II
Dissertação de Investigação
Artigo de investigação no âmbito das ciências básicas
“Estudo das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão
dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR
em adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas
pleomórficos da glândula salivar – sua relação com o
prognóstico”
Autor:
Ana Cristina Pedrosa Beleza Carvalho
Aluna do 5ºano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária
Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto
Orientador:
Professora Doutora Catarina Alexandra Pires Eloy
Professora Auxiliar Convidada
Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto
Porto, 2014
III
Lista de abreviaturas
Akt – Proteína cinase B
AP – Adenoma pleomórfico
CAP – Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGFR – Epidermal growth factor receptor
HE – Hematoxilina-eosina
HER2 - Human Epidermal growth factor Receptor 2
HMGA2 - High-mobility group AT-hook 2
PI3K - Phosphatidylinositol 3-kinase
PLAG1 – Pleomorphic adenoma gene 1
mTOR – Mammalian target of rapamycin
IV
Índice
Resumo ............................................................................................................................. 1
Abstract ............................................................................................................................. 2
Introdução ......................................................................................................................... 3
Objetivos ........................................................................................................................... 7
Materiais e métodos .......................................................................................................... 8
Resultados ....................................................................................................................... 11
Discussão ........................................................................................................................ 19
Conclusões ...................................................................................................................... 24
Referências bibliográficas .............................................................................................. 25
Agradecimentos .............................................................................................................. 28
Anexos ............................................................................................................................ 29
1
Resumo
Introdução: O adenoma pleomórfico é a neoplasia mais frequente das glândulas
salivares, tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação maligna.
O carcinoma ex-adenoma pleomórfico resulta da transformação maligna do adenoma
pleomórfico. A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR é uma via intracelular na
qual têm sido descritas alterações na expressão dos seus elementos associadas ao
desenvolvimento de vários tipos de neoplasias.
Objetivos: Estudar, numa série de adenomas pleomórficos e carcinomas ex-adenomas
pleomórficos, a relação das caraterísticas clínico-patológicas e da expressão dos
elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR com o comportamento destes
tumores.
Materiais e Métodos: Numa série de 16 tumores de glândulas salivares (11 adenomas
pleomórfico e 5 carcinomas ex-adenomas pleomórficos) os dados clínicos foram
colhidos das fichas clínicas e os dados histopatológicos foram obtidos através do estudo
das lâminas dos tumores primários ao microscópio ótico. Foi avaliada a expressão
imuno-histoquímica dos elementos da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR nos
tumores primários e nas recidivas tumorais.
Resultados: Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do
adenoma pleomórfico em pacientes do sexo feminino e em tumores com tamanho
inferior a 2 cm. Em todos os casos de adenoma pleomórfico que não recidivaram o
componente predominante era o estroma. A presença de cistos e de inflamação no tumor
são caraterísticas de benignidade nestes tumores. Verificou-se a existência de uma
associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores
primários e a ocorrência de transformação maligna. A expressão de HER2 nos
adenomas pleomórfico primários foi significativamente menos que nos recidivantes.
Conclusões: As caraterísticas clínico-patológicas permanecem como bons indicadores
do prognóstico do adenoma pleomórfico. A expressão de mTOR e HER2 em adenomas
pleomórfico está associada a comportamento biológico diferencial nestas neoplasias.
Palavras–chave: adenoma pleomórfico, carcinoma ex-adenoma pleomórfico, glândula
salivar, EGFR, HER2, Akt, mTOR, imuno-histoquímica.
2
Abstract Introduction: Pleomorphic adenoma is the most common salivary gland tumor, it has a
tendency to recur and it can undergo malignant transformation. Carcinoma ex-
pleomorphic adenoma is a malignant neoplasm that arises from pleomorphic adenoma.
The EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway is an intracellular pathway in which have been
described changes in the expression of its elements that have been associated with the
development of several types of cancer.
Objectives: To study, in a series of pleomorphic adenomas and carcinomas ex-
pleomorphic adenomas, the relationship between clinico-pathological characteristcs and
immunohistochemical expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway with tumor’s
behavior.
Materials and Methods: In a series of 16 salivary gland tumors (11 pleomorphic
adenomas and 5 carcinomas ex-pleomorphic adenomas) the clinical data were obtained
from patients’ medical records and the histopathological data were obtained through the
analysis of primary tumor’s section in the optic microscope. The immunohistochemical
expression of EGFR/HER2-Akt-mTOR pathway was evaluated in primary and recurrent
tumors.
Results: Recurrent pleomorphic adenoma occured more often in female patients and
when the primary tumor had a size smaller than 2 cm. All of the pleomorphic adenomas
that did not recur had stroma as the major component. Presence of cysts and
inflammation in tumor are benign characteristics. mTOR expression in primary tumors
was significantly associated with malignant transformation. HER2 expression was
significantly less intense in primary pleomorphic adenomas than in recurrent ones.
Conclusions: The clinico-pathological characteristics remain good indicators of
prognosis of pleomorphic adenoma. mTOR and HER2 expression in pleomorphic
adenoma is associated with differential biologic behavior in these tumors.
Keywords: pleomorphic adenoma, carcinoma ex-pleomorphic adenoma, salivar gland,
EGFR, HER2, Akt, mTOR, immunohistochemistry.
3
Introdução
As glândulas salivares são órgãos exócrinos responsáveis pela produção e
secreção de saliva, que são classificadas em glândulas major (parótida, submandibular e
sublingual) e minor (intra-orais e extra-orais) [1]. A incidência global anual de
neoplasias das glândulas salivares varia, geograficamente, entre 0,4 e 13,5 casos por
100000 indivíduos [2]. A maioria destas neoplasias é benigna (cerca de 54% a 79%) [1,
3].
O adenoma pleomórfico
(AP) é a neoplasia mais
frequente das glândulas salivares
e representa cerca de 80% das
neoplasias benignas e 60% de
todas as neoplasias destas
glândulas [3-6]. Os AP ocorrem
com mais frequência na glândula
parótida, durante a terceira e
quarta década de vida, e mais
vezes em mulheres do que em
homens [1, 5, 6].
Morfologicamente, o AP caracteriza-se pela presença de três componentes:
epitelial, mioepitelial e estromal (Figura 1) [6]. A variabilidade de proporções e
expressão destes três componentes contribui para o vasto espetro de caraterísticas
histológicas que o AP pode apresentar [6].
O AP tem tendência para recidivar e apresenta potencial de transformação
maligna em 6,2% dos casos [7-9]. O risco de recidiva local do adenoma pleomórfico
após a primeira cirurgia está associado com a presença de variáveis clínico-patológicas
que incluem: idade inferior a 30 anos aquando do diagnóstico, presença de neoplasia
extra-capsular sob a forma de nódulos satélites, variante rica em estroma e excisão
cirúrgica incompleta [1, 5, 6, 10].
A entidade que resulta da transformação maligna do AP (recidiva ou primário)
designa-se por carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CAP) e pode ocorrer sob a forma
de vários tipos histológicos [11, 12]. O risco de transformação maligna do AP aumenta
Figura 1 – Adenoma pleomórfico: aspeto morfológico dos
componentes epitelial, mioepitelial e estromal (HE, 400x).
4
com tempo de evolução da
neoplasia desde o diagnóstico e,
provavelmente, resulta da
acumulação de alterações
genéticas [1, 7]. Outros fatores
de risco para a transformação
maligna do AP incluem a origem
da neoplasia na glândula
submandibular, idade mais
avançada (média de 61 anos) do
paciente e maior tamanho da
neoplasia [13].
O CAP representa menos de 4% de todas as neoplasias das glândulas salivares e
12% das neoplasias malignas das glândulas salivares [12, 14, 15]. O seu pico de
incidência etária ocorre na sexta e sétima década de vida, afetando predominantemente
as glândulas major e as minor do palato (Figura 2) [1, 7].
O CAP é uma neoplasia maligna de alto grau de malignidade que é constituída
por áreas de AP e por um componente maligno (Figura 3) [12, 14]. O CAP apresenta,
comparativamente com o AP,
um aumento de frequência das
seguintes caraterísticas
histológicas: hipercromasia e
pleomorfismo nuclear, aumento
da atividade mitótica, necrose,
hialinização da matriz e
infiltração dos tecidos peri-
tumorais [1, 13]. Os locais mais
frequentes de metastização do
CAP são os pulmões e os ossos
[1].
Existem alterações moleculares típicas do AP e do CAP já descritas na literatura,
nomeadamente a sobreexpressão de PLAG1, devido à perda de heterozigotia no
Figura 2 – Imagem de ressonância magnética evidenciando recidiva de
carcinoma ex-adenoma pleomórfico, verificando-se prévia remoção da
parte da mandíbula e osso temporal direito devido à invasão pelo
tumor.
Figura 3 - Transformação maligna do adenoma pleomórfico,
apresentando-se sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE,
100x)
5
cromossoma 8q, e sobreexpressão de HMGA2, por perda de heterozigotia no
cromossoma 12q [7, 16, 17].
A via de sinalização EGFR/HER2-Akt-
mTOR é uma das vias intracelulares que se
pensa ter importância na regulação do
crescimento, sobrevivência, proliferação,
motilidade e diferenciação celular (Figura 4)
[18-21]. Alterações na expressão dos elementos
desta via de sinalização têm sido associadas ao
desenvolvimento neoplásico, nomeadamente,
em modelos de cancro de mama, cancro colo-
rectal, cancro da bexiga, cancro do ovário, e
carcinoma epidermóide da cabeça e pescoço
[22].
O epidermal growth factor receptor
(EGFR), também conhecido como ErbB1/HER1, é um oncogene que codifica uma
glicoproteína da membrana de 170-kDa, que funciona como um receptor de tirosina
cinase finamente regulado [23]. O gene ErbB2/Neu/HER2 pertence à mesma família do
EGFR e codifica também uma glicoproteína da membrana de 185-kDa [21, 23]. As
neoplasias que apresentam atividade aumentada do EGFR tendem a ter um
comportamento mais agressivo, associado a um pior prognóstico [23]. Quer o EGFR,
quer o HER2, constituem alvos terapêuticos anti-neoplásicos para os fármacos
cetuximab (anticorpo anti-EGFR) e trastuzumab (anticorpo anti-HER2), constituindo
exemplos de terapêutica oncológica dirigida e personalizada [21, 22, 24].
Na via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, o EGFR e o HER2 ligam-se à
PI3K que catalisa reações levando ao recrutamento e ativação da proteína cinase serina-
treonina Akt [19, 22]. A Akt é ativada pela ligação de fatores de crescimento ao recetor
tirosina cinases e adquire capacidade para fosforilar a proteínas mTOR, que intervêm no
desbloqueio da fase G1/S de transição do ciclo celular [20, 22].
Recentemente, um estudo realizado por Ettl et al. [24] mostrou a existência de
uma correlação positiva entre a sobreexpressão e aumento do número de cópias dos
genes EGFR e HER2 e a presença de histologia de alto grau de malignidade em
neoplasias malignas das glândulas salivares. Num outro estudo realizado por Ettl et al.
Figura 4 – Esquema da via celular EGFR/HER2-
Akt-mTOR. (Adaptado de Suzuki et al., 2012
[21] )
6
[20] os autores concluíram que a via PI3K-Akt-mTOR está ativa em neoplasias de
glândulas salivares e que os tumores com sobreexpressão citoplasmática das proteínas
Akt e mTOR apresentavam pior prognóstico. Este é o primeiro estudo que procura
determinar a relação da expressão dos elementos da via EGFR/HER2-Akt-mTOR com
as caraterísticas clínico-patológicas em AP e CAP.
7
Objetivos
Os objetivos deste trabalho de investigação são:
1. Identificar as caraterísticas clínico-patológicas numa série de casos de AP e CAP
que se relacionam com o comportamento e o prognóstico destes tumores.
2. Pesquisar a existência da expressão dos elementos da via de sinalização
EGFR/HER2-Akt-mTOR numa série de tumores de glândulas salivares que
inclui AP e CAP.
3. Identificar, numa série de AP e CAP, a relação entre a expressão dos elementos
da via de sinalização EGFR/HER2-Akt-mTOR, as caraterísticas clínico-
patológicas e com o comportamento destes tumores.
8
Materiais e métodos
Amostra
Trata-se de um estudo retrospetivo com uso de material de arquivo dos Serviços
de Anatomia Patológica do Hospital de São João do Porto e do Instituto Português de
Oncologia do Porto (IPO). A amostra deste estudo engloba 16 tumores de glândulas
salivares minor e major, que incluem 11 AP com mais de 8 anos de vigilância clínica e
5 CAP com mais de 5 anos de vigilância clínica, diagnosticados entre Janeiro de 1999 e
Abril de 2008. Foram registados os seguintes dados das fichas clínicas dos pacientes:
sexo, idade aquando do primeiro diagnóstico, localização do tumor, ocorrência de
recidivas, existência de metástases e estado atual do paciente.
Análise histopatológica
Foram colhidas dos arquivos todas as lâminas coradas com hematoxilina-eosina
(HE) obtidas dos blocos de parafina dos tumores primários e respetivas recidivas
incluídos na amostra em estudo. As lâminas referentes a cada caso foram estudadas ao
microscópico ótico por dois observadores (AC e CE). Para cada caso foram registados
os seguintes dados: tipo histológico, tamanho do tumor, estado da margem cirúrgica,
componente predominante (epitelial, mioepitelial ou estromal), assim como a existência
de cápsula, invasão da cápsula, nódulos satélites, invasão vascular, índice mitótico,
atipia citológica, necrose, inflamação, cistos e metaplasia escamosa. O índice mitótico
foi determinado contando as mitoses presentes em 10 campos de observação do
microscópio ótico (ampliação de 400x). As margens cirúrgicas foram classificadas em
margem com neoplasia e margem sem neoplasia.
Análise imuno-histoquímica
A análise imuno-histoquímica foi realizada nos tumores primários e nas
recidivas tumorais. Para cada caso foram feitos cortes de 3 µm a partir do bloco de
parafina representativo do tumor. Nestas seções foi realizada a coloração imuno-
histoquímica. Em resumo, após a desparafinação das lâminas com EZ prep®, foi
realizada a recuperação antigénica com uma solução à base de EDTA e com um tampão
9
citrato a uma temperatura de
95ºC. Foi utilizado o aparelho
Ventana - Bench Mark Ultra®
(Ventana, Medical Systems,
Tucson, AZ, USA). Os
anticorpos foram usados da
seguinte forma: EGFR
fosforilado (p-EGFRTyr1068
,
policlonal, Cell Signaling
Technology, Beverly, MA,
USA) com uma diluição
1:100 e incubação de 32
minutos, HER2 (PATHWAY anti-HER-2/neu, clone 4B5, Roche, Basel, Switzerland)
pré-diluído e 12 minutos de incubação, mTORser2481
(clone 7C10, Cell Signaling
Technology) com uma diluição 1:50 e incubação de 48 minutos, Akt fosforilado (p-
AktSer473
(clone 736E11, Cell Signaling Technology) com uma diluição 1:50 e
incubação de 48 minutos. Depois da lavagem aplicou-se o Kit DAB de revelação do
Ventana (Ventana, Medical Systems) e hematoxilina para marcação nuclear. Foram
usados os controlos positivos e negativos apropriados.
A expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2 foi membranar e foi avaliada
segundo os seguintes critérios descritos na Tabela I.
Graduação Avaliação da expressão
0 não expresso ou expresso em <10% das células
+1 expressão parcial a fraca em ≥ 10% das células
+2 expressão moderada a fraca em ≥ 10% das
células, e a toda a volta da membrana
+3 expressão forte em todas as células, e a toda a
volta da membrana
Tabela I – Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de EGFR e HER2
Figura 5 – Aparelho utilizado para a realização das colorações imuno-
histoquímicas.
10
A expressão imuno-histoquímica de mTOR foi citoplasmática e foi avaliada
segundo os seguintes critérios descritos na Tabela II.
Graduação Avaliação da expressão
0 não expresso ou expresso em <10% das células
+1 expressão fraca em ≥ 10% das células
+2 expressão moderada em ≥ 10% das células
+3 expressão forte em ≥ 10% das células
Tabela II - Critérios de avaliação da expressão imuno-histoquímica de mTOR
A expressão de Akt nas colorações imuno-histoquímicas não foi avaliável
porque, por motivos técnicos, não se conseguiu otimizar a reação do anticorpo para
deteção de expressão da proteína Akt.
Para a análise estatística considerou-se marcação negativa para valores de 0 e
+1, e marcação positiva para valores de +2 e +3.
Análise estatística
Todos os dados registados foram analisados no programa SPSS® para Windows,
versão 20.0 (SPSS, Erkrath, Germany). As relações entre dados dicotómicos clinico-
patológicos e imuno-histoquímicos foram estudados utilizando o teste exato de
probabilidades de Fisher (p<0,050).
11
Resultados
Na Tabela III resumem-se as caraterísticas clinico-patológicas nas neoplasias
estudadas. A amostra de AP compreendia 5 homens e 6 mulheres, com uma média de
idade aquando do diagnóstico de 47,6 anos. Atualmente, os 11 dos pacientes estão vivos
e sem doença. Dos AP estudados, 8 (72,7%) eram da glândula parótida, 1 (9,1%) da
glândula submandibular e 2 (18,2%) de glândulas minor do palato. Recidivaram 6
(54,5%) dos 11 AP, sendo que 5 eram da glândula parótida 1 era do palato.
A amostra de CAP compreendia 2 homens e 3 mulheres, com uma média de
idade aquando do diagnóstico de 46,4 anos. Atualmente, 4 dos pacientes estão vivos e
sem doença e 1 paciente está vivo e com doença. Dos CAP estudados, 2 eram da
glândula submandibular (40%) e 3 eram da glândula parótida (60%). Recidivaram 2
(40%) dos 5 CAP, sendo que era um da glândula parótida e outro da glândula
submandibular. Em nenhum dos casos havia registo de metástases ganglionares
regionais ou à distância. Não se verificou a presença de necrose em nenhum dos casos
de AP e CAP estudados.
Em nenhum dos AP estudados existia invasão vascular, que estava presente em
40% dos CAP. Em nenhum dos CAP analisados se verificou a presença de inflamação
ou cistos, que estavam presentes em 36,4% e 18,2%, respetivamente, dos AP. Todos os
CAP e 81,8% dos AP apresentavam margem cirúrgica com neoplasia.
Figura 6 – Caraterísticas histopatológicas do adenoma pleomórfico. A – Metaplasia escamosa
(HE,200x); B- Cistos (HE, 40x); C – Nódulo satélite (HE,100x); D – Invasão da cápsula
(HE, 40x).
12
Tabela III – Caraterísticas clínico-patológicas das neoplasias estudadas.+ -Presente; - - Ausente; M-Masculino; F-Feminino; VS – Vivo e sem doença; VC – Vivo e com doença; Es- Estromal;
Ep – Epitelial; Mio-Mioepitelial; x – não se aplica; CDuc – Carcinoma Ductal; CMuc – Carcinoma mucoepidermóide; CMio – Carcinoma mioepitelial; * - as caraterísticas descritas
correspondem ao componente benigno.
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as
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Met
ap
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escam
osa
Tip
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isto
lógic
o
com
pon
ente
mali
gn
o
Casos
AP
1 M 31 Parótida 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + - - - 0 - - - - - x
2 F 54 Palato 2 VS 1,5 C/neoplasia Ep - x - - 0 - - + - + x
3 F 48 Parótida 2 VS 0,5 C/neoplasia Mio + - - - 0 - - - - - x
4 M 42 Parótida 0 VS 2,5 S/neoplasia Es - x - - 1 - - - - - x
5 M 58 Palato 0 VS 2,0 C/neoplasia Es - x - - 0 - - - + + x
6 F 36 Parótida 1 VS 0,8 S/neoplasia Es + + - - 0 - - - - - x
7 M 21 Parótida 1 VS 2,7 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - + - - x
8 M 64 Submandibular 0 VS 3,0 S/neoplasia Es + + - - 5 - - + + + x
9 F 55 Parótida 1 VS 1,8 S/neoplasia Mio + - - - 3 + - - - - x
10 F 72 Parótida 0 VS 4,5 S/neoplasia Es + - - - 0 - - - - + x
11 F 43 Parótida 2 VS 1,4 C/neoplasia Es + - + - 0 - - + - - x
Casos
CAP *
12 M 40 Submandibular 1 VS 1,2 C/neoplasia Mio - x + + 0 - - - - + CDuc
13 M 65 Submandibular 0 VS 3,5 C/neoplasia Es + + - - 8 + - - - - CDuc
14 F 37 Parótida 0 VS 1,0 C/neoplasia Es + - - - 3 - - - - + CMuc
15 F 29 Parótida 4 VC 2,5 C/neoplasia Mio - x + - 0 - - - - - CMio
16 F 61 Parótida 0 VS 1,7 C/neoplasia Mio - x - + 3 + - - - - CMio
13
Na Tabela IV resume-se a expressão imuno-histoquímica de EGFR, HER2, e
mTOR nas neoplasias. A expressão imuno-histoquímica de EGFR no tecido salivar
peri-tumoral aparentemente normal (Figura 8A), nos casos em que foi possível avaliar,
foi negativa em 85,7% dos casos e positiva em 14,3% dos casos (corresponde apenas
ao caso 9). No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e considerando os
AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-histoquímica de EGFR
(Figura 8B) foi positiva em 62,5% dos casos e negativa em 37,5% dos casos. Nos
casos de CAP, a expressão de EGFR (Figura 8C) no componente maligno foi
semelhante à do componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de
EGFR manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos, diminuiu em 25%
dos casos e aumentou em 12,5% dos casos.
A expressão imuno-histoquímica de HER2 no tecido salivar peri-tumoral
aparentemente normal (Figura 8D), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa
em todos os casos. No tecido neoplásico, dos casos de neoplasia primária e
considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a expressão imuno-
histoquímica de HER2 (Figura 8E) foi negativa em 93,7% dos casos e positiva em
6,3% dos casos (corresponde apenas a um caso de CAP - caso 14). A expressão de
HER2 foi negativa em todos os AP que não sofreram transformação maligna. Nos
casos de CAP, a expressão de HER2 no componente maligno foi semelhante à do
componente benigno. Nos tumores recidivantes, a expressão de HER2 (Figura 8F)
manteve-se igual à do tumor primário em 62,5% dos casos e aumentou em 37,5% dos
casos. Comparando a expressão de HER2 nos AP primários e nos AP recidivantes
Figura 7 – Caraterísticas histopatológicas do carcinoma ex-adenoma pleomórfico. A –
anaplasia (HE, 400x); B – Transformação maligna do adenoma pleomórfico, apresentando-se
sob a forma de carcinoma mucoepidermóide (HE, 400x)
14
verifica-se uma diferença estatisticamente significativa (p=0,029), sendo que esta
nunca se verificou nos AP primários.
A expressão imuno-histoquímica de mTOR no tecido salivar peri-tumoral
aparentemente normal (Figura 8G), nos casos em que foi possível avaliar, foi negativa
em 12,5% dos casos e positiva em 87,5% dos casos. No tecido neoplásico, dos casos
de neoplasia primária e considerando os AP e o componente benigno dos CAP, a
expressão imuno-histoquímica de mTOR foi negativa em 50 % dos casos e positiva
em 50 % dos casos. A expressão de mTOR foi positiva no componente benigno de
todos os casos de CAP. Nos casos de CAP, a expressão de mTOR (Figura 9H e I) no
componente maligno foi igual à do componente benigno em 80% dos casos. Nos
tumores recidivantes, a expressão de mTOR manteve-se igual à do tumor primário em
75% dos casos, aumentou em 12,5% dos casos e diminui em 12,5% dos casos.
Figura 8 - A – Expressão de EGFR em parênquima de glândula salivar peritumoral (400x); B- Expressão de EGFR
em adenoma pleomórfico (200x); C- Expressão de EGFR em carcinoma ex- adenoma pleomórfico (200x); D –
Expressão de HER2 em parênquima de glândula salivar peritumoral (200x); E- Expressão de HER2 em adenoma
pleomórfico (100x); F- Expressão de HER2 em recidiva de adenoma pleomórfico (200x); G – Expressão de mTOR
em parênquima de glândula salivar peritumoral (100x); H e I- Expressão de mTOR em carcinoma ex-adenoma
pleomórfico (200x).
15
Caraterísticas
Imuno-histoquímicas
EGFR
peri-tumoral
EGFR
neoplasia
primária
EGFR
recidiva
HER2
peri-tumoral
HER2
neoplasia
primária
HER2
recidiva
mTOR
peri-tumoral
mTOR
neoplasia
primária
mTOR
recidiva
Casos AP
1 NA + x NA - x NA - x
2 NA + + NA - - NA - -
3 NA - + NA - - NA + +
4 - - x - - x + - x
5 - - x - - x + - x
6 - - - - - + + - +
7 NA - - NA - + NA + -
8 NA + x NA - x NA - x
9 + + - - - + + - -
10 - + x - - x - + x
11 NA + - - - - + - -
Casos CAP B M B M B M B M B M B M
12 NA + + + + NA - - - - NA + + - -
13 NA + + x x NA - - x x NA + + x x
14 - + + x x - + + x x + + - x x
15 NA + + + + NA - - - - NA + + - -
16 - - - x x NA - - x x + + + x x
Tabela IV - Caraterísticas imuno-histoquímicas das neoplasias estudadas. + - positivo ; - - negativo; NA- não avaliável por falta de representatividade no bloco da parafina selecionado; B -
componente benigno; M-componente maligno; x – caso sem recidiva.
16
A relação entre as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão imuno-
histoquímica de HER2, EGFR e mTOR nos casos de AP, e a ocorrência de recidiva
nestes tumores está descrita na Tabela V. Verificou-se uma maior tendência para a
ocorrência de recidiva do AP em pacientes do sexo feminino (p=0,080) e em tumores
com tamanho inferior a 2 cm (p=0,080). Dos 6 tumores com tamanho inferior a 2 cm, 4
apresentavam margem cirúrgica com neoplasia. Verificou-se também que, em todos os
casos de AP que não recidivaram, o componente predominante era o estroma (p=0,061).
Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites.
Na Tabela VI sumarizam-se as caraterísticas clínico-patológicas e a expressão de
HER2, EGFR e mTOR nos AP e no componente benigno dos CAP e a sua relação com
a transformação maligna. Nenhum dos fatores clínico-patológicos estudados apresentou
associação significativa com a transformação maligna do tumor. Nenhum dos AP que
sofreu transformação maligna apresentava inflamação. Verificou-se a existência de uma
associação estatisticamente significativa entre a expressão de mTOR nos tumores
primários e a ocorrência de transformação maligna (p=0,026). Dos tumores que
sofreram transformação maligna apenas um não apresentava expressão de EGFR.
17
Caraterística Com recidiva (n=6) Sem recidiva (n=5) p
Idade ≤ 47
> 47
3
3
2
3 1,000
Sexo Masculino
Feminino
1
5
4
1 0,080
Margem cirúrgica Margem sem neoplasia
Margem com neoplasia
2
4
3
2 0,567
Tamanho tumor ≤ 2 cm
> 2 cm
5
1
1
4 0,080
Componente
predominante
Epitelial ou Mioepitelial
Estroma
4
2
0
5 0,061
Índice mitótico ≤ 2
> 2
5
1
4
1 1,000
Cápsula Presente
Ausente
3
3
3
2 1,000
Invasão da cápsula
ou nódulos satélites
Presente
Ausente
3
3
1
4 0,545
Metaplasia escamosa Presente
Ausente
1
5
3
2 0,242
Atipia citológica Presente
Ausente
1
5
0
5 1,000
Inflamação Presente
Ausente
3
3
1
4 0,545
Cistos Presente
Ausente
0
6
2
3 0,182
Expressão mTOR no
tumor primário
Presente
Ausente
2
4
1
4 1,000
Expressão EGFR no
tumor primário
Positivo
Negativo
3
3
3
2 1,000
Tabela V – Análise das características clínico-patológicas e expressão imuno-histoquímica de EGFR e mTOR e a sua
relação com a ocorrência de recidiva nos adenomas pleomórficos.
18
Tabela VI - Análise das características clínico-patológicas e a expressão imuno-histoquímica de HER2, EGFR e
mTOR nas áreas de adenoma pleomórfico dos tumores estudados e a sua relação com a ocorrência de transformação
maligna.
Caraterística
AP com
transformação
maligna (n=5)
AP sem
transformação
maligna (n=11)
p
Idade ≤ 40
> 40
3
2
3
8 0,299
Sexo Masculino
Feminino
2
3
5
6 1,000
Tipo de margem
cirúrgica
Margem sem neoplasia
Margem com neoplasia
0
5
5
6 0,119
Componente
predominante
Epitelial ou Mioepitelial
Estroma
3
2
4
7 0,596
Índice mitótico ≤ 2
> 2
9
2
2
3 0,245
Cápsula Presente
Ausente
2
3
6
5 1,000
Invasão da cápsula
ou nódulos satélites
Presente
Ausente
3
2
4
7 0,596
Invasão vascular Presente
Ausente
2
3
0
11 0,083
Metaplasia escamosa Presente
Ausente
2
3
4
7 1,000
Atipia citológica Presente
Ausente
2
3
1
10 0,214
Inflamação Presente
Ausente
0
5
4
7 0,245
Cistos Presente
Ausente
0
5
2
9 1,000
Expressão mTOR Positivo
Negativo
5
0
3
8 0,026
Expressão HER2 Positivo
Negativo
1
4
0
11 0,313
Expressão EGFR Positivo
Negativo
4
1
6
5 0,588
19
Discussão
O AP apresenta uma maior tendência para recidivar do qualquer outro tumor das
glândulas salivares e tem capacidade de malignização, pelo que é relevante perceber o
que influencia a sua recidiva e a sua transformação maligna [5]. Não existem muitos
estudos sobre os fatores de risco clínico-patológicos relacionados com a recidiva do AP.
Alguns estudos realizados evidenciaram que a recidiva do AP é mais frequente
em pacientes mais jovens, pois quanto mais novo for o paciente maior será,
teoricamente, o número de anos que ainda tem de vida [5, 10, 25, 26]. Porém, outros
estudos não verificaram qualquer relação entre a idade e a recidiva do AP [27-29].
Neste estudo, a média de idades aquando do primeiro diagnóstico foi de 47,6 anos, o
que está de acordo com os valores médios encontrados na literatura [5, 27, 30, 31], que
variam entre 41-49, mas não se verificou uma associação significativa ente a idade
aquando do primeiro diagnóstico e a ocorrência de recidiva do AP. Apesar da série
estudada ser limitada em termos de número de casos, estes têm um tempo de vigilância
clínica elevado, o que confere significado a estes resultados.
Verificou-se uma maior tendência para a ocorrência de recidiva do AP em
pacientes do sexo feminino (p=0,080). Resultados semelhantes foram encontrados por
Wittekindt et al. e Friedrich et al. [26, 32]. No entanto, noutros estudos não se verificou
relação significativa entre a ocorrência de recidiva do AP e o sexo [25, 27-29].
A patogénese exata do CAP ainda não está bem estabelecida. Gerughty et al.
[33] apresentaram a hipótese destes tumores serem malignos desde o princípio, visto
que 60% dos pacientes da sua amostra não tinham qualquer registo de um tumor pré-
existente. Por outro lado, Katabi et al. [14] defenderam a ocorrência de transformação
maligna de um tumor benigno, baseando-se na idade média de surgimento dos tumores,
que é menor nos tumores benignos, e na presença prévia de uma massa relatada pela
maioria dos pacientes. No nosso estudo todos os CAP apresentavam, no exame
histológico, um componente benigno, pelo que se tratam de casos de AP que sofreu
transformação maligna.
Alguns dos fatores que têm sido associados com uma maior probabilidade de
ocorrência de transformação maligna do AP são a idade acima de 40 anos aquando do
tratamento inicial e o sexo masculino [5]. No nosso estudo 60% dos apresentavam idade
inferior a 40 anos aquando do diagnóstico de CAP, e não se verificou correlação
significativa entre a idade do paciente e a ocorrência de transformação maligna, nem
20
entre o sexo e a ocorrência de transformação maligna. Estes achados, tais como os
anteriormente descritos, terão de ser enquadrados nas limitações da amostra.
Verificou-se uma relação próxima da significância estatística entre o
componente predominante do AP e a ocorrência de recidiva (p=0,061). Todos os casos
de AP sem recidiva apresentavam como componente predominante o estroma. O
estroma é um elemento importante do AP e pode assumir diversas formas:
mixóide/mucóide, cartilagíneo ou hialino [1]. Este resultado não está de acordo com o
estudo realizado por Stennert et al. [34], que observou uma predominância do tipo
mixóide nas recidivas de AP, sendo que este tipo está associado a um maior risco de
recidiva, pois estes tumores apresentam zonas focais de ausência de encapsulação e
nódulos satélites. Por outro lado, os estudos realizados por Soares et al. e Park et al. [5,
30] não encontraram nenhuma evidência da existência de uma relação entre o estroma
mixóide ser o componente predominante em AP com recidiva. O resultado obtido no
nosso estudo pode ser explicado pelo enviesamento resultante de a amostra ser pequena,
e por não se ter feito uma classificação diferencial do subtipo de estroma.
Também a relação entre o tamanho do AP e a ocorrência da recidiva foi próxima
da significância estatística (p=0,080), tendo verificado que esta era maior nos tumores
mais pequenos. O estudo realizado por Redaelli de Zinis et al. [27] encontrou resultados
semelhantes, mas sem significância estatística. Este resultado pode ser explicado pela
tendência a efetuar cirurgias menos mutilantes nos casos de tumores pequenos, que
depois são complicadas por dificuldades operatórias. Os tumores desta série que eram
pequenos e que se localizavam na parótida (proximidade de estruturas nervosas
derivadas do nervo facial) e no palato (difícil pela localização e caraterísticas da
mucosa), podem eventualmente enquadrar-se neste grupo e ter tido como consequência
desta abordagem a não remoção total do tumor [30, 35, 36]. De facto, dos 6 casos com
tamanho inferior a 2 cm, 4 apresentavam margem cirúrgica com neoplasia, que é um
dos principais fatores de risco para a ocorrência de recidiva do AP [1, 5]. Neste estudo a
ocorrência de recidiva não está significativamente associada ao estado da margem
cirúrgica, no entanto, existe um número muito elevado de casos em que a margem
apresenta neoplasia numa amostra pequena, pelo que pode existir enviesamento dos
resultados.
Apenas os casos de AP com recidiva apresentavam nódulos satélites. O facto dos
nódulos satélites serem pequenos e nem sempre serem detetados nos exames
imagiológicos pode ter como consequência a sua não remoção durante o procedimento
21
cirúrgico, permitindo que estas células tumorais permaneçam no local e se continuem a
dividir, levando à recidiva do tumor [5]. Soares et al. [5] reportaram a presença de
nódulos satélites em todos os casos de AP recidivantes que analisaram. Stennert et al.
[34] num estudo histológico prospetivo, reportaram a existência de nódulos satélites em
cerca de 90% dos AP recidivantes. Park et al. [30] encontraram uma correlação entre a
existência de nódulos satélites e a ocorrência de recidiva.
A invasão vascular é tida uma como uma caraterística típica das neoplasias
malignas, mas alguns estudos mostraram que, excecionalmente, pode ocorrer no AP
[37, 38]. No entanto, pensa-se que é difícil para as células do AP sobreviveram por
muito tempo na corrente sanguínea devido às defesas imunitárias do hospedeiro, o que
justificaria a ausência de desenvolvimento de metástase em AP [37, 38]. Na série
estudada, verificou-se que a invasão vascular foi exclusiva dos tumores com
transformação maligna, o que está de acordo com a maioria das séries descritas na
literatura.
Nenhum dos casos de AP com recidiva ou AP com transformação maligna
apresentava cistos. A degeneração cística é uma caraterística histopatológica que pode
ocorrer nos AP, e por vezes tem como consequência o diagnóstico incorreto de
carcinoma mucoepidermóide [1, 39-41]. Nos casos descritos na literatura não existe
referência à ocorrência de recidiva nem de transformação maligna destes tumores [39-
41], pelo que se deve aprofundar a possibilidade de esta ser uma caraterística indicativa
de não recidiva e não malignidade.
Nenhum dos casos de AP com transformação maligna apresentava inflamação.
De acordo com o estudo realizado por Weichhart et al. [42] em monócitos humanos
isolados e células dendríticas mieloides, a ativação do mTOR inibe a produção de
citocinas pró-inflamatórias e estimula a libertação de citocinas anti-inflamatórias. Nesta
série, nos tumores estudados onde ocorreu transformação maligna verificou-se
sobreexpressão de mTOR, o que pode estar relacionado com esta ausência de
inflamação nestas neoplasias e que pode ser encarada como um fator promotor da
transformação maligna no AP. Resultados semelhantes tinham já sido obtidos por
Murayma et al. [43] no estudo do carcinoma gástrico, que verificaram que a expressão
citoplasmática de mTOR estava positivamente relacionada com a profundidade de
invasão de tumor e envolvimento de gânglios linfáticos, que são marcadores de
malignidade. Sabe-se que o mTOR é responsável pela regulação da proliferação celular
através da fosforilação de p70S6 na fase de transição de G1/S do ciclo celular, pelo que
22
a sua expressão alterada pode conduzir a uma proliferação celular desregulada, que é
caraterística das células malignas [44]. O mTOR é um alvo da rapamicina, um fármaco
antineoplásico cuja eficácia foi já avaliada com bons resultados em vários tumores
sólidos, incluindo neoplasias renais, da mama e do pâncreas [44-47]. Seria útil efetuar
estudos do tipo ensaio clínico para tratamento de CAP da glândula salivar com
inibidores do mTOR.
A amplificação/sobreexpressão do gene EGFR tem sido associada ao
desenvolvimento de várias neoplasias malignas no ser humano [48]. No que respeita aos
carcinomas de glândulas salivares, não existem muitos estudos e estes têm resultados
contraditórios. No estudo realizado por Katori et al. [49] verificou-se uma associação
entre a sobreexpressão do EGFR e o desenvolvimento de CAP. No estudo realizado por
Sugano et al. [50] os AP não apresentavam sobreexpressão de EGFR, mas esta existia
nos CAP estudados em áreas com caraterísticas consideradas transitórias entre
componentes benignos e malignos. No nosso estudo não se verificou nenhuma
associação estatisticamente significativa entre a expressão de EGFR e transformação
maligna do AP, mas nos tumores que sofreram transformação maligna apenas um não
apresentava expressão de EGFR. Estas observações podem indicar que a amplificação
do EGFR constitui uma etapa inicial no processo de transformação neoplásica,
principalmente porque a sua expressão é muito mais frequente em AP e CAP do que no
tecido peri-tumoral aparentemente normal. No caso do carcinoma do pulmão, a
sobreexpressão de EGFR é um dos sinais precoces de transformação neoplásica, estando
presente nos estádios pré-malignos [51].
Verificou-se que a expressão de HER2 era maior nas recidivas de AP quando
comparada com a expressão no AP primários, sendo que esta diferença é
estatisticamente significativa e não está documentada na literatura. A expressão de
HER2 em AP foi apenas estudada por Di Palma et al. [52], que não encontrou
sobreexpressão desta proteína.
Existe uma grande quantidade de evidências científicas que associam a
sobreexpressão de HER2 à malignidade em várias neoplasias humanas, incluindo as
neoplasias de glândulas salivares [21, 24]. No estudo realizado por Suzuki et al.,
verificou-se uma sobreexpressão do HER2 em 43% dos CAP estudados [21]. Também o
estudo realizado por Ettl et al. [24] demonstrou que a sobreexpressão HER2 está
presente em várias neoplasias malignas de glândulas salivares, tendo impacto no
prognóstico. No nosso estudo não foi encontrada nenhuma associação significativa entre
23
a expressão de HER2 e a transformação maligna, nem uma maior expressão deste nos
tumores com componente maligno, mas verificou-se que a expressão de HER2 era
negativa em todos os tumores que não sofreram transformação maligna. Deveria
realizar-se um estudo na população portuguesa com uma amostra maior, para poder
aferir se esta relação, de facto, existe. O estudo da expressão de HER2 reveste-se de
especial importância pois esta proteína é um alvo de terapêutica oncológica dirigida e
personalizada. Na literatura existem já casos descritos da utilização de trastuzumab no
tratamento de CAP com expressão significativa de HER2, tendo-se obtido bons
resultados [53, 54].
O nosso estudo apresenta algumas limitações. Como a amostra estudada é
pequena possíveis relações estatisticamente significativas existentes entre os dados
clínico-patológicos e imuno-histoquímicos, e entre estes e a ocorrência de recidiva e
transformação maligna podem não ser evidentes.
Como na amostra estudada, à exceção de um caso, todos os pacientes se
apresentavam vivos e sem doença, não foi possível calcular curvas de sobrevivência,
nem relacionar fatores clínico-patológicos e imuno-histoquímicos com a sobrevivência
e a presença de doença. Para tal, devem ser realizados estudos que englobem uma
amostra maior.
24
Conclusões
Tal como noutras séries, verificou-se na série estudada que o sexo
feminino, o tamanho dos tumores menor que 2 cm e a presença de nódulos satélites estão
associados a uma maior frequência de recidivas de AP. Nesta série, os casos de AP que
não recidivaram tinham o estroma como componente predominante.
Nenhum dos CAP apresentava inflamação tumoral ou cistos, que
parecem ser caraterísticas patológicas associadas a comportamento benigno.
O EGFR está expresso com mais frequência nos AP e CAP que no tecido
de glândula salivar peri-tumoral aparentemente normal, sugerindo um papel importante
desta proteína na transformação neoplásica.
O HER2 está expresso com mais frequências nas recidivas de AP e nos
CAP do que nos AP primários, indicando um papel desta proteína na progressão
neoplásica deste modelo tumoral. A confirmação desta associação em séries maiores
poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-HER2 em CAP resistentes ao tratamento
cirúrgico.
A expressão de mTOR em AP e CAP está associada à ausência de
inflamação tumoral e ao comportamento destas neoplasias, parecendo ser um indicador
de transformação maligna do AP. A confirmação desta associação em séries maiores
poderá justificar o uso de terapia dirigida anti-mTOR em CAP resistentes ao tratamento
cirúrgico.
25
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49. Katori, H., A. Nozawa, and M. Tsukuda, Expression of epidermal growth factor receptor,
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Imagem capa:
Aspeto histológico de adenoma pleomórfico de glândula parótida (HE, 200x)
28
Agradecimentos
À Professora Doutora Catarina Eloy agradeço pela enorme ajuda e apoio que me
disponibilizou ao longo da realização deste trabalho e pela exigência das suas correções.
Agradeço também tudo o que me ensinou durante este percurso sobre a realização de
investigação científica e por me ter proporcionado a oportunidade de aprender técnicas
que, de outra forma, não teria aprendido.
Às técnicas Sandra Relvas, Salomé Pereira, Bárbara Gomes e Helena Pereira, do
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S.João, agradeço a amabilidade e
disponibilidade, e a colaboração na preparação das lâminas histológicas e na realização
das colorações imuno-histoquímicas.
Ao Dr. Manuel Jacóme e Dra. Diana Felizardo, do IPO do Porto, agradeço a
colaboração na realização deste trabalho de investigação.
À Novartis Oncoloy, pelo financiamento deste projeto de investigação.
À minha família, por me ter proporcionado as melhores condições para que pudesse
estudar e desenvolver todas as minhas capacidades. Saliento o papel da minha mãe, Dra.
Ana Pedrosa, na escolha da minha profissão e o seu exemplo como Médica Dentista.
Aos meus colegas de curso, em especial o meu binómio Fábio, Carolina e Henrique,
agradeço o apoio, a ajuda e todos os bons momentos que vivemos ao longo do curso.
Às minhas amigas de sempre, Catarina, Andreia e Rita, por todo incentivo e apoio e por
18 anos de amizade verdadeira.
Ao Bruno, o meu melhor amigo, agradeço todo o amor, toda a compreensão, paciência
inesgotável e ajuda ao longo deste percurso. Agradeço também por me incentivar
sempre com otimismo e nunca me deixar desistir ou esmorecer.
29
ANEXOS
30
Anexo 1 – Parecer da Comissão de Ética da FMDUP
31
Anexo 2 – Declaração de autoria
32
Anexo 3 – Parecer do Orientador