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Validação e revalidação de métodos para a análise de micotoxinas: Aflatoxina B1, B2, G1, G2, Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina
Jefferson Vieira Santos
Mestrado em Tecnologia e Ciência Alimentar Departamento de Química e Bioquímica 2018
Orientador Luis F. Guido, Professor Auxiliar, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri,
Porto, ______/______/_________
i
“A falta de conhecimento de ontem é o preconceito de hoje
gerando um amanhã de pura ignorância.”
(Txblacklionzion)
ii
Agradecimentos
Os meus mais sinceros e sentidos agradecimentos vão para os meus familiares, em especial
aos meus pais, que mesmo distantes sempre me encorajaram a lutar pelos meus objetivos, a
enfrentar os obstáculos. Conseguiram transmitir conhecimentos que julgo serem de grande
importância e que levarei sempre comigo: ter princípios e manter-se sempre humilde.
Aos meus irmãos, que acreditaram e acreditam no meu potencial e constantemente torcem
por mim.
As minhas cunhadas, que as considero irmãs, muito obrigado por todo o apoio e pelas
palavras de conforto.
Ao meu companheiro, o qual foi o principal motivador para eu ingressar no mestrado. Obrigado
pelos momentos felizes e também por todas as dificuldades que passamos, porém, sempre
nos apoiamos um ao outro, és uma das razões pelo qual luto todos os dias.
Aos meus poucos, mas bons amigos, por todas as boas vibrações. À “Francisquinha” a qual
de colega, transformou-se em amiga, muito obrigado pelas palavras de apoio, pelo
companheirismo, e por sermos parceiros de profissão e ajudar um ao outro mutuamente. À
“Magg” por toda a solidariedade, preocupação, ajuda e por mostrar-se uma grande pessoa
sempre disposta a ajudar.
Às técnicas de laboratório Joana Rangel e Olga Delgado, por todo o conhecimento
transmitido, pela ajuda, pelas chamadas de atenção, pelas palavras de conforto e
encorajamento.
Aos técnicos do laboratório de “MIA” por acreditarem no meu trabalho. E ao grupo Mérieux
NutriScience Portugal, pela oportunidade em fazer parte desta equipa.
Ao meu professor orientador Luís Guido, pelo apoio, paciênca e por auxiliar a concretizar mais
uma etapa na minha vida prossional/acadêmica.
A Portugal, este país maravilhoso, o qual considero minha segunda casa, e que no qual,
trouxe tantas coisas boas para a minha vida.
A todos que diretamente ou indiretamente puderam fazer parte de mais este ciclo que se
encerra, o meu muito obrigado.
iii
iv
Resumo
O presente projeto de dissertação foi desenvolvido no âmbito do Mestrado em Tecnologia e
Ciência Alimentar, como componente da unidade de estágio curricular em parceria com a
empresa Mérieux NutriScience Portugal.
Com o objetivo de avaliar os níveis de contaminações de Aflatoxina B1, B2, G1, G2,
Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina, este trabalho teve como finalidade, validar e
revalidar as metodologias analíticas utilizadas para a deteção e quantificação por HPLC
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e adequação dos métodos utilizados no laboratório
da Mérieux NutriSciences Portugal com a Mérieux NutriSciences Espanha. De forma a
garantir a fiabilidade dos resultados, foram estudados parâmetros como: a repetibilidade do
método, a precisão intermédia, os limiares analíticos, a gama de trabalho e a realização de
testes de recuperação. Devido ao número extenso de matrizes a serem validadas para cada
método e ao grande volume de trabalho nas instalações da empresa, consequentemente a
indisponibilidade do equipamento (HPLC), não foi possível realizar todas as validações.
Sendo assim, o principal foco deste projeto será nas Aflatoxinas.
O método para a análise das Aflatoxinas apresentou-se específico e seletivo ao cumprir os
critérios de ensaios de recuperação estabelelecidos pelo Regulamento (EU) N° 519/2014 (50
a 120%), tendo os resultados obtidos ficado entre 76 e 119%. A exatidão foi constatada ao
comparar os resultados obtidos com o das matrizes FAPAS, onde os resultados se
enquadraram nos limites de concentrações descritos nos boletins. A linearidade fora
comprovada com o teste de RIKILT e o modelo foi considerado linear. O limite de quantificação
da reta obtido foi maior que a concentração do padrão de menor concentração, isto surge
como um fator de segurança, pois, caso este não cumpra com os critérios de repetibilidade,
é possível eleger o padrão subsequente, de modo a garantir resultados consistentes e
coerentes. Parâmetros como a repetibilidade e precisão intermédia, também foram estudados,
o coeficiente de variação manteve-se entre 11% e 6,4% respectivamente. Resultados estes
considerados satisfatórios.
Palavras-chave: micotoxinas, Aflatoxina, Desoxinivalenol, Zearalenona, Ocratoxina, HPLC,
validação.
v
Abstract
The following dissertation was developed under the Technology and Food Science Master’s
Degree, as a component of a curricular unit internship done in partnership with Mérieux
NutriScience Portugal.
With the objective of evaluating the contamination levels of Aflatoxin B1, B2, G1, G2,
Deoxynivalenol, Zearalenone and Ochratoxin, this project aimed to validate and revalidate the
analytical methodology used for detection and quantification through HPLC (High-
Performance Liquid Chromatography) and the adequacy of the methodology used in the
Mérieux NutriSciences Portugal - Mérieux NutriSciences Spain laboratory. In order to
guarantee the reliability of the results, parameters such as the following were studied:
methodological repeatability, intermediate precision, analytical thresholds, the array of work
and the realization of recovery tests. Due to the substantial number of evaluated matrices for
each method, to the great amount of work done in company facilities, and to the consequent
unavailability of equipment (HPLC), it wasn’t possible to execute every validation. Therefore,
the main focus of this project will be aflatoxins.
The method used for aflatoxin analysis was specific and selective, complying with the recovery
testing criteria established by rule No. 519/2014 of the Commission Regulation (EU) (50 to
120%), with results obtained lying between 76 and 119%. Accuracy was assured by comparing
the obtained results with those of the FAPAS matrices, where the results fit the concentration
ranges described in the data sheets. Linearity was validated with the RIKILT test and the model
was considered linear. The quantification limit for the curve was greater than the concentration
of the standard of lowest concentration. This arises as a safety factor, seeing as, if it doesn’t
comply with the repeatability criteria, it’s possible to elect the subsequent pattern, so as to
guarantee consistent and coherent results. Parameters such as repeatability and intermediate
precision were also studied. The variation coefficient remained between 11% and 6.4%,
respectively, yielding satisfactory results.
Keywords: mycotoxins, Aflatoxin, Deoxynivalenol, Zearalenone, Ochratoxin, HPLC,
validation.
vi
Índice
Agradecimentos ............................................................................................................................... ii
Resumo ............................................................................................................................................ iv
Abstract ............................................................................................................................................. v
Índice ................................................................................................................................................ vi
Índice de figuras .............................................................................................................................. ix
Índice de tabelas .............................................................................................................................. x
Abreviaturas e símbolos ................................................................................................................. xi
Apresentação da empresa ............................................................................................................. 1
Parte I -Teórica ................................................................................................................................ 3
1. Micotoxinas .............................................................................................................................. 4
1.1. Importância ........................................................................................................................... 4
1.2. Aflatoxina .............................................................................................................................. 5
1.3. Desoxinivalenol .................................................................................................................... 6
1.5. Zearalenona ......................................................................................................................... 7
1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos toxicológicos e patológicos. ....... 8
1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016 ...............................10
1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas ...................................................................11
1.8.1. Amostragem ....................................................................................................................11
1.8.2. Matrizes complexas ........................................................................................................11
1.8.3. Limites de deteção baixos ..............................................................................................11
1.9. A técnica ..............................................................................................................................12
1.9.1. Preparação da amostra ..................................................................................................12
1.9.2. Extração com solventes .................................................................................................12
1.9.2.1. Extração sólido-líquido ...............................................................................................12
1.9.2.2. Extração líquido-líquido ..............................................................................................13
1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de Imunoafinidade (IAC) .......13
1.9.3. Cromatografia ..................................................................................................................15
1.9.3.1. Histórico .......................................................................................................................15
1.9.3.2. Conceito .......................................................................................................................16
1.9.4. Componentes de um HPLC ...........................................................................................17
1.9.4.1. Injetor ...........................................................................................................................17
1.9.4.2. Bomba ..........................................................................................................................17
1.9.4.3. Coluna cromatográfica................................................................................................18
vii
1.9.4.4. Detetor .........................................................................................................................19
1.9.4.5. Sistema de processamento de dados .......................................................................22
1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica ............................................................22
Parte II - Validação de métodos....................................................................................................25
2. Validação de métodos analíticos ..........................................................................................26
2.1. Seletividade/Especificidade ...............................................................................................26
2.2. Sensibilidade .......................................................................................................................27
2.3. Limiares analíticos ..............................................................................................................27
2.3.1. Limite de deteção (LD) ...................................................................................................27
2.3.2. Limite de Quantificação (LQ) .........................................................................................28
2.4. Linearidade..........................................................................................................................28
2.5. Gama analítica ....................................................................................................................29
2.6. Precisão ...............................................................................................................................29
2.6.1. Repetibilidade ..................................................................................................................30
2.6.2. Reprodutibilidade ............................................................................................................32
2.6.3. Precisão intermédia ........................................................................................................32
2.7. Exatidão ...............................................................................................................................33
Parte III – Experimental .................................................................................................................35
3. Plano de validação .................................................................................................................36
4.1. Reagentes ...........................................................................................................................37
4.2. Materiais ..............................................................................................................................37
4.3. Equipamentos .....................................................................................................................37
4.4. Soluções ..............................................................................................................................39
4.4.1. Procedimento ..................................................................................................................39
4.5. Extração ..............................................................................................................................41
4.5.1. Caso geral .......................................................................................................................41
4.5.2. Outros casos ...................................................................................................................42
4.6. As principais adaptações realizadas para o ensaio ........................................................45
5. Discussão dos resultados ......................................................................................................47
5.1. Matrizes analisadas ............................................................................................................47
5.2. Sensibilidade .......................................................................................................................51
5.3. Limite de deteção - LD .......................................................................................................51
5.4. Limite de Quantificação - LQ .............................................................................................51
5.5. Linearidade..........................................................................................................................52
5.6. Gama de Trabalho ..............................................................................................................54
5.7. Precisão ...............................................................................................................................54
viii
5.7.1. Repetibilidade ..................................................................................................................54
5.7.2. Precisão intermédia ........................................................................................................56
5.8. Exatidão ...............................................................................................................................58
7. Conclusão ...............................................................................................................................61
8. Referências .............................................................................................................................62
Anexo 1 – Matrizes a serem validadas para Aflatoxinas ............................................................65
Anexo 2 – Folha de cálculo para a repetibilidade .......................................................................66
Anexo 3 – Folha de cálculo para precisão intermédia ................................................................66
Anexo 4 – Cromatogramas para Aflatoxinas, método atual e método a ser validado .............68
ix
Índice de figuras
Figura 1 - Instalações da Silliker Portugal .............................................................................. 2
Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015) ....... 14
Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016)..................................................... 16
Figura 4 - Características químicas de uma amostra (Adaptado de Chust, 1990) ................ 18
Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017) ........................................ 22
Figura 8 - Bomba ................................................................................................................. 38
Figura 6 - Banho a 70°C ....................................................................................................... 38
Figura 7 - Peça T ................................................................................................................. 38
Figura 9 - Misturador de aço inox ......................................................................................... 41
Figura 10 - Sistema de imunoafinidade montado ................................................................. 42
Figura 11 – Colunas de imunoafinidade ............................................................................... 42
Figura 12 - Fluxograma representativo da análise das Áflatoxinas ....................................... 45
Figura 13 - Reta de calibração Afla G2................................................................................. 50
Figura 14 - Reta de calibração Afla G1................................................................................. 50
Figura 15 - Reta de calibração Afla B2 ................................................................................. 50
Figura 16 - Reta de calibração Afla B1 ................................................................................. 50
Figura 17- Linearidade Afla G2 ............................................................................................ 53
Figura 18 - Linearidade Afla G1........................................................................................... 53
Figura 19 - Linearidade Afla B2 ........................................................................................... 53
Figura 20- Linearidade Afla B1 ............................................................................................. 53
x
Índice de tabelas
Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para
a saúde ............................................................................................................................................ 9
Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme
o decreto CE N.1881 2016 ............................................................................................................10
Tabela 3 – Massa molecular e absortividade molar para as Aflatoxinas G2, G1, B2 e B1. ....40
Tabela 4 – Volumes para a reta de calibração dos padrões para as Aflatoxinas. ...................40
Tabela 5 – Procedimento para a extração das Aflatoxinas nas matrizes que diferem do caso
geral. ...............................................................................................................................................43
Tabela 6 – Purificação por coluna de imunoafinidade para a análise das Aflatoxinas das
matrizes que diferem do caso geral .............................................................................................44
Tabela 8 - Principais alterações nas condições do HPLC para a análise das Aflatoxinas......46
Tabela 9 – Matrizes de referência utilizadas para a análise das Aflatoxinas ...........................47
Tabela 10 – Contaminação das amostras que não possuem Aflatoxinas. ...............................48
Tabela 11 - Padrões e áreas da reta de calibração para análise das Aflatoxinas ...................49
Tabela 12 - Sensibilidade do método para cada Aflatoxina analisada. ....................................51
Tabela 13 - Avaliação da linearidade da reta de calibração das Aflatoxinas através do teste de
RIKILT .............................................................................................................................................52
Tabela 14 – Matrizes analisadas para a determinação da repetibilidade, desvio padrão,
coeficiente de variação e limite de repetibilidade relativo. .........................................................55
Tabela 15 – Matrizes analisadas para a determinação da precisão intermédia, desvio padrão,
coeficiente de variação e limite da precisão intermédia. ............................................................57
Tabela 16 - Média, desvio padrão e coeficiente de variação para o ensaio de recuperação .59
Tabela 18 - Intervalos de aceitação para os ensaios de recuperação conforme o Regulamento
(UE) N° 519/2014 ...........................................................................................................................60
Tabela 19 - Matrizes para aflatoxinas ..........................................................................................65
xi
Abreviaturas e símbolos
A. Aspergillus
ACN Acetonitrilo
ADN Ácido Desoxirribonucleico
AFLA Aflatoxina
aw Atividade da água
C.V Coeficiente de variação
CE Comissão Europeia
DON Desoxinivalenol
ECD Electron Capture Detector
EGI Engenharia e Gestão de Qualidade Industrial
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
F Distribuição de Fisher
F. Fusarium
FAO Food and Agriculture Administration
FID Flame Ionization Detector
FLD Fluorescence Detector
G Grubbs
GC Gas Chromatography
GFC Gel Filtration Chromatography
GPC Gel Permeation Chromatography
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IAC Immunoaffinity Columns
IARC International Agency for Research on Cancer
L.P.I Limite da Precisão Intermédia
L.R Limite de Repetibilidade
L.R (%) Limite de Repetibilidade Relativo
LC Liquid Chromatography
LD Limite de Deteção
LQ Limite de Quantificação
MeOH Metanol
MS Mass Spectrometry
OA Ocratoxina A
OCRA Ocratoxina
P. Penicilluim
xii
PBS Phosphate Buffered Saline
S.A Sociedade Anonima
TLC Thin Layer Chromatography
UV Ultravioleta
ZEA Zearalenona
1 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Apresentação da empresa
✓ Histórico
Em Julho de 1992 em Vila Nova de Gaia, é fundada a Sociedade de Engenharia e Gestão da
Qualidade Industrial, Lda. (EGI), com o intuito de atender a demanda do mercado como uma
empresa prestadora de serviços para o ramo agro-alimentar. Surge em um momento onde a
prevenção da qualidade e segurança alimentar são fundamentais para a indústria. É neste
contexto e a falta de prestações de serviços de análises, que a EGI torna-se líder nacional no
setor.
Em 1993 a empresa tem o seu laboratório acreditado, conforme a sua política de qualidade e
sustentabilidade.
No ano 2000 implementa o laboratório de Análise Sensorial, visto a necessidade da avaliação
organoléptica na análise dos alimentos.
Com o forte crescimento e desenvolvimento, em Março de 2005 a EGI adquire novas
instalações, visando perspectivas futuras de modo a ampliar e acomodar todos os seus
laboratórios e serviços desenvolvidos.
Fruto de todo o desenvolvimento e liderança do setor, em Março de 2008 a empresa
multinacional norte-americana Silliker, adquire a empresa, tornando-se então o grupo Silliker
Portugal S.A. e integrante de um dos maiores grupos mundiais na prestação de serviços na
área da qualidade e segurança alimentar.
Desde 2014 que a Silliker aparesenta-se como Mérieux NutriSciences, pois foi a sociedade
da família Mérieux que em 1990 adquiriu a Silliker.
Atualmente o grupo Mérieux possui cerca de 100 laboratórios acreditados a operar em 21
países e a empregar 6500 funcionários.
✓ Missão
Proteger a saúde dos consumidores de todo o mundo disponibilizando uma vasta oferta de
serviços analíticos e de consultoria para as indústrias do setor alimentar e nutrição.
Adicionalmente presta serviços a empresas de diferentes setores, nomeadamente nas áreas
da água e ambiente, agroquímicos, bens de consumo, farmacêutica e cosméticos.
2 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
✓ Setores
As mediações da Merieux Portugal, estão divididas em: análises físico-químicas e
microbiológicas, análise sensorial, rotulagem, auditorias, consultorias de gestão da qualidade
e segurança alimentar e apoio ao cliente.
Figura 1 - Instalações da Silliker Portugal
3 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Parte I -Teórica
4 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1. Micotoxinas
Os primeiros relatos decorrem no século X, quando uma doença, até então desconhecida,
afetou grande parte da população Europeia em 943. Entre os principais sintomas estavam:
crises epiléticas, espuma pela boca, vómitos, crises de loucura e dores insuportáveis.Tratava-
se de um “fogo invisível” que desprendia a carne dos ossos e a consumia. Doença essa,
popularmente nomeada de “Fogo de Santo António”, uma vez que os enfermos recorriam ao
santuário de Santo António, localizado em França com o intuito de obter a cura (FAO, 2003).
Atualmente sabe-se que o “Fogo de Santo António” ou ergotismo, é uma intoxicação
proveniente da ingestão de alimentos contaminados por um produto tóxico produzido pelo
fungo Claviceps purpurea ou “Esporão do Centeio” (FAO, 2003). Este produto tóxico é
originário do metabolismo secundário produzido por alguns fungos filamentosos e fazem parte
da flora natural de alguns produtos alimentares (Soares et al., 2013). Os metabolitos
produzidos por esses fungos são denominados “Micotoxinas” e as doenças causadas são
chamadas “Micotoxicose”.
1.1. Importância
O ano de 1962 na Inglaterra ficou marcado pela morte de mais de 100.000 perús, que
apresentaram um quadro clínico de hemorragias internas e necrose hepática (Rocha et al.,
2014; Soares et al., 2013). Após investigações, descobriu-se que os perús morreram após a
ingestão da ração à base de amendoim originário do Brasil e África. A substância presente
nesses amendoins foi proveniente do fungo Aspergillus flavus. Surgia a primeira micotoxina a
ser estudada: a Aflatoxina, derivada da palavra Aspergillus flavous toxins (Food Ingredients
Brasil, 2009).
A partir do estudo da Aflatoxina, investigadores descobriram outros fungos responsáveis por
outras toxinas distintas. Atualmente estão documentadas no mundo todo mais de 400
micotoxinas, no entanto, apenas será relatado nesta dissertação as quatro principais:
Aflatoxina, Desoxinivalenol, Ocratoxina e Zearalenona.
Quando inaladas ou ingeridas, as micotoxinas no organismo humano são altamente tóxicas e
possuem efeitos diversos, sendo sempre prejudicial. Os efeitos irão depender do tipo de
micotoxina, da concentração, do tempo de exposição, do modo de ação da micotoxina, do
sexo, da idade e da massa corpórea (Tattibayeva, 2017).
5 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Entre os principais problemas estão: o aparecimento de tumores, a debilitação do sistema
imunológico, lesão renal, doenças crónicas, estrogénica, hemorrágica, mutagénica,
teratogénica, nefrotóxica e hepatotóxica (Pereira et al., 2014).
As micotoxinas são termoestáveis, portanto, durante o ciclo de processamento do alimento
e/ou pasteurização, as mesmas não são destruídas. Sendo um contaminante natural,
principalmente nos vegetais, é praticamente impossível a sua eliminação. Entretanto, torna-
se indispensável minimizar a contaminação por fungos para que estes não representem um
risco para a saúde da população.
1.2. Aflatoxina
Estão descritas 18 tipos de Aflatoxinas, sendo as principais: B1, B2, G1, G2, M1 e M2 (Coll et
al., 2015). A Aflatoxina B1 é a micotoxina mais tóxica e mais abundante. É um dos compostos
naturais mais carcinogénico em todas as espécies de animais pesquisadas. Classificada no
“Grupo I” pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como composto altamente
carcinogénico para os seres humanos. Ligam-se ao ADN e interferem na síntese da proteína
(Tattibayeva, 2017).
As Aflatoxinas apresentam tropismo pelos órgãos como o fígado, cérebro e rins. Os principais
fungos produtores desta micotoxina são: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Porém,
também são fungos produtores de micotoxinas: Aspergillus nomius, Aspergillus bombycis,
Aspergillus pseudotamari e Aspergillus ochraceoroseus (Rocha, 2014). A micotoxina
produzida pelo género A. flavus está adaptada a uma grande variedade de climas, substratos
e habitats. Os principais alimentos onde são encontrados maioritariamente são: amendoim,
milho e sementes de algodão. Produz unicamente as Aflatoxina Bs. O género Aspergillus
parasiticus, é sobretudo encontrado em amendoins. Entretanto, todas as estirpes produzem
Aflatoxinas Bs e Gs. Plantas aéreas como no caso do milho, geralmente são suscetíveis a
infeção por Aspergillus flavus, no entanto, plantas rasteiras como os frutos secos em contato
com o solo podem ser infetadas por Aspergillus flavus e parasiticus (Soares, 2013).
Para o desenvolvimento de A. Flavus e consequentemente das Aflatoxinas, a atividade da
água ótima é elevada (aw 0,99) e o valor mínimo é aproximadamente 0,82. O fungo prolifera-
se a uma temperatura entre 10 a 43°C, ocorrendo uma maior produção das micotoxinas a
uma temperatura entre 20 e 30°C.
6 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Para o fungo A. Parasiticus, as condições são semelhantes, com aw 0,83 para o crescimento
e 0,87 para a produção de micotoxinas. A temperatura ótima para o crescimento do fungo é
de 30°C e para produção de micotoxinas é de 28°C (FAO, 2003).
A intoxicação com Alfatoxina B1 é chamada de “Aflatoxicosis”, e apresenta-se como aguda
ou crónica. A aguda poderá ocorrer a nefrotoxicidade, cardiotoxicidade e hepatotoxicidade,
resultando em um quadro clínico de icterícia, vómitos, dores abdominais e insuficiência
hepática, provocando até mesmo a morte. A crónica relaciona-se com quadros de
desnutrição, carcinogénese e imunossupressão. Afeta o número e a função dos linfócitos e
inibem a fagocitose. Em pacientes que apresentam o vírus da hepatite B, o risco de
desenvolver cancro no fígado aumenta 60 vezes, pois a Aflatoxina B1 é 30 vezes mais potente
nestes indivíduos (Coll, 2015).
1.3. Desoxinivalenol
O Desoxinivalenol (DON) é o tricoteceno originário do género Fusarium graminearum e F.
culmorum. DON é o mais comum e não é classificado como carcinogénico em humanos. Os
tricotecenos são um grupo de aproximadamente 150 metabolitos produzidos pelo fungo do
género Fusarium, Myrothecium, Phomopsis, Stachybotrys, Trichoderma, Trichotecium,
Verticimonosporium entre outros. Os tricotecenos são conhecidos pela capacidade de inibir a
síntese de proteínas eucarióticas, interferindo na iniciação, alongamento e terminação da
síntese proteica (Rocha, 2014).
É encontrado principalmente em cereais, cevada, centeio, trigo e milho. O género F.
graminearum possui temperatura ótima de crescimento de 25°C, aw mínima para o
crescimento de 0,90, o limite máximo é superior a 0,99. É predominante em climas
temperados. Já o F. culmorum possui uma temperatura ótima de 21°C, comum em climas
frios. Outra peculiaridade é que tanto um fungo como o outro têm a capacidade de produzir
outros tricotecenos tóxicos: 15-acetildesoxinivalenol, 3-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-
acetilnivalenol e fusarenona-X.
Também conhecida como vomitoxina, a ingestão aguda, a curto e longo prazo poderá causar
a inibição do apetite, redução de peso, gastrointerites, vómitos, cardiotoxicidade,
teratogenicidade e imunotoxicidade. Um caso de micotoxicose aguda com a população da
Índia, China e zonas rurais do Japão, ocorreu após a ingestão de milho e trigo mofado. Num
período de cinco a trinta minutos, surgiram os sintomas de náuseas, vómitos, dores
abdominais, diarreia, tontura e dor de cabeça (FAO, 2003; Soares 2013).
7 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1.4. Ocratoxina
Descoberta em 1965 como um metabolito secundário do fungo Aspergillus ochraceus, durante
estudos para a descoberta de novas moléculas de micotoxinas. Existem cinco tipos de
Ocratoxinas: A, B, C, alfa e beta, entretanto, a A é a mais tóxica. A Ocratoxina A é produzida
por diversos fungos provenientes da armazenagem, são eles: A. ochraceus, A alliaceus, A.
ostianus, A. mellus, Penicilluim viridicatum, P. cyclopium e P. variable (Food Ingredients Brasil,
2009; Rocha 2014; Coll, 2015).
A OA tem sido encontrada em milho, feijão seco, cacau, soja, cevada, frutas cítricas,
castanhas do Brasil, tabaco mofado, presunto curado, amendoim, grãos de café, uvas e
derivados, frutos secos e arroz. Está principalmente presente nos países da Europa e Canadá,
pois são países onde o consumo de alimentos à base de cevada e trigo são maiores. São
nestes alimentos onde melhor se desenvolve o fungo P. verrucosam. Também é possível
encontrar OA na carne de animais que foram alimentados com cereais contaminados (Food
Ingredients Brasil, 2009; Tattibayeva, 2017)
A temperatura de máxima produção para a OA é de 30°C e aw 0,95. Para a A.ochraceus a
produção mínima ocorre a 30°C e aw 0,85. Quando se trata da espécie P. verrucosam, o fungo
desenvolve e produz OA de 0°C a 31°C. Poderá produzir quantidades consideráveis de toxina
a 4°C com aw 0,86. Ao ser ingerida, é absorvida pelo trato gastrointestinal ligando-se às
proteínas plasmáticas, como a albumina, alastrando-se pelo rim e com concentrações
menores no fígado, músculo e tecido adiposo. Os efeitos sobre a saúde não estão claramente
definidos. Efeitos carcinogénicos apenas foram comprovados em estudos com animais, já em
humanos, está apenas limitado a estudos descritivos. Nos animais estudados foi observado
um comportamento hepatóxico, imunossupressor e teratogénico. Com base nestas
evidências a IARC classificou como “grupo 2B”, ou seja, possível carcinogénico para humanos
(FAO, 2003; Food Ingredients Brasil, 2009; Cardona, 2014; Tattibayeva, 2017).
1.5. Zearalenona
Esta micotoxina é produzida pelo género Fusarium, sendo: F. graminearum, F.culmorum, F.
cerealis, F. esquiseti, F crookwellense, F. semitectum. São encontradas maioritariamente nas
culturas de milho, aveia, centeio, cevada e trigo em continentes como a América, Europa e
Ásia. A Zearalenona geralmente ocorre em simultâneo com a DON, pois são produzidas pelo
mesmo género de fungo, mas é encontrada em concentrações menores, quando comparada
com o DON. O fungo coloniza a planta no estágio de floração, em períodos de chuva. Mesmo
8 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
após a colheita, se o nível de humidade for elevado o fungo crescerá e produzirá a micotoxina
(Food Ingredientes Brasil, 2009; Soares et al., 2013).
A exposição a ZEA está relacionada com hiperestrogenismo em porcos, foi observado que
em altas concentrações os porcos também apresentaram alguns distúrbios como o aborto.
Foram relatados problemas reprodutivos em vacas e espécies de ovinos. Os estudos
experimentais realizados em animais não demonstraram quaisquer relações com o
desenvolvimento de cancro (Rocha et al., 2014). Já em humanos, segundo Cardona (2014) a
exposição a esta toxina tem sido responsável por alguns casos de puberdade precoce em
raparigas.
1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos
toxicológicos e patológicos.
A Tabela 1 apresenta as principais micotoxinas presentes nas diversas regiões, assim como
os principais alimentos e os efeitos causados quando ingeridas.
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para a saúde
Micotoxina Estrutura Química Região Predominante Efeitos Tóxicos Efeitos Patológicos Alimentos
AFLA
América do Norte,
América do Sul, África, Ásia e Austrália.
Citotóxico, mutagénico, hepatotóxico,
carcinogénico, teratogénico,
imunossupressor.
Hiperplasia das vias biliares, hemorragias intestinais e
renais, tumores no fígado, hepatite aguda, cirrose
hepática.
Frutos secos, cereais,
café, oleaginosas e amendoins.
DON
América do Norte, América do Sul,
Europa (Leste e Oeste).
Imunossupressor, neurotóxico, genotóxico,
teratogénico.
Náuseas temporais, vómitos, diarreia, dor abdominal, dor de cabeça, tonturas, febre,
anorexia.
Cereais de grão pequeno.
OCRA
América do Norte, América do Sul e
Europa (Oeste).
Citotóxico, nefrotóxico, teratogénico,
hepatotóxico.
Nefropatia endémica, nefropatia intersticial crónica,
enterite, nefropatia suína,
tumores renais.
Uvas, uvas passas, cafés, frutos secos,
cereais e pastelaria.
ZEA
América do Norte, África, Europa (Leste e
Oeste).
Genotóxico, efeito estrogénico.
Puberdade precoce, edema
da vulva, prolapso vaginal, atrofia testicular e dos
ovários, aumento das mamas
e aborto.
Cereais de grão pequeno.
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016
Os teores máximos permitidos para as micotoxinas presentes em alimentos estabelecidos pelo decreto da Comissão Europeia de 19 de
Dezembro de 2006, estão resumidamente apresentados na tabela a seguir:
Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme o decreto CE N.1881 2016
Alimento
Micotoxina
Alimento
Micotoxina
Alimento
Micotoxina
Alimento
Micotoxina
Afla B1 (μg/kg) Afla Total Ocratoxina A
(μg/kg) Desoxinivalenol
(μg/kg) Zearalenona
(μg/kg)
Amendoins e frutos de casca rija
2,0 4,0 Cereais 3,0 Cereais 750,0 Cereais 75,0
Frutos secos 5,0 10,0 Uvas passas 10,0 Pão 500,0 Pão 50,0
Cereais 2,0 4,0 Café 5,0 Alimentos para
bebés 200,0
Alimentos para
bebés 20,0
Milho 5,0 10,0 Vinho 2,0
Especiarias 5,0 10,0 Alimentos para
bebés 0,50
Alimentos para bebés
0,10 -
11 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas
Existem diversas metodologias para a análise e identificação de micotoxinas. No entanto, para
que uma análise seja fiável, dependerá de alguns fatores essenciais, apresentados a seguir.
1.8.1. Amostragem
Uma toma representativa do alimento, assim como sua devida homogeneização, é
fundamental para que a análise da amostra seja bem sucedida. As toxinas produzidas pelos
fungos não se distribuem uniformemente pelo alimento. Uma amostra não representativa
poderá invalidar a análise das micotoxinas.
1.8.2. Matrizes complexas
O sucesso da análise decorre da capacidade de separar a micotoxina de uma matriz
complexa. Uma matriz complexa pode ser considerada como amostras que contenham
diferentes composições como por exemplo o teor de carboidratos, proteínas e lípidos. Estes
por sua vez, podem interferir na separação e determinação das micotoxinas.
1.8.3. Limites de deteção baixos
Os limites de deteção são extremamente baixos, em alguns casos em ppb (partes por bilião),
µg/kg ou ng/kg. Um método de deteção bem sucedido deverá ser capaz de detetar estes
níveis de contaminação, com amostras aceitáveis de falsos negativos e positivos (Turner et
al., 2015).
Os métodos utilizados atualmente têm seguido uma série de etapas em comum como:
amostragem, homogeneização, extração, uma etapa de separação para eliminar ou minimizar
os componentes indesejados, purificação, concentração e finalmente a deteção confirmativa.
Entre os métodos de extração está a extração sólido-líquido, onde o analito é extraído por
intermédio de um ou vários solventes de uma matriz sólida. Na sequência é incluída uma
etapa de purificação do extrato obtido, de modo a eliminar os possíveis interferentes. Esta
purificação é realizada com colunas de imunoafinidade, pois permite um limite de deteção
extremamente baixo. Para a deteção confirmativa, utilizam-se técnicas cromatográficas
acopladas a uma variedade de detetores ou métodos imunoquímicos. Estas técnicas são
12 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
conhecidas como: Cromatografia Líquida (LC), Cromatografia Gasosa (GC) e Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (HPLC), combinadas com detetores como a Espectrometria de
Massa (MS), Fluorescência (FLD), Ultravioleta (UV), Ionização de Chama (FID) ou Captura
Eletrónica (ECD). Já as técnicas de rastreio de amostras são realizadas por Cromatografia
em Camada Fina (TLC) ou Imunoensaio, como o Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
(ELISA). Porém, estas duas últimas técnicas apenas permitem resultados qualitativos ou
semi-qualitativos (Pereira et al., 2014; Tattibayeva, 2017).
Na sequência estão descritas as técnicas utilizadas para a determinação das micotoxinas,
assim como o funcionamento do HPLC.
1.9. A técnica
1.9.1. Preparação da amostra
Assim como citado nos itens 1.8.1 e 1.8.2, os alimentos geralmente apresentam grande
complexidade na sua composição, logo, a etapa de amostragem é fundamental para a
obtenção de resultados fidedignos e a amostra deverá ser representativa de todo o produto a
analisar. Para alimentos como cereais, por exemplo, são utilizados moinhos que possam
reduzir os grãos inteiros a pó. Alimentos fluídos como vinhos, bebidas, papas e polpas de
frutas destinadas a alimentação infantil, são homogeneizados muitas vezes na própria
embalagem. Quando os alimentos a serem analisados são pastelarias, frutos secos etc, estes
necessitam de ser processados, de modo a obter um produto homogéneo.
1.9.2. Extração com solventes
1.9.2.1. Extração sólido-líquido
É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz sólida por intermédio de um
solvente. Normalmente é utilizada para extração de grãos, cereais e outras matrizes sólidas.
O solvente a ser utilizado varia de acordo com o analito a ser extraído. A grande maioria das
micotoxinas são solúveis em solventes polares e ligeiramente polares, entretanto, são
insolúveis em solventes apolares. Assim, são utilizadas misturas de solventes orgânicos como
a acetona, acetonitrilo, clorofórmio, diclorometano, acetato de etilo ou metanol com uma
pequena porção de ácidos diluídos ou água. A utilização de água ou sua acidificação promove
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
a eficiência da extração, uma vez que a água aumenta a penetração do solvente dentro do
alimento. Já a acidificação auxilia na quebra de interações moleculares entre a toxina e outros
constituintes como proteínas e açúcares. Muitas vezes solventes apolares são utilizados antes
de realizar a extração sólido-líquido, de modo a remover componentes lipofílicos. A relação
amostra e solvente, assim como o tempo de extração e temperatura devem ser
cuidadosamente controlados para que ocorra uma correta quantificação da toxina. (Pereira et
al., 2014; Fernandes, 2016).
Conforme citado por Pereira et al. (2014), estudos realizados com misturas de solventes
mostraram que a mistura de metanol com acetonitrilo, permite uma co-extração reduzida de
componentes indesejados da matriz sólida. Quando preparado na proporção acetonitrilo/água
(84:16) produziu menos compostos interferentes do que em outras misturas.
1.9.2.2. Extração líquido-líquido
É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz líquida por intermédio de um
solvente. Na extração líquido-líquido o solvente que apresenta uma baixa constante dielétrica
(tendem a ser imiscíveis com água) possuem baixa capacidade de extração de compostos
polares como as micotoxinas. Os solventes mais adequados são o metanol ou acetonitrilo e
devem ser misturados com a água na presença de sais para que estes reduzam a
miscibilidade mútua. Os analitos polares movem-se seletivamente da fase aquosa para a fase
orgânica polar (Turner et al., 2015).
1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de
Imunoafinidade (IAC)
Após a etapa de extração, a micotoxina presente no líquido é isolada por intermédio de
colunas de extração de fase sólida. Nesta etapa serão reduzidos os possíveis interferentes
presentes na matriz. A utilização de colunas de imunoafinidade (IAC) é uma das técnicas com
maior utilização, pois aumentam a seletividade do método. Essas colunas são compostas por
uma fase sólida constituída por anticorpos específicos para cada tipo de micotoxina. Quando
o líquido passa pelo interior da coluna, o analito (micotoxina) de interesse liga-se
seletivamente ao anticorpo, enquanto as impurezas são lixiviadas. Na sequência, o analito é
14 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
eluído por intermédio de um solvente ou uma mistura de solventes, de acordo com a
micotoxina a ser estudada (Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).
Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015)
As colunas de imunoafinidade são destacadas pela simplicidade, alta especificidade,
recuperação, melhor limite de deteção, reduzida percentagem do coeficiente de variação e
análise de múltiplos compostos em uma gama variada de matrizes. Os anticorpos utilizados
na fase sólida poderão ser monoclonais ou policlonais. Monoclonais apresentam um grau de
pureza elevado e são mais sensíveis às condições de ligação dos que os policlonais. É
necessário ter em conta que na presença de solventes orgânicos poderá ocorrer a
desnaturação do anticorpo, sendo assim, é de relevante importância que o extrato a ser
passado pela coluna, seja uma solução aquosa contendo muito pouco ou nenhum solvente
orgânico. A coluna só poderá ser utilizada uma única vez, pois, quando a micotoxina é eluída,
o anticorpo desnatura (Amado, 2002; Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).
Adição da matriz
contendo a
micotoxina
A micotoxina liga-se
ao anticorpo sendo
isolada da matriz
Eluição com o solvente
adequado, desnatura o
anticorpo, libertando a
toxina
Anticorpo
imobilizado
15 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1.9.3. Cromatografia
1.9.3.1. Histórico
Originária do grego “chroma” (cor) e “graphein” (escrever) a cromatografia é datada do ano
de 1903, quando o botânico russo Mikhail Semenovich Tswett, ministou uma palestra e
publicou um artigo com as aplicações da adsorção em análises bioquímicas. Em 1906 mais
dois artigos foram publicados e Tswett descreveu um método físico-químico testado por ele,
onde realizou a separação de pigmentos das plantas. O método possibilitou a separação de
pigmentos de cloroplastos presentes nas folhas verdes das plantas. O botânico utilizou uma
coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (fase estacionária) e o éter de petróleo
(fase móvel), obtendo assim a completa separação dos componentes em faixas coloridas
(Pacheco et al., 2017; Fernandes, 2016; Torre 2013).
Até a década de 30, a cromatografia não tinha muita importância, entretanto o químico alemão
Richard Kuhn em conjunto com o seu pós-doutorando o bioquímico francês Edgar Lederer,
aprimoraram a técnica e conseguiram separar e identificar xantofilas da gema do ovo. Já na
década de 40, os químicos britânicos Archer Martin e Richard Synge, surgiram com o modelo
e a explicação dos pratos teóricos, que está relacionado com a eficiência da separação,
trouxeram conceitos essenciais sobre o GC e o HPLC.
A partir da década de 70, foi possível fabricar colunas com partículas de tamanho reduzido,
importantes para uma boa resolução, também houve o surgimento de equipamentos capazes
de trabalharem sobre altas pressões o que possibilitou um aumento da velocidade na eluição
da fase móvel e consequemente reduzir o tempo de análise. Com o passar dos anos a técnica
sofreu avanços, até surgir a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. É a técnica de
separação mais usual, pois apresenta uma grande sensibilidade e é aplicável a uma vasta
gama de substâncias de elevado significado para as indústrias, ciência e população em geral
(Fernades, 2016; Torre, 2013; Collins, 1997).
Na análise através do HPLC, a utilização de detetores como UV, espalhamento de luz,
fluorescência aliados a softwares específicos, possibilitam a identificação e a análise
quantitativa dos componentes de uma mistura em concentrações muito reduzidas (Lanças,
2009).
16 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
1.9.3.2. Conceito
Quando ocorre uma separação via HPLC, a análise qualitativa dá-se através de uma
representação gráfica com picos (cromatogramas) equivalentes a cada composto da amostra
analisada. A separação dos picos através do sistema cromatográfico é definida de acordo
com a resolução, a retenção e a seletividade. A resolução, definida como a capacidade da
separação. É obtida através da razão da diferença entre a distância de dois picos pela média
da largura do pico, conform a expressão a seguir. (Chust, 1990).
Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016)
Em que:
R = 0 (não há separação)
R = 1,0 (separação parcial)
R = 1,5 (separação na linha de base)
A retenção mede a capacidade do sistema cromatgráfico em reter os componentes de uma
amostra. Já a seletividade é a capacidade do método de detetar um componente de uma
mistura de outros compostos dentro de uma matriz complexa (Aragão et al., 2009). O volume
de retenção/eluição é definido como o volume de fase móvel essencial para arrastar o soluto
através da coluna cromatográfica. O tempo é obtido de acordo com o tempo demorado após
a injeção da amostra na coluna até o soluto atingir o detetor. Maior será a capacidade da
separação quando maior for o tempo que o soluto é retido pela coluna (Fernandes 2016;
Kupiec 2004; Chust, 1990).
A dispersão dos picos cromatográficos comparado ao seu centro é descrito com base nos
pratos teóricos. Caso os picos não saiam simétricos e apresentem apenas uma proximidade
17 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
a forma Gaussiana, a quantidade de pratos teóricos é reduzida. É um fator que facilita o
controlo da eficiência do sistema e o desgaste da coluna cromatográfica. (Chust, 1990).
O processo de eluição (passagem do eluente pela coluna) poderá ser por dois tipos:
✓ Eluição isocrática: a composição da fase móvel não se altera durante a separação.
É a técnica mais simples;
✓ Eluição por gradiente: ocorre a mudança na composição da fase móvel durante a
separação, é indicado para a análise de matrizes complexas.
A redução da viscosidade da fase móvel proporciona um melhor desempenho da coluna
cromatográfica. Essa redução é influenciada pelo aumento da temperatura, entretanto, a
temperatura deve ser sempre controlada, caso contrário originará uma diminuição na
reprodutibilidade e cromatogramas com resolução reduzida (Fernandes, 2016).
1.9.4. Componentes de um HPLC
1.9.4.1. Injetor
Atualmente há muitos sistemas de injeção, entretanto, os mais usuais são as válvulas
manuais ou injetores automáticos. Na injeção manual, há uma válvula com seis vias e duas
posições permitindo que com o auxílio de uma seringa o loop (alça de amostragem) seja
preenchido pela amostra a ser analisada. Em sequência a válvula é rodada, de modo a inserir
o loop na linha cromatográfica em direção ao sistema de bombeamento e a coluna. Os
injetores automáticos apresentam as mesmas funções que um operador executaria na
operação manual: preenche o loop através da inserção da amostra por intermédio de uma
seringa. Outro modelo de injeção automática preenche o loop por meio de sucção da amostra.
Já outra vertente, possui a agulha de amostragem integrada ao loop de amostragem (Neto,
2009).
1.9.4.2. Bomba
As bombas utilizadas são de alta pressão e devem possibilitar o controle da pressão máxima.
Como a fase móvel é um líquido e apresenta alguma viscosidade, é essencial que seja
exercida uma pressão sobre a respetiva, de modo a permitir ultrapassar a resistência exercida
pelas partículas da coluna. Essas partículas apresentam caminhos de difusão relativamente
18 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
curtos, logo, produzem um elevado número de pratos teóricos. A bomba é considerada o
“coração do HPLC” e dela dependem uma variedade de fatores (Fernandes, 2016; Chust,
1990).
Caso o fluxo varie ocorrerá a modificação dos tempos de retenção e das áreas dos picos
cromatográficos, sendo assim, é essencial que o fluxo da fase móvel seja constante, não
apresente pulsações e tenha a possibilidade de ser regulado de acordo com o método a ser
realizado para a análise de uma amostra, é necessário utilizar fluxos baixos, para que assim
permita uma boa precisão e repetibilidade. O fluxo ideal poderá variar de 0,1 ml/min a 5,0
ml/min (Degani et al., 1998; Chust, 1990).
1.9.4.3. Coluna cromatográfica
É na coluna (fase estacionária) que ocorre a separação dos componentes da mistura/amostra.
É um dos componentes mais importantes e crítico no sistema cromatográfico. Geralmente as
colunas são compostas por aço inoxidável o que favorece a resistência à corrosão, são
resistentes a altas pressões e são reaproveitáveis, pois, não há a necessidade de efetuar a
regeneração após a sua utilização. Ao definir o tipo de coluna, é necessário definir as
características da amostra a ser separada conforme o diagrama apresentado por Chust
(1990):
Os diversos componentes presentes na amostra apresentam propriedades distintas, logo
diferentes graus de afinidade com a fase móvel e a coluna, sendo a velocidade de migração
distinta, o que irá permitir a separação cromatográfica. Assim, os componentes que possuem
Amostra Carga iónica
Estrutura
Química
Polaridade
Hidrossolúvel
Lipossolúvel
Positiva
Negativa
Grupo
Funcional
Estereoquímica
Figura 4 - Características químicas de uma amostra (Adaptado de Chust, 1990)
19 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
maior interação/ligação com a coluna serão aqueles que irão eluir por último, já os que
apresentam menor interação serão eluídos primeiro.
As colunas cromatográficas apresentam geralmente um diâmetro interno de 3 a 5 mm e o
comprimento varia de 10 a 50 cm. A capacidade da coluna é estabelecida pelo seu
comprimento e o material ao qual é contida internamente. Nas extremidades da coluna sem
provocar um aumento da pressão, há um disco de metal poroso ou teflon, de modo a previnir
a perda do recheio da coluna ou possíveis mudanças na compactação. O tamanho dos poros
está relacionado com a superfície que a amostra irá interagir. Uma coluna que funcione
adequadamente, as micropartículas devem ser esféricas e o seu tamanho reduzido, o que
proporcionará em uma elevada eficiência e área superficial proporcionando uma maior
retenção (Collins, 1997)
A fase estacionária poderá ser:
✓ Fase normal: a fase móvel é apolar e a fase estacionária é polar, os componentes
apolares serão eluídos primeiro, enquanto os polares ficarão retidos na coluna e serão
eluídos posteriormente;
✓ Fase reversa: quando a fase móvel é polar e a estacionária é apolar, logo os
componentes polares serão os primeiros a serem eluídos e os apolares os últimos.
Nas análises por HPLC, geralmente é utilizado a fase reversa em colunas C18
octadecilsílica (Silva, 2012; Degani et al., 1998)
É necessário que o solvente utilizado na fase móvel, apresente um elevado teor de pureza,
para evitar que este contamine a coluna. A fase móvel deverá ser filtrada, para a remoção de
partículas sólidas, oxigénio ou outros gases dissolvidos. Um outro modo de proteger a coluna
principal, é a inserção de uma pré-coluna (2-5 cm de comprimento) com as mesmas
características, é situada entre o injetor e a coluna principal (Degani, 1998; Collins, 1997).
1.9.4.4. Detetor
O detetor identifica a presença do sinal do analito de interesse que está a ser eluído na coluna,
gerando um sinal eletrónico em forma de pico cromatográfico. A sensibilidade é estimada de
acordo com a relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que faz com que
gere este sinal (Peres, 2002).
Um bom detetor deverá apresentar uma elevada sensibilidade, baixo limite de detecção, uma
alargada faixa de linearidade, confiabilidade e reprodutibilidade, ser facilmente operável, não
destruir o soluto, apresentar insensibilidade a possíveis mudanças na fase móvel e à
20 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
temperatura e baixo nível de ruído. Há uma grande variedade de detetores, a escolha
dependerá das características químicas/estruturais do analito a detetar (Collins, 1997; Chust,
1990).
Entre os detetores estão:
✓ Ultravioleta – Visível (UV-Vis) e de díodos: também conhecidos como detetores
fotométricos, medem a absorvância do UV-Vis. O funcionamento é com base na
absorvância da luz por parte da amostra. A resposta deste detetor é seletiva, pois
apenas deteta as substâncias que absorvem em um determinado comprimento de
onda. São insensíveis a variações de temperatura e vazão. São constituídos por uma
lâmpada de excitação, um filtro ou rede de difração e um divisor do feixe de luz que
dirige cada um dos feixes resultantes e de mesma intensidade a cada uma das duas
células de detecção (amostra e referência), incidindo posteriormente em um
fotodetetor. O fotodetetor medirá a diferença de intensidade de luz entre as células (a
luz que não é absorvida) e gerará um sinal elétrico que será amplificado e convertido
em unidades de absorção. A única desvantagem apresentada provém de sua
seletividade, uma vez que não podem ser utilizados nas análises de deteção de
lípidos, hidratos de carbono, ácidos gordos, hidrocarbonetos e grande parte dos
polímeros. O deteror de díodos utiliza os mesmos princípios do UV, entretanto, permite
a aquisição simultânea em vários comprimentos de onda . O detetor de díodo identifica
o espectro do composto e deteta o comprimento de onda, originando uma
quantificação precisa do composto (Collins, 1997; Chust, 1990).
✓ Fluorescência: é um detetor específico e um dos mais sensíveis para compostos
fluorescentes. Com condições adequadas é possível detetar quantidades na ordem
dos ppb. Entre os detetores de HPLC é o que apresenta maior sensibilidade, sendo
1000 vezes superior à do detetor de UV. Engloba todas as características do detetor
de UV-Vis e permite distinguir os componentes de interesse de uma amostra complexa
de substâncias não fluorescentes. Uma lâmpada de excitação seguida de um filtro de
excitação ou uma rede de difração incide um feixe luminoso sobre a célula de amostra
e excita os átomos da respetiva, o que origina a emissão de um feixe de luz ao voltar
ao estado fundamental. Esse feixe é dirigido a um segundo filtro ou monocromador
que distingui o comprimento de onda emitido, incidindo-o no fotodetetor. Apresenta um
elevado custo, porém, possibilita a análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos,
esteroides, vitaminas e corantes alimentares (Collins, 1997; Chust 1990).
21 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
✓ Condutividade: a principal aplicação é na cromatografia iónica (análise de aniões e
catiões) e metais de transição. É considerado um detetor de alta sensibilidade e
seletividade. O detetor mede a condutividade total da solução (eluente + amostra)
através de uma célula tubular com dois, quatro ou mesmo seis elétrodos de prata,
platina ou aço inoxidável. Geram um sinal analítico que será tratado e quantificado.
Apresenta grande sensibilidade na deteção (até10-8 M) e mudanças de temperatura.
Devido a este fator e a condutividade do eluente, é preciso recorrer a processos de
compensação e supressão química (reduz os interferentes da fase móvel na medição)
ou eletrónica (Inkemia Brasil, 2016; Chust, 1990).
✓ Índice de refração: é um detetor universal, pois apresenta resposta a qualquer
espécie de amostra, entretanto, a sua sensibilidade é moderada, sendo o UV 1000
vezes mais sensível. O funcionamento é baseado na mudança do índice de refração
do eluente devido os componentes da amostra, quanto maior for a diferença de
refração do componente e da fase móvel, maior será a intensidade do sinal. É sensível
às alterações de temperatura o que ocasiona a alteração da resposta do detetor. Não
é recomendado para análises de gradiente. Geralmente são utilizados quando os
demais detetores não correspondem aos compostos de interesse, e a sensibilidade
não seja relevante em separações preparativas e análises de macromoléculas em
cromatografia por exclusão de tamanho (Inkemia Brasil, 2016).
✓ Eletroquímico: também conhecido como amperométrico, possui uma grande
sensibilidade para detetar aminas biogénicas e alguns iões que não são detetados por
condutimetria, por exemplo, os cianetos, sulfuretos, sulfitos, halogenetos e arsenatos.
O seu funcionamento provém da oxidação ou redução do composto a analisar na
superfície do elétrodo. O ganho ou perda de eletrões proveniente da redução ou
oxidação gera uma corrente proporcional à concentração do composto ao passar na
célula de deteção. Apresenta uma grande sensibilidade (10-7 M) e permite uma boa
especificidade na identificação dos compostos obtidos através da seleção do potencial
redox da reação (Chust, 1990).
✓ Espectrometria de massas (MS): permite a informação estrutural de compostos e a
identificação de componentes desconhecidos presentes em amostras, através da
determinação da massa, carga e estrutura proveniente da forma ionizada dos
componentes. Apresenta elevada sensibilidade. As moléculas de uma amostra são
transformadas em iões em fase gasosa, em sequência são separados no
22 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
espectrómetro de acordo com a sua razão massa sobre a carga (Ikemia Brasil, 2016;
Wilson & Walker, 2010).
1.9.4.5. Sistema de processamento de dados
É neste componente onde ocorrerá o processamento de dados, o sinal obtido pelo detetor é
convertido em cromatograma. Os dados obtidos são processados e armazenados no
computador. Com a análise do cromatograma é possível identificar o tempo de retenção, a
altura do pico, a área e controlar a linha de base. O sistema de processamento de dados,
também trará informações a cerca da bomba, fluxo, em resumo comandará todos os
componentes do HPLC.
Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017)
1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica
A cromatografia líquida é classificada em cinco mecanismos distintos no processo de
separação. São eles:
✓ Adsorção: a separação é baseada nas diferenças de afinidade entre os componentes
da amostra e a fase estacionária. As moléculas são reversivelmente retidas na fase
estacionária. Dá-se então a separação dos componentes da amostra em bandas ou
zonas discretas, as quais poderão ser analisadas qualitativamente e
quantitativamente. Este mecanismo poderá ser de fase normal ou reversa, entretanto
23 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
a fase estacionária deverá possuir uma área superficial específica elevada, pois a
retenção é diretamente proporcional à área superficial (Fernandes, 2016).
✓ Partição: é composta por uma fase estacionária líquida e através da adsorção fica
retida na superfície da coluna e uma fase móvel líquida, que entra em contacto com a
fase estacionária que poderá ser polar ou apolar. A separação dos componentes
levará em conta a solubilidade da matriz em comparação com a fase móvel e
estacionária. Os componentes com maior solubilidade na fase móvel, serão eluídos
primeiramente e os componentes com maior solubilidade com a fase estacionária
serão retidos (Silva, 2012).
✓ Permuta iónica: a fase estacionária é carregada com catião ou anião, os
componentes das amostra com cargas contrários a fase estacionária são adsorvidos
seletivamente da fase móvel. Todos estes compostos adsorvidos são posteriormente
eluídos por deslocamento com outros íons com a mesma carga, entretanto, com maior
força de interação com a fase estacionária (Collins, 1997).
✓ Exclusão de tamanho: também conhecida como Permeação em Gel (GPC) e
Filtração em Gel (GFC). É utilizada para compostos de elevado peso molecular. Os
componentes da amostra são separados consoantes o tamanho da molécula.
Empacotada com um material inerte e com porosidade controlada, quando o
componente da amostra entra em contacto com a fase estacionária as micromoléculas
são retidas nos poros. Isto acarretará em uma maior retenção, logo, serão eluídas
mais tardamente, quando comparado com as moléculas maiores (Silva, 2012).
✓ Afinidade: as macromoléculas biológicas unem-se reversivelmente a ligantes
específicos. É necessário preparar uma fase estacionária seletiva, através da
imobilização covalente de ligantes específicos. A macromolécula de interesse ao
entrar em contacto com a coluna é retida, enquanto as moléculas que não possuem
afinidade com o ligante são eluídas (Collins, 1997).
24 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
25 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Parte II - Validação de métodos
26 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
2. Validação de métodos analíticos
A validação de métodos de ensaios tem a finalidade de verificar os requisitos específicos que
são adequados para a finalidade pretendida, logo, é necessário a validação de métodos não
normalizados, métodos criados ou desenvolvidos pelo próprio laboratório ou métodos
normalizados utilizados fora do âmbito para os quais foram concebidos e em ampliações de
métodos normalizados. A descrição do método de ensaio interno deve ser realizada em
documentos, de maneira detalhada e de modo a que qualquer pessoa com formação
adequada o possa executar (Pereira, 2016; Guia RELACRE, 2000).
O principal foco da validação é a confirmação das características do método, se atendem ou
não as especificações requeridas para os resultados analíticos, de modo a estabelecer limites
de controle a serem empregues no trabalho diário. É um aspeto fundamental para demonstrar
a fiabilidade do método nas condições praticadas, permitindo a obtenção de resultados muito
próximos ao valor verdadeiro do teor de um dado analito presente em uma amostra.
Resumidamente, a validação será um comprovativo, partindo de evidências diretas, de que o
método satisfez todos os requisitos para uma dada aplicação ou uso específico, garantindo a
qualidade analítica. Quando ocorrerem mudanças nas características de um método já
implementado e validado no laboratório, este deverá ser revalidado (Martins, 2016; Costa,
2015).
Os requisitos mínimos para uma validação irão depender do tipo de método em causa,
entretanto, compreendem a investigação e o conhecimento da gama de trabalho/linearidade,
limiares analíticos (deteção e quantificação), sensibilidade, precisão e exatidão para análises
quantitativas. Em análises qualitativas os parâmetros mais importantes a serem estudados
são o limite de deteção, a seletividade/especificidade e a robustez (Guia RELACRE, 2000).
2.1. Seletividade/Especificidade
A seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito específico em
uma matriz complexa sem a interferência dos outros componentes. A matriz poderá conter
compostos que interferem na medição. Esses interferentes poderão aumentar ou diminuir o
sinal, a magnitude do efeito também dependerá da concentração do analito (Pereira, 2016;
Guia RELACRE, 2000).
A especificidade de um método é quando este consegue separar o analito dos outros
compostos presentes na amostra. Em resumo, é quando o sinal medido é proveniente
27 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
unicamente do analito em estudo. É possível avaliar as interferências, através de um teste de
recuperação com uma série de amostras, com a mesma matriz, apenas variando a
concentração do analito, em duplicado e em condições de repetibilidade. O método será
específico e seletivo quando obter taxas de recuperação próximas a 100%, ou de acordo com
os critérios de aceitação pré-determinados pelo laboratório. (Guia RELACRE, 2000).
2.2. Sensibilidade
Irá avaliar a capacidade de um método ou equipamento distinguir as diferenças mínimas na
concentração do analito. É definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido (∆L) e
variação da concentração (∆C) correspondente a esse acréscimo. A sensibilidade
corresponde a derivada de primeira ordem da curva de calibração nessa zona de
concentração, se a curva de calibração for um modelo linear, a sensibilidade será constante
ao longo de toda a gama de trabalho, e equivalente ao declive da reta de calibração (Guia
RELACRE, 2000).
Sensibilidade = ∆L
∆C
(1)
2.3. Limiares analíticos
2.3.1. Limite de deteção (LD)
É o teor mínimo medido, no qual é detetado a presença do analito, entretanto, não
necessariamente quantificada como valor exato, com uma certeza estatística razoável
(usualmente 95%). Uma leitura inferior ao LD, não significa que o analito esteja ausente na
amostra, apenas é afirmado que com a probabilidade definida, a concentração do analito será
inferior a um certo valor (Pereira, 2016). É também denominado como a concentração mínima
distinguível de uma amostra com a mesma matriz, mas sem o analito (branco).
(2)
28 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Onde:
Sy/x: desvio padrão residual da curva de calibração
b: declive da reta.
2.3.2. Limite de Quantificação (LQ)
Corresponde à menor concentração medida, na qual é possível quantificar o analito com uma
determinada exatidão e precisão. Após a determinação de LQ, é necessário recorrer a uma
série de padrões internos, em condições de precisão intermédia cuja concentração se
encontre próxima ou igual à do limiar de quantificação, de modo a testar e verificar se a
exatidão e precisão obtida é satisfatória.
(3)
2.4. Linearidade
Corresponde a capacidade do método analítico produzir um sinal diretamente proporcional à
concentração do analito dentro do intervalo da gama de trabalho. Para traçar a curva de
calibração são necessários definir no mínimo cinco pontos, excluindo o ponto zero para não
proporcionar possíveis erros associados. Este parâmetro pode ser verificado através da
visualização da reta de calibração do gráfico e do valor do coeficiente de correlação linear
obtido que deve ser maior que 0,995 e por avaliação estatística através do teste RIKILT, o
qual analisa a linearidade de cada ponto da curva de calibração (Fernandes, 2016).
y = ax + b
(4)
Em que:
y: sinal instrumental
a: declive da reta
x: concentração do analito
b: interseção da reta com o eixo y (ordenada de origem)
29 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Para avaliar é necessário determinar a razão entre o sinal instrumental (yi) e a concentração
do padrão (xi) para cada ponto da reta e a média das razões obtidas (y i/xi)m. Na sequência é
calculada a percentagem da linearidade para cada ponto. E para que o método seja
considerado linear, é considerado o valor da média como 100% o que indica uma linearidade
perfeita, e cada ponto da reta deverá estar situado entre os 90% e 110%. Se houver algum
valor fora deste intervalo, este deverá ser descartado e o teste RIKILT deverá ser novamente
aplicado à gama reduzida, até se verificar os requisitos estabelecidos (Fernandes, 2016).
A equação a ser utilizada está representada a seguir:
(5)
2.5. Gama analítica
A gama de trabalho corresponde ao intervalo de concentrações no qual o analito pode ser
determinado com boa linearidade, precisão e exatidão. A escolha da gama, deve ter em
consideração a abrangência de toda a gama de concentração das amostras, sendo
recomendado que a concentração mais frequente das amostras incida sobre o centro da gama
(Martins, 2016; Pereira, 2016).
2.6. Precisão
A precisão avalia a dispersão dos resultados obtidos em ensaios independentes, repetidos
sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas. Permite
constatar que o método tem a capacidade de repetir e reproduzir os resultados obtidos em
análises sobre a mesma amostra ou padrão. É recomendável a utilização de amostras reais,
para que o efeito matriz, que pode influenciar os resultados obtidos bem como a avaliação da
precisão, seja considerado.
A dispersão é avaliada através de duas medidas extremas: repetibilidade e reprodutibilidade.
Entre ambas existe uma situação intermédia designada por precisão intermédia ou
variabilidade interlaboratorial (Guia RELACRE, 2000).
30 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
A precisão pode ser expressa sob a forma de desvio-padrão:
(6)
Ou pelo coeficiente de variação:
(7)
Em que s corresponde ao desvio padrão da precisão intermédia e �̅� a média dos resultados
obtidos.
2.6.1. Repetibilidade
Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas (ensaios
realizados sobre a mesma amostra, mesmo laboratório, mesmo analista, mesmo
equipamento, mesmo tipo de reagentes e a curtos intervalos de tempo). Para determinar a
repetibilidade de um método no próprio laboratório, é realizado uma série de medições (n ≥
10) sobre uma mesma amostra ou padrões em condições de repetibilidade. O limite de
repetibilidade é o valor máximo admissível para a diferença absoluta ente dois ensaios em
condições de repetibilidade, determinada para o nível de confiança de 95%.
∆𝒓 = 𝒕u𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) × √𝟐 × �̅�𝒓i
(8)
Onde o n é o número de réplicas que servem de base para determinar o desvio-padrão S̅𝒓i ,
referente à repetibilidade estimada 𝒕u𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) o valor crítico da distribuição t-student, com um
nível de significância de 0,05 e com n-1 graus de liberdade.
É necessário também considerar o coeficiente de variação de repetibilidade, CVr que é
numericamente igual à razão entre o desvio-padrão da repetibilidade (Sri) e a média dos
resultados obtidos, �̅�:
31 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
%𝑪𝑽𝒓 = 𝟏𝟎𝟎 × 𝑺𝒓𝒊
�̅�̅
(9)
Para verificar o afastamento ou resultados discrepantes das medições, é necessário aplicar o
teste de Grubbs:
G calculado = |𝒙̅𝒔−�̅�̅|
𝒔
(10)
xs é o valor suspeito
�̅� é o valor médio
s é o desvio padrão
Para n graus de liberdade para um nível de confiança de 99%:
Se Gcalculado < Gtabelado o valor suspeito não é aberrante face ao conjunto de dados
considerados;
Se Gcalculado > Gtabelado o valor suspeito é aberrante face ao conjunto de dados considerados,
logo deve ser rejeitado.
A homogeneidade das variâncias dos diferentes resultados para a análise da repetibilidade
são avaliadas de acordo com o teste de Cochran. De modo a verificar se há diferenças
significativas entre as variâncias ou não:
(11)
Sri2máx é a variância máxima do conjunto de dados considerados
∑ Sri2 é o somatório de todas as variâncias consideradas
Para um nível de confiança de 95% com n-1 graus de liberdade, em que n é o conjunto dos
dados considerados, temos:
Se Ccalculado < Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que não são
significativamente diferentes;
Se Ccalculado > Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que são
significativamente diferentes
32 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
2.6.2. Reprodutibilidade
Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições experimentais distintas,
realizando o mesmo método de ensaio numa mesma amostra, variando apenas algumas
condições como: operador, laboratório, equipamento e intervalo temporal.
A reprodutibilidade definirá a amplitude de erros aleatórios de quantificação a uma escala
transnacional e só pode ser estimada através de ensaios interlaboratoriais. Assim é efetuado
o envio de uma série de amostras aos laboratórios participantes, e estes realizam ensaios
sobre a mesma amostra. A variância associada é calculada de acordo com a seguinte
expressão:
𝑺2𝑹𝒊 = 𝑺2
𝑳𝒊 + 𝑺2𝒓𝒊
(12)
Onde:
𝑺2𝑹𝒊 : é a variância da reprodutibilidade
𝑺2𝑳𝒊 : é a variância interlaboral
𝑺2𝒓𝒊 : é a variância da repetibilidade
Se o principal foco é implementar um novo método de análise, o estudo da reprodutibilidade
de um método é indispensável, pois verifica a precisão do método sobre diferentes condições
de trabalho. Já quando o objetivo é a validação, o estudo da reprodutibilidade não possui a
mesma importância, uma vez que o método será executado pelo mesmo laboratório, será
utilizado o mesmo equipamento e as condições experimentais variam pouco ao longo do
tempo.
2.6.3. Precisão intermédia
Exprime a precisão estimada sobre a mesma amostra ou padrão ao utilizar a mesma
metodologia, o mesmo laboratório, estabelecendo exatamente as condições que sofrem
alterações como operadores distintos, equipamentos distintos e intervalo temporal distinto.
Para quantificar a precisão intermédia é necessário realizar várias medições sobre a mesma
amostra, variando os parâmetros experimentais em cada análise. É realizada com base nas
cartas de controlo de amplitudes, uma vez que, ao realizar as análises em dias diferentes há
33 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
uma variação aleatória considerável dos parâmetros experimentais não controlados, que
afetam o desempenho do método. A precisão intermédia é calculada consoante a seguinte
expressão:
(13)
Em que:
S precisão : é o desvio padrão relativo da precisão intermédia
n: o número de réplicas
t: número de amostras ensaiadas
yjk :o resultado replicado
k: (variando k entre 1 e n) do padrão j (variando j entre 1 e t)
�̅� j : a média aritmética dos resultados de n ensaios realizados sobre o padrão j (t – n) deve
ser superior a 15.
Quando n= 2 temos:
14)
Yj1 – primeiro resultado obtido para a amostra j;
Yj2 – segundo resultado obtido para a amostra j.
2.7. Exatidão
É a concordância do resultado obtido em um ensaio com um valor de referência tido como
verdadeiro. Ao ser inserida em uma série de resultados é acompanhada de possíveis erros
aleatórios e sistemáticos. Sendo assim, para avaliar a exatidão geralmente é utilizado
materiais de referência certificados, ensaios interlaboratoriais e testes comparativos (Guia
RELACRE, 2000).
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
2.8. Material de referência – FAPAS
A FAPAS é uma empresa de renome mundial e fornecedora de matrizes alimentares
certificadas, utilizadas no controle de qualidade desde 1990. Estes materiais de controle são
uma ferramenta de controlo interno dos resultados de um laboratório, assim como são úteis
no treino do analista. As matrizes FAPAS são elaboradas com um rigoroso controlo da
qualidade. A reprodutibilidade dos seus resultados é obtida mediante um consenso dos
laboratórios do grupo, utilizando diferentes métodos analíticos. Geralmente o material de
referência apresenta um relatório técnico, com a informação da matriz, gama de concentração
e o valor médio medido.
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Parte III – Experimental
36 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
3. Plano de validação
3.1. Objetivo
O objetivo é validar e revalidar as metodologias analíticas utilizadas para a deteção e
quantificação das micotoxinas (Aflatoxina G2, G1, B2 e B1; Desoxinivalenol, Ocratoxina e
Zearalenona) por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e adequação dos métodos
utilizados no laboratório da Mérieux NutriSciences Portugal com a Mérieux NutriSciences
Espanha. A metodologia portuguesa será adaptada de modo a se assemelhar com a
metodologia espanhola. A fiabilidade dos resultados será garantida com base no estudo de
parâmetros tais como a repetibilidade do método, a precisão intermédia, os limiares analíticos,
a gama de trabalho e a realização de testes de recuperação.
3.2. Observação
Devido ao número extenso de matrizes a serem validadas para cada método, e ao grande
volume de trabalho nas dependências da empresa e consequente indisponibilidade do
equipamento (HPLC), não foi possível realizar todas as validações, sendo as Aflatoxinas a
única família de compostos estudada. Entretanto, não houve tempo hábil para concluir a
validação da respetiva, pelo que apenas uma pequena parte das matrizes foram analisadas.
Os resultados apresentados no decorrer deste trabalho, serviram unicamente como base de
inicialização do estudo de validação. Para que esta seja concluída, é necessário que
futuramente o estudo seja retomado.
As matrizes a serem estudadas para o método das aflatoxinas, estão representadas no anexo
1.
37 FCUP
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4. Materiais e método
4.1. Reagentes
✓ Acetonitrilo – Honeywell (99,9%)
✓ Cloreto de sódio – VWR Chemicals (99,9%)
✓ Iodo cristalino – Sigma Aldrich (99,8%)
✓ Metanol para HPLC – VWR Chemicals (100%)
✓ Padrão para aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 – Sigma Aldrich (G2 98,5%; G1 99,7%; B2
99,0% e B1 99,0%)
✓ Tolueno – Carlo Erba Reagents (99,8%)
4.2. Materiais
✓ Células de quartzo com trajeto ótico de 1 cm - Hellma
✓ Colunas IAC para Aflatoxinas - Ambifood
✓ Espátula
✓ Filtro de plástico
✓ Papel filtro de membrana de porosidade 0,45 µm - VWR
✓ Matraz
✓ Unidade de filtração à vacuo
✓ Micropipeta - Eppendorf
✓ Papel filtro – VWR (5 – 13 µm)
✓ Papel filtro de microfibra de vidro – VWR (1,6 µm)
✓ Proveta de vidro – Linex (250 ml)
✓ Reservatório de vidro para colunas de imunoafinidade (10 ml) – Poulten & Graf
✓ Seringa de plástico
✓ Tubo Falcon – Sarstedt AG & Co (15 ml)
✓ Vial âmbar – VWR (1,5 ml)
4.3. Equipamentos
✓ Misturador equipado com copo de aço inox – Waring Laboratory
✓ Espectofotómetro (comprimento de onda entre 200 nm e 400 nm) – Pharma Spec UV
1700 Shimadzu
✓ HPLC (Agilent Technologies Série 1200) constituído por:
38 FCUP
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✓ Bomba de HPLC – HITACHI
✓ Sistema de injeção automático
✓ Sistema de derivatização pós-coluna constituído por uma segunda bomba não
peristáltica, uma peça T, um tubo em PTGE ou aço inox com comprimento de 3000
mm a 5000 mm e um diâmetro interno de 0,5 mm, e um banho de água regulado a
70ºC.
O frasco a conter a solução de iodo é inserido na bomba, em sequência na peça T os
capilares devem estar inseridos no banho, uma das extremidades do capilar de
coloração verde é ligado na saída na coluna e a extremidade do capilar de cor marrom
é conectado na saída da bomba (capilar metálico) e por último a extremindade do
capilar bege é conectado no detetor. O iodo entra em contato com a fase móvel
proveniente da coluna, que por sua vez é encaminhado para o detetor.
✓ Coluna analítica tipo C18 (4,6 mm x 150 mm e 5,0 µm de porosidade) - Waters
✓ Detetor de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 365 nm e um
comprimento de onda de emissão de 435 nm
✓ Forno de colunas a 40 °C – Shimadzu CTO 6A
✓ Balança eletrónica de precisão, capaz de pesar com a aproximação de 1mg – Metller
Toledo
✓ Banho de ultrassom – VWR
✓ Bomba peristáltica – ISMATEC
Figura 8 - Peça T Figura 7 - Banho a 70°C Figura 6 - Bomba
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
4.4. Soluções
✓ Solução de extração Metanol/Água (80:20)
✓ Solução de extração Metanol/Água (60:40)
✓ Solução de Tween 20 a 10%
✓ Solução Metanol/Água (50:50)
✓ Solução tampão fosfato pH 7,4 (PBS)
✓ Solução de tween 20 a 10% de PBS
✓ Solução tolueno/acetonitrilo (98:2)
4.4.1. Procedimento
Foi preparado previamente a fase móvel, constituída de uma mistura de água, acetonitrilo e
metanol na proporção 3:1:1. Em sequência foi preparado o reagente de derivatização
contendo metanol, iodo e água. O reagente de derivatização foi agitado por aproximademente
duas horas e em sequência foi deixado em repouso por 15 minutos. Finalmente foi filtrado por
filtração a vácuo. Foi preparada uma solução padrão das Aflatoxinas (100 µg/l para G1 e B1,
e 30 µg/l para G2 e B2) com metanol. Para realizar o enriquecimento das amostras que não
apresentam a toxina, foi preparada uma solução das Aflatoxinas (20 µg/l B1 e G1; 5 µg/l B2 e
G2) utilizando tolueno/acetonitrilo. A confirmação da concentração foi efetuada através da
curva de absorção, pela leitura em espectrofotómetro com comprimento de onda de 330 nm
a 370 nm. Sendo a solução de referência a mistura de tolueno/acetonitrilo.
A concentração foi calculada com base na seguinte equação:
ρ = �̅� 𝒙̅ 𝑴 𝒙̅ 𝟏𝟎𝟎
𝜺 𝒙̅ 𝒅
(15)
Em que:
�̅� = absorção média determinada a partir dos valores de absorção máxima de 3 curvas de
absorção. A diferença não deve exceder 5%.
M = massa molecular relativa de cada aflatoxina em g/mol
40 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
𝜀 = absortividade molar de cada aflatoxina em tolueno/acetonitrilo em m2/mol
d = trajeto ótico da célula em cm.
Tabela 3 – Massa molecular e absortividade molar para as Aflatoxinas G2, G1, B2 e B1.
Afla M (g/mol) 𝜺 (m2/mol)
B1 312 1930 B2 314 2040
G1 328 1660 G2 330 1790
Para elaborar a reta de calibração foi retirada uma alíquota da solução (100 µg/l B1 e G1; 30
µg/l B2 e G2) os seguintes volumes:
Tabela 4 – Volumes para a reta de calibração dos padrões para as Aflatoxinas.
Padrão Volume µl B1 (µg/l) B2 (µg/l) G1 (µg/l) G2 (µg/l)
1 500 5,00 1,50 5,00 1,50
2 250 2,50 0,75 2,50 0,75
3 100 1,00 0,30 1,00 0,30
4 1000 (padrão 1) 0,50 0,15 0,50 0,15
5 500 (padrão 1) 0,25 0,07 0,25 0,07
6 200 (padrão 1) 0,10 0,03 0,10 0,03
7 100 (padrão 1) 0,05 0,015 0,05 0,015
O volume dos balões volumétricos foram completados com a solução de água/metanol
(50:50).
41 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
4.5. Extração
4.5.1. Caso geral
Foi pesado aproximadamente 25g de amostra homogeneizada mais 5g de cloreto de sódio.
Juntou para o copo misturador de aço inox, 125 ml da solução de extração metanol/água
(60:40). A mistura foi homogeneizada por 3 minutos em velocidade alta.
A mistura foi filtrada através de um filtro de papel. Foram pipetados 10 ml do filtrado para um
matraz de 100 ml. Foram adicionados 10 ml de água e procedeu-se a homogeneização. A
mistura foi filtrada com a utilização do filtro de fibra de vidro. A coluna de imunoafinidade foi
prendida ao reservatório de vidro e este na bomba peristáltica. Foram vertidos 10 ml do
filtrado para o reservatório. Após passar os 10 ml, lavou-se a coluna com 2 porções de 10 ml
de água desionizada. As Aflatoxinas contidas na coluna foram eluídas para um tubo Falcon,
com 1 ml de metanol, seguido de 1 ml de água. A solução contendo a micotoxina foi
homogeneizada e transferida para um vial de 1,5 ml.
Figura 9 - Misturador de aço inox
42 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
4.5.2. Outros casos
Para as outras matrizes que diferem do caso geral, o procedimento seguido foi conforme o
especificado na Tabela a seguir.
Figura 10 - Sistema de imunoafinidade montado
Figura 11 – Colunas de imunoafinidade
43 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 5 – Procedimento para a extração das Aflatoxinas nas matrizes que diferem do caso geral.
1 2 3 4 5 6 7
Matriz
Frutos secos (com ou sem casca)
cereais e outros
tipos de amostras não identificadas
nos itens
posteriores
Especiarias Pistacho com ou
sem casca
Alimentos a base de cereais
para lactantes e crianças de curta
idade
Azeite, manteiga,
margarina ou óleos
Oleorresina Cerveja
Peso amostra (g) 25 25 45 25 5 5 20
Volume de solução extratora
125 ml (Metanol/água
60:40)
100 ml (Metanol/Água 80:20)
125 ml (Metanol/Água
60:40)
100 ml (Metanol/Água
80:20) -
20 ml (Metanol/Água 80:20)
-
5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 20 ml de metanol 1 g (NaCl) Ajustar o pH 7,9 ± 0,1 c/ NaOH 2M ou baixar com
HCl 1M
Dispersão 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx. veloc. Agitar vigorosamente
1 min.
Agitar em vortex 1
min
Adicionar 20 ml de água, agitar e deixar repousar
Filtrar
Filtro de papel. Pipetar da solução
filtrada
10 ml + 10 ml de água
Filtro de papel. Pipetar da solução
filtrada
6 ml + 60 ml de Tween 20 a 10% de PBS
Filtro de papel. Pipetar da solução
filtrada
10 ml + 10 ml de PBS
Filtro de papel. Pipetar da solução
filtrada
11 ml + 99 ml de PBS
Transferir 3 ml da fase metanólica
(superior) em um
matraz, adicionar 27 ml de água
Filtro de papel. Pipetar da solução
filtrada
2 ml + 20 ml de Tween a 10% de
PBS
Centrifugar Caso apareçam precipitados, centrifugar a 3500 rpm por 10 min. Filtrar com filtros de pregas
44 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
A purificação por coluna de imunoafinidade para os casos acima citados, seguem os seguintes
procedimentos:
Tabela 6 – Purificação por coluna de imunoafinidade para a análise das Aflatoxinas das matrizes que diferem do caso geral
Extração por coluna de imunoafinidade 1 2 3 4 5 6 7
Volume de amostra
na coluna 10 ml 55 ml 10 ml 100 ml 20 ml 11 ml 10 ml
Volume de água
para lavar a coluna 2 x 10 ml 2 x 10 ml 2 x 10 ml 3 x 5 ml 20 ml de
PBS 20 ml
Volume de eluente
1 ml de metanol +
1 ml de água
1 ml de metanol +
1 ml de água
1 ml de metanol +
1 ml de água
1 ml de metanol +
1 ml de água
2 ml de metanol +
2 ml de água
1 ml de metanol +
1 ml de água
1 ml de metanol +
1 ml de água
Fator de diluição 50 40 50 20 40 40 8
45 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
4.6. As principais adaptações realizadas para o ensaio
_______________________________________________________
* Para os demais casos o procedimento a ser seguido é conforme o indicado na Tabela 5.
Método atual: válido para
todas as matrizes Método a ser validado:
Caso Geral*
Figura 12 - Fluxograma representativo da análise das Áflatoxinas
Pesar 25,0 g de amostra homogeneizada + 5,0 g de NaCl
+125 ml de MeOH/H2O (70:30)
Homogeneizar por 3 min, em velocidade alta
Filtrar e pipetar 15 ml do filtrado para um matraz de 100 ml
Adicionar 30 ml de água e agitar.
Filtrar com filtro de fibra de vidro
Pipetar 10 ml do filtrado para o
reservatório contendo a coluna
IAC
Lavar a coluna com 2 porções
de 10 ml de água desionizada
Eluir com 1 ml de MeOH seguido
de 1 ml de água destilada
Injeção em HPLC com sistema
de derivatização pós-coluna
com detetor FLD (excitação
365; emissão 435 nm)
Pesar 25,0 g de amostra homogeneizada + 5,0 g de NaCl
+125 ml de MeOH/H2O (60:40)
Homogeneizar por 3 min, em velocidade alta
Filtrar e pipetar 10 ml do filtrado para um matraz de 100 ml
Adicionar 10 ml de água e agitar.
Filtrar com filtro de fibra de vidro
Pipetar 10 ml do filtrado para o
reservatório contendo a coluna
IAC
Lavar a coluna com 2 porções
de 10 ml de água desionizada
Eluir com 1 ml de MeOH seguido
de 1 ml de água destilada
Injeção em HPLC com sistema
de derivatização pós-coluna
com detetor FLD (excitação
365; emissão 450 nm)
46 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 7 - Principais alterações nas condições do HPLC para a análise das Aflatoxinas
Conforme apresentado na tabela 8, as alterações foram adaptadas a realidade e as condições
do laboratório nas instalações da Mérieux Portugal. No método utilizado em Espanha, o
equipamento utilizado é diferente do utilizado em Portugal, logo, na fase móvel não foi
adicionado KBr e HNO3 . A coluna utilizada para a validação foi de 150 mm o que justifica a
redução do fluxo para 0,7 ml. O volume de injeção passou de 300 µl para 100 µl. A emissão
do detetor FLD foi reajustada para 450 nm. E por fim a sensibilidade do equipamento foi
elevada de 12 para 18.
Condições HPLC
Método Atual Método a ser validado Alterações
Equipamento Agilent Technologies Série
1200 KOBRA CELL
Agilent Technologies Série 1200
Fase móvel Água/ACN/Metanol (3:1:1) Água/ACN/Metanol (3:1:1)
com KBr e HNO3 Água/ACN/Metanol (3:1:1)
Temperatura do banho
70 °C - 70 °C
Fluxo da fase móvel
1,2 ml/min 1,0 ml/min 0,7 ml/min
Reagente de
derivatização
100 mg de Iodo, 2 ml de
metanol e 200 ml de água -
100 mg de Iodo, 2 ml de
metanol e 200 ml de água
Fluxo do reagente
de derivatização 0,4 ml/min - 0,4 ml/min
Volume injeção amostra
300 µl 100 µl 100 µ
Coluna Coluna analítica tipo C18
por ex. 150x4,6mm e 5 µm Waters Spherisorb ODS2 5µ
250x4.6 mm Coluna analítica tipo C18 por
ex. 150x4mm e 5 µm
Detetor FLD Excitação 365 nm e
emissão 435 nm Excitação 365 nm e emissão
450 nm Excitação 365 nm e emissão
450 nm
Temperatura da coluna
40 °C 40 °C 40 °C
Sensibilidade 12 18 18
47 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
5. Discussão dos resultados
5.1. Matrizes analisadas
Algumas das matrizes estudadas, foram matrizes de referência, ou seja, amostras com a
concentração conhecida de Aflatoxinas. Para essas amostras a quantidade a ser pesada foi
reduzida entre 5 e 14 g. As informações pertinentes às matrizes de referências estão descritas
na Tabela 9. As demais matrizes a serem validadas, foram contaminadas com um volume e
concentração conhecidos, assim como apresentado na Tabela 10.
Tabela 8 – Matrizes de referência utilizadas para a análise das Aflatoxinas
Amostra Massa pesada (g) Afla Intervalo de conc. (μg/kg)
Pistacho 10
G2 0,423 – 1,089
G1 0,92 – 2,35
B2 0,82 – 2,11
B1 4,26 – 10,95
Total 6,423 – 16,499
Ração 7
G2 0,90 – 2,31
G1 1,06 – 2,72
B2 2,57 – 6,62
B1 7,9 – 20,2
Total 12,1 – 31,1
Farinha de milho 14
G2 0,530 – 1,363
G1 0,535 -1,376
B2 0,89 – 2,30
B1 0,96 – 2,47
Total 2,89 – 7,44
Amendoim 7
G2 0,85 – 2,19
G1 1,36 – 3,50
B2 0,83 – 2,13
B1 2,89 – 7,44
Total 5,8 – 15,0
G2 1,59 – 4,09
G1 1,69 – 4,36
Pimenta preta 5 B2 3,13 – 8,04
B1 3,66 – 9,42 Total 10,07 – 25,91
48 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 9 – Contaminação das amostras que não possuem Aflatoxinas.
Amostra Massa pesada
(g) Volume de contaminação
(ml) Afla
Conc. Teórica (μg/kg)
Arroz 25 4,0
G2 1,024
G1 3,264
B2 0,896
B1 3,616
Total 8,800
Farinha láctea 25 1,0
G2 0,256
G1 0,816
B2 0,224
B1 0,904
Total 2,200
Cárnico 25 2,0
G2 0,512
G1 1,632
B2 0,448
B1 1,808
Total 4,400
A concentração teórica para as amostras contaminadas foi calculada consoante a seguinte
expressão:
Valor teórico = 𝐶𝑜𝑛𝑐.𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑜
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
(16)
Com o objetivo de quantificar a concentração de aflatoxinas presente nas matrizes em µg/kg,
foram primeiramente injetados no HPLC os padrões para se obter a curva de calibração. Esta
reta foi construída sempre que se iniciou a análise no decorrer de seis dias. A média das áreas
dos picos obtidos correspondente a cada concentração encontram-se na Tabela 11, e os picos
cromatográficos representativos das Aflatoxinas encontram-se no anexo 4.
49 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 10 - Padrões e áreas da reta de calibração para análise das Aflatoxinas
Afla Conc. ng/ml Área Afla Conc. ng/ml Área
G2
0,016 37,704
G1
0,051 104,091
0,032 69,987 0,102 194,507
0,08 175,484 0,26 488,052
0,16 350,649 0,51 970,051
0,32 706,344 1,02 1961,016
0,8 1812,955 2,55 5045,817
1,6 3518,659 5,1 9686,999
Afla Conc. ng/ml Área Afla Conc. ng/ml Área
B2
0,014 56,520
B1
0,07 156,039
0,028 101,660 0,13 289,615
0,07 248,557 0,29 727,684
0,14 504,695 0,57 1460,476
0,28 1002,440 1,13 2953,528
0,7 2581,680 2,83 7579,568
1,4 5047,424 5,65 14695,200
As retas de calibração, estão apresentadas nas figuras de 13 a 16:
50 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Figura 14 - Reta de calibração Afla G1 Figura 13 - Reta de calibração Afla G2
Figura 15 - Reta de calibração Afla B2 Figura 16 - Reta de calibração Afla B1
51 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
O cálculo da concentração das Aflatoxinas, recorrendo a curva de calibração é dado por:
Afla (µg/kg) = 𝑅𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑎 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑝𝑜𝑙𝑎çã𝑜 𝑥 𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑚 𝑔
(17)
5.2. Sensibilidade
A sensibilidade é proveniente da capacidade do método analítico distinguir pequenas
diferenças de concentração do analito. Para este método em causa, como a reta de calibração
é um modelo linear, a sensibilidade é constante ao longo de toda a gama de trabalho e
equivale ao declive da reta. Sendo assim, a sensibilidade para cada Aflatoxina, está
representada na Tabela 12:
Tabela 11 - Sensibilidade do método para cada Aflatoxina analisada.
Micotoxina Equação da reta Coeficiente de Correlação
Linear (R2) Sensibilidade
Afla G2 y = 2208,5x + 4,0688 0,9998 2208,5
Afla G1 y = 1910,3x + 17,9110 0,9996 1910,3
Afla B2 y = 3616,9x + 3,3136 0,9999 3616,9
Afla B1 y = 2618,2x – 10,647 0,9998 2618,2
y é correspondente ao sinal analítico medido para cada um dos padrões da reta de calibração
em termos de área, e x a concentração dos respetivos.
5.3. Limite de deteção - LD
O limite de deteção, foi calculado com base na Tabela 11, com o auxílio da equação (2). O
limite de deteção encontrado para Aflatoxina G2 foi de 0,032 ng/ml, G1 0,137 ng/ml, B2 0,022
ng/ml e B1 0,117 ng/ml.
5.4. Limite de Quantificação - LQ
O limite de quantificação foi calculado com base na reta de calibração da Tabela 11, com o
auxílio da equação (3). O limite de quantificação para a Aflatoxina G2 foi de 0,096 ng/ml, G1
0,416 ng/ml, B2 0,066 ng/ml e B1 0,354 ng/ml.
52 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
5.5. Linearidade
Para estimar a linearidade da reta de calibração, recorreu-se ao teste de RIKILT com o auxílio
da equação (5). Os dados obtidos estão representados na Tabela 13:
Tabela 12 - Avaliação da linearidade da reta de calibração das Aflatoxinas através do teste de RIKILT
Micotoxina Pontos Xi (conc ng/ml) Yi (sinal analítico) Yi/Xi Yi/Xi (%)
Afla G2
1 0,016 37,704 2356,488 106
2 0,032 69,987 2187,096 98
3 0,08 175,484 2193,547 98
4 0,16 350,649 2191,555 98
5 0,32 706,344 2207,324 99
6 0,8 1812,955 2266,194 101
7 1,6 3518,659 2199,162 99
Média 2228,766
Afla G1
1 0,051 104,091 2041,007 105
2 0,102 194,507 1906,930 98
3 0,26 488,052 1877,124 97
4 0,51 970,051 1902,060 98
5 1,02 1961,016 1922,565 99
6 2,55 5045,817 1978,752 102
7 5,1 9686,999 1899,412 98
Média 1938,073
Afla B2
1 0,014 56,520 4037,127 110
2 0,028 101,660 3630,727 99
3 0,07 248,557 3550,819 97
4 0,14 504,695 3604,964 98
5 0,28 1002,440 3580,142 98
6 0,7 2581,679 3688,113 101
7 1,4 5047,424 3605,303 98
Média 3671,028
Afla B1
1 0,07 156,0387 2229,125 90
2 0,13 289,6147 2227,806 90
3 0,29 727,6843 2509,256 101
4 0,57 1460,476 2562,238 103
5 1,13 2953,528 2613,741 105
6 2,83 7579,568 2678,293 108
7 5,65 14695,2 2600,92 105
Média 2488,768
Para uma melhor visualização foram elaborados quatro gráficos, representados nas figuras
(17 a 20) para cada Aflatoxina, os quais representam as respetivas concentrações e as
percentagens calculadas, de modo a verificar a linearidade da reta.
53 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Figura 19 - Linearidade Afla B2
Figura 18 - Linearidade Afla G1
Figura 20- Linearidade Afla B1
Figura 17- Linearidade Afla G2
54 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Conforme os dados analisados, é possível verificar que cada ponto da reta de calibração para
as 4 micotoxinas, se enquadra no intervalo entre 90% a 110%, o que condiz com os
parâmetros estabelecidos pelo teste de RIKILT. Logo é constatado que as funções são
lineares.
5.6. Gama de Trabalho
A gama de trabalho foi estabelecida conforme a avaliação de todos os valores medidos para
as Aflatoxinas. Para as Aflatoxinas G2 e G1 a gama de trabalho é 0,5 – 5,0 μg/kg; para B2
0,5 – 10 μg/kg. para B1 0,5 – 15,0 μg/kg e para Totais 0,5 – 25,0 μg/kg.
5.7. Precisão
Para avaliar a precisão, foram realizados ensaios de repetibilidade e precisão intermédia.
5.7.1. Repetibilidade
Efetuaram-se 10 determinações para as amostras de amendoim, arroz, pimenta, farinha
láctea, farinha de milho, pistachio, cárnico e ração. Foram calculados, de acordo com a folha
de Excel do Anexo 2, a concentração do analito, o valor médio, o desvio padrão, o limite de
repetibilidade e o coeficiente de variação. Para as amostras de arroz, farinha láctea e cárnico,
foi necessário realizar um enriquecimento da amostra com (G2 - 6,4 μg/l G1 - 20,4 μg/l; B2 -
5,6 μg/l e B1 - 22,6 μg/l).
Para verificar se haviam resultados com valores muito afastados em relação ao conjunto dos
mesmos, foi aplicado o teste de Grubbs conforme Anexo 2. Para constatar a homogeneidade
de variâncias foi aplicado o teste de Cochran, que se encontra no mesmo anexo.
Os resultados obtidos estão representados na Tabela 14:
55 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 13 – Matrizes analisadas para a determinação da repetibilidade, desvio padrão, coeficiente de variação e limite de repetibilidade relativo.
Matriz Afla
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
Ensaio 5
Ensaio 6
Ensaio 7
Ensaio 8
Ensaio 9
Ensaio 10
Valor médio
Desvio Padrão
C.V (%) L.R L.R (%)
Teste de Grubbs
Ração
G2
1,67 1,56 1,43 1,35 1,57 1,46 1,56 1,56 1,52 1,49 1,5170 0,089 5,86 0,249 16,42 Aceitável Farinha de Milho 1,10 1,25 1,07 1,05 1,01 1,05 1,30 1,18 1,13 1,16 1,1300 0,093 8,26 0,261 23,13 Aceitável Pimenta 3,96 3,68 3,78 3,88 3,79 3,79 3,79 3,52 3,96 3,75 3,7900 0,130 3,43 0,365 9,62 Aceitável
Amendoim 1,49 1,65 1,57 1,45 1,61 1,68 1,78 1,87 1,69 1,69 1,6480 0,126 7,65 0,353 21,41 Aceitável Pistachio 0,77 0,90 0,74 0,97 0,83 0,78 0,86 0,73 0,68 0,81 0,8070 0,086 10,71 0,242 29,98 Aceitável Farinha Láctea 0,29 0,30 0,29 0,30 0,29 0,28 0,28 0,29 0,28 0,28 0,2880 0,007 2,74 0,022 7,67 Aceitável
Cárnico 0,48 0,45 0,45 0,46 0,45 0,48 0,49 0,49 0,47 0,46 0,4680 0,016 3,46 0,045 9,69 Aceitável Arroz 1,02 0,99 0,95 0,93 0,89 1,03 0,99 0,94 0,93 0,95 0,9620 0,044 4,59 0,124 12,86 Aceitável
Ração
G1
1,76 1,63 1,51 1,68 1,66 1,55 1,66 1,65 1,60 1,59 1,6290 0,070 4,33 0,198 12,14 Aceitável Farinha de Milho 1,03 0,98 1,00 0,99 0,97 0,98 1,01 1,11 1,05 1,10 1,0220 0,050 4,90 0,140 13,72 Aceitável
Pimenta 3,58 3,37 3,59 3,39 3,76 3,65 3,77 3,36 3,70 3,66 3,5830 0,157 4,39 0,441 12,30 Aceitável
Amendoim 2,12 2,33 2,22 2,04 2,31 2,40 2,50 2,52 2,40 2,44 2,3280 0,159 6,83 0,445 19,12 Aceitável Pistachio 1,56 1,81 1,49 1,56 1,64 1,57 1,76 1,48 1,65 1,60 1,6120 0,107 6,63 0,299 18,58 Aceitável Farinha Láctea 0,87 0,89 0,88 0,89 0,87 0,81 0,87 0,90 0,89 0,85 0,8720 0,026 3,00 0,073 8,40 Aceitável
Cárnico 1,46 1,29 1,30 1,29 1,31 1,37 1,44 1,42 1,34 1,31 1,3530 0,065 4,83 0,183 13,52 Aceitável Arroz 3,08 3,00 2,87 2,77 2,69 3,10 3,00 2,83 2,82 2,87 2,9030 0,136 4,68 0,381 13,11 Aceitável
Ração
B2
4,74 4,38 4,11 4,39 4,39 4,16 4,41 4,33 4,25 4,22 4,3380 0,176 4,06 0,493 11,37 Aceitável Farinha de Milho 1,71 1,64 1,68 1,66 1,67 1,66 1,70 1,87 1,80 1,83 1,7220 0,081 4,71 0,227 13,18 Aceitável Pimenta 6,89 6,81 7,00 6,82 7,30 7,17 7,16 6,88 7,19 7,12 7,0340 0,176 2,50 0,492 7,00 Aceitável
Amendoim 1,30 1,54 1,48 1,35 1,73 1,59 1,67 1,76 1,59 1,60 1,5610 0,150 9,62 0,420 26,93 Aceitável Pistachio 1,52 1,78 1,46 1,51 1,64 1,55 1,71 1,41 1,66 1,56 1,5800 0,115 7,31 0,323 20,46 Aceitável Farinha Láctea 0,26 0,27 0,27 0,27 0,26 0,23 0,26 0,27 0,27 0,26 0,2620 0,012 4,69 0,034 13,14 Aceitável
Cárnico 0,39 0,38 0,39 0,39 0,38 0,41 0,43 0,42 0,42 0,40 0,4010 0,018 4,47 0,050 12,51 Aceitável Arroz 0,86 0,84 0,80 0,77 0,75 0,88 0,85 0,79 0,79 0,80 0,8130 0,042 5,19 0,118 14,53 Aceitável
Ração
B1
13,95 12,94 12,16 13,49 13,30 12,48 13,25 13,30 12,67 12,52 13,006 0,548 4,21 1,535 11,80 Aceitável Farinha de Milho 1,99 1,89 2,13 1,97 1,96 1,99 1,94 2,15 2,13 2,14 2,0290 0,098 4,81 0,273 13,48 Aceitável Pimenta 9,42 8,04 8,52 8,29 9,16 9,15 8,75 8,24 9,56 8,58 8,7710 0,526 5,99 1,471 16,78 Aceitável
Amendoim 5,87 5,30 5,60 5,06 5,78 5,97 6,20 6,29 6,03 6,06 5,8160 0,393 6,76 1,100 18,92 Aceitável Pistachio 8,00 9,30 7,60 7,92 8,45 8,06 8,69 7,50 8,50 8,04 8,2060 0,539 6,57 1,509 18,39 Aceitável Farinha Láctea 1,02 1,06 1,03 1,05 1,02 0,97 1,04 1,05 1,01 1,02 1,0270 0,026 2,51 0,072 7,04 Aceitável
Cárnico 1,40 1,39 1,41 1,38 1,38 1,45 1,55 1,52 1,52 1,47 1,4470 0,065 4,47 0,181 12,51 Aceitável
Arroz 3,24 3,19 3,00 2,82 2,85 3,29 3,17 2,96 2,97 3,00 3,0490 0,163 5,36 0,457 15,00 Aceitável
Ração
Totais
22,12 20,51 19,21 20,91 20,92 19,65 20,88 20,84 20,04 19,82 20,4900 0,836 4,08 2,340 11,42 Aceitável Farinha de Milho 5,83 5,76 5,88 5,67 5,61 5,68 5,95 6,31 6,11 6,23 5,9030 0,243 4,13 0,682 11,55 Aceitável
Pimenta 23,85 21,90 22,89 22,38 24,01 23,76 23,47 22,00 24,41 23,11 23,1780 0,871 3,76 2,439 10,52 Aceitável Amendoim 10,78 10,82 10,87 9,90 11,43 11,64 12,15 12,44 11,71 11,79 11,3530 0,759 6,68 2,124 18,71 Aceitável Pistachio 11,85 13,79 11,29 11,96 12,56 11,96 13,02 11,12 12,49 12,01 12,2050 0,795 6,51 2,225 18,23 Aceitável
Farinha Láctea 2,44 2,52 2,47 2,51 2,44 2,29 2,45 2,51 2,45 2,41 2,4490 0,067 2,72 0,186 7,61 Aceitável Cárnico 3,73 3,51 3,55 3,52 3,52 3,71 3,91 3,85 3,75 3,64 3,6690 0,144 3,93 0,404 11,01 Aceitável Arroz 8,20 8,02 7,62 7,29 7,18 8,30 8,01 7,52 7,51 7,62 7,7270 0,383 4,96 1,073 13,88 Aceitável
56 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Com base nos dados obtidos na Tabela 14, os resultados observados para o limite de
repetibilidade para as Aflatoxinas, a diferença entre dois ensaios realizados em condições de
repetibilidade com um grau de confiança de 95%, de modo geral, não deverão exceder
valores entre 7% e 30% para Afla G2, 8% e 20% para Afla G1, 7% e 27% para Afla B2, 7% e
19 % para Afla B1 e para Aflas totais, isto consoante cada tipo de matriz.
Um coeficiente de variação relativamente pequeno, traduz-se como uma melhor condição de
repetibilidade, o que é observado nas análises realizadas, onde o coeficiente de variação ficou
abaixo dos 11%.
5.7.2. Precisão intermédia
Foram analisadas 4 amostras em duplicado no decorrer de 5 dias. Na Tabela 15 estão
apresentadas as concentrações para cada par de duplicado correspondente a cada
Aflatoxina, assim como o desvio padrão, o limite da precisão intermédia e o coeficiente de
variação, calculados conforme a folha de Excel apresentada no Anexo 3.
57 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 14 – Matrizes analisadas para a determinação da precisão intermédia, desvio padrão, coeficiente de variação e limite da precisão intermédia.
Matriz Concentração Afla G2 Concentração Afla G1 Concentração Afla B2 Concentração Afla B1 Concentração Aflas
Totais
Ração
1,480 1,380 1,680 1,610 4,110 3,830 12,460 11,600 19,730 18,420
1,520 1,510 1,620 1,600 4,280 4,290 12,720 12,790 20,140 20,190 1,650 1,560 1,780 1,660 4,660 4,390 13,790 12,940 21,880 20,550
1,330 1,220 1,420 1,300 4,000 3,680 12,010 10,900 17,940 16,370
1,510 1,400 1,560 1,430 4,170 3,850 12,080 10,940 19,320 17,620
Pistachio
0,780 0,880 1,460 1,630 1,600 1,780 7,890 8,620 11,730 13,010 0,770 0,900 1,560 1,810 1,520 1,780 8,000 9,300 11,850 13,790
0,920 0,930 1,760 1,760 1,820 1,870 9,320 9,410 13,820 13,970
0,780 0,780 1,540 1,520 1,550 1,600 8,110 8,240 11,980 12,140
Amendoim
1,410 1,530 2,100 2,250 1,290 1,400 5,030 5,360 9,830 10,540 1,590 1,660 2,270 2,380 1,500 1,570 5,660 6,000 11,020 11,610
1,680 1,730 2,380 2,490 1,580 1,610 5,900 6,120 11,540 11,950
1,620 1,590 2,330 2,310 1,520 1,490 5,810 5,750 10,990 10,880
Farinha de Milho
1,470 1,590 2,050 2,180 1,410 1,570 5,170 5,660 10,100 11,000
0,950 0,920 0,940 0,920 1,520 1,470 1,780 1,760 5,190 5,070
1,090 1,110 1,020 1,050 1,740 1,760 2,180 2,060 6,030 5,980
1,070 1,100 1,000 1,060 1,700 1,730 1,900 1,990 5,670 5,880 1,050 1,110 0,980 1,040 1,680 1,760 1,960 2,040 5,590 5,860
Arroz
0,930 0,900 0,820 0,810 1,530 1,530 1,640 1,700 4,920 4,940
0,440 0,410 1,370 1,240 0,380 0,350 1,500 1,340 3,690 3,340 0,960 0,900 2,880 2,730 0,790 0,760 3,490 2,850 8,120 7,240
0,990 0,910 3,080 2,840 0,850 0,780 3,230 2,980 8,150 7,510
0,820 0,770 2,140 2,180 0,690 0,680 2,060 2,260 5,710 5,890
Desvio padrão da Precisão Intermédia 0,399 0,107 0,082 0,052 0,062
Coeficiente de variação (%) 6,41 5,36 4,78 4,50 5,59
Limite da Precisão Intermédia (%) 17,96 15,02 13,38 12,61 15,66
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Com base nos dados representados na Tabela 15, o desvio padrão das amostras analisadas
para a precisão intermédia apresentou uma dispersão relativamente baixa, demonstrando que
os valores estão próximos da concentração esperada. A ter em conta fatores como matrizes
e concentrações distintas, o coeficiente de variação para as aflatoxinas G2, G1, B2 e B1
manteve-se entre 6,4% e 4,50%. Considerando o fator tempo (dias distintos) que podem afetar
o desempenho do método, o limite da precisão intermédia manteve-se entre 12,6 e 18%.
Tanto o desvio padrão, como o coeficiente de variação assim como o limite de precisão
intermédia, apresentaram uma percentagem relativamente pequena, logo conclui-se que os
resultados obtidos apresentaram uma boa precisão.
5.8. Exatidão
Para analisar a exatidão do método, os resultados analisados foram comparados com as
matrizes de referências certificadas, estes cumprem com as concentrações especificadas nas
respetivas concentrações alvo, conforme descrito nas tabelas 9, 14 e 15.
6. Ensaio de recuperação
Foram efetuados 5 ensaios de recuperação, sendo cada um deles realizados em duplicado.
Para os ensaios de recuperação, as matrizes sem a presença das Aflatoxinas, foram
contaminadas com um determinado volume e uma concentração conhecida, descritos na
Tabela 16.
59 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Tabela 156 - Média, desvio padrão e coeficiente de variação para o ensaio de recuperação
Amostra Afla
Conc. padrão adicionado
(μg/l)
Volume adicionado
(ml)
Valor real
(µg/kg)
Valor teórico
(µg/kg)
% Recuperação Média Desvio
Padrão CV (%)
Chocolate
G2 6,4
1 0,20 0,25 80,77
93,62 14,52 15,51
Amendoim 1 0,21 0,25 82,15
Arroz 4 0,91 1,02 88,99
Whisky 2 0,63 0,63 100,81
Farinha Láctea 1 0,3 0,26 115,38
Chocolate
G1 20,4
1 0,65 0,81 80,34
89,65 12,70 14,16
Amendoim 1 0,64 0,81 78,54
Arroz 4 2,73 3,26 83,75
Whisky 2 1,95 1,99 97,64
Farinha Láctea 1 0,88 0,81 107,98
Chocolate
B2 5,6
1 0,17 0,22 76,55
92,20 17,28 18,75
Amendoim 1 0,18 0,22 80,47
Arroz 4 0,76 0,89 84,94
Whisky 2 0,55 0,55 100,58
Farinha Láctea 1 0,27 0,22 118,46
Chocolate
B1 22,6
1 0,7 0,9 77,54
89,06 16,40 18,41
Amendoim 1 0,71 0,9 78,65
Arroz 4 2,84 3,61 78,51
Whisky 2 2,11 2,21 95,39
Farinha Láctea 1 1,04 0,9 115,19
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Os resultados dos ensaios de recuperação são provenientes da equação (16) seguida da
expressão abaixo:
Recuperação % = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑜
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 𝑥 100
(18)
De acordo com o Regulamento (UE) N° 519/2014 da Comissão de 16 de Maio de 2014, os
intervalos de aceitação são:
Tabela 16 - Intervalos de aceitação para os ensaios de recuperação conforme o Regulamento (UE) N° 519/2014
Recuperação Gama de conc. Valor recomendado
B1, B2, G1 e G2
< 1,0 μg/kg 50 a 120 %
1-10 μg/kg 70 a 110 %
> 10 μg/kg 80 a 110 %
Logo é possível verificar que os ensaios de recuperação se encontram dentro dos parâmetros
especificados, o que permite garantir que o método apresenta seletividade e especificidade.
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
7. Conclusão
É extremamente necessário que os laboratórios efetuem validações/revalidações nos seus
métodos laboratoriais. Estes irão definir se o método se adequa aos objetivos pretendidos, se
são capazes de demonstrar resultados fiáveis, atendam aos critérios estabelecidos pela
qualidade e se estão enquadrados nos parâmetros descritos nos regulamentos da União
Europeia.
O foco principal era validar e revalidar os métodos para Aflatoxinas, Zearalenona,
Desoxinivalenol e Ocratoxina, entretanto devido ao curto espaço de tempo apenas foi possível
iniciar o estudo das Aflatoxinas. O acompanhamento diário junto dos analistas do laboratório
foi fundamental para aprender a técnica e trabalhar com os equipamentos.
O método para análise das Aflatoxinas mostrou-se específico e seletivo ao atender os critérios
de recuperação estabelecidos pelo Regulamento (EU) N° 519/2014 (50 a 120%), tendo os
resultados obtidos enquadrarem-se entre 76 e 119%. O critério de exatidão foi alcançado com
base nas análises e nos resultados das análise das matrizes FAPAS, onde os resultados
obtidos se enquadram nos limites de concentrações descritos nos respetivos boletins. A
linearidade da curva de calibração utilizada no método, foi comprovada com o teste de RIKILT,
e esta por sua vez, enquadra-se perfeitamente nos critérios pré-estabelecidos pelo teste, logo
o modelo é considerado linear.
Como um dos parâmetros da qualidade, o fato de obter um LQ maior que o padrão de menor
concentração da reta, surge da eventualidade deste não obedecer os critérios de
repetibilidade e para que os resultados sejam consistentes e coerentes para o cliente.
Para analisar a precisão, foram estudadas a repetibilidade e a precisão intermédia. Para cada
parâmetro foi calculado um coeficiente de variação que ficou entre 11 % e 6,4%
respetivamente. Estes resultados são considerados satisfatórios para os critérios de
repetibilidade e precisão intermédia.
Apesar dos resultados atenderem os parâmetros estabelecidos, vale ressaltar, que a
validação não está concluída, sendo necessário que o estudo seja retomado e o restante das
matrizes sejam analisadas, assim como outros critérios como a incerteza associada.
Efetivamente o método não está validado, entretanto algumas melhorias foram constatadas e
atualmente encontram-se em uso no método das Aflatoxinas: o loop foi reduzido de 300
microlitros para 100 microlitros e o ganho foi aumentado de 12 para 18. Estas melhorias
resultaram em picos com uma melhor separação.
62 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
8. Referências
Amado MA. 2002. Métodos imunológicos na detecção e determinação de aflatoxinas em
alimentos: vantagens e inconvenientes. Millenium 26.
Aragão NM et al. 2009. Validação de métodos cromatográficos de análise - um experimento
de fácil aplicação utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e os princípios da
"Química Verde" na determinação de metilxantinas em bebidas. Química Nova 32 (9): 2476 –
2481.
Cardona AGM, Johnson NM, Phillips TD, Hayes AW. 2014. Mycotoxins in a changing global
environment – A review. Food and Chemical Toxicology 69: 220-230.
Chust RB. 1990. Introdução à cromatografia de líquidos (HPLC). Boletim SPQ 39: 43-53.
Coll HAS, Castro NC. 2015. Micotoxicosis y micotoxinas: generalidades y aspectos básicos.
Revista CES Medicina 29 (1): 143-152
Collins CH et al. 1997.Introdução a métodos cromatográficos. 7ª edição, Unicamp. Campinas
– SP.
Costa JCD. 2015. Validação de um método de cromatografia de alta eficiência para
determinação de conservantes em géneros alimentícios. Dissertação de mestrado. Instituto
Superior de Engenharia de Lisboa – Lisboa, 105p.
Degani ALG et al. 1998. Cromatografia um breve ensaio. Química nova na escola 7: 21 – 25.
FAPAS. 2018. About us. [Consul. em 01 de Set. 2018] Disponível em:
https://fapas.com/about-us
Fernandes MS. 2016. Validação do método de quantificação de ocratoxina A por HPLC em
cereais e café no laboratório da SGS Portugal. Dissertação de mestrado. Faculdade de
Ciências e Tecnologia Universidade de Lisboa – Lisboa, 67p.
Ferreira AS. 2013. Validação da determinação de teobromina em amostras de cacau e seus
derivados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Dissertação de mestrado.
Faculdade de Ciências e Tecnologia Universidade de Lisboa – Lisboa, 71p.
Food and Agriculture Organization. 2003. Manual sobre la aplicación del sistema de Análises
de Peligros y de Puntos Críticos de Control (APPCC) en la prevención y control de las
micotoxinas. Estudio FAO alimentación Nutrición 73: 1-130.
63 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Food Ingredients Brasil. 2009. As micotoxinas. Revista FI 7: 32-40.
Guia RELACRE. 2000. Validação de métodos internos de ensaio em análise química. [Consul.
04 Mai. 2018]. Disponível em:
http://www.relacre.pt/assets/relacreassets/files/commissionsandpublications/Guia%20RELA
CRE%2013.pdf
Inkemia Brasil. 2016. Cromatografia líquida de alta eficiência – Parte 1. [Consul. 19 Agos.
2018]. Disponível em: https://inkemiabrasil.com/2016/09/20/cromatografia-liquida-de-alta-
eficiencia-parte-1/
Keliri EC. 2017. Isolation, identification and quantification of cholesterol oxidation products, in
salted and unsalted meat, by high performance liquid chromatography – HPLC. Dissertation
bachelor’s degree. Department of Chemistry at the University of Cyprus – Nicosia, 52p.
Kos G, Krska R. 2015. Internet training course on modern sample preparation techniques for
the determination of mycotoxins. [Consul. 19 Agos. 2018]. Disponível em:
https://www.researchgate.net/publication/265192271/download
Kupiec T. 2004. Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid
Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding 8 (3): 223-227.
Lanças FM. 2009. A cromatografia líquida moderna e a espectrometria de massas: finalmente
“compatíveis”? Scientia Chromatographica 1: 35-61
Martins AFS. 2016. Implementação e validação de métodos analíticos. Dissertação de
mestrado. Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra – Coimbra, 101p.
Merieux NutriSciense Portugal 2017. Quem somos. [Consul. em 05 de Nov. 2017] Disponível
em: https://www.merieuxnutrisciences.com/pt/silliker-portugal
Neto AJS. 2009. Uma visão técnica para a compreensão e resolução de problemas em
sistemas de cromatografia líquida. Scientia Chromatographica 1: 83-96.
Pacheco S et al. 2015. História da Cromatografia Líquida. Revista Virtual de Química 7 (4):
1225 – 1271.
Pereira DAS. 2016. Implementação e validação de um método analítico para determinação
de carbono orgânico total. Dissertação de mestrado. Faculdade de Ciências e Tecnologia
Universidade de Lisboa – Lisboa, 119p.
64 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Pereira VL, Fernandes JO e Cunha SC. 2014. Mycotoxins in cereals and related foodstuffs: A
review on occurrence and recent methods of analysis. Trends in Food Science & Technology
36: 96-136.
Peres TB. 2002. Noções básicas de cromatografia. Biológico 64 (2): 227 – 229.
Regulamento (UE) N° 519/2014 da Comissão de 16 de Maio de 2014
Regulamento CE N.° 1881/2006 da União Europeia de 19 de dezembro de 2006.
Rocha MEB, Freire FCO, Maia FEF, Guedes MIF e Rondina D. 2014. Mycotoxins and their
effects on human and animal health. Food Control 36: 159-165.
Setel. 2018. Venta de materiales de control de calidad y de referencia. [Consul. em 01 de Set.
2018] Disponível em: http://www.setelsl.com/materialcontrol.shtml
Silva PD. 2012. Determinação de compostos fenólicos por HPLC. Dissertação de mestrado.
Universidade da Beira Interior – Covilhã, 108p.
Silva AFA. 2016. Validação de Métodos Analíticos para controlo de Qualidade de um
Medicamento,por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Dissertação de mestrado.
Faculdade de Ciências e Tecnologia – Lisboa.
Soares C, Abrunhosa L e Venâncio A. 2013. Fungos produtores de micotoxinas. Sociedade
Portuguesa de Microbiologia. [Consult. 06 Jan. 2018]. Disponível em:
http://hdl.handle.net/1822/27316.
Tattibayeva D. 2017. Presencia de elementos tóxicos y micotoxinas en cereales de Kazajistán.
Facultade de Veterinaria da Universidade de Santiago de Compostela. Tese de Doutorado.
65 FCUP
Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Anexo 1 – Matrizes a serem validadas para Aflatoxinas
Tabela 17 - Matrizes para aflatoxinas
Determinação de Aflatoxinas
Grupo Matrizes a estudar Analisado?
Açúcar, produtos açucarados e derivados
Chocolate com frutos secos Não
Preparado para gelatina Não
Doce com frutos secos Não
Alimentos confecionados e pré-confecionados
Puré de batata Não
Molho soja Não
Batata frita Não
Alimentos dietéticos, suplementos alimentares, produtos de alimentação especial
Farinha láctea Não
Alimento infantil Sim
Puré Não
Alimentos para animais (simples e compostos) Alimento seco para cão Não
Ração Sim
Bebidas alcoólicas Whisky Não
Bagaço Não
Bebidas não alcoólicas Bebida de soja Não
Café, chá, infusões e derivados Café Não
Infusão Não
Carne e produtos cárneos e derivados Alheira Não
Cárnico Sim
Cereais, leguminosas, pseudo-cereais e derivados
Cereais Não
Farinha de milho Sim
Arroz Sim
Especiarias, condimentos e derivados
Pimenta Sim
Mostarda Não
Sal Não
Frutos, algas, produtos hortícolas e derivados
Milho para pipocas Não
Amendoim Sim
Pistacho Sim
Gordura, óleos, sementes oleaginosas e derivados
Azeite Não
Óleo de girassol Não
Creme vegetal Não
Leite, produtos lácteos e derivados Gelado Não
Iogurte Não
Produtos da pesca e derivados Conserva de peixe Não
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Anexo 2 – Folha de cálculo para a repetibilidade
Anexo 3 – Folha de cálculo para precisão intermédia
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
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Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas
Anexo 4 – Cromatogramas para Aflatoxinas, método atual e método a ser validado