Londrina 2009
ANA PAULA ARTIMONTE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES
PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE
Londrina 2009
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES
PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE
Dissertação apresentada à Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite. Orientador: Profª. Drª. Waleska Schwarcz
ANA PAULA ARTIMONTE
Londrina, 18 de Fevereiro de 2009.
Profª. Drª. Waleska Schwarcz Universidade Norte do Paraná
Profª. Drª. Cristiana M. Pedroso Yoshida Universidade UNICAMP
Prof. Dr. Luiz César da Silva Universidade Norte do Paraná
ANA PAULA ARTIMONTE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA BOVINA E SUA APLICAÇÃO EM FILMES
PROTÉICOS A BASE DE SORO DE LEITE
Dissertação apresentada à UNOPAR - Universidade Norte do Paraná, no Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde, como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite, com nota final igual a _______, conferida
pela Banca Examinadora formada pelos professores: Drª. Waleska Schwarcz, Drª.
Cristiana M. Pedroso Yoshida, Dr. Luiz César da Silva.
Primeiramente agradeço a Deus por me guiar
e proteger em todas as etapas da minha vida.
Dedico esse trabalho aos meus queridos pais
Francy Araujo Hollanda e Joelcio Colombo
que em todos os momentos me apoiaram e
investiram em minha educação.
Ao meu namorado Marcelo Resquetti Tarifa,
que de forma especial e carinhosa me deu
força e coragem, me apoiando nos momentos
de dificuldades e compartilhando comigo as
ansiedades na busca da realização
profissional.
AGRADECIMENTOS
Á Profª. Orientadora Drª. Waleska Schwarcz, UNOPAR –
Universidade Norte do Paraná, agradeço pelo constante incentivo, sempre indicando
a direção a ser tomada nos momentos de maior dificuldade. Agradeço
principalmente, pela confiança depositada.
Aos professores Dr. Rafael Braga Gonçalves, Dr. Cláudio Lima
Aguiar, que contribuíram com seus preciosos ensinamentos.
Aos demais professores da Instituição UNOPAR – Universidade
Norte do Paraná, agradeço pelo aprendizado.
Ao Técnico Jorge Donato do Laboratório do Mestrado em Ciência e
Tecnologia do Leite da UNOPAR – Universidade Norte do Paraná pelo auxílio e
colaboração do trabalho.
As queridas estagiárias, Aline Guimarães, Karina Alves Andrioli e
Nathalia Leatti Maturana cuja participação foi fundamental para alcançar os
resultados aqui apresentados.
Aos meus colegas do Mestrado Ciência e Tecnologia do Leite da
UNOPAR – Universidade Norte do Paraná, pelas experiências vividas em sala de
aula que me motivaram para a realização deste trabalho.
Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança toda força de sua alma, todo o universo conspira a seu favor. Johann Wolfgang von Goethe.
ARTIMONTE, Ana Paula. Avaliação da atividade antimicrobiana da lactoferrina bovina e sua aplicação em filmes protéicos à base de soro de leite. 2008. 63. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite) Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2008.
RESUMO
Várias proteínas do soro de leite têm sido estudadas em detalhe recentemente devido ao seu grande potencial como proteínas antimicrobianas e sua possível aplicação em alimentos. Em particular a lactoferrina tem sido estudada, uma glicoproteína ligadora de ferro encontrada em diversas secreções. As embalagens para alimentos têm sido planejadas para proteger o produto, entretanto, as tecnologias envolvendo embalagens ativas visam o planejamento de interações desejáveis com o produto, aumentando ou monitorando sua vida - de - prateleira. O objetivo deste trabalho foi desenvolver filmes protéicos a base de soro de leite acrescidos de lactoferrina, e avaliar a atividade antimicrobiana destes filmes. Para isso, foram selecionadas três culturas de bactérias ATCC: Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus mirabilis. Inicialmente, foi realizado o teste de antibiograma por difusão em discos e ensaios de determinação do MIC da Lf para as bactérias testadas e a concentração mínima inibitória foi de 50 mg/ml. Entretanto a lactoferrina, nesta concentração não foi capaz de inibir totalmente o desenvolvimento dos microrganismos avaliados. Também foi determinado o MBC da Lf que revelou apenas atividade bacteriostática nas culturas testadas. Para o P. mirabilis a concentração de microrganismos obteve uma redução de 1,71 log, para E. coli de 1,74 log e para o S. aureus de 0,7 log. Os resultados obtidos nas curvas de crescimento, com ou sem lactoferrina, confirmaram os dados observados nos ensaios de determinação de MIC e MBC. O P. mirabilis foi o que se mostrou mais sensível ao tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais resistente. Na curva de crescimento com lactoferrina a fase lag para P. mirabilis e para E. coli foi estendida por duas horas e na fase log o crescimento das culturas foi menor sendo que para P. mirabilis a redução foi em média de 77% e para E. coli de 67%. Para o S. aureus não ocorreram alterações significativas no período de tempo na fase lag, entretanto, na fase log o microrganismo teve uma redução de 54% em seu crescimento. Os experimentos de atividade antimicrobiana demonstraram que o filme protéico a base do soro de leite acrescido de lactoferrina apresentou atividade antimicrobiana em todas as culturas avaliadas. O filme protéico sem adição de lactoferrina também foi capaz de inibir parcialmente o crescimento microbiano. Os resultados aqui apresentados confirmam o efeito antimicrobiano da lactoferrina. Desta forma, esta pesquisa demonstra a eficácia da produção de filmes comestíveis a base do soro de leite e sua atividade antimicrobiana testados em amostras de bactérias associadas à toxiinfecção alimentar.
Palavras-chave: Lactoferrina. Soro de Leite. Filmes Protéicos. Antimicrobiano.
ARTIMONTE, Ana Paula. Evaluation of Antimicrobial activity of bovine Lactoferrina end its applications in movies protein the basis of whey. 2008. 63. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite) Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2008.
ABSTRACT
Several milk whey proteins have been studied in detail recently due to its great potential as antimicrobial proteins and their possible application in food. In particular has been studied the lactoferrin, an iron binding glycoprotein found in various biological secretions. The food packing has been designed to protect the product, however, the active packaging has been developed to interact desirably with the product, increasing or checking its shelf life. The aim of this study was to develop whey proteins films containing lactoferrin, and evaluate the antimicrobial activity of these films. For this, were selected three ATCC cultures of bacteria: Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Proteus mirabilis. Initially, was performed the antibiogram obtained by discs diffusion method and tests to determine the MIC of Lf to the bacteria tested and the minimum inhibitory concentration was 50 mg / ml. However, the lactoferrin in this concentration was not able to completely inhibit the development of microorganisms evaluated. It was determined the MBC of Lf which showed only bacteriostatic activity in the tested cultures. For P. mirabilis the concentration of microorganisms obtained a reduction of 1.71 log for E. coli of 1.74 log and the S. aureus by 0.7 log. The results in growth curves, with or without lactoferrin, confirmed the data observed in determination tests of MIC and MBC. The P. mirabilis was more sensitive to treatment with lactoferrin and S.aureus was the most resistant. In the growth curve of lactoferrin with the lag phase for P. mirabilis and E. coli was extended by two hours and the log growth phase of cultures was lower and that for P. mirabilis the reduction was on average 77% and for E. coli at 67%. For S. aureus no significant changes occurred in the period of time in phase lag, however, at the microorganism has a log reduction of 54% in its growth. The experiments showed that antimicrobial activity of the whey protein film containing lactoferrin showed antimicrobial activity in all cultures studied. The film without the addition of lactoferrin protein was also able to partially inhibit the microbial growth. The results confirm the lactoferrin antimicrobial effect. Thus, this research demonstrates the production effectiveness of whey protein films and its antimicrobial activity tested in strains of bacteria associated with foodborne diseases.
Key-words: Lactoferrina, whey, Protein films, Antimicrobials.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 – Funções da lactoferrina 24
Figura 02 – Representação esquemática da estrutura 3D da lactoferrina
bovina 25
Figura 03 – Ilustração do antibiograma 37
Figura 04 – Análise do MIC e do MBC lactoferrina 38
Figura 05 – Fluxograma do preparo do filme protéico comestível 40
Figura 06 – Teste do antibiograma 43
Figura 07 – Filmes protéicos a base de soro de leite 49
Figura 08 – Avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes protéicos
a base de soro do leite 50
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 01 – Principais componentes do leite 20
Gráfico 02 – Atividade antimicrobiana da lactoferrina 44
Gráfico 03 – Ensaio de determinação do MIC 45
Gráfico 04 – Ensaio de determinação do MBC 46
Gráfico 05 – Curvas de crescimento bacteriano na presença e ausência de
Lactoferrina 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Principais características físico-químicas do leite 20
Tabela 02 – Principais componentes do leite 21
Tabela 03 – Porcentagem média das proteínas presentes no leite 22
Tabela 04 – Propriedades das proteínas do soro do leite 23
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
Lf Lactoferrina
BSA Albumina do soro bovino
DBO Demanda biológica de oxigênio
α−La Alfa-lactalbumina
Ig Imunoglobulinas
MIC Concentração mínima inibitória
MBC Concentração mínima bactericida
ATCC “American Type Culture Collection”
blf Lactoferrina bovina
Lf Lactoferrina
apo-Lf
Lactoferrina não ligada a ferro
Kda
Kilo Dalton
pH
Potencial hidrogeniônico
MAPA
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
LB Caldo Luria-Bertani
3D Tri dimensional
UFC Unidades formadoras de colônia
WPC Concentrado de soro protéico
WPI Isolado de soro protéico
PVC Policloreto cloreto de vinila
LPS Lipopolissacarídeos
DTA Doenças transmitidas por alimentos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 OBJETIVOS 17
2.1 OBJETIVO GERAL 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17
3 REFERENCIAL TEÓRICO 18
3.1 LEITE BOVINO 18
3.1.1 Cadeia Agroindustrial do Leite Bovino e a Importância de sua Produção 18
3.1.2 Generalidades do Leite Bovino 18
3.1.3 Composição do Leite Bovino 19
3.1.4 Proteínas Totais do Leite Bovino 21
3.1.4.1 Proteínas 22
3.1.5 Lactoferrina 24
.1.5.1 Atividade antimicrobiana da lactoferrina 26
3.2 EMBALAGENS ATIVAS 27
3.3 FILMES PROTÉICOS 28
3.3.1 Filmes Protéicos de Soro do Leite 30
3.4 TOXI-INFECÇÃO CAUSADA POR BACTÉRIAS 31
3.4.1 Cultura Bacteriana 33
3.4.1.1 Staphylococcus aureus 33
3.4.1.2 Proteus mirabilis 34
3.4.1.3 Escherichia coli 34
4 MATERIAL E MÉTODOS 36
4.1 REAGENTES 36
4.2 CULTURAS BACTERIANAS 36
4.3 CULTIVO BACTERIANO 36
4.4 LACTOFERRINA 36
4.5 ISOLADO DE SORO PROTÉICO 37
4.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA 37
4.7 ANÁLISE DO MIC E DO MBC LACTOFERRINA 38
4.8 CURVA DE CRESCIMENTO PADRÃO 39
4.9 FORMAÇÕES DOS FILMES 39
4.10 AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS FILMES PROTÉICOS NAS CULTURAS
BACTERIANAS 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 42
6 CONCLUSÃO 54
7 REFERÊNCIAS 55
14
1 INTRODUÇÃO
A conscientização crescente dos consumidores sobre a importância
de alimentos nutritivos motivou pesquisadores a concentrar boa parte de seus
esforços no estudo dos efeitos do soro de leite e de suas frações sobre a saúde.
Embora os produtos protéicos do soro possam ser usados apenas em razão de seus
valores nutricionais, suas aplicações como ingredientes funcionais são cada vez
mais importantes, o que motivou pesquisadores a concentrar boa parte de seus
esforços no estudo dos efeitos do soro e de suas frações sobre a saúde
(RICHARDS, 1997).
O soro do leite é obtido por meio da produção de queijos, uma vez
que o soro é um subproduto incontornável na produção de qualquer tipo de queijo.
Apesar de cerca de metade do soro produzido no mundo ser eliminado como
efluente nas terras ou em sistemas hídricos, resultando numa perda importante de
energia alimentar, bem como criando uma grande perda econômica, a outra metade
é processada em vários produtos alimentares ou rações (RODRIGUES & TEIXEIRA,
2007).
Muitos laticínios enfrentam um grande problema com relação ao
soro do leite. O principal problema associado á produção de queijo é o que fazer
com o soro gerado no processo. De modo geral, para a fabricação de 1 kg de queijo,
são necessários 10 L de leite, resultando em 9 kg de soro de leite como sub-produto
(ANTUNES, 2003).
O Brasil é um grande consumidor de queijo, nos últimos anos esse
consumo continua e tem crescido ainda mais. Juntamente com este aumento está
também a necessidade de criar novas alternativas para a utilização do soro. O
tratamento de efluentes é dispendioso e, sendo o soro rico em diversos
componentes utilizados em várias formulações de alimentos. Descartar o soro sem
um tratamento eficiente não é só um crime previsto por lei, mas é também rejeitar
um ingrediente que possui alta qualidade (RICHARDS, 2002; SANTOS &
FERREIRA, 2001).
O soro do leite é rico em diversos nutrientes, porém, é um potente
agente de poluição que pode provocar a destruição da flora e fauna devido a sua
alta demanda biológica de oxigênio (DBO) é a determinação da quantidade de
oxigênio dissolvida na água e utilizada pelos microorganismos na oxidação
15
bioquímica da matéria orgânica, que é cerca de 30.000 a 50.000 mg de oxigênio por
litro de soro, este valor é aproximadamente 100 vezes maior do que o de um esgoto
doméstico. Uma fábrica com produção média de 10.000 l de soro por dia polui o
equivalente a uma população de 5.000 habitantes, isto significa que para cada litro
de soro descartado nos efluentes, cerca de 30g a 50g de oxigênio dissolvido na
água desaparecerão (REDE AMBIENTE, 2007).
A maioria das indústrias de lacticínios não contempla ainda uma fase
de valorização de resíduos, especificamente das proteínas isoladas. Com o
desenvolvimento de tecnologias para a melhoria dos processos de industrialização
do leite, notou-se a possibilidade do aproveitamento industrial do soro no qual tem
despertado atenção de centros de pesquisas, indústrias e governos (RALPH, 1982).
Atualmente em nosso país, as proteínas do soro são empregadas
com grande sucesso na indústria de alimentos, porém com um papel coadjuvante
(SGARBIERI, 2004). Nos EUA, Europa e Pacífico Sul, este soro já é processado e
sua utilização em vários produtos derivados representa uma vantagem econômica
significativa para as indústrias de laticínios, em razão das propriedades nutricionais
e funcionais do soro e de seus componentes (HOMEM, 2003).
Em particular tem sido estudado detalhadamente o papel da
lactoferrina (proteína do soro do leite) devido ao seu grande potencial como proteína
antimicrobiana e para sua possível aplicação em alimentos (JELEN et al., 1998).
Muitas outras funções têm sido atribuídas para a lactoferrina tais como
imunomodulação, crescimento celular, função antitumoral, antioxidante e
antiinflamatório (WARD, URIBE-LUNA & CONNEELEY, 2002). Entretanto, a
concentração destes componentes no soro do leite é relativamente baixa o que
dificulta a pesquisa de suas aplicações funcionais.
Também tem sido estudada a aplicação das proteínas do soro de
leite no desenvolvimento de filmes protéicos comestíveis e biodegradáveis,
substituindo os filmes sintéticos na embalagem de alimentos. Os filmes comestíveis
têm um potencial promissor de crescimento na produção de alimentos, por exercer
diversas funções ainda relativamente pouco exploradas, como por exemplo, como
carreador de antimicrobianos. É importante conhecer e entender cada vez mais as
propriedades funcionais dos filmes em relação não apenas ao alimento, mas
também aos diversos fatores ambientais a que estarão expostos, o que indica a
16
necessidade de novas pesquisas sobre aspectos básicos e aplicações destes
compostos (MAIA et al., 2000).
Analisando a situação econômica e a tendência de ascensão da indústria de
laticínios nacional, tornam-se extremamente necessárias pesquisas que visem à
otimização do uso do soro do leite, uma vez que estes estudos terão um importante
impacto social e econômico.
17
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Esta dissertação teve como objetivo principal avaliar a atividade
antimicrobiana de filmes protéicos a base de soro de leite acrescido de lactoferrina.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Ø Formular filmes protéicos constituídos a base de soro de leite;
Ø Determinar a concentração específica com atividade antimicrobiana da
lactoferrina;
Ø Determinação dos parâmetros para a adição da lactoferrina nos filmes
protéicos a base de soro de leite;
Ø Caracterização da atividade antimicrobiana dos filmes protéicos a base de
soro de leite acrescido de lactoferrina.
18
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 LEITE BOVINO
3.1.1 Cadeia agroindustrial do leite bovino e a importância de sua produção
O Brasil é um dos maiores produtores de leite do mundo, ocupando
o sexto lugar no “rank” mundial. O leite é importante devido ao seu elevado valor
nutritivo. É um alimento essencial a algumas faixas da população, pela geração de
renda de centenas de produtores e ainda pela participação do leite e derivados na
cesta básica e, consequentemente, nos índices que calculam a inflação (GOMES,
1999).
Acredita-se que a cadeia agroindustrial de leite é uma das mais
importantes no cenário brasileiro. Presente em todos os estados da federação, a
pecuária de leite emprega mão-de-obra, gera excedentes comercializáveis e garante
renda para boa parte da população brasileira. Há poucas décadas, o processo de
transformação do leite em produtos lácteos não levava em consideração os
impactos ambientais e sociais associados, permitindo constantemente o surgimento
de problemas que, cada vez mais, tornam-se críticos para o bem estar da
sociedade, como a devastação de solos produtivos, a poluição das águas e do ar
(SANCHES, 1997).
A indústria nacional de leite se deparou com uma concorrência que
exigia medidas imediatas em termos de competitividade como, custos, qualidade
dos produtos e estratégias mercadológicas, além da implantação de alta tecnologia,
escala de produção e uma rede de distribuição eficiente (ALVES, 2005).
3.1.2 Generalidades do leite bovino
Muitas situações relatadas na história dizem que a necessidade de
sobrevivência fez com que o homem identificasse ainda na antiguidade, a
importância do leite como importante fonte nutricional (LEITE, VAITSMAN & DUTRA,
2006).
O leite nada mais é que uma secreção fluida das fêmeas de todas as
19
espécies de mamíferos. Cerca de 4 mil espécies de mamíferos o produzem, tendo
como função importante a de suprir as necessidades nutricionais essenciais para os
neonatos, o leite também exerce uma série de funções fisiológicas por meio de suas
proteínas e peptídios, por exemplo, fornecendo imunoglobulinas, enzimas, inibidores
enzimáticos, ligando-se ou transportando proteínas, fatores de crescimento e
agentes antimicrobianos (ANTUNES, 2003). O leite possui uma cor levemente
amarelada, onde a fase contínua é formada de água e substâncias hidrossolúveis, e
a fase descontínua é formada principalmente por micelas de caseína e glóbulos de
gordura (SGARBIERI, 2005). Possui odor suave e gosto levemente adocicado. O
leite é um produto muito sensível e que pode absorver odores do meio em que se
encontra. Quando exposto a temperatura elevada, o mesmo pode adquirir gosto
estranho e desagradável, o que deve ser evitado (BEHMER, 1984; ANTUNES,
2003).
Um item muito importante a considerar sobre o leite, como primeiro e
único alimento dos recém-nascidos, é que a primeira secreção das glândulas
mamárias, após o parto, tem composição muito diferente do leite e recebe o nome
de colostro. O colostro é um líquido amarelado, mais viscoso que o leite e a sua
composição varia muito nas primeiras 72h após o parto. O colostro é mucoso, de
consistência heterogênea, odor peculiar e sabor rançoso (HENG, 1999; BEHMER,
1984).
É extremamente importante o fornecimento do colostro aos bezerros
nas primeiras horas de vida e é reconhecido por vários autores por ser a única fonte
de anticorpos para proteção dos recém-nascidos dessa espécie (BRAMBELL, 1958;
RAJALA & CASTRÉN, 1995; MORIN et al., 1997).
O colostro é muito rico em proteínas (19,2%) sendo 2,65% de
caseínas e 16,56% de imunoglobulinas, sendo que as imunoglobulinas são
anticorpos transmitidos passivamente ao recém-nascido (SGARBIERI, 1996).
3.1.3 Composição do leite bovino
O leite, pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
(MAPA) do Brasil relata que é o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta,
em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas.
Como as necessidades nutricionais e fisiológicas de cada espécie de
20
mamífero são muito peculiares a cada uma delas, a composição do leite apresenta
marcante diversidade interespécies (ANTUNES, 2003).
A Tabela 1 apresenta as principais características físico-químicas do
leite.
Tabela 01: Características físico-químicas do leite. Cor branca pH 6,6 – 6,9 Densidade 1,023 – 1,040 g/mL Viscosidade 1,631 mPa.s (a 20°C) Atividade de água 0,993 Fonte: Adaptado de GONZÁLEZ, 2001.
O leite é uma fonte excelente da maioria dos sais minerais
necessários para o desenvolvimento dos indivíduos (EMBRAPA, 2008).
O leite é uma emulsão líquida em que a fase contínua é formada de
água e substâncias hidrossolúveis ao passo que a fase interna ou descontínua é
formada, principalmente, de micelas de caseína e de glóbulos de gordura. O leite de
vaca é composto de água, 87%, e sólidos totais 12 a 13%, assim distribuídos:
proteínas totais, gordura, lactose, além de minerais e vitaminas (SGARBIERI, 2005).
A gráfico 1 apresenta a porcentagem dos principais componentes do
leite.
Figura 1 – Principais componentes do leite. Fonte: Adaptado de FLEISCHMAN, (1924, p.19).
Gráfico 1- Principais Componentes do Leite
Fonte: Adaptado de DELAVAL, 2006.
Água
Gordura
Lactose
Caseina
Proteína do soro
NPN
Vitaminas e enzimas
Sais
Minerais
21
Tabela 2 – Principais componentes do leite
COMPONENTES PRINCIPAIS COMPOSIÇÃO MÉDIA
Água 87,0% Sólidos Totais 13,0% Gordura 3,9% Proteínas 3,4% Lactose 4,8% Minerais 0,8% Fonte: Adaptado de ANTUNES, 2003.
O leite, a água é o componente em maior quantidade, são
encontrados dissolvidos, suspensos ou emulsionados os demais componentes
(carboidratos, lipídios, sais minerais, vitaminas e proteínas) (PEREIRA et al., 2001).
3.1.4 Proteínas totais do leite bovino
As proteínas totais do leite podem ser consideradas de alta
qualidade nutricional e com excepcionais propriedades funcionais (ANTUNES,
2003).
Segundo Santos & Fonseca (2004), as proteínas totais do leite
podem ser classificadas em dois grandes grupos: as caseínas e as proteínas do
soro. A caseína pode ser definida como a fração da proteína do leite que sofre
precipitação em pH 4,6 enquanto que o restante das proteínas que não sofreram
esta precipitação é chamado coletivamente de proteínas do soro. Na composição
das proteínas totais do leite 20% são de proteínas do soro e 80% de caseínas.
As caseínas são classificadas em quatro subgrupos: caseínas α, β, κ
e γ, sendo que as caseínas α formam uma família de proteínas aparecem com
características diferentes (αs0 a αs5). Dentro de cada grupo de caseínas ainda
variantes genéticas (SGARBIERI, 1996).
A caseína é sintetizada nas células epiteliais da glândula mamária,
constituindo de 4 principais variantes genéticas: αs1, αs2, β e κ-caseína. Este grupo
de proteínas compõe aproximadamente 80% do total de proteínas do leite, o que
determina uma concentração média de 24-28 mg/ml, respectivamente.
Adicionalmente, a estas classes principais, a proteólise da β-caseína produz γ-
caseína (1-2 mg/ml) e outros peptídeos menores. De forma similar, a proteólise das
α-caseínas apresenta como subprodutos a gama-caseína (SANTOS & FONSECA,
2004).
22
As caseínas compreendem uma grande família de fosfoproteínas,
sendo encontradas no leite em concentrações que variam de 2,5 a 3,5%. Em termos
de composição, a caseína é caracterizada por apresentar quantidades relativamente
altas de fósforo (0,85%) e do aminoácido prolina (ANTUNES, 2003).
A Tabela 3 indica a distribuição das caseínas e proteínas do soro
presentes no leite bovino.
Tabela 3 – Porcentagem média das proteínas presentes no leite bovino.
Componentes % Total Caseína Soro
Caseínas 80
caseína α-s1 36 45
caseína α-s2 9 11
β-caseína 21 26
κ-caseína 12 15
γ-caseína 4 5
Proteínas do Soro 20
β-lactoglobulina 10 50
α-lactalbumina 4 20
Imunoglobulinas 2 10
Albumina sérica bovina (BSA) 1 5
Lactoferrina 1-2
Lisozima 0,5
Fonte: Adaptado de ANTUNES (2003).
3.1.4.1 Proteínas do soro
O soro do leite é oriundo da fabricação de queijos, a partir da
separação da caseína durante a fabricação do mesmo (FARREL et al., 2004). O
soro é composto por: glicomacropeptídeo, imunoglobulinas, albumina, lactoferrina,
lactoperoxidase, lisozima, lactolina, relaxina, lactofano, fatores de crescimento IGF-1
e IGF-2, proteoses-peptonas e aminoácidos livres (HARAGUCHI et al., 2006).
A Tabela 4 abaixo mostra os componentes presentes no soro do
leite, suas porcentagens e suas funções.
23
Tabela 4 - Propriedades das proteínas do soro do leite.
COMPONENTE DO SORO DO LEITE % NO SORO FUNÇÕES β-Lactoglobulina 50-55% Fonte de aminoácidos essências de cadeia ramificada (leucina,isoleucina e valina) α-Lactalbumina 20-25% Fonte de aminoácidos essências de cadeia ramificada Imunoglogulinas 10-15% Imunomoduladoras Lactoferrina 1-2% Antioxidante, antibacteriana, antiviral, antifúngica Lactoperoxidase 0.5% Antibacteriana BSA 5-10% Fonte de aminoácidos essências Glicomacropeptídeos 10-15% Fonte de aminoácidos essenciais de cadeia ramificada Fonte: Adaptado de MARSHALL, 2004.
As proteínas presentes no soro do leite apresentam excelente
composição em aminoácidos, alta digestibilidade e biodisponibilidade de
aminoácidos essenciais, portanto elevado valor nutritivo (SGARBIERI, 1996; ZINSLY
et al., 2001). Elas também apresentam excepcionais propriedades funcionais de
solubilidade, formação e estabilidade de espuma, emulsibilidade, geleificação,
formação de filmes e cápsulas protetoras (MODLER, 2000).
Aplicações do soro do leite têm crescido muito nos últimos 10 anos,
quanto ao aperfeiçoamento da filtração por membrana, a troca iônica, bem como o
estudo do soro de leite e seus componentes. Os derivados de soro dos Estados
Unidos são ingredientes multifuncionais utilizados em iogurtes e em milhares de
outras categorias de produtos. Recentemente pesquisas das funcionalidades das
proteínas soro têm demonstrado os benefícios do uso dos produtos de soro de leite
em iogurtes e culturas de produtos lácteos. O concentrado protéico contribui para o
sabor (flavour), textura e a diminuição de sinérese, derivados do soro podem manter
as culturas de bactérias probióticas. Recentemente, pesquisadores têm focado as
propriedades nutracêuticas das frações do soro como a lactoferrina, lactoperoxidase
e peptídeos, alguns dos benefícios terapêuticos das culturas de iogurte estão ligados
as proteínas do leite como (redução da incidência de câncer, realce das
24
propriedades imunológicas, fortificação dos ossos e diminuição do colesterol
sanguineo) (U.S Dairy Export Council, 1997).
3.1.5 Lactoferrina
Lactoferrina (Lf) é uma proteína verdadeiramente multifuncional que
tem sido muito estudada durante as últimas décadas. É conhecida por sua
capacidade de vincular-se a ferro, que finalmente levou à descoberta de sua
atividade antibacteriana. Além disso, a lactoferrina demonstrou ter atividade antiviral,
antifúngica e antiparasitária (DAIRY, COUNCIL & DIGEST, 2004; NABET & LINDEN,
2001; JENSSEN & HANCOCK, 2008).
A lactoferrina pertencente à família da transferrina, sendo
encontrada em diversas secreções como o leite, a lágrima, a saliva, e pode ser
encontrada predominantemente nos produtos de excreção das glândulas exócrinas
dos aparelhos digestivo, respiratório e reprodutivo. Recentemente muitas outras
funções foram atribuídas a Lf, tais como imunomodulação, regulação do crescimento
celular, função antitumoral, atividade antioxidante e antiinflamatório (WARD,
URIBELUNA, CONNEELEY, 2002; RODRIGUES & TEIXEIRA, 2007). A Figura – 1
ilustra algumas das funções atribuídas á lactoferrina.
Figura 1 – Funções da Lactoferrina
Fonte: Adaptado de BROCK, 2002.
25
A lactoferrina é uma importante proteína presente no soro de leite,
tendo sido isolada do componente-3 dos peptídios derivados da caseína (fragmentos
de β-caseína). É uma proteína com peso molecular da ordem de 76 kDa.
Polimeriza-se rapidamente na presença de íons Ca++ e parece ter ação
antimicrobiana, protegendo superfícies secretórias (SGARBIERI, 2004). Tem
similaridade com a lactoferrina encontrada na corrente sanguínea, onde funciona
como transportadora de ferro. Especula-se que seu papel no leite também envolva a
ligação de ferro, fazendo-o de modo tão eficiente que torna o ferro inacessível para o
crescimento de bactérias (incluindo algumas patogênicas) e fungos dados à
facilidade que apresenta de ligar-se a esse metal. Outras atividades da lactoferrina
também têm sido mencionadas na literatura: transporte de ferro, atividade contra
vírus, ligação de toxinas, promoção do crescimento de certas células animais,
ligação de plaquetas, efeitos imunomoduladores, cicatrização de feridas, ação
antiinflamatória e também que a lactoferrina humana e bovina são efetivas contra
vírus do herpes simples do tipo 1(ANTUNES, 2003).
A Figura - 2 mostra a representação esquemática da estrutura
tridimensional da lactoferrina bovina.
Figura 2: Representação esquemática da estrutura 3D da lactoferrina bovina.
O lobo N e o lobo C são conectados pela α-hélice mostrada em laranja. Em vermelho estão
destacados os aminoácidos que formam o sítio de ligação para ferro. Essa estrutura foi desenhada
para este trabalho utilizando-se o software MolMol (KORADI et al., 1996) a partir de dados
cristalográficos depositados no “Protein Data Bank” sob o nº 1BLF (MOORE et al., 1997).
26
3.1.5.1 Atividade antimicrobiana da lactoferrina
Proteínas e peptídeos antimicrobianos são sintetizados por uma
grande de variedade de organismos com o objetivo de atuarem como a primeira
linha de defesa contra infecções e são encontrados em diversos fluídos corporais.
Das mais abundantes podemos citar a lisozima e lactoferrina (JENSSEN &
HANCOCK, 2008).
Desde sua descoberta e caracterização, a lactoferrina tem sido
sujeita a numerosos estudos devido a sua estrutura, biosíntese, distribuição do
tecido, metabolismo e propriedades biológicas (BAKER & BAKER, 2008; VORLAND,
1999; LEVAY & VILJOEN, 1995).
A Lactoferrina possui várias funções biológicas já descritas, é
necessário um melhor entendimento sobre sua dinâmica estrutural, a fim de que seja
possível correlacioná-la com cada uma de suas funções (BAKER & BAKER, 2008).
Uma das primeiras atividades antimicrobianas descobertas da
lactoferrina foi sua habilidade em seqüestrar ferro do meio tornando-o indisponível
para as bactérias (BULLEN, ROGERS & LEIGH, 1972; ARNOLD, COLE &
MCGHEE, 1977). Durante muito tempo, acreditou-se que esse era o único
mecanismo de ação antimicrobiana da Lf. Muitos estudos demonstram que a apo-Lf
possui atividade antimicrobiana e que essa atividade era reduzida quando a Lf era
saturada por ferro (ARNOLD, BREWER & GAUTHIER, 1980; YAMAUCHI et al.,
1993). Alguns estudos e experimentos de cristalografia por difração de raios-x da Lf
mostraram que a proteína possui regiões catiônicas em sua superfície o que facilita
sua interação com o lipídeo A, que é um componente dos lipopolissacarídeos (LPS)
da membrana de bactérias Gram-negativas. Essa interação ocasiona dano à parede
celular bacteriana, modificando sua permeabilidade, levando a liberação da porção
LPS e o conseqüente colapso da bactéria (APPELMELK et al., 1994; ELISSON et
al., 1988). Devido esses danos causados pela Lf na membrana da bactéria, a Lf é
capaz de aumentar o efeito de drogas comerciais como a rifampicina (ELISSON et
al., 1988).
Outros estudos combinam a Lf a terapias padrão contra infecções
bacterianas a fim de diminuir o tempo de recuperação e minimizar os efeitos
colaterais do tratamento pela diminuição da dosagem dos antibióticos (DE BORTOLI
et al., 2007). Interessante notar que a importância do ferro para o crescimento
27
bacteriano, combinado com a capacidade de elementos do hospedeiro em
sequestrar esse ferro, levaram algumas cepas bacterianas a desenvolverem
estratégias de anular esse efeito. Sob condições de privação de ferro, algumas
bactérias Gram-negativas desenvolveram um mecanismo de obter ferro a partir da Lf
saturada por esse íon. Esse mecanismo envolve a interação da Lf com receptores
localizados na superfície bacteriana (LEWIS et al., 1998).
A lactoferrina conhecida pela sua ação inibitória na proliferação
celular, bem como pelas suas atividades antiinflamatórias e antioxidante, tem sido
também reportada como um agente anti-cancerígeno (BAVEYE et al., 1999; WARD,
2002).
A capacidade bactericida da Lf é atribuída pela interação direta da
molécula ou parte dela com as superfícies bacterianas. Esta interação pode ser
observada tanto em bactérias Gram positivas como em Gram negativas. Estudos
com bactérias Gram positivas m7ostram que tanto a Lf humana com a bovina, são
capazes de unirem-se as superfícies bacterianas, graças a sua carga positiva
(TOMITA et al., 1994; TOMITA et al., 2002; FRANCO et al., 2005).
3.2 EMBALAGENS ATIVAS
As indústrias de alimentos têm sofrido constantes mudanças para se
adaptar às crescentes exigências dos consumidores. A demanda por produtos
minimamente processados, sensorialmente similares aos alimentos in natura, tem
imposto novos requerimentos às embalagens, que devem assegurar uma vida – de -
prateleira adequada aos produtos (AZEREDO et al., 2000).
As embalagens têm sido selecionadas no sentido de ter mínima
interação com o alimento que acondicionam, constituindo assim barreiras inertes.
Entretanto, nas últimas décadas, diversos sistemas de embalagem têm sido
desenvolvidos com o objetivo de interagir de forma desejável com o alimento – são
as embalagens ativas, geralmente planejadas para corrigir deficiências das
embalagens passivas (ROONEY, 1995).
As embalagens ativas para alimentos vêm sendo muito estudadas,
conhecido como embalagem ativa, combinando áreas da tecnologia de alimentos,
biotecnologia, embalagem e ciência dos materiais. Estes sistemas consistem na
incorporação de aditivos tais como, agentes antimicrobianos, antioxidantes,
28
antiumectantes, microrganismos antagonistas, bactericidas, antibióticos, enzimas e
outros, na embalagem ao invés de serem adicionados diretamente nos alimentos
(REIS, 2005).
Embalagem ativa é aquela que exerce algum outro papel na
preservação de alimentos além de promover uma barreira inerte a influências
externas (ROONEY, 1995; GONTARD, 1997).
A embalagem tem como função aumentar a segurança do alimento
de acordo com os seguintes mecanismos: barreiras a contaminações
(microbiológicas e químicas) e prevenção de migração de seus próprios
componentes para o alimento. Já os sistemas de embalagem ativa devem acumular
funções adicionais, entre as quais podem ser destacadas: (a) absorção de
compostos que favorecem a deterioração, (b) liberação de compostos que
aumentam a vida – de - prateleira, e (c) monitoramento da vida – de – prateleira
(HOTCHKISS, 1995).
3.3 FILMES PROTÉICOS
Nos últimos anos, recobrimentos e filmes comestíveis têm recebido
interesse na indústria de alimentos devido às vantagens que os diferenciam das
embalagens não-comestíveis. A biodegradabilidade inerente ao filme é uma de suas
vantagens. Em adição a sua compatibilidade com o meio ambiente, maior segurança
alimentar pode ser alcançada pela incorporação de agentes ativos no filme
(GUILBERT et al., 1996; KESTER & FENNEMA, 1986; BOTREL, 2007). O caráter
comestível, sua biodegradabilidade e o aumento da segurança alimentar são os três
principais benefícios dos filmes comestíveis ativamente funcionais. Devido aos seus
aspectos ambientais, eles apresentam-se como alternativas para sistemas de
embalagens, sem os custos ambientais dos materiais sintéticos não degradantes.
Futuramente, poderão substituir total ou parcialmente algumas embalagens
sintéticas. (KESTER & FENNEMA, 1986).
Embora o uso de filmes e recobrimentos comestíveis para preservar
a qualidade dos alimentos não seja um conceito moderno, pesquisas neste campo
têm se intensificado recentemente, tanto em laboratórios acadêmicos e
governamentais, como na indústria privada. Os fatores que contribuem pelo
renovado interesse no desenvolvimento de recobrimentos comestíveis incluem
29
demanda do consumidor por alimentos de alta qualidade, preocupações ambientais
em relação ao acúmulo de embalagens não biodegradáveis e oportunidades para
criar alternativas de mercado para produção de filmes de fontes renováveis (GARG,
1990; ROLLER, 1999; BOTREL, 2007).
Os filmes comestíveis e revestimentos recentes não são senão o
aperfeiçoamento de técnicas aplicadas desde longa data. O revestimento de laranjas
e limões frescos com cera para retardar a desidratação foi praticado na China nos
séculos XII e XIII (HARDENBURG, 1967). O processo de envolver alimentos em
gordura com o intuito de reduzir a perda de umidade foi usado na Inglaterra no
século XVI (LABUZA & CONTRERAS-MEDELLIN, 1981).
Os filmes comestíveis são películas de variadas espessuras
constituídas por diferentes substâncias naturais e/ou sintéticas que se polimerizam e
isolam o alimento, sem riscos à saúde do consumidor, uma vez que não são
metabolizados pelo organismo e sua passagem pelo trato gastrointestinal se faz de
maneira inócua (MAIA et al., 2000).
Segundo Krochta & De Mulderjohnston (1997), filme comestível é
definido como fina camada de material comestível, formado diretamente como
revestimento, ou como revestimento pré-formado e colocado sobre o alimento ou
entre seus componentes.
Kester & Fennema, (1986), propuseram a utilização de filmes de
gelatina na preservação de carnes e outros gêneros alimentícios. Na década de 50,
emulsões de cera de carnaúba foram desenvolvidas para o revestimento de frutas e
vegetais frescos (KAPLAN, 1986). Mesmo assim, foram nessas últimas décadas que
se ampliaram às pesquisas e a produção de filmes de revestimento para uso na
indústria de alimentos, visando melhoria da qualidade e extensão da vida de
prateleira de vários tipos de produtos.
Coberturas com polímeros, como carboidratos, lipídios e proteínas,
têm sido utilizadas para modificar as atmosferas internas de frutas e vegetais
(CISNEROS-ZEVALLOS & KROCHTA, 2003). A função a ser desempenhada pelo
filme depende do produto alimentício e principalmente do tipo de deterioração a que
este produto está submetido (KESTER & FENNEMA, 1986).
Kester & Fennema, (1986); Krochta & De Mulderjohnston, (1997);
Nelson & Fennema, (1991) relatam que as principais funções dos filmes comestíveis
são: inibir a migração de umidade, oxigênio, dióxido de carbono, aromas, lipídios e
30
outros solutos; carrear aditivos alimentares e agentes antimicrobianos; melhorar a
integridade mecânica e as características de manuseio de alimentos.
Para a formação dos filmes comestíveis se faz necessário à adição
de um biopolímero, para promover a matriz estrutural, e de um plastificante de baixo
peso molecular, para aumentar a flexibilidade do filme (SHAW et al., 2002).
Plastificante é uma substância não-volátil que, quando adicionada a um material
altera suas propriedades mecânicas e/ou físicas. O sorbitol e o glicerol são
plastificantes por suas habilidades em reduzir as pontes de hidrogênio, enquanto
aumentam os espaços intermoleculares, e em diminuir as interações entre as
cadeias de polímeros, aumentado à flexibilidade e diminuindo as propriedades de
barreiras dos filmes (BANKER, 1996).
As proteínas do soro de leite possuem numerosas propriedades
funcionais importantes para a formação de filmes comestíveis tais como solubilidade
em água, gelatinização e atuar como emulsificantes. Os filmes protéicos de soro de
leite são transparentes, flexíveis e não apresentam odor nem sabor. Os filmes
protéicos podem também atuar como agentes antimicrobianos, antioxidantes entre
outros. Estes biopolímeros podem exercer diversas funções ainda relativamente
pouco exploradas, como carreador de aditivos (conservantes, flavorizantes, etc.) e
agentes antimicrobianos, barreiras a óleos e gorduras, minimização de danos
durante o transporte e comercialização, otimização dos efeitos de outros métodos de
conservação (como na refrigeração de frutas), e ainda, redução de gastos com
embalagens externas (MCHUGH & KROCHTA, 1994).
3.3.1 Filmes Protéicos de Soro do Leite
Os filmes possuem as características necessárias a filmes
comestíveis que são o controle de transferência de massas (gases, aromas,
umidade e solutos) e podem também atuar como veículo de ingredientes no
alimento tais como agentes antimicrobianos, antioxidantes entre outros. A formação
de filmes protéicos a base de soro de leite apresenta vantagens em relação às
embalagens sintéticas pela redução de resíduos e da poluição ambiental. O
potencial promissor de crescimento em diversos outros segmentos da produção de
alimentos depende do aperfeiçoamento e adaptação da estrutura físico-química e
dos métodos de aplicação dos revestimentos às características composicionais dos
31
alimentos (MAIA et al., 2000).
O transporte de gases como o oxigênio e o dióxido de carbono, tal
como a transmissão de umidade pode influenciar a estabilidade do armazenamento
de alguns alimentos, já que o oxigênio é um meio de deterioração de alimentos pela
oxidação de lipídios, vitaminas, pigmentos e componentes de “flavor”. Desta forma, o
emprego de filmes de proteínas do soro com propriedades de barreira ao oxigênio
em alimentos, visa estender a vida de prateleira e reduzir o custo da embalagem
(KESTER & FENNEMA, 1986).
Neste sentido, é importante conhecer cada vez mais as
propriedades funcionais dos filmes em relação não apenas aos alimentos, mas
também aos diversos fatores ambientais a que estão expostos. Analisando a
situação econômica e a tendência de ascensão da indústria de laticínios nacional,
tornam-se extremamente necessárias pesquisas que visem à otimização do uso do
soro do leite, uma vez que estes estudos terão um importante impacto social e
econômico (MAIA et al., 2000).
3.4 TOXI-INFECÇÃO ALIMENTARES CAUSADA POR BACTÉRIAS
Muitas das doenças transmitidas por alimentos (DTA) são
conhecidas desde épocas muito remotas. No ano 2000 AC. foi determinado algumas
leis sobre os alimentos que se podiam comer e os que se deveria rejeitar, e também
os métodos de preparação e a importância da higienização das mãos antes de
consumir os alimentos (SECRETARIA DA VIGILANCIA SANITÁRIA, 2005).
Antigamente, relacionavam-se os alimentos contaminados com o seu estado de
putrefação. Hoje, sabe-se que os alimentos contaminados com microrganismos
patogênicos podem ter aspecto, odor e sabor normais. DTA é um termo genérico,
aplicado a uma síndrome, geralmente, constituída de anorexia, náuseas, vômitos
e/ou diarréia. As DTA são atribuídas à ingestão de alimentos ou água contaminados
por bactérias, vírus, parasitas, toxinas, agrotóxicos, produtos químicos e metais
pesados. Além dos sintomas digestivos, podem ocorrer afecções extra-intestinais
em diferentes órgãos e sistemas, como: meninges; rins; fígado; sistema nervoso
central; terminações nervosas periféricas; e outros, de acordo com o agente
etiológico envolvido. O quadro clínico das DTA depende, portanto, do agente
etiológico envolvido e varia desde leve desconforto intestinal até quadros
32
extremamente sérios, com desidratação grave, diarréia sanguinolenta, insuficiência
renal aguda (síndrome hemolítica urêmica) e insuficiência respiratória (botulismo). A
alergia, por hipersensibilidade individual, a certos alimentos não é considerada uma
DTA. Existem vários mecanismos patogênicos envolvidos com a determinação das
DTA, que podem se manifestar por meio de:
Ø Infecções transmitidas por alimentos: são doenças que resultam da ingestão
de alimentos que contêm microorganismos patogênicos vivos. Exemplos:
salmoneloses, hepatite viral tipo A e toxoplasmose.
Ø Intoxicações causadas por alimentos: ocorrem quando as toxinas das
bactérias ou fungos estão presentes no alimento ingerido. Essas toxinas, na
maioria das vezes, não possuem cheiro ou sabor e são capazes de causar
doenças depois que o microrganismo é eliminado. Algumas toxinas podem
estar presentes, de maneira natural, no alimento, como no caso de alguns
fungos ou peixes. Exemplos: botulismo e toxina do Staphylococcus aureus.
Ø Toxinfecção causada por alimentos: é uma doença que resulta da ingestão de
alimentos com certa quantidade de microrganismos causadores de doenças,
os quais são capazes de produzir ou liberar toxinas após serem ingeridos.
Exemplos: cólera, síndrome hemolítica urêmica. (SECRETARIA DA
VIGILANCIA SANITÁRIA, 2005).
Segundo Franco & Landgraf (1996), as bactérias são
microrganismos amplamente distribuídos na natureza, sendo encontradas em todos
os ambientes. Podem ser responsáveis por doenças no homem, nos animais e nas
plantas ou por deteriorarem os alimentos e materiais diversos. Por outro lado,
podem ser úteis de diversas formas, tais como: compondo o que se denomina
microbiota normal do homem, sendo utilizados na produção de alimentos, como
simbióticos na agricultura e na medicina. Em condições ideais, as bactérias são os
microrganismos com maior velocidade de crescimento (exponencial), sendo o tempo
de geração, em condições ótimas de multiplicação, geralmente, de 15 a 20 minutos.
As bactérias são as responsáveis pela maior incidência de casos de contaminação
em alimentos.
Os contaminantes microbiológicos são as bactérias, os fungos, os
vírus e as parasitas. Alguns microrganismos possuem poucas exigências
alimentares, enquanto outros necessitam de alimentos bem específicos. Para cada
33
micróbio existe determinados pH, temperatura, umidade e oxigenação mínimas,
ótimas e máximas. De modo geral, os alimentos que satisfazem aos seres humanos,
também satisfazem algum tipo de microorganismo. Os alimentos podem ser
contaminados pelos micróbios de diversas maneiras, tornando necessária a criação
de mecanismos de defesa da produção contra sua ação. As bactérias são os
principais microrganismos causadores de toxinfecções. Durante a fase de
crescimento, ele ocorre de forma exponencial. As bactérias estão presentes em uma
gama variada de alimentos e são causadoras de diversas enfermidades. A grande
maioria dos alimentos pode servir como veículo de surtos de toxinfecções
alimentares decorrentes de contaminação bacteriana (PEETERS, 1999).
3.4.1 Culturas Bacterianas
3.4.1.1 Staphylococcus aureus
As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos,
pertencentes á família Micrococcaceae e por dividirem-se em planos diferentes,
quando vistos ao microscópio aparecem na forma de cacho de uva. São facultativas
anaeróbias, com maior crescimento sob condições aeróbias, quando, então,
produzem catalase. A espécie S. aureus é a que está associada mais
frequentemente ás doenças estafilocócicas, quer sejam de origem alimentar ou não.
As cepas de S. aureus são sensíveis a uma série de bacteriófagos, o que auxilia no
estudo de surtos de intoxicação, levando muitas vezes á fonte de infecção. Os
estafilococos são bactérias mesófilas apresentando temperatura de crescimento na
faixa de 7°C á 47°C; as enterotoxinas são produzidas entre 10°C e 46°C, com ótimo
entre 40°C e 45°C. Os extremos de temperatura estão na dependência dos demais
parâmetros que devem encontra-se em condições ótimas. Os surtos de intoxicação
alimentar são provocados por alimentos que permaneceram neste intervalo de
temperatura por tempo variável, de acordo com o nível de inóculo e temperatura de
incubação. Em geral, quanto mais baixa for à temperatura, maior será o tempo
necessário para a produção de enterotoxinas. Em relação ao pH, S. aureus cresce
na faixa de 4 á 9,8, com o ótimo entre 6 e 7. A S. aureus causa intoxicação
34
provocada pela ingestão do alimento que apresenta a toxina pré-formada. Portanto,
o agente causal não é a bactéria per se, mas várias toxinas (A, B, C1, C2, C3, D, E)
produzidas por esta bactéria, conhecidas como enterotoxinas. Os sintomas variam
com o grau de suscetibilidade do indivíduo, concentração da enterotoxina no
alimento e a quantidade consumida do alimento (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
3.4.1.2 Proteus mirabilis
São bastonetes entéricos Gram-negativos, são aeróbios e
frequentemente apresentam pleomorfismo, daí seu nome. Apresentam crescimento
que se espalha muito, formando camadas sobre as placas de ágar úmido. São
bactérias entéricas típicas e estão presentes no trato intestinal de humanos e
animais. Podem ser isolados de uma grande variedade de produtos vegetais e de
carnes, sobretudo daquelas que sofreram deterioração em temperaturas mesofílicas
(JAY, 2005).
São bacilos móveis, com flagelos peritríquios, e são patógenos em
potencial, embora seu envolvimento com doenças de origem alimentar seja ainda
discutível. No entanto, possuem um papel importante na deterioração de alimentos e
estão relacionados à infecções do trato urinário, feridas e diarréia (FRANCO &
LANDGRAF, 1996).
3.4.1.3 Escherichia coli
A Escherichia coli é um dos microrganismos mais prolíficos no trato
intestinal humano e pertence ao grupo dos coliformes fecais, assim o principal meio
de contaminação de alimentos é por fezes. É uma espécie predominante entre os
diversos microrganismos anaeróbicos facultativos que fazem parte da flora intestinal
de animais de sangue quente. Esse microrganismo pertence á família
Enterobacteriaceae e entre suas principais características destacam-se: bacilos
Gram-negativos, não-esporulados, capazes de fermentar glicose com produção de
ácido e gás. A maioria fermenta também a lactose, com produção de ácido e gás,
embora alguns sejam anaeróbicos. (FRANCO & LANDGRAF, 1996; TORTORA
2000).
A E. coli normalmente é inócua, entretanto algumas cepas podem
35
ser patogênicas. Todas as cepas patogênicas possuem fímbrias especializadas que
permitem que elas se liguem a certas células do epitélio intestinal. Além disso, elas
produzem toxinas que causam distúrbio gastrointestinais denominados de
gastroenterite por E.coli. (TORTORA, 2000).
Existem vários grupos patogênicos distintos de E. coli, e estes
grupos são responsáveis por 50 a 65% das diarréias dos viajantes, e boa parte da
diarréia de lactantes em países em desenvolvimento. Segundo Trabulsi (2004), as
Escherichia coli podem causar infecções intestinais, urinárias, septicemicas,
meningites e outros tipos de infecções. Provavelmente nenhuma bactéria seja tão
diversificada em sua patogenicidade como a Escherichia coli. Em relação ás
infecções intestinais pelo menos á seis categorias: Escherichia coli enteroinvasora
(EIEC), enterotoxigênica (ETEC), enteropatogênica (EPEC), entero-hemorrágica
(EHEC), enteroagregativa (EAggEC) e que adere difusamente (DAEC).
O significado da presença de E. coli em um alimento deve ser
avaliado sob dois ângulos. Inicialmente, E. coli, por ser uma enterobactéria, uma vez
detectada no alimento, indica que esse alimento tem uma contaminação microbiana
de origem fecal e, portanto está em condições higiênicas insatisfatórias (FRANCO &
LANDGRAF, 1996).
36
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 REAGENTES
Todos os reagentes utilizados neste trabalho são de grau analítico. A
água destilada. Todos os meios e materiais foram esterilizados em autoclave vertical
(PHOENIX), EUA.
4.2 CULTURAS BACTERIANAS
Foram utilizadas culturas puras ATCC de microrganismos
associados à “intoxicação alimentar”:
ØØØØ Staphylococcus aureus ATCC 25923;
ØØØØ Proteus mirabilis ATCC 25933;
ØØØØ Escherichia coli ATCC 25922.
4.3 CULTIVO BACTERIANO
As culturas de bactérias foram crescidas em meio líquido LB
“overnight” a 37 °C (FANEM), EUA, e posteriormente isoladas e em meio sólido ágar
Muller Hinton incubados overnight a 37 °C. As culturas estoques foram distribuídas
em placas em meio ágar nutriente “overnight” a 37°C e posteriormente armazenadas
a 4 °C.
4.4 LACTOFERRINA
A lactoferrina utilizada neste estudo foi adquirida da (SIGMA-
ALDRICH), EUA. As soluções de lactoferrina utilizadas nos experimentos de
atividade antimicrobiana foram diluídas em água deionizada.
37
4.5 ISOLADO DE SORO PROTÉICO
O isolado de soro protéico (WPI) utilizado foi adquirido da Davisco,
WPI BIPRO 95%, EUA.
4.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA LACTOFERRINA
Para a análise da atividade antimicrobiana foi realizado por meio do
método de difusão em disco. As culturas bacterianas foram inoculadas em meio LB
“overnight” a 37 °C (FANEM), EUA, em mesa agitadora. Terminado o período de
incubação, 0,1 mL do inoculo em meio LB foi disperso em placas contendo meio
Agar Muller Hinton com auxílio de uma alça Drigalski. Discos de papel de filtro
contendo diferentes concentrações de lactoferrina (10, 25, 50 mg/ml) foram
adicionados à placa com auxílio de uma pinça. Como controle negativo foi utilizado
disco com água deionizada e como controle positivo discos com antibióticos
(sulfadoxina- 2mg/mL e trimetoprima- 40 µg/mL).
Antibiograma
Agar Muller Hinton
Figura 03 – Ilustração do antibiograma por discos de difusão
38
4.7 ANÁLISE DO MIC E DO MBC LACTOFERRINA
l MIC - Concentração Mínima Inibitória
l MBC – Concentração Mínima Bactericida
Para o ensaio de MIC, 106 UFC/ml de cada culturas bacterianas
foram inoculadas em meio de LB, com diferentes concentrações de lactoferrina
(SIGMA-ALDRICH), EUA. (10-50 mg/ml) nas amostras;
Como controle positivo foi utilizado antibiótico (sulfadoxina- 2mg/mL
e trimetoprima- 40 µg/mL) diluídos em LB; e como controle negativo, meio LB;
No início do experimento e ao final do período de incubação
alíquotas de meio das culturas foram retiradas e lida a 660 nm, (SINTRA), EUA;
Para o ensaio de MBC as amostras e os controles, positivo e
negativo, foram diluídos em meio LB e as diluições foram distribuídas em placas
contendo ágar Mueller Hinton. Após a incubação a 37°C (FANEM), EUA, por 18
horas, as unidades formadoras de colônia (UFC) foram contadas.
Figura 04 – Ilustração do método do MIC e do MBC Lactoferrina
MBC
MIC
39
4.8 CURVA DE CRESCIMENTO PADRÃO
Para determinação da curva de crescimento padrão as culturas
bacterianas foram plaqueadas em Agar Muller Hinton “overnight” a 37 °C (FANEM),
EUA. Terminado o período de incubação foram inoculadas 5 a 10 colônias de cada
cultura bacteriana em 5 mL de meio LB, e incubadas em uma mesa agitadora a 3 °C
durante 8-10 horas até cada cultura atingisse a fase estacionária de crescimento. A
cada 60 min uma alíquota foi colhida e a absorbância foi lida em espectrofotômetro,
(SINTRA), EUA, a 660 nm. Foi comparada a curva de crescimento de cada cultura
na ausência e na presença de 50 mg/ml de lactoferrina.
4.9 FORMAÇÃO DO FILME PROTÉICO
Para a formação dos filmes protéicos foram preparadas amostras com 7 % de
isolado de soro protéico - WPI (Bipro, Davisco). Como agente plastificante foi
utilizado 5 % de glicerol (MERCK), EUA. As amostras foram aquecidas a 90°C
durante 30 minutos e depois resfriadas até a temperatura de 25ºC
aproximadamente, e depositadas em placas de petri de plástico (poliestireno) por
24-48 horas a temperatura ambiente para a evaporação do solvente. Como agente
antimicrobiano foi utilizado 50 mg/ml de lactoferrina, e esta foi adicionada aos filmes
após o resfriamento das amostras. Depois de prontos os filmes foram armazenados
em dessecador a 75% de umidade relativa. A Figura – 5 mostra as etapas e os
componentes utilizados para a elaboração dos filmes.
40
Figura 5 - Fluxograma do Preparo do Filme Protéico Comestível
Isolado Protéico (WPI)
Água Destilada
Agitação
Plastificante
Água Destilada
Agitação
Banho-maria90ºC/30 min
Resfriamento
Placas
Lactoferrina
41
4.10 AVALIAÇÃO DO EFEITO DOS FILMES PROTÉICOS NAS CULTURAS
BACTERIANAS
As culturas bacterianas foram incubadas em meio LB, a 37°C
“overnight” (FANEM), EUA. Ao final do período de incubação, 0,1 mL do inóculo em
meio LB foi disperso em placas contendo meio ágar Muller Hinton com auxílio de
uma alça Drigalski. Discos do filme protéico de 15 mm contendo diferentes
concentrações de lactoferrina (SIGMA-ALDRICH), EUA, foram adicionados à placa
com auxílio de uma pinça. Como controle foi utilizado discos de PVC. As placas
foram mantidas a 4°C por três horas para permitir a difusão da lactoferrina (SIGMA-
ALDRICH), EUA, no meio e posteriormente foram incubadas em estufa a 37°C
“overnight” (FANEM), EUA.
42
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
A lactoferrina é uma glicoproteína ligadora de ferro encontrada no
leite das mais variadas espécies. Uma de suas funções mais importantes é a de ser
a primeira linha de defesa contra infecções. Além disso, ela possui um importante
papel de inibir o desenvolvimento de microrganismos por remover o ferro, que é um
importante nutriente das bactérias, do microambiente. Entre as proteínas do soro do
leite, optamos inicialmente trabalhar com a lactoferrina, por ser a mais bem descrita
como tendo atividade antimicrobiana.
Inicialmente, foi realizado o teste de antibiograma por difusão em
discos para determinar a concentração da lactoferrina com atividade antimicrobiana
para cada bactéria testada. Os resultados obtidos demonstraram que lactoferrina em
concentrações de 10 e 25 mg/ml (dados não apresentados) não promoveram
inibição no desenvolvimento dos microrganismos testados. Somente na
concentração de 50 mg/ml de Lf a formação de halos de inibição foram observados
(Figura - 6). Entre as bactéras testadas somente o P. mirabilis, se mostrou sensível
a ação da Lf (halo de 20mm). Para as demais bactérias não foi observado halos de
inibição significativos quando comparado com os controles de antibiótico (Gráfico -
2). Entretanto, como já é descrito na bibliografia, para algumas bactérias o efeito
inibitório só é observado quando a bactéria se encontra em fase log de crescimento,
ou seja, os experimentos devem ser conduzidos em meio líquido.
Foram realizados ensaios de determinação da MIC da Lf em meio
líquido e conforme ilustrado no (Gráfico – 3) para as bactérias testadas a
concentração mínima inibitória da Lf foi de 50 mg/ml. Entretanto a lactoferrina, nesta
concentração não foi capaz de inibir totalmente o desenvolvimento dos
microrganismos avaliados.
As bactérias neste trabalho avaliadas não apresentaram o mesmo
perfil de sensibilidade a Lf. Entre as culturas testadas o P. mirabilis foi o que se
mostrou mais sensível ao tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais
resistente. No ensaio de MIC a concentração de P. mirabilis foi reduzida em 84%, da
E. coli de 64,5% e para o S. aureus de 43% (Gráfico – 3).
43
FFiigguurraa 66 --TTeessttee ddee AAnnttiibbiiooggrraammaa
A B
C
Ab
Ab
Ab
LF
LF
LF
H2O
LF
H2O
H2O
LF
LF
44
GGrrááffiiccoo 22 -- AAttiivviiddaaddee AAnnttiimmiiccrroobbiiaannaa ddaa LLaaccttooffeerrrriinnaa
Halo de inibição (mm)
0
10
20
30
40
50Antibiótico P. mirabilis
S.aureus
E. coli
Água
45
(A) Proteus mirabilis
[Lactoferrina] mg/ml
0 10 20 30 40 50 60
Absorbãncia660nm (D.O)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
(B) E. coli
(C) S. aureus
[Lactoferrina] mg/ml
0 10 20 30 40 50 60
Absorbância660nm (D.O)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
GGrrááffiiccoo 33 -- EEnnssaaiioo ddee DDeetteerrmmiinnaaççããoo ddoo MMIICC (A) P. mirabilis, no (B) para E. coli e no (C) para S. aureus.
[ L a c t o f e r r i n a ] m g /m l
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
Absorbância660nm (D.O)
0 , 0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1 , 0
46
Também foi determinada a concentração mínima bactericida (MBC)
da Lf para as culturas estudadas. Conforme mostrado no (Gráfico – 4), a lactoferrina
exerceu apenas atividade bacteriostática nas culturas testadas. Para o P. mirabilis a
concentração de microrganismos obteve uma redução de 1,71 log, para E. coli de
1,74 log e para o S. aureus de 0,7 log.
[Lactoferrina] mg/ml
0 50
Log de UFC/ml
0
2
4
6
8
10
12
14P. mirabilis
E.coli
S.aureus
GGrrááffiiccoo 44 -- EEnnssaaiioo ddee DDeetteerrmmiinnaaççããoo ddoo MMBBCC
Também foram realizadas curvas de crescimento bacteriano na
presença e na ausência de lactoferrina (Gráfico 5). Nestes experimentos é possível
identificar em que etapa da curva de crescimento a LF está exercendo seu efeito
inibitório.
47
(A) Proteus mirabilis
(B) E. coli B
(C) S. aureus
Gráfico 5 – Curvas de Crescimento Bacteriano na Presença e Ausência de Lactoferrina
(A) P. mirabilis, no (B) para E. coli e no (C) para S. aureus.
T e m p o ( h )
0 2 4 6 8
Absorbância660nm (D.O)
0 , 0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1 , 0
1 , 2 C o n t r o l e
L F 5 0
T e m p o ( h )
0 2 4 6 8
Absorbância660nm (D.O)
0 , 0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 , 8
1 , 0
C o n t r o l e
L F 5 0
T e m p o ( h )
0 2 4 6 8
Absorbância660nm (D.O)
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1 ,0C o n t r o l e
L F 5 0
48
Os resultados obtidos nas curvas de crescimento, com ou sem
lactoferrina, confirmaram os dados observados nos ensaios de determinação de MIC
e MBC (Gráficos 2 e 3). O P. mirabilis foi o que se mostrou mais sensível ao
tratamento com lactoferrina e o S.aureus foi o mais resistente. Na curva de
crescimento com lactoferrina a fase lag para P. mirabilis e para E. coli foi estendida
por duas horas e na fase log o crescimento das culturas foi menor sendo que para P.
mirabilis a redução foi em média de 77% e para E. coli de 67%. Para o S. aureus
não ocorreram alterações significativas no período de tempo na fase lag, entretanto,
na fase log o microrganismo teve uma redução de 54% em seu crescimento.
Os resultados obtidos pelos ensaios de MIC e MBC revelaram que a
concentração de lactoferrina de 50 mg/ml seria a ideal para a obtenção dos efeitos
bacteriostáticos nas culturas testadas. Seguindo os objetivos deste trabalho foram
formulados então filmes protéicos a base de soro de leite bovino, que seriam
acrescidos então de 50 mg/ml de lactoferrina.
Nossos resultados confirmaram que as proteínas do soro de leite possuem
numerosas propriedades funcionais importantes para a formação de filmes
comestíveis tais como solubilidade em água, gelatinização e atuação como
emulsificantes.
Os filmes protéicos de soro de leite obtidos em nossos experimentos
são transparentes, flexíveis, de uma espessura fina (em média 0,100 mm), como
mostra a Figura- 12. Eles também não apresentam odor nem sabor acentuado. Os
filmes acrescidos de lactoferrina apresentavam uma coloração levemente
avermelhada (dados não apresentados), mas não apresentou nenhuma outra
alteração visível em suas características quando comparados ao filmes sem adição
de lactoferrina.
49
FFiigguurraa 77 -- FFiillmmeess PPrroottééiiccooss aa BBaassee ddee SSoorroo ddoo LLeeiittee
Tendo definido as concentrações de isolado protéico e de glicerol
para a formulação dos filmes protéicos e as condições para adição de lactoferrina
foram encaminhados os ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana dos filmes
protéicos (Figura - 8).
50
FFiigguurraa 88 -- AAttiivviiddaaddee AAnnttiimmiiccrroobbiiaannaa ddooss FFiillmmeess PPrroottééiiccooss aa BBaassee ddee SSoorroo ddee LLeeiittee
Os experimentos de atividade antimicrobiana dos filmes
demonstraram que o filme protéico a base do soro de leite acrescido de lactoferrina
apresentou atividade antimicrobiana em todas as culturas avaliadas (Figura - 8). Foi
possível observar que não só ocorreu inibição das bactérias no local de adição dos
filmes, como também a formação de halos de inibição. O filme protéico sem adição
de lactoferrina também foi capaz de inibir parcialmente o crescimento microbiano.
Como se sabe além da lactoferrina, entre as proteínas do soro existe outras
proteínas com atividade antimicrobiana, tais como a lisozima e a lactoperoxidase, o
51
que explicaria a atividade antimicrobiana dos filmes sem adição de lactoferrina.
Os resultados aqui apresentados confirmam o efeito antimicrobiano
da lactoferrina, como observado nos isolados testados associados à toxinfecção
alimentar testados. O S. aureus e a E. coli são microrganismos de grande
importância econômica por estarem associados à DTAs,. Quanto ao P. mirabilis
apesar de não haver uma associação clara ainda de sua participação em casos de
toxinfecção alimentar é um importante microrganismos deteriorante de alimentos.
A cultura de Proteus mirabilis foi a que se mostrou mais sensível ao
tratamento com lactoferrina, corroborando os dados da literatura dos efeitos da
lactoferrina em bactérias gram negativas (JENSSEN & HANCOCK, 2008; TOMITA et
al., 2008). Experimentos de cristalografia por difração de raios-x da Lf mostraram
que a proteína possui regiões catiônicas em sua superfície o que facilita sua
interação com o lipídeo A, que é um componente dos lipopolissacarídeos (LPS) da
membrana de bactérias Gram-negativas. Essa interação ocasiona dano à parede
celular bacteriana, modificando sua permeabilidade, levando a liberação da porção
LPS e o conseqüente colapso da bactéria (APPELMELK et al., 1994; ELISSON et
al., 1988).
Poucos trabalhos na literatura demonstram a ação de lactoferrina em
cepas de S. aureus associado á infecção alimentar, a maioria avalia a atuação de
isolados deste microrganismo associados à mastite bovina (HYVONEN et al., 2008 e
LEE et al., 2004). Lee et al., (2004) testou dez isolados de S. aureus e quatro
apresentaram resistência a lactoferrina. Hyvönen et al., (2008), testou 22 isolados de
espécies de Staphylococcus coagulase-negativa e destes somente 3 foram
sensíveis ao tratamento com lactoferrina; 17 espécies apresentaram uma
sensibilidade intermediária e 2 foram resistentes. De uma forma geral a resistência
ou sensibilidade do Staphylococcus a Lf parece ser espécie específica.
Os resultados obtidos neste trabalho sobre atividade bacteriostática
da lactoferrina sobre a E. coli vão de encontro aos observados pela literatura
(BRANEM & DAVIDSON, 2004; AL-NABUSI & HOLLEY, 2007). Al-Nabusi & Holley
(2007), testou 5 cepas de E. coli e destas apenas duas se mostram sensíveis a LF
(redução de 1 log de crescimento comparado ao controle). Branem & Davidson
(2004), não observaram efeito bacteriostático da lactoferrina em nenhum dos dois
isolados de E. coli testados. Nestes trabalhos a atividade antimicrobiana da
52
lactoferrina foi amplificada quando combinadas com outros agentes antimicrobianos
(EDTA, nisina e lisozima).
As propriedades biológicas das proteínas dependem da sua
estrutura tridimensional e esta pode ser influenciada por fatores químicos e físicos
(ligantes, pH, temperatura, pressão, etc.) (PRIVALOV et al., 1986). Sendo a
lactoferrina uma proteína a sua atividade antimicrobiana também pode ser afetada
por diversos fatores físico-químicos. Um desdobramento deste trabalho seria
combinar a lactoferrina a compostos que otimizariam a sua atividade biológica.
Diversos estudos demonstravam que a apo-Lf possuía atividade
antimicrobiana e que essa atividade era reduzida quando a Lf era saturada por ferro
(ARNOLD, BREWER & GAUTHIER, 1980; YAMAUCHI et al., 1993). Desta forma
alguns trabalhos têm combinado o uso de lactoferrina com EDTA e sais de
bicarbonato para potencializar sua ação (BAKER & BAKER, 2008). Outros estudos
combinam a Lf a terapias padrão contra infecções bacterianas a fim de diminuir o
tempo de recuperação e minimizar os efeitos colaterais do tratamento pela
diminuição da dosagem dos antibióticos (DE BORTOLI et al., 2007). E por último a
combinação da Lf com outras substâncias antimicrobianas (BRANEM & DAVIDSON,
2004; AL-NABUSI & HOLLEY, 2007).
Os resultados aqui apresentados mostraram que o filme protéico a
base do soro de leite acrescido com lactoferrina teve atividade antimicrobiana em
todas as cepas avaliadas. Este resultado tem uma grande relevância principalmente
porque o S. aureus e uma das principais bactérias relacionada a surtos de
intoxicação alimentar. Estes resultados divergem de alguns estudos apresentados
na literatura. Min, Harris e Krochta (2005), não conseguiram inibir de forma efetiva
cepas de Salmonella entérica e de E. coli O157:H7 com filmes protéicos a base de
soro de leite acrescidos de lactoferrina. Entretanto neste estudo a concentração
máxima de Lf testada foi de 20 mg/ml; e nos ensaios conduzidos neste trabalho essa
concentração de Lf também não apresentou efeito inibitório. Brown, Wang & Oh
(2008), desenvolveram filmes a base de quitosana acrescidos com lactoferrina, e só
observaram a inibição de E. coli O157:O7 e Listeria monocytogenes quando
combinaram Lf e lisozima. A concentração máxima de lactoferrina utilizada neste
estudo foi de 2 mg/ml, e os autores comentam que a atividade da lactoferrina
utilizada poderia estar sendo afetada pela saturação com ferro. Desta forma, este
53
trabalho apresenta resultados promissores para o desenvolvimento de filmes
protéicos a base de soro de leite acrescido de lactoferrina.
54
6 CONCLUSÃO
A importância deste trabalho inicialmente foi a de explorar o
potencial da lactoferrina como uma alternativa para adição de conservantes
sintéticos nos alimentos Os resultados, ainda que iniciais, confirmam o efeito
antimicrobiano da lactoferrina, como observado nos isolados associados a
toxinfecção alimentar testados. Esse estudo é promissor, pois o desenvolvimento de
conservantes naturais é imprescindível devido ao fato de que aditivos sintéticos
podem fazem mal a saúde causando reações alérgicas dentre outros problemas.
Desta forma, este trabalho confirma a eficácia da produção de filmes
comestíveis a base do soro de leite e sua atividade antimicrobiana testados em
cepas de bactérias associadas à infecção alimentar. A lactoferrina adicionada ao
filme protéico inibiu completamente o crescimento das bactérias Proteus mirabilis, E.
coli, S. aureus testadas.
Estes filmes protéicos seriam uma opção de baixo custo e
biodegradável ao uso de embalagens e aditivos sintéticos, para a melhor
conservação dos alimentos. Estes biopolímeros podem exercer diversas funções
ainda relativamente pouco exploradas, como carreador de aditivos (conservantes,
flavorizantes, etc.) e agentes antimicrobianos, barreiras a óleos e gorduras,
minimização de danos durante o transporte e comercialização, otimização dos
efeitos de outros métodos de conservação (como na refrigeração de frutas), e ainda,
redução de gastos com embalagens externas.
55
REFERÊNCIAS
AL-NABULSI, A.A.; HOLLEY, R.A. Effects on Escherichia coli O157:H7 and meat starter cultures of bovine lactoferrin in broth and microencapsulated lactoferrin in dry sausage batters. Int J Food Microbiol. 1;113(1):84-91, jan, 2007.
ALVES, R. L. D. Projeto da rede de captação logística do soro de queijo produzido no estado de minas gerais. Viçosa – MG, 2005.
ANTUNES, A. J. Funcionalidade de proteínas do soro de leite bovino. Barueri - SP: Manole, 2003.
APPELMELK, B. J.; AN, Y. K.; GEERTS, M.; THIJS, B. G.; DE BOER, H. A.; MACLAREN, D. M.; DE GRAAFF, J.; NUIJENS, J. H. Lactoferrin is a lipid Abinding protein. Infect.Immun., v. 62, p. 2628-2632, 1994.
ARNOLD, R. R.; COLE, M. F.; MCGHEE, J. R. A bactericidal effect for human lactoferrin. Science, v. 197, p. 263-265, 1977.
ARNOLD, R. R.; BREWER, M.; GAUTHIER, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: sensitivity of a variety of microorganisms. Infect. Immun., v. 28, p. 893-898, 1980.
ARNOLD, R. R.; RUSSELL, J. E.; CHAMPION, W. J.; GAUTHIR, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: influence of physical conditions and metabolic state of the target microorganism. Infect. Immun., 32, p. 655-660, 1981.
AZEREDO H. M. C.; FARIA, J. A. F.; AZEREDO, A. M. C. Embalagens Ativas para Alimentos. Ciênc. Tecnol. Aliment. v.20, no.3, Campinas. Sept. /Dec, 2000.
BAKER, E. N.; BAKER, H. M. A structural framework for understanding the multifunctional character of lactoferrin, 2008. doi:10.1016/j.biochi.05.006, 2008.
BAKER, E. N, BAKER, H. M. Molecular Structure, binding properties and dynamics of lactoferrin. Cell Mol Life Sci; 62: 2531-2539, 2005.
BANKER, G.S. Films coating theory and practice. Journal of Pharmaceutical Sciences, v.55, p.81-89, 1996.
BAVEYE, S.; ELASS, E.; MAZURIER, J.; SPIK, G.; LEGRAND, D. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 37:281– 6, 1999.
BEHMER, M. L. Tecnologia do Leite (Leite, Queijo, Manteiga, Caseína, Iogurte, Sorvetes e Instalações). 15 ed. São Paulo: Nobel, 1984.
56
BOTREL, D. A.; SOARES, N. F. F.; GERALDINE, R. M.; PEREIRA, R. M.; FONTES, E. A. F. Qualidade de alho (Allium sativum) minimamente processado envolvido com revestimento comestível antimicrobiano. Ciênc. Tecnol. Aliment. Vol.27, no.1. Campinas. Jan./Mar, 2007.
BRAMBELL, F. W. R. The passive immunity of the young mammal. Biological Reviews, v.33, n.4, p.488-531, 1958.
BRANEN, J.K.; DAVIDSON, P.M. Enhancement of nisin, lysozyme, and monolaurin antimicrobial activities by ethylenediaminetetraacetic acid and lactoferrin. Int J Food Microbiol. 1;90(1):63-74. jan, 2004.
BROWN, C. A.; WANG, B.; OH, J. H. J. Antimicrobial activity of lactoferrin against foodborne pathogenic bacteria incorporated into edible chitosan film. Food Prot. 71(2):319-24, feb. 2008.
BROCK, J. H. The physiology of lactoferrin. Biochem. Cell Biol. v. 80, p. 1-6, 2002.
BULLEN, J. J.; ROGERS, H. J.; LEIGH, L. Iron-binding proteins in milk and resistance to Escherichia coli infection in infants. Br. Med. J., p. 69-75, 1972.
CISNEROS-ZEVALLOS, L.; KROCHTA, J.M. Whey protein coatings for fresh fruits and relative humidity effects. Journal of Food Science, v.68, p.176-181, 2003.
DAIRY COUNCIL DIGEST. Emerging health benefits of whey. 2003 Nov/Dec. [cited 2004 Sept 25]; 74(6). Available from: www.nationaldairycouncil.org.
DE BORTOLI, N.; LEONARDI, G.; CIANCIA, E.; MERLO, A.; BELLINI, M.; COSTA, F.; MUMOLO, M. G.; RICCHIUTI, A.; CRISTIANI, F.; SANTI, S.; ROSSI, M.; MARCHI, S. Helicobacter pylori eradication: a randomized prospective study of triple therapy versus triple therapy plus lactoferrin and probiotics. Am. J. Gastroenterol., v. 102, p. 951-956, 2007.
DELAVAL. Informações técnicas - leite http://www.delaval.com.br/Dairy_Knowledge/EfficientCooling/Leite.htm, 12 de junho de 2006 acessado em 03/02/2009.
DE WIT, J. N. Nutritional and functional characteristics if whey proteins in foods products. J Dairy Sci. 81(3):597-608, 1998.
ELLISON, R. T.; GIEHL, T. J.; LAFORCE, F. M. Damage of the outer membrane of enteric Gram-negative bacteria by lactoferrin and transferring. Infect. Immun., v. 56, p. 2774-2781, 1988.
57
EMBRAPA. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Composição do leite. 2008. Disponível em: <http://www.agenia.cnptia.embrapa.br/agenia8/ag01/arvore/ag01_128_21720039243 html>. Acesso em: 20 set. 2008.
FLEISCHMANN, W. Mecanismos y aplicaciones clínicas potenciales. Tratado de Lecheria. Barcelona, Gili. 1924.
FARRELL, H. M.; JIMENEZ-FLORES, R.; BLECK, G. T.; BROWN, E. M.; BUTLER, J. E.; CREAMER, L. K.; HICKS, C. L.; HOLLAR, C. M.; NG-KWAI-HANG, K. F.; SWAISGOOD, H. E. Nomenclature of the proteins of cows’ milk—Sixth Revision J. Dairy Sci., v. 87, p. 1641-1674, 2004.
FRANCO, G. M. B.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, cap. 4, p. 33 – 81, 1996.
FRANCO, D. A. R.; MORENA, L. V.; MONTFORT, G. R. C. Actividad antimicrobiana de la lactoferrina. Vol. 47, Nos. 3-4, 2005.
GARG, N.; CHUREY, J. J.; SPLITTSTOESSER, D. F. Effect of processing conditions on the microflora of fresh-cut vegetables. Journal of Food Protection, v. 53, n. 8, p. 701-703, 1990.
GOMES, S. T. Diagnóstico e Perspectivas da Produção de Leite no Brasil. Viçosa, 1999.
GONTARD, N. Active packaging. In: SOBRAL, P.J.A.; CHUZEL, G., eds. Workshop sobre biopolímeros. Pirassununga, FZEA. p. 23-27, 1997.
GONZÁLES, F. H. D. Composição Bioquímica do leite e hormônios da lactação. In: GONZÁLEZ, F.H.D.; DÜRR, J.W.; FONTANELI, R.S. (ed.) Uso do leite para monitorar a nutrição e o metabolismo de vacas leiteiras. Porto Alegre: UFRGS, p. 5- 22, 2001.
GUILBERT, S.; GONTARD, N.; GORRIS G. M. Prolongation of the Self-life of Perishable Food Products using Biodegradable Films and Coatings. Lebensmittel Wissenschoft und Technologie, v. 29, n. 1-2, p.10-17, 1996.
HARAGUCHI, F.K.; ABREU W.C.; DE PAULA, H. Proteínas do soro do leite: composição, propriedades nutricionais, aplicações no esporte e benefícios para a saúde humana. Rev. Nutr., v. 19, n. 4, p. 479-488, 2006.
HARDENBURG, R. E. Wax and related coatings for horticultural products: a bibliography. Washington DC : Agricultural Research Service Bulletin, United States Departament of Agriculture, p. 1551, 1967.
58
HENG, G. B. Chemical composition of bovine colostrum. Food for Health in the Pacific Rim. Trumball (Conn): Food and Nutrition Press. p.405, 1999.
HOMEM, G. R. Avaliação técnico-econômica e análise locacional de unidade processadora de soro de queijo em Minas Gerais. Viçosa: UFV, 2003.
HOTCHKISS, J. H. Safety considerations in active packaging. In: ROONEY, M.L. Active food packaging. Glasgow: Chapman & Hall. p. 238-255, 1995.
HYVÖNEN, P.; KÄYHKÖ, S.; TAPONEN, S.; WRIGHT, A. V.; PYÖRÄLÄ, S. Effect of bovine lactoferrin on the internalization of coagulase-negative staphylococci into bovine mammary epithelial cells under in-vitro conditions. Journal of Dairy Research, Jan 5:1-8, 2009.
JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. v. 6ed. São Paulo: Artmed, 711p. 2008.
JELEN, P.; LUTZ, S. Functional dairy. In: MAZZA, G. Functional foods, biochemical & processing aspects. LANCASTER: Techno. Publishing Co., Inc. p. 355-378, 1998.
JENSSEN, H. HANCOCK, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. ScienceDirect. 2008.
KAPLAN, H. J. Washing, waxing and coloradding. In: FRESH citrus fruits. Westport : W.F. Wardowski, 1986. p. 379.
KESTER, J. J.; FENNEMA, O. R. Edible film of lipids and coatings: a review. Food Technology, v. 10, n. 12, p. 47-59, Dec, 1986.
KROCHTA, J. M.; DE MULDERJOHNSTON, C. Edible and biodegradable polymer films: challenges and opportunities. Food Technology, v. 51, n. 2, p. 6074, Feb, 1997.
LABUZA, T. P., CONTRERASMEDELLIN, R. Prediction of moisture protection requirements for foods. Cereal Foods World, v. 26, p. 335, 1981.
LEE, N. Y,; KAWAI, K.; NAKAMURA, I.; TANAKA, T.; KUMURA, H.; SHIMAZAKI, K. J. Susceptibilities against bovine lactoferrin with microorganisms isolated from mastitic milk. Vet Med Sci. Oct; 66(10):1267-9, 2004.
LEITE, Z. T. C.; VAITSMAN, D. S.; DUTRA, P. B. Leite e alguns de seus derivados – da Antiguidade á Atualidade. Rio de Janeiro: UFRJ. v.29, 2006.
LEVAY, P. F.; VILJOEN, M. Lactoferrin: A general review. Haematological. 80: 252-267, 1995.
59
LEWIS, L. A.; ROHDE, K.; GIPSON, M.; BEHRENS, B.; GRAY, E.; TOTH, S. I.; ROE, B. A; DYER, D. W. Identification and molecular analysis of lbpBA, which encodes the two-component meningococcal lactoferrin receptor. Infect. Immun., v. 66, p. 3017-3023, 1998.
MAIA, H. L.; PORTE, A.; SOUZA, F. V. Filmes comestíveis: aspectos gerais, propriedades de barreira à umidade e oxigênio. B. CEPPA. Curitiba – PR. v. 18, n. 1, p. 105-128, jan./jun., 2000.
MARSHALL, K. Therapeutic applications of whey protein. Alternative Medicine Review. v. 9, p. 136-156, 2004.
MIN, S.; HARRIS, L. J.; KROCHTA, J. M. Antimicrobial Effects of Lactoferrin, Lysozyme, and the Lactoperoxidase System and Edible Whey Protein Films Incorporating the Lactoperoxidase System Against Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7- v. 70, p.332- 338, 2005.
MODLER, H. W. Milk processing. In: NAKAI, S.; MODLER, W. (Eds.). Food proteins: processing applications. Wiley-VCH, Inc. p.1-21, 2000.
MOORE, S. A.; ANDERSON, B. F.; GROOM, C. R.; HARIDAS, M.; BAKER, E. N. Three-dimensional structure of diferric bovine lactoferrin. Å resolution.. J. Mol. Biol., v. 274, p. 202-236, 1997.
MORIN, D. E.; McCOY, G. C.; HURLEY, W. L. Effects of quality, quantity, and timing of colostrum feeding and addition of a dried colostrum supplement on immunogloblin G1 absorption in Holstein bull calves. Journal of Dairy Science , v.80, n.4, p.747-753, 1997.
MCHUGH, T. H e KROCHTA, J. M. Milk-protein-based edible films and coatings. Food Technology, v.48: p. 97-103, 1994.
NABET, P.; LINDEN, G. Constituants bioactifs in lait, nutrition et santé. Paris: Tec. & Doc. p. 169-87, 2001.
NELSON, K. L.; FENNEMA, O. R. Methylcellulose films to prevent lipid migration in confectionery products. Journal of Food Science, v. 56, n. 2, p. 504509, Mar.-Apr, 1991.
PEETERS, S. E. Segurança Alimentar: Um desafio para a Engenharia de Produção. Programa de Engenharia de Produção/COPPE/UFRJ. Rio de Janeiro – RJ, 1999.
PEREIRA, D. B. C.; SILVA, P. H. F.; JÚNIOR, L. C. G. C.; LEAL, L. Físico-química do leite e derivados: métodos analíticos. 2. ed. Juiz de Fora: EPAMIG. P, 234, 2001.
60
PRIVALOV, P. L.; GRIKO, Y. U. V.; VENYAMINOV, S. Y. U.; KUTYSHENKO, V. P. Cold denaturation of myoglobin. J Mol Biol., v. 190, p. 487-98, 1986.
RAJALA, P.; CASTRÉN, H. Serum immunoglobulin concentrations and health of dairy calves in two management systems from birth to 12 weeks of age. Journal of Dairy Science , v.78, n.12, p.2737-2744, 1995.
RALPH, W. Profits in whey. Rural Research. N. 116, p. 22 – 27, 1982.
REDE AMBIENTE Educação Ambiental. Disponível em: < http://www.redeambiente. org.br/dicionario.asp?letra=D&id_word=236>. Acesso em: 17 jan, 2007.
REIS, A. B. Caracterização de filmes e coberturas de quitosana aplicados em papelão ondulado. Campinas- SP, 2005.
RICHARDS, N. S. P. S. Perspectivas Industriais e Proteção ao Meio Ambiente. Food Ingredients, 2002.
RICHARDS, N. S. P. S. Emprego racional do soro lático. Ver. Indústria de Laticínios. v. 2, n. 9, p. 67-69, 1997.
RODRIGUES, L.; TEIXEIRA, A. J. O potencial da lactoferrina na prevenção do cancro de mama, 2007.
ROLLER, S.; COVILL, N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice. International Journal of Food Microbiology, v. 47, n. 1-2, p. 67-77, 1999.
ROONEY, M. Reactive packaging materials for food preservation. In: Proceedings of the First Japan-Australia Workshop on Food Processing. p. 78-82, 1992.
ROONEY, M.L. Overview of active food packaging. In: ROONEY, M.L. Active food packaging. Glasgow: Chapman & Hall. b. p. 1-37, 1995.
SANCHES, C. S. Mecanismos de interiorização dos custos ambientais na Indústria: Rumo a mudanças de comportamento. In: Revista de administração de empresas. São Paulo. v. 37, n.2, abr./jun.p. 56-67, 1997.
SANTOS, J. P. V.; FERREIRA, C. L. L. F. Alternativas para o aproveitamento de soro de queijo nos pequenos e médios laticínios. Ver. do Instituto de Laticínios Cândido Tostes. v. 56, n. 321, p. 44 – 50, 2001.
SANTOS, M. V.; FONSECA, L. F. L. Monitoramento da Qualidade do Leite - Módulo 2 - Qualidade microbiológica do leite: métodos de análise e estratégias
61
de controle. Extensão; Docente; 01; Agripoint Ltda; Agripoint Ltda; Piracicaba - SP; BRASIL; Hipertexto. abr, 2004.
SGARBIERI, V. C. Proteínas em alimentos protéicos: propriedades, degradações, modificações. São Paulo: Editora-Livraria Varela. 517 p., p.139-157, 1996.
SGARBIERI, V. C. Propriedades Estruturais e Físico-Químicas das Proteínas do Leite. Braz. J. Food Technol. v.8, n.1, p. 43-56, Jan./Mar, 2005.
SGARBIERI, V. C. Propriedades fisiológicas-funcionais das proteínas do soro de leite. Revista de Nutrição, Campinas, v. 17, p. 397-409, out./ dez, 2004.
SHAW,N.B.; MONAHAN, F.J.; O’RIORDAN, E.D.; O’SULLIVAN, M. Physical properties of WPI films plasticized with glycerol, xylitol, or sorbitol. Journal of Food Science, v.67, p.164-167, 2002.
TOMITA, M., M. TAKASE, W. BELLAMY, & S. SHIMAMURA. A review: the active peptide of lactoferrin. Acta Paediatr. Jpn. 36:585–591. 1994.
TOMITA, M.; WAKABAYASHI, H.; SHIN, K.; YAMAUCHI, K.; YAESHIMA, T.; IWATSUKI, K. Twenty-five years of research on bovine lactoferrin applications. Biochimie. 91(1):52-7. jan, 2009.
TOMITA, M.,; WAKABAYASHI,H.; YAMAUCHI, K.; TERAGUCHI, S.; HAYASAWA, H. Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk production and applications. Biochem. Cell Biol. 80:109-112. 2002.
TORTORA, G. J.; FUNNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. Porto Alegre- RS, Ed. Artes Médicas, 827p., 2000.
VORLAND, L. H. Lactoferrin: A multifunctional glycoprotein. APMIS. 107: 971-981, 1999.
WARD, P. P.; URIBE-LUNA, S.; CONNEELEY; O. M. Lactoferrin in host defense. Biochem. Cell. Biol., v. 80, p. 95-102, 2002.
YAMAUCHI, K.; TOMITA, M.; GIEHL, T. J.; ELLISON, R. T. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin derived lactoferrin peptide fragment. Infect. Immun., v. 61, p. 719-728, 1993.
ZALL, R. R. Trends in whey fractionation and utilization, a global perspective. J. Dairy Sci., v.67, n.11, p.2621-2629, 1984.
ZINSLY, P. F.; SGARBIERI, V. C.; DIAS, N. F. G. P.; JACOBUCCI, H. B.; PACHECO, M. T. B.; BALDINI, V. L. S. Produção piloto de concentrados de
62
proteínas de leite bovino: composição e valor nutritivo. Braz. J. Food Technol. Campinas. 4:1-8, 2001.