2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
A Genética Molecular em Análises Clínicas
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
Genética Molecular em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações Técnicas de estudo de mutações desconhecidasdesconhecidas
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas
Métodos Baseados No TmMétodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clampsMelting Profiles and GC clamps DGGEDGGE
• PerpendicularPerpendicular• ParaleloParalelo
CDGECDGE TTGETTGE
Métodos Baseados na conformaçãoMétodos Baseados na conformação SSCPSSCP HAHA CSGECSGE
“Melting Profiles”
Vários domínios de fusãoVários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapasAs moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gelMoléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu PmMoléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão totalPodem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gradiente de desnaturaçãoGradiente de desnaturação QuímicoQuímico TemperaturaTemperatura
O gradiente pode ser:O gradiente pode ser: Perpendicular ao Perpendicular ao
campo eléctricocampo eléctrico Paralelo ao campo Paralelo ao campo
eléctricoeléctrico
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Não existe um gradiente no gel, Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corridaem cada momento da corrida
Existe uma temperatura Existe uma temperatura crescente ao longo da corridacrescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração Em cada momento, a migração em cada molécula depende de em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não esta já ter atingido ou não algum domínio de fusãoalgum domínio de fusão
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
VantagensVantagens
Mais fácil de fazer os Mais fácil de fazer os geisgeis
Mais reprodutível de Mais reprodutível de gel para gelgel para gel
DesvantagensDesvantagens
Mais difícil de acertar Mais difícil de acertar a gama de Tma gama de Tm
Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA
não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA
depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)
Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-
desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas
Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de desnaturanteConcentração de desnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos
(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)
WT1
WT2
mutantes
Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA
Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio:Principio:
Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais.conformacionais.
Método:Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus porosaumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bpUtilizar fragmentos com 300-800 bp
Hibridização
desnaturar
Hibridização
Adicionar sonda
Hibridização
Hibridização
Adicionar substracto
Dot-Blot
Variações
Hibridização em microplacaHibridização em microplaca hibridização reversahibridização reversa
DEIA(hibridização reversa em microplaca)(detecção com anti-dsDNA)
Inno-Lippa
Hibridização em filtroHibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)(tipo código de barras) Hibridização reversaHibridização reversa Marcação no produto do PCRMarcação no produto do PCR
Resultados do INNO-LIPA
MEIA
Southern Blot
Northern Blot
Semelhante ao SouthernSemelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNAUtiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restriçãoNão utiliza reacções de restrição