Transcript
Page 1: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA

Alterações no acoplamento entre as atividades

simpática e respiratória em ratos jovens

submetidos à hipóxia crônica intermitente

Daniel Breseghello Zoccal

Ribeirão Preto

2010

Page 2: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

DANIEL B. ZOCCAL

Alterações no acoplamento entre as atividades

simpática e respiratória em ratos jovens submetidos

à hipóxia crônica intermitente

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Benedito H. Machado

Ribeirão Preto

2010

Page 3: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

FICHA CATALOGRÁFICA

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.

Zoccal, Daniel Breseghello Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória

em ratos jovens submetidos à hipóxia crônica intermitente. Ribeirão Preto, 2010.

174 p.: il.; 30 cm Tese de doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP – Área de concentração: Fisiologia Orientador: Machado, Benedito H.

1. hipóxia crônica intermitente, 2. sistema nervoso simpático, 3. sistema respiratório, 4. acoplamento simpático-respiratório, 5. bulbo,

6. glutamato, 7. ATP.

Page 4: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aluno: Daniel Breseghello Zoccal

Título: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos jovens

submetidos à hipóxia crônica intermitente

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Fisiologia

Aprovado em:

Banca examinadora

Prof. Dr. Fernando Morgan de Aguiar Corrêa

Instituição: Departamento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Rubens Fazan Junior

Instituição: Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Juan Pablo García-Huidobro Toro

Instituição: Departamento de Fisiologia, Faculdade de Ciências Biológicas, PUC – Chile

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Julian F.R. Paton

Instituição: Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade de Bristol – Inglaterra

Assinatura: _________________________________________________________________

Prof. Dr. Benedito H. Machado (orientador)

Instituição: Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP

Assinatura: _________________________________________________________________

Page 5: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Dedico esta tese a Polyana,

Vinícius e Gustavo, sem os quais

não haveria motivação alguma

para seguir em frente.

Page 6: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Agradecimentos

Todas as pessoas que passam por nossas vidas, acabam contribuindo, direta ou

indiretamente, para o nosso crescimento e amadurecimento. Contudo, gostaria de nomear e

agradecer aqueles que têm sido muito importantes para mim e que, de fato, contribuíram para

este trabalho:

- A Deus, pela força, sabedoria, confiança e juízo que colocaste em minha vida;

- Aos meus queridos José, Nair e Leonardo, família sempre presente que me incentiva a seguir

o meu destino, mas nunca me deixa esquecer as minhas raízes;

- A minha amada esposa Polyana, pela sua paciência, compreensão, força e suporte para me

deixar sempre tranqüilo e seguro;

- Ao Prof. Benedito, pela acolhida em seu laboratório, pela confiança nas execuções dos

projetos, por todas as oportunidades oferecidas e, principalmente, por ser um ótimo professor

e também um pesquisador muito ativo, responsável, coerente e dinâmico, sempre buscando

além dos nossos limites – um exemplo a ser levado por toda a vida;

- À Leni, por me ensinar e por dar exemplo de que para ser um excelente profissional não

basta somente executar trabalhos de qualidade indiscutível, mas também é importante saber

manter a harmonia e a amizade dentro de um laboratório ou qualquer outro ambiente de

trabalho. Além disso, por ser o um porto seguro, uma amiga para compartilhar todos os

momentos de alegria, mas também estar sempre disposta a nos ouvir nos momentos de

dificuldade. Por ser simplesmente ela.

- Ao Prof. Julian Paton, pela sua intensa e afirmativa colaboração com o nosso estudo e pela

sua importantíssima co-orientação nos assuntos relacionados ao sistema respiratório;

- Ao Prof. Juan Pablo, pela amigável e calorosa acolhida em seu laboratório em Santiago e

pela oportunidade de me envolver intensamente no fascinante mundo dos nucleotídeos;

- Ao Prof. Antunes, não somente pela sua colaboração neste estudo, mas também por sempre

nos motivar a sempre buscar inovações, mas nunca se esquecendo que formação de recursos

humanos é tão importante quanto. Obrigado pelos ensinamentos.

Page 7: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

- Aos meus queridos amigos de laboratório: Cadu, Dani, João Henrique, Davi e Mirela – um

excelente grupo de trabalho. Obrigado pelas ricas e intensas discussões científicas, as quais

sempre me ajudaram a pensar além do que eu estava pensando. E também pela grande

amizade e pelos momentos de alegria, companheirismo e descontração, sempre muito

importantes para tornar a vida mais agradável;

- A todos os meus amigos do Departamento de Fisiologia (não listarei os nomes para não

correr o risco de esquecer alguém), obrigado pela amizade e pela companhia não somente

dentro, mas principalmente fora da Universidade;

- Aos Profs. Eduardo e Débora Colombari, pelos sinceros conselhos e pelas importantes

palavras de incentivo;

- A Rubens Fernando de Melo, pelo imprescindível auxílio técnico histológico;

- Aos amigos da secretaria do Departamento de Fisiologia: Elisa, Cláudia, Fernando e Carlos,

pelo excelente trabalho executado;

- A todos aqueles que me esqueci de mencionar, muito obrigado pelo apoio.

Page 8: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro

da FAPESP (2006/51159-6) e do CNPq

Page 9: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

“O fracasso é a oportunidade de começar de novo

com mais inteligência e redobrada vontade”.

Henry Ford

Page 10: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

RESUMO

ZOCCAL, D.B. Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos jovens submetidos à hipóxia crônica intermitente. 174 p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2010.

No presente trabalho estudamos as alterações cardiovasculares e respiratórias

promovidas pela hipóxia crônica intermitente (HCI) em ratos, bem como os possíveis

mecanismos centrais envolvidos nessas alterações. Para tanto, utilizamos ratos Wistar jovens

(P19-P21) submetidos à HCI (6% de O2 por 30 a 40 seg, a cada 9 minutos, 8 horas por dia)

por 10 dias, enquanto ratos controle foram mantidos em condições de normóxia (20,8% de

O2) durante o mesmo período. Observamos que ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias

apresentaram um aumento da pressão arterial basal associado a uma hiperatividade simpática

basal, a qual foi avaliada por meio do bloqueio ganglionar e pela análise espectral. Esse

aumento da atividade simpática após a HCI não estava relacionado a reduções no controle

barorreflexo da freqüência cardíaca. Por outro lado, os níveis elevados da pressão arterial de

ratos HCI apresentaram uma maior variabilidade associada à respiração, indicando uma maior

influência da atividade respiratória sobre o sistema cardiovascular após a HCI. Coerente com

esses resultados preparações in situ (preparação coração-tronco cerebral isolados) de ratos

HCI apresentaram níveis elevados da atividade simpática torácica, observados durante a fase

final da expiração, os quais se correlacionaram com uma hiperatividade motora abdominal

durante a mesma fase respiratória, indicando que os mecanismos neurais envolvidos com o

acoplamento entre as atividades simpática e respiratória estão alterados após a HCI.

Associado as alterações basais, verificamos que preparações in situ de ratos HCI apresentaram

respostas simpato-excitatória e taquipnêica à ativação do quimiorreflexo de maior magnitude,

sugerindo não somente uma facilitação do processamento das respostas do quimiorreflexo,

Page 11: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

mas também que as alterações autonômicas promovidas pela HCI estão associadas às

alterações respiratórias. Em preparações in situ, verificamos que microinjeções de ATP na

superfície rostral ventrolateral do bulbo (RVL) de ratos HCI promoveram respostas simpato-

excitatórias de maior magnitude, sem alterações na magnitude das respostas de redução da

freqüência de despolarização do nervo frênico e de aumento da atividade motora abdominal.

Esse maior aumento da atividade simpática promovido pelas microinjeções de ATP no RVL

de ratos HCI se correlacionou com um aumento da densidade dos receptores P2X3 e P2X4 do

ATP nesta região, a qual foi avaliada pela técnica de western blot. Além disso, verificamos

que microinjeções de L-glutamato no aspecto caudal do núcleo do trato solitário (NTSc) de

ratos HCI promoveram menores respostas de excitação pós-inspiratória vagal e apnéia,

associadas a respostas simpato-excitatórias de maior magnitude. Observamos também

alterações no padrão respiratório basal promovidas pelo antagonismo simultâneo dos

receptores ionotrópicos do L-glutamato e dos receptores P2 do ATP no NTSc de ratos HCI foi

menos expressivo do que nos ratos controle. Esses resultados estão de acordo com as

observações de que a densidade da subunidade NMDA R1 dos receptores glutamatérgicos

está aumentada no NTSc de ratos HCI. Esse conjunto de resultados indicam que a HCI parece

interferir com os mecanismos purinérgicos e glutamatérgicos no RVL e no NTSc,

respectivamente, os quais podem contribuir para as alterações no acoplamento central entre as

atividades simpática e respiratória observadas em ratos jovens submetidos à HCI.

Palavras chaves: hipóxia crônica intermitente, sistema nervoso simpático, sistema

respiratório, acoplamento simpático-respiratório, bulbo, glutamato, ATP.

Page 12: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

ABSTRACT

ZOCCAL, D.B. Alterations in central coupling of respiratory and sympathetic activities in juvenile rats submitted to chronic intermittent hypoxia. 174 p. Thesis (Ph.D.) – School of Medicine of Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2010.

In the present study, we evaluated the cardiovascular and respiratory alterations

induced by chronic intermittent hypoxia (CIH) exposure in rats as well as possible central

mechanisms underlying these alterations. Herein, we used juvenile male Wistar rats (P19-

P21) submitted to CIH (6% O2 for 30-40 s, every 9 minutes, 8 hours/day) for 10 days while

control rats were maintained in normoxia (20.8% O2) for the same period. We observed that

juvenile rats submitted to CIH for 10 days exhibited an increased baseline arterial pressure

associated with a sympathetic overactivity, evaluated by ganglionic blockade response and

power spectral analysis. The increased sympathetic activity observed after CIH was not

associated with reductions in cardiac baroreflex function. On the other hand, the higher levels

of arterial pressure of CIH rats showed an increased respiratory-related variability, pointing

out an augmented influence of respiratory activity on cardiovascular system after CIH. In

agreement with these results, we observed that in situ preparation (working heart-brainstem

preparation) of CIH rats exhibited higher levels of thoracic sympathetic activity during the

late phase of expiration, which were correlated with an enhanced abdominal motor nerve

activity during the same respiratory phase. These results indicate that the central mechanisms

underlying the coupling between respiratory and sympathetic activities are altered after CIH

exposure. In addition to these baseline alterations, we verified that CIH rats also showed an

increased sympatho-excitatory and tachypneic responses to chemoreflex activation,

suggesting that not only the processing of the peripheral chemoreflex responses is facilitated,

but also reinforcing that the autonomic alterations induced by CIH are associated with

Page 13: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

respiratory changes. Using in situ preparations, we observed that ATP microinjections into the

rostral ventrolateral medulla (RVL) of CIH rats produced higher sympatho-excitatory

responses accompanied by responses of apnea and excitation of abdominal motor activity.

The higher sympatho-excitation induced by ATP into RVL was associated with an increased

P2X3 and P2X4 ATP receptor density in this region, which was evaluated by western blot. In

other experiments, we observed that microinjections of L-glutamate into the caudal aspect of

nucleus of tractus solitarius (cNTS) of CIH rats produced smaller responses of vagal post-

inspiratory excitation and apnea, associated with an increased sympatho-excitatory response.

We also verified that the respiratory alterations induced by the simultaneous antagonism of

ionotropic glutamatergic receptors and purinergic receptors into the cNTS were smaller in

comparison to the alterations observed in control animals. These results are in accordance

with the observation that the density of NMDA R1 subunit of glutamatergic receptor is

increased in the cNTS of CIH rats. Altogether, these findings indicate that CIH interfere with

purinergic and glutamatergic mechanisms in the RVL and cNTS, respectively, which may

contribute to the alterations in the central coupling between respiratory and sympathetic

activities in juvenile rats submitted to CIH.

Keywords: chronic initermittent hypoxia, sympathetic nervous system, respiratory system,

respiratory-sympathetic coupling, medulla oblongata, glutamate, ATP.

Page 14: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema mostrando os diferentes grupos neuronais localizados na ponte e no bulbo, os quais estão envolvidos com a geração e modulação da atividade eferente simpática e do ritmo respiratório basal. Abreviaturas – NPB: núcleo parabraquial; KF: Kölliker-Fuse; A5: áera A5 da ponte; OS: oliva superior; 7: núcleo do nervo facial; nRT: núcleo retrotrapezóide; NA: núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; pré-BötC: complexo pré-Bötzinger; rVRG: grupo respiratório ventral rostral; cVRG: grupo respiratório ventral caudal; RVLM: região rostral ventrolateral do bulbo; CVLM: região caudal ventrolateral do bulbo; LRt: núcleo reticular lateral; AP: área postrema; NTSr: porção rostral do núcleo do trato solitário; NTSi: porção intermediária do núcleo do trato solitário; NTSc: porção caudal do núcleo do trato solitário; GRD: grupo respiratório dorsal. 37

Figura 2. Variações da fração inspirada de oxigênio (% oxigênio) na câmara HCI durante 2 episódios de hipóxia. As barras acima dos traçados indicam o período de injeção de nitrogênio (N2, barras pretas) e oxigênio (O2, barras cinza) dentro da câmara. Durante o período não compreendido pelas barras, pequenas frações de N2 e O2 eram injetadas para manter a concentração fracional de oxigênio próximo a 20,8%. O valor mínimo da fração inspirada de oxigênio (pico do estímulo à hipóxia) foi de 6%, o qual foi mantido durante 30 a 40 s, conforme ilustra o painel direito da figura ............................................................... 46

Figura 3. Esquema da preparação coração tronco-cerebral isolados (working heart-brainstem preparation), conforme detalhadamente descrito anteriormente nas sub-seções 3.4.1, 3.4.2 e 3.4.3 da seção Materiais e Métodos. Abreviaturas: Abd – atividade do nervo motor abdominal; ANF – atividade do nervo frênico; ANSt – atividade do nervo simpático torácico; ANVc – atividade do nervo vago cervical; amp – amplificadores; ECG – eletrocardiograma ..................................................................................................................... 57

Figura 4. Registros representativos das atividades originais e integradas (∫) dos nervos frênico (ANF) e vago (ANVc), mostrando a divisão dos componentes inspiratório (I, coincidente com o disparo do nervo frênico) e pós-inspiratório (PI, atividade remanescente observada durante o período expiratório) observados na ANVc.............................................. 60

Figura 5. Painel A: Registros de uma preparação representativa mostrando as atividades originais e integradas (∫) dos nervos frênico (ANF) e simpático torácico (ANSt) durante um período de 10 ciclos respiratórios e o ruído elétrico correspondente a cada nervo. Painel B: Divisão da ANSt média, obtida a partir do trecho em A, em 4 partes de acordo com a atividade do nervo frênico: inspiração (I), pós-inspiração (PI), expiração média (Em) e expiração final (Ef). Os valores 100% e 0% representados na figura mostram a atividade máxima observada durante I e o nível do ruído, respectivamente. A barra horizontal no painel A representa 1 s e no painel B 200 ms .................................................... 61

Figura 6. A: valores da PAS de ratos controle (controle, n = 29) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 28) avaliadas antes (pelo método indireto da pletismografia de cauda) e após o protocolo experimental (método direto da canulação da artéria femoral). * P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle; # P < 0,0001 – diferente em relação aos valores iniciais; ns – não significativo. B: magnitude do aumento da PAS (∆PAS) observado em ratos controle e HCI após 10 dias do protocolo experimental. * P < 0,0001, diferente em relação ao grupo controle .................................................................................... 72

Page 15: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 7. Valores basais da pressão arterial média (PAM, A) e diastólica (PAD, B), pressão de pulso (PP, C) e freqüência cardíaca (FC, D) de ratos controle (Controle, n = 29) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 28). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle ..................................................................................................................................... 73

Figura 8. Freqüência respiratória (fR, A), volume corrente (VT, B) e volume minuto (VE, C) basais de ratos controle (n = 19) e ratos submetidos à HCI (n = 21) .................................. 74

Figura 9. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica (painéis superiores) e do intervalo de pulso (painéis inferiores) de ratos controle (Controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 7). A e C: variância (σ2); B e E: espectros de animais representativos dos seus respectivos grupos experimentais; C e F: média das potências dos espectros. * P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle ............................................... 75

Figura 10. Registros da freqüência cardíaca (FC), pressão arterial pulsátil (PAP) e pressão arterial média (PAM) de um rato controle (panéis à esquerda) e de rato submetido à HCI (painéis à direita), ambos representativos dos seus respectivos grupos experimentais, ilustrando o efeito das injeções de losartan (10 mg/kg), AVPx (10 µg/kg) e hexametônio (25 mg/kg) sobre os parâmetros cardiovasculares.................................................................... 76

Figura 11. A: Valores da pressão arterial média (PAM) antes (Basal) e após a administração de losartan (LOS), AVPx e hexametônio (HXT) em ratos controle (controle, n = 9) e em ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). B: Magnitudes das respostas hipotensoras (∆PAM) promovidas pela injeção de hexametônio em animais do grupo controle e do grupo HCI. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle ....................... 78

Figura 12. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo em ratos controle (controle, n = 18) e em ratos submetidos à HCI (HCI, n = 17). Em A, está representado o número de seqüências detectadas em registros de ratos HCI e controle. * P = 0,0114 – diferente em relação ao grupo controle. Em B, C e D, estão representados, respectivamente, os valores da inclinação das seqüências up, down e total de ratos controle e HCI ................................... 80

Figura 13. Curvas sigmóides correlacionando as respostas barorreflexas da FC promovidas pelas variações na PAM de ratos controle (Controle, n = 19) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 34). No quadrante superior direito está contido a regressão linear da curva sigmoidal (de -20 mmHg à +20 mmHg), a qual é representada no gráfico pelo valores absolutos da PAM. Os círculos mostram o ponto operacional da curva barorreflexa de ratos controle e HCI. * P = 0,002 – diferente em relação à curva controle..... 81

Figura 14. Pressão arterial média (PAM) de ratos controle (controle, n = 19) e de ratos submetidos à HCI (n = 10) avaliada 1 dia e 15 dias após o término do protocolo de HCI. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle 1 dia após o término da HCI; # P < 0,05 – diferente em relação ao grupo HCI 15 dias após o término da HCI; ns – não significativo . 82

Figura 15. Registros originais e integrados (∫) das atividades dos nervos frênico (ANF), abdominal (Abd) e vago cervical (ANVc) obtido em uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetidos à HCI (HCI), representativos de seus respectivos grupos experimentais. A área em cinza representa o período expiratório final do ciclo respiratório e as setas no registro da ANVc indicam o começo da atividade pós-inspiratória. Em relação à Abd, note que o rato HCI apresenta um disparo adicional na fase final da expiração (*)......................................................................................................... 85

Page 16: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 16. Análise da atividade do nervo vago cervical (ANVc) em preparações de ratos mantidos em normóxia (Controle, em preto) e de ratos submetidos à HCI (HCI, em cinza) por 10 dias. Painel superior: Média da ANVc durante 1 ciclo respiratório, obtida a partir de um trecho contendo 10 ciclos respiratórios, de uma preparação controle e de uma HCI, representativa de seus respectivos grupos experimentais. O componente pós-inspiratório inicial (PI-inicial) da ANVc dos ratos HCI se mostrou menor do que o dos ratos controle, sem alterações significativas no componente pós-inspiratório final (PI-final). Painel inferior: Média dos valores da área sob a curva dos diferentes componentes da ANVc de ratos controle (n = 10) e HCI (n = 10). Os valores foram normalizados pela área total da média da ANVc, a qual era equivalente a soma das áreas dos 3 componentes. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle ................................................86

Figura 17. Análises do padrão de acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos mantidos em normoxia (Controle) e ratos submetidos à HCI (HCI) por 10 dias. Painel superior: divisão da atividade média integrada (∫) do nervo simpático torácico (ANSt), obtida a partir de um trecho de 10 ciclos respiratórios, de acordo com a atividade do nervo frênico (ANF) correspondente, em preparações controle (esquerda) e HCI (direita), representativas dos seus respectivos grupos experimentais. O pico da atividade simpática durante o ciclo respiratório foi considerado como 100% e o ruído elétrico como 0%. Note que o aumento da atividade simpática nos animais HCI, em relação aos animais controle, na fase final da expiração (setas). Painel intermediário: valores da ANSt durante as partes expiração final (Ef), inspiração (I), pós-inspiração (PI) e expiração média (Em) nos animais do grupo controle (n = 11) e do grupo HCI (n = 9) que apresentavam os quimiorreceptores intactos. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle. Painel inferior: valores da ANSt durante as partes relativas ao ciclo respiratório nos animais do grupo controle (n = 3) e no grupo HCI (n = 5) com desnervação dos quimiorreceptores periféricos. * P = 0,01 – diferente em relação ao grupo controle ..........................88

Figura 18. Registros simultâneo das atividades originais e integradas (∫) dos nervos abdominal (Abd), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) em preparações de um rato controle (Controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), representativas de seus respectivos grupos experimentais. A área em cinza representa a parte expiratória final do ciclo respiratório. Note que no animal HCI, o pico de atividade do nervo abdominal durante a fase final da expiração está associada ao aumento da atividade simpática (setas) ... 89

Figura 19. Análise de correlação cruzada entre as atividades dos nervos simpático torácico (ANSt, painel superior), frênico (ANF, painel intermediário) e abdominal (Abd, atividade referência) de preparações de um animal controle (Controle) e de um animal submetido à HCI (HCI), representativas de seus respectivos grupos experimentais. Note a alteração da correlação entre as atividades simpática e abdominal da fase pós-inspiratória, observada no animal controle, para a fase final da expiração, observada no animal HCI ....... 90

Figura 20. Valores do coeficiente de correlação (r) entre as atividades dos nervos simpático torácico e abdominal durante as fases pós-inspiratória (PI) e final da e expiração (Ef) obtidos em preparações de ratos controle (Controle, n = 5) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 5) ....................................................................................................................................91

Figura 21. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de bradicardia (FC), simpato-excitação [ANSt, original e integrado (∫)] e taquipnéia [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela administração de KCN (setas). Note a maior magnitude das respostas simpática e respiratórias dos animais HCI em comparação aos animais controle ............................................................................................. 93

Page 17: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 22. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e de ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de excitação vagal [ANVc, original e integrado (∫)] e abdominal [Abd, original e integrado (∫)] e de taquipnéia [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela administração de KCN (setas). Note que enquanto a resposta Abd dos animais controle ocorre nas fases pós-inspiratória e final da expiração, a resposta dos animais HCI ocorre preferencialmente na fase final da expiração ........................................................................... 94

Figura 23. Magnitudes das respostas de simpato-excitação (∆ANSt, painel A), bradicardia (∆FC, painel B) e aumento na atividade eferente vagal (∆ANVc, painel C) promovidas pela administração de KCN em preparações de ratos controle (n = 8 – 14) e de ratos submetidos à HCI (n = 8 – 14). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle ............. 95

Figura 24. A: Aumento na atividade motora abdominal (∆Abd) em resposta à administração de KCN em preparações de ratos controle (Controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). B: Padrão de ativação do nervo abdominal ao longo da fase expiratória durante a estimulação do quimiorreflexo em preparações de ratos controle e HCI. * P < 0,01 – diferente entre as fases PI e Ef. # P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle. Note a mudança no padrão de resposta Abd dos animais HCI, com o deslocamento do pico da resposta para a fase Ef...................................................................... 96

Figura 25. Decurso temporal das respostas de taquipnéia (ANF, %), avaliada a cada 2 segundos, durante 30 segundos, promovidas pela adminstração de KCN em preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14). * P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle. Nos animais HCI, a resposta de taquipnéia foi mais prolongada do que aquela observada nos animais controle ............................................. 97

Figura 26. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e de ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de simpato-excitação [ANSt, original e integrado (∫)] e de redução na freqüência do nervo frênico [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela microinjeção unilateral de L-glutamato 3 mM (setas) na superfície rostral ventrolateral do bulbo .............. 99

Figura 27. Magnitude das respostas simpato-excitatória (∆ANSt, A) e de alterações na freqüência cardíaca (∆FC, B) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (1, 3 e 10 mM) na superfície rostral ventrolateral do bulbo de preparações de ratos controle (Controle, n = 5) e de submetidos à ratos HCI (HCI, n = 4). Nesses gráficos, o eixo X (concentração de L-glutamato) está representado em escala logarítmica ...........100

Figura 28. Análise temporal das respostas de redução da freqüência de despolarização do nervo frênico (ANF) promovidas pelas microinjeções (tempo 0) de L-glutamato nas concentrações de 1 mM (painel superior), 3 mM (painel intermediário) e 10 mM (painel inferior) no RVL de preparações de ratos controle (controle, n = 5) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 4) ..................101

Figura 29. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetidos à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de L-glutamato (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) na superfície rostral ventrolateral do bulbo. Abreviações: NA – núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; RVLM: bulbo ventrolateral rostral; py: pirâmides; bas: artéria basilar ......................................................... 102

Page 18: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 30. Registros de preparações de um rato controle (painel a esquerda) e de um ratos submetido à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de aumento na atividade simpática [ANSt, original e integrado (∫)] e abdominal [Abd, original e integrado (∫)] e a redução na freqüência de despolarização do nervo frênico [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela microinjeção unilateral de ATP 10 mM (setas) na superfície rostral ventrolateral do bulbo ........................................... 105

Figura 31. Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, A), aumentos nas atividades simpática torácica (∆ANSt, B) e motora abdominal (∆Abd, C) e redução na freqüência de despolarização do nervo frênico (∆ANF, D) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de ATP (1, 10 e 50 mM) na superfície rostral ventrolateral do bulbo de preparações de ratos controle (Controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). Note o deslocamento para a direita da curva ∆ANSt vs [ATP] do grupo HCI em relação ao grupo controle. * P < 0,05; # P = 0,0019 – diferentes em relação ao grupo controle. Nesses gráficos, o eixo X (concentração de ATP) está representado em escala logarítmica .............................................................................................................................. 106

Figura 32. Evolução temporal das respostas de redução da freqüência de despolarização do nervo frênico (ANF) promovidas pelas microinjeções (tempo 0) de 1 mM (painel superior), 10 mM (painel intermediário) e 50 mM (painel inferior) de ATP no RVL de preparações de ratos controle (controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). * P < 0,05, # P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle .............................................. 107

Figura 33. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de ATP (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) na superfície rostral ventrolateral do bulbo. Abreviações: NA – núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; RVLM: bulbo ventrolateral rostral; py: pirâmides; bas: artéria basilar ......................................................... 108

Figura 34. Registros da freqüência cardíaca (FC) e das atividades originais e integradas (∫) dos nervos vago cervical (ANVc), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) de preparações de um rato controle (Controle, painel da esquerda) e de um rato submetido à HCI (HCI, painel da direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando os efeitos das microinjeções unilaterais de L-glutamato (250 mM) no NTS caudal (indicadas pelas setas).............................................................................................................................. 111

Figura 35 – Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, painel A), excitação vagal (∆ANVc, painel B) e simpática (∆ANSt, painel C) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (25, 50 e 250 mM) no NTS de preparações de ratos controle (Controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). * P < 0,05, # P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle. Nesses gráficos, o eixo X (concentração de L-glutamato) está representado em escala logarítmica .......................... 112

Figura 36. Evolução temporal da freqüência de despolarização do nervo frênico em resposta às microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (25, 50 e 250 mM, tempo 0) no NTS caudal de preparações de ratos controle (controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). * P < 0,001; # P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle......................................................................................................................... 113

Page 19: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 37. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de L-glutamato (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil............... 114

Figura 38. Registros da freqüência cardíaca (FC) e das atividades originais e integradas (∫) dos nervos vago cervical (ANVc), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) de preparações de um rato controle (Controle, painel da esquerda) e de um rato submetido à HCI (HCI, painel da direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando os efeitos das microinjeções unilaterais de α,β,metil-ATP (50 mM) no NTS caudal (indicadas pelas setas).............................................................................................................................. 116

Figura 39. Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, painel A), excitação vagal (∆ANVc, painel B) e simpática (∆ANSt, painel C) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de α,β,metil-ATP (25, 50 e 100 mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (n = 9) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). Nesses gráficos, o eixo X (concentração de α,β,metil-ATP) está representado em escala logarítmica.................................. 117

Figura 40. Evolução temporal da freqüência de despolarização do nervo frênico em resposta às microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de α,β,metil-ATP (25, 50 e 100 mM, tempo 0) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 9) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10) ............................................................................... 118

Figura 41. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os sítios das microinjeções unilaterais de α,β,metil-ATP (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil............... 119

Figura 42. Registros de uma preparação de um rato controle, representativa do grupo, mostrando as respostas de simpato-excitação, de bradicardia e de taquipnéia promovidas pela ativação do quimiorreflexo com KCN (indicado pela seta) antes (controle) e 2, 10, 30, 45 e 60 minutos após as microinjeções de KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal. FC: freqüência cardíaca; ANSt: atividade do nervo simpático torácico [original e integrada (∫)]; ∫ANF: atividade integrada do nervo frênico.................................................... 120

Figura 43. Registros de uma preparação de um rato submetido à HCI, representativa do grupo, mostrando as respostas de simpato-excitação, de bradicardia e de taquipnéia promovidas pela ativação do quimiorreflexo com KCN (indicado pela seta) antes (controle) e 2, 10, 30, 45 e 60 minutos após as microinjeções de KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal. FC: freqüência cardíaca; ANSt: atividade do nervo simpático torácico [original e integrada (∫)]; ∫ANF: atividade integrada do nervo frênico .................... 121

Figura 44. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta de bradicardia (∆FC) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN (0,05%). * P < 0,05 - diferente em relação à respectiva resposta controle (C)............................................................................................................................. 123

Page 20: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 45. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta simpato-excitatória (∆ ANSt) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN (0,05%). ‡ P < 0,05 – diferente em relação à respectiva resposta controle do grupo (C); * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle ........... 124

Figura 46. Porcentagem de inibição da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo (% inibição ANSt), em relação às respectivas respostas controle, após duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) .............................................. 124

Figura 47. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a freqüência basal de despolarização do nervo frênico (ANF basal). ‡ P < 0,01 – diferente em relação à respectiva freqüência basal (antes). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.................................................................................................. 125

Figura 48. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta de taquipnéia (∆ ANF) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN ........................................................................................................... 125

Figura 49. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo (A) de preparações de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos (B) a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções bilaterais de KYN + PPADS (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil .......................................................................................................................... 126

Figura 50. Densidade de receptores P2X1, P2X3, P2X4 e P2Y2; e das subunidades NMDAR1 e GluR2/3, avaliada em amostras do região rostral ventrolateral do bulbo, na qual estão localizadas os neurônios pré-motores simpáticos (RVLM) e neurônios respiratórios do BötC e pré-BötC de ratos controle (Controle, n = 3 - 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 3 - 8). Note o aumento da densidade de receptores P2X3 e P2X4 nos animais HCI em relação aos animais controle. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle .................................................................................................................... 128

Figura 51. Densidade das subunidades NMDAR1 e GluR2/3, avaliada em amostras do aspecto caudal do núcleo do trato solitário de ratos controle (Controle, n = 2 - 3) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 3). Note o aumento da densidade da subunidade NMDAR1. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle................................................................. 129

Page 21: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Figura 52. Representação esquemática mostrando o acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos controle. Neurônios expiratórios [pós-inspiratórios (post-inspiratory neurons), post-I, e neurônios expiratórios crescentes (augmenting expiratory neurons), aug-E], localizados no complexo Bötzinger [BötC (Sun et al., 1998; Smith et al., 2007)], e neurônios inspiratórios (insp) localizados no complexo pré-Bötzinger (pré-BötC) e o grupo respiratório ventral rostral (rVRG) estão reciprocamente conectados por vias inibitórias, coordenando o ritmo respiratório (Tian et al., 1999; Richter & Spyer, 2001; Shen et al., 2003; Smith et al., 2007). Os neurônios inspiratórios do rVRG enviam projeções excitatórias para o núcleo motor do frênico localizado no nível cervical (C) da medula espinhal (ME) (Smith et al., 2007; Abdala et al., 2009). Além disso, do rVRG e do BötC partem neurônios motores os quais irão compor o nervo vago (Smith et al., 2007). Os neurônios motores abdominais (Abd) localizados ao nível tóraco-lombar (T/L) da ME recebem projeções excitatórias dos neurônios aug-E do BötC e do grupo respiratório ventral caudal (cVRG) (Tian et al., 1999). O acoplamento simpático-respiratório observado na atividade do nervo simpático torácico de preparações de ratos controle é possivelmente gerado por projeções de neurônios insp e post-I ou diretamente para os neurônios pré-motores simpáticos (SIMP), localizados na porção rostral da superfície ventral do bulbo (rostral ventrolateral medulla, RVLM) (Haselton & Guyenet, 1989), ou via neurônios inibitórios GABAérgicos (GABA) localizados na porção caudal da superfície ventral do bulbo (caudal ventrolateral medulla, CVLM) (Mandel & Schreihofer, 2006). No NTS caudal estão presentes os neurônios inibitórios do grupo respiratório dorsal (DRG) e os neurônios envolvidos com o processamento das respostas do quimiorreflexo (QR). Além disso, estão também representados os neurônios dos núcleos parabraquial (NPB) e Kolliker-Füse (KF) e do núcleo retrotrapezóide (nRT), os quais geram estímulos excitatórios para os neurônios do grupo respiratório ventral (Smith et al., 2007; Abdala et al., 2009) ...................................................................................................... 157

Figura 53. Representação esquemática mostrando as alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos submetidos à HCI. Favor consultar legenda da figura 52 para as abreviaturas. Em ratos HCI, a excitabilidade dos neurônios aug-E do BötC parece estar aumentada, promovendo a excitação dos neurônios pré-motores do cVRG e dos neurônios motores abdominais, acarretando em um aumento da atividade Abd (expresso em vermelho). O aumento da atividade dos neurônios aug-E após a HCI também promove uma depressão da atividade dos neurônios post-I e, conseqüentemente, uma diminuição da atividade pós-inspiratória do nervo vago (expresso em azul). Nenhuma alteração significativa foi observada na atividade inspiratória basal de ratos HCI devido às recíprocas e equivalentes alterações nas atividades inibitórias dos neurônios aug-E e post-I sobre a atividade dos neurônios insp. Além disso, nós sugerimos que o aumento da excitabilidade dos neurônios aug-E está, provavelmente, promovendo a excitação dos neurônios SIMP e dos neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermédio-lateral (IML) (Sun et al., 1997; Tian et al., 1999), causando o aumento da atividade simpática durante a fase final da expiração. Ademais, também propomos que a exposição à HCI promove, no NTS caudal, um aumento da expressão de receptores ionotrópicos glutamatérgicos nos neurônios DRG e nos neurônios do QR envolvidos com a resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo. Na superfície ventral, sugerimos que a HCI induza ao aumento da expressão de receptores purinérgicos em neurônios SIMP do RVLM e em neurônios insp do pré-BötC. Possíveis alterações nos neurônios do nRT e nos neurônios do QR do NTS caudal envolvidos com a resposta de taquipnéia do quimiorreflexo ainda estão para ser elucidadas ........................................................................................................ 158

Page 22: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

µM Micromolar

10N Núcleo motor dorsal do vago

12N Núcleo do hipoglosso

7 Núcleo do nervo facial

A5 Área A5 da ponte

Abd Atividade do nervo motor abdominal

ANF Atividade do nervo frênico

ANSt Atividade do nervo simpático torácico

ANVc Atividade eferente do nervo vago

AOS Apnéia obstrutiva do sono

AP Área postrema

AT1 Receptor do tipo 1 da angiotensina II

ATP Adenosina tri-fosfato

aug-E Neurônio expiratório crescente

AVP Arginina-vasopressina

AVPx β-mercapto-β,β-cyclopenta-methylenepropionyl1,O-Me-Tyr2,Arg8]-vasopressin

bas Artéria basilar

BötC Complexo Bötzinger

bpm Batimentos por minuto

CO2 Dióxido de carbono

cpm Ciclos por minuto

CVLM Região caudal ventrolateral do bulbo

cVRG Porção caudal do grupo respiratório caudal

DRG Grupo respiratório dorsal

early-I Neurônio inspiratório inicial

Ef Expiração final

Em Expiração média

FC Freqüência cardíaca

FiO2 Fração inspirada de oxigênio

fR Freqüência respiratória

GABA Ácido gama-aminobutírico

Page 23: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

GLUR 2/3 Subunidade do receptor ionotrópico AMPA do L-glutamato

Gr Núcleo Grácil

HCI Hipóxia crônica intermitente

HF High frequency

HXT Hexametônio

Hz Hertz

I Inspiração

i.v. Intravenoso

IML Coluna intermediolateral da medula espinhal

insp Neurônios inspiratórios

IP Intervalo de pulso

KCN Cianeto de potássio

kDa Kilo Dalton

KF Núcleo Kölliker-Fuse

kg Kilograma

kHz Kilo Hertz

KYN Ácido quinurênico

late-E Neurônio expiratório crescente

late-I Neurônio inspiratório final

LF Low frequency

LOS Losartan

LRt Formação reticular lateral

ME Medula espinhal

mg Miligrama

mM Milimolar

mmHg Milímetro de mercúrio

ms Milissegundo

N2 Nitrogênio

NA Núcleo ambigus

nL Nanolitro

NMDAR1 Subunidade do receptor ionotrópico NMDA do L-glutamato

NPB Núcleo parabraquial

nRT Núcleo retrotrapezóide

Page 24: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

NTS Núcleo do trato solitário

NTSc Aspecto caudal do núcleo do trato solitário

NTSi Aspecto intermediário do núcleo do trato solitário

NTSr Aspecto rostral do núcleo do trato solitário

O2 Oxigênio

OS Oliva superior

P2X1 Receptor ionotrópico do ATP do tipo 1

P2X3 Receptor ionotrópico do ATP do tipo 3

P2X4 Receptor ionotrópico do ATP do tipo 4

P2Y2 Receptor metabotrópico do ATP do tipo 2

PAD Pressão arterial diastólica

PAM Pressão arterial média

PaO2 Pressão parcial de oxigênio no sangue arterial

PAP Pressão arterial pulsátil

PAS Pressão arterial sistólica

PCO2 Pressão parcial de dióxido de carbono

pFRG Grupo respiratório parafacial

pH Potencial hidrogeniônico

PI Pós-inspiração

PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride

PO2 Pressão parcial de oxigênio

PP Pressão de pulso

PPADS pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2’,4’-disulfonic acid

pre-BötC Complexo pré-Bötzinger

pre-I Neurônio pré-inspiratório

py Pirâmides

QR Quimiorreflexo

r Coeficiente de correlação

ROS Espécies reativas do oxigênio (reactive oxygen species)

RVL Região ventrolateral do bulbo

RVLM Região rostral ventrolateral do bulbo

rVRG Porção rostral do grupo respiratório ventral

s Segundos

Page 25: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

SIMP Neurônio pré-motor simpático do RVLM

V1a Receptor do tipo 1a da vasopressina

VE Volume minuto

VRG Grupo respiratório ventral

VT Volume corrente

Page 26: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................29

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................41

3. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................44

3.1. Animais ..........................................................................................................................45

3.2. Hipóxia Crônica Intermitente ........................................................................................45

3.3. Procedimentos experimentais in vivo.............................................................................47

3.3.1. Análise do ganho de peso dos animais....................................................................47

3.3.2. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares basais em animais acordados ............47

3.3.3. Avaliação da freqüência respiratória, volume corrente e volume minuto basais em animais acordados .......................................................................................................48

3.3.4. Avaliação do tônus vasomotor simpático em ratos acordados................................50

3.3.4.1. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica e do intervalo de pulso..50

3.3.4.2. Resposta ao bloqueio ganglionar......................................................................51

3.3.5. Determinação da concentração plasmática de vasopressina ...................................51

3.3.6. Avaliação da função barorreflexa ...........................................................................52

3.3.6.1. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo .................................................52

3.3.6.2. Análise da curva sigmoidal do barorreflexo.....................................................52

3.3.7. Análise da reversibilidade da hipertensão após o término da HCI .........................54

3.4. Procedimentos in situ - preparação coração tronco cerebral isolados ...........................54

3.4.1. Solução de perfusão ................................................................................................54

3.4.2. Procedimento cirúrgico e perfusão da preparação ..................................................54

3.4.3. Registros das atividades eferentes dos nervos vago, frênico, simpático torácico e frênico.............................................................................................................................56

3.4.4. Ativação do quimiorreflexo ....................................................................................58

Page 27: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3.4.5. Microinjeções de agonistas ou antagonistas farmacológicos em regiões bulbares.58

3.4.6. Análises dos resultados ...........................................................................................59

3.4.6.1. Análise do padrão respiratório basal ................................................................59

3.4.6.2. Análise do acoplamento entre as atividades simpática e respiratória...............60

3.4.6.3. Análise da correlação curzada entre as atividades simpática e respiratória .....62

3.4.6.4. Respostas autonômicas e respiratórias à ativação do quimiorreflexo e à microinjeções em regiões bulbares................................................................................62

3.4.7. Protocolos experimentais ........................................................................................63

3.4.7.1. Análise dos parâmetros autonômicos e respiratórios basais após 10 dias de HCI ................................................................................................................................63

3.4.7.2. Respostas autonômicas e respiratórias à ativação do quimiorreflexo após 10 dias de HCI ....................................................................................................................63

3.4.7.3. Avaliação dos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos na superfície rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI .......................................................63

3.4.7.4. Avaliação dos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos no aspecto caudal do núcleo do trato solitário 10 dias após a HCI .................................................64

3.4.8. Análise histológica ..................................................................................................64

3.5. Procedimentos in vitro – análise da densidade de receptores glutamatérgicos e purinérgicos em subregiões do bulbo ...................................................................................65

3.5.1. Coleta e preparo das amostras.................................................................................65

3.5.2. Western blot dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos ..................................66

3.6. Análise estatística ..........................................................................................................67

4. RESULTADOS ...................................................................................................................69

4.1. Resultados obtidos em animais acordados.....................................................................70

4.1.1. Efeito da exposição à HCI por 10 dias sobre o ganho de peso dos ratos jovens.....70

4.1.2. Parâmetros cardiovasculares basais após 10 dias de HCI .......................................70

4.1.3. Parâmetros respiratórios basais após 10 dias de HCI..............................................73

4.1.4. Tônus simpático vasomotor em ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias..........74

Page 28: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

4.1.4.1. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica e do intervalo de pulso após 10 dias de HCI.......................................................................................................74

4.1.4.2. Respostas cardiovasculares ao bloqueio ganglionar após 10 dias de HCI .......76

4.1.5. Concentração plasmática de vasopressina após 10 dias de HCI .............................78

4.1.6. Avaliação da função baroreflexa.............................................................................79

4.1.6.1. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo após 10 dias de HCI ................79

4.1.6.2. Análise da curva sigmoidal do barorreflexo após 10 dias de HCI ...................79

4.1.7 Valores da pressão arterial média e da freqüência cardíaca basais 1 dia e 15 dias após o término da exposição à HCI por 10 dias................................................................81

4.2. Resultados obtidos na preparação coração-tronco cerebral isolados.............................83

4.2.1. Análise dos parâmetros basais ................................................................................83

4.2.1.1. Pressão de perfusão de freqüência cardíaca basais após 10 dias de HCI .........83

4.2.1.2. Padrão respiratório após 10 dias de HCI ..........................................................84

4.2.1.3. Acoplamento simpático-respiratório após 10 dias de HCI...............................86

4.2.1.4. Análise da correlação cruzada entre as atividades abdominal e simpática após 10 dias de HCI.......................................................................................................89

4.2.2. Respostas autonômicas e respiratória à ativação do quimiorreflexo após 10 dias de HCI ...............................................................................................................................91

4.2.3. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção unilateral de diferentes concentrações de L-glutamato na superfície rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI ................................................................................................97

4.2.4. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção unilateral de diferentes concentrações de ATP na superfície rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI.................................................................................................................103

4.2.5. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção unilateral de diferentes concentrações de L-glutamato no aspecto caudal do núcleo do trato solitário após 10 dias de HCI ..........................................................................................109

4.2.6. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção unilateral de diferentes concentrações de α, β, metil-ATP no aspecto caudal do núcleo do trato solitário após 10 dias de HCI ..........................................................................................114

4.2.7. Efeito do antagonismo dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos no aspecto caudal do núcleo do trato solitário sobre as respostas à ativação do quimiorreflexo após 10 dias de HCI ...............................................................................119

Page 29: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

4.3. Avaliação da densidade de receptores glutamatérgicos e purinérgicos no tronco cerebral................................................................................................................................127

4.3.1. Densidade dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos na superfície rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI ....................................................................127

4.3.2. Densidade dos receptores glutamatérgicos no aspecto caudal do núcleo do trato solitário após 10 dias de HCI ..........................................................................................129

5. DISCUSSÃO .....................................................................................................................130

6. CONCLUSÕES.................................................................................................................159

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................................161

ANEXOS ...............................................................................................................................175

ANEXO A – Artigos publicados relacionados à tese .........................................................176

ANEXO B – Artigos publicados não relacionados à tese...................................................177

Page 30: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

1. INTRODUÇÃO

Page 31: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 30

A manutenção dos níveis adequados da pressão arterial de oxigênio no sangue arterial

(PaO2) é imprescindível para a vida e a falta de oxigênio (O2) para os tecidos pode promover

importantes alterações no funcionamento ou a morte celular (Powell et al., 2000; Peña &

Ramirez, 2005). Apesar de todas as células do organismo serem capazes de detectar variações

de O2, um conjunto de células neurais localizadas, principalmente, nos corpúsculos

carotídeos, apresentam a característica de se despolarizar em condições de hipóxia (Fitzgerald

& Lahiri, 1996; Lahiri et al., 2006), enviando potenciais de ação para o sistema nervoso

central e, por sua vez, promovendo a ativação de ajustes cardiovasculares e respiratórios

reflexos com o objetivo de restaurar a PaO2 para valores adequados. Esses ajustes se

caracterizam por respostas de aumento da pressão arterial, decorrente de um aumento da

atividade simpática, e o aumento da ventilação (Barros et al., 2002; Braga et al., 2007), as

quais ocorrem de forma sincronizada com o objetivo de otimizar os processos de aumento da

ventilação pulmonar e do débito cardíaco, melhorando a eficiência da captação de O2 e da

perfusão tecidual. Além dessas respostas simpática e respiratória, a ativação dos

quimiorreceptores periféricos em ratos também promove respostas de redução da freqüência

cardíaca e de alterações comportamentais, caracterizadas pela exploração do ambiente (Barros

et al., 2002).

Há evidências experimentais mostrando que importantes alterações nos mecanismos

que controlam as atividades simpática e respiratória são observados após a exposição crônica

à hipóxia (Powell et al., 2000; Hsieh et al., 2004; Peña & Ramirez, 2005; Chung et al., 2006;

Kline et al., 2007; Semenza & Prabhakar, 2007; Bantikyan et al., 2009; Iturriaga et al., 2009),

acarretando importantes disfunções cardiovasculares e ventilatórias. Tais disfunções são

também observadas após a exposição prolongada a episódios de hipóxia intercalados por

períodos de normóxia, condição esta denominada de hipóxia crônica intermitente (HCI). Em

humanos, essa condição pode ser observada principalmente em pacientes com apnéia

Page 32: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 31

obstrutiva do sono (AOS), os quais são submetidos à hipóxia intermitente em conseqüência

dos sucessivos períodos de obstrução das vias aéreas superiores durante o sono (Caples et al.,

2005; Dempsey et al., 2010). Estudos epidemiológicos demonstram que pacientes com AOS

apresentam uma maior predisposição a desenvolverem distúrbios cardiovasculares, tais como

a hipertensão pulmonar, disfunção vascular, arritmias e insuficiência cardíaca (Caples et al.,

2005). Contudo, a principal disfunção cardiovascular observada na AOS é o desenvolvimento

da hipertensão arterial (Hla et al., 1994; Somers, 1995). Ainda que a AOS, geralmente, está

associada a outros fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como

a obesidade e disfunções metabólicas (Kiely & McNicholas, 2000; Ortega & Mion, 2009),

vários estudos propuseram uma relação entre a exposição à hipóxia intermitente e a gênese da

hipertensão arterial na AOS (Fletcher, 1995; Somers, 1995; Narkiewicz et al., 2005). Nesse

sentido, com o objetivo de elucidar esta relação entre o aumento da pressão arterial e a HCI,

estudos em modelos animais têm sido conduzidos para verificar o efeito da exposição à HCI

sobre os mecanismos envolvidos no controle da função cardiovascular.

Estudos de Fletcher et al. documentaram que ratos adultos submetidos à HCI por 35

dias apresentaram um aumento significativo da pressão arterial basal (Fletcher et al., 1992b),

o qual foi prevenido pela remoção dos quimiorreceptores periféricos previamente a exposição

à HCI (Fletcher et al., 1992a), indicando uma importante contribuição da estimulação

intermitente dos quimiorreceptores periféricos para o desenvolvimento dos níveis elevados da

pressão arterial. Posteriormente, estudos do nosso laboratório demonstraram que ratos adultos

submetidos à HCI por 35 dias, em condições acordadas e livre movimentação, apresentaram

uma maior resposta depressora ao bloqueio ganglionar e níveis plasmáticos de noradrenalina

mais elevados, indicando que a hipertensão observada em ratos adultos expostos à HCI estava

associada a um aumento da atividade simpática basal (Zoccal et al., 2007b). Dessa forma, o

sistema nervoso simpático parece ter um importante papel na gênese da hipertensão induzida

Page 33: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 32

pela HCI. Entretanto, os mecanismos pelos quais a HCI promove o aumento da atividade

simpática basal, e como essa atividade aumentada influenciaria os níveis da pressão arterial,

ainda não estão elucidados.

Além das alterações no controle cardiovascular basal, ratos submetidos à HCI também

apresentam uma maior resposta simpato-excitatória à ativação dos quimiorreceptores

periféricos (Greenberg et al., 1999a; Braga et al., 2006), sugerindo que as vias neurais

envolvidas com a simpato-excitação apresentam alterações que facilitam o processamento

desta resposta. Sabe-se que as aferências dos quimiorreceptores periféricos fazem suas

primeiras sinapses no sistema nervoso central no núcleo do trato solitário (NTS) (Donoghue

et al., 1984; Mifflin, 1992; Andresen & Kunze, 1994), região localizada na superfície dorsal

do bulbo. Desta região, partem projeções que vão promover a ativação dos neurônios pré-

motores simpáticos da região rostral ventrolateral do bulbo (RVLM), direta (Aicher et al.,

1996; Koshiya & Guyenet, 1996a; Accorsi-Mendonca et al., 2009) ou indiretamente, via

conexões com núcleos localizados na ponte, como o núcleo parabraquial (Haibara et al.,

2002), ou no próprio bulbo, como o núcleo retrotrapezóide (Takakura et al., 2006) ou com a

região caudal ventrolateral do bulbo (CVLM) (Mandel & Schreihofer, 2009). Portanto,

possíveis alterações promovidas pela HCI na atividade ou excitabilidade dos neurônios

localizados nos grupamentos neuronais envolvidos com as respostas do quimiorreflexo podem

contribuir não somente para a maior resposta simpato-excitatória quimiorreflexa dos ratos

HCI, mas também para o aumento da atividade simpática basal e a conseqüente hipertensão

arterial. Nesse sentido, estudos de Greenberg et al. (1999b) mostraram que em situações de

hipóxia ocorre um aumento da expressão da proteína fos em regiões do tronco cerebral

envolvidas com a geração e modulação da atividade simpática, como, por exemplo, o NTS e o

RVLM, sugerindo uma maior ativação desses grupamentos neuronais pela HCI. Entretanto,

Page 34: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 33

não há estudos explorando os possíveis mecanismos envolvidos nas alterações no controle da

atividade simpática após a HCI.

Além do sistema nervoso simpático, há evidências de que a HCI pode também

interferir significativamente com os mecanismos envolvidos no controle da respiração. De

forma semelhante ao componente simpato-excitatório, a resposta de taquipnéia promovida

pela estimulação dos quimiorreceptores periféricos se mostrou facilitada em ratos expostos à

HCI, apresentando-se com uma maior duração (Ling et al., 2001; Braga et al., 2006). Além

disso, o fenômeno de aumento da atividade motora respiratória basal observado após a

exposição a um curto período de episódios de hipóxia intermitente, denominado de facilitação

respiratória a longo prazo, foi de maior magnitude e duração em ratos HCI (Baker & Mitchell,

2000; McGuire et al., 2003). Esses resultados sugerem que a rede neural envolvida com a

geração e controle da respiração é influenciada pela HCI. Contudo, não há estudos explorando

quais grupamentos neuronais do tronco cerebral e quais os mecanismos pelos quais a HCI

altera o controle da atividade respiratória.

A atividade respiratória basal é gerada por neurônios localizados no tronco cerebral, os

quais, por meio de conexões recíprocas e inibitórias, coordenam a atividade de neurônios

motores inspiratórios e expiratórios (Richter, 1982; Richter & Spyer, 2001; Smith et al.,

2007). Esses neurônios respiratórios pontinos e bulbares são genericamente classificados de

acordo com o padrão de atividade (decrescente ou crescente) e com a fase do ciclo

respiratório na qual estes neurônios apresentam atividade, como, por exemplo: pré-

inspiratório (pre-inspiratory, pre-I); inspiratório inicial (early inspiratory, early-I);

inspiratório final (late inspiratory, late-I); pós-inspiratório (post-inspiratory, post-I) e

expiratório final ou crescente [late expiratory (late-E) ou augmenting expiratory (aug-E)]

(Bianchi et al., 1995). Evidências experimentais indicam que os neurônios respiratórios

localizados no grupo respiratório ventral (VRG) apresentam um papel dominante na geração

Page 35: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 34

do ritmo respiratório basal (Bianchi et al., 1995; Feldman & Del Negro, 2006). Este

grupamento é subdividido em 4 regiões funcionalmente distintas e orientadas no sentido

rostro-caudal: i) complexo Bötzinger (BötC), região que contém neurônios post-I e aug-E, a

qual é considerada a principal fonte da atividade expiratória; ii) complexo pré-Bötzinger (pré-

BötC), grupo de inter-neurônios pre-I e early-I considerados como essenciais para a geração

da atividade inspiratória; iii) porção rostral do grupo respiratório ventral (rVRG), o qual

contém neurônios pré-motores late-I; e iv) porção caudal do grupo respiratório ventral

(cVRG), o qual contém neurônios bulbo-espinais aug-E (Ezure, 1990; Smith et al., 1991;

Bianchi et al., 1995; Ezure et al., 2003; Smith et al., 2007).

O VRG estabelece conexões com outros outros núcleos do tronco cerebral, os quais

são também importantes para promover o padrão eupnêico da respiração em mamíferos. Na

porção dorso-lateral da ponte estão localizados os núcleos parabraquial e Kölliker-Fuse, cujos

neurônios têm sido considerados importantes para a geração do ritmo respiratório basal por

prover estímulos excitatórios aos neurônios do VRG (Smith et al., 2007; Mörschel &

Dutschmann, 2009). Além disso, em uma porção dorsal do bulbo, a qual também compreende

a região do NTS, estão localizados grupamentos de neurônios inspiratórios e expiratórios, os

quais constituem o grupo respiratório dorsal (GRD). Apesar do seu papel na geração do ritmo

respiratório basal ainda não estar completamente esclarecido, estudos mostram que estes

neurônios do GRD apresentam uma importante função modulatória sobre os neurônios

respiratórios da ponte e do VRG (Bianchi et al., 1995; Subramanian et al., 2007; Braccialli et

al., 2008). Além disso, um grupo de neurônios localizados abaixo do núcleo do nervo facial,

denominado de núcleo retrotrapezóide (nRT), também têm sido considerado importante no

contexto da atividade respiratória, pois é um importante sítio responsável pela

quimiorrecepção central, modulando a atividade dos neurônios do VRG quando da alteração

do CO2/H+ no sangue arterial.

Page 36: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 35

Um importante aspecto relacionado ao sistema respiratório se refere ao seu importante

papel como modulador da atividade simpática. Sabe-se que a atividade respiratória é capaz de

de gerar oscilações rítmicas na atividade eferente simpática (Adrian & Bronk, 1932; Anrep et

al., 1936; Zhou & Gilbey, 1992; Pilowsky, 1995; Zhong et al., 1997). Estudos mostram que,

apesar de haver diferenças entre espécies (Häbler et al., 1994) ou entre diferentes nervos

simpáticos registrados (Gilbey et al., 1986; Jänig & Häbler, 2003), a atividade simpática

apresenta aumentos fásicos predominantemente durante a fase inspiratória ou início da fase

expiratória (Malpas, 1998). Há evidências de que parte deste acoplamento entre as atividades

simpática e respiratória é conseqüente das informações reflexas provenientes, principalmente,

dos receptores de estiramento pulmonar, os quais são ativados a cada ciclo respiratório (Anrep

et al., 1936; Boczek-Funcke et al., 1992). Entretanto, estudos documentaram que as

oscilações respiratórias na atividade simpática persistem após a vagotomia e a decerebração,

indicando que o acoplamento entre as atividades simpática e respiratória é gerado

primariamente no tronco cerebral, por meio de conexões entre os neurônios simpáticos e

respiratórios (Barman & Gebber, 1980; Haselton & Guyenet, 1989; Miyazaki et al., 1998). De

fato, se considerarmos que os grupamentos neuronais envolvidos com a geração e modulação

da atividade simpática estão, praticamente, sobrepostos aos neurônios responsáveis pela

geração do ritmo respiratório basal (conforme ilustrado na figura 1), não é difícil considerar a

hipótese da existência de múltiplas conexões sinápticas entre esses diferentes grupamentos

neuronais.

Dessa forma, baseado nas evidências de que a exposição à HCI promove alterações

tanto no controle da atividade eferente simpática como no controle neural da respiração (Ling

et al., 2001; McGuire et al., 2003; Braga et al., 2006; Zoccal et al., 2007b), no presente

estudo consideramos a hipótese de que ratos submetidos à HCI apresentam um padrão

alterado no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória, caracterizado,

Page 37: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 36

possivelmente, por um aumento da excitação dos neurônios simpáticos pelos neurônios

respiratórios, o qual poderia contribuir para o aumento das oscilações respiratórias na

atividade simpática, acarretando numa elevação dos níveis da atividade simpática basal

média. Para tanto, no presente estudo realizamos procedimentos experimentais tanto em ratos

acordados como em preparações in situ coração – tronco cerebral isolados. Em relação à

preparação in situ, esta apresenta algumas vantagens, tais como: i) é livre dos efeitos

depressores da anestesia; ii) exibe padrões de atividades simpática e respiratória coerentes

com aqueles observados nos modelos experimentais in vivo, embora a uma menor freqüência

respiratória; iii) o acoplamento simpático-respiratório é evidente, mesmo na ausência das

informações aferentes dos mecanoreceptores e receptores pulmonares, uma vez que a caixa

torácica está aberta; os pulmões, quando presentes, estão estáticos e a pressão de perfusão não

é pulsátil; iv) os reflexos cardiovasculares, tais como o baro- e o quimiorreflexo, estão

preservados; v) permite a avaliação simultânea de vários parâmetros cardio-respiratórios, por

meio dos registros da atividade eferente de diversos nervos motores, como, por exemplo, os

nervos simpático torácico, frênico, vago e abdominal. Portanto, no nosso entendimento, a

preparação coração-tronco cerebral isolados é uma ferramenta experimental adequada para os

estudos das funções autonômicas e respiratória.

Page 38: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 37

Figura 1. Esquema mostrando os diferentes grupos neuronais localizados na ponte e no bulbo, os quais estão envolvidos com a geração e modulação da atividade eferente simpática e do ritmo respiratório basal. Abreviaturas – NPB: núcleo parabraquial; KF: Kölliker-Fuse; A5: áera A5 da ponte; OS: oliva superior; 7: núcleo do nervo facial; nRT: núcleo retrotrapezóide; NA: núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; pré-BötC: complexo pré-Bötzinger; rVRG: grupo respiratório ventral rostral; cVRG: grupo respiratório ventral caudal; RVLM: região rostral ventrolateral do bulbo; CVLM: região caudal ventrolateral do bulbo; LRt: núcleo reticular lateral; AP: área postrema; NTSr: porção rostral do núcleo do trato solitário; NTSi: porção intermediária do núcleo do trato solitário; NTSc: porção caudal do núcleo do trato solitário; GRD: grupo respiratório dorsal.

Com o objetivo de explorar os possíveis mecanismos envolvidos nas alterações simpáticas

e respiratórias em ratos submetidos à HCI, duas importantes regiões do tronco cerebral foram os

focos de estudo do presente trabalho: i) o NTS, sítio no tronco cerebral responsável pelo

processamento das informações aferentes dos quimiorreceptores periféricos; e ii) a superfície

rostral ventrolateral do bulbo, denominada aqui de RVL, a qual contém os neurônios geradores da

atividade simpática e respiratória localizados na RVLM, no BötC e no pré-BötC.

Bulbo

7

NA

nRT RVLM

cVRGrVRG

BötC

LRt

NTSi

AP

NTSc

NPB

KF

OS

A5

Aferênciasperiféricas

pré-BötC

CVLM

Ponte

Encéfalo

Cerebelo

Medula Espinhal

NTSr

GRD

Page 39: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 38

O NTS é um importante núcleo para o controle das atividades simpática e respiratória,

uma vez que este recebe as informações aferentes dos mecano- e quimiorreceptores

localizados tanto no sistema cardiovascular como no sistema respiratório, como, por exemplo,

os barorreceptores, quimiorreceptores, receptores cardiopulmonares e os receptores de

estiramento pulmonar (Spyer, 1990). Este núcleo pode ser subdividido, no sentido rostro-

caudal, em três regiões, definidas com base na sua posição em relação à área postrema: NTS

rostral, NTS intermediário e NTS caudal (NTSc) (Loewy, 1990), conforme ilustra a figura 1.

Há evidências de que o NTSc é a sub-região que recebe, preferencialmente, as aferências dos

quimiorreceptores periféricos (Donoghue et al., 1984; Mifflin, 1992; Andresen & Kunze,

1994). Considerando a resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo, estudos do nosso

laboratório verificaram que o antagonismo simultâneo, mas não isolado, dos receptores

ionotrópicos do L-glutamato e dos receptores P2 do ATP no NTSc foram efetivos em atenuar

a magnitude do aumento da atividade simpática promovida pela estimulação dos

quimiorreceptores periféricos (Braga et al., 2007), sugerindo que o L-glutamato e o ATP são

os neurotransmissores envolvidos no processamento da resposta simpato-excitatória do

quimiorreflexo no NTSc. Fundamentados nessas informações e nas observações de que a

simpato-excitação à ativação do quimiorreflexo é maior após a exposição à HCI, no presente

estudo verificamos se a HCI promove alterações na neurotransmissão glutamatérgica e

purinérgica no NTSc.

No RVL, os mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos também parecem apresentar

um papel importante na transdução das respostas simpática e respiratórias à hipóxia. Estudos

de Koshiya et al. (1993) mostraram que o antagonismo dos receptores ionotrópicos do L-

glutamato no RVLM bloqueou a resposta simpática do quimiorreflexo, sugerindo um

importante papel do L-glutamato no processamento desta resposta ao nível da superfície

ventral do bulbo. Além disso, estudos de Gourine et al. (2005a; 2005b) evidenciaram que, em

Page 40: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 39

condições de hipóxia, o ATP era liberado na superfície ventral do bulbo e que este aumento

da concentração extracelular de ATP estava correlacionado às alterações reflexas na atividade

respiratória, tendo os autores sugerido um papel para o ATP no processamento da resposta

ventilatória à hipóxia. De forma interessante, essa liberação de ATP foi restrita as regiões da

superfície ventral do bulbo envolvidas com a geração do ritmo respiratório basal (Gourine et

al., 2005a). Portanto, no presente estudo avaliamos as possíveis alterações nos mecanismos

glutamatérgicos e/ou purinérgicos no RVL de ratos submetidos à HCI.

Para explorarmos as hipóteses apresentadas anteriormente, utilizamos o modelo de

ratos jovens (19 – 21 dias) submetidos à HCI por 10 dias, conforme estudos prévios do nosso

laboratório (Braga et al., 2006). Um das razões para a escolha de animais dessa idade se deu

por uma limitação técnica da preparação coração-tronco cerebral isolados, a qual é ideal para

ratos até 100 g. Contudo, não há estudos na literatura mostrando os efeitos da HCI sobre o

sistema cardiovascular de ratos durante este período crítico de desenvolvimento. Nesse

sentido, no presente estudo procuramos caracterizar as alterações cardiovasculares,

especialmente na atividade simpática e na pressão arterial basais, promovidas pela HCI em

ratos jovens acordados. Considerando estudos demonstrando que animais adultos submetidos

à HCI por 1 a 3 meses apresentam um aumento da pressão arterial basal, a qual estava

associada a uma diminuição do ganho do barorreflexo (Lai et al., 2006; Lin et al., 2007; Yan

et al., 2008), no presente estudo também procuramos verificar se ratos jovens submetidos à

HCI por 10 dias apresentam alterações na função barorreflexa, as quais também contribuiriam

para o desenvolvimento da hipertensão arterial observada neste modelo experimental.

Dessa forma, considerando o conjunto de informações até aqui apresentadas, a

hipótese do presente estudo é a de que ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias apresentam

importantes alterações no acoplamento entre os neurônios envolvidos com a geração das

atividades simpática e respiratória, as quais envolveriam alterações nos mecanismos

Page 41: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Introdução 40

glutamatérgicos e purinérgicos no NTSc e no RVL. Essas alterações nos mecanismos neurais

responsáveis pelo acoplamento simpático-respiratório após a HCI poderiam contribuir de

forma significativa para o aumento das oscilações na atividade simpática, acarretando em

níveis elevados desta atividade e promovendo, conseqüentemente, o aumento da pressão

arterial basal. Além disso, as alterações nos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos nos

neurônios bulbares do NTSc e RVL poderiam também contribuir para a facilitação das

respostas simpática e ventilatória à ativação dos quimiorreceptores periféricos.

Page 42: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

2. OBJETIVOS

Page 43: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Objetivos 42

No presente estudo, procuramos caracterizar as alterações cardio-respiratórias

promovidas pela HCI em ratos jovens, bem como estudar os possíveis mecanismos

envolvidos nessas alterações. Para tanto, utilizamos procedimentos experimentais in vivo, in

situ e in vitro. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram:

a. Avaliar, em animais acordados, os parâmetros cardiovasculares basais de ratos

jovens submetidos à HCI por 10 dias;

b. Determinar, em animais acordados, a atividade respiratória basal (freqüência

respiratória, volume corrente e volume minuto) de ratos jovens submetidos à HCI

por 10 dias;

c. Verificar, por métodos indiretos, o tônus simpático vascular em ratos acordados;

d. Estudar, em ratos acordados, o controle barorreflexo da freqüência cardíaca;

e. Avaliar a atividade simpática basal e o acoplamento entre as atividades simpática e

respiratória em ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias, utilizando a preparação

coração – tronco cerebral isolados;

f. Caracterizar as respostas autonômicas e respiratórias à ativação do quimiorreflexo

em ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias, utilizando a preparação coração –

tronco cerebral isolados;

g. Avaliar o padrão das respostas autonômicas e respiratórias às microinjeções de L-

glutamato e ATP no RVL de ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias, utilizando

a preparação coração – tronco cerebral isolados;

h. Verificar a magnitude das respostas autonômicas e respiratórias às microinjeções

de agonistas e antagonistas glutamatérgicos e purinérgicos no NTSc de ratos

Page 44: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Objetivos 43

jovens submetidos à HCI por 10 dias, utilizando a preparação coração – tronco

cerebral isolados;

i. Determinar, por meio da técnica de western blot, a densidade dos receptores

ionotrópicos glutamatergicos e dos receptores purinérgicos no RVL e no NTSc de

ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias.

Page 45: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Page 46: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 45

3.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar recém desmamados (19 – 21 dias), provenientes do

Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão Preto. Esses animais foram divididos em

dois grupos experimentais: i) Grupo controle: conjunto de animais mantidos em condições de

normóxia; ii) Grupo HCI, conjunto de animais submetidos ao protocolo de hipóxia crônica

intermitente, conforme detalhado a seguir. Todos os procedimentos experimentais utilizados

nestes estudos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA)

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP (Processo nº. 019/2006).

3.2. Hipóxia Crônica Intermitente

Os animais dos grupos controle e HCI foram acondicionados em caixas coletivas

(máximo de 10 animais por caixa) e mantidos em câmaras (volume de 210 L) equipadas com

injetores de gases bem como sensores de O2, CO2, temperatura e umidade. O grupo HCI foi

exposto aos episódios de hipóxia intermitente, os quais consistiam em 5 minutos de normóxia

(fração de oxigênio inspirado, FiO2, de 20,8%) procedido de um período de 4 minutos de

injeção de nitrogênio (N2) reduzir a FiO2 de 20,8% para 6%, permanecendo neste nível por 30

a 40 segundos. Neste nível, verificamos que a PaO2, a qual foi medida por meio de um

analisador de gases sangüíneos (Cobas b 121, Roche, Basel, Suíça) era de aproximadamente

20 mmHg. Em seguida, O2 era injetado dentro da câmara para retornar a FiO2 para 20,8%.

Desta forma, os ratos do grupo HCI eram submetidos a uma FiO2 de 6% por 30-40 segundos a

cada 9 minutos, conforme ilustra a figura 2. Este protocolo de HCI foi repetido 8 horas por dia

(das 9:30hs à 17:30hs) durante 10 dias. Nas 16 horas remanescentes (das 17:30hs às 9:30hs),

os animais eram mantidos em condições de normóxia. A injeção de N2 e O2 (White Martins,

Sertãozinho, Brasil) dentro das câmaras foi regulada por um conjunto de válvulas solenóides

Page 47: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 46

(Oxycycler, Modelo A84XOV, Biospherix, Redfield, EUA), as quais eram automaticamente

operadas por um software apropriado (AnaWin 2, versão 2.4.17). Na mesma sala na qual se

encontram as câmaras dos ratos HCI, os ratos dos grupos controle foram mantidos em câmara

identicas, porém em condições de normóxia, 24h por dia, durante 10 dias. De modo

semelhante ao grupo HCI, os ratos do grupo controle foram também expostos a ruídos de

injeção de gases dentro da câmara devido a freqüente injeção de N2 e O2 para manter a FiO2

em 20,8%. Em ambas as câmaras de ratos controle e HCI, a injeção de gases ocorreu na parte

superior das câmaras, para evitar jatos de ar diretamente sobre os animais, os quais causariam

estresse aos mesmos.

Figura 2. Variações da fração inspirada de oxigênio (% oxigênio) na câmara HCI durante 2 episódios de hipóxia. As barras acima dos traçados indicam o período de injeção de nitrogênio (N2, barras pretas) e oxigênio (O2, barras cinza) dentro da câmara. Durante o período não compreendido pelas barras, pequenas frações de N2 e O2 eram injetadas para manter a concentração fracional de oxigênio próximo a 20,8%. O valor mínimo da fração inspirada de oxigênio (pico do estímulo à hipóxia) foi de 6%, o qual foi mantido durante 30 a 40 s, conforme ilustra o painel direito da figura.

% O

xyge

n

5

7

9

11

13

15

17

19

21

6

30 s

1 min

6

7

N2 O2 N2 O2

% O

xigê

nio

Page 48: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 47

3.3. Procedimentos experimentais in vivo

3.3.1. Análise do ganho de peso dos animais

O peso corporal dos animais do grupo controle e HCI foi avaliados antes e após o

início do protocolo experimental para a avaliação do efeito da exposição à HCI por 10 dias

sobre o ganho de peso dos animais jovens.

3.3.2. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares basais em animais acordados

Para a análise das alterações na pressão arterial promovidas pela HCI, avaliamos esse

parâmetro cardiovascular antes e após o a exposição à HCI. Um dia antes do início do

protocolo experimental, a pressão arterial sistólica (PAS) foi medida indiretamente em ratos

dos grupos controle e HCI pelo método da pletismografia de cauda. Para tanto, os animais

eram mantidos dentro de um aparato de acrílico (IITC Life Science, Woodland Hills, EUA) e

um sensor acoplado a um oclusor era posicionado na cauda do animal (model 31, IITC Life

Science). Em seguida, os animais foram mantidos em uma câmara aquecida à 31-32º C

(model 306, IITC Life Science) e um período de 10 minutos foi considerado para a

estabilização. Após, o sensor/oclusor era operado de um modo a interromper a pulsação

arterial da cauda quando inflado e detectar o restabelecimento das pulsações quando

desinflado, mensurando, dessa forma, os valores da PAS.

Ao final do protocolo experimental, ou seja, no 10º dia, os mesmos grupos de animais

controle e HCI considerados anteriormente para a pletismografia de cauda foram anestesiados

com tribromo-etanol (250 mg/kg, i.p.; Aldrich, Milwaukee, EUA) e um cateter (PE-10

conectado a PE-50, Clay Adams, Parsippany, EUA) foi implantado na aorta abdominal,

através da artéria femoral, para o registro da pressão arterial pulsátil (PAP). O cateter foi

Page 49: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 48

exteriorizado subcutaneamente no dorso do animal, os quais, após a recuperação pós-

anestésica, permaneceram em plenas condições de livre movimentação. No dia seguinte a

cirurgia, quando os animais estavam completamente recuperados da anestesia e adaptados à

sala de registros, o cateter arterial foi conectado a um transdutor de pressão (MLT0380,

ADInstruments, Bella Vista, Australia), o qual, por sua vez, estava conectado a um

amplificador (Bridge Amp, ML221, ADInstruments). Os sinais da PAP foram adiquiridos por

um sistema de aquisisção (PowerLab 4/25, ML845, ADInstruments) e registrados em um

computador a uma freqüência de aquisição de 1 kHz por meio de um software apropriado

(Chart Pro, ADInstruments). Os valores das pressões arteriais diastólica (PAD), média (PAM)

e sistólica (PAS), e da freqüência cardíaca (FC) foram derivados a partir dos sinais da PAP.

Esses parâmetros cardiovasculares foram registrados em animais acordados por 45 a 60

minutos e os dados obtidos durante os últimos 30 minutos foram considerados para as

análises.

3.3.3. Avaliação da freqüência respiratória, volume corrente e volume minuto

basais em animais acordados

Os parâmetros respiratórios foram registrados pelo método da pletismografia de corpo

inteiro (Bartlett Jr & Tenney, 1970). Para tanto, o animal era mantido dentro de uma câmara

de acrílico (volume de 6 L), a qual era adequadamente vedada e as oscilações de pressão

causadas pela respiração, devido a diferença de temperatura entre o ar inspiratdo (~25 ºC) e o

ar expirado (~37 ºC), eram monitoradas por meio de um transdutor diferencial de pressão

(ML141 Spirometer, PowerLab, ADInstruments, Bella Vista, Austrália), o qual, por sua vez,

estava conectado a um sistema de aquisição (PowerLab 4/25, ML845, ADInstruments). Os

sinais foram então digitalizados em um microcomputador a uma freqüência de aquisição de 1

Page 50: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 49

kHz por meio de um software apropriado (Chart Pro, ADInstruments). Os valores de

freqüência respiratória (fR) foram derivados a partir do intervalo de tempo entre suscessivos

ciclos respiratórios e expressos em ciclos por minuto (cpm). Para a medida do volume

corrente (VT), os valores da amplitude dos ciclos respiratórios foram quantificados e aplicados

as equação abaixo, de acordo com (Drorbaugh & Fenn, 1955):

Na qual:

VK: volume de ar injetado na câmara do animal para calibração;

PT: alteração de pressão associada a cada ciclo respiratório;

PK: alteração de pressão associada ao volume de ar injetado para a calibração;

TC: temperatura corporal;

TA: temperatura do ar dentro da câmara do animal;

PB: pressão barométrica;

PC: pressão de vapor d’água à temperatura corporal;

PA: pressão de vapor d’água à temperatura da câmara.

Durante a realização dos experimentos, as temperaturas da câmara pletismográfica e

da sala de experimentos foram constantemente monitoradas. A calibração do volume (VK) foi

realizada a cada experimento por meio da injeção de um volume de 1 mL utilizando uma

seringa graduada. Os valores de VT obtidos foram corrigidos pelo peso do animal, sendo

expresso em mL/kg. Uma vez estabelecidos os valores de fR e VT, pela multiplicação desses

valores obtivemos o volume minuto (VE), o qual foi expresso em mL/kg/min.

Page 51: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 50

3.3.4. Avaliação do tônus vasomotor simpático em ratos acordados

3.3.4.1. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica e do intervalo de

pulso

A análise da variabilidade dos parâmetros cardiovasculares foi realizada com o

objetivo de se obter uma avaliação complementar acerca da modulação autonômica sobre o

sistema cardiovascular dos ratos controle e dos ratos submetidos à HCI por 10 dias. Para o

estudo da variabilidade da PAS e do intervalo de pulso (IP), os animais tiveram a pressão

arterial pulsátil registrada por um período de 30 minutos, a uma freqüência de amostragem de

1 kHz. Durante todo o período de registro, os animais não foram manipulados e o registro foi

realizado em uma sala acusticamente isolada para evitar efeitos indesejáveis de ruídos que

poderiam estressar os animais. Posteriormente, séries temporais da PAS (batimento a

batimento) e do IP (intervalos entre sucessivos valores da PAS) foram geradas, cujas

variabilidades foram avaliadas no domínio do tempo, pela análise da variância (σ2), e no

domínio da freqüência, pela análise das médias da estimação auto-regressiva, conforme já

descrito em outros trabalhos (Cerutti et al., 1991b; Malliani et al., 1991; Chen et al., 2005).

Para isso, as séries temporais foram fragmentadas em segmentos menores de 256 valores com

sobreposição de 50%. Como as séries temporais são expressas batimento a batimento, as

mesmas são irregularmente amostradas no tempo. Para torná-las regularmente amostradas,

utilizou-se o valor médio do intervalo R-R de cada segmento de 256 batimentos. A seguir,

aplicou-se a cada segmento a análise espectral auto-regressiva, a qual decompõe o sinal

periódico em seus respectivos componentes oscilatórios. Cada componente foi caracterizado

por uma amplitude (magnitude), expressa como potência (ordenada), e uma freqüência

correspondente (abscissa). Foram, então, obtidos os espectros de cada segmento que foram

agrupados em um espectro médio resultante para a PAS e IP. Os componentes oscilatórios

Page 52: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 51

foram quantificados nas faixas de baixa freqüência [LF (low frequency): 0,20 a 0,75 Hz] e alta

freqüência [HF (high frequency) 0,75 – 3,0 Hz].

3.3.4.2. Resposta ao bloqueio ganglionar

A contribuição do sistema nervoso simpático para a manutenção da pressão arterial de

ratos controle e HCI foi avaliada por meio da injeção intravenosa de hexametônio (25 mg/kg,

Sigma, St Louis, EUA), um bloqueador ganglionar que suprime a atividade simpática para os

vasos arteriolares. Previamente à administração de hexametônio, foram também realizados os

antagonismos dos receptores do tipo 1 da angiotensina (AT1), por meio da injeção intravenosa

de losartan (10 mg/kg, Galena, Campinas, Brasil), e dos receptores do tipo V1a da

vasopressina, por meio da injeção intravenosa de [β-mercapto-β,β-cyclopenta-

methylenepropionyl1,O-Me-Tyr2,Arg8]-vasopressin (AVPx, 10 µg kg−1, Sigma), com o

objetivo de eliminar os efeitos compensatórios dos mecanismos angiotensinérgicos e

vasopressinérgicos devido a grande queda na pressão arterial após o bloqueio ganglionar

(Zoccal et al., 2007b). Estas injeções foram realizadas a intervalos de tempo de 5 min e as

respostas foram avaliadas como sendo o pico das alterações na PAM e FC observadas após

cada injeção.

3.3.5. Determinação da concentração plasmática de vasopressina

Ao final do protocolo experimental, grupos específicos de animais controle e HCI

foram decapitados e o sangue foi coletado em tubos de ensaio contendo heparina. Estas

amostras foram então centrifugadas a 2000 g por 20 minutos a 4ºC para a coleta do plasma. A

determinação da concentração plasmática de vasopressina (AVP) foi realizada pelo método de

Page 53: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 52

radioimunoensaio após a extração da AVP utilizando acetona e éter de petróleo, conforme

descrito previamente (Glick & Kagan, 1979). Todas as amostras foram processadas

individualmente e as dosagens foram realizadas em duplicatas no mesmo ensaio.

3.3.6. Avaliação da função barorreflexa

3.3.6.1. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo

A partir dos registros da PAS dos ratos dos grupos controle e HCI obtidos 1 dia após

o término da HCI, ou seja, no 11º dia do protocolo experimental, o ganho espontâneo do

barorreflexo foi analisado pelo método da análise das seqüências. Todos os registros

utilizados continham o mesmo número de batimentos cardíacos (10.000 batimentos), os quais

foram analisados pelo software HemoLab (versão 5.9, disponível em

http://www.intergate.com/~harald/HemoLab/HemoLab.php), o qual detecta automaticamente

aumentos ou diminuições espontâneas da PAS que apresentam alterações em paralelo com o

intervalo de pulso (IP) com um fator de correlação maior ou igual a 0,8. Dessa forma, as

seqüências foram definidas como up quando aumentos na PAS estavam associados a um

prolongamento do IP ou como down quando decréscimos na PAS estavam associados a uma

diminuição do IP. Os valores do ganho espontâneo do barorreflexo foi avaliado pela

inclinação da regressão linear entre PAS vs IP e expressos em ms/mmHg.

3.3.6.2. Análise da curva sigmoidal do barorreflexo

Utilizando uma bomba de infusão (0,12 – 0,34 ml/min, Sage M361, Sage Instruments,

Freedom, CA, USA), infusões intravenosas de nitroprussiato de sódio (NPS, 50 µg/ml, Sigma,

St Louis, EUA) ou fenilefrina (Fen, 20 µg/ml, Sigma) foram realizadas em grupos de ratos

Page 54: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 53

controle e HCI com o objetivo de promover variações na pressão arterial. As alterações

reflexas na FC associadas aos aumentos ou diminuições na PAM, respectivamente, foram

quantificadas e representadas em um gráfico, no qual o eixo das ordenadas representa os

valores da variação da FC e o eixo das abscissas representa os valores da variação da PAM

induzidas pelo NPS e pela Fen. A partir destes valores, curvas sigmoidais foram geradas,

utilizando-se o software GraphPad Prism (versão 4, GraphPad, La Jolla, USA), de acordo

com a seguinte equação:

Na qual:

Y : variação da FC;

Bottom: resposta máxima de bradicardia (platô inferior);

Top: resposta máxima de taquicardia (platô superior);

V50: 50% da variação da FC ao longo da curva;

Slope: inclinação da curva;

X: variação da PAM.

Nestas curvas, a atividade barorreflexa foi avaliada pela análise dos seguintes

parâmetros: i) platô inferior da FC (resposta bradicárdica máxima); ii) platô superior da FC

(resposta taquicárdica máxima); amplitude da FC (diferença entre os platôs superior e

inferior); e iv) ganho médio (mmHg/bpm), o qual se refere a inclinação da porção linear da

curva sigmoidal, compreendida pelas variações da PAM entre -20 à +20 mmHg. Além disso,

os valores das respostas reflexas da FC também foram representados em um gráfico em

relação aos valores absolutos da PAM com o objetivo de se obter o ponto operacional do

barorreflexo.

Page 55: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 54

3.3.7. Análise da reversibilidade da hipertensão após o término da HCI

Ao final dos registros dos parâmetros cardiovasculares basais realizados no 11º dia do

protocolo experimental, grupos específicos de animais controle e HCI foram anestesiados

com tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.) e os cateteres da artéria femoral foram removidos. Após

a recuperação da cirurgia, os animais foram mantidos por 15 dias no biotério de manutenção

do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e então

submetidos a uma nova cirurgia para o implante de um novo cateter na artéria femoral

contralateral para os registros da pressão arterial e da freqüência cardíaca basais em animais

acordados, conforme descrito previamente.

3.4. Procedimentos in situ - preparação coração tronco cerebral isolados

3.4.1. Solução de perfusão

A solução de perfusão era composta por (mM): 125 de NaCl; 24 de NaHCO3; 3 de

KCl; 2,5 de CaCl2; 1,25 de MgSO4; 1,25 de KH2PO4 e 20 de dextrose, diluídos em água

deionizada. Outras substâncias foram adicionadas à solução de perfusão como um agente

oncótico (Ficoll 70, 1.25%, Sigma-Aldrich, MO, EUA) e um bloqueador da transmissão

neuromuscular (brometo de vecurônio 3 – 4 µg/ml, Cristália, SP, Brasil).

3.4.2. Procedimento cirúrgico e perfusão da preparação

Inicialmente, o animal foi profundamente anestesiado com halotano (AstraZenec do

Brasil Ltda, Cotia, SP, Brasil) e seccionado sub-diafragmaticamente. A cabeça e o tórax

foram imersos em uma cuba contendo solução de perfusão resfriada (2 – 4 ºC), seguido da

Page 56: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 55

decerebração ao nível pré-colicular e da remoção total da pele para evitar que os pêlos

contaminassem a solução de perfusão e obstruíssem o sistema de perfusão. Logo após, a aorta

descendente foi isolada para posterior canulação, seguido da remoção das costelas na porção

lateral esquerda do tórax, para permitir melhor exposição do coração e facilitar o acesso à

cadeia simpática paravertebral. Os pulmões foram removidos e o nervo frênico foi isolado,

cortando-o na sua junção ao diafragma. Em algumas preparações de ratos dos grupos controle

e HCI, as aferências provenientes das bifurcações das carótidas foram removidas

mecanicamente com o objetivo de se eliminar as aferências dos quimiorreceptores periféricos.

A efetividade deste procedimento foi confirmada por meio da ausência das respostas

autonômicas e respiratórias frente à ativação dos quimiorreceptores periféricos, como será

descrito adiante. A superfície dorsal do tronco cerebral foi exposta após a remoção do osso

occipital, da dura-máter e do cerebelo. Após esses procedimentos, a preparação foi então

transferida para uma câmara de registros e a aorta descendente foi canulada e perfundida

retrogradamente com a solução de perfusão descrita acima, utilizando uma bomba peristáltica

(Watson-Marlow 502S) a um fluxo de 21 – 25 mL/min. Além disso, vasopressina (0,6 – 1

nM, Sigma, MO, EUA ) foi adicionado à solução de perfusão para aumentar a resistência

vascular e, conseqüentemente, manter a pressão de perfusão entre 50 – 70 mmHg, conforme

descrito anteriormente (Pickering & Paton, 2006). Nessas condições de fluxo e pressão, o

nervo frênico apresentava padrão de despolarização crescente, indicando que a preparação

apresentava um padrão de atividade respiratória eupneica (Paton, 1996). Uma ilustração

esquemática da preparação coração-tronco cerebral isolados está representada na figura 3.

A solução de perfusão foi constantemente aerada com 95% O2 e 5% CO2, para o

fornecimento de oxigênio e dióxido de carbono à preparação e a manutenção do pH em

valores adequados. A análise gasométrica do perfusato (Cobas b 121, Roche, Basel, Suíça)

mostrou os seguintes valores: PO2 ± 380 mmHg, PCO2 ± 40 mmHg e pH ± 7,4.

Page 57: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 56

Posteriormente, esta solução foi aquecida por meio de um trocador de calor a uma

temperatura de aproximadamente 32ºC e filtrada utilizando-se um pré-filtro de polipropileno

de 25 mm de diâmetro e 25 µm de tamanho do poro (Millipore, PP25). Além disso, o

perfusato passou por uma “armadilha para bolhas”, cuja função era evitar a passagem de

bolhas para a preparação e de amortecer as pulsações geradas pela bomba peristáltica. Todos

os tubos do sistema eram relativamente impermeáveis ao O2 e ao CO2 (Tygon Cole Palmer, Il,

EUA: ID: 1,56 mm; OD: 4,7 mm). A porção final do tubo consistia em uma cânula de duplo

lúmem (Portex, MA, EUA: DI: 0,28mm; DE: 0,61 mm), sendo um utilizado para a perfusão e

outro para o registro da pressão de perfusão (PP). Essa cânula estava conectada a um

transdutor de pressão (modelo PT 300, Grass Telefactor, RI, EUA), o qual estava conectado a

um amplificador (Grass Quad Amplifier, modelo 15LT, RI, EUA). Os sinais da pressão de

perfusão foram convertidos por meio de uma placa A/D (CED, modelo 1401, Cambridge

Electronic Design Limited, Cambridge, Inglaterra) e registrados em um computador por meio

do software Spike 2 (versão 5, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Inglaterra).

3.4.3. Registros das atividades eferentes dos nervos vago, frênico, simpático

torácico e frênico

Diferentes combinações de registros da atividade dos nervos motores

cardiorespiratórios foram realizadas, dependendo do protocolo experimental. Todos os

registros foram obtidos utilizando-se eletrodos de sucção de vidro, os quais estavam

conectados a micromanipuladores (Narishige, Tóquio, Japão). A atividade do nervo frênico

foi registrada por meio de um eletrodo unipolar e padrão de despolarização em rampa deste

nervo foi utilizado como índice fisiológico da viabilidade da preparação (figura 3). O

eletrocardiograma foi registrado junto com a atividade do nervo frênico e por meio do

Page 58: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 57

intervalo R-R a freqüência cardíaca foi determinada. Em relação aos outros nervos, eletrodos

bipolares foram utilizados para o registro de suas atividades. O nervo vago foi dissecado ao

nível cervical, seccionado e sua atividade eferente foi registrada (figura 3). A atividade

eferente torácica foi registrada a partir da cadeia simpática torácica, ao nível de T8–T12

(figura 3). O nervo abdominal foi isolado da musculatura retro-abdominal ao nível tóraco-

lombar, seccionado distalmente e sua atividade registrada. Todos os sinais foram amplificados

(Bio-amplificadores, Insight, Ribeirão Preto, Brasil), filtrados (0,05–5 kHz) e adquiridos por

meio de um conversor A/D (CED 1401, Cambridge Electronic Design) em um computador,

utilizando o software Spike 2 (Cambridge Electronic Design).

Figura 3. Esquema da preparação coração tronco-cerebral isolados (working heart-brainstem preparation), conforme detalhadamente descrito anteriormente nas sub-seções 3.4.1, 3.4.2 e 3.4.3 da seção Materiais e Métodos. Abreviaturas: Abd – atividade do nervo motor abdominal; ANF – atividade do nervo frênico; ANSt – atividade do nervo simpático torácico; ANVc – atividade do nervo vago cervical; amp – amplificadores; ECG – eletrocardiograma.

5% CO2

95% O2

Visão dorsal do tronco cerebral

trocador decalor

bomba de perfusão

filtro

armadilhas de bolhas

nervosmotores

abdominais

aorta

nervovago cervical

cadeia simpáticatorácica

nervofrênico

eletrodo de sucção

amppressão de perfusão

transdutorpressão

ANSt

Abd

ANF + ECG

ANVc

KCN

artériacarótida

amp +-

amp +-

amp+-

amp+-

Page 59: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 58

3.4.4. Ativação do quimiorreflexo

Os quimiorreceptores periféricos foram ativados por meio da adminstração intra-

arterial de cianeto de potássio (KCN; 0,05% / 50 µL; Sigma Chemical, MO, EUA). Para

tanto, uma seringa foi acoplada ao sistema de perfusão da preaparação coração-tronco

cerebral isolado, próximo a entrada da aorta, como ilustrado na figura 3.

3.4.5. Microinjeções de agonistas ou antagonistas farmacológicos em regiões

bulbares

Em grupos separados de animais controle e HCI, microinjeções foram realizadas na

região rostral ventrolateral do bulbo (RVL) ou no aspecto caudal do núcleo do trato solitário

(NTSc), utilizando-se pipetas de vidro contendo 3 vias (tipo multibarrel) confeccionadas em

nosso laboratório. Estas pipetas estavam conectadas a uma bomba pneumática (Picospritzer II

– Parker Hannifin Corporation General Valve Division, Fairfield, NJ, EUA), a qual permitiu a

microinjeção das drogas por meio de “pulsos de pressão” calibrados para um volume de

aproximadamente 25 nL. Os sítios das microinjeções foram determinados com auxílio das

coordenadas estereotáxicas de (Paxinos & Watson, 1988), tomando como referência o

calamus scriptorius, o qual era visualmente identificado com o auxílio de uma lupa

estereoscópica (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Para as microinjeções na RVL, foram

consideradas as coordenadas: AP = + 1,3; L = 1,6; DV = - 2,7 a 3,0 mm. Para as

microinjeções realizadas no NTSc, foram utilizadas as seguintes coordenadas: AP = - 0,30; L

= 0,30; DV = - 0,4 à 0,45 mm. Para ambas as regiões, as coordenadas foram tomadas de

acordo com Paxinos & Watson (1998).

Page 60: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 59

3.4.6. Análises dos resultados

As análises das atividades dos nervos registrados foram feitas em sinais retificados e

integrados (constante de tempo de 100 ms), utilizando o software Spike 2.

3.4.6.1. Análise do padrão respiratório basal

Os registros das atividades dos nervos frênico, vago e abdominal foram utilizados para

a análise do padrão respiratório basal. Por meio da análise da atividade do nervo frênico,

avaliamos a atividade inspiratória. Para tanto, dois parâmetros foram analisados: i) freqüência

de despolarização, a qual foi determinada pelo intervalo de tempo entre dois bursts

consecutivos (envelope de potenciais) e expressa em Hz; ii) duração dos bursts, a qual

representa a duração da inspiração e consiste no tempo médio entre o início e o final do burst

do nervo frênico, expresso em ms. Em relação à atividade eferente vagal, esta é constituída de

2 componentes: i) inspiratório, fase de atividade coincidente com a atividade do nervo

frênico; ii) pós-inspiratório, atividade decrescente coincidente com o período expiratório,

como ilustrado na figura 4. Esses dois componentes são resultantes das atividades geradas por

neurônios inspiratórios e pós-inspiratórios (Smith et al., 2007) localizados na ponte e no

bulbo. Dessa forma, pelos registros do nervo vago avaliamos as atividades inspiratórias e pós-

inspiratórias por meio da medida da área sob a curva dos diferentes componentes. Para tanto,

obtivemos uma média da atividade do nervo vago a partir de um trecho de 10 ciclos

respiratórios. A partir dessas atividades médias, a atividade do nervo vago foi dividida em 3

partes: inspiratória (I, período coincidente com o disparo do nervo frênico), pós-inspiratória

inicial (PI-inicial, correspondente ao tempo de duração do nervo frênico após o seu disparo) e

pós-inspiratória final (PI-final, atividade remancescente após PI-inicial). Os valores da área

sob a curva foram então calculados em cada segmento da atividade vagal, sendo estes

Page 61: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 60

normalizados pelo valor total da área da atividade média, a qual foi determinada pela soma

das áreas obtidas em cada parte. A análise do padrão de atividade do nervo motor abdominal

que inerva a musculatura retro-abdominal foi utilizada como um índex da atividade

expiratória.

Figura 4. Registros representativos das atividades originais e integradas (∫) dos nervos frênico (ANF) e vago (ANVc), mostrando a divisão dos componentes inspiratório (I, coincidente com o disparo do nervo frênico) e pós-inspiratório (PI, atividade remanescente observada durante o período expiratório) observados na ANVc.

3.4.6.2. Análise do acoplamento entre as atividades simpática e respiratória

A partir de um trecho de 10 ciclos respiratórios, isto é, 10 disparos do nervo frênico,

uma média da atividade simpática torácica foi calculada por ciclo respiratório, conforme

ilustra a figura 5. Essas médias foram tomadas em sinais integrados da atividade simpática

com os mesmos parâmetros de amplificação e filtragem de sinal. O sinal médio da atividade

simpática torácica foi então dividido em 4 segmentos: inspiração (I), pós-inspiração (PI),

1 s

ANF

∫ANF

ANVc

∫ANVc

I PI

Page 62: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 61

expiração média (Em) e expiração final (Ef). A duração de cada segmento foi determinada em

função do tempo de disparo do nervo frênico, conforme ilustra a figura 5. Para analisar a

atividade simpática em cada segmento, ou seja, o padrão de distribuição da atividade

simpática ao longo do ciclo respiratório, uma escala percentual foi determinada para cada

preparação, assumindo o valor máximo (100%) à atividade máxima observada durante a

inspiração e o valor mínimo (0%) ao ruído elétrico registrado ao final dos experimentos, o

qual foi determinado 10 a 20 minutos após o desligamento da bomba de perfusão, quando a

preparação estava morta. Os dados obtidos em cada preparação foram então agrupados

conforme os grupos experimentais: ratos controle e HCI com quimiorreceptores periféricos e

ratos controle e HCI com desnervação dos quimiorreceptores periféricos.

Figura 5. Painel A: Registros de uma preparação representativa mostrando as atividades originais e integradas (∫) dos nervos frênico (ANF) e simpático torácico (ANSt) durante um período de 10 ciclos respiratórios e o ruído elétrico correspondente a cada nervo. Painel B: Divisão da ANSt média, obtida a partir do trecho em A, em 4 partes de acordo com a atividade do nervo frênico: inspiração (I), pós-inspiração (PI), expiração média (Em) e expiração final (Ef). Os valores 100% e 0% representados na figura mostram a atividade máxima observada durante I e o nível do ruído, respectivamente. A barra horizontal no painel A representa 1 s e no painel B 200 ms.

100%

0%

ANF

∫ANF

ANSt

∫ANSt

∫ANSt

ANF

ruído I PI EmEf

A B

Page 63: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 62

3.4.6.3. Análise da correlação curzada entre as atividades simpática e respiratória

Análises de correlação cruzada entre as atividades integradas dos nervos frênico, simpático

torácico e abdominal foram realizadas entre os grupos controle e HCI a partir de um período de 10

ciclos respiratórios. Para tanto, o pico da atividade do nervo abdominal foi utilizado como referência

para a obtenção dos histogramas de correlação, também chamados de correlogramas. Os resultados

obtidos foram expressos como coeficiente de correlação (r), o qual, de acordo com (Cohen, 1988),

pode variar desde 1 (sinais correlacionados), 0 (sinais não correlacionados) até −1 (sinais inversamente

correlacionados). Esta análise foi realizada por meio do programa Spike 2.

3.4.6.4. Respostas autonômicas e respiratórias à ativação do quimiorreflexo e à

microinjeções em regiões bulbares

As alterações na FC, ANF, ANSt, ANVc e Abd em respostas à ativação do quimiorreflexo

ou às microinjeções em regiões do bulbo, foram avaliadas por meio da variação absoluta ou

percentual dos parâmetros em relação aos valores obtidos imediatamente antes aos estímulos.

Dessa forma, as respostas observadas na FC e na ANF foram analisadas por meio da variação da

freqüência de eventos, isto é, bpm ou Hz, respectivamente. Em relação às ANSt, ANVc e Abd,

após a subtração do ruído elétrico, esses parâmetros foram quantificados por meio da análise da

área sob a curva e as respostas expressas em variações percentuais (%).

Nos protocolos envolvendo microinjeções em diferentes sub-regiões do bulbo de L-

glutamato, α,β,metil-ATP ou ATP em diferentes concentrações, as respostas obtidas nos

diferentes parâmetros analisados foram representadas em gráficos, cujos eixos das abscissas

(concentração) estão apresentados em escala logarítmica. Dessa forma, a partir dessas

representações, regressões não lineares foram obtidas utilizando-se o software GraphPad

Prism (versão 4, GraphPad, La Jolla, USA).

Page 64: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 63

3.4.7. Protocolos experimentais

3.4.7.1. Análise dos parâmetros autonômicos e respiratórios basais após 10 dias

de HCI

Para a análise das possíveis alterações nos parâmetros autonômicos e respiratórios

basais de ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias, após o isolamento e o posicionamento

dos nervos de interesse, um período de 15 a 20 minutos foi concedido para estabilização dos

registros eletrofisiológicos. A seguir, as atividades dos nervos foram registradas por 5 a 10

minutos, período considerados para as análises, como descrito anteriormente.

3.4.7.2. Respostas autonômicas e respiratórias à ativação do quimiorreflexo após

10 dias de HCI

Após os registros basais, duas injeções de KCN, em um intervalo de 5 minutos, foram

realizadas com o objetivo de promover a ativação dos quimiorreceptores periféricos. As

respostas foram então quantificadas e comparadas entre grupos de ratos controle e de ratos

jovens submetidos à HCI por 10 dias.

3.4.7.3. Avaliação dos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos na superfície

rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI

Para a avaliação de possíveis alterações nos mecanismos glutamatérgicos e

purinérgicos na RVL de ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias, diferentes concentrações

de L-glutamato (0,1; 1; 3 e 10 mM; Sigma Chemical, MO, EUA) ou de ATP (1, 10 e 50 mM;

Sigma Chemical, MO, EUA) foram unilateralmente microinjetadas na RVL de preparações de

Page 65: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 64

ratos controle e HCI e as respostas observadas nas ANF, ANSt, Abd e FC foram analisadas e

comparadas entre grupos.

3.4.7.4. Avaliação dos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos no aspecto

caudal do núcleo do trato solitário 10 dias após a HCI

Com o objetivo de verificar se a exposição à HCI interfere com os mecanismos

glutamatérgicos e purinérgicos no NTSc de ratos jovens, diferentes concentrações de L-

glutamato (25, 50 e 250 mM; Sigma Chemical, MO, EUA) ou de α,β,metil-ATP, análogo

estável do ATP (25, 50 e 100 mM; Sigma Chemical, MO, EUA) foram unilateralmente

microinjetadas no NTSc de preparações de ratos controle e HCI e as respostas promovidas nas

ANF, ANSt, ANVc e FC foram analisadas e comparadas entre grupos.

Além disso, com o objetivo de elucidar o envolvimento desses mecanismos nas

alterações no controle das atividades simpática e respiratória promovidas pela HCI, as

alterações na ANSt, ANF e FC do quimiorreflexo, promovidas pela adminstração de KCN,

foram avaliadas antes e 2, 10, 30, 45 e 60 min após as microinjeções bilaterais dos

antagonistas dos receptores ionotrópicos do glutamato, o ácido quinurênico (250 mM, Sigma

Chemical, MO, EUA) e dos receptores P2 do ATP, o pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2’,4’-

disulfonic acid (PPADS, 20mM, Sigma Chemical, MO, EUA), no NTSc de preparações de

ratos controle e HCI, conforme descrito anteriormente (Braga et al., 2007).

3.4.8. Análise histológica

Nos experimentos que envolveram microinjeções em diferentes subregiões do bulbo,

ao final dos experimentos 20 nL do corante azul de Evans 2% foi microinjetado no mesmo

Page 66: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 65

sítio de injeção dos agonistas ou antagonistas utilizados. Em seguida, o tronco cerebral foi

rapidamente removido e imerso em solução contendo formol 10% por 5 dias. Após, com o

auxílio de um micrótomo, cortes coronais e seqüenciais das áreas de interesse foram

realizados a uma espessura de 18 µm, os quais foram corados pelo método de Nissl. Para as

análises, somente foram considerados os animais que apresentaram o centro da microinjeção

nas áreas desejadas.

3.5. Procedimentos in vitro – análise da densidade de receptores glutamatérgicos e

purinérgicos em subregiões do bulbo

3.5.1. Coleta e preparo das amostras

Os animais considerados para os experimentos da análise da densidade de receptores

glutamatérgicos e purinérgicos inicialmente tiveram os seus parâmetros cardiovasculares

basais registrados in vivo, conforme descrito anteriormente. Ao final dos registros da pressão

arterial e da freqüência cardíaca basais, grupos específicos de ratos controle (n = 24) e de

ratos HCI (n = 24) foram anestesiados com halotano (Cristália Produtos Químicos

Farmacêuticos Ltda, Itapira, Brasil) e decapitados para a remoção do cérebro. O tronco

cerebral foi rapidamente separado e congelado em gelo seco. Em um criostato de

congelamento, fatias de 600 µm de expessura foram obtidas caudais ao calamus scriptorius,

nas quais estavam contidas os neurônios do NTSc. Além disso, no mesmo tecido

remanescente do tronco cerebral, fatias de 900 µm de espessura também foram obtidas 1,2

mm rostral ao calamus scriptorius, as quais continham os neurônios pré-motores simpáticos

da região rostral ventrolateral do bulbo (rostral ventrolateral medulla, RVLM) e os neurônios

respiratórios dos complexos Bötzinger (BötC) e pré-Bötzinger (pré-BötC. Nestas fatias

obtidas, punches bilaterais foram realizados com o auxílio de uma agulha apropriada

Page 67: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 66

(diâmetro interno de 1 mm) para a obtenção de tecidos neurais contendo os neurônios do

NTSc ou os neurônios do RVLM/BötC/pré-BötC. Como estas amostras eram relativamente

pequenas, foi necessário agrupar os punches obtidos de 3 animais para se obter quantidade

adequada de proteína para realizar os experimentos. Portanto, cada banda de receptor

(conforme descrito abaixo) representa um pool de 3 animais. Assim, a partir de 24 ratos

controle e 24 ratos HCI obtivemos 8 amostras controle e 8 amostras HCI.

3.5.2. Western blot dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos

Após a coleta, os punches foram triturados manualmente, utilizando um gral e um

pistilo, na presença de um 1 mL tampão de lise (Hepes 50 mM; NaCl 150 mM; MgCl2 2 mM;

EGTA 1 mM; Triton 1%; Glicerol 10 %, pH 7,4) contendo 52 mg/mL do inibidor de

proteases phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Após este processo, as suspensões obtidas

foram mantidas sob agitação em câmara fria por 30 minutos e centrifugadas por 15 minutos a

15.000 rpm a 4ºC. Os sobrenadantes foram separados e armazenados a -20ºC. Primeiramente,

a quantidade total de proteína contida em cada amostra foi determinada pelo método de BCA

(Bicinchoninic acid; Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Em seguida, dez microgramas

de proteína de cada amostra foram desnaturadas (Tris 150 mM; SDS 6%; Glicerol 5.52%;

DTT 300 mM; Azul de bromofenol 0,3%, pH 6,8) e separadas por eletroforese em gel SDS-

PAGE 10% na presença de um tampão Tris-glicina (Tris 25 mM; Glicina 192 mM; SDS 1%,

pH 8,5). Dez microgramas de um controle positivo, obtido a partir do extrato total do encéfalo

de 5 ratos não submetidos à nenhuma situação experimental, foram também submetidos ao

processo de separação junto com as amostras como um controle da imunoreatividade das

bandas dos receptores. As proteínas então separadas foram transferidas para membranas de

PVDF (polyvinylidene difluoride, 0,45 µm; Thermo Scientific) na presença de um tampão

Page 68: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 67

apropriado (Tris 25 mM; Glicina 192 mM; metanol 20 %, pH 8,5), e incubadas com soluções

contendo um dos seguintes anticorpos: i) receptores glutamatérgicos: anti-GLUR 2/3

(subunidade do receptor AMPA; 1:1000; Chemicon International, Temecula, CA, EUA;

produzido em coelho), anti-NMDAR1 (1:1000; Calbiochem, San Diego, EUA; produzido em

coelho); ii) receptores purinérgicos: anti-P2X1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnologies, Santa

Cruz, CA, EUA; produzido em coelho), anti-P2X3 (1:500; Santa Cruz Biotechnologies,

produzido em cabra), anti-P2X4 (1:500; Santa Cruz Biotechnologies, produzido em cabra),

anti-P2Y2 (1:1.000; Santa Cruz Biotechnologies, produzido em cabra); e iii) proteína

estrutural: anti-α-tubulina (1:40.000; Sigma, produzido em camundongo). A imunoreatividade

das proteínas foi detectada pela incubação com anticorpos secundários conjugados a

peroxidase (anti-coelho 1:5000, anti-cabra 1:5000 ou anti-camundongo 1:5000; Santa Cruz

Biotechnologies) e revelada pelo método de quimiluminescência (Thermo Scientific,

Waltham, EUA). Para tanto, as membranas foram expostas a filmes radiográficos (Hyperfilm

ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, EUA), os quais foram posteriormente digitalizados

para análise. A imunoreatividade das bandas foi quantificada pelo método da densitometria

utilizando o software NIH ImageJ 1.40 (National Institute of Health, USA;

http://rsbweb.nih.gov/ij/) e as quantidades relativas dos receptores foram normalizadas pelas

respectivas quantidades de α-tubulina. Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias.

3.6. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Para comparações

diretas entre os grupos controle e HCI, tais como o peso corpóreo, os parâmetros

cardiovasculares e respiratórios basais, a análise espectral, a magnitude da resposta depressora

evocada pelo hexametônio, a análise dos diferentes parâmetros barorreflexos, os parâmetros

Page 69: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Materiais e Métodos 68

autonômicos e respiratórios basais na preparação in situ, a atividade simpática nas diferentes

fases respiratórias, a análise do coeficiente de correlação, as magnitudes dos aumentos das

atividades simpática, vagal e abdominal em resposta a ativação do quimiorreflexo, as

magnitudes das respostas evocadas pelas microinjeções de L-glutamato, α,β,metil-ATP ou

ATP no NTS ou no RVL e as densidades das bandas de receptores purinérgicos e

glutamatérgicos foi utilizado o teste t de Student não pareado. Para as análises nas quais

houver mais de uma variável a ser analisada, como no caso do efeito temporal das injeções de

losartan, AVPX e hexametônio sobre a MAP e FC, da avaliação temporal respostas de

taquipnéia do quimiorreflexo, das respostas de apnéia evocadas pela microinjeções de L-

glutamato, α,β,metil-ATP ou ATP no NTS ou no RVL; e do efeito temporal dos antagonismos

com ácido quinurênico e com PPADS no NTSc sobre as respostas do quimiorreflexo, foram

utilizados o teste de ANOVA two-way seguido do pós-teste de Bonferroni. Todas as

operações gráficas e análises estatísticas foram realizadas pelo software GraphPad Prism

(versão 4, GraphPad, La Jolla, USA), sendo considerada as diferenças como significantes

quando P < 0,05.

Page 70: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

4. RESULTADOS

Page 71: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 70

4.1. Resultados obtidos em animais acordados

4.1.1. Efeito da exposição à HCI por 10 dias sobre o ganho de peso dos ratos

jovens

No início do protocolo experimental, os animais do grupo controle (n = 40) e do grupo

HCI (n = 40) apresentaram pesos semelhantes (46 ± 2 vs 44 ± 2 g). Entretanto, após 10 dias de

HCI, os animais do grupo HCI apresentaram um menor peso em comparação aos animais do

grupo controle (79 ± 3 vs 98 ± 4 g, P < 0,0001), evidenciando um menor ganho de peso nos

animais do grupo HCI.

4.1.2. Parâmetros cardiovasculares basais após 10 dias de HCI

Para se obter uma melhor avaliação do efeito da HCI sobre a pressão arterial de ratos

jovens, realizamos as medidas da PAS antes e após o protocolo experimental, utilizando o

método indireto da pletismografia de cauda e o método da canulação da artéria femoral,

respectivamente, conforme descrito detalhadamente na seção Materiais e Métodos. Por se

tratar de diferentes metodologias de avaliação da pressão arterial, inicialmente verificamos se

os valores obtidos por estes métodos eram comparáveis. Para tanto, realizamos o registro

direto da PAS em um grupo de animais (n = 5) com as mesmas características de idade e peso

que os animais antes do protocolo experimental (19 – 21 dias, 50 ± 1 g). Observamos que os

valores obtidos para a PAS pelo método indireto são equivalentes àqueles obtidos pelo

registro direto (87 ± 1 vs 87 ± 3 mmHg). Além disso, em outros animais “naïve” (n = 7) com

as mesmas características de idade e peso que os animais do grupo controle após o protocolo

experimental (29 – 31 dias, 106 ± 3 g), comparamos os valores da PAS obtidos pelos métodos

indireto e direto. Novamente, observamos que os valores obtidos pelos dois métodos são

equivalentes (122 ± 5 vs 121 ± 6 mmHg). Dessa forma, esses experimentos indicam que os

Page 72: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 71

resultados obtidos pelo método da pletismografia de cauda são equivalentes e comparáveis

com aqueles obtidos pelo método direto.

No início do protocolo experimental, os animais do grupo controle (n = 29) e do grupo

HCI (n = 28) apresentavam níveis semelhantes de PAS (86 ± 2 vs 87 ± 1 mmHg), conforme

ilustra a figura 6, painel A. Após 10 dias, a PAS dos animais de ambos os grupos

experimentais estava significativamente maior em relação aos valores observados

inicialmente (Controle: 115 ± 2 vs 87 ± 1 mmHg; HCI: 131 ± 3 vs 86 ± 2 mmHg; P < 0,0001;

figura 6, painel A). Entretanto, o aumento da PAS observado nos animais do grupo HCI foi

significativamente maior do que aquele observado nos animais do grupo controle (∆PAS: 45

± 3 vs 28 ± 1 mmHg; P < 0,0001; figura 6, painel B). Esses resultados mostram que os ratos

jovens submetidos à HCI por 10 dias apresentam um aumento da pressão arterial maior do

que aquele relacionado ao processo de desenvolvimento do animal, caracterizando um

processo hipertensivo. Em acordo com os dados da PAS, os níveis PAM (102 ± 3 vs 90 ± 1

mmHg; P < 0,0001) e a PAD (80 ± 2 vs 72 ± 2 mmHg; P < 0,05), mas não os valores da

pressão de pulso correspondente a diferença entre PAS e PAD (49 ± 2 vs 48 ± 2 mmHg),

também foram significativamente maiores nos ratos HCI em comparação aos ratos controle,

conforme mostra a figura 7, painéis A, B e C. Considerando a FC basal, nenhuma diferença

significativa foi observada entre os valores observados nos animais do grupo HCI e controle

(478 ± 17 vs 473 ± 7 bpm, respectivamente grupos HCI e controle), conforme ilustra a figura

7, painel D.

Page 73: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 72

Figura 6. A: valores da PAS de ratos controle (controle, n = 29) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 28) avaliadas antes (pelo método indireto da pletismografia de cauda) e após o protocolo experimental (método direto da canulação da artéria femoral). * P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle; # P < 0,0001 – diferente em relação aos valores iniciais; ns – não significativo. B: magnitude do aumento da PAS (∆PAS) observado em ratos controle e HCI após 10 dias do protocolo experimental. * P < 0,0001, diferente em relação ao grupo controle.

A

Antes Após0

70

80

90

100

110

120

130

140

ControleHCI

#

#

*

ns

PAS

(mm

Hg)

B

Controle HCI0

10

20

30

40

50 *

∆ P

AS

(mm

Hg)

Page 74: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 73

Figura 7. Valores basais da pressão arterial média (PAM, A) e diastólica (PAD, B), pressão de pulso (PP, C) e freqüência cardíaca (FC, D) de ratos controle (Controle, n = 29) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 28). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

4.1.3. Parâmetros respiratórios basais após 10 dias de HCI

Em relação aos parâmetros respiratórios basais, observamos que a fR (117 ± 4 vs 113

± 3 cpm), o VT (11 ± 1 vs 11 ± 1 mL/kg) e a VE (1291 ± 60 vs 1214 ± 56 mL/kg/min) dos

animais do grupo HCI (n = 21) foram semelhantes aos dos animais do grupo controle (n =

19), conforme mostram os painéis A, B e C da figura 8.

C

Controle HCI0

15

30

45

60

PP (m

mH

g)A

Controle HCI0

80

90

100

110

*PA

M (m

mHg

)

D

Controle HCI0

300

350

400

450

500

FC (b

pm)

B

Controle HCI0

60

70

80

90

*

PAD

(mm

Hg)

Page 75: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 74

Figura 8. Freqüência respiratória (fR, A), volume corrente (VT, B) e volume minuto (VE, C) basais de ratos controle (n = 19) e ratos submetidos à HCI (n = 21).

4.1.4. Tônus simpático vasomotor em ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias

Para avaliarmos a atividade simpática basal em animais acordados, utilizamos a

análise da variabilidade dos parâmetros cardiovasculares e o bloqueio ganglionar, a partir das

quais é possível avaliar indiretamente o tônus simpático em animais acordados.

4.1.4.1. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica e do intervalo de

pulso após 10 dias de HCI

Análises da variabilidade da PAS e do intervalo de pulos (IP) de ratos controle (n = 8) e HCI (n

= 7) foram realizadas no domínio do tempo e no domínio da freqüência, conforme mostra a figura 9.

Considerando a PAS, verificamos que o grupo HCI apresentou uma maior variância em relação ao

grupo controle (29 ± 4 vs 10 ± 2 mmHg2, P = 0.0003, figura 9, painel A). Além disso, tanto a magnitude

do componente de baixa freqüência (LF: 10,05 ± 0,91 vs 5,02 ± 0,63 mmHg2, P = 0,0004; figura 9,

painéis B e C) como o de alta freqüência (HF: 12,42 ± 2,46 vs 3,28 ± 0,61 mmHg2, P = 0,002; figura 9,

painéia B e C) se mostraram significativamente maiores no grupo HCI em comparação ao grupo

controle. Em relação ao IP, não só os parâmetros de variância (13 ± 2 vs 11 ± 3 ms2) e magnitude de LF

(1,49 ± 0,82 vs 2,06 ± 1,47 ms2) e HF (5,35 ± 1,12 vs 5,23 ± 1,21 ms2), como também a relação LF/HF

(0,26 ± 0,10 vs 0,12 ± 0,06), a qual representa o balanço autonômico para o coração, não foram

significativamente diferentes entre os grupos experimentais (figura 9, painéis D, E e F).

A

Controle HCI0

30

60

90

120

150fR

(cpm

)B

Controle HCI0

3

6

9

12

15

V T(m

L/kg

)

C

Controle HCI0

400

800

1200

1600

V E(m

L/kg

/min

)

Page 76: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 75

Figura 9. Análise da variabilidade da pressão arterial sistólica (painéis superiores) e do intervalo de pulso (painéis inferiores) de ratos controle (Controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 7). A e C: variância (σ2); B e E: espectros de animais representativos dos seus respectivos grupos experimentais; C e F: média das potências dos espectros. * P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle.

C

LF (0,20 - 0,75 Hz) HF (0,75 - 3,0 Hz)0

3

6

9

12

15 ControleHCI*

*

Potê

ncia

(mm

Hg2 )

B

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.00

3

6

9

12

15

HCIControleLF HF

Freqüência (Hz)Po

tênc

ia (m

mH

g2 /Hz)

A

Controle HCI0

5

10

15

20

25

30

35 *

σ2 (m

mH

g2 )

LF HF

E

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.00

2

4

6ControleHCI

Freqüência (Hz)

Potê

ncia

(ms2 /H

z)

F

LF (0,20-0,75 Hz) HF (0,75-3,0 Hz)0

2

4

6

8ControleHCI

Potê

ncia

(ms2 )

D

Controle HCI0

3

6

9

12

15

σ2 (m

s2 )

Page 77: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 76

4.1.4.2. Respostas cardiovasculares ao bloqueio ganglionar após 10 dias de HCI

A figura 10 apresenta registros da FC, da PAP e da PAM de um rato controle e de um

rato HCI, ambos representativos dos seus respectivos grupos experimentais, os quais ilustram

o efeito do antagonismo dos receptores AT1 da angiotensina II com losartan (10 mg/kg), dos

receptores V1a da vasopressina com AVPx (10 µg/kg) e do bloqueio ganglionar com

hexametônio (25 mg/kg) sobre a PAM dos ratos controle e HCI.

Figura 10. Registros da freqüência cardíaca (FC), pressão arterial pulsátil (PAP) e pressão arterial média (PAM) de um rato controle (panéis à esquerda) e de rato submetido à HCI (painéis à direita), ambos representativos dos seus respectivos grupos experimentais, ilustrando o efeito das injeções de losartan (10 mg/kg), AVPx (10 µg/kg) e hexametônio (25 mg/kg) sobre os parâmetros cardiovasculares.

Nos animais do grupo controle (n = 9), a injeção de losartan e AVPx não produziu

efeitos significativos sobre a PAM (valores de PAM antes: 88 ± 2 mmHg; após losartan: 88 ±

2 mmHg ; após AVPx: 85 ± 2 mmHg), conforme ilustra o painel A da figura 11. Por outro

Page 78: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 77

lado, a injeção de hexametônio promoveu uma queda acentuada na PAM de 85 ± 2 para 46 ±

2 mmHg (P < 0,0001, painel A da figura 11). Nos animais do grupo HCI (n = 8), a PAM

basal, ou seja, antes de qualquer tratamento farmacológico, era significativamente maior do

que a PAM dos ratos controle (102 ± 2 vs 88 ± 2 mmHg, P < 0,001, painel A da figura 11).

Após os antagonismos com losartan e AVPx, a PAM dos ratos HCI permaneceu elevada em

relação à PAM do grupo controle (PAM após losartan: 100 ± 2 vs 88 ± 2 mmHg; PAM após

AVPx: 96 ± 3 vs 85 ± 2 mmHg; P < 0,001; respectivamente grupos HCI e controle), como

mostra a figura 11, painel A. Após a injeção de hexametônio, uma acentuada redução na PAM

de 96 ± 3 para 48 ± 1 mmHg foi observada nos ratos HCI (P < 0,0001; figura 11, painel A).

Quando a magnitude da resposta hipotensora foi comparada entre grupos, verificamos que

resposta ao bloqueio ganglionar foi significativamente maior nos animais HCI do que nos

animais controle (∆PAM: -49 ± 2 vs - 39 ± 2 mmHg; P = 0,0065; painel B da figura 11). Em

relação à FC, observamos que as respostas promovidas pelo losartan (∆FC: 65 ± 12 vs 57 ± 10

bpm; P = 0,6083; respectivamente grupos HCI e controle), pelo AVPx (∆FC: -15 ± 13 vs 26 ±

15 bpm; P = 0,0617; respectivamente grupos HCI e controle) e pelo hexametônio (∆FC: -51 ±

26 vs -59 ± 13 bpm; P = 0,7556; respectivamente grupos HCI e controle) não foram diferentes

entre os grupos experimentais.

Page 79: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 78

Figura 11. A: Valores da pressão arterial média (PAM) antes (Basal) e após a administração de losartan (LOS), AVPx e hexametônio (HXT) em ratos controle (controle, n = 9) e em ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). B: Magnitudes das respostas hipotensoras (∆PAM) promovidas pela injeção de hexametônio em animais do grupo controle e do grupo HCI. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

4.1.5. Concentração plasmática de vasopressina após 10 dias de HCI

Os valores da concentração plasmática de vasopressina obtidos em ratos controle (n =

10) e em ratos HCI (n = 10) não foram estatisticamente diferentes (3,31 ± 0,21 vs 4,28 ± 0,67

pg/mL).

A

Basal LOS AVPx HXT0

30

50

70

90

110ControleHCI

* * *

# #

PAM

(mm

Hg)

B

Controle HCI

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-250

*

∆ P

AM (m

mHg

)

Page 80: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 79

4.1.6. Avaliação da função baroreflexa

4.1.6.1. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo após 10 dias de HCI

O número total de seqüencias de oscilações da PAS que apresentaram alterações

correlacionadas com o IP foi significativamente maior no grupo HCI (n = 17) do que no grupo

controle [n = 18, (9 ± 1 vs 4 ± 1 seqüências por 1000 batimentos, P = 0,0114)], indicando uma

maior variabilidade da PAM dos ratos HCI em relação aos ratos controle. Contudo, os valores

da inclinação das seqüências up (0,92 ± 0,10 vs 0,95 ± 0,12 ms/mmHg, respectivamente

grupos HCI e controle), down (0,69 ± 0,10 vs 0,79 ± 0,12 ms/mmHg, respectivamente grupos

HCI e controle) ou total (valor médio das seqüências up e down; 0,82 ± 0,09 vs 0,92 ± 0,10

ms/mmHg, respectivamente grupos HCI e controle) não foram diferente entre os grupos

experimentais, indicando que o ganho espontâneo do barorreflexo não foi alterado após a

exposição à HCI por 10 dias. Esses resultados estão ilustrados na figura 12.

4.1.6.2. Análise da curva sigmoidal do barorreflexo após 10 dias de HCI

As curvas sigmóides das respostas barorreflexas da FC dos ratos controle (n = 19, r2 =

0,80) e dos ratos HCI (n = 34, r2 = 0,79) são mostradas na figura 13. Na porção linear da

curva barorreflexa, a qual compreende entre as variações da PAM de -20 mmHg a + 20

mmHg, a inclinação observada no grupo HCI foi significativamente maior do que aquela

observado no grupo controle (-3,11 ± 0,08 vs -2,10 ± 0,10 bpm/mmHg; P < 0,0001, quadrante

superior da figura 13), indicando que os animais do grupo HCI apresentaram um maior ganho

do controle barorreflexo da FC. Associado a esse maior ganho, observamos que o ponto

operacional da curva barorreflexa dos ratos HCI estava deslocado para a direita em relação

aos ratos controle (quadrante superior da figura 13), indicando uma adaptação dos

barorreceptores ao novo nível de pressão arterial. Além disso, a faixa de variação da curva

Page 81: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 80

sigmoidal, ou seja, diferença entre as respostas máximas de bradicardia e taquicardia, foi

significativamente maior nos ratos HCI do que nos ratos controle (209 ± 13 vs 152 ± 8 bpm; P

= 0,002; figura 13), devido a uma maior magnitude do platô inferior ou resposta bradicárdica

máxima (−111 ± 9 vs −82 ± 9 bpm; P = 0,0267, figura 13). Embora não tenha sido

identificada diferença estatística, os valores do platô superior, ou resposta taquicárdica

máxima, foi maior nos animais HCI em relação aos animais controle (95 ± 9 vs 71 ± 8 bpm; P

= 0.0836; figura 13), os quais também contribuíram para a maior faixa de variação da curva

barorreflexa.

Figura 12. Análise do ganho do barorreflexo espontâneo em ratos controle (controle, n = 18) e em ratos submetidos à HCI (HCI, n = 17). Em A, está representado o número de seqüências detectadas em registros de ratos HCI e controle. * P = 0,0114 – diferente em relação ao grupo controle. Em B, C e D, estão representados, respectivamente, os valores da inclinação das seqüências up, down e total de ratos controle e HCI.

A

Controle HCI0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 *

Nº s

eqüê

ncia

s / 1

000

bpm

B

Controle HCI0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Up

(mse

mm

Hg-1

)

C

Controle HCI0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Dow

n(m

seg

× m

mH

g-1)

D

Controle HCI0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

tota

l(m

seg

× m

mH

g-1)

Page 82: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 81

Figura 13. Curvas sigmóides correlacionando as respostas barorreflexas da FC promovidas pelas variações na PAM de ratos controle (Controle, n = 19) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 34). No quadrante superior direito está contido a regressão linear da curva sigmoidal (de -20 mmHg à +20 mmHg), a qual é representada no gráfico pelo valores absolutos da PAM. Os círculos mostram o ponto operacional da curva barorreflexa de ratos controle e HCI. * P = 0,002 – diferente em relação à curva controle.

4.1.7 Valores da pressão arterial média e da freqüência cardíaca basais 1 dia e 15

dias após o término da exposição à HCI por 10 dias

Conforme descrito anteriormente, um dia após o término da HCI, ou seja, no 11º dia

do protocolo experimental, os animais submetidos à HCI (n = 10) apresentavam níveis

elevados de pressão arterial média (PAM) em relação aos animais do grupo controle [n = 19,

-40 -30 -20 -10 10 20 30 40

-120

-100

-80

-60

-40

-20

20

40

60

80

100

120

∆ FC

(bpm

)

∆ PAM (mmHg)

Controle HCI

*

70 80 90 100 110 120-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

PAM (mmHg)

∆ F

C (b

pm)

Page 83: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 82

(102 ± 5 vs 91 ± 1 mmHg, P < 0,05)] sem alterações significativas na freqüência cardíaca

(FC, 465 ± 12 vs 445 ± 13 bpm). Quinze dias após o término da HCI, a PAM dos animais do

grupo controle não se alterou em relação ao 11º dia (93 ± 2 vs 91 ± 1 mmHg). Contudo a

PAM dos animais do grupo HCI foi significativamente menor em relação aos respectivos

valores no 11º dia (102 ± 5 vs 91 ± 3 mmHg, P < 0,05), sendo, portanto, de magnitude

semelhante à PAM do grupo controle. Esses resultados estão demonstrados na figura 14. Em

relação a FC, novamente não foi observada diferença entre os grupos experimentais no 15º dia

após o término da HCI (349 ± 9 vs 371 ± 11 bpm). Contudo, em ambos os grupos

experimentais, os valores de FC no 15º dia foi significativamente menor do que os valores

observados no 11º dia (P < 0,001).

Figura 14. Pressão arterial média (PAM) de ratos controle (controle, n = 19) e de ratos submetidos à HCI (n = 10) avaliada 1 dia e 15 dias após o término do protocolo de HCI. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle 1 dia após o término da HCI; # P < 0,05 – diferente em relação ao grupo HCI 15 dias após o término da HCI; ns – não significativo.

1 dia 15 dias0

70

80

90

100

110 * #

ns

Controle HCI

PAM

(mm

Hg)

Page 84: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 83

4.2. Resultados obtidos na preparação coração-tronco cerebral isolados

4.2.1. Análise dos parâmetros basais

4.2.1.1. Pressão de perfusão de freqüência cardíaca basais após 10 dias de HCI

A pressão de perfusão das preparações do grupo HCI (n = 26) e controle (n = 26)

foram mantidos em níveis semelhantes (66 ± 2 vs 67 ± 2 mmHg) por meio do ajuste o fluxo

da perfusão entre 21 – 25 mL/min e pela adição de vasopressina à solução de perfusão. Em

relação a vasopressina, observamos que as preparações dos ratos HCI exigiram uma

concentração significativamente maior de vasopressina na solução de perfusão (1 – 1,2 nM)

do que as preparações dos ratos controle (0,6 – 0,8 pM) para que os níveis de pressão de

perfusão fossem semelhantes nos dois grupos experimentais. Além disso, quando a mesma

concentração de vasopressina foi adicionada (0,6 pM) ao perfusato, a pressão de perfusão das

preparações HCI se elevaram menos do que as preparações controle (4 ± 1 vs 14 ± 2 mmHg, P

< 0,01). Para excluir a possibilidade de que essa maior concentração de vasopressina exigida

pelas preparações dos ratos HCI poderia contribuir para as alterações autonômicas e

respiratórias observadas nesse grupo experimental, realizamos algumas preparações de ratos

não submetidos a situações experimentais algumas (n = 4), nas quais foi adicionada a mesma

concentração de vasopressina usada nas preparações de ratos HCI. Observamos que a relação

entre as atividades simpática e respiratória bem como nas respostas autonômicas e

respiratórias à ativação do quimiorreflexo não foram alteradas após o aumento da

concentração de vasopressina na solução de perfusão, indicando que a maior concentração de

vasopressina exigida pelas preparações dos ratos HCI não é um fator que esteja contribuindo

para as alterações observadas nesse modelo experimental. Em relação à freqüência cardíaca

(FC) basal, nenhuma alteração significativa foi observada entre as preparações dos ratos HCI

(n = 21) e controle (n = 24) que apresentavam os quimiorreceptores periféricos intactos (422

Page 85: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 84

± 19 vs 425 ± 11 bpm). De modo semelhante, as preparações dos ratos HCI (n = 5) e controle

(n = 3) com remoção dos quimiorreceptores periféricos também apresentaram valores

semelhantes de FC basal (404 ± 9 vs 406 ± 31 bpm).

4.2.1.2. Padrão respiratório após 10 dias de HCI

Considerando a atividade inspiratória, a qual foi avaliada pela atividade do nervo

frênico, verificamos que ambos os grupos HCI (n = 21) e controle (n = 24) com os

quimiorreceptores intactos apresentaram freqüência de despolarização (0,32 ± 0,03 vs 0,34 ±

0,02 Hz) e duração dos disparos do nervo frênico (511 ± 26 vs 541 ± 25 ms) de magnitudes

semelhantes. Da mesma forma, os animais do grupo HCI (n = 5) e do grupo controle (n = 3)

com remoção dos quimiorreceptores periféricos também não apresentaram diferenças

estatísticas quanto a freqüência de despolarização (0,21 ± 0,01 vs 0,22 ± 0,06 Hz) e duração

dos disparos do nervo frênico (1370 ± 209 vs 511 ± 26 ms). Comparando os grupos HCI e

controle com remoção dos quimiorreceptores periféricos com os correspondentes grupos HCI

e controle intactos, observamos que os grupos HCI e controle sem os quimiorreceptores

periféricos apresentaram maiores durações de disparos de nervo frênico (HCI: 1370 ± 209 vs

511 ± 26 ms; Controle: 745 ± 82 vs 541 ± 25 ms, P < 0,05), sem alterações estatísticas na

freqüência de despolarização.

A avaliação da atividade expiratória foi realizada a partir dos registros das atividades

dos nervos vago e abdominal. No grupo controle (n = 7), a atividade do nervo abdominal

apresentou um pico de atividade pós-inspiratória pequena, seguido de uma atividade irregular

de baixa amplitude ao longo do período expiratório restante, com uma pequena inibição

coincidente com o disparo de nervo frênico, conforme ilustram as figuras 15 e 18. Além disso,

a atividade do nervo vago mostrou dois componentes distintos: i) inspiratório, coincidente

Page 86: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 85

com o disparo do nervo frênico, e ii) pós-inspiratório, remanescente da atividade durante o

período expiratório, como mostram as figuras 15 e 16. No grupo HCI (n = 8) o padrão de

atividade expiratória do nervo abdominal foi claramente diferente em relação ao grupo

controle. Em 7 das 8 preparações, o nervo abdominal dos ratos HCI mostrou um disparo

adicional na fase final da expiração, o que não foi observado nos ratos controle, além do pico

pós-inspiratório e inibição inspiratória (figuras 15 e 18), indicando que os ratos HCI

apresentam um padrão de expiração ativa. Além disso, analisando a atividade do nervo vago,

observamos que a parte inicial do componente pós-inspiratório se mostrou reduzida nos ratos

HCI (n = 10) quando comparados com os ratos controle, como mostram as figuras 15 e 16.

Figura 15. Registros originais e integrados (∫) das atividades dos nervos frênico (ANF), abdominal (Abd) e vago cervical (ANVc) obtido em uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetidos à HCI (HCI), representativos de seus respectivos grupos experimentais. A área em cinza representa o período expiratório final do ciclo respiratório e as setas no registro da ANVc indicam o começo da atividade pós-inspiratória. Em relação à Abd, note que o rato HCI apresenta um disparo adicional na fase final da expiração (*).

∫ANVc

ANVc

∫Abd

Abd

ANF

CONTROLE

∫ANF

1 s

*

*

HCI

Page 87: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 86

Figura 16. Análise da atividade do nervo vago cervical (ANVc) em preparações de ratos mantidos em normóxia (Controle, em preto) e de ratos submetidos à HCI (HCI, em cinza) por 10 dias. Painel superior: Média da ANVc durante 1 ciclo respiratório, obtida a partir de um trecho contendo 10 ciclos respiratórios, de uma preparação controle e de uma HCI, representativa de seus respectivos grupos experimentais. O componente pós-inspiratório inicial (PI-inicial) da ANVc dos ratos HCI se mostrou menor do que o dos ratos controle, sem alterações significativas no componente pós-inspiratório final (PI-final). Painel inferior: Média dos valores da área sob a curva dos diferentes componentes da ANVc de ratos controle (n = 10) e HCI (n = 10). Os valores foram normalizados pela área total da média da ANVc, a qual era equivalente a soma das áreas dos 3 componentes. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

4.2.1.3. Acoplamento simpático-respiratório após 10 dias de HCI

Em ambos os grupos experimentais, a atividade do nervo simpático torácico

apresentou uma evidente modulação respiratória, a qual consistia em um pico de atividade

durante a fase final da inspiração (coincidente com a porção final do disparo de nervo frênico)

∫ANVc

Inspiratório PI-inicial PI-final

∫ANVc

Inspiratório PI-inicial PI-final

Inspiratório PI-inicial PI-final0

10

20

30

40

50

60

Controle HCI

*

Áre

a (%

)

Page 88: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 87

ou início da expiração, conforme ilustra o painel superior da figura 17. Além disso, durante a

fase pós-inspiratória a atividade simpática reduzia-se, atingindo os seus menores valores

durante a transição pós-inspiração – expiração média. Nos animais do grupo controle (n = 11),

a atividade simpática mantinha-se relativamente estável durante a fase final da expiração. De

forma diferente, os animais do grupo HCI (n = 9) apresentaram valores significativamente

mais elevados da atividade do nervo simpático torácico na fase final da expiração (52 ± 5 vs

40 ± 3 %, P < 0,05) – período no qual a atividade expiratória, avaliada pelo registro do nervo

abdominal, também se mostrou aumentada. Em relação às outras fases, nenhuma alteração

significativa na atividade simpática foi observada durante a inspiração (79 ± 3 vs 71 ± 3 %),

pós-inspiração (35 ± 4 vs 35 ± 4 %) e expiração média (42 ± 5 vs 38 ± 3 %) em comparação

aos ratos controle, como demonstrado no painel intermediário da figura 17. Considerando os

animais dos grupos com desnervação dos quimiorreceptores periféricos, as diferenças

observadas entre os grupos controle (n = 3) e HCI (n = 5) foram semelhantes àquelas

observadas nos animais com quimiorreceptores periféricos intactos, ou seja, os animais HCI

apresentaram um aumento significativo da atividade do nervo simpático torácico na fase final

da expiração (58 ± 3 vs 44 ± 1 %, P < 0,05), sem alterações nas demais fases respiratórias

(inspiração: 80 ± 2 vs 77 ± 2 %; pós-inspiração: 38 ± 7 vs 27 ± 6 %; expiração média: 49 ± 6

vs 34 ± 6 %), como ilustra o painel inferior da figura 17. Desta forma, a alteração no padrão

de acoplamento da atividade do nervo simpático torácico com a atividade respiratória

observado nos ratos HCI é independente de sinais provenientes dos quimiorreceptores

periféricos. Além disso, por meio de registros simultâneos da atividade dos nevos simpático

torácico e abdominal, verificamos que esse aumento da atividade simpática durante a fase

final da expiração está associado com o aumento da atividade expiratória, como demonstrado

na figura 18.

Page 89: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 88

Figura 17. Análises do padrão de acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos mantidos em normoxia (Controle) e ratos submetidos à HCI (HCI) por 10 dias. Painel superior: divisão da atividade média integrada (∫) do nervo simpático torácico (ANSt), obtida a partir de um trecho de 10 ciclos respiratórios, de acordo com a atividade do nervo frênico (ANF) correspondente, em preparações controle (esquerda) e HCI (direita), representativas dos seus respectivos grupos experimentais. O pico da atividade simpática durante o ciclo respiratório foi considerado como 100% e o ruído elétrico como 0%. Note que o aumento da atividade simpática nos animais HCI, em relação aos animais controle, na fase final da expiração (setas). Painel intermediário: valores da ANSt durante as partes expiração final (Ef), inspiração (I), pós-inspiração (PI) e expiração média (Em) nos animais do grupo controle (n = 11) e do grupo HCI (n = 9) que apresentavam os quimiorreceptores intactos. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle. Painel inferior: valores da ANSt durante as partes relativas ao ciclo respiratório nos animais do grupo controle (n = 3) e no grupo HCI (n = 5) com desnervação dos quimiorreceptores periféricos. * P = 0,01 – diferente em relação ao grupo controle.

QUIMIORRECEPTORES PERIFÉRICOS DESNERVADOS

QUIMIORRECEPTORES PERIFÉRICOS INTACTOS

100

30

∫ANSt (%)

ANF

Fases respiratórias

Ef I PI Em

HCI

ANF

Fases respiratórias

100

30

∫ANSt (%)

Ef I PI Em

CONTROLE

CONTROLE

Ef I PI Em0

25

50

75

100

Fases respiratórias

AN

St (%

)

HCI

Ef I PI Em0

25

50

75

100

*

Fases respiratórias

AN

St (%

)

CONTROLE

Ef I PI Em0

25

50

75

100

Fases respiratórias

AN

St (%

)

HCI

Ef I PI Em0

25

50

75

100

*

Fases respiratórias

AN

St (%

)

6565

QUIMIORRECEPTORES PERIFÉRICOS DESNERVADOS

QUIMIORRECEPTORES PERIFÉRICOS INTACTOS

100

30

∫ANSt (%)

ANF

Fases respiratórias

Ef I PI Em

HCI

ANF

Fases respiratórias

100

30

∫ANSt (%)

Ef I PI Em

CONTROLE

CONTROLE

Ef I PI Em0

25

50

75

100

Fases respiratórias

AN

St (%

)

HCI

Ef I PI Em0

25

50

75

100

*

Fases respiratórias

AN

St (%

)

CONTROLE

Ef I PI Em0

25

50

75

100

Fases respiratórias

AN

St (%

)

HCI

Ef I PI Em0

25

50

75

100

*

Fases respiratórias

AN

St (%

)

6565

Page 90: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 89

Figura 18. Registros simultâneo das atividades originais e integradas (∫) dos nervos abdominal (Abd), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) em preparações de um rato controle (Controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), representativas de seus respectivos grupos experimentais. A área em cinza representa a parte expiratória final do ciclo respiratório. Note que no animal HCI, o pico de atividade do nervo abdominal durante a fase final da expiração está associada ao aumento da atividade simpática (setas).

4.2.1.4. Análise da correlação cruzada entre as atividades abdominal e simpática

após 10 dias de HCI

Correlogramas de preparações representativas dos grupos controle e HCI estão representadas

na figura 19. Nesta figura, as atividades dos nervos simpático torácico (painel superior) e frênico

(painel intermediário) estão expressas em relação à atividade do nervo abdominal (painel inferior). No

grupo controle, o registro simultâneo das atividades dos nervos simpático torácico, frênico e

abdominal foram realizadas em 5 preparações. A atividade máxima do nervo abdominal (tempo 0) foi

observada no período pós-inspiratório, ou seja, imediatamente após o disparo do nervo frênico. Além

disso, a atividade máxima do nervo simpático torácico foi observada na porção final da despolarização

do nervo frênico (figura 19, painel da esquerda), indicando que a atividade simpática máxima ocorre

PND

∫PND

tSNA

∫tSNA

Abd

∫Abd

CONTROL CIH

1 s

PND

∫PND

tSNA

∫tSNA

Abd

∫Abd

CONTROL CIH

1 s

Page 91: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 90

na transição inspiração – pós-inspiração. Durante o período pós-inspiratório, observamos uma

correlação entre as atividades abdominal máxima (tempo 0) e simpática, cujo coeficiente de correlação

(r) foi de 0,36 ± 0,12 (figura 20, painel da esquerda). Entretanto, essa correlação ocorreu no momento

em que a atividade simpática estava decaindo. Em relação ao grupo HCI, 5 de 7 preparações

apresentaram a atividade máxima do nervo abdominal na fase final da expiração, ou seja, antes da

despolarização do nervo frênico (figura 19, painel da direita). De modo semelhante aos animais

controle, a atividade máxima do nervo simpático torácico do grupo HCI ocorreu na fase final da

inspiração. Entretanto, um segundo pico de atividade simpática foi observado no grupo HCI, o qual se

correlacionou com a atividade máxima do nervo abdominal durante a fase expiratória final (r = 0,36 ±

0,11, figura 20, painel da direita). Duas das 7 preparações HCI não apresentaram uma correlação

significativa entre a atividade simpática torácica e abdominal, ainda que essas preparações tenham

apresentado um pico de atividade abdominal durante a fase final da expiração. Por este motivo, essas

preparações não foram consideradas para as análises dos dados.

Figura 19. Análise de correlação cruzada entre as atividades dos nervos simpático torácico (ANSt, painel superior), frênico (ANF, painel intermediário) e abdominal (Abd, atividade referência) de preparações de um animal controle (Controle) e de um animal submetido à HCI (HCI), representativas de seus respectivos grupos experimentais. Note a alteração da correlação entre as atividades simpática e abdominal da fase pós-inspiratória, observada no animal controle, para a fase final da expiração, observada no animal HCI.

2

AN

St

(r)

AN

F(r

)A

bd (r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1segundos

CONTROLE

-2 -1 0 1 2segundos

tSN

A(r

)P

ND

(r)

Abd (r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

HCI

2

AN

St

(r)

AN

F(r

)A

bd (r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1segundos

CONTROLE

2

AN

St

(r)

AN

F(r

)A

bd (r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1segundos

CONTROLE

-2 -1 0 1 2segundos

tSN

A(r

)P

ND

(r)

Abd (r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

HCI

-2 -1 0 1 2segundos

tSN

A(r

)P

ND

(r)

Abd (r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

HCI

Page 92: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 91

Figura 20. Valores do coeficiente de correlação (r) entre as atividades dos nervos simpático torácico e abdominal durante as fases pós-inspiratória (PI) e final da e expiração (Ef) obtidos em preparações de ratos controle (Controle, n = 5) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 5).

4.2.2. Respostas autonômicas e respiratória à ativação do quimiorreflexo após 10

dias de HCI

A ativação do quimiorreflexo periférico pela administração de KCN produziu

respostas de bradicardia, simpato-excitação e taquipnéia (figura 21), bem como respostas de

aumento nas atividades nas atividades vagal e abdominal (figura 22). A resposta simpato-

excitatória foi significativamente maior nos animais do grupo HCI (n = 14) em relação aos

animais controle [n = 14, (128 ± 8 vs 94 ± 5%; P < 0.05; figura 23, painel A)] enquanto que a

resposta de bradicardia foi semelhante entre os grupos experimentais (-200 ± 25 vs -202 ± 15

bpm; figura 23, painel B). O aumento na atividade vagal observado após a ativação do

quimiorreflexo ocorreu preferencialmente na fase pós-inspiratória (figura 22) e a magnitude

deste aumento foi semelhante entre as preparações de ratos HCI (n = 8) e controle [n = 7, (75

± 8 vs 66 ± 4 %; figura 23, painel C). Em relação à atividade abdominal, a ativação dos

quimiorreceptores periféricos promoveu aumentos similares nos animais HCI e controle (625

± 130 vs 627 ± 205%; figura 24, painel A). Entretanto, o padrão de resposta observado foi

diferente nos animais HCI (n = 8) em comparação aos animais controle (n = 7). Em

PI

Controle HCI0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

semcorrelação

Coe

ficie

nte

de c

orre

laçã

o (r

)Ef

Controle HCI0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

semcorrelação

Coe

ficie

nte

de c

orre

laçã

o (r

)

Page 93: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 92

preparações de ratos controle, o aumento da atividade expiratória ocorreu nas fases pós-

inspiratória (55 ± 2 % da resposta) e na fase final da expiração (45 ± 2 % da resposta), com

prevalência durante a fase pós-inspiratória (P < 0,05, figura 24, painel A). Diferentemente, as

preparações de ratos HCI apresentaram uma facilitação da resposta abdominal quimiorreflexa

durante a fase final da expiração, uma vez que o aumento nesta fase foi significativamente

maior do que aquele observado na fase pós-inspiratória (35±2 vs 65±2 %; P < 0.001;

respectivamente fases pós-inspiratória e final da expiração). Considerando a resposta de

taquipnéia, o pico desta resposta não foi significativamente diferente entre grupos (251 ± 36

vs 214 ± 18). Entretanto, aos 4 seg (244 ± 36 vs 180 ± 21 %; P < 0.01) e aos 6 seg (251 ± 36

vs 166 ± 13 %; P < 0.001) após o estímulo, a freqüência de despolarização do nervo frênico

estava significativamente mais elevada em comparação a freqüência observada nos animais

controle, indicando uma maior duração da resposta de taquipnéia no grupo HCI, como

indicado na figura 25. Nos animais com desnervação dos quimiorreceptores periféricos,

nenhuma das respostas descritas anteriormente foi observada (dados não apresentados),

indicando a efetividade do procedimento de remoção dos quimiorreceptores periféricos.

Page 94: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 93

Figura 21. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de bradicardia (FC), simpato-excitação [ANSt, original e integrado (∫)] e taquipnéia [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela administração de KCN (setas). Note a maior magnitude das respostas simpática e respiratórias dos animais HCI em comparação aos animais controle.

Page 95: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 94

Figura 22. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e de ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de excitação vagal [ANVc, original e integrado (∫)] e abdominal [Abd, original e integrado (∫)] e de taquipnéia [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela administração de KCN (setas). Note que enquanto a resposta Abd dos animais controle ocorre nas fases pós-inspiratória e final da expiração, a resposta dos animais HCI ocorre preferencialmente na fase final da expiração.

Page 96: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 95

Figura 23. Magnitudes das respostas de simpato-excitação (∆ANSt, painel A), bradicardia (∆FC, painel B) e aumento na atividade eferente vagal (∆ANVc, painel C) promovidas pela administração de KCN em preparações de ratos controle (n = 8 – 14) e de ratos submetidos à HCI (n = 8 – 14). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

A

Controle HCI0

70

90

110

130

150*

∆ tS

NA

(%)

B

Controle HCI

-250

-200

-150

-100

-50

0

∆ F

C (b

pm)

C

Controle HCI0

25

50

75

100

∆ A

NVc

(%)

Page 97: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 96

Figura 24. A: Aumento na atividade motora abdominal (∆Abd) em resposta à administração de KCN em preparações de ratos controle (Controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). B: Padrão de ativação do nervo abdominal ao longo da fase expiratória durante a estimulação do quimiorreflexo em preparações de ratos controle e HCI. * P < 0,01 – diferente entre as fases PI e Ef. # P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle. Note a mudança no padrão de resposta Abd dos animais HCI, com o deslocamento do pico da resposta para a fase Ef.

A

Controle HCI0

250

500

750

1000

∆ A

bd (%

)

B

PI Ef PI Ef0

20

40

60

80

*

* #

#

Controle HCI

Prop

orçã

o PI

e E

f (%

)

Page 98: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 97

Figura 25. Decurso temporal das respostas de taquipnéia (ANF, %), avaliada a cada 2 segundos, durante 30 segundos, promovidas pela adminstração de KCN em preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14). * P < 0,01 – diferente em relação ao grupo controle. Nos animais HCI, a resposta de taquipnéia foi mais prolongada do que aquela observada nos animais controle.

4.2.3. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção

unilateral de diferentes concentrações de L-glutamato na superfície rostral ventrolateral

do bulbo após 10 dias de HCI

A figura 26 apresenta registros das atividades dos nervos simpático torácico (ANSt) e

frênico (ANF) de preparações coração tronco-cerebral isolados de animais representativos dos

grupos HCI e controle, os quais ilustram as respostas simpática e respiratória promovidas pela

microinjeção unilateral L-glutamato no RVL. Em ambos os grupos controle (n = 5) e HCI (n

= 4), microinjeções de diferentes concentrações de L-glutamato no RVL promoveram

respostas de simpato-excitação (∆ANSt – 1mM: 71 ± 12 vs 47 ± 9 %; 3mM: 90 ± 11 vs 72 ±

15 %; 10mM: 98 ± 12 vs 74 ± 10 %, respectivamente grupos HCI e controle) e alterações

discretas na FC (∆FC – 1mM: 4 ± 2 vs 7 ± 3 bpm; 3 mM: 3 ± 3 vs 6 ± 2 bpm; 10 mM: 6 ± 4

vs 7 ± 3 bpm; respectivamente grupos HCI e controle), as quais não foram diferentes entre os

grupos experimentais, conforme mostra a figura 27. Em relação à ANF, tanto as respostas de

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300

100

150

200

250

300

350 ControleHCI* *

Tempo (s)

AN

F (%

)

Page 99: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 98

redução da freqüência de despolarização (∆ANF – 1mM: -0,24 ± 0,02 vs -0,24 ± 0,05 Hz;

3mM: -0,24 ± 0,02 vs -0,19 ± 0,06 Hz; 10 mM: -0,22 ± 0,04 vs -0,31 ± 0,04 Hz;

respectivamente grupos HCI e controle) como o decurso temporal dessas respostas, ambas

análises representadas na figura 28, foram de magnitudes semelhantes nos grupos controle e

HCI. Esse conjunto de resultados sugere que a exposição à HCI não interfere com a

sensibilidade dos neurônios do RVL de ratos jovens ao L-glutamato. A figura 29 apresenta

fotomicrografias de secções coronais do tronco cerebral de uma preparação de um rato

controle e de um rato HCI, representativas dos grupos, as quais estão combinadas a uma

representação esquemática do RVL, ilustrando os sítios das microinjeções nesta região.

Page 100: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 99

Figura 26. Registros de preparações de ratos controle (painel a esquerda) e de ratos submetidos à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de simpato-excitação [ANSt, original e integrado (∫)] e de redução na freqüência do nervo frênico [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela microinjeção unilateral de L-glutamato 3 mM (setas) na superfície rostral ventrolateral do bulbo.

∫ANSt

ANSt

∫ANF

ANF

L-glutamato3 mM

L-glutamato3 mM

CONTROLE HCI

2 seg

Page 101: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 100

A

1 100

30

60

90

120 ControleHCI

3[L-glutamato], mM

∆ A

NSt

(%)

B

1 10

0

5

10

15 ControleHCI

3[L-glutamato], mM

∆ F

C (b

pm)

Figura 27. Magnitude das respostas simpato-excitatória (∆ANSt, A) e de alterações na freqüência cardíaca (∆FC, B) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (1, 3 e 10 mM) na superfície rostral ventrolateral do bulbo de preparações de ratos controle (Controle, n = 5) e de submetidos à ratos HCI (HCI, n = 4). Nesses gráficos, o eixo X (concentração de L-glutamato) está representado em escala logarítmica.

Page 102: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 101

Figura 28. Análise temporal das respostas de redução da freqüência de despolarização do nervo frênico (ANF) promovidas pelas microinjeções (tempo 0) de L-glutamato nas concentrações de 1 mM (painel superior), 3 mM (painel intermediário) e 10 mM (painel inferior) no RVL de preparações de ratos controle (controle, n = 5) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 4).

1 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150 ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (%

)

3 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150 ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (%

)

10 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150 ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (%

)

Page 103: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 102

Figura 29. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetidos à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de L-glutamato (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) na superfície rostral ventrolateral do bulbo. Abreviações: NA – núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; RVLM: bulbo ventrolateral rostral; py: pirâmides; bas: artéria basilar.

Page 104: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 103

4.2.4. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção

unilateral de diferentes concentrações de ATP na superfície rostral ventrolateral do

bulbo após 10 dias de HCI

Em ambos os grupos experimentais, microinjeções de ATP no RVL promoveram

respostas simpato-excitatória, ativação da atividade motora abdominal e redução da

freqüência de despolarização do nervo frênico, conforme ilustram os registros mostrados na

figura 30, os quais foram obtidos de preparações de ratos representativos dos grupos controle

(n = 7) e HCI (n = 8). Em relação as atividade autonômica, observamos que as respostas de

bradicardia (não ilustrada na figura 30) promovidas pelas microinjeções de diferentes

concentrações de ATP no RVL não foram estatisticamente diferentes entre os grupos

experimentais (∆FC – 1mM: -24 ± 12 vs -4 ± 2 bpm; 10 mM: -24 ± 12 vs -23 ± 17 bpm; 50

mM: -83 ± 22 vs -46 ± 23 bpm; respectivamente grupos HCI e controle), conforme ilustra o

painel A da figura 31. Por outro lado, as respostas simpato-excitatórias promovidas pelas

concentrações de 1mM (71 ± 11 vs 41 ± 4 %; P < 0,05) e de 10 mM (119 ± 17 vs 69 ± 7%; P

< 0,05), mas não a de 50 mM (138 ± 12 vs 110 ± 20 %), no RVL de ratos HCI forma

significativamente maiores do que as respostas observadas nos ratos controle, conforme

mostra o painel B da figura 31. Em relação à respostas respiratórias, observamos que a

amplitude da resposta de aumento na atividade motora abdominal promovida pelas

microinjeções de ATP no RVL não foi diferente entre os grupos experimentais (∆Abd - . 1

mM: 219 ± 72 vs 131 ± 33 %; 10 mM: 223 ± 45 vs 226 ± 52 %; 50 mM: 455 ± 86 vs 325 ± 95

%), conforme ilustra o painel C da figura 31. De maneira semelhante, a magnitude da redução

na freqüência de despolarização do nervo frênico também foi semelhante entre os grupos

∆ANF - 1 mM: -0,11 ± 0,02 vs -0,10 ± 0,05 Hz; 10 mM: -0.18 ± 0,03 vs 0,17 ± 0,05 Hz; 50

mM: -0,23 ± 0,03 vs -0,26 ± 0,05 Hz), conforme mostra o painel D da figura 31. Entretanto,

ainda considerando a alterações verificadas na ANF, observamos que a duração da resposta de

Page 105: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 104

apnéia promovida pelo ATP no RVL foi menor (P < 0,05) nos grupos HCI do que no grupo

controle, assim como demonstrados nos painéis A, B e C da figura 32. Os sítios das

microinjeções de ATP no RVL estão ilustrados na figura 33, a qual contém fotomicrografias

de secções coronais do tronco cerebral de uma preparação de um rato controle e de um rato

HCI, representativas dos grupos, as quais estão combinadas a uma representação esquemática

do RVL, ilustrando os sítios das microinjeções nesta região.

Page 106: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 105

Figura 30. Registros de preparações de um rato controle (painel a esquerda) e de um ratos submetido à HCI (painel a direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando as respostas de aumento na atividade simpática [ANSt, original e integrado (∫)] e abdominal [Abd, original e integrado (∫)] e a redução na freqüência de despolarização do nervo frênico [ANF, original e integrado (∫)] promovidas pela microinjeção unilateral de ATP 10 mM (setas) na superfície rostral ventrolateral do bulbo.

ANF

∫ANF

Abd

∫Abd

ANSt

∫ANSt

2 s

ATP10 mM

ATP10 mM

CONTROLE HCI

Page 107: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 106

Figura 31. Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, A), aumentos nas atividades simpática torácica (∆ANSt, B) e motora abdominal (∆Abd, C) e redução na freqüência de despolarização do nervo frênico (∆ANF, D) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de ATP (1, 10 e 50 mM) na superfície rostral ventrolateral do bulbo de preparações de ratos controle (Controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). Note o deslocamento para a direita da curva ∆ANSt vs [ATP] do grupo HCI em relação ao grupo controle. * P < 0,05; # P = 0,0019 – diferentes em relação ao grupo controle. Nesses gráficos, o eixo X (concentração de ATP) está representado em escala logarítmica.

A

1 10 100

-120

-90

-60

-30

0ControleHCI

[ATP], mM

∆ F

C (b

pm)

B

1 10 1000

30

60

90

120

150 *#

*

ControleHCI

[ATP], mM∆

AN

St (%

)

C

1 10 1000

100

200

300

400

500

600ControleHCI

[ATP], mM

∆ A

bd (%

)

D

1 10 100

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0ControleHCI

[ATP], mM

∆ A

NF

(Hz)

Page 108: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 107

1 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150

#

ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (%

)

10 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150

#*

ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (%

)

50 mM

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 300

25

50

75

100

125

150

#

ControleHCI* *

Tempo (s)

AN

F (%

)

Figura 32. Evolução temporal das respostas de redução da freqüência de despolarização do nervo frênico (ANF) promovidas pelas microinjeções (tempo 0) de 1 mM (painel superior), 10 mM (painel intermediário) e 50 mM (painel inferior) de ATP no RVL de preparações de ratos controle (controle, n = 7) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 8). * P < 0,05, # P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

Page 109: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 108

Figura 33. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (Controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de ATP (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) na superfície rostral ventrolateral do bulbo. Abreviações: NA – núcleo ambigus; BötC: complexo Bötzinger; RVLM: bulbo ventrolateral rostral; py: pirâmides; bas: artéria basilar.

Page 110: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 109

4.2.5. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção

unilateral de diferentes concentrações de L-glutamato no aspecto caudal do núcleo do

trato solitário após 10 dias de HCI

A figura 34 apresenta registros da freqüência cardíaca (FC) e das atividades dos

nervos simpático torácico (ANSt), vago cervical (ANVc) e frênico (ANF) de preparações

coração tronco-cerebral isolados de animais representativos dos grupos HCI e controle, os

quais ilustram as respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção

unilateral de diferentes concentrações de L-glutamato (25, 50 e 250 mM) no NTS caudal.

Microinjeções de L-glutamato no NTS caudal de ratos controle (n = 8) promoveram respostas

de bradicardia (∆FC: -32 ± 8, -49 ± 7, -91 ± 23 bpm; respectivamente 25, 50 e 250 mM);

simpato-excitação (∆ANSt: 16 ± 6; 25 ± 5; 27 ± 2 %; respectivamente 25, 50 e 250 mM) e

aumento do componente pós-inspiratório vagal (∆ANVc: 124 ± 17; 151 ± 22; 164 ± 23 %;

respectivamente 25, 50 e 250 mM), conforme mostra a figura 35. Além disso, as

microinjeções de L-glutamato no NTS caudal de preparações de ratos controle também

promoveram respostas de redução na atividade minuto do nervo frênico, como mostra as

figura 36. Em preparações do grupo HCI (n = 10), as microinjeções unilaterais de L-

glutamato no NTS caudal promoveram padrões de respostas autonômicas e respiratórias

semelhantes àquelas observadas nas preparações do grupo controle. Em relação às respostas

autonômicas, verificamos que a as respostas de bradicardia do grupo HCI (-58 ± 19, -59 ± 17,

-67 ± 26 bpm, respectivamente 25, 50 e 250 mM) foram de magnitude semelhante àquelas

observadas no grupo controle (figura 35, painel A). Entretanto, a resposta simpato-excitatória

promovida pela microinjeção de 250 mM (53 ± 9 %, P = 0,0318) de L-glutamato, mas não de

25 (26 ± 6%) e 50 mM (44 ± 10 %), no NTS caudal de ratos HCI foi significativamente maior

do que aquela observada no grupo controle (figura 35, painel C). Considerando as respostas

ventilatórias, verificamos que as respostas de excitação pós-inspiratória vagal do grupo HCI

Page 111: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 110

foi significativamente menor nas 3 concentrações de L-glutamato microinjetadas (54 ± 17, 85

± 13, 101 ± 11 %; respectivamente 25, 50 e 250 mM; P < 0,05) quando comparadas às

respostas controle, conforme mostra o painel B da figura 35. Além disso, as respostas de

redução na freqüência de despolarização do nervo frênico também foram significativamente

menores no grupo HCI em relação ao grupo controle, conforme mostra a figura 36. A

localização dos sítios de microinjeções no NTSc de preparações de ratos controle e HCI está

ilustrada na figura 37, a qual contém fotomicrografias de secções coronais do tronco cerebral

de uma preparação de um rato controle e de um rato HCI, representativas dos grupos, as quais

estão combinadas a uma representação esquemática do NTSc, ilustrando os sítios das

microinjeções nesta região.

Page 112: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 111

Figura 34. Registros da freqüência cardíaca (FC) e das atividades originais e integradas (∫) dos nervos vago cervical (ANVc), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) de preparações de um rato controle (Controle, painel da esquerda) e de um rato submetido à HCI (HCI, painel da direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando os efeitos das microinjeções unilaterais de L-glutamato (250 mM) no NTS caudal (indicadas pelas setas).

2 s

HCI

L-glutamato250 mM

L-glutamato250 mM

CONTROLEFC

∫ANVc

ANVc

∫ANSt

ANSt

∫ANF

ANF

Page 113: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 112

Figura 35 – Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, painel A), excitação vagal (∆ANVc, painel B) e simpática (∆ANSt, painel C) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (25, 50 e 250 mM) no NTS de preparações de ratos controle (Controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). * P < 0,05, # P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle. Nesses gráficos, o eixo X (concentração de L-glutamato) está representado em escala logarítmica.

B

10 100 10000

50

100

150

200ControleHCI*

* *

#

[L-glutamato], mM

∆ A

NVc

(%)

C

10 100 10000

20

40

60

80ControleHCI*

#

[L-glutamato], mM

∆ A

NSt

(%)

A

10 100 1000

-150

-100

-50

0ControleHCI

∆ F

C (b

pm)

Page 114: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 113

Figura 36. Evolução temporal da freqüência de despolarização do nervo frênico em resposta às microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de L-glutamato (25, 50 e 250 mM, tempo 0) no NTS caudal de preparações de ratos controle (controle, n = 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). * P < 0,001; # P < 0,0001 – diferente em relação ao grupo controle.

250mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.00.10.20.30.40.50.60.70.8 Controle

HCI* *

#

Tempo (s)

Freq

üênc

ia (H

z)

50mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.0

0.2

0.4

0.6

0.8 ControleHCI* *

#

Tempo (s)

Freq

üênc

ia (H

z)25mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7 ControleHCI

*#

Tempo (s)

Freq

üênc

ia (H

z)

Page 115: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 114

Figura 37. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções unilaterais de L-glutamato (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil.

4.2.6. Respostas autonômicas e respiratórias promovidas pela microinjeção

unilateral de diferentes concentrações de α, β, metil-ATP no aspecto caudal do núcleo do

trato solitário após 10 dias de HCI

A figura 38 apresenta registros de preparações de ratos dos grupos controle e HCI,

representativas de seus respectivos grupos, mostrando as alterações na freqüência cardíaca e

nas atividades dos nervos vago, simpático e frênico promovidas pelas microinjeções de

diferentes concentrações de α,β,metil-ATP (25, 50 e 100 mM) no NTS caudal. Nas

preparações de ratos controle (n = 9), verificamos que as microinjeções de α,β,metil-ATP

promoveram respostas de bradicardia (-77 ± 7, -88 ± 23, -89 ± 4 bpm, respectivamente 25, 50

e 100 mM), excitação pós-inspiratória vagal (87 ± 14, 130 ± 17, 145 ± 32 %, respectivamente

25, 50 e 100 mM) e simpato-excitação (30 ± 8, 42 ± 11, 64 ± 8 %, respectivamente 25, 50 e

100 mM), conforme demonstra a figura 39. Além disso, também verificamos importantes

respostas de redução na freqüência de despolarização do nervo frênico nas concentrações de

HCI

CC12N

Gr

10NCC 12N

Gr

10N

Controle

Page 116: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 115

50 e 100 mM, conforme mostra a figura 40. Em relação ao grupo HCI (n = 10), as respostas

autonômicas e respiratórias observadas em preparações de ratos HCI foram semelhantes

àquelas observados no grupo controle. Além disso, não observamos diferenças entre as

respostas de bradicardia (-128 ± 26; -125 ± 23; 152 ± 33 bpm; respectivamente 25, 50 e 100

mM; painel A da figura 39), excitação vagal (98 ± 18; 100 ± 13; 157 ± 35 %; respectivamente

25, 50 e 100 mM; painel B da figura 39), simpato-excitação (25 ± 4; 46 ± 9; 49 ± 13 %;

respectivamente 25, 50 e 100 mM; painel C da figura 39) e apnéia (figura 40) quando os

grupos experimentais foram comparados. A figura 41 contém fotomicrografias de secções

coronais do tronco cerebral de uma preparação de um rato controle e de um rato HCI,

representativas dos grupos, as quais estão combinadas a uma representação esquemática do

NTSc, ilustrando os sítios das microinjeções nesta região.

Page 117: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 116

Figura 38. Registros da freqüência cardíaca (FC) e das atividades originais e integradas (∫) dos nervos vago cervical (ANVc), simpático torácico (ANSt) e frênico (ANF) de preparações de um rato controle (Controle, painel da esquerda) e de um rato submetido à HCI (HCI, painel da direita), representativas de seus respectivos grupos, mostrando os efeitos das microinjeções unilaterais de α,β,metil-ATP (50 mM) no NTS caudal (indicadas pelas setas).

FC

α, β, metil-ATP50 mM

HCI

α, β, metil-ATP50 mM

∫ANVc

ANVc

∫ANSt

ANSt

∫ANF

ANF

CONTROLE

2 s

Page 118: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 117

Figura 39. Magnitude das respostas de bradicardia (∆FC, painel A), excitação vagal (∆ANVc, painel B) e simpática (∆ANSt, painel C) promovidas pelas microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de α,β,metil-ATP (25, 50 e 100 mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (n = 9) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10). Nesses gráficos, o eixo X (concentração de α,β,metil-ATP) está representado em escala logarítmica.

A

10 100

-200

-150

-100

-50

0ControleHCI

[α , β , metil-ATP], mM

∆ F

C (b

pm)

B

10 1000

50

100

150

200

250ControleHCI

[α , β , metil-ATP], mM

∆ A

NVc

(%)

C

10 1000

20

40

60

80ControleHCI

[α , β , metil-ATP], mM

∆ A

NSt

(%)

Page 119: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 118

Figura 40. Evolução temporal da freqüência de despolarização do nervo frênico em resposta às microinjeções unilaterais de diferentes concentrações de α,β,metil-ATP (25, 50 e 100 mM, tempo 0) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 9) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 10).

25 mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.00.10.20.30.40.50.60.70.8

ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (H

z)

50 mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.00.10.20.30.40.50.60.70.8

ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (H

z)

100 mM

-20 -10 0 10 20 30 40 500.00.10.20.30.40.50.60.70.8

ControleHCI

Tempo (s)

AN

F (H

z)

Page 120: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 119

Figura 41. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo de uma preparação de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os sítios das microinjeções unilaterais de α,β,metil-ATP (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil.

4.2.7. Efeito do antagonismo dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos no

aspecto caudal do núcleo do trato solitário sobre as respostas à ativação do

quimiorreflexo após 10 dias de HCI

As figuras 42 e 43 apresentam traçados de preparações de ratos controle e HCI,

representativas dos seus respectivos grupos experimentais, mostrando o efeito das

microinjeções no NTS caudal dos antagonistas dos receptores ionotrópicos do L-glutamato e

dos receptores P2 do ATP, respectivamente, ácido quinurênico (KYN, 250mM) e PPADS

(20mM), sobre as respostas simpato-excitatória, bradicárdica e taquipneica do quimiorreflexo.

HCI

CC12N

Gr

10NCC 12N

Gr

10N

Controle

Page 121: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 120

Figura 42. Registros de uma preparação de um rato controle, representativa do grupo, mostrando as respostas de simpato-excitação, de bradicardia e de taquipnéia promovidas pela ativação do quimiorreflexo com KCN (indicado pela seta) antes (controle) e 2, 10, 30, 45 e 60 minutos após as microinjeções de KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal. FC: freqüência cardíaca; ANSt: atividade do nervo simpático torácico [original e integrada (∫)]; ∫ANF: atividade integrada do nervo frênico.

∫AN

FAN

St(m

V)∫A

NSt

FC (bpm

)∫A

NF

ANSt

(mV)

∫AN

StFC (bpm

)

RATO CONTROLE

Controle 2’ 10’

30’ 45’ 60’

5 s

600

300

00,30

0,15

01,3

-1,3

0

1000

500

0

600

300

00,30

0,15

01,3

-1,3

0

1000

500

0

Page 122: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 121

Figura 43. Registros de uma preparação de um rato submetido à HCI, representativa do grupo, mostrando as respostas de simpato-excitação, de bradicardia e de taquipnéia promovidas pela ativação do quimiorreflexo com KCN (indicado pela seta) antes (controle) e 2, 10, 30, 45 e 60 minutos após as microinjeções de KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal. FC: freqüência cardíaca; ANSt: atividade do nervo simpático torácico [original e integrada (∫)]; ∫ANF: atividade integrada do nervo frênico.

∫AN

FAN

St(m

V)∫A

NSt

FC (bpm

)∫A

NF

ANSt

(mV)

∫AN

StFC (bpm

)

RATO HCI

Controle 2’ 10’

30’ 45’ 60’

5 s

600

300

00,40

0,15

01,5

-1,5

0

1000

500

0

600

300

00,30

0,15

01,5

-1,5

0

1000

500

0

Page 123: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 122

A resposta de bradicardia do quimiorreflexo foi atenuada de forma semelhante aos 2,

10, 30 e 45 minutos após o duplo antagonismo no NTS caudal de ambos os grupos

experimentais, conforme ilustra a figura 44. Em relação ao componente simpato-excitatório,

este foi significativamente atenuado em ambos os grupos experimentais aos 2 e aos 10

minutos após o duplo antagonismo no NTS caudal. No entanto, apesar de atenuada, a resposta

simpato-excitatória remanescente observada após KYN + PPADS no NTSc foi

significativamente maior no grupo HCI aos 2 (29,6 ± 2,8 vs 19,5 ± 3,9%, P = 0,0475) e aos 10

minutos (47,2 ± 10,0 vs 21,8 ± 4,7%, P = 0,0305) em comparação ao grupo controle,

indicando que o antagonismo foi menos efetivo no grupo HCI. Aos 30, 45 e 60 minutos, as

respostas simpato-excitatórias foram semelhantes às respectivas respostas controles em ambos

os grupos, sendo estas significativamente maiores no grupo HCI aos 45 e 60 minutos. Esses

resultados estão sumarizados na figura 45. Considerando que os grupos experimentais

partiram de respostas simpato-excitatórias diferentes, uma vez que esta foi maior nas

preparações de ratos HCI, realizamos uma análise na qual avaliamos a reversão da inibição da

resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo promovidas pelas microinjeções de KYN +

PPADS no NTSc das preparações dos ratos controle e HCI. Para tanto, os valores do

porcentual de inibição (em relação a resposta controle) foram então representados em um

gráfico, cujos pontos foram ajustados segundo uma equação polinomial de segundo grau para

obtenção das curvas. Observamos que a reversão do antagonismo dos receptores

glutamatérgicos e purinérgicos no NTS caudal sobre a resposta simpato-excitatória foi

semelhante entre os grupos experimentais (P > 0,05), conforme ilustrado na figura 46.

Considerando a ANF, o antagonismo simultâneo dos receptores ionotrópicos do L-

glutamato e dos receptores P2 do ATP no NTS caudal promoveu uma alteração no padrão

ventilatório basal tanto no grupo controle como no grupo HCI, como pode ser verificado nas

figuras 42 e 43. Em ambos os grupos experimentais, observamos um aumento no tempo de

Page 124: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 123

disparo do nervo frênico, indicando um aumento da duração da inspiração. Além disso, como

ilustra a figura 47, foi observado um aumento significativo na freqüência de despolarização

basal do nervo frênico do grupo controle aos 2 (0,76 ± 0.12 vs 0,34 ± 0,03 Hz, P < 0,01) e aos

10 minutos (0,78 ± 0,14 vs 0,34 ± 0,03 Hz, P < 0,01) após as microinjeções dos antagonistas

quando comparados com os valores basais. Entretanto, nenhuma alteração significativa foi

observada na freqüência basal da ANF do grupo HCI após a microinjeção dos antagonistas no

NTS caudal (figura 47). Entretanto, apesar das alterações no padrão e na freqüência da ANF

basal, a magnitude do aumento da ANF em resposta a ativação do quimiorreflexo com KCN

não foi afetada pelo antagonismo simultâneo com KYN e PPADS no NTS caudal, conforme

ilustra a figuras 48.

Figura 44. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta de bradicardia (∆FC) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN (0,05%). * P < 0,05 - diferente em relação à respectiva resposta controle (C).

C 2' 10' 30' 45' 60'

-250

-200

-150

-100

-50

0

* * * *

*

***

tempo após 250 mM KYN + 20 mM PPADS

ControleHCI

∆ F

C (b

pm)

Page 125: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 124

Figura 45. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta simpato-excitatória (∆ ANSt) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN (0,05%). ‡ P < 0,05 – diferente em relação à respectiva resposta controle do grupo (C); * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

Figura 46. Porcentagem de inibição da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo (% inibição ANSt), em relação às respectivas respostas controle, após duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14).

C 2' 10' 30' 45' 60'0

20

40

60

80

100

120

140 ControleHCI*

‡*

* *

* ‡

tempo após 250mM KYN + 20 mM PPADS

∆ A

NSt

(%)

0 10 20 30 40 50 60

-90

-70

-50

-30

-10

10

ControleHCI

Tempo após KYN + PPADS (min)

% in

ibiç

ão A

NSt

Page 126: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 125

Figura 47. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a freqüência basal de despolarização do nervo frênico (ANF basal). ‡ P < 0,01 – diferente em relação à respectiva freqüência basal (antes). * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

Figura 48. Efeito do duplo antagonismo com KYN (250mM) + PPADS (20mM) no NTS caudal de preparações de ratos controle (Controle, n = 14) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 14) sobre a resposta de taquipnéia (∆ ANF) do quimiorreflexo promovida pela administração de KCN.

Antes 2' 10' 30' 45' 60'0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0 ControleHCI

tempo após 250 mM KYN + 20 mM PPADS

**

‡‡

AN

F ba

sal (

Hz)

C 2' 10' 30' 45' 60'0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40 ControleHCI

tempo após 250 mM KYN + 20 mM PPADS

∆ A

NF

(Hz)

Page 127: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 126

CONTROLE

HCI

Figura 49. Fotomicrografias de secções coronais do bulbo (A) de preparações de um rato controle (controle) e de um rato submetido à HCI (HCI), combinadas com diagramas esquemáticos (B) a partir do Atlas de Paxinos e Watson (1998), mostrando os centros das microinjeções bilaterais de KYN + PPADS (indicado pela seta na fotomicrografia à esquerda e pelos círculos pretos no diagrama à direita) no NTS caudal. Abreviações: CC – canal central; 12N – núcleo do hipoglosso; 10N – núcleo motor dorsal do vago; Gr – núcleo Grácil.

Page 128: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 127

4.3. Avaliação da densidade de receptores glutamatérgicos e purinérgicos no

tronco cerebral

Previamente a obtenção das amostras para os experimentos de western blot, os animais

do grupo controle (n = 24) e do grupo HCI (n = 24) considerados para este protocolo

experimental tiveram seus parâmetros cardiovasculares registrados conforme descrito

anteriormente. Observamos que os ratos HCI apresentaram valores significativamente

maiores de PAM (101 ± 2 vs 92 ± 1 mmHg, P < 0,05) e de FC basais (508 ± 10 vs 473 ± 7

bpm, P < 0,05) quando comparados aos ratos controle.

4.3.1. Densidade dos receptores glutamatérgicos e purinérgicos na superfície

rostral ventrolateral do bulbo após 10 dias de HCI

Nas amostras de tecido neural contendo os neurônios pré-motores simpáticos do

RVLM e os neurônios respiratórios do BötC/pré-BötC de ambos os grupos experimentais,

bandas de proteínas bem definidas com peso molecular de aproximadamente 110 kDa foram

obtidas pelo uso dos anticorpos para as subunidades NMDAR1 e GluR2/3 dos receptores

ionotrópicos NMDA e não-NMDA, respectivamente, do L-glutamato. As bandas de α-

tubulina foram obtidas com peso molecular de 55 kDa. Observamos que as razões NMDAR1

/ α-tubulina (1,17 ± 0,07 vs 1,19 ± 0,15) e GluR2/3 / α-tubulina (1,32 ± 0,11 vs 1,57 ± 0,13)

foram semelhantes entre os grupos controle e HCI, sugerindo que a densidade dos receptores

glutamatérgicos no RVL de ratos HCI não está alterada, conforme ilustra a figura 51. Em

relação aos receptores purinérgicos, bandas de proteínas bem definidas com peso molecular

entre 72 – 55 kDa foram obtidas pelo uso dos anticorpos para os receptores P2X1, P2X3 e

P2Y2. Para os receptores P2X4 foram consideradas as bandas de proteínas obtidas próximas à

43 kDa. As razões P2X1/α-tubulina [0,88 ± 0,03 vs 0,92 ± 0,05; respectivamente grupos HCI

Page 129: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 128

(n = 8) e controle (n = 5)] e P2Y2/α-tubulina [(0,70 ± 0,05 vs 0,59 ± 0,04; respectivamente

grupos HCI (n = 7) e controle (n = 7)] não foram significativamente diferentes entre os grupos

experimentais. Entretanto, verificamos que a razão P2X3/α-tubulina foi significativamente

maior no grupo HCI em comparação ao grupo controle [0,92 ± 0,03 vs 0,79 ± 0,05; P =

0,0497; respectivamente grupos HCI (n = 8) e controle (n = 8)]. De forma semelhante,

observamos que a razão P2X4/α-tubulin também foi maior no grupo HCI do que no grupo

controle [0,93 ± 0,01 vs 0,77 ± 0,04; P = 0.0152; respectivamente grupos HCI (n = 3) e

controle (n = 3)]. Esses resultados sugerem que a densidade dos receptores P2X3 e P2X4 está

aumentada em ratos HCI, conforme indicado na figura 50.

Figura 50. Densidade de receptores P2X1, P2X3, P2X4 e P2Y2; e das subunidades NMDAR1 e GluR2/3, avaliada em amostras do região rostral ventrolateral do bulbo, na qual estão localizadas os neurônios pré-motores simpáticos (RVLM) e neurônios respiratórios do BötC e pré-BötC de ratos controle (Controle, n = 3 - 8) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 3 - 8). Note o aumento da densidade de receptores P2X3 e P2X4 nos animais HCI em relação aos animais controle. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

P2X1 P2X3 P2X4 P2Y20.00.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0 *

Controle HCI

*

P2/ α

-tub

ulin

Controle

HCI

P2X1 P2X3 P2X4 P2Y2 α-tubulina

GluR 2/3 NMDA R10.00.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Controle HCI

Glu

R/ α

-tub

ulin

Page 130: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Resultados 129

4.3.2. Densidade dos receptores glutamatérgicos no aspecto caudal do núcleo do

trato solitário após 10 dias de HCI

A partir das amostras de tecido neural contendo os neurônios do aspecto caudal do

núcleo do trato solitário, obtivemos bandas de proteínas bem definidas para as subunidades

NMDAR1 e GluR2/3 e para a α-tubulina, cujos pesos moleculares foram semelhantes das

respectivas bandas obtidas nas amostras do RVL. Observamos que a razão NMDAR1 / α-

tubulina foi significativamente maior (1,22 ± 0,02 vs 1,11 ± 0,01; P = 0,0203) nos animais

HCI (n = 3) do que nos animais controle (n = 2). Em relação à subunidade GluR2/3, não

houve significância estatística na a razão GluR2/3 / α-tubulina quando os grupos

experimentais foram comparados [1,14 ± 0,01 vs 0,99 ± 0,05; P = 0,0558; respectivamente

grupos HCI (n = 3) e controle (n = 3)]. Esse conjunto de resultados, o qual está apresentado na

figura 51, sugere que a densidade da subunidade NMDAR1 dos receptores ionotrópicos do L-

glutamato está aumentado no NTSc de ratos HCI.

Figura 51. Densidade das subunidades NMDAR1 e GluR2/3, avaliada em amostras do aspecto caudal do núcleo do trato solitário de ratos controle (Controle, n = 2 - 3) e de ratos submetidos à HCI (HCI, n = 3). Note o aumento da densidade da subunidade NMDAR1. * P < 0,05 – diferente em relação ao grupo controle.

NMDA R1 GluR 2/30.00.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3 ControleHCI*

Glu

R /

α-t

ubul

ina

Page 131: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

5. DISCUSSÃO

Page 132: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 131

Apesar de haver evidências experimentais mostrando uma relação entre a exposição à

HCI e o desenvolvimento da hipertensão arterial tanto em humanos como em modelos

animais (Fletcher, 2001; Caples et al., 2005; Leuenberger et al., 2005; Zoccal et al., 2007a;

Zoccal et al., 2007b), os mecanismos neurais envolvidos nessa disfunção cardiovascular ainda

não estão completamente elucidados. No presente estudo, demonstramos que ratos jovens

submetidos à HCI por 10 dias apresentam níveis elevados da pressão arterial, os quais

parecem ser dependentes de um aumento do tônus vasomotor simpático. Nossos resultados

mostram claramente que o desenvolvimento da hipertensão arterial promovida pela HCI em

ratos jovens não é secundária às alterações na função barorreflexa. Entretanto, a pressão

arterial dos animais HCI mostrou uma maior modulação respiratória, a qual foi avaliada pela

análise espectral, indicando que possíveis alterações na função respiratória ou no acoplamento

entre as atividades simpática e respiratória podem estar influenciando de forma significativa o

sistema nervoso simpático, contribuindo para o desenvolvimento da hipertensão nesses

animais. Nos experimentos realizados nas preparações in situ, verificamos que ratos jovens

submetidos à HCI apresentam um padrão de expiração forçada, o qual se correlaciona com os

níveis elevados da atividade simpática na fase final da expiração, indicando que o

acoplamento central entre as atividades simpática e respiratória está alterado após a exposição

à HCI. Observamos também que tanto a resposta simpato-excitatória quanto a de taquipnéia,

promovidas pela ativação do quimiorreflexo com KCN, estão exacerbadas nos animais HCI,

corroborando a idéia de que a HCI altera o controle neural das funções simpática e

respiratória. Nesse sentido, alterações nos mecanismos glutamatérgicos e purinérgicos foram

avaliadas no NTS e no RVL de ratos HCI com o objetivo de se verificar a possível

participação desses sistemas nas alterações simpática e respiratória nesses animais.

Page 133: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 132

Hipóxia crônica intermitente e o desenvolvimento da hiperatividade simpática e da

hipertensão arterial

Para melhor avaliarmos os efeitos da HCI sobre a pressão arterial de ratos jovens,

medidas da PAS foram realizadas antes e após o protocolo experimental, pelo uso dos

métodos indireto (pletismografia de cauda) e direto (cateter arterial), respectivamente. Apesar

das diferenças metodológicas, verificamos que os valores da PAS obtidos em ambos os

métodos utilizados foram comparáveis (dados apresentados na seção Resultados), validando a

presente análise comparativa. Dessa forma, observamos que previamente ao início do

protocolo experimental, os ratos dos grupos controle e HCI apresentavam valores semelhantes

de pressão arterial. Após 10 dias, tanto os animais do grupo controle quanto os animais do

grupo HCI apresentaram uma elevação da PAS em comparação aos respectivos valores

iniciais. O aumento da PAS observado em ratos controle está relacionado ao período de

maturação do animal (Kasparov & Paton, 1997; Dickhout & Lee, 1998), no qual ocorre um

aumento do tônus vascular devido às alterações na reatividade das células musculares lisas a

agentes vasoativos (Samora et al., 2007, 2008). Por outro lado, observamos que ratos

submetidos à HCI apresentaram um maior aumento na PAS do que aquele observado nos

ratos controle. Conseqüentemente, os níveis pressóricos dos ratos HCI foram

significativamente mais elevados do que os ratos controle. Com o objetivo de verificar se esse

aumento da pressão arterial de ratos HCI estava associado a uma hiperatividade simpática,

dois procedimentos experimentais distintos foram utilizados para avaliar indiretamente a

atividade simpática basal em animais acordados.

Inicialmente, realizamos experimentos envolvendo o bloqueio ganglionar em

associação com o antagonismo dos receptores AT1 da angiotensina II e dos receptores V1a da

vasopressina. O objetivo desses antagonismos foi excluir o efeito compensatório dos sistemas

angiotensinérgicos e vasopressinérgicos decorrente da grande redução na pressão arterial

Page 134: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 133

promovida pelo bloqueio ganglionar, evitando possíveis interferências no nível remanescente

da pressão arterial decorrente da retirada do componente simpático vascular (Zoccal et al.,

2007b). Utilizando estes procedimentos, verificamos que a resposta hipotensora ao bloqueio

ganglionar foi significativamente maior nos ratos HCI do que nos ratos controle, indicando

um maior tônus simpático vasomotor após a exposição à HCI.

Complementar aos estudos farmacológicos, também realizamos a análise da

variabilidade da PAS e do IP. Sabe-se que a modulação tônica do sistema nervoso autônomo

sobre o sistema cardiovascular é um dos principais fatores responsáveis pela geração da

variabilidade da pressão arterial e da freqüência cardíaca (Akselrod et al., 1985; Malliani et

al., 1991). Oscilações de baixa freqüência na pressão arterial e na freqüência cardíaca estão

associadas a uma modulação simpática sobre as arteríolas e o coração, respectivamente,

enquanto que as oscilações de alta freqüência refletem a modulação da atividade respiratória

sobre a pressão arterial ou a modulação parassimpática sobre a freqüência cardíaca (Japundzic

et al., 1990; Cerutti et al., 1991a; Malliani et al., 1991). Portanto, pela análise da variabilidade

dos parâmetros cardiovasculares é possível inferir alterações no controle autonômico do

sistema cardiovascular. No presente estudo, verificamos que a variabilidade do IP de ratos

HCI, tanto no domínio do tempo como no domínio da freqüência, não foi diferente quando

comparada com ratos controle, sugerindo que o balanço simpato-vagal cardíaco não está

alterado após a HCI. No entanto, observamos que a variância da PAS nos ratos HCI estava

aumentada em relação aos ratos controle. Além disso, a magnitude da potência do

componente de baixa freqüência estava significativamente maior nos grupo HCI do que no

grupo controle, indicando uma maior modulação simpática vasomotora sobre a pressão

arterial dos ratos HCI. Esses resultados, combinados com aqueles obtidos pelo bloqueio

ganglionar, sugerem fortemente que o desenvolvimento da hipertensão arterial de ratos HCI

está efetivamente associado a um aumento do tônus simpático basal.

Page 135: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 134

Com o objetivo verificar se a hiperatividade simpática e o conseqüente aumento da

pressão arterial observados após a HCI fossem decorrentes de uma diminuição da função

barorreflexa, esta foi avaliada nos ratos controle e HCI. Pelo método das seqüências,

verificamos que a sensibilidade do barorreflexo espontâneo foi semelhante entre os grupos

experimentais, sugerindo que o controle barorreflexo cardíaco, pelo menos na estreita faixa de

variações fisiológicas da pressão arterial, não estava alterado após 10 dias de HCI. Entretanto,

quando consideramos toda a extensão da curva sigmoidal barorreflexa, a qual foi obtida pelas

injeções (i.v.) de fenilefrina e nitroprussiato de sódio, observamos que ratos jovens

submetidos à HCI por 10 dias exibiam um aumento do ganho da função barorreflexa, uma vez

que: i) a faixa de variação dos valores de FC da curva sigmoidal foi significativamente maior

no grupo HCI do que no grupo controle, devido às maiores respostas máximas de bradicardia

(platô inferior) e taquicardia (platô superior), embora este último parâmetro não tenha sido

estatisticamente diferente; ii) a inclinação da porção linear da curva sigmoidal, a qual

compreendeu as variações de PAM entre -20 a + 20 mmHg, foi maior nos animais HCI do

que nos animais controle. Considerando que as respostas máximas de bradicardia e

taquicardia reflexas estão correlacionadas com as atividades parassimpáticas e simpáticas

máximas para o coração (Head & McCarty, 1987), os resultados indicam que os ratos HCI

apresentaram uma facilitação de ambos os componentes autonômicos da atividade

barorreflexa cardíaca. De fato, a maior resposta taquicárdica dos animais HCI é coerente com

os resultados mostrando um aumento da atividade simpática nesses animais.

Diferente dos nossos resultados, estudos realizados em camundongos (Lin et al., 2007)

ou ratos adultos (Gu et al., 2007; Yan et al., 2008) submetidos à HCI e avaliados sob

condições de anestesia, mostraram uma atenuação do controle barorreflexo da freqüência

cardíaca. Apesar de haver diferenças em relação à espécie e ao uso de anestésicos, estes

estudos avaliaram a função barorreflexa em animais submetidos à HCI por períodos de 1 a 3

Page 136: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 135

meses (Gu et al., 2007; Lin et al., 2007; Yan et al., 2008), portanto muito superior aos 10 dias

utilizados nos nossos estudos. Nesse sentido, estudos de Lai et al. (2006) avaliaram a

associação entre hipertensão e disfunção barorreflexa em ratos adultos submetidos à HCI e

livres dos efeitos dos anestésicos. De acordo com os autores, os ratos expostos à HCI

apresentaram uma elevação da pressão arterial, associada a um aumento da potência de LF

(componente simpático) da variabilidade do IP 5 dias após o início da HCI, enquanto que uma

redução do ganho do barorreflexo espontâneo foi observada somente após 17 dias de

exposição. Portanto, de acordo com esse estudo, existe uma janela temporal entre o aumento

da pressão arterial e a disfunção barorreflexa em ratos submetidos à HCI, o que está de acordo

com os nossos resultados mostrando que o desenvolvimento da hipertensão em ratos

submetidos à HCI não é secundário a uma redução no ganho do barorreflexo. De fato, nossos

resultados mostram um aumento da função barorreflexa dos ratos HCI, o que poderia evitar

um aumento ainda maior dos níveis da pressão arterial observados.

Dessa forma, podemos sugerir que outros mecanismos não relacionados com a função

barorreflexa poderiam estar envolvidos no aumento da atividade simpática e da pressão

arterial basais de ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias. Nesse sentido, outro aspecto

importante observado pela análise espectral se refere ao expressivo aumento da potência do

componente de alta freqüência da pressão arterial dos ratos HCI em relação aos ratos controle,

indicando uma maior modulação respiratória sobre a pressão arterial após a HCI. As

oscilações na atividade simpática associadas à atividade respiratória são decorrentes de: i)

alterações na pressão da caixa torácica durante o ciclo respiratório, aumentando o retorno

venoso e, conseqüentemente, estimulando os barorreceptores; ii) informações provenientes

dos receptores pulmonares, principalmente os de estiramento pulmonar, modulando a

atividade simpática; iii) conexões entre os neurônios geradores da atividade respiratória e

simpática localizados no tronco cerebral (Bernardi et al., 2001). Considerando estudos

Page 137: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 136

mostrando que o sistema respiratório é um dos principais fatores que geram oscilações na

atividade eferente simpática (Häbler et al., 1994; Koshiya & Guyenet, 1996b; Malpas, 1998),

uma maior influência do sistema respiratório sobre o sistema nervoso simpático poderia

contribuir para o aumento dos níveis basais da atividade simpática e, conseqüentemente, da

pressão arterial em ratos submetidos à HCI.

A realização de estudos com o objetivo de se avaliar as atividades simpática e

respiratória em animais acordados, por meio de registros diretos e simultâneos das atividades

de diferentes nervos, é de muito difícil execução. Portanto, utilizamos a abordagem da

preparação in situ coração tronco-cerebral isolados, uma vez que esta apresenta uma série de

vantagens, conforme descrito na Introdução. Dessa forma, observamos que o padrão de

disparo da atividade do nervo simpático torácico em preparações de ratos jovens submetidos à

HCI se mostrou diferenciado em comparação com a atividade registrada em preparações de

ratos controle. Em ambos os grupos experimentais, a atividade simpática torácica apresentou-

se nitidamente modulada pela atividade respiratória, apresentando um pico de atividade

durante a fase final da inspiração, seguido de uma redução durante o período pós-inspiratório.

Entretanto, observamos que os ratos submetidos à HCI exibiram um aumento significativo da

atividade simpática durante a fase final da expiração. Considerando que na preparação

coração tronco-cerebral isolados os pulmões se encontram estáticos, essas alterações não

foram dependentes da ativação dos receptores de estiramento pulmonar. Além disso, esse

mesmo padrão de alteração nas atividades simpática e expiratória também foi observado em

animais com remoção dos corpúsculos carotídeos, excluindo a participação dos

quimiorreceptores periféricos. Portanto, esses resultados indicam a HCI interfere com a

atividade dos neurônios do tronco cerebral envolvidos com o controle da atividade simpática.

Page 138: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 137

Atividade respiratória basal em ratos jovens submetidos à HCI

Estudos demonstram que a o ritmo respiratório basal é gerado no tronco cerebral

(Smith et al., 1991; Richter & Spyer, 2001; Feldman & Del Negro, 2006; Smith et al., 2007),

no qual neurônios inspiratórios e expiratórios estão reciprocamente conectados por vias

inibitórias, produzindo padrões de atividades inspiratórias e expiratórias sincronizadas

(Richter & Spyer, 2001; Rybak et al., 2007; Smith et al., 2007). No presente estudo, tanto a

duração dos bursts, ou envelopes de potenciais de ação, quanto à freqüência de despolarização

do nervo frênico foram semelhantes entre os grupos experimentais, sugerindo que a atividade

inspiratória basal não foi afetada pela exposição à HCI. Por outro lado, a atividade eferente

vagal dos ratos HCI mostrou-se reduzida durante a fase inicial pós-inspiratória quando

comparada com a respectiva atividade do grupo controle. Além disso, os ratos HCI também

apresentaram um pico de atividade no nervo abdominal durante a fase final da expiração, o

qual não foi observado nos animais do grupo controle. Esses resultados indicam que ratos

jovens submetidos à HCI apresentaram um padrão alterado de atividade expiratória, com uma

redução da atividade pós-inspiratória e aumento da atividade expiratória na fase final do ciclo

expiratório.

Entre as regiões do tronco cerebral envolvidas com a geração da atividade respiratória,

o complexo Bötzinger (BötC), região localizada na porção rostral do grupo respiratório

ventral, é reconhecido como a principal fonte de neurônios expiratórios (Ezure, 1990; Jiang &

Lipski, 1990; Shen et al., 2003; Smith et al., 2007). Estudos demonstram que esta região

contém preferencialmente neurônios que exibem um padrão decrescente de atividade,

caracterizados por uma rápida despolarização na fase final da inspiração, denominados de

neurônios pós-inspiratórios (post-inspiratory neurons, post-I), e neurônios que apresentam um

padrão crescente de atividade que iniciam sua despolarização durante o meio da expiração e

terminam imediatamente antes do disparo do nervo frênico, denominados de neurônios

Page 139: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 138

expiratórios crescentes (augmenting expiratory neurons, aug-E) (Bianchi et al., 1995; Smith

et al., 2007). Sabe-se que o BötC está diretamente conectado não somente com os

grupamentos neuronais do grupo respiratório ventral, como o complexo pré-Bötzinger (pré-

BötC), e as porções rostral e caudal do grupo respiratório ventral (rVRG e cVRG,

respectivamente), mas também com outros núcleos pontinos e bulbares, tais como o complexo

parabraquial/Kölliker-Fuse, o núcleo retrotrapezóide e o grupo respiratório dorsal / núcleo do

trato solitário (Douse & Duffin, 1992; Bianchi et al., 1995; Janczewski & Feldman, 2006;

Rybak et al., 2007; Smith et al., 2007; Mörschel & Dutschmann, 2009). A figura 53 ilustra a

relação dos neurônios expiratórios localizados no BötC com outros grupamentos neuronais do

tronco cerebral.

A atividade dos neurônios post-I é pode ser avaliada indiretamente por meio da análise

do componente pós-inspiratório da atividade eferente vagal. Além disso, o nervo abdominal, o

qual em condições basais apresenta sua atividade predominantemente na fase pós-inspiratória,

pode também apresentar um padrão crescente de atividade durante a fase final da expiração,

semelhante à atividade dos neurônios aug-E, em condições de aumento da atividade

expiratória, como, por exemplo, durante a ativação dos quimiorreceptores periféricos (como

apresentado no presente estudo). Portanto, por meio dos registros da atividade dos nervos

vago e abdominal, realizamos uma avaliação indireta da atividade dos neurônios expiratórios

do BötC. Dessa forma, o aumento da atividade motora abdominal dos ratos HCI observado na

fase final da expiração sugerem que a atividade dos neurônios aug-E do BötC, em condições

de normóxia, está aumentada após a exposição à HCI. De fato, estudos de Kanjhan et al.

(1995) mostraram que a freqüência de despolarização dos neurônios do BötC aumentam em

condições de hipóxia, indicando que a atividade desses neurônios é sensível a este estímulo.

Portanto, considerando que os neurônios aug-E do BötC enviam projeções para a medula

espinhal (Tian et al., 1998), é provável que o aumento da atividade desses neurônios,

Page 140: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 139

ocasionada pela exposição à HCI, promova a excitação dos neurônios motores abdominais da

medula espinhal, levando ao aumento da atividade motora abdominal na fase final da

expiração. Além disso, também é possível que a excitação dos neurônios motores abdominais

pelos neurônios aug-E do BötC ocorra de forma indireta, via ativação do neurônios do cVRG

(Ezure et al., 2003), os quais, por sua vez, excitariam neurônios motores abdominais da

medula espinhal (Ezure et al., 2003; Fortuna et al., 2008).

Outra evidência a favor da hipótese de um aumento da atividade dos neurônios aug-E

pela HCI é a observação de que a atividade pós-inspiratória vagal nos ratos HCI está

diminuída. Considerando que os neurônios post-I e aug-E do BötC estão reciprocamente

conectados por vias inibitórias (Shen et al., 2003), a maior excitação dos neurônios aug-E

promovida pela HCI levaria a uma depressão dos neurônios post-I, reduzindo a sua atividade

a cada ciclo respiratório, conforme ilustra a figura 54. Essas observações são consistentes com

os achados de uma menor atividade pós-inspiratória do nervo vago, ainda que restrita a sua

fase inicial. Alternativamente, também é possível que o aumento da atividade dos neurônios

aug-E seja decorrente de um efeito inibitório da HCI sobre a atividade dos neurônios post-I,

acarretando em uma diminuição da inibição sobre os neurônios aug-E.

Considerando as diversas conexões do BötC com outros núcleos respiratórios do

tronco cerebral (Douse & Duffin, 1992; Bianchi et al., 1995; Janczewski & Feldman, 2006;

Rybak et al., 2007; Smith et al., 2007; Mörschel & Dutschmann, 2009), é provável que a HCI

possa interferir com a atividade de outros grupamentos neuronais, os quais, por sua vez,

afetariam a atividade dos neurônios do BötC. Nesse sentido, um núcleo a ser considerado é o

núcleo retrotrapezóide (nRT) – também denominado de grupo respiratório parafacial (pFRG)

(Onimaru et al., 1987, 1988). Estudos de Abdala et al. (2009) mostraram que em condições de

hipercapnia há um aumento da atividade motora abdominal durante a fase final da expiração

(de modo semelhante ao observado nos animais HCI), o qual é abolido quando da inibição

Page 141: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 140

química do nRT com isoguvacina (agonista dos receptores GABAA), sugerindo que esta

região é importante para a geração de um padrão de expiração forçada, pelo menos em

condições de hipercapnia. Portanto, considerando estes estudos, é possível que a exposição à

HCI aumente a excitabilidade dos neurônios do nRT, os quais, por sua vez, excitariam os

neurônios aug-E do BötC ou do cVRG (Abdala et al., 2009). Contudo, estudos adicionais

serão necessários para verificar o papel do nRT nas alterações expiratórias promovidas pela

HCI.

Outro grupamento neuronal a ser considerado no contexto das alterações respiratórias

basais induzidas pela HCI é o NTS. Estudos mostram que na região do NTS existem

neurônios inspiratórios e expiratórios, os quais são denominados de grupo respiratório dorsal

(Berger, 1977; Richerson & Getting, 1992; Bianchi et al., 1995; Subramanian et al., 2007).

Apesar de seu papel na geração do ritmo respiratório ainda ser um assunto em discussão,

estudos mostram que a inibição dos neurônios do grupo respiratório dorsal promove

alterações significativas no ritmo respiratórios basal (Braga et al., 2007; Braccialli et al.,

2008). Estudos do nosso laboratório realizado em animais acordados mostram que

microinjeções de agonistas de receptores glutamatérgicos promove respostas de apnéia

(Almado & Machado, 2005) enquanto que microinjeções de antagonistas dos receptores

ionotrópicos do L-glutamato, com o ácido quinurênico, na porção caudal do NTS (caudal ao

calamus scriptorius) promove um aumento da freqüência respiratória basal, (Braccialli et al.,

2008). Em preparações in situ, estudos em andamento no nosso laboratório mostram que esse

mesmo antagonismo no NTS caudal promove um aumento da freqüência de despolarização e

da duração dos disparos do nervo frênico (aumento da duração da inspiração), associados a

uma redução significativa do componente pós-inspiratório vagal (Costa-Silva et al., resultados

submetidos ao J Neurophysiology), sugerindo que a neurotransmissão glutamatérgica no NTS

caudal é importante para a geração da atividade pós-inspiratória e do padrão respiratório

Page 142: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 141

eupnêico. Nesse sentido, há evidências de que os neurônios do grupo respiratório dorsal

presentes no NTS caudal são inibitórios e fazem conexões com os neurônios do grupo

respiratório ventral (Richter et al., 1987; Marchenko & Sapru, 2000; Subramanian et al.,

2007). No presente estudo, verificamos em preparações de animais controle que

microinjeções de L-glutamato no NTS caudal promoveram respostas de redução na freqüência

de despolarização do nervo frênico, a qual se deu, provavelmente, pela excitação dos

neurônios post-I do BötC, os quais são responsáveis pelo término da inspiração (Bianchi et

al., 1995; Smith et al., 2007). Este aumento da atividade dos neurônios post-I promovido pelo

L-glutamato no NTS caudal foi evidenciado pela resposta de aumento da atividade pós-

inspiratória vagal. Portanto, a excitação dos neurônios post-I do BötC em resposta à

estimulação dos neurônios inibitórios do NTS caudal pelo L-glutamato ocorreu,

provavelmente, por uma via dissináptica inibitória, assim como é observado nas vias do

reflexo de Hering-Breuer (Hayashi et al., 1996; Kubin et al., 2006). Para tanto, a excitação

dos neurônios inibitórios do NTS caudal promoveriam a inibição dos neurônios que inibem os

neurônios post-I, como, por exemplo, os neurônios aug-E do BötC. Esta hipótese que exige

estudos eletrofisiológicos para ser comprovada, está ilustrada na figura 53.

Em preparações de ratos submetidos à HCI, verificamos que as alterações respiratórias

promovidas pelo antagonismo conjunto dos receptores ionotrópicos glutamatérgicos e dos

receptores purinérgicos no NTS caudal foi menos expressivo nos animais HCI do que nos

animais controle. Considerando que as respostas respiratórias e autonômicas ao agonista

purinérgico α, β, metil-ATP não foram diferentes entre os grupos experimentais, é provável

que as alterações observadas após o duplo antagonismo estejam relacionadas ao L-glutamato

e aos seus receptores. De fato, os resultados mostrando um aumento da expressão de

receptores ionotrópicos do L-glutamato nesta região após a HCI corroboram os achados

obtidos pelo uso dos antagonistas, cujos efeitos foram menos expressivos nos ratos HCI do

Page 143: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 142

que nos ratos controle. Contudo, observamos que as microinjeções unilaterais de L-glutamato

no NTS caudal de ratos HCI promoveram respostas de apnéia com menor duração, as quais

foram acompanhadas de respostas de excitação do componente pós-inspiratório vagal de

menor magnitude. Se considerarmos que os neurônios respiratórios presentes no NTS caudal

apresentam uma maior expressão de receptores ionotrópicos glutamatérgicos após a HCI, as

respostas respiratórias promovidas pela excitação dos neurônios inibitórios desta região pelo

L-glutamato somente poderão ser de menor magnitude se a excitabilidade dos neurônios aug-

E do BötC, os quais inibem os neurônios post-I, estiver aumentada, condição que, de fato,

parece ocorrer nos animais HCI. Esta hipótese está ilustrada na figura 53. Portanto, ainda que

estudos adicionais sejam necessários para a confirmação dessas hipóteses, sugerimos que as

alterações na neurotransmissão glutamatérgica nos neurônios respiratórios presentes no NTS

caudal contribui para as alterações no padrão respiratório dos animais HCI.

Acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos jovens submetidos à HCI

por 10 dias

Apesar do padrão de acoplamento entre as atividades simpática e respiratória variar de

acordo com a espécie, nervo registrado e tipo de preparação utilizada (Gilbey et al., 1986;

Häbler et al., 1994; Jänig & Häbler, 2003; Dick et al., 2004), o acoplamento entre os

neurônios simpáticos e respiratórios parece ocorrer ao nível da superfície ventral do bulbo

(Barman & Gebber, 1980; McAllen, 1987; Sun et al., 1994; Häbler et al., 1996; Zhong et al.,

1997). Há evidências de que os neurônios geradores da atividade respiratória parecem

modular diretamente a atividade dos neurônios pré-motores simpáticos da RVLM, gerando,

sobre estes, padrões de atividade acoplados ao ciclo respiratório (Haselton & Guyenet, 1989;

Miyazaki et al., 1998). Por outro lado, estudos de Mandel & Schreihofer (2006)

Page 144: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 143

demonstraram que a atividade dos neurônios GABAérgicos da CVLM, os quais inibem

tonicamente os neurônios pré-motores simpáticos da RVLM, também é modulada pelos

neurônios respiratórios, sugerindo a existência de uma via indireta da modulação respiratória

sobre os neurônios simpáticos.

Em nossos experimentos realizados na preparação in situ, a atividade do nervo

simpático torácico de ratos controle exibiu um aumento fásico durante a fase inspiratória, com

um pico na porção final da inspiração, seguido de uma redução durante a fase pós-inspiratória

e uma atividade tônica durante o restante da fase expiratória. Portanto, considerando os dados

que demonstram que: i) os neurônios simpáticos da RVLM exibem um pico de atividade

coincidente com o disparo de nervo frênico (Haselton & Guyenet, 1989); ii) diferentes

populações de neurônios GABAérgicos da CVLM apresentam uma depressão em sua

atividade durante a inspiração ou um aumento durante a pós-inspiração (Mandel &

Schreihofer, 2006); e iii) os grupamento de neurônios inspiratórios e pós-inspiratórios

apresentam populações de neurônios excitatórios e inibitórios (Bianchi et al., 1995; Smith et

al., 2007); o acoplamento simpático-respiratório observado em preparações de ratos controle

possivelmente ocorre por uma modulação dos neurônios simpáticos da RVLM pelos

neurônios inspiratórios e pós-inspiratórios, a qual pode se dar tanto direta como

indiretamente, via neurônios GABAérgicos da CVLM, como mostra o painel A da figura 52.

Em relação às preparações dos ratos submetidos à HCI, a atividade do nervo simpático

torácico também apresentou um pico de atividade durante a fase final da inspiração, seguido

de uma inibição durante o período pós-inspiratório. Contudo, a atividade simpática dos ratos

HCI apresentou um padrão em rampa durante a fase expiratória, sendo os valores

significativamente maiores durante a fase final da expiração quando comparada à atividade

dos ratos controle. Estudos de Dick et al. (2004) documentaram que a exposição aguda à

hipóxia (8% de O2, durante 30 – 45 segundos) promoveu um aumento da atividade simpática

Page 145: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 144

esplâncnica de animais anestesiados, principalmente durante a segunda metade do período

expiratório. Em outro estudo, Dick et al. (2007) demonstraram que ratos anestesiados

submetidos à hipóxia intermitente aguda (10 episódios de 8% de O2 por 45 segundos)

apresentaram um aumento da atividade simpática durante a primeira metade do período

expiratório, o qual persistiu por 60 minutos após o último episódio de hipóxia. Estes estudos

indicam que a hipóxia intermitente aguda promoveu um aumento do acoplamento simpático-

respiratório, com um aumento da atividade simpática preferencialmente durante o período

expiratório, os quais são consistentes com os nossos resultados obtidos em ratos submetidos à

HCI por 10 dias. Entretanto, os dados apresentados foram obtidos durante (Dick et al., 2004)

ou imediatamente após (Dick et al., 2007) o estímulo de hipóxia, enquanto que os nossos

resultados foram obtidos entre 16 e 24 horas após horas o último episódio de hipóxia,

indicando que 10 dias de HCI em ratos jovens promove alterações persistentes no padrão de

acoplamento entre as atividades simpática e expiratória.

A atividade simpática de ratos HCI, portanto, se mostrou significativamente maior na

mesma fase respiratória na qual foi observado o aumento da atividade motora abdominal. A

análise da correlação entre as atividades dos nervos simpático torácico e abdominal mostrou

que este aumento da atividade simpática observado durante a fase final da expiração se

correlacionou com o aumento da atividade expiratória, fato que não foi observado nos ratos

controle. De acordo com Cohen (1988), esta correlação (r = 0,36±0,11) é de media potência e,

portanto, significativa do ponto de vista estatístico. Contudo, esta análise não nos permite

determinar se o aumento da atividade expiratória está diretamente promovendo o aumento da

atividade simpática, ou vice-versa. Alternativamente, poderia se pensar em outra região do

sistema nervoso central, a qual estaria excitando tanto a atividade simpática como a atividade

expiratória. Entretanto, baseado em evidências existentes na literatura, sugerimos que o

aumento da atividade expiratória, provavelmente gerada pelos neurônios aug-E do BötC,

Page 146: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 145

estaria promovendo o aumento da atividade dos neurônios pré-motores simpáticos da RVLM.

Estudos de Sun et al. (1997) demonstraram a justaposição de projeções axonais de neurônios

do BötC com os neurônios pré-motores simpáticos da RVLM, sugerindo que os neurônios do

BötC podem fazer contato sináptico com os neurônios da RVLM. Além disso, considerando

estudos de Tian et al. (1999) mostrando os neurônios aug-E enviam projeções para a medula

espinhal, é possível considerar a hipótese de que o aumento da atividade simpática possa

ocorrer por conexões diretas dos neurônios aug-E com os neurônios pré-ganglionares

simpáticos da coluna intermédio-lateral. Desta forma, sugerimos que o aumento da atividade

dos neurônios aug-E esteja promovendo o aumento da atividade simpática observado nos

ratos submetidos à HCI, via projeções diretas para os neurônios pré-motores simpáticos da

RVLM ou para os neurônios pré-ganglionares da medula espinhal, conforme ilustra a figura

53. Há também a possibilidade de que estas alterações ocorram via neurônios da CVLM, os

quais inibem os neurônios da RVLM, uma vez que estes também exibem um padrão de

atividade acoplado ao ciclo respiratório (Mandel & Schreihofer, 2006).

Os resultados do presente estudo nos permitem sugerir que as alterações no

acoplamento simpático-respiratório observados após a HCI contribuam para o aumento da

atividade simpática e, conseqüentemente, para o aumento da pressão arterial. De modo

semelhante aos nossos resultados, Simms et al. (2009) demonstraram que preparações in situ

de ratos jovens espontaneamente hipertensos (SHR), previamente ao desenvolvimento da

hipertensão, apresentaram um aumento do acoplamento entre as atividades simpática e

inspiratória, sugerindo que as alterações no acoplamento simpático-respiratório parecem

contribuir para o desenvolvimento da hipertensão observada nesses animais. Essas

observações estão de acordo com os nossos achados em ratos submetidos à HCI, mostrando

um importante papel para o acoplamento central entre as atividades simpática e respiratória

nos mecanismos envolvidos na gênese da hipertensão.

Page 147: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 146

Envolvimento dos mecanismos purinérgicos da superfície rostral ventrolateral do bulbo nas

alterações do acoplamento entre as atividades simpática e respiratória de ratos submetidos

à HCI

Há evidências de que o ATP é um dos principais neurotransmissores liberados na

superfície ventral em condições de hipóxia (Gourine et al., 2005a; Gourine et al., 2005b), o

qual, atuando sobre os seus receptores ionotrópicos (P2X) e metabotrópicos (P2Y), parece

contribuir para o processamento das respostas autonômicas e respiratória (Rong et al., 2003;

Lorier et al., 2007). Nesse sentido, procuramos explorar possíveis alterações nos mecanismos

purinérgicos na superfície rostral ventrolateral do bulbo de ratos submetidos à HCI que

pudessem explicar, pelo menos em parte, as alterações observadas no acoplamento simpático-

respiratório. Para tanto, realizamos microinjeções de ATP na superfície rostral ventrolateral

do bulbo com o objetivo de verificar a sensibilidade dos neurônios da RVLM e do BötC a este

agonista. Apesar da limitação metodológica de que as microinjeções no RVLM/BötC também

tenham atingido áreas adjacentes a estes grupamentos neuronais, como o pré-BötC, é

importante ressaltar que estas foram realizadas próximas ao pólo caudal do núcleo facial,

local onde se encontram, predominantemente, os neurônios do RVLM e do BötC, conforme

mostra a figura 1.

Inicialmente realizamos algumas microinjeções do agonista estável do ATP, o α, β,

metil-ATP, no RVL de ratos controle e HCI. Contudo, observamos o fenômeno de

taquifilaxia ao realizar sucessivas microinjeções de α, β, metil-ATP no RVL dos animais

controle e HCI (resultados não mostrados no presente estudo). Dessa forma, optamos por

realizar microinjeções de ATP, ao qual não se verificou a taquifilaxia. Em preparações de

ratos controle, microinjeções de ATP no RVL promoveram respostas de aumento da atividade

simpática acompanhadas de aumentos na atividade motora abdominal e reduções na

freqüência de despolarização do nervo frênico, as quais seguiram padrões concentração-

Page 148: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 147

dependentes. Além disso, também observamos respostas de bradicardia, as quais,

provavelmente, foram decorrentes da ativação dos neurônios do núcleo ambigus (NA) como

conseqüência do espraiamento do volume microinjetado. Esses resultados são semelhantes ao

observado por Thomas et al. (2001), os quais mostraram, em animais anestesiados, respostas

de apnéia e aumento da pressão arterial após a microinjeção de ATP no RVL. É provável que

estas respostas promovidas pelas microinjeções de ATP no RVL sejam decorrentes da

ativação de receptores P2X e/ou P2Y presentes nos neurônios pré-motores simpáticos do

RVLM, neurônios expiratórios do BötC e neurônios pré-ganglionares parassimpáticos do NA

(Thomas et al., 2001; Lorier et al., 2007; Dergacheva et al., 2008). Sugerimos que estas

respostas não são decorrentes da adenosina resultante da degradação do ATP microinjetado

no RVL, uma vez que as respostas autonômicas e respiratórias observadas foram semelhantes

àquelas promovidas pelas microinjeções de α, β, metil-ATP no RVL, mesmo que este tenha

apresentado taquifilaxia nesta região.

Em preparações de animais HCI, observamos que as respostas simpato-excitatórias

promovidas pelas microinjeções de ATP no RVL foram significativamente maiores do que

nos animais controle. Por outro lado, a magnitude das respostas de bradicardia, aumento da

atividade motora abdominal e redução da freqüência de despolarização do nervo frênico

foram semelhantes entre os grupos experimentais. Considerando a resposta de apnéia,

observamos que a reversão desta resposta foi significativamente mais rápida nos animais HCI

do que nos animais controle. Associado às alterações funcionais, observamos por meio de

procedimentos de immunoblotting que a densidade dos receptores P2X3 e P2X4 se mostrou

significativamente maior no RVL de ratos HCI. Esse conjunto de resultados sugere que ratos

HCI apresentam uma maior expressão de receptores P2X3 e/ou P2X4 nos neurônios pré-

motores simpáticos do RVLM. Além disso, aparentemente os neurônios expiratórios do BötC

não apresentam alterações na sensibilidade ao ATP, uma vez que as respostas de aumento na

Page 149: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 148

atividade motora abdominal forma semelhantes entre os grupos experimentais.

Alternativamente, é possível que uma maior excitabilidade do BötC ao ATP não tenha sido

verificada por meio da técnica de microinjeção, uma vez que a resposta expiratória real possa

ter sido mascarada em conseqüência do espraiamento do ATP e ativação de receptores

purinérgicos em outras regiões que promovam respostas “opostas” à ativação dos neurônios

do BötC, como é o caso do pré-BötC ou do nRT. De fato, essa hipótese é fundamentada na

observação de que a duração da resposta de apnéia promovida pelo ATP no RVL foi menor

nos animais HCI, a qual pode ser decorrente de uma maior ativação dos neurônios

inspiratórios do pré-BötC nesses animais, decorrente de uma maior expressão de receptores

purinérgicos, conforme observado. Essas observações estão de acordo com estudos

eletrofisiológicos mostrando que o ATP promove um aumento da freqüência de

despolarização dos neurônios do pré-BötC (Lorier et al., 2007).

Dessa forma, pelos protocolos experimentais conduzidos no presente estudo, não foi

possível elucidar a participação dos mecanismos purinérgicos do RVL nas alterações no

acoplamento simpático-respiratório de ratos submetidos à HCI. Entretanto, nossos resultados

relacionados às alterações nos mecanismos purinérgicos no RVL após a HCI são condizentes

com estudos sugerindo um importante papel para o ATP no controle respiratório e no

processamento das respostas autonômicas e respiratória à hipóxia no RVL (Thomas et al.,

2001; Gourine et al., 2005a; Gourine et al., 2005b). Além disso, os resultados relacionados ao

L-glutamato no RVL, nos quais tanto as respostas simpática e apneica às microinjeções de L-

glutamato como a densidade de subunidades dos receptores ionotrópicos glutamatérgicos não

foram diferentes entre os ratos HCI e controle, dão mais força à hipótese do possível

envolvimento do ATP nas alterações autonômicas e respiratórias observadas nos ratos HCI.

No entanto, novos experimentos futuros, como, por exemplo, microinjeções de antagonistas

Page 150: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 149

de receptores purinérgicos no RVL, serão necessários para elucidar o papel desses

mecanismos nas alterações promovidas pela HCI.

Facilitação das respostas simpato-excitatória e respiratória de ratos jovens submetidos à

HCI

Além das alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratórias

basais, no presente estudo observamos que a ativação dos quimiorreceptores periféricos com

KCN em ratos HCI promoveu uma maior resposta de excitação simpática e uma resposta de

taquipnéia mais prolongada, quando comparadas com as respostas obtidas em ratos controle.

Esses resultados foram semelhantes àqueles demonstrados previamente em nosso laboratório

(Braga et al., 2006) e indicam que o processamento das respostas simpato-excitatória e

taquipneica do quimiorreflexo estão facilitadas após a HCI. Por outro lado, no presente estudo

também verificamos que a magnitude das respostas de bradicardia e de aumento nas

atividades vagal e abdominal foram semelhantes entre os grupos experimentais, indicando que

HCI não interfere de forma significativa com os mecanismos relacionados ao processamento

dessas respostas.

Estudos mostram que a exposição à HCI promove alterações na atividade dos

neurônios do NTS caudal (Sica et al., 2000; Reeves et al., 2003; de Paula et al., 2007; Kline

et al., 2007), região onde as aferências dos quimiorreceptores periféricos fazem suas primeiras

sinapses no sistema nervoso central (Donoghue et al., 1984; Mifflin, 1992). Fundamentados

em estudos do nosso laboratório demonstrando o envolvimento do L-glutamato e o ATP no

processamento do componente simpato-excitatório do quimiorreflexo no NTS caudal (Braga

et al., 2007), procuramos explorar o envolvimento de possíveis alterações na

neurotransmissão glutamatérgica e purinérgica nesta região sobre as alterações das respostas à

Page 151: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 150

ativação do quimiorreflexo observadas após a HCI. Verificamos que o duplo antagonismo dos

receptores ionotrópicos glutamatérgicos purinérgicos no NTS caudal reduziu

significativamente a magnitude da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo em ambos

os grupos experimentais. Entretanto, esses antagonismos foram menos efetivos nos animais

do grupo HCI, uma vez que a magnitude da resposta simpática permaneceu significativamente

maior nos ratos HCI. Além disso, verificamos que a respostas simpato-excitatória promovida

pela microinjeção unilateral de L-glutamato no NTS caudal de ratos HCI foi

significativamente maior do que aquela observada nos ratos controle. Esses resultados são

coerentes com nossos resultados mostrando uma maior expressão de receptores ionotrópicos

no NTS caudal desses animais, indicando que a HCI interfere com a neurotransmissão

glutamatérgica nesta região. Por outro lado, verificamos que a resposta simpática promovida

pela microinjeção de α, β, metil-ATP no NTS caudal foi semelhante entre os grupos HCI e

controle, indicando que a HCI não interfere de forma significativa com a neurotransmissão

purinérgica no NTS caudal. Esse conjunto de resultados nos permite sugerir que alterações

nos mecanismos glutamatérgicos no NTS caudal estão envolvidos na facilitação da resposta

simpato-excitatória do quimiorreflexo observado em ratos HCI, provavelmente decorrente de

um aumento da expressão de receptores ionotrópicos glutamatérgicos em neurônios do NTS

caudal que enviam projeções para os neurônios pré-motores simpáticos da RVLM (Aicher et

al., 1996; Koshiya & Guyenet, 1996a; Accorsi-Mendonca et al., 2009).

Há evidências de que a exposição à HCI promove um aumento da sensibilidade dos

quimiorreceptores periféricos localizados nos corpúsculos carotídeos (Peng et al., 2003;

Iturriaga et al., 2009; Peng et al., 2009), sugerindo que a liberação de neurotransmissores no

NTS caudal decorrente da ativação dos quimiorreceptores seja maior nos ratos HCI do que

nos ratos controle. Dessa forma, considerado que o principal neurotransmissor liberado pelas

aferências do quimiorreflexo é o L-glutamato (Andresen & Kunze, 1994), uma maior

Page 152: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 151

liberação deste neurotransmissor no NTS caudal em resposta à hipóxia, combinado a uma

maior expressão de receptores ionotrópicos glutamatérgicos em neurônios do NTS caudal,

contribuiria de forma significativa para o aumento da magnitude da resposta simpato-

excitatória do quimiorreflexo. Contudo, é provável que os mecanismos envolvidos na maior

resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo não estejam restritos ao NTS caudal e possam

envolver alterações na neurotransmissão ou na excitabilidade de neurônios em outras regiões

do tronco cerebral. Considerando os estudos mostrando um importante papel para o ATP na

superfície ventral do bulbo em situações de hipóxia (Gourine et al., 2005a; Gourine et al.,

2005b), nossos resultados relacionados ao aumento da expressão de receptores purinérgicos

no RVL de ratos HCI, provavelmente em neurônios pré-motores simpáticos da RVLM,

sugerem o envolvimento dos mecanismos purinérgicos dessa região no processamento da

maior resposta simpato-excitatória à ativação do quimiorreflexo. Contudo, experimentos

adicionais serão necessários para verificar esta hipótese.

De forma diferente da resposta simpato-excitatória, as respostas de taquipnéia

promovidas pela estimulação dos quimiorreceptores periféricos, tanto dos animais HCI como

dos animais controle, não foram afetadas pelo antagonismo dos receptores glutamatérgicos e

purinérgicos no NTS caudal. Esses resultados estão de acordo com o estudo de Braga et al.

(2007), o qual demonstrou que o duplo antagonismo dos receptores do L-glutamato e do ATP

no NTS caudal não altera a magnitude da resposta de taquipnéia do quimiorreflexo. Portanto,

mecanismos relacionados a outros sistemas de neurotransmissão ou outras sub-regiões do

bulbo parecem contribuir para a resposta de taquipnéia do quimiorreflexo mais prolongada

dos ratos HCI. Nesse sentido, é provável que as alterações nos mecanismos purinérgicos no

RVL dos animais HCI também contribuam para a resposta de taquipnéia prolongada

observada nesses animais. Nossos resultados mostrando que o retorno da apnéia ao padrão

respiratório normal após as microinjeções de ATP no RVL de ratos HCI foi mais rápido do

Page 153: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 152

que nos ratos controle, sugerem que a excitabilidade dos neurônios inspiratórios do pré-BötC

pode estar aumentada, conforme discutido anteriormente. Esse efeito pode ser decorrente de

uma maior expressão de receptores purinérgicos nesses neurônios, os quais parecem mediar o

aumento da freqüência de despolarização dos neurônios do pré-BötC em resposta ao ATP

(Lorier et al., 2007). Entretanto, estudos envolvendo o uso de antagonistas serão necessários

para verificar o envolvimento do ATP no pré-BötC na facilitação da resposta de taquipnéia

dos animais HCI.

Considerando o aumento da resposta motora abdominal, verificamos que, apesar da

magnitude das respostas ser semelhantes entre os grupos experimentais, o padrão desta

resposta foi diferente nos animais HCI, nos quais o aumento da atividade motora abdominal

ocorreu preferencialmente na fase final da expiração, o que é coerente com a hipótese de que

a atividade dos neurônios aug-E do BötC parece estar aumentada após a HCI. Contudo,

nenhuma correlação foi observada entre a resposta motora abdominal durante a fase final da

expiração e a maior resposta simpato-excitatória à ativação do quimiorreflexo. Dessa forma,

as alterações no acoplamento entre os neurônios simpáticos e expiratórios, as quais parecem

contribuir para o aumento da atividade simpática basal em ratos HCI, não parecem contribuir

para a maior resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo observada nesses animais. Por

outro lado, observamos que esta resposta simpática ocorre durante o pico da resposta de

taquipnéia, a qual também se encontra facilitada. Estas observações sugerem que durante a

ativação dos quimiorreceptores periféricos, a maior resposta simpato-excitatória dos ratos

HCI parece estar associada à facilitação da resposta de taquipnéia.

Page 154: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 153

Reversibilidade da hipertensão de ratos submetidos à HCI

Observamos que 15 dias após o final do protocolo de HCI, a pressão arterial média dos

ratos HCI, a qual se encontrava elevada um dia após o último episódio de HCI, retornou à

valores semelhantes àqueles observados em ratos controle, mostrando não somente a

reversibilidade das alterações nos mecanismos neurais envolvidos na hiperatividade simpática

induzida pela HCI, mas também que essas alterações parecem ser dependentes da hipóxia

intermitente. Apesar de haver diferenças entre o modelo experimental da HCI e a apnéia

obstrutiva do sono (AOS) em humanos, esses resultados estão de acordo com os estudos

mostrando que a hipertensão arterial de pacientes com AOS é revertida após o tratamento com

“pressão positiva contínua nas vias aéreas” (CPAP), a qual restabelece a oxigenação normal

do sangue desses pacientes (Caples et al., 2005). Neste cenário, um importante mecanismo a

ser considerado é o aumento da formação de espécies reativas do oxigênio (ROS) (Peng &

Prabhakar, 2003; Semenza & Prabhakar, 2007; Peng et al., 2009), cuja formação é

dependente dos episódios de hipóxia intermitente (Peng & Prabhakar, 2004). Estudos

demonstram que as ROS podem afetar diretamente a atividade dos neurônios simpático (Kishi

et al., 2004; Chan et al., 2009) e respiratórios (MacFarlane et al., 2008). Alternativamente, o

aumento da formação de ROS pela HCI poderia promover a ativação de importantes

mediadores intracelulares, por meio da mobilização de cálcio intracelular (Gibson et al., 2002;

Kim et al., 2004), como, por exemplo, a ativação do fator de transcrição induzido pela hipóxia

– 1 (HIF-1), o qual está envolvido na regulação da transcrição de várias proteínas relacionadas

às respostas adaptativas à hipóxia (Semenza & Prabhakar, 2007). Contudo, estudos adicionais

serão necessários para verificar se há ou não o envolvimento do aumento da formação de ROS

nas alterações na atividade dos neurônios simpáticos e respiratórios do bulbo de ratos HCI.

Page 155: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 154

Implicações funcionais para as alterações nas atividades dos neurônios respiratórios

bulbares e seu acoplamento com os neurônios simpáticos de ratos submetidos à HCI

Em mamíferos, o ciclo respiratório pode ser divido em 3 fases: i) inspiração; ii) pós-

inspiração (ou fase expiratória I); e iii) expiração (ou fase expiratória II) (Bianchi et al., 1995;

Richter & Spyer, 2001). In vivo, a inspiração é caracteriza por ser um processo ativo,

enquanto que a expiração (estágios I e II) ocorre passivamente. Condizente com estas

observações in vivo, verificamos que a atividade do nervo motor abdominal em preparações in

situ de ratos controle, a qual controla a contração da musculatura torácica e abdominal,

apresentou uma atividade de baixa amplitude na fase pós-inspiratória. Além disso, nas

preparações in situ de ratos controle, verificamos que o registro da atividade eferente vagal

apresentou 2 componentes distintos: i) inspiratório; e ii) pós-inspiratório. De acordo com

estudos de Dutschmann & Paton (2002), os nervos motores craniais, como é o caso do nervo

vago, contém neurônios motores inspiratórios e pós-inspiratórios, os quais controlam o tônus

musculatura das vias aéreas superiores e, conseqüentemente, a resistência do fluxo de ar a

cada ciclo respiratório. Particularmente, esses diferentes neurônios motores inspiratórios e

pós-inspiratórios são importantes, respectivamente, para controle da musculatura abdutora e

adutora da glote a cada ciclo respiratório. Dessa forma, durante a inspiração, a musculatura

abdutora da glote é contraída, promovendo a dilatação da glote e a diminuição da resistência

das vias aéreas superiores à passagem de ar para os pulmões. Por outro lado, durante a

expiração, a musculatura adutora se contrai, promovendo o fechamento da glote e o aumento

da resistência para a saída de ar dos pulmões (Paton & Dutschmann, 2002). Essa contração

pós-inspiratória da glote, e o conseqüente aumento da resistência das vias aéreas superiores,

tem como objetivo reduzir o efluxo de ar dos pulmões durante a expiração para aumentar o

tempo para as trocas gasosas e para manter o volume residual pulmonar, evitando o colapso

dos pulmões (Harding, 1984; Bartlett, 1986).

Page 156: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 155

Em preparações de ratos HCI, verificamos que atividade motora abdominal

apresentou-se aumentada durante a fase final da expiração, caracterizando um processo de

expiração forçada, assim como observado em condições de asfixia (Abdala et al., 2009) ou de

exercício físico moderado/intenso (Abraham et al., 2002). Esse aumento da atividade

abdominal de ratos HCI estava associado a uma redução da atividade pós-inspiratória vagal,

caracterizando uma redução da resistência das vias aéreas superiores. Portanto, acreditamos

que essas alterações no padrão respiratório basal, decorrentes das alterações nas atividades

dos neurônios respiratórios bulbares, sejam mecanismos pelos quais os ratos submetidos à

HCI possam expelir o ar dos pulmões mais facilmente durante a fase final da expiração, sendo

esta uma forma de aumentar a troca de ar pulmonar e garantir o aporte de O2.

Conseqüentemente, os mecanismos responsáveis pela geração deste padrão respiratório

alterado nos animais HCI parece influenciar de forma significativa o sistema nervoso

simpático, fato evidenciado tanto in situ, pela correlação entre o aumento da atividade

simpática durante a fase final da expiração e o aumento da atividade motora abdominal, como

in vivo, pelo aumento da modulação respiratória sobre a pressão arterial de ratos HCI

hipertensos.

Esse aumento da atividade simpática acoplado com a expiração pode representar uma

tentativa do organismo em melhorar a eficiência de captação de O2 no sangue arterial, por

aumentar o fluxo sangüíneo para os pulmões durante essa fase respiratória. Após a retirada

dos estímulos de hipóxia intermitente, a hipertensão dos animais HCI não é mais observada,

sugerindo que, uma vez retirado o estímulo hipóxico, as “adaptações” cardio-respiratórias não

são mais necessárias. Entretanto, esses mecanismos ativados pela hipóxia intermitente

apresentam implicações patológicas, uma vez que há o desenvolvimento da hipertensão

arterial. Ainda que a magnitude da elevação da pressão arterial dos ratos HCI seja moderada,

essa foi acompanhada por um grande aumento de sua variabilidade, a qual, segundo alguns

Page 157: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 156

autores, é um importante fator que contribui para o desenvolvimento de lesões em órgãos-alvo

decorrentes do aumento da atividade simpática vascular (Miao et al., 2006; Tatasciore et al.,

2007). De fato, o grande aumento da variabilidade da pressão arterial observado nos ratos

submetidos à HCI pode estar correlacionado ao aumento das oscilações da atividade simpática

relacionadas à respiração, indicando, portanto, um importante papel para os mecanismos

relacionados ao acoplamento simpático-respiratório na gênese da hipertensão arterial

observada neste modelo experimental.

Page 158: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 157

Figura 52. Representação esquemática mostrando o acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos controle. Neurônios expiratórios [pós-inspiratórios (post-inspiratory neurons), post-I, e neurônios expiratórios crescentes (augmenting expiratory neurons), aug-E], localizados no complexo Bötzinger [BötC (Sun et al., 1998; Smith et al., 2007)], e neurônios inspiratórios (insp) localizados no complexo pré-Bötzinger (pré-BötC) e o grupo respiratório ventral rostral (rVRG) estão reciprocamente conectados por vias inibitórias, coordenando o ritmo respiratório (Tian et al., 1999; Richter & Spyer, 2001; Shen et al., 2003; Smith et al., 2007). Os neurônios inspiratórios do rVRG enviam projeções excitatórias para o núcleo motor do frênico localizado no nível cervical (C) da medula espinhal (ME) (Smith et al., 2007; Abdala et al., 2009). Além disso, do rVRG e do BötC partem neurônios motores os quais irão compor o nervo vago (Smith et al., 2007). Os neurônios motores abdominais (Abd) localizados ao nível tóraco-lombar (T/L) da ME recebem projeções excitatórias dos neurônios aug-E do BötC e do grupo respiratório ventral caudal (cVRG) (Tian et al., 1999). O acoplamento simpático-respiratório observado na atividade do nervo simpático torácico de preparações de ratos controle é possivelmente gerado por projeções de neurônios insp e post-I ou diretamente para os neurônios pré-motores simpáticos (SIMP), localizados na porção rostral da superfície ventral do bulbo (rostral ventrolateral medulla, RVLM) (Haselton & Guyenet, 1989), ou via neurônios inibitórios GABAérgicos (GABA) localizados na porção caudal da superfície ventral do bulbo (caudal ventrolateral medulla, CVLM) (Mandel & Schreihofer, 2006). No NTS caudal estão presentes os neurônios inibitórios do grupo respiratório dorsal (DRG) e os neurônios envolvidos com o processamento das respostas do quimiorreflexo (QR). Além disso, estão também representados os neurônios dos núcleos parabraquial (NPB) e Kolliker-Füse (KF) e do núcleo retrotrapezóide (nRT), os quais geram estímulos excitatórios para os neurônios do grupo respiratório ventral (Smith et al., 2007; Abdala et al., 2009).

Page 159: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Discussão 158

Figura 53. Representação esquemática mostrando as alterações no acoplamento entre as atividades simpática e respiratória em ratos submetidos à HCI. Favor consultar legenda da figura 52 para as abreviaturas. Em ratos HCI, a excitabilidade dos neurônios aug-E do BötC parece estar aumentada, promovendo a excitação dos neurônios pré-motores do cVRG e dos neurônios motores abdominais, acarretando em um aumento da atividade Abd (expresso em vermelho). O aumento da atividade dos neurônios aug-E após a HCI também promove uma depressão da atividade dos neurônios post-I e, conseqüentemente, uma diminuição da atividade pós-inspiratória do nervo vago (expresso em azul). Nenhuma alteração significativa foi observada na atividade inspiratória basal de ratos HCI devido às recíprocas e equivalentes alterações nas atividades inibitórias dos neurônios aug-E e post-I sobre a atividade dos neurônios insp. Além disso, nós sugerimos que o aumento da excitabilidade dos neurônios aug-E está, provavelmente, promovendo a excitação dos neurônios SIMP e dos neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermédio-lateral (IML) (Sun et al., 1997; Tian et al., 1999), causando o aumento da atividade simpática durante a fase final da expiração. Ademais, também propomos que a exposição à HCI promove, no NTS caudal, um aumento da expressão de receptores ionotrópicos glutamatérgicos nos neurônios DRG e nos neurônios do QR envolvidos com a resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo. Na superfície ventral, sugerimos que a HCI induza ao aumento da expressão de receptores purinérgicos em neurônios SIMP do RVLM e em neurônios insp do pré-BötC. Possíveis alterações nos neurônios do nRT e nos neurônios do QR do NTS caudal envolvidos com a resposta de taquipnéia do quimiorreflexo ainda estão para ser elucidadas.

Page 160: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

6. CONCLUSÕES

Page 161: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Conclusões 160

No presente estudo, verificamos que ratos jovens submetidos à HCI por 10 dias

desenvolveram hipertensão arterial dependente de um aumento da atividade simpática basal, o

qual não foi dependente de alterações na função barorreflexa. Entretanto, observamos que os

níveis elevados da pressão arterial de ratos HCI apresentaram uma maior modulação

respiratória, sugerindo uma maior influência do sistema respiratório sobre o sistema

cardiovascular após a HCI. Em preparações in situ, verificamos que os ratos HCI

apresentaram um aumento da atividade simpática basal durante a fase final da expiração, o

qual estava correlacionado a um padrão respiratório alterado, com um aumento da atividade

motora abdominal na fase final da expiração – caracterizando um processo de expiração

ativa/forçada. Esses resultados indicam que ratos submetidos à HCI apresentaram um padrão

alterado de acoplamento entre as atividades simpática e expiratória, provavelmente devido a

um remodelamento ou aumento da efetividade sináptica (synaptic strength) entre os neurônios

aug-E do BötC e dos neurônios pré-motores simpáticos do RVLM. Verificamos também que

ratos HCI apresentam uma facilitação das respostas simpato-excitatória e taquipnéia

promovidas pela estimulação dos quimiorreceptores periféricos. Essas alterações autonômicas

e respiratórias induzidas pela HCI parecem estar associadas às alterações na neurotransmissão

glutamatérgica no NTS caudal e na neurotransmissão purinérgica no RVL. De um modo

geral, esse conjunto de resultados mostra que as alterações autonômicas observadas nos ratos

HCI estão estreitamente correlacionadas com as alterações respiratórias, indicando que a

interação entre esses dois sistemas é importante não somente em condições fisiológicas, mas

também em condições fisiopatológicas, nas quais alterações no acoplamento simpático-

respiratório podem contribuir o desenvolvimento de disfunções cardiovasculares, como o

aumento da atividade simpática e, conseqüentemente, no desenvolvimento da hipertensão

arterial.

Page 162: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Page 163: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 162

Abdala AP, Rybak IA, Smith JC & Paton JF. (2009). Abdominal expiratory activity in the rat brainstem-spinal cord in situ: patterns, origins and implications for respiratory rhythm generation. J Physiol 587, 3539-3559.

Abraham KA, Feingold H, Fuller DD, Jenkins M, Mateika JH & Fregosi RF. (2002). Respiratory-related activation of human abdominal muscles during exercise. J Physiol 541, 653-663.

Accorsi-Mendonca D, Bonagamba LG, Leao RM & Machado BH. (2009). Are L-glutamate and ATP cotransmitters of the peripheral chemoreflex in the rat nucleus tractus solitarius? Exp Physiol 94, 38-45.

Adrian ED & Bronk DW. (1932). Discharges in mammalian sympathetic nerves. J Physiol 74, 115-133.

Aicher SA, Saravay RH, Cravo S, Jeske I, Morrison SF, Reis DJ & Milner TA. (1996). Monosynaptic projections from the nucleus tractus solitarii to C1 adrenergic neurons in the rostral ventrolateral medulla: comparison with input from the caudal ventrolateral medulla. J Comp Neurol 373, 62-75.

Akselrod S, Gordon D, Madwed JB, Snidman NC, Shannon DC & Cohen RJ. (1985). Hemodynamic regulation: investigation by spectral analysis. Am J Physiol 249, H867-875.

Almado CE & Machado BH. (2005). Respiratory and autonomic responses to microinjection of NMDA and AMPA into the commissural subnucleus of the NTS of awake rats. Brain Res 1063, 59-68.

Andresen MC & Kunze DL. (1994). Nucleus tractus solitarius--gateway to neural circulatory control. Annu Rev Physiol 56, 93-116.

Anrep GV, Pascual W & Rössler R. (1936). Respiratory variations of the heart rate I. The reflex mechanism of the respiration arrhythmia. Proc R Soc Lond B Biol Sci 119, 191-217.

Baker TL & Mitchell GS. (2000). Episodic but not continuous hypoxia elicits long-term facilitation of phrenic motor output in rats. J Physiol 529 Pt 1, 215-219.

Bantikyan A, Song G, Feinberg-Zadek P & Poon CS. (2009). Intrinsic and synaptic long-term depression of NTS relay of nociceptin- and capsaicin-sensitive cardiopulmonary afferents hyperactivity. Pflugers Arch 457, 1147-1159.

Page 164: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 163

Barman SM & Gebber GL. (1980). Sympathetic nerve rhythm of brain stem origin. Am J Physiol 239, R42-47.

Barros RCH, Bonagamba LGH, Okamoto-Canesin R, de Oliveira M, Branco LGS & Machado BH. (2002). Cardiovascular responses to chemoreflex activation with potassium cyanide or hypoxic hypoxia in awake rats. Autonomic Neuroscience 97, 110-115.

Bartlett DJ. (1986). Upper airway motor systems. In Handbook of Physiology: The Respiratory System, ed. Cherniack NS & Widdicombe JG, pp. 223-245. American Physiological Society, Bethesda.

Bartlett Jr D & Tenney SM. (1970). Control of breathing in experimental anemia. Respiration Physiology 10, 384-395.

Berger AJ. (1977). Dorsal respiratory group neurons in the medulla of cat: spinal projections, responses to lung inflation and superior laryngeal nerve stimulation. Brain Res 135, 231-254.

Bernardi L, Porta C, Gabutti A, Spicuzza L & Sleight P. (2001). Modulatory effects of respiration. Auton Neurosci 90, 47-56.

Bianchi AL, Denavit-Saubie M & Champagnat J. (1995). Central control of breathing in mammals: neuronal circuitry, membrane properties, and neurotransmitters. Physiol Rev 75, 1-45.

Boczek-Funcke A, Dembowsky K, Habler HJ, Janig W & Michaelis M. (1992). Respiratory-related activity patterns in preganglionic neurones projecting into the cat cervical sympathetic trunk. J Physiol 457, 277-296.

Braccialli AL, Bonagamba LG & Machado BH. (2008). Glutamatergic and purinergic mechanisms on respiratory modulation in the caudal NTS of awake rats. Respir Physiol Neurobiol 161, 246-252.

Braga VA, Soriano RN, Braccialli AL, de Paula PM, Bonagamba LG, Paton JF & Machado BH. (2007). Involvement of L-glutamate and ATP in the neurotransmission of the sympathoexcitatory component of the chemoreflex in the commissural nucleus tractus solitarii of awake rats and in the working heart-brainstem preparation. J Physiol 581, 1129-1145.

Braga VA, Soriano RN & Machado BH. (2006). Sympathoexcitatory response to peripheral chemoreflex activation is enhanced in juvenile rats exposed to chronic intermittent hypoxia. Experimental Physiology 91, 1025-1031.

Page 165: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 164

Caples SM, Gami AS & Somers VK. (2005). Obstructive Sleep Apnea. Ann Intern Med 142, 187-197.

Cerutti C, Gustin MP, Paultre CZ, Lo M, Julien C, Vincent M & Sassard J. (1991a). Autonomic nervous system and cardiovascular variability in rats: a spectral analysis approach. Am J Physiol 261, H1292-1299.

Cerutti C, Gustin MP, Paultre CZ, Lo M, Julien C, Vincent M & Sassard J. (1991b). Autonomic nervous system and cardiovascular variability in rats: a spectral analysis approach. Am J Physiol Heart Circ Physiol 261, H1292-1299.

Chan SHH, Wu KLH, Chang AYW, Tai M-H & Chan JYH. (2009). Oxidative Impairment of Mitochondrial Electron Transport Chain Complexes in Rostral Ventrolateral Medulla Contributes to Neurogenic Hypertension. Hypertension 53, 217-227.

Chen Y, Joaquim LF, Farah VM, Wichi RB, Fazan R, Jr., Salgado HC & Morris M. (2005). Cardiovascular autonomic control in mice lacking angiotensin AT1a receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288, R1071-1077.

Chung S, Ivy GO & Reid SG. (2006). GABA-mediated neurotransmission in the nucleus of the solitary tract alters resting ventilation following exposure to chronic hypoxia in conscious rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 291, R1449-1456.

Cohen J. (1988). Statistical power analysis for the behavioral sciences. Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale, NJ.

de Paula PM, Tolstykh G & Mifflin S. (2007). Chronic intermittent hypoxia alters NMDA and AMPA-evoked currents in NTS neurons receiving carotid body chemoreceptor inputs. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 292, R2259-2265.

Dempsey JA, Veasey SC, Morgan BJ & O'Donnell CP. (2010). Pathophysiology of sleep apnea. Physiol Rev 90, 47-112.

Dergacheva O, Wang X, Kamendi H, Cheng Q, Pinol RM, Jameson H, Gorini C & Mendelowitz D. (2008). 5HT2 receptor activation facilitates P2X receptor mediated excitatory neurotransmission to cardiac vagal neurons in the nucleus ambiguus. Neuropharmacology 54, 1095-1102.

Dick TE, Hsieh YH, Morrison S, Coles SK & Prabhakar N. (2004). Entrainment pattern between sympathetic and phrenic nerve activities in the Sprague-Dawley rat: hypoxia-evoked sympathetic activity during expiration. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286, R1121-1128.

Page 166: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 165

Dick TE, Hsieh YH, Wang N & Prabhakar N. (2007). Acute intermittent hypoxia increases both phrenic and sympathetic nerve activities in the rat. Exp Physiol 92, 87-97.

Dickhout JG & Lee RM. (1998). Blood pressure and heart rate development in young spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol 274, H794-800.

Donoghue S, Felder RB, Jordan D & Spyer KM. (1984). The central projections of carotid baroreceptors and chemoreceptors in the cat: a neurophysiological study. J Physiol 347, 397-409.

Douse MA & Duffin J. (1992). Projections to Botzinger expiratory neurons by dorsal and ventral respiratory group neurons. Neuroreport 3, 393-396.

Drorbaugh JE & Fenn WO. (1955). A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics 16, 81-87.

Dutschmann M & Paton JF. (2002). Glycinergic inhibition is essential for co-ordinating cranial and spinal respiratory motor outputs in the neonatal rat. J Physiol 543, 643-653.

Ezure K. (1990). Synaptic connections between medullary respiratory neurons and considerations on the genesis of respiratory rhythm. Prog Neurobiol 35, 429-450.

Ezure K, Tanaka I & Saito Y. (2003). Brainstem and spinal projections of augmenting expiratory neurons in the rat. Neurosci Res 45, 41-51.

Feldman JL & Del Negro CA. (2006). Looking for inspiration: new perspectives on respiratory rhythm. Nat Rev Neurosci 7, 232-242.

Fitzgerald RS & Lahiri S. (1996). The history of chemoreception. In Respiratory Physiology: People and Ideas, ed. West JB, pp. 289-318. Oxford University Press, New York.

Fletcher EC. (1995). The relationship between systemic hypertension and obstructive sleep apnea: facts and theory. Am J Med 98, 118-128.

Fletcher EC. (2001). Physiological and Genomic Consequences of Intermittent Hypoxia: Invited Review: Physiological consequences of intermittent hypoxia: systemic blood pressure. J Appl Physiol 90, 1600-1605.

Page 167: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 166

Fletcher EC, Lesske J, Behm R, Miller CC, 3rd, Stauss H & Unger T. (1992a). Carotid chemoreceptors, systemic blood pressure, and chronic episodic hypoxia mimicking sleep apnea. J Appl Physiol 72, 1978-1984.

Fletcher EC, Lesske J, Qian W, Miller CC, 3rd & Unger T. (1992b). Repetitive, episodic hypoxia causes diurnal elevation of blood pressure in rats. Hypertension 19, 555-561.

Fortuna MG, West GH, Stornetta RL & Guyenet PG. (2008). Botzinger Expiratory-Augmenting Neurons and the Parafacial Respiratory Group. J Neurosci 28, 2506-2515.

Gibson GE, Zhang H, Xu H, Park LC & Jeitner TM. (2002). Oxidative stress increases internal calcium stores and reduces a key mitochondrial enzyme. Biochim Biophys Acta 1586, 177-189.

Gilbey MP, Numao Y & Spyer KM. (1986). Discharge patterns of cervical sympathetic preganglionic neurones related to central respiratory drive in the rat. J Physiol 378, 253-265.

Glick SM & Kagan A. (1979). Vasopressin. In Methods of Hormone Radioimmunoassay, 2 edn, ed. Jaffe B.M. & H.R. B, pp. 341–351. Academic Press, New York.

Gourine AV, Llaudet E, Dale N & Spyer KM. (2005a). ATP is a mediator of chemosensory transduction in the central nervous system. Nature 436, 108-111.

Gourine AV, Llaudet E, Dale N & Spyer KM. (2005b). Release of ATP in the Ventral Medulla during Hypoxia in Rats: Role in Hypoxic Ventilatory Response. J Neurosci 25, 1211-1218.

Greenberg HE, Sica A, Batson D & Scharf SM. (1999a). Chronic intermittent hypoxia increases sympathetic responsiveness to hypoxia and hypercapnia. J Appl Physiol 86, 298-305.

Greenberg HE, Sica AL, Scharf SM & Ruggiero DA. (1999b). Expression of c-fos in the rat brainstem after chronic intermittent hypoxia. Brain Res 816, 638-645.

Gu H, Lin M, Liu J, Gozal D, Scrogin KE, Wurster R, Chapleau MW, Ma X & Cheng ZJ. (2007). Selective impairment of central mediation of baroreflex in anesthetized young adult Fischer 344 rats after chronic intermittent hypoxia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293, H2809-2818.

Page 168: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 167

Häbler HJ, Bartsch T & Jänig W. (1996). Two distinct mechanisms generate the respiratory modulation in fibre activity of the rat cervical sympathetic trunk. J Auton Nerv Syst 61, 116-122.

Häbler HJ, Jänig W & Michaelis M. (1994). Respiratory modulation in the activity of sympathetic neurones. Prog Neurobiol 43, 567-606.

Haibara AS, Tamashiro E, Olivan MV, Bonagamba LG & Machado BH. (2002). Involvement of the parabrachial nucleus in the pressor response to chemoreflex activation in awake rats. Auton Neurosci 101, 60-67.

Harding R. (1984). Perinatal development of laryngeal function. J Dev Physiol 6, 249-258.

Haselton JR & Guyenet PG. (1989). Central respiratory modulation of medullary sympathoexcitatory neurons in rat. Am J Physiol 256, R739-750.

Hayashi F, Coles SK & McCrimmon DR. (1996). Respiratory neurons mediating the Breuer-Hering reflex prolongation of expiration in rat. J Neurosci 16, 6526-6536.

Head GA & McCarty R. (1987). Vagal and sympathetic components of the heart rate range and gain of the baroreceptor-heart rate reflex in conscious rats. J Auton Nerv Syst 21, 203-213.

Hla KM, Young TB, Bidwell T, Palta M, Skatrud JB & Dempsey J. (1994). Sleep apnea and hypertension. A population-based study. Ann Intern Med 120, 382-388.

Hsieh YH, Siegel RE & Dick TE. (2004). Pontine GABAergic pathways: role and plasticity in the hypoxic ventilatory response. Respir Physiol Neurobiol 143, 141-153.

Iturriaga R, Rey S, Del Rio R, Moya EA & Alcayaga J. (2009). Cardioventilatory acclimatization induced by chronic intermittent hypoxia. Adv Exp Med Biol 648, 329-335.

Janczewski WA & Feldman JL. (2006). Distinct rhythm generators for inspiration and expiration in the juvenile rat. J Physiol 570, 407-420.

Jänig W & Häbler HJ. (2003). Neurophysiological analysis of target-related sympathetic pathways--from animal to human: similarities and differences. Acta Physiol Scand 177, 255-274.

Page 169: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 168

Japundzic N, Grichois ML, Zitoun P, Laude D & Elghozi JL. (1990). Spectral analysis of blood pressure and heart rate in conscious rats: effects of autonomic blockers. J Auton Nerv Syst 30, 91-100.

Jiang C & Lipski J. (1990). Extensive monosynaptic inhibition of ventral respiratory group neurons by augmenting neurons in the Botzinger complex in the cat. Exp Brain Res 81, 639-648.

Kanjhan R, Lipski J, Kruszewska B & Rong W. (1995). A comparative study of pre-sympathetic and Botzinger neurons in the rostral ventrolateral medulla (RVLM) of the rat. Brain Res 699, 19-32.

Kasparov S & Paton JF. (1997). Changes in baroreceptor vagal reflex performance in the developing rat. Pflugers Arch 434, 438-444.

Kiely JL & McNicholas WT. (2000). Cardiovascular risk factors in patients with obstructive sleep apnoea syndrome. Eur Respir J 16, 128-133.

Kim D-K, Natarajan N, Prabhakar NR & Kumar GK. (2004). Facilitation of dopamine and acetylcholine release by intermittent hypoxia in PC12 cells: involvement of calcium and reactive oxygen species. J Appl Physiol 96, 1206-1215.

Kishi T, Hirooka Y, Kimura Y, Ito K, Shimokawa H & Takeshita A. (2004). Increased Reactive Oxygen Species in Rostral Ventrolateral Medulla Contribute to Neural Mechanisms of Hypertension in Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats. Circulation 109, 2357-2362.

Kline DD, Ramirez-Navarro A & Kunze DL. (2007). Adaptive Depression in Synaptic Transmission in the Nucleus of the Solitary Tract after In Vivo Chronic Intermittent Hypoxia: Evidence for Homeostatic Plasticity. J Neurosci 27, 4663-4673.

Koshiya N & Guyenet PG. (1996a). NTS neurons with carotid chemoreceptor inputs arborize in the rostral ventrolateral medulla. Am J Physiol 270, R1273-1278.

Koshiya N & Guyenet PG. (1996b). Tonic sympathetic chemoreflex after blockade of respiratory rhythmogenesis in the rat. J Physiol 491 ( Pt 3), 859-869.

Koshiya N, Huangfu D & Guyenet PG. (1993). Ventrolateral medulla and sympathetic chemoreflex in the rat. Brain Res 609, 174-184.

Kubin L, Alheid GF, Zuperku EJ & McCrimmon DR. (2006). Central pathways of pulmonary and lower airway vagal afferents. J Appl Physiol 101, 618-627.

Page 170: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 169

Lahiri S, Roy A, Baby SM, Hoshi T, Semenza GL & Prabhakar NR. (2006). Oxygen sensing in the body. Prog Biophys Mol Biol 91, 249-286.

Lai CJ, Yang CC, Hsu YY, Lin YN & Kuo TB. (2006). Enhanced sympathetic outflow and decreased baroreflex sensitivity are associated with intermittent hypoxia-induced systemic hypertension in conscious rats. J Appl Physiol 100, 1974-1982.

Leuenberger UA, Brubaker D, Quraishi S, Hogeman CS, Imadojemu VA & Gray KS. (2005). Effects of intermittent hypoxia on sympathetic activity and blood pressure in humans. Autonomic Neuroscience 121, 87-93.

Lin M, Liu R, Gozal D, Wead WB, Chapleau MW, Wurster R & Cheng ZJ. (2007). Chronic intermittent hypoxia impairs baroreflex control of heart rate but enhances heart rate responses to vagal efferent stimulation in anesthetized mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293, H997-1006.

Ling L, Fuller DD, Bach KB, Kinkead R, Olson EB, Jr. & Mitchell GS. (2001). Chronic Intermittent Hypoxia Elicits Serotonin-Dependent Plasticity in the Central Neural Control of Breathing. J Neurosci 21, 5381-5388.

Loewy AD. (1990). Central autonomic pathways. In Central regulation of autonomic functions, ed. Loewy AD & Spyer KM, pp. 88 - 103. Oxford University Press, New York.

Lorier AR, Huxtable AG, Robinson DM, Lipski J, Housley GD & Funk GD. (2007). P2Y1 Receptor Modulation of the Pre-Botzinger Complex Inspiratory Rhythm Generating Network In Vitro. J Neurosci 27, 993-1005.

MacFarlane PM, Wilkerson JER, Lovett-Barr MR & Mitchell GS. (2008). Reactive oxygen species and respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Respiratory Physiology & Neurobiology 164, 263-271.

Malliani A, Pagani M, Lombardi F & Cerutti S. (1991). Cardiovascular neural regulation explored in the frequency domain. Circulation 84, 482-492.

Malpas SC. (1998). The rhythmicity of sympathetic nerve activity. Prog Neurobiol 56, 65-96.

Mandel DA & Schreihofer AM. (2006). Central respiratory modulation of barosensitive neurones in rat caudal ventrolateral medulla. J Physiol 572, 881-896.

Mandel DA & Schreihofer AM. (2009). Modulation of the sympathetic response to acute hypoxia by the caudal ventrolateral medulla in rats. J Physiol 587, 461-475.

Page 171: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 170

Marchenko V & Sapru HN. (2000). Different patterns of respiratory and cardiovascular responses elicited by chemical stimulation of dorsal medulla in the rat. Brain Res 857, 99-109.

McAllen RM. (1987). Central respiratory modulation of subretrofacial bulbospinal neurones in the cat. J Physiol 388, 533-545.

McGuire M, Zhang Y, White DP & Ling L. (2003). Chronic intermittent hypoxia enhances ventilatory long-term facilitation in awake rats. J Appl Physiol 95, 1499-1508.

Miao CY, Xie HH, Zhan LS & Su DF. (2006). Blood pressure variability is more important than blood pressure level in determination of end-organ damage in rats. J Hypertens 24, 1125-1135.

Mifflin SW. (1992). Arterial chemoreceptor input to nucleus tractus solitarius. Am J Physiol 263, R368-375.

Miyazaki M, Arata A, Tanaka I & Ezure K. (1998). Activity of rat pump neurons is modulated with central respiratory rhythm. Neurosci Lett 249, 61-64.

Mörschel M & Dutschmann M. (2009). Pontine respiratory activity involved in inspiratory/expiratory phase transition. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 364, 2517-2526.

Narkiewicz K, Wolf J, Lopez-Jimenez F & Somers VK. (2005). Obstructive sleep apnea and hypertension. Curr Cardiol Rep 7, 435-440.

Onimaru H, Arata A & Homma I. (1987). Localization of respiratory rhythm-generating neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations from newborn rats. Neurosci Lett 78, 151-155.

Onimaru H, Arata A & Homma I. (1988). Primary respiratory rhythm generator in the medulla of brainstem-spinal cord preparation from newborn rat. Brain Res 445, 314-324.

Ortega KC & Mion D, Jr. (2009). Metabolic syndrome and obstructive sleep apnoea: two circumferences in the same individual. J Hum Hypertens.

Paton JF. (1996). A working heart-brainstem preparation of the mouse. J Neurosci Methods 65, 63-68.

Page 172: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 171

Paton JF & Dutschmann M. (2002). Central control of upper airway resistance regulating respiratory airflow in mammals. J Anat 201, 319-323.

Paxinos G & Watson C. (1988). The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic, London.

Paxinos G & Watson C. (1998). The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press, London.

Peña F & Ramirez J-M. (2005). Hypoxia-induced changes in neuronal network properties. Molecular Neurobiology 32, 251-283.

Peng Y-J, Overholt JL, Kline D, Kumar GK & Prabhakar NR. (2003). Induction of sensory long-term facilitation in the carotid body by intermittent hypoxia: Implications for recurrent apneas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 10073-10078.

Peng Y-J & Prabhakar NR. (2003). Reactive oxygen species in the plasticity of respiratory behavior elicited by chronic intermittent hypoxia. J Appl Physiol 94, 2342-2349.

Peng YJ, Nanduri J, Yuan G, Wang N, Deneris E, Pendyala S, Natarajan V, Kumar GK & Prabhakar NR. (2009). NADPH Oxidase Is Required for the Sensory Plasticity of the Carotid Body by Chronic Intermittent Hypoxia. J Neurosci 29, 4903-4910.

Peng YJ & Prabhakar NR. (2004). Effect of two paradigms of chronic intermittent hypoxia on carotid body sensory activity. J Appl Physiol 96, 1236-1242; discussion 1196.

Pickering AE & Paton JF. (2006). A decerebrate, artificially-perfused in situ preparation of rat: utility for the study of autonomic and nociceptive processing. J Neurosci Methods 155, 260-271.

Pilowsky P. (1995). Good vibrations? Respiratory rhythms in the central control of blood pressure. Clin Exp Pharmacol Physiol 22, 594-604.

Powell FL, Huey KA & Dwinell MR. (2000). Central nervous system mechanisms of ventilatory acclimatization to hypoxia. Respir Physiol 121, 223-236.

Reeves SR, Gozal E, Guo SZ, Sachleben LR, Jr., Brittian KR, Lipton AJ & Gozal D. (2003). Effect of long-term intermittent and sustained hypoxia on hypoxic ventilatory and metabolic responses in the adult rat. J Appl Physiol 95, 1767-1774.

Page 173: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 172

Richerson GB & Getting PA. (1992). Medullary respiratory neurons in the guinea pig: localization and firing patterns. Brain Res 591, 79-87.

Richter DW. (1982). Generation and maintenance of the respiratory rhythm. J Exp Biol 100, 93-107.

Richter DW, Ballantyne D & Remmers JE. (1987). The differential organization of medullary post-inspiratory activities. Pflugers Arch 410, 420-427.

Richter DW & Spyer KM. (2001). Studying rhythmogenesis of breathing: comparison of in vivo and in vitro models. Trends Neurosci 24, 464-472.

Rong W, Gourine AV, Cockayne DA, Xiang Z, Ford AP, Spyer KM & Burnstock G. (2003). Pivotal role of nucleotide P2X2 receptor subunit of the ATP-gated ion channel mediating ventilatory responses to hypoxia. J Neurosci 23, 11315-11321.

Rybak IA, Abdala AP, Markin SN, Paton JF & Smith JC. (2007). Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res 165, 201-220.

Samora JB, Frisbee JC & Boegehold MA. (2007). Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am J Physiol Heart Circ Physiol 292, H207-214.

Samora JB, Frisbee JC & Boegehold MA. (2008). Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am J Physiol Heart Circ Physiol 294, H2344-2351.

Semenza GL & Prabhakar NR. (2007). HIF-1α Dependent Respiratory, Cardiovascular, and Redox Responses to Chronic Intermittent Hypoxia. Antioxidants & Redox Signaling 9, 1391-1396.

Shen L, Li YM & Duffin J. (2003). Inhibitory connections among rostral medullary expiratory neurones detected with cross-correlation in the decerebrate rat. Pflugers Arch 446, 365-372.

Sica AL, Greenberg HE, Ruggiero DA & Scharf SM. (2000). Chronic-intermittent hypoxia: a model of sympathetic activation in the rat. Respir Physiol 121, 173-184.

Simms AE, Paton JF, Pickering AE & Allen AM. (2009). Amplified respiratory-sympathetic coupling in the spontaneously hypertensive rat: does it contribute to hypertension? J Physiol 587, 597-610.

Page 174: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 173

Smith JC, Abdala AP, Koizumi H, Rybak IA & Paton JF. (2007). Spatial and functional architecture of the mammalian brain stem respiratory network: a hierarchy of three oscillatory mechanisms. J Neurophysiol 98, 3370-3387.

Smith JC, Ellenberger HH, Ballanyi K, Richter DW & Feldman JL. (1991). Pre-Botzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science 254, 726-729.

Somers VK. (1995). Sympathetic neural mechanisms in obstructive sleep apnea. The Journal of Clinical Investigation 96, 1897-1904.

Spyer KM. (1990). The central nervous organization of reflex circulatory control. In Central regulation of autonomic functions, ed. Loewy AD & Spyer KM, pp. 168-188. Oxford University Press, New York.

Subramanian HH, Chow CM & Balnave RJ. (2007). Identification of different types of respiratory neurones in the dorsal brainstem nucleus tractus solitarius of the rat. Brain Res 1141, 119-132.

Sun QJ, Goodchild AK, Chalmers JP & Pilowsky PM. (1998). The pre-Botzinger complex and phase-spanning neurons in the adult rat. Brain Res 809, 204-213.

Sun QJ, Minson J, Llewellyn-Smith IJ, Arnolda L, Chalmers J & Pilowsky P. (1997). Botzinger neurons project towards bulbospinal neurons in the rostral ventrolateral medulla of the rat. J Comp Neurol 388, 23-31.

Sun QJ, Pilowsky P, Minson J, Arnolda L, Chalmers J & Llewellyn-Smith IJ. (1994). Close appositions between tyrosine hydroxylase immunoreactive boutons and respiratory neurons in the rat ventrolateral medulla. J Comp Neurol 340, 1-10.

Takakura AC, Moreira TS, Colombari E, West GH, Stornetta RL & Guyenet PG. (2006). Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol 572, 503-523.

Tatasciore A, Renda G, Zimarino M, Soccio M, Bilo G, Parati G, Schillaci G & De Caterina R. (2007). Awake systolic blood pressure variability correlates with target-organ damage in hypertensive subjects. Hypertension 50, 325-332.

Thomas T, Ralevic V, Bardini M, Burnstock G & Spyer KM. (2001). Evidence for the involvement of purinergic signalling in the control of respiration. Neuroscience 107, 481-490.

Page 175: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Referências Bibliográficas 174

Tian GF, Peever JH & Duffin J. (1998). Synaptic connections to phrenic motoneurons in the decerebrate rat. Adv Exp Med Biol 450, 51-59.

Tian GF, Peever JH & Duffin J. (1999). Botzinger-complex, bulbospinal expiratory neurones monosynaptically inhibit ventral-group respiratory neurones in the decerebrate rat. Exp Brain Res 124, 173-180.

Yan B, Soukhova-O'Hare GK, Li L, Lin Y, Gozal D, Wead WB, Wurster RD & Cheng ZJ. (2008). Attenuation of heart rate control and neural degeneration in nucleus ambiguus following chronic intermittent hypoxia in young adult Fischer 344 rats. Neuroscience 153, 709-720.

Zhong S, Zhou SY, Gebber GL & Barman SM. (1997). Coupled oscillators account for the slow rhythms in sympathetic nerve discharge and phrenic nerve activity. Am J Physiol 272, R1314-1324.

Zhou SY & Gilbey MP. (1992). Respiratory-related activity of lower thoracic and upper lumbar sympathetic preganglionic neurones in the rat. J Physiol 451, 631-642.

Zoccal DB, Bonagamba LGH, Antunes-Rodrigues J & Machado BH. (2007a). Plasma corticosterone levels is elevated in rats submitted to chronic intermittent hypoxia. Autonomic Neuroscience 134, 115-117.

Zoccal DB, Bonagamba LGH, Oliveira FRT, Antunes-Rodrigues J & Machado BH. (2007b). Increased sympathetic activity in rats submitted to chronic intermittent hypoxia. Experimental Physiology 92, 79-85.

Page 176: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

ANEXOS

Page 177: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

ANEXO A – Artigos publicados relacionados à tese

Page 178: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 (2008) pp 3253–3265 3253

Increased sympathetic outflow in juvenile rats submittedto chronic intermittent hypoxia correlates with enhancedexpiratory activity

Daniel B. Zoccal1, Annabel E. Simms2, Leni G. H. Bonagamba1, Valdir A. Braga1, Anthony E. Pickering2,

Julian F. R. Paton2 and Benedito H. Machado1

1Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil2Department of Physiology and Pharmacology, Bristol Heart Institute, School of Medical Sciences, University of Bristol, Bristol BS8 1TD, UK

Chronic intermittent hypoxia (CIH) in rats produces changes in the central regulation of cardio-

vascular and respiratory systems by unknown mechanisms. We hypothesized that CIH (6%

O2 for 40 s, every 9 min, 8 h day−1) for 10 days alters the central respiratory modulation of

sympathetic activity. After CIH, awake rats (n = 14) exhibited higher levels of mean arterial

pressure than controls (101 ± 3 versus 89 ± 3 mmHg, n = 15, P < 0.01). Recordings of phrenic,

thoracic sympathetic, cervical vagus and abdominal nerves were performed in the in situ working

heart–brainstem preparations of control and CIH juvenile rats. The data obtained in CIH

rats revealed that: (i) abdominal (Abd) nerves exhibited an additional burst discharge in late

expiration; (ii) thoracic sympathetic nerve activity (tSNA) was greater during late expiration than

in controls (52 ± 5 versus 40 ± 3%; n = 11, P < 0.05; values expressed according to the maximal

activity observed during inspiration and the noise level recorded at the end of each experiment),

which was not dependent on peripheral chemoreceptors; (iii) the additional late expiratory

activity in the Abd nerve correlated with the increased tSNA; (iv) the enhanced late expiratory

activity in the Abd nerve unique to CIH rats was accompanied by reduced post-inspiratory

activity in cervical vagus nerve compared to controls. The data indicate that CIH rats present an

altered pattern of central sympathetic–respiratory coupling, with increased tSNA that correlates

with enhanced late expiratory discharge in the Abd nerve. Thus, CIH alters the coupling between

the central respiratory generator and sympathetic networks that may contribute to the induced

hypertension in this experimental model.

(Received 17 March 2008; accepted after revision 30 April 2008; first published online 1 May 2008)

Corresponding author B. H. Machado: Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of

Sao Paulo, 14049-900, Ribeirao Preto, SP, Brazil. Email: [email protected]

Chronic intermittent hypoxia (CIH) is observed inthe pathophysiological state of obstructive sleep apnoea(OSA). As a consequence of the long-term exposureto intermittent hypoxia, OSA patients are at increasedrisk of substantial dysfunctions in the cardiovascularsystem including the development of sustained hyper-tension (Hoffman et al. 2004; Caples et al. 2005). Clinical(Narkiewicz & Somers, 1997; Leuenberger et al. 2005)and experimental (Zoccal et al. 2007b) evidence indicatesincreased sympathetic outflow as the main cause forthe sustained hypertension after CIH. However, therelationship between CIH and the mechanisms under-pinning excessive sympathetic activity are not understood

J. F. R. Paton and B. H. Machado are joint last authors.

completely. Studies from our laboratory documentedthat juvenile rats submitted to CIH exhibited a greatersympathoexcitatory response to peripheral chemoreceptoractivation (Braga et al. 2006), suggesting that the centralprocessing of the sympathoexcitatory component of thechemoreflex is enhanced. This possibility is supportedby studies in CIH rats showing important functionalchanges in pontine–medullary areas involved in thegeneration and respiratory modulation of sympatheticnerve activity (Greenberg et al. 1999; Reeves et al.2003, 2006). In addition to changes in the sympatheticnervous system, considerable alterations are also observedin the respiratory system of rats submitted to CIH,such as enhanced long-term facilitation of respiratorymotor activity (McGuire et al. 2003) and an augmentedventilatory response to hypoxia (Ling et al. 2001; Braga

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society DOI: 10.1113/jphysiol.2008.154187

Page 179: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3254 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

et al. 2006) suggesting that CIH changes brainstemrespiratory network function in rats (Reeves et al. 2006;Kline et al. 2007).

It is well known that cardiovascular sympathetic activityis markedly modulated by central respiratory activity(Adrian et al. 1932; Zhou & Gilbey, 1992; Pilowsky,1995; Malpas, 1998). The pattern of coupling betweenrespiratory and sympathetic activities varies according tothe species (Habler et al. 1994), the nerve recorded (Janig& Habler, 2003) and the state of the preparation (Gilbeyet al. 1986; Dick et al. 2004), but the predominant patternsinclude a peak of sympathetic nerve discharge coincidentwith either inspiration or immediately after inspirationin the post-inspiratory/early expiratory period (Malpas,1998). There is evidence that part of the respiratorymodulation of sympathetic activity is a consequenceof afferent feedback from pulmonary stretch receptors(Anrep et al. 1936; Boczek-Funcke et al. 1992). However,several studies have documented that the influenceof respiratory rhythm on sympathetic activity persistsafter vagotomy indicating a central coupling betweenrespiratory and presympathetic neurons located in thebrainstem (Barman & Gebber, 1980; Haselton & Guyenet,1989; Habler et al. 1996; Zhong et al. 1997). Therefore,considering the evidence that CIH affects brainstemcontrol of both the respiratory and sympathetic nervoussystems, we tested the hypothesis that CIH changes thetemporal profile of coupling between centrally generatedrespiratory activities and sympathetic activities in juvenilerats. To test this, we used an in situ and artificiallyperfused working heart–brainstem preparation of juvenilerats (Pickering & Paton, 2006; Simms et al. 2007) since itgenerates robust sympathetic activity, which is respiratorymodulated, and is free from the depressant effects ofanaesthesia.

Methods

Animals

Juvenile male Wistar rats (19–21 days) were divided intotwo experimental groups: rats exposed to chronic inter-mittent hypoxia (CIH, n = 40) and rats maintained undernormoxic conditions (control, n = 41). These rats wereobtained from the Animal Care of the University ofSao Paulo at Ribeirao Preto, Brazil. All experimentalapproaches were approved by the Ethical Committeeon Animal Experimentation of the School of Medicineof Ribeirao Preto, University of Sao Paulo (protocol019/2006).

Chronic intermittent hypoxia

Both CIH and control rats were housed in collectivecages and maintained inside Plexiglas chambers (volume,

210 l) equipped with gas injectors as well as sensors ofO2, CO2, humidity and temperature. The CIH group wasexposed to a protocol of 5 min of normoxia (fraction ofinspired O2, FIO2

, of 20.8%) followed by 4 min of pure N2

injection to reduce the FIO2from 20.8 to 6%, remaining

at this level for 40 s. After this hypoxic period, pure O2

was injected into the chamber to return the FIO2back

to 20.8%. This 9 min cycle was repeated 8 h a day (from9.30 am to 5.30 pm) for 10 days. During the remaining16 h, the animals were maintained at a FIO2

of 20.8%.The injections of N2 and O2 (White Martins, Sertaozinho,Brazil) into the chamber were regulated by a solenoid valvesystem whose opening–closing control was operated by acomputerized system (Oxycycler, Biospherix, USA). In anidentical chamber in the same room, the control groupof rats was exposed to a FIO2

of 20.8% 24 h a day for10 days. The control rats were also exposed to a similarvalve noise due to the frequent injection of O2 to maintainthe FIO2

at 20.8%. In both CIH and control chambers, thegas injections were performed at the upper level of thechamber in order to avoid direct jets of gas impacting onthe animals, which could cause stress.

Mean arterial pressure and heart rate measurements

At the end of the experimental protocol some of the CIH(n = 14) and control rats (n = 15) were anaesthetized withtribromoethanol (250 mg kg−1, i.p.; Aldrich, Milwaukee,WI, USA) and a catheter was inserted into the abdominalaorta through the femoral artery (PE-10 connected toPE-50 tubing, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA) forarterial pressure measurement. The catheter was tunnelledsubcutaneously and exteriorized through the back ofthe neck. Twenty-four hours later, when the rats werecompletely recovered from the surgery and adapted to theenvironment of the recording room, the arterial catheterwas connected to a pressure transducer (MLT0380,ADInstruments, NSW, Australia), and in turn, to anamplifier (Bridge Amp, ML221, ADInstruments, NSW,Australia). The pulsatile arterial pressure signals wereacquired by a data acquisition system (PowerLab 4/25,ML845, ADInstruments) and recorded on the hard driveof a computer using appropriate software (Chart Pro,ADInstruments). The values of diastolic, mean and systolicarterial pressure and heart rate were then determined fromthe signals of pulsatile arterial pressure. The cardiovascularparameters were recorded in conscious freely movingrats under normoxic conditions for 45–60 min and thedata obtained during the last 30 min were considered foranalysis.

Working heart–brainstem preparation (WHBP)

CIH (n = 26) and control rats (n = 26) were deeplyanaesthetized with halothane (AstraZeneca do Brasil Ltda.,

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 180: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3255

Cotia, SP, Brazil) such that the withdrawal responses tonoxious pinching of the tail and paw were absent. Theanimals were then transected caudal to the diaphragm,exsanguinated and submerged in a cooled Ringer solution.They were decerebrated at the precollicular level tomake insentient, and skinned. The descending aorta wasisolated and the lungs removed. In some CIH (n = 5) andcontrol preparations (n = 3) all the afferents arising fromcarotid bifurcations were mechanically removed in orderto disrupt the carotid chemoreceptor afferents. The efficacyof peripheral chemoreceptor denervation was confirmedby the absence of autonomic and respiratory responsesto peripheral chemoreceptor activation with potassiumcyanide (data not shown). This procedure also removed theafferents from carotid baroreceptors. Preparations werethen transferred to a recording chamber, the descendingaorta was cannulated and perfused retrogradely withRinger solution (in mm: NaCl, 125; NaHCO3, 24; KCl,5; CaCl2, 2.5; MgSO4, 1.25; KH2PO4, 1.25; dextrose,10) containing 1.25% Ficoll (an oncotic agent; Sigma,St Louis, MO, USA) and a neuromuscular blocker(vecuronium bromide, 3–4 μg ml−1, Cristalia ProdutosQu’micos Farmaceuticos Ltda, Sao Paulo, Brazil), using aroller pump (Watson-Marlow 502s, Falmouth, Cornwall,UK) via a double-lumen cannula. The perfusion pressurewas maintained in the range 50–70 mmHg by adjustingthe flow between 21 and 25 ml min−1 and by addingvasopressin (600–1200 pm, Sigma) to the perfusate, aspreviously described (Pickering & Paton, 2006). Theperfusate was continuously gassed with 5% CO2 and95% O2 (White Martins, Sertaozinho, Brazil), warmedto 31–32◦C (temperature measured at the point of entryinto the aorta) and filtered using a nylon mesh (pore size:25 μm, Millipore, Billirica, MA, USA).

Data recordings and analyses

Numerous combinations of cardiorespiratory motornerves were isolated and recorded with up to threebeing recorded simultaneously. All nerve recordingswere obtained using glass suction electrodes held in amicromanipulator (Narishige, Tokyo, Japan). Phrenicnerve (left) discharge was recorded from its central endusing a unipolar electrode and its rhythmic rampingactivity gave a continuous physiological index of pre-paration viability. The electrocardiogram was visible onthe phrenic recording and using a window discriminatorthe R-wave was captured and the inter-R wave intervaldisplayed as heart rate (HR). The cervical vagus nerve(left) was cut distally and its central activity recorded.The efferent activity of the left thoracic sympathetic nerve(tSNA) was recorded from the sympathetic chain at thelevel of T8–T12. An abdominal nerve was isolated fromthe abdominal muscles on the right at thoracic–lumbarlevel, cut distally and its activity recorded. The activities

of cervical vagus, thoracic sympathetic and abdominalnerves were recorded using bipolar glass suctionelectrodes. All the signals were amplified, band-passfiltered (0.5–5 kHz) and acquired in an A/D converter(CED 1401, Cambridge Electronic Design, CED,Cambridge, UK) to a computer using Spike 2software (CED). The frequency of phrenic dischargewas determined by the time interval betweenconsecutive phrenic bursts and the analyses of theactivities of cervical vagus, thoracic sympathetic andabdominal nerves were carried out on the rectifiedand integrated signals (time constant of 100 ms).All the analyses were performed off-line using Spike 2software with custom-written scripts.

Analysis of respiratory–sympathetic activity coupling

Phrenic-triggered averaging of integrated tSNA wascarried out using the same amplification and band-passfilter parameters. These averages were taken from 10integrated phrenic cycles (time constant of 100 ms).The averaged tSNA was divided into four parts: lateexpiration, inspiration (I), post-inspiration (PI) andmid-expiration. The time duration of late expiration, I,PI and mid-expiration was based on the duration ofthe inspiratory phrenic burst (i.e. time to the peak ofthe ramp). To analyse the pattern of tSNA during therespiratory cycle, the peak activity observed during Iwas considered to be 100% and the activities observedduring I, PI, mid- and late-expiration periods were theaverage values obtained, normalized by the peak of activityobserved during I. The noise level, which was consideredas 0%, was determined 10–20 min after ceasing arterialperfusion at the end of each experiment and subtractedfrom tSNA. This analysis was applied for each preparationand the data obtained were pooled across preparations,i.e. CIH (n = 9) and control rats (n = 11) with intact peri-pheral chemoreceptors, and CIH (n = 5) and control rats(n = 3) with denervated peripheral chemoreceptors.

Analysis of vagus nerve activity

Phrenic-triggered averaging of integrated cervical vagusnerve activity over 10 respiratory cycles was subsequentlydivided into three parts: inspiratory (coincident withinspiratory phrenic discharge), early post-inspiratory(early PI, duration of which was defined by the duration ofthe preceding phrenic burst as described above) and late-PI(i.e. all remaining PI activity). To assess the activity in theinspiratory and post-inspiratory phases of vagus activity,areas under the curve were quantified in each part andnormalized by the total area, i.e. sum of areas obtained ininspiratory, early PI and late-PI. This analysis was appliedfor each preparation and the data obtained were pooled

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 181: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3256 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

together and compared between CIH (n = 10) and controlgroups (n = 10).

Analysis of cross-correlation

Cross-correlation analyses were performed betweenphrenic versus abdominal activities and between tSNAversus abdominal activities in control (n = 5) and CIH(n = 5) groups over 10 phrenic cycles. The peak activity ofthe abdominal nerve was used as a trigger (time 0) for allcorrelograms. The results are expressed as the correlationcoefficient (r), in accordance with Cohen (1988), rangingfrom 1 (correlated waves) through 0 (uncorrelated) to –1(correlated but inverted waves). In all cases, neural signalswere smoothed using a time constant of 100 ms. Thisanalysis was performed offline using Spike 2 software.

Statistical analyses

The results were expressed as mean ± standard error ofthe mean and compared using Student’s unpaired t test.The comparisons were carried out on GraphPad Prismsoftware (GraphPad Software, version 4) and differenceswere considered significant at P < 0.05.

Results

Body weight after CIH exposure

Both juvenile CIH (n = 40) and control rats (n = 41)entered the hypoxic and control chambers with similarbody weight (46 ± 2 versus 44 ± 2 g). At the end of the

A

Control CIH0

50

60

70

80

90

*

DA

P (

mm

Hg)

D

Control CIH0

10

20

30

40

50

60

PP (

mm

Hg)

C

Control CIH0

70

80

90

100

110*

MA

P (

mm

Hg)

B

Control CIH0

100

110

120

130

140

*

SA

P (

mm

Hg)

Figure 1. Cardiovascular parametersmeasured in awake juvenile controland chronic intermittenthypoxia-treated (CIH) ratsDiastolic (DAP, A), systolic (SAP, B) andmean arterial pressure (MAP, C), and pulsepressure (PP, D) of control (n = 15) andCIH-treated rats (n = 14). ∗ Different fromcontrol group, P < 0.05.

experimental protocol, the rats submitted to CIH for10 days exhibited a lower body weight compared to controlrats (79 ± 3 versus 98 ± 4 g, P < 0.0001).

Cardiovascular parameters after CIH exposuremeasured in conscious rats in vivo

Conscious CIH rats (n = 14) exhibited significantly higherdiastolic (80 ± 2 versus 72 ± 2 mmHg, P < 0.05, Fig. 1A),systolic (129 ± 3 versus 120 ± 3 mmHg, P < 0.05, Fig. 1B)and mean arterial pressure (101 ± 3 versus 89 ± 3 mmHg,P < 0.01, Fig. 1C), with no changes in the differential pulsepressure (49 ± 2 versus 48 ± 2 mmHg, Fig. 1D) relativeto controls (n = 15). There was no difference in baselineheart rate between CIH and control rats (511 ± 15 versus495 ± 11 beats min−1).

Cardiovascular parameters after CIH exposuremeasured in the WHBP

The perfusion pressure of WHBP of CIH (n = 26) andcontrol rats (n = 26) was set to similar levels (66 ± 2versus 67 ± 2 mmHg) by adjusting the perfusate flowrate between 21 and 25 ml min−1 and by adding vaso-pressin (AVP) to the perfusate (see Methods). In thisregard, we observed that WHBP of CIH rats requireda higher concentration of AVP (1000–1200 pm) thancontrols (600–800 pm) to match perfusion pressure at agiven perfusion rate. In addition, when the same dose ofAVP was added to the perfusate (600 pm), the perfusionpressure increased less in CIH than control WHBP (4 ± 1versus 14 ± 2 mmHg, P < 0.01). To exclude the possibility

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 182: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3257

that the higher concentration of AVP required by WHBPsof CIH rats might contribute to the respiratory andsympathetic alterations observed in this experimentalgroup, WHBPs of naive rats (n = 4) received the sameconcentration of AVP used in CIH rats and the recordsshowed no changes in the basal pattern of sympatheticand respiratory activities and their coupling (data notshown). In relation to baseline heart rate, no differenceswere observed between CIH (n = 21) and control rats(n = 24) with intact peripheral chemoreceptors (422 ± 19versus 425 ± 11 beats min−1). Similarly, CIH (n = 5) andcontrol rats (n = 3) with denervated peripheral chemo-receptors exhibited similar baseline perfusion pressures(at comparable flow rates and vasopressin administration)and heart rate (404 ± 9 versus 406 ± 31 beats min−1).

Respiratory pattern after CIH exposure measured inthe WHBP

Both CIH (n = 21) and control WHBPs (n = 24) withintact peripheral chemoreceptors showed similar phrenicdischarge duration (511 ± 26 versus 541 ± 25 ms) andfrequency (0.32 ± 0.03 versus 0.34 ± 0.02 Hz). Likewise,CIH (n = 5) and control rats (n = 3) with denervatedperipheral chemoreceptors showed no statisticaldifference in phrenic discharge duration (1370 ± 209versus 745 ± 82 ms) and frequency (0.21 ± 0.01 versus0.22 ± 0.06 Hz). In comparison with control and CIHgroups with intact peripheral chemoreceptors, bothcontrol and CIH-denervated groups showed longerphrenic duration (CIH: 1370 ± 209 versus 511 ± 26 ms;control: 745 ± 82 versus 541 ± 25 ms; P < 0.05), with nostatistical difference in relation to phrenic frequency.

In relation to the expiratory activity, analyses wereperformed between abdominal and cervical vagus basalnerve recordings of control and CIH rats. In all

∫cVN

cVN

∫Abd

Abd

PND

Control

∫PND

1 s

*

*

CIH

Figure 2. Raw and integrated (∫

)activities of motor nerves recordedsimultaneously from cervical vagus(cVN), abdominal (Abd) and phrenicnerve (PND) from one representativeworking heart–brainstem preparation(WHBP) in the control and CIH groupsThe shaded grey area in the recordingsindicates the late expiratory phase of therespiratory cycle and the arrows in the cVNindicate the beginning of post-inspiratoryactivity. Note the emergence oflate-expiratory bursts in the Abd of the CIHrat (∗).

preparations of control rats (n = 7), the abdominalactivity showed a relatively small post-inspiratory-relateddischarge, followed by irregular low amplitude activityduring the remaining expiratory phase and an inhibitioncoincident with the phrenic discharge (Figs 2 and 5).In addition, the vagus activity in controls (n = 10)exhibited inspiratory (coincident with phrenic discharge)and post-inspiratory activities followed by quiescenceprior to the next phrenic burst (Fig. 3). In the CIH group(n = 8), the expiratory activity pattern of the abdominalnerve was markedly different relative to controls. In 7out of 8 preparations, the abdominal nerve exhibited anovel burst that occurred during late expiration; the smallpeak of activity in post-inspiration remained as did theinhibition during inspiration (Figs 2 and 5). This indicatedthat in CIH rats, but not controls, there was evidencefor enhanced/forced expiratory activity. Besides, early PIactivity, but not late-PI activity recorded from the cervicalvagus was also reduced in CIH (n = 10) when comparedto controls (n = 10; Fig. 3).

Respiratory–sympathetic coupling after CIH exposurein the WHBP

In both CIH and control rats, tSNA showed clearrespiratory modulation with peak activity coincidentwith the end of inspiratory phrenic discharge and startof expiration (Fig. 4, upper panels). During the PIperiod, tSNA declined reaching its lowest level duringmid-expiration in both animal groups (Fig. 4, upperpanels). In contrast to control rats, CIH animals (n = 9)exhibited a higher level of tSNA during late expiration(52 ± 5 versus 40 ± 3%, P < 0.05) – a time when lateexpiratory activity was expressed in the abdominal nerveof these animals. However, no significant difference intSNA was observed during I (79 ± 3 versus 71 ± 3%),

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 183: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3258 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

PI (35 ± 4 versus 35 ± 4%) and mid-expiration (42 ± 5versus 38 ± 3%) in comparison to control rats (n = 11;middle panels of Fig. 4). Control rats with denervatedperipheral chemoreceptors (n = 3) exhibited a similarpattern of respiratory modulation of tSNA to controlrats with intact peripheral chemoreceptors. Similarly, CIHrats with denervated peripheral chemoreceptors (n = 5)again presented a higher tSNA during late expiration(58 ± 3 versus 44 ± 1%, P < 0.05) but similar activityduring the other respiratory periods when comparedto CIH rats with intact peripheral chemoreceptors(I: 80 ± 2 versus 77 ± 2%; PI: 38 ± 7 versus 27 ± 6%;mid-expiration: 49 ± 6 versus 34 ± 6%, lower panel of Fig.4). Thus, the central respiratory coupling of tSNA andthe enhancement seen during the late expiratory periodobserved in CIH rats were both independent of peri-pheral chemoreceptor input. In addition, the simultaneousrecordings of tSNA and abdominal nerve showed that the

∫cVN

inspiratory early-PI late-PI

Inspiratory early-PI late-PI

0

10

20

30

40

50

60

Control CIH

*

AU

C o

f cV

N (

%)

∫cVN

inspiratory early-PI late-PI

Inspiratory early-PI late-PI

0

10

20

30

40

50

60

Control CIH

*

AU

C o

f cV

N (

%)

∫cVN

inspiratory early-PI late-PI

∫cVN

inspiratory early-PI late-PI

Inspiratory early-PI late-PI

0

10

20

30

40

50

60

Control CIH

*

AU

C o

f cV

N (

%)

Figure 3. Analysis of cervical vagus nerve activity (cVN) incontrol and CIH-treated ratsUpper panel: phrenic-triggered average of integrated cervical vagusnerve (

∫cVN), obtained from 10 phrenic cycles in one representative

WHBP of control and CIH groups. The early post-inspiratory activity(early PI) of cVN observed in CIH rats was reduced in relation tocontrols, but there was no change in late-PI and inspiratory activities.Lower panel: mean values of the area under the curve (AUC) of thedifferent components of cVN in control (n = 10) and CIH groups(n = 10). The values were normalized by the total cVN area (equivalentto the sum of the areas of the three cVN components). ∗ Differentfrom control group, P < 0.05.

increased late-expiratory sympathetic activity of CIH ratsis associated with enhanced/forced expiratory activity, asshown in Fig. 5.

Cross-correlation between abdominal outflowand sympathetic activity

Representative correlograms from one control (left) andone CIH (right) WHBP are shown in Fig. 6. In this figure,tSNA (upper panels) and phrenic nerve activity (middlepanels) are triggered from the peak of abdominal nerveactivity (lower panels). In this control group simultaneousrecording of abdominal and tSNA were performed infive WHBPs. The maximal peak of abdominal activity (attime 0) correlated with post-inspiration (i.e. immediatelyafter phrenic discharge) whereas tSNA occurred duringthe latter stages of the phrenic burst (Fig. 6, left panels).This indicates that in control rats, the maximal tSNAcorrelated with the transition between late inspirationand post-inspiration. The correlation coefficient (r) forabdominal nerve activity versus tSNA was 0.36 ± 0.12(Fig. 7, left panel). It was noteworthy that in all controlWHBPs the correlation between abdominal activityand tSNA occurred during post-inspiration, when thesympathetic activity was decreasing and the abdominaldischarge was increasing. In contrast, in the CIH rats(n = 5 out of 7) the abdominal nerve activity correlatedwith the late expiratory phase, occurring prior to phrenicdischarge (Fig. 6, right panels). Similar to control rats,maximal tSNA correlated with late inspiration in the CIHgroup. However, unlike control rats, a second peak in tSNAwas found to correlate with the late expiratory peak inabdominal nerve activity (r = 0.36 ± 0.11; Fig. 7, rightpanel). Two out of 7 CIH preparations did not showsignificant correlation coefficients during late expiration,despite the fact that these preparations exhibited a greaterpeak of abdominal nerve activity during late expiration.These were not considered in the data analysis.

Discussion

CIH exposure, hypertension and sympatheticoveractivity

The mechanisms underlying the hypertension observedafter CIH exposure are not understood completely. It iswell characterized that adult rats submitted to CIH for35 days present an increase in arterial pressure (Fletcher,2001; Zoccal et al. 2007a,b). However, our study is thefirst to show that juvenile rats exposed to CIH for just10 days exhibit a significant increase in baseline arterialpressure comparable to that reported previously in adultrats using a similar protocol of CIH but for 35 days(Zoccal et al. 2007a,b). Combined with this increasein arterial pressure, we observed a different pattern of

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 184: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3259

sympathetic activity in CIH rats. Both CIH and controlgroups presented a peak of tSNA during late inspirationwith a decline during post-inspiration. However, CIHrats also exhibited an additional significant increase intSNA during late expiration, which correlated with an

Figure 4. Respiratory–sympathetic coupling assessed in control and CIH-treated ratsUpper panels: phrenic-triggered average of thoracic sympathetic nerve activity (tSNA) obtained from 10 phreniccycles in a representative control (left) and CIH-treated rat (right). Peak sympathetic activity was normalized to100% and the noise level to 0%. Note the elevated tSNA in Late E in CIH-treated rats (arrows). Middle panels:mean tSNA during late expiratory (Late E), inspiratory (I), post-inspiratory (PI) and mid-expiratory (Mid E) parts ofthe respiratory cycle in control (n = 11) and CIH (n = 9) rats with intact peripheral chemoreceptors. ∗ Differentfrom control, P < 0.05. Lower panels: mean tSNA relative to the respiratory cycle in CIH (n = 5) and control rats(n = 3) with denervated peripheral chemoreceptors. ∗ Different from control, P = 0.01.

enhanced late expiratory activity. It is noteworthy thatthis difference in the tSNA pattern was not dependenton afferents arising either from the lungs (these areabsent in WHBP) or from the carotid bodies, which wereremoved in some experiments without altering the distinct

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 185: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3260 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

PND

∫PND

tSNA

∫tSNA

Abd

∫Abd

1 s

PND

∫PND

tSNA

∫tSNA

Abd

∫Abd

Control CIH

1 s

Figure 5. Simultaneous recordings ofraw and integrated (

∫) abdominal (Abd),

thoracic sympathetic (tSNA) and phrenicnerve activities (PND) in a representativecontrol and CIH-treated WHBP (CIH)The shaded grey area in the recordingsrepresents the late expiratory phase of therespiratory cycle. Note the emergence of lateexpiratory discharges in both the Abd andtSNA (arrowed) of CIH-treated rats.

pattern and coupling between phrenic and sympatheticactivities. Therefore, the observed change in the couplingof respiratory and sympathetic activities reflects a centralnervous system phenomenon.

Respiratory pattern after 10 days of CIH exposure

The central respiratory rhythm is generated in the brain-stem (Feldman & Smith, 1995; Richter, 1996; Smith et al.2007). Inspiratory and expiratory neurons involved in thegeneration of the respiratory pattern are predominantly

2

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1

seconds

-2 -1 0 1 2

seconds

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

CIH

2

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1 -2 -1 0 1 2

seconds

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

2

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1 2

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.8

-0.4

0.0

0.8

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1

Control

-2 -1 0 1 2

seconds

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

-2 -1 0 1 2

seconds

tSN

A(r

)

PN

D(r

)

Abd

(r)

0.0

0.6

-0.4

0.0

1.0

-0.2

0.0

1.0

-0.2

Figure 6. Cross-correlation analyses among the activities of thoracic sympathetic (tSNA, upper panel),phrenic (PND, middle panel) and abdominal (Abd, reference activity) nerves of a representative controland CIH WHBPPND and tSNA were triggered from the main peak in Abd. In control rats, the main Abd discharge occurred duringthe post-inspiratory period but in rats treated with CIH this occurred late in the expiratory phase. Note the switchin correlation of Abd to tSNA from post-inspiration in control rats to late expiration in CIH-treated rats.

connected reciprocally via inhibitory pathways to producealternating inspiratory and expiratory spinal and cranialmotor activities (Richter, 1996; Richter & Spyer, 2001;Smith et al. 2007). In our experiments, no significantchanges were observed in inspiratory phrenic activityin CIH rats, indicating that the inspiratory activity wasnot significantly affected by CIH exposure. On the otherhand, the early post-inspiratory activity of the cervicalvagus nerve was smaller in CIH than controls. Besides,CIH rats also exhibited a novel peak in the abdominalnerve activity during late expiration, consistent with an

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 186: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3261

enhanced or forced expiration. Accordingly, our resultsindicate that CIH rats exhibit a different pattern ofexpiratory activity, with reduced post-inspiratory andenhanced late-expiratory activities. We did not determinewhether the altered expiratory activity pattern is alsoobserved in in vivo preparations but this possibilitydeserves additional studies.

A major source of expiratory neurons in the respiratorynetwork is the Botzinger complex (BotC), a neuro-nal group located in the ventral respiratory column ofthe ventrolateral medulla (Ezure, 1990; Jiang & Lipski,1990; Shen et al. 2003; Smith et al. 2007). The BotCcontains neurons that exhibit a decrementing pattern ofdischarge, characterized by a rapid depolarization at theend of inspiration (post-inspiratory neurons, post-I), andneurons that show an augmenting pattern of discharge(augmenting expiratory neurons, aug-E), which initiatetheir firing in mid-expiration and terminate prior tophrenic activity (Smith et al. 2007). The left panel ofFig. 8 illustrates the interrelationship among the expiratoryneurons located in BotC and the other respiratory andautonomic neurons in the ventral medulla. The patternof activity of post-I neurons can be recorded in cervicalvagus and abdominal nerves. Abdominal nerve activityalso presents an augmenting pattern of activity duringlate expiration in conditions of enhanced respiratorydrive, such as during the activation of peripheral chemo-receptors (data not shown). It is important to notethat the basal abdominal nerve activity of WHBP ofCIH (but not control) rats exhibited this aug-E firing,suggesting the possibility that intermittent hypoxia excitesand recruits aug-E BotC cells (or any other respiratoryneurons associated with forced expiration; see Janczewski& Feldman, 2006; Fortuna et al. 2008; right panel of Fig. 8)and that this persists even when CIH is withdrawn. Indeed,Kanjhan et al. (1995) showed that the firing frequency ofBotC neurons increases in hypoxic conditions. Based onthe finding that some of these BotC expiratory neuronshave bulbospinal projections (Tian et al. 1999), theseneurons may provide an excitatory drive to the abdominalmotoneurones. Thus, we suggest that this connection maybe strengthened by CIH as a result of their repetitiveactivation. The other evidence that supports the hypothesis

PI

Control CIH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

nocorrelation

Corr

ela

tion C

oeffic

ient (r

)

Late E

Control CIH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

nocorrelation

Corr

ela

tion C

oeffic

ient (r

)

Figure 7. Mean correlation coefficient(r) between the activities of thoracicsympathetic and abdominal nervesduring post-inspiratory (PI) and lateexpiratory (Late E) phases in control(n = 5) and CIH (n = 5) groupsNote the switch in correlation betweenAbd and tSNA from PI to Late E phase inCIH rats.

that BotC aug-E neurons are more excitable in CIHrats is that the early post-inspiratory activity in vagusnerve activity is depressed. With the reciprocal inhibitoryconnections between post-I and aug-E (Shen et al. 2003),we propose that the CIH-induced excitation of aug-Emay depress post-I neuronal activity, reducing its firingper respiratory cycle, as illustrated in the right panel ofFig. 8. This is consistent with our finding of a reduction ofPI activity in cervical vagus nerve, although it was observedin the early component. An alternative possibility is thatCIH depresses PI neuronal activity which allows aug-E tobecome predominant. Further experiments are requiredto check these two possibilities.

Respiratory–sympathetic coupling after 10 daysof CIH exposure

The pattern of entrainment between sympathetic andrespiratory activities varies according to the species, thenerve recorded and state of the preparation (Gilbeyet al. 1986; Habler et al. 1994; Janig & Habler, 2003;Dick et al. 2004). In our experiments, the thoracicsympathetic activity of WHBP of control rats exhibits aphasic increase during the inspiratory phase, with a peakmainly in late inspiration, followed by a decline duringthe post-inspiratory phase and a tonic activity duringthe end of expiration. Previous studies documented thatthe respiratory modulation of sympathetic motor outflowoccurs, at least in part, at the level of the brainstem viareticulospinal sympathoexcitatory neurons located in therostral ventrolateral medulla (RVLM, Barman & Gebber,1980; McAllen, 1987; Haselton & Guyenet, 1989; Koshiya& Guyenet, 1996; Habler et al. 1996; Zhong et al. 1997).Accordingly, neurons involved in the control of respirationcould directly modulate the activity of sympathetic RVLMneurons and generate patterns of activity entrained to therespiratory cycle (Haselton & Guyenet, 1989), which areabolished after the inhibition of the medullary respiratoryregions including the rostral ventral respiratory group, thepre-Botzinger complex (pre-BotC) and the BotC (Koshiya& Guyenet, 1996). On the other hand, studies by Mandel& Schreihofer (2006) demonstrated that the activity

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 187: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3262 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

of GABAergic neurons of caudal ventrolateral medulla(CVLM) that inhibit the sympathetic RVLM neuronsis also modulated by respiratory inputs, suggesting anindirect pathway of respiratory modulation for RVLMneurons. Therefore, based on the data showing that: (i)sympathoexcitatory RVLM neurons exhibit a peak ofdischarge coincident with the phrenic burst (Haselton& Guyenet, 1989), (ii) GABAergic neurons of CVLMneurons present a depression of the neuronal activityduring inspiration or an increase in neuronal dischargeduring post-inspiration (Mandel & Schreihofer, 2006),and (iii) inspiratory and post-inspiratory neurons are bothexcitatory and inhibitory (Bianchi et al. 1995; Smith et al.

Figure 8. Schematic drawings of the coupling between central respiratory and sympathetic activity incontrol and CIH ratsIn control rats (left panel), expiratory neurons (post-inspiratory, post-I, and inhibitory (i) augmenting expiratoryneurons, aug-E), mainly located in Botzinger complex (BotC; Sun et al. 1998; Smith et al. 2007), and inspiratoryneurons (insp) located in pre-Botzinger complex (pre-BotC) and rostral ventral respiratory group (rVRG) arereciprocally connected by inhibitory pathways coordinating the respiratory rhythm (Richter, 1996; Tian et al.1999; Richter & Spyer, 2001; Shen et al. 2003; Smith et al. 2007). The different types of inspiratory neuronsrecorded in pre-BotC and rVRG were classified together as ‘insp’ for clarity. The grey boxes represent the maintonic excitatory sources to BotC (intrinsic (in) BotC, Smith et al. 2007; retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratorygroup (RTN/pFRG), Janczewski & Feldman, 2006; and pons, Smith et al. 2007) and pre-BotC (in pre-BotC (intrinsic,in) and pons, Johnson et al. 1994; Smith et al. 2007). The sympathetic–respiratory coupling observed in thoracicsympathetic activity in the WHBP of control rats is driven potentially by projections from insp and post-I, modulatingthe activity of premotor sympathetic neurons (symp) located in rostral ventrolateral medulla (RVLM) directly(Haselton & Guyenet, 1989) or via inhibitory neurons (GABA) located in caudal ventrolateral medulla (CVLM,Mandel & Schreihofer, 2006). In CIH rats (right panel), the excitability of aug-E neurons is probably increased afterCIH exposure (indicated by the increased abdominal nerve activity during Late E), which, in turn, may depressthe activity of the post-I neurons and consequently reduce the post-inspiratory activity in cervical vagus nerve (asreported herein). In addition, we hypothesize that the excitability of another population of excitatory (e) aug-Eneurons is also increased in CIH rats and it may be the source of the neuronal activity that is driving excitatoryinputs to symp and sympathetic preganglionic neurons of the intermediolateral column of spinal cord (IML; Sunet al. 1997; Tian et al. 1999), leading to the enhanced sympathetic activity observed during late expiration. This eaug-E population is speculative (?) and needs to be confirmed as a driver of sympathetic overactivity of CIH rats. Nochanges in inspiratory activity were observed in CIH possibly because of the reciprocal, and presumed equivalent,changes in aug-E and post-I inhibitory activity on inspiratory neurons.

2007), a possible scenario for the respiratory–sympatheticcoupling observed in control rats is that the activity ofRVLM neurons is modulated by inputs from inspiratoryand post-inspiratory neurons either directly or viaGABAergic CVLM neurons, as illustrated in the left panelof Fig. 8.

With respect to the WHBP of CIH rats, the thoracicsympathetic activity also presented a peak of activityduring late inspiration, followed by a decline duringpost-inspiration. However, CIH rats exhibit a rampingpattern of sympathetic activity during expiration, witha significantly higher activity during the late expiratoryphase in comparison to controls. Dick et al. (2004)

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 188: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3263

reported that acute short-term hypoxia (8% O2 for30–45 s) increases splanchnic sympathetic nerve activitymainly during the second half of expiration. In anotherstudy, Dick et al. (2007) also demonstrated thatanaesthetized adult rats exposed to acute intermittenthypoxia (10 exposures of 8% O2 for 45 s) presentedan increase in tSNA during the first half of expirationthat persisted until 60 min after the last exposureof hypoxia, indicating that acute intermittent hypoxiaenhances respiratory–sympathetic coupling. This pre-ferential recruitment of the sympathetic activity in theexpiratory phase during hypoxia is consistent with ourdata in CIH rats. However, these previously reportedobservations were made either during (Dick et al. 2004) orimmediately after (Dick et al. 2007) the hypoxic stimuluswhile those in the present study were made in CIH rats 24 hafter the last exposure to hypoxia. Our findings suggestthat 10 days of CIH induces a long-term and persistentalteration in the strength of central coupling betweenlate expiratory activity and sympathetic motor circuitryin juvenile rats, which is associated with arterial hyper-tension. In future studies it will be important to determinehow long these changes persist after the cessation of theintermittent hypoxia.

The analysis of cross-correlation showed that theincrease in tSNA during late expiration correlated withthis late expiratory peak of abdominal nerve activity inCIH rats, which was not observed in controls. Accordingto Cohen (1988), this correlation (r = 0.36 ± 0.11) was ofmedium strength and is considered statistically significant.Our analysis does not allow us to determine whetherthe enhanced abdominal expiratory activity is directlydriving sympathetic activity or vice versa. Alternatively,a common excitatory drive impinging on both abdominaland sympathetic activities may exist. However, based onrelated evidence, we hypothesize that the enhanced lateexpiratory activity may be driving the late expiratoryburst in tSNA and probably BotC aug-E neurons aremodulating RVLM pre-sympathetic neurons. Studies byThomas et al. (2001) have shown that the activation ofneurons in the ventral surface of medulla, at the level ofBotC and pre-BotC, evoked a reduction in the phrenicnerve discharge accompanied by an increase in arterialpressure, indicating an entrainment between expirationand sympathoexcitation. This is consistent with a studyby Sun et al. (1997) showing close appositions of axonalprojections from intracellularly labelled BotC neuronsto RVLM bulbospinal neurons. Additionally, it may alsobe the case that the enhanced late expiratory dischargein tSNA results from direct projections of aug-E BotCneurons to spinal cord (Tian et al. 1999). Therefore, wesuggest that the enhanced activity of aug-E neurons andcorrelated increase in tSNA may occur via projectionsto RVLM pre-sympathetic neurons and/or spinal cordand that the synaptic strength of this excitatory input(s)

is increased by CIH, as illustrated in the right panelof Fig. 8. We also acknowledge that CVLM neurons,which inhibit the RVLM bulbospinal cells, should also beconsidered as they are also respiratory modulated (Mandel& Schreihofer, 2006).

Conclusion and perspectives

In conclusion, our findings show that juvenile ratsexposed to CIH for 10 days exhibit hypertension and anincrease in sympathetic activity that correlates with anenhanced/forced expiration. Thus, our data indicate thatCIH induces chronic changes in neuronal plasticity in thecoupling between respiratory and sympathetic activitiesin this experimental model. We have not yet been ableto determine whether the enhanced sympathetic activityobserved during late expiration is the cause of hyper-tension observed in CIH rats. This is an important issuethat deserves further electrophysiological studies to verifypossible changes in the neurochemical profile of neuronsof the ventral medulla involved in the generation ofsympathetic and respiratory activities.

References

Adrian ED, Bronk DW & Phillips G (1932). Discharges inmammalian sympathetic nerves. J Physiol 74, 115–133.

Anrep GV, Pascual W & Rossler R (1936). Respiratoryvariations of the heart rate I. The reflex mechanism of therespiration arrhythmia. Proc R Soc Lond B Biol Sci 119,191–217.

Barman SM & Gebber GL (1980). Sympathetic nerve rhythm ofbrain stem origin. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol239, R42–R47.

Bianchi AL, Denavit-Saubie M & Champagnat J (1995).Central control of breathing in mammals: neuronal circuitry,membrane properties, and neurotransmiters. Physiol Rev 75,1–45.

Boczek-Funcke A, Dembowsky K, Habler HJ, Janig W, McAllenRM & Michaelis M (1992). Classification of preganglionicneurones projecting into the cat cervical sympathetic trunk.J Physiol 453, 319–339.

Braga VA, Soriano RN & Machado BH (2006).Sympathoexcitatory response to peripheral chemoreflexactivation is enhanced in juvenile rats exposed to chronicintermittent hypoxia. Exp Physiol 91, 1025–1031.

Caples SM, Gami AS & Somers VK (2005). Obstructive sleepapnea. Ann Intern Med 142, 187–197.

Cohen J (1988). Statistical Power Analysis for the BehavioralSciences, 2nd edn. Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale,NJ, USA.

Dick TE, Hsieh Y-H, Morrison S, Coles SK & Prabhakar N(2004). Entrainment pattern between sympathetic andphrenic nerve activities in the Sprague-Dawley rat:hypoxia-evoked sympathetic activity during expiration.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286, R1121–R1128.

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 189: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

3264 D. B. Zoccal and others J Physiol 586.13

Dick TE, Hsieh YH, Wang N & Prabhakar N (2007). Acuteintermittent hypoxia increases both phrenic and sympatheticnerve activities in the rat. Exp Physiol 92, 87–97.

Ezure K (1990). Synaptic connections between medullaryrespiratory neurons and considerations on the genesis ofrespiratory rhythm. Prog Neurobiol 35, 429–450.

Feldman JL & Smith JC (1995). Neural control of respiratorypattern in mammals: An overview. In Regulation ofBreathing , ed. Dempsey JA & Pack AI, pp. 39–69. Decker,New York.

Fletcher EC (2001). Physiological consequences of intermittenthypoxia: systemic blood pressure. J Appl Physiol 90,1600–1605.

Fortuna MG, West GH, Stornetta RL & Guyenet PG (2008).Botzinger expiratory-augmenting neurons and the parafacialrespiratory group. J Neurosci 28, 2506–2515.

Gilbey MP, Numao Y & Spyer KM (1986). Discharge patternsof cervical sympathetic preganglionic neurones related tocentral respiratory drive in the rat. J Physiol 378, 253–265.

Greenberg HE, Sica AL, Scharf SM & Ruggiero DA (1999).Expression of c-fos in the rat brainstem after chronicintermittent hypoxia. Brain Res 816, 638–645.

Habler H-J, Bartsch T & Janig W (1996). Two distinctmechanisms generate the respiratory modulation in fibreactivity of the rat cervical sympathetic trunk. J Auton NervSyst 61, 116–122.

Habler H-J, Janig W & Michaelis M (1994). Respiratorymodulation in the activity of sympathetic neurones. ProgNeurobiol 43, 567–606.

Haselton JR & Guyenet PG (1989). Central respiratorymodulation of medullary sympathoexcitatory neurons in rat.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 256, R739–R750.

Hoffmann M, Bybee K, Accurso V & Somers VK (2004). Sleepapnea and hypertension. Minerva Med 95, 281–290.

Janczewski WA & Feldman JL (2006). Distinct rhythmgenerators for inspiration and expiration in the juvenile rat.J Physiol 570, 407–420.

Janig W & Habler H-J (2003). Neurophysiological analysis oftarget-related sympathetic pathways – from animal tohuman: similarities and differences. Acta Physiol Scand 177,255–274.

Jiang C & Lipski J (1990). Extensive monosynaptic inhibition ofventral respiratory group neurons by augmenting neurons inthe Botzinger complex in the cat. Exp Brain Res 81, 639–648.

Johnson SM, Smith JC, Funk GD & Feldman JL (1994).Pacemaker behavior of respiratory neurons in medullaryslices from neonatal rat. J Neurophysiol 76, 2598–2608.

Kanjhan R, Lipski J, Kruszewska B & Rong W (1995). Acomparative study of pre-sympathetic and Botzingerneurons in the rostral ventrolateral medulla (RVLM) of therat. Brain Res 699, 19–32.

Kline DD, Ramirez-Navarro A & Kunze DL (2007). Adaptivedepression in synaptic transmission in the nucleus of thesolitary tract after in vivo chronic intermittent hypoxia:evidence for homeostatic plasticity. J Neurosci 27,4663–4673.

Koshiya N & Guyenet PG (1996). Tonic sympatheticchemoreflex after blockade of respiratory rhythmogenesis inthe rat. J Physiol 491, 859–869.

Leuenberger UA, Brubaker D, Quraishi S, Hogeman CS,Imadojemu VA & Gray KS (2005). Effects of intermittenthypoxia on sympathetic activity and blood pressure inhumans. Auton Neurosci 121, 87–93.

Ling L, Fuller DD, Bach KB, Kinkead R, Olson EB & MitchellGS (2001). Chronic intermittent hypoxia elicitsserotonin-dependent plasticity in the central neural controlof breathing. J Neurosci 21, 5381–5388.

McAllen RM (1987). Central respiratory modulation ofsubretrofacial bulbospinal neurones in the cat. J Physiol 388,533–545.

McGuire M, Zhang Y, White DP & Ling L (2003). Chronicintermittent hypoxia enhances ventilatory long-termfacilitation in awake rats. J Appl Physiol 95, 1499–1508.

Malpas S (1998). The rhythmicity of sympathetic nerveactivity. Prog Neurobiol 56, 65–96.

Mandel DA & Schreihofer AM (2006). Central respiratorymodulation of barosensitive neurones in rat caudalventrolateral medulla. J Physiol 572, 881–896.

Narkiewicz K & Somers VK (1997). The sympathetic nervoussystem and obstructive sleep apnea: implications forhypertension. J Hypertens 15, 1613–1619.

Pickering AE & Paton JFR (2006). A decerebrate,artificially-perfused in situ preparation of rat: utility for thestudy of autonomic and nociceptive processing. J NeurosciMethods 155, 260–271.

Pilowsky P (1995). Good vibrations? Respiratory rhythms inthe central control of blood pressure. Clin Exp PharmacolPhysiol 22, 594–604.

Reeves SR, Gozal E, Guo SZ, Sachleben LR Jr, Brittian KR,Lipton AJ & Gozal D (2003). Effect of long-term intermittentand sustained hypoxia on hypoxic ventilatory and metabolicresponses in the adult rat. J Appl Physiol 95, 1767–1774.

Reeves SR, Guo SZ, Brittian KR, Row BW & Gozal D (2006).Anatomical changes in selected cardio-respiratory brainstemnuclei following early post-natal chronic intermittenthypoxia. Neurosci Lett 402, 233–237.

Richter DW (1996). Neural regulation of respiration:rhythmogenesis and afferent control. In ComprehensiveHuman Physiology, vol. II, ed. Gregor R & Windhorst U,pp. 2079–2095. Springer-Verlag, Berlin.

Richter DW & Spyer KM (2001). Studying rhythmogenesis ofbreathing: comparison of in vitro and in vivo models. TrendsNeurosci 24, 464–472.

Shen LL, Li YM & Duffin J (2003). Inhibitory connectionsamong rostral medullary expiratory neurons detected withcross-correlation in the decerebrate rat. Pflugers Arch 446,365–372.

Simms A, Paton JFR & Pickering AE (2007). Hierarchicalrecruitment of the sympathetic and parasympathetic limbsof the baroreflex in normotensive and spontaneouslyhypertensive rats. J Physiol 579, 473–486.

Smith JC, Abdala APL, Koizumi H, Rybak IA & Paton JFR(2007). Spatial and functional architecture of themammalian brainstem respiratory network: a hierarchy ofthree oscillatory mechanisms. J Neurophysiol 98, 3370–3387.

Sun Q-J, Goodchild AK, Chalmers JP & Pilowsky PM (1998).The pre-Botzinger complex and phase-spanning neurons inthe adult rat. Brain Res 809, 204–213.

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 190: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.13 Late-expiratory sympathetic overactivity after CIH 3265

Sun Q-J, Minson J, Llewellyn-Smith IJ, Arnolda L, Chalmers J& Pilowsky P (1997). Botzinger neurons project towardsbulbospinal neurons in the rostral ventrolateral medulla ofthe rat. J Comp Neurol 388, 23–31.

Thomas T, Ralevic V, Bardini M, Burnstock G & Spyer KM(2001). Evidence for the involvement of purinergic signallingin the control of respiration. Neuroscience 107, 481–490.

Tian GF, Peever JH & Duffin J (1999). Botzinger-complex,bulbospinal expiratory neurones monosynaptically inhibitventral-group respiratory neurones in the decerebrate rat.Exp Brain Res 124, 173–180.

Zhong S, Zhou SY, Gebber GL & Barman SM (1997). Coupledoscillators account for the slow rhythms in sympatheticnerve discharge and phrenic nerve activity. Am J PhysiolRegul Integr Comp Physiol 272, R1314–R1324.

Zhou S-Y & Gilbey MP (1992). Respiratory-related activity oflower thoracic and upper lumbar sympathetic preganglionicneurones in the rat. J Physiol 451, 631–642.

Zoccal DB, Bonagamba LG, Antunes-Rodrigues J & MachadoBH (2007a). Plasma corticosterone levels is elevated in ratssubmitted to chronic intermittent hypoxia. Auton Neurosci134, 115–117.

Zoccal DB, Bonagamba LG, Oliveira FR, Antunes-Rodrigues J& Machado BH (2007b). Increased sympathetic activity inrats submitted to chronic intermittent hypoxia. Exp Physiol92, 79–85.

Acknowledgements

In Brazil this study was supported by CNPq (472704/2004-4) and

FAPESP (2004/03285-7 and 2006/51159-6). In the UK J.F.R.P.

was in receipt of a Royal Society Wolfson Research Merit Award

and A.E.P. holds a Wellcome Trust Advanced Fellowship. The

authors thank Dr Ana Paula Lima Abdala for her important

contribution to the analyses of the correlograms.

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

Page 191: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Frontiers in Research Review:

In vitro Approaches to the Study of Neural Control of Autonomic andRespiratory Functions

DO CHANGES IN THE COUPLING BETWEEN RESPIRATORYANDSYMPATHETIC ACTIVITIES CONTRIBUTE TO NEUROGENIC

HYPERTENSION?

Daniel B Zoccal,* Julian FR Paton† and Benedito H Machado*

*Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, Sao Paulo, Brazil

and †Department of Physiology and Pharmacology, Bristol Heart Institute, School of Medical Sciences,University of Bristol, Bristol, UK

SUMMARY

1. It is well known that respiration markedly modulatesthe sympathetic nervous system. Interactions between pontineand medullary neurons involved in the control of sympatheticand respiratory functions are the main mechanism underlyingthe respiratory related oscillations in sympathetic nerveactivity.2. Recently, in rats treated with chronic intermittent hypoxia,

we demonstrated that alterations in respiratory pattern maydrive increased sympathetic outflow and hence the developmentof systemic hypertension. These experiments, performed inthe in situ working heart–brain stem preparation, raise thepossibility that enhanced central coupling between respiratoryand sympathetic activities could be a potential mechanismunderpinning the development and/or the maintenance ofneurogenic hypertension.3. In the present review, we discuss the neural basis of the

enhanced entrainment between respiratory and sympatheticneurons in the brain stem that can be induced by chronicintermittent hypoxia and the possible implications of thesemechanisms in the genesis of sympathetic overactivity and,consequently, hypertension.Key words: hypertension, respiration, respiratory–sympathetic

coupling, sympathetic activity, working heart–brain stempreparation.

INTRODUCTION

The cause of neurogenic hypertension is not fully understood.As classically demonstrated bLy Dittmar,1 the central nervous system(CNS) is essential to the maintenance of vascular tone and arterialblood pressure at adequate levels to permit optimal perfusion of vitalorgans such as the brain. Studies have described that sympatheticnerve discharge (SND) to the cardiovascular system exhibits rhyth-mic oscillations that are synchronized with the respiratory cycle.2–11

A part of this respiratory–sympathetic modulation is consequent tothe afferent information arising from the pulmonary stretch receptorsand baroreceptors.2,12 However, the respiratory oscillations in SNDpersist after vagotomy and decerebration,3,5,11,13,14 supporting theconcept of a central coupling of respiratory and sympathetic net-works. This coupling seems to be an important mechanism to:

(i) optimize minute ventilation and car-diac output to increase the efficiencyof oxygen uptake/perfusion at rest; and(ii) allow appropriate dynamic integrativecardiovascular and respiratory reflexresponses essential for maintaining home-

ostasis. An example is the integrative response to low oxygen (orhypoxia) involving increases in arterial blood pressure that are madepossible by the enhanced respiratory modulation of sympatheticnerve activity.In conscious animals, acute hypoxia produces bradycardia and

hypertension due to activation of the peripheral chemoreceptors.15

Under chronic conditions, hypoxia (both continuous and intermittent)appears to induce CNS plasticity of respiratory and sympathetic

‘‘cause ofneurogenichypertension’’

Correspondence: Daniel B Zoccal, Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, 14049-900, Ribeirao Preto,SP, Brazil. Email: [email protected]. This paper has been peer reviewed. Received 2 February 2009, revision 1 April 2009; accepted 2 April 2009.� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd doi: 10.1111/j.1440-1681.2009.05202.x

Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2009) 36, 1188–1196

Page 192: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

functions, leading to pathological abnormalities.11,16–20 Such cardior-espiratory dysfunctions can be observed after long-term exposure toepisodes of hypoxia interspersed with normoxic breathing, namelychronic intermittent hypoxia (CIH), as observed in the pathophysio-logical state of obstructive sleep apnoea (OSA). Indeed, it has beensuggested that there is a strong causal relationship between OSA/CIH and the development of hypertension in humans21,22 and

animals,11,20,23 which is attributed to anincrease in sympathetic outflow.11,20–23

In the present review, we explore theneural pathways underlying theentrainment between respiratory andsympathetic activities. Further, basedon recent data from CIH-treated rats,we discuss the possible involvement

of alterations in central respiratory–sympathetic coupling in thegeneration of neurogenic hypertension.

CENTRAL ENTRAINMENT OF RESPIRATORYAND SYMPATHETIC ACTIVITIES DURING

NORMAL BREATHING

Generation and modulation of sympathetic andrespiratory activities

Although sympathetic and respiratory functions are highly modulatedby peripheral afferent information, these functions are primarily gen-erated by the coordinated activity of different pontine–medullarynuclei (Fig. 1). It is important to note that most of the respiratory andsympathetic nuclei are intermingled and located in similar regions.Although several groups of neurons participate in the control of sym-pathetic and respiratory outflows, studies have suggested that theneuronal networks driving sympathetic and respiratory activities arelocated bilaterally in two columns within the ventrolateral medullaoblongata, which extend from the cervical spinal cord caudally to thefacial motor nucleus placed most rostrally (Fig. 1a).

With respect to the sympathetic nervous system, it has been demon-strated that a clusterof bulbospinal neurons located in the rostral ventro-lateral aspect of the medulla oblongata, the so-called rostralventrolateral medulla (RVLM; Fig. 1), which contains vesicular gluta-mate transporter-2 (i.e. glutamatergicneurons),24,25 is amajor source ofexcitation to the preganglionic sympathetic neurons in the intermedio-lateral columnof the spinal cord. This concept is supported by observa-tions that pharmacological inhibition of RVLM neurons produces alarge fall in sympathetic activity, and consequently in arterial pressure,to spinal levels.26–29 The activity of these RVLM neurons is highlymodulated by inputs arising from other nuclei, mainly from a group ofbarosensitive GABAergic interneurons of the caudal ventrolateralmedulla (CVLM),30 as shown inFig. 1b. These inhibitoryCVLMneu-rons receive direct projections from the intermediate (or subpostremal)region of the nucleus tractus solitarius (iNTS), located in the dorsome-dial medulla (Fig. 1a,b), which, in turn, receives arterial baroreceptorsinputs.31,32 In addition, peripheral arterial chemoreceptor afferentsestablish their first synapses in the commissural nucleus tractus solitar-ius (cNTS) that ‘directly’ activate RVLM neurons (Fig. 1a,b),33 evok-ing a potent sympathoexcitatory response.31,34 Other connections toRVLMneurons from, for example, the medullary Raphe nuclei, caudalpressor area, A5, parabrachial nucleus or forebrain (hypothalamus,amygdala, cortical regions), which all contribute to the generation ofsympathetic outflow, are not the focus of the present review and havebeen reviewed elsewhere.29 Therefore, the excitability of RVLM neu-rons clearlydependson thebalanceof excitatoryand inhibitory synapticdrives,35 althoughRVLMneuronsmayalsobecapableof intrinsicfiringbasedonpacemaker properties,36 at leastunder certain conditions.In relation to respiratory activity, it has been suggested that the coor-

dination of the respiratory phases (inspiration, postinspiration andexpiration)37 is, in general, consequent to the reciprocal inhibitoryconnections between inspiratory and expiratory brain stem neuronsleading to phasic drives to inspiratory and expiratory motoneurons atcranial and spinal levels (Fig. 1b).38–40 The respiratory neurons aregenerally classified according to their firing pattern (decrementing

List of abbreviations:

aug-E Augmenting expiratory neurons PBN Medial and lateral parabrachial nucleusaug-I Augmenting inspiratory neurons pFRG Parafacial respiratory groupBotC Botzinger complex post-I Postinspiratory neuronsCIH Chronic intermittent hypoxia Pre-BotC Pre-Botzinger complexcNTS Commissural nucleus tractus solitarius pre-I Pre-inspiratory neuronsCVLM Caudal ventrolateral medulla RTN Retrotrapezoid nucleuscVRC Caudal ventral respiratory column RVLM Rostral ventrolateral medullaDRC Dorsal respiratory column rVRC Rostral ventral respiratory columnearly I Early inspiratory neurons SND Sympathetic nerve dischargeiNTS Intermediate nucleus tractus solitarius VRC Ventral respiratory columnKF Kolliker-Fuse nucleus WHBP Working heart–brain stem preparationOSA Obstructive sleep apnoea

‘‘coordinatedactivity ofdifferent pontine–medullary nuclei’’

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

Central respiratory–sympathetic coupling 1189

Page 193: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

or augmenting) and phase relative to the respiratory cycle. The latterinclude, for example: pre-inspiratory (pre-I), early inspiratory (early I),augmenting inspiratory (aug-I), postinspiratory (post-I; also called decre-menting expiratory) and augmenting expiratory (aug-E) neurons.41

Experimental evidence indicates that the respiratory neurons locatedin the ventral respiratory column (VRC) play a dominant role in thegeneration of the breathing pattern.41,42 The VRC is divided intofour functionally distinct and rostrocaudally orientated subnuclei(Fig. 1) as follows: (i) the Botzinger complex (BotC), considered

the major source of expiratory activity and containing post-I and aug-E neurons; (ii) the pre-Botzinger complex (pre-BotC), a group of pre-Iand early I interneurons that are considered essential for generatinginspiratory activity; (iii) the rostral VRC (rVRC), containing the bul-bospinal premotor aug-I neurons; and (iv) the caudal VRC (cVRC),which houses a group of bulbospinal aug-E neurons that transmit exci-tatory drive to spinal motoneurons40,41,43,44 supplying respiratory tar-gets. In addition to the VRC, the pontine nuclei, which include theKolliker-Fuse (KF) and medial and lateral parabrachial nuclei (PBN),play an important role in the generation of the respiratory pattern andin the coordination of cranial and motor outflows45 by providing tonicand/or phasic drives to the VRC.40,46 Other important groups ofinspiratory and expiratory neurons are located in the iNTS and cNTSand constitute the dorsal respiratory column (DRC).41,47 Although itsfunction in the generation of respiratory rhythm is not yet completelyunderstood, the DRC is an important nucleus that modulates respira-tory activity at the medullary and pontine levels.41,48 For example, theDRC is essential for the afferent-evoked responses originating from

peripheral chemoreceptors, as wellas from pulmonary stretch recep-tors.41,48,49 Finally, a group of neuronslocated below the facial nucleus,named the retrotrapezoid nucleus(RTN), has been considered a key siteof central chemoreception that modu-lates the activity of VRC neurons in

response to alterations in CO2/H+ in the blood.50,51 In addition, pre-

vious in vivo and in vitro studies have postulated52 and recorded53

neurons of RTN region (named the parafacial respiratory group(pFRG)) that exhibit late expiratory discharge (Fig. 1).

A model of coupling between medullaryrespiratory and sympathetic neurons duringeupnoeic breathing

The concept of central coupling between respiratory and sympatheticneurons in the brain stem came from studies showing that decerebratedanimals with vagotomy exhibit respiratory modulation of SND.3

It has been suggested that part of this central respiratory–sympatheticcoupling occurs between respiratory and RVLM neurons(Fig. 1b).14,54–56 Electrophysiological studies have demonstrated thatpresympathetic RVLM neurons exhibit patterns of activities entrainedwith the respiratory cycle, such as decreased activity duringinspiration, peak of activity during inspiration and peak of activityduring late inspiration or postinspiration,5 which were abolishedafter pharmacological inhibition of the pre-Botzinger complex(Pre-BotC) and rVRC neurons.57 Conversely, Mandel andSchreihofer58 have documented that the barosensitive GABAergicCVLM neurons also exhibit respiratory related patterns of activities,

‘‘centralrespiratory–sympatheticcoupling’’

Fig. 1 (a) Schematic drawings of brain stem regions involved in the genera-tion and modulation of sympathetic and respiratory activities. (b) Model ofinteractions between respiratory and cardiovascular brain stem nuclei thatcoordinate respiratory modulation of sympathetic outflow. PBN, parabrachialnucleus; KF, Kolliker-Fuse nucleus; SO, superior olive; 7, facial nucleus;RTN/pFRG, retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group; NA, nucleusambigus; BotC, Botzinger complex; pre-BotC, pre-Botzinger complex; rVRG,rostral ventral respiratory group; RVLM, rostral ventrolateral medulla;CVLM, caudal ventrolateral medulla; LRt, lateral reticular nucleus; AP, areapostrema; iNTS, intermediate nucleus tractus solitarius; cNTS, commissuralnucleus tractus solitarius; DRC, dorsal respiratory column; IML, intermedio-lateral column of the spinal cord; E, expiratory neurons; I, inspiratory neurons;SYMP, sympathetic premotor neurons; GABA, GABAergic neurons.

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

1190 DB Zoccal et al.

Page 194: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

namely inspiratory peak, inspiratory depression, inspiratory peakwith postinspiratory depression and postinspiratory peak, some ofwhich can be inversely related to the pattern observed in RVLMneurons.5 This indicates that the GABAergic CVLM neurons are alsomodulated by the central respiratory neurons and may play a role inthe central respiratory–sympathetic coupling (Fig. 1b). These findingsstrongly suggest that the central coupling between the respiratory andsympathetic neurons occurs at the level of the VRC and RVLM.However, a recent study by Baekey et al.59 demonstrated thatfollowing transection between the pons and medulla to remove theKF, PBN and A5, the respiratory modulation of sympathetic activitywas eliminated. This supports the notion of a role for pontinerespiratory neurons in the respiratory–sympathetic coupling duringeupnoeic breathing.Although the pattern of respiratory–sympathetic coupling

varies according to species,13 the sympathetic nerve recorded7 orthe state of the animal/preparation,4,10,11 it is observed pre-dominantly as an increase in SND during the inspiration and/orpostinspiration/early expiration.9 Most of the experimental evidencedescribing respiratory–sympathetic coupling was obtained inanaesthetized, paralysed and artificially ventilated animals. In ourlaboratory, we have been using the working heart–brain stem pre-paration (WHBP),60 which is suitable for studies of the centralmechanisms underlying respiratory–sympathetic coupling.11,61 TheWHBP consists of a decerebrated, arterially perfused rat in situpreparation, as illustrated schematically in Fig. 2. This preparationpresents several interesting features: (i) it is free of the depressanteffects of anaesthesia; (ii) it exhibits a eupnoeic pattern of respira-tory motor activities and generates robust sympathetic activity;(iii) the respiratory–sympathetic coupling is markedly evident evenin the absence of mechanical/pulmonary afferent feedback (as thechest is open; the lungs, when present, are static and the perfusionpressure is non-pulsatile); (iv) the cardiorespiratory reflexes, suchas baro- and chemoreflexes, are preserved; and (v) it allowsthe simultaneous evaluation of several respiratory andcardiovascular parameters, such as heart rate and the activity ofthe vagus, phrenic, thoracic sympathetic and abdominal motornerves (Fig. 2). In the WHBP of Wistar rats, the pattern of sympa-thetic activity observed is a phasic increase during the inspiratoryphase, with a peak during late inspiration/early expiration,followed by a decrease during postinspiration and a tonic activityduring the end of expiration (Fig. 3b,c). This respiratory–sympa-thetic pattern is similar to that observed in vivo in the rat.9 Basedon the data detailing respiratory related patterns of neuronaldischarge of RVLM and CVLM neurons, we hypothesized that thecentral respiratory modulation of the thoracic sympatheticactivity observed in the WHBP is driven by excitation ofpresympathetic RVLM neurons during inspiration eitherdirectly5,62 or via inhibition of the GABAergic CVLM neurons.58

In addition, we postulate that there would be increasing inhibition

of RVLM neurons during the postinspiratory phase caused by theincrease in firing rate of the CVLM neurons at this respiratoryphase (Fig. 3a).58 Taking into account the connections betweenrespiratory and RVLM neurons, it is possible to speculate thatany changes in the excitability of the respiratory neuronal net-work and/or alterations in synaptic strength may contribute toincreased sympathetic outflow. Thus, our hypothesis is that apotential mechanism underpinning neurogenic hypertension isdue to an enhancement of respiratory–sympathetic coupling.

CHANGES IN RESPIRATORY–SYMPATHETICCOUPLING AND THE DEVELOPMENT OF

HYPERTENSION

Altered respiratory and sympathetic activity followingexposure to CIH

One of the most evident consequences following exposure to CIH isthe development of cardiovascular dysfunction, including systemichypertension.11,20–23 Rats submitted to CIH exhibited higher arterialpressure, which is prevented by denervation of the peripheral che-moreceptors,63 indicating that the CIH-induced hypertension is con-sequent to the intermittent activation of sensory feedback from thecarotid bodies. Studies from our laboratory demonstrated that thehypertension in rats submitted to CIH is dependent mainly on anincrease in sympathetic vasoconstrictor activity20 rather than ahormonal-mediated mechanism. In addition, rats submitted to CIHalso exhibited a greater sympathoexcitatory response to peripheral

chemoreceptor activation,16 suggest-ing a central sensitization of this com-ponent of the reflex. In addition tochanges in the sympathetic nervoussystem, rats submitted to CIH alsoexhibit significant changes in respira-tory function, such as an augmented

ventilatory response to hypoxia16,64,65 and long-term facilitation.64,65

These data support the notion that CIH induces alterations in brainstem–spinal circuitry involved in the control of both sympathetic andrespiratory motor activities.19,66–68

Strengthened respiratory–sympathetic couplingfollowing exposure to CIH

Based on studies showing that CIH can affect the central controlof respiratory and sympathetic systems (see above), we are testingthe hypothesis that CIH also enhances the coupling betweensympathetic and respiratory motor activity. The question beingaddressed is whether this coupling has any functional consequenceon arterial pressure levels. To this end, we use the WHBP

‘‘CIH inducesalterations inbrain stem’’

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

Central respiratory–sympathetic coupling 1191

Page 195: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

of juvenile rats (postnatal day (P) 19–21) after submitting the rats toCIH (6% O2 for 40 s every 9 min, 8 h/day) for 10 days. Thisprotocol in use in our laboratory11,16 produces hypertension and therats exhibit sympathetic overactivity despite the limited exposure toCIH.11 We observed that the pattern of thoracic sympatheticactivity of rats submitted to CIH showed a peak during late inspira-tion with a decline during postinspiration, which was similar to thatin control animals (Fig. 3b,c). However, rats submitted to CIHshowed an additional ramping pattern of sympathetic activity coinci-dent with the late expiratory phase that was not observed in controlanimals (Fig. 3b,c). In addition, CIH-treated rats also exhibited aunique late expiratory burst in abdominal motor activity that wasnever seen in control animals (Fig. 3b). Thus, rats submitted to CIHexhibit chronic enhanced/forced expiratory activity under controlconditions even when blood gases are normal. Interestingly, the lateexpiratory related sympathetic bursting was significantly correlated

with the abdominal enhanced expiratory activity (Fig. 3b). We pro-pose that in rats submitted to CIH there is an increase in the activityof BotC expiratory neurons that acts to provide supplementary excita-tory drive to RVLM neurons (Fig. 3a). How CIH increases the excit-ability of BotC aug-E neurons remains unclear. The hypothesis ofenhanced BotC aug-E neuronal activity is supported by results show-ing reduced postinspiratory activity in the cervical vagus nerve com-pared with controls (Fig. 3b). Because BotC aug-E and post-Ineurons are reciprocally connected by inhibitory pathways,69 theCIH-induced excitation of the aug-E neurons would be expected todepress post-I neuronal activity in the BotC, which may account forthe reduced vagal postinspiratory activity found in rats submitted toCIH (Fig. 3a). Therefore, our findings suggest that juvenile ratssubmitted to CIH exhibit a different pattern of respiratory activity, withreduced postinspiratory and enhanced late expiratory activities. Wepostulate that the latter drives, at least in part, the increased sympathetic

Fig. 2 Schema of the working heart–brain stem preparation (WHBP), as described previously.11 Briefly, the preparation consists of a hemisectioned (belowthe diaphragm) and decerebrated rat that is perfused arterially through the abdominal aorta. The perfusion solution consists of a modified Ringer’s solutionthat is carbogen gassed (95% O2/5% CO2), warmed (31–32�C) and free of bubbles and debris (as a result of the bubble traps and a filter in the perfusionsystem). The perfusate enters the preparation via a double-lumen cannula, allowing the simultaneous recording of aortic perfusion pressure. After passingthrough the preparation, the perfusate is recycled to the reservoir for regassing. The WHBP allows recordings of activities from the cervical vagus nerve(cVN), the phrenic nerve (PN), the thoracic sympathetic nerve (tSN) at the T8–T12 level and the abdominal motor nerve (Abd) at thoracic–lumbar level. Allthese activities are recorded using bipolar glass suction electrodes, with the exception of PN activity, which is recorded using a unipolar electrode, whichallows a electrocardiogram (ECG) to be recorded.

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

1192 DB Zoccal et al.

Page 196: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

activity observed in rats submitted to CIH. The neurotransmittersystems that may underpin this enhanced drive remain unknown, butcandidates such as ATP,70,71 serotonin65 or reactive oxygen species72,73

may all be involved. The neurochemical and cellular mechanismsunderlying the enhanced respiratory–sympathetic coupling in ratssubmitted to CIH require further investigation.

How unique is the augmented centralrespiratory–sympathetic coupling in hypertensiveanimal models?

In addition to CIH, other experimental models of hypertension exhibitalterations in central respiratory–sympathetic coupling. In a recent

Fig. 3 (a) Model of central coupling between respiratory and sympathetic neurons in control (left panels) and rats submitted to chronic intermittent hypoxia(CIH; right panels). Red arrows indicate excitatory connections; blue arrows indicate inhibitory connections. The full description of this schema is presented in thetext. BotC, Botzinger complex; pre-BotC, pre-Botzinger complex; rVRG, rostral ventral respiratory group; RVLM, rostral ventrolateral medulla; CVLM,caudal ventrolateral medulla; aug-E, augmenting expiratory neurons; post-I, postinspiratory neurons; insp, inspiratory neurons; symp: presympathetic neurons;GABA, GABAergic neurons; C, cervical levels in the spinal cord; T/L, thoracic and lumbar levels in the spinal cord; IML, intermediolateral columnof the spinal cord. (b) Recordings of the activities of the cervical vagus (cVN), abdominal motor (Abd), thoracic sympathetic (tSN) and phrenic nerves (PN)of control rats and rats submitted to CIH. The grey lines represent the initiation of phrenic bursts. Note the reduction in the postinspiratory component of thecVN (arrows) and novel peak in Abd (asterisks; prior to the phrenic burst) in rats submitted to CIH compared with controls. (c) Phrenic-triggered average(10 sweeps) of tSN of one control and one CIH preparation indicating a higher level of tSN in the rats submitted to CIH during the late expiratory (late E;red arrow), but not the inspiratory (I), postinspiratory (PI) or mid-expiratory (Mid-E), phases of the respiratory cycle. The percentage scale of the tSN wasdetermined by the maximal (inspiratory peak) and the minimal (noise) of sympathetic activity. For details, see Zoccal et al.11

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

Central respiratory–sympathetic coupling 1193

Page 197: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

study by Simms et al.,61 it was verified that in juvenile spontaneouslyhypertensive rats at an age prior to the development of hypertensionthere was already an amplified respiratory modulation of sympatheticactivity. This was seen as higher levels during inspiration and a lateexpiratory related discharge compared with control. Simms et al.61

also suggested that the mechanisms underlying the entrainmentbetween respiratory and sympathetic neurons may be partly responsi-ble for the development of hypertension in this rat model. Therefore,considering these data, we believe that the hypothesis that changes inthe entrainment between respiratory and sympathetic neurons cancontribute to the development of neurogenic hypertension seems tobe consistent and therefore justifies further investigation to elucidatenovel and important CNS mechanisms.

Clinical implications for OSA in humans stemmingfrom enhanced respiratory–sympathetic couplingin rats submitted to CIH

The finding that CIH induced an enhanced respiratory–sympatheticcoupling in rats11 has the potential for major pathophysiological con-sequences, such as elevated arterial pressure and end-organ damage.Although we acknowledge that the rodent model of CIH does notreproduce the pathophysiology of OSA in humans, the enhancedsympathetic activity in these patients may include an additionalrespiratory modulation. Clearly, OSA in humans is complex andother comorbidities, such as obesity, metabolic syndrome and dia-betes,74 can all contribute to the cardiovascular dysfunction. How-

ever, it is possible that CIHcould be the trigger stimulusfor the hypertension in OSApatients via sympathetic over-activity. Indeed, if our hypoth-esis that the augmented centralcoupling between respiratory

and sympathetic activities is responsible, in part, for the increasedsympathetic activity in OSA patients is correct, our CIH rat data maypresent new insights about this disease offering possibilities of addi-tional effective therapeutic strategies.

REFERENCES

1. Dittmar C. Uber die Lage des sogenannten Gefasscentrums in derMedulla oblongata. Ber. Verh. Sachs Akad. Wiss. Leipzig Math. Phys.Kl. 1873; 25: 449–69.

2. Adrian ED, Bronk DW, Phillips G. Discharges in mammalian sympa-thetic nerves. J. Physiol. 1932; 74: 115–33.

3. Barman SM, Gebber GL. Sympathetic nerve rhythm of brain stemorigin. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 1980; 239: R42–7.

4. Gilbey MP, Numao Y, Spyer KM. Discharge patterns of cervicalsympathetic preganglionic neurones related to central respiratory drivein the rat. J. Physiol. 1986; 378: 253–65.

5. Haselton JR, Guyenet PG. Central respiratory modulation of medullarysympathoexcitatory neurons in rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp.Physiol. 1989; 256: R739–50.

6. Czyzyk-Krzeska MF, Trzebski A. Respiratory-related discharge patternof sympathetic nerve activity in the spontaneously hypertensive rat.J. Physiol. 1990; 426: 355–68.

7. Janig W, Habler H-J. Neurophysiological analysis of target-related sym-pathetic pathways: From animal to human: Similarities and differences.Acta Physiol. Scand. 2003; 177: 255–74.

8. Pilowsky P. Good vibrations? Respiratory rhythms in the centralcontrol of blood pressure. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1995; 22:594–604.

9. Malpas S. The rhythmicity of sympathetic nerve activity. Prog.Neurobiol. 1998; 56: 65–96.

10. Dick TE, Hsieh Y-H, Morrison S, Coles SK, Prabhakar N. Entrainmentpattern between sympathetic and phrenic nerve activities in theSprague-Dawley rat: Hypoxia-evoked sympathetic activity duringexpiration. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2004; 286:R1121–8.

11. Zoccal DB, Simms AE, Bonagamba LGH et al. Increased sympatheticoutflow in juvenile rats, submitted to chronic intermittent hypoxiacorrelates with enhanced expiratory activity. J. Physiol. 2008; 586:3253–65.

12. Bernardi L, Porta C, Gabutti A, Spiazza L, Sleight P. Modulatory effectsof respiration. Auton. Neurosci. 2001; 90: 47–56.

13. Habler H-J, Janig W, Michaelis M. Respiratory modulation in the activ-ity of sympathetic neurones. Prog. Neurobiol. 1994; 43: 567–606.

14. Zhong S, Zhou SY, Gebber GL, Barman SM. Coupled oscillatorsaccount for the slow rhythms in sympathetic nerve discharge and phre-nic nerve activity. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 1997;272: R1314–24.

15. Machado BH. Neurotransmission of the cardiovascular reflexes in thenucleus tractus solitarii of awake rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 940:179–96.

16. Braga VA, Soriano RN, Machado BH. Sympathoexcitatory response toperipheral chemoreflex activation is enhanced in juvenile rats exposed tochronic intermittent hypoxia. Exp. Physiol. 2006; 91: 1025–31.

17. Tolstykh G, Belugin S, Mifflin S. Responses to GABA(A) receptor acti-vation are altered in NTS neurons isolated from chronic hypoxic rats.Brain Res. 2004; 1006: 107–13.

18. Pena F, Ramirez JM. Hypoxia-induced changes in neuronal networkproperties.Mol. Neurobiol. 2005; 32: 251–83.

19. Kline DD, Ramirez-Navarro A, Kunze DL. Adaptive depression insynaptic transmission in the nucleus of the solitary tract after in vivochronic intermittent hypoxia: Evidence for homeostatic plasticity.J. Neurosci. 2007; 27: 4663–73.

20. Zoccal DB, Bonagamba LG, Oliveira FR, Antunes-Rodrigues J,Machado BH. Increased sympathetic activity in rats, submitted tochronic intermittent hypoxia. Exp. Physiol. 2007; 92: 79–85.

21. Somers VK, Dyken ME, Clary MP, Abboud FM. Sympathetic neuralmechanisms in obstructive sleep apnea. J. Clin. Invest. 1995; 96: 1897–904.

22. Leuenberger UA, Brubaker D, Quraishi S, Hogeman CS, ImadojemuVA, Gray KS. Effects of intermittent hypoxia on sympathetic activityand blood pressure in humans. Auton. Neurosci. 2005; 121: 87–93.

23. Fletcher EC. Physiological consequences of intermittent hypoxia:Systemic blood pressure. J. Appl. Physiol. 2001; 90: 1600–5.

‘‘potential for majorpathophysiologicalconsequences’’

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

1194 DB Zoccal et al.

Page 198: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

24. Ross CA, Ruggiero DA, Park DH et al. Tonic vasomotor control by therostral ventrolateral medulla: Effect of electrical or chemical stimulationof the area containing C1 adrenaline neurons on arterial pressure, heartrate and plasma catecholamines and vasopressin. J. Neurosci. 1984; 4:474–94.

25. Stornetta RL, Sevigny CP, Schreihofer AM, Rosin DL, Guyenet PG.Vesicular glutamate transporter DNPI/VGLUT2 is expressed by both C1adrenergic and nonaminergic presympathetic vasomotor neurons of therat medulla. J. Comp. Neurol. 2002; 444: 207–20.

26. Benarroch EE, Granata AR, Ruggiero DA, Park DH, Reis DJ. Neuronsof C1 area mediate cardiovascular responses initiated from ventralmedullary surface. Am. J. Physiol. 1986; 250: R932–45.

27. Dampney RA, Goodchild AK, McAllen RM. Vasomotor control by sub-retrofacial neurones in the rostral ventrolateral medulla. Can. J. Physiol.Pharmacol. 1987; 65: 1572–9.

28. Sved AF, Gordon FJ. Amino acids as central neurotransmitters inthe baroreceptor reflex pathway. News Physiol. Sci. 1994; 9: 243–6.

29. Guyenet PG. The sympathetic control of blood pressure. Nat. Neurosci.2006; 7: 335–46.

30. Schreihofer AM, Guyenet PG. Baro-activated neurons with pulse-modu-lated activity in rat caudal ventrolateral medulla express GAD67 mRNA.J. Neurophysiol. 2003; 89: 1265–77.

31. Spyer KM. Modulation of NTS function by multiple descending inputs:An overview. In: Barraco R (ed.). Nucleus of the Solitary Tract. CRCPress, Boca Raton. 1994; 161–7.

32. Bailey TW, Hermes SM, Andresen MC, Aicher SA. Cranial visceralafferent pathways through the nucleus of the solitary tract to caudal ven-trolateral medulla or paraventricular hypothalamus: Target-specificsynaptic reliability and convergence patterns. J. Neurosci. 2006; 26:11 893–902.

33. Koshiya N, Guyenet PG. NTS neurons with carotid chemoreceptorinputs arborize in the rostral ventrolateral medulla. Am. J. Physiol. 1996;270: R1273–8.

34. Accorsi-Mendonca D, Bonagamba LG, Leao RM, Machado BH. Areglutamate and ATP co-transmitters of the peripheral chemoreflex in thenucleus tractus solitarius? Exp. Physiol. 2009; 94: 38–45.

35. Lipski J, Kanjhan R, Kruszewska B, Rong W. Properties of presympa-thetic neurones in the rostral ventrolateral medulla in the rat: An intracel-lular study ‘in vivo’. J. Physiol. 1996; 490: 729–44.

36. Sun MK, Young BS, Hackett JT, Guyenet PG. Reticulospinal pacemakerneurons of the rat rostral ventrolateral medulla with putative sym-pathoexcitatory function: An intracellular study in vitro. Brain Res.1988; 442: 229–39.

37. Richter DW. Generation and maintenance of the respiratory rhythm.J. Exp. Biol. 1982; 100: 93–107.

38. Richter DW. Neural regulation of respiration: Rhythmogenesis andafferent control. In: Gregor R (ed.). Comprehensive Human Physiology,Vol. II. Springer-Verlag, Berlin. 1996; 2079–95.

39. Richter DW, Spyer KM. Studying rhythmogenesis of breathing: Compar-ison of in vitro and in vivomodels. Trends Neurosci. 2001; 24: 464–72.

40. Smith JC, Abdala APL, Koizumi H, Rybak IA, Paton JFR. Spatial andfunctional architecture of the mammalian brainstem respiratory network:A hierarchy of three oscillatory mechanisms. J. Neurophysiol. 2007; 98:3370–87.

41. Bianchi AL, Denavit-Saubie M, Champagnat J. Central control ofbreathing in mammals: Neuronal circuitry, membrane properties, andneurotransmiters. Physiol. Rev. 1995; 75: 1–45.

42. Feldman JL, Del Negro C. Looking for inspiration: New perspectives onrespiratory rhythm. Nat. Neurosci. 2006; 7: 232–42.

43. Smith JC, Ellenberger HH, Ballanyi K, Richter DW, Feldman JL. Pre-Botzinger complex: A brainstem region that may generate respiratoryrhythm in mammals. Science 1991; 254: 726–9.

44. Ezure K, Tanaka I, Saito Y. Brainstem and spinal projections ofaugmenting expiratory neurons in the rat. Neurosci. Res. 2003; 45:41–51.

45. Rybak IA, Shevtsova NA, Paton JF et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respir. Physiol. Neurobiol. 2004; 143:307–19.

46. Dutschmann M, Morschel M, Reuter J et al. Postnatal emergenceof synaptic plasticity associated with dynamic adaptation of therespiratory motor pattern. Respir. Physiol. Neurobiol. 2008; 164:72–9.

47. Subramanian HH, Chow CM, Balnave RJ. Identification of differenttypes of respiratory neurons in the dorsal brainstem nucleus tractus soli-tarius of the rat. Brain Res. 2007; 1141: 119–32.

48. Bonham AC, McCrimmon DR. Neurons in a discrete region of thenucleus tractus solitarius are required for the Hering–Breuer reflex in rat.J. Physiol. 1990; 427: 261–80.

49. Ezure K, Tanaka I, Saito Y, Otake K. Axonal projections of pulmonaryslowly adapting receptor relay neurons in the rat. J. Comp. Neurol.2002; 446: 81–94.

50. Guyenet PG, Stornetta RL, Bayliss DA. Retrotrapezoid nucleus and cen-tral chemoreception. J. Physiol. 2008; 586: 2043–8.

51. Li A, Zhou S, Nattie E. Simultaneous inhibition of caudal medullaryraphe and retrotrapezoid nucleus decreases breathing and the CO2

response in conscious rats. J. Physiol. 2006; 577: 307–18.52. Janczewski WA, Feldman JL. Distinct rhythm generators for inspiration

and expiration in the juvenile rat. J. Physiol. 2006; 570: 407–20.53. Onimaru H, Kumagawa Y, Homma I. Respiration-related rhythmic

activity in the rostral medulla of newborn rats. J. Neurophysiol. 2006;96: 55–61.

54. McAllen RM. Central respiratory modulation of subretrofacial bulbosp-inal neurones in the cat. J. Physiol. 1987; 388: 533–45.

55. Guyenet PG, Darnall RA, Riley TA. Rostral ventrolateral medulla andsympathorespiratory integration in rats. Am. J. Physiol. 1990; 28:R1063–74.

56. Habler H-J, Bartsch T, Janig W. Two distinct mechanisms generate therespiratory modulation in fibre activity of the rat cervical sympathetictrunk. J. Auton. Nerv. Syst. 1996; 61: 116–22.

57. Koshiya N, Guyenet PG. Tonic sympathetic chemoreflex after blockadeof respiratory rhythmogenesis in the rat. J. Physiol. 1996; 491: 859–69.

58. Mandel DA, Schreihofer AM. Central respiratory modulation of baro-sensitive neurones in rat caudal ventrolateral medulla. J. Physiol. 2006;572: 881–96.

59. Baekey DM, Dick TE, Paton JFR. Pontomedullary transection attenu-ates central respiratory modulation of sympathetic discharge, heart rateand the baroreceptor reflex in the in situ rat preparation. Exp. Physiol.2008; 93: 803–16.

60. Paton JFR. Aworking heart–brainstem preparation of the mouse. J. Neu-rosci. Methods 1996; 65: 63–8.

61. Simms AE, Paton JFR, Pickering AE, Allen AM. Amplified respira-tory–sympathetic coupling in the spontaneously hypertensive rat: Doesit contribute to hypertension? J. Physiol. 2008; 587: 597–610.

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

Central respiratory–sympathetic coupling 1195

Page 199: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

62. Miyawaki T, Pilowsky P, Sun Q-J et al. Central inspiration increases bar-osensitivity of neurons in rat rostral ventrolateral medulla. Am. J. Phy-siol. 1995; 268: R909–18.

63. Fletcher EC, Lesske J, Behm R, Miller CC, Stauss H, Unger T. Carotidchemoreceptors, systemic blood pressure, and chronic episodic hypoxiamimicking sleep apnea. J. Appl. Physiol. 1992; 72: 1978–84.

64. McGuire M, Zhang Y, White DP, Ling L. Chronic intermittent hypoxiaenhances ventilatory long-term facilitation in awake rats. J. Appl. Phy-siol. 2003; 95: 1499–508.

65. Ling L, Fuller DD, Bach KB, Kinkead R, Olson EB, Mitchell GS.Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in thecentral neural control of breathing. J. Neurosci. 2001; 21: 5381–8.

66. Greenberg HE, Sica AL, Scharf SM, Ruggiero DA. Expression of c-fosin the rat brainstem after chronic intermittent hypoxia. Brain Res. 1999;816: 638–45.

67. Reeves SR, Gozal E, Guo SZ et al. Effect of long-term intermittent andsustained hypoxia on hypoxic ventilatory and metabolic responses in theadult rat. J. Appl. Physiol. 2003; 95: 1767–74.

68. Reeves SR, Guo SZ, Brittian KR, Row BW, Gozal D. Anatomicalchanges in selected cardio-respiratory brainstem nuclei following early

post-natal chronic intermittent hypoxia. Neurosci. Lett. 2006; 402: 233–7.

69. Shen LL, Li YM, Duffin J. Inhibitory connections among rostral medul-lary expiratory neurons detected with cross-correlation in the decerebraterat. Pflugers Arch. 2003; 446: 365–72.

70. Thomas T, Ralevic V, Bardini M, Burnstock G, Spyer KM. Evidence forthe involvement of purinergic signalling in the control of respiration.Neuroscience 2001; 107: 481–90.

71. Gourine AV, Llaudet E, Dale N, Spyer KM. Release of ATP in the ven-tral medulla during hypoxia in rats: Role in hypoxic ventilatoryresponse. J. Neurosci. 2005; 25: 1211–18.

72. Prabhakar NR, Kumar GK, Nanduri J, Semenza GL. Ros signaling insystemic and cellular responses to chronic intermittent hypoxia. Anti-oxid. Redox Signal. 2007; 9: 1397–403.

73. Macfarlane PM, Wilkerson JE, Lovett-Barr MR, Mitchell GS. Reactiveoxygen species and respiratory plasticity following intermittent hypoxia.Respir. Physiol. Neurobiol. 2008; 164: 263–71.

74. Kiely JL, McNicholas WT. Cardiovascular risk factors in patientswith obstructive sleep apnoea syndrome. Eur. Respir. J. 2000; 16:128–33.

� 2009 The AuthorsJournal compilation � 2009 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

1196 DB Zoccal et al.

Page 200: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

972 Exp Physiol 94.9 pp 972–983

Experimental Physiology – Research Paper

Sympathetic-mediated hypertension of awake juvenilerats submitted to chronic intermittent hypoxia is notlinked to baroreflex dysfunction

Daniel B. Zoccal1, Leni G. H. Bonagamba1, Julian F. R. Paton2 and Benedito H. Machado1

1Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil2Department of Physiology & Pharmacology, Bristol Heart Institute, School of Medical Sciences, University of Bristol, Bristol BS8 1TD, UK

In the present study, we evaluated the mechanisms underpinning the hypertension observed

in freely moving juvenile rats submitted to chronic intermittent hypoxia (CIH). Male juvenile

Wistar rats (20–21 days old) were submitted to CIH (6% O2 for 40 s every 9 min, 8 h day−1) for

10 days while control rats were maintained in normoxia. Prior to CIH, baseline systolic arterial

pressure (SAP), measured indirectly, was similar between groups (86 ± 1 versus 87 ± 1 mmHg).

After exposure to CIH, SAP recorded directly was higher in the CIH (n = 28) than in the control

group (n = 29; 131 ± 3 versus 115 ± 2 mmHg, P < 0.05). This higher SAP of CIH rats presented

an augmented power of oscillatory components at low (10.05 ± 0.91 versus 5.02 ± 0.63 mmHg2,

P < 0.05) and high (respiratory-related) frequencies (12.42 ± 2.46 versus 3.28 ± 0.61 mmHg2,

P < 0.05) in comparison with control animals. In addition, rats exposed to CIH also exhibited

an increased cardiac baroreflex gain (−3.11 ± 0.08 versus −2.1 ± 0.10 beats min−1 mmHg−1,

P < 0.0001), associated with a shift to the right of the operating point, in comparison

with control rats. Administration of hexamethonium (ganglionic blocker, i.v.), injected

after losartan (angiotensin II type 1 receptor antagonist) and [β-mercapto-β,β-cyclopenta-

methylenepropionyl1, O-Me-Tyr2, Arg8]-vasopressin (vasopressin type 1a receptor antagonist),

produced a larger depressor response in the CIH (n = 8) than in the control group (n = 9;

−49 ± 2 versus −39 ± 2 mmHg, P < 0.05). Fifteen days after the cessation of exposure to CIH,

the mean arterial pressure of CIH rats returned to normal levels. The data indicate that the

sympathetic-mediated hypertension observed in conscious juvenile rats exposed to CIH is not

secondary to a reduction in cardiac baroreflex gain and exhibits a higher respiratory modulation,

indicating that an enhanced respiratory–sympathetic coupling seems to be the major factor

contributing to hypertension in rats exposed to CIH.

(Received 15 April 2009; accepted after revision 1 July 2009; first published online 3 July 2009)

Corresponding author B. H. Machado: Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of

Sao Paulo, 14049-900, Ribeirao Preto, SP, Brazil. Email: [email protected]

One of the major problems faced by patients withobstructive sleep apnoea syndrome is the long-termexposure to repetitive episodes of hypoxaemia andreoxygenation (Somers et al. 1995; Caples et al.2005), which characterizes the state of chronicintermittent hypoxia (CIH). Chronic intermittent hypoxiais associated with a frequent activation of the peripheralchemoreceptors and, in turn, the sympathetic nervoussystem, which over time have a cumulative effect, leadingto substantial cardiovascular dysfunctions (Fletcher et al.1992; Fletcher, 2001; Caples et al. 2005; Allahdadi et al.

2005). The most evident pathology is the developmentof arterial hypertension (Hla et al. 1994; Somers et al.1995; Narkiewicz et al. 1998; Fletcher, 2001; Zoccal et al.2007a,b). Studies from our laboratory demonstrated thatadult rats exposed to CIH for 5 weeks exhibited raisedlevels of arterial pressure that were associated with bothaugmented sympathetic activity (Zoccal et al. 2007b)and increased plasma corticosterone levels (Zoccal et al.2007a). However, the targets and the mechanisms by whichCIH affects the autonomic control of arterial pressure arenot completely understood.

DOI: 10.1113/expphysiol.2009.048306 C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 201: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 973

There is evidence that exposure to CIH evokessignificant alterations at different levels of regulation ofboth the cardiovascular and the respiratory system in adultrats. These include enhanced sensitivity of the peripheralchemoreceptors (Peng & Prabhakar, 2004; Pawar et al.2008), functional changes in the neurochemistry of brain-stem structures involved in the generation and modulationof autonomic activity (Greenberg et al. 1999b; Reeves &Gozal, 2006; Reeves et al. 2006; Yan et al. 2008), enhancedlong-term facilitation of respiratory motor activity (Baker& Mitchell, 2000; McGuire et al. 2003) and augmentationof the sympathetic and ventilatory responses to hypoxia(Greenberg et al. 1999a; Ling et al. 2001). Consideringthat the central respiratory rhythm generator stronglymodulates the activity of sympathetic nerves regulatingcardiovascular function (Gilbey et al. 1984, 1986; Haselton& Guyenet, 1989; Habler et al. 1994; Janig & Habler,2003; Mandel & Schreihofer, 2006; Zoccal et al. 2008), anyrespiratory-related alterations observed after exposure toCIH may also contribute to mechanisms underlying theCIH-induced sympatho-activation and hypertension inadult rats. In this regard, we demonstrated in a studyusing the in situ working heart–brainstem preparationthat juvenile rats (postnatal day 19–21) submitted to10 days of CIH exhibited higher levels of sympatheticactivity that was significantly correlated with an enhancedaugmenting expiratory activity (as recorded from theabdominal motor nerve) that is not normally present(Zoccal et al. 2008). These data suggest that CIH altersthe pattern of respiratory rhythm generation as well as itscentral modulation of sympathetic outflow (Zoccal et al.2008). What remains unclear is whether the respiratory-related sympathetic overactivity was either in part orentirely responsible for the hypertension observed in theseyoung animals submitted to CIH.

Another important mechanism that has beenconsidered in the pathogenesis of hypertension isthe impairment of baroreflex function (Minami &Head, 1993; Vitela et al. 2005). Studies performed inanaesthetized adult rats (Gu et al. 2007) or mice (Linet al. 2007) submitted to CIH suggest that the CIH-induced hypertension is associated with a reduction inbaroreflex control of heart rate. However, both studieswere performed after 1–3 months of CIH, and nostudy has evaluated the baroreflex gain in juvenile ratsexposed to CIH for only 10 days. Accordingly, in thepresent study we aimed to characterize the potentialmechanisms underpinning the hypertension observed infreely moving juvenile rats submitted to CIH for 10 days.To this end, we evaluated the following: (i) whethersympathetic overactivity is the main factor maintainingthe hypertension; (ii) the respiratory modulation ofcardiovascular function; (iii) the cardiac baroreflex gain;and (iv) how long the hypertension in juvenile rats persistsafter the cessation of the CIH stimulus.

Methods

Animals

In all experimental protocols, 156 juvenile male Wistar rats(19–21 days old) were used, divided in two experimentalgroups: rats exposed to chronic intermittent hypoxia(CIH group, n = 80) and rats maintained under normoxicconditions (control group, n = 76). These rats wereobtained from the Animal Care facility of the Universityof Sao Paulo at Ribeirao Preto, Brazil. All experimentalapproaches followed the Guide for the Care and Useof Laboratory Animals published by the US NationalInstitutes of Health (NIH publication no. 85-23, revised1996) and were approved by the Ethical Committeeon Animal Experimentation of the School of Medicineof Ribeirao Preto, University of Sao Paulo (protocol019/2006).

Chronic intermittent hypoxia

Both CIH and control rats were housed in collective cagesand maintained inside Plexiglass chambers (volume of210 l) equipped with gas injectors as well as sensors ofO2, CO2, humidity and temperature. The CIH group wasexposed to a protocol of 5 min of normoxia (fraction ofinspired O2, F iO2

, of 20.8%) followed by a 4 min period ofpure N2 injection to reduce the F iO2

from 20.8 to 6%, whichwas maintained for 30–40 s. After this hypoxic period, pureO2 was injected into the chamber to return the F iO2

back to20.8%. This experimental protocol is illustrated in Fig. 1.This 9 min cycle was repeated for 8 h a day (from 09.30to 17.30 h) for 10 days. During the remaining 16 h, theanimals were maintained at a F iO2

of 20.8%. The injectionof N2 and O2 (White Martins, Sertaozinho, Brazil) intothe chamber was regulated by a solenoid valve operated bya computerized system (Oxycycler, Biospherix, Redfield,USA). In an identical chamber in the same room, thecontrol group of rats was exposed to a F iO2

of 20.8%, 24 ha day for 10 days. The control rats were also exposed toa similar valve noise due to the frequent injection of O2

to maintain the F iO2at 20.8%. In both CIH and control

chambers, the gas injections were performed at the upperlevel of the chamber in order to avoid direct jets of gasimpacting on the animals, which could cause stress.

Measurements of arterial pressure priorto CIH exposure

One day before starting the CIH and control protocols,systolic arterial pressure (SAP) was indirectly measuredby the tail-cuff method in CIH (n = 28) and control rats(n = 29). To reduce the stress that this method may cause,rats were conditioned to a specific restrainer apparatus(IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA), which

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 202: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

974 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 94.9 pp 972–983

was kept in a warming chamber (31–32◦C, model 306,IITC Life Science). Rats were allowed at least 10 minfor stabilization prior to measurement. An integratedsensor-cuff occluder (model 31, IITC Life Science) wasplaced on the tail and operated to stop arterial pulsationon inflation and to detect the return of pulsations ondeflation, permitting the measurement of SAP.

Recordings of baseline arterial pressure and heartrate after exposure to CIH

At the end of the experimental protocol, the ratsfrom control and CIH groups were anaesthetized withtribromoethanol (250 mg kg−1, I.P.; Aldrich, Milwaukee,WI, USA), and a catheter was inserted into the abdominalaorta through the femoral artery (PE-10 connected to PE-50 tubing, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA), for arterialpressure measurement. Another catheter was placed intothe femoral vein for systemic administration of drugs. Thecatheters were tunnelled subcutaneously and exteriorizedthrough the back of the neck to prevent them frombeing chewed. The rats were then housed singly andtheir respiratory movements were monitored until theyregained consciousness. After 24 h, when the rats hadadapted to the environment of the recording room, thearterial catheter was connected to a pressure transducer

Figure 1. Variations of fraction of inspired oxygen (% Oxygen) in the chronic intermittent hypoxiachamber during 2 episodes of hypoxiaThe bars above the traces indicate the time of injections of nitrogen (N2, black bars) or oxygen (O2, grey bars) intothe chamber. In the remaining time of the cycle (not indicated with bars) small fractions of O2 or N2 were flushedin order to maintain the oxygen at 20.8%. At the nadir of the cycle (peak of hypoxic stimulus) the oxygen wasmaintained at 6% for 30–40 s, as illustrated in the inset of the figure.

(MLT0380, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia)and, in turn, to an amplifier (Bridge Amp, ML221,ADInstruments). The pulsatile arterial pressure signalswere acquired by a data acquisition system (PowerLab4/25, ML845, ADInstruments) and recorded on a harddrive of a computer using appropriate software (ChartPro, ADInstruments). The values of diastolic, systolic andmean arterial pressures (MAP) and heart rate (HR) werethen determined from the signals of pulsatile arterialpressure. The cardiovascular parameters were recorded inconscious, freely moving rats in normoxic conditions forat least 30 min, at a sampling rate of 1 kHz.

Evolution of high blood pressure after cessationof CIH

Following the recordings of baseline parameters onthe eleventh day after the beginning and 1 day afterthe cessation of CIH, specific groups of CIH (n = 10)and control animals (n = 19) were anaesthetized withtribromoethanol (250 mg kg−1, I.P.; Aldrich), and thearterial catheter was removed. After recovery fromanaesthesia, the animals were group housed with waterand food ad libitum, maintained in the animal house ofthe Department of Physiology at the School of Medicine ofRibeirao Preto for 15 days and then submitted to surgery

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 203: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 975

to implant a catheter into the contralateral femoral arteryfor the measurement of arterial pressure and heart rate, asdescribed in the previous subsection.

Systolic arterial pressure and pulse intervalvariabilities

From baseline recordings, the arterial pressure of control(n = 9) and CIH rats (n = 8) was processed (Chart Pro,ADInstruments), and beat-by-beat time series of SAP andpulse interval (PI) were extracted. The overall variabilitiesof these series were calculated in the time domain andexpressed as the variance (σ2) of the entire time series.Fluctuations in SAP and PI were also assessed in thefrequency domain using autoregressive spectral analysis(software kindly provided by Dr Alberto Porta, Universityof Milan, Italy to Dr Rubens Fazan-Jr, University of SaoPaulo, Brazil), as described elsewhere (Malliani et al. 1991).Briefly, the PI and SAP series were divided into segments of256 beats with 50% overlap. The spectra of each segmentwere calculated via the Levinson–Durbin recursion, andthe order of the model was chosen according to Akaike’scriterion (for details, see Malliani et al. 1991). The powerof the obtained oscillatory components was quantified intwo frequency bands: low frequency (LF, 0.20–0.75 Hz)and high frequency (HF, 0.75–3.0 Hz). Oscillations lowerthan 0.20 Hz were not quantified.

Analysis of cardiac baroreflex

Two methods were employed to analyse the cardiacbaroreflex function of control and CIH animals, as follows:(i) the sequence analysis technique; and (ii) analysisof sigmoidal baroreflex curve. Regarding the sequencemethod, the spontaneous baroreflex sensitivity (SBS) wascalculated from the baseline pulsatile arterial pressureof control (n = 18) and CIH rats (n = 17) using thefreely available computer software, HemoLab version 5.9(http://haraldstauss.com/HemoLab/HemoLab.php) thatautomatically detected spontaneously occurring rampsof progressive increases and decreases of four or morevalues of SAP that paralleled changes in PI (3 beats ofdelay) with a linear correlation higher than 0.8. Theramp sequences were defined as up sequences when SAPincreases were associated with PI lengthening or as downsequences when SAP decreases were associated with PIshortening, and the SBS was assessed by the slope (inms mmHg−1) of the linear regression between the SAPand the subsequent PI. This analysis was used to evaluatethe cardiac baroreflex function over the physiologicalrange of fluctuations in arterial pressure, without anypharmacological manipulations. Considering that thesequence analyses techniques are restricted to a smallrange of arterial pressure variability, we also analysed

the reflex HR variation induced by vasoactive drugs inorder to verify the baroreflex gain over a full rangeof arterial pressure changes. To this end, intravenousinfusions of sodium nitroprusside (SNP, 50 μg ml−1,Sigma, St Louis, MO, USA) or phenylephrine (Phe,20 μg ml−1, Sigma) were performed in distinct groups ofCIH (n = 34) and control rats (n = 19) using an infusionpump (0.12–0.34 ml min−1, Sage M361, Sage Instruments,Freedom, CA, USA). Changes in HR matching withSNP- or Phe-induced MAP variations were determinedand plotted to generate sigmoidal curves. From thesecurves, the baroreflex activity was determined by theanalysis of the following parameters: (i) lower heart rateplateau (maximal bradycardic response, in beats min−1);(ii) upper heart rate plateau (maximal tachycardicresponse, in beats min−1); (iii) heart rate range (differencebetween upper and lower plateau levels, in beats min−1);and (iv) average gain (in beats min−1 mmHg−1), whichis the average slope of the linear portion of the curve(between −20 and +20 mmHg). In addition, the absolutechanges in MAP were also plotted against the changes inHR in both experimental groups in order to evaluate theoperating point of the baroreflex.

Evaluation of baseline vascular sympathetic activity

The contribution of the sympathetic nervous system tomaintenance of the arterial pressure of CIH rats wasevaluated by the intravenous injection of hexamethoniumchloride (25 mg kg−1, Sigma), a ganglionic blocker thatsuppresses sympathetic activity. Prior to hexamethoniumadministration, we performed sequential injection oflosartan (10 mg kg−1, Galena, Campinas, SP, Brazil),to antagonize angiotensin II type 1 (AT1) receptors,and [β-mercapto-β,β-cyclopenta-methylenepropionyl1,O-Me-Tyr2, Arg8]-vasopressin (AVPx, 10 μg kg−1, Sigma),a vasopressin V1a receptor antagonist, in order toavoid the expected compensatory angiotensinergic andvasopressinergic mechanisms due to the large fall inarterial pressure after the ganglionic blockade. Theseinjections were performed with a time interval of 5 min,and the responses were evaluated as the maximal changein MAP/HR after each injection.

Statistical analysis

The data were expressed as means ± S.E.M. and comparedusing Student’s t test or one-way ANOVA followed byNewman–Keuls test as appropriate. Two-way ANOVAfollowed by Bonferroni’s post hoc test were applied toanalyse the effect of the pharmacological antagonists onthe cardiovascular parameters of CIH and control animals.The comparisons were carried out using GraphPad Prism

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 204: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

976 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 94.9 pp 972–983

software (version 4, La Jolla, CA, USA) and differenceswere considered significant at P < 0.05.

Results

Baseline parameters of juvenile rats before and afterexposure to CIH for 10 days

In order to verify whether the arterial pressure valuesobtained by the different methods of measurement(tail cuff versus chronic catheter) were comparable, weperformed measurements in two groups of naive rats ofdifferent ages and weights, as follows: (i) rats of 19–21 daysand 50 ± 1 g (n = 5), similar to those used for CIH; and(ii) rats of 29–31 days and 106 ± 3 g (n = 7), similar to thecontrol rats used at the end of the protocol. We observedthat the SAP values obtained by the indirect and the directmethods of measurement were equivalent in both groupsof animals (19–21 days, 87 ± 1 versus 87 ± 3 mmHg; 29–31 days, 122 ± 5 versus 121 ± 6 mmHg, using indirect anddirect methods, respectively), which validated the tail-cuffmethod for the purpose of the present study.

A

Before After0

70

80

90

100

110

120

130

140

ControlCIH

#

#

*

ns

SA

P (

mm

Hg

)

B

Control CIH0

10

20

30

40

50

60 *

ΔS

AP

(m

mH

g)

Figure 2. Increased systolic arterial pressure (SAP) of ratssubmitted to CIH for 10 daysA, systolic arterial pressure (SAP) of control rats (n = 29) and ratssubmitted to CIH for 10 days (n = 28) measured before (by thetail-cuff method) and after the experimental protocol by the directmethod via an arterial catheter. ∗P < 0.0001 different from controlgroup; #P < 0.0001 different from initial values; ns, not significant.B, magnitude of the increase in SAP (�SAP) of control and CIH groupsafter 10 days of experimental protocol.

Before the experimental protocol, control (n = 29) andCIH rats (n = 28) exhibited similar SAP levels measuredusing the tail cuff (86 ± 2 versus 87 ± 1 mmHg, CIHand control group, respectively). After 10 days, bothgroups showed a significant increase in SAP in relationto their initial values (control group, 115 ± 2 versus87 ± 1 mmHg; CIH group, 131 ± 3 versus 86 ± 2 mmHg;P < 0.0001; Fig. 2A). However, the increase in SAP washigher in the CIH than in the control group (�SAP,45 ± 3 versus 28 ± 1 mmHg, in CIH and control group,respectively; P < 0.0001, Fig. 2B), indicating the degree ofthe hypertension caused by the CIH above the maturation-related increase in arterial pressure. In accordance, base-line MAP of CIH rats 1 day after the last episode of hypoxiawas also significantly higher in relation to that of controlrats (102 ± 3 versus 90 ± 1 mmHg; P < 0.0001), whereasno difference was observed in baseline HR between groups(478 ± 17 versus 473 ± 7 beats min−1, in CIH and controlgroup, respectively).

Fifteen days after the end of the CIH protocol, the MAPof the CIH group (n = 10) returned to levels similar tothose observed in the control group (n = 19; 91 ± 3 versus93 ± 2 mmHg, CIH and control group, respectively), asdemonstrated in Fig. 3. In addition, baseline HR was notdifferent between groups 15 days after exposure to CIH(349 ± 9 versus 371 ± 12 beats min−1, CIH and controlgroup, respectively).

Spectral analysis of variability in systolic arterialpressure and pulse interval in awake CIH and controlrats

The results of the analyses of SAP and PI variabilitiesin the time and frequency domains in control andCIH rats are shown in Fig. 4. In relation to SAP,the CIH group exhibited a higher variability, indicatedby an enhanced variance in relation to the control

1 day after CIH 15 days after CIH0

70

80

90

100

110 * #

ns

ControlCIH

MA

P (

mm

Hg

)

Figure 3. Mean arterial pressure (MAP) of control rats (n = 19)and rats submitted to CIH for 10 days (CIH, n = 10) measured 1and 15 days after cessation of the CIH protocol∗P < 0.05 different from control group 1 day after cessation of CIH;#P < 0.05 different from control group 15 days after cessation of CIH;ns, not significant.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 205: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 977

group (29 ± 4 versus 10 ± 2 mmHg2; P = 0.0003; Fig. 4A).This was associated with an increase in the magnitudeof both LF (10.05 ± 0.91 versus 5.02 ± 0.63 mmHg2;P = 0.0004; Fig. 4B and C) and HF oscillatory components(12.42 ± 2.46 versus 3.28 ± 0.61 mmHg2; P = 0.002;Fig. 4B and C). Considering PI, variance (13 ± 2 versus11 ± 3 ms2), LF and HF magnitudes (LF, 1.49 ± 0.82 versus2.46 ± 1.47 ms2; HF, 5.35 ± 1.12 versus 5.23 ± 1.21 ms2,CIH and control group, respectively) and LF/HFratio (0.26 ± 0.10 versus 0.12 ± 0.06, CIH and controlgroup, respectively) were similar between groups, asdemonstrated in Fig. 4D–F .

Cardiac baroreflex activity after 10 days of CIH

Sequence analysis data. The total number of upand down sequences detected was significantlyhigher in CIH (n = 17) than in control animals(n = 18; 9 ± 1 versus 4 ± 1 sequences per 1000 beats,P = 0.0114), which is consistent with the greatervariability in the SAP described in the previoussubsection. However, the slopes of these sequencesin both groups were similar (total, 0.82 ± 0.09 versus0.92 ± 0.10 ms mmHg−1; up sequences, 0.92 ± 0.10 versus0.95 ± 0.12 ms mmHg−1; down sequences, 0.69 ± 0.10versus 0.79 ± 0.12 ms mmHg−1, CIH and control groups,

C

LF (0.20 - 0.75 Hz) HF (0.75 - 3.0 Hz)0

3

6

9

12

15Control

CIH*

*

SA

P P

ow

er

(mm

Hg

2)

B

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.00

3

6

9

12

15

CIHControlLF HF

Frequency (Hz)

Po

wer

(mm

Hg

2/H

z)

A

Control CIH0

5

10

15

20

25

30

35 *

σ 2

(m

mH

g2)

LF HF

E

0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.00

1

2

3

4

5

6ControlCIH

Frequency (Hz)

Po

wer

(ms

2/H

z)

D

Control CIH0

3

6

9

12

15

SA

P v

ari

an

ce (

mm

Hg

2)

F

LF (0.20 - 0.75 Hz) HF (0.75 - 3.0 Hz)0

2

4

6

8Control

CIH

PI

Po

wer

(ms

2)

Figure 4. Power spectral analysis of systolic arterial pressure (SAP, upper panels) and pulse interval (PI,lower panels) of control rats (n = 8) and rats submitted to CIH for 10 days (CIH, n = 9)A and D, variance (σ 2). B and E, spectra of representative animals from their respective groups. C and F, magnitudeof the LF and HF components. ∗P < 0.01 different from control group.

respectively), indicating that the baroreflex gain in thespontaneous range of variation was not altered after10 days of CIH exposure.

Sigmoidal analysis. The curves obtained in control(n = 19, r2 = 0.80) and CIH groups (n = 34, r2 = 0.79)are shown in Fig. 5. In the linear portion of thebaroreflex function curve (from −20 to 20 mmHg),the slope of the CIH group was significantlyhigher than that of the control group (−3.11 ± 0.08versus −2.1 ± 0.10 beats min−1 mmHg−1, P < 0.0001),indicating that CIH rats present a higher average gainof baroreflex control of HR. In addition, the range of thebaroreflex curve was significantly larger in CIH rats thanin control animals (209 ± 13 versus 152 ± 8 beats min−1,P = 0.002). This larger range of HR in the CIH groupwas due to the higher level of the lower plateau of theHR response compared with control animals (−111 ± 9versus −82 ± 9 beats min−1, P = 0.0267). Although notstatistically different, the values of the level of the upperplateau of HR were higher in CIH group (95 ± 9 versus71 ± 8 beats min−1, P = 0.0836), which also contributedto the larger HR range of the CIH group. The operatingpoint of the baroreflex curve in CIH rats was shifted tothe right (inset of Fig. 5), indicating a resetting of thebaroreceptors.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 206: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

978 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 94.9 pp 972–983

Vascular sympathetic activity of awake CIH rats

Figure 6 shows traces from representative CIH andcontrol rats during sequential systemic antagonismof AT1 receptors using losartan (10 mg kg−1) and ofvasopressin V1a receptors using AVPx (10 μg kg−1),followed by ganglionic blockade with hexamethonium(25 mg kg−1). In control rats (n = 9), the injection oflosartan and AVPx did not produce any effect on MAP(baseline, 88 ± 2 mmHg; after losartan, 88 ± 2 mmHg;after AVPx, 85 ± 2 mmHg), as illustrated in Fig. 7A.In contrast, administration of hexamethonium evokeda large fall in MAP from 85 ± 2 to 46 ± 2 mmHg(P < 0.0001; Fig. 7A). In CIH rats (n = 8), baselineMAP prior to the pharmacological antagonisms wassignificantly higher than baseline MAP of control animals(102 ± 2 versus 88 ± 2 mmHg; P < 0.001; Fig. 7A). Afterthe pharmacological treatment with losartan and AVPx,MAP of CIH rats remained higher than in the control

70 80 90 100 110 120-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

MAP (mmHg)

HR

(b

ea

ts m

in-1

)

-40 -30 -20 -10 10 20 30 40

-120

-100

-80

-60

-40

-20

20

40

60

80

100

120

HR

(beats

min

-1)

MAP (mmHg)

Control CIH

Figure 5. Sigmoidal baroreflex curves correlating SNP- and Phe-induced variations in MAP with HRresponses (�HR) in control rats (n = 19) and rats submitted to CIH for 10 days (CIH, n = 34)The inset illustrates the linear portion of the curve using absolute values of MAP versus �HR and the circles indicatethe operating point of the baroreflex.

group (MAP after losartan, 100 ± 2 versus 88 ± 2 mmHg;MAP after AVPx, 96 ± 3 versus 85 ± 2 mmHg, CIHand control groups, respectively; d.f. = 1, F = 17.28,P < 0.001), as shown in Fig. 7A. However, a large fallin MAP from 96 ± 3 to 48 ± 1 mmHg (P < 0.0001;Fig. 7A) was observed in the CIH group following thehexamethonium injection. The magnitude of this decreasein MAP was significantly greater in CIH than in controlanimals (�MAP, −49 ± 2 versus −39 ± 2 mmHg, controland CIH groups, respectively; P = 0.0065; Fig. 7B). Heartrate responses observed after losartan (�HR, 65 ± 12versus 57 ± 10 beats min−1, CIH and control groups,respectively; P = 0.6083) and AVPx (�HR, −15 ± 13versus 26 ± 15 beats min−1, CIH and control groups,respectively; P = 0.0617) were not statistically differentbetween groups. Likewise, CIH and control groupsexhibited similar reductions in HR after ganglionicblockade (�HR, −51 ± 26 versus −59 ± 13 beats min−1,CIH and control groups, respectively; P = 0.7556).

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 207: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 979

Discussion

In spite of the experimental evidence supporting arelationship between CIH and arterial hypertension(Fletcher, 2001; Caples et al. 2005; Leuenberger et al. 2005;Zoccal et al. 2007a,b), the mechanisms by which CIHinduces this cardiovascular dysfunction are not completelyunderstood. In the present study, we demonstrated forthe first time that conscious juvenile rats submitted toCIH for only 10 days exhibited higher levels of base-line arterial pressure, which appeared dependent on anincreased sympathetic outflow. Our data clearly show thatthe hypertensive state of CIH rats is not secondary to animpairment of cardiac baroreflex function. In contrast,the arterial pressure of these freely moving juvenile CIHrats showed an elevated respiratory-related variability,indicating an alteration either in the respiratory systemor in its coupling with sympathetic nervous system, whichmay contribute to the development of hypertension inthese animals.

The effects of CIH on baseline arterial pressure ofjuvenile rats were compared using both indirect (tailcuff) and direct methods (arterial catheter). Despite thepotential confounding issues of stress relating to tail-cuffmeasurements, we were able to show that the values of

Figure 6. Augmented baseline vascular sympathetic activity in CIH ratsRepresentative recordings from one control rat and one rat submitted to CIH for 10 days, showing alterationsin heart rate (HR, upper panel), pulsatile (PAP, middle panel) and mean arterial pressures (MAP, lower panel)during sequential systemic administration of losartan (AT1 receptor antagonist, 10 mg kg−1), AVPx (V1a receptorantagonist, 10 μg kg−1) and hexamethonium (ganglionic blocker, 25 mg kg−1).

SAP obtained using both techniques were comparable (seeResults section). Thus, we observed that CIH and controlrat groups presented similar levels of SAP prior to the CIHprotocol. After 10 days, CIH and control rats exhibitedhigher levels of SAP than the respective initial values.The increase in SAP in control rats seems to be relatedto a critical period of rat development (see Kasparov &Paton, 1997; Dickhout & Lee, 1998), probably associatedwith changes in the responsiveness of vascular muscle cells(Samora et al. 2007, 2008) rather than in the sympatheticnervous system, since the cardiac sympathetic efferentactivity (Seidler & Slotkin, 1979) and its baroreceptorcontrol (Bartolome et al. 1980) are fully functional at 2–3 weeks of age.

Juvenile rats exposed to CIH for 10 days showeda greater increase in SAP in comparison with controlanimals. These higher levels of arterial pressure in CIHrats were associated with an augmented sympatheticactivity, in accordance with the experiments involvingthe ganglionic blockade combined with pharmacologicalinterventions to exclude the compensatory effects ofangiotensin II and vasopressin due to the large fallin arterial pressure observed after the ganglionicblockade. These expected effects of angiotensin II andvasopressin could potentially mask the real contribution

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 208: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

980 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 94.9 pp 972–983

of sympathetic activity to the maintenance of the basalarterial pressure (Zoccal et al. 2007b). Using this approach,we verified that hexamethonium evoked a greater fall inarterial pressure in CIH than in control rats, indicatingthat a higher sympathetic vascular tonus underlies theincreased arterial pressure observed after exposure to CIH.Remarkably, the levels of arterial pressure reached afterganglionic blockade in CIH and control rats were similar,which supports the concept that sympathetic overactivityin CIH rats underlies the high blood pressure.

As further evidence of elevated cardiovascularsympathetic activity in CIH rats, we used variabilityanalysis of systolic arterial pressure and pulse intervalin the time and frequency domains (Akselrod et al.1981; Malliani et al. 1991). Briefly, oscillations in thelow frequency (LF) range of arterial pressure and heartrate are related to sympathetic modulation of arteriolesand the heart, respectively, while oscillations in highfrequency (HF) range are representative of a respiratorymodulation of arterial pressure and of a parasympatheticmodulation of heart rate (Japundzic et al. 1990; Ceruttiet al. 1991; Malliani et al. 1991). In relation to pulse intervalvariability, variance as well as LF and HF powers weresimilar between groups, suggesting that the sympatho-vagal balance to the heart of CIH juvenile rats was notaltered. However, we did observe an enhanced varianceof systolic pressure in CIH rats with a twofold increasein the power of the LF component in comparisonwith control rats, indicating an increased sympatheticvasomotor modulation of systolic arterial pressure of CIHrats. These findings, combined with the pharmacologicalstudies using ganglionic blockade, strongly support theconcept that the higher level of baseline arterial pressureof juvenile rats submitted to CIH for 10 days is maintainedby enhanced sympathetic vasoconstrictor outflow.

Another important aspect observed in our powerspectral analysis of systolic arterial pressure of CIH juvenilerats was related to its respiratory component. We observeda fourfold increase in the power of the HF componentof systolic arterial pressure of CIH rats compared withcontrol animals, indicating that the arterial pressure ofCIH rats is under enhanced respiratory modulation. Theserespiratory-related oscillations in arterial pressure arecaused mainly by the following factors: (i) changes inthe intrathoracic pressure during the respiratory cycle,which increases the venous return and the cardiac output,stimulating the arterial baroreceptors; (ii) signals arisingfrom lungs, especially from stretch receptors, which,in turn, reflexly modulate sympathetic activity; and(iii) alterations in the central coupling between respiratoryrhythmogenic and sympathetic neurons in the brainstem(Bernardi et al. 2001). Regarding the central coupling, wehave documented recently that the CIH-induced higherlevels of sympathetic activity in juvenile rats correlatedwith an enhanced abdominal motor expiratory activity,

which was independent of respiratory phasic changes invenous return and afferent discharge arising from thelungs and carotid bodies (Zoccal et al. 2008). Thesedata suggest that the enhanced expiratory activity isleading to the augmented sympathetic activity in CIHrats as a consequence of a strengthened central couplingbetween the respiratory neurons of the central patterngenerator and premotor sympathetic neurons (Zoccalet al. 2008). This hypothesis shows a parallel with arecent report indicating that an amplified respiratory–sympathetic coupling may contribute to the sympatheticoveractivity observed in spontaneously hypertensive rats(Simms et al. 2009). Thus, the results of the present studysupport the notion that CIH induces plasticity withinbrainstem circuits regulating respiratory–sympatheticcoupling, and additional studies are required to explorethe underpinning neurochemical mechanisms.

In order to verify whether the sympathetic overactivityand hypertension observed after exposure to CIH could besecondary to a decreased baroreflex function, we evaluatedthe cardiac baroreflex gain in control and CIH animals.The analysis of the spontaneous baroreflex sensitivityshowed no differences between groups, suggesting that

A

Baseline LOS AVPx HXT0

30

50

70

90

110Control

CIH

* * *

# #

MA

P (

mm

Hg

)

BControl CIH

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-250

*

MA

P (

mm

Hg

)

Figure 7. Effects of losartan, AVPx and hexamethonium onarterial pressure of control and CIH ratsA, mean arterial pressure (MAP) prior (baseline) and after systemicadministration of losartan (LOS), AVPx and hexamethonium (HXT) incontrol rats (n = 9) and in rats submitted to CIH for 10 days (n = 8).∗P < 0.01 different from control group; #P < 0.01 different fromrespective control and CIH values before hexamethonium. B, absolutemagnitudes of the fall in MAP (�MAP) observed after administrationof hexamethonium in control and CIH groups.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 209: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 981

the cardiac baroreflex control, at least within the narrowrange of physiological variations of arterial pressure, is notaltered in juvenile rats after exposure to CIH. However,when the analysis of baroreflex function was performedconsidering the sigmoidal curve obtained by the useof intravenous infusion of sodium nitroprusside andphenylephrine, we observed that juvenile rats submitted toCIH for 10 days exhibited an increased cardiac baroreflexgain. In addition, we also observed a larger HR range of thebaroreflex in the CIH rats compared with control animals.This was probably consequent to an increase in the lowerplateau of the HR (maximal bradycardic response) as wellas the higher plateau of the HR (maximal tachycardicresponse), although the latter was not statistically differentfrom control values. Considering that the lower and higherplateaus of HR are correlated with the maximal cardiacparasympathetic and sympathetic baroreflex activity,respectively (Head & McCarty, 1987), these results suggestthat juvenile rats exposed to CIH present an enhancementof both autonomic components of the cardiac baroreflex.Indeed, the greater tachycardic response is consistentwith the finding that the sympathetic nervous system issensitized in the CIH rats.

Different from our results, previous studies performedin anaesthetized mice (Lin et al. 2007) or young adultFischer 344 rats (Gu et al. 2007; Yan et al. 2008)submitted to CIH documented an impairment of thecardiac baroreflex. In addition to differences in animalstrain and the use of anaesthesia, these previous studiesevaluated the baroreflex after 1–3 months of exposureto CIH (Lin et al. 2007; Gu et al. 2007; Yan et al.2008), which contrasts with only 10 days in the presentstudy. In this regard, Lai et al. (2006) evaluated theassociation between hypertension and impairment ofcardiac baroreflex function in conscious adult rats. Theauthors observed that the hypertension developed in CIHrats was associated with an increase in the LF oscillatory(sympathetic) component of pulse interval on the fifthday of exposure to CIH, while the reduction in thespontaneous cardiac baroreflex activity was not observeduntil the seventeenth day of CIH. Thus, there was a timelag between the development of hypertension and theimpairment of cardiac baroreflex, which is in agreementwith our results showing that the onset of hypertensionin juvenile CIH rats is not secondary to reductions inthe cardiac baroreflex gain. Therefore, our data indicatethat juvenile rats submitted to CIH exhibit no reductionof baroreflex function, rather a sensitization, which mayprevent a higher increase in arterial pressure than the mildhypertensive level observed in juvenile rats exposed toCIH. Why the gain of the cardiac baroreflex is increasedin juvenile rats exposed to CIH is an intriguing questionthat nerits further experimental investigation.

Fifteen days after the cessation of exposure to CIH,the mean arterial pressure of CIH rats returned to levels

similar to those observed in control animals, indicatingreversibility in the neuronal plasticity. This observationraises the hypothesis that the enhanced sympatheticactivity of CIH rats is triggered by a mechanism dependenton the exposure to CIH. In this scenario, one potentialmechanism is an increase in generation of reactive oxygenspecies, which can directly interfere with the activity ofsympathetic and respiratory neurons (Lin et al. 2003;Macfarlane et al. 2008) or can activate hypoxia-induciblefactor-1, an important regulator of the transcription ofa variety of genes involved in the adaptive responses tohypoxia (for review see Prabhakar et al. 2007). However,further studies are required to elucidate the possibleincrease in formation of reactive oxygen species in juvenileCIH rats on the activity of neurons involved in theregulation and modulation of sympathetic and respiratoryactivities.

In conclusion, different experimental approachesindicate that the hypertension developed in juvenile ratsexposed to CIH for 10 days ss dependent on augmentedsympathetic activity, which ss not secondary to alterationsin the cardiac baroreflex function. In addition, thehigher levels of arterial pressure of juvenile rats followingCIH are associated with a greater variability in theHF range, indicating a greater influence of respiratoryactivity on the arterial pressure. This could representthe phenomenon that we previously described in thein situ working heart–brainstem preparation, in whichthe augmented levels of sympathetic activity correlatewith an enhanced expiratory activity (Zoccal et al.2008), suggesting respiratory–sympathetic coupling asa potential mechanism underlying the hypertensionobserved in this experimental model. The cellularand neurochemical mechanisms underlying this alteredcoupling between sympathetic and respiratory activitiesobserved after CIH exposure are matters for furtherinvestigation.

References

Akselrod S, Gordon D, Ubel FA, Shannon DC, Berger AC &Cohen RJ (1981). Power spectrum analysis of heart ratefluctuation: a quantitative probe of beat-to-beatcardiovascular control. Science 213, 220–222.

Allahdadi KJ, Walker BR & Kanagy NL (2005). Augmentedendothelin vasoconstriction in intermittent hypoxia-inducedhypertension. Hypertension 45, 705–709.

Baker TL & Mitchell GS (2000). Episodic but not continuoushypoxia elicits long-term facilitation of phrenic motoroutput in rats. J Physiol 529, 215–219.

Bartolome J, Mills E, Lau C & Slotkin TA (1980). Maturation ofsympathetic neurotransmission in the rat heart. V.Development of baroreceptor control of sympathetic tone. JPharmacol Exp Ther 215, 596–600.

Bernardi L, Porta C, Gabutti A, Spicuzza L & Sleight P (2001).Modulatory effects of respiration. Auton Neurosc 90, 47–56.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 210: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

982 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 94.9 pp 972–983

Caples SM, Gami AS & Somers VK (2005). Obstructive sleepapnea. Ann Intern Med 142, 187–197.

Cerutti C, Gustin MP, Paultre CZ, Lo M, Julien C, Vincent M &Sassard J (1991). Autonomic nervous system andcardiovascular variability in rats: a spectral analysisapproach. Am J Physiol Heart Circ Physiol 261,H1292–H1299.

Dickhout JG & Lee RM (1998). Blood pressure and heart ratedevelopment in young spontaneously hypertensive rats. Am JPhysiol Heart Circ Physiol 274, H794–H800.

Fletcher EC (2001). Physiological consequences of intermittenthypoxia: systemic blood pressure. J Appl Physiol 90,1600–1605.

Fletcher EC, Lesske J, Culman J, Miller CC & Unger T (1992).Sympathetic denervation blocks blood pressure elevation inepisodic hypoxia. Hypertension 20, 612–619.

Gilbey MP, Jordan D, Richter DW & Spyer KM (1984).Synaptic mechanisms involved in the inspiratory modulationof vagal cardio-inhibitory neurones in the cat. J Physiol 356,65–78.

Gilbey MP, Numao Y & Spyer KM (1986). Discharge patternsof cervical sympathetic preganglionic neurones related tocentral respiratory drive in the rat. J Physiol 378, 253–265.

Greenberg HE, Sica A, Batson D & Scharf SM (1999a). Chronicintermittent hypoxia increases sympathetic responsiveness tohypoxia and hypercapnia. J Appl Physiol 86, 298–305.

Greenberg HE, Sica AL, Scharf SM & Ruggiero DA (1999b).Expression of c-fos in the rat brainstem after chronicintermittent hypoxia. Brain Res 816, 638–645.

Gu H, Lin M, Liu J, Gozal D, Scrogin KE, Wurster R, ChapleauMW, Ma X & Cheng ZJ (2007). Selective impairment ofcentral mediation of baroreflex in anesthetized young adultFischer 344 rats after chronic intermittent hypoxia. Am JPhysiol Heart Circ Physiol 293, H2809–H2818.

Habler H-J, Janig W & Michaelis M (1994). Respiratorymodulation in the activity of sympathetic neurones. ProgNeurobiol 43, 567–606.

Haselton JR & Guyenet PG (1989). Central respiratorymodulation of medullary sympathoexcitatory neurons inrat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 256,R739–R750.

Head GA & McCarty R (1987). Vagal and sympatheticcomponents of the heart rate range and gain of thebaroreceptor-heart rate reflex in conscious rats. J Auton NervSyst 21, 203–213.

Hla K, Young T, Bidwell M, Palta M, Skatrud J & Dempsey J(1994). Sleep apnea and hypertension: a population-basedstudy. Ann Intern Med 120, 382–388.

Janig W & Habler H-J (2003). Neurophysiological analysis oftarget-related sympathetic pathways – from animal tohuman: similarities and differences. Acta Physiol Scand 177,255–274.

Japundzic N, Grichois ML, Zitoun P, Laude D & Elghozi JL(1990). Spectral analysis of blood pressure and heart rate inconscious rats: effects of autonomic blockers. J Auton NervSyst 30, 91–100.

Kasparov S & Paton JF (1997). Changes in baroreceptor vagalreflex performance in the developing rat. Pflugers Arch 434,438–444.

Lai CJ, Yang CC, Hsu YY, Lin YN & Kuo TB (2006). Enhancedsympathetic outflow and decreased baroreflex sensitivity areassociated with intermittent hypoxia-induced systemichypertension in conscious rats. J Appl Physiol 100,1974–1982.

Leuenberger UA, Brubaker D, Quraishi S, Hogeman CS,Imadojemu VA & Gray KS (2005). Effects of intermittenthypoxia on sympathetic activity and blood pressure inhumans. Auton Neurosci 121, 87–93.

Lin HH, Chen C-H, Hsieh W-K, Chiu TH & Lai C-C (2003).Hydrogen peroxide increases the activity of rat sympatheticpreganglionic neurons in vivo and in vitro. Neuroscience 121,641–647.

Lin M, Liu R, Gozal D, Wead WB, Chapleau MW, Wurster R &Cheng ZJ (2007). Chronic intermittent hypoxia impairsbaroreflex control of heart rate but enhances heart rateresponses to vagal efferent stimulation in anesthetized mice.Am J Physiol Heart Circ Physiol 293, H997–H1006.

Ling L, Fuller DD, Bach KB, Kinkead R, Olson EB & MitchellGS (2001). Chronic intermittent hypoxia elicitsserotonin-dependent plasticity in the central neural controlof breathing. J Neurosci 21, 5381–5388.

Macfarlane PM, Wilkerson JE, Lovett-Barr MR & Mitchell GS(2008). Reactive oxygen species and respiratory plasticityfollowing intermittent hypoxia. Respir Physiol Neurobiol 164,263–271.

McGuire M, Zhang Y, White DP & Ling L (2003). Chronicintermittent hypoxia enhances ventilatory long-termfacilitation in awake rats. J Appl Physiol 95, 1499–1508.

Malliani A, Pagani M, Lombardi F & Cerutti S (1991).Cardiovascular neural regulation explored in the frequencydomain. Circulation 84, 482–492.

Mandel DA & Schreihofer AM (2006). Central respiratorymodulation of barosensitive neurones in rat caudalventrolateral medulla. J Physiol 572, 881–896.

Minami N & Head GA (1993). Relationship betweencardiovascular hypertrophy and cardiac baroreflex functionin spontaneously hypertensive and stroke-prone rats. JHypertens 11, 523–533.

Narkiewicz K, van de Borne PJH, Montano N, Dyken ME,Phillips BG & Somers VK (1998). Contribution of tonicchemoreflex activation to sympathetic activity and bloodpressure in patients with obstructive sleep apnea. Circulation97, 943–945.

Pawar A, Peng YJ, Jacono FJ & Prabhakar NR (2008).Comparative analysis of neonatal and adult rat carotid bodyresponses to chronic intermittent hypoxia. J Appl Physiol104, 1287–1294.

Peng YJ & Prabhakar NR (2004). Effect of two paradigms ofchronic intermittent hypoxia on carotid body sensoryactivity. J Appl Physiol 96, 1236–1242.

Prabhakar NR, Kumar GK, Nanduri J & Semenza GL (2007).ROS signaling in systemic and cellular responses to chronicintermittent hypoxia. Antioxid Redox Signal 9,1397–1403.

Reeves SR & Gozal D (2006). Changes in ventilatoryadaptations associated with long-term intermittent hypoxiaacross the age spectrum in the rat. Respir Physiol Neurobiol150, 135–143.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 211: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 94.9 pp 972–983 Hypertension and chronic intermittent hypoxia 983

Reeves SR, Guo SZ, Brittian KR, Row BW & Gozal D (2006).Anatomical changes in selected cardio-respiratory brainstemnuclei following early post-natal chronic intermittenthypoxia. Neurosci Lett 402, 233–237.

Samora JB, Frisbee JC & Boegehold MA (2007).Growth-dependent changes in endothelial factors regulatingarteriolar tone. Am J Physiol Heart Circ Physiol 292,H207–H214.

Samora JB, Frisbee JC & Boegehold MA (2008). Increasedmyogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles withjuvenile growth. Am J Physiol Heart Circ Physiol 294,H2344–H2351.

Seidler FJ & Slotkin TA (1979). Presynaptic and postsynapticcontributions to ontogeny of sympathetic control of heartrate in the preweanling rat. Br J Pharmacol 85, 531–534.

Simms AE, Paton JF, Pickering AE & Allen AM (2009).Amplified respiratory–sympathetic coupling in thespontaneously hypertensive rat: does it contribute tohypertension? J Physiol 587, 597–610.

Somers VK, Dyken ME, Clary MP & Abboud FM (1995).Sympathetic neural mechanisms in obstructive sleep apnea. JClin Invest 96, 1987–1904.

Vitela M, Herrera-Rosales M, Haywood JR & Mifflin SW(2005). Baroreflex regulation of renal sympathetic nerveactivity and heart rate in renal wrap hypertensive rats. Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol 288, R856–R862.

Yan B, Soukhova-O’Hare GK, Li L, Lin Y, Gozal D, Wead WB,Wurster RD & Cheng ZJ (2008). Attenuation of heart ratecontrol and neural degeneration in nucleus ambiguusfollowing chronic intermittent hypoxia in young adultFischer 344 rats. Neuroscience 153, 709–720.

Zoccal DB, Bonagamba LG, Antunes-Rodrigues J & MachadoBH (2007a). Plasma corticosterone levels is elevated in ratssubmitted to chronic intermittent hypoxia. Auton Neurosci134, 115–117.

Zoccal DB, Bonagamba LG, Oliveira FR, Antunes-Rodrigues J& Machado BH (2007b). Increased sympathetic activity inrats submitted to chronic intermittent hypoxia. Exp Physiol92, 79–85.

Zoccal DB, Simms AE, Bonagamba LG, Braga VA, PickeringAE, Paton JF & Machado BH (2008). Increased sympatheticoutflow in juvenile rats submitted to chronic intermittenthypoxia correlates with enhanced expiratory activity. JPhysiol 586, 3253–3265.

Acknowledgements

This work was supported by Fundacao de Amparo a Pesquisa

do Estado de Sao Paulo (2004/03285-7 and 2006/51159-6); and

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientıfico e Tecnologico

(472704/2004-4). J.F.R.P. was in receipt of a Royal Society

Wolfson Research Merit Award.

C© 2009 The Authors. Journal compilation C© 2009 The Physiological Society

Page 212: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

ANEXO B – Artigos publicados não relacionados à tese

Page 213: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

DIFERENTES ABORDAGENS EXPERIMENTAIS NO ESTUDODA MODULAÇÃO DA ATIVIDADE SIMPÁTICA NO

SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE RATOS

DIFFERENT EXPERIMENTAL APPROACHES TO STUDY THE SYMPATHETIC MODULATIONIN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM OF RATS

Benedito H Machado1, Josiane C Cruz2, Gisela P Pajolla3, Daniel B Zoccal2,Valdir A Braga2, Daniela Accorsi-Mendonça3

1Docente. Departamento de Fisiologia. 2Pós-Graduandos do Progrma de Pós-Graduação em Fisiologia. 3Pós-Doutorandas do Departa-mento de Fisiologia. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.CORRESPONDÊNCIA: Benedito H. Machado. Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, CEP 14049-900,Ribeirão Preto, SP, Brasil. Fone: 55-16-3602-3015; FAX: 55-16-3633-0017; e-mail: [email protected].

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D. Diferentes abordagensexperimentais no estudo da modulação da atividade simpática no sistema nervoso central de ratos.Medicina (Ribeirão Preto) 2006; 39 (1): 101-109.

RESUMO: Essa revisão tem como objetivo apresentar a experiência do nosso laboratório,acumulada ao longo dos últimos anos no estudo da neurotransmissão do componente simpato-excitatório do quimiorreflexo no núcleo do trato solitário (NTS) de ratos. Essa abordagem experi-mental tem sido utilizada como um modelo para o melhor entendimento dos mecanismosneuroquímicos envolvidos na geração e modulação da atividade simpática, a qual tem importan-tes repercussões para o sistema cardiovascular tanto em condições fisiológicas quanto emcondições fisiopatológicas como a hipertensão arterial. O foco específico dessa revisão estácentrado na neurotransmissão do componente simpato-excitatório do quimiorreflexo no núcleodo trato solitário (NTS) e apresentamos vários métodos e abordagens experimentais que estãosendo utilizados com vistas ao melhor entendimento desse complexo sistema de neurotrans-missão. Com essa combinação de métodos, que vão desde um neurônio do NTS até o ratoacordado e com livre movimentação, queremos ilustrar as múltiplas possibilidades de aborda-gens experimentais contemporâneas, as quais estão nos proporcionando as condições ma-teriais para estender os horizontes dessa importante área do conhecimento.

Descritores: Quimiorreflexo. NTS. Hipóxia. Sistema Nervoso Autônomo. L-glutamato. ATP.Pressão Arterial.

101

Medicina, Ribeirão Preto, X SIMPÓSIO BRASILEIRO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR39 (1): 101-109., jan./mar. 2006 Capítulo X

1 - INTRODUÇÃO

O completo entendimento dos mecanismos cen-trais envolvidos na geração e modulação da atividadeautonômica simpática para o coração e os vasos arte-riais, continua sendo uma das fronteiras do conheci-mento ainda por ser explorada e conquistada. Consi-derando a importância dos problemas que afetam o

sistema cardiovascular e em especial a hipertensãoarterial de origem neural, temos justificativas para osfisiologistas se ocuparem de projetos de pesquisa nabusca dessa fronteira. O nosso laboratório vem sededicando ao estudo da modulação da atividadeeferente simpática no sistema nervoso central. Nessecontexto, o nosso foco de investigação se concentrana neurotransmissão das aferências dos quimiorrecep-

Page 214: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

102

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D

tores periféricos no núcleo do trato solitário (NTS),uma estrutura de localização dorsal no tronco cere-bral que recebe as informações aferentes sensoriais,incluindo aquelas do barorreflexo, do reflexo cardio-pulmonar e do quimiorreflexo1,2,3.

A justificativa para se estudar a neurotransmis-são do quimiorreflexo no NTS é relativamente sim-ples: ainda que esse reflexo seja normalmente ativadoapenas em condições de hipóxia, isso resulta em res-postas ventilatórias e autonômicas importantes, comespecial destaque para uma grande elevação dapressão arterial resultante do aumento da atividadeeferente simpática4,5. Dessa forma, o modelo experi-mental para a ativação dos quimiorreceptores perifé-ricos por hipóxia hipóxica (diminuição da PO2) ou hi-póxia citotóxica [injeção intravenosa de baixas con-centrações de cianeto de potássio (KCN)] nos pare-cem escolhas apropriadas para a excitação de dife-rentes áreas do sistema nervoso central envolvidascom a geração e modulação da atividade simpática6.Nesse cenário, as primeiras sinapses das aferênciasdos quimiorreceptores periféricos ocorrem no NTS eos neurotransmissores e neuromoduladores envolvi-dos no processamento dos componentes autonômicose respiratórios do quimiorreflexo ainda não foram es-tabelecidos.

Para o estudo adequado das aferências doquimiorreflexo temos utilizado diferentes abordagensexperimentais, sendo a principal delas os estudos far-macológicos, por meio das microinjeções no NTS deratos não-anestesiados. Essa abordagem, inicialmen-te descrita por Michelini e Bonagamba7 nos permitiuuma séria de avanços para o melhor entendimento dosneurotransmissores e dos seus diferentes subtipos dereceptores envolvidos no processamento dos compo-nentes autonômicos simpático e parassimpático, comotambém do componente ventilatório em resposta à ati-vação do quimiorreflexo. Além dessa abordagem en-volvendo o animal não-anestesiado e com livre movi-mentação, temos utilizado outras abordagens comple-mentares como a preparação coração tronco-cere-bral isolados, a imunohistoquímica de receptores doL-glutamato e do ATP, a eletrofisiologia (patch-clamp)de neurônios do NTS em fatias do tronco cerebral, e ahipóxia intermitente para uma ativação freqüente e alongo prazo do quimiorreflexo. Os itens subseqüentesse referem a cada uma dessas abordagens experi-mentais e destacam os principais resultados obtidos,bem como as vantagens e desvantagens de cada umdesses procedimentos experimentais.

2- MICROINJEÇÕES DE ANTAGONISTAS DERECEPTORES DE AMINOÁCIDOS EXCI-TATÓRIOS NO NTS DE RATOS NÃO ANES-TESIADOS

A ativação do quimiorreflexo com a injeção in-travenosa de KCN no rato acordado foi descrita deforma elegante por Franchini e Krieger4. Esses auto-res descreveram as respostas cardiovasculares e res-piratórias à ativação do quimiorreflexo com KCN norato acordado e mostraram que sob os efeitos da anes-tesia a magnitude dessas respostas era significativa-mente menor. A injeção de KCN nas doses entre 80 e120 m g/kg promove, no rato acordado, uma elevaçãosignificativa da pressão arterial, a qual é essencial-mente dependente da atividade eferente simpática, poisa mesma foi bloqueada com o tratamento prévio como prazosin, um antagonista a -1 adrenérgico5 e não foialterada pelo antagonismo dos receptores da vasopres-sina8. Além disso, a ativação do quimiorreflexo pro-move uma intensa resposta de bradicardia, a qual nãoé secundária a ativação dos barorreceptores decor-rente da elevação da pressão arterial, pois mesmo apóso bloqueio da resposta pressora com o prazosin, a res-posta de bradicardia não se alterou5. Esses resultadosmostraram que a ativação do quimiorreflexo promoveduas respostas autonômicas independentes, isto é, umaresposta simpato-excitatória e uma resposta de exci-tação parassimpática.

Os nossos experimentos iniciais tiveram comoobjetivo avaliar o envolvimento dos receptores deaminoácidos excitatórios na neurotransmissão doscomponentes autonômicos simpático e parassimpáti-co do quimiorreflexo no NTS de ratos não-anestesia-dos. Nesse sentido, o trabalho de Haibara et al.5 mos-trou que o componente parassimpático (bradicardia)foi bloqueado de forma dose-dependente pelo AP-5,um antagonista seletivo dos receptores NMDA, quan-do microinjetado no NTS intermediário bilateralmen-te. No entanto, esse estudo mostrou que a respostapressora do quimiorreflexo não foi alterada pelo anta-gonismo dos receptores NMDA. Na etapa seguinte oobjetivo foi promover o bloqueio dos receptores não-NMDA com a finalidade de bloquear a respostapressora do quimiorreflexo, a qual seria provavelmen-te mediada por esses subtipos de receptores9. Nessesentido foram realizadas microinjeções do DNQX, umantagonista seletivo dos receptores não-NMDA, noNTS de ratos não anestesiados e surpreendentemen-te a resposta pressora não foi bloqueada. A microinje-

Page 215: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

103

Controle central da atividade simpática

ção do ácido quinurênico, um antagonista não-seletivodos receptores de aminoácidos excitatórios, tambémnão bloqueou a resposta pressora (simpato-excitató-ria) do quimiorreflexo. Ainda que esse conjunto de re-sultados pudesse, num primeiro momento, sugerir queo L-glutamato e os receptores de aminoácidos excita-tórios não participariam da neurotransmissão do com-ponente simpatoexcitatório do quimiorreflexo no NTS,essas evidências não foram conclusivas, pois tanto amicroinjeção do DNQX quanto a do ácido quinurênicono NTS promoveram elevações significativas da pres-são arterial basal, provavelmente por bloquear a viasimpato-inibitória do barorreflexo. Dessa forma, a re-dução na magnitude da resposta pressora à ativaçãodo quimiorreflexo observada após a microinjeção des-ses antagonistas no NTS poderia ser secundária a ele-vação da pressão arterial basal e não necessariamen-te decorrente do bloqueio das vias neurais envolvidascom o componente simpato-excitatório do quimiorre-flexo no NTS.

Para solucionar o impasse experimental geradopor essas manipulações dos receptores não-NMDAno NTS, provavelmente decorrente do bloqueio da viasimpato-inibitória do barorreflexo, e conseqüente ele-vação da pressão arterial, passamos a desenvolver umnovo protocolo experimental no qual a ativação doquimiorreflexo foi feita antes e após a microinjeção deácido quinurênico no NTS. Após a microinjeção doácido quinurênico foi feita a normalização da pressãoarterial por meio da infusão intravenosa de nitroprus-siato de sódio e a seguir, quando a pressão arterialbasal se encontrava nos níveis basais, o quimiorrefle-xo foi novamente ativado. Nesses experimentos veri-ficamos de forma clara que o bloqueio dos receptoresde aminoácidos excitatórios no NTS não promoveunenhuma alteração na magnitude da resposta pressoraà ativação do quimiorreflexo10. Dessa forma, o con-junto dos nossos resultados sobre a neurotransmissãodo componente simpato-excitatório do quimiorreflexono NTS indica que o antagonismo dos receptores doL-glutamato no NTS não bloqueia a resposta simpato-excitatória do quimirreflexo. Esses achados abriramnovas e interessantes possibilidades sobre as caracte-rísticas da neurotransmissão do componente simpato-excitatório do quimiorreflexo no NTS e a partir dosmesmos passamos a considerar a possível participa-ção de outros neurotransmissores nesse processamento,com especial atenção para o ATP e os receptores P2,uma vez que estudos de Yao et al.11 documentaram apresença de receptores P2 do ATP no NTS de ratos.

Os nossos estudos correspondentes as microin-jeções de ATP no NTS de ratos não-anestesiadosmostraram que essa purina promoveu aumento na pres-são arterial e bradicardia semelhante às respostas àativação do quimiorreflexo, o que nos permitiu sugerirque o ATP poderia participar na neurotransmissão dessereflexo no NTS12. Em estudo subseqüente envolven-do registro da ventilação, por meio da pletismografiade corpo inteiro, verificamos que a microinjeção doATP no NTS intermediário, sub-região corresponden-te às sinapses do barorreflexo, promoveu o aumentoda pressão arterial, bradicardia e apnéia. No entanto,quando o ATP foi microinjetado no NTS caudal, sub-região correspondente às sinapses do quimiorreflexo,verificamos um grande aumento da pressão arterialassociado a uma resposta de taquipnéia, o que efeti-vamente contribuiu ainda mais para a nossa hipótesesobre o possível envolvimento do ATP e dos seus re-ceptores no processamento da resposta simpato-exci-tatória e ventilatória do quimiorreflexo no NTS cau-dal13. Portanto, esse conjunto de resultados relativosao ATP atuando como um possível neurotransmissorou co-transmissor da aferências dos quimiorrecepto-res periféricos no NTS caudal nos permitiram consi-derar o envolvimento do ATP no processamento doquimiorreflexo no NTS caudal e atualmente estamosutilizando várias abordagens experimentais para con-firmar essa hipótese. No entanto, temos que admitirque o uso de animais acordados com livre movimenta-ção oferece uma série de limitações para registros deatividade neural, para a manipulação de diferentes sub-regiões do sistema nervoso central simultaneamente emesmo para o controle de variáveis fisiológicas comoa pressão arterial e a ventilação em respostas aos di-ferentes procedimentos experimentais. Dessa forma,temos utilizado diferentes abordagens experimentaiscomplementares ao animal acordado, a fim de testar ahipótese relativa à participação do ATP como um neu-rotransmissor/neuromodulador ou co-transmissor dasvias neurais do quimiorreflexo no NTS caudal.

3- MICROINJEÇÕES NO NTS NA PREPARA-ÇÃO CORAÇÃO-TRONCO CEREBRALISOLADOS

Nos resultados descritos acima, envolvendo aneurotransmissão do componente simpato-excitatóriodo quimiorreflexo no NTS, quantificamos as altera-ções na pressão arterial como um índice indireto dasvariações na atividade eferente simpática. No entan-

Page 216: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

104

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D

to, uma das limitações da avaliação do componentesimpato-excitatório do quimiorreflexo por meio dasalterações na pressão arterial é o fato de que manipu-lações no sistema nervoso central, por meio da micro-injeção de antagonistas como o ácido quinurênico noNTS podem influenciar outros sistemas de regulaçãocomo o barorreflexo e conseqüentemente alterar apressão arterial basal, tornando difícil a análise e ainterpretação dos resultados. Nesse sentido, recente-mente introduzimos no nosso laboratório a prepara-ção coração-tronco cerebral isolados, a qual foi de-senvolvida pelo professor Julian F.R. Paton, na Uni-versidade de Bristol, Inglaterra14.

A preparação coração-tronco cerebral isoladosconsiste de uma preparação in situ, na qual os experi-mentos são realizados na ausência dos efeitos da anes-tesia. As etapas para a obtenção dessa preparação eas suas principais características são as seguintes:a) o animal é inicialmente anestesiado com um anes-

tésico de inalação e logo a seguir descerebrado,b) é feita uma transecção subdiafragmática, retirado

todo o sangue e por meio da artéria aorta se iniciaa perfusão artificial com uma solução de fluidocerebroespinhal artificial propulsionada por meiode uma bomba peristáltica, cuja velocidade (fluxo)determinará o nível da pressão de perfusão,

c) a preparação possui um padrão respiratório motor“eupnêico”,

d) todos os reflexos cardiovasculares estão preserva-dos,

e) permite os registros da freqüência cardíaca, da ati-vidade do nervo frênico e principalmente o regis-tro direto da atividade eferente simpática torácica.

Além disso, a preparação coração-tronco ce-rebral isolados permite a obtenção de um elevado ín-dice de histologias positivas nos experimentos commicroinjeções no NTS, uma vez que a superfície dorsaldo tronco cerebral é exposta e facilmente acessívelcom as micropipetas de vidro, acopladas ao estereo-táxico e conectadas a uma bomba de pressão para ainjeção de drogas no NTS.

Tendo em vista os resultados obtidos em ratosacordados com a microinjeção do ATP no NTS des-critos no item anterior12,13, passamos a utilizar a pre-paração-coração tronco cerebral isolados para explo-rar o possível envolvimento do ATP na neurotransmis-são do quimiorreflexo no NTS. Nesse sentido é im-portante destacar que a ativação do quimiorreflexocom KCN na preparação coração-tronco cerebral iso-

lados promove aumento da atividade simpática, bradi-cardia e aumento da atividade do nervo frênico, o quecontribui para que essa preparação seja um modeloexperimental adequado para esse tipo de estudo. Osresultados obtidos com a preparação coração-troncocerebral isolados, mostraram que a microinjeção deATP no NTS intermediário, sub-região correspondenteàs sinapses do barorreflexo, promoveu respostas debradicardia, apnéia e inibição simpática de forma de-pendente da dose; essas respostas são típicas daquelasobservadas quando da ativação de neurônios envolvi-dos no controle barorreflexo. Por outro lado, a micro-injeção do ATP no NTS caudal, sub-região correspon-dente às sinapses do quimiorreflexo, promoveu respos-tas de bradicardia e taquipnéia dependentes da dose,mas não promoveu qualquer alteração na atividadesimpática, sugerindo que os neurônios do NTS que envi-am projeções para o RVLM, envolvidos na respostasimpato-excitatória do quimiorreflexo, não são excita-dos pelo ATP. Vale lembrar que a preparação cora-ção-tronco cerebral isolados é um modelo experimen-tal que envolve a decerebração ao nível dos colículos, econseqüentemente as conexões entre o NTS e o nú-cleo paraventricular do hipotálamo (PVN) estão au-sentes. Dessa forma, podemos sugerir que o ATP pode-ria promover a excitação de neurônios do NTS queenviam projeções para o PVN, o qual é parte inte-grante das vias neurais do quimiorreflexo15. O aumentoda freqüência de despolarização do nervo frênico (ta-quipnéia) observada no estudo de Antunes et al.16 deusuporte adicional para a hipótese de que o ATP atuan-do no NTS caudal excitaria neurônios envolvidos nocontrole da resposta respiratória do quimiorreflexo13.

Com relação ao envolvimento do L-glutamatoe dos seus receptores na neurotransmissão do quimi-orreflexo no NTS na preparação coração-tronco ce-rebral isolados, verificamos que a microinjeção de di-ferentes antagonistas dos receptores de aminoácidosexcitatórios, como o ácido quinurênico (antagonista nãoseletivo dos receptores ionotrópicos do glutamato) ouo MCPG (antagonista não seletivo dos receptoresmetabotrópicos do glutamato), no NTS caudal não al-terou a magnitude das respostas simpato-excitatória edo nervo frênico promovidas pela ativação dos quimi-orreceptores periféricos, sugerindo que o L-glutama-to e os seus receptores não parecem estar envolvidosna neurotransmissão do componente simpato-excita-tório do quimiorreflexo no NTS caudal, pelo menosno que diz respeito aos neurônios do NTS que enviamprojeções para os neurônios do RVLM17. Esses re-

Page 217: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

105

Controle central da atividade simpática

sultados estão de acordo com estudos descritos noitem anterior com ratos não-anestesiados. Atualmen-te estamos explorando a possível interação entre oL-glutamato e o ATP no processamento das informa-ções aferentes dos quimiorreceptores periféricos noNTS e as perspectivas para o melhor entendimentodesse complexo sistema de neurotransmissão do com-ponente simpato-excitatório do quimiorreflexo no NTSsão excelentes.

A preparação coração-tronco cerebral isoladoscomo destacado anteriormente oferece uma série devantagens. No entanto ela tem, como todos os proce-dimentos experimentais, as suas limitações entre asquais destacamos:a) o animal é decerebrado o que impossibilita os estu-

dos de conexões prosencefálicas com as estrutu-ras do tronco cerebral;

b) a preparação é mantida numa temperatura de apro-ximadamente 32o C, diferente daquela do animalintacto;

c) a preparação é perfundida com uma solução artifi-cial e não mais com sangue;

d) a pressão de perfusão da preparação é baixa (~60mmHg) e determinada pela velocidade da bombade perfusão;

e) os barorreceptores artérias nestas condições en-contram-se desativados. Apesar dessas limitaçõesa preparação mantém ventilação espontânea e to-dos os reflexos cardiovasculares estão preserva-dos. Em geral as preparações são viáveis por perí-odos de até 3 horas de duração.

4- ELETROFISIOLOGIA PATCH-CLAMP DENEURÔNIOS DO NTS EM FATIAS DOTRONCO CEREBRAL

Embora a utilização das técnicas de microinje-ções no NTS de animais não-anestesiados e na pre-paração coração-tronco cerebral isolados tenham tra-zido grandes contribuições para o estudo da neuro-transmissão do quimiorreflexo, os resultados obtidos apartir dessa abordagem não foram suficientes paraidentificar o neurotransmissor envolvido no processa-mento do componente simpato-excitatório (respostapressora) do quimiorreflexo. Para isso é necessária autilização de técnicas refinadas para a avaliação daneurotransmissão no NTS. Com essa finalidade intro-duzimos no nosso laboratório a técnica eletrofisiológi-ca de patch-clamp em fatias do tronco cerebral, aqual está nos permitindo estudar em detalhes os me-

canismos eletrofisiológicos da membrana celular e tam-bém aspectos funcionais da transmissão sináptica emneurônios do NTS.

Embora as células do NTS apresentem um diâ-metro pequeno, a utilização da técnica de patch-clampnessas células já tem sido bastante utilizada por ou-tros laboratórios especializados na eletrofisiologia deneurônios do NTS18/,22. Esses estudos permitem o re-gistro de correntes iônicas macro e/ou microscópicasque fluem pela membrana celular através de canaisiônicos, como também a detecção de modificações nopotencial da membrana em resposta ao fluxo dessesíons. Assim, com a implantação dessa técnica em nossolaboratório temos como objetivo principal avaliar osdiferentes aspectos da neurotransmissão nos neurô-nios integrantes das vias neurais do quimiorreflexo noNTS. Nosso foco principal corresponde à identifica-ção dos neurônios do NTS que enviam projeções parao RVLM, os quais poderiam fazer parte das proje-ções simpato-excitatórias do quimiorreflexo. A préviamarcação com o traçador retrógrado DiI (corantefluorescente) desses neurônios do NTS que enviamprojeções para o RVLM, permite que os mesmos se-jam identificados sob microscopia de contraste e en-tão realizados os estudos eletrofisiológicos dos mes-mos. Nesses experimentos podemos, na configuraçãovoltage-clamp (-70 mV), fazer o registro eletrofisio-lógico de correntes pós-sinápticas espontâneas exci-tatórias (sEPSCs) ou excitatórias estimuladas(eEPSCs) pelo estimulo elétrico do Trato Solitário.Posteriormente avaliamos também se os receptoresdo L-glutamato e/ou do ATP participam da sinapseexcitatória entre esses neurônios, por meio da perfu-são da fatia com antagonistas seletivos para esses re-ceptores e registro das sEPSCs e eEPSCs. O possí-vel bloqueio dessas correntes sinápticas pelos antago-nistas dos receptors de L-glutamato e/ou ATP nos per-mitirão identificar se esses neurotransmissores estãoenvolvidos na sinapse entre os neurônios do NTS eRVLM, supostamente envolvidos na resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo. Com esses procedimen-tos experimentais esperamos poder caracterizar osneurotransmissores e neuromoduladores envolvidos noprocessamento do componente simpato-excitatório doquimiorreflexo no NTS.

Embora a técnica de patch-clamp permita oregistro da atividade neuronal ela, como as demaistécnicas experimentais, apresenta as suas limitações,entre as quais podemos destacar:a) é uma abordagem experimental in vitro;

Page 218: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

106

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D

b) permite a cada experimento o registro de um úniconeurônio, o que implica necessariamente no regis-tro de um elevado número de neurônios para queos achados sejam representativos da atividade dosneurônios daquele núcleo em estudo;

c) alguns dos circuitos neuronais podem ser secciona-dos durante a obtenção da fatia, o que pode even-tualmente comprometer a integração sináptica emanálise. Portanto, mais uma vez vale ressaltar queapenas a combinação de vários procedimentostécnicos e experimentais nos permitirão um me-lhor entendimento dessa complexa neurotransmis-são/neuromodulação nos neurônios do NTS.

5- HIPÓXIA INTERMITENTE

A hipóxia intermitente (HI) é uma condiçãoexperimental que consiste em submeter os animais aepisódios de hipóxia intercalados por períodos denormóxia, os quais se repetem por um longo períodode tempo. Esse modelo experimental, inicialmentedesenvolvido por Fletcher et al.23, tem sido utilizadopara promover em ratos as situações de hipóxia se-melhantes àquelas observadas nos pacientes acome-tidos pela apnéia obstrutiva do sono (AOS). O inte-resse em mimetizar essa condição fisiopatológica emmodelos animais decorreu de observações sobre aevolução clínica desses pacientes ao longo de anos,nos quais foi verificada uma grande incidência de pro-blemas cardiovasculares, com destaque para o desen-volvimento da hipertensão arterial24.

Os estudos de Fletcher et al.23 verificaram queratos expostos a uma redução da PO2 de 21% a 5% acada 30 segundos, 8 horas por dia, durante 5 semanas,apresentavam um aumento significativo da pressãoarterial média, assim como observado nos pacientescom AOS. Estudos de Fletcher et al.25 também mos-traram que quando os animais eram submetidos a des-nervação dos quimiorreceptores periféricos localiza-dos nos corpúsculos carotídeos, os mesmos não apre-sentavam o aumento da pressão arterial média em res-posta a HI, indicando que as alterações na pressãoarterial eram decorrentes da estimulação dos quimior-receptores periféricos a cada episódio de hipóxia.

Vários estudos sugeriram que esse aumento dapressão arterial observado nos ratos submetidos à HIseria decorrente de uma hiperatividade simpática26,27,assim como foi mostrado nos pacientes com AOS28.Portanto, partindo da premissa de que ratos submeti-dos à HI poderiam apresentar um aumento da ativida-de simpática basal, passamos a utilizar esse modelo

experimental para o estudo dos mecanismos neuraisenvolvidos com a gênese e a modulação da atividadesimpática. Tendo em vista que não havia evidênciasdiretas de que a atividade simpática estivesse realmenteaumentada após a HI, utilizamos a análise espectralpara avaliar a variabilidade do componente simpáticosobre o sistema cardiovascular. Além disso, tambémrealizamos a avaliação do tônus simpático vasomotorapós a HI por meio da administração do bloqueadorganglionar hexametônio ou do antagonista dos recep-tores a 1-adrenérgicos prazosin. O conjunto dos resul-tados obtidos indicou que a atividade simpática de ra-tos submetidos à HI não parece estar aumentada29,contrariando as sugestões feitas anteriormente poroutros autores. Além disso, estudos do nosso laborató-rio, utilizando esse modelo experimental indicaram queo aumento de pressão arterial observado após a HIseria decorrente de alterações hormonais, as quaispoderiam influenciar o controle do tônus vascular29.

Dessa forma, o modelo experimental da HI, nonosso entendimento, não parece se caracterizar poruma hiperatividade simpática. No entanto, mesmo nãoapresentando um aumento da atividade simpática ba-sal, esse modelo nos parece adequado para o estudodos mecanismos centrais envolvidos com a geração emodulação da atividade simpática, pois já foi demons-trado que ratos submetidos à HI, quando expostos aum novo episódio de hipóxia, apresentam as respostassimpato-excitatória30 e ventilatória31 exacerbadas.Considerando que o NTS é a região na qual ocorrem assinapses das aferências dos quimiorreceptores, e quenesse núcleo diferentes neurotransmissores estãoenvolvidos com o processamento das respostas autonô-micas e ventilatórias, é provável que ocorram altera-ções na neurotransmissão do quimiorreflexo no NTSapós a HI, as quais poderiam explicar as respostasexacerbadas quando os animais são submetidos a umanova situação de hipóxia. Portanto, o entendimento des-sas possíveis alterações no NTS poderá nos auxiliarna determinação dos neurotransmissores envolvidosnas diferentes respostas do quimiorreflexo, especial-mente do componente simpato-excitatório, o qual é oprincipal foco de investigação do nosso laboratório.

6- IMUNOHISTOQUÍMICA DE RECEPTO-RES NO NTS E EXPRESSÃO DA PROTEÍ-NA FOS

O NTS é dividido, no seu aspecto rostro-cau-dal, em três sub-núcleos: NTS rostral, NTS comissu-ral intermediário e NTS comissural caudal32. Estudos

Page 219: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

107

Controle central da atividade simpática

anatômicos33 e funcionais34,35 mostraram a participa-ção do NTS comissural nas vias neurais do quimiorre-flexo. Com a finalidade de identificar mais precisa-mente as diferentes sub-regiões do NTS comissuralintermediário e do NTS comissural caudal envolvidasno processamento das informações aferentes dos qui-miorreceptores periféricos, estamos utilizando técni-cas de imunohistoquímica. A ativação intermitente doquimiorreflexo por períodos de 30 minutos pode pro-mover a expressão da proteína Fos, a qual correspon-de a uma proteína de transcrição e que faz parte dafamília dos immediate early gene, cuja expressão ini-cia-se poucos minutos após a excitação neuronal.Portanto, a expressão da proteína Fos, revelada pormeio de procedimentos de imunohistoquímica, podeser utilizada como um indicador da atividade neuro-nal36/39. Nos nossos estudos verificamos que o estí-mulo intermitente do quimiorreflexo com KCN (i.v.)por 30 minutos ativa neurônios nos aspectos lateraistanto do NTS comissural intermediário quanto do NTScomissural caudal40. A localização específica dessesneurônios em sub-regiões do NTS nos permitirá umamelhor caracterização eletrofisiológica e neuroquími-ca dos neurônios do NTS envolvidos na neurotrans-missão do quimiorreflexo no NTS.

Além de ser utilizada na revelação da expres-são da proteína FOS, temos utilizado os procedimen-tos de imunohistoquímica para a marcação de subuni-dades específicas de receptores de aminoácidos exci-tatórios (AAE) com vistas ao melhor entendimento doscomplexos mecanismos neuroquímicos no NTS envol-vidos na neurotransmissão do quimiorreflexo. Nessesestudos temos utilizado a técnica de imunofluorecên-cia para a análise das diferentes subunidades dos re-ceptores de AAE e dos receptores P2 do ATP no NTSde ratos submetidos à hipóxia intermitente (HI), na qualo quimiorreflexo, como descrito anteriormente, é ati-vado de forma intermitente ao longo de várias sema-nas. Optamos pela técnica de imunofluorescência porser um método mais sensível que os métodos enzimá-ticos na revelação da imunorreatividade aos diferen-tes subtipos de receptores41. Os métodos enzimáticosapresentam uma maior difusão da imunomarcação, poisos neurônios apresentam muitas enzimas endógenasque precisam ser bloqueadas e a realização deste blo-queio pode afetar a morfologia do tecido, o que nãoacontece com o método de imunofluorescência. Alémdisso, a imunofluorescência é um método estequiomé-trico, pois o anticorpo secundário já vem com o mar-cador fluorescente. Portanto, uma molécula de anti-

corpo secundário com o marcador fluorescente irá seligar ao antígeno, enquanto que no método enzimáticoa reação de revelação do antígeno que ocorre não éestequiométrica, isto é, não há controle da quantidadede DAB (diaminobenzidina) que irá reagir com a en-zima (peroxidase) que está presente na molécula doanticorpo secundário. Dessa forma, na imunomarca-ção com métodos enzimáticos não há correlação en-tre intensidade óptica e a concentração de antígeno.Adicionalmente, uma outra vantagem da imunofluo-rescência é que este método permite uma melhor de-finição na localização de diferentes antígenos numamesma célula ou tecido por meio da utilização defluorocromos de cores diferentes42.

Uma das limitações desses métodos de imuno-marcação se refere ao fato dos mesmos não seremquantitativos, o que dificulta a identificação de even-tuais alterações na densidade de um determinadosubtipo de receptor numa região específica do siste-ma nervoso central, como no caso do NTS. Portanto,além dos estudos qualitativos por meio da imunofluo-recência das diferentes subunidades dos receptoresde aminoácidos excitatórios e dos receptores P2 doATP no NTS de ratos submetidos à HI, estamos utili-zando os procedimentos semi-quantitativos por meioda técnica de Western-blot, a qual se caracteriza pelaseparação, por meio da eletroforese, das proteínas deum homogenato de células ou tecidos, que após se-rem transferidas para uma membrana de nitrocelulosepodem ser imunodetectadas e quantificadas. Com essaabordagem experimental queremos avaliar se a HIpromove alterações na densidade dos receptores glu-tamatérgicos e purinérgicos no NTS, uma vez queevidências experimentais sugerem que estes dois sis-temas de neurotransmissão possam estar atuando con-juntamente no processamento do componente simpato-excitatório do quimiorreflexo no NTS.

7- PERSPECTIVAS

Os estudos concluídos ou em andamento nonosso laboratório relacionados a neurotransmissão docomponente simpato-excitatório do quimiorreflexo noNTS de ratos indicam que o L-glutamato e os recep-tores de aminoácidos excitatórios não parece ser oúnico sistema de neurotransmissão do quimiorreflexoe apontam para uma possível participação do ATP edos receptores P2 nesse processamento. Os meca-nismos e as possíveis interações entre os sistemas glu-tamatérgicos e purinérgicos nessa importante neuro-

Page 220: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

108

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D

REFERÊNCIAS

1 - Machado BH. Neurotransmission of the cardiovascular re-flexes in the nucleus tractus solitarii of awake rats.In: Chapleau MW, Abboud F, eds. Neuro-cardiovascular regu-lation-from molecules to man. Ann N Y Acad Sci 2001; 940:179-96.

2 - Machado BH, De Paula PM, Callera JC. Regulação reflexada circulação. In: Tibiriçá E, ed. Fisiopatologia em MedicinaCardiovascular. Rio de Janeiro: Revinter; 2001. p. 27-52.

3 - Machado BH. Chemoreflex and sympathoexcitation. In: DunNJ, Machado BH, Pilowsky PM, eds. Neural mechanisms ofcardiovascular regulation. Boston: Kluwer Academic Publish-ers; 2004. p. 31-58.

4 - Franchini KG, Krieger EM. Cardiovascular responses ofconscious rats to carotid body chemoreceptors stimulationby intravenous KCN. J Auton Nerv System 1993; 42: 63-70.

5 - Haibara AS; Colombari E; Chianca Jr DA; Bonagamba LGH;Machado BH. NMDA receptors in NTS are involved inbradycardic but not in pressor response of chemoreflex. AmJ Physiol 1995; 269: H1421-7.

6 - Barros RC; Bonagamba LGH; Okamoto-Canesin R; De OliveiraM; Branco LGS, Machado BH. Cardiovascular responsesto chemoreflex activation with potassium cyanide or hypoxichypoxia in awake rats. Auton Neurosci 2002; 97: 110-5.

7 - Michelini LC, Bonagamba LGH. Baroreceptor reflex modulationby vasopressin microinjected into the nucleus tractus solitariiof conscious rats. Hypertension 1988; 11 (Suppl. I): I-75-I-79.

8 - Fernandes LG, Antunes VR, Bonagamba LGH, Machado BH.Pressor response to chemoreflex activation in awake rats:role of vasopressin and adrenal medulla. Physiol Behav 2005;84: 39-44.

9 - Haibara AS, Bonagamba LGH, Machado BH. Sympathoexci-tatory neurotransmission of the chemoreflex in the NTS ofawake rats. Am J Physiol 1999; 276: H1215-22.

transmissão continua sendo objeto de estudos, comparticular interesse na possível co-transmissão peloL-glutamato e o ATP. Para isso, diferentes aborda-gens experimentais como a eletrofisiologia e a imuno-histoquímica serão indispensáveis para o melhor co-nhecimento da neuroquímica dessa neurotransmissão.Caso esses mecanismos glutamatérgicos e purinérgi-cos estejam efetivamente envolvidos na neurotrans-missão desse componente simpato-excitatório no NTS,estaremos abrindo um campo de investigação impor-tante relacionado aos mecanismos neurais de disfun-ções autonômicas como a hiperatividade simpática,

responsável, pelo menos em parte, pela geração emanutenção da hipertensão arterial. Nesse sentido, ouso de diferentes abordagens experimentais, desde umneurônio isolado do NTS até o rato acordado e comlivre movimentação, será indispensável para que essafronteira do conhecimento seja conquistada.

AGRADECIMENTOS

Os estudos do nosso laboratório citados na pre-sente revisão tiveram o apoio financeiro da FAPESP,CNPQ, PRONEX e CAPES.

Machado BH, Cruz JC, Pajolla GP, Zoccal DB, Braga VA, Accorsi-Mendonça D. Different experimentalapproaches to study the sympathetic modulation in the central nervous system of rats. Medicina(Ribeirão Preto) 2006; 39 (1): 101-109.

ABSTRACT: The main purpose of the present review is to present the experience of our labo-ratory on the last few years on studies related to the neurotransmission of the sympatho-excitatorycomponent of the chemoreflex in the nucleus tractus solitary (NTS) of rats. The experimentalapproach of the chemoreflex activation has been used as a model for the understanding of theneurochemical mechanisms involved in the generation and modulation of the sympathetic activity,which have influence on the cardiovascular system on physiological and pathophysiological cir-cumstances such as arterial hypertension. The specific focus of this review is the neurotransmis-sion of the sympatho-excitatory component of the chemoreflex in the NTS but also we presentseveral methods and experimental approaches used currently in our laboratory in order to under-stand this complex neurotransmission system. Using this combination of methods from the NTSneurons to the awake rat, we wish to discuss the use of several contemporary techniques, whichare allowing us to expand the frontiers of this important scientific area.

Keywords: Chemoreflex. NTS. Hypoxia. Autonomic Nervous System. L-glutamate. ATP.Pressure Blood.

Page 221: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

109

Controle central da atividade simpática

10 - Machado BH, Bonagamba LGH. Antagonism of glutamatereceptors in the intermediate and caudal NTS of awake ratsproduced no changes in the hypertensive response tochemoreflex activation. Auton Neurosci 2005; 117: 25-32.

11 - Yao ST, Barden JA, Finkelstein DI, Bennet MR, Lawrence AJ.Comparative study on the distribution patterns of P2X(1)-P2X(6) receptor immunoreactivity in the brainstem of the ratand the common marmoset (Callithrix jacchus): Associationwith catecholamines cell groups. J Comp Neurol 2000; 427:485-507.

12 - De Paula PM, Antunes VR, Bonagamba LGH, Machado BH.Cardiovascular responses to microinjection of ATP into thenucleus tractus solitarii of awake rats. Am J Physiol RegulInteg Comp Physiol 2004; 287: R1164-71.

13 - Antunes VR, Bonagamba LGH, Machado BH. Hemody-namic and respiratory responses to microinjection of ATPinto the intermediate and caudal NTS of awake rats. BrainRes 2005; 1032: 85-93.

14 - Paton JFR. A working heart-brainstem preparation of themouse. J Neurosci Methods 1996; 65, 63-8.

15 - Olivan MV, Bonagamba LGH, Machado BH. Involvement ofthe paraventricular nucleus of the hypothalamus in the pres-sor response to chemoreflex activation in awake rats. BrainRes 2001; 895(1/2):167-72.

16 - Antunes VR, Braga VA, Machado BH. Autonomic and respi-ratory responses to microinjection of ATP into the intermedi-ate or caudal nucleus tractus solitarius in the working heart-brainstem preparation of the rat. Clin Exp Pharmacol Physiol2005; 32: 467-72.

17 - Braga VA, Machado BH. Chemoreflex sympathoexcitationis not altered by the antagonism of glutamate receptors inthe commissural NTS in the working heart-brainstem prepa-ration of rat. Exp Physiol. Em publicação 2006.

18 - Ueno S, Ishibashi H, Akaike N. Perforated-patch methodreveals extracellular ATP-induced K+ conductance in disso-ciated rat nucleus solitarii neurons. Brain Res 1992;597(1):176-9.

19 - Andresen MC, Yang M. Dynamics of sensory afferent syn-aptic transmission in aortic baroreceptor regions on nucleustractus solitarius. J Neurophysiol 1995; 74:1518-28.

20 - Aylwin ML, Horowitz JM, Bonham AC. NMDA receptors con-tribute to primary visceral afferent transmission in the nucleusof the solitary tract. J Neurophysiol 1997; 77:2539-48.

21 - Kato F, Shigetomi E. Distinct modulation of evoked andspontaneous EPSCs by purinoceptors in the nucleus trac-tus solitarii of the rat. J Physiol 2001; 530(Pt 3): 469-86.

22 - Endoh T. Characterization of modulatory effects of postsyn-aptic metabotropic glutamate receptors on calcium currentsin rat nucleus tractus solitarius. Brain Res 2004; 1024(1/2):212-24.

23 - Fletcher EC, Lesske J, Quiam W, Miller CC, Unger T. Repeti-tive episode hypoxia causes diurnal elevation of systemicblood pressure in rats. Hypertesion 1992; 19: 555-61.

24 - Hla K, Young T, Bidwell M, Palta M, Skatrud J, Dempsey J.Sleep apnea and hypertension: a population-based study.Ann Intern Med 1994; 120: 382-8.

25 - Fletcher EC, Lesske J, Behm R, Miller CC, Stauss H, Unger T.Carotid chemoreceptors, systemic blood pressure, andchronic episodic hypoxia mimicking sleep apnea. J ApplPhysiol 1992; 72: 1978-84.

26 - Sica AL, Greenberg HE, Ruggiero, Scharf SM. Chronicintermittent hypoxia: a model of sympathetic activation in therat. Resp Physiol 2000; 121: 173-84.

27 - Fletcher EC. Physiological consequences of intermittenthypoxia: systemic blood pressure. J Appl Physiol 2001;90:1600-5.

28 - Somers VK, Dyken ME, Clary MP, Abboud FM. Sympatheticneural mechanisms in obstructive sleep apnea. J Clin Invest1995; 96:1897-904.

29 - Zoccal DB. Função cardiovascular de ratos submetidos àHCI. [Dissertação de Mestrado em Fisiologia], Ribeirão Pre-to: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP; 2006.

30 - Greenberg HE, Sica A, Batson D, Scharf SM. Chronic inter-mittent hypoxia increases sympathetic responsiveness tohypoxia and hypercapnia. J Appl Physiol 1999; 86:298-305.

31 - McGuire M, Zhang Y, White DP, Ling L. Chronic intermittenthypoxia enhances ventilatory long-term facilitation in awakerats. J Appl Physiol 2003; 95: 1499-1508.

32 - Spyer KM. The central nervous organization of reflexcirculatory control. In: Loewy AC, Spyer KM, eds. Centralregulation of autonomic functions. New York: Oxford, 1990.p. 168-88.

33 - Finley JC, Katz DM. The central organization of carotid bodyafferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res1992; 572(1/2):108-16.

34 - Vardhan A, Kachroo A, Sapru HN. Excitatory amino acidreceptors in commissural nucleus of the NTS mediate ca-rotid chemoreceptor responses. Am J Physiol 1993; 264(1Pt 2):R41-50.

35 - Zhang W, Mifflin SW. Excitatory amino acid receptorswithin NTS mediate arterial chemoreceptor reflexes in rats.Am J Physiol 1993; 265(2 Pt 2):H770-3.

36 - Berquim P, Bodineau L, Gros F, Larnicol N. Brainstem andhypothalamic areas involved in respiratory chemoreflex: aFos study in adults rats. Brain Res 2000; 857: 30-40.

37 - Chan RK, Jarvina EV, Sawchenko P E. Effects of selectivesinoaortic denervations on phenylephrine-induced activa-tional responses in the nucleus of the solitary tracts. Neuro-science 2000; 101:165-78.

38 - Greenberg H E, Sica AL, Ruggiero DA. Expression of c-fosin the rat brainstem after chronic intermittent hypoxia. BrainRes 1999; 816:638-45.

39 - Hirooka Y, Polson JW, Potts PD, Dampney RAL. Hypoxia-induced Fos expression in neurons projecting to the pres-sor region in the rostral ventrolateral medulla. Neuroscience1997; 80:1209-24.

40 - Cruz JC. Expressão da proteína c-FOS em neurônios donúcleo do trato solitário e do núcleo paraventricular dohipotálamo em resposta à estimulação do quimiorreflexo emratos não anestesiados. [Dissertação de Mestrado em Fisi-ologia], Ribeirão Preto: Faculdade de Medicina de RibeirãoPreto - USP; 2004.

41 - Mao S-Y. Conjugation of fluorochromes to antibodies. In:Javois LC ed. Methods in molecular biology - Immunocy-tochemical methods and protocols. 2nd ed. Totowa (NJ):Humana Press INC.; 1999. p.35-8.

42 - Krenacs T, Krenacs L, Raffeld M. Multiple antigen immun-ostaining procedures. In: Javois LC ed. Methods in molecularbiology - Immunocytochemical methods and protocols. 2nd ed.Totowa (NJ): Humana Press INC.; 1999. p. 223-234.

Page 222: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Clinical 131 (2007) 65–69www.elsevier.com/locate/autneu

Autonomic Neuroscience: Basic and

Differential influence of iNOS and nNOS inhibitors on rostralventrolateral medullary mediated cardiovascular

control in conscious rats

Marli C. Martins‐Pinge a,⁎, Martha R.L. Garcia a,Daniel B. Zoccal c, Carlos C. Crestani d, Phileno Pinge‐Filho b

a Department of Physiological Sciences, State University of Londrina, Londrina, PR, Brazilb Department of Pathological Sciences, State University of Londrina, Londrina, PR, Brazil

c Department of Physiology, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazild Department of Pharmacology, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Received 21 March 2006; received in revised form 7 July 2006; accepted 10 July 2006

Abstract

We evaluated the cardiovascular effects of nitric oxide (NO) inhibitors microinjected into the rostral ventrolateral medulla (RVLM) ofconscious rats. Application of L‐NAME or aminoguanidine (AG) induced an increase in arterial blood pressure (MAP) and an increase inheart rate, whereas 7‐nitroindazole (7‐NI) decreased MAP and HR. Microinjection of glutamate produced an increase in MAP which wasfollowed by either a tachycardia or a bradycardia. Such responses were blocked totally by prior administration of L‐NAME and attenuated(∼ 50%) by 7‐NI. In contrast, glutamate responses were enhanced by following AG. We conclude that in conscious rats, NO has tonic effectsin the RVLM and may participate in the modulation of the actions of glutamate through iNOS and nNOS pathways.© 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Nitric oxide; Conscious rats; RVLM; Arterial pressure

It is now well established that within the RVLM nitricoxide (NO) influences neural elements regulating cardio-vascular functions (Patel et al., 2001). The premotor neuronsin the RVLM which provide a major tonic excitatory drive tosympathetic preganglionic neurons (Guertzenstein andSilver, 1974; Dampney, 1994), are an important site ofaction of NO. So the RVLM can be considered a potentialtarget site for NO to exert its modulatory action oncardiovascular functions.

In fact, NO seems to play a functional role in the RVLMas neurons in the area express NO synthase (Iadecola et al.,

⁎ Corresponding author. Departamento de Ciências Fisiológicas, Centrode Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina; Rodovia CelsoGarcia Cid, Km 380, Campus Universitário, CEP 86055–900, Londrina,PR, Brazil. Tel.: +55 43 3371 4307; fax: +55 43 3371 4467.

E-mail addresses: [email protected], [email protected](M.C. Martins‐Pinge).

1566-0702/$ - see front matter © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.autneu.2006.07.004

1993; Hirooka et al., 1996). Some investigators reportedincreases in arterial pressure to NO donors microinjected inRVLM (Hirooka et al., 1996; Martins‐Pinge et al., 1997),whereas others reported decreases in arterial pressure(Shapoval et al., 1991; Zanzinger et al., 1995; Tseng et al.,1996; Kagiyama et al., 1997). In the study of Morimoto et al.(2000), the authors used different doses of NO donors or NOprecursors and showed that low doses of exogenous NO inthe RVLM increased arterial pressure in a dose‐dependentmanner, whereas high NO doses decreased arterial pressure.A recent report (Chan et al., 2001a) shows that inducible NOsynthase (iNOS) and neuronal NO synthase (nNOS) mRNAare present in the ventrolateral medulla, and underphysiologic conditions, both nNOS and iNOS in theRVLM are active at the levels of functional expression andmolecular synthesis. In another study of the same group(Chan et al., 2001b), the authors observed that selectiveblockade of nNOS or iNOS activity in the RVLM resulted in

Page 223: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Fig. 1. Histology of the lower brain stem showing the center of the micro-injection in the RVLM (shaded area) of one representative animal (A) and aschematic representation (B) of an injection site. Amb, ambiguous nucleus;mlf, medial longitudinal fasciculus; py, pyramidal tractus; RVL, rostroven-trolateral reticular nucleus; Sp5O, spinal trigeminal nucleus, oral part.

66 M.C. Martins‐Pinge et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 131 (2007) 65–69

an arterial pressure and sympathetic vasomotor reductionand enhancement, respectively.

In anesthetized animals, Chan et al. (2003) demonstratedthat NO derived from nNOS induced sympathoexcitation viaionotropic glutamate receptors and NO generated by iNOSelicited sympathoinhibition via GABAA receptors in theRVLM. Although this study was conducted under physio-logical conditions, the approach was done in anesthetizedanimals, a condition that may be a limiting factor in theinterpretation and analysis of the results. In contrast,Mayorov (2005) was unable to demonstrate an effect ofRVLM‐applied NOS inhibitors on cardiovascular variablesof conscious rabbits. The author suggested that the disparitybetween the studies, apart from species differences, mayrelate to the influence of anesthesia and surgical stress, whichcan rapidly activate iNOS. The effects of NOS inhibitors inthe RVLM of conscious rats have not been evaluated.

The aim of the present study was to investigate thecardiovascular effects of NOS blockade into the RVLMneurons on responses to the microinjection of glutamate intothe RVLM of awake unrestrained rats.

All experiments were performed in conscious, freelymoving, adult male Wistar rats (n=22) supplied by thecentral animal house of the State University of Londrina inBrazil. The animals were housed individually in Perspexcages in a room with a 12:12‐h light/dark cycle. Food andwater were always available except during the experiments.All experimental protocols were performed in accordancewith the Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsand the Ethical Principles for Animal Experimentationestablished by the Brazilian Committee for Animal Experi-mentation (COBEA) and were approved by the animalexperimentation Ethics Committee of the State University ofLondrina (CEEA/UEL).

Initially, the rats were anesthetized with sodium pento-barbital (40 mg/kg IP) and placed prone in a stereotaxicapparatus (David Kopf Institute) with the incisor bar 5 mmbelow the interaural line. The methodology for implantationof guide cannulas and their fixation was the same asdescribed previously (Martins‐Pinge et al., 1997).

Twenty‐four hours before the experiments, under anesthe-sia (sodium pentobarbital, 40 mg/kg IP), the femoral arteryand vein were cannulated, and the catheters were dorsallyexternalized to record arterial pressure (AP) and drugadministration, respectively. On the day of the experiment,the animals were kept in their cages, and basal recordingswere obtained for at least 30 min. The mean arterial bloodpressure (MAP) was recorded by using a Statham A23XLtransducer (Statham Instruments) connected to a Narco Bio‐System Physiograph MK‐III‐S recorder. A micropipette wasconnected to a 0.5 μL Hamilton syringe (7101) and insertedinto the guide cannula. Just before infusion, all drugs weredissolved in physiological saline. L‐Glutamate (5 nmol/L,100 nl) was unilaterally microinjected into the RVLM beforeand 15 min after using the administration of one of the NOSinhibitors: the nonselective constitutive NOS inhibitor, L‐

NAME (15 nmol/100 nl), or the relative selective iNOSinhibitor, aminoguanidine (250 pmol/100 nl) or the selectivenNOS inhibitor, 7 NI (5 pmol/100 nl). L‐Glutamate,aminoguanidine and 7‐nitroindazole were obtained fromSigma Chemical Co. L‐NAME was obtained from RBI(Research Biochemicals International).

The choice of dose for aminoguanidine and 7 NI wasbased in previous studies (Chan et al., 2001a, b) which haddemonstrated the effective inhibition of iNOS by amino-guanidine and nNOS by 7 NI. We believe that using lowdoses of antagonists we can better preserve the selectivity ofthe drug. In the case of L‐NAME, (our first experiments), webelieve we are inhibiting both nNOS and eNOS pathways.

The maximal response to L‐glutamate and NOS inhibitorswere noted. The microinjections into the RVLM did notproduce any overt signs of discomfort. For microinjections, a30‐G needle was slowly lowered through the guide cannulainto the RVLM. The placement of the injection needle in theRVLM produced in all animals a transient increase in MAP.The microinjection was only made when the mechanicaltransient increase in MAP had recovered to basal values.

At the end of the experiments, 100 nl of 2% Evans bluedye was injected into the same site. The rats were submittedto euthanasia with an overdose of anesthetic, and the brain

Page 224: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Fig. 2. Chart recordings showing mean arterial pressure (MAP, mm Hg) andheart rate (HR, bpm) of NOS inhibitors microinjected into the RVLM(arrows).

Fig. 3. Bar graphs show the maximal alterations in mean arterial pressure(MAP) and heart rate (HR) produced by the NOS inhibitors microinjectedinto the RVLM. The numbers in parentheses represent number of animalsper group. (⁎) Significantly different compared to values before drugmicroinjection. (#) Significantly different compared to saline values(p<0.05).

67M.C. Martins‐Pinge et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 131 (2007) 65–69

stem was removed and fixed in 10% formaldehyde. Injectionsites were evaluated at the conclusion of each experiment byobserving the dye diffusion within the RVLM and plottingthem on schematic diagrams. For histological identificationof the injection sites, the brain stem was cut coronally into40‐μm‐thick sections and stained with 1% neutral red.

All data are reported as mean±S.E.M. Changes inmaximal responses induced by microinjection of drugs into

the RVLM were analyzed by paired Student's t‐test. One‐way analysis of variance (ANOVA) followed by Student'st‐test was used to test changes between groups. The crite-rion for statistical significance was P<0.05.

The baseline values for mean arterial pressure (MAP) andheart rate (HR) for each group were considered as a meanvalue of the period of basal recording (±30 min) of eachanimal. Although the baseline mean values for all groupswere not statistically different (MAP: 113±3 mm Hg; HR:375±16 bpm; n=22), the differences between drugs andpreinjection control values were considered separately.

The histological sections were examined microscopicallyand compared to the rat brain atlas (Paxinos and Watson,1998). Only the rats in which the sites of microinjection werelocated in the RVLM were used for data analysis (Fig. 1).

The cardiovascular effects of NOS blockers wereevaluated (Figs. 2 and 3). Unilateral microinjection of L‐NAME (15 nmol/100 nl) into the RVLM produced anincrease in MAP and an increase in HR. The peak responsewas observed after approximately 10 min after microinjec-tion. Unilateral microinjection of aminoguanidine(250 pmol/100 nl) produced an increase in MAP, similar tothe effect of L‐NAME, and a significant increase in HR. In

Page 225: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

68 M.C. Martins‐Pinge et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 131 (2007) 65–69

this case, the peak effect for aminoguanidine was around5 min. In contrast, 7‐NI (5 pmol/100 nl) induced a decreasein MAP and a decrease in HR. The peak response wasobserved around 10 min.

Unilateral microinjections of L‐glutamate into the RVLMelicited an increase in MAP followed by tachycardia orbradycardia. The peak of the response was observed after1 min of the microinjection and returned to basal values after2–3 min. This effect of glutamate was evaluated before andafter NOS blockers (Fig. 4). After L‐NAME, the effects inMAP and HR produced by glutamate was almost abolished.Although the pressor response of glutamate after aminogua-nidine was enhanced, the HR effects of glutamate afteraminoguanidine were not different. The pressor response ofglutamate after 7 NI was attenuated by about 50% comparedwith the first microinjection, and the HR effects wereabolished.

The first contribution of the present study was to confirma physiological role for iNOS at the RVLM in a conscious ratpreparation. Although this effect had been evidenced before(Chan et al., 2001b), it was seen in anaesthetised animals. Wethink that it is important to assess the action of anaesthesia asit has been to differentially influence neurotransmission in

Fig. 4. Bar graphs show the maximal alterations in mean arterial pressure(MAP) and heart rate (HR) produced by L‐glutamate into the RVLM before(control, n=4) and after microinjection of any of the NOS inhibitors used(L‐NAME, n=6; aminoguanidine, n=5; 7‐nitroindazole, n=7). (⁎)Significantly different compared to control (p<0.05).

anaesthetised versus unanaesthetized preparations (Bache-lard et al., 1990; Araújo et al., 1999). We verified that nNOSinhibition produced a decrease in MAP and HR, suggesting atonic effect for nNOS in RVLM. After iNOS inhibition, weobserved an increase in MAP and HR. Our data togethersuggest that nNOS and iNOS contribute to the cardiovas-cular actions of the endogenous NO in the RVLM ofconscious rats.

The second contribution of this study was to show aninterference of both NO pathways (iNOS and nNOS) inglutamate response in the RVLM. Glutamate produces anincrease in MAP when microinjected into the RVLM of bothanesthetized and conscious animals (Bachelard el al., 1990).In our study, a glutamate response was attenuated after 7 NIand enhanced after aminoguanidine, suggesting an interac-tion between NO and glutamate neurotransmission. Thesedata are in line with previous data (Chan et al., 2003) wheremicroinjection of iNOS and nNOS blockers in RVLMpromoting opposed cardiovascular effects were antagonizedby co‐administration into the RVLM of a selective solubleguanylate cyclase (sGC) inhibitor. It is well known that theNO/sGC/cGMP transduction pathway modulates the func-tions of ionotropic glutamate receptors in the brain (Fedeleand Raiteri, 1999) and more specifically in RVLM (Martins‐Pinge et al., 1999). Having this in mind, it is possible thatnitric oxide produced either by nNOS or iNOS can interferewith glutamatergic neurotransmission in RVLM of consciousrats.

The role of nitric oxide has been discussed by manyresearchers, although most of the experiments wereconducted in anesthetized preparations, which can influencethe effects of interventions, both qualitatively and quantita-tively. However, in some other papers, the experiments wereconducted in a conscious preparation. Kishi et al. (2001)injected recombinant adenovirus vectors encoding the cDNAof endothelial NOS (eNOS) into the RVLM. The authorsobserved an overexpression of eNOS in the RVLM resultingin a local increase in NO production. The increased NO inRVLM caused a decrease in MAP, HR and sympatheticactivity in conscious rats. The authors addressed these effectsto an inhibitory role of nitric oxide in RVLM of consciousrats, although there are some comments that arise from thatconclusion: an overexpression of NO could not be aphysiological effect of nitric oxide, it is more likely anactivation of iNOS, which is well known to promote itseffects through great amounts of NO produced.

In conscious rabbits, Mayorov (2005) demonstratedexcitatory effects through NO donors microinjected intothe RVLM, but no tonic effects were observed after NOSblockers. The doses utilized in that paper were the same aswe and others used when working with rats. Maybe thereason for the disparity between our data and Mayorov's datais just related to the different species used.

In summary, the current results are consistent wit the ideathat nNOS and iNOS have tonic cardiovascular effectswithin RVLM. Its actions appear to be produced (nNOS

Page 226: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

69M.C. Martins‐Pinge et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 131 (2007) 65–69

derived) and decreasing (iNOS derived) the efficacy ofglutamate‐mediated neurotransmission.

References

Araújo, G.C., Lopes, O.U., Campos, R.R., 1999. Importance ofglycinergic and glutamatergic synapses within the rostral ventrolateralmedulla for blood pressure regulation in conscious rats. Hypertension34, 752–755.

Bachelard, H., Gardiner, S.M., Bennett, T., 1990. Cardiovascular responseselicited by chemical stimulation of the rostral ventrolateral medulla inconscious unrestrained rats. J. Auton. Nerv. Syst. 31, 185–190.

Chan, J.Y.H., Wang, S.H., Chan, S.H.H., 2001a. Differential roles of iNOSand nNOS at rostral ventrolateral medulla during experimentalendotoxemia in the rat. Shock 15, 65–72.

Chan, S.H.H., Wang, L.L., Wang, S.H., Chan, J.Y.H., 2001b. Differentialcardiovascular responses to blockade of nNOS or iNOS in rostralventrolateral medulla of the rat. Br. J. Pharmacol. 133, 606–614.

Chan, S.H.H., Wang, L.L., Chan, J.Y.H., 2003. Differential engagements ofglutamate and GABA receptors in cardiovascular actions of endogenousnNOS or iNOS at rostral ventrolateral medulla of rats. Br. J. Pharmacol.138, 584–593.

Dampney, R.A.L., 1994. Functional organization of central pathwaysregulating the cardiovascular system. Physiol. Rev. 74, 323–364.

Fedele, E., Raitere, M., 1999. In vivo studies of the cerebral glutamatereceptor /NO/cGMP pathway. Prog. Neurobiol. 58, 89–120.

Guertzenstein, P.G., Silver, A., 1974. Fall in blood pressure produced fromdiscrete regions of the ventral surface of the medulla by glycine andlesions. J. Physiol. 242, 489–503.

Hirooka, Y., Polson, J.W., Dampney, R.A., 1996. Pressor and sympa-thoexcitatory effects of nitric oxide in the rostral ventrolateral medulla.J. Hypertens. 14, 1317–1324.

Iadecola, C., Faris, P.L., Hartman, B.K., Xu, X., 1993. Localization ofNADPH diaphorase in neurons of the rostral ventrolateral medulla:

possible role of nitric oxide in central autonomic regulation and oxygenchemoreception. Brain Res. 603, 173–179.

Kagiyama, S., Tsuchihashi, T., Abe, I., Fujishima, M., 1997. Cardiovasculareffects of nitric oxide in the rostral ventrolateral medulla of rats. BrainRes. 757 (1), 155–158.

Kishi, T., Hirooka, Y., Sakai, K., Shigematsu, H., Shimokawa, H., Takeshita,A., 2001. Overexpression of eNOS in the RVLM causes hypotensionand bradycardia via GABA release. Hypertension 38, 896–901.

Martins‐Pinge, M.C., Baraldi‐Passy, I., Lopes, O.U., 1997. Excitatoryeffects of nitric oxide within the rostral ventrolateral medulla of freelymoving rats. Hypertension 30, 704–707.

Martins‐Pinge, M.C., Araújo, G.C., Lopes, O.U., 1999. Nitric oxide‐dependent guanylyl cyclase participates in the glutamatergic neuro-transmission within the rostral ventrolateral medulla of awake rats.Hypertension 34 (part 2), 748–751.

Mayorov, D.N., 2005. Selective sensitization by nitric oxide of sympatheticbaroreflex in rostral ventrolateral medulla of conscious rabbits.Hypertension 45, 901–906.

Morimoto, S., Sasaki, S., Miki, S., Kawa, T., Nakamura, K., Itoh, H.,Nakata, T., Takeda, K., Nakagawa, M., Fushiki, S., 2000. Nitric oxide isan excitatory modulator in the rostral ventrolateral medulla in rats. Am.J. Hypertens. 13, 1125–1134.

Patel, K.P., Li, Y.F., Hirooka, Y., 2001. Role of nitric oxide in centralsympathetic outflow. Exp. Biol. Med. 226 (9), 814–824.

Paxinos, G., Watson, C., 1998. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates,4th ed. Academic Press, New York.

Shapoval, L.N., Sagach, V.F., Pobegailo, L.S., 1991. Nitric oxide influencesventrolateral medullary mechanisms of vasomotor control in the cat.Neurosci. Lett. 132, 47–50.

Tseng, C.J., Liu, H.Y., Lin, H.C., Ger, L.P., Tung, C.S., Yen, M.H., 1996.Cardiovascular effects of nitric oxide in the brain stem nuclei of rats.Hypertension 27, 36–42.

Zanzinger, J., Czachurski, J., Seller, H., 1995. Inhibition of basal and reflex‐mediated sympathetic activity in the RVLM by nitric oxide. Am. J.Physiol. 268, R958–R962.

Page 227: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 92.1 pp 79–85 79

Experimental Physiology

Increased sympathetic activity in rats submitted to chronicintermittent hypoxia

Daniel B. Zoccal, Leni G. H. Bonagamba, Fabıola R. T. Oliveira, Jose Antunes-Rodriguesand Benedito H. Machado

Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

Long-term exposure to intermittent hypoxia may lead to important cardiovascular dysfunctions,such as hypertension. Rodent models of chronic intermittent hypoxia (CIH) have been used tostudy the mechanisms underlying the increase in mean arterial pressure (MAP) observed afterexposure to CIH. Several studies suggest that the hypertension of rats submitted to CIH isassociated with an increase in sympathetic activity. However, there are no studies documentingthe direct measurement of sympathetic activity in conscious freely moving rats exposed to CIH.Therefore, the present study aimed to evaluate whether or not the increase of MAP in rats exposedto CIH is associated with an increase in sympathetic activity. To reach this goal, we analysed theeffect of ganglionic blockade on baseline MAP as well as the plasma levels of catecholamines.Rats submitted to CIH (fractional inspired O2 of 6%, for 40 s in every 9 min, 8 h day−1) for35 days (n = 31) exhibited a significant increase in MAP compared with control rats (n = 28)maintained under normoxia (112 ± 2 versus 103 ± 1 mmHg, P = 0.0003). The injection of theganglionic blocker hexamethonium resulted in a similar fall in MAP in CIH and control groups(−46 ± 2 versus −41 ± 3 mmHg). However, hexamethonium after previous antagonism of theangiotensin II type 1 (AT1) receptors with losartan produced a larger decrease in MAP in theCIH than in the control group (−58 ± 2 versus −50 ± 2 mmHg, P = 0.0165). The injection oflosartan itself produced no major changes in the baseline MAP in both groups. The measurementof plasma catecholamines showed an increase in plasma noradrenaline (10.12 ± 0.90 versus

4.74 ± 0.32 ng ml−1, P = 0.0042) in rats exposed to CIH compared with control rats. These dataprovide strong evidence to support the concept that rats submitted to CIH exhibit an increasein sympathetic activity, which seems to be determinant in the maintenance of hypertension inthis experimental model.

(Received 18 August 2006; accepted after revision 26 October 2006; first published online 3 November 2006)Corresponding author B. H. Machado: Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirao Preto, University ofSao Paulo, 14049-900, Ribeirao Preto, SP, Brazil. Email: [email protected]

The development of hypertension is one of themost important cardiovascular dysfunctions observed inpatients with obstructive sleep apnoea (OSA; Hoffmannet al. 2004; Caples et al. 2005). A large body ofevidence illustrates that the observed increase in arterialblood pressure in OSA patients is associated with theintermittent episodes of hypoxia, suggesting a correlationbetween long-term exposure to intermittent hypoxia andhypertension (Hla et al. 1994; Fletcher, 2000; Caples et al.2005). However, other variables as well as the hypoxiastimulus are present in OSA patients, such as obesity,alcohol intake, smoking and ageing (Kiely & McNicholas,2000), which make the understanding of the mechanisms

underlying the increase in arterial pressure in thesepatients difficult. The rodent chronic intermittent hypoxicmodel, developed by Fletcher et al. (1992c), allows abetter evaluation of the neural and hormonal mechanismsassociated with the several cardiovascular dysfunctionsconsequent on the intermittent hypoxia exposure withoutthe influence of the above-mentioned variables.

It has been demonstrated that rats submitted tochronic intermittent hypoxia (CIH) for 5 weeks exhibiteda sustained increase in arterial pressure, which wasprevented by previous carotid body denervation (Fletcheret al. 1992a,c). Moreover, other studies have alsoshown that hypercapnia (Fletcher et al. 1995) or sleep

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society DOI: 10.1113/expphysiol.2006.035501) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 228: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

80 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 92.1 pp 79–85

disruption/arousals (Fletcher, 2001) have no additionaleffect on the increase in arterial pressure evoked byCIH in rats, showing that the hypertension observedin this experimental model is caused by intermittentstimulation of the peripheral chemoreceptors by hypoxiarather than any other stimuli. Although these findingshave clearly demonstrated that the hypertension in ratssubmitted to CIH is a consequence of long-term exposureto intermittent hypoxia, the mechanisms underlying thisincrease in arterial pressure remain to be fully understood.

The increase in arterial blood pressure in rats submittedto CIH seems to be dependent on several factors,mainly neural and hormonal changes, which may affectthe regulation of the cardiovascular system at centraland peripheral levels. With respect to the sympatheticnerve activity, experiments by Fletcher et al. (1992b)demonstrated that the chemical sympathectomy causedby 6-OH-dopamine, administered before exposure toCIH, prevented the increase in arterial pressure inrats. Similar results were observed in another study, inwhich denervation of the renal sympathetic nerves wasperformed before exposure to CIH (Bao et al. 1997),showing that the increase in arterial pressure observedin rats submitted to CIH is dependent on the integrityof the sympathetic nervous system to the kidneys. Basedupon these studies, several studies have attributed themaintenance of the hypertension observed in rats afterexposure to CIH to an increase in sympathetic outflow(Sica et al. 2000; Fletcher, 2001; Prabhakar et al. 2005).A recent study by Lai et al. (2006) documented that thebaroreflex sensitivity is reduced in rats submitted to CIH,which may contribute to an increase in the sympatheticoutflow. Although these studies provide evidence thatsympathetic activity is important for the development ofhypertension in rats submitted to CIH, there is no directand conclusive evidence that the sympathetic nerve activityis increased and correlates with the increase in the baselinearterial pressure observed in this experimental model.

In addition to a possible increase in sympathetic nerveactivity, there is evidence that hormonal changes may alsocontribute to the hypertension in rats exposed to CIH.The increase in the vascular response to endothelin-1 inrats submitted to CIH is accompanied by an increase inthe expression of endothelin A receptors, suggesting thatendothelin contributes to the hypertension in rats exposedto CIH (Allahdadi et al. 2005). The renin–angiotensinsystem also plays an important role in this experimentalmodel, since the blockade of angiotensin II type 1 (AT1)receptors during CIH exposure prevented the increasein arterial pressure (Fletcher et al. 1999). However, thecontribution of angiotensin II and the AT1 receptors inthe maintenance of hypertension after CIH has not beenevaluated.

Taking into account that the neural and hormonalmechanisms involved in the maintenance of hypertension

in rats exposed to CIH are not yet completely understood,in the present study we evaluated the role of sympatheticactivity and of angiotensin II. To reach this goal, weanalysed (a), the fall in arterial pressure in response to theantagonism of AT1 receptors combined with ganglionicblockade and (b), the plasma level of catecholamines inrats submitted to CIH.

Methods

Animals

The experiments were performed on male Wistar rats,weighing 293 ± 2 g, obtained from the Animal Carefacility of the University of Sao Paulo at Ribeirao Preto,Brazil. All experimental approaches were approved bythe Animal Care and Ethical Committee of the Schoolof Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo(protocol 030/2004). The animals were divided into twoexperimental groups: rats that were exposed to the episodesof intermittent hypoxia (CIH group, n = 31) and ratsthat were maintained under normoxic conditions (controlgroup, n = 28).

Chronic intermittent hypoxia

Both CIH and control rats were housed in collective cages(five animals per cage) and maintained inside Plexiglasschambers (volume, 210 l) equipped with gas injectors aswell as sensors of O2, CO2, humidity and temperature. TheCIH group was submitted to a protocol consisting of 5 minof normoxia (fractional inspired O2, FIO2 , 20.8%) followedby 4 min of pure N2 injection into the chamber to reducethe FIO2 from 20.8 to 6%. After 40 s at this FIO2 level, pureO2 was injected into the chamber to return the FIO2 backto 20.8%. This 9 min cycle was repeated 8 h per day (from9.30 am to 5.30 pm) for 35 days. During the remaining16 h, the animals were maintained at an FIO2 of 20.8%.The N2 and O2 injections into the chamber were regulatedby a solenoid valve system whose opening–closing controlwas performed by a computerized system (Oxycycler,Biospherix, Redfield, NY, USA). In other chambers, inthe same room, the control group was exposed to an FIO2

of 20.8%, 24 h a day for 35 days. The control rats werealso exposed to a similar valve noise owing to the frequentinjection of O2 to maintain the FIO2 at 20.8%. In both CIHand control chambers, the gas injections were performedat the upper level of the chamber in order to avoid directjets of gases into the cages of the animals, which mightcause additional stress to the animals.

Arterial pressure and heart rate recordings

At the end of experimental protocol, on the 35thday, the rats were anaesthetized with tribromoethanol(250 mg kg−1, i.p.; Aldrich, Milwaukee, WI, USA) and

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 229: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 92.1 pp 79–85 Chronic intermittent hypoxia and sympathetic activity 81

a catheter was inserted into the abdominal aortathrough the femoral artery (PE-10 connected to PE-50 tubing, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA) forthe arterial pressure measurement. Another catheterwas inserted into the femoral vein and was usedfor systemic drug administration. The catheters weretunnelled subcutaneously and exteriorized through theback of the neck. Twenty-four hours later, when the ratshad completely recovered from the surgery and adaptedto the environment of the recording room, the arterialcatheter was connected to a pressure transducer (PT 300model, Grass Instruments, West Warwick, RI, USA), whichwas connected to an amplifier (Grass Quad Amplifier,15LT model, Grass Instruments). The pulsatile arterialpressure (PAP) signals were recorded in a computerizeddata-acquisition system (Polyview, version 2.5, GrassInstruments), and mean arterial pressure (MAP) andheart rate (HR) were derived from PAP using appropriatecomputer software (Windaq Waveform Browser, DataqInstruments, Akron, OH, USA). The cardiovascularparameters were recorded in conscious freely moving ratsunder normoxic conditions for 30 min.

Ganglionic blockade

After recording of baseline MAP and HR in CIH andcontrol rats for 30 min, hexamethonium, a ganglionicblocker, was injected (25 mg kg−1, i.v.; Sigma, St Louis,MO, USA) and the cardiovascular parameters recorded forthe next 5 min. The magnitude of the fall in MAP in bothgroups was tentatively used to evaluate the contributionof the sympathetic nervous system to the maintenance ofthe baseline MAP.

Antagonism of AT1 receptor and ganglionic blockade

This protocol was also performed in CIH and control ratsafter recording of baseline MAP and HR for 30 min. Toverify the contribution of angiotensin II and AT1 receptorsin the sustained increase of MAP in rats exposed toCIH, an injection of the AT1 receptor antagonist losartan(10 mg kg−1, i.v.; Galena, Campinas, SP, Brazil) was made,and the cardiovascular parameters were recorded for thenext 5 min. Thereafter, hexamethonium (25 mg kg−1, i.v.)was injected, and the changes were evaluated in thefollowing 5 min. The contribution of the sympatheticnervous system to the maintenance of arterial pressureof both groups was evaluated by the magnitude of thefall in MAP observed after the hexamethonium injectioncombined with the previous AT1 receptor antagonism bylosartan. The AT1 receptor antagonism was importantto prevent activation of the renin–angiotensin system,resulting from the large fall in arterial pressure afterganglionic blockade, which might mask the net effect ofthe sympathetic withdrawal.

Plasma catecholamine measurements

In selected CIH and control rats (CIH rats, n = 10; controlrats, n = 10), after recording of baseline MAP and HR,the animals were killed by decapitation and the trunkblood was collected into tubes containing heparin. Theplasma was separated by centrifugation at 1940 g for20 min at 4◦C, and the plasma levels of noradrenaline(NA) and adrenaline (ADR) were determine by HPLC(LC-10 A, Shimadzu Instruments, Duisburg, Germany)with electrochemical detection (L-ECD-6A, ShimadzuInstruments, Duisburg, Germany) with a Shim-pack CLC-ODS (M) (5 µm; Shimadzu) reversed-phase column, aspreviously described in detail (Garofalo et al. 1996).

Statistical analysis

The data were expressed as means ± s.e.m. andcompared using Student’s unpaired t test. Differences wereconsidered significant at P < 0.05.

Results

Body weight and baseline MAP and HR

At the end of 35 days of the protocol, CIH rats(n = 31) exhibited a lower body weight (388 ± 6 versus501 ± 6 g, P < 0.00001) than the control rats (n = 28),despite the fact that at the beginning of the protocolboth groups had similar body weights (292 ± 2 versus295 ± 2 g). Moreover, the rats submitted to CIH exhibiteda significant increase in baseline diastolic (97 ± 1versus 88 ± 1 mmHg, P = 0.0002), mean (112 ± 2 versus103 ± 1 mmHg, P = 0.0003) and systolic arterial pressure(132 ± 2 versus 120 ± 2 mmHg, P < 0.0001), as wellas in baseline HR (389 ± 8 versus 357 ± 6 beats min−1,P = 0.0032) when compared with control rats. Figure 1summarizes the data related to the baseline MAP and HRof both experimental groups.

Effect of ganglionic blockade on MAP and HR

The injection of hexamethonium alone in specific groupsof CIH (n = 13) and control rats (n = 10) produced asimilar fall in MAP (−46 ± 2 versus −41 ± 3 mmHg),despite the fact that these groups exhibited significantdifferences with respect to the baseline MAP (114 ± 2versus 103 ± 3 mmHg, P = 0.0074).

Effect of AT1 receptor antagonism and ganglionicblockade on MAP and HR

Figure 2 illustrates traces from two rats, representativeof their respective groups, showing the effects of the

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 230: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

82 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 92.1 pp 79–85

sequential injections of losartan and hexamethonium onPAP, MAP and HR of CIH (n = 8) and control rats (n = 8).

The injection of losartan produced no significantchanges in the MAP of both CIH (112 ± 2 versus107 ± 3 mmHg) and control rats (103 ± 2 mmHgversus 100 ± 1 mmHg), as shown in Fig. 3A, whilethe HR increased in control (347 ± 11 versus418 ± 16 beats min−1, P = 0.0026) but not in CIHrats (375 ± 16 versus 408 ± 18 beats min−1). In contrast,injection of hexamethonium (Fig. 3B) produced a largedecrease in MAP of both groups, and the magnitude of thisfall (Fig. 3C) was significantly greater in the CIH than inthe control group (−58 ± 2 versus −50 ± 2 mmHg,P = 0.0165). Interestingly, MAP (54 ± 1 versus53 ± 1 mmHg CIH and control groups, respectively)and HR values (405 ± 8 versus 393 ± 14 beats min−1,CIH and control groups, respectively) after losartanand hexamethonium injections were similar in CIH andcontrol groups.

Plasma NA and ADR

Figure 4 summarizes the data indicating a significantincrease in plasma levels of NA in the CIH group(n = 10) in comparison with the control group (n = 10;10.12 ± 0.90 versus 4.74 ± 0.32 ng ml−1, respectively,P = 0.0042). This figure also shows that the plasma levelsof ADR in both groups were not statistically different

B

Control CIH0

300

325

350

375

400 *

HR

(b

eats

min

-1)

A

Control CIH0

95

100

105

110

115 *

MA

P (

mm

Hg

)

Figure 1. Baseline MAP (A) and HR (B) of rats maintained innormoxia (control, n = 18) and rats submitted to chronicintermittent hypoxia (CIH, n = 18) for 5 weeks∗P < 0.01 compared with control group.

(14.64 ± 1.05 versus 12.67 ± 1.20 ng ml−1, in CIH andcontrol groups, respectively).

Discussion

Several studies have been performed using theexperimental model of CIH in order to evaluate themechanisms involved in the sustained increase ofarterial pressure observed after long-term exposure tointermittent hypoxia (Fletcher, 2001; Prabhakar et al.2001, 2005). Although it is generally accepted that theincrease in arterial pressure of rats submitted to CIH isassociated with an increase in sympathetic activity, thedirect measurement of the sympathetic nerve activityin conscious freely moving rats remains a technicalchallenge in terms of recording and the comparison ofdata obtained from multifibre recordings. The presentconcept of sympathetic overactivity in CIH rats isbased upon studies showing that sympathectomy eitherchemical sympathectomy caused by 6-OH-dopamineor renal sympathetic nerve denervation, before CIH,prevented the increase in arterial pressure (Fletcher et al.1992b; Bao et al. 1997), but there is no evidence that theincrease in MAP in this experimental model is maintainedby an increase in sympathetic activity. In the presentstudy, we evaluated the sympathetic activity of CIH ratsby ganglionic blockade combined with AT1 receptorantagonism and by the measurement of the plasma levelsof catecholamines.

Ganglionic blockade has been extensively used as anindex of total sympathetic activity (Guild et al. 2005).By the evaluation of the magnitude of the fall in MAPproduced by ganglionic blockade, it is possible to assessindirectly the sympathetic activity to the resistance vessels.However, in the present study, we verified that the fall inMAP in response to hexamethonium alone was similarin CIH and control rats, a finding that at first mightsuggest that the sympathetic activity in CIH rats wasnot altered. To check this possibility, in another group ofrats, we antagonized the AT1 receptors before producingganglionic blockade for two reasons: first, to evaluate thecontribution of angiotensin II and the AT1 receptors tothe maintenance of hypertension in CIH rats; and second,to avoid the possibility that the activation of the renin–angiotensin system during the large fall in MAP producedby ganglionic blockade might bring the baseline MAP tosimilar level in CIH and control rats as a consequence ofthe vasoconstrictor effect of angiotensin II. The activationof this hormonal system at the very low level of MAP afterhexamethoniun might mask the net effect of sympatheticwithdrawal on the MAP.

The injection of losartan produced no changes in MAPof both groups, indicating that angiotensin II and AT1

receptors were not playing a major role in the maintenanceof high arterial blood pressure in CIH rats. In contrast,

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 231: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 92.1 pp 79–85 Chronic intermittent hypoxia and sympathetic activity 83

the ganglionic blockade performed after AT1 receptorantagonism produced a greater fall in MAP in the CIHthan in the control group. Interestingly, the difference inthe magnitude of the fall in MAP observed in CIH andcontrol rats (−58 ± 2 versus −50 ± 2 mmHg, respectively)is similar to the difference between the baseline MAPin CIH and control rats (112 ± 2 versus 103 ± 2 mmHg,respectively). Moreover, after the double blockade, theMAP in CIH and control rats reached similar levels. Thesedata support the concept that the increase in baselinearterial pressure of CIH is mediated by an increase insympathetic outflow to the vascular beds.

In order to provide additional evidence in favour of apossible increase in sympathetic activity in CIH rats, wealso measured the plasma levels of catecholamines becausethey reflects the sympathetic drive to the resistance vessels(Yamaguchi & Kopin, 1979; Hirakawa et al. 1997). Our datadocumented that plasma NA in rats submitted to CIH washigher than in control rats, supporting the concept thatrats submitted to CIH exhibit sympathetic overactivity.Nevertheless, no changes in plasma ADR were observed inCIH rats.

Based upon studies by Fletcher et al. (1999) showing thatthe systemic AT1 receptor antagonism during exposure

Figure 2. Changes in HR and MAP in response to losartan and hexamethonium in control and CIH ratsTraces from two rats representative of their respective groups showing the sequential effects of AT1 antagonistlosartan and ganglionic blocker hexamethonium on the baseline heart rate (HR), pulsatile arterial pressure (PAP)and mean arterial pressure (MAP) of control rats maintained in normoxia (control) and rats submitted to chronicintermittent hypoxia (CIH) for 5 weeks.

to CIH prevented the increase in MAP, we hypothesizedthat angiotensin II, acting on peripheral AT1 receptors,might also play a role in the maintenance of hypertensionin CIH rats. However, the administration of losartanproduced no significant changes in MAP of CIH rats,suggesting that angiotensin II and AT1 receptors do notcontribute to the maintenance of high blood pressurein this experimental model. Considering that Collister &Osborn (2005) demonstrated that chronic administrationof the AT1 receptor antagonist losartan decreases thebaseline MAP of normotensive rats by reducing the base-line sympathetic activity, it is possible that the evidencepresented by Fletcher et al. (1999) about the effectof chronic AT1 receptor antagonism in preventing theincrease in MAP in CIH rats is, in fact, related tothe attenuation in the sympathetic activity produced bylosartan. This possibility is also supported by studiesshowing that losartan can cross the blood–brain barrier(Culman et al. 1999), as well as that plasma angiotensin IIcan act on AT1 receptors on the blood vessels in thebrainstem, with a possible influence on neurones inthis region involved in the modulation and generationof sympathetic activity (Paton et al. 2006). The dataof the present study support the concept that the

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 232: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

84 D. B. Zoccal and others Exp Physiol 92.1 pp 79–85

maintenance of high blood pressure in rats submitted toCIH is dependent on sympathetic overactivity but not oncirculating angiotensin II.

Despite the fact that the evaluation of sympatheticactivity by ganglionic blockade and by the measurementof plasma NA reflects the total sympathetic activity, withthe present experimental approach it is not possible todetermine the contribution of individual vascular bedsto the overall effect. However, the tachycardia presentedby CIH rats indicates that the thoracic sympathetic

B

Control CIH0

BaselineLOS + HEX

45

55

65

75

85

95

105

115 *

‡ ‡MA

P (

mm

Hg

)

A

Control CIH0

BaselineLOS

45

55

65

75

85

95

105

115 * †

MA

P (

mm

Hg

)

Control CIH

-60

-55

-50

-450

*

C

∆M

AP

(m

mH

g)

Figure 3. MAP before and after losartan or losartan plushexamethanium in control and CIH ratsA, MAP of rats maintained in normoxia (control) or chronicintermittent hypoxia (CIH) before (baseline) and 5 min after losartan(LOS) ∗P < 0.01 compared with control baseline MAP. B, MAP ofcontrol and CIH rats before (baseline) and after the double blockadewith losartan and hexamethonium (LOS + HEX). ∗P < 0.01 comparedwith control baseline MAP; †P < 0.05 compared with control MAPafter losartan; ‡P < 0.0001 compared with baseline values.C, magnitude of the fall in mean arterial pressure (�MAP) in responseto the combined and sequential antagonism of AT1 receptors(losartan) and ganglionic blockade (hexamethonium) in control and inCIH rats. ∗P = 0.0165 compared with control group.

nerve activity to the heart is increased. Likewise, studiesby Bao et al. (1997), which demonstrated that renalsympathetic nerve denervation, prior to CIH exposure,abolished the increase in arterial pressure, suggested thatthe renal sympathetic nerve discharge might be increasedin CIH rats. However, the level of sympathetic outflowto the different vascular beds and its relationship withhypertension in CIH rats is an important aspect thatremains to be investigated.

The observed increase in sympathetic activity in CIHrats is probably associated with changes in importantareas of the central nervous system, especially inthose related to the generation and/or modulation ofsympathetic activity. First, it well known that neuronalactivity is sensitivity to low parial pressures of O2, andhypoxia in neurones induces adaptive responses, such aschanges in ionic channels, membrane or cytosolic haemproteins, mitochondrial proteins and/or oxygen-sensitivetranscription factors including hypoxia-inducible factor-1α and nuclear factor κβ (NFκβ) (Semenza, 2000; Pena& Ramirez, 2005; Greenberg et al. 2006). In addition,studies by Greenberg et al. (1999) provided evidence thatthe neuronal activity of cardiovascular-controlling brain-stem areas, such as nucleus tractus solitarii, medullaryreticular formation (A1 noradrenergic cell area of theventrolateral medulla) and mid-line raphe, are alteredin rats submitted to CIH. Besides, using an in situunanaesthetized decerebrated preparation, we observedthat juvenile rats submitted to CIH for 10 days exhibitedlarger sympathoexcitatory, tachypnoeic and bradycardicresponses to chemoreflex activation than control rats(Braga et al. 2006), suggesting that the processing ofchemoreflex afferents is enhanced in rats submitted toCIH. Therefore, the central mechanisms underlying thisobserved increase in sympathetic nerve activity in ratssubmitted to CIH is an important matter that remainsto be investigated.

In conclusion, we verified that ganglionic blockade,combined with antagonism of AT1 receptors, produced

NA ADR0

5

10

15

20ControlCIH

*

Pla

sma

[NA

] o

r [A

DR

] (n

g m

l-1)

Figure 4. Plasma NA and ADR in rats maintained in normoxia(control, n = 10) and in rats submitted to chronic intermittenthypoxia (CIH, n = 10) for 5 weeks∗P = 0.0042 compared with control group.

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 233: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Exp Physiol 92.1 pp 79–85 Chronic intermittent hypoxia and sympathetic activity 85

a larger decrease in MAP of CIH than of control rats.In addition, high plasma levels of NA were observed inCIH rats. These data strongly support the concept thatrats submitted to CIH exhibit sympathetic overactivity,which seems to be determinant to the observed increase inarterial pressure observed in this experimental model.

References

Allahdadi KJ, Walker BR & Kanagy NL (2005). Augmentedendothelin vasoconstriction in intermittent hypoxia-inducedhypertension. Hypertension 45, 705–709.

Bao G, Metreveli N, Li R, Taylor A & Fletcher EC (1997). Bloodpressure response to chronic episodic hypoxia: role of thesympathetic nervous system. J Appl Physiol 83, 95–101.

Braga VA, Soriano RN & Machado BH (2006).Sympathoexcitatory response to peripheral chemoreflexactivation is enhanced in juvenile rats exposed to chronicintermittent hypoxia. Exp Physiol 91, 1025–1031.

Caples SM, Gami AS & Somers VK (2005). Obstructive sleepapnea. Ann Intern Med 142, 187–197.

Collister JP & Osborn JW (2005). Role of a responsivesympathetic nervous system in the chronic hypotensiveeffects of losartan in normal rats. J Cardiovasc Pharmacol 46,147–154.

Culman J, von Heyer C, Piepenburg B, Rascher W & Unger T(1999). Effects of systemic treatment with irbesartan andlosartan on central responses to angiotensin II in conscious,normotensive rats. Eur J Pharmacol 367, 255–265.

Fletcher EC (2000). Cardiovascular effects of continuouspositive airway pressure in obstructive sleep apnea. Sleep 23(Suppl. 4), S154–S157.

Fletcher EC (2001). Physiological consequences of intermittenthypoxia: systemic blood pressure. J Appl Physiol 90,1600–1605.

Fletcher EC, Bao G & Li R (1999). Renin activity and bloodpressure in response to chronic episodic hypoxia.Hypertension 34, 309–314.

Fletcher EC, Bao G & Miller CC 3rd (1995). Effect of recurrentepisodic hypocapnic, eucapnic, and hypercapnic hypoxia onsystemic blood pressure. J Appl Physiol 78, 1516–1521.

Fletcher EC, Lesske J, Behm R, Miller CC, Stauss H & Unger T(1992a). Carotid chemoreceptors, systemic blood pressureand chronic episodic hypoxia mimicking sleep apnea. J ApplPhysiol 72, 1978–1984.

Fletcher EC, Lesske J, Culman J, Miller CC & Unger T (1992b).Sympathetic denervation blocks blood pressure elevation inepisodic hypoxia. Hypertension 20, 612–619.

Fletcher EC, Lesske J, Qian W, Miller CC & Unger T (1992c).Repetitive episodic hypoxia causes diurnal elevation ofsystemic blood pressure in rats. Hypertension 19, 555–561.

Garofalo MAR, Kettelhut IC, Roselino JES & Migliorini RH(1996). Effect of acute cold exposure on norepinephrineturnover rates in rat white adipose tissue. J Auton Nerv Syst60, 206–208.

Greenberg HE, Sica AL, Scharf SM & Ruggiero DA (1999).Expression of c-fos in the rat brainstem after chronicintermittent hypoxia. Brain Res 816, 638–645.

Greenberg H, Ye X, Wilson D, Htoo AK, Hendersen T & Liu SF(2006). Chronic intermittent hypoxia activates nuclearfactor-κB in cardiovascular tissues in vivo. Biochem BiophysRes Commun 343, 591–596.

Guild S-J, Barret CJ & Malpas SC (2005). Long-term recordingof sympathetic nerve activity: the new frontier inunderstanding the development of hypertension? Clin ExpPharmacol Physiol 32, 433–439.

Hirakawa H, Nakamura T & Hayashida Y (1997). Effect ofcarbon dioxide on autonomic cardivascular responses tosystemic hypoxia in conscious rats. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 273, R747–R754.

Hla K, Young T, Bidwell M, Palta M, Skatrud J & Dempsey J(1994). Sleep apnea and hypertension: a population-basedstudy. Ann Intern Med 120, 382–388.

Hoffmann M, Bybee K, Accurso V & Somers VK (2004). Sleepapnea and hypertension. Minerva Med 95, 281–290.

Kiely JL & McNicholas WT (2000). Cardiovascular risk factorsin patients with obstructive sleep apnoea syndrome. EurResp J 16, 128–133.

Lai CJ, Yang CCH, Hsu YY, Lin YN & Kuo TBJ (2006).Enhanced sympathetic outflow and decreased baroreflexsensitivity are associated with intermittent hypoxia-inducedsystemic hypertension in conscious rats. J Appl Physiol 100,1974–1982.

Paton JF, Lonergan T, Deuchars J, James PE & Kasparov S(2006). Detection of angiotensin II mediated nitric oxiderelease within the nucleus of the solitary tract using electron-paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. Auton Neurosci30, 193–201.

Pena F & Ramirez JM (2005). Hypoxia-induced changes inneuronal network properties. Mol Neurobiol 32, 251–283.

Prabhakar NR, Fields RD, Baker T & Fletcher EC (2001).Intermittent hypoxia: cell to system. Am J Physiol Lung CellMol Physiol 281, L524–L528.

Prabhakar NR, Peng YJ, Jacono FJ, Kumar GK & Dick TE(2005). Cardiovascular alterations by chronic intermittenthypoxia: importance of carotid body chemoreflexes. Clin ExpPharmacol Physiol 32, 447–449.

Semenza GL (2000). HIF-1: mediator of physiological andpathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol 88,1474–1480.

Sica AL, Greenberg HE, Ruggiero DA & Scharf SM (2000).Chronic intermittent hypoxia: a model of sympatheticactivation in the rat. Resp Physiol 121, 173–184.

Yamaguchi I & Kopin IJ (1979). Plasma catecholamines andblood pressure responses to sympathetic stimulation inpithed rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 237, H305–H310.

Acknowledgements

This study was supported by Conselho Nacional deDesenvolvimento Cientıfico e Tecnologico (CNPq)(472704/2004-4) and Fundacao de Amparo a Pesquisa doEstado de Sao Paulo (FAPESP) (2004/03285-7 and 2004/05410-3).

C© 2007 The Authors. Journal compilation C© 2007 The Physiological Society) at FMRP/USP on February 9, 2010ep.physoc.orgDownloaded from Exp Physiol (

Page 234: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 134 (2007) 115–117www.elsevier.com/locate/autneu

Short communication

Plasma corticosterone levels is elevated in rats submittedto chronic intermittent hypoxia

Daniel B. Zoccal, Leni G.H. Bonagamba, José Antunes-Rodrigues, Benedito H. Machado⁎

Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 14049–900, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Received 17 October 2006; received in revised form 8 January 2007; accepted 9 January 2007

Abstract

In the present study we investigated whether plasma corticosterone is altered in rats exposed to chronic intermittent hypoxia (CIH). Ratswere submitted to a fraction of inspired oxygen of 6%, for 40 s, every 9 min, 8 h a day, for 35 days (CIH rats, n=17), while control rats weremaintained under normoxic conditions (n=16). After CIH, the rats presented a significant increase in baseline mean arterial pressure (118±2vs 106±3, mmHg) but not in baseline heart rate (381±17 vs 362±12 bpm) when compared to the control rats. Besides, a significant increasein plasma corticosterone was observed in CIH rats in comparison to the control rats (39±4 vs 20±2 μg/dl). Considering that corticosteronecan affect both peripheral and central sympathetic mechanisms, the elevated plasma corticosterone may represent a new insight on themechanisms underlying the hypertension observed after CIH.© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Chronic intermittent hypoxia; Hypertension; Corticosterone

Obstructive sleep apnea (OSA) in humans is associatedwith an increase in arterial pressure (Caples et al., 2005).Studies in humans (Philips and Somers, 2000) and dogs(Brooks et al., 1997) evidenced that the main factor leading tohypertension in OSA is the intermittent hypoxia experiencedduring sleep. However, OSA patients present other variablesthat contribute to hypertension, including obesity (Capleset al., 2005). To perform a better evaluation of the relationshipbetween intermittent hypoxia and hypertension, the experi-mental model of chronic intermittent hypoxia (CIH) has beenused to study the mechanisms underlying the sustainedincrease in arterial pressure observed after the long-termexposure to intermittent hypoxia. Previous study by Fletcheret al. (1992) demonstrated that the development of hyper-tension in rats submitted to CIH is dependent on the integrityof the chemoreceptors presented in the carotid bodies,suggesting that the significant increase in arterial pressureis a consequence of the intermittent activation of the

⁎ Corresponding author. Tel.: +55 16 3602 3015; fax: +55 16 3633 0017.E-mail address: [email protected] (B.H. Machado).

1566-0702/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.autneu.2007.01.004

peripheral chemoreflex. Recent study from our laboratorydocumented that the maintenance of high blood pressure inrats submitted to 35 days of intermittent hypoxia is associatedwith an increase in the sympathetic activity as well as in theplasma level of noradrenaline but not with the renin–angiotensin system (Zoccal et al., 2007).

Besides cardiovascular and respiratory responses, theactivation of the peripheral chemoreflex evokes an importantbehavior response (Barros et al., 2002), which may becorrelated to the stressful response induced by the hypoxiastimulus. During stress conditions, several mechanisms,including behavior, visceral and endocrine changes areactivated as part of the homeostatic control (Aguilera, 1994).In rats, the major endocrine mechanism is the activation ofthe hypothalamic–pituitary–adrenal axis, resulting inincreases in circulating corticosterone (Dallman et al.,1992). This hormone affects a wide variety of bodyfunctions, including the cardiovascular function (Grunfled,1990; Yang and Zhang, 2004). Moreover, it was demon-strated that elevated plasma glucocorticoids is associatedwith the pathogenesis of essential hypertension (Connellet al., 1996; Walker et al., 1996). Accordingly, we can

Page 235: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Fig. 1. Baselinemean arterial pressure (MAP, panel A), heart rate (HR, panel B)and plasma levels of corticosterone (panel C) of control (n=16) and of ratssubmitted to CIH (n=17) for 35 days. (⁎) Different from control rats, Pb0.01.

116 D.B. Zoccal et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 134 (2007) 115–117

hypothesize that the plasma corticosterone is altered in ratssubmitted to CIH, which could contribute to the develop-ment of the hypertension observed in this experimentalmodel. Therefore, in the present study we sought to explorepossible changes in plasma corticosterone in rats exposed toCIH for 35 days.

To reach this goal, adult male Wistar rats (295±5 g) weremaintained into plexiglas chambers in cages with no morethan 5 individuals and submitted to the following CIHprotocol (CIH group, n=17): 5 min of normoxia (fraction ofinspired oxygen, FiO2, of 20.8%) followed by 4 min of100% nitrogen injection into the chamber to reduced theFiO2 from 20.8 to 6%, remaining in this level for 40 s. Afterthis hypoxic period, 100% oxygen was flushed into thechamber to return the FiO2 back to 20.8%. This 9-minutecycle was repeated for 8 h a day (from 9:30 am to 5:30 pm),for 35 days. In other chambers, control rats were alsomaintained in cages with no more than 5 individuals (n=16)for the same time but under a FiO2 of 20.8%. On the 35thday, the rats were anesthetized with tribromoethanol(250 mg/kg, i.p.; Aldrich, Milwaukee, WI, USA) and acatheter was inserted into the abdominal aorta through thefemoral artery (PE-10 connected to PE-50, Clay Adams,Parsippany, NJ, USA) for the arterial pressure measurement.Twenty-four hours later, when CIH and control rats wererecovered from the anesthesia and the surgical stress, thearterial catheter was connected to a pressure transducer (PT300 model, Grass Telefactor, RI, USA), which wasconnected to an amplifier (Grass Quad Amplifier, 15LTmodel, RI, USA). The pulsatile arterial pressure (PAP)signals was recorded in conscious freely-moving rats undernormoxic conditions for 30 min in a computerized data-acquisition system (Polyview, Grass Instruments, version2.5) and mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR)were derived from PAP using an appropriated computersoftware (Windaq Waveform Browser, Dataq Instruments,Akron, OH, USA).

After the recordings of the cardiovascular parameters, therats were decapitated and the trunk blood was collected intotubes containing 3 drops of heparin. Rats from CIH andcontrol groups were decapitated in an alternated sequence ina room isolated from the other animals and it was alwaysperformed in the period from 1:00 PM to 2:00 PM in order toavoid any circadian influence on the plasma level ofcorticosterone. The plasma was separated by centrifugationat 3000 rpm for 20 min at 4 °C and stored at −70 °C. Plasmacorticosterone was determined after ethanol extraction by aradioimmunoassay method, as previously described indetails (Vecsei et al., 1979). All the data were expressed asmean±standard error and compared using Students t-test,considering the differences significant at Pb0.05. Theexperimental procedures used in the present study wereapproved by the Ethical Committee for Animal Experimen-tation of the School of Medicine of Ribeirão Preto, USP.

Fig. 1 shows that rats submitted to CIH for 35 days (n=17)presented a significant increase in MAP (panel A: 118±2 vs

106±3 mmHg, P=0.0014) but not in HR (panel B: 381±11vs 362±12 bpm, P=0.2402) when compared to control rats(n=16). In relation to the corticosterone the data shows thatthe plasma levels were significantly higher in CIH than incontrol rats (panel C: 39±4 vs 20±2 μg/dl, P=0.0004).

The mechanisms involved in the sustained increase inarterial pressure observed in rats after the exposure to CIHare not yet completely understood. Different studies pointedout an important role for sympathetic nervous system as wellas for changes in the humoral mechanisms controlling of thevascular tonus to CIH-induced hypertension (Fletcher, 2001;Zoccal et al., 2007). In the present study, we identified thatrats submitted to CIH for 35 days presented a large increasein plasma corticosterone when compared to rats maintainedunder normoxia. It has been suggested that the glucocorti-coids play an important role for a normal cardiovascularfunction (Grunfled, 1990; Yang and Zhang, 2004). More-over, it has been demonstrated that elevated plasmaglucocorticoids is associated with essential hypertension(Connell et al., 1996; Walker et al., 1996). Studies by

Page 236: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

117D.B. Zoccal et al. / Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 134 (2007) 115–117

Parlapiano et al. (2005) documented that OSA patients withhypertension also presented high levels of cortisol in late andnocturnal hours. Taking in account that hypoxia is a stressfulsituation for the rat, it is reasonable to suggest that theincrease in plasma corticosterone, observed 24 hours afterthe last episode of hypoxia, is associated with the effect of35 days of intermittent hypoxia itself as well as theconsequent intermittent stress. However, we cannot ruleout the possibility that the observed increase in the plasmacorticosterone in CIH rats is due to an enhanced acuteresponse of these animals to the stress of handling anddecapitation when compared to the same acute response ofcontrol rats maintained under normoxia and free of theintermittent stress. Therefore, the observed increase in theplasma corticosterone in CIH rats can be associated to apersistent change in the basal level and/or to an enhancedresponse to acute stress and further studies are required todifferentiate these important mechanisms.

Corticosterone induces substantial changes in the cardio-vascular system, acting both in peripheral (Yang and Zhang,2004) as well as in the central mechanisms (Saphier andFeldman, 1990; Rong et al., 1999). In relation to theperipheral actions of the corticosterone, it has beendemonstrated that corticosterone enhances the vasoconstric-tor responses to catecholamines, angiotensin II, vasopressinand endothelin, as well as reduces the synthesis of importantvasodilators in endothelial cells, such as NO and prostacy-clin (Yang and Zhang, 2004). Therefore, we can hypothesizethat the observed increase in plasma corticosterone con-tributes to changes in the vascular reactivity in CIH rats,which may result in increase in the vascular resistance.

There is evidence that glucocorticoids play a facilitatoryrole on the sympathetic activity to the circulation. Studies byTakahashi et al. (1983) demonstrated that the exogenousadministration of glucocorticoid increases renal sympatheticnerve activity. Besides, it has been demonstrated thatglucocorticoids alter the activity of neurons in the rostralventrolateral medulla (Rong et al., 1999) as well as in theparaventricular nucleus of hypothalamus (Saphier and Feld-man, 1990), which are important areas involved in themodulation of sympathetic activity. Considering theseobservations as well as studies from our laboratorydocumenting that the increase in MAP observed in CIH ratsis dependent of the increase in sympathetic activity (Zoccalet al., 2007), we can suggest that the elevated plasmacorticosterone may play a critical role to induce an increase inthe sympathetic outflow to the vascular resistance beds.

The present results open an important window for a betterunderstanding of the mechanisms involved in the pathogen-esis of hypertension induced by the long-term exposure tointermittent hypoxia. Further studies are required to evaluatea possible link between the observed increase in plasmacorticosterone and the sympathetic overactivity in rats sub-mitted to CIH.

Acknowledgements

This study was supported by CNPq (472704/2004–4) andFAPESP (2004/03285–7 and 2004/05410–3).

References

Aguilera, G., 1994. Regulation of pituitary ACTH secretion during chronicstress. Front. Neuroendocrinol. 15, 321–350.

Barros, R.C., Bonagamba, L.G., Okamoto-Canesin, R., de Oliveira, M.,Branco, L.G., Machado, B.H., 2002. Cardiovascular responses tochemoreflex activation with potassium cyanide or hypoxic hypoxia inawake rats. Auton. Neurosci. 97 (2), 110–115.

Brooks, D., Horner, R.L., Kozar, L.F., Render-Teixeira, C.L., Phillipson, E.A.,1997. Obstructive sleep apnea as a cause of systemic hypertension.Evidence from a canine model. J. Clin. Invest. 99, 106–109.

Caples, S.M., Gami, A.S., Somers, V.K., 2005. Obstructive sleep apnea.Ann. Intern. Med. 142, 187–197.

Connell, J.M., Kenyon, C.J., Ingram, M., Holloway, C., Jamieson, A.,Panarelli, M., Inglis, G., Fraser, R., 1996. Corticosteroids in essentialhypertension: multiple candidate loci and phenotypic variation.Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (5), 369–374.

Dallman, M.F., Akana, S.F., Scribner, K.A., Bradbury, M.J., Walker, C.-D.,Strack, A.M., Casio, C.S., 1992. Stress, feedback and facilitation in thehypothalamus pituitary adrenal axis. J. Neuroendocrinol. 4, 517–526.

Fletcher, E.C., 2001. Physiological consequences of intermittent hypoxia:systemic blood pressure. J. Appl. Physiol. 90, 1600–1605.

Fletcher, E.C., Lesske, J., Behm, R., Miller, C.C., Stauss, H., Unger, T.,1992. Carotid chemoreceptors, systemic blood pressure and chronicepisodic hypoxia mimicking sleep apnea. J. Appl. Physiol. 72 (5),1978–1984.

Grunfled, J.-P., 1990. Glucocorticoids in blood pressure regulation. Horm.Res. 34, 111–113.

Parlapiano, C., Borgia, M.C., Minni, A., Alessandri, N., Bassal, I., Saponara,M., 2005. Cortisol circadian rhythm and 24-hour Holter arterial pressurein OSAS patients. Endocr. Res. 31 (4), 371–374 (abstract).

Philips, B.G., Somers, V.K., 2000. Neural and humoral mechanismsmediating cardiovascular responses to obstructive sleep apnea. Respir.Physiol. 1999, 181–187.

Rong, W., Wang, W., Yuan, W., Chen, Y., 1999. Rapid effects ofcorticosterone on cardiovascular neurons in the rostral ventrolateralmedulla of rats. Brain Res. 815 (1), 51–59.

Saphier, D., Feldman, S., 1990. Iontophoresis of cortisol inhibits responsesof identified paraventricular nucleus neurones to sciatic nervestimulation. Brain Res. 535 (1), 159–162.

Takahashi, H., Takeda, K., Ashizawa,H., Inoue,A.,Yoneda, S., Yoshimura,M.,Ijichi, H., 1983. Centrally induced cardiovascular and sympathetic re-sponses to hydrocortisone in rats. Am. J. Physiol. 245 (6), H1013–H1018.

Vecsei, P., Haack, D., Lichtwald, K., Vielhauer, W., 1979. Corticosteroid andcorticosteroid metabolite levels in animals immunized against corticos-teroids. J. Steroid Biochem. 11 (1C), 971–980.

Walker, B.R., Best, R., Shackleton, C.H., Padfield, P.L., Edwards, C.R.,1996. Increased vasoconstrictor sensitivity to glucocorticoids inessential hypertension. Hypertension 27 (2), 190–196.

Yang, S., Zhang, L., 2004. Glucocorticoids and vascular reactivity. Curr.Vasc. Pharmacol. 2, 1–12.

Zoccal, D.B., Bonagamba, L.G., Oliveira, F.R., Antunes-Rodrigues, J.,Machado, B.H., 2007. Increased sympathetic activity in rats submitted tochronic intermittent hypoxia. Exp. Physiol. 92 (1), 79–85.

Page 237: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2007) 34, 1156–1159 doi: 10.1111/j.1440-1681.2007.04699.x

Blackwell Publishing AsiaOriginal ArticlesInotropic effect of chemoreceptor activationVA Braga et al.

ACTIVATION OF PERIPHERAL CHEMORECEPTORS CAUSES POSITIVE INOTROPIC EFFECTS IN A WORKING HEART–BRAINSTEM

PREPARATION OF THE RAT

Valdir A Braga, Daniel B Zoccal, Renato N Soriano, Vagner R Antunes,† Julian F Paton,† Benedito H Machado and Eugene Nalivaiko‡

Department of Physiology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil

SUMMARY

1. The aim of the present study was to evaluate the effects ofperipheral chemoreceptor activation on myocardial contractilityin an anaesthetic-free decerebrated rat preparation.

2. In the decerebrated and retrogradely perfused workingheart–brainstem preparation, we recorded phrenic nerveactivity, left ventricular (LV) pressure (microtip Millar catheter),LV dP/dT, heart rate and aortic perfusion pressure before andafter activating peripheral chemoreceptors with bolus intra-arterial injections of KCN.

3. Without cardiac pacing, chemoreflex activation causedfalls in heart rate (–108 ± 21 b.p.m.) and complex polyphasicchanges in LV pressure and LV dP/dT. If the heart was paced,chemoreflex activation caused significant rises in LP pressure(+16 ± 3 mmHg) and LV dP/dt (+778 ± 93 mmHg/s). Thesepositive inotropic effects were significantly and substantiallyattenuated by b-adrenoceptor blockade with atenolol. In allinstances, chemoreflex activation elicited potent tachypnoeicresponses.

4. In conclusion, activation of peripheral chemoreceptors innon-anaesthetized rats evokes a positive inotropic response thatis sympathetically mediated. This observation may be relevantfor the evaluation of neurally induced effects of acute hypoxiaon the ventricular myocardium.

Key words: peripheral chemoreceptors, sympathetic, ventricularcontractility.

INTRODUCTION

The peripheral chemoreceptor reflex (termed ‘chemoreflex’ from hereon) is an important physiological mechanism for the homeostasis ofblood gases, but also serves as a defensive reflex for protecting the

heart during shortages of oxygen while maintaining arterial pressurenecessary for perfusion of the brain. The primary autonomiccomponents of the reflex (i.e. those not associated with lung inflation)have been well defined in terms of vagally mediated bradycardiaand a sympathetially mediated vasoconstriction.1 However, there isa paucity of knowledge regarding chemoreflex-mediated changes inventricular contractility, although some data exist in anaesthetizeddogs and cats2,3 and only one study has been performed in consciousdogs.4

General anaesthetics alter the pattern of response followingchemoreflex activation5 and, thus, it is of major importance to evaluatethe effects of peripheral chemoreceptor stimulation on indices ofventricular contractility in anaesthetic-free preparations. This hadbeen performed in only one earlier study in conscious dogs.4 Dogs,however, are not the appropriate species for the examination of brainmechanisms of the chemoreflex. Stereotactic pharmacological studiescould be readily performed in rats, but at present it is unknownwhether the chemoreflex elicits any inotropic effects in this species.

Previously, Kollai and Koizumi6 reported that activation ofperipheral chemoreceptors by sodium cyanide results in a transientand coincident increase in both vagal and sympathetic outflows tothe heart in anaesthetized dogs. Similar vagosympathetic coactivationduring the chemoreflex was observed in a more recent study in theworking heart–brainstem preparation of the rat7 and reviewed recentlyby us.8 In their original paper, Kollai and Koizumi6 suggested thatthe functional significance of vagosympathetic coactivation may bein coordinating the relationship between heart rate and ventricularcontractility, so that the increase in sympathetic outflow targets theventricular myocardium. In the present study, we aimed to testthis hypothesis using a decerebrated non-anaesthetized juvenile ratpreparation. The advantage of this highly invasive preparation is inthe possibility to keep haemodynamic parameters constant andeliminate reflexes from lung receptors that otherwise impede inter-pretation of changes in contractility indices (see Discussion).

METHODS

The experimental design followed the European Convention for the Protectionof Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes(Council of Europe no. 123, Strasbourg 1985; http://conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm). All experiments were performed in anin situ working heart–brainstem preparation.9 Briefly, in deeply anaesthetized(5% halothane in O2) male Wistar rats (90–100 g), the lower part of the bodywas removed after sub-diaphragmatic transection. The preparation wassubmerged in refrigerated saline, decerebrated at the precollicular level (withthe part of the brain rostral to decerebration removed) and skinned. The left

Correspondence: Eugene Nalivaiko, Department of Human Physiologyand Centre for Neuroscience, Flinders University, Adelaide, SA 5000,Australia. Email: [email protected]

*Present address: Department of Physiology, School of Medicine ofRibeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

†Present address: Department of Physiology, School of Medical Sciences,University of Bristol, Bristol, UK.

Received 17 February 2007; revision 19 March 2007; accepted 20 March2007.

© 2007 The Authors Journal compilation © 2007 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

Page 238: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Inotropic effect of chemoreceptor activation 1157

© 2007 The AuthorsJournal compilation © 2007 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

lung was removed, leaving the pulmonary circuit partially opened. Thepreparation was then transferred to a recording chamber and perfusedretrogradely via the descending aorta using a peristaltic pump. Perfusionpressure was maintained in the range 50–70 mmHg by adjusting the flowrate of the pump to 28–32 mL/min. The composition of the perfusate wasas follows (in mmol/L): NaCl 125; NaHCO3 24; KCl 5; CaCl2 2.5; MgSO4

1.25; KH2PO4 1.25; dextrose 10; Ficoll 70 1.25%. The pH of the perfusatewas maintained at 7.3 by saturating with carbogen. From the peristaltic pump,the perfusate entered into a heat exchanger, where it was warmed to +31∞C.In this configuration only a fraction of the perfusate returns to the heartbecause most leaks from cut vessels into the recording chamber, where it iscollected and returned for recirculation.

We used anaesthesia only prior to decerebration and lumbar transection.Subsequently, for at least 30 min before the beginning and during theexperiment, the preparation was perfused with anaesthetic-free solution thatwas in contact with ambient air. Because halothane is a volatile anaestheticwith a high diffusion coefficient, during data collection our preparation wasanaesthetic free. Vecuronium bromide (2–4 mg/mL) was used to preventspontaneous respiratory movements. Left ventricular pressure (LVP) wasrecorded using a miniature pressure catheter (SPR-524; Millar Instruments,Houston, TX, USA) inserted into the lumen of the left ventricle via an incisionat the apex of the heart and secured with a purse suture. The first derivativeof LVP (LV dP/dt) and heart rate (HR) were computed online. For both LVPand LV dP/dt, peak systolic values were used for analysis. Rhythmic phrenicnerve discharge was recorded by a suction electrode and gave a continuousphysiological index of preparation viability. Using two stainless-steelpin electrodes, the heart was paced with rectangular 0.5 msec pulses at afrequency exceeding spontaneous beating by 10–15 b.p.m. with a voltageexceeding threshold by 50%. For activating peripheral chemoreceptors,potassium cyanide (KCN; 50 mL of a 0.05% solution) was injected into thedescending aorta, as described previously,10 always between phrenic bursts(Fig. 1). The chemoreflex was elicited without and 5 min later with cardiacpacing. Subsequently, either atenolol (0.5 mg/100 mL) or saline was addedto the perfusate and chemoreflex activation was repeated. Analysis of variancewith repeated measures and Fisher’s protected t-test were used to determinethe significance of differences in measured variables. Data are presented asthe mean±SEM.

RESULTS

In total, 13 preparations were studied (seven with atenolol and sixwith saline). The mean data values for the basal cardiovascular andrespiratory parameters were HR 298 ± 12 b.p.m., LVP 90 ± 6 mmHg,LV dP/dt 2990 ± 134 mmHg/s, left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) 0.8 ± 0.1 mmHg, mean perfusion pressure 62 ± 2 mmHgand respiratory rate 13 ± 2 phrenic bursts/min (n = 13). Respiratorysinus arrhythmia was clearly present in all preparations (Fig. 1, topleft panel).

Cardiovascular responses to chemoreflex activation depended onwhether it was elicited with or without cardiac pacing. In the lattercase, we observed marked falls in HR (–108 ± 21 b.p.m.), a two- tothreefold rise in LVEDP, complex polyphasic changes in LV dP/dTand LVP (initial increase and subsequent fall followed by a rise)and small and inconsistent changes in perfusion pressure (seesmall pressor response, Fig. 1a). When the chemoreflex was activatedduring cardiac pacing, it caused significant rises in LVP and LVdP/dt (Table 1), but had no effect on either LVEDP or perfusionpressure (Fig. 1b). Cardiac pacing also completely abolished therespiratory related changes in LVP and LV dP/dT that were insynchrony with the sinus arrhythmia (compare left and middlepanels in Fig. 1).

b1-Adrenoceptor blockade with atenolol reduced both baselineHR (from 301 ± 14 to 266 ± 10 b.p.m.; P < 0.05) and LV dP/dt(from 3077 ± 169 to 2658 ± 250 mmHg/s; P < 0.05), but had no

effect on either LVP or perfusion pressure. In paced atenolol-treatedpreparations, chemoreflex activation still evoked rises in LVP andLV dP/dt, but these were significantly smaller than pre-atenolol values(Fig. 1c; Table 1). Attenuation of KCN-induced inotropic responses

Fig. 1 Respiratory and cardiovascular effects elicited by activation ofperipheral chemoreceptors by intra-aortic injection of KCN (0.05%, 50 mL)in a working heart–brainstem preparation of the rat. (a) Control responseswithout cardiac pacing; (b) control responses with cardiac pacing; (c) responsesafter b1-adrenoceptor blockade, with cardiac pacing. Shown, from top tobottom, are integrated phrenic nerve discharge (ÚPND), heart rate (HR),perfusion pressure in the aorta (PP), left ventricular pressure (LVP; full scale)and, below, at extended vertical scale, to show changes in LVEDP and thefirst derivative of the left ventricular pressure (LV dP/dt). Arrows under ÚPNDtraces indicate moments of KCN injection. Note the pronounced cardiacsinus arrhythmia in the unpaced condition (a). The reflex-evoked increasein LVEDP was abolished during cardiac pacing (b). White traces on LVPand LV dP/dt records (middle panel) show the shape of the correspondingsignals at expanded time-scale (trace duration: 0.8 s).

Table 1 Changes in left ventricular pressure (LVP) and the first derivativeof LVP (LV dP/dt) elicited by chemoreflex activation in preparations withpaced hearts

Atenolol treated Saline treated

Before After Before After

LVP (mmHg) +16 ± 3 +5 ± 2* +13 ± 3 +15 ± 3LV dP/dt (mmHg/s) +778 ± 93 +394 ± 76* +618 ± 88 +590 ± 91

*P < 0.05 compared with pretreatment values.

Page 239: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

1158 VA Braga et al.

© 2007 The AuthorsJournal compilation © 2007 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

by atenolol was clearly not related to a serial effect because inanother group of rats in which vehicle only was added to the perfusateinstead of the b1-adrenoceptor blocker, these responses remainedunchanged (Table 1).

As reported previously,10–12 KCN induced powerful tachypnoea(from 13 ± 2 to 23 ± 3 phrenic bursts/min) in our preparation. Thisrespiratory response was unaffected by both cardiac pacing andsympathetic blockade.

DISCUSSION

The most important finding of the present study is that in anaesthetic-free decerebrated rat preparations, activation of peripheral chemore-ceptors elicits bradycardia associated with an increase in myocardialcontractility. It is well established that chemoreflex-inducedbradycardia is vagally mediated.13 In the present study, the rises inLVP and LV dP/dt were reduced by b1-adrenoceptor blockade and,thus, were sympathetically mediated. This is in full agreement withsimilar observations made by Vatner and Rutherford4 in consciousdogs and indicates, as suggested by Kollai and Koizumi,6 that duringchemoreflex, vagal and sympathetic neural outflows are both activatedbut have different targets within the heart and hence distinctconsequences on cardiac function, with vagal activity destined to thesino-atrial node and sympathetic activity directed to the ventricularmyocardium. Attempting to elucidate functional significance of thisneural pattern, Koizumi et al.14 demonstrated that direct simultaneouselectrical stimulation of vagal and sympathetic cardiac nervesresulted in a greater increase in cardiac output than did sympatheticstimulation alone.

In the few studies performed in anaesthetized dogs and cats, wherethe inotropic state of the myocardium was assessed during chemoreflexactivation, previous authors also observed increases in LVP and LVdP/dt.2,3 Interestingly, in both these species, consistent rises in cardiaccontractility were evoked from the aortic chemoreceptors, whereasactivation of carotid chemoreceptors produced small and variableeffects,3 or even reduced contractility.2 At present it is unknown whatreflex responses are present following stimulation of the aorticchemoreceptors in the rat.15 Our results suggest two possibilities,either: (i) there is a chemoreflex-induced positive inotropism, similarto other species; or (ii) the chemoreflex-mediated inotropic effect ismediated via carotid chemoreceptors, in contrast with other species.It may be that this inotropic response of chemoreflex activation(whether of carotid or aortic origin) is a common feature for manyor all mammalian species.

Chemoreflex-induced changes in contractility have never beenassessed before in the rat and have been examined in the non-anaesthetized state in only one earlier canine study.4 Importantly,because our results were obtained in decerebrated preparations, theywere not obscured by the action of general anaesthetics. This couldbe the reason for the powerful bradycardic effect we observedhere and reported previously in conscious, freely moving rats16 asopposed to the modest bradycardia usually observed during generalanaesthesia. We did not observe the pressor component of thechemoreflex normally present in conscious animals.17–19 In ourarterially perfused preparation, the most likely explanation for thisis the absence of most vascular beds where vasoconstriction occurs,because in other experiments (in the same preparation) we haveconsistently seen increases in sympathetic activity destined forvascular beds following chemoreflex stimulation.20

In the present study, we used LVP and LV dP/dt as indices of thecardiac contractile state. These indices are dependent on HR, cardiacpreload and afterload21–23 and, for this reason, it is difficult to interpretcomplex polyphasic changes in LVP and LV dP/dT that occurredin unpaced preparations. Our conclusions regarding chemoreflex-induced inotropic changes are based on observations made duringcardiac pacing, when force–frequency effects were eliminated andwhen there were no changes in pre- and after-load (as documentedby stable LVEDP and aortic perfusion pressure). Our preparation isquite invasive; however, it provides several clear advantages: (i) lackof chemoreceptor-induced pressor effects (discussed above) thatwould obscure results via afterload-dependent mechanisms; and(ii) because the lungs were permanently deflated, absence of feedbackfrom pulmonary afferents (stretch receptors) warranted absence ofany secondary respiration-related components.

Assuming the inotropic component of the chemoreflex is presentin humans, our findings may have important clinical implications.Patients with obstructive sleep apnoea have multiple episodes ofhypoxaemia during sleep, presumably resulting in repetitiveactivation of the chemoreflex. Several previous studies have reportedan association between obstructive sleep apnoea and cardiacarrhythmias24,25 and it may be that chemoreflex-induced increases inthe sympathetic outflow to the myocardium may potentially explainthe higher rate of cardiac mortality among these patients.

In conclusion, activation of peripheral chemoreceptors inanaesthetic-free decebrated rats evokes a positive inotropic responsethat is sympathetically mediated.

REFERENCES

1. de Burgh Daly M, Scott MJ. An analysis of the primary cardiovascularreflex effects of stimulation of the carotid body chemoreceptors in thedog. J. Physiol. 1962; 162: 555–73.

2. Karim F, Hainsworth R, Sofola OA, Wood LM. Responses of the heartto stimulation of aortic body chemoreceptors in dogs. Circ. Res. 1980;46: 77–83.

3. Daly MD, Jones JF. Respiratory modulation of carotid and aortic bodyreflex left ventricular inotropic responses in the cat. J. Physiol. 1998;509: 895–907.

4. Vatner SF, Rutherford JD. Control of the myocardial contractile stateby carotid chemo- and baroreceptor and pulmonary inflation reflexesin conscious dogs. J. Clin. Invest. 1978; 61: 1593–601.

5. Machado BH. Neurotransmission of the cardiovascular reflexes in thenucleus tractus solitarii of awake rats. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 940:179–96.

6. Kollai M, Koizumi K. Reciprocal and non-reciprocal action of the vagaland sympathetic nerves innervating the heart. J. Auton. Nerv. Syst. 1979;1: 33–52.

7. Boscan P, Allen AM, Paton JF. Baroreflex inhibition of cardiacsympathetic outflow is attenuated by angiotensin II in the nucleus ofthe solitary tract. Neuroscience 2001; 103: 153–60.

8. Paton JF, Boscan P, Pickering AE, Nalivaiko E. The yin and yang ofcardiac autonomic control: Vago–sympathetic interactions revisited.Brain Res. Rev. 2005; 49: 555–65.

9. Paton JF. A working heart–brainstem preparation of the mouse.J. Neurosci. Methods 1996; 65: 63–8.

10. Antunes VR, Braga VA, Machado BH. Autonomic and respiratoryresponses to microinjection of ATP into the intermediate or caudalnucleus tractus solitarius in the working heart–brainstem preparationof the rat. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2005; 32: 467–72.

11. Paton JF, Li YW, Kasparov S. Reflex response and convergence ofpharyngoesophageal and peripheral chemoreceptors in the nucleus ofthe solitary tract. Neuroscience 1999; 93: 143–54.

Page 240: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

Inotropic effect of chemoreceptor activation 1159

© 2007 The AuthorsJournal compilation © 2007 Blackwell Publishing Asia Pty Ltd

12. Braga VA, Machado BH. Chemoreflex sympathoexcitation was notaltered by the antagonism of glutamate receptors in the commissuralnucleus tractus solitarii in the working heart–brainstem preparation ofrats. Exp. Physiol. 2006; 91: 551–9.

13. Daly MB. Peripheral Arterial Chemoreceptors and Respiratory–Cardiovascular Integration. Physiological Society Monograph No. 46.Clarendon Press, Oxford. 1997.

14. Koizumi K, Terui N, Kollai M, Brooks CM. Functional significance ofcoactivation of vagal and sympathetic cardiac nerves. Proc. Natl Acad.Sci. USA 1982; 79: 2116–20.

15. Brophy S, Ford TW, Carey M, Jones JF. Activity of aortic chemoreceptorsin the anaesthetized rat. J. Physiol. 1999; 514: 821–8.

16. Haibara AS, Bonagamba LG, Machado BH. Sympathoexcitatoryneurotransmission of the chemoreflex in the NTS of awake rats. Am.J. Physiol. 1999; 276: R69–80.

17. Huang W, Lahiri S, Mokashi A, Sherpa AK. Relationship betweensympathetic and phrenic nerve responses to peripheral chemoreflex inthe cat. J. Auton. Nerv. Syst. 1988; 25: 95–105.

18. Franchini KG, Krieger EM. Cardiovascular responses of conscious ratsto carotid body chemoreceptor stimulation by intravenous KCN. J. Auton.Nerv. Syst. 1993; 42: 63–70.

19. Haibara AS, Colombari E, Chianca DA, Bonagamba LG, Machado BH.NMDA receptors in NTS are involved in bradycardic but not inpressor response of chemoreflex. Am. J. Physiol. 1995; 269: H1421–7.

20. Pickering AE, Paton JF. A decerebrate, artificially-perfused in situpreparation of rat: Utility for the study of autonomic and nociceptiveprocessing. J. Neurosci. Methods 2006; 155: 260–71.

21. Bowditch HP. Ueber die Eigenthuemlichkeiten der Reizbarkeit, welchedie Muskelfasern des Herzens zeigen. Verh. K. Sachs Gen. Wochenschr.Leipzig Math. Phys. Cl. 1871; 23: 652–69.

22. von Anrep G. On the part played by the suprarenals in the normalvascular reactions of the body. J. Physiol. 1912; 45: 307–17.

23. Patterson SW, Starling EH. On the mechanical factors which determinethe output of the ventricles. J. Physiol. 1914; 48: 357–79.

24. Gami A, Howard D, Olson E, Somers V. Day–night pattern of suddendeath in obstructive sleep apnea. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 1206–14.

25. Guilleminault C, Connolly SJ, Winkle RA. Cardiac arrhythmia andconduction disturbances during sleep in 400 patients with sleep apneasyndrome. Am. J. Cardiol. 1983; 52: 490–4.

Page 241: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

J Physiol 586.20 (2008) pp 4791–4792 4791

JOURNAL CLUB

Are ATP and glutamate releasedfrom slowly adapting pulmonarystretch receptor afferentsin the NTS?

Valdir A. Braga1, Daniel B. Zoccal2

and Daniela Accorsi-Mendonca2

1Department of Medicine, The University

of Chicago, Chicago, IL, USA2Department of Physiology, School of

Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao

Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

Email: [email protected]

The slowly adapting pulmonary stretch

receptors (SARs) are an important

mechanosensory component of the

respiratory system involved in the lung

inflation control, regulating the inspiratory

and expiratory phase timing through

connections with neurones within the

brainstem involved with the control of

respiratory activity. The activation of these

receptors evokes responses of inspiratory

shortening and expiratory lengthening,

collectively termed as the Breuer–Hering

reflex, and is characterized by the mono-

synaptic activation of the pump cells located

in a discrete region of the nucleus tractus

solitarius (NTS), whose pattern of discharge

is determined by the lung inflation. In

a very elegant series of experiments,

Bonham et al. (1993) demonstrated that

glutamate, acting on its non-NMDA

receptors, is the neurotransmitter released

by the SARs afferents in the NTS, once the

broad-spectrum glutamatergic receptor

antagonist kynurenic acid (KYN) or the

non-NMDA receptor antagonists CNQX

and DNQX, but not the NMDA receptor

antagonist AP-5, microinjected in a

delineated area of the NTS containing

the major population of pump cells,

were able to attenuate/prevent the apnoea

evoked by the Breuer–Hering activation.

Thus, the concept that glutamate is the

neurotransmitter released by SARs terminal

in the NTS has been well accepted for the

last 15 years or so.

In a recent study in The Journal

of Physiology, Gourine et al. (2008)

proposed that the neurotransmission of

the Breuer–Hering reflex in the NTS

involves other neurotransmitters than solely

glutamate. Using an elegant series of

experimental approaches, such as the

measurement of neurotransmitter release by

biosensors, pharmacological antagonisms

and extracellular recordings of NTS neurone

activity, the authors tested the hypothesis

that both ATP and glutamate are released

from SARs terminals in the NTS. Using

state-of-the-art biosensors, Gourine et al.

(2008) showed that within the region of the

NTS where SARs make their first synapses,

the concentrations of ATP and glutamate

increase rhythmically in a phase-locked

manner with increase in tracheal pressure

(a measure of lung inflation). It was also

demonstrated that the rhythmic release

of ATP was not affected by inhibition

of the central respiratory generator or by

the application of KYN or GABA on the

dorsal surface of medulla, but was abolished

after reversible pharmacological blockade of

afferent vagal transmission, suggesting that

SARs terminals release ATP in the NTS and

mediate the Breuer–Hering reflex. Taking

into consideration some important issues

regarding the purinergic transmission in

the NTS, the group of data presented by

Gourine et al. (2008) does not fully confirm

that the ATP is released along with glutamate

from SARs afferents.

There are several pieces of evidence

showing that ATP is not released from

peripheral inputs in the NTS, supporting

the concept that only glutamate is release

from SARs terminals within this brain-

stem region. Although the distribution of

purinergic receptors (P2X1–P2X6) has been

characterized by immunohistochemistry in

the NTS and the activation of presynaptic

P2X receptors was shown to facilitate

glutamate release from afferent terminals in

the NTS, stimulation of the solitary tract

does not release ATP and the recordings

of neurones in the nodose ganglion do

not show purinergic currents, suggesting a

different source for ATP than the terminal

afferents at the NTS (Yao et al. 2000; Jin

et al. 2004). On the other hand, studies using

immunodetection and electron microscopy

have demonstrated the presence of vesicular

glutamate transporter 1 or 2 in terminal

afferents in the NTS. Furthermore, vagus

nerve sensory afferents present glutamate

immunoreactivity in synapse boutons on

NTS neurones, indicating that glutamate is

a neurotransmitter within these neurones.

Further, electrophysiological studies also

confirm that the solitary tract releases only

glutamate upon stimulation.

Gourine et al. (2008) suggested that SARs

terminals release ATP by showing that the

rhythmic increase in ATP concentration in

the NTS evoked by lung inflation was not

affected by high concentrations of KYN

and GABA applied on the dorsal surface

of medulla, which supposedly suppressed

the neuronal activity on the dorsal

medulla, including the NTS. Although

significant changes in baseline arterial

pressure and inspiratory activity were

observed after topical applications of KYN

and GABA, there are no guarantees that

these treatments on the dorsal medulla were

effective in depressing all neuronal activity

at the NTS level. This issue becomes more

evident if it is considered that KYN and

GABA applications on the dorsal surface

of the medulla produced opposite effects

on the arterial pressure. As previously

demonstrated, bilateral microinjection of

KYN or GABA in the NTS of rats, at

the level of the area postrema, evokes an

increase in baseline arterial pressure due

to the inhibition of the sympathoinhibitory

pathway of the baroreflex (Machado, 2001).

Therefore, the data presented by Gourine

et al. (2008) showing discrepant effects

of KYN and GABA applications on the

dorsal surface of the medulla raises the

following question: is the neuronal activity

in the dorsal surface of the medulla,

especially in the NTS, properly suppressed

by the topical application of KYN and

GABA? Accordingly, although Gourine

et al. (2008) showed that the increase in

ATP concentration in the NTS correlates

with the normal lung inflation, there is

no experimental evidence supporting the

hypothesis that ATP is released from SARs

terminals. Alternatively, ATP can be released

by other neurones or even by glial cells

within the NTS circuitry that could be

excited by the glutamate released from

the SARs terminals, which in turn would

contribute to more glutamate release in a

feed-forward mechanism. Although equally

interesting, this possibility also requires

further investigation.

Considering that ATP is released from

the SARs terminals into NTS, one would

assume that the continuous inflation

of the lungs would evoke a sustained

increase in ATP concentration at NTS.

This important issue should be further

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society DOI: 10.1113/jphysiol.2008.160549

) at FMRP/USP on February 9, 2010jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (

Page 242: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

4792 Journal Club J Physiol 586.20

investigated to corroborate or refute the

main hypothesis proposed by the authors.

Alternatively, the authors showed that

high-frequency stimulation of the vagus

nerve (pulses of 1 ms, 0.5 mA, 100 Hz,

which mimics lung inflation) promoted

an increase in ATP concentration in the

NTS. However, this approach does not

fully confirm whether the increase in ATP

concentration was evoked solely by the

stimulation of SARs afferents or whether it

was associated with the activation of other

reflex pathways that transit along the vagus

nerve, such as the baroreflex, which is also

stimulated at high-frequency stimulation

of the vagus. In favour of the argument

that ATP is not released from SARs

terminals, Kato et al. (2004) demonstrated

in rabbits that the purinergic antagonist

PPADS did not affect the respiratory

responses evoked by high-frequency

stimulation of the vagus nerve. Thus,

further studies are needed to clarify this

aspect.

Finally, the authors demonstrated that

microinjections of ATP in the NTS induced

an immediate and prolonged apnoea. In

addition, ionophoretic application of ATP

on pump cells increases significantly their

activity. However, it can not be assumed

that the effects observed on pump cells and

respiratory activities were a direct effect

of ATP or an effect of the glutamate per

se, due to the facilitation in glutamate

release produced by ATP. Therefore, the

experiments showing the effects of the

antagonism of purinergic and glutamatergic

receptors on pump cell activity may

not address this issue properly. The

reduction in neuronal activity of pump cells

observed after ionophoretic application of

the broad-spectrum purinergic receptor

antagonist suramin was not different

from the reduction observed after the

combination of suramin and KYN. The

use of suramin as a purinergic antagonist

is controvertial because it has very poor

selectivity for purinergic receptors acting,

depending upon concentration, even on

glutamatergic receptors.

In summary, the elegant series of

experiments presented by Gourine et al.

(2008) suggesting that in a discrete area of

the NTS, where the major population of

pump cells are located, the concentration

of ATP increases phase-locked with lung

inflation is intriguing and thoughtful.

However, the precise cellular source of

ATP as well as its physiological significance

in mediating the neurotransmission of

the Breuer–Hering reflex is still unclear

and will certainly be a matter for

further investigation. This study will greatly

contribute to the field and inspire other

investigators interested in the neuro-

transmission of the cardiovascular and

pulmonary reflexes in brainstem areas such

as the NTS.

References

Bonham AC, Coles SK & McCrimmon DR

(1993). Pulmonary stretch receptor afferents

activate excitatory amino acid receptors in the

nucleus tractus solitarii in rats. J Physiol 464,

725–745.

Gourine AV, Dale N, Korsak A, Llaudet E, Tian

F, Huckstepp R & Spyer KM (2008). Release

of ATP and glutamate in the nucleus tractus

solitarii mediate pulmonary stretch receptor

(Breuer–Hering) reflex pathway. J Physiol 586,

3963–3978.

Jin YH, Bailey TW, Li BY, Schild JH & Andresen

MC (2004). Purinergic and vanilloid receptor

activation releases glutamate from separate

cranial afferent terminals in nucleus tractus

solitarius. J Neurosci 24, 4709–4717.

Kato F, Shigetomi E, Yamazaki K, Tsuji N &

Takano K (2004). A dual-role played by

extracellular ATP in frequency-filtering of the

nucleus tractus solitarii network. Adv Exp

Med Biol 551, 151–156.

Machado BH. (2001). Neurotransmission of the

cardiovascular reflexes in the nucleus tractus

solitarii of awake rats. Ann N Y Acad Sci 940,

179–196.

Yao ST, Barden JA, Finkelstein DI, Bennett MR

& Lawrence AJ (2000). Comparative study on

the distribution patterns of P2X1-P2X6

receptor immunoreactivity in the brainstem of

the rat and the common marmoset (Callithrix

jacchus): association with catecholamine cell

groups. J Comp Neurol 427, 485–507.

C© 2008 The Authors. Journal compilation C© 2008 The Physiological Society

) at FMRP/USP on February 9, 2010jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (

Page 243: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

F

M

Aa

b

c

d

e

a

AA

KRBA

1

tamtrovmbwmoop

1d

Respiratory Physiology & Neurobiology 168 (2009) 19–25

Contents lists available at ScienceDirect

Respiratory Physiology & Neurobiology

journa l homepage: www.e lsev ier .com/ locate / resphys io l

rontiers review

ultiple pontomedullary mechanisms of respiratory rhythmogenesis

.P.L. Abdala a, I.A. Rybak b, J.C. Smith c, D.B. Zoccal d, B.H. Machado d, W.M. St-John e, J.F.R. Paton a,∗

Department of Physiology & Pharmacology, Bristol Heart Institute, School of Medical Sciences, University of Bristol, University Walk, Bristol BS8 1TD, United KingdomDepartment of Neurobiology and Anatomy, Drexel University College of Medicine, Philadelphia, PA, USACellular and Systems Neurobiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USADepartment of Physiology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, BrazilDepartment of Physiology, Dartmouth Medical School, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH 03755, USA

r t i c l e i n f o

rticle history:ccepted 10 June 2009

eywords:etrotrapezoid nucleiötzinger complexbdominal nerve

a b s t r a c t

Mammalian central pattern generators producing rhythmic movements exhibit robust but flexible behav-ior. However, brainstem network architectures that enable these features are not well understood. Usingprecise sequential transections through the pons to medulla, it was observed that there was compartmen-talization of distinct rhythmogenic mechanisms in the ponto-medullary respiratory network, which hasrostro-caudal organization. The eupneic 3-phase respiratory pattern was transformed to a 2-phase andthen to a 1-phase pattern as the network was physically reduced. The pons, the retrotrapezoid nucleusand glycine mediated inhibition are all essential for expression of the 3-phase rhythm. The 2-phaserhythm depends on inhibitory interactions (reciprocal) between Bötzinger and pre-Bötzinger complexes,whereas the 1-phase-pattern is generated within the pre-Bötzinger complex and is reliant on the per-sistent sodium current. In conditions of forced expiration, the RTN region was found to be essential forthe expression of abdominal late expiratory activity. However, it is unknown whether the RTN generates

or simply relays this activity. Entrained with the central respiratory network is the sympathetic nervoussystem, which exhibits patterns of discharge coupled with the respiratory cycle (in terms of both gainand phase of coupling) and dysfunctions in this coupling appear to underpin pathological conditions. Inconclusion, the respiratory network has rhythmogenic capabilities at multiple levels of network organi-zation, allowing expression of motor patterns specific for various physiological and pathophysiological respiratory behaviors.

. Introduction

Breathing in mammals is a critical robust homeostatic processhat ensures adequate levels of oxygen (O2) in blood and provides

means to exhaust carbon dioxide (CO2). Rhythmic respiratoryovements must occur continuously throughout life so the con-

rol system has to be robust, yet flexible to account for integratedesponses under different stressors. The mammalian respiratoryscillator originates from brainstem networks encompassing theentrolateral medulla and pons and has evolved to generate rhyth-ic patterns of motor activity producing coordinated movements of

oth the respiratory pump muscles (diaphragm, thorax, abdomen),hich bring about lung inflation and deflation, and upper airway

uscles, controlling resistance to airflow. These rhythmic motor

utflows must be coordinated temporally to allow efficient andptimal exchange and transport of O2 and CO2 thereby ensuringhysiological homeostasis within the brain and the rest of the body.

∗ Corresponding author. Tel.: +44 117 331 2275; fax: +44 117 331 2288.E-mail address: [email protected] (J.F.R. Paton).

569-9048/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.oi:10.1016/j.resp.2009.06.011

© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Clearly, the cardiovascular system plays an essential role for gastransport and distribution to meet demand. It is therefore not sur-prising that the respiratory and cardiovascular systems are tightlycoupled via neural connections within the pons and medulla (Fig. 1;see Dick et al., this issue).

This highly phase coordinated respiratory motor output relieson a combination of synaptic interactions among populations ofrespiratory neurons, and their electrophysiological properties. Thisnetwork is highly dynamic, plastic and designed to be modulated tomeet the demands of an ever-changing environment. It is, therefore,highly state-dependent and it is under control of various peripheraland central sensory inputs as well as all types of endogenous neuro-modulatory signals. For example, alterations in the metabolic stateof a mammal, or the O2 and CO2 levels in the blood, will modifythe respiratory motor pattern and mechanisms of rhythm gener-ation (Rybak et al., 2007; St-John et al., 2002; Smith et al., 2007;

Abdala et al., 2009). State-dependent changes not only regulatethe frequency and amplitude of the motor activity (i.e., rate anddepth of breathing), but can dramatically reconfigure the networkgenerating respiratory rhythm. This occurs rapidly and seamlesslyand can result in short term and chronic responses (see below).
Page 244: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

20 A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Physiology & Neurobiology 168 (2009) 19–25

Fig. 1. Cardio-laryngo-sympathetic–respiratory coupling recorded in situ. A mon-tage showing integrated activities of the phrenic nerve (PNA), recurrent laryngealnerve (RLN) and sympathetic nerve activity (SNA; thoracic chain) to show coor-dination of cranial and spinal cardio-respiratory motor outflows in an arteriallyperfused rat preparation without pulmonary stretch receptor feedback. Note the3-phase rhythm (inspiration, Insp; post-inspiration; expiration, Exp) correspond-ing to that defined by Richter (1982). During central inspiratory activity indexedby phrenic (Insp), heart rate (HR) increases (due to central synaptic inhibition ofcardiac vagal motoneurons and increased sympathetic discharge) and the glottisdilates due to activation of laryngeal abductors. During early expirations (so-called,post-inspiration), heart rate falls as the inspiratory related inhibition of the cardiacvtap

Thphet

2p

nTrdgrarfsiurrNoap

Fig. 2. Eupneic pattern of respiratory motor activity in situ. In control conditions(normocapnia) phrenic (PN) and hypoglossal (HN) have an inspiratory ramp shapedactivity envelope whereas abdominal nerve (AbN; lumbar segment (1) exhibits smallamplitude post-inspiratory activity. Using 10% carbon dioxide (i.e., 5% above normo-capnic conditions), central respiratory drive was raised. This resulted in generation of

agal motoneurons is removed. At this time the laryngeal adductors fire causing aransient constriction of the glottis; the latter stalls expiratory air flow so givingdequate time for gas exchange. Note, that the SNA is respiratory phase locked andeaks in the post-inspiratory phase. Modified from Paton and Nolan (2000).

his short review will summarise a number of recent studies thatave described the hierarchical compartmental organization of theonto-medullary network generating respiratory rhythm. Belowighlights the transitions dependent on metabolic state and itsssential coupling to the cardiovascular system. The latter is illus-rated with reference to pathological conditions.

. The 3-phase rhythm of respiration: a unified startingoint?

Richter (1982) emphasised the concept that the ‘normal’ or eup-eic respiratory pattern comprised 3 phases per respiratory cycle.his included: inspiration, post-inspiration (stage I) and active expi-ation (stage II; see also Bianchi and Gestreau, this issue). Fig. 1epicts these 3 phases by comparing phrenic and recurrent laryn-eal motor outflows. This pattern seems to hold true in mouse andat including newborn rats (Abdala et al., 2009; Dutschmann etl., 2000; Paton, 1996b, 1997; Paton et al., 2006). Stage II expi-ation (termed here as late-E) is best observed when recordingrom abdominal motor nerves under high respiratory drive statesuch as hypercapnia (Fig. 2). Note that hypoxia, hypercapnia andschemia will bring into play late-E activity, but late-E is absentnder normoxia and normocapnia. This activity accentuates expi-atory pumping via abdominal muscle contraction and thereby

educes expiratory time to allow respiratory frequency to increase.ote also, that during the expression of late-E activity, the onsetf hypoglossal motor activity occurs coincidently and earlier rel-tive to phrenic than when late-E is absent. Thus, hypoglossalre-inspiratory discharge is both longer in duration and advanced in

augmenting expiratory activity in the AbN outflow (Late-E; arrowed) and advancedthe onset of pre-inspiratory HN activity relative to PN; the latter indicating reducedairway resistance during both the forced expiration and inspiration. The pattern ofPN now showed an abrupt onset in discharge (see Abdala et al., 2009).

onset during forced expiration; this is important for reducing upperairway resistance during abdominal expiratory pumping (Fig. 2;Abdala et al., 2009).

3. Putting differences in experimental preparations aside

The above description is based on that from the arterially per-fused in situ preparation of decerebrate rat (Paton, 1996a,b). Thispreparation provides a phrenic motor pattern that is similar to thatreported from an in vivo decerebrate rat (e.g. Shen et al., 2003).The slower frequency reflects the absence of phasic pulmonarystretch receptor feedback and cooler operating temperature (31 ◦C).However, it is distinct to that reported from in vitro preparationsof neonatal rat and mouse either transverse slice (thick or thin),en bloc brainstem or brainstem spinal cord. Why are there thesedifferences? A proposal is, that the physical compartmentalizationand/or change in metabolic state that accompany the in vitro prepa-ration enforce a reorganization of the neuronal mechanisms gen-erating respiratory motor pattern. The following section describesan attempt to unify the central respiratory control field by provid-

ing an explanation as to why different preparations (in vitro versusin situ/in vivo) produce different respiratory motor patterns. But,importantly, it also reveals novel insights into the hierarchical orga-nization of the ponto-medullary network and multiple mechanismsfor rhythm generation that operate in a state-dependent manner.
Page 245: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

iology

4g

ptrtprmtaihmtdcRTp(

FssAurrpiCtAp

A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Phys

. The 3–2–1 hypothesis of respiratory rhythm/patterneneration

The hypothesis is that there is both spatial and functional com-artmentalization of the respiratory network. If this is the case,hen logically it should be possible to divide it up. Sequentialostral to caudal transections through the ponto-medullary respira-ory network within the in situ perfused rat brainstem-spinal cordreparation allowed us to show that network dynamics reorganizedapidly (within a respiratory cycle or two) and new rhythmogenic

echanisms emerge (Rybak et al., 2007; Smith et al., 2007). Thus,he 3-phase respiratory rhythm (eupneic pattern) transformed to2-phase and then to a 1-phase rhythm as the network was phys-

cally reduced using precision micro-vibratome slicing. Based onistological reconstruction of boundaries from sliced brainstems ofultiple preparations, expression of the 3-phase rhythm required

he presence of the pons, whereas generation of the 2-phase rhythmepended on the integrity of Bötzinger (BötC) and pre-Bötzingeromplexes (pre-BötC; see Ruangkittisakul and Ballanyi, this issue;

uangkittisakul et al., this issue) and interactions between them.he 1-phase pattern was generated within the pre-Bötzinger com-lex and disappeared once this region was transected caudallyFig. 3).

ig. 3. 3–2–1 phase hypothesis of respiration. (A) Schematic drawing depicting thepatial arrangement of the ventral respiratory column viewed sagittally. Microtran-ections of the brainstem are indicated by the vertical dashed lines. Abbreviations:mbC: compact nucleus ambiguus; BötC: Bötzinger Complex; LRt: lateral retic-lar nucleus; Pn: pontine nucleus; pre-BötC: pre-Bötzinger Complex; RTN/vlPF:etrotrapezoid nucleus and ventrolateral parafacial regions; rVRG: rostral ventralespiratory group; V: trigeminal motor nucleus; VII: facial motor nucleus. (B) Activityatterns of phrenic (PN), abdominal (AbN), and central vagus (cVN) nerves from an

ntact preparation (3-phase pattern) during eucapnia (5% CO2) and hypercapnia (7%O2), and after a ponto-medullary transection. The latter resulted in a 2-phase pat-ern in which late-E abdominal bursts are abolished during hypercapnia (8.5% CO2).fter a transection at the rostral boundary of the pre-BötC, a 1-phase inspiratoryattern was evoked and all expiratory motor activity was abolished.

& Neurobiology 168 (2009) 19–25 21

Clearly this approach is extreme, so could one obtain these 3- to2- or 2- to 1-phase transitions without physically cutting throughthe ponto-medullary neuraxis? This was approached by reducingchloride-mediated synaptic inhibition (low extracellular Cl− con-centration in ponto-medullary intact preparations; Smith et al.,2007), or lowering CO2 (Smith et al., 2007) or blocking glycinereceptors with strychnine (Büsselberg et al., 2001; Dutschmann andPaton, 2002). All these manipulations transformed the 3-phase to a2-phase respiratory pattern a response similar to that reported afterinactivation of the Kolliker Fuse (Dutschmann and Herbert, 2006).Moreover, a 1-phase pattern (analogous to gasping) could be pro-duced during ischemia (Paton et al., 2006). In all cases, the blockadeof persistent sodium current (INaP) abolished the 1-phase rhythmin stark contrast to the 3-phase and 2-phase rhythms which are notdependent on this current (Smith et al., 2007). These results sug-gest that the 3-phase and 2-phase rhythms depend on inhibitorysynaptic interactions between networks of neurons located in twocore adjacent compartments—the BötC and pre-BötC, with essen-tial tonic drive arising from different rostral regions. The 1-phaserhythm, however, depends on INaP and local synaptic excitationconfined to the pre-BötC only. Thus, these data suggest that theponto-medullary respiratory network has numerous rhythmogeniccapabilities that are distinct and operate at multiple levels of net-work organization. This provides both robustness and back-up, andundoubtedly allows expression of motor patterns specific for vari-ous physiological and/or pathophysiological respiratory behaviors.Finally, the 2- and 1-phase respiratory motor patterns may maponto those that are observed in vitro. Therefore, it becomes essen-tial to know what regions of the network are being isolated inslice preparations (BötC and pre-BötC or pre-BötC only) as bothuse distinct neuronal mechanisms to generate rhythmic motor out-puts. In en bloc brainstem or brainstem-spinal cord preparationsextreme metabolic conditions such as hypercapnia and hypoxia inthe deeper brainstem tissue may impair network connectivity andsynaptic functions, resulting in either a 2- or 1-phase pattern. Suchmetabolic disturbances were mimicked by depressing glycinergicsynaptic inhibition and raising levels of extracellular potassium(see St-John et al., 2002). This resulted in switching from a 3-phaseeupneic pattern to a 1-phase pattern (see St-John et al., 2002).

5. The pre-BötC: a kernel with essential connections

The results from Smith et al. (1991, 2007) indicate that the pre-BötC when isolated physically can generate respiratory rhythmicitybut in the intact ponto-medullary brainstem is functionally embed-ded into a broader network. Clearly it can operate in multiple modesof rhythm generation, such as intrinsic bursting, which does notrequire phasic inhibition, or a tonic activity mode which needs pha-sic inhibition to exhibit rhythmic bursting activity (Smith et al.,2000). It is proposed that the mechanism by which the pre-BötCgenerates rhythmic activity are based on synaptic inputs (phasicand tonic) from many levels of the central neuraxis including boththe BötC (providing phasic inhibition) and from more rostral struc-tures including the retrotrapezoid nucleus (RTN; see Guyenet et al.,this issue; Onimaru et al., this issue) and the pons (controlling thestate of the pre-BötC). These inputs define the mode of operationof the pre-BötC and hence the rhythmogenic mechanism expressedby the entire brainstem respiratory network.

Until recently, intrinsic burster neurons of the pre-BötC hadonly been described in neonatal tissue in vitro, with no functioningpons. Evidence now exists demonstrating the first description

of pre-BötC bursters in mature mice (Paton, 1997) and rats(Fig. 4; Paton et al., 2006; St-John et al., 2009) with an intactpontomedullary brainstem. In the mature rat, these neurons havean intrinsic ability to generate bursts in the absence of ionotropicmediated synaptic inputs. They are located in both the pre-BötC
Page 246: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

22 A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Physiology & Neurobiology 168 (2009) 19–25

Fig. 4. Respiratory burster neurons recorded from a ponto-medullary intact in situ rat preparation. Prior to their synaptic isolation, burster neurons were characterized asi rizedb videnta e to blw 2009

atawteFsodnvlnfmtieaibidnct

nspiratory and held relatively hyperpolarized during eupnea (A). Bursters depolaicuculline) when ectopic bursts that did not correspond to a phrenic burst were end resulted in intrinsic bursting which was voltage-dependent (B-i, ii) and sensitivhile others were in the rostral ventral respiratory group region (see St-John et al.,

nd extend caudally into the rostral ventral respiratory column,hey have axons that cross the midline and some, but not all,re glutamatergic (St-John et al., 2009). In the intact network,hen the intrinsic bursting property is suppressed (see below),

hese bursters are inspiratory neurons such that their firing isither coincident with phrenic motor outflow or just precedes it.urther, in the intact ponto-medullary system intrinsic bursting isuppressed by chloride mediated synaptic inhibition. The blockadef GABAA and glycine receptors depolarize these neurons and theyemonstrate ectopic bursting (Fig. 4). As with in vitro bursters ofeonatal rats, it is clear that the frequency of burst generation isoltage-dependent. However, it was found that even at the upperimit of their intrinsic bursting frequency was slower than the eup-eic rhythm (St-John et al., 2009) suggesting another mechanism

or eupneic breathing. Finally, intrinsic bursters are sensitive toetabolic hypoxia (induced by cyanide), which is consistent with

heir role in gasp generation (St-John et al., 2009). Indeed, thisntrinsic property makes them ideal for operating in low oxygennvironments when synaptic inhibition is likely to fail (Schmidt etl., 1995). In sum, based on recent evidence (St-John et al., 2009),t seems unlikely that the intrinsic bursting property of theseurster neurons is expressed during eupnea. During eupnea, the

ntrinsic bursting property of pacemakers or groups of pacemakersiscussed earlier (see Feldman and Del Negro, 2006) might haveo crucial role in driving normal breathing. However, the ioniconductances of these neurons may play critical roles in shapinghe pattern of discharge of these neurons during eupnea.

subsequent to blockade of glycine and GABAA receptors (1 �M strychnine, 20 �M(arrowed). Blockade of ionotropic glutamate receptors arrested phrenic discharge

ockade of persistent sodium current. Some bursters were found in the pre-BötC (C)for details).

6. Forced breathing: recruitment of an expiratory oscillator

The abdominal motor outflow targets accessory muscles ofbreathing. During quiet breathing these muscles provide postu-ral tone and a foundation on which the thoracic pump musclecan operate but do not show respiratory rhythmic contraction.However, during increased respiratory drive as during exerciseor hypercapnia, abdominal muscle pumping is recruited to pro-vide a mechanism for active (or forced) expiratory pumping. Itremains unclear where the oscillator for this active expiratory activ-ity resides but the parafacial respiratory group (pFRG) has beensuggested (Feldman and Del Negro, 2006).

The location of the pFRG partially overlaps with the RTN (Fortunaet al., 2008). The RTN plays a critical role in controlling the respi-ratory rhythm and has appropriate connectivity to/from the ponsand ventral respiratory column as well as input from periph-eral chemoreceptors (see Guyenet, 2008; Guyenet et al., 2008;Mulkey et al., 2004; Nattie, 2001). The RTN senses changes inarterial tension of CO2 (central chemosensitivity) in both anaes-thetised and conscious rats. In addition, inactivation of the RTN inanaesthetised rats causes apnea that cannot be reversed by concur-rent peripheral chemoreceptor stimulation (Mulkey et al., 2004)

whereas activation of the RTN stimulates breathing (Abbott et al.,2009). Recordings from this region indicate that chemosensitiveneurons fire tonically and are only weakly respiratory modulatedeven with high levels of hypercapnia in adult anaesthetised rats(Guyenet, 2008). Yet others describe phasic expiratory neurons
Page 247: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

iology

tbrti(etnnitoporFeii

dnittdtqpu

miom(raonRAh

Fbv(r

A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Phys

hat fire in late and early expiration—so-called “pre-inspiratory” (oriphasic expiratory) in in vitro en bloc brainstem/spinal cord prepa-ations of neonatal rats. Onimaru et al. (1987, 1988, 2006) proposedhat this “pre-inspiratory” activity originates from a primary (pre-nspiratory) oscillator located in the pFRG that entrains a secondaryinspiratory) oscillator in the pre-BöC. Others, using both in vitron bloc and in vivo preparations of newborn rats, reported thathe same biphasic-E activity originating in pFRG drives abdomi-al muscles activity (Janczewski et al., 2002), although they didot substantiate this claim by providing central unitary record-

ngs. Notwithstanding, Janczewski and Feldman (2006) proposedhat the same biphasic-E activity is generated by an “expiratoryscillator” located in RTN/pFRG that interacts reciprocally with there-BötC inspiratory oscillator, and that the coupling of these twoscillators represents a fundamental mechanism for respiratoryhythm generation (Feldman and Del Negro, 2006; Janczewski andeldman, 2006). This concept opposes that suggested by Onimarut al. (1987, 1988, 2006) who believe that the RTN/pFRG providesnspiratory promoting oscillations. How might these opposingdeas be reconciled?

Recent data from Abdala et al. (2009) using the unanesthetisedecerebrate in situ rat indicate that suppression of the RTN doesot cause apnoea. Rather, it depresses post-inspiratory activity dur-

ng normocapnia and totally abolishes late-E abdominal activityhat is evoked during hypercapnia (Fig. 5; Abdala et al., 2009). Fur-her, in conditions of hypercapnia a sub-population of RTN neuronsischarged during late expiration and they were comparable tohose of Onimaru et al. (1987, 1988, 2006). These neurons wereuiescent during normocapnia, but, their phenotype, projectionatterns and whether they are originators or followers remainnknown.

Thus, there is accumulating evidence indicating that in theature rat the RTN region is essential for expression of late-E activ-

ty and for abdominal pumping during hypercapnia. It appears thatscillatory activity within the RTN of mature rats is absent in nor-ocapnia but emerges with hypercapnia. Data from Abdala et al.

2009) contest the importance of the RTN/pFRG as a fundamentalhythmogenic mechanism during normal breathing (see Feldmannd Del Negro, 2006; Janczewski and Feldman, 2006). The origin

f the late-E discharges in RTN is unknown and may be within thisucleus or from other regions such as the pons; if the latter, then theTN may act as a relay to retroambigual abdominal motoneurons.s demonstrated below, it is clear that abdominal motor activity isighly plastic and can be up-regulated under chronic pathological

ig. 5. Reversible inactivation of the RTN abolished the 3-phase respiratory pattern and hy bilateral microinjections of isoguvacine hydrochloride (GABAA receptor agonist). Thisagus (cVN) nerves, and the phrenic nerve pattern (PN) was transformed to a “square-wave10% CO2). Note that hypercapnia partially reinstated post-inspiratory activity during RTight panel). All traces show integrated nerve activities.

& Neurobiology 168 (2009) 19–25 23

conditions of intermittent hypoxia and become expressed duringnormocapnia.

7. Plasticity of respiratory modulation of sympatheticactivity: novel insights into pathological states

Physiologically it is essential to match cardiac output with respi-ratory minute volume to ensure efficient delivery of oxygen to thetissues not only in resting conditions but also during physiologi-cal challenges. Fig. 1 shows that the central networks regulatingbreathing and the cardiovascular system are coupled including res-piratory modulation of both heart rate and thoracic sympatheticnerve activity; the latter typically occurs during late inspiration andearly post-inspiratory phases. Since the work of Anrep et al. (1936),it was known that respiratory sinus arrhythmia was, in part, gener-ated by central cross-talk and independent from afferent feedback.It is pertinent to mention that pathologies relating to central res-piratory arrhythmias may well have cardiovascular abnormalitieswhich may, in part, precipitate the respiratory disorder as well asvice versa. Below are two examples describing the plasticity ofcentral respiratory–sympathetic coupling and how this relates tocommon pathologies.

The point was made above (Fig. 5) that late-E abdominal motoractivity (active or forced expiration) is recruited under conditionsof high respiratory drive such as hypercapnia. However, recentdata indicate that abdominal expiratory activity can be expressedin normocapnia in rats after treatment with chronic intermittenthypoxia (CIH, Fig. 6; Zoccal et al., 2008). Following 10 days of CIH,rats exhibited late-E abdominal activity that persisted beyond thetreatment paradigm. The animals exhibited a significant increase inmean arterial pressure of more than 10 mmHg, which characterizeshypertension. Interestingly, the respiratory modulation of sympa-thetic nerve activity in CIH treated rats (but not controls) includedan additional late-E related burst (Zoccal et al., 2008), whichcould provide an explanation for the increased arterial pressure.Thus, abdominal late-E activity is highly plastic, recruited followingrepeated peripheral chemoreceptor stimulation (by CIH) and mayprovide clues to the sympathoexcitability and hypertension foundin patients with repeated sleep apnoeas (obstructive or central).

A second example of plasticity within central respiratory–cardiovascular circuits is the observation that the normalinspiratory–post-inspiratory modulation of sympathetic activity isaugmented in the spontaneously hypertensive (SH) rat (Simms etal., 2009), an established model of human hypertension. Moreover,

ypercapnia evoked Late-E abdominal nerve activity. The RTN/vlPF was inactivatedresulted in a depression of post-inspiratory motor output on both AbN and central” shape. RTN/vlPF suppression also abolished late-E AbN bursts during hypercapniaN/vlPF inactivation. Late-E activity recovered after isoguvacine washed out (∼1 h;

Page 248: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

24 A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Physiology

Fig. 6. Chronic intermittent hypoxia causes long-term plasticity in respiratorymodulation of sympathetic activity. Cardiovascular and respiratory control sys-tems can only work efficiently when coupled. In control conditions, rats showinspiratory/post-inspiratory modulation of thoracic sympathetic nerve activity(tSNA) relative to phrenic discharge (PND). This modulation is chronically alteredin juvenile rats exposed to chronic intermittent hypoxia (CIH) for 10 days. In CIHtwla

tammttwtcas

8

3giepnrommwbIaCacpmnm

A

HS

reated rats an additional burst of sympathetic activity emerges, which correlatedith the development of a Late-E burst in the abdominal motor outflow (Abd). The

atter may well contribute to the hypertension generated in the CIH model of sleeppnoea.

his enhanced modulation translated into Traube-Hering waves inrterial pressure that were significantly larger than those in nor-otensive control rats. The functional relevance of this amplifiedodulation in SH rats was demonstrated by reversibly arresting

he respiratory rhythm generator with hypocapnia. On re-startinghe central rhythm generator (by returning to normocapnia), thereas an increase in arterial pressure of ∼20 mmHg, which reflected

hat produced following reinstatement of respiratory–sympatheticoupling. This evidence strengthened the causality argument thatberrant cardiorespiratory coupling can contribute to pathologicaltates.

. Conclusions

As described herein, in addition to generating the eupneic-phase rhythmic pattern of breathing, the respiratory rhythmenerator can, under certain conditions, generate other breath-ng patterns, such as apneusis, gasping and breathing with forcedxpiratory activity. These patterns reflect the dynamics of theonto-medullary circuit and the multiple state-dependent mecha-isms that can be adopted for rhythm generation. These differentespiratory motor patterns have been equated with the notionf hierarchically organized compartments spanning the ponto-edullary respiratory regions each with its distinct neuronalechanisms for operation. The review also alludes to the plasticityithin the respiratory network and how chronic manipulation of

reathing (e.g. with CIH) can cause pathology, such as hypertension.t remains to be elucidated how the fundamental ponto-medullaryrchitecture changes to cause other pathological states such asheyne-Stokes, Kussmaul’s and Biot’s breathing. All said, revealingmechanistic understanding of any breathing pathology relies on aomplete understanding of respiratory and cardiovascular activitiesaralleled with iterative exchanges with multiscale computationalodels. This combined approach has every chance of providing

ovel guidance in the design of new therapeutic treatments of com-on cardiorespiratory diseases.

cknowledgements

The support of the National Institutes of Health (NIH) and Britisheart Foundation is acknowledged. JFRP is the recipient of a Royalociety Wolfson Research Merit Award.

& Neurobiology 168 (2009) 19–25

References

Abbott, S.B., Stornetta, R.L., Fortuna, M.G., Depuy, S.D., West, G.H., Harris, T.E.,Guyenet, P.G., 2009. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats.J. Neurosci. 29, 5806–5819.

Abdala, A.P.L., Rybak, I.A., Smith, J.C., Paton, J.F.R., 2009. Abdominal expiratory activityin the rat brainstem-spinal cord in situ: patterns, origins, and implications forrespiratory rhythm generation. J. Physiol., doi:10.1113/jphysiol.2008.167502.

Anrep, G.V., Pascual, W., Rossler, R., 1936. Respiratory variations of the heart rate.II. The central mechanism of the sinus arrhythmia and the inter-relationshipsbetween central and reflex mechanism. Proc. R. Soc. Lond. 119 (Series B),218–230.

Bianchi, A.L., Gestreau, C., this issue. The respiratory network: an overview of a halfcentury research. Respir. Physiol. Neurobiol.

Büsselberg, D., Bischoff, A.M., Paton, J.F.R., Richter, D.W., 2001. Loss of glycinergicinhibition reveals two modes of respiratory rhythm generation. Pflügers Arch.441, 444–449.

Dick, T.E., Baekey, D.M., Paton, J.F.R., Lindsey, B.G., Morris, K.F., this issue. Cardio-respiratory coupling depends on the pons. Respir. Physiol. Neurobiol.

Dutschmann, M., Herbert, H., 2006. The Kölliker-Fuse nucleus gates the postinspi-ratory phase of the respiratory cycle to control inspiratory off-switch and upperairway resistance in rat. Eur. J. Neurosci. 24, 1071–1084.

Dutschmann, M., Paton, J.F.R., 2002. Glycinergic inhibition is essential for co-ordinating cranial and spinal respiratory motor outputs in the neonatal rat. J.Physiol. 543, 643–653.

Dutschmann, M., Wilson, R.J., Paton, J.F.R., 2000. Respiratory activity in neonatal rats.Auton. Neurosci. 84, 19–29.

Feldman, J.L., Del Negro, C.A., 2006. Looking for inspiration: new perspectives onrespiratory rhythm. Nat. Rev. Neurosci. 7, 232–242.

Fortuna, M.G., West, G.H., Stornetta, R.L., Guyenet, P.G., 2008. Bötzinger expiratory-augmenting neurons and the parafacial respiratory group. J. Neurosci. 28,2506–2515.

Guyenet, P.G., 2008. The 2008 Carl Ludwig Lecture: retrotrapezoid nucleus,CO2 homeostasis, and breathing automaticity. J. Appl. Physiol. 105, 404–416.

Guyenet, P.G., Bayliss, D.A., Stornetta, R.L., Fortuna, M.G., Abbott, S.B., Depuy, S.D.,this issue. Retrotrapezoid nucleus, respiratory chemosensitivity and breathingautomaticity. Respir. Physiol. Neurobiol.

Guyenet, P.G., Stornetta, R.L., Bayliss, D.A., 2008. Retrotrapezoid nucleus and centralchemoreception. J. Physiol. 586, 2043–2048.

Janczewski, W.A., Feldman, J.L., 2006. Distinct rhythm generators for inspiration andexpiration in the juvenile rat. J. Physiol. 570, 407–420.

Janczewski, W.A., Onimaru, H., Homma, I., Feldman, J.L., 2002. Opioid-resistant res-piratory pathway from the preinspiratory neurones to abdominal muscles: invivo and in vitro study in the newborn rat. J. Physiol. 545, 1017–1026.

Mulkey, D.K., Stornetta, R.L., Weston, M.C., Simmons, J.R., Parker, A., Bayliss, D.A.,Guyenet, P.G., 2004. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neu-rons in rats. Nat. Neurosci. 7, 1360–1369.

Nattie, E.E., 2001. Central chemosensitivity, sleep, and wakefulness. Respir. Physiol.129, 257–268.

Onimaru, H., Arata, A., Homma, I., 1987. Localization of respiratory rhythm-generating neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations fromnewborn rats. Neurosci. Lett. 78, 151–155.

Onimaru, H., Arata, A., Homma, I., 1988. Primary respiratory rhythm generator in themedulla of brainstem-spinal cord preparation from newborn rat. Brain Res. 445,314–324.

Onimaru, H., Ikeda, K., Kawakami, K., this issue. Phox2b, RTN/pFRG neurons andrhythmogenesis. Respir. Physiol. Neurobiol.

Onimaru, H., Kumagawa, Y., Homma, I., 2006. Respiration-related rhythmic activityin the rostral medulla of newborn rats. J. Neurophysiol. 96, 55–61.

Paton, J.F.R., 1996a. A working heart-brainstem preparation of the mouse. J. Neurosci.Methods 65, 63–68.

Paton, J.F.R., 1996b. The respiratory network in the ventrolateral medulla of themature mouse studied in a working heart–brainstem preparation. J. Physiol. 493,819–831.

Paton, J.F.R., 1997. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones duringcentral apnoea in mature mice. J. Physiol. 502, 623–639.

Paton, J.F.R., Abdala, A.P.L., Koizumi, H., Smith, J.C., St-John, W.M., 2006. Respiratoryrhythm generation during gasping depends on persistent sodium current. Nat.Neurosci. 9, 311–313.

Paton, J.F.R., Nolan, P.J., 2000. Similarities in reflex control of laryngeal and cardiacvagal motor neurones. Resp. Physiol. 119, 101–111.

Ruangkittisakul, A., Ballanyi, K., this issue. Structure-function analysis of inspiratorypre-Bötzinger complex networks in “calibrated” newborn rat brainstem slices.Respir. Physiol. Neurobiol.

Ruangkittisakul, A. Okada, Y., Oku, Y., Koshiya, N., Ballanyi, K., this issue. Fluorescenceimaging of active respiratory networks. Respir. Physiol. Neurobiol.

Richter, DW, 1982. Generation and maintenance of the respiratory rhythm. J. Exp.Biol. 100, 93–107.

Rybak, I.A., Abdala, A.P., Markin, S.N., Paton, J.F., Smith, J.C., 2007. Spatial organi-zation and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and patterngeneration. Prog. Brain. Res. 165, 201–220.

Schmidt, C., Bellingham, M.C., Richter, D.W., 1995. Adenosinergic modulation of res-piratory neurones and hypoxic responses in the anaesthetized cat. J. Physiol. 483,769–781.

Page 249: Alterações no acoplamento entre as atividades simpática e

iology

S

S

S

S

A.P.L. Abdala et al. / Respiratory Phys

hen, L., Li, Y.M., Duffin, J., 2003. Inhibitory connections among rostral medullaryexpiratory neurones detected with cross-correlation in the decerebrate rat.Pflügers Arch. 446, 365–372.

imms, A.E., Paton, J.F.R., Pickering, A.E., Allen, A.M., 2009. Amplifiedrespiratory–sympathetic coupling in neonatal and juvenile spontaneouslyhypertensive rats: does it contribute to hypertension? J. Physiol. 587, 597–610.

mith, J.C., Ellenberger, H.H., Ballanyi, K., Richter, D.W., Feldman, J.L., 1991. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythmin mammals. Science 254, 726–729.

mith, J.C., Butera, R.J., Koshiya, N., Del Negro, C., Wilson, C.G., Johnson, S.M., 2000.Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybridpacemaker-network model. Respir. Physiol. Neurobiol. 122, 131–147.

& Neurobiology 168 (2009) 19–25 25

Smith, J.C., Abdala, A.A., Koizumi, H., Rybak, I.A., Paton, J.F.R., 2007. Spatial andfunctional architecture of the mammalian brainstem respiratory network: ahierarchy of three oscillatory mechanisms. J. Neurophysiol. 98, 3370–3387.

St-John, W.M., Rybak, I.A., Paton, J.F.R., 2002. Potential switch from eupnea to fictivegasping following blockade of glycine transmission and potassium channels. Am.J. Physiol. 283, R721–R731.

St-John, W.M., Stornetta, R.L., Guyenet, P.G., Paton, J.F.R., 2009. Location and prop-

erties of respiratory neurones with putative intrinsic bursting properties in therat in situ. J. Physiol., doi:10.1113/jphysiol.2009.170308.

Zoccal, D.B., Simms, A.E., Bonagamba, L.H., Braga, V.A., Pickering, A.E., Paton, J.F.R.,Machado, B.H., 2008. Increased sympathetic outflow in juvenile rats submittedto chronic intermittent hypoxia correlates with enhanced expiratory activity. J.Physiol. 586, 3253–3265.


Recommended