáticos a sensibilidade foi
de 4% e a especificidade de 100%. Examinando cães oligossintomáticos, a sensibilidade
do EIE® foi de 38,1% e a especificidade de 100%. Para cães sintomáticos a
sensibilidade e a especificidade do EIE® foram de 88,9% e 100%, respectivamente. Em
conclusão, o DPP® apresentou elevada sensibilidade no diagnóstico de cães
sintomáticos, mas baixa sensibilidade em cães assintomáticos e oligossintomáticos;
porém o DPP® apresentou desempenho superior aos obtidos pelo EIE®, sugerindo que o
9
DPP® pode ser usado como teste de triagem sorológica do programa de controle da
leishmaníase visceral canina.
Palavras Chave: Diagnóstico. Cães. Leishmaníase Visceral. Sorologia.
10
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis (VL) is a major public health problem in the world and the dog is
the main reservoir for this disease. Currently, the VL has spread to many urban centers
in Brazil, mainly as a result of failures in control measures aimed at the domestic
reservoir, which are reflected the type of diagnosis used and the delay of its results. A
new method for rapid diagnosis, Dual Path Platform (DPP®), based on
immunochromatography is being tested. Thus, the main objective of this study was to
contribute to the control of canine visceral leishmaniasis (CVL), by validating the DPP®
rapid test for detection of anti-Leishmania chagasi antibodies. The
immunochromatographic test (DPP–Bio-Manguinhos®) and Enzyme-linked
immunosorbent assay (EIE – Bio-Manguinhos®) have been validated using Indirect
Immunofluorescence (IFI – Bio-Manguinhos®) as the gold standard. We examined 103
dogs divided into three groups based on different clinical signs of visceral
leishmaniasis: asymptomatic (n = 35), oligosymptomatic (n = 31) and symptomatic (n =
37). Blood samples were collected from the cephalic vein to obtain serum for use with
the IFI® and EIE®. A drop of blood from the tip of the ear was also collected from each
dog to utilize with the DPP® test. Data analysis was performed on the total sample and
group of different clinical signs using a contingency table 2 x 2 and analyzed by
GraphPad PRISMTM 5.0. For the total sample, regardless of disease signs, DPP®
showed sensitivity of 56.10% and specificity of 100% when compared to IFI®. When
DPP® was used in the diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity was 12% and the
specificity was 100%. Examining oligosymptomatic dogs, DPP® sensitivity was 52.4%
and the specificity was 100%. For symptomatic dogs DPP®, the sensitivity and
specificity were 88.9% and 100% respectively. EIE® on total sample, regardless of
signs, showed a sensitivity of 50% and specificity of 100%. When EIE® was used in the
diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity was 4% and the specificity 100%.
Examining oligosymptomatic dogs, EIE® sensitivity was 38.10% and the specificity
was 100%. For symptomatic dogs EIE® sensitivity and specificity were 88.9% and
100% respectively. In conclusion, the DPP® showed high sensitivity in the diagnosis
of symptomatic dogs, but low sensitivity in asymptomatic and oligosymptomatic dogs,
however the DPP® showed superior performance to those obtained by EIE®, suggesting
that the DPP® can be used as serological screening test control program of canine
visceral leishmaniasis.
11
Keywords: Diagnosis. Dogs. Visceral Leishmaniasis. Serology.
12
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Formas amastigotas (esquerda) e promastigotas (direita) de
Leishmania spp......................................................................................................
19
Figura 2. Vetores do gênero Lutzomyia spp, a-Fêmea, b-Macho..........................
Figura 3. Ciclo clássico de transmissão de Leishmania spp.................................
Figura 4. Número de casos e incidência de leishmaníase visceral. Ceará, 2002 a
2009................................................................................................................
Figura 5. 5a. Cão com dermatite grave, alopecia, hipotricose e
hiperqueratose. 5b. Cão com uveíte grave...........................................................
Figura 6. Teste imunocromatográfico Dual Path Platform (DPP®)...................
20
21
22
24
34
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Validação do DPP® usando IFI® como padrão-ouro de acordo com cães
assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos e sobre o total das amostras, com grau
de concordância Kappa (к)........................................................................................44
Tabela 2. Validação do EIE® usando IFI® como padrão-ouro de acordo com cães
assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos e sobre o total das amostras, com grau
de concordância Kappa (к).........................................................................................44
Tabela 3. Detecção de anticorpos anti-Leishmania pelos testes DPP®, IFI® e EIE® no
diagnóstico da leishmaníase visceral canina de acordo com as formas clínicas da
doença........................................................................................................................44
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
WHO Organização Mundial de Saúde
LV Leishmaníase Visceral
UECE Universidade Estadual do Ceará
PH Potencial Hidrogênio Iônico
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
DNA Ácido desoxirribonucleico
PCR Reação de polimerase em cadeia
RIFI Reação de imunofluorescência indireta
ELISA
CCZ
Ensaio imunoenzimático indireto
Centro de Controle de Zoonoses
µL Microlitros
mL Mililitros
kg Quilograma
g Grama
cm Centímetro
°C Graus Celsius
% Porcentagem
15
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................. 18
2.1 Generalidades sobre a Leishmaníase Visceral ..................................................... 18
2.1.1 Definição .................................................................................................. 18
2.1.2 Agente Etiológico e Taxonomia ............................................................... 18
2.1.3 Ciclo Biológico ......................................................................................... 19
2.1.4 Epidemiologia ........................................................................................... 21
2.1.5 Resposta imunológica às leishmaníases ................................................... 22
2.1.6 Apresentação Clínica ................................................................................ 24
2.1.7 Controle .................................................................................................... 25
2.2 DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VICERAL CANINA .......................... 26
2.2.1 Diagnóstico clínico ................................................................................... 26
2.2.2 Métodos parasitológicos ........................................................................... 27
2.2.3 Métodos moleculares................................................................................28
2.2.4 Métodos sorológicos.................................................................................29
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 35
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA..............................................................................................................36
5. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 37
5.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 37
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 37
6. CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................... 38
7. CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 52
8. PERSPECTIVAS ................................................................................................................... 53
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 54
10. APÊNDICES............................................................................................................66
16
INTRODUÇÃO
As leishmaníases são doenças causadas por protozoários flagelados pertencentes
ao gênero Leishmania, com uma grande diversidade de manifestações clínicas.
Apresentam uma incidência anual de 2 milhões de casos humanos, sendo 500.000 casos
de leishmaníase visceral (LV), caracterizada como doença crônica e fatal quando não
tratada (WHO, 2010). É causada por Leishmania donovani na Índia e no leste da África,
por L. infantum na Europa e norte da África (LUKES et al., 2007, REY, 2008) e nas
Américas é causada pelo protozoário Leishmania chagasi (sin. Leishmania infantum)
(MOREIRA et al., 2007) e transmitida principalmente por Lutzomyia longipalpis, sendo
o cão o principal reservatório doméstico do parasita (SOLANO-GALLEGO et al., 2001.
Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil são responsáveis por 90% dos casos
registrados no mundo (WHO, 2010).
No Brasil, a LV é uma doença endêmica com registro de surtos freqüentes e em
franca expansão, ocorrendo registro de casos da doença em áreas antes consideradas
livres, como na região Sul (KRAUSPENHAR, et al., 2007; THOMAZ-SOCCOL et al.,
2009). No Estado do Ceará, nordeste brasileiro, a doença encontra-se disseminada e a
cidade de Fortaleza concentra a maior incidência em humanos (CEARÁ, 2011). Em
relação à população canina de Fortaleza, levantamento epidemiológico demonstrou que
a doença está difundida tanto nos cães domiciliados quanto nos cães de movimento
irrestrito (RONDON et al., 2008).
O Ministério da Saúde do Brasil na busca do controle da LV preconiza a
eutanásia de cães soropositivos, o controle do vetor, diagnóstico precoce e tratamento de
casos humanos (BRASIL, 2006). No entanto o impacto dessas medidas não tem surtido
o efeito esperado na redução de casos humanos, determinando assim a necessidade de
reavaliação das ações propostas. (WHO, 2010). Por isso, um correto diagnóstico é um
importante passo para evitar a eutanásia desnecessária de cães e a transmissão da
doença, pois assim evita-se que o cão infectado permaneça no ambiente como fonte de
infecção (FERREIRA et al., 2008).
Em cães, o diagnóstico clínico isolado da doença não é suficiente para detectar
animais positivos, devido ao largo espectro de sinais clínicos, desde animais saudáveis a
casos em estágio avançado da doença (CAMARGO; LANGONI et al., 2006). O
diagnóstico definitivo da LV pode ser obtido através da demonstração de amastigotas
em tecido do animal infectado ou de promastigotas em cultura ou através da detecção do
17
DNA utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Infelizmente, estes
métodos requerem procedimentos invasivos, um laboratório bem equipado e técnicos
treinados, o que é atualmente inviável em inquéritos epidemiológicos (BRASIL, 2006;
GOMES et al., 2008; LIMA et al., 2010). Os métodos sorológicos são os mais utilizados
em levantamentos epidemiológicos, sendo os mais empregados o teste de
Imunofluorescência Indireta (IFI), Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e teste
imunocromatográfico rápido (QUEIROZ et al., 2009; PALTRINIERI et al., 2010).
O teste imunocromatográfico DPP® (Bio-Manguinhos®) é um teste qualitativo
para detecção de anticorpos anti-Leishmania que utiliza a proteína recombinante K39
(rK39) como antígeno. Esta proteína é o produto de um gene clonado a partir de L.
chagasi e que contém uma repetição de 39 aminoácidos conservados entre as espécies
viscerotrópicas de Leishmania (Leishmania donovani, L. infantum e L. chagasi). A
presença de anticorpos anti-rK39 é indicativo de infecção, e ainda não foi relatado a
reatividade com outros tripanossomatídeos (BURNS-JR et al., 1993; BISUGO et al.,
2007).
Uma das falhas apontadas no controle da leishmaníase visceral canina (LVC) é o
longo intervalo de tempo, de 30 a 80 dias, entre o diagnóstico e a retirada dos cães
positivos do ambiente, favorecendo a transmissão da doença (LIRA et al., 2006). Desta
forma, novas alternativas de diagnóstico são necessárias para auxiliar no controle desta
enfermidade e o uso do DPP® pode ser um recurso para obtenção de resultados mais
eficientes, precisos e confiáveis do diagnóstico da LVC, impedindo que reservatórios
transmitam o parasita. Desta forma, o objetivo desse estudo foi contribuir para o
controle da leishmaníase visceral canina (LVC), através da validação do teste
imunocromatográfico rápido DPP® para detecção de anticorpos anti-Leishmania
chagasi, em cães com e sem sinais clínicos da doença e comparar seus resultados com o
teste de Ensaio Imunoenzimático (EIE®), de Bio-Manguinhos®.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Generalidades sobre a Leishmaníase Visceral.
2.1.1 Definição
A leishmaníase visceral (LV) é uma zoonose sistêmica potencialmente fatal
quando não tratada. É conhecida por: calazar, barriga d’água, entre outras
denominações. Caracteriza-se pela infecção de fagócitos mononucleares pelo
protozoário L. chagasi (sin. L. infantum). No Brasil é uma doença endêmica e até o
momento seu principal transmissor é o inseto Lutzomyia. longipalpis (BARATA et al,
2004; BRASIL, 2006). Esta enfermidade é um grande problema de saúde pública em
mais de 88 países, possuindo uma incidência anual de 500 mil casos humanos (WHO,
2010). Esta zoonose grave afeta milhões de cães na Europa, Ásia, Norte da África e
América do Sul (DUPREY et al., 2006).
2.1.2 Agente Etiológico e Taxonomia
L. chagasi faz parte do Complexo donovani que abrange todas as espécies de
leishmânias ditas viscerotrópicas. Durante seu ciclo vital as leishmânias apresentam
duas formas distintas, amastigota, encontrada dentro de células do sistema fagocítico
mononuclear do hospedeiro vertebrado e promastigota, no tubo digestivo do hospedeiro
invertebrado (Fig. 1) (REY, 2008).
Os agentes etiológicos da LV são protozoários classificados taxonomicamente
como pertencentes ao Reino Protista (HAEKEL 1886); Subreino Protozoa
(GOLDFUSS 1817); Filo Sarcomastigophora (HONIBERG ; BALAMUTH 1963);
Subfilo Mastigophora (DIESING 1866); Classe Zoomastigophora (CALKINS 1909);
Ordem Kinetoplastida (VICK KERMAN 1976); Subordem Trypanosomatina (KENT
1880); Família Trypanosomatidae (GROBBEN 1905); Gênero Leishmania (ROSS
1903); Subgênero Leishmania (SAF’JANOVA 1982) e Espécies Leishmania donovani
(LAVERAN ; MENSIL 1903), L. infantum (NICOLE 1908) e L. chagasi (CUNHA ;
CHAGAS 1937) (CABRERA, 1999).
19
Figuras. 1a. Formas amastigotas (esquerda) e 1b. promastigotas (direita) de Leishmania
spp. A seta vermelha indica amastigotas parasitando macrófago. A seta preta indica o
cinetoplasto .
Fonte: http://picsicio.us e https://www.msu.edu/course/zol
2.1.3 Ciclo biológico
O ciclo biológico de L. chagasi é do tipo heteroxênico, envolvendo como
principal transmissor as fêmeas de L. longipalpis e os vertebrados que funcionam como
hospedeiros e reservatórios (GOMES et al., 1995; BRASIL, 2006). No velho mundo a
transmissão dos parasitas Leishmania spp ocorre através de flebotomíneos pertencentes
ao gênero Phlebotomus e no novo mundo através do gênero Lutzomyia (Fig. 2), que são
encontrados em regiões de climas quentes e temperados, apresentando atividade
crepuscular e pós-crepuscular (RATH et al., 2003).
A infecção do vetor ocorre pela ingestão, durante o repasto sanguíneo, de
amastigotas de Leishmania spp existentes no interior dos macrófagos, células do
Sistema Mononuclear Fagocitário, presentes na pele do hospedeiro infectado. Na porção
média do tubo digestivo do inseto, as amastigotas transformam-se em promastigotas, e
se multiplicam até originarem as promastigotas metacíclicas infectantes. O parasita leva
aproximadamente de 6 a 9 dias para completar seu desenvolvimento no vetor, mas esse
tempo pode variar dependendo da espécie de flebotomíneo. Ainda é escasso o
conhecimento acerca da longevidade e da fecundidade de flebotomíneos infectados por
Leishmania spp (KAMHAWI et al., 2006).
a b
20
Durante o processo de digestão do sangue, ingerido pelo flebotomíneo, há
formação de uma matriz, formada principalmente por quitina, conhecida como matriz
peritrófica, cuja função é proteger o epitélio intestinal do inseto. Porém, essa matriz
peritrófica acaba por proteger as formas promastigostas do parasita da ação de enzimas
digestivas do flebotomíneo. A matriz peritrófica garante proteção por tempo suficiente
para que cerca de 50% das formas iniciais do parasita, ingeridas pelo inseto, se
diferenciem em formas mais resistentes (KAMHAWI et al., 2006; PIMENTA et al.,
1997). Após resistirem à ação das enzimas presentes na porção média do tubo digestivo
do vetor as leishmânias escapam da matriz peritrófica, através da excreção da enzima
quitinase, aderem ao epitélio intestinal onde completam o seu ciclo de vida dentro do
inseto vetor, se desenvolvendo e se diferenciando até darem origem às formas infectivas
(LEHANE et al., 1997).
Vale ressaltar que o crescimento parasitário no vetor só será abundante se, após
o repasto sanguíneo infectante, a fêmea vier a alimentar-se de sucos vegetais ou de
substâncias açucaradas. Se, em lugar disso, houver nova refeição de sangue, por volta
do quarto ou quinto dia, os flagelados degeneram ou a infecção torna-se leve. Assim,
será improvável que os parasitos possam ser inoculados em novos hospedeiros pela
picada dos insetos (REY, 2008).
No Brasil, a transmissão se dá pela picada dos vetores L. longipalpis e acredita-
se que L. cruzi em alguns municípios de Mato Grosso do sul (BRASIL, 2006), porém
admite-se a hipótese da transmissão entre a população canina pela ingestão de
carrapatos Rhipicephalus sanguineus infectados (COUTINHO, 2005; PAZ et al., 2010)
e transmissão venérea (SILVA et al., 2009). Porém, não existem evidências sobre a
importância epidemiológica destes mecanismos de transmissão para humanos ou na
Figura 2: Vetores do gênero Lutzomyia spp, a-Fêmea, b-Macho.
Fonte: http://www.parasitesandvectors.com
21
Figura 3. Ciclo clássico de transmissão de Leishmania spp
Fonte: Organização Mundial da saúde (2008)
manutenção da enfermidade. Até o momento, só foi comprovada a transmissão direta no
cão, através do coito (PAZ et al., 2010).
2.1.4 Epidemiologia
A LV é encontrada nas Américas Central e do Sul, Ásia, África e região do
Mediterrâneo. Nas Américas a LV ocorre desde o México até a Argentina. A LV foi
descrita em 12 países, porém Venezuela, Colômbia, Bolívia, Equador, Peru e Brasil
apresentam prevalência mais elevada (AGUILLAR et al., 1998; DAVIES et al., 2000).
A LV inicialmente descrita como doença de ambiente silvestre ou rural, na
atualidade é apontada como doença reermegente, com incidência crescente e em franco
processo de urbanização em cidades de grande e médio porte (ALVES ;
BEVILACQUA, 2004; MONTEIRO et al., 2005; BRASIL, 2006).
O cão é considerado o principal reservatório doméstico de L. chagasi, tanto em
ambiente urbano quanto rural. Os reservatórios silvestres da doença são raposas
(Cerdocyon thous), marsupiais (Didelphis albiventris) e roedores (Nectomys squamipes)
(DANTAS-TORRES et al., 2006; REY, 2008). A importância do cão como reservatório
de L. chagasi deve-se ao fato de apresentar intenso parasitismo cutâneo e ser capaz de
transmitir o parasita ao vetor mesmo assintomático, constituindo-se em elo essencial
para disseminação e amplificação de focos e normalmente antecedendo o acometimento
de casos humanos (MADEIRA et al., 2004; NUNES et al., 2010).
No Brasil, historicamente, os casos de LV concentravam-se na região Nordeste.
Entretanto, nos últimos anos, as regiões sudeste e norte assumiram uma proporção
significativa desses casos. Recentemente, ocorreram relatos de LVC no Paraná
22
(THOMAZ-SOCCOL et al., 2009) e no Rio Grande do Sul (KRAUSPENHAR, et al.,
2007) anteriormente consideradas áreas livres da doença.
No Ceará, observa-se uma incidência crescente da LV nos últimos anos (Fig. 4),
sendo que em 2008 foram notificados 814 casos humanos, sendo 576 confirmados em
97 municípios. Destes, foram confirmados 31 óbitos, sendo 15 em Fortaleza. Em 2009,
foram confirmados 666 casos, em 102 municípios, com 33 óbitos, sendo 10 óbitos em
Fortaleza, atingindo todas as faixas de idade, embora 36% tenham ocorrido em crianças
de 1 a 4 anos (243 casos). Quanto ao sexo, apesar de 64% terem sido do sexo
masculino, ocorreram casos no sexo feminino em todas as faixas de idade. A letalidade
é elevada (5,6% em 2008 e 5% em 2009). Os municípios com maior número de casos
confirmados em 2009 foram Fortaleza (390 casos), Sobral (92 casos) e Barbalha (25
casos) (CEARÁ, 2009; CEARÁ, 2011).
A ampla distribuição geográfica da LV deve-se a urbanização desordenada,
migração humana constante, desmatamento acentuado, adaptação do vetor a novos
ecótopos e a presença do cão, reservatório da LV no ambiente doméstico (ALVES ;
BEVILACQUA, 2004; LAINSON ; RANGEL, 2005).
2.1.5 Resposta Imunológica às leishmaníases
Estudos recentes indicaram que a patogenia das Leishmaníases se processa por
uma resposta não adequada por parte do sistema imunológico, sendo relatado que o
Figura 4: Número de casos e incidência de leishmaníase visceral. Ceará, 2002 a 2009.
Fonte: Secretária da Saúde do Estado do Ceará.
23
surgimento da doença, bem como sua evolução seriam consequência de complexas
interações entre o parasita e a resposta imune desencadeada pelo hospedeiro (MANNA
et al., 2006; MIRANDA et al., 2007; BANETH et al., 2008).
Para que ocorra o estabelecimento da infecção por Leishmnia spp é necessário
que o parasita adentre as células fagocitárias (monócitos, macrófagos residentes e as
células dendríticas) e polimorfonucleares neutrófilos. As células fagocitárias da
imunidade inata utilizam mecanismos químicos e celulares de resposta rápida para
controlar o crescimento e/ou eliminação do agente invasor (ABBAS et al., 2008;
PALTRINIERI, 2010).
Após a fagocitose dos protozoários, estes ativam mecanismos intrínsecos
capacitando-os a resistirem à ação de enzimas hidrolíticas e espécies reativas ao
oxigênio, (PALTRINIERI, et al., 2010 ASSCHE et al., 2011). Os protozoários ao
conseguirem escapar dos mecanismos da resposta inata, podem desenvolver dois tipos
de respostas adquiridas: uma celular, com participação dos linfócitos T, e outra do tipo
humoral, com a produção de anticorpos e envolvimento de linfócitos B (ABBAS et al.,
2008).
A LV por ser provocada por um parasita estritamente intracelular, necessita da
participação dos linfócitos T helper 1 (Th1) e células de memória, presentes na resposta
celular, para que os macrófagos consigam controlar de modo eficaz a infecção (ABBAS
et al., 2008). Contrariamente, os animais que desenvolvem resposta predominantemente
do tipo humoral, com a participação de células T helper 2 (Th2) e elevada produção de
anticorpos, apresentam quadros clínicos severos com prognóstico reservado, devido à
deposição de complexos imunes (CIARAMELLA ; CORONA, 2003; MIRANDA et al.,
2007).
Quando a resposta celular por linfócitos Th1 é majoritária (Th1 > Th2), observa-
se um padrão de resistência à infecção por Leismania spp, mediada por interferon-γ
(IFN- γ), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e as interleucinas IL-2 e IL-12; todos com
características protetoras em relação à doença, por ativarem macrófagos responsáveis
pela eliminação dos parasitas (FERRER, 2002; CIARAMELLA ; CORONA, 2003;
BARBIÉRI, 2006 ). Ao contrário, quando a resposta celular por linfócitos Th2 é
predominante e mediada pelas interleucinas IL-4, IL-6 e IL-10 observa-se maior
susceptibilidade, a progressão clínica da doença (CIARAMELLA ; CORONA, 2003).
É relatado que em zonas endêmicas, casos de leshmaníase visceral podem surgir
secundariamente a fatores que provocam imunossupressão, como várias parasitoses,
24
infecções, medicamentos e doenças crônicas. Todos esses fatores levam à ruptura do
equilíbrio entre o hospedeiro e o parasita, alterando o tipo de resposta imune que o
animal desenvolve (FERRER, 2002).
2.1.6 Apresentação clínica
A LV é caracterizada por apresentar evolução crônica com envolvimento
sistêmico através de sinais como hepatoesplenomegalia e caquexia podendo levar à
morte se não tratada. No entando, dependendo da fase da doença e do tipo de resposta
imune do hospedeiro, pode apresentar-se assintomático (SIMÕES-MATTOS et al.,
2002; MAIA-ELKHOURY et al., 2008).
Na doença canina, de acordo com as manifestações clínicas, o hospedeiro pode
ser classificado como assintomático, que não apresentam sinais clínicos característicos
de infecção; oligossintomático, onde se observa a presença de linfoadenopatia, leve
perda de peso e alterações dermatológicas; e sintomático, ou seja, diversos sinais da
doença são evidentes, como alterações dermatológicas, incluindo alopecia, dermatite
furfurácea e úlceras, bem como onicogrifose, linfadenopatia, emagrecimento acentuado,
ceratoconjuntivite e paresia dos membros posteriores (MANCIANTI, et al., 1988;
BRASIL, 2006).
Figuras. 5a. Cão com dermatite grave, alopecia, hipotricose e
hiperqueratose. 5b. Cão com uveíte grave.
Fonte: adaptado de Ciaramela ; Corona, 2003.
A LVC por ser uma doença de sintomatologia inespecífica, é difícil de ser
diagnosticada apenas pela história do animal e apresentação clínica (KONTOS;
25
KOUTINAS, 1993). Os responsáveis pela grande variedade de sinais clínicos presentes
na LVC são os complexos imunes que se depositam em vários órgãos e tecidos dos
vertebrados, como pele, vasos sanguíneos, tecidos oculares e em várias articulações, o
que conduz ao aparecimento de diversos sintomas, como úlceras cutâneas e das pontas
das orelhas, epistáxis, uveíte, conjuntivite e episclerite imunomediada e claudicação por
poliartritre (KONTOS; KOUTINAS, 1993; CIARAMELLA; CORONA, 2003;
TROTZ-WILLIAMS; GRADONI, 2003).
2.1.7 Controle
A estratégia para o controle da LV no Brasil inclui a identificação precoce e o
tratamento de casos humanos, borrifação de inseticidas de poder residual vinculada aos
casos humanos. Recomenda-se também, o destino adequado do lixo, a remoção de
entulhos e da matéria orgânica do peridomicílio, além da identificação de cães
sorologicamente positivos, seguida pela suas eutanásias e atividades de educação em
saúde (BRASIL, 2006).
De acordo com Gontijo ; Melo (2004) as medidas de controle preconizadas pelo
Ministério da Saúde não tem sido totalmente efetivas, uma vez que doenças transmitidas
por vetores biológicos associados a reservatórios domésticos e a aspectos ambientais
são reconhecidamente de difícil controle, aliado ao recente processo de urbanização da
doença e a falta de conhecimento sobre esses focos.
Em 2003, o Ministério da Saúde promoveu mudanças no programa de controle
da LV visando melhorar as normas de vigilância e controle e as recomendações
passaram a ser específicas para cada situação epidemiológica e de acordo com cada
área a ser trabalhada. Dessa forma, os municípios foram classificados conforme a
média da incidência dos casos de LV humana dos últimos cinco anos, sendo assim
dispostos: área de transmissão esporádica (< 2,4 casos positivos); área de transmissão
moderada (2,4 a 4,4 casos); área de transmissão intensa (>4,4 casos) e áreas
silenciosas, estas foram incorporadas ao programa para evitar ou minimizar os
problemas referentes à leishmaníase visceral em novas áreas (BRASIL, 2006).
Nos últimos anos, surgiram novas alternativas para o controle e prevenção da
LV como o uso de coleiras impregnadas com deltametrina que conseguiram controlar a
incidência da doença canina (KILLICK-KENDRICK et al., 1997), assim como, o
surgimento da vacina para os cães (LEMESRE et al, 2007). As coleiras impregnadas
26
com deltametrina (Scalibor®) demonstraram não só uma redução na taxa de alimentação
dos flebotomíneos (DAVID et al., 2001; REITHINGER et al., 2004), como também
diminuição do tempo de vida dos flebotomíneos, o que levou a diminuição da taxa de
propagação da doença (REITHINGER et al., 2004).
A primeira vacina desenvolvida para o controle da LVC, Leishmune® produzida
pela empresa Fort Dodge Saúde Animal, utiliza o antígeno purificado FML (complexo
glicoprotéico) de L. donovani que nos cães vacinados promoveu um aumento da
resposta imune celular do tipo Th1, ocorrendo regressão dos sinais clínicos e
aparentemente, esta alternativa parece bloquear a transmissão da doença (SARAIVA et
al., 2006; DANTAS-TORRES, 2006). Aparentemente o aumento dos títulos de IgG2
está associado com a expansão da produção de interferon-γ e interleucina-2 pelas Th1,
promovendo proteção e resistência (LEMESRE et al., 2007). Recentemente, através da
publicação do Ato n.10, em outubro de 2011 no diário oficial da união, o MAPA
renovou o registro da vacina Leishmune®, através do deferimento de solicitação de
correção de fórmula, o que autoriza a continuidade da comercialização dessa vacina no
Brasil (MAPA, 2011).
Em 2008, entrou no mercado brasileiro uma nova vacina, Leish-Tec® da
empresa Hertape Calier Saúde Animal, que utiliza como antígeno a proteína
recombinante A2, que é específica do estágio amastigota, sendo descrita em várias
espécies de Leishmania spp. Resultados preliminares mostraram que os animais
vacinados desenvolveram perfil imunológico protetor (Th1), ou seja, alta resposta
imune celular. Ademais não desenvolveram reação pós-vacinal e permaneceram
soronegativos frente aos exames sorológicos de rotina (COELHO et al., 2003, ZANIN
et al., 2007, FERNANDES et al., 2008). No entanto, ainda faltam os últimos resultados
relacionados à fase III de teste de eficácia de vacinas exigidos pelo MAPA.
2.2. DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA
O diagnóstico da leishmaníase visceral canina pode ser realizado através de
métodos clínicos, parasitológicos, sorológicos e moleculares.
2.2.1. Diagnóstico clínico
27
Em áreas endêmicas o diagnóstico da LV é dificultado pelo fato dos sintomas
não serem patognomônicos da doença. Desta forma o diagnóstico clínico isoladamente,
não é suficiente para identificar um cão infectado (CAMARGO; LANGONI, 2006),
tornando a utilização de exames laboratoriais de suma importância para confirmação
diagnóstica (BRASIL, 2006).
2.2.2 Métodos parasitológicos
A observação direta do parasita fornece prova definitiva da infecção, pois uma
vez que o parasito é visualizado, a infecção é confirmada sem qualquer dúvida. A
pesquisa de parasitos pode ser feita em esfregaços de medula óssea, obtidos por punção
de costela, da crista ilíaca ou do fêmur, esfregaços de linfonodo e, muito raramente,
esfregaços de baço ou ainda através de biópsia cutânea (FAYET, 1999;
CIARAMELLA; CORONA, 2003; QUEIROZ et al., 2009).
As amastigotas do parasita são reconhecidas por seu formato, que varia de
esférico a ovóide, medindo cerca de 2 a 6 μm de diâmetro, contendo núcleo
arredondado e cinetoplasto ligeiramente arredondado (IKEDA-GARCIA; FEITOSA,
2006).
A parasitemia encontrada no exame parasitológico é muito variável, não tendo
correlação com a intensidade da sintomatologia (PALTRINIERI et al., 2010). Em
algumas situações é muito difícil observar parasitas, principalmente em animais em fase
inicial da doença, sendo comum a ocorrência de resultados negativos. Dessa forma, este
diagnóstico apresenta alta especificidade, mas a sua sensibilidade é baixa, de cerca de
50% no caso de esfregaços de medula óssea, decaindo para valores de 30% em
esfregaços de linfonodo (FAYET, 1999).
Quando os parasitas não são visíveis utiliza-se métodos parasitológicos
indiretos, como, cultura a partir de aspirados de medula óssea e de linfonodos, através
da utilização de meios específicos, como o Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) ou o RPMI-
1640 (TROTZ-WILLIAMS; GRADONI, 2003). As culturas são incubadas a uma
temperatura de 24-26°C obtendo-se crescimento de promastigotas após cinco dias. A
inoculação em animais de laboratório, mais comumente hamsters, tem sido utilizada em
estudos experimentais, contudo seu uso não tem valor prático no diagnóstico da doença
devido à longa espera para se obter um resultado (BRASIL, 2006; IKEDA-GARCIA;
FEITOSA, 2006; GOMES et al., 2008).
28
2.2.3 Métodos moleculares
Dentre as mais modernas técnicas utilizadas para o diagnóstico das
leishmaníases, destacam-se as técnicas moleculares. A reação em cadeia pela
polimerase (PCR) é a que mais vem sendo utilizada em trabalhos sobre diagnóstico da
LV canina (SOLANO-GALLEGO et al., 2001; GOMES et al., 2007). Esta técnica
baseia-se na amplificação in vitro de seqüências de nucleotídeos específicas presentes
no parasita, sendo um método bastante sensível e específico para detectar DNA de
Leishmania spp em ampla variedade de amostras clínicas do homem, cães, reservatórios
silvestres e vetores (GOMES et al., 2008).
As leishmânias, como os outros membros da ordem Kinetoplastida, apresentam
uma rede de moléculas de DNA circular denominado de DNA do cinetoplasto ou
kDNA, nas suas mitocôndrias. O kDNA é formado por arranjos de maxicírculos e
minicírculos, onde os minicírculos representam 95% do kDNA. Os minicírculos são
compostos por cerca de 800-1200 pares de bases (pb), apresentando uma região
conservada entre os cinetoplastídeos, que contem cerca de 120-200 pb que podem ser
utilizados como alvo da PCR e uma região não conservada ou variável, que pode
apresentar diferenças entre cepas de uma mesma espécie. (RAY, 1989; CAVALCANTI
et al., 2008; GOMES et al., 2008).
Em casos fortemente suspeitos, mas em que as técnicas sorológicas ou a
observação direta do parasita são inconclusivas, indica-se a PCR (MANNA et al.,
2007). Os estudos têm demonstrado resultados mais vantajosos com amostras de pele,
conjuntiva, medula óssea e aspirados de linfonodos, com menor sensibilidade e
especificidade quando o sangue periférico é utilizado como amostra, provavelmente
devido ao número de parasitas presentes nesse tecido (SOLANO-GALLEGO et al.,
2001; NUNES et al., 2007; FERREIRA et al., 2008). Em aspirado de medula óssea, a
especificidade da PCR pode chegar a 100% e a sensibilidade entre 80-93,3%,
sensibilidade bem superior quando comparados aos métodos diretos e cultura de
parasitas que apresentam sensibilidade entre 50-60% (TAVARES, et al., 2003;
MARTIN-SANCHEZ et al., 2004).
Faz-se o uso principalmente da PCR convencional e da PCR em tempo real
quantitativa (qPCR). A qPCR permite a monitorização das amplificações das seqüências
específicas de DNA durante o decorrer da reação e possibilitam a eliminação da etapa
laboriosa pós-amplificação (preparo do gel para eletroforese), convencionalmente
29
necessária para visualização do produto amplificado na PCR convencional
(CAVALCANTI et al., 2008; MAIA; CAMPINO, 2008) . Como uma das características
da infecção por Leishmania spp é o animal apresentar parasitas em latência, as
abordagens quantitativas são necessárias para elucidar o status de positivos dos cães
pela PCR em cães de áreas endêmicas, facilitando a monitorização da carga parasitária e
sua resposta ao tratamento, bem como o acompanhamento do desenvolvimento de
novas vacinas (MARY et al., 2004 ; VITALE et al., 2004; FRANCINO et al., 2006). A
qPCR é consideravelmente mais sensível que a PCR convencional, como demonstrando
por Francino et al. (2006) que verificaram que a PCR convencional somente poderia ser
positiva em amostras com carga parasitária superior a 30 Leishmania spp/mL, enquanto
a qPCR detecta cargas parasitárias em concentrações maiores que 0,2 Leishmania
spp/mL de amostra. Os resultados da qPCR tornam-se extremamente importantes
quando se busca um diagnóstico sensível e rápido, particularmente em casos onde os
diagnósticos sorológicos são duvidosos. Assim, pode-se observar que as vantagens da
qPCR em relação à PCR convencional são inúmeras e incluem, rapidez na obtenção dos
resultados, reprodutibilidade e capacidade quantitativa (CAVALCANTI et al., 2008;
GOMES et al., 2008).
Infelizmente, o elevado custo dos métodos moleculares não permite que sejam
realizados de forma rotineira pelos laboratórios oficiais das leishmaníases, por requerer
laboratórios bem equipados e habilidade técnica (BRASIL, 2006).
2.2.4. Métodos sorológicos
Os métodos sorológicos, de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o
Ensaio Imunoenzimático (ELISA), são os mais utilizados tanto na prática clínica quanto
em inquéritos epidemiológicos, sendo métodos preconizados pelo Ministério da Saúde
(BRASIL, 2006). Utiliza-se com menor frequência outros testes sorológicos, como a
imunodifusão, imunomigração rápida e o teste de aglutinação direta (FAYET, 1999).
Os métodos diagnósticos utilizados em inquéritos epidemiológicos devem
possuir alta sensibilidade e especificidade, pois através de uma alta sensibilidade
consegue-se detectar o maior número de doentes, evitando a permanência de animais
positivos na população e através de uma alta especificidade, evita-se que cães não
infectados com o parasita pesquisado sejam sacrificados (ALVES; BEVILACQUA,
2004).
30
Reação de Imunofluoresçência Indireta – RIFI
A RIFI é indicada como referência pela Organização Mundial de Saúde Animal
(OIE) para o diagnóstico sorológico da LVC (GRADONI ; GRAMICCIA., 2000). É o
teste de eleição para inquéritos epidemiológicos, por apresentar sensibilidade e
especificidade adequadas, quando comparada a outras técnicas (ALVES;
BEVILACQUA, 2004). No entanto, relata-se a ocorrência de reações cruzadas com
outros tripanossomatídeos, como Leishmania braziliensis. (DA COSTA et al., 2003;
MADEIRA et al., 2006a; MADEIRA et al., 2006b).
O kit de Imunofluorescência Indireta (IFI-BioManguinhos®) é distribuído pelo
Ministério da Saúde para laboratórios públicos, apresentando sensibilidade de 68% e
especificidade de 87,5% (LIRA, 2006). Assim, a baixa especificidade observada no Kit
IFI® de Bio-Manguinhos® deve-se provavelmente ao antígeno bruto de L. major-like
que é empregado (LIRA et al., 2006). Este antígeno é inespecífico por se tratar de uma
espécie de leishmânia causadora de leishmaníase cutânea sugerindo assim ocorrência de
reações cruzadas com outros tripanossomatídeos. De acordo com Mancianti et al.
(1996), a RIFI apresenta sensibilidade de 98,4% e especificidade de 100%, fato este
observado quando utiliza-se o antígeno bruto de L. infantum, espécie causadora da
leishmaníase visceral.
Vale ressaltar, que no município do Rio de Janeiro, Brasil, cães soropositivos
pelos testes sorológicos IFI® e EIE® de Bio-Manguinhos®, demonstraram através de
análises isoenzimáticas a infecção por L. braziliensis, co-infecção por L. chagasi e L.
braziliensis e infecção por Trypanossoma caninum. Demonstrando que os kits IFI® e
EIE® não são capazes de discriminar a infecção por diferentes tripanossomatídeos
(SILVA et al., 2011).
O material recomendado para a realização do IFI® é o soro sangüíneo e o
resultado considerado sororreagente é aquele que possua título igual ou superior ao
ponto de corte que é a diluição de 1:40 (BRASIL, 2006). No entanto, a técnica de
imunofluorescência indireta é mais usada nos levantamentos epidemiológicos no Brasil
através do uso da coleta de sangue canino em papel de filtro, demonstrando resultados
conflitantes. Figueiredo et al. (2010) trabalhando com 146 cães negativos à
imunofluorescência indireta utilizando sangue em eluato de papel de filtro, detectaram
que 34,9% e 6,8% desses cães foram positivos à imunofluorescência indireta e ao
ELISA quando o soro foi utilizado, respectivamente. Demonstrando a possibilidade de
31
falsos negativos com a utilização de eluato de sangue, favorecendo a permanência do
cão infectado no meio ambiente. Silva et al. (2011) utilizando 144 cães soropositivos ao
IFI® com o uso de eluato de sangue em papel de filtro, encontraram 28% e 22% de
positividade quando se testou o soro dos mesmos animais no IFI® e no EIE®,
respectivamente. O que demonstra uma elevada ocorrência de falsos positivos quando
se utiliza o eluato de papel de filtro, levando à eutanásia de animais não infectados pelo
programa de controle da leishmaníase visceral.
O RIFI é um dos testes mais sensíveis, no entanto, um resultado negativo não
exclui que o animal esteja afetado, uma vez que há animais que demoram algum tempo
a desenvolver a resposta humoral e a atingir títulos de anticorpos considerados
positivos. Assim, em animais clinicamente suspeitos ou com resultados duvidosos deve-
se repetir o teste passadas 4 a 6 semanas ou recorrer a outro tipo de teste (BRASIL
2006).
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
O ELISA é bastante útil para análises de laboratório, possibilitando a análise de
grande quantidade de amostras em pouco tempo (MAIA; CAMPINO, 2008), sendo, por
isso, um teste mais rápido e de fácil execução (CAMARGO; LANGONI, 2006) quando
comparado ao RIFI. A técnica de ELISA permite detectar baixos títulos de anticorpos e
é acurado na identificação de casos assintomáticos (CÂNDIDO et al., 2008).
Moreira et al. (2007) demonstraram que o ELISA utilizando antígeno bruto de L.
chagasi obteve sensibilidade 95,65% em animais assintomáticos seguido de 87,8% para
o grupo de sintomáticos, no entanto, obteve uma sensibilidade de apenas 68% para os
animais oligossintomáticos e especificidade de 100% para todos os grupos de animais.
Contudo, o kit ELISA (EIE - Bio-Manguinhos®), preconizado pelos órgãos da Saúde
Pública que utiliza o antígeno solúvel e lisado de Leishmania major-like, possui uma
sensibilidade 72% e especificidade 87,5% (LIRA et al., 2006). Esta diminuição na
especificidade observada no kit EIE® de Bio-Manguinhos® pode ser devido ao uso de
antígeno não específico para Leishmania viscerotropica. A sensibilidade e a
especificidade desse método diagnóstico dependem do tipo de antígeno empregado
(espécie ou forma evolutiva do parasita) e de outros fatores como tempo de incubação
ou tipo de microplacas utilizadas (REITHINGER et al., 2002).
32
As técnicas que utilizam antígenos brutos são limitadas em termos de
especificidade, apresentando reações cruzadas não somente com outras espécies da
família Trypanosomatidae, mas também com outros organismos filogeneticamente
distantes (GONTIJO; MELO, 2004). Rotineiramente os métodos sorológicos utilizam
parasitas totais ou lisados, o que normalmente diminui a especificidade. Assim,
pesquisas tem sido realizadas para a identificação de antígenos dominantes, que se
caracterizam por induzir a formação de anticorpos específicos e detectáveis nos testes
sorológicos, contribuindo para maior confiabilidade do diagnóstico sorológico (ALVES;
BEVILACQUA, 2004)
Assim, a busca por testes ELISA mais específicos, possibilitaram o emprego de
novos antígenos, tais como, os antígenos recombinantes rK39, rK9 e rK26 ou
purificados como as glicoproteínas de membrana gp63, gp72 e gp70, específicas do
gênero Leishmania spp que aparentemente conferem grande sensibilidade ao teste
sorológico (SCALONE et al., 2002; ROSATI et al., 2003).
A proteína rK39 tem sido utilizada no diagnóstico da LV pela técnica de ELISA
apresentando valores de sensibilidade maiores que 93% e especificidade variando de 84
a 100% (QU et al., 1994; ZIJLSTRA et al., 1998; BRAZ et al., 2002; De ASSIS et al.,
2008; PEDRAS et al., 2008).
Testes Imunocromatográficos
Nos últimos anos vários testes imunocromatográficos rápidos comerciais foram
desenvolvidos, utilizando como antígenos proteínas recombinantes como rk39 e rK26,
como também a utilização de proteínas extraídas de bactérias, tais como as proteínas A
e G, que fazem parte dos reagentes marcadores dos testes para o diagnóstico da LV
humana (CARVALHO et al., 2003; CHAPPUIS et al., 2006; SUNDAR, et al., 2006; De
ASSIS et al., 2008; WELCH et al., 2008,) e canina (REITHINGER et al., 2002; da
COSTA et al., 2003; METTLER et al., 2005; BISUGO et al., 2007; LEMOS et al.,
2008; LIMA et al., 2010).
A maioria dos testes imunocromatográficos emprega anticorpos monoclonais
anti-IgG de cão e antígenos de Leishmania de diferentes fontes adsorvidos em
membranas de nitrocelulose (GRADONI, 2002). Os antígenos que formam a linha teste
são rK26 ou rK39, e o anticorpo anti-IgG canino, constituindo a linha-controle. A
presença de anticorpos anti-rK39 ou rk26 é indicativo de infecção, e ainda não foi
33
relatada a reatividade com outros tripanossomatídeos (BURNS-JR et al., 1993;
BISUGO et al., 2007).
Mais recentemente surgiu a marcação com o complexo proteína A adicionado de
ouro coloidal. Essa técnica consiste na adsorção, pelas moléculas da proteína A, de
partículas de ouro, muito pequenas (5-20 nm) e elétrondensas. A proteína A é extraída
da bactéria Staphylococcus aureus e, além da afinidade pelo ouro coloidal, tem
afinidade por uma região comum às moléculas das imunoglobulinas (segmento Fc),
especialmente a IgG. Essa técnica tem sido utilizada em testes imunocromatográficos,
apresentando grande precisão para localizar moléculas protéicas e grande resolução,
pois as partículas de ouro coloidal são muito pequenas (MONGODIN et al., 2000;
IIJIMA et al., 2011).
Os graus de sensibilidade e especificidade de testes imunocromatográficos, que
utilizam o antígeno recombinante rK39 em humanos, mostram sensibilidade que variam
de 89-98% e especificidade que variam de 97-100% (CARVALHO et al., 2003;
CHAPPUIS et al., 2006; SUNDAR, et al., 2006; de ASSIS et al., 2008; WELCH et al,
2008,). Em cães, os resultados diferem mais, mostrando sensibilidade que varia de 72-
97,06% e especificidade de 61-100% (REITHINGER et al., 2002; da COSTA et al.,
2003; METTLER et al., 2005; BISUGO et al., 2007; LEMOS et al., 2008; LIMA et al.,
2010).
Dual Path Platform (DDP®) é uma inovadora tecnologia de imunoensaio
cromatográfico para testes de diagnóstico rápido, que foi desenvolvido pela empresa
norte americana Chembio® e a empresa nacional Bio-Manguinhos®, Rio de Janeiro,
Brasil. (http://www.chembio.com/newtechnologies.html).
O teste DDP® utiliza a proteína recombinante K39 (rK39) como antígeno, uma
sequência de 39 aminoácidos clonada da região quinase específica de L. chagasi que
tem sido amplamente avaliada no diagnóstico da LV canina (BURNS-JR et al., 1993).
O DPP® é caracterizado por ser rápido, pois o resultado é conhecido após 15
minutos da coleta da amostra biológica (soro, plasma e sangue total), é de fácil
manipulação, pois não precisa de pessoa especializada para a sua execução. O antígeno
rK39 de L. chagasi que pode promover maior sensibilidade e especificidade à técnica,
portanto sua validação se faz necessária.
34
O teste DPP® é realizado pela adição de 5 µL de sangue total ao poço 1
intitulado “Amostra + Tampão”, a seguir são adicionadas 2 gotas do tampão. Após 5
minutos as duas linhas azuis, controle (C) e teste (T), desapareceram. A seguir coloca-se
4 gotas do tampão no poço 2 intitulado “Tampão”. A leitura dos resultados é realizada
10 a 15 minutos após esta etapa, quando se avalia o resultado: negativo, aparecimento
de uma linha vermelha ou positivo, duas linhas vermelhas.
Figura 6: Teste imunocromatográfico Dual Path Plataform (DPP®)
35
3. JUSTIFICATIVA
A crescente expansão da Leishmaníase Visceral no Brasil tem demonstrado que
a aplicação das medidas de controle adotadas não tem sido eficazes. A principal ação de
controle da LV é o levantamento sorológico da população canina através de um teste de
triagem ELISA e caso seja positivo realiza-se o teste confirmatório RIFI. Os cães
positivos pelos 2 testes sorológicos devem ser eutanasiados. Estes testes apresentam
reações cruzada e um tempo muito longo de espera entre a coleta do material e entrega
dos resultados, portanto, este fato favorece a permanência de animais positivos nas áreas
urbanas e assim mantem o ciclo de transmissão ativo, característica determinante para a
expansão da doença humana e entre os animais. Sendo assim, há necessidade de um
diagnóstico de alta sensibilidade e especificidade, porém simultaneamente, prático,
rápido, de fácil manipulação e de alta credibilidade para os proprietários dos cães, e que
torne a retirada do cão realmente positivo do ambiente, evitando a propagação da
doença. O teste imunocromatográfico DPP® pode desempenhar esse papel tornando
viável o controle da leishmaníase visceral humana e canina.
36
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
O teste imunocromatográfico DPP® para o diagnostico da Leishmaníase Visceral
Canina é mais sensível e específico do que a técnica imunoenzimática atualmente
empregada pelo Ministério da Saúde.
37
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
• Contribuir para o controle da LVC, determinando o melhor diagnóstico para a detecção
de cães com Leishmaníase Visceral Canina.
5.2 Objetivos Específicos
• Validar o teste DPP® para a detecção de anticorpos anti-Leishmania chagasi tendo como
padrão-ouro o teste IFI®, em cães com e sem sinais clínicos da doença.
• Comparar os resultados do DPP® e do Ensaio Imunoenzimático (EIE®) com os
resultados do teste IFI®, de Bio-Manguinhos®;
38
6. CÁPITULO 1
Validação do teste imunocromatográfico rápido Dual Path Platform para o
sorodiagnóstico da Leishmaníase Visceral Canina em uma área endêmica do Brasil
Validation of a rapid immunochromatographic test Dual Path Platform for serodiagnosis
of Canine Visceral Leishmaniasis in an endemic area of Brazil
Veterinary Parasitology
Novembro, 2011
39
Validation of the rapid immunochromatographic test Dual Path Platform (DPP®) for
serodiagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis in an endemic area of Brazil
Eudson Maia de Queiroz-Júniora; Fernanda Cristina Macedo Rondona; Ana Caroline
Moura Rodriguesa; João Batista e Silva Júniora; Juliana de Carvalho Ribeiroa;
Alexander Amaral Medeirosb; Celeste da Silva Freitasc; Katia da Silva Calabresec;
Sthenia Santos Albano Amórad, Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiroa; Claudia Maria
Leal Bevilaquaa*
aFaculdade de Veterinária/Programa de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias/Universidade Estadual do Ceará; bCentro de Controle de Zoonoses –
Fortaleza; cLaboratório de Imunologia e Protozoologia, Fundação Oswaldo Cruz-Rio
de Janeiro; dLaboratório de Microbiologia Veterinária, Universidade Federal Rural do
Semi-árido
Corresponding author:
Universidade Estadual do Ceará/Laboratório de Doenças Parasitárias/PPGCV, Av.
Dedé Brasil, 1700, CEP 60740-903 Fortaleza, Ceará, Brasil.
Phone. 55. 85.31019853; fax 55.85.31019860
e-mail: [email protected] or [email protected]
40
Abstract
Visceral leishmaniasis is a major public health problem in the world and the dog is the
main reservoir for this disease. A new method for rapid diagnosis - Dual Path Platform
(DPP®) - based on immunochromatography to detect infected dogs being tested. Thus,
the main objective of this study was to contribute to the control of canine visceral
leishmaniasis (CVL), by validating the DPP® rapid test for detection of anti-Leishmania
chagasi antibodies. The immunochromatographic test (DPP–Bio-Manguinhos®) and
Enzyme-linked immunosorbent assay (EIE – Bio-Manguinhos®) has been validated
using Indirect Immunofluorescence (IFI – Bio-Manguinhos®) as the gold standard. We
examined 103 dogs divided into three groups based on different clinical symptoms of
visceral leishmaniasis: asymptomatic (n = 35), oligosymptomatic (n = 31) and
symptomatic (n = 37). Blood samples were collected from the cephalic vein to obtain
serum for use with the IFI® and EIE®. A drop of blood from the tip of the ear was also
collected from each dog to utilize with the DPP® test. Data analysis was performed on
the total sample and group of different clinical signs using a contingency table 2 x 2 and
analyzed by GraphPad PRISMTM 5.0. For the total sample, regardless of disease
symptoms, DPP® showed sensitivity of 56.10% and specificity of 100% when compared
to IFI®. When DPP® was used in the diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity
was 12% and the specificity was 100%. Examining oligosymptomatic dogs, DPP®
sensitivity was 52.4% and the specificity was 100%. For symptomatic dogs DPP®, the
sensitivity and specificity were 88.9% and 100% respectively. EIE® on total sample,
regardless of signs, showed a sensitivity of 50% and specificity of 100%. When EIE®
was used in the diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity was 4% and the
specificity 100%. Examining oligosymptomatic dogs, EIE® sensitivity was 38.10% and
the specificity was 100%. For symptomatic dogs EIE® sensitivity and specificity were
88.9% and 100% respectively. In conclusion, the DPP® showed high sensitivity in the
diagnosis of symptomatic dogs, but low sensitivity in asymptomatic
and oligosymptomatic dogs, however the DPP® showed superior performance to those
obtained by EIE®, suggesting that the DPP® can be used as serological
screening test control program of canine visceral leishmaniasis.
Keywords: diagnosis, dogs, Leishmaniasis, serology.
41
Introduction
Leishmaniasis are considered neglected diseases around the world, with an
annual incidence of 2 million human cases. 500.000 of these are cases of Visceral
Leishmaniasis (VL). India, Bangladesh, Nepal, Sudan and Brazil account for 90% of
cases of Leishmaniasis reported worldwide (WHO, 2010).
Visceral Leishmaniasis (VL) is caused by the protozoan Leishmania chagasi
(sin. Leishmania infantum) (Moreira et al., 2007), and is primarily transmitted by
Lutzomyia longipalpis in the new world. Dogs appear to be the main domestic reservoir
of the parasite (Solano-Gallego et al., 2001).
In Brazil, the incidence of VL cases is increasing, with new cases occurring in
areas previously considered disease free, as in southern Brazil (Krauspenhar, et al.,
2007; Thomaz-Soccol et al., 2009). In Ceará state, northeastern Brazil, the disease is
widespread and the city of Fortaleza has the largest number of new cases in humans
(Ceará, 2011). In relation to the canine population of Fortaleza, epidemiological survey
showed that the disease is widespread in both house dogs and stray dogs (Rondon et al.,
2008).
The Ministry of Health of Brazil, in search of LV control, advocated euthanasia
of seropositive dogs, vector control, early diagnosis and treatment of human cases
(Brasil, 2006). However, the impact of these measures has not yielded the expected
reduction in human cases (WHO, 2010). Therefore, correct diagnosis is an important
step to prevent the spread of this disease. As this helps decrease the number of infected
dogs remaining in the environment as a source of infection (Ferreira et al., 2008).
In respect to dogs, the clinical diagnosis of VL alone is not sufficient to detect
positive animals due to the broad spectrum of clinical signs, from healthy animals to
cases with advanced disease (Camargo and Langone et al, 2006).
The definitive diagnosis of VL can be confirmed by demonstration of
amastigotes in tissue or promastigotes in culture or by using the Polymerase Chain
Reaction (PCR). Unfortunately, these methods require invasive procedures, a well
equipped laboratory and trained technicians (Brasil, 2006; Gomes et al., 2008; Lima et
al., 2010). Due to the difficulty of using direct diagnostic methods, serologic methods
are most often used in epidemiological surveys, with the most widely used tests
including the indirect immunofluorescence test (IFI), enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) and immunochromatographic test (Queiroz et al, 2009; Paltrinieri et al.,
42
2010).
The DPP® immunochromatographic test is a qualitative test to detect anti-
Leishmania antibodies using the recombinant protein K39 (rK39) as an antigen. This
protein is the product of a cloned gene from Leishmania chagasi and contains a repeat
of 39 amino acids conserved between species viscerotropic Leishmania (L. donovani, L.
infantum and L. chagasi). Presence of anti-rK39 antibody indicative of infection is not a
reported reactivity with other trypanosomatids (Burns-Jr et al., 1993; Bisugo et al.,
2007).
One of the flaws pointed out in the control of Canine Visceral Leishmaniasis
(CVL) is the long time interval, 30 to 80 days between diagnosis and withdrawal of
positively-tested dogs in the environment, favoring disease transmission (Lira et al.,
2006). Thus, new diagnostic alternatives are needed to control this disease. The use of
DPP® can be a resource for achieving more efficient, accurate and reliable diagnosis of
CVL, preventing them from transmitting the parasite reservoir. Therefore, the objective
of this study was to contribute to the control of CVL, by validating the DPP® test for
detection of anti-Leishmania chagasi antibodies, in dogs with or without clinical signs
of the disease and compare results with the indirect immunofluorescence test (IFI®), of
Bio-Manguinhos®.
Materials and methods
This study was approved by the Ethics Committee for Animal Use State
University of Ceará (CEUA/UECE), registered under number 10724228-1/01.
A total of 103 dogs were examined clinically and classified into three groups.
Group 1: asymptomatic individuals presented no signs characteristics of LV; group 2:
oligosymptomatic animals showed one to three characteristics signs and group 3:
symptomatic animals showed more of three characteristics signs, according Mancianti
et al. (1988). These dogs were from the Zoonoses Control Center of Fortaleza (State of
Ceará, Northeast Brazil), Veterinary Hospital Unit of the Veterinary School at the State
University of Ceará and private clinics in the city of Fortaleza. Blood samples were
collected by cephalic venipuncture and placed in tubes without an anticoagulant. These
tubes were then centrifuged to obtain serum and stored at -20°C until the completion of
the ELISA (EIE®) and IFI (IFI®). To conduct the immunochromatographic test, a drop
of blood was collected from the tip of the ear from each dog.
43
Serological tests
Kits were used for the IFI (IFI®-Canine Visceral Leishmaniasis - Bio-
Manguinhos®, Rio de Janeiro, Brazil) and ELISA (EIE®-Canine Visceral Leishmaniasis
- Bio-Manguinhos®, Rio de Janeiro, Brazil), according with the manufacturer's
instructions.
The DPP® test (Bio-Manguinhos®, Rio de Janeiro, Brazil) is a qualitative
immunochromatographic test for the detection of antibodies against L. chagasi using the
recombinant protein K39. The DPP® kits to perform this study were provided by Bio-
Manguinhos.
For the test DPP®, 5 µL of whole blood were added to well 1 entitled "Sample +
Buffer" and the following were added with 2 drops of buffer. After 5 minutes, the two
blue lines control (C) and test (T), disappeared. Four drops of buffer were added to well
2 entitled "Buffer". Result readings were performed 10 to 15 minutes after this step,
when we assessed the result: negative appearance of a red line; or positive if it
contained two red lines.
Statistical analysis
The sensitivity and specificity of DPP® test were calculated using the IFI® as the
gold standard on the total sample and on different groups of clinical signs using a
contingency table 2 x 2. Results were analyzed by the statistical program GraphPad
PrismTM 5.0. The sensitivity was calculated as follows: Sensitivity = True Positive/(True
Positive + False Negative) x 100 and Specificity = True Negative / (True Negative/False
Positive) x 100 and for these measurements we calculated the confidence interval of
95%. In addition, the degree of agreement between the evaluated tests was determined
by calculating the coefficient Kappa (к) (Pereira, 2000).
Results
The results of DPP® for the total samples, as well as for the different animal
groups with clinic symptoms (assymptomatics, oligosymptomatics and symptomatic)
are shown in table 1.
44
Table 1. Validation of DPP® test in assymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic
dogs for the total number of samples along with the degree of agreement Kappa (к),
using the IFI® as the gold standard, with a 95% confidence interval
Test ASY
к OLI
к SYM
к Total
к Sens. Spec. Sens. Spec. Sens. Spec. Sens. Spec.
DPP® 12% 100% 0.07 52.4% 100% 0.41 88.9% 100% 0.30 56.1% 100% 0.34 ASS (Asymptomatic), OLI (Oligosymptomatic) e SYM (Symptomatic); Sens = Sensitivity; Spec =
Specificity The EIE® results for the total number of samples and data about the different
animal groups with clinic signs (assymptomatics, oligosymptomatics and symptomatics)
are shown in table 2.
Table 2. Validation of the EIE® test in assymptomatic, oligosymptomatic and
symptomatic dogs for the total number of samples along with the degree of agreement
Kappa (к), using the IFI® as the gold standard, with a 95% confidence interval
Test ASY
к OLI
к SYM
к Total
к Sens Spec Sens Spec Sens Spec Sens Spec EIE®
4 %
100%
0.02
38.1%
100%
0.28
88.9%
100%
0.30
50%
100%
0.29
ASY (Asymptomatic), OLI (Oligosymptomatic) e SYM (Symptomatic); Sens = Sensitivity; Spec =
Specificity
The detection of anti-Leishmania antibodies in blood serum by EIE® and IFI®
tests and in the total blood by the DPP® test according to the disease clinic form and
total of samples are presented in table 3.
Table 3. Detection of anti-Leishmania antibodies for DPP®, IFI® and EIE® tests in the
diagnosis of canine visceral leishmaniasis according to its clinic forms and on the total
number of samples
Tests Dogs positive/dogs examined (%)
Asymptomatic Oligosymptomatic Symptomatic Total
DPP® 3/35 (8.5%) 11/31 (35.4%) 32/37 (86.4%) 46/103 (44.6%)
IFI® 25/35 (71.4%) 21/31 (67.7%) 36/37 (97.2%) 82/103 (79.6%)
EIE® 1/35 (2.8%) 8/31 (25.8%) 32/37 (86.4%) 41/103 (39.8%)
45
Discussion
In recent years there have been many investments in the research and
development of assay diagnosing using immunochromatographic methods, which are
adapted to different types of samples. For example, these assays can be completed using
whole blood, serum, plasma, and urine (Carvalho et al, 2003; Da Costa et al, 2003;
Mettler et al, 2005; Bisugo et al, 2007; Lemos et al, 2008; Lima et al, 2010;
Chakravarty et al., 2011). The immunochromatography utilizes anti-IgG monoclonal
antibodies and antigens from different sources adsorbed in nitrocellulose membranes
(Gradoni, 2002). DPP® is a rapid diagnosis test for canine visceral leishmaniasis,
developed by Bio-Manguinhos® which uses the immunochromatography principle and
uses K39 protein as an antigen for whole blood, serum, or plasma samples.
The validation of DPP® was performed using whole blood and obtained 44.6%
positive results, while the diagnosis made by EIE® and IFI® using the serum from the
same animals received 39.8% and 79.6% positive results, respectively. DPP® presented
a lower capacity to detect positive animals. This result may be due to the fact that
DPP® utilizes whole blood for sample testing, while EIE® and IFI® uses serum. Bisugo
et al. (2007) validated an immunochromatographic anti-rk39 rapid test using the IFI®
and EIE® of Bio-Manguinhos® as gold standards, and detected 31.3% positive animals
from serum samples and only 17.4% from total blood samples, while IFI® and EIE®
detected anti-Leishmania antibodies in 25.1% and 27.2% of these same serum samples,
respectively. These results indicate that the use of whole blood may not be the optimal
choice for utilization in screening tests, despite the speed and convenience of the exam.
This fact can be explained due to the low concentration of antibodies in the whole blood
sample and also due to the presence of cells and other elements which can interfere with
the binding of anti-Leishmania antibodies to complex colloidal gold-associated to
protein A or migration of this complex to the test line, where the antigen is fixed
(Rocha, 2002).
The results of the DPP® test in symptomatic dogs were similar to that reported
by other studies which validated immunochromatographic tests using protein k39 as an
antigen. Lima et al. (2010) obtained sensibility of 91.5% in symptomatic dogs, while
Mettler et al. (2005) reported 96.7% of sensibility in symptomatic dogs, but differed in
relation to asymptomatic dogs, because the test had a sensitivity of 52.9%.
According to the clinical progression of this disease in dogs, from asymptomatic
to symptomatic, an increase in detectability was observed in the DPP® when compared
46
to IFI®. This fact can be explained by the higher specific antibodies produced, which
tend to increase with the development of infection (Deplazes et al., 1995; Paltrinieri et
al., 2010) and the detection of antibodies is usually low in asymptomatic dogs.
(Leontides et al., 2002; Da Costa et al., 2003; Mettler et al., 2005).
The serologic diagnostic tests currently used, IFI and ELISA, to detect
Leshmania spp present intrinsic problems, such as a persistent detection of antibodies
after healing or cross reactions with antibodies from other pathogens such as
Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma caninum (Ferreira et al.,
2007; Da Costa et al., 2003, Madeira et al., 2006a; Madeira et al., 2006b). IFI is the gold
standard of serologic tests, but its use for screening in dogs with CVL is limited by the
requirement of experienced technicians and the necessary serial dilutions make it a
laborious examination (Gradoni and Gramiccia, 2000). In comparison to IFI, the ELISA
test can be used in a large number of samples, requires less time, and is overall easier to
complete (Camargo and Langone, 2006; Maia and Campino, 2008). Due to these
reasons, public health officials in Brazil have recommended serological screening of
canine populations using ELISA and positive results are confirmed by the IFI test.
The IFI® and EIE® serological kits from Bio-Manguinhos® use soluble
promastigotes of Leishmania major-like as antigens, which is the cause of Cutaneous
Leishmaniasis (Lira et al., 2006). This also propitiates the occurrence of cross reactions.
Seropositive dogs by IFI® and EIE®, and results showed, infection by L. braziliensis,
mixed infection by L. braziliensis and L. chagasi and infection by Trypanossoma
caninum. Thus, the possibility exists that a higher proportion of positively-tested dogs
by IFI®, particularly in dogs with asymptomatic and oligosymptomatic characteristics in
this study, may be due to co-infections with other parasites. This demonstrates that the
IFI® and EIE® kits are not able to discriminate between different trypanosomatids
infection (Silva et al., 2011).
Currently in Brazil, epidemiological surveys utilize EIE® and IFI® tests for
diagnosis of CVL. However, the second test (IFI®) is only used if the first one (EIE®)
shows a positive result. This is due to the fact that the EIE® test is more sensitive and, if
the result is negative, there is no justifiable reason to utilize a second test. As a result, if
the decision to euthanize 41 positively-tested dogs based on the consecutive use of the
EIE® and IFI® tests, respectively, 46 animals would be euthanized based upon the DPP®
test, as the detection appears to be 4.8% higher with the immunochromatographic test.
47
Further studies are needed to know which the best sample to be used in
the DPP® test, but also increase the sensitivity of the test on asymptomatic
andoligosymptomatic dogs. Thus, even the DPP® presents lower sensitivity than IFI®,
can be used as a screening test because it presented great margin of concordance with
the EIE® test already used as a screening test. DPP® may remove the infected reservoir
from the environment faster, stopping the transmission of parasites to susceptible dogs.
Just the same, results from this test may increase the confidence of the dog’s owner
when completed by Public Health Services in Brazil, as the exam can be completed in
the dog’s residence, under the observation of the owner.
Acknowledgements
This work received financial support from CAPES. Dr. Claudia M. L. Bevilaqua has a
grant from CNPq. The authors are grateful to Dr. Evanisa Alves Ventura, Director of
the Zoonoses Control Center of Fortaleza-Ceará.
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7. CONCLUSÕES
1. O teste DPP® apresentou elevada sensibilidade no diagnóstico de cães
sintomáticos para LVC;
2. O teste DPP® apresentou baixa sensibilidade no diagnóstico de cães
assintomáticos e oligossintomaticos para LVC;
3. O teste DPP® apresentou desempenho superior aos obtidos pelo EIE®, sugerindo
que o DPP® pode ser usado como teste de triagem sorológica do programa de
controle da leishmaníase visceral canina.
53
8. PERSPECTIVAS
1. Mais estudos são necessários com o objetivo de conhecer o melhor material a ser
utilizado no teste DPP®;
2. Novos estudos devem ser realizados com o objetivo de aumentar a sensibilidade
do teste DPP® sobre cães assintomáticos e sintomáticos;
3. O teste DPP® poderá ser usado como teste de triagem pelo programa nacional de
controle das leishmaníases, contribuindo para resultados mais rápidos,
favorecendo a retirada do reservatório do meio ambiente e aumentando a
credibilidade de testes sorológicos utilizados pelos órgãos da saúde pública.
54
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66
APÊNDICES
67
APÊNDICE A – Ficha clínica utilizada para caracterizar os cães do estudo.
FICHA CLÍNICA
CÃO N°. _______ Data: _________
1. Origem: ( ) CCZ ( ) Clínica – Qual? _________ 2. Porte: ( ) Pequeno ( ) Médio ( ) Grande 3.
Pelagem: ( ) Curta ( ) Longa; Tonalidade: ( ) Clara ( ) Escura 4. Idade: ( ) menor que 1 ano ( ) maior
que 1 ano. 5. Sinais Clínicos: ( ) Ausentes ( ) presentes ( ) Assintomático/A ( )
Oligossintomático/O-até 3 ( ) Sintomático/S-mais de 3
5.1. Gerais: ( ) Linfadenomegalia ( ) generalizada ( ) anteriores ( ) posteriores:Quais?__________
( ) Emaciação ( ) Anorexia ( ) Onicogrifose ( ) Mucosas Pálidas ( ) Esplenomegalia ( )
Hepatomegalia
5.2. Lesões oculares: ( ) Secreções ( ) mucopurulenta ( ) sanguinolenta ( ) Úlcera de córnea
( ) Opacidade ocular ( ) uveíte
5.3. Lesões dermatológicas
ALOPECIA ( ) Generalizada/Difusa ( )Localizada
Localização ( )Cabeça ( )Corpo ( )Membros ( )Cauda ( ) olhos ( ) Dorso ( ) Anterior direito ( )Base ( ) orelha ( )Ventre ( ) Anterior esquerdo ( )Extremidade ( ) focinho ( ) Lateral-Direita ( ) Posterior direito
( ) Pescoço ( ) Lateral - Esquerda ( ) Posterior esquerdo ( ) Dorso ( ) Região crista ilíaca ( ) Regiões de contato ( )Ventre
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral - Esquerda ( ) Lateral - Esquerda
ÚLCERAS ( ) Generalizada/Difusa ( )Localizadas
Localização ( )Cabeça ( )Corpo ( )Membros ( )Cauda ( ) olhos ( ) Dorso ( ) Anterior direito ( )Base ( ) orelha ( )Ventre ( ) Anterior esquerdo ( )Extremidade ( ) focinho ( ) Lateral-Direita ( ) Posterior direito
( ) Pescoço ( ) Lateral - Esquerda ( ) Posterior esquerdo ( ) Dorso ( ) Região crista ilíaca ( ) Regiões de contato ( )Ventre
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral - Esquerda ( ) Lateral - Esquerda
DERMATITE ( ) Generalizada/Difusa ( )Localizada ( ) Seca ( ) Seborréica ( )Furfurácea
68
Localização ( )Cabeça ( )Corpo ( )Membros ( )Cauda ( ) olhos ( ) Dorso ( ) Anterior direito ( )Base ( ) orelha ( )Ventre ( ) Anterior esquerdo ( )Extremidade ( ) focinho ( ) Lateral-Direita ( ) Posterior direito
( ) Pescoço ( ) Lateral - Esquerda ( ) Posterior esquerdo ( ) Dorso ( ) Região crista ilíaca ( ) Regiões de contato ( )Ventre
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral-Direita
( ) Lateral - Esquerda ( ) Lateral - Esquerda
APÊNDICE B – Cálculo dos dados. Validação do DPP®, em comparação ao padrão-
ouro IFI® em cães assintomáticos.
DPP® X IFI® (ASSINTOMÁTICOS)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
DPP® Categoria 1 - Positivo 3 (VP) 0 (FP) 3
Categoria 2 - Negativo 22 (FN) 10 (VN) 32
Total 25 10 35 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.072 0.072
P-valor do Kappa da categoria 0.252 0.252
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.196 inf: -0.051
sup: 0.196 inf: -0.051
69
Kappa Geral
Kappa geral 0.072
P-valor geral 0.252
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.196 inf: -0.051
APÊNDICE C – Cálculo dos dados. Validação do DPP®, em comparação ao padrão-
ouro IFI® em cães oligossintomáticos.
DPP® X IFI® (OLIGOSSINTOMÁTICO)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
DPP® Categoria 1 - Positivo 11 (VP) 0 (FP) 11
Categoria 2 - Negativo 10 (FN) 10 (VN) 20
Total 21 10 31 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.415 0.415
P-valor do Kappa da categoria 0.0040 0.0040
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.701 inf: 0.13
sup: 0.701 inf: 0.13
70
Kappa Geral
Kappa geral 0.415
P-valor geral 0.0040
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.701 inf: 0.13
APÊNDICE D – Cálculo dos dados. Validação do DPP®, em comparação ao padrão-
ouro IFI® em cães sintomáticos.
DPP® X IFI® (SINTOMÁTICO)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
DPP® Categoria 1 - Positivo 32 (VP) 0 (FP) 32
Categoria 2 - Negativo 4 (FN) 1 (VN) 5
Total 36 1 37 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.302 0.302
P-valor do Kappa da categoria 0.01 0.01
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.533 inf: 0.071
sup: 0.533 inf: 0.071
71
Kappa Geral
Kappa geral 0.302
P-valor geral 0.01
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.533 inf: 0.071
APÊNDICE E – Cálculo dos dados. Validação do DPP® em comparação ao padrão-ouro
IFI® sobre o total dos 103 cães.
DPP® X IFI® (TOTAL – 103 CÃES)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
DPP® Categoria 1 - Positivo 46 (VP) 0 (FP) 46
Categoria 2 - Negativo 36 (FN) 21 (VN) 57
Total 82 21 103 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.343 0.343
P-valor do Kappa da categoria < 0.001 < 0.001
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.488 inf: 0.197
sup: 0.488 inf: 0.197
72
Kappa Geral
Kappa geral 0.343
P-valor geral < 0.001
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.488 inf: 0.197
APÊNDICE F – Cálculo dos dados. Validação do EIE® em comparação ao padrão-ouro
IFI® em cães assintomáticos.
EIE® X IFI® (ASSINTOMÁTICO)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
EIE® Categoria 1 - Positivo 1 (VP) 0 (FP) 1
Categoria 2 - Negativo 24 (FN) 10 (VN) 34
Total 25 10 35 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela com Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.023 0.023
P-valor do Kappa da categoria 0.521 0.521
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.094 inf: -0.048
sup: 0.094 inf: -0.048
73
Kappa Geral
Kappa geral 0.023
P-valor geral 0.521
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.094 inf: -0.048
APÊNDICE G – Cálculo dos dados. Validação do EIE® em comparação ao padrão-ouro
IFI® em cães oligossintomáticos.
EIE® X IFI® (OLIGOSSINTOMÁTICO)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
EIE® Categoria 1 - Positivo 8 (VP) 0 (FP) 8
Categoria 2 - Negativo 13 (FN) 10 (VN) 23
Total 21 10 31 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela com Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.284 0.284
P-valor do Kappa da categoria 0.023 0.023
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.53 inf: 0.038
sup: 0.53 inf: 0.038
74
Kappa Geral
Kappa geral 0.284
P-valor geral 0.023
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.53 inf: 0.038
APÊNDICE H – Cálculo dos dados. Validação do EIE® em comparação ao padrão-ouro IFI® em cães sintomáticos.
EIE® X IFI® (SINTOMÁTICO)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
EIE® Categoria 1 - Positivo 32 (VP) 0 (FP) 32
Categoria 2 - Negativo 4 (FN) 1 (VN) 5
Total 36 1 37 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela com Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.302 0.302
P-valor do Kappa da categoria 0.01 0.01
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.533 inf: 0.071
sup: 0.533 inf: 0.071
75
Kappa Geral
Kappa geral 0.302
P-valor geral 0.01
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.533 inf: 0.071
APÊNDICE I – Cálculo dos dados. Validação do EIE® em comparação ao padrão-ouro IFI® sobre o total dos 103 cães.
EIE® X IFI® (TOTAL – 103 CÃES)
IFI®
Categoria 1 Positivo Categoria 2 Negativo Total
EIE® Categoria 1 - Positivo 41 (VP) 0 (FP) 41
Categoria 2 - Negativo 41 (FN) 21 (VN) 62
Total 82 21 103 Tabela de contigência 2 x 2
Tabela com Kappa para as categorias
Cat. 1
P Cat. 2
N
Kappa da categoria 0.29 0.29
P-valor do Kappa da categoria < 0.001 < 0.001
Intervalo de 95% de confiança
do Kappa da categoria
sup: 0.426 inf: 0.154
sup: 0.426 inf: 0.154
76
Kappa Geral
Kappa geral 0.29
P-valor geral < 0.001
Intervalo de 95% de confiança do Kappa
sup: 0.426 inf: 0.154
77
APÊNDICE J – Termo de Consentimento Livre Esclarecido destinado aos proprietários
dos cães utilizados do estudo.
Universidade Estadual do Ceará - UECE Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – PPGCV
LABORATÓRIO DE DOENÇAS PARASITÁRIAS - LABODOPAR Av. Paranjana, 1700 – Campus do Itaperi – 60.740-000 – Fortaleza-CE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO
Eu____________________________________________________________________
_________RG nº______________________, declaro estar ciente dos objetivos do
projeto de pesquisa intitulado “Validação de um Teste Imunocromatográfico RÁPIDO
Dual Path Plataform (DPP®) Para o Diagnóstico da Leishmaníase Visceral Canina”, que
tem como pesquisador principal a Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua e declaro
permitir a coleta de 5mL de sangue de meu cão, bem como a coleta de uma gota de
sangue da ponta da orelha do mesmo cão, para a realização de testes diagnósticos para
Leishmaníase Visceral Canina.
Fui informado que meus dados não serão revelados, sob qualquer hipótese, somente
servirão para controle da pesquisa. Da mesma forma, estou ciente de que não terei
qualquer gasto ou ganho financeiro por participar da pesquisa.
Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem
nenhum prejuízo para mim e sem sofrer qualquer penalidade.
Declaro que uma cópia desse Termo de Consentimento Livre Esclarecido me foi
entregue por membro do projeto de pesquisa e que qualquer dúvida a respeito poderei
entrar em contato com os pesquisadores no Laboratório de Doenças Parasitárias no
endereço: Av. Paranjana, 1700 – Campus do Itaperi – 60.740-000 – Fortaleza-CE e no
telefone (85) 3101. 9853.
Fortaleza___ de _______________ 2011 _______________________________________________________ Membro do projeto de pesquisa Eu aceito participar do projeto citado acima, voluntariamente, após ter sido devidamente esclarecido. ________________________________________________________ Participante da pesquisa
