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WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos de congelamento São Paulo 2007

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WALKIRIA FERREIRA SILVA

Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes

protocolos de congelamento

São Paulo

2007

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WALKIRIA FERREIRA SILVA

Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos de congelamento

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e

Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade de São Paulo, para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento: Cirurgia

Área de Concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres

Orientadora:Profª. Drª. Maria Angélica Miglino

São Paulo 2007

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FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: Silva, W. F.

Título: Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de

suínos em diferentes protocolos de congelamento

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade

de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências

Data:___/___/___

Banca Examinadora

Prof. Dr.______________________________Instituição:___________________________

Assinatura:_____________________________Julgamento:_________________________

Prof. Dr. _______________________________Instituição:__________________________

Assinatura:______________________________Julgamento:________________________

Prof. Dr. ________________________________Instituição:_________________________

Assinatura:_______________________________Julgamento:_______________________

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Dedicatória e

Agradecimentos

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Introdução

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Silva, W.F.

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1 INTRODUÇÃO

A terapia celular é tida como uma terapia muito promissora no que diz

respeito ao tratamento de diversas doenças, fundamentada principalmente na

provável regeneração dos tecidos lesados promovida pelas células

transplantadas. A sua importância e aplicabilidade terapêutica torna-se ainda mais

evidenciável tendo-se em vista a incapacidade de proliferação de muitos tipos

celulares para a reposição do tecido injuriado (HIDEMASA et al., 2003). Uma das

fontes de células com provável capacidade de regeneração tecidual, no caso as

células-tronco, é a medula óssea. Verificam-se dois tipos distintos de fonte celular

componentes da medula óssea, sendo, 1) as células hematopoiéticas

multipotentes – capazes de originar células sanguíneas (plaquetas, eritrócitos,

monócitos, granulócitos e linfócitos) e 2) as células multipotentes não

hematopoiéticas – capazes de originar células mesenquimais ou estromais

(PROCKOP, 1997; KRAUSE, 2002). Relata-se ainda que ambas as fontes

celulares sejam passíveis de obtenção sem a instituição de terapia

imunossupressiva (SUSSMAN, 2001).

A quantificação do crescimento celular, incluindo proliferação e viabilidade,

tem se mostrado uma ferramenta essencial em muitos laboratórios que estudam

as células mononucleares totais. Muitos ensaios de viabilidade são baseados em

um ou dois parâmetros, tais como atividade metabólica e integridade da

membrana celular. Usualmente a atividade metabólica é mensurada em

populações celulares por meio de incubação com tetrazolium. Seguindo-se o

ensaio a exclusão por morte celular após-marcação com azul Tripan,

diferenciando-se então as células viáveis das não viáveis (CELL, 2003).

Ainda assim, muito a que ser pesquisado quanto à possível viabilidade

celular para utilização em transplantes, ou em bioengenharia de tecidos, uma vez

que, é ampla a variedade de fontes celulares e, não obstante, mais amplo ainda

pode ser a aplicação de técnicas de criopreservação e o período de estocagem

destas células.

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Objetivo

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Silva, W.F.

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2 OBJETIVO

Objetivamos testar diferentes protocolos de congelamento aplicados às

células mononucleares totais de origem medular com vista à determinação da

viabilidade celular pós-descongelamento (45 e 60), e conseqüente potencialidade

de expansão em cultura.

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Revisão Bibliográfica

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

As referências consultadas que embasaram a elaboração desta dissertação

foram separadas em capítulos como se segue.

3.1 REGENERAÇÃO TECIDUAL

Quanto às referências sobre regeneração tecidual dispomos:

3.1.1 Histórico

Em 1955, Barnes e Loutit detectaram que as células de baço

criopreservadas injetadas depois da irradiação letal podem produzir a recuperação

hematológica em ratos. Aproximadamente 40 anos depois, criopreservação de

medula óssea se tornou uma prática padrão na clínica para transplantes autológos

de medula óssea (AREMAN; AREMAN; SACHER; DEEG, 1990; SPUTTEK, 1991;

ROWLEY, 1992; HUBEL,1997; IKEHARA, 2002; SPUTTEK, 2004; HAIDER;

ASHRAF, 2005; FLEMING; HUBEL, 2006). A criopreservação também foi usada

com sucesso para transplantes alogênicos de medula óssea, embora o seu uso

não tenha se tornado comum (LASKY, 1989). O processamento de células-tronco

hematopoiéticas para transplantes modificou-se consideravelmente em 10 anos

passados. As células-tronco convenientes para transplantes podem ser obtidas de

várias fontes inclusive da medula óssea (AMOS; GORDON, 1995).

Na década de 60 foi descoberto que alguns tecidos adultos têm capacidade

de auto-regeneração como a pele, o epitélio intestinal e principalmente o sangue,

o qual tem suas células constantemente destruídas e reguladas por um complexo

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e fino processo de proliferação e diferenciação celular. Durante muitas décadas

estudou-se o processo de hematopoiese, processo de produção das células

sanguíneas, a partir de células-tronco multipotentes, localizadas no interior da

medula óssea, que são capazes de dar origem às células progressivamente mais

diferenciadas e com menor capacidade proliferativa. As células mesenquimais da

medula óssea, também têm capacidade de gerar as linhagens mielóide e linfóide,

que originam os tipos celulares presentes no sangue. O processo de renovação

celular é tão intenso que diariamente novas células sanguíneas entram na

circulação (SCORSIN, 1997).

3.1.2 Panorama Atual

A noção de que vários tecidos e órgãos do corpo humano como o fígado,

músculo esquelético, pâncreas e sistema nervoso têm um estoque de células-

tronco, apresentando uma capacidade limitada de regeneração tecidual após

injúria, é recente. Ainda mais atual é a idéia de que as células-tronco presentes

nestes vários órgãos não sejam apenas multipotentes, ou seja, capazes de gerar

as células constitutivas daquele órgão específico, mas também pluripotentes, as

quais poderiam também gerar células de outros órgãos e tecidos (GOODELL,

2001; MALOUF, 2001). Obviamente, a possibilidade de se utilizar as próprias

células dos indivíduos adultos poderia contribuir para a resolução dos dois

principais problemas enfrentados pela bioengenharia: a rejeição imunológica de

transplantes heterólogos e as objeções ético-religiosas do uso de material fetal. O

primeiro relato incontestável desta propriedade das células-tronco adultas foi

publicado em 1998, por um grupo de cientistas italianos, os quais estudaram a

regeneração do músculo esquelético por células derivadas da medula óssea

(FERRARI, 1998).

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3.1.3 Células-tronco e criopreservação

O intuito da criopreservação é preservar a célula-tronco, obtida da medula

óssea, sangue periférico ou cordão umbilical, de maneira que a sua viabilidade e

integridade funcional sejam mantidas após o descongelamento (BITTENCOURT;

ROCHA, 2006). As células-tronco podem ser mantidas congeladas a -80ºC por até

dois anos ou por períodos significativamente mais longos (mais de 14 anos)

quando armazenados em tanque de nitrogênio líquido (AIRD, 1992; DE VRIES,

2004).

Na criobiologia, a formação de cristais de gelo durante o congelamento é a

causa primária de danos celulares. Cristais de gelo intracelulares podem ser

formados durante o congelamento rápido, resultando em uma ruptura mecânica

das estruturas celulares. Sob processo de congelamento lento, a formação de

cristais de gelo ocorre no espaço extracelular, resultando em um aumento da

osmolaridade extracelular à medida que a água livre é incorporada aos cristais de

gelo. Essa diminuição de água resulta na concentração de solutos extracelulares,

tais como os íons sódio, podendo causar uma hiperosmolaridade extracelular,

levando a uma desidratação celular. A desidratação progressiva da célula ocorrerá

durante o congelamento excessivamente lento, permitindo maior passagem de

água para o espaço extracelular, sendo incorporada aos cristais de gelo. Parece

que a permeabilidade celular à água seja o fator limitante no estabelecimetno do

processo de congelamento para qualquer célula em particular (MASSUMOTO,

2000).

Múltiplos mecanismos foram encontrados para garantir a sobrevivência das

células ao descongelamento. A resposta de uma célula ao ambiente congelado

pode ser mostrada esquematicamente na figura 1. Inicialmente, as células são

suspendidas em uma solução criopreservante em temperatura ambiente. Como a

amostra é esfriada, a formação do gelo é iniciada (espontaneamente ou

semeando). A formação do gelo na solução extracelular retira a água na forma do

gelo da solução. Esta retirada de água produz uma modificação abrupta na

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concentração da porção descongelada da solução extracelular. Quando exposto à

concentração extracelular crescente, a célula responde exprimindo água para

conseguir um novo estado de equilíbrio entre soluções intracelulares e

extracelulares. Em altas taxas de esfriamento, o equilíbrio não pode ser mantido

porque a taxa na qual o potencial químico na solução extracelular está sendo

diminuída é muito maior do que a taxa na qual a água pode difundir-se fora da

célula. O resultado deste desequilíbrio é a formação de gelo intracelular (IIF)

sendo letal à célula (TONER, 1993).

Figura 1 – Esquema representativo do comportamento celular quando submetida a protocolos de congelamento

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Os protocolos de criopreservação geralmente requerem o uso de

crioprotetores compostos para promover melhor sobrevivência das células e

tecidos sob congelamento (BATESON, 1994; KARLSSON, 1996; MULDREW,

1996; BIDAULT, 2000; LAKEY, 2003;), e para moderar os normalmente letais

efeitos da concentração extracelular de sal, do gelo intracelular e gelo na matriz

celular. Na criopreservação tradicional de células em suspensão, crioprotetores

são usados para manipular o ponto de congelamento intra e extracelular, assim

manipulando também a quantidade de gelo formado a dada temperatura. O

sucesso de um protocolo depende normalmente da concentração de

crioprotetores dentro das células ou tecidos. O crioprotetor entra nas células e

tecidos através de equilíbrio termodinâmico com o meio. No caso reverso,

equilíbrio termodinâmico também proporciona a remoção dos crioprotetores

internos através de uma solução de diluição usada no fim do processo quando as

células ou tecidos são preparadas para o uso (FATHY, 1984; FULLER, 1989;

TAYLOR, 1992; FULLER, 1994; WALCERZ, 1995; ISBELL, 1997; ZIGGER, 1997;

ELMOAZZEN, 2005;).

O crioprotetor mais frequentemente utilizado é o dimetilsulfóxido (DMSO). A

adição desse penetrante crioprotetor diminui o volume de água para formação de

cristais de gelo e consequentemente, o grau de desidratação da célula. Isso

resulta em adequada criopreservação das células(AIRD,1992; MASSUMOTO,

1996; DE VRIES, 2004; ). Os crioprotetores foram criados com o propósito de

substituir a água nas células. Isso minimiza o dano criado pela formação de gelo e

propicia a formação de um estado amorfo nas células, em vez de cristais de gelo,

durante o ciclo resfriamento-crioarmazenamento-aquecimento. Os crioprotetores

podem ser separados em dois grupos principais, em relação a seus papéis, a

saber, agentes penetrantes e não-penetrantes de acordo com a tabela 1.

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Tabela 1 - Classificação de agentes criopreservadores segundo o peso molecular e outras propriedades.

A. Crioprotetores penetrantes (PC) B. Crioprotetores não penetrantes (NPC) Baixa molecularidade: MW<100Da

Açúcares:180<MW<594Da

Alta molecularidade: MW>1000Da

Poli alcoólicos (PVAs): Ficoll Dextran Etileno glicol (EG) Monossacarídeos Polivinil pirrolidona

(PVP) Dimetilsulfóxido (DMSO) Frutose, Glicose Polietilglicol (PEG) Propilenoglicol Lactose, Maltose Polvinil alcoólico (PVA) Glicerol Agente bloqueador de

formação de cristais de gelo derivado de PVA

Amido hidróxietílico (HES)

Butandióis: 1,2-/2,3-butandiol

Dissacarídeos: Sacarose Trehalose

Acetamida, Metanamida Polissacarídeos: Rafinose

Fonte: Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs. KULESHOVA et al. 2006.

Um ponto importante a ser considerado no desenvolvimento dos processos

de criopreservação é o de evitar efeitos tóxicos das soluções criopreservantes. A

toxicidade dos crioprotetores penetrantes é objeto de árdua investigação, já que

todos os agentes de baixo peso molecular são potencialmente tóxicos às células.

Para a criobiologia, os procedimentos para estimar os efeitos de um crioprotetor

para a viabilidade celular são bem conhecidos. Essa estimativa é, em geral, feita

pela avaliação das variáveis nos seguintes parâmetros: tipo de crioprotetor,

concentração de crioprotetor e tempo de exposição ao crioprotetor (MUKAIDA,

1998; VALDEZ , 1998; KULESHOVA, 2006).

Os protocolos atuais de criopreservação de células-tronco hematopoiéticas,

são geralmente baseadas em concentrações de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)

como crioprotetor intracelular (ELLIOT, 1994), os efeitos tóxicos relacionados à

infusão de DMSO são, via de regra, relacionados à dosagem, e apesar de serem

geralmente inócuos ou leves, podem se tornar severos (DAVIS, 1990;

STRONCEK, 1991; ZAMBELLI, 1998). Geralmente para a criopreservação são

utilizados freezers programados seguido pelo armazenamento das células em

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nitrogênio líquido ou em fase de vapor, o que consome muito tempo e requer

equipamentos automatizados de valores exorbitantes (ELLIOT, 1994).

Há dez anos foi descrito um protocolo simplificado de criopreservação de células-tronco hematopoiéticas a -80ºC que não dependia de congelamento programado em freezer. Tal protocolo envolvia o armazenamento de soluções contendo 5% e 10% de DMSO, sendo esse o único crioprotetor (GALMES, 1995; GALMES, 1996; GALMES, 1999). A maioria dos estudos parece indicar que esse procedimento simplificado está associado a uma redução na toxicidade e a custos mais baixos, nenhuma diferença significativa foi observada em períodos médios de armazenamento e viabilidade pós-descongelamento de células nucleadas entre as células criopreservadas com 5% e 10% DMSO. Quando usada a criopreservação a 5% DMSO, foi observada uma regeneração hematológica mais lenta comparada à do grupo criopreservado a 10%DMSO, isso pode sugerir que a concentração de DMSO 10% aumenta a proteção ou conservação das células, permitindo a mesma dose de células no grupo DMSO10% induzir uma recuperação hematológica mais veloz que uma dose similar aplicada ao grupo de DMSO 5% (GALMES, 2007).

As células-tronco da medula óssea apresentam capacidade de se transformar em diferentes tipos de células (FUKUDA, 2001), entretanto, para a realização dos transplantes autólogos de células mononucleares totais da medula, serão necessários alguns cuidados essenciais no processo de criopreservação e armazenamento, cujos efeitos devido ao longo prazo de congelamento e capacidade imunohematopoiética ainda são pouco conhecidos. A partir de então, RE, 1998 estudaram células da medula óssea, criopreservadas e estocadas por mais de cinco anos relatando a preservação de boa viabilidade com formação de colônias in vitro, as quais registraram índices de contagem de granulócitos maiores do que 500x106/L em 21 dias e de plaquetas maiores do que 20x109/L após 30 dias de transplante. Ao término de 29 dias, o nível de hemoglobinas do paciente era satisfatório, não havendo necessidade de transfusão.

Walter et al. (1999) reportaram que o armazenamento das células criopreservadas deve obedecer a um padrão de baixas temperaturas entre -70 a –

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180Cº, acrescentando-se que, quando armazenadas a temperatura entre –80 a -

90Cº, pode-se também obter resultados satisfatórios.

Liu et al. (1980) descreveram alta viabilidade das células hematopoiéticas

provenientes da medula óssea de ratos vivos após criopreservação,

demonstrando que as células precursoras granulocíticas tiveram média à

moderada viabilidade enquanto a capacidade proliferativa dos eritrócitos

demonstrou-se diminuindo após congelamento.

A tecnologia de preservação de células cultivadas tem progredido, e as

células mesenquimais criopreservadas tem apresentado alta capacidade de

reparação tecidual devido à facilidade de diferenciação (BRUDER, 1997; SPURR,

2002).

Uma etapa muito importante no transplante autólogo de medula óssea é a

criopreservação da mesma ou das células tronco-hematopoiéticas periféricas. A

criopreservação permite o estabelecimento de regimes de condicionamento por

vários dias, como também, o armazenamento profilático para pacientes a serem

transplantados meses ou anos mais tarde. O fato de que a célula-tronco

hematopoiética possa ser criopreservada com sucesso é evidenciado pela

capacidade da mesma em regenerar a função da medula após regimes com altas

doses de quimioterápicos. A falha na recuperação hematopoiética, geralmente,

não é atribuída à criopreservação de células pluripotentes, porém há relatos que

correlacionam a mau criopreservação de células pluripotentes como sendo

responsável pela demora na recuperação hematopoiética, após o transplante

(ROWLEY, 1992; MASSUMOTO, 2000). Existem dois métodos de

criopreservação. Um dele é realizado pelo congelamento rápido das células,

quando a medula ou as células-tronco periféricas são colocadas diretamente em

um freezer a -80ºC e a concentração final da solução crioprotetora é de 5%

dimetilsulfóxido (DMSO), 6% de solução de amido hidroxietilamido e 4% de

albumina humana em solução salina. O outro método realiza o congelamento lento

e progressivo, quando a razão de decaimento da temperatura é controlada por

computador. Nele, a solução crioprotetora é constituída por 40% de meio de

cultura, 40% de plasma autólogo e 20% de DMSO. A técnica de congelamento

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lento e descongelamento rápido evita os danos mecânicos e a desidratação

causada pela formação e crescimento de cristais de gelo. O descongelamento das

células deve ser rápido para que os cristais de gelo, formados durante o

congelamento, não danifiquem a membrana celular (MASSUMOTO, 1996).

Pettengell et al. (1994) demostraram que células mononucleares de medula

óssea e de sangue periférico, criopreservadas em temperatura de 4ºC por 5 dias

apresentaram viabilidade diminuída com o passar das horas. As análises

realizadas 24 h após a criopreservação alcançaram índice de viabilidade de 90%,

passadas 48 horas a viabilidade reduziu-se a 68%, atingindo 47% após 72 h de

criopreservação. Segundo Weiner, Tobias e Yankee (1976) células

mononucleares de medula óssea humana, foram coletadas e criopreservadas em

solução contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), atingindo uma viabilidade de

50% após descongelamento. De acordo com Galmes et al., (1995) foram usadas,

para transplantes em 11 pacientes, células-tronco criopreservadas a temperatura

de –80ºC por congelamento em freezer programado mecanicamente e

crioprotegidas por solução contendo 10% DMSO proporcionando uma viabilidade

de 90%.

Parker et al., (1981) relataram a criopreservação de medula óssea humana

por período de 42 meses em nitrogênio líquido, conferindo-se viabilidade de 79%

após o processo de descongelamento. Em estudo realizado por Donnenberg et al.

(2002) testou-se a viabilidade de células mononucleares de medula óssea

criopreservadas por um período de 9 a 14 anos, sendo verificado que 95% das

células estavam viáveis após descongelamento para transplante. Kawano et al.

(2004) testaram o método de criopreservação com temperatura a -80ºC, em

freezer programado com medula óssea humana coletada de pacientes por um

período de 7 anos e obtiveram resultados de viabilidade variando de 75% – 89%

quando as células foram descongeladas.

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Materiais e Métados

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4 MATERIAis E MÉTODOS

O material utilizado e os métodos empregados nesta investigação são

descritos neste capítulo

4.1 MATERIAL PROPOSTO

Foram utilizados para a extração de medula óssea 8 suínos hígidos,

fêmeas, pesando aproximadamente 25 Kg, provenientes de granjas da Cidade de

São Paulo.

4.2 PROTOCOLO ANESTÉSICO

Os animais foram pré-medicados com associação anestésica de Cloridrato

de Ketamina (Dopalen - Vetbrand) na dose de 3 mg/Kg e Cloridriato de

Midazolan (Dormire - Cristália) na dose de 0,5 mg/Kg na mesma seringa,

aplicados via intramuscular (IM). Logo após, os animais foram encaminhados a

sala de cirurgia. Na sala cirúrgica foi realizado acesso venoso na orelha para a

infusão de fluidoterapia, com utilização de Ringer Lactato e o volume infundido foi

de aproximadamente 1 litro e 500 ml. A indução anestésica foi realizada com

emprego de Propofol (Propovan - Cristália), na dose de 5 mg/Kg intravenoso (IV).

Em seguida realizou-se a intubação orotraqueal (IOT), com sonda traqueal

adequada ao animal. A manutenção anestésica foi realizada pela aplicação de

anestesia geral inalatória utilizando-se Isofluorano (Isoforine - Cristália) utilizando

aparelho de anestesia modelo Shoogun Evolution 2700 (Takaoka) (Figura 2) e a

modalidade ventilatória escolhida foi Ventilação Controlada a Pressão (Pcv) com

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FR= 15 (freqüência respiratória) e PEEP = 5 cm H2O (pressão respiratória final

das vias aéreas).

Figura 2 – Fotografia do aparelho de anestesia inalatória Shoogun Evolution 2700(Takaoka)

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Silva, W.F.

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4.3 Protocolo Cirúrigico

Com os animais em plano anestésico realizou-se a assepsia da pele na

região da crista ilíaca. Seguindo-se a analgesia da pele, tecido subcutâneo e

musculatura com utilização de Cloridrato de Lidocaína a 0,2% sem vaso constritor,

e aguardado sua ação procedeu-se a punção com agulha para punção óssea,

tamanho 11 x 10,2cm (HS MEDICAL) (Figura 3A), a qual apresentava-se envolta

por uma cânula sendo ambas perfuro-cortante, dispensando assim, uma incisão

local. A agulha foi introduzida na medula óssea e, por pressão negativa foram

aspirados aproximadamente 60ml de sangue de medula em seringas de 10mL

Luer-lock (BD) (Figura 3B) contendo anticoagulante (heparina sódica bergamo-

Actiparin®) (CROW; WALSHAW, 2000). Após a coleta (Figura 4) as seringas

contendo o aspirado medular foram suavemente homogeneizadas e

acondicionadas em isopor com gelo para transporte e conseqüente separação das

células mononucleares.

Figura 3 – Fotografia da cânula para punção de medula óssea (A) e seringa lower-lock (B)

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Figura 4 – Em A: Fotografia do procedimento de punção da medula óssea da crista ilíaca realizado após anti-sepsia e localização óssea através de palpação. Em B, desenho esquematizado demonstrando as regiões de interesse no momento da coleta de material

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4.4 SEPARAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES TOTAIS DA MEDULA

ÓSSEA

A separação das células foi realizada por gradiente de densidade Ficoll-

PaqueTMPlus®1 (Amersham Bioscience) (STRAUER et al., 2001).

O material coletado foi separado em frações de 20ml e estes colocados em

tubos cônicos, adicionando-se aos mesmos, solução fisiológica 0,9% na proporção

de 1:1 o qual nos referimos como sendo solução final. Em outros tubos foram

colocados 15ml de Ficoll-PaqueTM Plus (Amsersham Pharmacia©) e com

emprego de pipeta de transferência alocada à parede do tubo, adicionando

suavemente a solução final preparada com a medula óssea (15ml de Ficoll-Paque

e 30ml de medula óssea).

EstatécnicaevitaqueocorramisturacomoFicoll-

PaqueTM Plus , (Amsersham Pharmacia©), pois

somente assim a separação celular por gradiente de

densidade pode ser realizada com sucesso.

Em seguida, estes tubos contendo solução

mistacompostademedula, solução fisiológica e Ficoll

foram centrifugados por 20 minutos, a velocidade de

2000rpm e a temperatura de 20ºC. Após a

centrifugação pode-se observar a formação de um

halodecélulas mononucleares, sob o plasma (Fig. 4),

o qual foi coletado com auxílio de pipeta Pasteur e

acondicionado em outro tubo cônico, adicionando-se

então solução de soro fetalbovino(SBF),associado à

solução fisiológica (SF) 0,9% em uma proporção de

1:6 (5ml de soro fetal e 30ml de solução fisiológica).

Novamente o material foi centrifugado por sete

dmdmdmdmd

Figura 4 – Esquema representativo da formação e localização do halo de células (CMMO) no tubo cônico após a centrifugação

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4.4.1 Teste de Viabilidade

Os testes de viabilidade foram feitos a partir de contagem das células

coradas com azul Tripan com utilização de Câmara de Neubauer, imediatamente

após a coleta das amostras (Figura 5).

Figura 5 - Fotografia demonstrando os materiais empregados na estimativa da viabilidade celular – São Paulo, SP, Brasil, 2007

Para a citometria, as amostras foram descongeladas em banho-maria a

uma temperatura de 37ºC e colocadas em tubos cônicos com volume de 15ml de

solução fisiológica 0,9% para centrifugação por 5 minutos a 2000rpm. Este

procedimento foi repetido por mais duas vezes. Seguidamente, as amostras foram

ressuspendidas em volume de 2ml de solução fisiológica para a marcação das

células viáveis e não viáveis com corante fluorescente para em seguida serem

avaliadas pelo citômetro.

Durante o processamento no citômetro de fluxo, há a passagem de células

individualmente por uma câmara de fluxo que gera um fluxo laminar de células,

onde incide um raio de luz (laser). A dispersão do mesmo (scatter) e dos corantes

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fluorescentes emite luzes de freqüências variadas que são captadas por filtros e

detectores fotomultiplicadores, os quais convertem a luz em pulsos eletrônicos e

que serão captados pelo software. A dispersão luminosa fornece os primeiros

dados sobre a caracterização de sua amostra celular. Ela permite investigar a

célula no que diz respeito ao seu tamanho (forward scatter) e à sua complexidade

e granularidade (side scatter). Em geral, esses critérios são utilizados para a

exclusão de debris celulares e células mortas. Por outro lado, os corantes

permitem a identificação do tipo celular, ou seja, do fenótipo celular. Deste modo o

conjunto dessas informações permite a quantificação das células e análise da

pureza celular. A citometria de fluxo apresenta outras aplicações nos estudos com

células-tronco, tais como a análise da viabilidade celular com o uso de corantes

fluorescentes (FONTES; ORELLANA; PRATA, 2006).

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4.5 CRIOPRESERVAÇÃO

Foram testados protocolos com meios de cultura composto principalmente

por DMSO. Após a coleta e separação as células mononucleares totais foram

congeladas em criotubos com capacidade de 1,8ml contendo os meios de

congelamento, determinados por oito protocolos distintos (Tabela 2):

1) meio de congelamento A foi composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO),

40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% plasma autólogo.

2) meio de congelamento B continha 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40%

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de plasma autólogo.

3) meio de congelamento C teve em sua composição 20% dimetilsulfóxido

(DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo.

4) meio de congelamento D foi composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO),

80% de plasma autólogo.

5) meio E constituiu-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de

Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo.

6) meio F conteve 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park

Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo.

7) meio G conteve 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino

(SFB) e 47,5% de plasma autólogo.

8) meio H constituiu-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 95% de plasma.

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Tabela 2 – Tabela representativa dos componentes dos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação – São Paulo, SP, Brasil, 2007

Componentes do meio de congelamento

DMSO1 PLASMAAUTÓLOGO DMEM2 RPMI3 SORO FETAL

BOVINO5,0% 20,0% 40,0% 47,5% 40,0% 47,5% 40,0% 47,5% 40% 47,50%

A X X X B X X X C X X X D X 2X E X X X F X X X G X X X

Meio

H X 2X

1. DMSO – Dimetilsulfóxido 2X – Representam o dobro da concentração 2. DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium 3. RPMI – Roswell Park Memorial Institute

O congelamento das células foi feito da seguinte forma: 30 minutos a -4ºC,

4 horas a uma temperatura de -20ºC, 12 horas em temperatura de -40ºC para

depois serem transferidas para o nitrogênio líquido a uma temperatura de -196ºC.

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Resultados

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5 RESULTADOS

Os resultados encontrados nesta pesquisa são discorridos em tópicos.

5.1 RESUTADOS OBTIDOS EM CÂMARA DE NEUBAUER

Após um período de 45 dias de congelamento, as amostras foram

descongeladas em banho-maria a uma temperatura de 37ºC e colocadas em

tubos cônicos com volume de 15ml de solução fisiológica 0,9% para centrifugação

por 5 minutos a 2000rpm. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes.

Seguidamente as amostras foram ressuspendidas em volume de 2ml de solução

fisiológica para a marcação das células não viáveis com Azul Tripan. Os

resultados dos meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 3.

Tabela 3 – Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação realizados em câmara de Newbauer após o descongelamento – São Paulo, SP, Brasil, 2007

Células Viáveis - Descongelamento com 45 dias Contagem em Câmara de Neubauer [%] [20%] DMSO [5%] DMSO

A B C D E F G H 1 43,0 20,0 87,0 78,0 68,0 75,0 72,0 43,0 2 83,0 73,0 70,0 30,0 85,0 60,0 84,0 82,0 Animal 3 72,0 69,0 73,3 62,5 41,8 50,0 70,0 41,9

Média 66,0 54,0 76,8 56,8 64,9 61,7 75,3 55,6 Mínimo 43,0 20,0 70,0 30,0 41,8 50,0 70,0 41,9 Máximo 83,0 73,0 87,0 78,0 85,0 75,0 84,0 82,0

DP1 20,7 29,5 9,0 24,5 21,8 12,6 7,6 22,8 CV2 3,2 1,9 8,5 2,3 3,0 4,9 9,9 2,4

1. DP – Desvio Padrão 2. CV – Coeficiente de Variação

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5.2 RESULTADOS OBTIDOS PELA TÉCNICA DE CITOMETRIA DE FLUXO

Após um período de 45 dias de congelamento, as amostras foram

submetidas à quantificação realizada em citômetro de fluxo. Os resultados dos

meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 4 e gráficos 1, não

obstante, ainda representaram-se as viabilidades obtidas em montagens de dot

plots (Gráficos 2 a 9).

Tabela 4 - Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação realizados em citômetro de fluxo após o descongelamento – São Paulo, SP, Brasil, 2007.

Células Viáveis – Descongelamento com 45 dias Contagem em Citômetro de Fluxo [%]

Protocolos 20% DMSO Protocolos 5% DMSO A B C D E F G H

1 19,48 21,77 2,31 54,24 6,49 3,79 3,05 5,87 2 15,54 15,40 40,24 80,00 8,78 22,82 9,74 18,16 3 16,40 25,36 24,68 70,00 5,70 13,85 6,88 38,74 4 14,36 7,08 10,33 84,20 25,80 10,28 10,41 30,74 5 30,28 11,11 38,33 23,55 25,41 27,13 8,77 30,86 6 70,23 72,47 73,35 66,98 20,54 26,40 28,64 59,31 7 28,14 18,54 24,90 24,80 15,35 11,36 11,45 26,22

Animal

8 18,90 9,56 25,22 10,27 14,66 13,89 12,08 17,44 Média 26,67 22,66 29,92 51,76 15,34 16,19 11,38 28,42 Mínimo 14,36 7,08 2,31 10,27 5,70 3,79 3,05 5,87 Máximo 70,23 72,47 73,35 84,20 25,80 27,13 28,64 59,13

DP1 18,54 21,07 21,66 28,45 8,04 8,37 7,54 16,09 CV2 1,44 1,08 1,38 1,82 1,91 1,93 1,51 1,77

1. DP – Desvio Padrão 2. CV – Coeficiente de Variação

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A B C D E F G H

Protocolos [20%] DMSO Protocolos [5%] DMSO

Contagem em Citômetro de Fluxo [%]

Células Viáveis - Descongelamento com 45 dias

Gráfico 1 – Histograma representativo das médias obtidas pela contagem de viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação realizadas em citômetro de fluxo após o descongelamento em 45 dias – São Paulo, SP, Brasil, 2007.

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Após um período de 60 dias de congelamento, as amostras foram

submetidas à quantificação realizada em citômetro de fluxo. Os resultados dos

meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 5 e gráfico 10. As

viabilidades obtidas foram demonstradas em dot plots a seguir (Figs. 14 a 21).

Tabela 5 - Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação realizados em citômetro de fluxo após o descongelamento – São Paulo, SP, Brasil, 2007

1. DP – Desvio Padrão 2. CV – Coeficiente de Variação

Células Viáveis – Descongelamento com 60 dias Contagem em Citômetro de Fluxo [%]

Protocolos 20% DMSO Protocolos 5% DMSO A B C D E F G H

1 17,38 3,59 18,12 54,89 4,78 23,27 12,13 28,77 2 14,92 20,53 32,54 54,78 13,31 22,24 12,73 24,12 3 16,92 2,80 17,19 48,32 32,52 34,91 17,32 36,13 4 15,40 24,80 37,70 43,20 12,80 18,20 11,40 31,70 5 18,73 19,28 15,09 37,28 17,45 20,41 10,13 42,54 6 5,50 11,11 17,68 83,11 14,27 16,33 14,62 27,12 7 16,90 28,47 29,01 79,56 11,10 12,13 6,98 42,63

Animal

8 65,20 66,30 66,00 61,72 13,35 38,82 25,17 72,02 Média 21,37 22,11 29,17 57,86 14,95 23,29 13,81 38,13 Mínimo 5,50 2,80 15,09 37,28 4,78 12,13 6,98 24,12 Máximo 65,20 24,80 37,70 54,89 32,52 34,91 17,32 42,54

DP1 1,54 10,26 10,26 7,60 10,23 6,50 2,74 7,05 CV2 13,88 2,16 2,84 7,61 1,46 3,58 5,05 5,41

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A B C D E F G H

Protocolos [20%] DMSO Protocolos [5%] DMSO

Contagem em Citômetro de Fluxo [%]

Células Viáveis - 60 dias

Gráfico 10 – Histograma representativo das médias obtidas pela contagem de viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à criopreservação realizadas em citômetro de fluxo após o descongelamento em 60 dias – São Paulo, SP, Brasil, 2007

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Silva, W.F.

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As amostras avaliadas com 45 dias de congelamento pertencentes aos

protocolos A, B, C e D contendo 20% DMSO (dimetilsulfóxido) como crioprotetor,

apresentaram médias de viabilidade superiores as apresentada no

descongelamento dos protocolos E, F, G e H contendo 5% DMSO

(dimetilsulfóxido), no mesmo período. O mesmo ocorreu quando fizemos o

descongelamento das amostras após o período de 60 dias, conforme tabelas 4 e 5

(acima). Os protocolos D e H individualmente apresentaram melhor viabilidade

tanto para o descongelamento no período de 45 dias quanto para o período de 60

dias.

Foram selecionados aleatoriamente três protocolos após 60 dias de

criopreservação e colocados em cultivo para observarmos se estas células

perderam sua capacidade de expansão. As amostras ficaram em cultivo por sete

dias. Durante este período notamos que nos primeiros dias as células

apresentaram boa viabilidade e intensa atividade metabólica e algumas células se

aderiram ao fundo das placas. A partir do quinto dia as células começaram a

morrer e no sétimo dia quase não observamos células viáveis nas placas.

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Discussão

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Silva, W.F.

68

6 DISCUSSÃO

6.1 MÉTODOS DE ESTIMATIVA DE VIABILIDADE CELULAR

A quantificação da porcentagem de viabilidade celular foi feita por campo

em câmara de Neubauer em microscópio óptico de luz, através da marcação com

Azul Tripan que penetra nas células mortas em função do aumento de

permeabilidade da membrana celular. Na dependência do tamanho celular, pode-

se haver a indução de contagem de debris celulares como pequenas células, uma

vez que não há coloração específica para os mesmos.

Já pela técnica de citometria de fluxo, as células em apoptose ou mortas

tiveram seu núcleo corado em laranja com marcador Guava® PCATM -96

ViaCount® Flex Reagent. O núcleo das células viáveis foi corado em vermelho. A

especificidade do marcador não permite corar debris celulares, uma vez que estes

não apresentam núcleo. Não obstante, a quantificação realizada pelo citômetro de

fluxo baseia-se na avaliação individual de cada evento, ou seja, célula, através do

capilar submetido à irradiação laser, proporcionando uma quantificação mais

confiável uma vez que os valores obtidos sejam livres de víeis conferindo médias

grupais mais próximas da realidade.

Baseando-nos nas peculiaridades de cada método quantitativo para a

estimativa da porcentagem da viabilidade celular, acreditamos que o emprego de

técnicas de citometria de fluxo apresente resultados confiáveis em comparação à

câmara de Neubauer, hipótese que testamos comparando-se os resultados

obtidos por ambos métodos.

As análises dos resultados da quantificação tanto em câmara de Neubauer

quanto em citômetro de fluxo foram primariamente baseadas no índice do

coeficiente de variação (CV), convencionalmente adotando-se os valores próximos

a 1 que determina maior confiabilidade dos resultados obtidos pela metodologia

empregada. Deste modo, observamos melhores índices na quantificação realizada

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Silva, W.F.

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por citometria de fluxo em comparação à câmara de Neubauer, fato este que

embasa a nossa preferência e alteração do método de quantificação previamente

adotado conforme os objetivos iniciais da presente pesquisa.

6.2 MEIOS DE CONGELAMENTO

A análise dos meios de congelamento que empregamos, permite-nos

verificar alternância de dois aspectos inerentes a todos os protocolos: 1)

disponibilidade de nutrientes e 2) capacidade de criopreservação.

6.2.1 Disponibilidade de nutrientes

Quanto à disponibilidade de nutrientes utilizamos concentrações distintas

de 40% para DMEM, RPMI e SFB correspondente aos protocolos A, B e C

acrescidos com 40% de plasma e 20% de DMSO (criopreservante) cada. A

avaliação após 45 dias de congelamento revelou que o SFB proveu uma

viabilidade celular de 29,92% (C), seguido por DMEM com 26,67% (B) e por último

RPMI com 22,66% (A). De mesmo modo, as análises dos resultados apresentados

pelos meios A, B e C aos 60 dias de congelamento, demonstrou índices similares

aos 45 dias sendo SFB 29,17% (C), seguido de DMEM com 22,11% (B) e RPMI

com 21,37% (A).

O fato do soro fetal bovino (SFB) apresentar melhores índices de

viabilidade das células mononucleares totais de suínos aos 45 e 60 dias pós-

congelamento, leva-nos a supor que este fato possa estar relacionado ou à maior

acessibilidade dos nutrientes presentes no SFB ou que estes nutrientes devam

sofrer menor degradação durante o período. Deste modo, acreditamos poder

inferir que o SFB a 40% acrescidos a protocolos apresentando 20% de DMSO

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(crioprotetor) destaca-se dentre os demais meios de cultura utilizados nos meios

de congelamento.

Seguindo-se a análise dos meios contendo concentrações elevadas a

47,5% de DMEM, RPMI, e SFB em 40% de plasma e 5% DMSO (criopreservante)

referentes aos protocolos E, F, e G respectivamente, foi possível observar que aos

45 e 60 dias, os meios contendo RPMI apresentaram melhores índices de

viabilidade celular, 16,19% / 23,29% (F), seguido de DMEM co 15,34% / 14,95%

(E) e SFB com 11,38% / 13,81% (G). A alteração na posição do ranking de

viabilidade celular apresentada entre os meios enriquecidos com RPMI e SFB

deva relacionar-se tanto mais à concentração do criopreservante (DMSO) do que

ao enriquecimento do meio, conforme discutiremos no capitulo referente a

capacidade de criopreservação.

Após as análises dos resultados das amostras descongeladas com 45 dias

de criopreservação, compostas apenas por plasma autólogo e DMSO na

proporção 80% plasma e 20% DMSO para o protocolo D e 95% plasma e 5%

DMSO para protocolo H, observamos uma maior viabilidade das células no

protocolo D com índices de 62,40% e H com 24,87%.

Acreditamos que os melhores índices apresentados pelos protocolos

contendo apenas plasma autólogo (D e H) em comparação aos meios A, B, C, E,

F e G possam relacionar-se ao nível dos componentes nutritivos disponíveis no

plasma em superioridade aos demais meios comerciais (DMEM e RPMI) e soro

fetal bovino (meio heterólogo), uma vez que, seus níveis devam apresentar-se de

modo similar ao in situ para as células.

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Silva, W.F.

71

6.2.2 Capacidade de criopreservação

Observamos que os protocolos contendo 20% DMSO (A, B, C e D) tiveram

maior média de viabilidade tanto para o período de 45 dias de congelamento

quanto para o período de 60 dias, quando comparados aos protocolos E, F, G e H

com concentração de 5% DMSO. Esta constatação deixa claro que o DMSO em

maior concentração também possa propiciar maior proteção ou conservação às

células de suínos, como ocorrido com células tronco hematopoiéticas humanas

em relatos de Galmes et al. (2007).

De acordo com a literatura, o DMSO em concentrações altas (30%) torna-

se tóxico para as células, preconiza-se o uso deste crioprotetor em concentrações

de 5%, 10% e 20%, sendo a última pouco utilizada (MASSUMOTO; MIZUKAMI

2000), segundo Galmes et al. (2007) células tronco hematopoiéticas

criopreservadas em solução contendo 5% de DMSO apresentaram regeneração

hematológica mais lenta quando comparadas ao grupo criopreservado a 10%

DMSO, sugerindo então que a concentração de 10% DMSO aumenta a proteção

ou conservação das células, o que pode ocorrer com células criopreservadas em

solução com 20% DMSO. Essa queda na viabilidade deve ser relacionada aos

danos celulares causados durante a criopreservação pela formação de cristais de

gelo e no descongelamento.

As células colocadas em cultivo demonstraram pouca capacidade de

adesão nas placas e se mantiveram viáveis por 7 dias, talvez seja necessário o

uso de um meio de cultura mais rico em nutrientes apropriado para células

criopreservadas devido aos danos causados durante os processos de

criopreservação e descongelamento.

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Considerações Finais

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7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Em função dos resultados obtidos achamos por bem elencar alguns pontos

importantes para que as viabilidades celulares não decaiam tanto durante e após

o processo de criopreservação. É importante testar concentrações maiores dos

meios responsáveis pela nutrição das células como também aferir o tempo de vida

útil que o meio terá quando exposto a temperaturas baixas por períodos

prolongados de congelamento. Outro fator importante é suplementar esses meios

e/ou fazer associações de soluções comumente usadas na nutrição de células

com intuito de oferecer maior quantidade de nutrientes em maior concentração por

longo períodos de criopreservação.

Os crioprotetores também são de extrema importância no processo de

congelamento e por isso sua toxicidade deve ser levada em consideração. Os

crioprotetores penetrantes são os mais utilizados e também são tóxicos para as

células quando usados em altas concentrações, para minimizar esse efeito

normalmente letal pode-se acrescentar a solução de congelamento um

crioprotetor não penetrante tais como: monossacarídeos, frutose, glicose, etc., e

com isso reduzir a concentração que será usada da solução penetrante.

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Conclusões

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8 CONCLUSÕES

Baseando-se nos métodos aplicados e nos resultados obtidos podemos

concluir que:

1. Para a quantificação da viabilidade das células mononucleares totais de

medula óssea de suínos, o melhor método é a citometria de fluxo com o

auxílio de um marcador fluorescente para o núcleo das células que irá

diferenciar as vivas das células mortas com maior confiabilidade.

2. Os meios comumente usados na criopreservação (DMEM, RPMI e

SFB), devem ser suplementados para fornecer nutrientes em maior

quantidade e concentração.

3. O plasma autólogo pode ser usado em concentrações altas como meio

de nutrição para as células sem associação com um meio heterólogo.

4. O DMSO em concentração de 5% para células mononucleares de

suínos associado aos meios de cultivo não forneceu crioproteção

suficiente para evitar morte celular.

5. A melhor concentração do crioprotetor DMSO para células

mononucleares de suínos foi de 20%.

6. Quando colocadas em cultivo pós-congelamento, mesmo por um

período curto, as células mononucleares de suínos necessitam de meios

mais suplementados para se expandirem.

7. Dos protocolos testados, os mais eficientes na criopreservação foram o

D seguido pelo H, já os protocolos menos eficientes foram: C, A, B, F, E,

G em ordem decrescente.

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Referências

Bibliográficas

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Silva, W.F. 77

REFERÊNCIAS

AIRD, W.; LABOPIN, M.; GORIN, N. C. Long-term cryopreservation of human stem cells. Bone Marrow Transplantation, v. 9, p.487-490, 1992. AMOS, T.; GORDON, M. Sources of human hematopoietic stem cells for transplantation. Cell Transplantation, v. 4, p. 547-569, 1995.

AREMAN, E.; SACHER, R.; DEEG, H. Processing and storage of human bone marrow: A survey of current practices in North America. Bone Marrow Transplantation, v. 6, p.203-209, 1990.

AREMAN, E. M.; SACHER, R. A.; DEEG, H. J. Cryopreservation and storage of

human bone marrow: A survey of current practices. Progress in Clinical and Biological Research, v. 9, p. 333-523, 1990.

BARNES, D. W. H.; LOUTIT, J. F. The radiation recovery factor: preservation by the polge-smith-parkes technique. Journal of the National Cancer Institute, v. 15, p. 90, 1955.

BATESON, E. A. J.; BUSZA, A. L.; PEGG, D. E.; TAYLOR, M. J. Permeation of rabbit common carotid arteries with dimethyl-sulfoxide. Cryobiology, v. 31, p. 393-397 (1994).

BIDAULT, N. P.; HAMMER, B. E.; HUBEL, A. Rapid MR image of cryoprotectant permeation in an engineered dermal replacement. Cryobiology, v. 40, p. 13-26, 2000.BITTENCOURT, H.; ROCHA, V. A célula-Tronco Hematopoiética e seu uso clínico. In: ZAGO, M. A.; COVAS, D.T. Células-tronco a nova fronteira da medicina. SãoPaulo: Editora Atheneu, 2006. p. 122.

BRUDER , S. P.; JAISWAL, E.; HAYNESWORTH, E. Growth kinetics, self-renew-al,

and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during

extensive sucultivation and following cryopreservation. Journal of cellular Biochemistry,v. 64, p.278-294, 1997.

CELL proliferation and viability measurement. Biochemica, nº 3, 2003. Disponível em: <www.roche-applied-science.com/apoptosis>. Acesso em: 20 set. 2005.

CROW, S. E.;WALSHAW,S.O.Manual de procedimentos clínicos em cães, gatos e coelhos. São Paulo: Artmed, 2000. p. 279.

Page 78: Walkiria Ferreira Silva - teses.usp.br · WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos

Silva, W.F. 78

DAVIS, J. M.;ROWLEY,S.D.;BRAINE,H.G.;PIANTADOSI,S.; SANTOS, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood, v. 75, p. 781-786,1990.

DE VRIES, E. G.; VELLENGA, E.; KLUIN-NELEMANS, J. C. The happy destiny of frozen haematopoietic stem cell: from immature stem cells to mature applications. European journal of cancer care, v. 40, p. 1987-1992, 2004.

DONNENBERG, A. D.; KOCH, E. K.; GRIFFIN, D. L.; STANCZAK, H. M.; KISS, J. E.; CARLOS, T. M.; BUCHBARKER, D. M.; YEAGER, A. M. Viability of cryopreserved BM progenitor cells stored for more than a decade. Cytotherapy, v. 4, n. 2, p. 157-163, 2002.

ELLIOT, C.; MCCARTHY, D. A Survey of methods of processing and storage of bone marrow and blood stem cells in the EBMT. Bone Marrow Transplantation, v.14, p. 419-423, 1994.

ELMOAZZEN, H. Y.; ELLIOT, J. A. W.; MCGANN, L. E. Cryoprotectant equilibration in tissues. Cryobiology, v. 51, p. 85-91, 2005.

FATHY, G. M.; McFARLANE, D. R.; ANGELL, C. A.; MERYMAN, C. A. Vitrificationas an approach to cryopreservation. Cryobiololy, v.21, n. 4, p. 407-426,1984.FERRARI, G.; CUSELLA-DE ANGELIS, G.; COLETTA, M. Muscle regeneration by bone marrow derived myogenic progenitors. Science. v. 279, p. 1528-30,1998.

FLEMING, K. K.; HUBEL, A. Cryopreservation of hematopoietic and non-hematopoietic stem cells. Transfusion and Apheresis Science, v. 34, p. 309-315, 2006.

FONTES, A. M.; ORELLANA, M. D.; PRATA, K. L. Células-Tronco e seus Métodos de Estudo.p. 100-101. In: ZAGO, M. A.; COVAS, D. T. Células-tronco a nova fronteira da medicina. São Paulo: Editora Atheneu, 2006. FULLER, B.J.; BUSZA, A.L.; PROCTOR, E. Studies on cryoprotectant equilibration in the intact rat-liver using nuclear magnetic resonance spectroscopy-a noninvasive method to assess distribution of dimethyl-sulfoxide in tissues. Cryobiology, v. 26, n. 2, p. 112-118,1989. FULLER, B. J.; BUSZA, A. L. Proton NMR-studies on the permeation of tissue fragments by dimethyl-sulfoxide – liver as a model for compact tissues. Cryobiology, v. 15, p. 131-134,1995.

FUKUDA, K. Development od regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stemcells for cardiovascular tissue engineering. Journal of Artificial Organs, v. 25, p. 187-193, 2001.

Page 79: Walkiria Ferreira Silva - teses.usp.br · WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos

Silva, W.F. 79

GALMES,A.;BESALDUCH,J.;BARGAY,J.;MATAMOROS,N.;MOREY,M.;NOVO,A.; SAMPOL, A. A simplified method for cryopreservation of hematopoietic stem cells with -08º degrees C mechanical freezer with dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant. Leukemia & Lymphoma, v. 17, n. 1-2, p. 181-184,1995.

GALMES, A.; BESALDUCH, J.; BARGAY, J. MATAMOROS, N.; DURAN, M. A.; MOREY, M. Cryopreservation of hematopoietic progenitor cells with 5-percent dimethyl-sulfoxide at -80 degrees C without rate-controlled freezing. Transfusion, v. 36, p. 794-797, 1996.

GALMES, A.; BESALDUCH, J.; BARGAY, J.; MATAMOROS, N.; MOREY, M.; NOVO, A.; GUERRA, J. M. Long-term storage at -80 degrees C of hematopoietic progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant. Transfusion, v. 39, p. 70-73,1999.

GALMES, A.; GUTIÉRREZ, A.; SAMPOL, A.; CANARO, M.; MOREY, M.; IGLESIAS, J.; MATAMOROS, N.; DURAN, M. A.; NOVO, A.; BEA, M. D.; GALÁN, P.; BALANSAT, J.; MARTINÉZ, J.; BARGAY, J.; BESALDUCH, J. Long-term hemtologic reconstitution and clinical evaluation of autologous peripheral blood stem cell transplantation after cryopreservation of cells with 5% and 10% dimethilsulfoxide at -80ºC in a mechanical freezer. The Hematology Journal, v. 92, n. 7, p. 986-989, 2007.

GOODELL, M. A.; JACKSON, K. A.; MAJKA, S. M. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 938, p. 208-220, 2001.

HAIDER, H.; ASHRAF, M. Bone marrow stem cell transplantation for cardiac repair. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology, v. 288, n. 67, p. 2557-2567, 2005.

HIDEMASA, O.; BRADFUTE, S. B.; GALLARDO, T. D.; NAKAMURA, T.; GAUSSIN, V.; MISHINA,Y.; POCIUS, J.; MICHAEL, L. H.; BEHRINGER, R. R.;GARRY, D. J.; ESTMAN, M. L.; SCHNEIDER, M. D. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS online, v.100, n. 21, p. 12313-12318, 2003.

HUBEL, A. Parameters of cell freezing: Implications for the cryopreservation of stem cells. Transfusion Medicine Reviews, v. 11, n. 3, p. 224-233, 1997.

IKEHARA, S. Bone marrow transplantation: a new strategy for intractable diseases. Drugs of today, v. 38, p. 103-111, 2002.

Page 80: Walkiria Ferreira Silva - teses.usp.br · WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos

Silva, W.F. 80

ISBELL, S.A. Development of a protocol for the quantitative evaluation of contrast in NMR images for cryoprotective solvents in intact tissues. Cryobiology,v.34, p. 165-175, 1997.

ISBELL, S. A.; FYFE, C. A.; AMMONS, R. L .M.; PEARSON, B. Mensurement of cryoprotective solvent penetration into intact organ tissues using high-field NMR micromaging. Cryobiology, v. 35, p. 165-172, 1997.

KARLSSON, J. O. M.; TONER, M. Long-term storage of tissues by cryopreservation: critical issues. Biomaterials, v. 17, p. 243-256, 1996. KAWANO, Y.; LEE, C. L.; WATANABE, T.; ABE, T.; SUZUYA, H.; OKAMOTO, Y.; MAKIMOTO, A.; NAKAGAWA, R.; WATANABE, H.; TAKAUE, Y. Cryopreservation of mobilized blood stem cells at a higher cell concentration without the use of a programad freezer. Annals of Hematology, v. 83, n. 1, p. 50-54, 2004.

KRAUSE, D. S. Plasticity of marrow derived stem cell. Human Gene Therapy, v. 9, p. 754-758, 2002.

KULESHOVA, L. L.; GOUK, S. S.; HUTMACHER, D. W. Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs. Biomaterials, v. 28, p. 1585-1596, 2007.

LAKEY, J. R. T.; HELMS, L. M. H.; MOSER, G.; LIX, B. SLUPSKY, C. M.; REBEYKA, I. M.; SYKES, B. D.; McGANN, L. E. Dynamics of cryoprotectant permeation in porcine heart valve laflets. Cell Transplantation, v.12, p. 123-128, 2003.

LASKY, L. VANBUREN, N. WEISDORF, D. Successful allogeneic cryopreserved marrow transplantation. Transfusion, v. 29, p. 182-189, 1989.

LAW, P.; MERYMAN, H. Cryopreservation of human bone marrow grafts. In gee A. Bone marrow processing and purging. A pratical guide. 1 ed, Florida: CRCPress, 1991. p. 332-40.

LIU, P. I.; POON, K. C.; CROOK, L.; LIU, S. S.; EGUCHI, M. In vitro and in vivo assessment of the viability of cryopreserved postmortem murine bone marrow cells. Annals of Clinical Laboratory Science, v. 10, n. 2, p. 165-168,1980.

MALOUF, N. N.; COLEMAN, W. B.; GRISHAM, J. W. Adult derived stem cells from the liver become myocytes in the heart in vivo. The American Journal of Pathology, v. 158, p. 1929-1935, 2001.

Page 81: Walkiria Ferreira Silva - teses.usp.br · WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos

Silva, W.F. 81

MASSUMOTO, C. M.; MENDRONI, A.; CARBONELL, A. L.; MOTA, M. A.; MIZUKAMI, S. Mobilização e coleta de células-tronco hematopoéticas de sangue periférico. Revista de Hematologia e Hemoterapia, v. 2, p. 224-227, 1996.

MASSUMOTO, C.; MIZUKAMI, S. Autologus bone marrow transplantation and postransplant immunotherapy. Medicina, Ribeirão Preto, v. 33, p. 405-414, 2000.

MUKAIDA, T.; WADA, S.; TAKAHASHI, K.; PEDRO, P. B.; AN, T. Z.; KASAI, M. Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos. Human Reprotuction, v. 13, n. 10, p. 2874-2879,1998.

MULDREW, K.; SYKES, B.; SCHACHAR, N.; MCGANN, L. E. Permeation kinetics of dimethyl sulfoxide in articular cartilage.Cryobiology, v. 17, p. 331-340, 1996.

PARKER, L. M.; BINDER, N.; GEMAN, R.; RICHMAN, C. M.; WEINER, R. S.; YANKEE, R. A. Prolonged cryopreservation of human bone marrow.Transplantation, v. 31, n. 6, p. 454-457, 1981.

PETTENGELL, R.; WOLL, P. J.; CONNOR, D. A.; DEXTER, T. M.; TESTA, N. G. Viability of haemopoietic progenitors from whole blood, bone marrow and leukapheresis product: effects of storage media, temperature and time. Bone Marrow Transplantation, v. 14, n. 5, p. 703-709, 1994.

PROCKOP, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science, v. 279, p. 71-74, 1997.

RE, A.; VIAJAYARAGHAVAN, K.; BASADE, M. M.; HE, S.; GULATI, S.C. Long-term cryopreservation: successful trilineage engraftment after autololous bone marrow transplantation with bone marrow cryopreserved for sevens years. Journal of Hematotherapy, v. 7, n. 2, p. 185-188, 1998.

ROWLEY, S. D. Techniques of bone marrow and stem cell cryopeservation and storage. In american association of blood banks. 1992. p. 105-127.

SCORSIN, M.; HAGEGE, A. A.; MAROTTE, F. Does transplantation of cardiomyocytes improve function of infarcted myocardium? Circulation, v. 96, p. 188-193, 1997.

SPURR, E. E.; WIGGINS, N. E.; MARSDEN, K. A.; LOWENTHAL, R. M.; RAGG, S. J. Cryopreserved human haematopoietic stem cells retain engraftment potential after extended (5-14 years) cryostorage. Cryobiology, v. 44, p. 210-217, 2002.

SPUTTEK, A.; SPUTTEK, R. Cryopreservation in transfusion medicine and hematology. In Life in the frozen state. Boca Raton, FL: CRC Press, p. 483-504, 2004.

Page 82: Walkiria Ferreira Silva - teses.usp.br · WALKIRIA FERREIRA SILVA Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de suínos em diferentes protocolos

Silva, W.F. 82

SPUTTEK, A. Cryopresevation of red blood cells platelets lymphocytes and stem cells. In Clinical Applications of Cryobiology. Boca Raton, FL: CRC Press, p. 95-147, 1991.

STRAUER, B. E.; BREHM, M.; ZEUS, T. Myocardial regeneration after intracoronay transplantation of human autologous stem cells pollwing acute myocardial infartion. Dtsch Méd Wochenschr, v. 126, n. 34-35, p. 932-938,2001.

STRONCEK, D. F.; FAUSTSCH, S. K.; LASKY, L. C.; HURD, D. D.; RAMSAY, N. K.; McCULLOUGH, J. Adverse reactions in patients transfused with cryopreserved marrow. Transfusion, v. 31, p. 521-526, 1991.

SUSSMAN, M. Cardiovascular biology. Hearts and Bones. Nature, n. 410, p. 410:640-641, 2001.

TAYLOR, N. J.; BUSZA, A. L. A convenient, noninvasive method for mensuring the kinetics of permeation of dimethyl-sulfoxide indo isolated corneas using Nmr-spectroscopy. Cryobiology, v. 13, p. 273-282, 1992. TONER, M. Nucleation of ice crystals inside biological cells. In steponkus, P. (Ed.). Low-temperature biology. London England: JAI Press, 1993. p. 1-51. VALDEZ, C. A.; MAZNI, O. A.; TAKAHASHI, Y.; FUJIKAWA, S.; KANAGAWA, H. Successful cryopreservation of mouse blastocysts using a new vitrification solution. Journal of Reproduction and Fertility, v. 96, n. 2, p. 793-802, 1998.

WALCERZ, D. B.; TAYLOR, M. J.; BUSZA, A. L. Determination of the kinetics of permeation of dimethyl-sulfoxide in isolated corneas. Cell Biophysics, v. 26, p. 79-102, 1995. WALTER, Z.; SZOSTEK, M.; WEGLARSKA, D.; RAGUSZEWSKA, D.; JABLONSKI, M.; LORENZ, F.; SKOTNICKI, A. B. Methodes for freezing, thawing and viability estimation of hemopoietic stem cells. Przegl Lek, v. 56, p. 35-39, 1999. (Suplemento, 1).

WEINER, R. S.; TOBIAS, J. S.; YANKEE, R. A. The processing or human bone marrow for cryopreservation and reinfusion. Biomedicine, v. 24, n. 4, p. 226-231, 1976.

ZAMBELLI, A.; POGGI, G.; DA PRADA, G.; PEDRAZZOLI, P.; CUOMO, A.; MIOTTI,D. Clinical toxicity of cryopreserved circulating progenitor cells infusion. Anticancer Research, v. 18, p. 4705-4708, 1998.

ZIGGER, M. A. J.; TREDGET, E. E.; SYKES, B. D.; McGANN, L. E. Injury and protection in split-thickness skin after very rapid cooling and warning. Cryobiology, v.35, p. 53-69, 1997.