MICHELE DALVINA CORREIA DA SILVA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DAS LECTINAS
ClaveLL (Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN) E BmoLL
(Bauhinia monandra LEAF LECTIN)
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MICHELE DALVINA CORREIA DA SILVA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DAS LECTINAS ClaveLL
(Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN) E BmoLL (Bauhinia monandra
LEAF LECTIN)
Orientadora: Profª. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, M.C., Ph.D.
Co-orientadores: Profª. Maria Tereza dos Santos Correia, M.C., Dr.
Prof. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão, M.C., Dr.
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DAS LECTINAS ClaveLL
(Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN) E BmoLL (Bauhinia monandra
LEAF LECTIN)
Tese de Doutorado apresentada para o cumprimento
parcial das exigências para a obtenção do título de Doutor
em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de
Pernambuco.
2008
Silva, Michele Dalvina Correia da
Aplicações biotecnológicas das lectinas ClaveLL
(Cladonia verticillaris Lichen Lectin) E BmoLL (Bauhinia
monandra Leaf Lectin). / Michele Dalvina Correia da Silva. –
Recife: A Autora, 2008.
211 fls. .: il.
Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) – UFPE. CCB
1. Lectina 2. Cladonia verticillaris 3. Bauhinia
monandra 4.Histoquímica I Título
577.1 CDU (2ª. Ed.) UFPE
572. CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 171
MICHELE DALVINA CORREIA DA SILVA
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DAS LECTINAS ClaveLL
(Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN) E BmoLL (Bauhinia monandra
LEAF LECTIN)
BANCA EXAMINADORA:
2008
IV
Aos meus pais, Arnaldo e Maria das Graças, por tudo o que sou hoje, dedico.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela vida maravilhosa que ele me concede todos os dias e pelas
pessoas lindas que fazem parte dela!
À minha família, meus pais, meus irmãos Helen, Arnaldo e meu sobrinho Allan, por
estarem sempre presentes em minha vida, pelo verdadeiro sentimento de amor que existe em
nosso lar, pela dedicação e compreensão que podemos exercer uns com os outros, pelo
constante apoio e força que me dão em todas as minhas decisões na vida e em tudo o que eu
faço, obrigada.
À professora Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, como pessoa,
professora e orientadora, por muitos anos de constante orientação científica aliada à confiança
e ótima convivência, que me renderam aprendizado e oportunidade de crescimento pessoal e
profissional.
À professora Dra. Maria Tereza dos Santos Correia, pelos muitos anos de orientação,
incentivo e apoio constantes.
Aos amigos do Laboratório de Glicoproteínas, pela amizade verdadeira que
construímos juntos, apoio, estímulo e ajuda presentes desde sempre. Em especial, agradeço à
Amanda, Mariana Cristina, Roberto, Thiago, Francis, Nathaly, Fernando, Neila e Flávia por
estarem presentes e disponíveis quando preciso, contribuindo muito para a realização dos
trabalhos.
Aos amigos Flávio Veras e Carla Melo pela colaboração, de forma direta ou indireta,
pela companhia e momentos de descontração e pelas ótimas amizades que eles representam
para mim.
Aos professores Dr. Haroudo Xavier, Dr. Roberto Mello, Dr. Eduardo Beltrão, Dra.
Norma Gusmão, Dra. Patrícia Paiva e Dra. Auristela Albuquerque pela oportunidade de
VI
colaboração, pelos valiosos ensinamentos e também pela convivência agradável e
simplicidade como pessoas.
Aos amigos do Departamento de Bioquímica Maria Reis, João Virgínio, Neide, Miron,
Djalma, Helena, Ademar e Jorge, pela amizade e auxílio em todas as horas que preciso.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, pela aprovação do meu
ingresso como aluna e pela oportunidade.
À Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, por me acolher de forma tão especial
desde a minha graduação até então, sendo há muito a minha segunda casa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, também
ao CNPq e à FACEPE pelo suporte financeiro.
VII
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS X
LISTA DE TABELAS XII
LISTA DE ABREVIATURAS XIII
RESUMO XVII
ABSTRACT XVIII
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 LECTINAS 3
1.1.1 Histórico e Denominação 3
1.1.2 Distribuição 5
1.1.3 Detecção e Especificidade 8
1.1.4 Características Estruturais 11
1.1.5 Classificação 13
1.1.6 Papéis Fisiológicos 16
1.1.7 Lectinas e Evolução 21
1.1.8 Propriedades Biológicas e Aplicações 22
1.1.9 Purificação 26
1.1.10 Caracterização 30
1.2 OS LIQUENS 33
1.2.1 Constituição e Denominação 33
1.2.2 O Gênero Cladonia e a Espécie Cladonia verticillaris 35
1.2.3 Lectinas de Liquens 36
1.3 AS LEGUMINOSAS 38
1.3.1 Generalidades 38
1.3.2 O Gênero Bauhinia e a Espécie Bauhinia monandra 38
VIII
1.3.3 A Lectina de Bauhinia monandra 40
1.4 PROTEÍNAS ANTIMICROBIANAS 41
1.4.1 Distribuição nos Seres Vivos e nas Classes de Proteínas 41
1.4.2 Lectinas com Ação Antimicrobiana contra Fusarium ou Bactérias 43
1.5 OS VEGETAIS E SUAS DEFESAS NATURAIS 45
1.5.1 Defesa Vegetal contra Microrganismos e Animais 45
1.5.2 Lectinas com Ação Inseticida 45
1.5.3 Mecanismos de Ação Inseticida das Lectinas 48
1.5.4 A Biotecnologia e os Inseticidas Naturais 49
1.6 OS CUPINS 50
1.6.1 Classificação dos Nasutitermes 50
1.6.2 Aspectos Gerais e Importância Econômica e Ambiental 50
1.7 DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS 52
1.7.1 A Doença de Alzheimer: Aspectos Clínicos e Histopatológicos 53
1.7.2 Origem dos Fatores Neuropatológicos da Doença de Alzheimer 55
1.7.3 Lectinas como Marcadores em Patologia Forense 57
2 JUSTIFICATIVA 61
3 OBJETIVOS 64
3.1 Objetivo Geral 65
3.2 Objetivos Específicos 65
4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
5 ARTIGOS 109
Artigo 1: Purification and characterization of Cladonia verticillaris lichen lectin
with antimicrobial activity
110
Artigo 2: Purified Cladonia verticillaris lichen lectin: insecticidal activity on
Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae)
143
IX
Artigo 3: Antimicrobial and insecticidal activities on Nasutitermes corniger
(Isoptera: Termitidae) of Bauhinia monandra leaf lectin
168
Artigo 4: Histochemistry of hippocampus from Alzheimer’s disease patients with
Cladonia verticillaris lichen lectin and Bauhinia monandra leaf lectin
189
6 CONCLUSÕES 209
X
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
Figura 1 – Ensaio de Hemaglutinação para detecção de lectinas. 9
Figura 2 – Ensaio de Inibição da Hemaglutinação lectínica. 10
Figura 3 – Estrutura de lectinas vegetais com base em seus domínios funcionais. 15
Figura 4 – Espécie Cladonia verticillaris. 35
Figura 5 – Espécie Bauhinia monandra. 40
Figura 6 – Bioensaio para avaliação inseticida e repelente de amostras protéicas. 47
Figura 7 – Espécie Nasutitermes corniger. 50
ARTIGOS
Artigo 1: Purification and characterization of Cladonia verticillaris lichen lectin with
antimicrobial activity
Figure 1 – Chromatographies of ClaveLL purification and characterization. 139
Figure 2 – Effect of temperature, ions and pH on ClaveLL HA. 140
Figure 3 – Interaction of F1 and ClaveLL with Cramoll 1,4 on radial diffusion and
chromatography, and electrophoretic profile of ClaveLL.
141
Figure 4 – Growth inhibition of Fusarium sp. in presence of ClaveLL and Cercobin. 142
Artigo 2: Purified Cladonia verticillaris lichen lectin: insecticidal activity on
Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae)
Figure 1 – Survival percentile of N. corniger in presence of E and F1. 166
Figure 2 – Survival percentile of N. corniger in presence of ClaveLL. 167
Artigo 3: Antimicrobial and insecticidal activities on Nasutitermes corniger (Isoptera:
Termitidae) of Bauhinia monandra leaf lectin
Figure 1 - Growth inhibition of Fusarium sp. in presence of BmoLL and Cercobin. 187
Figure 2 - Survival percentile of N. corniger in presence of BmoLL. 188
Artigo 4: Histochemistry of hippocampus from Alzheimer’s disease patients with
XI
Cladonia verticillaris lichen lectin and Bauhinia monandra leaf lectin
Figure 1 – Histochemistry of hippocampus with Alzheimer’s disease using
ClaveLL.
207
Figure 2 – Histochemistry of hippocampus with Alzheimer’s disease using BmoLL. 208
XII
LISTA DE TABELAS
ARTIGOS
Artigo 1: Purification and characterization of Cladonia verticillaris lichen lectin with
antimicrobial activity
Table 1 – Purification of ClaveLL. 136
Table 2 – Proteins or peptides with antifungal activity against Fusarium species. 137
Table 3 – Antibacterial and agglutinating activities of ClaveLL. 138
Artigo 3: Antimicrobial and insecticidal activities on Nasutitermes corniger (Isoptera:
Termitidae) of Bauhinia monandra leaf lectin
Table 1 – Antibacterial and agglutinating activities of BmoLL. 186
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS
Aβ1–40, Aβ1–42, Aβ: peptídeo β-amilóide, do inglês “β-amyloid peptide”
AD: Alzheimer’s disease
AH: atividade hemaglutinante
APP: proteína precursora do β-amilóide, do inglês “β-amyloid precursor protein”
ATD: Alzheimer-type dementia
BmoLL: lectina de folha de Bauhinia monandra, do inglês “Bauhinia monandra leaf lectin”
BmoLL-HRP: BmoLL conjugate to HRP
BSA-1B4: Bandeiraea simplicifolia agglutinin
CFU: colony forming units
ClaveLL: lectina do líquen Cladonia verticillaris, do inglês “Cladonia verticillaris lichen
lectin”
ClaveLL-HRP: ClaveLL conjugate to HRP
CML: Cordyceps militaris lectin
CM-celulose: carboximetilcelulose
Con A: Canavalia ensiformes agglutinin
CRD: carbohydrate recognition domain
CTLR: C-type lectin receptors
DA: doença de Alzheimer
DAB: diaminobenzidine
DBA: Dolichos biflorus agglutinin
DEAE-celulose: dietilaminoetilcelulose
DS: Down’s syndrome
E: crude extract
XIV
ECA: Erythrina cristagalli agglutinin
ED50: decrease of 50% weight
e-PHA: erythroagglutinating phytohemagglutinin from Phaseolus vulgaris
F1: protein fraction precipitate (0-30 %)
FPLC: fast protein liquid chromatography
Gal–GalNAc: Galactose-N-Acetil-Galactosamina
Gal–GlcNAc: Galactose-N-Acetil-Glicosamina
GalNAc: N-Acetil-Galactosamina
GlcNAc: N-Acetil-Glicosamina
GNA: Galanthus nivalis agglutinin
GOL: Gracilaria ornata lectin
GSA-IB4: Griffonia simplicifolia iso agglutinin B4
GSI: Griffonia simplicifolia agglutinin
GS-I: Griffonia simplicifolia I lectin
HA: haemagglutinating activity
HeLa: linhagem de células cancerosas da doadora involuntária, Henrietta Lacks
Hep G2: linhagem de células humanas de hepatoma
HIV: human immunodeficiency virus
HPLC-RP: cromatografia líquida de alta performance em fase reversa
HRP: horseradish peroxidase
L1210: linhagem de células humanas de leucemia
LCL: Lens culinaris lectin
LC50: lethal dose to kill 50% of insects
LD50: lethal dose to kill 50% of insects
l-PHA: Phaseolus vulgaris leukoagglutinating lectin
XV
MAC: minimum agglutinating lectin concentration
MBV: cerebral microvessels
Molt4: linhagem de células humanas derivada de células T de leucemia
M1: linhagem de células humanas de leucemia
NFT: emaranhados neurofibrilares, do inglês “neurofibrillary tangles”
PAA: Pisum arvense agglutinin
PBS: 0.15 M sodium phosphate buffer, pH 7, containing 0.15 M NaCl
PHA: Phaseolus vulgaris agglutinin
PNA: Arachis hypogaea agglutinin
PSA: Pisum sativum agglutinin
RIP: ribosome-inactivating protein
RP-HPLC: reversed-phase high performance liquid chromatography
SD: síndrome de Down
S.D.: standard deviation
SDS-PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulphate
SFI1: Segestria florentina toxin 1
SFI1/GNA: fusão da lectina GNA à neurotoxina SFI1
SHA: specific HA
SSAP: L-amino acid oxidase from the skin mucus of rockfish Sebastes schlegelii
SUCEN: Superintendência de Controle de Endemias
TEL: Talisia esculenta lectin
TFA: acid trifluoracetic
THA: total HA
UEA-I: Ulex europaeus isolectin I
WGA: Wheat Germ Agglutinin
XVI
XCL: Xerocomus chrysenteron lectin
YNB: yeast nitrogen base
XVII
RESUMO
Lectinas são proteínas presentes em diferentes organismos, dos quais são isoladas; possuem
origem não imune e habilidade para se ligarem a carboidratos ou glicoconjugados, através de
sítios específicos; forças de interação eletrostática e a presença de íons metálicos podem
influenciar o processo de ligação. Neste trabalho, foram avaliadas a lectina de folhas de
Bauhinia monandra, BmoLL, e a lectina do líquen Cladonia verticillaris, ClaveLL. A
investigação e conseqüente emprego biotecnológico de lectinas como proteínas com ação
antimicrobiana e inseticida, bem como sua utilidade em histoquímica no estudo e diagnóstico
de patologias, estimularam a realização desta Tese. As lectinas foram avaliadas quanto a
potencial ação contra bactérias e espécies fúngicas do gênero Fusarium, como proteínas
inseticidas para a espécie de cupins Nasutitermes corniger, e também como ferramentas
histoquímicas para a investigação histopatológica dos hipocampos de pacientes com doença
de Alzheimer. BmoLL e ClaveLL são ativas contra diferentes espécies de Fusarium (F.
solani, F. lateritium, F. fusarioides, F. moniliforme e F. verticiloides com BmoLL; e
Fusarium verticiloides, F. descemcellulare, F. fusarioides, F. oxysporum e F. moniliforme
com ClaveLL) e são hábeis em aglutinar, como também inibir a proliferação de bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas. BmoLL e ClaveLL possuem ação não repelente e
inseticida contra N. corniger. Em histoquímica de hipocampo, BmoLL (galactose-específica)
reconhece o citoplasma neuronal e marca intensamente corpos amiláceos que ocorrem em
abundância; ClaveLL (com elevada afinidade por N-acetil-D-glicosamina e glicoproteínas)
reconhece intensamente células neuronais e corpos amiláceos e, mais importante, marca
neurônios lesionados com emaranhados neurofibrilares ou com degeneração grânulo-
vacuolar, degenerações que são típicas da doença de Alzheimer.
Palavras chave: lectina, Cladonia verticillaris, Bauhinia monandra, ação antimicrobiana, ação
inseticida, Nasutitermes corniger, histoquímica com lectina, doença de Alzheimer.
XVIII
ABSTRACT
Lectins are proteins present in different organisms from which are isolated; they have no
immune origin and have ability to bind carbohydrates or glycoconjugates through specific
sites; electrostatic interaction forces and the presence of metallic ions can influence the
binding process. In this work, Bauhinia monandra leaf lectin, BmoLL, and Cladonia
verticillaris lichen lectin, ClaveLL, were evaluated. The investigation and consequent
biotechnological lectin utilization as proteins with antimicrobial and insecticide actions as
well as its application in histochemistry for pathology studies and diagnosis stimulated the
accomplishment of this Thesis. Lectins were evaluated regarding potential action against
bacteria and different fungal Fusarium species, as insecticide proteins to termite species
Nasutitermes corniger and also as histochemical tools for the histopathological investigation
of hippocampus of patients with Alzheimer's disease. BmoLL and ClaveLL are active against
different Fusarium species (F. solani, F. lateritium, F. fusarioides, F. moniliforme and F.
verticiloides with BmoLL; and Fusarium verticiloides, F. descemcellulare, F. fusarioides, F.
oxysporum and F. moniliforme with ClaveLL) and are able to agglutinate as well as to inhibit
the proliferation of Gram-positive and Gram-negative bacteria. BmoLL and ClaveLL have not
repellent and insecticide actions against N. corniger. In histochemistry of hippocampus,
BmoLL (specific to galactose) recognizes the neuron cytoplasm and label intensely corpora
amylacea that occur in abundance; ClaveLL (with elevated affinity for N-acetyl-D-
glucosamine and glycoproteins) intensely recognizes neuron cells and corpora amylacea and,
more important, stain neurons with neurofibrillary tangles or with granulo-vacuolar
degeneration, degeneration lesions that are typical of Alzheimer's disease.
Key words: lectin, Cladonia verticillaris, Bauhinia monandra, antimicrobial action,
insecticidal action, Nasutitermes corniger, lectin histochemistry, Alzheimer's disease.
1
1 INTRODUÇÃO
2
O universo celular, estrutura básica necessária para a existência da vida em toda a sua
diversidade, é constituído por uma infinidade de moléculas diferenciadas umas das outras, tais
como lipídeos, proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos, peptídeos, glicoproteínas,
proteoglicanos, glicolipídeos, lipoproteínas. Cada uma delas tem seu papel funcional muito
bem pré-definido geneticamente, antes mesmo que elas venham a ser construídas por esse
mesmo universo celular, a partir do funcionamento de organelas envolvidas em sua
construção. Na célula tudo é muito bem controlado, como numa imensa fábrica onde não são
admitidos erros de produção. Dentre os quatro grandes grupos das mais variadas
macromoléculas, encontram-se as proteínas, competindo com os carboidratos como
macromoléculas mais abundantes nos organismos.
No início do século XIX, as proteínas eram ainda desconhecidas quanto ao arranjo
complexo que podem possuir para a determinação de sua estrutura. William Astbury (1898-
1961) foi um dos pioneiros nos estudos de proteínas através da difração por raios-X. Através
de suas pesquisas iniciadas em 1928, esclareceu a estrutura de várias proteínas fibrosas como
a queratina, demonstrando que tais macromoléculas eram formadas por um arranjo
relativamente simples e repetitivo (Astbury; Street, 1932). A partir de então, as proteínas em
geral foram consideradas como sendo constituídas sempre por um mesmo padrão simples,
com variações deste padrão de uma molécula para outra. As idéias sobre a estrutura das
proteínas na época variaram, mas, em geral, os pesquisadores tinham uma mesma visão
simplificada destas macromoléculas, estruturalmente falando. Por exemplo, sugeriram que as
proteínas fossem arranjos regulares de aminoácidos dispostos em proporções regulares
(Bergmann; Niemann, 1937a; Bergmann; Niemann, 1937b), ou que proteínas como a
hemoglobina e a insulina, hoje reconhecidas como estruturas protéicas globulares e
complexas, fossem formadas por feixes de fibras paralelas.
3
Foi somente nos anos 50 em que as pesquisas envolvendo a estrutura de proteínas
deram a estas moléculas um novo significado. Após muitas investigações, em 1955, Frederick
Sanger e colaboradores já haviam determinado a seqüência completa de aminoácidos da
insulina, mostrando uma estrutura protéica constituída por aminoácidos arranjados numa
seqüência longa e irregular (Sanger, 1959). Sanger apresentou para o mundo uma nova forma
de entender as proteínas, como macromoléculas complexas as quais têm seu papel funcional
determinado a partir da seqüência de subunidades. Ainda nos anos 50, a estrutura
tridimensional das proteínas foi descoberta (Kendrew et al., 1958), sendo reconhecida como
responsável por uma complexidade estrutural e por uma especificidade química de ligação a
substratos, cuja função protéica depende dessas duas características, as quais são
determinadas pela seqüência aminoacídica que as compõem.
Antes mesmo que a estrutura das proteínas fosse razoavelmente estudada e
satisfatoriamente compreendida como complexos arranjos aminoacídicos, em 1888 foram
descobertas as lectinas, uma classe intrigante de proteínas. Hoje, as lectinas possuem
reconhecidamente um leque de possibilidades de funções e propriedades diversas para os
organismos vivos e para a biotecnologia, até então não exploradas (Bies et al., 2004).
1.1 LECTINAS
1.1.1 Histórico e Denominação
As lectinas começaram a ser investigadas desde que a primeira destas moléculas foi
descoberta por Stillmark em 1888 que, estudando a toxicidade de extratos de mamona
(Ricinus communis) observou sua capacidade para aglutinar eritrócitos devido à presença de
uma proteína extraída, a ricina (Sharon; Lis, 1988). Este fato marcou o início de muitas
pesquisas envolvendo essas moléculas. Um ano depois, em 1889, Hellin observou que o
extrato tóxico de jequiriti (Abrus precatorius) também aglutinava células sanguíneas devido à
4
presença de uma proteína denominada abrina (Sharon; Lis, 1991). Essas duas lectinas são hoje
reconhecidas como pertencentes ao grupo de proteínas inativadoras de ribossomos,
denominadas RIPs (Bradberry, 2007; Olsnes, 2004). Essas proteínas, quando presentes em
plantas e capazes de aglutinar eritrócitos, foram inicialmente denominadas como
fitohemaglutininas, hemaglutininas, fitoaglutininas ou aglutininas de plantas (Sharon; Lis,
1988).
A descoberta de que algumas proteínas encontradas em sementes apresentavam
especificidade para aglutinar grupos sanguíneos humanos foi uma informação importante
descrita em pesquisas independentes realizadas por Renkonen em 1948 (Sharon, 1989) e por
Boyd e Reguera (1949).
Lectina é um termo originado do latim “lectus”, que significa selecionado, escolhido;
Boyd e Shapleigh (1954) utilizaram este termo para designar o grupo de proteínas que
apresentam a característica comum de seletividade na interação com carboidratos. Este termo
foi generalizado por Sharon e Lis (1972), englobando todas as proteínas presentes em fontes
de natureza variada, de origem não imunológica, capazes de ligar-se a carboidratos, com
especificidade ou não para eritrócitos de um determinado grupo sanguíneo.
Em 1980, as lectinas foram muito bem definidas por Goldstein et al. como proteínas
ou glicoproteínas de origem não imunológica, que apresentam dois ou mais sítios de ligação
capazes de interagir, de forma reversível, com carboidratos, precipitar glicoconjugados e
aglutinar células de origem animal ou vegetal.
Em 1981, Dixon sugeriu uma nova definição para estas moléculas como sendo
proteínas que possuem pelo menos um sítio de reconhecimento a carboidratos, desta maneira
incluindo as demais proteínas semelhantes às lectinas. Ainda em 1981, Kocourek & Horejsi
denominaram-nas como proteínas ou glicoproteínas de origem não imune que se ligam a
carboidratos, generalizando o termo para proteínas monovalentes, di ou polivalentes capazes
5
de interagir com carboidratos. Autores como Barondes (1988) e Sharon e Lis (1990)
sugeriram também a existência de um sítio adicional de natureza hidrofóbica nas lectinas, o
qual determina algumas interações entre proteínas.
A habilidade de aglutinar células distingue lectinas de outras macromoléculas capazes
de ligar carboidratos e é por isso geralmente incluída na definição de lectinas, de acordo com
aquela proposta por Goldstein et al. (1980). A origem não imune das lectinas é enfatizada
porque serve para distingui-las de anticorpos anti-carboidratos que aglutinam células.
Enquanto os anticorpos são estruturalmente similares, as lectinas diferem entre si quanto à
composição aminoacídica, requerimentos de metais, peso molecular e estrutura
tridimensional. Além disso, as lectinas não são apenas encontradas em animais, mas também
em outros organismos que não possuem sistema imune, como plantas e bactérias (Moreira et
al., 1990).
Outra definição bem aceita para as lectinas foi proposta por Kennedy et al. (1995).
Estes autores apresentam essas moléculas como uma classe de proteínas de origem não
imunológica que reconhecem carboidratos, livres ou conjugados a superfícies celulares,
através de seus sítios de ligação reversível.
Peumans e Van Damme (1998; 1995) definiram, de forma mais abrangente, as lectinas
de plantas como todas as proteínas que possuem no mínimo um domínio não-catalítico que se
liga reversivelmente a um mono ou oligossacarídeo específico, estendendo o conceito para
proteínas que se comportam de forma completamente diferente com relação às suas
propriedades de aglutinação e/ou precipitação de glicoconjugados.
1.1.2 Distribuição
As primeiras investigações a respeito das lectinas indicaram sua presença em plantas,
tanto que elas foram inicialmente chamadas por nomes que mostravam sua origem vegetal.
6
No entanto, hoje é reconhecida a larga distribuição dessas moléculas na natureza e são já
encontradas nos mais diversos organismos.
Lectinas de Fungos e Bactérias
Dentre os microrganismos, os fungos se destacam muitíssimo nas pesquisas
envolvendo o isolamento e caracterização de novas lectinas, presentes em espécies produtoras
de corpos de frutificação ou cogumelos (Li et al., 2008; Liu et al., 2008; Wälti et al., 2008;
Goldstein et al., 2007; Jung et al., 2007; Thakur et al., 2007; Candy et al., 2003; Trigueros et
al., 2003; Wang; Ng, 2003a; Wang et al., 2003; Kawagishi et al., 2001; Mo et al., 2000) ou,
mais raramente, em leveduras (Al-Mahmood et al., 1988). Eles representam uma extensa
fonte biológica para muitos grupos de lectinólogos em todo o mundo. Mas além dos fungos,
também alguns outros microrganismos como as bactérias e cianobactérias têm sido avaliadas
quanto à detecção e obtenção de lectinas (Syed et al., 1999; Yamaguchi et al., 1999;
Yamaguchi et al., 1998), porém com menor representatividade.
Lectinas Animais
A presença das lectinas no corpo dos animais invertebrados ocorre em representantes
de quase todos os filos; elas são encontradas muito freqüentemente na hemolinfa destes
organismos, mas também presentes em fluido celômico. Dentre muitas lectinas isoladas de
invertebrados, alguns exemplos são aquelas de protozoários (Babal; Russel, 1999), insetos
(Ourth et al., 2005; Pace et al., 2002; Chen et al., 1999), moluscos (Takahashi et al., 2008;
Banerjee et al., 2004), crustáceos (Sun et al., 2008; Sun et al., 2007; Yang et al., 2007;
Alpuche et al., 2005; Nagai et al., 1999), pepinos-do-mar (Gowda et al., 2008a), poliquetas
(Molchanova et al., 2007) e esponjas (Moura et al., 2006).
Em animais vertebrados, as lectinas têm sido isoladas e/ou caracterizadas de bovinos
(Ye; Ng, 2000), de peixes (Bazil; Entlicher, 1999; Murayama et al., 1997), de anfíbios
(Lerivray et al., 1985) e outros organismos. No homem em especial, existem hoje inúmeras
7
lectinas já bem caracterizadas, presentes em diferentes tecidos e células do corpo, como no
pulmão (Sorensen et al., 2007; Kishore et al., 2006; Dunphy et al., 2002), no soro (Wallis,
2007; Bouwman et al., 2006), em placenta (Soilleux; Coleman, 2003), em dendritos
(Kanazawa 2007; Kanazawa et al., 2004) entre outras.
Lectinas Vegetais
Lectinas são comumente detectadas em plantas, em especial em sementes de
representantes da família Leguminosae (Spilatro et al., 1996). Os vegetais têm constituído
uma fonte rica de lectinas, servindo como principais materiais de análise, objetivando o
isolamento dessas moléculas.
Em geral, a maior fonte de lectinas vegetais são as sementes, nas quais essas
moléculas podem representar um percentual significativo da matéria seca (Lis; Sharon, 1981).
Sementes quiescentes constituem a principal fonte de lectinas de leguminosas, podendo
corresponder a 10 % da proteína total presente nesse tecido (Sharon; Lis, 1990). No entanto, a
localização e a maior quantidade de lectinas nas plantas não se restringe a um só tecido, nem a
maior concentração está necessariamente nas sementes. Outros tecidos de muitos vegetais
apresentam-se como principais fontes de lectinas. Em Bauhinia monandra, por exemplo, as
folhas constituem um dos principais tecidos que são fontes de purificação lectínica (Coelho;
Silva, 2000).
Muitas lectinas são freqüentemente detectadas e purificadas de sementes (Singha et
al., 2007; Sitohy et al., 2007; Susseeland et al., 2007; Konozy et al., 2003; Freire et al., 2002;
Rego et al., 2002; Machuka et al., 1999; Cavada et al., 1998; Gupta; Srivastava, 1998;
Moreira et al., 1998) justamente por esse ser um tecido geralmente rico na sua presença. No
entanto, elas também são detectadas em outros tecidos ou órgãos vegetais, embora de forma
menos freqüente, como em cascas de árvores (Wititsuwannakul et al., 1998), no cerne (Sá et
al., 2008a), em folhas (Rameshwaram; Nadimpalli, 2008; Ooi et al., 2004; Coelho; Silva,
8
2000), em frutos (Wang; Ng, 2006; Benito et al., 1998; Peumans et al., 1998), em raízes
(Naeem et al., 2001), em tubérculos (Kaur et al., 2006), em bulbos (Bertrand et al., 1998;
Parisi et al., 2008), em rizomas (Chu; Ng, 2006; Kaur et al., 2005; Citores et al., 1997;
Peumans et al., 1997), em coleóptilos (Martinez; Cordoba, 2000), em cotilédones (Oliveira et
al., 2002; Gupta; Srivastava, 1998; Nomura et al., 1998), no látex de algumas espécies
(Seshagirirao; Prasad, 1995; Stirpe et al., 1993) e outras partes dos vegetais.
Espécies criptogâmicas também têm sido exploradas quanto ao isolamento de lectinas,
especialmente as algas (Leite et al., 2005; Ambrosio et al., 2003; Hori et al., 2000; Sato et al.,
2000; Sampaio et al., 1998a; Sampaio et al., 1998b;) e, em menores proporções, os liquens
(Elifio et al., 2000; Molina; Vicente, 2000; Lehr et al., 1995; Kardish et al., 1991; Ingram,
1982; Lockhart et al., 1978; Howe; Barrett, 1970; Barrett; Howe, 1968; Estola; Vartia, 1955).
1.1.3 Detecção e Especificidade
As lectinas são, em sua maioria, di ou polivalentes e são capazes de formar pontes
entre carboidratos ou glicoproteínas que se apresentam em solução ou estão ligadas à
membrana celular (Flemming et al., 1992). Devido a esta habilidade, a presença de lectinas
numa amostra pode ser facilmente detectada a partir de ensaios de aglutinação, nos quais estas
interagem com células, através de seus sítios de ligação, formando diversas ligações
reversíveis entre células. O ensaio de hemaglutinação (Figura 1) é o mais comumente
utilizado por promover a fácil visualização desta propriedade aglutinante de eritrócitos pelas
lectinas. Os eritrócitos utilizados no ensaio podem ser de origem humana ou de outros
animais, tratados enzimaticamente (Jung et al., 2007; Leite et al., 2005) ou quimicamente
(Coelho; Silva, 2000; Nomura et al., 1998) assim como não tratados (Mo et al., 2000;
Sampaio et al., 1998a; Sampaio et al., 1998b; Wititsuwannakul et al., 1998).
9
Figura 1 – Ensaio de Hemaglutinação para detecção de lectinas.
Landsteiner e Raubitscheck (1908) observaram que vários extratos de sementes
apresentavam diferentes atividades hemaglutinantes com eritrócitos de diferentes fontes
animais e que aglutininas vegetais eram específicas para determinados tipos sanguíneos. Boyd
e Reguera (1949), estudando a aglutinina de Phaseolus limenses, descobriram sua
especificidade para eritrócitos do tipo A, determinando que algumas aglutininas têm
especificidade para determinado grupo do sistema ABO. Portanto, lectinas podem apresentar
especificidade para eritrócitos de diferente origem animal ou de diferente tipagem, como a
lectina de Zizyphus mauritiana (Gupta; Srivastava, 1998) que só aglutina eritrócitos humanos,
as lectinas de Charybdis japonica (Umetsu, 1991) e do cogumelo Marasmius oreades (Winter
et al., 2002) específicas para eritrócitos humanos tipo B, e a lectina de Tachypleus tridentatus
(Nagai, 1999) específica para eritrócitos humanos tipo A. Diferentemente, uma lectina
fúngica da espécie Cordyceps militaris, denominada CML, aglutina eritrócitos de
camundongos e ratos, mas não é capaz de aglutinar eritrócitos do grupo ABO (Jung et al.,
2007); também uma lectina de Gracilaria ornata (GOL) aglutina eritrócitos animais (de
coelho e de galinha), mas não de humanos (Leite et al., 2005). Outras lectinas, no entanto, são
Lectina
Eritrócito
10
caracterizadas como não específicas para grupos sanguíneos (Liu et al., 2008; Banerjee et al.,
2004).
A detecção de lectinas através do ensaio de hemaglutinação é confirmada pelo
fenômeno de inibição desta hemaglutinação (Figura 2) na presença de um (ou mais)
carboidrato(s) em concentração determinada na solução do ensaio. Outra forma de avaliar a
presença de lectinas numa amostra é através de ensaios de precipitação de polissacarídeos ou
glicoproteínas (Goldstein et al., 2007; Moreira et al., 1998; Yamaguchi et al., 1998).
Figura 2 – Ensaio de Inibição da Hemaglutinação lectínica.
De acordo com Sharon e Lis (1990) algumas lectinas apresentam interações mais
fortes com oligossacarídeos em comparação com monossacarídeos, outras são quase
exclusivas para oligossacarídeos. Assim, as lectinas podem ser classificadas com
especificidade para monossacarídeo ou para oligossacarídeo. A determinação da
especificidade de uma lectina é dada pelo monossacarídeo que, em menor concentração,
possua maior habilidade para inibir sua atividade de hemaglutinação ou de precipitação de
polissacarídeos ou glicoproteínas; no entanto, algumas lectinas não apresentam um
Lectina
Eritrócito
Carboidrato
11
monossacarídeo inibidor e são inibidas apenas por oligossacarídeos (Wälti et al., 2008),
glicoproteínas e/ou polissacarídeos (Thakur et al., 2007).
Muitas lectinas de plantas ou mesmo de outros seres podem ser inibidas por mono ou
dissacarídeos, como é o caso da lectina de ovos do peixe Scomberomorous niphonius, uma
lectina representante da família das lectinas animais ligadoras de raminose, um
monossacarídeo (Terada et al., 2007), e de lectinas dos cogumelos Agrocybe cylindracea,
específica para lactose (Liu et al., 2008) e Lyophyllum decastes, com especificidade para
galabiose, um dissacarídeo raro em tecidos humanos (Goldstein et al., 2007); geralmente as
concentrações de tais carboidratos necessárias para inibição são relativamente altas, quando
comparadas às concentrações de oligossacarídeos complexos, inibidores de outras lectinas.
Essa elevada capacidade de reconhecer oligossacarídeos como inibidores é devido ao fato de
que o sítio de ligação das lectinas é mais complementar para oligossacarídeos (Peumans; Van
Damme, 1998).
1.1.4 Características Estruturais
A especificidade de lectinas de plantas a carboidratos é primeiramente determinada
pela estrutura tridimensional dos seus sítios de ligação, que se apresentam conservados a nível
aminoacídico, dentro de famílias de lectinas (Peumans; Van Damme, 1998). Essas moléculas
exibem uma elevada similaridade em seus resíduos de aminoácidos, incluindo aqueles
envolvidos na ligação a monossacarídeos e a maioria dos que coordenam os íons metálicos
necessários à integridade das subunidades e ao correto posicionamento dos resíduos para a
ligação (Sharon, 1993).
As diferenças estruturais entre as lectinas ocorrem desde a estrutura primária até o
último grau de organização molecular; elas podem ser diferentes na seqüência aminoacídica,
na variação do número de subunidades por molécula e na natureza dos polipeptídeos. Pontes
12
dissulfeto, pontes de hidrogênio e também as interações hidrofóbicas podem estar presentes
na associação de subunidades (Kennedy et al., 1995); as interações entre as subunidades
parecem desempenhar um papel dominante na estabilidade dessas proteínas (Mitra et al.,
2002).
As especificidades e afinidades dos sítios associados são alcançadas principalmente
por pontes de hidrogênio, com a ajuda de forças de van der Walls e interações hidrofóbicas
com resíduos de aminoácidos aromáticos que estão próximos às porções hidrofóbicas de
monossacarídeos (Sharon, 1993), contribuindo para a estabilidade e especificidade dos
complexos formados.
Algumas lectinas apresentam íons metálicos ligados à sua estrutura; tais ligações são
coordenadas por moléculas de água, que também servem para mediar interações das lectinas
com carboidratos (Sharon; Lis, 2002). As lectinas podem conter de 2 a 12 sítios de interação,
dependendo da natureza da molécula e do seu estado de oligomerização (Balzarini, 2006).
Hoje, simulações de dinâmica molecular apresentam lectinas estruturalmente flexíveis
às diferenças experimentais de análise, como moléculas adaptáveis. Estes estudos comprovam
que a presença de íons divalentes no meio pode determinar se há ou não interação da lectina
com o carboidrato (a concentração pode determinar a reunião de monômeros de carboidratos
formando micelas no sítio hidrofóbico da lectina) e se esta é melhorada ou não por um íon
específico; o complexo de ligação das moléculas é estabilizado por muitas pontes de
hidrogênio, ou pelo menos por uma ponte hidrogênio. Esses ensaios demonstram que as
interações eletrostáticas específicas e favoráveis entre os resíduos de aminoácidos da lectina e
os monômeros do ligante facilitam a ligação do complexo; as interações específicas (como
pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas) ou não específicas (interações de van der
Waals) são as principais contribuições de força para a estabilidade do complexo molecular
formado (Konidala; Niemeyer, 2007).
13
1.1.5 Classificação
Lectinas de Fungos e Bactérias
Lectinas de bactérias são raramente isoladas e não se tem relatos sobre sua
classificação; uma lectina da cianobactéria Microcystis viridis é chamada de lectina ligadora
de manana, por apresentar afinidade por esse tipo de polímero (Yamaguchi et al., 1999). Os
fungos apresentam lectinas, as quais podem classificadas de acordo com a estrutura
molecular; por exemplo, a lectina de Psathyrella velutina é chamada lectina do tipo integrina,
por apresentar similaridades estruturais com o domínio extracelular dessa classe de moléculas
de adesão celular (Cioci et al., 2006). Mas as lectinas de fungos também podem ser
classificadas como as lectinas animais, ainda de acordo com sua estrutura, como é o caso da
lectina de Coprinopsis cinerea que é considerada uma lectina relacionada às galectinas, classe
de lectinas caracterizada por apresentar muitos resíduos conservados (Wälti et al., 2008).
Finalmente, várias lectinas de fungos têm sido classificadas de acordo com a especificidade
(como as lectinas vegetais), em lectinas arabinose (Wang; Ng, 2005), N-acetil-D-
galactosamina (Chumkhunthod et al., 2006), melibiose e xilose (Zheng et al., 2007)
específicas, ou ligadoras de lactose (Liu et al., 2008).
Lectinas Animais
Nos animais vertebrados, estão presentes duas classes de lectinas, com base em sua
localização: as lectinas integrais de membrana e as lectinas solúveis presentes nos fluidos
intra e intercelulares (Barondes, 1984). Assim, são lectinas integrais de membrana aquelas
que se localizam dentro de membranas como constituintes estruturais; essa classe é
constituída de lectinas que diferem quanto à especificidade a carboidratos e a propriedades
físico-químicas. Já as lectinas do meio extracelular são solúveis, ou seja, podem mover-se
livremente nos meios intra e intercelulares.
14
Drickamer (1988) subdividiu lectinas animais em dois grupos: as lectinas tipo-C (Ca++
dependentes, com especificidades diversas) e as lectinas tipo-S (tiol dependentes). Sharon
(1993) inclui no grupo das lectinas tipo-C, os receptores endocíticos tais como lectinas
hepáticas; os receptores macrofágicos que podem atuar na fagocitose de microorganismos
patogênicos; as selectinas que medeiam a adesão de leucócitos às células endoteliais e os
carreiam para tecidos linfóides e sítios de inflamação; e moléculas secretadas presentes na
matriz extracelular e no soro.
Gabius (1997) apresentou as lectinas de origem animal divididas em cinco principais
grupos, de acordo com seus caracteres estruturais. São eles: lectinas tipo-C; lectinas tipo-I;
galectinas (ou tipo-S); pentranxinas e lectinas tipo-P. Lectinas tipo-C são aquelas que
dependem da presença de íons Ca2+ para ligarem-se ao carboidrato, e que possuem domínios
de reconhecimento a carboidratos conservados. Lectinas tipo-I são aquelas que possuem
domínios de reconhecimento a carboidratos (CRD) semelhantes a imunoglobulinas. As
galectinas ou lectinas tipo-S são dependentes de tiol, possuem também CRD conservados e
são específicas para β-galactosídeos. As pentranxinas são as lectinas que apresentam um
arranjo pentamérico de subunidades. As lectinas tipo-P são aquelas constituídas de CRD
similares, mas não bem definidos; são específicas para glicoproteínas contendo manose-6-
fosfato.
Lectinas Vegetais
As lectinas de plantas têm sido mais recentemente classificadas dentro de sete famílias
de proteínas relacionadas entre si do ponto de vista estrutural e evolutivo (Van Damme et al.,
1998); são elas as lectinas de floema de cucurbitáceas, lectinas quitina-ligantes contendo
domínios de heveína, lectinas de leguminosas (Garcia-Pino et al., 2006), proteínas
inativadoras de ribossomos tipo 2 (Stirpe et al., 2007; Pelosi et al., 2005; Hartley; Lord 2004),
lectinas manose-ligantes de monocotiledôneas, lectinas relacionadas à jacalina (Barre et al.,
15
2004; Rougé et al., 2003) e a família das amarantinas. As três últimas compartilham
características estruturais semelhantes e apresentam exclusivamente β estrutura (Wright,
1997). A família de lectinas de leguminosas é a mais bem estudada e caracterizada.
Baseando-se na estrutura global das lectinas de plantas, estas podem ser divididas
(Figura 3) em quatro principais tipos distintos: as merolectinas, as hololectinas, as
quimerolectinas (Peumans; Van Damme, 1995) e as superlectinas (Van Damme et al., 1996).
As merolectinas são proteínas formadas exclusivamente por um domínio de ligação a
carboidrato; são proteínas pequenas, formadas por um único polipeptídeo e, por conta de sua
natureza monovalente, são incapazes de precipitar glicoconjugados ou aglutinar células. As
hololectinas também são exclusivamente formadas de domínios de ligação a carboidratos,
mas contêm dois ou mais destes domínios que são idênticos ou muito semelhantes; este grupo
compreende todas as lectinas que possuem múltiplos sítios de ligação, sendo capazes de
aglutinar células ou precipitar glicoconjugados. As quimerolectinas correspondem à fusão de
proteínas contendo um domínio de ligação a carboidrato com um domínio não relacionado
(que possui uma atividade catalítica definida ou não apresenta atividade biológica) que atua
de forma independente. As superlectinas consistem de moléculas com pelo menos dois
domínios de interação a carboidratos distintos.
Figura 3 – Estrutura de lectinas vegetais com base em seus domínios funcionais.
Merolectinas Hololectinas Quimerolectinas Superlectinas
16
As proteínas vegetais ligantes de carboidratos podem ainda ser classificadas de acordo
com sua especificidade de interação, em lectinas manose/glicose (Nomura et al., 1998;
Correia; Coelho, 1995), manose/maltose, galactose/N-acetilgalactosamina, N-
acetilglicosamina/(N-acetilglicosamina)n, galactose (Coelho; Silva, 2000; Machuka et al.,
1999; Cavada et al., 1998), manose (Koike et al., 1995; Mo et al., 1993), fucose, ácido
siálico, entre outras.
1.1.6 Papéis Fisiológicos
Com base nas suas propriedades gerais e localização em diferentes tecidos, muitas
funções fisiológicas para lectinas já foram sugeridas. A existência de sítios ligantes a
carboidratos específicos, característica principal das lectinas é, sem dúvida, um fator
importante para a determinação do seu papel fisiológico.
Lectinas de Fungos e Bactérias
As lectinas em microorganismos parecem desempenhar vários papéis importantes;
parecem atuar na ligação destes às células hospedeiras, parecem atuar como determinantes no
reconhecimento em processos imunológicos, fagocitose e adesão celular (Ponchel; Irache,
1998).
Lectinas de superfície bacteriana e estruturas semelhantes a lectinas parecem estar
envolvidas na iniciação da infecção mediando a aderência bacteriana a células epiteliais,
como ocorre em infecções dos tratos urinário e gastrointestinal. O padrão de distribuição de
actinomicetes contendo lectinas galactose (lactose)-específicas na superfície epitelial oral
apóia a hipótese de que essas lectinas são os principais mediadores da aderência, colonização
e estabelecimento de comunidades microbianas específicas na cavidade oral (Lis; Sharon,
1986a).
17
Lectinas de fungos podem estar envolvidas na biossíntese da parede celular e
diferenciação do micélio, na adesão de esporos de espécies patogênicas a insetos e a
nematodos, no reconhecimento fungo-micoparasitas (Kellens; Peumans, 1990), atuar como
proteínas estoque, e apresentar atividade pesticida (Trigueros et al., 2003). A lectina presente
em Rhizoctonia solani parece desempenhar um papel fisiológico de proteína de estocagem,
além de atuar no reconhecimento específico desse fungo aos micoparasitas Trichoderma
(Kellens; Peumans, 1990).
Em liquens, tem sido sugerido que as lectinas de origem fúngica podem estar
envolvidas no estabelecimento da simbiose entre o fungo e a alga, servindo como fator de
reconhecimento interespecífico (Elifio et al., 2000; Molina; Vicente, 2000; Kardish et al.,
1991; Petit et al., 1983; Petit, 1982; Lockhart et al., 1978). Lectinas micobiontes têm sido
implicadas no reconhecimento do cianobionte por um micobionte. Porém, pesquisas
englobando observações diretas, experimentos sobre lectina-ligante e análises de intron de
tRNALeu indicam a especificidade cianobionte-micobionte (Raí; Bergman, 2002).
Lectinas Animais
As lectinas encontradas em tecidos de animais parecem estar envolvidas com o
mecanismo de endocitose e translocação intracelular de glicoproteínas (Yamashita et al.,
1999), na ligação a glicoconjugados (Barondes, 1984), com o processo de apoptose
(Rabinovich et al., 1999), parecem ainda possuir papéis na defesa contra microorganismos, na
regulação dos processos de migração e adesão celular e no processo de ligação de bactérias a
células epiteliais (Rudiger et al., 2000; Ponchel; Irache, 1998). Possuem também uma função
no sistema imune de aves e mamíferos (Holmskov et al., 1994).
Em animais vertebrados, a classe de lectinas integrais de membrana parece estar
envolvida com a ligação de glicoconjugados a membranas, na superfície celular ou no interior
de vesículas, resultando na localização desses glicoconjugados em sítios específicos da
18
membrana (endocitose), ou no transporte dos mesmos para outros compartimentos celulares
(translocação intracelular) (Barondes, 1984); já a classe de lectinas solúveis move-se nos
compartimentos aquosos dentro e entre as células, interagindo com glicoconjugados solúveis
e ligados a membranas. O fato de que essas proteínas parecem estar inicialmente concentradas
no interior das células, e serem secretadas por estas, sugere que tais moléculas possuem uma
função comum de ligar-se a glicoconjugados complementares presentes sobre e em torno das
células que as liberam (Barondes, 1984).
Dentre as lectinas tipo-C, as moléculas mais estudadas são as proteínas manose-
específicas presentes no soro de mamíferos, que atuam contra patógenos; elas se ligam a
oligomanosídeos da superfície celular de bactérias e fungos, neutralizando-os por lise celular
ou opsonização (Sharon, 1993). Já as lectinas dessa classe que atuam como receptores,
chamadas CTLR, funcionam como moléculas de sinalização da superfície celular, capazes de
reconhecer uma gama de moléculas de patógenos altamente conservadas e estimulam uma
resposta imune adequada (Willcocks et al., 2006).
Outros organismos, tais como insetos e protozoários (animais invertebrados),
apresentam em suas estruturas celulares as lectinas; em alguns protozoários essas proteínas
parecem estar relacionadas com o mecanismo de reconhecimento desses organismos aos seus
hospedeiros parasitados. Ensaios imunohistoquímicos e imunocitoquímicos com tecidos de
bovinos para detectar lectinas de parasitas Tritrichomonas sp e seus sítios de ligação nos
tecidos, comprovam a influência da lectina como mediadora da adesão de tais parasitas ao
tecido hospedeiro (Babal; Russel, 1999).
Lectinas Vegetais
Lectinas vegetais podem desempenhar importantes papéis tais como proteínas de
reserva de nitrogênio, como fatores de reconhecimento específico, como proteínas envolvidas
no mecanismo de defesa contra vírus e microrganismos fitopatogênicos, insetos, nematóides e
19
animais herbívoros predadores interagindo com glicoconjugados presentes nesses organismos
e interferindo no crescimento, desenvolvimento e fisiologia dos mesmos (Ripoll et al., 2003;
Wang; Ng, 2003b; Chen et al., 2002; Freire et al., 2002; Bandyopadhyay et al., 2001;
Machuka et al., 1999; Ponchel; Irache, 1998; Peumans; Van Damme, 1995). Lectinas de
plantas podem ainda atuar como mediadores da simbiose planta-microrganismo (Limpens;
Bisseling, 2003; Naeem et al., 2001; Rudiger, 1998).
Outras funções já foram indicadas para lectinas, como por exemplo, fenômenos
relacionados à defesa e/ou à regulação e sinalização celulares (Jiang et al., 2006), moléculas
participantes na organização celular, na embriomorfogênese, na fagocitose, na proteção
celular, no mecanismo de crescimento da parede celular, na mitose induzida, no
reconhecimento polínico e, especialmente, são consideradas ativamente envolvidas no
transporte de carboidratos e fixação destes nos tecidos vegetais. Através de análise
ultraestrutural, diferentes formas moleculares, isolectinas que se diferenciam na
especificidade de ligação e no padrão de glicosilação, têm se mostrado presentes num mesmo
compartimento celular sugerindo diferentes funções para essas moléculas dentro da organela
(Santos et al., 2004).
O metabolismo de lectinas parece estar relacionado com o ciclo de vida do vegetal,
uma vez que o desaparecimento destas moléculas nos órgãos de reserva é, em geral,
semelhante ao padrão de degradação protéica.
As diferentes especificidades de ligação a carboidratos de diferentes lectinas para
reconhecer uma grande diversidade de carboidratos ou glicoproteínas presentes em
microorganismos e outros animais, assim como sua dupla função de estocagem/defesa contra
predadores podem ser consideradas características resultantes de uma grande evolução
adaptativa de plantas (Peumans; Van Damme, 1998).
20
As lectinas já foram ditas como únicas proteínas de origem vegetal com capacidade
para reconhecer e se ligar a glicoconjugados presentes na superfície de microorganismos ou
no trato intestinal de insetos e mamíferos herbívoros (Peumans; Van Damme, 1998). Tais
moléculas parecem desempenhar um importante papel de proteção do vegetal contra esses
organismos predadores, afetando o crescimento e desenvolvimento de insetos e apresentando
atividades tóxicas em animais herbívoros. Algumas lectinas já são conhecidas quanto a sua
toxicidade, tais como a lectina de Sambucus sieboldiana (Rojo et al., 1997), a aglutinina de
Phaseolus vulgaris (PHA), a lectina de Robinia pseudoacacia e a lectina de Sambucus nigra
(Peumans; Van Damme, 1998). As lectinas de arroz, de Urtica dioica e a WGA (wheat germ
agglutinin) apresentam uma atividade inseticida sobre Callosobruchus maculatus;
experimentos mostraram que estas lectinas atuam causando altos níveis de mortalidade no
inseto (Huesing et al., 1991). Este fato é um indicativo de que tais moléculas atuam de fato,
no mecanismo de proteção contra o ataque de predadores.
De acordo com alguns estudos, lectinas de plantas são potentes inibidores in vitro de
viroses animais e de humanos. Dessa forma, algumas delas podem ter um papel antiviral
indireto; por exemplo, a presença de lectinas inseticidas pode prevenir e/ou reduzir a difusão
de doenças virais transmitidas por insetos (Peumans; Van Damme, 1995).
Lectinas de plantas possuem a capacidade de se ligarem especificamente a hifas
fúngicas, e atuam impedindo o consumo de nutrientes e a incorporação de precursores
necessários para o crescimento do fungo. Atuam ainda sobre a germinação de esporos
fúngicos, provavelmente num estágio muito inicial do processo, inibindo-o, de modo que há
um prolongamento do período latente que precede a germinação (Lis; Sharon, 1981).
21
1.1.7 Lectinas e Evolução
Dentre os argumentos indicativos de que as lectinas possuem um papel de defesa nas
plantas, o mais importante é a capacidade de ligação dessas moléculas a glicoconjugados de
outros organismos. Tais moléculas, em geral, se ligam a carboidratos simples; no entanto, elas
possuem uma afinidade muito alta por oligossacarídeos que são incomuns ou totalmente
ausentes em plantas. Exemplos deste fato são as lectinas de plantas quitina-ligantes, como a
lectina de Viscum album (Peumans et al., 1996), e as lectinas ácido-siálico-ligantes. As
primeiras reconhecem um carboidrato típico da parede celular de fungos e do exoesqueleto de
invertebrados; as segundas reconhecem um carboidrato que é ausente em plantas, mas que é o
principal componente de glicoproteínas animais. Além dessa capacidade característica de
ligação, lectinas de plantas possuem estabilidade elevada, mesmo quando submetidas a
condições desfavoráveis como mudanças de pH, de temperatura ou exposição a proteases de
insetos e animais. Essas moléculas parecem ainda estar preferencialmente associadas com
determinadas partes vegetais que são mais suscetíveis ao ataque de outros organismos
(geralmente órgãos de estocagem e sementes) e que necessitam de um sistema de defesa
(Peumans; Van Damme, 1995).
As lectinas, em especial aquelas de sementes e outros tecidos de estocagem, parecem
desempenhar um papel como proteínas de reserva devido a suas propriedades bioquímicas,
sua abundância e seu papel na regulação do desenvolvimento vegetal. No entanto, como
proteínas de reserva, essas moléculas parecem ainda desempenhar uma dupla função: elas
atuam como proteínas de defesa, sendo tóxicas contra diversos organismos predadores, ao
mesmo tempo em que estocam nitrogênio. As diferentes especificidades de ligação a
carboidratos de diferentes lectinas para reconhecer uma grande diversidade de carboidratos ou
glicoproteínas presentes em microrganismos e outros animais, assim como sua dupla função
de estocagem e defesa contra predadores, podem ser consideradas características resultantes
22
de uma grande evolução adaptativa de plantas (Peumans; Van Damme, 1998). Um estudo
estrutural da lectina de sementes de Parkia platycephala demonstrou um arranjo circular de
domínios do tipo β-prisma que conferem adaptabilidade à molécula; sua ligação ao
carboidrato é flexível e a estrutura cíclica da molécula indica uma evolução convergente na
construção de lectinas relacionadas com funções de defesa do hospedeiro contra patógenos e
ataque aos organismos predadores (del Sol et al., 2005).
1.1.8 Propriedades Biológicas e Aplicações
As lectinas, por suas propriedades características, principalmente por sua habilidade
em ligar glicoconjugados, destacam-se como importantes ferramentas em pesquisas
englobando diversas áreas da ciência, em especial, na Bioquímica, Biologia Celular e
Molecular, Imunologia, Farmacologia, Medicina e em Análises Clínicas. Tais moléculas
desempenham os mais variados efeitos sobre as células, dentre os quais aglutinação,
estimulação mitogênica, redistribuição de componentes de superfície celular, modificação da
atividade de enzimas de membrana, inibição de crescimento fúngico e bacteriano, toxicidade,
imunomodulação, entre outros (Li et al., 2008; Takahashi et al., 2008; Sitohy et al., 2007;
Kaur et al., 2006).
As lectinas, em especial aquelas com especificidade a manose ou a N-acetil-
glicosamina, apresentam uma habilidade anti-HIV (Human Immunodeficiency Virus)
marcante em ensaios de cultura de células (Molchanova et al., 2007), não somente inibindo a
infecção celular como também prevenindo a infecção viral de células infectadas para
linfócitos T não infectados (Balzarini, 2006). Algumas lectinas podem também atuar inibindo
a atividade da transcriptase reversa HIV-1 (Li et al., 2008; Zheng et al., 2007; Wang; Ng,
2006). Uma ação aparentemente contrária em relação aos vírus é observada na aglutinina de
Dolichos biflorus e a aglutinina de soja, que podem promover o aumento da infecção de
23
algumas células por determinados vírus, quando estas são tratadas antes ou durante a
inoculação viral (Ogino et al., 1999).
Ações de diferentes lectinas contra células bacterianas (Gowda et al., 2008b;
Takahashi et al., 2008; Wellman-Labadie et al., 2008; Santi-Gadelha et al., 2006;
Gaidamashvili; van Staden, 2002) e protozoários (Moura et al., 2006), contra fungos (Sitohy
et al., 2007; Trindade et al., 2006; Yan et al., 2005; Freire et al., 2002) ou nematodos (Ripoll
et al., 2003) têm sido avaliadas, indicando que estas proteínas podem ser viáveis na
terapêutica clínica do futuro.
Lectinas apresentam atividade mitogênica sobre células mononucleares sanguíneas, e
antiproliferativa sobre linhagens celulares de câncer humano (Kaur et al., 2006; Kaur et al.,
2005), como células de leucemia (L1210 e M1) e de hepatoma (Hep G2) (Ngai; Ng, 2004). A
atividade mitogênica é uma propriedade comum para muitas lectinas, especialmente àquelas
de origem fúngica, atuando sobre esplenócitos (Li et al., 2008; Wong et al., 2008; Zheng et
al., 2007; Wang; Ng, 2006; Ho et al., 2004; Ngai; Ng, 2004) e linfócitos T humanos
(Banerjee et al., 2004; Maciel et al., 2004), entre outros tipos celulares.
A ação antitumoral de lectinas tem sido observada sobre o sarcoma 180 (Li et al.,
2008; Andrade et al., 2004) e sobre algumas linhagens de células tumorais humanas (Liu et
al., 2006; Karasaki et al., 2001). O efeito modulador da resposta imune é uma propriedade
observada em algumas lectinas (Gavrovic-Jankulovic et al., 2008; Ghosh; Maiti, 2007).
Outras lectinas, em especial as lectinas de plantas e, dentre elas, principalmente as
RIPs tipo 2, podem apresentar atividade citotóxica in vitro, induzindo apoptose (Stirpe et al.,
2007). Exemplos de lectinas comerciais com ação citotóxica para células de mamíferos são a
ricina, a abrina e, em menor intensidade, a aglutinina de Canavalia ensiformes
(Concanavalina A - Con A) e a WGA, entre outras. A ação tóxica de lectinas sobre células é
geralmente seletiva; elas são muito mais ativas sobre células transformadas, que são mais
24
sensíveis aos seus efeitos, quando comparadas a células normais (Lis; Sharon, 1986b). A
sielboldina-b, uma lectina presente em Sambucus sieboldiana, foi avaliada quanto a sua
toxicidade in vivo em camundongos suíssos, e citotoxidade in vitro sobre células HeLa
(linhagem de célula cancerosa cujo nome deriva de sua doadora involuntária, Henrietta
Lacks); não apresentou ação tóxica in vivo quanto à síntese protéica, mas foi fortemente
citotóxica in vitro, com a habilidade de uma proteína ribossomo-inativadora (Rojo et al.,
1997). Outra lectina, isolada de Viscum album, também apresentou propriedade citotóxica
sobre células Molt4 de humanos, uma linhagem celular derivada de células T de leucemia
(Peumans et al., 1996). A lectina de Phaseolus acutifolius foi testada in vivo em camundongos
e mostrou possuir baixa toxicidade, podendo ser utilizada em estudos carcinogênicos que
possam levar a terapia do câncer (Reynoso-Camacho et al., 2003).
As lectinas, além de seus efeitos sobre células, também têm habilidade para atuar
como moléculas inseticidas contra uma variedade de espécies (Sá et al., 2008a; Sá et al.,
2008b; Kaur et al., 2006; Dutta et al., 2005; Leite et al., 2005) sendo seus genes utilizados na
produção de transgênicos de plantas de interesse econômico (McCafferty et al., 2008; Ramesh
et al., 2004; Kanrar et al., 2002).
Uma lectina de Galanthus nivalis, GNA, foi fusionada a uma neurotoxina de aranha,
SFI1 (Segestria florentina toxin 1) inseto-específica; a lectina atuou como carreadora da
neurotoxina, levando-a para a hemolinfa das larvas de lepidópteros; a fusão SFI1/GNA
mostrou potencial utilização da lectina como pesticida em cultivos de plantas (Fitches et al.,
2004).
Devido ao fato de algumas lectinas possuírem habilidade para mediar mucoadesão,
citoadesão e citoinvasão de drogas (Gabor et al., 2004), essas moléculas têm sido exploradas
quanto à sua utilização em sistemas de liberação de drogas. Nesse sentido, lectinas têm sido
avaliadas em ensaios biotecnológicos; BmoLL (lectina de folhas de Bauhinia monandra) e
25
LCL (lectina de Lens culinaris) foram incorporadas e também adsorvidas na superfície de
nanopartículas, mostrando ser potenciais ferramentas para a utilização dessas nanopartículas
em medicamentos de administração oral com liberação controlada (Rodrigues et al., 2003).
A detecção de glicoproteínas por lectinas envolve a ligação da lectina a um
carboidrato, presente no glicoconjugado de interesse sobre células, seções teciduais ou
isolados. Tal ligação é detectada pela visualização direta através de técnicas utilizando
lectinas marcadas (Tazaki, 1997), ou de forma indireta através da aplicação de técnicas
imunológicas. Lectinas radioativamente marcadas e lectinas conjugadas são reagentes
sensíveis e específicos para detecção de glicoproteínas e outros glicoconjugados presentes em
diferentes substratos (Szöke et al., 2007; Thöm et al., 2007; Beltrão et al., 2003).
Lectinas têm sido utilizadas em Histologia e Patologia como ferramentas em ensaios
citoquímicos, histoquímicos ou imunohistoquímicos para localização de glicoconjugados em
diferentes tecidos animais (Franceschini et al., 2000), para detecção e caracterização de
resíduos glicosilados e diferentes composições de glicoconjugados na superfície de células e
tecidos humanos e animais, relacionadas a muitos estágios fisiológicos e patológicos distintos
(Fiedler et al., 2007; Hemmoranta et al., 2007; Szöke et al., 2007; Thöm et al., 2007; Babál et
al., 2006; Beltrão et al., 2003; Barou et al., 2002; Pedini et al., 2002; Meyer et al., 2000).
Essas proteínas têm sido aplicadas na exploração de tecidos renais de humanos e de outros
animais, e têm fornecido contribuições importantes para o prognóstico e diagnóstico de
doenças em humanos, como o câncer (Danguy et al., 1998; Kabir, 1998), para distinguir o
câncer de próstata e a hiperplasia benigna neste órgão (Basu et al., 2003), para caracterizar e
avaliar o padrão de ligação em tecidos humanos de mama transformados (Beltrão et al.,
1998), para detecção de modificações celulares em vários tecidos (Kunstfeld; Petzelbauer,
2001), como inflamação e alterações associadas à neoplasia (Brinck et al., 1998).
26
As lectinas são também úteis na medicina forense, caracterizando patologias cerebrais
(Ulfig et al., 2004), auxiliando na investigação, prognóstico ou diagnóstico de patologias
cerebrais em circunstâncias de pós-morte em seres humanos (Arendash et al., 2007; Uryu et
al., 2007; Ishikawa et al., 2006; Ulfig et al., 2004; Lefebvre et al., 2003; Minnasch et al.,
2003; Nishi et al., 2003; Liu et al., 2002; Ng’walali et al., 2002; Nishimura et al., 2000;
Cummings et al., 1992) e em animais (Medina-Flores et al., 2004;).
1.1.9 Purificação
Devido à amplitude de propriedades e aplicações, lectinas têm sido purificadas por
métodos convencionais que se baseiam nos seus aspectos moleculares gerais, como proteínas
que são, e seus aspectos particulares, como um grupo de proteínas com afinidade por
carboidratos e glicoconjugados.
O primeiro passo no processo de purificação de lectinas, em especial aquelas de
origem vegetal, é a extração dessas proteínas em solução salina (Kawagishi et al., 2001) ou
solução tampão (Trigueros et al., 2003). Tal solução é misturada ao triturado do vegetal de
forma a constituir um extrato com concentração determinada. O material é submetido à
extração em período de tempo e condições de temperatura definidos, sob agitação constante.
O método de extração utilizando tais soluções resulta num aumento de solubilidade das
proteínas do triturado e, portanto, é um passo importante ao processo de purificação protéica.
O material extraído é filtrado e o extrato sobrenadante é centrifugado em centrífuga
refrigerada para obtenção do extrato bruto, livre do triturado.
Após extração dessas moléculas, em geral é procedida purificação parcial utilizando o
método de precipitação protéica por fracionamento salino com sulfato de amônio (Elifio et al.,
2000); tal processo baseia-se na separação de moléculas de acordo com suas diferenças de
solubilidade. A precipitação utilizando sais neutros é possível porque estes sais, em função de
27
sua força iônica, afetam a solubilidade de proteínas globulares; em concentrações reduzidas,
eles aumentam a solubilidade de proteínas (salificação, ou salting in), mas quando a força
iônica é aumentada, há uma redução da solubilidade protéica e estas podem chegar a ser quase
completamente precipitadas (dessalificação, ou salting out); proteínas precipitadas são
capazes de manter sua conformação nativa e podem ser dissolvidas sem sofrer desnaturação
(Lehninger, 1976). Assim, diferentes fracionamentos são procedidos para purificação parcial
de várias lectinas presentes num extrato, já que proteínas diferentes apresentam reações
diferentes em resposta a concentrações salinas.
As lectinas parcialmente purificadas são geralmente submetidas ao processo de diálise
exaustiva (Plumer, 1978) em membranas seletivas, método baseado na separação de
moléculas por diferenças de peso molecular; as proteínas ficam retidas enquanto que
moléculas menores - como carboidratos ou sais - presentes na amostra passam para a solução
solvente no exterior da membrana.
Geralmente as últimas etapas de isolamento, após extração e precipitação salina,
consistem no emprego de técnicas cromatográficas. Há uma variedade de tais métodos úteis
para purificação de lectinas, entre eles, a cromatografia por troca iônica (Wang et al., 2003), a
cromatografia por exclusão molecular e cromatografia por afinidade (Candy et al., 2003).
Alguns protocolos de purificação podem combinar os três métodos cromatográficos para a
purificação total da lectina (Wang; Ng, 2003a).
A cromatografia por troca iônica possui uma fase estacionária altamente carregada à
qual, solutos ou moléculas (como proteínas) com carga de sinais contrários a esta são
seletivamente adsorvidas da fase móvel. As moléculas adsorvidas podem então ser eluídas,
por deslocamentos com outros íons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior força de
interação com a fase estacionária. Este método de separação baseia-se na adsorção reversível
e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz; essa diferença de afinidade
28
se deve a diferenças de carga, e pode ser controlada por fatores como pH e força iônica
(Spadaro, 1997). A cromatografia por troca iônica está associada à purificação de lectinas, tais
como a de Viscum album (Peumans et al., 1996), e a de Hevea brasiliensis (Wititsuwannakul
et al., 1998); esse método cromatográfico permite também a separação de isoformas de
preparações lectínicas, pela utilização de gradiente salino crescente (Mishra et al., 2004).
Matrizes orgânicas como o dextrano e a agarose podem ser usadas na cromatografia de
troca iônica, porém a mais utilizada é a celulose. A celulose é um biopolímero de glicose que
apresenta ligações cruzadas de pontes de hidrogênio, tendo grupos hidroxílicos que são
facilmente oxidáveis a grupos carboxílicos, sendo esta a razão que capacita à celulose como
trocador (Spadaro, 1997). Dentre os trocadores utilizados, derivados da matriz de celulose,
estão o dietilaminoetilcelulose (DEAE-celulose), um trocador aniônico, e o
carboximetilcelulose (CM-celulose), um trocador catiônico, ambos carregados em pH neutro.
A técnica cromatográfica de exclusão molecular, também conhecida como filtração em
gel, permeação em gel, ou peneira molecular de fusão restrita, promove uma distribuição
seletiva e dinâmica das moléculas entre fases líquidas distintas e dependentes de uma
estrutura estacionária composta por poros de tamanho controlado. Esse tipo de cromatografia,
quando aplicada a uma série homóloga de polímeros, tais como lectinas e misturas de
proteínas, tendo densidade e formas semelhantes é um método importante que pode, de forma
rápida e útil, determinar a massa molecular (Cavada et al., 1998; De Simone et al., 1994) e a
forma destas macromoléculas, permitindo purificá-las (Freire et al., 2002; Cavada et al.,
1998) e também defini-las como estruturas mono, di, tri ou tetraméricas, quando os resultados
são comparados a corridas eletroforéticas (Kawagishi et al., 2001). Uma matriz de exclusão
molecular é composta por um gel constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. As partículas estacionárias
compõem um gel com características de inércia química, estabilidade e baixo teor de íons. O
29
espaço entre as partículas é ocupado pelo líquido que flui pelo material levando, ou não, as
substâncias a serem separadas. A fase estacionária controla o movimento das substâncias que
por ela passam, variando suas velocidades e promovendo a separação (Rothschild, 1997).
Os géis utilizados comumente como matriz de exclusão molecular são dextrano
(Sephadex), os géis de poliacrilamida (Bio-Gel), os géis de agar e agarose, e outros. O
Sephadex, dentre todos eles, é o mais utilizado. Trata-se de um biopolímero (ou seja, um
polissacarídeo) obtido por fermentação da sacarose, pela ação bacteriana; é formado por
unidades de glicose predominantemente unidas por ligações ∝-1-6, apresentando ramificações
que variam entre 1-2, 1-3 e 1-4 (Spadaro; Fonseca, 1997). Seu tratamento com substâncias
químicas produz ligações cruzadas nas cadeias polissacarídicas, fornecendo um material que,
em água, produz um gel com estrutura tridimensional (Rothschild, 1997), útil para sua
utilização em processos de purificação de lectinas.
O princípio da cromatografia por bioafinidade (ou biosseletividade) baseia-se no
isolamento seletivo de macromoléculas biológicas, pela utilização das propriedades dessas
moléculas de se ligarem de forma reversível a ligantes específicos. Esses ligantes são
covalentemente imobilizados à matriz, promovendo uma fase estacionária seletiva. A amostra
é aplicada à coluna; as moléculas sem afinidade passam sem ligar à matriz, enquanto as
moléculas específicas para o mesmo são retidas. Estas podem ser eluídas pela alteração de pH
e/ou força iônica do meio, que tornam o complexo molécula-ligante menos estável levando à
dissociação do mesmo, ou ainda pelo emprego de substâncias com maior afinidade ao ligante
(Spadaro; Fonseca, 1997). No caso de purificação de lectinas, o ligante a ser imobilizado é um
carboidrato ou um glicoconjugado específico. Em alguns tipos de matriz, o ligante não precisa
ser imobilizado, pois já se caracteriza pela própria matriz como é o caso do Sephadex, um
biopolímero produzido pela ação bacteriana sobre a sacarose.
30
Vários suportes podem ser úteis em cromatografia de afinidade, como a matriz de
celulose, a matriz de gel de guar (ou guaran), a agarose, a Sepharose e o dextrano. Essas
matrizes têm sido amplamente utilizadas como processo de purificação de muitas lectinas, tais
como o Sephadex (Bazil; Entlicher, 1999; Gupta; Srivastava, 1998; Moreira et al., 1997) para
lectinas com afinidade por glicose/manose, o gel de guar (Coelho; Silva, 2000; Cavada et al.,
1998; Sampaio et al., 1998a), e a Sepharose (Candy et al., 2003; Arreguín-Espinosa;
Arreguín-Lozano, 1997) ambas para lectinas galactose específicas também para lectinas com
afinidade por galactose. Algumas lectinas são ainda purificadas em suportes de afinidade
contendo glicoconjugados específicos imobilizados, como as lectinas de Ulva lactuca
(Sampaio et al., 1998b) e de Castanea crenata (Nomura et al., 1998).
1.1.10 Caracterização
A caracterização de lectinas envolve, entre outros métodos, o ensaio de
hemaglutinação, utilizado para detecção e útil para caracterizá-las quanto à especificidade
dentro do sistema ABO ou entre eritrócitos de animais. Ensaios de atividade hemaglutinante e
de inibição por carboidratos e/ou glicoconjugados são excelentes meios de caracterização
lectínica, promovendo a descoberta da especificidade de ligação a eritrócitos (Nagai et al.,
1999) a mono, di ou oligossacarídeos e quanto à capacidade de interação da lectina a outras
moléculas como glicoproteínas, glicolipídeos ou polissacarídeos (Machuka et al., 1999;
Gupta; Srivastava, 1998; Moreira et al., 1998; Yamaguchi et al., 1998), contribuindo para a
determinação do suporte de afinidade ideal para a sua purificação.
A determinação da dependência ou não de lectinas por íons metálicos constitui outra
etapa necessária na caracterização, pois algumas lectinas precisam da presença destes íons
para promover sua atividade biológica (Sampaio et al., 1998a). Muitas lectinas são
metaloproteínas; precisam de cátions divalentes tais como Ca2+ e Mn2+ para exibir atividade.
31
A presença de cátions na estrutura da proteína promove termoestabilidade e uma relativa
resistência à ação enzimática. Exemplos de lectinas dependentes de metais são a lectina
isolada de sementes de Dioclea altíssima (Moreira et al., 1997) e a lectina de Pitilota filicina
(Sampaio et al., 1998a).
O teste de temperatura para determinação da estabilidade protéica constitui outro
passo na caracterização. Algumas lectinas são termossensíveis, e outras, termoestáveis; isso
significa que tais proteínas têm sua atividade biológica otimizada em determinadas
temperaturas e ausente em temperaturas desfavoráveis à manutenção da estrutura nativa.
Algumas lectinas apresentam uma atividade acentuada, depois de submetidas a temperaturas
relativamente altas (Correia; Coelho, 1995); outras lectinas, como a lectina do líquen
Dictyonema glabratum (Elifio et al., 2000) e a lectina do fungo Polyporus adusta (Wang et
al., 2003), apresentam uma perda gradual desde temperaturas relativas até a perda total em
valores mais elevados, ou mesmo são extremamente sensíveis, perdendo totalmente a
atividade em temperaturas relativamente baixas (55 °C, Jung et al., 2007; 50 °C, Kawagishi et
al., 2001).
Lectinas podem ser estáveis dentro de diferentes soluções com valores de pH
variáveis, como é observado para as lectinas dos fungos Mycoleptodonoides aitchisonii
(Kawagishi et al., 2001) e Ganoderma capense (Ngai; Ng, 2004), ativas em valores de pH
variando de 4 a 9 e de 4 a 11, respectivamente; esta é uma avaliação importante, uma vez que
estas proteínas devem ser mantidas em soluções que apresentem condições ideais a sua
manutenção nativa e conseqüente utilização nos diferentes experimentos a que podem ser
submetidas. As proteínas em geral podem sofrer desnaturação em pH desfavorável. Por isso, o
conhecimento do comportamento da molécula frente à variação do pH pode ser determinante
para a purificação e estabilização de uma lectina.
32
Técnicas eletroforéticas (Laemmli, 1970; Davis, 1964; Reisfeld et al., 1962) que
servem para indicar basicidade ou acidez de uma lectina, assim como para determinar sua
estrutura quanto ao número de subunidades, massa molecular (Rego et al., 2002) ou ainda
para caracterizá-la como uma glicoproteína (Coelho; Silva, 2000), são importantes na
caracterização lectínica. Outro importante método eletroforético, é o método de
eletrofocalização ou focalização isoelétrica, útil para determinar o ponto isoelétrico da
proteína de interesse.
A cromatografia de filtração em gel aliada à eletroforese permite caracterizar bem as
lectinas em homotetrâmeros (Kawagishi et al., 2001), trímeros, dímeros de subunidades
idênticas (Mo et al., 2000) ou não, ou monômeros (Banerjee et al., 2004). Muitos outros
métodos e ensaios, tais como a imunodifusão, a difusão dupla, e especialmente o
seqüenciamento aminoacídico também são ferramentas importantes na caracterização de
lectinas; o seqüenciamento expõe informações valiosas sobre a estrutura e função das
moléculas, avalia a pureza e a concentração protéica, é capaz de detectar erros na sua
formação e modificações estruturais, servindo também de base para o entendimento de outras
questões, incluindo aquelas ligadas à evolução das espécies de onde as diferentes lectinas são
isoladas.
O seqüenciamento de lectinas tem permitido detectar isoformas, e identificar membros
de novas famílias homólogas destas proteínas, em grupos de organismos, através da
comparação de seqüências de lectinas com elevada homologia entre si (Candy et al., 2003;
Trigueros et al., 2003); a análise da estrutura primária permite sugerir a presença de pontes
dissulfeto em pontos específicos da molécula, e indica que alguns resíduos são determinantes
da atividade biológica (Zhang et al., 2003).
A técnica de cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (HPLC-RP)
constitui um meio útil de obter lectinas puras que já tenham sido pré-purificadas, de estimar
33
massas moleculares, caracterizar e fracionar proteínas e peptídeos muito semelhantes. A
cromatografia líquida de alta resolução (FPLC) tem sido amplamente utilizada como um
passo final de purificação mais refinada de lectinas, após a utilização de outros métodos
cromatográficos (Ng et al., 2003; Wong; Ng, 2003) e como um método de caracterização de
massa molecular destas proteínas. FPLC e HPLC-RP têm sido utilizadas para estabelecer a
homogeneidade de lectinas puras, para separar estruturas em subunidades, assim como
determinar se essas moléculas são monoméricas ou não (Wang et al., 2001).
A cristalografia, outra ferramenta de caracterização molecular, permite estudar a
estrutura quaternária de lectinas verificando o arranjo de seus domínios, como se comportam
nas interações e levantar questões relacionando tais estruturas com a função e evolução
molecular (del Sol et al., 2005). O estudo molecular através de simulações de dinâmica
permite avaliar de maneira mais refinada a influência de íons divalentes e interações
eletrostáticas específicas (ou seja, pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas) ou não
específicas (como interações de van der Waals) sobre a determinação de interação com
ligantes e a intensidade e estabilidade dessas interações (Konidala; Niemeyer, 2007). Essas
duas formas de caracterização molecular trazem informações sobre a adaptabilidade e
flexibilidade das lectinas.
1.2 OS LIQUENS
1.2.1 Constituição e Denominação
Os liquens são organismos simbiontes e mutualistas que resultam da associação entre
uma ou mais espécies de algas, fotobiontes, e uma espécie de fungo, micobionte (Harksworth;
Hill, 1984). As algas que compõem a associação liquênica são unicelulares, clorofíceas ou
cianofíceas. Em torno de 20 % das espécies fúngicas bem conhecidas são formadoras de
liquens; dentre elas, a maioria pertence aos ascomicetos (98 %), e algumas poucas espécies
34
são deuteromicetos (1,6 %) e basidiomicetos (0,4 %) (Raí; Bergman, 2002; Alexopoulos;
Mims, 1979; Xavier-Filho; Rizzini, 1976). Num talo liquênico, encontram-se camadas
sucessivas de alga e fungo; o córtex superior é composto por hifas entrelaçadas que protegem
a camada gonidial formada por algas. A terceira camada, a medula, é formada por um feixe de
hifas frouxas e, logo abaixo, está o córtex inferior, formado por outro feixe de hifas (Nash,
1996).
Esse tipo de associação entre organismos é dito mutualista, benéfica para ambos os
seres constituintes. Em geral, cada membro de uma associação mutualista é especializado para
executar uma função complementar ao outro. No líquen, uma alga fotossintética se junta ao
fungo e pode obter nutrientes de substratos difíceis, tais como cascas de árvores ou superfícies
rochosas (Ricklefs, 1996). Os liquens são capazes de fixar alimentos do ar atmosférico e
absorver sais minerais de substratos, para sua alimentação.
Em geral, as espécies fotobiontes formadoras de liquens são poucas, podendo uma
mesma alga ser encontrada constituindo vários liquens diferentes. No entanto, para cada
líquen há uma espécie de fungo e, por isso, a classificação desses organismos é baseada no
micobionte constituinte. As características observadas para a classificação são o talo liquênico
e os órgãos reprodutivos.
Os organismos liquênicos são amplamente distribuídos por todo o mundo; eles são
capazes de suportar condições climáticas severas, mas também são extremamente sensíveis à
poluição atmosférica sendo bem conhecidos como bio-indicadores.
Espécies liquênicas despertam interesses de muitos pesquisadores por suas
contribuições para o estudo da qualidade do ar, como também pelo fato de que seus extratos e
preparações contêm componentes que apresentam várias atividades, tais como antioxidante
(Behera et al., 2006; Halici et al., 2005; Odabasoglu et al., 2005) e antibacteriana (Behera et
al., 2008; Gulluce et al., 2006), antifúngica (Manojlovic et al., 2005), antimicrobiana (Saenz
35
et al., 2006; Pereira et al., 1991), antiinflamatória (Muhammad et al., 2005), anti-ulcerogênica
(Bayir et al., 2006; Odabasoglu et al., 2006), imunomoduladora (Omarsdottir et al., 2007;
Omarsdottir et al., 2006; Olafsdottir et al., 2003) e mitogênica (Omarsdottir et al., 2005), anti-
mitótica e anti-proliferativa (Bucar et al., 2004; Campanella et al., 2002), citotóxica (Bézivin
et al., 2003; Nascimento et al., 1994), antitrombótica (Kim; Lee, 2006) e anticoagulante
(Martinichen-Herrero et al., 2005a; Martinichen-Herrero et al., 2005b), dentre outros efeitos.
No entanto, poucos princípios ativos de origem liquênica já foram isolados e caracterizados.
1.2.2 O Gênero Cladonia e a Espécie Cladonia verticillaris
A espécie Cladonia verticillaris (Figura 4) é classificada dentro do Reino Fungi,
Divisão Eumycota, Subdivisão Ascomycotina, Ordem Lecanorales, Família Cladoniaceae,
Gênero Cladonia.
Figura 4 – Espécie Cladonia verticillaris.
C. verticillaris é um líquen autóctone; é encontrado em quantidade abundante sobre os
solos arenosos de tabuleiros costeiros no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil, como
também em outras regiões mundiais. Esse líquen tem sido utilizado como uma espécie
36
biomonitora para detecção de poluentes atmosféricos (Mota Filho et al., 2007; Silva et al.,
2007; Villarouco et al., 2007).
Dentre as substâncias produzidas nos liquens pela simbiose, há depsídios, depsidomas,
dibenzofuranos e ácido úsnico. Alguns destes produtos originados do metabolismo secundário
dos liquens, possivelmente desempenham um papel importante na sua fisiologia, além do
papel de defesa característico (Yano-Melo et al., 1999). Sessenta e cinco espécies do gênero
Cladonia foram analisadas quanto à composição em ácidos aromáticos; um número
significante desses organismos apresentou alto teor do ácido fumarprotocetrárico aromático;
C. verticillaris apresenta uma proporção relativa desse ácido, de 79,9/95,7% (Huovinen et al.,
1990) e de 78,57% em extração total (Yano-Melo et al., 1999). Esse ácido é considerado um
metabólito secundário biologicamente ativo e presente em diferentes espécies de liquens, com
atividade antimicrobiana (Yılmaz et al., 2004) e, em C. verticillaris, efeito alelopático (Yano-
Melo et al., 1999). Outras propriedades, tais como a atividade antitumoral e citotóxica,
também têm sido atribuídas a esse ácido e estão sob avaliação em laboratórios de pesquisas.
Vários liquens pertencentes à família Cladoniaceae têm apresentado extratos com atividade
citotóxica (Nascimento et al., 1994). Extratos e frações de C. verticillaris foram avaliados
contra o sarcoma-180, apresentanto efeito antitumoral sobre o crescimento de tumores; os
resultados indicaram que a atividade antitumoral é influenciada pela sazonalidade e que o
material coletado no período mais seco contém maior teor de princípios ativos antitumorais
(Santos, 1996).
1.2.3 Lectinas de Liquens
Em relação à sua ampla distribuição, as lectinas podem ser encontradas e isoladas de
organismos liquênicos (Elifio et al., 2000; Molina; Vicente, 2000; Ingram, 1982; Lockhart et
al., 1978; Howe; Barrett, 1970).
37
As primeiras pesquisas relacionadas à detecção de lectinas em espécies de liquens
foram iniciadas por Estola e Vartia (1955); estes pesquisadores utilizaram 100 espécies e
observaram que apenas 8 destas apresentavam atividade lectínica, 6 das quais pertencentes ao
mesmo gênero. Em seguida, Barret e Howe (1968) avaliaram extratos salinos de liquens e
verificaram que 22 espécies de gêneros diferentes apresentaram atividade hemaglutinante e
que não mostraram especificidade para os vários tipos de eritrócitos testados. Em 1970, estes
mesmos autores conseguiram isolar uma lectina de líquen, inespecífica para um tipo
sangüíneo. Desde então vem crescendo o interesse quanto ao isolamento de lectinas presentes
em espécies liquênicas, organismos estes que apresentam inúmeras atividades biológicas já
avaliadas.
As pesquisas objetivando purificar lectinas de liquens continuaram e, em 1978,
Lockhart et al. observaram que as espécies Peltigera canina e P. polydactyla apresentavam
lectinas, as quais pareciam estar envolvidas no processo de estabelecimento da associação
simbiótica entre fungo e alga. Desde então, outras lectinas têm sido isoladas de espécies de
liquens (Elifio et al., 2000; Molina; Vicente, 2000; Kardish et al., 1991; Petit et al., 1983;
Ingram, 1982; Petit, 1982) e têm contribuído para o esclarecimento do seu papel na relação de
simbiose destes organismos.
No entanto, lectinas de liquens não são frequentemente purificadas; em geral, quando
purificadas, elas são avaliadas estruturalmente ou mesmo a respeito de suas potenciais
funções orgânicas, mas poucas aplicações biológicas e tecnológicas têm sido descritas para
essas moléculas de natureza exótica. O envolvimento dessas moléculas no estabelecimento da
simbiose vem sendo estudado e sugerido por alguns autores como sendo seu possível papel
fisiológico nestes organismos (Elifio et al., 2000; Molina; Vicente, 2000; Kardish et al., 1991;
Petit et al., 1983; Petit, 1982; Lockhart et al., 1978).
38
1.3 AS LEGUMINOSAS
1.3.1 Generalidades
A família das leguminosas (Leguminosae) representa o terceiro maior grupo de plantas
superiores, perdendo em número de espécies apenas para as famílias das Orchidaceae e
Compositae. As leguminosas são conhecidas principalmente por serem produtoras de grãos,
muitas delas com extrema importância para a economia, como o amendoim, a lentilha, os
feijões, o grão de bico, a ervilha, a fava, a soja, entre outros. Esses vegetais têm grande
representação para a alimentação, porque constituem uma base alimentar bastante rica em
caboidratos (necessários para a produção de energia para o corpo assim como para o bom
funcionamento do sistema nervoso), proteínas (responsáveis pela constituição de tecidos e
órgãos) e outros compostos importantes para a manutenção da saúde, como o ferro, as
vitaminas e as fibras.
Além de suas propriedades nutricionais e medicinais, que conferem a exploração de
seus produtos renováveis, como óleos, sementes e frutos, as leguminosas são amplamente
exploradas também devido à produção de madeiras nobres ou com valor comercial, como o
pau-brasil (Caesalpinia echinata), angelim vermelho (Dinizia excelsa), angico, jacarandá do
Pará (Dalbergia paraense) e cedrorana (Cedrelinga catenaeformis). As plantas pertencentes à
família das Leguminosae representam um dos principais recursos utilizados como fonte de
descobertas de novas proteínas, tais como as lectinas. Hoje existe um amplo conhecimento
sobre lectinas provenientes das leguminosas, em caráter funcional (Bezerra et al., 2007) e
estrutural (Moreno et al., 2008; del Sol et al., 2007; Garcia-Pino et al., 2006).
1.3.2 O Gênero Bauhinia e a Espécie Bauhinia monandra
As Bauhinias foram assim denominadas pelo botânico francês Charles Plumier, em
homenagem aos irmãos Johann Bauhin e Caspard Bauhin, dois importantes botânicos suícos
39
do século XVI; conhecidas por muitos nomes vulgares, como asas de anjo, flor borboleta, pata
de vaca, orquídea dos pobres, pluma de Napoleão, as Bauhinias são plantas arbustivas cujas
folhas bilobadas e arredondadas constituem uma característica marcante das espécies.
Algumas espécies do gênero Bauhinia apresentam propriedades interessantes que vêm
sendo avaliadas. Por exemplo, B. variegata produziu efeito antitumoral sobre linfoma ascítico
de Dalton em ratos albinos suíços (Rajkapoor et al., 2003), B. forficata foi capaz de atuar
como hipoglicemiante em ratos normais e em ratos com diabetes induzida (Silva et al., 2002),
assim como apresentou efeito antidiabético em ratos (Pepato et al., 2002) e B. megalandra
mostrou propriedade de redução da absorção intestinal de glicose (Mujica et al., 2003). Essas
atividades biológicas têm posto o gênero Bauhinia em destaque como plantas popularmente
conhecidas com potencial medicinal contra alguns tipos de câncer e, especialmente, com
poder curativo da hiperglicemia e diabetes.
A espécie Bauhinia monandra (Figura 5) é classificada dentro do Reino Plantae,
Divisão Magnoliophyta, Classe Magnoliopsida, Ordem Fabales, Família Fabaceae,
Subfamília Caesalpinioideae, Tribo Cercideae, Gênero Bauhinia. B. monandra (e também B.
variegata e B. forficata) é hoje amplamente utilizada pela medicina popular; suas folhas são
conhecidas por possuirem ações antioxidante (Argolo et al., 2004), hipoglicemiante, diurética
e no emagrecimento e, por isso, são adotadas na alimentação diária de muitas pessoas, sob a
forma de chá.
40
Figura 5 – Folhas, flores e vagens da espécie Bauhinia monandra.
1.3.3 A Lectina de Bauhinia monandra
Uma lectina galactose específica, denominada BmoLL, foi isolada das folhas de B.
monandra em quantidades de miligramas (300 mg/kg) (Coelho; Silva, 2000); estudos estão
sendo procedidos para avaliar a sua ação hipoglicemiante, sendo de grande importância o
conhecimento mais aprofundado de suas características estruturais e seu potencial de ligação a
superfícies celulares de tecidos diferenciados. O comportamento interfacial de BmoLL e sua
interação com monocamadas lipídicas são aspectos estruturais que têm sido estudados por
medidas de tensão superficial (Rosilio et al., 2004); BmoLL também tem sido avaliada quanto
às suas propriedades dielétricas em monocamadas (Andrade et al., 2005 parte I) e em
monocamadas misturadas com fosfolipídeos (Andrade et al., 2005 parte II). Além de seu
estudo estrutural, BmoLL também tem sido aplicada em ensaios biológicos apresentando
atividade inseticida contra diferentes insetos (Macedo et al., 2007). Esta lectina revelou ainda
ter habilidade para interagir com isolados endofíticos presentes nas folhas de B. monandra
(Ramos, 2003).
41
1.4 PROTEÍNAS ANTIMICROBIANAS
As proteínas antimicrobianas, dentre elas as lectinas, prendem o interesse de muitos
pesquisadores por elas poderem servir como ferramentas contra infecções fúngicas e
bacterianas em organismos vegetais ou mesmo em patologias humanas. Tais proteínas podem
ser incorporadas em plantas transgênicas conferindo resistência a estas contra patógenos; as
lectinas podem, ainda, servir futuramente como princípios ativos para produção de
antifúngicos ou antibacterianos de uso clínico.
1.4.1 Distribuição nos Seres Vivos e nas Classes de Proteínas
Proteínas ou peptídeos com ação antifúngica são ubíquos na natureza e são expressos
em diferentes estruturas ou órgãos de muitos vegetais e animais (Ng, 2004). Além disso, essas
moléculas são distribuídas em diferentes classes de proteínas, tais como as quitinases (Ye; Ng,
2005; Ye; Ng, 2002b; Young; Byung, 1996), as proteínas tipo-quitinase (Ye; Ng, 2002a), as
glucanases, as proteínas tipo-taumatina, as tioninas, proteínas tipo-ciclofilina, as lectinas
(Sitohy et al., 2007; Trindade et al., 2006; Wang; Ng, 2003b; Freire et al., 2002; Ye et al.,
2001; Ciopraga et al., 1999), as proteínas inativadoras de ribossomo, ribonucleases,
desoxirribonucleases, peroxidases e inibidores de proteases (Joshi et al., 1998).
Muitas proteínas e peptídeos têm demonstrado atividade contra fungos, em especial,
aqui apresentados exemplos de inibidores de espécies do gênero Fusarium. Um exemplo é o
inibidor de protease cisteína, uma molécula com 24 kDa isolada de milheto que tem forte ação
antifúngica contra muitas espécies fúngicas incluindo espécies de Fusarium (Joshi et al.,
1998).
Alguns outros exemplos são os peptídeos, muito presentes nos organismos e com ação
antimicrobiana. Dois peptídeos antifúngicos foram avaliados por Huang et al. (2000) e por
Duvick et al. (1992), um ligador de quitina (de folhas de Ginkgo biloba) que exerceu
42
atividade antifúngica contra F. graminearum e F. moniliforme dentre outros fungos e outro
isolado de milho (com apenas 4 kDa) que exibiu uma ação supressora na germinação de
esporos ou na elongação de hifas de F. moniliforme, F. graminearum e também contra várias
bactérias, respectivamente. Ainda entre os peptídeos, dois deles, um com homologia para
defensina, isolado de Vigna sesquipedalis (Wong; Ng, 2005a), e outro isolado de Phaseolus
lunatus com apenas 7 kDa, denominado lunatusina (Wong; Ng, 2005b), atuaram ambos contra
F. oxysporum e outros fungos ou bactérias apresentando um amplo espectro de utilização
contra microrganismos.
As quitinases também estão bem representadas entre as macromoléculas
antimicrobianas; duas isoformas básicas, b1 (32 kDa) e b2 (22 kDa), purificadas de Capsicum
annuum mostraram atividade contra F. oxysporum e outras espécies de fungos (Young;
Byung, 1996). Outras duas proteínas do feijão P. vulgaris, uma antifúngica e outra do tipo
quitinase (utilizando 300 µg, mais potente que a primeira) apresentaram efeito antifúngico
frente a F. oxysporum (Ye; Ng, 2002a). Esses mesmos autores identificaram duas quitinases,
uma em Delandia umbellata, chamada delandina com ação também contra F. oxysporum (Ye;
Ng, 2002b) e outra (isolada de Phaseolus mungo) com efeito sobre F. solani e F. oxysporum,
utilizando 60 µg (Ye; Ng, 2005).
Do mesmo modo que as macromoléculas antifúngicas mostram ampla distribuição na
natureza, as proteínas antibacterianas ou peptídeos são encontrados em diferentes organismos;
são enzimas ou representam muitos grupos protéicos, tais como as L-aminoácido oxidases ou
proteínas presentes em peixes (Kitani et al., 2008; Nagashima, 2003), as crustinas presentes
em crustáceos (Smith et al., 2008; Supungul et al., 2008), catelicidinas (Daly et al., 2008;
Chen et al., 2005) e fosfolipases A2 (Nevalainen et al., 2007) ambas presentes em mamíferos,
defensinas de fungos, plantas, insetos e animais (Lundy et al., 2008; Zhu, 2008), lectinas tipo-
43
C presentes em camarões, vieiras (Sun et al., 2008; Wang et al., 2007a) e lectinas de plantas
(Santi-Gadelha et al., 2006; Gaidamashvili; van Staden, 2002) entre outras proteínas.
Como exemplo de molécula antibacteriana, a L-aminoácido oxidase de peixe,
denominada SSAP, é uma proteína interessante; ela mostrou ser seletiva ao atuar sobre
bactérias Gram-negativas, enquanto outras enzimas de seu grupo possuem uma ampla ação
contra bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas (Kitani et al., 2008). Outro exemplo é a
Crustina Pm1, uma isoforma da crustina (proteína do camarão Penaeus monodon que foi
super expressa em E. coli); exibiu efeito antibacteriano contra bactérias Gram-positivas e foi
potente inibidora sobre S. aureus e Streptococcus iniae (Supungul et al., 2008).
Entre as moléculas com ação contra bactérias, os peptídeos são muito bem
representados, sendo generosamente encontrados na natureza; dois peptídeos com
propriedades antifúngicas (isolados de Vigna sesquipedalis cv. e Phaseolus lunatus)
mostraram também possuir atividade contra bactérias quando avaliados em E. coli, Bacillus
megaterium (Wong; Ng, 2005a), B. megaterium, B. subtilis (Wong; Ng, 2005b) dentre outras.
Kacprzyk et al. (2007) obtiveram resultados interessantes ao avaliar a ação de um peptídeo
sintético rico em histidina sobre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas; os dados
provaram que tais peptídeos possuem uma ação contra E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis e S.
aureus que está relacionada com as condições de acidez. Chen et al. (2005) investigando o
efeito de β-defensinas humanas, catelicidina LL-37 e lisozima de pele sobre S. aureus e E.
coli, utilizando diferentes condições de pH, concluiu que estas moléculas apresentam um
efeito antibacteriano sinergista contra essas bactérias, em condições de acidez.
1.4.2 Lectinas com Ação Antimicrobiana contra Fusarium ou Bactérias
A vasta oferta de lectinas hoje comercializadas, assim como as possibilidades de
isolamento de novas moléculas biologicamente ativas com potente ação para uso em amplo
44
espectro, apresenta as lectinas como sendo continuamente avaliadas quanto às várias
atividades biológicas, dentre elas, a ação contra microrganismos.
Alguns exemplos de lectinas com atividade antimicrobiana contra os microrganismos
utilizados nesse trabalho são citados. Três lectinas, isoladas de sementes de Talisia esculenta
(Freire et al., 2002), de Pisum sativum (Sitohy et al., 2007) e de Astragalus mongholicus (Yan
et al., 2005) mostraram ser inibidoras do crescimento de F. oxysporum; outra lectina, um
homodímero com 67 kDa isolada de um feijão (Phaseolus vulgaris) possui propriedades
antifúngicas com atividade moderada contra F. oxysporum, entre outras espécies fúngicas (Ye
et al., 2001). A aglutinina de gérmen de trigo (WGA) isolada de uma variedade de Romanian
dihaploid, mostrou habilidade para inibir o crescimento de duas espécies de Fusarium
patogênicas, o F. graminearum e o F. oxysporum (Ciopraga et al, 1999). Outros exemplos são
duas lectinas ligadoras de quitina, isoladas a partir de sementes da jaca (Artocarpus
heterophyllus) e da fruta-pão (Artocarpus altilis), que inibiram o crescimento de F.
moniliforme quando utilizadas em elevada concentração (Trindade et al., 2006).
Com relação a bactérias, algumas pesquisas têm sido realizadas avaliando potenciais
efeitos lectínicos; uma lectina do invertebrado marinho Holothuria scabra, mostrou um amplo
espectro de forte atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Gowda et al.,
2008b). A lectina de sementes de Araucaria angustifolia também é ativa contra os dois grupos
de bactérias (Santi-Gadelha et al., 2006). Duas outras lectinas, tipo C, purificadas de ovos de
galinha e ganso, são bactericidas contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus e
Pseudomonas aeruginosa (Wellman-Labadie et al., 2008). Gaidamashvili e van Staden (2002)
realizaram um estudo utilizando diferentes aglutininas vegetais com o objetivo de avaliar suas
possíveis interações com S. aureus e B. subtilis; eles observaram que as aglutininas de
Hypoxis hemerocallidea e de Combretum mkhuzense foram capazes de agregar células de S.
aureus (utilizando 4 e 5 µg/ml, respectivamente); outras aglutininas de C. mkhuzense,
45
Kniphofia spp. e Tulbaghia violacea agregaram células de B. subtilis somente em altas
concentrações.
1.5 OS VEGETAIS E SUAS DEFESAS NATURAIS
1.5.1 Defesa Vegetal contra Microrganismos e Animais
Na defesa contra microrganismos, insetos, herbívoros ou em resposta a estresse
abiótico, as plantas utilizam-se de seus metabólitos secundários ou de macromoléculas
resultantes do metabolismo primário. Acredita-se que as principais funções dos metabólitos
secundários seja proteger os vegetais contra o ataque de patógenos ou predadores e também
garantir a sobrevivência frente a outros estresses bióticos ou abióticos posteriores (Zhao et al.,
2005). Estes metabólitos são, em geral, moléculas de baixo peso molecular como alcalóides,
terpenóides, saponinas, iridóides, polifenóis e taninos. Carlini e Grossi-de-Sá (2002)
apresentam bem em uma revisão que, entre as muitas proteínas envolvidas nos mecanismos
de defesa das plantas, estão as lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomo (tipos 1 e 2)
(He; Liu, 2003), inibidores de enzimas proteolíticas (inibidores de proteases) (Lalitha et al.,
2005) e glicohidrolases (inibidores de α-amilase) (Kluh et al., 2005), arcelinas (encontradas
somente nos tipos selvagens de feijão comum, Phaseolus vulgaris) (Rougé et al., 1993),
quitinases (Fitches et al., 2004), hemilectinas também denominadas quimerolectinas
(proteínas do tipo lectinas monovalentes), proteínas tipo canatoxina (ureases, proteínas do tipo
hemilectinas) (Stanisçuaski et al., 2005) bem como ureases (Follmer, 2008) e formas
modificadas de proteínas de estocagem.
1.5.2 Lectinas com Ação Inseticida
As lectinas, proteínas de ampla distribuição e de origem não imune, apresentam a
habilidade de reconhecer variados carboidratos ou outras moléculas glicosiladas
46
(glicoconjugados) livres ou presentes sobre a superfície celular, através de seus sítios de
reconhecimento reversível (Kennedy et al., 1995), distinguem-se na biotecnologia devido a
suas muitas aplicações já bem definidas e assim como outras utilizações potenciais que são
continuamente avaliadas e estudadas por pesquisadores da área da lectinologia. Muitas
lectinas de plantas têm apresentado ação inseticida com efeitos em diferentes estágios de vida
dos insetos como nos estágios larval (Coelho et al., 2007; Macedo et al., 2007; Leite et al.,
2005; Macedo et al., 2002; Fitches et al., 2001) de ninfa (Bandyopadhyay et al., 2001) e
adulto (Sauvion et al., 2004) assim como também na oviposição (Sadeghi et al., 2006),
indicando ação inseticida contra representantes das ordens Coleoptera (Sadeghi et al., 2006;
Leite et al., 2005; Macedo et al., 2002; Machuka et al., 2000), Homoptera (Dutta et al., 2005;
Bandyopadhyay et al., 2001), Hemiptera (Sauvion et al., 2004), Diptera (Kaur et al., 2006),
Diptera e Hemiptera (Trigueros et al., 2003), Lepidoptera (Coelho et al., 2007; Fitches et al.,
2001), Coleoptera e Lepidoptera (Macedo et al., 2007), Hymenoptera (Couty et al., 2001)
dentre outras. Nasutitermes corniger são insetos que possuem a habilidade de construir túneis
e galerias e, numa condição de estresse pela presença de possíveis substâncias tóxicas, eles
podem reagir fechando esses espaços para evitar o contato físico (Su et al., 1982). Desta
forma, a possível ação repelente de lectinas frente a esses insetos pode ser avaliada através de
um bioensaio específico apresentado por esses autores, que permite a observação do
comportamento dos cupins frente à presença de lectinas ou soluções controle (Figura 6a).
Os efeitos das lectinas sobre os insetos como moléculas inseticidas são avaliados
geralmente através de bioensaios onde há incorporação da lectina numa dieta artificial
oferecida (Kang et al., 1990) (Figura 6b e c). A toxicidade das lectinas parece depender tanto
de uma resistência necessária dessas moléculas contra proteínas assimiladoras e degradação
proteolítica pelas enzimas digestivas do inseto quanto da sua ligação às estruturas na
membrana peritrófica e/ou estruturas quitinosas na região do intestino médio (Coelho et al.,
47
2007; Macedo et al., 2007). A ação inseticida de lectinas ainda é desconhecida, mas é
provável que envolva sua ligação às glicoproteínas das células epiteliais do intestino médio;
sugere-se que existem vários modos de ação para diferentes lectinas nos níveis celulares
(Sauvion et al., 2004), não implicando necessariamente na interrupção da função celular e
lise. O mecanismo de ação das lectinas como moléculas tóxicas, pode também estar
relacionado às enzimas digestivas e proteínas assimiladoras nas quais as lectinas podem
interferir com suas funções, dessa forma inibindo a digestão e absorção e causando a privação
nutricional (Coelho et al., 2007; Leite et al., 2005; Eisemann et al., 1994).
Figura 6 – (a) Bioensaio para avaliação inseticida utilizando cupins submetidos a uma
alimentação artifical (papel de filtro embebido com amostra lectínica). (b, c) Bioensaio para
avaliação repelente utilizando cupins submetidos ao meio agar 2 %, com perfurações
periféricas contendo papél de filtro embebido com amostras protéicas; em (b) montagem do
experimento (preparação de placas, perfurações e inclusão de amostras e insetos); em (c)
observação de abertura de túneis e galerias pelos insetos, em direção às amostras protéicas).
a
c
b
48
Geralmente, lectinas N-acetil-D-glicosamina específicas ou com habilidade para ligar
à quitina parecem possuir propriedade inseticida; no entanto, as lectinas de origem vegetal
com diferentes especificidades para açúcares também têm mostrado habilidade como
moléculas inseticidas sugerindo que essa propriedade não é exclusividade de lectinas GlcNAc
específicas. Por exemplo, XCL, uma lectina do cogumelo Xerocomus chrysenteron que
apresenta afinidade para D-galactose e lactose (e uma menor afinidade para N-acetil-D-
galactosamina) teve efeito sobre Drosophila melanogaster e o afídio da ervilha Acyrthosiphon
pisum apresentando uma LC50 de 0,4 mg/ml e 0,023 mg/ml respectivamente (Trigueros et al.,
2003). Outra lectina da alga vermelha Gracilaria ornata denominada GOL (inibida somente
por algumas glicoproteínas) causou uma redução significativa na sobrevivência de larvas (em
torno de 65 % utilizando 1% (p/p) em relação ao grupo controle, utilizando um bioensaio
onde os insetos receberam uma dieta de sementes artificiais. A lectina GOL também afetou de
forma significativa o percentual de emergência de insetos adultos em relação ao grupo
controle (Leite et al., 2005). Em outra avaliação, Sadeghi et al. (2006) utilizando 14 lectinas
de plantas (pertencentes a 4 famílias de lectinas) com diferentes especificidades, numa
concentração de 0,05% (p/v) em solução, mostraram que todas as lectinas tiveram efeito
deterrente na oviposição de C. maculatus variando de 36 a 78 %. A lectina isolada das
sementes de Talisia esculenta, TEL (que tem propriedades de ligação à quitina e que é inibida
por manose e glicose) promoveu cerca de 90% de mortalidade de larvas de Callosobruchus
maculatus e Zabrotes subfasciatus com LD50 e ED50 (diminuição de 50% do peso) de cerca de
1% (p/p) para os dois insetos (Macedo et al., 2002).
1.5.3 Mecanismos de Ação Inseticida das Lectinas
Alguns possíveis mecanismos de ação das lectinas para promover a mortalidade de
insetos já foram propostos pela literatura; dependendo dos alvos subcelulares da lectina, pode
49
haver uma diminuição do influxo alimentar através de sua ligação ao epitélio do intestino
médio ou à matriz peritrófica (Fitches et al., 1997; Eisemann et al., 1994); a lectina pode
também cruzar a barreira epitelial do intestino médio e passar para dentro do sistema
circulatório do inseto resultando numa ação tóxica, interferindo com lectinas endógenas
envolvidas na autodefesa, presentes na hemolinfa (Fitches et al., 2001); outro mecanismo
proposto é que as lectinas podem ser internalizadas pelas vesículas endocitóticas presentes nas
células epiteliais e bloquear a localização nuclear e a importação nuclear de proteínas
seqüência-dependente, inibindo a proliferação celular (Yu et al., 1999).
1.5.4 A Biotecnologia e os Inseticidas Naturais
Hoje é crescente o interesse biotecnológico e industrial na descoberta de novos
pesticidas naturais para promover um controle biológico que evite o impacto ambiental. É
nesta concepção que a pesquisa em biotecnologia vem utilizando cada vez mais as
ferramentas da genética molecular para criar vegetais transgênicos portadores de genes
codificadores de inibidores de enzimas digestivas, inibidores de amilases, peptídeos, lectinas e
outras moléculas. Genes que codificam lectinas entomotóxicas vêm sendo amplamente
introduzidos na produção de plantas de interesse econômico e vêm rendendo transgênicos
menos suscetíveis ao ataque de microrganismos (Prasad et al., 2008) e insetos (McCafferty et
al., 2008; Dutta et al., 2005; Ramesh et al., 2004; Hilder; Boulter, 1999; Schuler et al., 1998).
Neste sentido, novas lectinas inseticidas podem ser consideradas como possíveis estratégias
biotecnológicas para a preservação de espécies em extinção e para a indústria madeireira
(visando às madeiras de importância industrial), sendo incorporadas a plantas transgênicas
para servir como controle nas pragas de insetos, por exemplo, contra espécies de térmites
parasitas de madeira, causadores de grande prejuízo às madeireiras e consumidores em todo o
mundo.
50
1.6 OS CUPINS
1.6.1 Classificação dos Nasutitermes
A espécie Nasutitermes corniger (Figura 7) está classificada dentro do gênero
Nasutitermes pertencente à família Termitidae, mundialmente a mais rica família em espécies
(somando em torno de 70-75 % de todas as espécies de térmitas catalogadas, encontrados em
madeira, grama ou solo) (Inward et al., 2007; Tokuda et al., 1999) dentro da ordem Isoptera,
subfamília Nasutitermitinae (que possui 93 gêneros); o gênero é representado por mais de 240
espécies, formando o maior gênero de insetos comedores de madeira da ordem Isoptera
(Bergamaschi et al., 2007). Representantes destes insetos podem ser encontrados distribuídos
no planeta principalmente nas regiões tropicais.
Figura 7 – Espécie Nasutitermes corniger.
1.6.2 Aspectos Gerais e Importância Econômica e Ambiental
Os cupins são insetos essencialmente sociais e extremamente organizados. Vivem
geralmente em ninhos que podem ser dos tipos mais diversos, de acordo com as espécies;
assim, os cupins podem ser xilófagos (vivendo isolados do solo, em troncos de árvores ou
madeiras tratadas), arborícolas (construindo os ninhos em troncos de árvore ou madeira podre,
51
com comunicação com o solo por galerias superficiais) ou humívoros (cujos ninhos são
construídos no chão). Os organismos de um ninho se organizam em castas de forma que cada
casta diferente é responsável por desempenhar funções específicas para a manutenção e
sobrevivência do ninho como um todo; desta forma, existem os indivíduos alados e
reprodutores (temporários) e as castas de indivíduos ápteros sexuados férteis (com função de
substituição do rei e da rainha) ou estéreis, os operários (construtores do ninho e responsáveis
pela prole e pelo alimento) e soldados (defensores da colônia) ambos podendo ser machos ou
fêmeas. Com relação à alimentação, a casta de operários é responsável por manter os
reprodutores e soldados nutridos; para isso os cupins realizam a troca de alimentos pela boca,
chamado de alimento estomodéico, um líquido claro, utilizado pelos operários para alimentar
as outras castas.
No Brasil, podem ocorrer representantes de quatro famílias de cupins: Kalotermitidae
(considerados primitivos, não constroem ninhos nem possuem operárias; só atacam e
alimentam-se exclusivamente de madeira seca), Rhinotermitidae (são alados, constroem
ninhos subterrâneos e atacam plantas vivas ou madeira morta), Serritermitidae (formada por
uma únca espécie, Serritermes serrifer, exclusiva do Brasil) e Termitidae (principal família
entre os cupins, alados, construtores de diferentes tipos de ninhos e com hábito alimentar bem
diversificado, podendo atacar madeiras, folhas e húmus).
Na família Termitidae destacam-se quatro gêneros, por representarem as principais
pragas de mudas no campo; são eles Cornitermes, Syntermes, Anoplotermes e Nasutitermes.
Essa família é encontrada em todo o Brasil; é muito diversificada e corresponde a 85 % de
todas as espécies de térmitas que ocorrem no território brasileiro. Suas espécies são em geral,
humívoras; o gênero Nasutitermes, no entanto, pode nidificar em raízes de árvores, sobre
troncos, sob o solo e também sobre o solo, formando montículos. Os Nasutitermes destacam-
se também entre os gêneros de maior interesse à economia do homem por causarem prejuízos
52
elevados nas áreas urbanas e peridomiciliares. A espécie Nasutitermes corniger é neotropical,
formadora de colônias monogênicas ou poligênicas, com uma ou várias rainhas,
respectivamente (Adams et al., 2007) e bem adaptada à área urbana.
Cupins ou térmitas constituem um grande grupo de insetos eusociais. Eles são
responsáveis pelo prejuízo causado pelos danos em árvores ou produtos da madeira e em
plantações; no entanto, esses insetos também são benéficos do ponto de vista ecológico desde
que eles são os maiores responsáveis pela decomposição de celulose, o polímero de
carboidrato mais presente no mundo, atuando como biorecicladores na produção de carbono e
hidrogênio para o meio ambiente.
Os térmitas possuem a habilidade de digerir a celulose utilizando três tipos diferentes
de celulases (que podem ser de origem endógena ou simbiótica), as endoglucanases, as
exoglucanases e as β-glicosidases (Breznak; Brune, 1994); as enzimas de origem endógena
são aquelas codificadas por genes do genoma do próprio inseto enquanto que as enzimas de
origem simbiótica são aquelas produzidas por simbiontes existentes no intestino posterior
(Zhou et al., 2008). Toda a ordem Isoptera é constituída por sete famílias cujos representantes
(exceto os da família Termitidae) apresentam protozoários celulolíticos no intestino posterior
(Tokuda et al., 1999), sendo a família Termitidae (de acordo com características morfológicas
e moleculares) aceita como a família mais recentemente evoluída derivada dos Isoptera
(Miura et al., 1998).
1.7 DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS
As doenças neurodegenerativas como a Doença de Alzheimer (DA), de Parkinson, de
Huntington, doenças neuromotoras e doenças de Prion envolvem importantes perdas de
sinapse e de axônio, antes mesmo do aparecimento dos sintomas e da perda de neurônios
(Saxena; Caroni, 2007); no entanto, não está claro ainda até que ponto os processos que levam
53
à perda axonal e sináptica constituem a principal causa das perdas funcionais nessas
neuropatologias.
Alguns fatores parecem ser predisponentes para o desenvolvimento de
neuropatologias. Pode-se considerar a mitocôndria como tendo importante papel na função
celular, sendo ela a principal fonte de produção de energia na célula e, qualquer defeito na
função mitocondrial irá ter papel importante na patofisiologia de doenças, tais como a
diabetes, a obesidade, as miopatias e as doenças neurodegenerativas em geral (Nisoli et al.,
2008). Dentre as doenças neurodegenerativas, existem evidências com relação às demências
de que inflamações cerebrais funcionam como co-fatores essenciais no desenvolvimento
dessas doenças, em especial a DA (Evin; Weidemann, 2002); dados sugerem que há também
uma estreita ligação entre disrregulação lipídica e demência, sendo a hipercolesterolemia
considerada como um fator de risco inicial para o desenvolvimento da DA (Dufouil et al.,
2005; Pappolla et al., 2003). Há uma preocupação geral em se definir as possíveis formas de
se proteger contra o desenvolvimento da DA; nesse sentido, os hábitos de exercícios físicos
regulares assim como o exercício mental são sempre ditos como fatores protetores contra a
DA. O estabelecimento de uma dieta alimentar adequada também parece atuar como fator na
prevenção ou pelo menos no desenvolvimento tardio do início da DA (Florent-Béchard et al.,
2007). Os fatores intrínsecos do indivíduo que estão associados a um risco maior para adquirir
a DA, especificamente, incluem uma história familiar da DA, ser portador de outras doenças,
tais como hipertensão, doenças cardíacas, doenças cardiovasculares, diabetes, elevada
ingestão de álcool e danos cerebrais anteriores (Findeis, 2007).
1.7.1 A Doença de Alzheimer: Aspectos Clínicos e Histopatológicos
DA é uma doença neurodegenerativa caracterizada por demência lenta e progressiva
que ocorre ainda no início, podendo estar relacionada à perda neuronal (Kobayashi et al.,
54
1989), à deposição extracelular de placas senis e presença de emaranhados neurofibrilares
(NFT) denominados degeneração neurofibrilar (Bonifati; Kishore, 2007) todas essas, provas
patológicas da DA (Bonifati; Kishore, 2007; Findeis, 2007; Yoon et al., 2007; Ng’walali et
al., 2002).
A DA está entre várias doenças neurodegenerativas e é caracterizada por causar
demência de forma lenta e progressiva desde o início da idade adulta. Esta neuropatologia tem
sido diagnosticada em todos os países e o número de pacientes tem aumentado de forma
exponencial. Estima-se que 5% da população com idade superior a 65 anos apresente a DA, e
que a partir desta idade, o número de pacientes dobre a cada 5 anos. Sugere-se que
aproximadamente 50 % da população acima de 85 anos sofre deste mal (Florent-Béchard et
al., 2007).
Os principais sintomas de DA são a perda de memória progressiva e o envolvimento
de outras funções cerebrais superiores tais como deficiência cognitiva e o funcionamento da
linguagem e de funções motoras. Fatores neuropatológicos, representados por perda neuronal
e lesões microscópicas, são do tipo deposição extracelular de placas amilóides (ou placas
senis) e presença de NFT (Bonifati; Kishore, 2007; Wang et al., 2007b) que podem estar
associados à demência na DA. Neurites distróficas, degeneração neuronal, astrócitos e
micróglia ativados, em especial ao redor das placas senis, também caracterizam cérebros com
DA.
NFT são acúmulos intraneuronais de filamentos helicoidais pareados, constituídos de
proteína tau hiperfosforilada de maneira anormal. Já as placas senis são caracterizadas por
deposição extracelular de agregados de peptídeo β-amilóide, do tipo Aβ1–40 ou Aβ1–42
(sendo o último mais neurotóxico, mais agregado e mais envolvido com a DA); o peptídeo
pode conter 39 a 42 resíduos de aminoácidos resultantes da clivagem proteolítica da maior
proteína precursora de β-amilóide neuronal (amyloid precursor protein - APP), uma proteína
55
trans-membrana glicosilada; NFT e placas senis são a prova histológica da patologia da DA
(Bonifati; Kishore, 2007; Findeis, 2007; Yoon et al., 2007; Ng’walali et al., 2002). No
entanto, nem as placas senis nem NFT são evidências inequívocas para responder pela
patologia da DA desde que o mesmo padrão de distribuição destes achados histológicos em
indivíduos com DA é observado também em indivíduos com síndrome de Down (SD) e, em
menor número, em indivíduos não dementes, mas com idade avançada; o papel
neuropatológico de ambas as lesões está relacionado às disfunções cognitivas dos indivíduos
que apresentam demência (Nishi et al., 2003; Ng’walali et al., 2002). Li et al. (2007)
enfatizam o significado do peptídeo Aβ intracelular como sendo uma explicação
complementar para a fisiologia neuronal defeituosa e para a perda neuronal na DA. Várias
evidências sugerem que o acúmulo do peptídeo Aβ intraneuronal é um evento inicial na DA
associada à disfunção neuronal (Arbel; Solomon, 2007). As mitocôndrias constituem um local
de agregação intracelular para o peptídeo Aβ; ambos os monômeros e oligômeros do peptídeo
Aβ estão presentes dentro das mitocôndrias; os níveis mitocondriais do peptídeo Aβ no
cérebro com DA podem desempenhar um papel patológico induzindo uma disfunção
mitocondrial através de muitos fatores e interações dentre as várias vias de sinalização celular
(Wang et al., 2007b).
1.7.2 Origem dos Fatores Neuropatológicos da Doença de Alzheimer
Os carboidratos localizados na superfície das células são encontrados como
glicolipídeos ou glicoproteínas na face externa da membrana celular, onde estão envolvidos
na maioria dos grandes eventos biológicos e podem servir também como marcadores
(Boullanger et al., 2008). As cadeias de carboidratos são modificações co-translacionais ou
pós-translacionais sofridas pelas proteínas e podem também ocorrer em formas lipídicas
constituindo glicoconjugados. Tais modificações são executadas por ações consecutivas de
56
glicosiltransferases e outras moléculas celulares. Muitas modificações pós-translacionais, tais
como N- e O-glicosilações, fosforilações, O-sulfações de tirosina e ε glicações têm sido
descritas em APP trans-membrana (Schmitt, 2006).
Cadeias de glicano podem alterar de forma significativa a conformação protéica e,
conseqüentemente, podem modular a atividade funcional de uma proteína como também
modular as interações proteína/proteína (Geyer; Geyer, 2006). Por exemplo, modificações do
tipo O-GlcNAc são envolvidas com muitas funções celulares (Kneass et al., 2004; Zachara et
al., 2004) e enzimas de adição (O-GlcNAc transferase, OGT) e remoção (O-glicoproteína 2-
acetamido-2-desoxi-D-glicopiranosidase) de modificações do tipo O-GlcNAc apresentam
intensa expressão em tecidos cerebrais (Gao et al., 2001; Kreppel et al., 1997). Deste modo, é
evidente que tal modificação atua em importantes funções cerebrais.
Modificações do tipo O-GlcNAc e fosforilação, quando ocorrem simultaneamente,
parecem estar envolvidas com a regulação da participação da proteína tau hiperfosforilada na
formação de NFT intracelular (Liu et al., 2004). A proteína tau pertence à família de proteínas
cerebrais associadas aos microtúbulos, as quais são envolvidas na polimerização e
estabilidade dos microtúbulos neuronais, e podem ser modificadas por fosforilação pós-
translacional, glicosilação N- e O-ligadas, ubiquitinação, glicação, proteólise e outros eventos
(Buée et al., 2000). A fosforilação anormal da proteína tau ocorre em algumas doenças
neurodegenerativas tais como a DA, e essa forma anormal da proteína tau é o principal
componente dos filamentos (previamente citados como NFT) que se acumulam nos neurônios
degenerando. Além disso, moléculas de proteína tau de cérebros com DA são glicosiladas
com sacarídeos N- e O-ligados.
A glicosilação final de moléculas celulares é um dos processos chave pelos quais as
células modificam suas proteínas e lipídeos constituintes, e podem mudar várias propriedades
físicas e químicas, reatividade e funções biológicas dessas moléculas (Babál et al., 2006). Os
57
glicoconjugados encontrados nas células cerebrais são importantes moléculas de
reconhecimento nas interações de mediação célula-célula durante o desenvolvimento do
sistema nervoso central (Nishi et al., 2003; Nishimura et al., 2000), atuam como indutores no
desenvolvimento e migração de neurônios, na adesão de células neurais e outras funções.
Assim, um desequilíbrio no metabolismo glicídico pode deliberar desordens cerebrais
resultando em modificações protéicas anormais e pode produzir o acúmulo ou deposição de
glicoconjugados no espaço intracelular e/ou na matriz intercelular (Nishimura et al., 2000).
1.7.3 Lectinas como Marcadores em Patologia Forense
As lectinas, através da análise histoquímica, são moléculas capazes de detectar e
caracterizar diferentes composições de glicoconjugados na superfície de células e tecidos,
detectando a expressão diferenciada dos constituintes, relacionada a muitos estágios
fisiológicos e patológicos distintos (Fiedler et al., 2007; Hemmoranta et al., 2007; Szöke et
al., 2007; Thöm et al., 2007; Babál et al., 2006; Beltrão et al., 2003; Barou et al., 2002).
A medicina forense está envolvida, dentre muitas tarefas, com a investigação de
predisposições do indivíduo a condições fatais em conseqüência de traumas e doenças. Então,
a avaliação de mudanças degenerativas no cérebro é significativa, desde que muitas doenças
degenerativas estão intimamente relacionadas a disfunções cerebrais, como o déficit cognitivo
e a perda de memória. Dessa forma, os ensaios histológicos e imunohistoquímicos são
importantes para investigar ou diagnosticar anormalidades cerebrais e doenças após óbito em
humanos (Uryu et al., 2007; Ishikawa et al., 2006; Ulfig et al., 2004; Minnasch et al., 2003;
Nishi et al., 2003; Ng’walali et al., 2002; Nishimura et al., 2000; Cummings et al., 1992) e
animais (Arendash et al., 2007; Medina-Flores et al., 2004), alguns destes ensaios utilizando
lectinas como marcadores. Hoje, o diagnóstico clínico da DA ainda é limitado, necessitando
da análise histológica pós-morte do cérebro para um diagnóstico definitivo. A presença de
58
placas senis, NFT e outras lesões características é que define a DA, pelo menos no estado
mais avançado (Findeis, 2007).
A aplicação da histoquímica com lectinas em neuropatologia forense é um método
econômico para detectar mudanças degenerativas relacionadas a carboidratos em diferentes
regiões do cérebro, tais como depósitos de carboidrato (por exemplo, placas senis e NFT) que
são marcadores patológicos predominantes de DA e SD (corpos amiláceos que são relevantes
na hipóxia cerebral repetida e dano mitocondrial, depósitos amilóides e outras lesões) e que
estão presentes nessas e outras condições neurodegenerativas.
Placas senis e NFT estão presentes no córtex cerebral e hipocampo de algumas pessoas
com idade mais avançada, de pacientes com SD e/ou demência do tipo DA. As lesões foram
marcadas pelas lectinas PSA (Pisum sativum agglutinin), GS-I (Griffonia simplicifolia I
lectin} e Con A (mas não mostraram reatividade com outras lectinas testadas) não sendo
detectadas em tecido de pessoas mais jovens (Nishimura et al., 2000). NFT no córtex cerebral
com SD foram fracamente marcadas com WGA, GSI (Griffonia simplicifolia agglutinin),
GSA-IB4 (Griffonia simplicifolia iso agglutinin B4), Con A, e PSA; as placas senis foram
marcadas difusamente com essas lectinas, fortemente com Con A e PSA, e moderadamente
com WGA e GSA-IB4 (Nishi et al., 2003). Mann et al. (1988), estudando a composição
oligossacarídica das placas senis e de NFT, observaram que diferentes grupos de lectinas
marcaram placas senis e NFT, e que o pré-tratamento com neuraminidase aboliu a marcação
de NFT com algumas lectinas (mas não com todas), sugerindo que os oligossacarídeos
contribuem de forma diferente com os resíduos de glicoconjugados que formam parte da
estrutura das placas senis e NFT. WGA reconheceu a proteína tau e esse reconhecimento foi
específico para resíduos GlcNAc O-ligados (Lefebvre et al., 2003); outras técnicas
confirmaram que proteínas tau humanas são glicosiladas somente com resíduos O-GlcNAc.
No entanto, in vivo, as proteínas tau hiperfosforiladas que se agregam em NFT durante as
59
doenças neurodegenerativas são destituídas de resíduos O-GlcNAc. Liu et al (2002),
analisando a composição monossacarídica e blots específicos de lectina, sugeriram que a
proteína tau na DA seja glicosilada principalmente por N-ligações, que a glicosilação dessa
proteína é uma anormalidade inicial da degeneração neurofibrilar e pode facilitar a sua
hiperfosforilação anormal no cérebro com DA.
Além dessas duas lesões, outras características histológicas podem ser observadas,
como o material ao redor dos vasos sanguíneos na formação hipocampal. São depósitos
amilóides do tipo vascular, encontrados principalmente em pacientes com DA apresentando
demência; esses depósitos, também presentes no cerebelo de pacientes com SD, foram
fortemente marcados com algumas lectinas (Ulex europaeus isolectin I - UEA-I; GS-I; e
Dolichos biflorus agglutinin - DBA), mas não reagiram com Con A e PSA (Nishimura et al.,
2000). Mann et al (1992) utilizaram 14 lectinas para analisar diferenças de expressão de
sacarídeos nos microvasos cerebrais, em grupos diferentes: pessoas com DA, com SD e
pessoas idosas sem quadro demencial; eles observaram aumentos específicos de reatividade
em relação às doenças, à idade e às diferentes lectinas utilizadas, sugerindo que podem existir
mudanças seletivas relacionadas à doença na membrana basal, que podem se originar da perda
de neurônios que inervam os microvasos cerebrais. Essas mudanças podem indicar prejuízos
na função e na integridade da barreira cérebro-sangue.
Os corpos amiláceos, encontrados com freqüência em doenças neurológicas, reagiram
bem com GS-I (lectina específica para galactose e GaINAc), UEA-I (específica para fucose),
DBA (específica para GalNAc), Arachis hypogaea agglutinin - PNA (específica para Gal–
GalNAc) e Erythrina cristagalli agglutinin - ECA (específica para Gal–GlcNac), mas não
foram marcados por lectinas específicas para manose (PSA e Con A) (Nishimura et al., 2000).
As lectinas, moléculas com diferentes especificidades para carboidratos, são poderosas
armas histoquímicas para uma caracterização detalhada de estágios celulares fisiológicos,
60
doenças metabólicas e patologias, traçando as mudanças que ocorrem nas células e tecidos.
No entanto, o uso de lectinas no estudo da DA (Nishi et al., 2003; Nishimura et al., 2000;
Cummings et al., 1992; Mann et al., 1992; Kobayashi et al., 1989; Mann et al., 1988) ainda
não é expressivo, considerando as potenciais contribuições que essas moléculas podem trazer
para uma melhor compreensão da patologia, colaborando com informações sobre mudanças
celulares e teciduais nos processos de glicosilação alterados.
61
2 JUSTIFICATIVA
62
Os liquens são organismos estudados em todo o mundo, devido aos seus muitos efeitos
biológicos; eles apreentam ação antioxidante, antibiótica, antimicrobiana, antiinflamatória,
anti-proliferativa, anti-mitótica, mitogênica, anti-ulcerogênica, antitumoral,
imunomoduladora, antifúngica, antitrombótica, anticoagulante e citotóxica (Behera et al.,
2008; Omarsdottir et al., 2007; Bayir et al., 2006; Behera et al., 2006; Gulluce et al., 2006;
Kim; Lee, 2006; Odabasoglu et al., 2006; Omarsdottir et al., 2006; Saenz et al., 2006; Halici
et al., 2005; Manojlovic et al., 2005; Muhammad et al., 2005; Odabasoglu et al., 2005;
Omarsdottir et al., 2005; Bucar et al., 2004; Bézivin et al., 2003; Olafsdottir et al., 2003;
Campanella et al., 2002; Nascimento et al., 1994; Pereira et al., 1991). A família das
Cladoniaceae, o gênero Cladonia e a espécie C. verticillaris (Figura 4) têm sido avaliados em
sua composição química (Yano-Melo et al., 1999; Huovinen et al., 1990) e propriedades
biológicas, apresentando atividade citotóxica e antimicrobiana (Nascimento et al., 1994;
Pereira et al., 1991); C. verticillaris em especial, apresenta propriedade alelopática (Yano-
Melo et al., 1999) e antitumoral (Santos, 1996).
C. verticillaris (bem como outras espécies do gênero) é encontrada crescendo de
forma abundante em várias regiões do Nordeste do Brasil. A fácil obtenção desta espécie
devidamente identificada, assim como o interesse na purificação de lectinas de liquens
permitiu o desenvolvimento de parte desse trabalho. A obtenção da lectina do líquen C.
verticillaris (ClaveLL) por um protocolo relativamente barato e simplificado, rendendo
quantidades razoáveis da lectina (aproximadamente 930 mg/kg), estimulou a avaliação dessa
proteína em ensaios biológicos de interesse biotecnológico.
Algumas Bauhinias (como a B. monandra) são conhecidas pelo uso popular como
plantas de poder antidiabético e curativo do câncer. Por isso, algumas delas estão sendo
avaliadas e têm apresentado atividade antioxidante (Argolo et al., 2004), antitumoral
63
(Rajkapoor et al., 2003), hipoglicemiante (Silva et al., 2002), antidiabética (Pepato et al.,
2002), redutora da absorção intestinal de glicose (Mujica et al., 2003) entre outras.
B. monandra, cujo chá das folhas é popularmente utilizado como hipoglicemiante,
diurético e emagrecedor, é fonte de isolamento da lectina presente nas folhas, BmoLL
(Coelho; Silva, 2000), com provável ação hipoglicemiante, com efeito inseticida (Macedo et
al., 2007) e afinidade por endofíticos (Ramos, 2003). A espécie, conhecida como pata de
vaca, é amplamente encontrada na região Nordeste e também em outras regiões do Brasil,
presente em áreas urbanas como planta ornamental de praças, jardins e vias públicas. Ela é
aparentemente resistente ao ataque de pragas, pois em seus tecidos, em geral, não são
observados danos causados por herbívoros, insetos ou microrganismos. A avaliação de
BmoLL nesse sentido torna-se extremamente atraente e válida cientificamente.
A importância desse trabalho se reflete no uso das lectinas propostas, ClaveLL
(Cladonia verticillaris lichen lectin) e BmoLL (Bauhinia monandra leaf lectin), com três
diferentes objetivos: 1- como proteínas com ação antimicrobiana de utilidade para pesquisas e
aplicações na área da saúde humana e resistência vegetal; 2- como proteínas inseticidas contra
espécies de interesse para a indústria e preservação de espécies; 3- como marcadores
histoquímicos para caracterização, estudo e contribuição no diagnóstico da DA através da
análise histoquímica de hipocampos. O trabalho encontra diretrizes quanto à ampla utilização
de lectinas, por suas propriedades características, como ferramentas em biologia molecular e
produção de plantas transgênicas resistentes a fitopatógenos, microrganismos e insetos
(McCafferty et al., 2008; Prasad et al., 2008; Dutta et al., 2005; Ramesh et al., 2004; Hilder;
Boulter, 1999; Schuler et al., 1998) e como ferramentas histoquímicas para o estudo,
caracterização, prognóstico ou diagnóstico de tecidos humanos normais, com transformações
benignas ou malignas (Ulfig et al., 2004; Basu et al., 2003; Nischi et al., 2003; Kunstfeld;
Petzelbauer, 2001; Brinck et al., 1998; Danguy et al., 1998; Kabir, 1998;).
64
3 OBJETIVOS
65
3.1 OBJETIVO GERAL
Purificar e caracterizar uma lectina presente no líquen C. verticillaris (ClaveLL),
purificar uma lectina presente em folhas de B. monandra (BmoLL, através de um protocolo
pré-estabelecido), bem como avaliar ClaveLL e BmoLL quanto às suas propriedades
biotecnológicas, como lectinas com ação antimicrobiana e inseticida e aplicáveis na
histoquímica de patologias cerebrais.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Purificar as lectinas ClaveLL e BmoLL através de métodos de extração, precipitação
protéica e cromatografia;
Com C. verticillaris:
- Quantificar a presença protéica nas preparações obtidas do líquen;
- Determinar a presença lectínica nas preparações através de ensaios de AH e de inibição da
AH;
- Caracterizar a lectina purificada através de métodos cromatográficos de elevada resolução
utilizando os sistemas de FPLC e HPLC;
- Caracterizar a lectina através de ensaios de AH com variação de temperatura, pH, presença
de íons ou carboidratos;
- Avaliar a interação com outras macromoléculas através de ensaios de AH utilizando
glicoconjugados, difusão radial e colunas de afinidade (utilizando amostras pré-purificadas);
- Avaliar o perfil eletroforético da lectina e seu possível caráter glicoprotéico.
Com as lectinas ClaveLL e BmoLL:
- Avaliar a interação lectínica com células bacterianas, bem como sua atividade antibacteriana
utilizando diferentes metodologias;
- Avaliar a possível atividade antifúngica contra diferentes espécies do gênero Fusarium;
66
- Avaliar potenciais atividades repelente e inseticida contra cupins da espécie Nasutitermes
corniger;
- Avaliar as lectinas como marcadores histoquímicos com potencial afinidade por
degenerações histopatológicas típicas da doença de Alzheimer e como moléculas úteis para a
observação e estudo das histopatologias.
67
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109
5 ARTIGOS
110
Artigo 1: a ser submetido ao periódico Biologicals
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Cladonia verticillaris LICHEN
LECTIN WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY
111
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Cladonia verticillaris LICHEN
LECTIN WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY
Silva, M. D. C.1; Oliva, M. L. V.2; Silva, M. C. C.1; Paiva, P. M. G. 1; Melo, C. M. L.3;
Gusmão, N. B.3; Correia, M. T. S.1; Coelho, L. C. B. B.1*
1Laboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco. 2Departamento de Bioquímica,
Universidade Federal de São Paulo. 3Laboratório de Ensaios Biotecnológicos,
Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco.
*Corresponding author: Luana C. B. B. Coelho
e-mail address: [email protected]
112
Abstract
Cladonia verticillaris lichen lectin (ClaveLL) was purified from an extract (E) ammonium
sulphate fractionation (F1), followed by Sephadex G-100 gel filtration chromatography.
ClaveLL samples were assayed to haemagglutinating activity (HA) and analyzed by
polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) and by
FPLC and HPLC systems. ClaveLL was submitted to carbohydrate/glycoprotein inhibition,
thermal stability, ion assay and HA stability under distinct pH values. ClaveLL was totally
inhibited by glycoproteins contained in rabbit serum, colostrum and bovine fetal serum,
fetuin, asialofetuin, casein and asocasein. The lectin was sensible to temperature (70 °C, 30
min), not ion dependent and ion solutions stimulated HA. ClaveLL was pH stable (5.5 to 12)
and most active in acidic (5.5) pH value. SDS-PAGE resolved ClaveLL as an unique
polypeptide band (glycosylated) with molecular weight smaller than 14 kDa. F1 contains
glycoprotein with glucose/mannose residues since it did bind to Cratylia mollis seed lectin
(Cramoll 1,4) in radial diffusion assays and Cramoll 1,4-Sepharose affinity matrix. Gel
filtration chromatography was resolved in three distinct active peaks to native lectin. ClaveLL
on C4 RP-HPLC system showed a main homogeneous peak and hydrophobic profile. Highly
purified glycosylated ClaveLL at low protein concentration (0.75 µg) showed antifungal
effect to Fusarium verticiloides, F. descemcellulare, F. fusarioides, F. oxysporum and F.
moniliforme; ClaveLL (0.225 µg, disk diffusion method; 1.5 µg/ml, microdilution assay) had
antibacterial effect to Gram-positive (Bacillus subtilis, Corynebacterium callunae,
Streptococcus faecalis, Micrococcus luteus and Staphylococcus aureus) and Gram-negative
(Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Serratia sp.)
bacteria. Therefore, ClaveLL showed to be a potential agent against pathogenic fungi and
bacteria species of economic interest for agriculture and health.
Key words: lichen lectin, Cladonia verticillaris, glycoprotein, antimicrobial activity.
113
Introdution
Lichens are symbiont organisms that result from the association between algae species
(fotobionts) and one fungal species (mycobiont). Around 20 % of the well-known fungal
species form lichens, among these most are ascomycetes (98 %), and a few are
deuteromycetes and basidiomycetes (Rai and Bergman, 2002). Lichens have been awaking
interest since its extracts and substances showed activities such as antimicrobial (Saenz et al.,
2006; Pereira et al., 1991), antifungal (Manojlovic et al., 2005), cytotoxic (Bézivin et al.,
2003; Nascimento et al., 1994), antioxidant (Behera et al., 2006; Halici et al., 2005;
Odabasoglu et al., 2005) and antibacterial (Behera et al., 2008; Gulluce et al., 2006),
immunomodulatory (Omarsdottir et al., 2007; Omarsdottir et al., 2006; Olafsdottir et al.,
2003) and mitogenic (Omarsdottir et al., 2005), antiulcerogenic (Bayir et al., 2006;
Odabasoglu et al., 2006), antithrombotic (Kim and Lee, 2006) and anticoagulant
(Martinichen-Herrero et al., 2005a; Martinichen-Herrero et al., 2005b), anti-inflammatory
(Muhammad et al., 2005), antimitotic and anti-proliferative (Bucar et al., 2004; Campanella et
al., 2002).
Lectins are proteins of non immune origin with wide distribution in nature that
recognize carbohydrates or glycoconjugates free or linked to cell surfaces through specific
recognition sites containing hydrophobic interaction force (Kennedy et al., 1995), hydrogen
bridges and van der Walls forces (Sharon, 1993). Some lectins own metallic ions linked to its
structure; such links are coordinated by water molecules, which also serve to mediate the
interactions of lectins with carbohydrates (Sharon and Lis, 2002). Lectins have been isolated
from seeds (Singha et al., 2007; Sitohy et al., 2007; Susseeland et al., 2007; Freire et al.,
2002), vertebrate (Dunphy et al., 2002), invertebrate (Yang et al., 2007; Pace et al., 2002),
bacteria (Syed et al., 1999), yeasts, algae (Ambrosio et al., 2003), mushrooms (Jung et al.,
2007; Trigueros et al., 2003) and lichens (Elifio et al., 2000; Molina and Vicente, 2000;
114
Ingram, 1982; Lockhart et. al., 1978; Howe and Barrett, 1970). Some authors have reported
that lichen lectins can have an important role in the establishment of symbiosis, as a
recognition factor between species (Elifio et al., 2000; Molina and Vicente, 2000; Kardish et
al., 1991; Petit et al., 1983; Petit, 1982; Lockhart et al., 1978). However, very little has been
done with respect to lichen lectins biological properties and potential biotechnological
applications.
Antimicrobial proteins arrest the interest of many researchers as tools against fungal
and bacterial infections to plants or human pathologies. Such proteins can be incorporated in
transgenic plants checking resistance against pathogens; also, lectins can serve as active
principles of antifungal or antibacterial clinical use. Antifungal proteins or peptides are
ubiquous in nature and expressed in different structures or organs of many vegetables and
animals (Ng, 2004). Moreover, these molecules are distributed in different protein classes
such as chitinases (Ye and Ng, 2005; Ye and Ng, 2002b; Young and Byung, 1996), chitinase-
like proteins (Ye and Ng, 2002a), glucanases, thaumatin-like proteins, thionins, cyclophilin-
like proteins, lectins (Sitohy et al., 2007; Trindade et al., 2006; Wang and Ng, 2003; Freire et
al., 2002; Ye et al., 2001; Ciopraga et al., 1999), ribosome inactivating proteins,
ribonucleases, deoxyribonucleases, peroxidases, and protease inhibitors (Joshi et al., 1998) all
exhibiting antifungal activity. Also, antibacterial proteins or peptides are found in different
organisms and they are enzymes or represent many protein groups such as L-amino acid
oxidase or proteins present in fishes (Kitani et al., 2008; Nagashima, 2003), crustins present
in crustaceans (Smith et al., 2008; Supungul et al., 2008), cathelicidins (Daly et al., 2008;
Chen et al., 2005) and phospholipases A2 (Nevalainen et al., 2007) both present in
mammalian, defensins from fungus, plants, insects and animals (Lundy et al., 2008; Zhu,
2008), C-type lectins present in shrimps, scallops (Sun et al., 2008; Wang et al., 2007) and
115
plant lectins (Santi-Gadelha et al., 2006; Gaidamashvili and van Staden, 2002) among other
proteins.
A simple protocol was developed to isolate Cladonia verticillaris lichen lectin,
ClaveLL, active and highly purified, with high molecular weights that suggested molecular
aggregates forms to the native lectin (170, 110 principal peak and 82 kDa), great affinity for
glycoproteins and antimicrobial effect, inhibiting the growth of Fusarium species and
bacteria, phytopathogen and/or animal and human pathogens.
Material and Methods
ClaveLL Purification C. verticillaris was collected in the State of Paraíba,
Northeastern Brazil and gently identified by Dr. Eugênia Cristina Gonçalves Pereira
(Departamento de Ciências Geográficas, Centro de Filosofia e Ciências Humanas, UFPE).
Lichen flour was submitted to extraction (10 %, w/v) in 0.15 M sodium phosphate buffer
containing 0.15 M NaCl, pH 7.0 (selected buffer) for 16 h at room temperature, followed by
filtration and centrifugation on refrigerated centrifuge (8.000 rpm, 20 min). The crude extract
(E) was ammonium sulphate treated for 4 h at room temperature, followed by centrifugation
(8.000 rpm at 4 °C for 20 min), F1 (0-30 %). Proteins were determined (Lowry et al., 1951)
using a bovine serum albumin standard curve. F1 (18 mg) was applied to Sephadex G-100
column (1.4 x 63 cm) containing 100 ml of gel. The molecular exclusion column was eluted
with selected buffer (flow rate of 20 ml/h); collected fractions were monitored by absorbance
(UV 280 nm) and haemagglutinating activity (HA). The homogeneity of ClaveLL isolated by
molecular exclusion as well as its molar mass under native or denatured conditions was
evaluated by gel filtration chromatography through HPLC and FPLC systems. ClaveLL
sample (1 mg/2 ml of 0.5 M NaCl) was injected to gel filtration Hiprep 16/60 Sephacryl S-
300 column connected to ÄKTA-FPLC system (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) pre-
116
equilibrated with 0.5 M NaCl; the column was eluted with 0.5 M NaCl (240 ml and flow rate
36 ml/h); collected fractions (2.6 ml) were monitored by absorbance (UV 280 nm) and HA.
The standards (Sigma, USA) used were bovine serum albumin (66,000 Da), fetuin (64,000
Da), ovalbumin (45,000 Da), trypsin inhibitor type III-O chicken (28,000 Da) and trypsin
(25,000 Da). Following the lectin was chromatographed on a C4 column connected to RP-
HPLC system (model LC-10AD from Shimadzu, Japan) equilibrated in 0.1 % acid
trifluoracetic solution (TFA) in water (solvent A); elution was made with 90 % acetonitrile
gradient (5 to 100 %) in 0.1 % TFA (solvent B).
HA Assays Samples (E, F1 and ClaveLL) were submitted to HA assays in microtiter
plates (Correia and Coelho, 1995) with two-fold serial dilutions in 0.15 M NaCl followed by
addition of glutaraldehyde-treated (rabbit, quail, chicken and ABO system) 2.5 % erythrocyte
suspension in 0.15 M NaCl (v/v); HA title was determined as the inverse of largest dilution
with total agglutination, after 45 min of rest. Specific HA (SHA) was determined as
HA/protein concentration (mg/ml). For the other HA assays were used glutaraldehyde-treated
rabbit erythrocytes. ClaveLL samples were incubated in increasing temperatures from 30 to
100 °C for 30 min, followed by immediate cooling at room temperature and HA
determination; sample aliquots were submitted to continuous heating in all temperatures.
ClaveLL was incubated in solutions containing divalent ions (MnCl2, MgCl2, CaCl2, BaCl2,
HgCl2, CdCl2 and CoCl2) with concentrations between 5 and 40 mM; ClaveLL was also
submitted to incubation with ions (MnCl2, MgCl2, CaCl2 and MnCl2-CaCl2) with the same
concentrations, after dialysis for 16 h in 5 mM EDTA solution. In microtiter plates, for each
assay, were placed 50 µl of ion concentration solutions in all wells except in the second well,
which received twice the ion concentration; ClaveLL (50 µl) was added and after two-fold
serial dilutions and rest for 15 min the HA was determined. ClaveLL was incubated in
117
different buffers and pH range solutions (5.5 to 12), in microtiter plates, after two-fold serial
dilutions, for 15 min; HA was determined.
HA Inhibition Assays Using Carbohydrates and Glycoproteins Inhibition assays
followed the same procedure used for the ion incubation assays; several carbohydrate (1.56 to
200 mM in 0.15 M NaCl) or glycoprotein (1.95 to 500 µg/ml, in 0.15 M NaCl) solutions were
used.
Radial Diffusion Assays In small Petri plates containing 4 ml of agar gel (1 %, w/v) in
0.15 M NaCl wells drillings of 3 mm (1 central and 4 peripheric) were done; the samples F1
and ClaveLL (20 µl with 397 and 3.3 µg, respectively) were applied in central wells of plates
and glycoproteins or proteins were applied in peripheric wells. After rest in humid chamber at
4 °C for 72 h, plates were washed and stained according to Ashford et al. (1982).
Electrophoresis F1 and ClaveLL samples (100 µg) were applied in PAGE containing
sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) for denatured proteins (Laemmli, 1970) with or
without β-mercaptoethanol treatment. Proteins were detected with Coomassie Brilliant blue or
Schiff’s reagent.
Antifungal Activity ClaveLL antifungal effect was evaluated with Fusarium species
according to a modified assay based on Wong and Ng (2005a). ClaveLL was filtered to
sterilization and applied (50 µl with 0.75 µg of protein) on sterile Petri plate (90 x 15 mm)
surfaces containing 10 ml of Yeast Nitrogen Base (YNB) agar medium; a fungal mycelium
disk (6 mm in diameter) containing different Fusarium species (F. solani, URM-2480; F.
oxysporum, URM-2489; F. moniliforme, URM-3226; F. decemcellulare, URM-3006; F.
lateritium, URM-2491) obtained from the Culture Collections from the Departamento de
Micologia, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil and (F. fusarioides and F.
verticiloides} from the Laboratório de Fungos do Solo, Departamento de Agronomia,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Brasil were placed in the middle of plates. Lectin
118
buffer and commercial antifungal Cercobin (10 ppm) constituted negative and positive
controls, respectively. Plates were incubated at 28 °C for 72 h and fungi growth halos were
measured in millimeters. The effect of ClaveLL on Fusarium sp. was defined by comparison
with fungal growth in the negative control and antifungal activity of positive control. All
assays were carried out in triplicate. Antifungal effect was evaluated by growth halos
reduction. Inhibition percentage data were expressed as a mean ± standard deviation (S.D.).
Antibacterial Activity ClaveLL antibacterial effect was evaluated using a disk
diffusion method; inoculum preparations were made according to Bauer et al. (1966).
Stationary cultures from different Gram-positive (Bacillus subtilis, ATCC-6633;
Corynebacterium callunae, ATCC-5991; Staphylococcus aureus, ATCC-6538; Streptococcus
faecalis, ATCC-6057) or Gram-negative (Escherichia coli, ATCC-25922; Klebsiella
pneumoniae, ATCC-29665; Pseudomonas aeruginosa, ATCC-27853) bacterial strains
obtained from the Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco,
Brasil, were maintained into Nutrient agar medium and stored at 4 ºC. Bacteria were cultured
in Nutrient broth medium and incubated under permanent shaking overnight at 37 ºC.
Bacterial culture concentrations were adjusted turbidimetrically at a wavelength of 600 nm to
106 colony forming units (CFU).ml-1 constituting the inoculum working concentration. Each
inoculum (0.5 ml) was added to warm Nutrient agar medium (100 ml) at 43 °C and solutions
(10 ml) were distributed in sterile Petri plates (90 x 15 mm). After medium solidification,
sterile paper disks (with 6 mm in diameter) impregnated with ClaveLL filtered to sterilization
(15 µl equivalent to 0.225 µg) were placed on Petri plate surfaces containing bacteria in
solidified agar medium. Lectin buffer and commercial antibacterial amoxicilin (1 mg/ml)
constituted the negative and positive controls, respectively. Plates were incubated at 37 °C for
24 h and transparent rings around each paper disk that revealed antimicrobial activity (zones
of growth inhibition) were measured in millimeters. The effect of ClaveLL on bacterial strains
119
was defined by comparison with the negative control that should not have any effect on
growth bacteria. All assays were carried out in triplicate. Zone of growth inhibition data were
expressed as a mean ± S.D.
Bacterial Agglutination Assay Minimum agglutinating lectin concentration (MAC)
able to promote bacterial agglutination was quantitatively determined through agglutination
assays in microtiter plates with two-fold serial dilutions of ClaveLL (0.180 mg/ml) in 0.15 M
NaCl. Overnight bacterial cultures were diluted with Nutrient broth medium (at a ratio of
1:100) and an aliquot (100 µl) was added to each well for a final volume of 200 µl; after
overnight incubation of plates at 37 °C, MAC was determined through visual observation of
agglutination. All assays were carried out in triplicate.
Quantitative Antibacterial Microdilution Assay Quantitative antibacterial effect of
ClaveLL was evaluated with bacterial strains (Gram-positive B. subtilis, UFPEDA 16;
Micrococcus luteus, UFPEDA 06; S. aureus, UFPEDA 01; or Gram-negative E. coli,
UFPEDA 224; P. aeruginosa, UFPEDA 39; Serratia sp., UFPEDA 398; obtained from
Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil) through
microassay using sterile microplates for culture cell. Pre-inoculum of bacteria were used for
inoculum preparation (106 colony forming units (CFU).ml-1) through strong agitation in sterile
water containing glass pearls. Nutrient broth medium (180 µl) was added to microplates
followed by ClaveLL filtered to sterilization (20 µl with 0.3 µg of protein), which was thus
ten times diluted (final 1.5 µg/ml). To each well inoculum was added using a platinum handle
(10 µl). The wells first sequence of plates were free of bacteria for control of medium sterility.
Wells were monitored by absorbance (visible light 600 nm) in time 0; plates were sealed and
incubated for 18 h at 35 °C followed by a new absorbance. Last absorbances were subtracted
from the first absorbances and resultant absorbances with ClaveLL were compared to
120
resultant absorbances in lectin buffer (control). All assays were carried out in triplicate.
Growth inhibition percentage data were expressed as a mean ± S.D.
Results and Discussion
Lichens are widely distributed in the world; they support severe climatic terms but are
extremely sensible to atmospheric pollution being well-known as bioindicators. Lichen
preparations contain components with antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory,
cytotoxic, mitogenic, antimitotic, anti-proliferative, antiulcerogenic, immunomodulatory,
antithrombotic and anticoagulant effects. However, few active principles have already been
isolated and characterized. A few lichen lectins were isolated and had its potential properties
evaluated. Autochthons C. verticillaris is abundantly found on sandy soils of coastal boards in
the State of Paraíba, Northeast Brazil. This lichen has been used as biomonitor to detect
atmospheric pollutants (Mota Filho et al., 2007; Silva et al., 2007; Villarouco et al., 2007). In
this work a new lichen lectin was purified from C. verticillaris; the purification protocol
established for ClaveLL is summarized in the Table 1. E and F1 agglutinated glutaraldehyde-
treated human erythrocytes from all ABO system as well as glutaraldehyde-treated
erythrocytes from rabbit, chicken and quail; the highest HA was obtained with rabbit
erythrocytes. F1 was chosen for lectin purification and characterization since it showed the
highest HA, Total HA (THA), protein concentration (mg/ml) and specific HA (SHA).
Molecular exclusion chromatography separated F1 in two peaks: the first clarified and
with HA, denominated ClaveLL; the second, without activity, contained a strong color, like F1
(Figure 1a). Sephadex G-100 molecular exclusion constituted an economic protocol since the
same matrix was efficiently reused at least 30 times for ClaveLL purification.
Gel filtration chromatography on Sephacryl S-300 resolved ClaveLL in three distinct
peaks with HA and molecular weights of 170, 110 (main peak) and 82 kDa; a peak without
121
HA had molecular weight of 44 kDa (Figure 1b). SDS-PAGE revealed a unique polypeptide
to ClaveLL (Figure 3c) with molecular weight of approximately 14 kDa, glycosylated (Figure
3d). The active peaks from gel filtration chromatography suggest molecular aggregate forms
for native lectin, composed by subunits with low molecular identical or distinct weights. The
lectin isolated from the mushroom Polyporus squamosus (Mo et al., 2000) showed molecular
mass of 52 kDa through gel filtration, and 28 kDa in SDS-PAGE showing to be a homodimer
of identical subunits; Mycoleptodonoides aitchisonii lectin (Kawagishi et al., 2001) showed to
be a homotetramer with molecular weight of the native protein estimated around 64 kDa by
gel filtration. ClaveLL chromatographed in C4 revealed a strong hydrophobic character and
homogeneous profile characteristic of a highly purified protein (Figure 1c and 1d).
ClaveLL was sensible to temperature with a gradual fall of HA from 40 °C; activity
was abolished at 70 °C (Figure 2a). Lichen lectin from Dictyonema glabratum (Elifio et al.,
2000) incubated by 30 min, also lost gradually activity from 40 °C with total lost at 80 °C.
Mushroom lectins such as Mycoleptodonoides aitchisonii lectin (Kawagishi et al., 2001) and
Cordyceps militaris lectin (Jung et al., 2007) were sensible to temperature losing totally
activity at 50 °C and over 55 °C, respectively. Differently, the lectin from the mushroom
Polyporus adusta (Wang et al., 2003) was stable until 70 °C; activity was lost at 90 °C.
ClaveLL activity increased with MnCl2, BaCl2, CaCl2 and MgCl2 (Figure 2b);
previous treatment of lectin with EDTA through exhaustive dialysis did not abolish totally its
HA which still was partially recovered when incubated with tested ions. ClaveLL was not
dependent, but activity was stimulated by these ions.
ClaveLL was active in all evaluated pH values (Figure 2c), but it was most active at
pH 5.5. ClaveLL stability under different solutions was comparable to lectins from the
mushrooms Mycoleptodonoides aitchisonii (Kawagishi et al., 2001) and Ganoderma capense
(Ngai and Ng, 2004), active in pH values 4 to 9 and 4 to 11, respectively.
122
F1 and ClaveLL activities were inhibited by carbohydrates or glycoproteins. F1 was
totally inhibited by glycoproteins presents in rabbit serum (1.95 µg/ml) and in bovine fetal
serum (62.5 µg/ml); carbohydrates (N-acetylglucosamine, ramnose, arabinose, xylose and
mannose) or glycoproteins (fetuin, casein, ovalbumin and peroxidase) were partial inhibitors
of F1. Glycoproteins presents in rabbit serum, colostrum and bovine fetal serum, fetuin,
asialofetuin, casein and asocasein (1.95 µg/ml) totally inhibited ClaveLL; ovalbumin, N-
acetylglucosamine, galactose, ramnose, mannose, glucose and trealose were partial inhibitors
of ClaveLL. Inhibition of ClaveLL HA by N-acetylglucosamine (one of the main components
of fungi cell wall) and glycoproteins created the interest about its potential antimicrobial
activity towards plant and human pathogenic fungi or bacteria species.
Radial diffusion assays revealed protein/glycoprotein interaction among F1 and
ClaveLL with lectin from the seeds of Cratylia mollis, Cramoll 1,4 (Figure 3a) as well as with
rabbit serum glycoproteins and avidin (an egg glycoprotein). F1 also recognized other
glycoprotein samples (human serum from type A+ blood, rabbit serum and total or delipided
human plasma).
F1 and ClaveLL were mostly inhibited by glycoproteins. The high affinity for
glycoproteins was confirmed with radial diffusion assay, with strong recognition of F1 and
ClaveLL to glycoproteins presents in rabbit serum; the recognition of Cramoll 1,4 (a not
glycosylated glucose/mannose specific lectin) indicates that protein samples contain
glucose/mannose residues. F1 can have glucose/mannose residues, since its chromatography
on Cramoll 1,4-Sepharose (an affinity matrix with Cramoll, isoforms 1 and 4
glucose/mannose specific, immobilized to Sepharose CL-4B) presented an adsorved peak
eluted with 0.3 M mannose (Figure 3b).
ClaveLL showed antifungal activity against F. verticiloides (20 %), F.
descemcellulare (20 %), F. fusarioides (17.4 %), F. oxysporum (11.1 %) and F. moniliforme
123
(11.1 %); F. solani and F. lateritium were not lectin inhibited (Figure 4); the best lectin
inhibitory effect was observed after 72 h. The lectin was as efficient as the commercial
antifungal Cercobin against F. fusarioides or more effective than the same against F.
moniliforme. Other proteins and peptides also demonstrated antifungal activity against
Fusarium species using different protein concentrations (Table 2).
ClaveLL showed inhibition halos (zones of growth inhibition) in plates with Gram-
positive B. subtilis, C. callunae and S. faecalis, and Gram-negative E. coli, K. pneumoniae
and P. aeruginosa bacteria. The antibacterial effect of ClaveLL obtained in this assays were
summarized in Table 3. S. aureus growth was not affected by ClaveLL at assayed protein
concentration. L-Amino acid oxidase from fish, named SSAP, acted of selective form on
Gram-negative bacteria strains (but other enzymes of this group own wide action against
Gram-positive or Gram-negative bacteria) (Kitani et al., 2008).
ClaveLL showed cellular agglutination with all tested bacteria and a better MAC for
C. callunae promoting cellular agglutination in very low protein concentration. MAC values
were summarized in Table 3. A study using different plant agglutinins to evaluate its possible
interactions with S. aureus and B. subtilis showed that Hypoxis hemerocallidea and
Combretum mkhuzense agglutinins were able to aggregate S. aureus (at 4 and 5 µg/ml,
respectively); C. mkhuzense, Kniphofia spp. and Tulbaghia violacea agglutinins aggregated B.
subtilis only in high concentrations (Gaidamashvili and van Staden, 2002).
Quantitative microassay to evaluate antibacterial effect of ClaveLL in low
concentration on bacterial strains revealed low effect on growth of Gram-positive M. luteus
(10.2 %) and S. aureus (10.1 %) or of Gram-negative Serratia sp. (6.8 %), E. coli (4.8 %) and
P. aeruginosa (3.3 %) bacteria (Table 3). ClaveLL did not promote antibacterial activity on B.
subtilis (0.8 %).
124
ClaveLL showed inhibitory effect on Gram-positive and Gram-negative bacteria. The
lectin showed different results to S. aureus and B. subtilis according to used assays; it
promoted S. aureus cell agglutination and growth inhibition on microdilution assay, but did
not inhibit zone of growth on plates. Also, ClaveLL promoted B. subtilis cell agglutination
and growth inhibition on plates but not on microdilution assay (using other strain, UFPEDA
16). The results indicate that distinct assays are necessary for a better understanding of
interaction and inhibitory effect mechanisms of lectins with microorganisms; ClaveLL
differentiated strains from identical species. Crustin Pm1, an isoform of crustin (from the
shrimp Penaeus monodon that was overexpressed in E. coli) exhibited antimicrobial effect
against Gram-positive bacteria showing strong inhibition on S. aureus and Streptococcus
iniae (Supungul et al., 2008). Two antifungal peptides from Vigna sesquipedalis cv. and
Phaseolus lunatus showed antibacterial activity on E. coli, Bacillus megaterium (Wong and
Ng, 2005a), B. megaterium, B. subtilis (Wong and Ng, 2005b) and other bacteria strains.
Kacprzyk et al. (2007) studied histidine-rich synthetic peptide action on Gram-negative and
Gram-positive bacteria and concluded that such peptides had antimicrobial activity on E. coli,
P. aeruginosa, B. subtilis and S. aureus related with acidity condition. The effect of human β-
defensins, cathelicidin LL-37 and skin lysozyme on S. aureus and E. coli in different pH
conditions revealed a synergistic antibacterial effect against both bacteria in acidic conditions
(Chen et al., 2005).
Highly purified glycosilated ClaveLL was stable to pH changes and mainly inhibited
by glycoproteins. The lectin, a fungal growth inhibitor to different Fusarium species, with
inhibitory effect to Gram-positive and Gram-negative growth bacteria is an useful tool in
microbiology applications. ClaveLL is the first purified lectin from lichen species that
demonstrated growth inhibition property on phytopathogenic fungi and bacteria species.
125
ClaveLL is under evaluation in our laboratory to its potential as a natural antimicrobial on
pathogenic fungi and bacteria of economic interest for agriculture and human health.
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136
Table 1. Purification of ClaveLL
Sample Volume
(ml)
Protein
(mg/ml)
Total protein
(mg) HA SHA THA Yield % Purification fold
E 150.0 7.75 1162.5 256 33.0 38,400 100.0 -
F1 25.7 19.85 510.1 8,192 412.7 210,534 548.3 12.5
ClaveLL 226.7 0.08 18.6 64 780.5 14,508 37.8 23.6
HA: hemagglutinating activity; SHA: specific HA; THA: total HA
137
Table 2. Proteins or peptides with antifungal activity against Fusarium species
Protein classes Source Antifungal activity
against Fusarium sp. Reference
Capsicum annuum L. cv. F. oxysporum Young and Byung, 1996
Delandia umbellata F. oxysporum Ye and Ng, 2002b
Chitinases
Phaseolus mungo
F. solani
F. oxysporum Ye and Ng, 2005
Not determined pinto bean (P. vulgaris) F. oxysporum Ye and Ng, 2002a
Chitinase-like pinto bean (P. vulgaris) F. oxysporum Ye and Ng, 2002a
Talisia esculenta seeds F. oxysporum Freire et al., 2002
Pisum sativum F. oxysporum Sitohy et al., 2007
red kidney bean (P. vulgaris) F. oxysporum Ye et al., 2001
Romanian dihaploid variety F. graminearum
F. oxysporum Ciopraga et al., 1999
jackfruit seeds F. moniliforme Trindade et al., 2006
Lectins
breadfruit seeds F. moniliforme Trindade et al., 2006
Chitin-binding Peptide leaves of Ginkgo biloba F. graminearum
F. moniliforme Huang et al., 2000
maize kernels F. moniliforme
F. graminearum Duvick et al., 1992
Vigna sesquipedalis cv. F. oxysporum Wong and Ng, 2005a Peptides
Phaseolus lunatus L. F. oxysporum Wong and Ng, 2005b
Protease inhibitor pearl millet Fusarium sp. Joshi et al., 1998
138
Table 3. Antibacterial activity on disk diffusion methoda, on quantitative microdilution assayb
and MAC values on bacterial agglutination assay of ClaveLL
Bactéria Zone of growth inhibition (mm)a* MAC (µg/ml)
Corynebacterium callunae 12.50 (± 0.36) 2.81
Streptococcus faecalis 12.45 (± 0.42) 5.62
Bacillus subtilis 11.20 (± 0.34) 5.62
Gram-positive
Staphylococcus aureus 0 5.62
Escherichia coli 10.35 (± 0.32) 5.62
Pseudomonas aeruginosa 10.20 (± 0.34) 11.25
Gram-negative
Klebsiella pneumoniae 10.10 (± 0.17) 11.25
Bactéria Growth inhibition (%)b
Micrococcus luteus 10.20 (± 0. 35)
Staphylococcus aureus 10.10 (± 2.49)
Gram-positive
Bacillus subtilis 0.85 (± 1.47)
Serratia sp. 6.80 (± 1.20)
Escherichia coli 4.83 (± 0.32)
Gram-negative
Pseudomonas aeruginosa 3.30 (± 0.75)
(*) It includes the diameter of disk paper. Used bacterial strains for (a) and MAC were: C.
callunae, ATCC-5991; S. faecalis, ATCC-6057); B. subtilis, ATCC-6633; S. aureus, ATCC-
6538; E. coli, ATCC-25922; P. aeruginosa, ATCC-27853; K. pneumoniae, ATCC-29665.
Used bacterial strains for (b) were: M. luteus, UFPEDA 06; S. aureus, UFPEDA 01; B.
subtilis, UFPEDA 16; Serratia sp., UFPEDA 398; E. coli, UFPEDA 224; P. aeruginosa,
UFPEDA 39.
139
Figure 1. ClaveLL isolated from F1 through gel filtration chromatography using Sephadex G-
100 column (HA in log scale) (a); ClaveLL resolved in two main peaks through gel filtration
chromatography using Sephacryl S-300 column connected to ÄKTA-FPLC system (b);
ClaveLL resolved in one peak through chromatography using C4 column connected to RP-
HPLC system, mAbs 215 nm (c) and 280 nm (d).
2
1
0 40 80 120 160 200 ml
2
1
a Log HA A 280 nm
80
60
40
20
0 50 100 150 ml
mAU
kDa: 170 110 82 44
b
400
200
0
mAbs
0 20 40 60 min
c mAbs
0 20 40 60 min
400
200
0
d
140
Figure 2. (a) Effect of temperature on ClaveLL HA. At room temperature, HA corresponds to
observed in 30 ºC. (b) Effect of ions on ClaveLL HA before dialysis (1, MnCl2; 2, BaCl2; 3,
CaCl2; 4, MgCl2; in ions absence HA corresponds to observed with 5 and 10 mM MgCl2) and
after dialysis in EDTA solution (5, MnCl2; 6, CaCl2; 7, MgCl2; 8, MnCl2-CaCl2; in ions
absence HA was smaller than observed with 5 mM MnCl2-CaCl2). (c) Effect of pH on
ClaveLL HA.
0
1
2
30 40 50 60 70
Temperature
Log H
A
a
b
c
0
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7 8
40 m M
20 m M
10 m M
5 m M
Divalent Ions
divalentes
Lo
g H
A
0
1
2
3
5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH
Lo
g H
A
141
Figure 3. (a) Radial diffusion assay with F1 and ClaveLL using Cramoll 1,4. (b) F1
chromatography on Cramoll 1,4-Sepharose CL-4B. (c) SDS-PAGE of ClaveLL (obtained
from Sephadex G-100 chromatography) stained with Coomassie Blue or (d) Shiff’s reagent.
a
ClaveLL
Cramoll 1,4
F1
c d
A 280 nm
a
↓↓↓↓
↓↓↓↓
b
0.3 M Mannose
1 M NaCl
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 50 100 150 ml
142
Figure 4. Fusarium growth curve of F. decemcellulare (a), F. solani (b), F. oxysporum (c), F.
lateritium (d), F. verticiloides (e), F. fusarioides (f) and F. moniliforme (g) in YNB agar
medium containing lectin buffer, ClaveLL or cercobin on surface, and inhibition (%) of fungi
growth (h). Lectin buffer and cercobin constituted negative and positive controls,
respectively.
c d
e f
g h
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
a b
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
50
F.
descencellu
lare
F.
sola
ni
F.
oxysporu
m
F.
late
ritium
F.
vert
icili
oid
es
F.
fusarioid
e
F.
monili
form
e
Species
% I
nh
ibit
ion
ClaveLL
Cercobin
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
ClaveLL
Cercobin
Buffer
0
10
20
30
40
50
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
143
Artigo 2: a ser submetido ao periódico International Biodeterioration & Biodegradation
PURIFIED Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN: INSECTICIDAL ACTIVITY ON
Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae)
144
PURIFIED Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN: INSECTICIDAL ACTIVITY ON
Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae)
Michele D. C. da Silvaa; Roberto A. Sá a; Thiago H. Napoleão a; Francis S. Gomes a;
Nataly D. L. Santosa; Auristela C. Albuquerqueb; Haroudo S. Xavierc; Patrícia M. G.
Paivaa; Maria T. S. Correia a; Luana C. B. B. Coelho a*.
aLaboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco; bDepartamento de Biologia, Área
Zoologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco; cLaboratório de Farmacognosia,
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade
Federal de Pernambuco.
*Corresponding author: Luana C. B. B. Coelho
e-mail address: [email protected]
145
Abstract
Cladonia verticillaris lichen lectin (ClaveLL) was isolated through Sephadex G-100 gel
filtration chromatography and characterized as a pure lectin through AKTA-FPLC and
HPLC systems. The lichen extract (E), protein fraction (F1) and ClaveLL were assayed to
evaluate their potential insecticidal and/or repellence activities on termite Nasutitermes
corniger. E, F1 and ClaveLL were evaluated for hemagglutinating activity (HA), protein
estimation and presence of secondary metabolites. E and F1 samples and active ClaveLL,
free of secondary metabolites that can promote insect mortality, were able to induce
mortality of termites with LC50 values for workers and soldiers of 47.42 and 103.59 µg
protein/cm2 for E, 51.97 and 121.46 µg protein/cm2 for F1, and 3.13 and 8.01 µg
protein/cm2 for lectin, respectively, after 29 % of the experimental time. C. verticillaris
preparations are potential tools for researches involving termites (or other insects) of
economic interest to wooden industry or agriculture as well as preservation of plant species
in extinction that are targets of termites or other plagues.
Key words: lectin, lichen, Cladonia verticillaris, insecticidal activity, termite, Nasutitermes
corniger.
146
Introduction
Termites constitute a great group of social insects and they are responsible for
prejudice and damage caused in trees or wood products; these insects however, are also
ecologically beneficial since they are the great responsible for decomposition of cellulose, the
most present carbohydrate polymer in the world, acting in biorecycling. The genus
Nasutitermes belongs to the most species-rich Termitidae family that contains around 70-75
% of all termite cataloged species, wood, grass or soil feeders (Inward et al., 2007; Tokuda et
al., 1999), Nasutitermitinae subfamily, which have 93 genera and is represented by more than
240 species, forming the largest genus of wood-feeding Isoptera (Bergamaschi et al., 2007).
Representatives of these insects can be found mainly distributed over tropical regions.
Termites have ability to digest cellulose through three types of cellulases, with
endogenous and symbiotic origins, endoglucanases, exoglucanases and β-glucosidases
(Breznak and Brune, 1994); enzymes of endogenous origin are those encoded by genes in the
termite genome and enzymes of symbiotic origin are those produced by hindgut symbionts
(Zhou et al., 2008). All order Isoptera is constituted of seven families that have (except
Termitidae) cellulolytic protozoa in the hindguts of termites (Tokuda et al., 1999), being
according to morphological and molecular characters, the Termitidae family accepted as the
most recently evolved and derived Isopteran family (Miura et al., 1998).
Plants use either secondary metabolites or macromolecules resultant of the primary
metabolism against microorganisms, insects, herbivorous or in response to abiotic stress. The
main roles of plant secondary metabolites are believed to protect vegetables from attack by
pathogens or predators and also to survive to other biotic and abiotic stresses (Zhao et al.,
2005). In plants, as well reviewed by Carlini and Grossi-de-Sá (2002), among the many
proteins involved in defense's mechanisms are lectins, ribosome-inactivating proteins (types 1
and 2) (He and Liu, 2003), inhibitors of proteolytic enzymes (protease inhibitors) (Lalitha et
147
al., 2005) and glycohydrolases (α-amylase inhibitors) (Kluh et al., 2005), arcelins (found only
in wild accessions of the common bean Phaseolus vulgaris) (Rougé et al., 1993), chitinases
(Fitches et al., 2004), hemilectins also denominated chimerolectins (protein like monovalent
lectins), canatoxin-like protein (protein like hemilectins) (Stanisçuaski et al., 2005) as well as
modified forms of storage proteins and ureases (Follmer, 2008).
Lectins, proteins of wide distribution and not immune origin that present the ability to
recognize a variety of carbohydrates or other glycosilated molecules free or present on cell
surface through its reversible bind sites (Kennedy et al., 1995) stand out in biotechnology due
to many applications and other potential utilities that are daily evaluated and studied by
researchers in lectinology. Several lectins have revealed effects in different life stages of
insects that indicate insecticide activity against Coleoptera (Sadeghi et al., 2006; Leite et al.,
2005; Macedo et al., 2002; Machuka et al., 2000), Homoptera (Dutta et al., 2005;
Bandyopadhyay et al., 2001), Hemiptera (Sauvion et al., 2004), Diptera (Kaur et al., 2006),
Diptera and Hemiptera (Trigueros et al., 2003), Lepidoptera (Coelho et al., 2007; Fitches et
al., 2001;), Coleoptera and Lepidoptera (Macedo et al., 2007), Hymenoptera (Couty et al.,
2001) and other order insect representatives. The unique report of lectin toxicity on an insect
of Isoptera order is the lethal effect of a lectin from the heartwood of a timber tree
(Myracrodruon urundeuva) on Nasutitermes corniger (Sá et al., 2008). This lectin induced
mortality of workers and soldiers with values of LC50 of 0.248 mg/ml and 0.199 mg/ml,
respectively. The authors pointed out the possibility of participation of this lectin in the
natural resistance of M. urundeuva.
Around its wide distribution, lectins can be found and isolated from lichens (Elifio et
al., 2000; Molina and Vicente, 2000; Ingram, 1982; Lockhart et al., 1978; Howe and Barrett,
1970); the involvement of these molecules in the symbiosis establishment have been studied
and its possible physiological role suggested (Elifio et al., 2000; Molina and Vicente, 2000;
148
Kardish et al., 1991; Petit et al., 1983; Petit, 1982; Lockhart et al., 1978). ClaveLL is a new
lichen lectin that has been purified in your laboratory; its potential antimicrobial activities and
its use as histochemical marker are being evaluated.
In this work, we propose ClaveLL as a pure lectin sample (free of secondary
metabolites that can interfere in insecticidal assay) with insecticide activity against
Nasutitermes corniger, a termite species wood parasite and, because of this, of larger interest
for wooden industry and for preservation of areas with tree species in extinction. Additionally,
a lichen protein fraction and extract of C. verticillaris samples used in purification protocol of
ClaveLL also were active against termites.
Material and Methods
Lectin Purification
C. verticillaris lichen lectin was obtained through a sequential purification protocol; lichen
was dried at room temperature and an overnight extraction was performed in 0.15 M sodium
phosphate buffer, pH 7, containing 0.15 M NaCl (PBS), for 16 h at room temperature,
followed by filtration, centrifugation and protein precipitation with 30 % (w/v) ammonium
sulphate for 4 h at room temperature. Fraction precipitate, F1 (0-30 %), was obtained by
centrifugation, submitted to protein quantification (Lowry et al., 1951) and chromatography
(18 mg) on gel filtration Sephadex G-100 (1.4 x 63 cm) column to obtain pure and active
lectin, denominated ClaveLL. Extract (E), protein fraction (F1) and ClaveLL samples obtained
in the purification process had its haemagglutinating activity evaluated with glutaraldehyde-
treated erythrocyte suspension, 2.5 % (v/v) in 0.15 M NaCl (Bing et al., 1967) according to
Correia and Coelho (1995). Activity inhibition assays were performed with N-acetyl-
glucosamine and animal glycoprotein solutions.
149
Phytochemical Analysis
Phytochemical evaluation used E, F1 and ClaveLL samples in PBS and metanolic extract that
was prepared through a metanolic infusion (3 g of triturated lichen) under constant agitation
for 30 min. Samples were analyzed by thin layer chromatography on silica sheet (Merck,
Germany). The analyses used to mobile phase several systems of development, reagents for
adequate revelation and chromatographic standards, to investigate the presence of alkaloids
(EtOAc- HCOOH- AcOH- H2O (100:11:11:26 v/v) and Dragendorff´s reagent) (Wagner and
Bladt, 1996), terpenoids as triterpenoids and steroids (EtOAc- HCOOH- AcOH- H2O
(100:0.5:0.5:0.5 v/v) and Liebermann-Burchard reagent) (Harbone, 1998), saponins (EtOAc-
HCOOH- AcOH- H2O (100:11:11:26 v/v) and anisaldehyde to reveal) (Wagner and Bladt,
1996), iridoids (EtOAc- HCOOH- AcOH- H2O (100:11:11:26 v/v) and vanillin sulphuric acid
to reveal) (Wagner and Bladt, 1996), sugars (n-BuOH- Me2CO- phosphate buffer, pH 5.0
(40:50:10 v/v) and 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride to reveal) (Wallenfels, 1950) and
polifenols as coumarins (Et2O- toluene- AcOH 10% (50:50:50 v/v) and UV 365 nm to detect)
(Wagner and Bladt, 1996), cinnamic deriveds, phenylpropanoglucosides, flavonoids and
fenolic acids (EtOAc- HCOOH- AcOH- H2O (100:11:11:26 v/v) and Neu’s reagent) (Wagner
and Bladt, 1996; Markhan, 1982; Neu, 1956), condensed proanthocyanidins and
leucoanthocyanidins (EtOAc- HCOOH- AcOH- H2O (100:11:11:26 v/v) and vanillin
chloridric to reveal) (Roberts et al., 1956) and hydrolysable tannins (n-BuOH- Me2CO-
phosphate buffer pH 5.0 (40:50:10 v/v) and iron alumen to reveal) (Stiasny, 1912).
Insecticidal Assays
Termite species N. corniger collected in the area of the Universidade Federal Rural de
Pernambuco was identified by Dr. Luiz Roberto Fontes (from Superintendência de Controle
de Endemias, SUCEN, Brasil). Termite colonies were kept at vegetation house from the
Departamento de Agronomia from Universidade Federal Rural de Pernambuco. Termiticidal
150
activity was evaluated by a bioassay based on the method described by Kang et al. (1990);
assays were carried out on Petri plates (90 x 15 mm) covered by filter paper. Disks of filter
paper (4 cm diameter) were soaked with E or F1 samples for 4, 0.4 or 0.2 mg of total protein
(corresponding to 320, 32 or 16 µg/cm2 offered on filter paper for the feeding of the insects,
respectively), lectin sample for 120, 80, 40 or 10 µg of total protein (corresponding to 9.6,
6.4, 3.2 or 0.8 µg protein/cm2, respectively), or with PBS (negative control), were dried at
room temperature and then placed in the plates. Twenty insects (16 workers and 4 soldiers)
from termite colonies of the vegetation house properly adapted to the environment were
carefully transferred to plates. All plates were kept protected of the light, at 28 °C; monitoring
of assays was performed daily to detect death of insects and to guarantee the humidity of the
plates adding a water drop to paper covering plates until death of all insects. Assays were
made in quintuplicate. Survival rates were obtained for each treatment and expressed as mean.
Statistical analyses were determined through Statplus (2006). Significant differences between
groups were established using Student´s t-test (p<0.05) assuming equal variances
(homoscedastic) and considering the accumulative mortality during all assay; the
concentration required to kill 50% of insects in each treatment (LC50) was determined for E,
F1 and lectin after 29 % of the experimental time and defined from the data obtained with
different protein concentration of samples using Probit Analysis with a reliability interval of
95%.
Repellence Assays
The potential repellent property from E, F1 and ClaveLL samples was evaluated through assay
based on Su et al. (1982). A 2% agar solution was added to Petri plates until the border of
plates; after solidification and temperature reduction of gel for room temperature holes were
made in agar by the removal of 1 central cylinder (25 mm diameter) and 8 peripheral
cylinders (6 mm diameter). Disks of filter paper (6 mm diameter) were soaked with E or F1
151
samples for 300, 150, 30 or 15 µg of total protein (corresponding to concentrations of 1060,
530, 106 or 53 µg/cm2, respectively), lectin sample for 11.5, 5.75, 2.25, 1.5 or 0.75 µg of total
lectin (corresponding to 40.6, 20.3, 7.95, 5.3 or 2.65 µg lectin/cm2, respectively), or with PBS
(negative control), were put to dry at room temperature and placed in the peripheral cylinders
of plates. Each protein concentration was present in double in plates and each plate was
carried in triplicate performing a total of 6 repetitions for each protein concentration assayed.
Twenty insects (16 workers and 4 soldiers) were carefully transferred to central holes in the
plates that were maintained protected of the light, at 28 °C; plates were daily observed to
evaluate absence or presence of termites in the disks with E, F1, lectin or PBS treated,
construction standards of tunnels in agar and closing by insects of constructed galleries and to
detect death of insects.
Results
A quantity of 20 g from C. verticillaris flour allowed to obtain 1162.50 mg (total
protein) in E, 510.14 mg in F1 and 18.58 mg of ClaveLL through a simple established
protocol; ClaveLL represents 0.093 percent of the dry brute flour, 1.59 percent and 3.64
percent of the total protein present in E and F1, respectively. These samples agglutinated
glutaraldehyde-treated human erythrocytes from all ABO system, rat, chicken, quail and
(mostly) rabbit. E and F1 showed elevated protein concentration, HA and specific HA;
moreover, they (including purified active ClaveLL through molecular exclusion
chromatography) were free of secondary metabolites constituting samples chosen to evaluate
its potential insecticidal properties via protein.
Phytochemical analysis of E, F1 and ClaveLL samples in PBS showed none
constituting secondary metabolites (alkaloids, terpenoids as triterpenoids and steroids,
saponins, iridoids and polyfenols as coumarins, cinnamic deriveds, phenylpropanoglucosides,
152
flavonoids and fenolic acids, condensed proanthocyanidins and leucoanthocyanidins and
hydrolysable tannins); the chromatograms revealed total absence of secondary metabolites.
The metanolic extract analyzed to potential presence of terpenoids, revealed bands
corresponding to β-amirin and β-sitosterol standards and additional bands of smaller polarity
that characterize triterpenes and steroids, which reacted with Liebermann-Burchard reagent.
No other secondary metabolite was detected in the metanolic extract, through the preparative
analysis by thin layer chromatography on silica sheet. Presence of terpenes in the metanolic
extract proved the existence of secondary metabolites in the lichen constitution, which were
not extracted with PBS as the first step to obtain the lectin.
E, F1 and ClaveLL free of secondary metabolites samples in PBS were submitted to
insecticidal assays against N. corniger to evaluate termiticidal activity; E, F1 and ClaveLL
samples in all tested concentrations promoted 100% of workers and soldiers mortality below
time obtained for control; all assays also showed survival rate of 50 % in a smaller time than
that obtained for the control. ClaveLL was able to promote premature death of insects
(comparing with the negative control) in all tested concentrations; the insects reacted in
different way front to used concentrations, presenting periods for the total mortality in each
rehearsal where the minor and larger time to the total mortality did correspond to the largest
and smaller offered concentrations, respectively.
Effect analyzes of E and F1 samples of 4, 0.4 or 0.2 mg of total protein (corresponding
to 320, 32 or 16 µg/cm2, respectively) on workers showed that there was death induction of
100% of workers after 65, 76 and 82 % of the experimental time (E) and 41, 59 and 71 % of
days (F1), in respective concentrations; survival rate of 50 % for E treatment was observed
around 12 % of days (4 mg) and between 24-30 and 30-35 % of days (with 0.4 and 0.2 mg of
total protein, respectively) and for F1 treatment was around 12 % of days (4 mg), between 24-
30 and 29 % of days (with 0.4 and 0.2 mg of total protein, respectively). Mortality induction
153
with E and F1 was related to protein concentration on workers (Figure 1a and 1b). LC50 value
for workers was 47.42 (Standard error, SE, 15.59) for E and 51.97 µg protein/cm2 (SE 25.41)
for F1 (corresponding to 3.0 and 3.26 mg/ml, respectively) after 29 % of the experimental
time. In negative control of E and F1 assays 100% of mortality was observed after 100 % of
days and survival rate of insects was lower than 50% around 41 % of days. On soldiers E and
F1 samples for 320, 32 and 16 µg protein/cm2 also induced death of 100% of insects after 41,
71 and 82 % of the experimental time (E) and 41, 53 and 76 % of days (F1) in these
concentrations, respectively; survival rate of 50 % for treatments was observed around 12, 35
and 41 % of days for E and around 12, 29 and 35 % of days for F1 (concentrations above
cited, respectively). E and F1 mortality induction was also related to protein concentration on
soldiers (Figure 1c and 1d). LC50 value for soldiers was 103.59 (SE 18.17) for E and 121.46
µg protein/cm2 (SE 34.87) for F1 (corresponding to 6.5 and 7.7 mg/ml, respectively) after 29
% of the experimental time. Negative control on E and F1 assays showed 100% of mortality
after 94 % of days and survival rate of 50% around 41 % of days.
E and F1 showed statistically significant difference only with 4 mg of total protein
(320 µg/cm2) treatment in relation to workers and soldiers death of negative control. There
was significant difference among E 4 mg and 200 µg of total protein treatments to induce
workers death. Effects of other treatments with E and F1 on workers or soldiers were not
significantly different; result of E and F1, 4 mg of total protein treatment on death of insects
was not statistically different.
The analyzes of workers revealed that treatment with 120 µg of total lectin offered
(9.6 µg lectin/cm2) induced death of all insects after 37 % of the experimental time (average
in percentile); 100% of mortality after 46, 56 and 63 % of days were promoted for treatments
with 80 (6.4 µg lectin/cm2), 40 (3.2 µg lectin/cm2) and 10 (0.8 µg lectin/cm2) of total lectin,
respectively. Survival rate of 50 % for these treatments was observed around 22 and 24 % of
154
days for treatment with 120 and 80 µg of total lectin, and around 29 and 34 % of days for
treatments with 40 and 10 µg of total lectin, respectively. Mortality induction with the lectin
was also proportional to protein concentration on N. corniger workers (Figure 2a). LC50 value
for workers was 3.13 µg lectin/cm2 (SE 0.34) (corresponding to 0.196 mg/ml) after 29 % of
the experimental time. In negative control of lectin assays 100% of mortality was observed
only after 100 % of days and survival rate lower than 50% around 63 % of days. Soldier
analyzes showed that 9.6 µg lectin/cm2 treatment induced death of all insects after 39 % of the
experimental time (average in percentile), 100% of mortality after 46, 59 and 68 % of days
were promoted for treatments with 6.4, 3.2 and 0.8 µg lectin/cm2, respectively. Survival rate
of 50 % for these treatments was observed around 27, 41, 49 and 56 % of days for treatments
of insects with 9.6, 6.4, 3.2 and 0.8 µg lectin/cm2, respectively. Lectin mortality induction is
also proportional to protein concentration on N. corniger soldiers (Figure 2b). LC50 value
obtained for soldiers caste was 8.01 µg lectin/cm2 (SE 0.24) (corresponding to 0.5 mg/ml)
after 29 % of the experimental time. Negative control on lectin assays showed 100% of
mortality after 98 % of time and survival rate of 50% around 83 % of days.
Results with all lectin treatments showed statistically significant difference for
workers, soldiers and for all insect death induction in relation to control. There was none
significant differences among lectin concentrations to induce workers death; however,
concentration of 9.6 µg/cm2 showed statistical difference in relation to 3.2 and 0.8 µg/cm2 to
promote death of soldiers, as well as 6.4 µg/cm2 in relation to 0.8 µg/cm2. The statistical
analyses on all insects showed ClaveLL effect on termite death proportional to protein
concentration (Figure 2c); 9.6 µg/cm2 was significantly different in relation to 0.8 µg/cm2 to
promote death of all termites.
E, F1 and ClaveLL samples showed no repellent property against workers or soldiers
since these insects continuously and randomly visited peripheral cylinders containing disks of
155
filter paper with E, F1 and lectin samples in all used concentrations as well as with PBS.
Insects built galleries randomly, where was observed no standards related with samples or
negative control presence and tunnel construction. Termites maintained galleries open and
active throughout the experiment duration.
According to LC50 determination, in relation to toxic activity on insect castes, effect of
E, F1 and ClaveLL was higher on workers than soldiers.
Discussion
ClaveLL was simple and efficiently purified and yielded milligram quantities (18 mg
from 20 g of flour); C. verticillaris is a lichen of wide distribution on the world and represents
a rich lectin source. ClaveLL with high affinity to N-acetyl-D-glucosamine and several
glycoproteins which summed to the elevated protein concentration available awoke the
interest in investigation of its potential applicability as an insecticide molecule.
It is known that chemical plant defence against microorganisms, insects or herbivore
predators can be due to secondary metabolites of low molecular weight and to lectins or many
other protein types. Evaluated samples showed to be free of alkaloids, terpenoids, saponins,
iridoids, polifenols, condensed anthocyanidins and hydrolysable tannin compounds that can
be responsible for insecticidal action in plants suggesting that action of samples against
termites evaluated in this work occur via lectin.
All concentrations of tested lectin induced mortality of termites. Effect of different
lectin concentrations on termites seems to be more effective on soldiers since there was
statistical difference for this caste when lectin concentration varied. However effect of lectin
seems to be increased along time on workers once that LC50 value for workers it was lower in
relation to LC50 value for soldiers, after 29 % of the experimental time. Lectins also showed
effects in different life stages of larva insect (Coelho et al., 2007; Macedo et al., 2007; Leite
156
et al., 2005; Macedo et al., 2002; Fitches et al., 2001), nymph (Bandyopadhyay et al., 2001)
and adult stage (Sauvion et al., 2004) and on oviposition (Sadeghi et al., 2006); Similarly to
lectin from the M. urundeuva heartwood (MuHL), termiticidal effect of ClaveLL yielded
different LC50 values for soldier and worker castes but, on the other hand, ClaveLL was more
effective on workers while MuHL was more toxic for soldiers (Sá et al., 2008).
Treatment with 9.6 µg lectin/cm2 was the main concentration with toxic effect on
termites, inducing to death all workers and soldiers at 37 and 39 % of the experimental time
respectively. Lectin effects on the insects are expressed using different parameters to protein
values according to used experimental methods that generally are based on bioassays with
lectin incorporation into artificial diets offered to target insects. Lectin toxicity seems to
depend upon both the necessary resistance of the molecule against assimilatory proteins and
proteolytic degradation by the insect digestive enzymes and on the binding to insect gut
structures, in the peritrophic membrane and/or chitinous structures in the midgut region
(Coelho et al., 2007; Macedo et al., 2007). Insecticidal action of lectins still is unknown, but it
is probable that involves its binding to glycoproteins of midgut epithelial cells; it is suggested
that various modes of action exist to different lectins at the cellular levels (Sauvion et al.,
2004), not necessarily implying in the disruption of cellular function and lysis. Action
mechanism of lectins as toxic molecules can also be related to digestive enzymes and
assimilatory proteins in which lectins can interfere with its functions and inhibiting digestion
and absorption causing nutritional deprivation (Coelho et al., 2007; Leite et al., 2005;
Eisemann et al., 1994).
In general, N-acetyl-D-glucosamine specific lectins with ability to bind to chitin
appear to own insecticidal property; however, plant lectins with different specificities to
sugars also showed ability as insecticidal molecules suggesting that this property is not
exclusive to N-acetyl-D-glucosamine specific lectins. For example, XCL, a Xerocomus
157
chrysenteron (mushroom) lectin with affinity for D-galactose and lactose and to a lesser
extent, N-acetyl-D-galactosamine, had effect on Drosophila melanogaster and pea aphid
Acyrthosiphon pisum showing LC50 values of 0.4 mg/ml and 0.023 mg/ml respectively
(Trigueros et al., 2003). Other Gracilaria ornata lectin (a red alga) named GOL only
inhibited by some glycoproteins showed that 1% (w/w) caused a significant 65.1% reduction
in larval survival in relation to control artificial seeds. Also, GOL significantly affected the
percentage of adult emergence in relation to control (Leite et al., 2005). In other work,
Sadeghi et al. (2006) used 14 plant lectins (of four lectin families) with several specificities at
a concentration of 0.05% (w/v) solution; they showed that all lectins had deterrent effect
against oviposition of C. maculatus adults varying of 36 to 78 %. Talisia esculenta lectin
(TEL) isolated from seeds with chitin-binding properties and inhibited by mannose and
glucose produced ca. 90% mortality to Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus
larvae with LD50 and ED50 (decrease of 50% weight) of ca. 1% (w/w) for both insects
(Macedo et al., 2002).
N. corniger are insects that have ability to build tunnels and galleries and on stress
condition at presence of possible toxic substances they can react closing these spaces to avoid
physical contact (Su et al., 1982). The investigation of repellent activity revealed that
ClaveLL and other samples (E and F1) did not have repellent property on termites; the results
suggested that the insects have eaten the paper disk containing lectin and that the insecticidal
effect was due to action of lectin. Similarly to ClaveLL, MuHL did not show repellent
property (Sá et al., 2008).
ClaveLL may promote termite mortality as already proposed by the literature to other
lectins; according to subcellular targets of lectin, it may decrease food intake through its
binding to the midgut epithelium or to the peritrophic matrix (Fitches et al., 1997; Eisemann
et al., 1994); it could cross midgut epithelial barrier and pass into insect circulatory system
158
resulting in a toxic action interfering with endogenous lectins involved in self-defense present
in the haemolymph (Fitches et al., 2001); it may be internalized by endocytotic vesicles into
the epithelial cells and blocks nuclear localization sequence-dependent nuclear protein import
inhibiting cell proliferation (Yu et al., 1999).
There is an increasing biotechnological and industrial interest in the discovery of new
natural pesticides to promote a biological control avoiding the environmental impact. In this
conception, genes coding for inhibitors of digestive enzymes, amylase inhibitors, peptides,
lectins and other molecules have been used in production of transgenic plants with resistance
to microorganisms (Prasad et al., 2008) and insects (Hilder and Boulter, 1999; Schuler et al.,
1998). Inside our interest, genes of lectins are being widely introduced into transgenic plant
production of economic interest (McCafferty et al., 2008; Ramesh et al., 2004).
ClaveLL is a lectin easily purified in milligram quantities that can be considered as a
possible biotechnological tool in plague management strategies (as termite species, wooden
parasites) for the plant species preservation and to decrease the prejudices of the wooden
industry or agriculture. Therefore, ClaveLL could be of biotechnological interest to make
trees of industrial or commercial importance more resistant to termite action.
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carbohydrate-based cellulase inhibitors: Evidence from in vitro biochemistry and in vivo
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166
Figure 1. Survival percentile of Nasutitermes corniger worker (a and b) and soldier (c and d)
castes in presence of PBS (control), extract (E) or fraction 0-30 % (F) (treatments at concentration
of 0.2, 0.4 and 4 mg total protein). Each point represents the mean of five repetitions. Statistically
significant difference was observed between 4 mg and control (in a, b, c and d), and between
4 mg and 200 µg (in c).
E 4 mg
E 400 ug
E 200 ug
control
F 4 mg
F 400 ug
F 200 ug
control
E 4 mg
E 400 ug
E 200 ug
control
F 4 mg
F 400 ug
F 200 ug
control
a b
c d
Surv
ival
(%
)
Time (days in percentile)
Surv
ival
(%
) Su
rviv
al (
%)
Surv
ival
(%
)
Time (days in percentile)
Time (days in percentile)
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
Time (days in percentile)
167
Figure 2. Survival percentile of Nasutitermes corniger worker (a), soldier (b) castes or all insects
(c) in presence of PBS (control) or lectin (treatments at concentration of 10, 40, 80 and 120 µg
total lectin). Each point represents the mean of five repetitions. Statistically significant
difference was observed between all treatments and control, between 120 µg and 40 µg (in b),
between 120 µg and 10 µg (in b and c), and between 80 µg and 10 µg (in b).
ClaveLL 120 µg
ClaveLL 80 µg
ClaveLL 40 µg
ClaveLL 10 µg
control
ClaveLL 120 µg
ClaveLL 80 µg
ClaveLL 40 µg
ClaveLL 10 µg
control
ClaveLL 120 µg
ClaveLL 80 µg
ClaveLL 40 µg
ClaveLL 10 µg
control
a
b
c
Time (days in percentile)
Surv
ival
(%
) Su
rviv
al (
%)
Surv
ival
(%
)
Time (days in percentile)
Time (days in percentile)
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 75 100
168
Artigo 3: a ser submetido ao periódico Biodegradation
ANTIMICROBIAL AND INSECTICIDAL ACTIVITIES ON Nasutitermes corniger
(Isoptera: Termitidae) OF Bauhinia monandra LEAF LECTIN
169
ANTIMICROBIAL AND INSECTICIDAL ACTIVITIES ON Nasutitermes corniger
(Isoptera: Termitidae) OF Bauhinia monandra LEAF LECTIN (BmoLL)
Silva, M. D. C.1; Silva, M. B. R. 1; Paiva, P. M. G. 1; Sá, R. A. 1; Melo, C. M.2; Gusmão,
N. B.2; Albuquerque, A. C.3; Correia, M. T. S.1; Coelho, L. C. B. B.1*
1Laboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco. 2Laboratório de Ensaios
Biotecnológicos, Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco. 3Departamento de Biologia, Área Zoologia,
Universidade Federal Rural de Pernambuco;
*Corresponding author: Luana C. B. B. Coelho
e-mail address: [email protected]
170
Abstract
Bauhinia monandra leaf lectin (BmoLL) was purified according to a pre-established protocol
where leaves flour extract was submitted to ammonium sulphate fractionation followed by
chromatography on guar gel affinity and elution of adsorbed lectin with galactose; BmoLL
was evaluated for haemagglutinating activity and protein quantification, and was submitted to
assays against Fusarium sp., Gram-positive and Gram-negative bacteria and temites
Nasutitermes corniger to verify its potential antimicrobial, insecticidal and repellent actions,
respectively. BmoLL showed strong antifungal effect to F. solani and F. lateritium; was also
an inhibitor to F. fusarioides, F. moniliforme and F. verticiloides. BmoLL promoted
agglutination as well as inhibited the growth of pathogen bacteria. BmoLL was able to induce
the mortality of the evaluated termites with all treatments comprehended from 32 to 2 µg
lectin/cm2 used; LC50 values for workers and soldiers were 8.83 and 47.12 µg lectin/cm2 in
filter paper after 9 days, respectively. BmoLL is a potential tool for researches involving
pathogenic Fusarium species, bacteria or termites (as well as other plagues) of interest for
agriculture, health and for the wooden industry.
Key words: lectin, Bauhinia monandra, antimicrobial activity, Fusarium, insecticidal activity,
termite, Nasutitermes corniger.
171
Introduction
Species of Bauhinia genera represents a group of vegetables that have been evaluated
in relation to antitumor (Rajkapoor et al., 2003), hypoglycemic (Silva et al., 2002) and
antidiabetic (Pepato et al., 2002) effects, as well as in the reduction of the intestinal glucose
absorption (Mujica et al., 2003). Current popular use of Bauhinia monandra is for many
implications involving the health; is mainly used for its hypoglycemic activity. B. monandra
leaf lectin was purified in milligram amounts (Coelho and Silva, 2000) and this galactose-
specific lectin has been studied in relation to hypoglycemic action being of big importance a
larger knowledge about its potential to bind to different cell surfaces.
Plant lectins have been isolated mainly from seeds (Singha et al., 2007; Sitohy et al.,
2007; Susseelan et al., 2007; Freire et al., 2002), but also isolated from roots (Naeen et al.,
2001), leaves (Coelho and Silva, 2000) or algae (Ambrosio et al., 2003) and lichens (Elifio et
al., 2000; Molina and Vicente, 2000). Some of these molecules have been demonstrating
action antimicrobial (Sitohy et al., 2007; Santi-Gadelha et al., 2006; Trindade et al., 2006;
Freire et al., 2002; Gaidamashvili and van Staden, 2002; Ye et al., 2001; Ciopraga et al.,
1999) or insecticidal; their genes are being incorporated in transgenics as an alternative to
check resistance for vegetables of economic interest, and come producing plants less
susceptible to microrganisms attack (Prasad et al., 2008) and insects (McCafferty et al., 2008;
Dutta et al., 2005; Ramesh et al., 2004; Hilder and Boulter, 1999; Schuler et al., 1998).
BmoLL already revealed anti-insect activity against Anagasta kuehniella
(Lepidoptera: Pyralidae), Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus (Coleoptera:
Bruchidae) (Macedo et al., 2007). In this work, BmoLL was isolated on guar gel affinity
affinity chromatography and was evaluated as a potential molecule with antifungal action
against Fusarium species phytopathogen and pathogen human, antibacterial action against
different bacteria and insecticide effect on Nasutitermes corniger, termites that cause financial
172
prejudices to the wooden industry, degrade trees and are distributed by the whole world,
specially over tropical regions.
Material and Methods
BmoLL Purification: BmoLL was purified according to a pre-established protocol (Coelho
and Silva, 2000); B. monandra fresh leaves (after removal of the petioles and wash) were
dried at room temperature and an extraction overnight was performed in 10 mM citrate
phosphate buffer pH 6.5 containing 0.15 M NaCl, for 16 h at 4 °C followed by filtration,
centrifugation and protein precipitation with 60 % (w/v) ammonium sulphate for 4 h at room
temperature. Precipitate after centrifugation and dialysis was submitted to protein
quantification (Lowry et al., 1951) and chromatography on guar gel affinity column of which
adsorbed lectin was eluted with citrate phosphate buffer containing 50 mM galactose. BmoLL
dialysed had its hemagglutination activity (HA) evaluated with 2.5 % suspension in 0.15 M
NaCl (v/v) of rabbit erythrocytes treated with glutaraldehyde; the HA title was determined as
the inverse of the largest dilution with total agglutination, after 45 min of rest.
Antifungal Activity: BmoLL was evaluated with Fusarium species according a modified
assay based on Wong and Ng (2005). BmoLL was filtered to sterilization and applied (50 µl
with 29.75 µg of protein) on sterile Petri plate (90 x 15 mm) surfaces containing 10 ml of
Yeast Nitrogen Base (YNB) agar medium; a fungal mycelium disk (6 mm in diameter)
containing different Fusarium species (F. solani, URM-2480; F. oxysporum, URM-2489; F.
moniliforme, URM-3226; F. lateritium, URM-2491) obtained from the Culture Collections
from the Departamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil and (F.
fusarioides and F. verticiloides} from the Laboratório de Fungos do Solo, Departamento de
Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Brasil were placed in the middle of
plates. Lectin buffer and commercial antifungal Cercobin (10 ppm) constituted negative and
173
positive controls, respectively. Plates were incubated at 28 °C for 72 h and fungi growth halos
were measured in millimeters. Lectin effect on Fusarium sp. was defined by comparison with
fungal growth in the negative and positive control and was evaluated by growth halos
reduction. All assays were carried out in triplicate and the inhibition percentage data were
expressed as a mean ± standard deviation (S.D.).
Antibacterial Activity:
Disk Diffusion Method - Inoculum preparations were made according to Bauer et al. (1966).
Stationary cultures from different Gram-positive (Corynebacterium callunae, ATCC-5991;
Streptococcus faecalis, ATCC-6057; Bacillus subtilis, ATCC-6633; Staphylococcus aureus,
ATCC-6538) or Gram-negative (Escherichia coli, ATCC-25922; Pseudomonas aeruginosa,
ATCC-27853; Klebsiella pneumoniae, ATCC-29665) bacterial strains obtained from the
Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, were maintained
into Nutrient agar medium and stored at 4 ºC. Bacteria were cultured in Nutrient broth
medium and incubated under permanent shaking overnight at 37 ºC. Bacterial culture
concentrations were adjusted turbidimetrically at a wavelength of 600 nm to 106 colony
forming units (CFU).ml-1 constituting the inoculum working concentration. Each inoculum
(0.5 ml) was added to warm Nutrient agar medium (100 ml) at 43 °C and solutions (10 ml)
were distributed in sterile Petri plates (90 x 15 mm). After medium solidification, sterile paper
disks (6 mm in diameter) impregnated with BmoLL filtered to sterilization (15 µl equivalent
to 8.925 µg) were placed on Petri plate surfaces containing bacteria in solidified agar medium.
Lectin buffer and commercial antibacterial amoxicilin (1 mg/ml) constituted negative and
positive controls, respectively. Plates were incubated at 37 °C for 24 h and transparent rings
around each paper disk that revealed antimicrobial activity (zones of growth inhibition) were
measured in millimeters. BmoLL effect on bacterial strains was defined by comparison with
174
the negative control that should not have any effect on growth bacteria. All assays were
carried out in triplicate. Zone of growth inhibition data were expressed as a mean ± S.D.
Quantitative Antibacterial Microdilution Assay - Other bacterial strains (Gram-positive B.
subtilis, UFPEDA 16; Micrococcus luteus, UFPEDA 06; S. aureus, UFPEDA 01; or Gram-
negative E. coli, UFPEDA 224; P. aeruginosa, UFPEDA 39; Serratia sp., UFPEDA 398)
were obtained from Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco,
Brasil. Pre-inoculum of bacteria were used for inoculum preparation (106 colony forming
units (CFU).ml-1) through strong agitation in sterile water containing glass pearls. Nutrient
broth medium (180 µl) was added to sterile microplates for culture cell followed by filtered
BmoLL (20 µl with 11.9 µg of protein), which was thus ten times diluted (final 5.95 µg/ml).
To each well inoculum was added using a platinum handle (10 µl). The wells first sequence of
plates was free of bacteria for control of medium sterility. Wells were monitored by
absorbance (visible light 600 nm) in time 0; plates were sealed and submitted to incubation
for 18 h at 35 °C followed by a new absorbance. Last absorbances were subtracted from the
first absorbances and resultant absorbances in presence of BmoLL were compared to resultant
absorbances in presence of lectin buffer (control). All assays were carried out in triplicate.
Growth inhibition percentage data were expressed as a mean ± S.D.
Bacterial Agglutination Assay: Minimum agglutinating lectin concentration (MAC) able to
promote bacterial agglutination was quantitatively determined through assays in microtiter
plates with two-fold serial dilutions of BmoLL (1.9 mg/ml) in 0.15 M NaCl. Overnight
bacterial cultures were diluted with Nutrient broth medium (at a ratio of 1:100) and an aliquot
(100 µl) was added to each well for a final volume of 200 µl; after overnight incubation of
plates at 37 °C, MAC was determined through visual observation of agglutination. All assays
were carried out in triplicate.
175
Insecticidal Assays: Termite species N. corniger collected in the area of the Universidade
Federal Rural de Pernambuco was identified by Dr. Luiz Roberto Fontes (from
Superintendência de Controle de Endemias, SUCEN, Brasil). Termite colonies were kept at
vegetation house from the Departamento de Agronomia from Universidade Federal Rural de
Pernambuco. Termiticidal activity was evaluated by a bioassay based on the method described
by Kang et al. (1990); assays were carried out on Petri plates (90 x 15 mm) covered by filter
paper. Disks of filter paper (containing 4 cm diameter) were soaked with BmoLL for 400,
100, 50 or 25 µg of total protein (corresponding to 32, 8, 4 or 2 µg lectin/cm2 offered on filter
paper for the feeding of the insects, respectively), or with Extraction buffer (negative control),
were dried at room temperature and then placed in the plates. Twenty insects (16 workers and
4 soldiers) from termite colonies of the vegetation house properly adapted to the environment
were carefully transferred to plates. All plates were kept protected of the light, at 28 °C;
monitoring of assays was performed daily to detect death of insects and to guarantee the
humidity of the plates adding a water drop to paper covering plates until death of all insects.
Assays were made in triplicate. Survival rates were obtained for each treatment and expressed
as mean. Statistical analyses were determined through Statplus (2006). Significant differences
between groups were established using Student´s t-test (p<0.05) assuming equal variances
(homoscedastic) and considering the accumulative mortality during all assay; the
concentration required to kill 50% of insects in each treatment (LC50) was determined after 9
days and defined from the data obtained with different protein concentration of samples using
Probit Analysis with a reliability interval of 95%.
Repellence Assays: The potential repellent property from BmoLL was evaluated through
assay based on Su et al. (1982). A 2% agar solution was added to Petri plates until the border
of plates; after solidification and temperature reduction of gel for room temperature holes
were made in agar by the removal of 1 central cylinder (25 mm diameter) and 8 peripheral
176
cylinders (6 mm diameter). Disks of filter paper (6 mm diameter) were soaked with BmoLL
or Extraction buffer (negative control), were put to dry at room temperature and placed in the
peripheral cylinders of plates. Each protein concentration was present in double in plates and
each plate was carried in triplicate performing a total of 6 repetitions for each protein
concentration assayed. Twenty insects (16 workers and 4 soldiers) were carefully transferred
to central holes in the plates that were maintained protected of the light, at 28 °C; plates were
daily observed to evaluate absence or presence of termites in the disks with BmoLL or
Extraction buffer treated, construction standards of tunnels in agar and closing by insects of
constructed galleries and to detect death of insects.
Results and Discussion
Alcoolic preparations of Bauhinia variegata stem (Rajkapoor et al., 2003), B. forficata
leaves (Silva et al., 2002), and aqueous preparations of B. forficata (Pepato et al., 2002) and
B. megalandra leaves (Mujica et al., 2003) have produced antitumor, hypoglycemic,
antidiabetic effects and reduction of the intestinal absorption of glucose, respectively. These
biological activities have been putting Bauhinias in highlight and prove the presence of active
principles in your components, able of promote interactions in cell surfaces.
Bauhinia monandra is today widely used by the popular medicine because your leaves
are well-known popularly by own antioxidant (Argolo et al., 2004), hypoglycemic, diuretic
and slimming effect. Active BmoLL, a galactose-specific lectin present in your leaves showed
here active as antifungal molecule (Figure 1), strongly inhibiting the growth of Fusarium
solani (72.5 %) and F. lateritium (57.15 %); was also an inhibitor to F. fusarioides (27.8 %),
F. moniliforme (24 %) and F. verticiloides (14.3 %); F. oxysporum was not inhibited by
BmoLL (Figure 1b); inhibitory effect promoved by BmoLL was more efficient after 72 h. The
lectin was equally efficient to commercial antifungal Cercobin against F. solani; against other
177
Fusarium species evaluated BmoLL was better than Cercobin. Other lectins have
demonstrated antifungal activity against Fusarium species; four lectins isolated from Talisia
esculenta seeds (Freire et al., 2002), Pisum sativum (Sitohy et al., 2007), Astragalus
mongholicus (Yan et al., 2005) and Phaseolus vulgaris (Ye et al., 2001) were inhibitors to F.
oxysporum; WGA (isolated from Romanian dihaploid) was able to inhibit two other
pathogenic F. graminearum and F. oxysporum species (Ciopraga et al, 1999). F. moniliforme
was inhibited by lectins, two chitin-binding molecules purified from Artocarpus heterophyllus
and Artocarpus altilis (Trindade et al., 2006).
Since cell surface, especially bacteria can be differentiated in relation to your
glicosylated components, there is the interest discovering new lectins able of recognize,
interact or even inhibit the development of microbial cells once lectins recognize
carbohydrates or glicoconjugates present in cell surfaces, according its specificity. In
antibacterial assays, BmoLL showed inhibition halos (zones of growth inhibition) in plates
with Gram-positive C. callunae, S. faecalis and B. subtilis and Gram-negative E. coli, P.
aeruginosa and K. pneumoniae bacteria. BmoLL not affected the S. aureus growth. In
quantitative microassay BmoLL was only active against Gram-positive Micrococcus luteus
(22.59 %) and Gran-negative Serratia sp. (8.02 %). BmoLL also promoted cellular
agglutination with all tested bacteria; B. subtilis showed a better MAC (Table 1). Lectins from
different sources can be antibacterial against Gram-positive and Gram-negative bacteria, as a
lectin from marine species Holothuria scabra (Gowda et al., 2008), the lectin from Araucaria
angustifolia seeds (Santi-Gadelha et al., 2006) and C-type lectins from chicken and goose
eggs (both actives against B. subtilis, S. aureus and P. aeruginosa (Wellman-Labadie et al.,
2008). Gaidamashvili and van Staden (2002) using very plant lectins, obtained aggregation of
S. aureus with very low lectins concentration (4 and 5 µg/ml) or of B. subtilis with very high
concentrations, depending of lectin or bacteria.
178
On N. corniger, BmoLL was able to promote termiticidal activity with all
concentratios. 100% or 50 % of workers and soldiers mortality below time obtained for
control was showed in BmoLL assays. BmoLL concentrations was able to promote premature
death of insects where was observed that death was proportional to used concentrations,
however, there was none significant statistical differences among BmoLL concentrations to
induce workers or soldiers death. All lectin treatments showed statistical significance in
relation to control.
Workers analysis revealed that treatment with 400, 100 or 50 and 25 µg of total
BmoLL in filter paper (32, 8, 4 or 2 µg lectin/cm2, respectively) induced death of all insects
after 12, 14 and 20 days, respectively (average in percentile); Survival rate of 50 % for these
treatments was observed, in order, around 5, 8, 9 and 10 days. In negative control of lectin
assays 100% of mortality was observed only after 34 days and survival rate lower than 50%
around 23 days (Figure 2a). LC50 value for workers was 8.83 µg lectin/cm2 (SE 1.31) after 9
days. Soldier analyzes showed that BmoLL promoted 100% of mortality after 14 (with 400
µg), 16 (with 100 or 50 µg) and 21 days (with 25 µg of total lectin). Survival rate of 50 % or
more for these treatments was observed around 10, 13 and 14 days. Negative control showed
100% of mortality after 34 days and survival rate of 50% around 31 days (Figure 2b). Lectin
mortality induction was proportional to protein concentration on workers and soldiers castes
of N. corniger soldiers. LC50 value for soldiers was 47.12 µg lectin/cm2 (SE 2.36) after 9
days. LC50 values revealed that worker caste was more sensitive to the toxic lectin effect.
In addition, BmoLL promoted no repellent action on N. corniger; insects visited
peripheral cylinders with disks of filter paper with lectin as well as with Extract buffer.
Insects built galleries and tunnels that were maintained open and were observed no standards
related with lectin or negative control presence.
179
Bauhinia monandra is easily found ornamenting gardens and squares; generally in it is
not observed none type of damage caused by phytopathogens, insects or other herbivores. It is
an intriguing fact that stimulated to analyze the BmoLL lectin as potential pesticide. Chemical
plant defence against plagues predators can be due to secondary metabolites or proteins as
lectins.
Many lectins have demonstrated action against life development of insects (Coelho et
al., 2007; Macedo et al., 2007; Leite et al., 2005; Macedo et al., 2002; Fitches et al., 2001)
nymph (Sadeghi et al., 2006; Sauvion et al., 2004; Bandyopadhyay et al., 2001). Acoording
Macedo et al. (2007), BmoLL is able to bind to chitin as well as to midgut extracts and
membrane proteins of Callosobruchus maculatus larvae and your insecticidal activity may
involve binding to chitin components, interaction with glycoconjugates on epithelial cell
surface, binding to glycosylated digestive enzymes and/or assimilatory proteins, resistance
against enzymatic digestion and also decrease of the α-amylase activity in midgut of insects.
Lectins with insecticidal action probably own different modes of action according its cell
localization (Sauvion et al., 2004).
Lectins able to bind N-acetyl-glucosamine with affinity to chitin own insecticidal
property; however, plant lectins with different specificities to sugars also showed ability as
insecticidal molecules suggesting that this property is not exclusive to specificity of lectins
(Sadeghi et al., 2006; Leite et al., 2005; Trigueros et al., 2003;Macedo et al., 2002).
Lectins as well as peptides and other proteins have been introduced in transgenic
plants for resistance to microorganisms and insects (McCafferty et al., 2008; Prasad et al.,
2008; Ramesh et al., 2004; Hilder and Boulter, 1999; Schuler et al., 1998). BmoLL easily
purified in milligram quantities with property antimicrobial, especially against Fusarium sp.,
and insecticidal against N. corniger (specie of industrial and biotechnological interest) is a
promising molecule for investigations regarding your utilization as a lectin able to check
180
resistance for vegetables acting as a natural pesticide as well as in researches involving
pathogen human microorganisms.
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186
Table 1. Antibacterial activity on disk diffusion methoda, on quantitative microdilution assayb
and MAC values on bacterial agglutination assay of BmoLL
Bacteria Zone of growth inhibition (mm)a* MAC (µg/ml)
Corynebacterium callunae 6.40 (± 0.32) 118.75
Streptococcus faecalis 6.50 (± 0.05) 118.75
Bacillus subtilis 8.30 (± 0.10) 59.37
Gram-positive
Staphylococcus aureus 0 118.75
Escherichia coli 6.45 (± 0.13) 118.75
Pseudomonas aeruginosa 6.53 (± 0.30) 118.75
Gram-negative
Klebsiella pneumoniae 6.61 (± 0.27) 118.75
Bacteria Growth inhibition (%)b
Micrococcus luteus 22.59 (± 1.20)
Staphylococcus aureus 0
Gram-positive
Bacillus subtilis 0
Serratia sp. 8.02 (± 3.14)
Escherichia coli 0
Gram-negative
Pseudomonas aeruginosa 0
(*) It includes the diameter of disk paper. Used bacterial strains for (a) and MAC were: C.
callunae, ATCC-5991; S. faecalis, ATCC-6057); B. subtilis, ATCC-6633; S. aureus, ATCC-
6538; E. coli, ATCC-25922; P. aeruginosa, ATCC-27853; K. pneumoniae, ATCC-29665.
Used bacterial strains for (b) were: M. luteus, UFPEDA 06; S. aureus, UFPEDA 01; B.
subtilis, UFPEDA 16; Serratia sp., UFPEDA 398; E. coli, UFPEDA 224; P. aeruginosa,
UFPEDA 39.
187
Figure 1. Fusarium growth curve of F. solani (a), F. oxysporum (b), F. lateritium (c), F.
verticiloides (d), F. fusarioides (e) and F. moniliforme (f) in YNB agar medium containing
lectin buffer, BmoLL or cercobin on surface, and inhibition (%) of fungi growth (g). Lectin
buffer and cercobin constituted negative and positive controls, respectively.
c d
e f
0
10
20
30
40
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
BmoLL
Cercobin
Buffer
0
10
20
30
40
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
1 2 3
daysfu
ng
i g
row
th (
mm
)
0
10
20
30
40
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
0
10
20
30
40
1 2 3
days
fun
gi
gro
wth
(m
m)
a b
g
0
20
40
60
80
100
F. sola
ni
F.
oxysporu
m
F. la
teritiu
m
F.
vert
icilioid
es
F. fu
sarioid
e
F.
monilifo
rme
Species
% I
nh
ibit
ion
BmoLL
Cercobin
188
Figure 2. Survival percentile of Nasutitermes corniger worker (a), soldier (b) castes in presence
of CPB (control) or BmoLL (treatments at concentration of 25, 50, 100 and 400 µg total lectin.
Each point represents the mean of three repetitions.
b
Time (days)
Surv
ival
(%
)
a
Time (days)
Surv
ival
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
BmoLL 400 µg
BmoLL 100 µg
BmoLL 50 µg
BmoLL 25 µg
Control
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
BmoLL 400 µg
BmoLL 100 µg
BmoLL 50 µg
BmoLL 25 µg
Control
189
Artigo 4: a ser submetido ao periódico Histology and Histopathology
HISTOCHEMISTRY OF HIPPOCAMPUS FROM ALZHEIMER’S DISEASE
PATIENTS WITH Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN AND Bauhinia monandra
LEAF LECTIN
190
HISTOCHEMISTRY OF HIPPOCAMPUS FROM ALZHEIMER’S DISEASE
PATIENTS WITH Cladonia verticillaris LICHEN LECTIN AND Bauhinia monandra
LEAF LECTIN
Silva, M. D. C.1; Lima, A. L. R.1,2; Silva, M. B. R. 1; Beltrão, E. I. C.1,2; Mello, R. J. V.3;
Correia, M. T. S.1; Coelho, L. C. B. B.1*
1Laboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco. 2Setor de Patologia, Laboratório de
Imunopatologia Keiso-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, Recife,
Brasil. 3Departamento de Patologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal
de Pernambuco.
*Corresponding author: Luana C. B. B. Coelho
e-mail address: [email protected]
191
Abstract
Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative brain pathology related to
memory loss and cognitive dysfunction in elderly individuals, mainly characterized for
presence of intracellular neurofibrillary tangles, extracellular deposition of senile plaques,
amyloid deposits of vascular type (blood vessels dependent) or vessel independent, spherical
deposits and corpora amylacea. Cladonia verticillaris lichen lectin (ClaveLL) and Bauhinia
monandra leaf lectin (BmoLL) were conjugated to horseradish peroxidase (HRP) to evaluate
glycosylated residues of glycoconjugates from histological surface of patient hippocampus
with AD. ClaveLL and BmoLL recognize carbohydrate binding sites containing N-acetyl-
glucosamine (and other carbohydrates or glycoproteins) and galactose, respectively. Neurons
with intracellular neurofibrillary tangles or granulo-vacuolar degeneration in the hippocampal
formation were recognized by lectin staining using ClaveLL-HRP conjugate; corpora
amylacea and blood vessels were strongly stained with ClaveLL- and BmoLL-conjugates.
Lectins were able to recognize cytoplasm of neurons. These lectin staining are handy
histochemical tools to investigate carbohydrate composition in the brain tissues for AD
diagnosis.
Key words: lichen, Cladonia verticillaris, Bauhinia monandra, lectin histochemistry,
hippocampus, brain, Alzheimer’s disease.
192
Introduction
Alzheimer’s disease (AD) is among several neurodegenerative diseases and it is
characterized for causing slowly progressive dementia on the adult age of onset. Main AD
symptoms are progressive memory loss and involvement of other higher brain functions such
as cognitive dysfunction, language and motor functioning. The neuropathological features are
neuronal loss, and microscopic lesions such as extracellular deposition of amyloid plaques
(senile plaques) and presence of intracellular neurofibrillary tangles, NFT (Bonifati and
Kishore, 2007; Wang et al., 2007) that can be associated to dementia in AD. Dystrophic
neurites, degenerating neurons, and activated astrocytes and microglia especially around the
senile plaques also characterize AD brains.
NFT are intraneuronal accumulations of paired helical filaments composed of
abnormally hyperphosphorylated tau protein. The senile plaques are characterized for
extracellular deposition of aggregated β-amyloid peptide, Aβ1–40 or Aβ1–42 (the last is more
neurotoxic, aggregated and more involved with AD), 39–42 amino acid residues resultant
from the intracellular proteolytic cleavage of neuronal larger β-amyloid precursor protein
(APP), a glycosylated trans-membrane protein; NFT and senile plaques constitute histological
hallmarks of AD pathology (Ng’walali et al., 2002; Bonifati and Kishore, 2007; Findeis,
2007; Yoon et al., 2007). However, neither plaques nor NFT are unequivocal evidence to
account for the AD pathology since the same distribution pattern in individuals with AD is
observed as those in individuals with Down’s syndrome (DS) and in smaller numbers in non-
demented elderly persons; the neuropathological role from both lesions is related to cognitive
dysfunctions of individuals with dementia (Ng’walali et al., 2002; Nishi et al., 2003). Li et al.
(2007) emphasize the significance of intracellular Aβ as a complementary explanation for
defective neuronal physiology and neuronal cell loss in AD. Several evidences support the
role of intraneuronal Aβ accumulation as an early event in AD-associated neuronal
193
dysfunction (Arbel and Solomon, 2007). Mitochondria constitute an intracellular aggregation
site for Aβ; both monomers and oligomers of Aβ are present within
mitochondria; mitochondrial Aβ levels in AD brain may play a pathological role by inducing
mitochondrial dysfunction through numerous factors and interactions among various signaling
pathways (Wang et al., 2007).
Forensic pathology involves, among several tasks, the investigation of individual
predispositions to fatal conditions in consequence of traumas and diseases. So, evaluation of
brain degenerative changes is significant, since many neurodegenerative diseases are
intimately related to brain dysfunctions, as deficit cognitive and memory loss. Thus,
histological and immunohistochemical assays constitute important tools to investigate or
diagnose cerebral abnormalities and diseases in postmortem circumstance of humans
(Cummings et al., 1992; Nishimura et al., 2000; Ng’walali et al., 2002; Minnasch et al., 2003;
Nishi et al., 2003; Ulfig et al., 2004; Ishikawa et al., 2006; Uryu et al., 2007) and animals
(Medina-Flores et al., 2004; Arendash et al., 2007), some of these using lectin as
histochemical markers. Clinical diagnosis is still limited today to “probable” or “possible”
AD; therefore, unequivocal diagnosis of definite AD continues to require postmortem
histological analysis of the brain to investigate the presence of the characteristic senile
plaques, NFT and other lesions that define the disease, at least in later disease stage (Findeis,
2007).
Lectins are molecules capable to detect and characterize different glycoconjugate
composition of cell and tissue surfaces, detecting distinct expression of these constituent
molecules related to many physiological and pathological stages through
(immuno)histochemical assays or others (Barou et al., 2002; Beltrão et al., 2003; Babál et al.,
2006; Fiedler et al., 2007; Hemmoranta et al., 2007; Szöke et al., 2007; Thöm et al., 2007).
Lectin histochemistry application in forensic neuropathology is an economical method
194
to detect carbohydrate-related degenerative changes in different regions of the brain involved
with different pathologies, such as carbohydrate deposits (senile plaques and NFT)
predominant pathological markers of AD and DS (corpora amylacea which is relevant to
repeated brain hypoxia and mitochondrial damage, amyloid deposits and other lesions) and
present in these and other neurodegenerative conditions. Thus, in the present paper lectin
staining is a handy tool that contributed with information on carbohydrate composition in the
brain tissues for AD diagnosis.
Materials and Methods
Lectin Purification
C. verticillaris lichen lectin was obtained through a sequential purification protocol; lichen
was dried at room temperature and an extraction overnight was performed in 0.15 M sodium
phosphate buffer pH 7 containing 0.15 M NaCl, for 16 h at room temperature followed by
filtration, centrifugation and protein precipitation with 30 % (w/v) ammonium sulphate for 4 h
at room temperature. Precipitate obtained by centrifugation was submitted to protein
quantification (Lowry et al., 1951) and chromatography (18 mg) on gel filtration Sephadex G-
100 (1.4 x 63 cm) column to obtain pure and active lectin. BmoLL was purified according to a
pre-established protocol (Coelho and Silva, 2000); B. monandra fresh leaves (after removal of
the petioles and wash) were dried at room temperature and an extraction overnight was
performed in 10 mM citrate phosphate buffer pH 6.5 containing 0.15 M NaCl, for 16 h at 4 °C
followed by filtration, centrifugation and protein precipitation with 60 % (w/v) ammonium
sulphate for 4 h at room temperature. Precipitate after centrifugation and dialysis was
submitted to protein quantification (Lowry et al., 1951) and chromatography (144 mg) on
guar gel (10 ml) affinity column; adsorbed lectin was eluted with citrate phosphate buffer
195
containing 50 mM galactose. ClaveLL and BmoLL (dialysed) had its activity evaluated with
rabbit erythrocytes treated with glutaraldehyde (Bing et al., 1967).
Conjugation
Lectin conjugation to horseradish peroxidase (HRP) was performed according to Beltrão et al.
(1998). Lectins were dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer (PBS) pH 6.8 for 16 h
at 4 °C. HRP was added to dialyzed lectins (a proportion of 3 mg for 1 mg of lectin); the
solutions were softly shaken and 50 µl of 1% (v/v) glutaraldehyde aqueous solution was
added. After incubation under rest for 2 h at 25 °C, solutions were dialyzed against 0.01 M
PBS pH 6.8 containing 0.15 M NaCl, for 16 h at 4 °C. ClaveLL-HRP and BmoLL-HRP
activities were evaluated by hemagglutinating assays (Correia and Coelho, 1995) using
glutaraldehyde-treated rabbit erythrocytes, 2.5 % (v/v) suspension in 0.15 M NaCl.
Lectin Histochemistry of Hippocampus
Tissue sections in paraffin blocks were obtained from Death Verification Service from the
State of Pernambuco. Sections were cut (4 µm) and adhered to albuminized
slides. Histological slices were deparaffined with xylene, hydrated through graded alcohol 70-
100% and treated with 0.1% (w/v) trypsin solution for 2 min at 37 °C. Slices were submitted
to treatment with 0.3 % (v/v) methanolic hydrogen peroxide solution for 15 min at 25 °C. For
lectin histochemistry, histological slices were incubated with ClaveLL-HRP or BmoLL-HRP
conjugates (60 µg/ml of lectin) for 2 h at 4 °C; negative control slices were incubated with
ClaveLL-HRP containing 0.3 M N-acetyl-glucosamine (specific inhibitory sugar for
carbohydrate recognition sites of ClaveLL) or BmoLL-HRP containing 0.3 M D-galactose
(specific inhibitory sugar for carbohydrate recognition sites of BmoLL). Histological slices
were washed (twice for 5 min) with 0.01 M PBS pH 7.2, containing 0.15 M NaCl, after each
step. Horseradish peroxidase was visualized by incubation in 0.01 M PBS containing
196
diaminobenzidine (DAB) and hydrogen peroxide solution (Beltrão et al., 2003) for 5 to 8 min.
Slices were counterstained with haematoxylin and evaluated through optic microscopy.
Results
We found that NFT present in the dentate gyrus and other regions of the hippocampus of
patients with AD contained glycidic radicals able to be recognized by ClaveLL-HRP (Figure
1F-I); cells with granulo-vacuolar degeneration (other tipical degeneration in AD) also were
stained by ClaveLL-HRP (Figure 1J). BmoLL-HRP was not reactive with NFT. Both lectins
evaluated were not able to detect senile plaques on hippocampus tissues tested (if tissues
contained senile plaques). Strong recognition of blood vessels in the hippocampal formation
was detected by lectin staining using ClaveLL-HRP (Figure 1A) and BmoLL-HRP (Figure
2A). Lectins were able to recognize cell cytoplasm of neurons (Figure 1A-C and E, with
ClaveLL; Figure 2B, C, E and F, with BmoLL). Moreover, ClaveLL-HRP (Figure 1A, B and
D) and BmoLL-HRP (Figure 2A and D) conjugates, GlcNac (or fetuin, asialofetuin, casein,
asocasein and glycoproteins present in colostrum and in rabbit or bovine fetal serums) and
galactose specific, respectively, showed strong reactivity with corpora amylacea present in the
hippocampus of patients with AD. BmoLL-HRP not stained cell cytoplasm and blood vessels
in hippocampus of patients without Alzheimer’s disease.
Discussion
Lectins with different specificities to carbohydrates are powerful histochemical tools
for a detailed characterization of physiological cell stages, metabolic diseases and general
pathologies tracing changes in cells and tissues. However, use of lectins specifically in the
histochemical study of AD is not significant in relation to the potential contributions that
these molecules can provide for a better understanding of the pathology (Mann et al., 1988;
197
Kobayashi et al., 1989; Cummings et al., 1992; Mann et al., 1992; Nishimura et al., 2000;
Nishi et al., 2003), contributing with information on cells and tissue changes in respect to
modified glycosylation processes.
AD is a neurodegenerative disease characterized by a slow progressive dementia on
the adult age of onset that can be linked to neuronal loss (Kobayashi et al., 1989),
extracellular deposition of senile plaques and presence of NFT (Bonifati and Kishore, 2007),
whith are the pathological hallmarks of AD (Ng’walali et al., 2002; Bonifati and Kishore,
2007; Findeis, 2007; Yoon et al., 2007).
Carbohydrates located at cell surface are found as glycolipids or glycoproteins at the
outer layer of cell membrane, where they are involved in most of the major biological events
and can serve as biological markers (Boullanger et al., 2008). Carbohydrate-chains are co-
translational or posttranslational modifications of proteins and also can occur in lipid-linked
forms constituting glycoconjugates. Such modifications are executed by sequential actions of
cellular glycosyltransferases and other molecules. Many post-translational modifications, such
as N- and O-glycosylation, phosphorylation, tyrosin O- sulfation and ε glycation have been
described in trans-membrane APP (Schmitt, 2006). Glycan chains can significantly alter
protein conformation and may consequently modulate the functional activity of a protein as
well as protein/protein interactions (Geyer and Geyer, 2006). For instance, O-GlcNAc like
modification is involved with many cell functions (Kneass et al., 2004; Zachara et al., 2004)
and enzymes of addition (O-GlcNAc transferase, OGT) and removal (O-glycoprotein 2-
acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosidase) of O-GlcNAc like modification show intense
expression in brain tissues (Kreppel et al., 1997; Gao et al., 2001). Thus, it is clear that the
modification act on important brain functions. O-GlcNAc and phosphorylation like
modifications, when simultaneous, they seem to be involved with regulation of
hyperphosphorylated tau protein participation on intracellular NFT formation (Liu et al.,
198
2004). Final glycosylation of cell molecules is one of the key processes by which the cell
modifies proteins and lipids constituents, and it can change several physical and chemical
properties, reactivity, and biological function of these molecules (Babál et al., 2006). Brain
glycoconjugates are important recognition molecules in mediating cell–cell interactions
during development of the central nervous system (Nishimura et al., 2000; Nishi et al., 2003),
act as inductors in development and migration of neurons, neural cell adhesion and others.
Thus, an imbalance in the glycidic metabolism can deliberate cerebral disorders resulting in
abnormal protein modifications and may produce the accumulation or deposition of
glycoconjugates intracellular and/or the intercellular matrix (Nishimura et al., 2000).
Although both ClaveLL-HRP and BmoLL-HRP lectins were not able to detect senile
plaques on hippocampus, these lesions and NFT were recognized mainly in the cerebral
cortex and hippocampus of some elderly people, patients with DS and/or ATD (Alzheimer-
type dementia); lesions were clearly stained by Con A (Canavalia ensiformes agglutinin),
PSA (Pisum sativum agglutinin) and GS-I (Griffonia simplicifolia I lectin) lectins (showed no
reactivity with other lectins tested) and not detected in the younger control group (Nishimura
et al., 2000). Nishi et al. (2003) reviewed that NFT in cerebral cortex with DS were detected
by weak but clear lectin staining using WGA (Wheat Germ Agglutinin), GSI (Griffonia
simplicifolia agglutinin), GSAI-B4 (Griffonia simplicifolia iso agglutinin B4), Con A, and
PSA; senile plaques were diffusely stained by these lectins, reacting strongly with Con A and
PSA, and moderately with WGA and GSA-IB4. Mann et al. (1988) studying the
oligosaccharidic composition from structure of the senile plaque and NFT with lectin
histochemistry, observed that different lectin groups stained the neurites of senile plaques and
NFT; neuraminidase pretreatment abolished staining of NFT by some of these lectins that
stained NFT (but did not affect staining of all). Authors concluded that oligosaccharides could
contribute (but in different ways) to glycoprotein or glycolipid residues that form an integral
199
part of the structure of the senile plaque and the NFT. Tau proteins belong to the family of
brain microtubule associated proteins involved in polymerisation and stability of neuronal
microtubules and can be posttranslationally modified by phosphorylation, N- and O-linked
glycosylation, ubiquitination, glycation, proteolysis and other events (Buée et al., 2000).
Abnormal phosphorylation of tau proteins occurs during neurodegenerative diseases such as
Alzheimer’s disease and these abnormally phosphorylated tau proteins are the main
components of filaments (named NFT) that accumulate in degenerating neurons. In addition,
tau proteins from brains with AD are glycosylated with N- and O-linked saccharides.
Lefebvre et al (2003) verified that WGA recognized the tau protein and this recognition was
indeed specific for O-linked GlcNAc residues; use of other techniques confirmed that human
tau proteins were glycosylated with O-GlcNAc residues only. However, in vivo, the
hyperphosphorylated tau proteins that aggregate in NFT during neurodegenerative diseases
are devoid of O-GlcNAc residues. Liu et al. (2002) through monosaccharide composition
analyses and specific lectin blots suggested that tau in AD brain was glycosylated mainly
through N-linkage and they suggested that tau glycosylation is an early abnormality of
neurofibrillary degeneration in AD, and that glycosylation of tau might facilitate its abnormal
hyperphosphorylation in AD brain.
In spite of strong recognition of ClaveLL-HRP by material surrounding blood vessels
on hippocampal formation, previous investigations demonstrated that amyloid deposits of
vascular type found mainly in the hippocampus of patients with ATD and nearby the dentate
nucleus of the cerebellum of a patient with DS showed good reactivity with UEA-I (Ulex
europaeus isolectin I), GS-I and DBA (Dolichos biflorus agglutinin), and no reactivity with
Con A and PSA (Nishimura et al., 2000). Mann et al. (1992) used 14 lectins to investigate the
expression of saccharides by cerebral microvessels (MBV) in ageing, AD and DS, and
verified that in AD and in persons over 50 years of age with DS, binding of e-PHA
200
(erythroagglutinating phytohemagglutinin from Phaseolus vulgaris), l-PHA (Phaseolus
vulgaris leukoagglutinating lectin) and PAA (Pisum arvense agglutinin) was increased
beyond (in relation to age alone), as was binding of UEA-I and BSA-1B4 (Bandeiraea
simplicifolia agglutinin) in AD, but not in DS. These specific increases in AD and DS may
reflect selective disease-related changes in basement membrane (that occurs in DS after 50
years of age and that could stem from the loss of neurones from locus caeruleus, raphe and
nucleus basalis, which are thought to innervate MBV and exert control over blood flow and
permeability) and could indicate an impaired blood-brain barrier function or integrity.
Corpora amylacea were found with increasing frequency in different neurological
diseases, for instance in the hippocampus of patients with DS or ATD; this lesion in this work
was strongly stained with ClaveLL-HRP and BmoLL-HRP lectins, that are GlcNAc inhibited
and galactose specific, respectively. It showed good reactivity with GS-I (specific to galactose
and GaINAc) and was also stained by UEA-I (specific to fucose), DBA (specific to GalNAc),
PNA (specific to Gal–GalNAc) and ECA (specific to Gal–GlcNac) lectins, but was not
stained by lectins specific to mannose (PSA and Con A) (Nishimura et al., 2000).
The new lectin ClaveLL obtained from the lichen Cladonia verticillaris is being
analyzed in relation to its potential antifungal, antibacterial and insecticide activities.
Bauhinia monandra leaves are broadly used as popular hypoglycemic medicine in Northeast
of Brazil and a galactose-specific lectin (BmoLL) is present in leaves in milligram amounts
(Coelho and Silva, 2000). The interfacial behavior of BmoLL and its interaction with lipid
monolayers have been studied by surface tension measurements (Rosilio et al., 2004);
dielectric properties of BmoLL monolayers (Andrade et al., 2005 part I) and mixed
monolayers with phospholipids (Andrade et al., 2005 part II) have been evaluated. BmoLL
also revealed anti-insect activity (Macedo et al., 2007).
201
Lichen lectins are not frequently purified; in general they are evaluated structurally,
however few biological or biotechnological applications have been described to these
molecules of exotic biological nature. Also, leaf lectins are purified less habitually in
comparison to seeds and other vegetable structures. In this work, we show a new lectin
(ClaveLL) of lichenic nature with glycoproteins or N-acetyl-glucosamine-binding property
that is able to recognize neuron cells and some characteristic intra and extra cellular structures
(lesions) of the hippocampus of patients with AD. In addition, we introduce that BmoLL, a
galactose specific lectin purified from leaves, also was able to recognize corpora amylacea
characteristic in brain tissues of patients with AD; BmoLL was also able to recognize
cytoplasm of neuron cell and blood vessels present in the hippocampus with Alzheimer
disease. These lectins with different specificities are useful as histochemistry markers to
diagnosis or study AD through the hippocampus tissues.
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207
Figure 1. Lectin histochemistry in the hippocampal formation of patients with AD: cells with
neurofibrillary tangles showed strong reactivity with ClaveLL-HRP (F, G, H, and I) that were
not stained with BmoLL-HRP; blood vessels (A), cell cytoplasm (A, B, C and E) and cells
with granulo-vacuolar degeneration (J) also showed clear reactivity with ClaveLL-HRP;
corpora amylacea in the hippocampus were strongly stained by ClaveLL-HRP (A, B, and D).
A, B, C, D and E (X 400x1.7), F (X 200x1.7) and G, H, I and J (X 400x3.0) with
haematoxylin counterstain.
A B C
D E
F H J G
I
208
Figure 2. Lectin histochemistry in the hippocampal formation of patients with AD: cells
cytoplasm showed clear reactivity with BmoLL-HRP (B, C, E and F); blood vessels (A) and
corpora amylacea in the hippocampus (A and D) were strongly stained by BmoLL-HRP. A (X
200x1.7) and B, C, D, E and F (X 400x1.7) with haematoxylin counterstain.
A C B
D E F
209
6 CONCLUSÕES
210
- Num protocolo simples, cromatografias em Sephadex G-100 isolam mais que 18 mg de
ClaveLL presente na fração protéica (F1), obtida do extrato (E) de apenas 20 g do líquen
Cladonia verticillaris;
- ClaveLL é termossensível, não dependente de íons, estável em pH ácido e básico,
glicosilada e apresenta elevada afinidade por glicoconjugados;
- ClaveLL possui elevado peso molecular (110 kDa), forte caráter hidrofóbico, perfil
homogêneo e parece ser constituída por agregados moleculares em condições para proteínas
nativas;
- ClaveLL em baixas concentrações e BmoLL apresentam ação antifúngica atuando como
inibidores do crescimento de espécies de Fusarium, podendo ser mais eficientes que o
antifúngico comercial Cercobin. As lectinas também atuam inibindo o crescimento de
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como promovem aglutinação bacteriana;
- ClaveLL é uma amostra lectínica livre de metabólitos secundários, com elevada afinidade
por N-acetil-D-glicosamina e, especialmente, glicoproteínas. BmoLL é uma lectina específica
para galactose e tem afinidade por quitina. As duas lectinas apresentam ação inseticida contra
Nasutitermes corniger, uma espécie que ataca madeiras;
- Adicionalmente, preparações protéicas do líquen (E e F1), também livres de metabólitos
secundários, são similarmente tóxicas para os cupins;
- ClaveLL e preparações do líquen (E e F1) bem como BmoLL não possuem ação repelente
sobre os insetos avaliados reforçando que a morte dos mesmos ocorre devido à ingestão de
papel contendo as preparações;
- ClaveLL reconhece células neuronais e algumas lesões intra e extra-celulares (degenerações
e corpos amiláceos) características da doença de Alzheimer;
- BmoLL marca o citoplasma neuronal e corpos amiláceos (abundantes em hipocampos de
pacientes com a doença de Alzheimer);
211
- ClaveLL e BmoLL são lectinas úteis como marcadores histoquímicos para contribuir com o
diagnóstico e estudo da doença de Alzheimer.