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Dezembro - 2012
Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira
Workshop de Validação de Metodologia Analítica
• Apresentar a teoria de validação de métodos à luz da Anvisa,
traçando paralelo com outras normas nacionais e
internacionais;
• Estimular análise crítica a respeito do tema;
• Mostrar a importância da leitura de artigos científicos, pois
nenhum tema é esgotado por si só em regulamentos
técnicos;
• Na legislação encontramos “o que deve ser feito” e “não o
como fazer”;
• Refletir a respeito da construção do conhecimento em nossa
prática diária e a contribuição desta para o regulatório.
Objetivos da Palestra
Introdução à Validação
Validação
Definição:
Validação é um ato documentado que atesta que qualquer
procedimento, processo, equipamento, material, atividade ou sistema realmente e consistentemente leva aos
resultados esperados. (RDC nº 17/2010)
“Os estudos de validação são parte essencial das BPF e
devem ser conduzidos de acordo com Protocolos pré-
definidos e aprovados. Relatório (...) contendo os
resultados e conclusões devem ser preparados e
arquivados.” (RDC nº 17/2010)
Validação
Plano Mestre de Validação
“Planejamento de todas as atividades de validação com os
objetivos, procedimentos, prazos e responsabilidades
definidos.”
Deve conter no mínimo: RDC nº 17/2010
I - uma política de validação;
II - estrutura organizacional das atividades de validação;
III - sumário (situação atual e programação);
IV - modelos de documentos ou referência a eles;
V - planejamento e cronograma;
VI - controle de mudanças; e
VII - referências a outros documentos existentes.
É um plano escrito que descreve como a validação será conduzida, definindo os critérios de aceitação.
Inclui:
Pontos de decisão e responsabilidades
Lista de equipamentos
Parâmetros de teste
Desenho experimental
Dados que devem ser coletados e medidos
Documentos inerentes
Protocolo de Validação
É um resumo ou sumário do processo de validação, contendo todos os dados e resultados
obtidos. Deve concluir se os critérios de aceitação foram atingidos e relatar as não conformidades.
Relatório de Validação
Validação da Metodologia
Analítica
Validação de Metodologia Analítica
É o processo pelo qual se estabelece, através de
estudos laboratoriais, que as características de
performance do método, também denominadas
parâmetros de validação, apresentam os requisitos
necessários para aplicação analítica pretendida.
(USP 36).
Definição:
Objetivo:
“A validação dos procedimentos analíticos tem por
objetivo demonstrar que os métodos de ensaio
utilizados apresentam resultados que permitem avaliar
objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme
os parâmetros especificados.”
Validação de Metodologia Analítica
A Anvisa ressalta a importância da qualidade analítica
dos resultados como um dos instrumentos
fundamentais para a proteção e promoção da saúde
da população. (Guia para qualidade em química
analítica)
Validação de Metodologia Analítica
Verificar adequação ao uso;
Identificar fontes potenciais de erros;
Conhecer as variáveis críticas;
Apresentar prova de que o método pode ser usado
para tomada de decisão;
Satisfazer especificações / requisitos legais;
EURACHEM, 1998
Validação de Metodologia Analítica
Uma das ferramenta que garante a qualidade analítica dos
resultados. Permite:
Definições
Método Normalizado:
É aquele desenvolvido por um organismo de
normalização ou outras organizações, cujos métodos
são aceitos pelo setor técnico em questão. (INMETRO -
DOQ-CGRE-008/2011)
Estão aqui incluídos os Métodos Farmacopéicos.
Definições
Método Não Normalizado:
É aquele desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras
partes (por exemplo: pelo laboratório produtor do
medicamento), ou adaptados a partir de métodos
normalizados e validados. (INMETRO - DOQ-CGRE-
008/2011)
Quando Efetuar a Validação do Método?
Método não normalizado
Método criado/desenvolvido pelo próprio laboratório
Ampliações / Modificações dos métodos normalizados
Método normalizado usado fora do escopo indicado
Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011).
Segundo a Anvisa (RE 899/2003).
No caso de metodologia analítica não descrita em
farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente
reconhecido pela Anvisa, deverá ser validada.
Quando Efetuar a Validação do Método?
A metodologia analítica deverá ser revalidada:
Mudanças na síntese da substância ativa;
Mudanças na composição do produto acabado;
Mudanças no procedimento analítico.
Segundo a RE 899/2003.
Determinadas outras mudanças podem requerer validação.
Quando Efetuar a Revalidação do Método?
pH da fase móvel (CLAE) + 0,2 unidades,
Concentração de sais no tampão (CLAE) + 10% (absoluto),
Relação de componentes da fase móvel (CLAE) + 30% (relativo),
Nenhum componente pode ser reduzido a zero (CLAE) ,
Comprimento de onda (CLAE) + 3 nm,
Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%,
Diâmetro interno da coluna (CLAE) + 50%, (CG) + 25%,
Velocidade de fluxo + 50%,
Revisão: Pharmacopeial Forum 31(3), pag. 834 – 835 .
Modificação x Ajuste
Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados?
No caso de metodologias analítica descrita em
farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será
considerada validada. (RE 899/2003)
O laboratório deve confirmar que tem competência para
aplicar o método de modo apropriado e que atinge o
pretendido e que opera bem sob as condições normais de
uso.(DOQ-CGCRE-008-INMETRO/2011)
Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados?
Para usar metodologia analítica descrita na USP-NF é necessário verificar sua adequação nas
condições atuais de uso.
Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados?
Estratégia para Validação de Métodos Normalizados
Definir escopo da aplicação
O método atende ?
N Validação
completa
Verificar competência do
laboratório
S
Documentar resultados
Definição:
Evidência documentada que um método previamente validado desempenha como pretendido, no ambiente em que está sendo aplicado.
O que é Verificação?
Segundo a RDC Nº. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010
Validação parcial para método de teor.
Especificidade, linearidade, exatidão, precisão
(repetibiliddae e intermediária) e intervalo.
Verificar a especificidade, a estabilidade da solução da
amostra e a precisão intermediária.
Segundo o FDA.
Verificação da competência analítica.
Validação
Otimização Desenvolvimento
Estratégia para Validação de Métodos Não Normalizados
Resultado obtido com colunas cromatográficas diferentes.
Desenvolvimento/Otimização
T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.
Coluna
cromatográfica
T
k’
N
C18 1,63 8,93 1969
C8 1,27 9,76 5175
Resultados referentes à variação proporção da fase móvel.
Desenvolvimento/Otimização
Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos
teóricos.
Proporção da fase móvel Rt T k’ N
75:25 2,93 1,51 4,87 3320
80:20 3,79 1,39 6,58 4055
85:15 5,32 1,27 9,65 5249
Desenvolvimento/Otimização
Resultados referentes à variação de pH da fase móvel (85:15).
Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos
teóricos.
pH Rt T k’ N
5,0 5,44 1,29 9,88 5208
6,0 5,45 1,28 9,89 5252
6,5 5,38 1,28 9,77 5165
No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou
formulários oficiais.
Robustez
LQ e LD
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Precisão intermediária
Especificidade e Seletividade
Linearidade
Intervalo
Precisão
Exatidão De acordo com
a classificação
do teste segundo
sua finalidade.
Segundo a RE 899.
Validação de Metodologia Analítica
Classificação dos testes segundo sua finalidade
Categoria Finalidade do teste
I Testes quantitativos para determinação do
princípio ativo em produtos farmacêuticos ou
matérias-primas.
II Testes quantitativos ou ensaio limite para
determinação de impurezas e produtos de
degradação em produtos farmacêuticos ou
matérias-primas.
III Testes de performance (por exemplo: dissolução,
liberação do ativo)
IV Testes de identificação.
Definir o objetivo do método;
Definir os parâmetros de desempenho e critérios de aceitação;
Desenvolver o PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO;
Definir os experimentos de validação – conhecer bem o método antes de iniciar a validação;
Executar os experimentos preliminares (definição dos testes de conformidades do sistema);
Ajustar os parâmetros do método se necessário;
Realizar os experimentos completos de validação - Executar o protocolo de validação;
Desenvolva POP para a execução do método, na rotina;
Prepare o RELATÓRIO DE VALIDAÇÃO.
Planejamento (passos) da Validação.
Ensaios necessários para a validação do método.
Categoria IV
Categoria III
Categoria II
Quantitativo Ensaio limite
Categoria I Parâmetro
Especificidade SIM SIM SIM SIM
Linearidade SIM SIM
SIM SIM Intervalo
*
*
LD
LQ
Exatidão
Robustez
Precisão SIM SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
** **
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
*
Repe
Inter
*
NÃO
SIM
SIM
*
**
*
*
*
SIM
NÃO NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.
** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária.
Teste de Adequação do Sistema
Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da adequação do sistema (SHABIR, 2003)
Parâmetros Recomendações
Fator de capacidade (k') O pico deve estar bem resolvido de outros
picos e do volume morto k' 2,0.
Repetitividade É desejável um DPR 1% para N 5
Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada
Resolução (R)
R 2 entre o pico de interesse e o potencial
interferente que elui mais próximo
Fator de cauda (T) T 2
Número de pratos teóricos (N) Em geral deve ser 2000
Definição dos Parâmetros de
Validação
Definição dos Parâmetros de Validação
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.
Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário demonstrar a capacidade de discriminação do método.
Especificidade
Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas comparação dos resultados obtidos de amostras contaminadas (impurezas ou excipientes) com amostras não contaminadas –
demonstrar que o resultado do teste não é afetado.
Impureza ou produto de
degradação não disponíveis
Utilizar amostras armazenadas sob
condições de estresse (Ex: luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica,
oxidação).
Definição dos Parâmetros de Validação
Especificidade
Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos.
Detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas.
Plano Experimental
Análise Qualitativa – Identificação
Preparar um placebo (matriz),
Contaminar o placebo com o material de referência,
Comprovar o resultado positivo para o placebo contaminado com o material de referência e o resultado negativo para a matriz em branco.
Especificidade
2.41
2.94
3.10
4.39
5.28, Didanosina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma do Padrão 100%.
N
N
N
NH
O
OHO
3.29
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma do Placebo.
2.41
2.94
3.10
3.33
4.39
5.29, Didanosina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
Intensity (mV)
Cromatograma do Placebo contaminado.
N
N
N
NH
O
OHO
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Resolução entre picos adjacentes, do componente principal e outros componentes (Rs) > 2.
Impurezas e produtos de degradação não disponíveis, submeter
amostras a condições de estresse: exposição a temperatura, exposição a luz, hidrólise ácida (HCl 0,1N), hidrólise alcalina (NaOH 0,1N) e Oxidação (H2O2 3%). Comparar os resultados obtidos com as amostras degradadas e não degradadas.
Plano Experimental
Especificidade
Cromatograma obtido após exposição à temperatura de 1000 C
2.48
3.03
3.18
4.83
5.48, Didanosina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma obtido após exposição à solução de ácido clorídrico 0,1N.
2.49
3.26
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
100
200
300
400
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma obtido após exposição à solução de peróxido de
hidrogênio 3 %
0.24
1.62
2.30
2.51
3.26
3.96
4.59
5.66, Didanosina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma após injeção da solução de hipoxantina
2.54, Hipoxantina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Cromatograma obtido após injeção da solução de Didanosina
contaminada com hipoxantina, R= 13,51
2.51, Hipoxantina
3.34
5.79, Didanosina
0 1 2 3 4 5 6 7
Retention Time (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
Intensity (mV)
Exemplo de um estudo de Especificidade.
Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise
de, no mínimo, 5 concentrações diferentes.
Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.
Estas concentrações devem seguir os intervalos da tabela a seguir:
Definição dos Parâmetros de Validação
Limites percentuais do teor do analito que devem estar contidos no
intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos.
Ensaio Alcance
Determinação quantitativa do analito em
matérias-primas ou em formas farmacêuticas
De 80% a 120% da concentração teórica
do teste.
Determinação de impurezas Do nível de impureza esperado até 120%
do limite máximo especificado. Quando apresentarem importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os
limites de quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de
impurezas a serem controladas.
Uniformidade de conteúdo De 70% a 130% da concentração teórica
do teste.
Ensaio de dissolução De ± 20% sobre o valor especificado para
o intervalo. Caso a especificação para a dissolução envolva mais de um tempo, o alcance do método deve incluir –20%
sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor.
Plano Experimental
Preparar uma solução mãe da substância química de
referência e a partir desta, diluições a fim de obtermos
soluções em cinco níveis de concentração. Por exemplo:
50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.
Linearidade
Elaborar Curva de Calibração
Calcular coeficiente angular (b)
Calcular coeficiente linear (a)
Cálculo do coeficiente de correlação linear (r)
Cálculo do erro padrão da estimativa (desvio padrão residual), (Se)
Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE)
Calcular a Média, Variância o DP e o DPR . Prosseguir com
os seguintes cálculos.
Cálculos Estatísticos
Linearidade
Um resultado analítico afetado por erro grosseiro difere, quase
sempre de modo visível, dos demais resultados do conjunto das
determinações executadas (replicatas) em paralelo na mesma amostra.
Determinação de Valores Aberrantes.
Tais resultados são denominados aberrantes, comprometendo a
precisão e a exatidão do resultado final.
Portanto o tratamento estatístico dos dados inicia-se pela detecção
de valores aberrantes, que pode ser realizado através do teste de
Grubbs.
Este teste estatístico pode ser aplicado quando se deseja verificar se
o menor valor ou o maior valor é aberrante, denominado teste de
Grubbs para um valor aberrante, onde n 3.
Cálculos Estatísticos
s
xxG
i
Em função do número de replicatas (n) e um nível de significância .
Onde :
= valor suspeito de ser aberrante.
= média dos valores obtidos.
= desvio padrão dos valores obtidos.
ix
x
s
Teste de Grubbs.
Se G calculado > G tabelado ----- valor suspeito é considerado
aberrante, e então descartado.
Se G calculado < G tabelado ------- valor suspeito não é considerado
aberrante.
Cálculos Estatísticos
Determinação de valor aberrante. Teste de Grubbs
Estudo de caso.
s
xxG
i
Gcalc > Gtab
x s= 74,76 = 0,75 Aberrante, portanto, é descartado.
Cálculos Estatísticos
Gtab = 1,89
Padrão 50 % Padrão 75 % Padrão 100 % Padrão 125 % Padrão 150 %
Replicata 1 49,94 75,10 100,18 124,35 148,43
Replicata 2 49,88 75,00 100,07 124,31 148,44
Replicata 3 49,99 75,14 99,78 124,15 148,25
Replicata 4 49,96 73,23 99,95 124,04 148,26
Replicata 5 49,99 75,00 99,93 124,43 148,23
Replicata 6 49,99 75,09 100,10 124,30 148,19
04,2
75,0
76,7423,73
G
A variância é calculada dividindo o somatório dos quadrados dos
desvios de cada valor em relação à média, pelo número de graus de
liberdade (n-1).
Variância (s2 ou V).
1
2
2
n
xxs
i
Desvio padrão é igual a raiz quadrada positiva da variância. Deve
ser expresso com dois algarismos significativos.
Desvio padrão (s ou DP).
1
2
n
xxs
i
Cálculos Estatísticos
Cálculos Estatísticos
Homocedasticidade Verificar a homocedasticidade, ou seja, a independência da variância
das respostas do método com as concentrações das amostras
analisadas (homogeneidade da variância dos resíduos) pelo teste de
Cochran, aplicando a fórmula que se segue.
2
2
s
maiorsC
cal
maiors2
2
s
Onde:
= maior variância
= somatório das variâncias
Se C calculado < C tabelado Homocedasticidade
Se C calculado > C tabelado Heterocedasticidade
Cálculos Estatísticos
Homocedasticidade:
Se o critério de homocedasticidade for aceito, a regressão linear é
executada pelo método dos mínimos quadrados, que estima qual a
melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente a
partir da curva de calibração.
Se não houver relação linear, realizar transformação matemática
Homocedasticidade
2
2
s
maiorsC
cal
maiors2
2
s
= 0,020
= 0,058
Cálculos Estatísticos
Aplicando a fórmula, C calculado = 0,344.
Como C calculado 0,344 é menor que
C tabelado 0,506.
O critério de homocedasticidade foi
aceito.
Curva de calibração:
Realizada análise de regressão deve-se apresentar o coeficiente de
correlação linear (r), a inclinação (coeficiente angular), o intercepto
da reta (coeficiente linear), soma residual dos quadrados mínimos
da regressão linear e desvio padrão. A regressão linear é
representada por uma equação do tipo:
Onde, é o valor da resposta para uma dada concentração x do
analito.
bxay ˆ
y
Cálculos Estatísticos
2
ˆii
yySSE
= valor previsto pela reta (valor projetado).
SSE
iy
iy
Onde,
= soma dos quadrados dos resíduos.
= valor observado experimentalmente (valor medido).
Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).
Cálculos Estatísticos
Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).
O critério da reta de regressão é encontrar os coeficientes a e b,
que minimizem a soma dos quadrados dos resíduos, procedimento
denominado método dos quadrados mínimos.
Se os pares de valores estiverem contidos na reta ajustada a
soma dos quadrados dos resíduos será igual a zero e a explicação
da reta ajustada será completa (reta ideal), portanto o objetivo é que
a soma dos quadrados dos resíduos seja mais próxima de zero
possível.
Cálculos Estatísticos
2
ˆ2
n
yys
ii
e
= n -2 graus de liberdade
Onde,
= erro padrão da estimativa (desvio padrão residual)
= valor observado experimentalmente (valor medido)
= valor previsto pela reta (valor projetado)
es
iy
iy
Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).
Cálculos Estatísticos
O erro padrão da estimativa mede a dispersão dos desvios,
denominados resíduos, ao redor da reta de regressão.
Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).
O conceito do erro padrão da estimativa ou desvio padrão
residual, é equivalente ao do desvio padrão que mede a
variabilidade dos valores da amostra ao redor da média aritmética
desses valores.
Atendidas as premissas de regressão linear, se espera que
aproximadamente 95 % dos valores da amostra y se encontrem no
intervalo de + 2 x se de seus respectivos valores projetados pela reta
de regressão , ou seja, que os valores dos resíduos se encontrem
neste intervalo (+ 2 x se).
Cálculos Estatísticos
Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.
Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.
Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.
Analista 1:
Estatística de regressão
R múltiplo 0,999972427
R-Quadrado 0,999944855
R-quadrado ajustado 0,999940613
Erro padrão 0,27788902
Observações 15
Resultado:
Erro Padrão da Estimativa ou Desvio Padrão Residual (Se)
Estudo de caso.
Critério de Aceitação:
Os valores dos resíduos devem-se encontrar no intervalo (+ 2 x Se).
Cálculos Estatísticos
Resultado dos resíduos.
Como pode ser observado na tabela o resultado dos resíduos foi satisfatório.
Encontram-se dentro do intervalo de + 2 x 0,28 = + 0,56.
Cálculos Estatísticos
Analista 1:
Identificação da amostra: Padrão Lamivudina INCQS
Concentração Y previsto Resíduos
1 50,32 -0,23
2 50,32 -0,30
3 50,32 -0,23
4 74,95 0,18
5 74,95 0,10
6 74,95 0,16
7 99,59 0,44
8 99,59 0,35
9 99,59 0,44
10 124,22 -0,22
11 124,22 -0,23
12 124,22 -0,29
13 148,85 0,06
14 148,85 -0,18
15 148,85 -0,05
Variável X 1 Plotagem de resíduos
-0,50
0,00
0,50
0 200 400 600 800
Variável X 1
Resíd
uo
s
PLOTAGEM DE AJUSTE DE
LINHA.
0
200
0 200 400 600 800
Variável X 1
Y Y
Y previsto
Estudo dos resíduos e dos valores medido e previsto para y.
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor
verdadeiro.
Ou compara-se os resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida.
Exatidão.
Para o Fármaco:
Aplica-se a metodologia analítica proposta, na análise de uma substância de pureza conhecida (padrão de referência).
Definição dos Parâmetros de Validação
No caso de todos os componentes do medicamento não estarem disponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao medicamento.
Para o Produto (Forma Farmacêutica).
Analisa-se uma amostra, na qual foi adicionada uma quantidade conhecida do fármaco a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado).
Definição dos Parâmetros de Validação
Exatidão.
No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradação, aceita-se a comparação dos resultados obtidos com um segundo método bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou outro procedimento analítico validado).
Para Impurezas.
Utiliza-se o método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao fármaco.
Definição dos Parâmetros de Validação
Exatidão.
no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada.
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de:
A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, acrescida do intervalo de confiança.
Definição dos Parâmetros de Validação
Exatidão.
Preparar uma solução mãe concentrada e efetuar as diluições na matriz a fim de obter três concentrações diferentes. Partir da solução mãe também para a calibração, para evitar erros de pesagem.
Plano Experimental
Exatidão.
Efetuar nove determinações, em três concentrações diferentes, com três réplicas cada, por exemplo: 75%, 100% e 125% do valor rotulado, em triplicata de injeção.
Realizar as análises no mesmo dia usando o mesmo analista.
É geralmente expressa como porcentagem de recuperação (R%) da
substância de interesse, calculada segundo a fórmula, acrescida
dos intervalos de confiança.
Onde,
= concentração teórica correspondente (valor esperado).
= porcentagem de recuperação.
= média dos resultados (valor determinado experimentalmente).
x
xR
100%
R %
x
x
Cálculos Estatísticos
Exatidão.
a
saca
x
xxR
100%
Onde,
= porcentagem de recuperação
Quando não há possibilidade de preparar matriz limpa da amostra,
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de
referência) ao medicamento, para determinar a Exatidão, que é
calculada segundo a fórmula.
= conc. medida na amostra com adição do analito ou padrão
= conc. medida na amostra sem adição do analito ou padrão
= concentração adicionada
%R
cax
sax
ax
Cálculos Estatísticos
Exatidão.
Calcular a Média,
Calcular o Desvio padrão (DP),
Calcular o Desvio padrão relativo (DPR),
Calcular o percentual de Recuperação,
Calcular o Intervalo de confiança.
Critérios de Aceitação - Exatidão
Para ensaios de teor (maior componente) a recuperação média
deve ser de 100% + 2% para cada concentração na faixa de 80 a
120% da concentração alvo ou de estudo.
Cálculos Estatísticos
Exatidão.
Intervalo de confiança (IC).
É o intervalo dentro do qual o valor verdadeiro se encontra.
n
tsx
Portanto:
= valor verdadeiro
= média dos valores obtidos x
n
tsIC
n0 de graus de liberdade, = n –1
Onde,
= valor tabelado, em função de:
= desvio padrão
= tamanho da amostra (número de replicatas)
s
n
t
Cálculos Estatísticos
nível de significância ().
Analista 1:
Identificação das amostras: Placebo contaminado - Lamivudina comprimido revestido
Concentração da
amostra
75% 100% 125%
Replicata A1 98,02 99,34 99,26
Replicata A2 98,31 99,48 99,18
Replicata A3 98,35 99,51 99,14
Replicata B1 100,71 98,32 99,44
Replicata B2 100,51 98,40 99,36
Replicata B3 100,56 98,39 99,42
Replicata C1 98,63 99,12 99,36
Replicata C2 98,68 99,38 99,38
Replicata C3 99,18 99,21 99,46
Média 99,22 99,02 99,33
DP 1,08 0,50 0,11
DPR 1,09 0,51 0,12
% Recuperação 99,22 99,02 99,33
IC +0,83 +0,38 +0,08
Cálculos Estatísticos Exatidão.
n
tsIC
ttab = 2,306.
= n –1 = 8
Nível de 75%.
83,09
08,1306,2
IC
Nível de 100%.
Nível de 125%.
38,09
50,0306,2
IC
08,09
11,0306,2
IC
% R = 99,22 + 0,83%
% R = 99,02 + 0,38 %
% R = 99,33 + 0,08 %
Cálculos Estatísticos
Exatidão.
60 – 115 0,000 000 01 10 ppb
80 – 110 0,000 001 1 ppm
90 – 107 0,000 1 0,01 %
95 – 105 0,001 0,1 %
97 – 103 0,01 1 %
98 – 102 0,1 10 %
98 – 102 1,0 100 %
Recuperação média
%
Concentração
Fracional
Concentração
Critério De Aceitação : AOAC, 2000
Critérios de Aceitação - Exatidão
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.
Precisão.
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis.
Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação.
Definição dos Parâmetros de Validação
Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias.
Estes dados não precisam ser apresentados para a concessão de registro.
Definição dos Parâmetros de Validação
Precisão.
Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste.
Definição dos Parâmetros de Validação
Precisão.
Verificar a precisão nos níveis repetibilidade e precisão intermediária. Efetuar seis determinações, a 100% do valor rotulado, através da analise de três amostras diferentes.
No nível repetibilidade realizar as seis análises, de cada uma das amostras, no mesmo dia e com o mesmo analista. Para o parâmetro precisão intermediária, com as mesmas amostras descritas acima, executar três tipos de comparação: Repetir as análises, usando um analista diferente. Repetir as analises, utilizando um equipamento diferente.
Plano Experimental
Precisão.
Repetibilidade Calcular a Média,
Calcular o DP,
Calcular o DPR.
Precisão Intermediária – Teste de F Calcular as variâncias (s2),
Calcular o valor de F para cada uma das comparações utilizadas
para avaliação da precisão intermediária.
Cálculos Estatísticos
Precisão.
Amostra Laboratório A Laboratório B Laboratório C
A1 101,84 100,16 96,97
A2 102,61 100,52 97,32
B1 101,54 98,05 96,55
B2 101,71 98,26 96,78
C1 100,58 99,27 98,27
C2 100,57 99,31 98,46
D1 101,85 98,56 96,41
D2 101,74 98,72 95,80
E1 101,18 98,52 96,35
E2 101,19 98,78 96,15
F1 100,54 99,00 96,83
Média 101,33 99,02 96,89
DP 0,67 0,73 0,79
DPR 0,66 0,74 0,82
Cálculos Estatísticos
Precisão.
Repetibilidade Calcular a Média,
Calcular o DP,
Calcular o DPR.
O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a
metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, do
tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores
superiores a 5% (RE 899).
Critério de Aceitação segundo a RE 899/2003:
Cálculos Estatísticos
Precisão.
Repetibilidade
Critérios de Aceitação - Precisão
Fórmula empírica de Horwitz RSD r 2(1 - 0,5 log c). 0,67
Analito % Horwitz Calculado DPR r %
100 2 1,3
10 2,8 1,9
1 4 2,7
0,1 5,6 3,7
0,01 8 5,3
0,001 11 7,3
0,0001 16 11
0,00001 23 15
0,000001 32 21
0,0000001 45 30
c – concentração fracional: representa a concentração percentual
dividida por cem.
Precisão Intermediária – Teste de F Calcular as variâncias (s2),
Calcular o valor de F para cada uma das comparações
utilizadas para avaliação da precisão intermediária.
Cálculos Estatísticos
Comparação de variâncias (s2): Teste de F.
Para comparação de variâncias pelo Teste-F, partimos da
hipótese nula de que não há diferença significativa entre as
variâncias comparadas, ou seja:
2
2
2
1ss :
1H:
0H 2
2
2
1ss
Cálculos Estatísticos
O teste de hipótese aqui realizado, ou seja para comparação
de variâncias, é um teste em duas caudas, portanto a tabela de F
utilizada é a bicaudal.
Comparação de variâncias (s2): Teste de F.
Cálculos Estatísticos
para os graus liberdade (para o numerador)
o (nível de significância) definido;
111 n
122 n e para os graus liberdade (para o denominador)
calcF
2
2
2
1
s
s
2
2
2
1ss
O Ftab é encontrado na tabela de F, para:
calcF
2
2
2
1
s
s
2
2
2
1ss
Cálculos Estatísticos
Comparação de variâncias (s2): Teste de F.
Para que a hipótese nula seja aceita, Fcalc < Ftab ou Fcrit .
O valor de Fcalc é sempre maior que a unidade.
Identificação das amostras: Amostras do laboratório A
analisadas por analistas diferentes.
Amostras
Laboratório A
Analista 1
Equip. 2
Analista 2
Equip. 2
A1 101,84 100,36
A2 102,61 100,54
B1 101,54 99,46
B2 101,71 99,55
C1 100,58 101,53
C2 100,57 99,89
D1 101,85 100,24
D2 101,74 100,39
E1 101,18 100,05
E2 101,19 100,02
F1 100,54 100,85
F2 100,58 100,84
Média 101,33 100,31
DP 0,67 0,58
DPR 0,66 0,58
s2 0,45 0,34
Fcalc. = 0,45/0,34
Fcalc = 1,32
Ftab= 3,43
Fcalc< Ftab
H0 é aceita.
Analistas diferentes:
satisfatória
:0
H 2
2
2
1ss
2
2
2
1ss :
1H
Precisão Intermediária
Identificação das amostras: Amostras do laboratório A analisadas
com equipamentos diferentes.
Amostras
Laboratório A
Analista 2
Equip.2
Analista 2
Equip.1
A1 100,36 99,21
A2 100,54 98,80
B1 99,46 100,41
B2 99,55 100,83
C1 101,53 99,50
C2 99,89 99,64
D1 100,24 100,41
D2 100,39 100,07
E1 100,05 99,02
E2 100,02 99,03
F1 100,85 99,02
F2 100,84 98,80
Média 100,31 99,56
DP 0,58 0,70
DPR 0,58 0,70
S2 0,34 0,49
Precisão Intermediária
:0
H 2
2
2
1ss
2
2
2
1ss :
1H
Fcalc = 0,49/0,34
Fcalc = 1,44
Ftab= 3,43
Fcalc< Ftab
H0 é aceita.
Equip. diferentes:
satisfatória
A ANOVA (análise de variância) é utilizada para comparação de
duas ou mais análises, a partir da distribuição F, utilizada para
realizar o teste de hipótese, onde a hipótese nula é de que não
há diferenças estatisticamente significativas entre as análises,
se Fcalc < Ftab aceita-se a hipótese nula ( ). :0
H
Ftab para o nível de significância adotado.
Precisão Intermediária
Cálculos Estatísticos
Exatidão,
Intervalo
Intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico.
É estabelecido pela confirmação de que o método apresenta:
O intervalo depende da aplicação pretendida.
Precisão, Linearidade
... adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado.
Definição dos Parâmetros de Validação
O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável.
Limite de Detecção (LD).
O Limite de Detecção é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
Definição dos Parâmetros de Validação
A avaliação do limite de detecção (LD) pode ser: Visual,
Relação sinal/ruído - 3:1,
Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 3 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração
A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :
Desvio padrão do Branco.
Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.
Definição dos Parâmetros de Validação
A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.
O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.
Limite de Quantificação (LQ).
O Limite de Quantificação é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser determinada com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições experimentais estabelecidas.
Definição dos Parâmetros de Validação
Definição dos Parâmetros de Validação
Limite de Quantificação (LQ).
Relação sinal/ruído - 10:1,
Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 10 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.
A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :
Desvio padrão do Branco.
Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal.
Robustez.
Caso haja susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.
Definição dos Parâmetros de Validação
Robustez.
Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico:
Preparo das Amostras: Tempo de extração
Estabilidade das soluções analíticas
Espectrofotometria: Variação do pH da solução Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia Líquida: Variação do pH da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel
Definição dos Parâmetros de Validação
Cromatografia Gasosa. Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Velocidade do gás de arraste
Definição dos Parâmetros de Validação
Robustez.
Avaliação da Robustez
Planejamento experimental para avaliar a robustez pelo
método de Youden – matriz de experimento;
A verificação da robustez deve ser realizada após a
validação do método;
Avaliar qual o impacto das variações – teor (exatidão)
Bibliografia
ANVISA, Habilitação de Laboratórios Analíticos em saúde – segundo os
requisitos da ISO/IEC 17025 – Procedimento GGLAS 02/17025, 2. ed, Brasília,
2002.
ANVISA, Guia para Qualidade em Química Analítica – Uma Assistência a
Acreditação, v. 1, 1. ed, Brasília, 2004.
BRASIL, Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a
publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". Diário
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003.
ANVISA, Informe Técnico nº 1 de 15 de julho de 2008 – Esclarecimento sobre o
item 2.9 do anexo da Resolução RE nº 1 de 29/07/2005, que trata do Guia para
Realização dos Estudos de Estabilidade.
Bibliografia
FURMAN,W. B. Pharm.Techn. 22, (6), 1998, 54 -65.
CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Validation of Chromatografic
Methods, nov. 1994.
INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientações sobre Validações de Métodos de
Ensaios Químicos. RJ, Brasil, 20003.
LAPPONI, J.C. Estatística usando Excel. São Paulo: Lapponi treinamento e editora,
2000.
BRITO, N.M. Avaliação da Exatidão e da Precisão de Métodos de Análise de
Resíduos de Pesticidas Mediante Ensaios de Recuperação. Pesticidas:
R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p. 155-168, jan./dez. 2002
BRASIL, Resolução (RDC) nº 210, de 04 de agosto de 2003. Atualiza as Boas
Práticas de Fabricação de medicamentos com o objetivo de acompanhar o
desenvolvimento de novas tecnologias. Diário Oficial [da] Republica Federativa do
Brasil, Brasília, DF, 14 de agosto de 2003.
Bibliografia
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. Verification of Compendial
Procedures, 31(2), Mar-Abr, 2005, p. 555-558.
PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. 31(3), May-June, 2005, p. 834-835.
SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for
pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between
validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US
Pharmacopoeia and the International Conference on Harmonization. Journal of
Chromatography A, 987, p. 57-66, 2003. Disponível em http://www.sciencedirect.com,
Acesso em: 16 de abril de 2003.
USP (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA). Chromatography, 27 ed. Rockville:
United States Pharmacopeial Convention, 2004, p. 2272 – 2284.
NBR ISO/IEC 17025, Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de
Calibração e de Ensaios. ABNT, RJ, Brasil, 2001.