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MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE PARA A PARA A VITELOGENINA VITELOGENINA DE PEIXES DE PEIXES AÇÃO DE METAIS E AÇÃO DE METAIS E XENOESTRÓGENOS XENOESTRÓGENOS LAB. DE TOXICOLOGIA CELULAR LAB. DE TOXICOLOGIA CELULAR DEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR DEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR DETECÇÃO E DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTÉICA EXPRESSÃO PROTÉICA

Vitelogenina Em Peixes

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Page 1: Vitelogenina Em Peixes

MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A MÉTODOS PARA ESTUDOS COM A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS: ENFOQUE

PARA A PARA A VITELOGENINAVITELOGENINA DE PEIXES DE PEIXES

AÇÃO DE METAIS EAÇÃO DE METAIS EXENOESTRÓGENOSXENOESTRÓGENOS

LAB. DE TOXICOLOGIA CELULARLAB. DE TOXICOLOGIA CELULARDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPRDEP. BIOLOGIA CELULAR, UFPR

DETECÇÃO E DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DA

EXPRESSÃO PROTÉICAEXPRESSÃO PROTÉICA

Page 2: Vitelogenina Em Peixes
Page 3: Vitelogenina Em Peixes

SISTEMA REPRODUTORSISTEMA REPRODUTORNEUROENDÓCRINONEUROENDÓCRINO

CÉREBROCÉREBRO

HIPOTÁLAMOHIPOTÁLAMOGtRH (+) / DPM (–)

HIPÓFISEHIPÓFISE GtH I & GtH II (+)

e outros (+/–)

TESTÍCULO/OVÁRIOTESTÍCULO/OVÁRIO ESxH e outros fatores dimorfismo sexual gametogênese (Zn) incorpora VTG (GtH I)

Page 4: Vitelogenina Em Peixes

POSSÍVEIS ETAPASPOSSÍVEIS ETAPASpara o estudo dapara o estudo da

EXPRESSÃO de PROTEÍNASEXPRESSÃO de PROTEÍNAS

seqüência da proteína seqüência de ácidos nucléico

MÉTODOS:

QUALITATIVOS: imuno-detecção (avaliação subjetiva);QUANTITATIVOS:

quantificação relativa:métodos semi-quantitativos (ELISA direto);métodos indiretos (p.ex.: análise de imagens);

quantificação absoluta:p.ex.: cromatografia ou ELISA sandwich

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POSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃOPOSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃO

de de VITELOGENINAVITELOGENINA ( (VTGVTG) em fígado (HEPATÓCITOS) e) em fígado (HEPATÓCITOS) e

DETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃODETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃO em TECIDOS de TRAÍRAem TECIDOS de TRAÍRA

: uma OU outra ENTRADA

: uma E outra ENTRADA+

: relação INTRA-ESPECÍFICA (Hm)

: relação INTERESPECÍFICA (outras espécies - spp )

proteínas (PTs) ou

aminoácidos (aa’s) ou

seqüência de aa’s

DNA ou seqüência de DNA

RNA ou seqüência de RNA

DNA, RNA, PT, aa’s ou

SEQÜÊNCIAS spp Hm

Page 6: Vitelogenina Em Peixes

ISOLAMENTO ou PURIFICAÇÃO deVTG de Hm (PLASMA ou CÉLULAS)

>> cromatografia de troca iônica (purificação)>> fracionamento por precipitação (isolamento)

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay>> INCUBAÇÃO com anti-VTG

>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO

>> COLORIMETRIA (padrões : VTG purificada)

>> VALIDAÇÃO (bioensaios)

IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS

>> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON

>> INCUBAÇÃO com anti-VTG ou anti-VTG

>> INCUBAÇÃO com ANTI-2ário-CONJUGADO

>> DENSITOMETRIA (padrões : VTG purificada)

RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG

PRODUÇÃO DE anti-VTGIMUNIZAÇÃO em spp +

INDUÇÃO de VTG de Hmno FÍGADO por IIP de17-ESTRADIOL (E2)

anti-VTG de spp REAÇÃO CRUZADA

RT ( transcriptase reversa )TRANSCRIÇÃO REVERSA

mRNA’s >>> cDNA’s

EXTRAÇÃO de RNA-total do FÍGADO

NORTHERN BLOT

HIBRIDIZAÇÃO: cDNA-VTG ou SHt

>> RNA em GEL de AGAROSE

>> DENSITOMETRIA (padrões de RNA)

+

EXPRESSÃO in vitro do DNA-VTG de Hm>> VETORES de EXPRESSÃO (“gene” de VTG)>> produção de VTG (ou VTG-aa’s) em host cell

PCR ( DNA polimerase )

>> amplificação e isolamento

de cDNA ou OUTRO

>> com PRIMERS para VTG

construir SONDA MARCADA :

DNA-VTG

+

CONSTRUÇÃO/OBTENÇÃO de PRIMERS

oligonucleotídeos sintéticos degenerados

>> para sequências conservadas de aa’s

do domínio carboxi-terminal (3’) da VTG

(17 sequências conhecidas de 15 spp )

>> ALEATÓRIOS

SONDA HETERÓLOGA MARCADA (SHt )HIBRIDIZAÇÃO com ESTRINGÊNCIA

>> RNA ou DNA ou cDNA ou

>> oligonucleotídeos sintéticos degenerados

relacionados à seqüência(s) de DNA do GENE

que codifica a VTG em spp de peixes

EXTRAÇÃO de DNA-total do FÍGADO>> clivagem aleatória (endonuclease de restrição)>> coleção heterogênea de fragmentos de DNA

“ISOLAMENTO” do DNA-VTG

HIBRIDIZAÇÃO: DNA-VTG ou SHt

>> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE

>> seleção de colônia com clones de DNA-VTG

+

+

CLONAGEM do DNA de Hm( DNA-total ou cDNA-VTG )

DNA de Hm (EXÓGENO à bactéria ou levedura)+

VETOR DE CLONAGEM (plasmídio ou fago)=

CLONES de DNA recombinante (COLÔNIAS)

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VTG plasmática

de Sparus aurata

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cDNA-VTG de Sparus aurata

mRNA-VTG

de Sparus aurata

Northern Blot:

autoradiografia (32P)

5 dias após IIP :

5 mg E2 . kg-1

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SDS-PAGE (7%)Comassie Blue

3 10 30 M

VTG

3 3 10 10 30 30 M

VTG

ELISA

VTG de Sparus aurata

VTGWestern Blot: anti(2)-enzima

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RESPOSTA

ESTROGÊNICA

INDUZIDA EM

Salvelinus alpinus

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mRNA-VTGNorthern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

VTG: Western Blot(policlonal de truta em coelho / anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase)

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mRNA-RE2

Northern Blot: sonda fluorescente (cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

Page 13: Vitelogenina Em Peixes

mRNA-VEPsNorthern Blot:

sonda fluorescente(cDNA-DIG)

Salvelinus alpinus

IIP : 10 mg E2 . kg-1

Page 14: Vitelogenina Em Peixes

CULTIVO PRIMÁRIODE HEPATÓCITOS

DE TRUTA

Page 15: Vitelogenina Em Peixes

IOD

TRUTA

mRNA-VTG

Northern Blot:

autoradiografia (32P)

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[VTG]% (IOD)VTG SDS-PAGE (5-20 %)

TRUTA

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[VTG]% (IOD)

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EXPRESSÃODE VTG

vs.EXPOSIÇÃO AO Pb++

EMHoplias malabaricus

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VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)

empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)

dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)

linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 200 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),

com EDTA/MgCl2 e H2O

linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :

1 2 3 4 5 6 7 8 MWM

205 kDa

116 kDa97,4 kDa

66 kDa45 kDa

29 kDa

Page 20: Vitelogenina Em Peixes

VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricusevidenciada por SDS-PAGE descontínuo (Coomassie Brilliant Blue)

empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separação em ACRILAMIDA a 9 %INDUÇÃO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E2)

dose via intraperitoneal: 20 g E2 . g-1 biomassa — iip E2(+)

linha 1: 400 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E2 (-)linha 2: 400 nl do animal 4, FÊMEA jovem E2 (-)linha 3: 100 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E2(+)linha 4: 400 nl do animal 1, FÊMEA jovem E2 (-)linhas 5 a 8: 150 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x),

com EDTA/MgCl2 e H2O

linha 5: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,5linha 6: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 2,0linha 7: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,5linha 8: [EDTA] : [Mg++] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E2(+) :

1 2 3 4 5 6 7 8MWM

116 kDa97,4 kDa

45 kDa

29 kDa